JP2003146997A

JP2003146997A - オリゴペプチド

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Publication number: JP2003146997A
Application number: JP2001347338A
Authority: JP
Inventors: Kyoko Takebe; 京子武部; Yumiko Oka; 由美子岡; Keiko Tochigi; 慶子栃木; Yohei Hirai; 洋平平井
Original assignee: Sumitomo Electric Industries Ltd
Current assignee: Sumitomo Electric Industries Ltd
Priority date: 2001-11-13
Filing date: 2001-11-13
Publication date: 2003-05-21
Anticipated expiration: 2021-11-13
Also published as: JP3951676B2

Abstract

(57)【要約】【課題】毛成長促進作用を有するオリゴペプチドを提
供すること。【解決手段】以下の（１）から（３）の何れかに記載
のオリゴペプチド。（１）下記のアミノ酸配列(I)、（II）又は（III）を含
む８から２０アミノ酸残基から成るオリゴペプチドであ
って、毛成長促進作用を有するオリゴペプチド： Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp-Gln （I） Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp-Gln （II） Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp-Gln （III）（２）上記のアミノ酸配列(I)、（II）又は（III）にお
いて１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入
されたアミノ酸配列を含む８から２０アミノ酸残基から
成るオリゴペプチドであって、上記（１）に記載のオリ
ゴペプチドと同様の毛成長促進作用を有するオリゴペプ
チド；（３）上記の（１）又は（２）に記載のオリゴペプチド
の修飾オリゴペプチドであって、上記の（１）又は
（２）のオリゴペプチドと同様の毛成長促進作用を有す
る修飾オリゴペプチド：

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、毛成長促進作用を
有するオリゴペプチド、及び該オリゴペプチドを有効成
分として含む医薬に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】上皮組織の正常な形態形成は上皮組織の
周りに存在する間充織細胞由来の因子による制御を受け
ていることが示唆されており、また、上皮組織の形態形
成異常に起因する疾患の多くが間充織細胞の異常を原因
としていることから、間充織細胞が上皮組織の形態形成
を制御するメカニズムの解明に興味がもたれている。し
かしながら、上皮組織の形態形成の制御に関与する物質
群は複雑な系の中で時間的及び空間的な制御を受けて発
現されており、それらの物質を単離して機能を解析する
ことは極めて困難であること、また、上皮組織の形態形
成を単純化したモデル実験系の構築も難しいことなどの
理由から、この分野の研究には今日まで大きな進展が見
られていない。上皮組織の形態形成に起因する疾患の発
症機序の解明やそれらの疾患の治療方法の確立などのた
めに、上皮組織における形態形成の制御メカニズムの解
析が切望されていた。

【０００３】このような状況下にあって、上皮組織の形
態形成の制御に関与するエピモルフィン (epimorphin)
が分離・精製された（特開平6-25295 号公報）。この物
質は277 ないし 289個のアミノ酸からなる蛋白質をコア
・蛋白質とする生理活性物質であり、主として間充織細
胞により生合成されていることが明らかにされた。ま
た、エピモルフィンは、上皮細胞に作用して上皮組織の
形態形成を促進する作用を有していること、並びにエピ
モルフィンが機能しない場合には正常な組織形成が行わ
れないことも明らかにされた。

【０００４】エピモルフィンの構造については、エピモ
ルフィン分子が構造上大きく４個のフラグメントに分け
られることが見いだされている（欧州特許公開第069866
6 号）。すなわち、エピモルフィンの全長を構成するポ
リペプチドは、Ｎ末端側より、コイルドコイル領域
(1)、機能ドメイン(2)、コイルドコイル領域(3)、及び
Ｃ末端の疎水性領域に分けることができる。これらのフ
ラグメントのうち、機能ドメイン（ヒト・エピモルフィ
ンではＮ末端より104 番目から187 番目のアミノ酸によ
り特定される領域）については、この領域が細胞接着に
関与しており、エピモルフィンの生理活性の発現に密接
にかかわっていることが示唆されている（上掲欧州特許
公開）。

【０００５】エピモルフィンが正常な形態形成を促進す
る作用を有することから、この物質は、形態形成の異常
に起因する疾患などの予防や治療のための医薬や、又は
育毛剤などの医薬の有効成分として有用であることが期
待される。しかしながら、哺乳類動物から得られた天然
型エピモルフィンは生理食塩水などの水性媒体に難溶で
あり、医薬として実用に供することが困難であった。こ
のため、天然型エピモルフィンの形態形成促進作用を実
質的に保持しつつ、溶解性に優れたエピモルフィン誘導
体を創製する試みがなされている。例えば、Ｃ末端部の
疎水性領域を除去した改変体（フラグメント123）など
が知られている（特開平6-25295 号公報）。エピモルフ
ィンの部分構造を有するポリペプチドが上皮細胞に作用
して上皮組織の形態形成を促進することが知られている
（国際公開WO98/22505号）。このポリペプチドは生理食
塩水などの水性媒体に溶解可能なポリペプチドであり、
上記刊行物には、該ポリペプチドが毛成長促進作用を有
することが教示されている。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、毛成
長促進作用を有するオリゴペプチドを提供することにあ
る。また、本発明の別の課題は、上記のオリゴペプチド
を有効成分として含む医薬を提供することにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者は上記の課題を
解決すべく鋭意努力した結果、エピモルフィンの部分構
造であるオリゴペプチドのアミノ酸残基の位置を改変し
たオリゴペプチドが、優れた毛成長促進作用を有してい
ることを見出し、本発明を完成するに至った。

【０００８】すなわち本発明によれば、以下の（１）か
ら（３）の何れかに記載のオリゴペプチドが提供され
る。（１）下記のアミノ酸配列(I)、（II）又は（III）を含
む８から２０アミノ酸残基から成るオリゴペプチドであ
って、毛成長促進作用を有するオリゴペプチド： Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp-Gln （I） Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp-Gln （II） Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp-Gln （III）（２）上記のアミノ酸配列(I)、（II）又は（III）にお
いて１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入
されたアミノ酸配列を含む８から２０アミノ酸残基から
成るオリゴペプチドであって、上記（１）に記載のオリ
ゴペプチドと同様の毛成長促進作用を有するオリゴペプ
チド；（３）上記の（１）又は（２）に記載のオリゴペプチド
の修飾オリゴペプチドであって、上記の（１）又は
（２）のオリゴペプチドと同様の毛成長促進作用を有す
る修飾オリゴペプチド：

【０００９】本発明の一態様によれば、上記のオリゴペ
プチドを架橋することにより得られるホモ二量体又はヘ
テロ二量体オリゴペプチドが提供され、より具体的に
は、上記のオリゴペプチドを架橋剤を用いて架橋するこ
とにより得られる、ホモ二量体又はヘテロ二量体オリゴ
ペプチドが提供される。

【００１０】本発明の別の側面によれば、上記の何れか
のオリゴペプチド又は生理学的に許容されるそれらの塩
を有効成分として含む医薬（例えば、毛成長促進剤）が
提供される。

【００１１】本発明の別の側面によれば、上記のいずれ
かのオリゴペプチド又は生理学的に許容されるその塩を
有効成分として含む医薬が提供される。本発明の医薬
は、例えば、哺乳類動物に対して毛成長促進剤として用
いることができる。

【００１２】本発明のさらに別の側面によれば、上記の
医薬（例えば、毛成長促進剤）の製造のための上記のオ
リゴペプチド又は生理学的に許容されるその塩の使用；
及び毛の成長促進方法であって、上記のオリゴペプチド
又は生理学的に許容されるその塩の有効量をヒトを含む
哺乳類動物に投与する工程を含む方法が提供される。

【００１３】

【発明の実施の形態】以下、本発明の実施の形態につい
て詳細に説明する。本発明のオリゴペプチドの第1の実
施態様は、下記のアミノ酸配列(I)、（II）又は（III）
を含む８から２０アミノ酸残基から成るオリゴペプチド
であって、毛成長促進作用を有するオリゴペプチドであ
る。 Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp-Gln （I）（配列番号１） Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp-Gln （II）（配列番号２） Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp-Gln （III）（配列番号３）

【００１４】上記のアミノ酸配列(I)、（II）又は（II
I）は、国際公開WO98/22505号に開示されたポリペプチ
ド(II)のC-末端から１１個のアミノ酸残基において、N-
末端から１個のアミノ酸残基（Lys）およびC-末端から
２個のアミノ酸残基（Asp-Glu）を除き、さらにシステ
イン残基（Cys）の位置を変更したアミノ酸配列であ
る。上記のアミノ酸配列(I)、（II）又は（III）を含む
オリゴペプチドは、下記の実施例に具体的に示すように
毛成長促進作用を有している。

【００１５】本発明のオリゴペプチドはアミノ酸配列
(I)、（II）又は（III）を含む８から２０アミノ酸残基
から成るオリゴペプチドであり、アミノ酸残基の数は、
毛成長促進作用を示す限り、８から２０の範囲内の任意
の数とすることができる。アミノ酸残基の数は好ましく
は８から１５であり、より好ましくは８から１２であ
り、特に好ましくは８から１０の範囲内である。

【００１６】本発明のオリゴペプチドの第２の態様は、
上記のアミノ酸配列(I)、（II）又は（III）において１
〜数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入された
アミノ酸配列を含む８から２０アミノ酸残基から成るオ
リゴペプチドであって、上記に記載の本発明のオリゴペ
プチドと同様の毛成長促進作用を有するオリゴペプチド
である（以下、このオリゴペプチドを「本発明の改変オ
リゴペプチド」と呼ぶ場合がある。）。

【００１７】本発明のオリゴペプチドの第３の態様は、
上記のアミノ酸配列(I)、（II）又は（III）を含む８か
ら２０アミノ酸残基から成るオリゴペプチドであって、
毛成長促進作用を有するオリゴペプチド、又は上記した
本発明の改変オリゴペプチドの修飾オリゴペプチドであ
って、上記した本発明のオリゴペプチド又は改変オリゴ
ペプチドと同様の毛成長促進作用を有する修飾オリゴペ
プチドである。

【００１８】上記の改変オリゴペプチド又は修飾オリゴ
ペプチドが、上記のアミノ酸配列(Ｉ)、（II）又は（II
I）を含む８から２０アミノ酸残基から成るオリゴペプ
チドと同様の毛成長促進作用を有することは、本明細書
の実施例に詳細かつ具体的に記載した試験方法によっ
て、又は上記試験方法に適宜の改変や修飾を加えること
により、当業者が容易に確認可能である。

【００１９】上記改変オリゴペプチドにおいて、挿入又
は置換されるアミノ酸の種類は特に限定されないが、Ｌ
-アミノ酸であることが好ましい。挿入又は置換される
アミノ酸の個数及び位置も特に限定されないが、システ
イン残基は置換されないことが好ましい。例えば、挿入
されるアミノ酸の個数は１〜5個、好ましくは1〜3個、
より好ましくは1〜2個である。N-末端又はC-末端に１〜
数個、好ましくは1〜5個、より好ましくは1〜3個程度の
アミノ酸が付加されていてもよい。また、置換されるア
ミノ酸の個数は好ましくは１〜5個、より好ましくは1〜
3個、特に好ましくは1〜2個である。

【００２０】あるアミノ酸を別のアミノ酸で置換して得
られる改変オリゴペプチドが置換前のオリゴペプチドと
同様の毛成長促進作用を有するためには、置換されるア
ミノ酸同士は互いに類似した性質を有するアミノ酸であ
ることが好ましい場合がある。具体的には、上記のアミ
ノ酸配列(I)、（II）又は（III）においては、Cys残基
以外のSer（２箇所）、Ile、Glu、Gln（２箇所）、及び
Aspの５種（合計7箇所）のアミノ酸残基が置換の対象と
なりうる。このうち、Ser（セリン）は、ヒドロキシア
ミノ酸に属するThr（トレオニン）に置換することが可
能であり、Ile（イソロイシン）は、脂肪族アミノ酸で
あるGly（グリシン）、Ala（アラニン）、Val（バリ
ン）またはLeu（ロイシン）に置換することが可能であ
り、Glu（グルタミン酸）は、酸性アミノ酸であるAsp
(アスパラギン酸)に置換することが可能であり、Gln
（グルタミン）は、アミドであるAsn（アスパラギン）
に置換することが可能であり、そしてAsp（アスパラギ
ン酸）は、酸性アミノ酸であるGlu（グルタミン酸）に
置換することが可能である。但し、これらは置換の好ま
しい具体例を例示したものにすぎず、毛成長促進作用を
維持する限りは他のアミノ酸で置換することも可能であ
る。

【００２１】上記の修飾オリゴペプチドにおいて、「修
飾」という用語は、化学的修飾及び生物学的修飾を含め
て最も広義に解釈しなければならない。修飾の例として
は、例えば、アルキル化、エステル化、ハロゲン化、又
はアミノ化などの官能基導入、酸化、還元、付加、又は
脱離などによる官能基変換、糖化合物（単糖、二糖、オ
リゴ糖、若しくは多糖）又は脂質化合物などの導入、リ
ン酸化、あるいはビオチン化などを挙げることができる
が、これらに限定されることはない。好ましい修飾オリ
ゴペプチドとしては、ビオチン化されたオリゴペプチド
を挙げることができ、より好ましくは修飾オリゴペプチ
ドとして、スペーサを介して又はスペーサーを介さずに
ビオチンがN-末端に結合したオリゴペプチドを挙げるこ
とができる。上記の修飾オリゴペプチドにおいて、ビオ
チンには所望の生理活性を損なわない限りにおいて適宜
の化学的修飾が施されていてもよい。ビオチン化された
オリゴペプチドの製造方法は、本明細書の実施例に具体
的に示されている。適宜の長さのスペーサーを介してビ
オチンをオリゴペプチドのN-末端に導入するためには、
例えば、NHS-Biotin又はNHS-LC-Biotin(いずれピアース
社から入手できる)などを用いることができる。

【００２２】また、別の好ましい修飾オリゴペプチドと
しては、オリゴペプチド中のシステイン残基のスルフヒ
ドリル基により二量化したオリゴペプチドを挙げること
ができる。二量化したオリゴペプチドとしては、同一の
オリゴペプチドを架橋することにより得られるホモ二量
体オリゴペプチドでもよいし、異なる２種類のオリゴペ
プチドを架橋することにより得られるヘテロ二量体オリ
ゴペプチドでもよい。本発明のホモ二量体又はヘテロ二
量体オリゴペプチドは、上記した本発明の何れかのオリ
ゴペプチド（改変オリゴペプチドや修飾オリゴペプチド
を含む）を架橋剤を用いて架橋することにより得ること
ができる。

【００２３】本発明で用いる架橋剤として好ましくは、
オリゴペプチド中のシステイン残基のスルフヒドリル基
を活性化して、他のオリゴペプチド中のシステイン残基
のスルフヒドリル基と共有結合を形成することができ
る、二官能性架橋剤を挙げることができる。

【００２４】本発明で用いることができる二官能性架橋
剤の具体例としては、ビスマレイミド化合物が挙げら
れ、例えば、水酸基などの置換基を有していてもよい低
級アルキル基（例えば、炭素数１から１０、より好まし
くは炭素数１から８のアルキル基）の両末端にマレイミ
ド基のＮ原子が結合している化合物を挙げることができ
る。ビスマレイミド化合物の具体例としては、１，４−
ビスマレイミジル−２，３−ジヒドロキシブタン、１，
６−ビスマレイミドヘキサン、ビスマレイミドエタン、
及び１，４−ビスマレイミドブタンなどが挙げられる。

【００２５】さらに、上記した本発明の何れかのオリゴ
ペプチド（改変オリゴペプチドや修飾オリゴペプチドを
含む）中のシステイン残基に架橋剤が結合している、単
量体オリゴペプチドも本発明の範囲内である。

【００２６】さらに、上記オリゴペプチドの二量体のみ
ならず、三量体以上の多量体も本発明の範囲に包含され
る。例えば、S-S結合により二量化したオリゴペプチド
がさらに別のオリゴペプチドとS-S結合などにより架橋
することにより形成した三量体以上の多量体も本発明の
範囲に包含される。

【００２７】上記した各種のオリゴペプチド（改変オリ
ゴペプチドや修飾オリゴペプチドも含む）は遊離形態で
あってもよいが、酸付加塩又は塩基付加塩として提供さ
れてもよい。酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸
塩、硝酸塩、リン酸塩などの鉱酸塩；又は、p-トルエン
スルホン酸塩、メタンスルホン酸塩、クエン酸塩、蓚酸
塩、マレイン酸塩、酒石酸塩などの有機酸塩を挙げるこ
とができる。塩基付加塩としては、例えば、ナトリウム
塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などの
金属塩；アンモニウム塩；メチルアンモニウム塩、トリ
エチルアンモニウム塩などの有機アンモニウム塩を挙げ
ることができる。グリシンなどのアミノ酸と塩を形成す
る場合もあり、また、分子内で対イオンを形成すること
もある。

【００２８】さらに、これらのオリゴペプチド又はその
塩は、水和物又は溶媒和物として存在する場合がある。
上記オリゴペプチドは複数の不斉炭素を有している。各
不斉炭素の立体は特に限定されないが、アミノ酸残基は
L-アミノ酸であることが望ましい。これらの不斉炭素に
基づく光学活性体、ジアステレオ異性体などの立体異性
体、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体などはいずれ
も本発明の範囲に包含される。

【００２９】本発明のオリゴペプチドは、ペプチド合成
に通常用いられる固相法および液相法などの化学的手法
により合成することができる。ペプチド合成におけるア
ミノ基等の保護基および縮合反応の縮合剤については種
々の成書があり、それらを参照することができる。固相
法では市販の各種ペプチド合成装置を利用することがで
きる。必要に応じて、官能基の保護及び脱保護を行うこ
とにより効率的に合成を行うことができる。保護基の導
入及び脱離方法については、例えば、プロテクティブ・
グループス・イン・オーガニック・シンセシス（Protec
tive Groups inOrganic Synthesis）、グリーン（T. W.
Greene）著、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ・イ
ンコーポレイテッド（John Wiley & Sons, Inc.）（198
1年）などを参照することができる。また、通常の遺伝
子発現操作等の生物学的手法に従って、上記オリゴペプ
チドをコードするDNA 配列を含む組み換えベクターを製
造した後、該ベクターにより形質転換された微生物（形
質転換体）を調製し、該形質転換体を培養した培養物か
ら所望のオリゴペプチドを分離・精製することができ
る。もっとも、上記オリゴペプチドの製造方法はこれら
の化学的方法及び生物学的方法に限定されることはな
い。また、化学的修飾又は生物学的修飾などを含めて修
飾オリゴペプチドの製造方法は当業者に周知されてお
り、いかなる方法を用いてもよい。

【００３０】本発明のオリゴペプチドは、医薬の有効成
分として有用である。本明細書における医薬という用語
は、ヒトを含む哺乳類の病気の予防又は治療のほか、医
薬部外品として分類される場合がある毛成長促進剤など
を含めて最も広義に用いる。

【００３１】本発明の医薬の投与対象、薬効、並びに本
発明の医薬による治療の対象疾患の具体例を以下に列挙
する。（１）本発明のオリゴペプチドは、血管再生作用、再生
促進作用、心臓血管再生作用、血管内皮細胞誘導作用な
どを示し、慢性閉塞性動脈硬化症、バージャー病、重症
狭心症、動脈硬化症などの治療及び予防に有用である
（Exp Cell Res 1996 Jan 10, 222(1):189-98）（２）本発明のオリゴペプチドは、膵臓上皮の形態形成
に関与し、糖尿病などの治療および予防に有用である
（J Cell Biol 2001, Mar 5;152(5):911-22）。

【００３２】（３）本発明のオリゴペプチドは、肝臓の
形成（再生）に関与し、肝代謝障害の治療および予防に
有用である（Biochem Biophys Res Commun 1998 Sep 1
8; 250(2):486-90）。（４）本発明のオリゴペプチドは、骨や歯の形成に関与
し、歯周病、骨折、骨腫瘍、骨欠損、骨粗しょう症の治
療および予防に有用である（Arch Oral Biol 1995 Feb;
40(2):161-4）。

【００３３】（５）本発明のオリゴペプチドは、肺分岐
の形態形成や肺線維症に関与し、肺疾患の治療および予
防に有用である（Biochem Biophys Res Commun 1997 Ma
y 19;234(2):522-5；及びAm J Respir Cell Mol Biol 2
000 Aug;23(2):168-74）。（６）本発明のオリゴペプチドは、腸ひだの形成に関与
し、腸疾患の治療および予防に有用である（Am J Physi
ol 1998 Jul; 275(1 Pt1):G114-24）。

【００３４】（７）本発明のオリゴペプチドは、筋肉の
構造に維持に関与し、例えば、筋ジストロフィー症の治
療および予防に有用である（Histochem J 1998 Dec;30
(12):903-8）。（８）本発明のオリゴペプチドは、胆嚢上皮の形成に関
与し、胆嚢疾患の治療および予防に有用である（Cell T
issue Res 2000 May; 300(2):331-44）（９）本発明のオリゴペプチドは、乳上皮の形態形成に
関与し、乳疾患の治療および予防に有用である（J Cell
Biol 2001 May 14; 153(4):785-94）

【００３５】これらの中でも最も好ましくは、毛成長促
進剤として使用することができる。本明細書において用
いられる「毛成長促進剤」という用語は、育毛促進、発
毛促進、及び脱毛予防などを含めて最も広義に解釈すべ
きであり、いかなる意味においても限定的に解釈しては
ならない。

【００３６】本発明の医薬としては、上記のオリゴペプ
チド又は生理学的に許容されるその塩から選ばれる１又
は２種以上の物質をそのまま用いてもよいが、通常は、
製剤学的に許容しうる１又は２種以上の製剤用添加物を
用いて上記物質の１又は２種以上を有効成分として含む
医薬組成物を製造して投与することが好ましい。上記の
オリゴペプチドの１種又は２種以上を有効成分として含
む毛成長促進剤は、クリーム剤、噴霧剤、塗布用の溶液
剤、又は貼付剤などとして外用剤として適用できるが、
注射剤として患部に直接投与してもよく、毛成長促進剤
としての使用目的に好適な形態の製剤として提供するこ
とが可能である。

【００３７】例えば、シャンプーやリンスに有効成分で
ある上記のオリゴペプチドを配合してもよく、上記のオ
リゴペプチドをリポソームなどに封入して製剤を調製し
てもよい。このような形態の組成物も本発明の医薬に包
含される。皮膚のケラチン層を通して有効成分であるオ
リゴペプチドを効率的に経皮吸収させるために、適宜の
界面活性剤や脂溶性物質などをクリーム剤などに配合す
ることも好適である。上記の毛成長促進剤の投与量は使
用目的、製剤形態、有効成分の種類などに応じて適宜選
択可能であるが、例えば、本明細書の実施例に具体的に
示した投与量を参考にして選択することが可能である。

【００３８】

【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明するが、本発明の範囲は以下の実施例に限定される
ことはない。実施例１：各種オリゴペプチドの作製下記のアミノ酸配列で表されるオリゴペプチド（Ａ）、
（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ）をFmocを用いた固相法により
合成した。 Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp-Gln-Asp-Glu （Ａ）（配列番号４） Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp-Gln-Asp-Glu （Ｂ）（配列番号５） Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp-Gln-Asp-Glu （Ｃ）（配列番号６） Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp-Gln （Ｄ）（配列番号２）

【００３９】次に、合成したオリゴペプチドを架橋剤
（ビスマレイミドヘキサン、品名ＢＭＨ、ピアス社製）
を用いて二量化してホモ二量体を作成した。具体的に
は、同架橋剤の使用説明書に従った。

【００４０】得られた反応混合物中には、ホモ二量体オ
リゴペプチドだけではなく、架橋剤が結合した単量体オ
リゴペプチドも含まれている。

【００４１】また、上記と同様にして、オリゴペプチド
（I）及び（II）を等量で用いてヘテロ二量体オリゴペ
プチドを作製した。なお、得られた反応混合物中には、
ヘテロ二量体オリゴペプチドだけではなく、架橋剤が結
合した単量体オリゴペプチドも含まれている。

【００４２】合成した各オリゴペプチド（Ａ）、（Ｂ）
及び（Ｃ）は高速液体クロマトグラフィー(HPLC)により
精製し、HPLC及びMassによって純度が90%以上であるこ
とを確認した。HPLCの条件は以下のとおりである。カラム：ODS-UG3（モノメリックODS、野村化学製）内径
1.0 mm、全長100 mm 測定：室温(25℃) 検出：UV 214 nm、280 nm 溶出溶媒：溶媒Ａ及び溶媒Ｂのグラジエント（溶媒A：
0.1% トリフルオロ酢酸；溶媒B：90%アセトニトリル/0.
1% トリフルオロ酢酸、5分後（溶媒B：0%）から55分
（溶媒B：55%）の直線濃度勾配）流速：75 ml/ml リテンションタイム pep7: 21.52分(dimer), 20.59分(monomer)

【００４３】実施例２：新生毛包に特異的なモノクロー
ナル抗体の作製Ｂ５７ＢＬマウスの成長期（４８から５０日目）の皮膚
から毛を切り取り、８M尿素、２％ＳＤＳ、１００ｍＭ
のＤＴＴを含むＰＢＳ中で３７℃で一晩インキュベート
し、タンパク質を抽出した。また、Ｂ５７ＢＬマウスの
ヒゲの毛包（毛球部に色素がついているもの；成長期）
を実体顕微鏡で採取し、ＰＢＳ中にホモジナイズした。
上記2種類の試料（タンパク質量として０．５ｍｇ）を
混合し、等量のコンプリートアジュバンドと混合してミ
セルを作製した。上記で得たミセル（０．２ｍｇ）をラ
ット（Wister）の皮下（３箇所）に分けて投与して免疫
した。初回免疫の１ヵ月後に上記と同様に追加免疫を行
なった。さらに2週間後に上記と同様に２回目の追加免
疫を行なった。２回目の追加免疫の３日後に、免疫ラッ
トから脾臓を取り出し、メッシュにて血球成分を回収し
た。この血球成分の中には抗体産生細胞が含まれてい
る。上記で回収した血球成分（全量）とマウスミエロー
マP３Ｕ１とをポリエチレングリコール１５００を用い
て混合し、ダルベッコ／ハムF１２混合培地中に懸濁
し、９６ウエルプレートに各ウエル１００μｌずつ播い
た。翌日、等量（１００μｌ）のＨＡＴ培地（シグマ
社）を各ウエルに添加した。２日後に各ウエルから１５
０μｌずつを吸引廃棄し、１５０μｌの新培地を各ウエ
ルに添加した。９６ウエルプレートを３７℃のＣＯ₂イ
ンキュベーター内に静置した。

【００４４】成長期のＢ５７ＢＬマウスのヒゲの毛包を
８Ｍ尿素中に超音波粉砕機を用いて溶解した。この溶液
にニトロセルロースメンブレンを５分間浸し、ＰＢＳで
十分に洗浄したものをBioradドットブロッターに装着し
たものを用いて、上記の９６ウエルプレートの各ウエル
から回収したハイブリドーマ上清を一次スクリーニング
した。先ず、上記で作製したニトロセルロースメンブレ
ンを５％スキムミルクを溶解したトリスバッファー（Ｔ
ＢＳＴ）でブロッキングした後、当該ニトロセルロース
メンブレンを底とする各ウエルにハイブリドーマ上清１
００μｌを添加した。１時間インキュベートした後、ト
リスバッファーで洗浄し、二次抗体であるホースラディ
ッシュパーオキシダーゼ標識抗ラットＩｇＧ（１μｇ／
ｍｌＴＢＳＴ）を添加した。発色基質であるＥＣＬ試薬
（アマシャムファルマシア社製）を添加して、発色の有
無により成長期のヒゲの毛包と反応する抗体（全部で５
０種類）を選出した（一次スクリーニング）。

【００４５】上記の一次スクリーニングで選出した抗体
（５０種類）について、成長期ヒゲ毛包の凍結切片（１
０μｍ）を用いて特異的に反応にするものを選出した
（二次スクリーニング）。具体的には、スライドガラス
上に成長期ヒゲ毛包の凍結切片を置き、一次スクリーニ
ングで選出されたハイブリドーマ上清を添加し、二次抗
体で発色させた。具体的には、クライオスダト（ブライ
ト社）で作成した成長期ヒゲ毛包の凍結切片を−２０℃
メタノールで処理し、ＴＢＳＴで１時間ブロッキングを
行った後、ハイブリドーマ上清を１時間反応させた。ト
リスバッファーで洗浄後、ＦＩＴＣ標識抗ラットＩｇＧ
（ＴＢＳＴに１００μｇ／ｍｌで溶解したもの）を反応
させた。トリスバッファーで洗浄後、カバーガラスをか
けて、蛍光顕微鏡にて観察を行った。

【００４６】二次スクリーニングの結果、全部で８種類
の抗体を選出した。これらの抗体は表皮とは反応せず、
毛包に特異的に反応するものであった。これら８種類の
抗体を限界希釈法でクローニングした。

【００４７】これら８種類の抗体について、成長期ヒゲ
毛包又は休止期ヒゲ毛包をサンプルとしたウエスタンブ
ロットで反応性を調べ、さらに毛包が形成されている１
４日齢マウス胎児皮膚の切片試料を用いて反応性を調べ
た。その結果、成長期ヒゲ毛包及び形成途中毛包（新生
毛包）と特異的に反応し、休止期ヒゲ毛包とは反応しな
いモノクローナル抗体としてｍＡｂ２７を取得した。モ
ノクローナル抗体ｍＡｂ２７を産生するハイブリドーマ
は、受託番号ＦＥＲＭＰ−１８５７８として平成１３
年１１月２日付けで独立行政法人産業技術総合研究所
特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東一丁目
１番地１中央第６）に寄託されている。

【００４８】実施例３：各種オリゴペプチドの毛成長促
進作用の評価１２日目のＩＣＲマウス胎児の上アゴ皮膚組織を実体顕
微鏡で採取し、左と右に分けて５頭分を回収した。回収
した５頭分の皮膚を左（コントロール用）と右（被験オ
リゴペプチド用）を別々に５個ずつ一枚のヌクレポアメ
ンブレン（孔径８μｍ、直径１３ｍｍ）の上に載せ、実
体顕微鏡で観察して外側が上になるようにした。１％Ｂ
ＳＡを含むダルベッコＭＥＭ／ハムＦ１２培地５００μ
ｌを２４ウエルディッシュの２ウエルに添加し、片方に
は被験オリゴペプチド溶液（溶媒はＰＢＳ）を最終濃度
２０μＭとなるように添加し、他方には溶媒（ＰＢＳ）
を対照として同量入れた。被験オリゴペプチドとして
は、実施例１で作製したものを使用した。

【００４９】皮膚組織を載せたメンブレン１枚ずつを上
記のウエル中の溶液に浮かべ、３７℃で６日間培養し
た。メンブレンから５個の組織片をＳＤＳサンプルバッ
ファ（ＳＤＳ０．０２ｇ／ｍｌ、グリセロール０．
２ｇ／ｍｌ、ｐＨ６．８）１００μｌ中に回収し、超音
波粉砕器により溶解した。対照も同様に処理した。上記
処理で得た溶液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（アクリルアミド４
〜２０％）にて電気泳動後（３５ｍＡ、１．５時間）、
ＰＶＤＦ膜にトランスファーし、５％スキムミルクを含
むトリス緩衝液（ＴＢＳＴ）中で１時間インキュベート
した。実施例２で取得したｍＡｂ２７（ＴＢＳＴ中１０
μｇ／ｍｌ）と１時間反応後、ＴＢＳにて十分に洗浄
し、ペルオキシダーゼ標識抗ラットＩｇＧ（アマシャム
社）をＴＢＳＴで１／１０００に希釈したものを二次抗
体として反応させ、十分に洗浄後、ＥＣＬキット（アマ
シャム社）を用いてｍＡｂ２７の反応の強さを調べた。

【００５０】得られた結果を図１及び図２に示す。図１
における各レーンの被験オリゴペプチドは以下の通りで
ある。左から１番目：Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp-Gln-Asp-
Glu （Ａ）左から２番目：対照左から３番目：Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp-Gln-Asp-
Glu （Ｂ）左から４番目：対照左から５番目：Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp-Gln-Asp-
Glu （Ｃ）左から６番目：対照図１の結果から分かるように、左から１番目、３番目及
び５番目のレーンのバンドはそれぞれ左から２番目、４
番目及び６番目のレーンのバンドよりも濃かった。これ
らの結果は、被験したオリゴペプチド（Ａ）、（B）及
び（Ｃ）は発毛活性を有することを実証するものであ
る。

【００５１】図２における各レーンの被験オリゴペプチ
ドは以下の通りである。左から１番目：オリゴペプチド（Ａ）とオリゴペプチド
（Ｂ）を処理後に混合したもの左から２番目：対照左から３番目：オリゴペプチド（Ａ）とオリゴペプチド
（Ｂ）を混合後に処理したもの左から４番目：対照左から５番目：Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp-Gln
（Ｄ）左から６番目：対照図２の結果から分かるように、オリゴペプチド（Ａ）と
オリゴペプチド（Ｂ）を処理後に混合したものも、処理
後に混合したものと同様の発毛活性が認められた。従っ
て、ヘテロ二量体オリゴペプチドも発毛活性を有するこ
とが実証された。また、Ｃ末端側の２アミノ酸を削除し
たオリゴペプチド（Ｄ）にも発毛活性が認められた。

【００５２】

【発明の効果】本発明のオリゴペプチドは毛成長促進作
用を有しており、毛成長促進剤などの医薬の有効成分と
して有用である。

【００５３】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Sumitomo Electric Industries,Ltd. <120> Oligopeptide <130> A11473MA <160> 6

【００５４】 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 1 Ser Ile Glu Gln Cys Ser Asp Gln 1 5

【００５５】 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 2 Ser Ile Glu Cys Gln Ser Asp Gln 1 5

【００５６】 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 3 Ser Ile Cys Glu Gln Ser Asp Gln 1 5

【００５７】 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 4 Ser Ile Glu Gln Cys Ser Asp Gln Asp Glu 1 5 10

【００５８】 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 5 Ser Ile Glu Cys Gln Ser Asp Gln Asp Glu 1 5 10

【００５９】 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 6 Ser Ile Cys Glu Gln Ser Asp Gln Asp Glu 1 5 10

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ホモ二量体オリゴペプチドを用いた発
毛活性検定の結果を示す。

【図２】図２は、ヘテロ二量体オリゴペプチド及びホモ
二量体オリゴペプチドを用いた発毛活性検定の結果を示
す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者栃木慶子神奈川県横浜市栄区田谷町１番地住友電気工業株式会社横浜製作所内 (72)発明者平井洋平神奈川県横浜市栄区田谷町１番地住友電気工業株式会社横浜製作所内Ｆターム(参考） 4C084 AA02 AA07 BA01 BA08 BA17 BA18 BA23 BA31 CA18 DB53 DC50 NA14 ZA921 ZC412 4H045 AA10 AA30 BA15 BA16 BA17 CA40 DA00 EA20 FA33

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】以下の（１）から（３）の何れかに記載
のオリゴペプチド。（１）下記のアミノ酸配列(I)、（II）又は（III）を含
む８から２０アミノ酸残基から成るオリゴペプチドであ
って、毛成長促進作用を有するオリゴペプチド： Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp-Gln （I） Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp-Gln （II） Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp-Gln （III）（２）上記のアミノ酸配列(I)、（II）又は（III）にお
いて１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入
されたアミノ酸配列を含む８から２０アミノ酸残基から
成るオリゴペプチドであって、上記（１）に記載のオリ
ゴペプチドと同様の毛成長促進作用を有するオリゴペプ
チド；（３）上記の（１）又は（２）に記載のオリゴペプチド
の修飾オリゴペプチドであって、上記の（１）又は
（２）のオリゴペプチドと同様の毛成長促進作用を有す
る修飾オリゴペプチド：
【請求項２】請求項１に記載のオリゴペプチドを架橋
することにより得られるホモ二量体又はヘテロ二量体オ
リゴペプチド。
【請求項３】請求項１に記載のオリゴペプチドを架橋
剤を用いて架橋することにより得られる、請求項２に記
載のホモ二量体又はヘテロ二量体オリゴペプチド。
【請求項４】請求項１から３のいずれかに記載のオリ
ゴペプチド又は生理学的に許容されるそれらの塩を有効
成分として含む医薬。
【請求項５】毛成長促進剤である、請求項４に記載の
医薬。