MXPA05000277A

MXPA05000277A - Configuraciones de antigenos moleculares de usan una particula tipo virus derivada de la proteina de recurimiento ap205.

Info

Publication number: MXPA05000277A
Application number: MXPA05000277A
Authority: MX
Inventors: Regina Renhofa
Original assignee: Cytos Biotechnology Ag
Priority date: 2002-07-17
Filing date: 2003-07-14
Publication date: 2005-03-31
Also published as: HK1078880A1; WO2004007538A2; EP1532167B1; BR0312935A; ZA200410046B; ATE542828T1; CA2489410A1; US20040076611A1; RU2007144895A; US20070128219A1; US7138252B2; RU2005104235A; EP2351770A1; CN1668637B; CN102061288A; CN1668637A; AU2003246690B2; US7494656B2; JP4726483B2; WO2004007538A3

Abstract

La presente invencion proporciona una composicion que comprende una particula de tipo virus AP205 (VLP) y un antigeno. La invencion tambien proporciona un proceso para la produccion de un antigeno o determinante antigeno enlazado a la VLP AP205. La VLP AP205 enlazada a un antigeno, es util en la produccion de composiciones para inducir respuestas inmunes que son utiles para la prevencion o tratamiento de enfermedades, trastornos o condiciones que incluyen enfermedades infecciosas alergicas, cancer, adiccion a farmacos, envenenamiento y a inducir eficientemente las respuestas inmunes auto-especificas, en particular las respuestas de anticuerpos.

Description

CONFIGURACIONES DE ANTIGENOS MOLECULARES QUE USAN UNA PARTICULA TIPO VIRUS DERIVADA DE LA PROTEINA DE RECUBRIMIENTO AP205 Campo de la Invención La presente invención está en los campos de medicina, inmunología, virología y biología molecular.

Antecedentes de la Invención La vacunación ha proporcionado una de las vías más efectivas para luchar contra enfermedades infecciosas y ha llevado a los beneficios más importantes para salud pública en el último siglo. Las estrategias de vacunación recientes usan patógenos vivos atenuados o inactivados como el inmunógeno . Las preocupaciones de seguridad dentro del público y las autoridades ha fomentado una búsqueda para vacunas más definidas y seguras. Esta búsqueda estimula una nueva dirección de investigación, donde los antígenos individuales se aislan o expresan recombinantemente y se inyectan como inmunógenos. Los ejemplos de estos incluyen el desarrollo y uso de vacunas de subunidad. Tales vacunas, sin embargo, requieren frecuentemente la adición de un adyuvante para generar una respuesta inmune suficiente contra el antígeno, ya que una proteina aislada típicamente no es suficientemente Ref . :160767 inmunologica para generar una respuesta inmune protectora. No obstante que se conocen varios adyuvantes fuertes, tal como el adyuvante de Freund completo, son generalmente tóxicos y no pueden usarse en humanos . Se hacen por lo tanto grandes esfuerzos en la búsqueda de nuevos adyuvantes. Recientemente, la investigación en los principios de discriminación por el sistema inmune entre éste y los externos, ha revelado que el grado de organización y la repetibilidad de los antígenos en las superficies de virus son una señal muy fuerte para que un antígeno se reconozca como externo (Bachmann & Zinkernagel Immunol . Today 17:553-558 (1996) ) . Se hizo uso de esta propiedad de estructuras virales en el diseño de nuevas vacunas con base en partículas tipo virus (VLP, popr sus siglas en inglés) , que combinan la inmunogenicidad de estructuras virales y el perfil de seguridad mejorada de vacunas no replicables. En aquellas vacunas, el antígeno ya sea se fusiona o se une a las partículas tipo virus, en un enlace químico que es covalente o no covalente. De esta manera, la propiedad inmunogénica de la estructura viral se transfiere al antígeno al enlazar el antígeno a partículas tipo virus. Se han usado una variedad de VLPs para el enlace de los antígenos. Por ejemplo, WO 00/32227 describe el uso de un antígeno de núcleo de hepatitis B en la producción de ciertos tipos de vacuna.

Una nueva clase de VLPs altamente expresables y altamente inmunogénicos se ha descrito en WO 03/056905 que se incorpora en la presente como referencia para su totalidad. Estos VLPs se componen de la proteína recubierta de bacteriófagos de ARN. Las proteínas recubiertas se expresan recombinantemente en la bacteria, y la VLP no contiene el genoma de ARN fago y por lo tanto no se replica. Un nuevo bacteriófago de ARN AP205, se ha identificado recientemente ( lovins, J., et al., J. Gen Virol 83: 1523-33 (2002)). El fago de ARN AP205 (Taxono y ID:154784) es un virus de ARN de hebra positiva, de hebra sencilla (no en etapa de ARN) que pertenece a la familia Leviviridae, género Levivirus, subgrupo Levivirus no clasificados. Los otros miembros de este subgrupo son fagos de ARN B01, frl, T 19 y PP7. Dos subgrupos de Levivirus descritos incluyen los siguientes fagos de ARN: fr, JP501, f2, 12 , MS2 y R17 (subgrupo I) y BZ13, JP34, TH1 , GA, y U1 (subgrupo II). El genoma AP205 es de 4267 nucleótidos (nt) en longitud. La secuencia genómica de longitud completa: acceso AF334111, NC_002700. El hospedador natural del fago AP205 es Acinetobacter spp. (Klovins, J. , et al., J. Gen Virol 83: 1523-33 (2002)). El genoma del fago AP205 comprende 3 estructuras de lectura abierta grandes (ORFs) que codifican para la maduración, las proteínas recubiertas y de replicasa. Además dos ORFs pequeños adicionales se presentan en la terminación 5', que precede el gen de maduración. La función de las proteínas codificadas por estas ORFs se desconocen. Se ha postulado que una de estas ORFs puede codificar para una proteína de lisis (Klovins, J., et al., J". Gen Virol 83:1523-33 (20G2) ) .

Breve Descripción de la Invención Se ha descubierto que la proteína recubierta AP205 puede expresarse recombinantemente en las bacterias usando los vectores de la invención. También se han desarrollado métodos para la purificación de partículas tipo virus AP205. Por otro lado las proteínas recubiertas AP205 producidas por el presente método forman espontáneamente cápsidas, como se evidencia por la microscopía de electrón (EM, popr sus siglas en inglés) y la inmunodifusión, y por lo tanto la proteína recubierta sola junto con ARN es suficiente para ensamblar la cápsida en E. coli. Esto descarta cualquier regla de la proteína codificada por dos ORFs de fusión desconocida. Una característica sorprendente de la invención es que no existe homología' de secuencias, entre la secuencia de la proteína recubierta AP205 y las otras proteínas recubiertas de fago de ARN de las cuales se saca la estructura, aun las propiedades estructurales de la cápsida formada por la proteína recubierta AP205 y aquellas formadas por la proteína recubierta de aquellos fagos RNA son casi indistinguibles cuando se observan en EM. Se ha descubierto que las VLP ??20? son altamente inmunogénicas, y pueden enlazarse con moléculas orgánicas para generar constructos de vacuna que exhiben las moléculas orgánicas orientadas de manera repetitiva. Se sacan altas concentraciones contra las moléculas orgánicas así exhibidas que muestran que las moléculas orgánicas enlazadas son accesibles para interactuar con las moléculas de anticuerpo y son inmunogénicas La presente invención proporciona partículas tipo virus recombinantemente expresadas (VLP, popr sus siglas en inglés) , ensambladas espontáneamente de al menos una proteína recubierta de bacteriófago AP205 expresada recombinantemente en E. coli. En un aspecto relacionado, la invención proporciona formas mutantes competentes ensambladas de VLP AP205, que incluye la proteína recubierta AP205 con las substitución de prolina en el aminoácido 5 a treonina (SEQ ID N0:3) . Estas VLP, VLP AP205 derivadas de fuentes naturales (SEQ ID NO:l), o partículas virales AP205, pueden unirse al menos una molécula orgánica para producir configuraciones repetitivas ordenadas de moléculas orgánicas. Las moléculas orgánicas de la invención incluyen antígenos y determinantes de antígeno, alérgenos, auto antígenos, haptenos, antígenos de cáncer y antígenos de enfermedad infecciosa, así como moléculas orgánicas pequeñas tales como fármacos de abuso tipo nicotina y derivados de la misma. La inmunización de animales usando conjugados ant£geno-AP205 VLP, o composiciones que comprenden tales conjugados como se proporciona por la invención, inducen una respuesta inmune contra el antigeno exhibido. La VLP de la invención de esta manera es útil para la . unión y despliegue de moléculas en particular de antígenos. Por lo tanto, los conjugados, composiciones y métodos de la invención son útiles para la estimulación de una respuesta inmune contra una variedad de antigenos exhibidos, de esta manera para el uso en animales. En un primer aspecto, la presente invención proporciona una partícula tipo virus que comprende, alternativamente, o preferiblemente consiste de, " o alternativamente o preferiblemente consiste de al menos una proteína seleccionada del grupo que consiste de: (a) una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO: 1; (b) una protelna que tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO:3; y (c) una rauteína de la proteína (a) o (b) . Preferiblemente, la proteína es recombinante . De esta manera, la invención proporciona una cápsida formada por al menos una proteína seleccionada del grupo que consiste de: (a) una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO:l; (b) una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO:3; y (c) una muteína de la proteína (a) o (b) . En una modalidad preferida, la mutelna tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO : 1 o como se establece en SEQ ID NO : 3 , en donde al menos un residuo de aminoácido, preferiblemente tres residuos de amino, más preferiblemente dos residuos de aminoácido, y aun más preferiblemente un residuo de aminoácido de SEQ ID N0:1 ó SEQ ID NO: 3 se agrega, elimina o substituye, en donde preferiblemente la al menos una substitución es una substitución conservadora. En una modalidad preferida adicional, la muteína tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO:l o como se establece en SEQ ID NO: 3, en donde al menos un residuo de cisteina, preferiblemente dos residuos de cisteina de SEQ ID NO:l ó SEQ ID NO : 3 se elimina o substituye, en donde preferiblemente el al menos uno, preferiblemente dos substituciones es una substitución conservadora. Todavía en una modalidad preferida adicional, la muteína tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO:l o como se establece en SEQ ID NO:3, en donde al menos un residuo de lisina, preferiblemente tres residuos de Usinas, más preferiblemente dos residuos de lisina, y aun más preferiblemente una lisina de SEQ ID NO:l ó SEQ ID NO: 3 se agrega, elimina o substituye, en donde la preferiblemente al menos una substitución es una substitución conservadora. En un segundo aspecto, la invención proporciona una muteína que tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID N0:3. Alternativamente, la invención proporciona una muteína de la proteina recombinante de SEQ ID N0:1 ó SEQ ID N0:3, en donde al menos un residuo de aminoácido, preferiblemente tres residuos de aminoácido, más preferiblemente dos residuos de aminoácido, y aun más preferiblemente un residuo de aminoácido de SEQ ID N0:1 ó SEQ ID NO: 3 se agrega, elimina o substituye, en donde preferiblemente la al menos una substitución es una substitución conservadora. Todavía en un aspecto adicional, la invención proporciona una muteína para la proteína recombinante de SEQ ID N0:1 ó SEQ ID NO:3, en donde al menos un residuo de cisterna, preferiblemente dos residuos de cisterna de SEQ ID NO:l ó SEQ ID NO: 3, se elimina o substituye, en donde preferiblemente la al menos una, preferiblemente dos, substituciones es una substitución conservadora. Alternativamente, la invención proporciona una muteína de la proteína recombinante de SEQ ID NO:l ó SEQ ID NO:3, en donde al menos un residuo de lisina, preferiblemente tres residuos de lisina, más preferiblemente dos residuos de lisina y aun más preferiblemente una lisina de SEQ ID NO:l ó SEQ ID NO: 3 se agrega, elimina o substituye, en donde preferiblemente la al menos una substitución es una substitución conservadora. En otro aspecto, la invención proporciona un vector para producir una partícula tipo virus AP205 cuya secuencia es de al menos 80%, preferiblemente al menos 90%, más preferiblemente al menos 95%, y aun más preferiblemente 99% idéntica a la de SEQ ID NO: 2 ó SEQ ID NO: 4. Alternativamente, la invención proporciona un vector para la producción de una proteína recombinante que comprende el polipéptido fusionado a la proteína, en donde la proteína se selecciona del grupo que consiste de: (a) una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID N0:1; (b) una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos como se establece' en SEQ ID NO: 3; y (c) una muteína del polipéptido de (a) o (b) . En un aspecto adicional, la invención proporciona un método para producir una partícula tipo virus AP205 que comprende las etapas de: (a) proporcionar un ácido nucleico que contiene una secuencia de nucleótido que es al menos 80%, preferiblemente al menos 90%, más preferiblemente al menos 95% y aun más preferiblemente 100% idéntica a la de SEQ ID NO : 2 ó SEQ ID NO : 4 , o proporciona un vector que comprende una secuencia de nucleótido que es al menos 80%, preferiblemente al menos 90%, más preferiblemente al menos 95%, y aun más preferiblemente 99% idéntica a la SEQ ID NO: 2 ó SEQ ID NO:4; (b) introducir el ácido nucleico o el vector en la célula hospedadora; (c) expresar el ácido nucleico o la secuencia del vector en la células hospedadora para obtener una proteína o una muteína capaz de formar una partícula tipo virus AP205. Preferiblemente, la célula hospedadora es E. coli . Todavía en un aspecto adicional, la invención proporciona un método para producir una partícula tipo virus AP205 que comprende las etapas de: a) proporcionar un cido nucleico o un vector que codifica al menos una proteína seleccionada del grupo que consiste de: (i) una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO:l; (ii) una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO: 3; y (iii) una muteína de la proteína de (i) o (ii) ; b) introducir el ácido nucleico o el vector en la célula hospedadora; c) expresar que el ácido nucleico o la secuencia del vector en la células hospedadora para obtener la proteína o la muteína capaz de formar la partícula tipo virus AP205. Preferiblemente, la célula hospedadora es E. coli. Las modalidades preferidas de las proteínas y muteínas indicadas bajo (i) y (ii) ya se han indicado arriba. En una primera modalidad, la invención proporciona una composición que comprende de una o más VLPs recombinantes de bacteriófago de ARN AP205 o mutantes de los mismos. En una modalidad adicional, la invención comprende composiciones que comprenden una o más VLP AP205 y una o más moléculas, orgánicas, en donde las moléculas se unen, enlazan, acopla o fusiona, esto es, se enlaza, a la ' VLP AP205. En otra modalidad la molécula orgánica es un antigeno. En ciertas otras modalidades, las moléculas orgánicas se seleccionan del grupo que consiste de: a) una molécula orgánica apropiada para producir una respuesta inmune contra células de cáncer; b) una molécula orgánica apropiada para inducir una respuesta inmune contra enfermedades infecciosas; c) una molécula orgánica apropiada para inducir una respuesta inmune contra alérgenos; d) una molécula orgánica apropiada para producir una respuesta mejorada contra auto-antígenos ; e) una molécula orgánica apropiada para producir una respuesta inmune en animales de granja o mascotas; y f) una molécula apropiada para inducir una respuesta contra un fármaco, una hormona o una compuesto tóxico y g) fragmentos (por ejemplo, un epítopo o dominio antigénico de cualquiera de las moléculas establecidas en (a) - (f) . En otra modalidad, las moléculas orgánicas son uno o más antígenos. En tal modalidad, los antígenos son polipéptidos recombinantes . En otra modalidad, los antígenos se extraen de una fuente natural, tal como polen, abejas, patógenos o tumores. Aún en otra modalidad, el antígeno se selecciona del grupo que consiste de: a) un polipéptido apropiado para inducir una respuesta inmune contra células de cáncer; b) un polipéptido apropiado para inducir una respuesta inmune contra enfermedades infecciosas; c) un polipéptido apropiado para inducir una respuesta inmune contra alérgenos; d) un polipéptido apropiado para inducir una respuesta inmune contra auto-antígenos ; y e) un polipéptido apropiado para inducir una respuesta inmune en animales de granja o mascotas . En una modalidad particular, el antígeno comprende un epítopo de células T-citotóxicas o células T-auxiliares . En una modalidad relacionada, el antígeno comprende un epítopo de célula B. En un aspecto relacionado, la invención proporciona métodos para enlazar, esto es, unir, moléculas orgánicas a la VLP AP205. En ciertas modalidades, las moléculas orgánicas se enlazan de una manera orientada a la VLP AP205. En otra modalidad de la invención, los conjugados o composiciones se usan en métodos para inmunizar un animal al introducilo subcut neamente, intramuscularmente, intranasalmente , intradermalmente, intravenosamente, transdermalmente, transmucosalmente, oralmente o directamente en el ganglio linfático. En otra modalidad, la composición se aplica localmente cerca del tumor o el reservorio de virus local contra el cual se busca la vacuna. La presente invención también se refiere a una vacuna que comprende una cantidad inmunológicamente efectiva de la composición de la presente invención junto con un diluyente, portador o excipiente farmacéuticamente aceptable. En una modalidad adicional, la vacuna comprende además un adyuvante, tal como Alum o adyuvante de Freund incompleto. La invención también proporciona métodos para inmunizar y/o tratar un animal que comprende administrar al animal una cantidad i munológicamente efectiva de conjugados, composiciones, o vacunas de la invención. Los conjugados de VLP AP205 o composiciones puede usarse para vacunas contra tumores, enfermedades virales, auto moléculas, moléculas pequeñas no peptidicas, por ejemplo. La vacunación puede ser para propósitos profilácticos o terapéuticos o ambos. Los conjugados o composiciones de VLP AP205 pueden usarse para vacunas contra alergias con objeto de inducir la desviación inmune y/o respuesta de anticuerpos contra el alérgeno, apropiadas para el tratamiento o prevención de alergias . La invención proporciona además, métodos para tratar o prevenir enfermedades, trastornos físicos, o condiciones en un individuo o una población de individuos, por la administración de composiciones que comprenden o alternativamente, consisten esencialmente con VLP AP205 enlazada a una molécula orgánica. En un aspecto relacionado las moléculas o anticuerpos inmunes, respectivamente, tales como anticuerpos, generados con trátales composiciones pueden usarse para el tratamiento, profilaxis, diagnóstico de una enfermedad, condición o trastorno. En otro aspecto de la invención, las composiciones que comprenden una VLP AP205 enlazada a una molécula orgánica se proporcionan en forma de un kit . En otro aspecto de la invención, las composiciones que comprenden una molécula inmune y anticuerpo respectivamente, aislados para usarse de una VLP AP205 enlazada a una molécula orgánica también se proporcionan en forma de una kit. Tales kits son útiles para una variedad de propósitos que incluyen pero no se limitan a la detección de moléculas inmunes y anticuerpos, respectivamente, que reacciona a moléculas orgánicas presentadas en la VLP, para la detección de moléculas orgánicas, para la separación por exclusión de moléculas inmunes y anticuerpos respectivamente, y/o para el diagnóstico de condiciones caracterizadas por la presencia o ausencia de moléculas y anticuerpos inmunes, respectivamente. En ciertas modalidades relacionadas, los kits de la invención pueden comprender uno o más componentes adicionales tales como amortiguantes, portadores, excipientes, adyuvantes, reactivos de detección, etc. En otro aspecto, la invención también proporciona vectores y células hospedadoras para la expresión de la proteína recubierta del bacteriófago de ARN AP205 que forma las partículas tipo virus. Las células hospedadoras incluyen procariotas que incluyen E. coli; y eucariotas que incluyen levadura, animales, líneas celulares, etc. En otro aspecto la invención proporciona métodos para expresar la proteína recubierta del bacteriófago de ARN AP205 y las partículas tipo virus de la misma. En otro aspecto, la invención proporciona métodos para purificar y aislar partículas tipo virus del bacteriófago AP205. Otras modalidades de la presente invención serán aparentes para alguien con experiencia ordinaria a la luz de lo que se conoce en el arte, los siguientes dibujos y la descripción de la invención, y las reivindicaciones.

Breve Descripción de las Figuras Las figuras 1A-1E describen micrográficas de electrón que comparan las partículas de fago AP205 con las partículas tipo virus AP205 ensambladas espontáneamente de la proteína recombinante expresada en E. coli y purificada. La figura 1A muestra una foto de micrográfica de electrón de las partículas de fago AP205, mientras que una foto de micrográfica de electrón de partículas microensambladas de VLP AP205 recombinantes se muestra en la figura B. La figura 2 muestra el análisis SDS-PAGE de la reacción de acoplamiento de VLP AP205 y VLP ?)ß para el péptido Derpl.2. Las muestras se corren bajo condiciones reducidas en un gel Tris-glicina en un 16%. La pista 1 es el marcador de proteína, con los pesos moleculares correspondientes indicados en el borde izquierdo del gel; la pista 2 proteína de cápsida derivada; pista 3, el sobrenadante de la reacción de acoplamiento de la proteína de cápsida de <2ß para el péptido Derpl .2 ; pista 4 el peletizado de la reacción de acoplamiento de la proteína de cápsida ?)ß para el péptido Derpl.2; pista 5, VLP AP205 derivada; pista 6, el sobrenavate de la reacción de acoplamiento de VLP AP205 para el péptido Derpl.2; pista 7, el peletizado de la reacción de acoplamiento de VLP AP205 para el péptido Derpl.2; los productos de acoplamiento correspondientes a los acoplamientos de 1, 2, 3, 4 y respectivamente 5 péptidos por monómero se indican por flechas en la figura. Un número mayor de epítopos podrá acoplarse a la VLP AP205 más que la proteína cápsida <2ß. La figura 3 muestra un análisis ELISA de los anticuerpos IgG específicos para "Derpl.2" en el suero de ratones inmunizados contra el péptido Derpl.2 acoplados a la VLP AP205 o la proteína de cápsida <2ß respectivamente. Las concentraciones IgG totales, así como las concentraciones del subtipo IgG se determinan. No se detectaron anticuerpos específicos para Derpl .2 en ninguno de los sueros preinmunes analizados para cada uno de los subtipos IgG. La figura muestra que para ambos de AP205 y £>ß, los subtipos típicos de una respuesta inmune Thl se inducen, como la concentración en IgG2a es mucho mayor que la concentración IgGl . Se obtiene una respuesta inmune antipéptido específica fuerte con el péptido acoplado a ambas VLPs . Los anticuerpos específicos para el portador también se miden por ELISA, y esto se compara para ambos portadores . Las figuras 4A-4C muestra secuencias parciales de los diferentes vectores de expresión eucarioticos usados. Solo se muestran las secuencias de modificadas. Figura 4?: pCep-Xa-Fc* : la secuencia se muestra del sitio Bam HI hacia dentro y demuestran diferentes características arriba de la secuencia traducida (SEQ ID NO: 103 y SEQ ID NO: 104) . La flecha indica el sitio de desdoblamiento de la proteasa de factor Xa. Figura 4B : pCep-EK-Fc* : la secuencia se muestra del sitio Bam HI hacia adentro y muestra características diferentes arriba de la secuencia traducida (SEQ ID NO: 105 y SEQ ID NO: 106) . La · flecha indica el sitio de desdoblamiento de la enterocinasa . La secuencia en dirección descendente del sitio Hind III es idéntico a uno mostrado en la figura 4?. Figura 4C: pCep-SP-EK-Fc* : la secuencia se muestra desde el inicio de la señal de péptido en y se muestran diferentes características arriba de la secuencia traducida (SEQ ID NO: 107 y SEQ ID NO: 108) . La secuencia de señal de péptido que se desdobla por la señal de peptidaza se muestra en negritas. Las flechas indican el sitio de desdoblami nto de la enterocinasa. La secuencia en dirección descendente del sitio Hind III es idéntica a una mostrada en la figura 4A. Las figuras 5A-5B describen constructos de rMIF, y un SDS-PAGE describe la expresión y purificación de constructos rMIF, para acoplamiento del constructo VLP ??205. La figura 5A muestra una descripción esquemática de los constructos MIF, que agregan el enlazador de aminoácido que contiene un residuo de cisteína. La figura 5B muestra un análisis SDS-PAGE del constructo MIF purificado, corrido bajo condiciones reductoras, y manchado con azul brillante Coomassie. Cargados en los geles están los constructos de rata purificado rMIF-Cl (SEQ ID NO: 114), rMIF (SEQ ID NO: 115) y rMIF-C3 (SEQ ID NO: 117) descritos en la figura 5A. La figura 6 muestra los resultados de la reacción de acoplamiento de rMIF-Cl a la VLP AP205. Pista 1: marcador molecular. Pista 2: VLP AP205. Pista 3: VLP AP205 derivado. Pista 4: VLP AP205 derivado dializado. Pista 5: VLP AP205 derivado, dializado. Pista 6: Reacción de acoplamiento de rMIF-Cl a la VLP ??205. El producto de acoplamiento se indica por una flecha en la figura. Los pesos moleculares de las proteínas marcadoras se indican en el borde izquierdo del gel . La figura 7 muestra el análisis por ELISA de la respuesta IgG específica para rMIF-Cl en los sueros de ratones inmunizados con rMIF-Cl acoplados a la VLP AP205. La figura 8 muestra un análisis ELISA de los anticuerpos IgG específicos para el péptido Angio I en los sueros de 3 ratones (1-3) inmunizados el día 0 y 14 contra el péptido Angio I acoplado a la VLP AP205. Las concentraciones IgG totales se determinan en el suero del día 21.

Descripción Detallada de la Invención Definiciones Las siguientes definiciones son resúmenes de los conceptos comúnmente entendidos por alguien de experiencia ordinaria en el arte relevante y se suministra para los propósitos de comprensión de la siguiente descripción pero no se significan que se han una limitación de la descripción. Ligadura de aminoácido: una ligadura de aminoácido y también denominada solamente ligadura dentro de esta especificación como se usa en la presente, se asocia al antígeno o determinante antigénico con el segundo sitio de colocación o más preferiblemente ya comprende o contiene el segundo sitio de colocación, típicamente pero no necesariamente como un residuo de aminoácido preferiblemente como un residuo de cisteína. El término ligador de aminoácidos como se usa en la presente sin embargo no pretende implicar que tal ligadura de aminoácidos consista exclusivamente de residuos de aminoácidos aun si una ligadura de aminoácidos que consiste de residuos de aminoácidos es una modalidad preferida de la presente invención. Los residuos de aminoácidos de la ligadura de aminoácidos están preferiblemente compuestos de aminoácidos que se presentan naturalmente o de aminoácidos no naturales conocidos en el arte todos L o todos D o mezclas de los mismos. Sin embargo, una ligadura de aminoácidos que comprende una molécula con un grupo sulfhidrilo residuo de cisteína también se abarca dentro de la invención. Tal molécula comprende preferiblemente una porción C1-C6 alquil-, cicloalquil (C5 , C6) aril o heteroarilo. Sin embargo además de una ligadura de aminoácidos una ligadura que comprende preferiblemente una porción C1-C6 alquil-, cicloalquil (C5 , C6) aril o heteroarilo y desprovista de algunos aminoácidos debe estar abarcado dentro del alcance de la invención. La asociación entre el antígeno o determinante antigénico u opcionalmente un segundo sitio de colocación y la ligadura de aminoácidos, es preferiblemente por medio de un enlace covalente, más preferiblemente por forma de un enlace de péptido . Animal: como se usa en la presente el término "animal" significa que incluye por ejemplo, humanos, ovejas, alces, venados, caricu, visones, mamíferos, monos, caballos, ganado, cerdos, cabras, perros, gatos, ratas, ratones, pájaros, pollo reptiles, peces, insectos, y arácnidos. Anticuerpo: Como se usa en la presente el término "anticuerpo" se refiere a moléculas que pueden enlazarse a un epítopo o determinante antigénico. El término significa que incluye anticuerpos completos y fragmentos de enlace a antígenos de los mismos incluyendo anticuerpos de cadena sencilla. Tales anticuerpos incluyen fragmentos de anticuerpos de enlace a los antígenos humanos que incluye pero no se limitan a Fab, Fab', y F(ab')2,Fd, de cadena sencilla, Fvs (scFv) , anticuerpos de cadena sencilla, Fvs (sdFv) ligados de bisulfuro y fragmentos que comprenden un dominio VL 0 VH. Los anticuerpos pueden ser de cualquier origen animal incluyendo pájaros o mamíferos. Preferiblemente, los anticuerpos son mamíferos por ejemplo, humanos, murinos, conejo, cabra, conejillo de indias, camellos caballo, y similares u otros animales adecuados por ejemplo, pollos. Como se usan en la presente, los anticuerpos humanos incluyen anticuerpos que la secuencia de aminoácidos de una inmunoglubulina humana e incluyen anticuerpos aislados de las colecciones humanas de inmunoglobulina o de animales transgénicos para una o más inmunoglobulinas humanas y que expresan las inmunoglobulinas endógenas como se describe por ejemplo, en la patente de E.U.A No. 5,939,598, la descripción de la cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad. Antígeno : Como se usa en la presente el término "antígeno" se refiere a una molécula que puede enlazarse por un anticuerpo o un receptor de célula T (TCR) si se presenta por moléculas HC. El término antígeno como se usa en la presente también abarca epítopos de células T. Un epítopo de células T se reconoce por un receptor de células T en el contexto de un MHC de clase I presente en todas las células el cuerpo excepto eritrocitos, o la clase II presente en células inmunes y en particular células que presentan antigenos . Este evento de reconocimiento conduce a la activación de células T y a mecanismos posteriores de efector tal como la proliferación de células T, secreción de citocinas, secreción de perforina, etc. Un antígeno puede adicionalmente reconocerse por el sistema inmune y/o ser capaz de inducir una respuesta inmune humoral y/o respuesta inmune celular que conduzca a la activación de lifositos B y/o T. Esto puede sin embargo, requerir que al menos en ciertos casos, el antigeno contenga o se ligue a un epítopo de célula TH y esté dado en un adyuvante. Un antígeno puede tener uno o más epítopos (epítopos B y T) . La reacción específica referida anterior significa que indican que el antígeno reaccionará preferiblemente, típicamente en una forma selectiva con su anticuerpo correspondiente o TCR y con la diversidad de otros anticuerpos de TCR que puede ser provocados por otros antígenos. Antígenos como se usa en la presente también puede ser mezclas de diversos antígenos individuales. Los antígenos como se usan en la presente incluyen pero no se limitan alérgenos, autoantígenos , haptenos, antígenos de cáncer, y antígenos de enfermedades infecciosas así como moléculas orgánicas pequeñas tales como fármacos de abuso (como la nicotina) y fragmentos y derivados de los mismos. Adicionalmente, los antlgenos usados para la presente invención pueden ser péptidos, proteínas, dominios, carbohidratos, alcaloides, lipidos, o moléculas pequeñas tales como por ejemplo, hormonas esteroides y fragmentos y derivados de los mismos. Determinantes antigenicos: Como se usa en la presente el término "determinante antigénico" significa que se refiere a aquella porción de antigeno que se reconoce específicamente por los linfocitos de B o T. Los linfocitos B responden a determinantes antigénicos externos por medio de la producción de anticuerpos mientras que los linfocitos T son el mediador de la inmunidad celular. Así los determinantes o epítopos antigénicos son aquellas partes de un antígeno que se reconocen por anticuerpos o en el contexto de un HC por receptores de célula T. Un determinante antigénico contiene uno o más epítopos . Los alérgenos también sirven como alérgenos en animales vertebrados . Alérgenos: Como se usa en la presente, el término "alérgeno" se refiere a antígenos asociados con la alergias una respuesta alérgica se caracteriza por la liberación de factores inflamatorios particularmente histamina lo que conduce a la inflamación patológica en un individuo. Las alérgicas se asocian también típicamente con anticuerpos IgE y dirigidos contra los alérgenos. El término "alérgeno" como se usa en la presente también abarca extractos de alérgenos y epítopos alergénicos. Los ejemplos de los alérgenos incluyen pero no se limitan a pólenes (por ejemplo, de pastos, ambrosia abredul y cedro de la montaña, polvo de casa y ácaros del polvo, alérgenos epidérmico de mamíferos y caspas de animales, mohos y hongos, cuerpos de insectos y veneno de insectos, plumas, alimentos y fármacos (por ejemplo, penicilina) . Partícula del tipo del virus AP205 o ??205 VLP: Como se usan en la presente, los términos partícula tipo virus AP205 o AP205 VLP se refieren a composiciones y partículas de tipo virus respectivamente que comprende o consiste alternativamente esencialmente de o alternativamente y preferiblemente consiste de al menos una proteína y proteína de recubrimiento respectivamente del bacteriófago AP205 o un fragmento o una muteína del mismo en donde al menos una proteína de recubrimiento o fragmento de muteína del mismo es típicamente preferiblemente capaz de ensamblarse formando una partícula de tipo virus. En modalidades alternativas y preferidas los términos "partícula de tipo virus AP205" o "AP205 VLP" como se usa en la presente se refiere a composiciones y partículas de tipo virus respectivamente, que comprenden o consiste alternativamente esencialmente de o alternativamente o preferiblemente consisten de al menos una proteína y proteína de recubrimiento respectivamente del bacteriófago AP205 o una muteína del mismo, en donde al menos una proteína de recubrimiento del bacteriófago AP205 o la muteína del mismo puede ensamblar formando una partícula de tipo virus. En una modalidad muy preferida de la presente invención, los términos partícula de tipo virus AP205 o AP205 VLP se refieren a composiciones y partículas de tipo virus respectivamente que comprenden o consisten alternativamente esencialmente de o alternativamente y preferiblemente consisten de al menos una proteína de recubrimiento del bacteriófago AP205 que tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO: 1, en donde típica y preferiblemente al menos una proteína de recubrimiento puede ensamblar a una partícula tipo virus y cápsida respectivamente. En una modalidad adicional alternativa preferida de la presente invención, los términos "partícula tipo virus AP205" o "AP205 VLP" se refieren a composiciones que comprenden o consisten alterna ivamen e esencialmente de o alternativa y preferiblemente consisten de al menos una muteína de una proteína de recubrimiento del bacteriófago AP205 que tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO: .3, en donde al menos una muteína de la proteína de recubrimiento puede ensamblar a una partícula de tipo virus. En una modalidad adicional alternativa muy preferida de la presente invención, los términos "partícula de tipo virus AP205" o "AP205 VLP" se refieren a composiciones y partículas de tipo virus respectivamente, que comprenden o consisten alternativamente esencialmente de o alternativamente y preferiblemente consisten de al menos una muteína de una proteina de recubrimiento de bacteriófago AP205 que tiene una secuencia de aminoácidos como establece en SEQ ID NO: l o SEQ ID NO : 3 , en donde al menos una muteina de la proteína puede ensamblar a una partícula de tipo virus. En una modalidad adicional alternativa muy preferida de la presente invención, los términos partícula de tipo virus ??205 o AP205 VLP se refieren a composiciones de partículas de tipo virus respectivamente que comprende o consiste alternativamente esencialmente de o alternativa o preferiblemente consisten de al menos una muteína que tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO: 1 o como se establece en SEQ ID NO: 3, en donde al menos un residuo de aminoácido, preferiblemente tres residuos de aminoácidos, más preferiblemente dos residuos de aminoácidos, y aun más preferiblemente un residuo de aminoácidos, se a9re9a elimina o substituye, en donde preferiblemente al menos una substitución es una substitución conservadora. En todavía una modalidad alternativa adicional muy preferida de la presente invención, los términos partícula de tipo virus AP205 o AP205 VLP se refieren a composiciones y partículas de tipo virus respectivamente que comprenden o consisten alternativamente de esencialmente de o consisten alternativa o preferiblemente de al menos una muteína que tiene una secuencia de aminoácidos como se establece SEQ ID NO: 1, o como se establece en SEQ ID NO: 3, en donde al menos un residuo de cisteína, preferiblemente tres residuos de cisteína, más preferiblemente dos residuos de cisteína, y aun más preferiblemente una cisteína se elimina o substituye, en donde preferiblemente al menos una substitución en una substitución conservadora. Nuevamente en otra modalidad muy preferida de la presente invención los términos "partícula de tipo virus AP205" o "AP205 VLP" se refiere a composiciones de partícula de tipo virus respectivamente que comprenden o consisten alternativamente esencialmente de o consiste alternativa o preferiblemente de al menos una muteína que tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO: l o como se establece en SEQ ID NO: 3, en donde al menos un residuo de lisina, preferiblemente tres residuos de lisina, más preferiblemente dos residuos de lisina , y aun más preferiblemente una lisina se agrega, elimina o substituye, en donde preferiblemente al menos una substitución es una substitución conservadora. Las modalidades adicionales preferidas de AP205 VLP son evidentes como avanza la especificación. Las subunidades AP205 que componen el AP205 VLP se pueden todas ligar a otras subunidades dentro de la partícula por puentes bisulfuro o alternativamente una mayoría de las subunidades AP205 VLP se ligan a otras subunidades AP205 VLP dentro de la partícula por puentes bisulfuro. En algunas modalidades, una minoría o ninguna de las subunidades AP205 VLP se ligan por puentes bisulfuro a otras subunidades AP205 VLP dentro de la partícula. Asociación: Como se usa en la presente, el término "asociación" como aplica al primero o segundo sitio de colocación, se refiere al enlace del primero y segundo sitios de colocación que es preferiblemente por medio de al menos un enlace que no es péptido. La naturaleza de la asociación puede ser covalente, iónica, hidrofóbica, polar, o cualquier combinación de las mismas preferiblemente la naturaleza de la asociación es covalente. Primer sitio de colocación: Como se usa en la presente, la frase "primer sitio de colocación" se refiere a un elemento natural o no natural, al cual el segundo sitio de colocación colocado en el antígeno o determinante antígeno puede ser asociarse. El primer sitio de colocación puede ser una proteína un polipéptido una amina un ácido puede ser una proteína un polipéptido, un aminoácido, un péptido una azúcar un polinucléotido un polímero natural o sintético o un metabolito secundario o compuesto (biotina, fluoresceína, retinol, digoxigenina, iones metálicos, fluoruro, de fenilmetilsulfonilos) o una combinación de los mismo o un grupo químicamente reactivo del mismo. El primer sitio de colocación se localiza típica o preferiblemente en la superficie de la partícula del núcleo tal como preferiblemente la partícula de tipo virus. Los sitios de colocación primeros múltiples están presentes en la superficie del núcleo y de la partícula de tipo virus respectivamente, típicamente en una configuración repetitiva. Segundo sitio de colocación: Como se usa en la presente, la frase segundo sitio de colocación se refiere a un elemento asociado con el antígeno o determinante antigénico al cual el primer sitio de colocación localizado en la superficie de la partícula del núcleo y al partícula de tipo virus respectivamente se pueden asociar. El segundo sitio de colocación del antígeno o determinante antigénico puede ser una proteína, un polipéptido, un péptido, un azúcar, un polinucléotido, un polímero natural o sintético un metabolito o compuesto secundario biotina, fluoresceína, retinol digoxigenina, iones metálicos, fluoruro de metilfenilsulfinilo) o una combinación de los mismos o un grupo químicamente reactivo de los mismos. Al menos está presente un segundo sitio de colocación en el antígeno o determinante antigénico. El término "antígeno o determinante antigénico, con al menos un segundo sitio de colocación" se refiere por lo tanto a un antígeno o constructo antigénico que comprende al menos el antígeno o determinante antigénico y el segundo sitio de colocación. Sin embargo, en particular para un segundo sitio de colocación que es de origen no natural esto es que no se presenta naturalmente del antígeno o determinante antíigenico, estos antígenos o constructos antigénicos comprende una ligadura de aminoácidos. Enlazado: Como se usa en la presente, el término enlazado se refiere al enlace o colocación que puede ser covalente por ejemplo, por acoplamiento químico o no covalente por ejemplo, interacciones iónicas, interacciones hidrofóbicas, enlaces de hidrógeno etc. Los enlaces covalentes pueden ser por ejemplo, éster, éter, fosfoamida, péptido, imida, enlaces de carbono y azufre, enlaces de carbono y fósforo y similares. El término enlazado es más amplio e incluye términos tales como acoplado, fusionado y colocado . Proteínas de recubrimiento: Como se usa en la presente el término proteínas de recubrimiento se refiere a las proteínas de un bacteriófago o una fago de ARN que puede incorporarse dentro del ensamble de cápsidas del bacteriófago o el fago de ARN. La proteína de recubrimiento también se refiere como CP. En la invención actual el término se refiere más usualmente a las proteínas de recubrimiento del fago de ARN AP205. Partícula de núcleo: Como se usa en la presente, el término "partícula de núcleo" se refiere a una estructura rígida con una organización repetitiva inherente. Una partícula de núcleo como se usa en la presente puede ser el producto de una proceso sintético o el producto de un proceso biológico . Enfermedad, trastorno, condición: Como se usan en la presente los términos "enfermedad" o "trastorno" se refieren a cualquier condición adversa de un individuo incluyendo tumores, cáncer, alergias, adiciones autoinmunidad, envenenamiento incapacidad de la función óptima, mental o corporal . Condiciones como se usan en la presente incluyen enfermedades y trastornos pero también se refieren a estados fisiológicos. Por ejemplo, la fertilidad es un estado fisiológico pero una enfermedad o trastorno. Las composiciones de la invención adecuadas para evitar el embarazo al disminuir la fertilidad se describirían por lo tanto como el tratamiento de una condición (fertilidad pero no un tratamiento de un trastorno o enfermedad) . Se entienden otras condiciones por aquellos con experiencia ordinaria en la técnica. Epitopo: Como se usa en la presente, el término "epítopo" se refiere a un elemento básico o una unidad más pequeña reconocimiento por un anticuerpo individual o receptor de células T, y así el dominio particular región o estructura molecular al cual se enlaza el anticuerpo o receptor de células T. Un antígeno puede consistir de epitopos numerosos mientras que un hapteno posee típicamente pocos epitopos. Respuesta inmune: Como se usa en la presente, el término "respuesta inmune" se refiere a cualquier acción de un sistema inmune de un individuo que se dirige contra una molécula o compuesto tal como antígeno. En los mamíferos, la respuesta inmune incluye ambas de las actividades de las células y la producción de moléculas solubles tales como citocinas y anticuerpos. El término así incluye una respuesta inmune humoral y/o una respuesta inmune celular que conduce a la activación o proliferación de linfocitos B y/o T. En algunos casos sin embargo las respuestas inmunes pueden ser de baja intensidad y hacerse detectable solamente cuando se usa al menos una substancia de acuerdo con la invención. Inmunogénicos se refiere a un agente utilizado para estimular el sistema inmune de un organismo viviente, de manera que una o más funciones del sistema inmune se incrementa y dirigen hacia el agente inmunogénico . Un polipéptido inmunogénico es un polipéptido que produce una respuesta inmune celular y/o humoral, ya sea sola o ligada a una portador en presencia o ausencia de un activante . Desviación i mune: Como se usa en la presente el término desviación inmune se refiere a la estimulación de una respuesta inmune que es de una naturaleza diferente a una respuesta inmune preexistente. Por ejemplo, un individuo que posee una respuesta inmune TH2 contra un alérgeno de manera tal que se produzcan anticuerpos IgE al exponer al alérgeno se pueden producir, y una modalidades de la presente invención para producir una respuesta inmune TH1 contra el alérgeno. Tal respuesta TH1 se contrarrestará a la alergia induciendo una respuesta TH2 y así mejorar la enfermedad alérgica . Inmunoterapéutico : Como se usa en la presente el término "inmunoterapéutico" se refiere a una composición para el tratamiento del enfermedades, trastornos o condiciones. Más específicamente, el término se utiliza para referirse a un método de tratamiento en donde se genera una respuesta inmune benéfica por vacunación. Cantidad inmunológicamente activa: Como se usan en la presente, el término "cantidad inmunológicamente activa" se refiere a una cantidad de una composición suficiente para inducir una respuesta inmune en un individuo cuando se introduce en ese individuo. La cantidad de una composición necesaria para hacer una inmunológicamente activa varia según muchos factores incluyendo la composición, la presencia de otros componentes en la composición por ejemplo, adyuvantes, el antígeno de la vía de inmunización el individuo el estado inmune o fisiológico previo etc. Individuo: Como se usa en la presente, el término individuo se refiere a organismos multicelulares e incluye plantas y animales. Los organismos multicelulares preferidos son animales más preferidos son vertebrados y aun más preferidos son mamíferos y más preferidos son humanos.

Bajo o indetectable : Como se usa en la presente frase bajo o indetectable cuando se usa en referencia al nivel de expresión de genes, se refiere a un nivel de expresión que es significativamente inferior aquel que se observa cuando el gen se induce al máximo (por ejemplo, al menos cinco veces inferior) o no es más fácilmente detectable por los métodos usados en los ejemplos en la presente. Mimótopo : Como se usa en la presente el término mimótopo se refiere a una substancia que induce la respuesta inmune a una antígeno o determinante antigénico. Generalmente el término mimótopo se usara con referencia a un antígeno en particular. Por ejemplo, un péptido que produce la producción de anticuerpos a una fosfilapasa A2 (PLA2) es un mimótopo del determinante antigénico del cual se enlaza los anticuerpos. Un mimótopo puede tener o no una similaridad estructural substancial con, o compartir propiedades estructurales con un antígeno o determinante antigénico al cual induce - una respuesta inmune. Los métodos para la generación e identificación de mimótopos que inducen las respuestas inmunes a los antígenos en particular o determinantes antigénicos se conocen en el arte y se describe en alguna otra parte en la presente. Muteína: Como se usa en la presente el término muteína se refiere a una proteína o polipéptido que difiere por uno o más aminoácidos de una polipéptido de referencia dado por ejemplo, natural tipo silvestre etc, en donde tal diferencia es provocada por la adición, substitución o eliminación de al menos un aminoácido o una combinación del mismo. Las modalidades preferidas comprenden mutaciones derivadas de la substitución de al menos un aminoácido, preferiblemente derivadas de la substitución conservadora de al menos un aminoácido. La substituciones conservadoras incluyen substituciones isoestericas, substituciones en donde la naturaleza cargada polar aromática, alif tica o hidrofóbica del aminoácido se mantiene. Por ejemplo, la substitución de un residuo de lisina con un residuo de serina es una substitución conservadora. En modalidades preferidas de la presente invención, el término muteína se refiere a una proteína o polipeptido que difiere por tres, preferiblemente dos y más preferiblemente un aminoácido de una referencia dada como polipeptido (natural, tipo silvestre etc) , en donde tal diferencia en provocada por' la adición substitución o eliminación o una combinación de los mismos. En modalidades preferidas de la presente invención, el término mutenina se refiere a una proteína o polipéptido que difiere por tres preferiblemente dos y más preferiblemente un aminoácido de un polipéptido de referencia dado (por ejemplo, natural tipo silvestre etc) , en donde tal diferencia se deriva de la substitución de tres preferiblemente dos y más preferiblemente un aminoácido derivado preferiblemente de las substitución conservadora de tres preferiblemente dos y más preferiblemente un aminoácido. Origen natural : Como se usa en la presente el término origen natural significa que todo o partes del mismo no son sintéticas o existen o se producen en la naturaleza. Preferiblemente como se usan en la presente el término origen natural significa que el todo no es sintético o existe o se produce en la naturaleza. No natural : Como se usan en la presente el término significa generalmente que no es de la naturaleza, más específicamente el término significa de la mano del hombre. Origen no natural: Como se usa en la presente, el término origen no natural significa generalmente sintético o que no es de la naturaleza, más específicamente el término significa de la mano del hombre. Configuración determinante antigénica o antígeno repetitivo o ordenado : Como se usa en la presente el término configuración determinante antigénica o antígeno repititivo o ordenado se refiere generalmente a un patrón de repetición del determinante antigénico o de antígeno, caracterizado por una configuración espacial preferiblemente y típicamente uniforme de los antígenos o determinantes antigénicos con respecto a la partícula del núcleo y a la partícula tipo virus respectivamente. En una modalidad de la invención, el patrón de repetición puede ser un patrón geométrico. Los ejemplos típicos y preferidos de las configuraciones determinantes antigénicas o antígenos repetitivas o ordenadas son aquellas que poseen ordenes para cristalinos estrictamente repetitivo de antígenos o determinantes antigénicos, preferiblemente con un espaciamiento de 1 a 30 nanoraetros , preferiblemente de 5 a 15 nanometros . Molécula orgánica: Como se usa en la presente el término molécula orgánica o moléculas orgánicas como se refiere en la presente invención incluye preferiblemente antígenos y determinantes de antígenos, alérgenos, autoantígeno, haptenos, antígenos de cáncer y antígenos de enfermedades infecciosas así como moléculas orgánicas pequeñas tales como fármacos de abuso (como la nicotina) y fragmentos derivados del mismo. Polipéptido: como se usa en la presente el término polipéptido se refiere a una polímero compuesto de un residuo de aminoácidos generalmente residuos naturales de aminoácidos ligados juntos a través de enlaces de péptidos. Un polipéptido no necesariamente puede estar limitado de tamaño e incluye proteínas y péptidos. Un péptido es un polipéptido en un tamaño típico de alrededor de cinco hasta alrededor de 50 aminoácidos, o cualquier aminoácidos en número dentro de este rango general. Un péptido puede sin embargo también ser de una longitud mayor por ejemplo, de hasta 120-150 aminoácidos.

Proteína: Como se usan en la presente el término proteína se refiere a un polipéptido generalmente de un tamaño de alrededor de 5, o más 10, o más 20, o más 25, o más 50, o más 75, o más 100, o más 200, o más 500, o más 1,000 o más 2000 o más aminoácidos. Las proteínas tienen generalmente un estructura tridimensional definida aunque no necesariamente la necesitan y se refieren a menudo como plegadas, en lo opuesto a péptidos y polipéptidos que a menudo no poseen una estructura tridimensional definida, si no que más bien pueden adoptar un número grande de combinaciones diferentes y se refieren como no plegados. Los péptidos pueden sin embargo también tener una estructura tridimensional definida. Purificado: como se usa en la presente, cuando se usa el término purificado con referencia a una molécula, significa que la concentración de la molécula purificada se ha incrementado con relación a moléculas asociadas con ella y su ambiente natural o ambiente en el cual se produce encuentro sintetiza. Las moléculas naturalmente asociadas incluyen proteínas ácidos nucleicos, lípidos, y azúcares pero generalmente no incluyen agua, soluciones amortiguadoras, reactivos agregados para mantener integridad o facilitar la purificación de la molécula a ser purificada. Por ejemplo, aun si el ARNm se diluye con un solvente acuoso cromatografía en columna, oligo dT se purifican las moléculas de ARNm por esta cromatografía si los ácidos nucleicos asociados naturalmente y otras moléculas biológicas no se enlazan a la columna y se separan de las moléculas objetivo de ARNm. De acuerdo con esta definición, una substancia puede ser 5% o mas, 10% o mas, 20% o mas, 30% o mas, 40% o mas, 50% o más 60% o mas, 70% o mas, 80% o mas, 90% o mas, 95% o mas, 98% o mas, 99% o más o 100% pura cuando se considera con relación a sus contaminantes . Receptor: Como se usa en la presente, el término receptor se refiere a proteínas o glicoproteínas o fragmentos de las mismas, que puede interactuar con otra molécula denominada el ligando. El ligando puede pertenecer a cualquier clase de compuesto químicos o bioquímicos. El receptor no necesariamente necesita hacer una proteína de enlace a la membrana. La proteína soluble, como por ejemplo, la proteína de enlace a la maltosa o proteína de enlace al retinol también son receptores . Residuo: Como se usan en la presente el término residuo significa un aminoácido específico en una estructura de polipéptido o cadena lateral. Célula hospedadora recombinante : Como se usa en la presente, el término célula hospedadora recombinante se refiere a una célula hospedadora dentro de la cual una o más moléculas de ácido nucleico de la invención se han introducido. Las células hospedadoras incluyen eucariotas incluyendo por ejemplo, mamíferos, insectos, plantas, aves, levadura, y procarioticos por ejemplo, E, coli, B, subtilis, etc . Fago de ARN: Como se usa en la presente el término de fago de ARN se refiere a virus de ARN que infectan bacterias, más específicamente a los virus de ARN en sentido positivo de hebra sencilla que infectan bacterias . Autoantígeno : Como se usa en la presente, el término auto antígeno se refiere a moléculas o compuestos que pueden codificarse por el ADN del hospedador. Estos incluyen péptidos proteínas, carbohidratos, ácidos nucleicos, lipidos y otras moléculas biológicas. Más típicamente y preferiblemente el término autoantígeno se refiere polipéptidos o proteínas codificados por el ADN del hospedador. Los productos generados por las proteínas o ARN codificado por el ADN del hospedador también se definen, como misma. Las proteínas modificadas a través de modificaciones pos traducezonales y procesamiento protiolitico o por el empalme alternativo de un producto de auto gen también de definen como misma. Los productos generados por las proteínas o ARN codificado por el ADN del hospedador se definen como mismos. Además las proteínas que resultan de una combinación de dos o varias automoléculas o que representan una fracción de una auto molécula y proteínas que tiene una alta homología con las auto moléculas como se definen arriba (<95%, preferiblemente <97%, más preferiblemente <99%) también se pueden considerar mismas . Vector: Como se usa en la presente, el término vector se refiere a un agente (por ejemplo, un plásmido o un virus) utilizado para transmitir material genético a una célula hospedadora. Un vector puede estar compuesto de ADN o ARN. Partículas de tipo virus (VLP) : Como se usa en la presente, el término partículas tipo virus se refiere a una estructura que se asemeja a una partícula de virus. Además una partícula de tipo virus de conformidad con la invención no es replicativa y no infecciosa ya que carece de todo o de una parte del genoma viral, en particular los componente replicativos e infecciosos del genoma viral . Una partícula tipo virus de conformidad con la invención puede contener un ácido nucleico diferente de su genoma. Una modalidad típica y preferida de la partícula tipo virus de conformidad con la presente invención, es una cápsidad viral tal como la c psida viral del virus correspondiente, bacteriófago o fago de ARN. Los términos cápsida viral o cápsida como se usa de forma intercambiable en la presente, se refieren a un ensamble macromolecular compuesto de subunidades de proteína viral . Típica y preferiblemente, la subunidades de proteína viral se ensamblan en una cápsida viral y cápsida respectivamente que tiene una estructura con una organización repetitiva inherente en donde la estructura es típicamente esférica o tubular. Por ejemplo, las cápsidas de los fagos de AR tienen un forma esférica de simetría en icosaedros . El término estructura de tipo cápsida como se usa en la presente se refiere a un ensamble macromolecular compuesto de subunidades de proteina de viral que se asemejan a la morfología cápsida en el sentido antes definido pero que se desvia de un ensamble simétrico típico mientras que se mantiene un grado suficiente de desorden y repetibilidad . Partícula tipo virus de un bacteriófago: Como se usa en la presente, el término partícula tipo virus de un bacteriófago se refiere a una partícula tipo virus que se asemeja a la estructura de una bacteriófago, que no es replicativa y no infecciosa y carece al menos del gen o genes que codifican la maquinaria de replicación del bacteriófago, y carecen también típicamente del gen o genes que codifican la proteína o proteínas responsables de la colocación viral o entrada en el hospedador. Esta definición debe sin embargo también abarcar partículas tipo virus de bacteriófagos, en las cuales el gen o genes antes mencionados está todavía presente o inactivos y por lo tanto, también conducen a partículas tipo virus no replicantes y no infecciosas de un bacteriófago . Partículas de virus : El término partículas de virus como se usa en la presente se refiere a una forma morfológica de un virus. En algunos tipos de virus comprende un genoma rodeado por una cápsida de proteína, otros tiene estructuras adicionales (por ejemplo, envolventes, colas, etc) . Uno, un o uno : Cuando los términos uno, un, o uno se usan en esta descripción significa al menos uno o uno o mas, a menos que se indique de otra manera. Como se usa en la presente cuando se refiere a cualquier valor numérico, el término alrededor significa un valor de ±10% del valor establecido (por ejemplo, alrededor de 50°C abarca un intervalo de temperatura desde 45°C a 55°C inclusive similármente "alrededor de 100 mM" abarca un rango de concentraciones desde 90 mM a 110 mM inclusive) .

Introducción . Se ha descubierto que las proteínas de recubrimiento AP205 recombinantes se pueden expresar las bacterias usando los vectores de la invención y obtenidas en forma purificada. Las proteínas de recubrimiento AP205 recombinantes de la presente se autoensamblan espontáneamente dentro de las bacterias en partículas tipo virus AP205. La invención proporciona células hospedadoras y vectores adecuados para la expresión de AP205 VLP y también formas variantes competentes de ensamble de la proteína de recubrimiento AP205. Estos VLP expresados los VLP de AP205 derivados de fuentes naturales o partículas vírales de AP205 también se pueden enlazar a moléculas orgánicas para producir configuraciones repetitivas ordenadas de las moléculas orgánicas . Las moléculas orgánicas de la invención incluyen antígenos, alérgenos, autoantígenos, haptenos, antigenos del cáncer y antígenos de enfermedades infecciosas. En una modalidad, las moléculas orgánicas usan polipéptidos o proteínas . Formación de conjugados de la invención, esto es, enlace de moléculas orgánicas a los VLP, se logra por colocación, ligadura fusión u otro enlace, que incluye enlaces covalentes y no covalentes. En una modalidad, el VLP contiene un primer sitio de colocación, la molécula orgánica contienen un segundo sitio de colocación. La asociación entre la molécula orgánica sucede al ligar el primero y segundos sitios de colocación, directamente o por medio de una tercera molécula típica y preferiblemente por un reticulador. Los sitios de colocación pueden presentarse naturalmente o se pueden introducir. En una modalidad preferida el enlace comprende al menos un enlace covalente preferiblemente comprende un enlace péptido o alternativamente y preferiblemente comprende un enlace que no es de péptido. Inmunización de animales con los conjugados AP205 VLP o con composiciones que comprenden tales conjugados como se suministran por la invención, inducen una respuesta inmune fuerte contra la molécula orgánica desplegada. Así, los conjugados y composiciones de la invención son útiles para la estimulación de una respuesta inmune contra una diversidad antígenos desplegados y así para el uso animales. La presente invención también se refiere a una vacuna que comprende una cantidad inmunológicamente efectiva de la composición de uno o más conjugados de la presente invención junto con un diluyente, portador o excipiente farmacéuticamente aceptable. Los VLP de AP205 se pueden usar para vacunar contra haptenos alérgenos, tumores, enfermedades virales o auto moléculas o moléculas pequeñas que no son de péptidos por ejemplo. La vacunación puede ser para propósitos profilácticos o terapéuticos o ambos . En una aspecto relacionado las moléculas inmunes y los anticuerpos respectivamente tales como anticuerpos generados contra tales composiciones se pueden usar para el tratamiento, profilaxis, o diagnóstico de una enfermedad, condición, o trastorno. Tales anticuerpos y composiciones de la invención también son útiles como kits.

Clonación de la proteína de recubrimiento del bacteriófago AP205. El genoma AP205 consiste de una proteína de maduración una proteínas de recubrimiento una replicasa ' y dos estructuras de lectura abiertas que no están presentes en los fagos relacionados, un gen de lisis y una estructura de lectura abierta que juega una papel en la traducción del gen de maduración (Klovins, J. , et al., J. Gen. Virol . 83: 1523-33 (2002) ) . En una aspecto de la invención, el ADNc de la proteína de recubrimiento se aisla por transcripción inversa del ARN del bacteriófago AP205 seguido por PCR usando métodos conocidos en el arte. El ADNc de la proteína de recubrimiento que incluye un sitio de enlace ribosomal en dirección ascendente del gen de la proteína de recubrimiento se clono en el vector pQblO (Kozlovska, T.M., et al., Gene 137: 133-37 (1993)) . En otro método, el ADNc de la proteína de recubrimiento AP205 se puede clonar en el vector pQbl85 reemplazando el gen de la proteína de recubrimiento del bacteriófago QB y así en dirección descendente de sitio de enlace ribosomal presente en el vector. Ambos métodos conducen a la expresión de la proteína en la formación de cápsida. Así, en la presente invención, la proteína de recubrimiento se puede expresar a partir de los vectores que contienen un sitio de enlace ribosomal que no es un sitio de enlace ribosomal AP205 tal como en el vector pQbl85. Los vectores pQblO y pQbl85 son vectores derivados de vector pGEM y la expresión de los genes clonados en estos vectores se controla promotor trp (Kozlovska, T.M. et al., Gene 137:133-37 (1993)). pAP283-58 (SEQ ID NO: 2) comprende un sitio de enlace ribosomal supuesto AP205 en la siguiente secuencia que está en la dirección descendente del sitio Xbal e inmediatamente en la dirección ascendente del codón de partida ATG de la proteína de recubrimiento AP205: tetasraATTTTCTGCGCACCCATCCGGGTGGCGCCCAAAGTGAGGAAAATCACatg (SEQ ID NO: 5) . El vector pQb!85 comprende una secuencia Shine Delagarno en dirección descendente del sitio Xbal y en dirección ascendente del codón de partida (tctagaTTAACCCAACGCGTAGGAG TCAGGCCatg (SEQ ID NO: 6), secuencia Shine Delagarno subrayada) , que también está presente en el vector pAP281-32 (SEQ ID NO: 4) . Otros vectores conocidos en el arte incluyen por ejemplo, pKK 223.3, familia de vector pET, pBR322 (Sutcliffe, J.G.Cold Spring Harb . Symp . Quant . Biol . 43 Pt 1:77-90(1979)), pUC 18, pUC19, que todos se modifican para comprender una promotor adecuado y sitios de enlace a ribosomas si no están presentes o no están adecuados para la expresión de la proteína de recubrimiento y la formación posterior de partículas tipo virus como se reconocería por alguien experto en la técnica. Otros vectores derivados de los vectores antes mencionados y otros vectores adecuados para la expresión de las proteínas en E. coli u otros hospedadores conocidos por alguien experto en la técnica y general cualquier vector adecuado para la expresión de proteínas en E.coli u otros hospedadores son adecuados para la práctica de la invención, con tal de que permitan la expresión de la proteína de recubrimiento y la formación posterior de partículas de tipo virus . En un aspecto de la presente invención, los vectores para la expresión del gen de la proteína de recubrimiento AP205 se transfectan en E. coli. Las cepas adecuadas de E. coli incluyen pero no se limitan a E. coli K802, JM 109, RR1. Otras cepas de E. coli se conocen por alguien experto ordinario en la técnica, y las combinaciones adecuadas de vectores y cepas se pueden identificar al probar la expresión de la proteína de recubrimiento por SDS-PAGE y la formación de ensamble y cápsida, al purificar primero opcionalmente las cápsidas por filtración con gel y posteriormente probarlas en un ensayo de inmunodifusión (prueba Ouchterlony) o microscopio de electrones (Kozlovska, T.M..et al., Gene 137 :133-37 (1993) ) . Las proteínas de recubrimiento AP205 expresadas de los vectores pAP283-58 y pAP281-32 pueden estar desprovistas del aminoácido inicial del metionina debido al procesamiento el citoplasma de E.coli. Los polipéptidos desdoblados con metionina y en particular en la presente el polipéptido desdoblado con metionina de SEQ ID NO: 1 Y SEQ ID NO: 3, así como las formas no desdobladas de los polipéptidos AP205 que conducen a los VLP de AP205 de acuerdo con la presente invención o mezclas de los mismos que también conducen a los VLP de AP205 de acuerdo con la presente invención, son modalidades y están dentro del alcance de la invención. Partículas tipo virus de AP205 En una modalidad, la invención proporciona proteínas de recubrimiento AP205 que forman cápsidas. Tales proteínas se expresan de forma recombinante o se preparan de fuentes naturales. Los fragmentos de proteínas de recubrimiento AP205 recombinantes que pueden ensamblarse en un VLP son modalidades adicionales de la invención. Estos fragmentos se pueden generar por eliminación, ya sea internamente o en las terminaciones de la proteína de recubrimiento. Las inserciones en la secuencia de la proteína de recubrimiento o fusiones con la secuencia de las proteínas de recubrimiento compatibles con el ensamble . en un VLP son modalidades adicionales de la invención. El resultado de las inserciones, eliminaciones y fusiones con la secuencia de la proteína de recubrimiento que es compatible con el ensamble en un VLP se puede determinar por un microscopio de electrones . La presente invención proporciona métodos de purificación para la proteína de recubrimiento ??205 recombinante. Las partículas formadas por la proteína de recubrimiento AP205 se pueden aislar en forma pura por una combinación de etapas de fraccionamiento por precipitación y de etapas de purificación por filtración con gel . Otros métodos de aislamiento de las partículas tipo virus se conocen en el arte y se pueden usar para aislar las partículas de tipo virus (VLPs) del bacteriófago AP205. Por ejemplo, el uso de ultracentrifugación para aislar los VLP del retrotransposon de levadura Ty se describe en la patente de E.U.A No. 4,918,166, que se incorpora aquí como referencia en su totalidad. Además de la filtración con gel, también se pueden usar otras etapas cromatográficas tales como el intercambio de iones, interacción hidrofóbica o cromatografía por afinidad. La expresión de la proteína de recubrimiento recombinante ??205 conduce al ensamble en partículas del tipo virus las cuales se analizan por la microscopía de electrones tiene una apariencia idéntica y tamaño como las partículas de fago. Es un hallazgo de la presente invención que los VLP se puedan purificar. Esta invención proporciona por lo tanto un nuevo VLP que se puede obtener en altas cantidades en una forma pura . Los VLP de AP205 autoensamblados de E.coli tienen una apariencia idéntica y tamaño que las partículas de fago AP205. Como se ha demostrado para otros VLP (VLP del polioma de VP1 y Papilloma Ll VLP, Chackerian B. et al., PNAS 96: 2373-2378 (1999) ) , la manipulación de condiciones experimentales o la fusión de epítopos de los VLP puede conducir a VLP con un estado diferente se ensamble. Por ejemplo, las partículas de un número de triangulación inferior que el wt o una forma principal de partícula se pueden obtener. Por lo tanto los VLP AP205 de tamaño pequeño que las partículas de fago AP205 o mezclas de los VLP de AP205 del mismo tamaño y de tamaño más pequeño que las partículas del fago AP205 también son modalidades de la invención. Cuando se analiza en un PAGE no reductor, las subunidades de VLP AP205 corren con un peso molecular aparente superior que cuando se analizan por PAGE de reducción, lo que muestra que se asocian los subunidades por puentes bisulfuro como se describe en el ejemplo 17 de WO 03/024481. En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un vector que contiene una estructura de lectura abierta adecuada para la producción de una partícula tipo virus AP205, el vector comprende además un ácido nucleico adicional de manera tal que el vector resultante puede producir una partícula tipo virus AP205 recombinante que comprenda aminoácidos codificados por el ácido nucleico adicional . En otro aspecto, la presente invención proporciona un vector que contiene una estructura de lectura abierta adecuada para la producción de una partícula de tipo virus AP205 el vector comprende además un sitio de enzima de restricción adecuado para la introducción de ácidos nucleicos adicionales, de manera que el vector resultante pueda producir una partícula de tipo virus recombinante que comprenda aminoácidos codificados por el ácido nucleico adicional .

Moléculas Orgánicas, Haptenos y Antígenos . Las moléculas orgánicas usadas en los métodos conjugados y composiciones de la presente invención incluyen algún antigeno hapteno molécula orgánica o fragmento del mismo. Las moléculas de la invención incluyen haptenos, moléculas orgánicas y fragmentos de antígenos que en sí mismos (esto es sin enlazarse al virus AP205 o partícula de tipo virus) no pueden inducir una respuesta inmune en un animal. La molécula orgánica incluye por ejemplo, (a) molécula orgánica adecuada para inducir una respuesta inmune contra células de cáncer; (b) moléculas orgánicas adecuadas para inducir una respuesta inmune contra enfermedades infecciosas; (c) moléculas orgánicas adecuadas para inducir una respuesta inmune contra alérgenos (d) moléculas orgánicas adecuadas para inducir una respuesta inmune contra auto antígeno (e) antígenos o ápetenos adecuados para inducir una respuesta inmune contra fármacos hormonas o toxinas particularmente fármacos de abuso y (f) fragmentos (por ejemplo, un dominio) de cualquiera de molécula orgánica antígenos o haptenos establecidos en (a) -(e) .

Enfermedades Infecciosas . En una modalidad específica de la invención la molécula orgánica antígeno o determinante antigénico es uno que es útil para la prevención de enfermedades infecciosas. Tal tratamiento será útil para tratar una amplia variedad de enfermedades infecciosas que afecten a un amplio rango de hospedadores por ejemplo, especies humanas, de vacas, oveja, cerdo, perro, gato y otras especies de mamíferos y también especies que no son de mamíferos. Tales vacunas se pueden usar profilácticamente para evitar una infección en un individuo o población, o terapéuticamente para mitigar una infección en marcha. Las enfermedades infecciosas para las cuales se conoce o se desea una vacuna, son bien conocidas por expertos en la técnica, los ejemplos incluyen infecciones de etiología viral tales como VIH influenza herpes hepatitis viral, Epstein Barr, polio, encefalitis viral sarampión viruela, etc, infecciosas de etiología bacteriana tales como neumonía tuberculosis, cifilis, enfermedad de lyme, cólera salmonelosis , meningitis, sepsis, etc, o infecciones de etiología de parásitos tales como paludismo, tripanosomiasis, leismaniasis , tricomaniasis , amibiasis, etc. Los antígenos o determinantes antigénicos usados en los conjugados, composiciones, y métodos de la invención se conocen por aquellos de experiencia ordinaria en las técnicas relevantes. Ejemplos de los antígenos o determinantes antigénicos incluyen los siguientes: los antígenos del VIH gp 140 y gp 160; los antígenos de la influenza hemaglutinina, la proteína M2 y la neuraminidasa, antígeno de superficie de la hepatis B y proteínas de la circumsporozoita y malaria.

En una de tales modalidades de la invención, el antígeno o determinante antigénico se selecciona del grupo que consiste de (a) una proteína recombinante del VIH, (b) una proteina recombinante del virus de la influenza (por ejemplo, una proteína M2 del virus de la influenza o un fragmento del mismo, (c) una proteína recombinante del virus de hepatitis C, (d) una proteína recombinante de Toxoplasma, (e) una proteína recombinante de Plasmodium falciparum, (f) una proteína recombinante de Plasmodium vivax, (g) una proteína recombinante de Plasmodium ovale (h) una proteína de Plasmodium malariae, (i) una proteína recombinante de Chlamydia y (j ) un fragmento de cualquiera de las proteínas establecidas en (a) - (i) . En otra modalidad, la invención se lleva a composiciones de vacunas que comprenden al menos una antígeno o determinante antigénico codificado por un ácido nucleico viral de la influenza, y el uso de tales composiciones de vacuna para producir respuestas inmunes. En tal modalidad específica el antígeno de la influenza o determinante antigénico es una proteína 2 (por ejemplo, una proteína M2 que tiene los aminoácidos que se muestran en número de acceso al GenBank P06821, número de acceso PIR MFIV62 , o fragmento del mismo (por ejemplo, aminoácidos desde alrededor de 2 hasta alrededor de 24) . Porciones de una proteína M2 así como otras proteínas contra las cuales se busca una respuesta inmunológica. Adecuadas para su uso en la invención que comprenden péptidos de cualquier número de aminoácidos de longitud pero que serán generalmente de al menos 6 aminoácidos (por ejemplo, los péptidos 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 95, o 97 aminoácidos de longitud).

Hormonas, Toxinas y Fármacos especialmente fármacos de abuso . En un aspecto adicional la invención proporciona composiciones adecuadas para estimular las respuestas innmunes contra los haptenos . Estos haptenos incluyen pero no se limitan a hormonas fármacos y compuesto tóxicos . Las respuestas inmunes contra diversidad de fármacos hormonas y compuesto tóxicos se usan proteger a un individuo en riesgo de exposición a tales compuestos, como terapia de un individuo expuesto o tales compuestos o para evitar o tratar adacciones a tales compuestos . Los compuestos tóxicos representativos incluyen pero no se limita con productos naturales de plantas tóxicas animales y microorganismos. Tales productos aflatoxina, toxina, de la ciguautera, y tetrodoxina. Otros compuestos tóxicos representativos producidos artificialmente o como resultado del metabolismo incluyen antibióticos (por ejemplo, vancomincina) , compuestos anticancer (por ejemplo, vinblastina) y agentes para guerra química (por ejemplo, Sarin, gas mostaza VX) . Un aspecto de la invención incluye la producción de anticuerpos contra metabolitos tóxicos de agentes farmacéuticos comúnmente usados tales como que un individuo puede continuar recibiendo los efectos benéficos de un agente farmacéutico sin los efectos laterales asociados con los metabolitos tóxicos. Así en una modalidad preferida, la toxina es un metabolito generado en el cuerpo de un individuo, en donde el metabolito es un metabolito de un agente farmacéutico. En una modalidad adicional preferida la toxina es un agente de guerra química. Las moléculas orgánicas, antígenos o determinantes antigénicos adecuados para su uso en conjugados, composiciones y métodos de tratamiento de la adicción a drogas, en particular adicción a drogas recreativas se conocerán aquellos de experiencia ordinaria en las artes relevantes. Los ejemplos representativos de moléculas orgánicas o antígenos o determinantes antigénicos incluyen por ejemplo, opioides, o derivados de morfina tales como codeína, fentanilo, heroína, morfina, y opio, estimulantes tales como la anfetamina, cocaína, MDMA (metilendioximetanfetamina) , metanfetamina , metilfenidato y nicotina, alucinógenos como el LSD, mescalina y psilocibina, canabinoides tales como el hachís y mariguana, otros fármacos de adicción o compuestos y 1 derivados, subproductos, variantes y complejos de tales compuestos .

Alergias y Cáncer En modalidades relacionadas, la invención proporciona composiciones adecuadas para su uso como inmunoterapéuticos que se pueden usar para el tratamiento o prevención de alergias o cáncer. Los antígenos o determinantes antigénicos adecuados para su uso en conjugados, composiciones y métodos de tratamiento o prevención de alergias, se conocería por aquellos de experiencia ordinaria en el arte relevante. Los ejemplos representativos de tales antígenos o determinantes antigénicos incluyen los siguientes: fosfolipasa de veneno de abeja A2, Bet vi (alérgeno del polen del abedul) , 5 Dol m V (alérgeno del veneno del avispón de cara blanca) , melitina y Der p I (alérgeno del acaro del polvo de las casas) gluten gliadina, alérgenos de los mariscos, alérgenos de la cucaracha, cacahuate y otros alérgenos de las nueces, ambrosia y otros alérgenos del polen, alérgenos de la grevillea así como fragmentos de cada uno de los cuales se puede usar para producir respuestas inmunológicas . En una modalidad en particular de la invención el alérgeno se selecciona del grupo que consiste de (a) una proteína recombinante de la alergia a la picadura de abeja (b) una protelna recombinante de la alergia de las nueces (c) proteínas recombinantes de alergias a los alimentos (d) proteínas recombinantes del asma (e) una proteína recombinante de Chlamydia y (f) un fragmento cualquiera de los alérgenos de (a) hasta (e) . Como se observa arriba un antígeno o determinante antigénico adecuado para su uso en los conjugados composiciones o métodos de la presente invención es Der p I . Der p I es una proteasa de 25kD que se encuentra en las partículas fetales de ácaros de polvos de las casas y representan el mayor 80% de los pacientes alérgicos a los ácaros tiene anticuerpos anti-Der p I IgE. En particular los péptidos Der pl y p52-72 y pll7-133 (SEQ ID NO: 64), entre otros se sabe que comprenden epítopos que se reconocen por anticuerpos específicos para los anticuerpos nativos Der p I IgE formulados en una respuesta polxclonal al antígeno entero enlazado con alta afinidad a la región del péptido 59-64 (L. Pierson-Mullany et al. (2000) Molecular Immunology) . Otras regiones también enlazan IgE con alta afinidad. El péptido pll7-133 contiene una cisteína en su terminación N que representa el segundo sitio de colocación de conformidad con la invención. La modelación 3D asigna péptidos p52-72 y pll7-133 a la superficie de la proteína entera (Jeannin, P. et al., Molecular Immunology 30:1511-1518(1993)). Sin embargo, otros fragmentos de la proteína Der p I pueden comprender epltopos de células B adecuados para la presente invención. En una modalidad preferida de la composición de la invención, el antígeno o determinante antigénico es un péptido Der pl, y en donde el péptido DerpI con el segundo sitio de colocación tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: a) CGNQSLDLAEQELVDCASQHCH (SEQ ID NO: 97); y . b) CQIYPPNANKI EALAQTHSA (SEQ ID NO : 64) . En modalidades adicionales, la invención proporciona composiciones de vacuna adecuadas para su uso en métodos para la prevención y/o atenuación de reacciones alérgicas tales como las reacciones alérgicas que conducen a la anafilaxis. Como se describe en alguna otra parte en la presente, las reacciones alérgicas se pueden caracterizar por las respuestas TH2 contra un antígeno que conduce a la presencia de anticuerpos IgE. La estimulación de las respuestas inmunes TH1 y la producción de anticuerpos IgG pueden mejorar la enfermedad alérgica. Así, las composiciones de vacuna de la invención incluyen composiciones que conducen a la producción de anticuerpos que evitan y/o atenúan reacciones alérgicas. Así, en ciertas modalidades, las composiciones de vacuna de la invención incluyen composiciones que producen una respuesta inmunológica contra un alérgeno. Los ejemplos de tales alérgenos incluyen fosfalipasas tales como las proteínas de fosfolipasa A2 (PLA2) , de Apis ellifera (No. de acceso a GenBank 443189, No. de acceso a GenBank 229378) , Apis dorsata (No. de acceso a GenBank B59055) , Apis cerana (No. de acceso a GenBank A59055) , Bombus pennsylvanicus (No. de acceso a GenBank B56338) , y Heloderma suspectum (No. de acceso a GenBank P80003; No. de acceso a GenBank S14764; No. de acceso a GenBank 226711) . Al usar la secuencia de aminoácidos de una proteína PLA2 de Apis mellífera (No. de acceso a GenBank 443189, No. de acceso a GenBank 229378) para ilustración, los péptidos de al menos alrededor de 60 aminoácidos de longitud que representan alguna porción de la secuencia completa PLA2, también se pueden usar en composiciones para evitar y/o atenuar las reacciones alérgicas. Los ejemplos de tales péptidos incluyen péptidos que comprenden los aminoácidos 1-60, aminoácidos 1-70, aminoácidos 10-70, aminoácidos 20-80, aminoácidos 30-90, aminoácidos 40-100, aminoácidos 47-99, aminoácidos 50-110, aminoácidos 60-120, aminoácidos 70-130 o aminoácidos 90-134 así como porciones correspondientes de otras proteínas PLA2 (por ejemplo las proteínas PLA2 antes descritas) . Ejemplos adicionales de tales péptidos incluyen péptidos que incluyen los aminoácidos 1-10, aminoácidos 5-15, aminoácidos 10-20, aminoácidos 20-30, aminoácidos 30-40, aminoácidos 40-50, aminoácidos 50-60, aminoácidos 60-70, aminoácidos 70-80, aminoácidos 80-90, aminoácidos 90-100, aminoácidos 100-110, aminoácidos 110-120 o aminoácidos 120-130 así como porciones correspondientes de otras proteínas PLA2 (por ejemplo, las proteínas PIA2 antes descritas) . Las porciones de PLA2 así como porciones de otras proteínas contra las cuales se busca una respuesta inmunológica, adecuadas con su uso con la invención pueden comprender o consisten alternativamente de péptidos que tienen generalmente al menos 6 aminoácidos de longitud (por ejemplo los péptidos 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 aminoácidos de longitud) . Los péptidos PLA2 (por ejemplo, las proteínas de longitud completa PLA2 antes discutidas así como su porción de cada una) también se pueden acoplar a cualquier sustancia (por ejemplo, una proteína cápsida AP205 o fragmento de la misma) lo que permite las formaciones de configuración de antígeno ordenadas y repetitivas. La selección de antígenos o determinación antigénicas para composiciones y métodos de tratamiento para cáncer debería conocerse por aquellos de habilidad ordinaria en las técnicas relevantes. En una modalidad particular de la invención, la determinante antigénica o de antígeno se selecciona del grupo que consiste de: (a) una proteína recombinante de células de cáncer de mama; (b) una proteína recombinante de células de cáncer de riñon; (c) una proteína recombinante de células de cáncer de próstata; (d) una protelna recombinante de células de cáncer de piel; (e) una proteína recombinante de células de cáncer de cerebro; (f) una proteína recombinante de células de cáncer de leucemia; (g) un perfil recombinante; y (h) un fragmento de cualesquiera de las proteínas establecidas en (a) - (g) . Los ejemplos representativos de tales tipos antígenos o determinantes antigénicos incluyen lo siguiente: Her2 (cáncer de mama) , GD2 (neurobl stoma) , EGF-R (glioblastoma maligno) , CEA (cáncer medular de la tiroides) , y CD52 (leucemia) , proteína de melanoma humano gplOO, proteína de melanoma humano melan-A/MART-1 , tirocinasa, proteína NA17-A nt, proteína MAGE-3, proteína p53, y proteína HPV16E7, así como fragmentos de cada una de las cuales se puede usar para producir respuestas inmunológicas . Los determinantes antigénicos adicionales útiles para composiciones y métodos de tratamiento para el cáncer, son moléculas y determinantes antigénicos involucrados en la angiogénesis . La angiogénesis , la formación de nuevos vasos sanguíneos, juega un papel esencial en los procesos fisiológicos y patofisiológicos tales como la cicatrización de heridas y el crecimiento de tumores sólidos respectivamente (Folkman, J. (1995) JTat Medicine 1, 27-31; Folkman, J. , and Klagsburn, M. (1987) Science 235, 442-446; Martiny-Baron, G. , and Marmé, D. (1995) Curr.Opin. Biotechnol . 6, 675-680; Risau, w. (1997) Nature 386, 671-674) . Los tumores que crecen rápidamente se inician y dependen de la formación de vasos sanguíneos para suministrar el suministro de sangre requerido. Así, se cree que los agentes anti ngiogénicos son efectivos como terapéuticos anticáncer. Entre los diversos factores angiogénicos supuestos que se han identificado, el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF, popr sus siglas en inglés) es un mitogeno potente especiales de células endoteliales y un estimulante primario de la vascularización de muchos tumores sólidos. Así, el bloqueo de la acción VEGF es un objetivo para la intervención en la angiogénesis producida por tumores, como un medio de bloqueo del endotelio más que el del tumor como una estrategia para combatir tumores (Millauer, B. et al., (1994) Nature 367, 576-579; Kim, J et al. (1993) Nature 362, 841-844) . Un anticuerpo anti-VEGFR-II (IMC-1C11) y un anticuerpo anti-VEGF se han descrito (Lu, D. et al. (2000) J. biol. Chem. 275, 14321-14330; Presta, L. G, et al (1997) Cáncer Res. 47, 4593-4599) . El anticuerpo anti-VEGFR-2 monoclonal neutralizante anterior reconoce un. epítopo que se ha identificado como sitio de enlace supuesto VEGF/VEGFR-II (Piossek, C. et al. (1999) J Biol Chem. 274, 5612-5619). Así, en una modalidad de la invención, el antígeno o determinante antigénico usado en los conjugados, métodos o composiciones de la invención, es un péptido derivado del sitio de contacto VEGFR-II. Esto proporciona una composición y una composición de vacuna de acuerdo con la invención, que puede tener propiedades angiogénicas útiles para el tratamiento del cáncer. La inhibición del crecimiento del tumor en ratones usando sueros específicos para VEGFR-2 se ha demostrado (Wei, YQ et al. (2000)Nature Medicine 6, 1160-1165) . Por lo tanto, los determinantes antigénicos adicionales adecuados para las composiciones de la invención y composiciones de vacuna antiangiogenicas de conformidad con la invención, comprenden el péptido derivado VEGFR-II humana con la secuencia de aminoácidos CTARTELNVGI DFNWEYPSSKHQHKK (SEQ ID NO: 99) , y/o el péptido derivado de murina VEGFR-II que tiene la secuencia de aminoácidos CTARTELNVGLDFTWHSPPSKHHKK (SEQ ID NO: 113) y/o los dominios globulares extracelulares relevantes de 1-3 de VEGFR-II.

Autoantígenos En modalidades específicas, la invención proporciona composiciones de vacuna adecuadas para su uso en métodos para la prevención y/o atenuación de enfermedades o condiciones que son provocadas o exacerbadas por productos de autogenes (por ejemplo, factores de necrosis de tumor) . Usualmente es difícil sino es que imposible, inducir respuestas de anticuerpos para automoléculas por vacunación convencional. La presente invención proporciona una forma de mejorar la eficiencia de la vacunación al incrementar el grado de repetibilidad del antígeno a usarse para inmunización a través del enlace del antígeno al AP205 VLP. A diferencia de las proteínas aisladas, los virus que producen respuestas inmunes prontas y eficientes en ausencia de cualquier adyuvante tanto con y sin auxilio de células T (Bachmann & Zinkernagel, Ann. Rev. Inxnunol: 15:235-270 (1997) ) . No obstante que varios virus consisten a menudo de algunas proteínas, estas son capaces de disparar respuestas inmunes muchos más fuertes que sus componentes aislados. Para respuestas de células B, se conoce que un factor crucial para la inmunogenicidad de los virus es la repetitividad y orden de epítopos de superficie. Muchos virus exhiben una superficie cuasi-cristalina que exhibe una configuración regular de inmunoglobulinas específicas de epítopo eficientemente reticulada en células B (Bachmann & Zinkernagel, Jmmunol . Today: 17:553-558 (1996)). Esta reticulación de inmunoglobulina de superficie en células B es una señal de activación fuerte que induce directamente el progreso del ciclo celular y la producción de anticuerpos IgM. Además, tales células B disparadas son capaces de activar células auxiliares T que de nuevo inducen el encendido de la producción de anticuerpo IgM a IgG en células B y la generación de la memoria de célula B de larga vida, el punto mayor de cualquier vacuna (Bachmann & Zinkernagel, Ann.

Rev. Im unol: 15:235-270 (1997)). La estructura viral aún se enlaza a la generación de anti-anticuerpos en enfermedad inmune y como parte de la respuesta natural de los patógenos (ver Fehr, T . , et al., J" Exp. Med. 185:1785-1792 (1997). De esta manera, los anticuerpos presentados por una superficie viral altamente organizada son capaces de inducir respuestas de anti-anticuerpos fuertes. El sistema inmune usualmente falla al producir anticuerpos contra estructuras auto derivadas. Para antígenos solubles presentes a bajas concentraciones, se debe a la tolerancia del nivel de célula Th. Bajo estas condiciones, el acoplamiento del auto antígeno al portador que puede entregar la célula T puede romper la tolerancia. Para proteínas solubles presentes a altas concentraciones o proteínas asociadas a la membrana a bajas concentraciones pueden ser tolerantes las células B y H- Sin embargo, la tolerancia de la célula B puede ser reversible (anérgica) y puede romperse por la administración del antígeno de una manera altamente organizada acoplado a un portador externo (Bachmann & Zinkernagel, Ann. Rev. Immunol: 15:235-270 (1997)). De esta, manera las composiciones de vacuna de la invención incluyen conjugados, composiciones y métodos que llevan a la producción de anticuerpos que previenen y/o alivian enfermedades o condiciones causadas o exacerbadas por los productos de gen "propios" . Los ejemplos de tales enfermedades o condiciones incluyen enfermedad injerto contra hospedador, reacciones alérgicas mediadas por IgE, anafilaxis, síndrome de tensión respiratoria adulto, enfermedad de Crohn, asma alérgico, leucemia linfoblástica aguda (ALL) , diabetes, linforna no de Hodgkin (NHL) , enfermedad de Graves, lupus eritematoso sistémico (SLE) , enfermedades autoinmunes inflamatorias, miastemia gravis, linfadenopatí de enfermedad inmunoproliferativa (IPL) , linfadenopatía angioinmunoproliferativa (AIL) , linfadenopatía de inmunoblastos (IBL) , artritis reumatoide, diabetes, esclerosis múltiple, enfermedad de Alzheimer, osteoporosis, y condiciones autoinmunes asociadas con ciertas infecciones que incluyen fiebre reumática, fiebre escarlata, enfermedad de lyme, y poliartritis infecciosa. La selección de antígenos o determinantes antigénicas para conjugados, composiciones y métodos de tratamiento para otras enfermedades o condiciones asociadas con los autoantígenos , también se conocería por aquellos de experiencia ordinaria en la técnica relevante. Los ejemplos representativos de tales antígenos o determinantes antigénicas son, por ejemplo, linfotoxinas (p.ej., linfotoxina a (LT a), Linfotoxina ß (LT ß) ) , y receptores de linfotoxina, activador del receptor del ligando kB de factor nuclear (RANKL) , factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) , receptor de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF-R) , interleucina 5, interleucina-17 , interleucina-13 , CCL21 , CXCL12, SDF-1, MCP-1, endoglina, resistina, GHRH, LHRH, TRH, MIF, eotaxina, bradicinina, BLC, factor a de necrosis de tumor y péptido beta amiloide (?ß?_ 2) , así como fragmentos de cada uno de los cuales pueden usarse para sacar respuestas inmunológicas . En una modalidad, la determinante antigénica es él péptido beta amiloide (?ß?_42) (DAEFRHDSGYEVHHQ LVFFAEVGSNKGAIIGLMVGGWIA (SEQ ID NO: 7)), o un fragmento del mismo. El péptido ?ß tiene un papel central en la neuropatológica de la enfermedad de Alzheimer. La acumulación extracelular, específica de región, del péptido ?ß se realiza por microgliosis, cambios citoesgueletal , neuritis distrófica y perdida sináptica. Estas alteraciones patológicas son enlazadas por la declinación cognitiva que define la enfermedad. En un modelo de ratón que tiene Alzheimer, los animales transgénicos producidos por ingeniería genética para producir ¦?ß?-42 (ratones-PDAPP) , desarrollan placas y daño de neurona en sus cerebros. El trabajo reciente ha mostrado que la inmunización de ratones PDAPP jóvenes, usando ?ß!-42 resulten en la inhibición de la formación de placa y la neuritis distrófica asociada (Schenk, D. et al., Nature 400: 173-77 (1999) ) . Adicionalmente , la inmunización de ratones PDAPP más viejos que ya han desarrollado patologías tipo AD, reduce la extensión y progreso de las neuropatologías . En otros estudio, anticuerpos administrados periféricamente erigidos contra ?ß?-2, son capaces de inducir la liberación de amiloide pre-existente (Bard, F. et al., Nature Medicine 6:916-19 (2000)). Este estudio utiliza ya sea anticuerpos policlonales elevados erigidos contra ?ß?_42, o anticuerpos monoclonales erigidos contra fragmentos sintéticos derivados de regiones diferentes de ?ß. Esta inducción de anticuerpos contra ?ß usa los conjugados, métodos y composiciones de la presente invención puede considerarse como un tratamiento terapéutico potencial de la enfermedad de Alzheimer. Esta bien establecido que la administración de proteínas purificadas solas usualmente no es suficiente para erigir una respuesta inmune fuerte; el antígeno aislado generalmente deberá darse junto con substancias auxiliares llamadas adyuvantes. Con estos adyuvantes, el antígeno administrado se protege contra la degradación rápida y el adyuvante proporciona liberación extendida de un nivel bajo de antígeno. En la presente invención, el péptido ?ß o fragmentos del mismo se hacen inmunogénicos a través del enlace a AP205 VLP y no necesariamente requiere un adyuvante.

Como se indica, uno de los eventos principales de la enfermedad de Alzheimer (AD) es la desposición de amiloides como masa fibrosa insoluble (amiloidegénesis) que resulta en placas y depósitos neuríticos extracelulares alrededor de las paredes de los vasos sanguíneos cerebrales (para revisión ver Selkoe, D.J. (1999) Nature. 399, A23-31) . El constituyente principal de las placas neuríticas y la angiopatía congofílica es el amiloide ß (?ß) , no obstante que estos depósitos contienen otras proteínas tal como glicosaminoglicanos y apoliproteínas . La ?ß se desdobla proteoliticamente desde una glicoptroteína más grande conocida como proteínas de precursor amiloide. (APPs) , que comprenden isoformas de 695-770 aminoácidos con una región de transmembrana hidrofóbica sencilla. La ?ß forma un grupo de péptidos de hasta 43 aminoácidos de longitud que muestra una heterogenicidad de la terminal amino y carboxi (truncación) así como modificaciones (Roher, A.E. et al (1988) J. Cell Biol. 107, 2703-2716. Rocher, A. E. et al (1993) JU. Neurochem. 61,1916-1926). Las isoformas prominentes son ?ß 1-40 y 1-42. Tiene una alta propensión a formar agregados laminares ß en fibrilos, lo que por último lleva al amiloide. Estudios recientes han demostrado que la reducción inducida por vacuna en los depósitos amilodies cerebrales resultan mejor en la cognición (Echen, D et al. (1999) Nature. 400, 173-177) . Por lo tanto, los fragmentos de ?ß apropiados para generar vacunas de la invención incluyen, pero no se limitan a: ?ß 1-15, ?ß 1-27 y ?ß 33-42. Un enlazador de aminoácido se fusiona a la secuencia de aminoácidos de ?ß o los fragmentos ?ß, para permitir el acoplamiento a AP205 VLP, como se describe en la presente en cualquier lugar. Los enlazadores de aminoácido apropiados para la fusión a la terminal N de ?ß o fragmentos de ?ß incluyen pero no se limitan a la secuencia CGG y CGHGNKS . Los enlazadores apropiados para la fusión a la terminal C de ?ß o fragmentos de ?ß incluyen pero no se limitan a la secuencia GGC. En una modalidad, cuando se fusiona un enlazador a la terminal C de ?ß o fragmentos de ?ß, se amidata la cisteína de terminal C. El fragmento ?ß 1-15 se fusiona a un enlazador de aminoácido y tiene la secuencia: DAEFRHDSGYEVHHQGTGC- H2 (SEQ ID NO: 8), en donde se amida la cisteína de terminal C, que se indica por la ???2" de terminal C. El fragmento ?ß de 1-27 se fusiona a un enlazador de aminoácido y tiene la secuencia: DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNGGC- H2 (SEQ ID NO: 9) . El fragmento ?ß 33-42 se fusiona a un enlazador de aminoácido y tiene la secuencia: CGHGNKSGLMVGGWIA (SEQ ID NO: 10) . En una modalidad de la invención, el antígeno o determinante antigénica comprende, o preferiblemente es, un péptido de angiotensina o un fragmento del mismo. El término "péptido de angiotensina" como se usa en la presente, abarca cualquier péptido que comprende la secuencia o fragmento de la misma, de una angiotensinógeno, angiotensina I o angiotensina II. La angiotensina se asocia con la hipertensión (Gardiner et al, Br. J. Pharm. 129:1178 (2000)).

Por lo tanto, los conjugados, composición y métodos de la presente invención apropiados para reducir niveles de angiotensina son apropiados para el tratamiento de hipertensión. En una modalidad, el conjugado o composición comprende al menos un péptido de antigiotensina. La secuencia de aminoácidos de péptidos en algunas modalidades son como siguen: angiotensinógenos : DRVYIHPFHLVIHN (SEQ ID NO: 11); angiotensina I: DRVYIHPFHL (SEQ ID NO: 12); angiotensina II: DRVYIHPF (SEQ ID NO: 13) . Típicamente, uno o más aminoácidos se agregan a la terminal C y/o N de la secuencia de péptido de angiotensina. Aquellos aminoácidos adicionales son, en particular valiosos para una asociación orientada y ordenada a la partícula de tipo virus AP 205. La secuencia de los péptidos de angiotensina corresponde a la secuencia humana, que es idéntica a la secuencia de murina. Por lo tanto, la inmunización de un humano o un ratón con vacunas o composiciones, respectivamente comprende tales péptidos de angiontensiona como un antígeno o determinante antigénica de conformidad con la invención, es una vacuna contra un autoantigeno . En algunas modalidades, el péptido de angiotensina con el segundo sitio de enlace tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: a) la secuencia de aminoácidos de CGGDRVYIHPF (SEQ ID NO: 14) ,· b) la secuencia de aminoácidos de CGGDRVYIHPFHL (SEQ ID NO: 15); c) la secuencia de aminoácidos de DRVYIHPFHLGGC (SEQ ID NO: 16) ; y d) la secuencia de aminoácidos de CDRVYIHPFH (SEQ ID NO: 98) . En otra modalidad de la invención, la determinante antigénica es RANKL (activador del receptor del ligando NFkB) . El RANKL también se conoce como TRANCE (Citocina que induce la activación relacionada con TNF) , ODF (Factor de diferenciación de osteoclasto) o OPGL (Ligando de osteoprotegerina) . La secuencia de aminoácidos de la parte extracelular de RANKL humano se muestra en la base de datos EMBL deposito RANKL_humano : TrEMBL:014788. Las secuencias para la parte extracelular de RANKL murino y una isoforma se muestran en la base de datos EMBL deposito RANKL-ratón: TrEMBL:035235, y en las formas de empalme RANKL_ratón: TrEMBL : Q9JJK8 y TrEMBL : Q9JJK9 , respectivamente. Se ha mostrado que RANKL es un factor esencial en la osteoclastogénesis . La inhibición de la interacción de RANKL con su receptor RANK puede llevar a una supresión de osteoclastogénesis y de esta manera proporcionar un método para detener la resorción ósea excesiva como se muestra en la osteoporosis y otras condiciones. La interacción RANKL/RANK se inhibe ya sea por una proteína de fusión RANK-Fc o el receptor señuelo soluble de RANKL, llamado osteoprotegerina (OPG) . En el hueso, el RANKL se expresa en células estromales u osteoblastos, mientras que RANK se expresa en el precursor osteoclasto. La interacción de RANK y RANKL es crucial para el desarrollo de precursores de osteoclasto a osteoclastos maduros. La interacción puede bloquearse por OPG, La osteoporosis desarrollada por ratones deficientes en OPG que pueden rescatarse por inyección de OPG recombinante, sugiere que OPG es capaz de invertir la osteoporosis. De esta manera, la inhibición de la interacción RANK-RANKL al proporcionar conjugados apropiados, composiciones y métodos de la invención (por ejemplo, conjugados RANKL-AP205 VLP) son efectivos en invertir o prevenir la osteoporosis. Además, la calcificación arterial se observa en ratones agénicos OPG que podrán invertirse por inyección de OPG (Min et al., J. Exp. Med. 4:463 (2000)). En un modelo de artritis inducida por adyuvante, la inyección OPG fue capaz de prevenir la perdida ósea y la destrucción del cartílago, pero no la inflamación (hinchado de garras) . Se asume que las células T activadas llevan a un incremento mediado por RANKL de osteoclastogénesis y perdida ósea. OPG inhibe la osteoclastogénesis inducida por el cáncer de próstata y previene el crecimiento de tumor de próstata en el hueso de ratones. OPG disminuye el avance del dolor de cáncer ósea en ratones . RANKL es una proteína de transmembrana de 245 aa que pertenece a la superfamilia TNF. Parte de la región extracelular (178aa) puede desdoblarse por una proteasa tipo TACE (Lum et al., J Biol . Chem. , 274: 13613 (1999)). Además, las variantes de empalme carecen del dominio de transmembrana se han descrito (Ikeda et al., Endocrinologyl 142: 1419 (2001) ) . La porción celular desdoblada contiene el dominio altamente homólogo para TNF-a soluble y forma homotrimeros como se aprecia por TNF- . La terminación C se aprecia que está involucrada en el sitio de contacto de trímero. Una cisteína está presente en la región de la secuencia. Se ha construido un modelo para la estructura tridimensional de la región correspondiente de RANKL y se ha encontrado que la cisteína presente de forma natural puede no ser accesible en la estructura de doblado para la interacción con el primer sitio de enlace en el portador de conformidad con la presente invención. La terminación N en un sitio apropiado para lavar un segundo ciclo de enlace comprende un enlazador de aminoácido con un residuo de cisteína adicional. Un constructo humano-RANKL con un enlazador de aminoácidos de terminal N contiene un residuo de cisteína fusionado a su parte extracelular de RANKL en una modalidad de la invención. Sin embargo, un enlazador aminoácido que contiene un residuo de cisteína como el segundo sitio de enlace y está fusionado en la terminal C de la secuencia RANKL o la parte extracelular de RANKL, lleva a modalidades adicionales de la invención. Los constructos humanos-RANKL se generan de conformidad con las enseñanzas descritas en la presente y alguien de habilidad en la técnica será capaz de comparar las secuencias RANKL de murino y humano en una secuencia de aminoácidos alineada para identificar la parte de la secuencia de humano-RANKL a clonarse en los vectores . Los fragmentos que contienen los aminoácidos 138-317 y los correspondientes a la región de terminal C del dominio extracelular de RANKL, comprenden una modalidad de la invención, y se modifican para acoplar AP205 VLP como se requiera de conformidad con las enseñanzas de la presente invención. La invención también abarca otros vectores apropiados usados para la expresión en el hospedador apropiado descrito abajo. Los constructos humanos-RANKL adicionales que se pretende que se abarquen dentro del alcance de la presente invención, incluyen aquellos que comprenden la parte de la región extracelular (178aa) o fragmentos de la misma que pueden cubrirse con una proteasa tipo TACE (Lum et al., J Biol . Cheem. 274:13613 (1999) ) , o que comprende la secuencia correspondiente a las variantes de empalme alternativo que carece del dominio de transmembrana, así como fragmentos conservadores del mismo. Los fragmentos de terminal C humanos de RANKL comprenden los aminoácidos 165-317 también son modalidades de la invención. Los fragmentos de RANKL que abarcan la región extracelular completa (aminoácidos 71-317) y pueden modificarse para acoplarse a AP205 VLP y como se requiera de conformidad con las enseñanzas de la presente invención, también están dentro del alcance de la invención. RANKL se ha expresado en diferentes sistemas (por ejemplo E. coli, células de insectos, células de mamíferos) y se ha demostrado que es activo. Por lo tanto, se pueden usar diversos sistemas de expresión para la producción de antígenos RANKL de la composición. En el caso en donde la expresión de la proteína de dirige al periplasma de E- coli, el péptido de señal de RANKL, o los constructos de RANKL que consisten de la parte extra celular de la proteína y ambos · posiblemente modificados para comprender un segundo sitio de colocación de conformidad con la invención, se reemplaza con un péptido de señal bacteriano. Para la expresión de la proteína en el citoplasma de E. coli, los constructos RANKL están desprovistos del péptido de señal . En una modalidad de la invención el determinante antigénico es MIF o un fragmento del mismo. El MIF es una citocina que funciona como un inhibidor de la migración de macrófagos . También se conoce como proteína 6 de respuesta temprana retrazada (DER6) factor de inhibición de la glicosilación o tautomerasa fenilpiruvato . El MIF se ha demostrado que está implicado en un amplio rango de condiciones . MIF (mARN y proteína) está sobreregulado en la reacción de hipersensibilidad de tipo retrasado (DTH) inducida por tuberculina y el anticuerpo anti- IF inhibe esta reacción DTH. El MIF también se sobreregula en el rechazo renal de haloinjerto. En un modelo para la enfermedad autoinmune ocular, uvoretinitis autoinmune experimental (EAU) , el tratamiento anti-MIF provoca el retraso del desarrollo EAU. En los pacientes, hay en incremento en el suero de MIF, que también es el caso en pacientes con enfermedad de Behcet y pacientes que padecen de iridociclitis . La inmunización de MIF puede suministrar una forma de tratamiento contra la artritis reumatoide . De esta manera, los conjugados, compuestos y métodos de la invención apropiados para inmunizar contra MIF, o para reducir el MIF del suero, son útiles o en el tratamiento o prevención de aquellas enfermedades, condiciones o trastornos asociados con la sobre población de MIF. La alta concentración de MIF en el suero se ha encontrado en pacientes con dermatitis atópica. En lesiones de la piel, MIF se expresa difusivamente en lugar de encontrarse en la capa celular basal en controles. La concentración de MIF se reduce después del tratamiento con esteroides, consistente con un papel de MIF en la inflamación. MIF se ha encontrado que también contribuye al establecimiento de glomérulonefritis . Los animales tratados con anticuerpos anti-MIF muestran una glomérulonefritis significativamente reducida. MIF se deriva de la pituitaria, secretada por ejemplo, durante la estimulación de LPS, y potencia a la endotoxemia. En consecuencia el mAb anti-MIF inhibe la endotoxemia y el choque séptico, mientras que MIF recombinante incrementa marcadamente la letalidad de la peritonitis. MIF también es un modulador inducido por la glucocorticoide de la producción de citocina de promueve inflamación. MIF también se produce por células T (TH2) que soporta la proliferación de células T y el tratamiento anti-MIF reduce la proliferación de célula T y niveles de IgG. Hay una concentración de MIF incrementada en el fluido cerebroespinal de pacientes con esclerosis múltiple y enfermedad neuro-Behcet . Los altos niveles de MIF también se encuentran en el suero de pacientes con psoriasis extendida. Los altos niveles de MIF se encuentra en el suero de pacientes con colitis ulcerante pero no en pacientes con enfermedad de Crohn. Los altos niveles de MIF se encuentran en el suero de pacientes con asma bronquial. El MIF también se sobre regula en el fluido sinovial de pacientes con artritis reumatoide. El tratamiento anti-MIF reduce efectivamente la artritis reumatoide en ratones y modelos de rata (Mikulo ska et al . , J Immunol. 158:5514-7 (1997); Leech et al., Arthritis Rheum. 41:910-7 (1998), Leech et al. Arthritis Rheum. 43:827-33 (2000) , Santos et al., Clin. Exp. Immunol. 123:309-14 (2001) ) . De esta manera, el tratamiento directo para inhibir la actividad MIF usando una composición que comprende MIF como una determinante antigénica son benéficas para las condiciones arriba mencionadas . El MIF de ratón, rata y humano consiste de 114 aminoácidos y contiene 3 cisteínas conservadas como se muestra en MIF_rata: SEQ ID NO: 120, MIF_ratón: SEQ ID NO: 121 y MIF_humano: SEQ ID NO: 119 S issProt. Tres subunidades forman un homotrimero que no se estabiliza por enlaces de bisulf ro. La estructura de rayos X se ha resuelto y muestra 3 cisteínas libres (Sun et al., PNAS 93: 5191-96 (1996)), aunque algunos datos de la literatura reclaman la presencia de un enlace bisulfuro. Sin embargo, ninguna de las cisteínas está lo suficientemente expuesta para una interacción óptima con un primer sitio de colocación posible presente en el portador. Así, cuando se expone la terminación C de la proteína en la estructura del trímero, una ligadura de aminoácidos que contiene un residuo de cisterna se agrega en un aspecto a la terminación C de la proteína para la generación del segundo sitio de colocación en esta modalidad de la invención. Existe solamente un cambio de aminoácido entre el MIF de ratón y rata, y similarmente una homología de secuencia muy alta (alrededor de un 90% de identidad de secuencia) entre el MIF de humano y de rata, y el MIF de humano y ratón. La invención abarca conjugados, composiciones y métodos que comprenden constructos del MIF de humano y ratón asociado con el AP205 VLP.

Una ligadura de aminoácido que contiene una cisteína que se agrega en la terminación N en la secuencia de MIF, conduce a modalidades adicionales de la presente invención. El MIF se ha expresado en E. coli , purificado y se muestra que es completamente funcional (Bernhagen et al., Biochemistry 33: 14144-14155 (1994) . Así, el MIF se puede expresar en E. coli para la generación de modalidades útiles de la invención. La actividad de la tautomerasa del MIF se inhibe si la metionina de partida no se eleva del constructo. Los constructos de MIF expresados en E. coli muestran actividad en la tautomerasa. Los mutantes de MIF en donde la metionina de partida se desdobla y en donde el residuo de prolina justo después de la metionina de partida en la secuencia se mutan hacia alanina, tampoco muestran la actividad de la tautomerasa y representan modalidades adicionales de la invención y se pretenden que estén abarcados dentro del alcance de la invención. En una modalidad específica, AP205 se conjuga a los mutantes de MIF desprovistos de la actividad de la tautomerasa. En una modalidad de la invención, el antígeno o determinante antigénico es interleucina 17 (IL-17) . El IL-17 humano es una proteína' homodimérica ligada a bisulfuro de 32-kDa, con una glicosilación variable (Yao, Z. et al., J. Inmunol 155:5483-5486 (1995); Fossiez, F. et al., J". Exp. Med. 183:2593-2603(1996)). La proteína comprende 155 aminoácidos e incluye una secuencia de señal en la secreción de terminal N de 19 a 23 residuos. La secuencia de aminoácidos IL-17 es similar a la proteína del virus del herpes (HSV13) y no es similar a otras citocinas o proteína conocidas. Las secuencias de aminoácido del IL-17 humano se muestra en el No. acceso GenBank : AAC50341. La secuencia de proteína de ratón se muestra en No. acceso GenBank: AAA37490. Del gran número de líneas celulares y de tejidos evaluadas, se ha detectado el transcrito de ARNm que codifica IL-17 solamente en las células T activadas y en las células mononucleares de sangre periférica estimuladas por forbol 12-miristato 13 -acetato/ionomicina (Yao, Z. et al., J. Immunol 155:5483-5486 (1995); Fossiez, F. et al., J". Exp. Med. 183: 2593-2603 (1996)). Ambas secuencia de humanos y ratón contienen 6 residuos de cisteína. El receptor para IL-17 se expresa ampliamente en muchos tipos y tejidos celulares (Yao, Z. et al., CytoJine 9:794-800 (1997) ) . Aunque la secuencia de aminoácidos del receptor humano IL-17 (866 aa) predice una proteína con un dominio de membrana trans-sencillo y un dominio intracelular largo de 525 aa, la secuencia del receptor es única y no es similar a aquella de algunos de los receptores de la familia de receptor de citocina/factor de crecimiento. Esto acoplado con la falta de similitud de IL-17 mismo con otras proteínas conocidas, indica que IL-17 y su receptor puede ser parte de una familia novedosa de proteína de señalización y receptores. Los estudios clínicos indican que IL-17 puede estar involucrado en muchas enfermedades inflamatorias . El IL-17 se secreta por las células T sinoviales de los pacientes con artritis reumatoide y estimula la producción de mediadores inflamatorios (Chabaud, M. et al., J". Immunol. 161: 409-414 (1998); Chabaud, M. et al., Arthritis Rheum. 42:963-970 (1999)). Los altos niveles de IL-17 se han reportado en pacientes con artritis reumatoide (Ziolkowska M. et al., J. Immunol. 164: 2832-8 (2000)). La interleucina 17 se ha demostrado que tiene un efecto en la degradación de proteoglicanos en articulaciones en rodillas de murina (Dudler J. et al., Ann Rheum Dis. 59:529-32 (2000) y contribuye a la destrucción de la matriz del sinovio (Chabaud M. et al., Cytokine 12:1092-9 (2000)). Estos son modelos relevantes de artritis en animales para la prueba del efecto de inmunización contra IL-17 (Chabaud M. et al., C toJcine 12:1092-9 (2000)). Los niveles elevados de ARNm de IL-17 se han encontrado en células mononucleares de pacientes con esclerosis múltiple (Matusevicius , D. et al., ult. Soler. 5:101-104 (1999)). Los niveles elevados de suero de IL-17 se observan en pacientes que padecen de Lupus Eritemosus Sistémico ( ong C.K. et . al., Lupus 9: 583-93 (2000) . Además, los niveles de ARNm de IL-17 se incrementan en células T aisladas de la piel psoriática de lesiones (Teunissen, M. B. et al., J". Invest. Dermatol. 111:645-649 (1998)). La participación de IL-17 en el rechazo de injerto de riñon también se ha demostrado (Fossiez F. et al., Int Rev. Imunol. 16:541-51 (1998)) . La evidencia para un papel de IL-17 en el rechazo de aloinjerto de órganos también se ha presentado por Antonysamy et al. (J. Immunol 162: 577-84 (1999) ) que muestran que el IL-17 promueve la diferenciación funcional de los progenitores de las células dendríticas . Sus hallazgos sugieren un papel para el IL-17 en la proliferación de células T halogenicas que pueden estar mediadas en parte por medio de un efecto inductor de la maduración de los DCs . Además el mismo grupo reporta (Tang J. L. et al., Transplantation 72:348-50 (2001)) un papel para le IL-17 en la inmunopatogénesis del rechazo vascular agudo en donde el antagonismo de interleucina 17 inhibe el rechazo vascular agudo pero no crónico. El IL-17 parece tener un potencial como un objetivo novedoso para la intervención terapéutica en el rechazo de aloinjerto. El anticuerpo monoclonal anti-IL17 mAb5 (Schering-Plough Research Institute) también puede inhibir completamente la producción de IL-6 de sobrenadantes del sinovio de artritis reumatoide (RA) después de la inducción por 50 ng/ml de IL-17. Un mAb MX1 irrelevante no tuvo efecto en este ensayo. El mAb 5 es un IgGl de ratón obtenido después de la inmunización con rIL-17 humano (r= recombinante) . Una concentración de 1 µ9/p?1 de mAb5 pudo inhibir completamente la producción de IL-6 en el sistema de ensayo (Chabaud, M. et al., J. I munol 161: 409-414 (1998)). Así, la inmunización contra IL-17 proporciona una forma de tratamiento para las diversas condiciones antes descritas. Así, en una modalidad de la invención la composición comprende un ligador que contiene un segundo sitio de colocación fusionado a la terminación C del IL-17 recombinante. En modalidades adicionales una ligadura de aminoácido que contiene una cisteína se fusiona a la terminación N de la secuencia que corresponde a la secuencia de la proteína procesada o se inserta en la terminación N de la secuencia de la forma madura de la proteína, en la terminal C del péptido de señal. Para sistemas de expresión eucarióticos , el péptido de señal del gen IL-17 como es el caso para otros autoantígenos aquí indicados, se puede reemplazar por otro péptido de señal por ejemplo, que se origine por un vector de expresión eucariótico específico. Para la expresión en bacterias, el péptido de señal se reemplaza por un péptido de señal bacteriano para la expresión soluble en el periplasma. Para la expresión en el citoplasma, el constructo está desprovisto en el péptido de señal. Los constructos de IL-17 humano desprovistos del péptido de señal, comprenderán en algunas modalidades los residuos 24-155, 22-155, 21-155 o 20-155. Los constructos de ratón IL-17 desprovistos del péptido de señal, comprenderán en algunas modalidades los residuos 26-158, 24-158 o 27-155. El IL-17 humano se puede expresar en células de CV1/EBNA, h.IL-17 recombinante ha demostrado secretarse por formas glicosiladas y no glicosiladas (Yao, Z. et al., J. Immunol. 155:5483-5486 (1995)). El IL-17 también se puede expresar como una proteína de fusión hIL-17/Fc, con el desdoblamiento posterior de la proteína IL-17 de la proteína de fusión. El IL-17 también se puede expresar en la levadura Pichia pastoris (Murphy K. P. et al., Protein Exp. Purif. 12:208-14 (1998)). El IL-17 humano también se puede expresar en E. coli. Cuando la expresión de IL-17 en E. coli se dirige al periplasma, el péptido de señal IL-17 se reemplaza por un péptido de señal bacteriano. En una modalidad los constructos de IL-17 están desprovistos del péptido de señal para la expresión de proteína en el citoplasma de E. coli. En otra modalidad de la invención, el determinante antigénico es interleucina 13 (IL-13) . IL-13 es una citocina que se secreta por linfocitos T activados e impacta principalmente a los monocitos macrófagos y células B. los primeros 20 aminoácidos de la proteína del precursor corresponden al péptido de señal y están ausentes de la proteína procesada. También se ha descrito la secuencia de ratón (Brown .D. et al., J". Immunol 142:679-687 (1989)). Dependiendo del hospedador de expresión, el constructo de IL-13 comprenderá la secuencia de la proteína precursora, por ejemplo, para la expresión y secreción en hospedadores eucarióticos o consisten de la proteína madura, por ejemplo, para la expresión citoplásmica de E. coli. Para la expresión en el periplasma de E. coli, el péptido de señal de IL-13 se reemplaza por un péptido de señal bacteriano. El IL-13 es una citocina derivada del 2 ayuda T (como IL-4, IL-5) que ha estado recientemente implicada en las respuestas alérgicas de las vías respiratorias (asma) . La sobreregulación de IL-13 y el receptor de IL-13 se han encontrado en muchos tipos de tumor (por ejemplo linfoma Hodgkin) . La interleucina 13 se secreta y estimula por las células Hodgkin y Reed-Sternberg (Kapp U. et al., J". Exp Med. 189:1939-46 (1999)). Así, la inmunización contra el IL-13 proporciona una forma de tratamiento entre otras de las condiciones antes descritas tales como asma o linfoma de Hodgkins . En una modalidad, la composición comprende una ligadura de aminoácidos que comprende un residuo de cisteína y se funciona a la terminación N o C de la secuencia de IL-13 maduro para introducir un segundo sitio de colocación dentro de la proteína. En otras modalidades, una ligadura de aminoácidos que contiene una cisteína se agrega a la terminación N de la forma madura de IL-13 ya que está libremente accesible según la estructura de R de IL-13 (Eisenmesser, E. Z. et al., J. Mol. Biol. 310:231 (2001)). En otras modalidades la ligadura de aminoácidos que contiene la cisteína se fusiona la terminación N de la secuencia que corresponde a la secuencia de la proteína procesada, o se inserta en la terminación N de la secuencia de la forma madura de la proteína, en la terminal C en el péptido de señal. En otras modalidades, una ligadura de aminoácidos que contiene un residuo de cisteína se agrega a la terminación C de la proteína. El IL-13 se puede expresar en E. coli (Eisenmesser E. Z. et al., Protein Expr. Purif. 20:186-95 (2000)) o en células NS-0 (líneas de células eucarióticas) (Cannon-Carlson S. et al., Protein Expr. Purif 12:239-48 (1998)). En una modalidad de la invención, el determinante antigénico es la interleucina 5 (IL-5) . El IL-5 es una citocina específica de linaje para la eosinofilopoiesis y juega una parte importante en enfermedades asociadas con un número creciente de eosinófilos, tales como el asma. La función biológica de IL-5 se ha demostrado en diversos estudios (Coffman R.L. et al., Science 245:308-10 (1989); Kopf et al., Immunity 4:15-24 (1996)), que señalan en efecto benéfico al inhibir la función de IL-5 en enfermedades mediadas a través de eosinófilos. La inhibición de la acción de IL-5 proporciona así una forma de tratamiento contra el asma y otras enfermedades relacionadas con eosinófilos. El IL-5 forma un dimero, ligado covalentemente por un puente de bisulfuro. Un constructo de cadena sencilla (se) se ha reportado en donde 2 monómeros de IL-5 se ligan por un ligador péptido. En una modalidad de la invención, un ligador péptido contiene una cisteina se agrega en la terminación N de la secuencia de la forma procesada de la forma IL-5. La adición de una ligador que contiene una cisteina también se vislumbra en la terminación M de la secuencia de la forma procesada de una scIL-5. En otras modalidades, el ligador de aminoácido que contiene una cisteina se fusiona a la terminal N de la secuencia que corresponde a la secuencia de proteína de la procesada o se inserta en la terminación N de la secuencia de la forma madura de proteína, en la terminal C del péptido de señal . En otras modalidades, el ligador que contiene una cisteina se fusiona a la terminación C de la secuencia de IL-5 o la terminación C de la secuencia scIL-5. Se han descrito diversos sistemas de expresión para IL-5 y se pueden usar para la expresión de las composiciones de la invención. Se ha descrito un sistema de expresión bacteriano utilizando E. coli por Proudfoot et al., (Biochem J. 270:357-61 (1990) ) . En el caso en donde se expresa IL-5 en el citoplasma de E. coli el constructo de IL-5 está desprovisto del péptido de señal . Las células de insectos también se pueden usar para producir peptidos de IL-5 para elaborar las composiciones de la invención (Pierrot C. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 253: 756-60 (1998)). Similarmente los sistemas de expresión de baculovirus (células sf9 Ingley E. et al., Eur. J. Biochem. 196:623-9 (1991) and Brown P. M. et al., Protein Expr. Purif. 6:63-11 (1995)) también se pueden usar. Finalmente, los sistemas de expresión de mamíferos también se han reportado (células CHO) y se pueden usar en estas composiciones de la invención (Kodama S et al., J. Biochem. (Tokio) 110:693-701 (1991)). Los sistemas de expresión de baculovirus (Mitchell et al., Biochem Soc. Trans. 21:332S (1993); Kunimoto DY et al., Cytokine 3:224-30 (1991)) y un sistema de expresión de células de mamíferos usando células CHO (Kodama S et al., Glycobiology 2:419-27 (1992)) también se han descrito para el IL-5 de ratón. La expresión de los constructos de murina de IL-5 en donde la secuencia IL-5 se fusiona en su terminación N a los ligadores de aminoácidos que contienen un residuo de cisteína, son adecuados para el acoplamiento de IL-5 a AP205 VLP. Se pueden generar los constructos humanos de acuerdo con las enseñanzas en la presente produciendo las proteínas humanas C-IL-5-E, humanas C-IL-5-F y humanas C-IL-5-S adecuadas para el acoplamiento a AP205 VLP y que conducen a otras modalidades de la invención. E una modalidad de la invención, el determinante antigénico es CCL-21. CCL-21 es una quimiocina de la subfamilia CC que también se conoce como una citocina- pequeña de inducción A21 como éxodo-2, como SLD (citocina de un linfocito secundario) , como TCA4 (agente 4 quimiotáctico derivado del timo) o 6Ckine. CCL21 inhibe la hemopoiesis y estimula la quimiotaxis para los quimiocitos, células T activadas y células dendriticas pero no para las células B, macrófagos o neutrófilos . Muestra una actividad preferente hacia las células T nuevas. También es un quimioatrayente potente de células mesangiales. CCL21 se enlaza a los receptores de quimiocina CCR7 y a CXCR3 (dependiendo de la especie) . Pueden disparar una suspensión rápida dependiente de la integrina de los linfocitos que se enrollan bajo la cubierta fisiológica y se expresan altamente por vénulas endoteliales altas. El crecimiento de tumor inhibido por CCL21 de murina y la angiogénesis en un modelo de ratón SCID de cáncer de pulmón humano (Arenberg et al . , Cáncer Immunol Immunother. 49: 587-92 (2001)) y un modelo de tumor de carcinoma en ratones (Vicari et al., Inmuno1. 165:1992-2000 (2001)). La actividad angioestatica del CCL21 de murina también se detecta en un ensayo de micro cavidad de la cornea de rata (Soto et al., Proc. Nati. Acad. Sci . USA 95: 8205-10 (1998).

Se ha demostrado que los receptores de quimiocina CCR7 y CXCR4 están sobre regulados en células de cáncer de mama y que CCL21 y CXCL12 los ligandos respectivos se expresan ampliamente en órganos que representan los primeros destinos de la metástasis de cáncer de mama (Müller et al. (líature 410:50-6 (2001)). La quimiotaxis mediada por CCL21 in vitro se puede bloquear al neutralizar los anticuerpos anti-CCL21 como fue la quimiotaxis mediada por CXCR4 por los anticuerpos respectivos. Así, la inmunización contra CCL21 proporciona una forma de tratamiento contra la metástasis esparcida en canceres, más específicamente en cáncer de mama. El CCL21 secretado consiste de 110 o 111 en ratones y humanos respectivamente. Las secuencias respectivas se muestran en Swissprot: SY21 humano y en Swissprot : SY21 ratón. En contraste con otras citocinas CC, el CCL21 contiene 2 más cisteínas dentro de una región prolongada en la terminación C. Se supone que todas las cisteínas están acopladas en enlaces bisulfuros. En lo siguiente, los constructos y sistemas de expresión se describen para elaborar las composiciones de la invención que comprenden el determinante antigénico CCL21. En la estructura de NMR de la proteína homologa de eotaxina, ambas terminaciones N y C se exponen al solvente . En algunas modalidades, las ligaduras de aminoácidos que contiene un residuo de cisteína como un segundo sitio de colocación se agrega la terminación C de la proteína. Se ha expresado una proteína de fusión con fosfatasa alcalina (en la terminación C de CCL21) y se muestra que es funcional, lo que muestra que las fusiones en la terminación C de CCL21 son compatibles con el enlace del receptor. En algunas modalidades específicas, el ligador de aminoácidos que contiene una cisteína se fusiona a la terminación N de la secuencia que corresponde a la secuencia de la proteína procesada, o se inserta en la terminación N de la secuencia de la forma madura de la proteína, en la terminal C del péptido de señal. Se han descrito varios sistemas de expresión para la producción de CCL21 (por ejemplo Hedrock y colaboradores, J. Immunol. 159:1589-93 (1997)). Por ejemplo, puede ser expresado en un sistema de baculovirus (Nagira y colaboradores, J. Biol . Chem. 272:19518-24 (1997)). En una modalidad relacionada, el antigénico determinante es factor-1 derivado estromal (SDF-1) , ahora denominado CSCL12. El CXCL12 es una quimiocina producida por células estromales de médula de hueso y fue identificada originalmente como un factor estimulatorio para las células pre-B . Como se estableció arriba, se ha demostrado que los receptores de quimocina CCR7 y CXCR4 están sobrerregulados en células de cáncer de mama y que CCL21 y SDF-1, los ligandos respectivos, están altamente expresados en órganos que representan los primeros destinos de la metástasis de cáncer de mama (Müller y colaboradores, Nature 410: 50-6 (2001)). La quimiotaxis mediante SDF-1/CSCR4 in vitro puede ser inhibida mediante neutralización de los anticuerpos anti-SDF-1 y CXCR . En un modelo de metástasis de cáncer de mama en ratones SCID que usan la línea de célula de cáncer de mama MDA- B-231 humana, se observó un decremento significativo en la metástasis de pulmón cuando los ratones fueron tratados con anticuerpos anti-CXCR4. En los ganglios linfáticos de drenado, se observó una reducción de la metástasis a los ganglios linfáticos inguinal y auxiliar (metástasis de 38% en lugar de 100% en controles) . Así, la inmunización contra CXCL2 provee una forma de tratamiento contra metástasis de cáncer, más específicamente de cáncer de mama. El par SDF-l/receptor de quimiocina CXCR4 ha demostrado incrementar la eficacia de alojar las células progenitoras hematopoiéticas primitivas para ser médula ósea. Además, se ha supuesto que el CXCR4 y SDF-1 influyen en la distribución de células de leucemia linfocítica crónica. Estas células invariablemente infiltran la médula ósea de pacientes y se demostró que su migración en la médula ósea fue dependiente de CXCR . Las células de leucemia linfocítica crónica experimentan apoptosis salvo que ellas sean cocultivadas con células stromal . Los anticuerpos que bloquean SDF-1 pueden inhibir este efecto de protección de las células stromal (Burger y colaboradores, Blood 96:2655-63 (2000)). La inmunización contra CXCL12 provee así una forma de tratamiento contra la leucemia linfocítica crónica. El CXCR4 ha demostrado ser un correceptor para entrar VIH en células T. El SDF-1 inhibe la infección de células CD4+ por cepas de VIH X4 (CXCR4-dependiente) (Oberlin y colaboradores, Nature 382:833-5 (1996); Bleul y colaboradores, Nature 382:829-33 (1996), Rusconi y colaboradores, Antivir Ther. 5:199-204 (2000)). Los análogos de péptido sintético de SDF-1 han demostrado inhibir efectivamente la entrada de VIH-1 y la infección vía el receptor CXCR4 (WO059928A1) . Así, la inmunización contra CXCL12 provee una forma para bloquear la entrada de VIH en células T, y por lo tanto una forma de tratamiento de SIDA. Las interacciones de SDF-1-CXCR4 también se reportaron para jugar un papel central en la acumulación de célula CD4+ T en synovium de artritis reumatoide (Nanki y colaboradores, 2000) . La inmunización contra SDF-1 así provee una forma de tratamiento contra artritis reumatoide. El SDF-1 humano y de murino son conocidos por presentarse en dos formas, SDF-?a y SDF-?ß, por empalme diferencial de un gen único. Ellos difieren en cuatro aminoácidos de terminación C que están presentes en SDF-?ß (74 aa) y ausentes en SDF-la (70 aa) . La secuencia de SDF-1 humano está mostrada en Swissprot : SDFl_humano y la secuencia de ratón SDF-1 está mostrada en Swissport : SDFl_ratón. El SDF-1 contiene cuatro cisteínas conservadas que forman dos enlaces de bisulfuro intramolecular. La estructura de cristal de SDF muestra un dímero ligado no covalentemente (Dealwis y colaboradores, PNAS 95:6941-46 (1998)). La estructura de SDF-1 también muestra una extensión de terminación N grande. Se usó mutagénesis de barrido de alanina para identificar (parte de) el sitio de enlazamiento del receptor en SDF-1 (Ohnishi y colaboradores, J. Interferon Cytokine Res. 20:691-700 (2000)) y Elisseeva y colaboradores, (J. Biol. Chem. 275:26799-805 (2000)) y Heveker y colaboradores, (Curr. Biol. 8:369-76 (1998)) describió el enlazamiento del receptor de inhibición de péptidos derivados de SDF-1 (y entrada de VIH) . ? continuación, se describen los sistemas de construcción y expresión apropiados para la generación de las composiciones de la invención relacionada con SDF-1. Las terminaciones N- y C- de SDF-1 están expresadas para el solvente. En modalidades específicas, una ligadura de aminoácido que contiene una cisteína como segundo sitio de acoplamiento es así fundida al término de la secuencia de proteína, mientras que en otras modalidades específicas una ligadura de aminoácido que contiene una cisteína como segundo sitio de acoplamiento se fusiona a la terminación N de la secuencia de proteína. La ligadura de aminoácido que contiene una cisteína se fusiona a la terminación N de la secuencia que corresponde a la secuencia de la proteína procesada, o insertada en la terminación N de la secuencia de la forma madura de la proteína, la Terminal C del péptido de señal. Los genes que codifican estos constructos específicos pueden ser clonados en un vector de expresión apropiado. La expresión de SDF-1 en un sistema de virus sendai en fibroblastos embriónicos de pollo (Moriya y colaboradores, FEBS Lett. 425:105-11 (1998)) se ha descrito además de expresión en E. coli (Holmes y colaboradores, Prot. Exp.. Purif. 21:367-77 (2001)) y síntesis química de SDF-1 (Dealwis y colaboradores, PNAS 95:6941-46 (2001)). En otra modalidad de la invención, el determinante antigénico es quimioatrayente de linfocito B (BLC, CXCL13) . El BLC está expresado en el bazo, parches de Peyer y ganglios linfáticos (Gunn y colaboradores, 1998) . Su expresión es más fuerte en los centros germinales, donde las células B experimentan mutación somática y maduración de afinidad. Este pertenece a la familia de la quimiocina CXC, y su homólogo más cercano es GROa (Gunn y colaboradores, Nature 391:799-803 (1998)). EL BLC humano es 64% homólogo al BLC de murino. Su receptor es CXCR5. El BLC también comparte homología con IL-8. El BLC recluta células B para folículos en órganos linfoides secundarios tales como bazo y parches de Peyer. El BLC también es requerido para reclutamiento de células B para compartimento de los ganglios linfáticos ricos en Células Dendríticas foliculares (FDCs) (Ansel y colaboradores, Nature 406:309-314 (2000)). El BLC también induce la expresión incrementada de Linfotoxina a1ß2 (1?a1ß2) en las células B reclutadas . Esto provee un circuito de retroalimentación positivo, puesto que los promotores 1,?a1ß2 de expresión BLC (Ansel y colaboradores, Nature 406:309-314 (2000)). EL BLC también ha demostrado ser capaz de inducir neogénesis linfoide (Luther y colaboradores, Immunity 12:471-481 (2000) ) . Aparentemente los FDC también expresan BLC. Así la inmunización contra BLC puede proveer una forma de tratamiento contra enfermedades autoinmunes donde la neogénesis linfoide está involucrada, tal como sinovitis reumatoide y artritis reumatoide o diabetes tipo I . Se ha descrito una construcción de BLC que lleva una terminación C His-tag, y es funcional (Ansel, K. M. y colaboradores, J. Exp. Med. 190:1123-1134 (1999)). En una modalidad de la presente invención, la composición comprende una ligadura que contiene un residuo de cisterna como segundo sitio de acoplamiento y que está fusionado en la Terminal C de la secuencia BLC. En IL-8, el cual es homólogo a BLC, ambas terminaciones N- y C- son libres. La fusión de una ligadura de aminoácido que contiene un residuo de cisteína como segundo sitio de acoplamiento a la terminación N del BLC lleva a una modalidad de la invención. En otras modalidades de la presente invención, la composición comprende una ligadura de aminoácido que contienen una cisteína y que está fusionada a la terminación N de la secuencia que corresponde a la secuencia de la proteína procesada, o insertada en la terminación N de la secuencia de la forma ' madura de la proteína, la Terminal C del péptido de señal. Los genes que codifican para estas constructos específicas pueden ser clonados en un vector de expresión apropiado y expresados en consecuencia. La secuencia de BLC humano está mostrada en Acceso: NP_006410. Los aminoácidos 1-22 de la secuencia son el péptido de señal. La secuencia de ratón está mostrada en Acceso: NP_061354. Los aminoácidos 1-21 son el péptido de señal. Las composiciones de la invención con BLC como el determinante antigénico, en algunas modalidades, usan la forma madura de la proteína para la generación de las composiciones de la invención. En otra modalidad específica, el determinante antigénico es Eotaxina. La Eotaxina es una quimiocina específica para el receptor de Quimiocina 3, presente en eosinofilis, basófilis, y células Th2. Sin embargo las semillas de Eotaxina para ser altamente específicas para Eosinofilis (Zimmerman y colaboradores, J. Immunol . 155:5839-46 (2000)). La migración de Eosinofil se reduce al 70% en el ratón agénico de eotaxin-1, el cual sin embargo todavía puede desarrollar eosinofilia (Rothenberg y colaboradores, J. Exp. Med. 185:785-90 (1997)). Las semillas de IL-5 para ser responsable de la migración de eosinofilos desde la médula ósea hasta la sangre, y eotaxina para la migración local en el tejido (Humbles y colaboradores, J. Exp. Med. 186:601-12 (1997)). El genoma humano contiene 3 genes de eotaxina, eotaxina 1-3. Ellos comparten 30% de homología con cada uno de los otros. Hasta aquí son conocidos dos genes en el ratón: eotaxina 1 y eotaxina 2 (Zimmerman y colaboradores, J. Immunol. 165:5839-46 (2000)). Ellos comparten 38% de homología. El eotaxin-2 de murino comparte 59% de homología con eotaxin-2 humano. En el ratón, las semillas de eotaxin-1 para ser expresadas omnipresentemente en el tracto gastrointestinal, mientras que las semillas de eotaxin-2 son predominantemente expresadas en el yeyuno (Zimmerman y colaboradores, J. Immunol. 165:5839-46 (2000)). La Eotaxina-1 está presente en el fluido bronco alveolar (Teixeira y colaboradores, J. Clin. Invest . 100:1657-66 (1997)). La Eotaxina tienen un P de 8.3 kDa. Este está en equilibrio entre monómeros y dímeros sobre un rango amplio de condiciones, con un Kd estimado de 1.3 mM en 37 °C (Crump y colaboradores, J. Biol . Chem. 273:22471-9 (1998)). Sin embargo la forma de monómero es predominante. La estructura de Eotaxina se ha esclarecido por espectroscopia MR. El sitio de enlazamiento a su receptor CCR3 está en la terminación N- , y la región que precede la primer cisteína es crucial (Crump y colaboradores, J. Biol. Chem. 273:22471-9 (1998)). Los péptidos de Jos receptores de quimiocina que rodean la Eotaxina confirmaron este hallazgo. La eotaxina tiene cuatro cisteínas que -forman dos puentes de bisulfuro. Por lo tanto, en una modalidad, la composición del invento comprende una ligadura de aminoácido que contiene un residuo de cisteína como segundo sitio de acoplamiento y que está en una modalidad, fusionada a la terminación C de la secuencia de Eotaxin. En más modalidades, una ligadura de aminoácido que contiene una cisteína está fusionada a la terminación N de la secuencia que corresponde a la secuencia de la proteína procesada, o insertada en la terminación N de la secuencia de la forma madura de la proteína, Terminal C del péptido de señal. Los genes que codifican para estas constructos específicas están clonados en un vector de expresión apropiado . La eotaxina puede ser sintetizada químicamente (Clark- Lewis y colaboradores, Biochemistry 30:3128-3135 (1991)). La expresión en E. coli se ha descrito para Eotaxina-1, en el citoplasma (Crump y colaboradores, J. Biol. Chem. 273:22471-9 (1998) ) . La expresión en E. coli como cuerpos de inclusión con repliegue subsecuente ( ayer y colaboradores, Biochemistry 39:8382-95 (2000)), y la expresión de célula de insecto (Frossman y colaboradores, J. Ex . Med. 185:2171-6 (1997)) se ha descrito para Eotaxin-2, y puede, más aún, ser usada para estar en las modalidades específicas de la invención. En todavía otra modalidad especifica de la invención, el determinante antigénico es el factor de estimulación de colonia de Macrófago (M-CSF o CSF-1) . El M-CSF o CSF-1 es un regulador de proliferación, la diferenciación y sobrevivencia de macrófagos y sus progenitores de médula ósea. El receptor para M-CSF es un receptor de cinasa de tirosina de superficie de célula, codificado por el protooncogen cFMS . Una expresión elevada de M-CSF y su receptor se ha asociado con prognosis pobre en varios cánceres epiteliales tales como cáncer de mama, uterino y de ovario. Se ha estudiado la progresión del tumor en una cepa de ratón que resulta de la cruza de un ratón transgénico susceptible de cáncer mamario (PyMT) con un ratón que contiene una mutación nula recesiva en el gen csf-1. Estos ratones muestran metástasis pulmonar y de carcinoma invasivo de etapa última tardía atenuada comparada con el ratón PyMT (Lin y colaboradores, J. Exp. Med. 193:727-739 (2001) ) . La causa parece ser la ausencia de reclutamiento de macrófago a los tejidos neoplásticos. El crecimiento subcutáneo del cáncer de pulmón de Le is también es impartido en los ratones nulos de csf.l. Está postulado que el mecanismo de mejoramiento del macrófago de crecimiento del tumor puede ser a través de factores angiogénicos , factores de crecimiento y proteasas producidas por los macrófagos . Los datos estructurales en la forma soluble de -CSF están disponibles (estructura de cristal : Pandit y colaboradores, Science 258:1358-62 (1992)), y muestran que ambas terminaciones N- y C- de la proteína son accesibles. Sin embargo, la terminación N- está cercano al sitio de interacción con el receptor. Además el M-CSF está presente en ambas formas de superficie de célula y soluble, donde la región de transmembrana está en su terminación C. Por lo tanto cierta modalidad de la presente invención comprende una ligadura de aminoácido que contiene una cisteína y que está, en una modalidad, agregada a la terminación C del M-CSF o fragmentos de esta, en la terminación C de la forma soluble de M-CSF. En otras modalidades, la ligadura de aminoácido que contiene una cisteína está fusionada a la terminación N de la secuencia que corresponde a la secuencia de la proteina procesada o de la forma soluble de la proteína, o insertada en la terminación N de la secuencia de la forma madura de la proteína o de la forma soluble de la proteína, la Terminal C del péptido de señal. El M-CSF es un dímero, donde los dos monómeros están ligados vía un puente de bisulfuro de intercadena . Se ha descrito un sistema de expresión en E. coli para un fragmento de aminoácido 149 de terminación N (funcional) de -CSF (Koths y colaboradores. Mol. Reprod. Dev. 46:31-37 (1997) ) . Este fragmento de M-CSF, modificado como se esbozó arroba, representa un determinante antigénico de acuerdo con las modalidades de la invención. La secuencia humana está mostrada en Acceso :NP_000748. Otros determinantes antigénicos de la presente invención comprenden fragmentos de terminación N que consisten de residuo 33-181 o 33-185 de 1 secuencia de arriba, que corresponde a la forma soluble del receptor. La secuencia de ratón está mostrada en Acceso: NP_031804. La secuencia madura inicia en el aminoácido 33. Así, un determinante antigénico de acuerdo con la presente invención comprende el aminoácido 33-181 o 33-185. En una modalidad, el determinante antigénico es Resistina (Res) . Se realizaron estudios de inmunización pasiva con anticuerpos policlonales de conejo generados contra una proteína de fusión de ratón de Resistina (mRes) fusionado a GST, expresado en bacteria. Esta inmunización pasiva lleva a absorber glucosa mejorada en un modelo de animal de obesidad/diabetes Tipo II (Steppan y colaboradores, Nature 409:307-12 (2001)). La Resistina (Res) es una hormona de péptido 114 aa de aproximadamente 12 KD. Esta contiene 11 cisteínas de la cual una terminación N mayor demostró ser responsable de la dimerización de la proteína y las otras' 10 se cree están involucradas en enlaces de bisulfuro intramoleculares (Banerjee y Lazar,- J. Biol . Chem. 276:25970-3 (2001)). La mutación de la primera cisteína a alanina suprime la dimerización de mRes . El mRes con una etiqueta FLAG en su terminación C permanece activo en un modelo animal (Steppan y colaboradores, Nature 409:307-12 (2001)). Similarmente una HA de Terminal C etiquetada (etiqueta Haemagglutinin) versión de resistina demostró ser activo en un ensayo de cultivo de tejido (Kim y colaboradores, J. Biol. Chem. 276:11252-6 (2001) ) . Por lo tanto, en una modalidad, las composiciones presentes comprenden una ligadura de aminoácido que contienen un residuo de cisteína como segundo sitio de acoplamiento y que está fusionado en la terminación C de la secuencia de resistina. En otra modalidad, la ligadura de aminoácido que contiene una cisteína está fusionada a la terminación N de la secuencia que corresponde a la secuencia de la proteína procesada, o insertada en la terminación N de la secuencia de la forma madura de la proteína, la Terminal C del péptido de señal. En una modalidad de la presente invención, el MRes o huRes también puede ser expresado como moléculas de fusión fe con un sitio de desdoblamiento de proteasa insertado entre la Resistina y la parte Fe de la construcción, tal como terminal C a uno o más residuos de cisteína de la región de articulación de la parte Fe de la proteína de fusión en un sistema de expresión eucariótico, o tal como se acordó en las descripciones de aquí. El desdoblamiento de la proteína de fusión libera Resistina adicionalmente que comprende ya sea una ligadura de aminoácido que contiene un residuo o parte de cisteína o todo de la región de articulación de la parte Fe de la proteína de fusión la cual comprende un residuo de cisteína en su terminación C, la cual es apropiada para el acoplamiento a AP205 VLP. La secuencia de Resistina humana está mostradas en Acceso: AF323081. La secuencia de ratón se muestra en Acceso AF323080. Una modalidad favorecida de la invención es la proteína de resistina humana fusionada en su terminación C a una ligadura de aminoácido que contiene residuo de cisteína. La construcción de resistina humana puede ser generada de acuerdo con las enseñanzas desglosadas aquí y por comparación de secuencias de Resistina humana y de murino en un alineamiento de secuencia de proteína para identificar la parte de la secuencia de Resistina humana a ser clonada en vectores de aquí, o en otros vectores de expresión apropiados. Ejemplo de constructos de resistina humana apropiadas para la generación de composiciones de la invención son resistina-C-Xa humana, resistina -C-EK humana y resistina-C humana. Las constructos de Resistina Humana así generados son una modalidad de la invención. La vacuna contra la Resistina que utiliza las composiciones antes mencionadas de la invención puede así proveer una forma de tratamiento de Diabetes Tipo II y obesidad. En otra modalidad el determinante antigénico es Linfotoxina- ß . La inmunización contra linfotoxina-ß puede ser útil en el tratamiento de enfermedad mediada de Prión. Los priones son proteínas celulares que existen en la mayoría de las especies mamíferas. Las proteínas de prión existen en dos formas, una forma normalmente plegada que está usualmente presente en individuos saludables (PrPc) y una forma no plegada que provoca enfermedad (PrpSc) . La hipótesis del prión actual postula que la forma de prión no plegada PrpSc puede catalizar el repliegue del prión saludable PrPc en enfermedad que provoca PrpSc (A. Aguzzi, Haematologica 85, 3-10 (2000)). En algunos casos raros, esta transición también puede ocurrir espontáneamente, provocando CJD clásica en humanos. Algunas mutaciones en PrPc están asociadas con un incremento en esta transición espontánea, que provoca las diferentes formas de CJD familial. Sin embargo, el PrpSc también puede ser infeccioso y puede ser transmitido por transfusión de sangre o vía la cadena alimenticia. La forma última de la enfermedad mediada del prión se conoce como Kuru uru y usualmente ocurre en caníbales humanos. Sin embargo, puesto que las especies que son alimentadas en sus propios individuos no son abundantes, esta forma de enfermedad transmitida oralmente es muy rara de ser documentada para otras especies . La alimentación masiva de vacas con productos de carne por todas partes de Europa cambiaron la situación y cantidades de vacas infectadas con la forma transmisible de PrpSc que provoca BSE, incrementada dramáticamente en años recientes, hizo padecer a cientos de miles de vacas. Esta presentación repentina de números masivos de vacas enfermas de BSE provocó mucho miedo en la población humana de que una enfermedad similar pudiera , ser inducida en humanos. Verdaderamente en 1996, el primer caso de una forma variante de CJD se reportó que podía ser atribuida al consumo de carne infectada de PrpSc. Hasta ahora, este temor se ha incrementado más, debido a que el número de humanos infectados ha incrementado constantemente durante los siguientes años y no se ve cura. Más aún, puesto que la oveja sucumbe a una enfermedad mediada de prión llamada escrapie o puesto que otras especies mamíferas pueden ser infectadas con PrpSc, es posible que las enfermedades similares a BSE también puedan ocurrir en otras especies. La reproducción del agente de Escrapie (una enfermedad mediada de prión) se cree que tiene lugar principalmente en tejidos linfoides y se demostró que depende de células dendríticas foliculares que expresan proteína de prión (FDC) (Brown y colaboradores, Nature Med. 11:1308-1312 (1999)). El mecanismo de transmisión del prión se ha estudiado a gran detalle . Ahora está claro que los priones primero se reproducen en los órganos linfoides de ratones infectados y subsecuentemente son transportados al sistema nervioso central . Se demostró que los ratones que carecen de células dendríticas foliculares funcionales muestran una reproducción de prión impar en bazos y un retardo de neuroinvasión (pequeño) (Montrasio y colaboradores, Science 288:1257-1259 (2000) ) . Esto se logró mediante la inyección de los ratones con una proteína de fusión de receptor Fe de linfotoxina ß soluble (LT R-Fc) . Esta construcción de receptor soluble inhibe el desarrollo de los FDC mediante interferencia con la interacción crucial de linfotoxina- ß en células T, B o N con el receptor de linfotoxina-ß en las células precursoras de FDC. Las FDC son un tipo de célula pobremente estudiadas pero que se conoce claramente ahora que ellas dependen de ~ la producción de linfotoxina y/o TNF por células B para su desarrollo (F. Mackay, J. L. Browning, NAture 395, 26-27 (1998) ) . Verdaderamente, los ratones deficientes para linfotoxina no exhiben FDC (M. S. Matsumoto, y colaboradores, Science 264, 703-707 (1996)). Además para los FDC,, los anticuerpos también pueden jugar un papel en la progresión de la enfermedad (S. Brandner, M. A. Klein, A. Aguzzi, Transfus Clin Biol 6, 17-23 (1999)). Así, la vacuna contra linfotoxina-ß (también llamada TNFy) , receptor de LT o ??ß, elimina de esa manera los FDC de órganos linfoides, puede proveer una vacuna para el tratamiento o prevención de Creutzfeld-Jakob (forma variante) u otras enfermedades mediadas de prión tal como encefalopatía espongioforme de bovino (BSE) y así previene la reproducción de prión y neuroinvasión. La inmunización contra la Linfotoxina- ß también puede proveer una forma de tratamiento de diabetes. La expresión del transgén de la proteína de fusión LT R-Fc soluble en ratones NOD diabéticos no obesos bloqueados de desarrollo de diabetes pero no insulitis (Ettinger y colaboradores, J. Exp. ed. 193:1333-40 K (2001)). Wu y colaboradores, J. Exp. Med. 193:1327-32 (2001)) también se usaron ratones NOD para estudiar el involucramiento de linfotoxina-ß, pero en lugar de animales transgénicos ellos inyectaron la proteína de fusión LT R-Fc. Ellos observaron una inhibición fuerte del desarrollo de diabetes e inhibición de insulitis. Más interesantemente, ellos pueden aún invertir la preexistencia de insulitis mediante el tratamiento de proteína de fusión. En el páncreas la formación de estructuras foliculares linfoides pueden así ser invertidas. La vacuna contra la linfotoxina-ß puede así proveer una manera de tratamiento contra la diabetes tipo I . En una modalidad, la composición del invento comprende una ligadura de aminoácido que contiene una cisteína y que se agrega a la terminación N de la secuencia que corresponde a la forma procesada de la linfotoxina-ß, o insertada entre la terminación N de la secuencia que corresponde a la forma madura de la proteína, y el péptido de señal, la Terminal C al péptido de señal. En unas modalidades relacionadas de la invención, la parte extracelular de la linfotoxina-ß se expresa como una proteína de fusión ya sea con transferasa de glutatióna-S , fusionada por la Terminal N a la linfotoxina-ß, o con una etiqueta de histidina 6 seguida por una etiqueta myc, fusionada otra vez por la termina N a la parte extracelular la linfotoxina-ß . Un espaciador de aminoácido que contiene un sitio de desdoblamiento de proteasa además de una secuencia de ligadura que contiene una cisteína como sitio de acoplamiento, por la Terminal C al sitio de desdoblamiento de la proteasa, está fusionada a la terminación N de la secuencia de la parte extracelular de la linfotoxina-ß . En una modalidad la parte extracelular de la linfotoxina-ß consiste de fragmentos que corresponden a los aminoácidos 49-306 o 125-306 de la linfotoxina-ß . Estas composiciones específicas de la invención pueden ser clonadas y expresadas en el vector eucariótico pCEP-Pu. En ciertas modalidades, las composiciones del invento comprenden una ligadura de aminoácido que contiene un residuo de cisterna apropiado como segundo sitio de acoplamiento, y que está fusionado a la terminación C de la linfotoxina- ß o fragmentos de la linfotoxina- ß . En una modalidad particularmente favorecida, la secuencia de aminoácidos LACGG, que comprende la ligadura de aminoácido ACGG que por ella misma contiene un residuo de cisteína para acoplamiento a AP205 VLP está fusionado a la terminación N de la parte extracelular de la linfotoxina-ß o de un fragmento de la parte extracelular de la linfotoxina-ß, produciendo las proteínas C-LT349-30e humana y ??_?ß?2e~306 humana después de desdoblamiento con enterocinasa de las proteínas de fusión que corresponden expresadas ya sea en el vector pCEP-SP-GST-EK o el vector pCP-SP-his-myc-EK. En una modalidad, el antígeno o determinante antigénico es la proteína prión, los fragmentos de ésta y en particular péptidos de la proteína prión. En una modalidad de la invención, el determinante antigénico es la proteína prión o fragmentos de ésta. La inmunización contra la proteína prión puede proveer una manera de tratamiento o prevención de Creutzfeld-Jakob (forma variante) u otras enfermedades mediadas de prión. Los péptidos de murino que corresponden a fragmentos de la proteína de prión de murino y de la secuencia CSAMSRPMIHFGNDWEDRYYRENMYR (SEQ ID NO: 17) ("cprp largo") y CGNDWEDRYYREN YR (ttcprp corto") (SEQ ID NO: 18) comprende un residuo de cisteína de terminación N agregado para acoplamiento química a AP205 VLP y llevar a una modalidad de la invención. En una modalidad la proteína prión es la proteína prión humana. La orientación sobre cómo modificar la proteína prión humana para asociación con la AP205 VLP se da a través de la solicitud. Las constructos de proteína prión de ratón están desglosadas, y las constructos de proteína prión humana también pueden ser generadas . Además las constructos comprenden la secuencia de proteína prión humana completa, y otros fragmentos de la proteína prión humana, las cuales además son composiciones de la invención. La inmunización contra la proteína prión puede proveer una manera de tratamiento o prevención de Creutzfeld-Jakob (forma variante) u otras enfermedades mediadas de prión. La inmunización que usa las composiciones de la invención que comprenden la proteína prión puede proveer una forma de tratamiento contra las enfermedades mediadas de prión en otros animales. Los péptidos de la proteína de prión humana que corresponde a los péptidos de murino descritos arriba y de la secuencia de aminoácidos CSAMSRPIHFGSDYEDRYYRE MHR ("cprp larga humana") (SEQ ID NO: 19) y CGSDYEDRYYRENMHR ("cprp corta humana") (SEQ ID NO: 20) lleva a modalidades de la invención. Estos péptidos comprenden un residuo de cisteína de terminación N agregado para acoplamiento a AP205 VLP. Los péptidos de bovino y oveja que corresponden son CSAMSRPLIHFGNDYEDRYYREN HR ("cprp larga bovino") (SEQ ID NO: 21) y CGNDYEDRYYRENMHR ("cprp corta bovino") (SEQ ID NO: 22) CSAMSRPLIHFGNDYED YYRENMYR ("cprp larga de oveja") (SEQ ID NO: 23) y CGNDYEDRYYRENMYR ("cprp corta de oveja") (SEQ ID NO: 24), todos que llevan a modalidades de la invención. En una modalidad de la invención, el determinante antigénico es el factor a de necrosis de tumor (TNF-a) , fragmentos de estos o pép idos de TNF-a. En particular, los péptidos o fragmentos de TNF-a pueden ser usados para inducir una respuesta inmune específica dirigida hacia la proteína completa mediante inmunización de un humano o un animal con vacunas o compuestos, respectivamente, que comprenden los péptidos o fragmentos de acuerdo con la invención. Los siguientes péptidos de murino son homólogos de murino a péptidos de humano que han demostrado estar limitados por anticuerpos que neutralizan la actividad de TNF-a (Yone y colaboradores, J. Biol . Chem. 270:19509-19515) y estuvieron, en otra modalidad de la invención, modificados con residuos de cisterna para acoplamiento a AP205 VLP. El péptido MuTNFa; la secuencia CGG se agregó a la terminación N del epítopo que consiste de residuos de aminoácido 22-32 de TNF-a de murino madura, que da la secuencia CGGVEEQLEWLSQR (SEQ ID NO: 25) . El péptido 3'TNF II; la secuencia GGC se usó en la terminación C del epítopo que consiste de residuos de aminoácido 4-22 de TNF-a de murino maduro y la glutamina 21 fue mutada a glicina. La secuencia del péptido que resulta es: SSQNSSDKPVAHWANHGVGGC (SEQ ID NO: 26). El péptido 5'TNF II: un residuo de cisterna se fusionó a la terminación N del epítopo que consiste de residuos de aminoácido 4-22 de TNF-a de murino maduro y la glutamina 21 fue mutada a glicina. La secuencia del péptido que resulta es: CSSQNSSDKPVAHVVANHGV (SEQ ID NO : 27). La secuencia humana que corresponde al epítopo 4-22 es SSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQ (SEQ IN NO: 28). Como para la secuencia de murino una cisteína es, en una modalidad, fusionada en la terminación N del epítopo, o la secuencia GGC se fusiona en la terminación C del epítopo para acoplamiento covalente a AP205 VLP de acuerdo con la invención. Sin embargo, está dentro del alcance de la presente invención que otra cisteína que contiene secuencias se fusione en las terminaciones N o C de los epítopos . En general, uno o dos residuos de glicina están, en una modalidad, insertados entre el residuo de cisteína agregado y la secuencia del epítopo. Sin embargo, otros aminoácidos también pueden ser insertados en lugar de los residuos de glicina, y estos residuos de aminoácido incluyen aminoácidos pequeños tales como serina. En una modalidad preferida más de la composición de la invención, el antígeno o determinante antigénico es el factor OÍ de necrosis de tumor (TNF-a) , fragmentos o muteínas de estos o péptidos de TNF-a o fragmentos o muteínas de estos, en donde el antígeno o determinante antigénico con el segundo sitio de acoplamiento tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: a) la secuencia de aminoácidos de CSSRTPSDKPVAHWANPQAEGQ (SEQ ID NO: 100) ; b) la secuencia de aminoácidos de SSRTPSD PVAHWANPQAEGQGGC (SEQ ID NO: 101) ; y c) la secuencia de aminoácidos de CGGQLQWLNRRANA (SEQ ID NO : 102) . La secuencia humana que corresponde a los residuos de aminoácido 22-32 es QLQWLNRRANA (SEQ ID NO: 29) . En una modalidad relacionada, la secuencia CGG se fusiona en la terminación N del epítopo para acoplamiento covalente a AP205 VLP de acuerdo con la invención. Otros epítopos TNF-a apropiados para usar en la presente invención se han descrito y están desglosados por ejemplo por Yone y colaboradores, (J. BIol. Chem. 270: 19059-19515). La invención además incluye composiciones las cuales contienen mimótopos de los antígenos o determinantes antigénicos descritos aquí. Una composición especifica de la invención comprende un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo presentado en una partícula similar a virus para inducción de una respuesta inmune contra aquel anticuerpo. En una modalidad, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo que son producidos por células de linfoma, son seleccionados para acoplamiento a la partícula similar a virus para inmunización con el propósito de inducir una respuesta inmune protectora contra el linfoma.

En otras modalidades más, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que imita un antígeno es acoplado al AP205 VLP. El anticuerpo que imita o fragmento de anticuerpo es generado por inmunización e aislamiento subsecuentemente del anticuerpo de imitación o fragmento de anticuerpo, o mediante cualquier método conocido en la técnica tal como por ejemplo tecnología de hibridoma (Gherardi, E. y colaboradores, J. Immunol . ethods 126: 61-68 (1990)), despliegue de fago (Harrison y colaboradores, Methods Enzymol . 267:83-109 (1996)), despliegue de ribosoma (Hanes, J. y colaboradores, Nat. Biotechnol. 18:1287-1292 (2000), híbrido de levadura dos (Visintin, . y colaboradores, Proc. Na i. Acad. Sci. USA 96:11723-11728 (1999)), despliegue de la superficie de levadura (Poder, ET. & Wittrup, KD. Methods. Enzym. 328:430-444 (2000)), despliegue de superficie bacterial (Daugherty, PS. y colaboradores, Protein Eng. 12:613-621 (1999)). El anticuerpo que imita también puede ser aislado de una colección de anticuerpos o una colección de anticuerpo naive que usa métodos conocidos en la técnica. En una modalidad más, se usa un anticuerpo que reconoce el sitio de combinación de otro anticuerpo, esto es un anticuerpo anti-idiotípico , además llamado el anticuerpo de inmunización. El anticuerpo reconocido por el anticuerpo anti-idiotípico será además referido como el anticuerpo de neutralización. Así, mediante la inmunización contra el anticuerpo anti-idiotípico, las moléculas con la especificidad del anticuerpo de neutralización se generan in situ; además nos referiremos a estos anticuerpos generados como los anticuerpos inducidos. En otra modalidad, el anticuerpo de inmunización se selecciona para interactuar con una molécula ligando de la molécula objetivo contra la cual se busca la inmunización. La molécula ligando puede ser cualquier molécula que interacciona con la molécula objetivo pero, en una modalidad, preferentemente interactuará con el sitio de la molécula objetivo contra la cual los anticuerpos deben ser generados para inhibición de su función. La molécula ligando puede ser un ligando natural de la molécula objetivo, o puede ser cualquier ligando construido, diseñado o aislado que tiene propiedades de enlazamiento apropiadas. Los anticuerpos de inmunización pueden ser de origen humano, así como aislados nuevos o colección de anticuerpos humanos inmunes, o puede ser aislado de una colección generada de otra fuente animal, por ejemplo de origen murino . El acoplamiento del anticuerpo o fragmento de anticuerpo a AP205 VLP se logra ya sea por reducción limitada de los puentes de bisulfuro expuestos (por ejemplo del puente de bisulfuro de intercadena entre CH1 y CK o CX en un fragmento FAB) o, en otra modalidad, mediante fusión de una ligadura que contiene un residuo de cisteína en la terminación C del anticuerpo o fragmento de anticuerpo. En una modalidad más, una ligadura que contienen un residuo de cisteína se fusiona a la terminación N del anticuerpo o fragmento de anticuerpo para acoplamiento a un VLP o proteína pilus . En la técnica se conocen un sinnúmero de composiciones de vacunas que emplean imótopos, como son métodos para generación e identificación de mimótopos de epítopos particulares. Por ejemplo, Arnon y colaboradores, Immunology 101:555-562 (2000), el desglose completo del cual está incorporado aquí por referencia, describe vacunas basadas en péptido de mimótopo contra Schistosoma mansoni . Los mimótopos usados en estas vacunas se obtienen por separación por exclusión de una colección de péptido aleatoria de 8-meros de fase sólida para identificar mimótopos de un epítopo reconocido por un anticuerpo monoclonal protector contra Schistosoma mansoni. Similarmente , Olszewska y colaboradores, Virology 272:98-105 (2000), el desglose completo del cual está incorporado aquí por referencia, describe ratones f . Además, Zuercher y colaboradores, Eur . J. Immunol 30:128-135 (2000), el desglose completo del cual está incorporado aquí por referencia, describe las composiciones y métodos para inmunización anti-IgE oral usando el fago de despliegue de epítopo. En particular, los bacteriófagos M13 de despliegue de epítopo se emplean como portadores para una vacuna anti-IgE oral. Las composiciones de vacuna evaluadas contienen mimótopos y epítopos del anticuerpo anti-IgE monoclonal BSW17. Las modalidades de la invención incluyen composiciones de vacuna las cuales contienen mimótopos que provocan respuestas inmunológicas contra antígenos particulares, además de conjugatos mimótopo individual/AP205 VLP los cuales recuperan estas composiciones de vacuna, y el uso de estas composiciones de vacuna para provocar respuestas inmunológicas contra antigenos específicos o determinantes antigénicos. Los mimótopos también pueden ser polipéptidos , tales como anticuerpos anti- idiotípicos . Por lo tanto, en una modalidad m s de la invención, el antígeno o determinante antigénico es un anticuerpo anti- idiotípico o fragmento de anticuerpo ant'i-idiotípico . La invención además incluye composiciones que contienen mimótopos de los antígenos o determinantes antigénicos descritos aquí . Los mimótopos de antígenos particulares pueden ser generados e identificados por cualquier número de medios que incluye separación ' por exclusión de coleccións de despliegue de fago de péptido aleatorias (ver, por ejemplo, WO 97/31948, el desglose completo de la cual está incorporado aquí por referencia) . La separación por exclusión de las colecciones a menudo será realizada para identificar péptidos que enlazan a uno o más anticuerpos que tienen especificidad para un antígeno particular. Los mimótopos apropiados para el uso en composiciones de vacuna de la invención pueden ser péptidos lineales o circulares. Los mimótopos que son péptidos lineales o circulares pueden ser ligados a andamiajes moleculares no naturales o partículas de núcleo y VLP, respectivamente, por un enlace que no es un enlace de péptido. Como se indicó arriba, han sido identificados un sinnúmero de mimótopos IgE humanos y epítopos los cuales provocan respuestas inmunológicas contra moléculas IgE humanas. (Ver, por ejemplo, WO 97/31948) . Así, en ciertas modalidades, las composiciones de vacuna de la invención incluyen composiciones que provocan una respuesta inmunologica contra moléculas de inmunoglobina (por ejemplo, moléculas IgE) . Los péptidos que pueden ser usados para provocar tales respuestas inmunológicas incluyen proteínas, subunidades de proteínas, dominios de moléculas IgE, y mimótopos los cuales son capaces de provocar la producción de anticuerpos que tienen especificidad para moléculas IgE. Generalmente, las porciones de moléculas IgE usadas para preparar composiciones de vacuna serán -derivadas de moléculas IgE de las especies de las cuales las composiciones vayan a ser administradas. Por ejemplo, una composición de vacuna proyectada para administración a humanos a menudo contendrá una o más porciones de la molécula IgE humana, y/o uno o más mimótopos los cuales son capaces de provocar respuestas inmunológicas contra moléculas IgE humanas. En modalidades específicas, las composiciones de vacuna de la invención proyectadas para administración a humanos contendrán por lo menos una porción de la región constante de la cadena pesada IgE propuesta en Acceso No. AAB59424. En más modalidades específicas, los péptidos IgE usados para preparar composiciones de vacuna de la invención comprenden, o alternativamente consisten de, péptidos que tienen las siguientes secuencias de aminoácido: CGGVNLTWSRASG (SEQ ID NO: 30) . En modalidades específicas adicionales, las composiciones de vacuna de la invención contendrán por lo menos un mimótopo el cual es capaz de provocar una respuesta inmune que resulta en la producción de anticuerpos que tiene especificidad para un antígeno particular. Ejemplos de mimótopos de IgE apropiados para uso en la preparación de composiciones de vacuna de la invención incluyen péptidos que tienen las siguientes secuencias de aminoácidos : Mimótopo SEQ ID Mimótopo SEQ ID NO NO INHRGYWV 31 VKLP RFYQV 39 RNHRGYWV 32 VWTACGYGRM 40 RSRSGGYWLW 33 GTVSTLS 41 V LTWSRASG 34 LLDSRYW 42 ?e?3 epítopo QPAHSLG 43 VNLPWSRASG 35 L GMQGR 44 VNLTWSFGLE 36 LTLSHPHWVLNHFVS 45 VNLPWSFGLE 37 SMGPDQTLR 46 ?e?3 mimótopo VNLTWS 47 VNRPWSFLE 38 GEFCI HRGYWVCGDPA 48 Preparación de vacunas e inmunógenos Los VLP de bacteriófago AP205 son útiles en la generación de constructos de vacuna, y hacen a los antágenos acoplados a este altamente inmunogénicos . La presente invención provee métodos de acoplamiento de antígenos al AP205 VLP. En una modalidad el antígeno es acoplado al VLP mediante la forma de enlazamiento cruzado químico, que usa un reticulado heterobifuncional . Varios reticulados heterobifuncionales se conocen en la técnica. En algunas modalidades el reticulado heterobifuncional contiene un grupo funcional el cual puede reaccionar con el grupo amino de cadena de lado de los residuos de lisina del VLP, y el grupo funcional el cual puede reaccionar con un residuo de cisteína naturalmente presente, se hace disponible para reacción por reducción, o construido en el antígeno y opcionalmente también se hace disponible para reacción por reducción. El primer paso del procedimiento, llamado la derivación, es la reacción del VLP con el reticulado. El producto de esta reacción es un VLP activado, también llamado portador activado. En el segundo paso, el reticulado no reaccionado se remueve usando métodos usuales tales como filtración de gel o diálisis. En el tercer paso, el antígeno se reacciona con el VLP activado, y este paso se llama el paso de acoplamiento. El antígeno no reaccionado puede ser opcionalmente removido en un cuarto paso. Varios reticulados heterobifuncionales se conocen en la técnica. Estos incluyen los reticulados SMPH (Pierce) Sulfo-MBS, Sulfo-EMCS , Sulfo-GMBS, Sulfo-SIAB, Sulfo-SMPB, Sulfo-SMCC, SVSB, SIA y otros reticulados disponibles, por ejemplo de Pierce Chemical Company (Rockford, IL, USA) , y que tiene un grupo funcional reactivo hacia grupos amino y un grupo funcional reactivo hacia residuos de cisteína. Los reticulados mencionados arriba todos llevan a formación de una ligadura de tioéter. Otra clase de reticulados apropiados en la práctica de la invención se caracteriza por la introducción de una ligadura de bisulfuro entre el antígeno y el VLP en acoplamiento. Los reticulados que pertenecen a esta clase incluyen por ejemplo SPDP y Sulfo-LC-SPDP (Pierce) . La extensión de derivación del VLP con reticulado puede ser influenciado por variación de condiciones experimentales tales como la concentración de cada uno de los patrones de reacción, el exceso de un reactivo sobre el otro, el PH, la temperatura y la resistencia iónica, como es bien conocido de la teoría de reacción en el campo de química orgánica. El grado de acoplamiento, esto es la cantidad de antígenos por subunidades de AP205 VLP puede ser ajustada por variación de las condiciones experimentales descritas arriba para coincidir los requerimientos de la vacuna. La solubilidad del antígeno puede imponer una limitación sobre la cantidad de antígeno que puede ser acoplada en cada subunidad, y en aquellos casos donde la vacuna obtenida es insoluble, la reducción de la cantidad de antígenos por subunidad es benéfica. Un método de acoplamiento de antígenos a AP205 VLP, es la ligadura de un residuo de lisina en la superficie del AP205 VLP con un residuo de cisteína en el antígeno. En algunas modalidades, se requiere la construcción de una ligadura de aminoácido que contiene un residuo de cisteína al antígeno para acoplamiento al AP205 VLP. Alternativamente, una cisteína puede ser introducida ya sea por inserción o mutación dentro del antígeno.

En una modalidad preferida de la presente invención, la composición comprende una ligadura de aminoácido. Preferiblemente la ligadura de aminoácido está enlazada a por lo menos un antígeno, determinante antigénico y molécula orgánica, respectivamente, mediante la forma de por lo menos un enlace covalente. La selección de la ligadura de aminoácido será dependiente de la naturaleza del antígeno, en sus propiedades bioquímicas, tales como pl, distribución de carga, o glicosilación. En general, las ligaduras de aminoácidos flexibles son modalidades favorecidas. Ejemplos de ligaduras de aminoácidos son la región de articulación de Inmunoglobulinas , ligaduras de serina de glicina (GGGGS)n (SEQ ID N0:49) , ? ligaduras de glicina (G)n todas que contienen además un residuo de cisteína como segundo sitio de acoplamiento y opcionalmente además residuos de glicina. (Los siguientes son ejemplos de las ligaduras de aminoácidos: Gamma 1 terminal N: CGDKTHTSPP (SEQ ID NO: 50) Gamma 1 terminal c: DKTHTSPPCG (SEQ ID NO: 51) Gamma 3 terminal N: CGGPKPSTPPGSSGGAP (SEQ ID NO: 52) Gamma 3 terminal C: PKPSTPPGSSGGAPGGCG (SEQ ID NO: 53) Ligadura de glicina terminal N: GCGGGG (SEQ ID NO: 54) Ligadura de glicina terminal C: GGGGCG (SEQ ID NO: 55) Ligadura de glicina-lisina terminal C: GGKKGC (SEQ ID NO: 56) Ligadura de glicina-lisina terminal N: CGK GG (SEQ ID NO: 57) Para péptidos, las ligaduras GGCG (SEQ ID NO : 58) , GGC o GGC-NH2 (estánds de "NH2" para amidación) en la terminación C del péptido, o CGG en su terminación N ha demostrado ser útil. En algunas modalidades, los residuos de glicina serán insertados entre aminoácidos voluminosamente y la cisteina para ser usada como un segundo sitio de acoplamiento. Las modalidades preferidas de la ligadura de aminoácido se seleccionan del grupo que consiste de: (a) CGG; (b) ligadura gamma 1 terminal N; (c) ligadura gama 3 terminal N; (d) regiones de articulación Ig; € ligaduras de glicina Terminal N; (f) (G)KC(G)n con n=0-12 y k=0-5 (SEQ ID NO: 93); (g) ligaduras de glicina-serina Terminal N; (h) (G)KC(G)m(S)i(GGGGS)n con n=0-3, k=0-5, m=0-10, 1=0-2 (SEQ ID NO: 94); (i) GGC; (k) GGC-NH2 ; (1) ligadura gamma 1 Terminal C; (m) ligadura gamma 3 terminal C; (n) ligaduras de glicina Terminal C; (o) (G)nC(G)k con n=0-12 y k=0-5 (SEQ ID NO: 95); (p) ligaduras de glicina-serina Terminal C; (q) (G)m(S)i(GGGGS)n(G)0C(G)k con n=0-3, k=0-5, m=0-10, 1=0-2, y o=0-8 (SEQ ID NO: 96) . En ciertas modalidades, el antígeno o determinante de antígeno comprende un segundo sitio de acoplamiento o un sitio de acoplamiento reactivo único capaz de asociación con los primeros sitios de acoplamiento en los AP205 VLP o subunidades VLP, respectivamente. Esto asegura un enlazamiento y asociación definida y uniforma, respectivamente, de por lo menos uno, pero comúnmente más de uno, preferiblemente más de 10, 20, 40, 80, 120 antígenos al AP205 VLP. La provisión de un segundo sitio de acoplamiento único o un sitio de acoplamiento reactivo único en el antígeno, así, asegura un tipo único y uniforme de enlazamiento y asociación, llevando respectivamente a un arreglo repetitivo y altamente ordenado. Por ejemplo, si el enlazamiento y la asociación, respectivamente, se efectúa por medio de una interacción de lisina- (como el primer sitio de acoplamiento) y cisteína- (como el segundo sitio de acoplamiento, se asegura, de acuerdo con esta modalidad preferida de la invención, que solamente un residuo de cisteína por antígeno, independientemente de si este residuo de cisteína está presente de forma natural o no natural en el antígeno, es capaz de enlazamiento y asociación, respectivamente, con el AP205 VLP y el primer sitio de acoplamiento del AP205 VLP, respectivamente. El residuo de cisteína presente en el antígeno debe estar en su estado reducido para reaccionar con el reticulado heterobifuncional en el VLP activado, esto es que debe estar disponible una cisteína libre o un residuo de cisteína con un grupo sulfhidrilo libre. En el ejemplo donde el residuo de cisteína para funcionar como segundo sitio de acoplamiento está en una forma oxidada, por ejemplo si este está formando un puente de bisulfuro, se requiere la reducción de este puente de bisulfuro con por ejemplo DTT, TCEP o ß-mercaptoetanol . El acoplamiento del antígeno al AP205 VLP mediante el uso de un reticulado heterobifuncional de acuerdo con el método descrito arriba, permite el acoplamiento del antígeno al ??205 VLP en una forma orientada. Otros métodos de enlazamiento del antígeno al AP205 VLP incluyen métodos donde el antígeno es reticulado al AP205 VLP usando la carbodiimida EDC, y NHS. EL antígeno o determinante de antígeno también pueden ser primero tiolatado a través de reacción, por ejemplo con SARA, SATP o iminotiolano . El antígeno o el determinante de antígeno, después de desprotección si se requiere, puede luego ser acoplado al AP205 VLP como sigue. Después de la separación del reactivo de tiolación en exceso, el antígeno o determinante de antígeno reacciona con el AP205 VLP previamente activado con un reticulado heterobifuncional que comprende una porción de reactivo de cisteína, y por lo tanto despliega por lo menos uno o varios reactivos de grupos funcionales hacia residuos de cisteína, a lo cual el antígeno tiolatado o el determinante de antígeno puede reaccionar, tal como se describió arriba. Opcionalmente, se incluyen cantidades bajas de un agente de reducción en la mezcla de reacción. En otros métodos, el antígeno se acopla al AP205 VLP usando un reticulado homobifuncional tal como glutaraldehído, DSG, MB[PEO]4, BS3, (Pierce Chemical Company, Rockford, IL, USA) u otros reticulados homobifuncionales conocidos con reactivos de grupos funcionales hacia grupos amina o grupos carboxilo del AP205 VLP. En una modalidad adicional, el antígeno o determinante antigenico se enlaza a AP205VLP a través de la modificación de las porciones de carbohidratos presentes en el antígeno glicosilado o determinante antigénico y la reacción posterior con el AP205VLP. En una modalidad, el antígeno glicosilado o determinante antigenico reacciona con peryodato de sodio en una reacción de oxidación moderada de la porción de carbohidratos, para producir un antígeno activado o determinante antigenico con uno o más grupos funcionales de aldehidos. El antígeno así activado o determinante antigénico se separa del peryodato en exceso de sodio y reaccionada además con AP205VLP, en donde los residuos de lisina del AP205VLP o de al menos una subunidad AP205VLP reaccionan con el grupo funcional aldehido previamente formado sobre el antígeno o determinante antigénico por ejemplo como se describe por Hermanson, G.T. in Bioconjugate Techniques, Academic Press Inc., San Diego, CA, USA. La autopolimerización del antígeno activado o determinante antigénico se puede controlar al ajustar el pH como se describe en la publicación antes mencionada. La base formada de Schiff se reduce además preferiblemente con cianoborohidruro de sodio que se retira posteriormente por filtración con gel o diálisis. Alternativamente, los grupos carboxilo del AP205VLP o de al menos una de la subunidad AP205VLP pueden reaccionar con EDC y una dihidrazida, tal como dihidrazida del ácido adípico para producir una porción de hidrazida disponible para reacción con uno o más grupos funcionales aldehido presentes en el antígeno activado o determinante antigénico. La hidrazona así formada puede además reducirse con cianborohidruro de sodio. Alternativamente, el antígeno activado o determinante antigeníco con uno o más grupos funcionales aldehido reacciona con cisteamina lo que resulta en la introducción de un grupo cisteína en el antígeno o determinante antigénico. Métodos adicionales de reticulado y reticuladores adecuados para el enlace al antígeno o determinante antigénico de un AP205VLP, así como la guía para efectuar las reacciones de acoplamiento y sobre el uso de los reticuladores químicos y los procedimientos de reticulado químico se pueden encontrar en Hermanson, G.T. en Bioconjugate Techniques, Academic Press Inc., San Diego, CA, USA. Otros métodos de enlace del VLP a un antígeno incluyen métodos en donde el VLP se biotinila y el antígeno expresado como una proteína de fusión de estreptavidina o métodos en donde ambos antígenos y el VLP están biotinilados . En este caso, el antígeno se puede primero enlazar a la estreptavidina o avidina al ajustar la relación del antígeno con la estreptavidina de manera tal que los sitios de enlace libres estén todavía disponibles para el enlace del VLP que se agrega en la siguiente etapa. Alternativamente, todos los componentes se pueden mezclar en una reacción de un recipiente. Otros pares receptor ligando en donde una forma soluble del receptor y del ligando está disponible, y que pueden reticularse con el VLP o el antígeno, se pueden usar como agentes de enlace para enlazar el antígeno al VLP. En una modalidad preferida de la presente invención, el primero y/o segundo sitios de colocación se seleccionan del grupo que consiste de: (a) un antígeno y un anticuerpo o fragmento de anticuerpo para el mismo (b) biotina y avidina, estreptavidina y biotina, (c) un receptor y su ligando, (d) una proteína de enlace al ligando y subligando, (e) un polipéptido de cremallera de leucina interactuante, (f) un grupo amino y un grupo químico reactivo al mismo, (e) un grupo carboxilo y un grupo químico reactivo al mismo, (h) un grupo sulfhidrilo y un grupo químico reactivo al mismo, e (i) una combinación de los mismos.

Respuestas Inmunes La natrualeza o tipo de la respuesta inmune no es un factor limitante de esta descripción. El resultado deseado de una respuesta inmune terapéutica o profiláctica puede variar de acuerdo con la enfermedad, srgún los principios bien conocidos en el arte. Por ejemplo, una respuesta inmune contra un agente infeccioso puede evitar complentamenté la colonización y replicacion de un agente infeccioso, afectando la inmunidad estéril y la ausencia de algunos síntomas de enfermedad. Sin embargo, una vacuna contra agentes infecciosos se puede considerar efectiva si reduce el número, severidad o duración de los síntomas, si reduce el número de individuos en una población con los síntomas o reduce la transmisión de un agente infecioso. Similarmente, las respuestas inmunes contra el cáncer, alérgenos o antiantígenos pueden tratar completamente una enfermedad, pueden mejorar los síntomas o pueden ser una faceta en una intervención tarapéutica global contra una enfermedad. Por ejemplo, la estimulación de una respuesta inmune contra un cáncer se puede acoplar con un método quirúrgico, quimioterapéutico, radiológico, hormonale, u otros inmunológicos con objeto de afectar el tratamiento. Adicionalmente, se puede desear estimular tipos diferentes de respuestas inmunes dependiendo de la enfermedad y según los principios conocidos en el arte. Es bien conocido por ejemplo, que algunas respuestas inmunes son más adecuadas para un antígeno en particular que otras respuestas inmunes. Algunas respuestas inmunes son de hecho inadecuadas y pueden provocar patología tal como inflamación patológica en respuesta a infección, alergias y enfermedad autoinmune descritas además en la presente. Aunque no se desean ciertas respuestas inmunes específicas, la presente invención estimula las respuestas inmunes hacias metas terapéuticas o profilácticas. Una modalidad adicional particular de la invención, incluye la generación de una respuesta inmune capaz de contrarrestar los efectos a una respuesta inmune patología . La naturaleza de la respuesta inmune se puede afectar por la naturaleza del antígeno, via de introducción al cuerpo, dosis, régimen de dosis, naturaleza repetitiva del antígeno, respaldo del hospedador y factores de señalización de sistema inmune. Tal conocimiento es bien conocido en el arte. Como tal, se puede preparar una respuesta inmune por la aplicación de la teoría conocida en el arte y la experimentación de rutina. Aunque no se desea apegarse por la teoría, la invención actual presenta ventajas particulares novedosas y sorprendentes como un componente de una composición farmacéutica para generar una respuesta inmune y particularmente como una vacuna. Primeramente, otros portadores conocidos en el arte-incluyendo BSA, hemocianina de una variedad de lapa, toxoide tetánico, proteínas bacterianas de la membrana exterior, toxina del cólera, exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa y pilos bacterianos pueden ser inadecuados para su uso en un individuo y en particular un humano. Los portadores antes mencionados pueden inducir reacciones alérgicas o estimular las respuestas inmunes patológicas (por ejemplo, toxina del cólera, KLH, BSA) . Los portadores antes mencionados pueden requerir la presencia de adyuvantes tales como un adyuvante completo de Freund considerado ahora inadecuado para su uso en humanos . Diversos portadores pueden ser componentes de las vacunas actuales (por ejemplo toxoide tetánico, toxina del cólera, exotoxina A) , o representar antígenos que se encuentran comúnmente (por ejemplo pilos bacterianos, exotoxina A, proteína de membrana exterior) . Como tales un individuo puede poseer un alto nivel de inmunidad prexistente para estos portadores, de manera tal que la inmunización con el conjugado de antígeno y portador inducirá una respuesta inmune relativamente mayor para el portador que el antígeno novedoso. Por estas razones, individualmente o como un todo, el uso de AP205VLP como una proteína portadora puede representar una mejora útil sobre las proteínas portadoras actuales. Una composición conjugada AP205-DerPl puede estimular una respuesta inmune contra DerPl sin el uso de adyuvante completo de Freund y sin la evidencia de respuestas patológicas inmunes. En el uso de AP205 como una proteína inmune, es posible que los antígenos de AP205 conjugados a AP205 se puedan tomar por el antígeno que presentan células y con ello estimular la ayuda de las células T para inducir la respuesta inmune. Además, los haptenos que son normalmente no inmunogénicos, se pueden acoplar AP205 con lo que se genera una respuesta inmune contra tales haptenos . Una característica ventajosa adicional de la invención es que los antígenos deben estar presentes en la superficie de un VLP en configuraciones regulares repetitivas que pueden inducir respuestas inmunes eficientes con y sin ayuda de c luas T. Esta característica de la invención es particularmente ventajosa. La presente invención proporciona así métodos para mejorar la eficiencia de la vacunación particularmente contra autoantígeno al incrementar el grado de repetibilidad del antígeno para usarse para la inmunización a través del enlace del antígeno a AP205VLP.

Composiciones vacunas y la administración de las mismas y métodos de tratamiento . La invención proporciona composiciones de vacuna que se pueden usar para evitar y/o atenuar enfermedades o condiciones . La invención proporciona además métodos de vacunación para prevenir y/o atenuar enfermedades o condiciones en individuos. En una modalidad, la invención proporciona vacunas para la prevención de enfermedades infecciosas en un amplio intervalo de especies, particularmente especies de mamíferos tales como humanos, monos, vacas, perros, gatos, cerdos, caballos, etc.. las vacunas se pueden diseñar para tratar infecciones de etiología viral tal como el VIH, influenza, herpes, hepatitis viral, Epstein Barr, polio, encefalitis viral, sarampión, viruela, etc., o infeciones de etiología bacteriana tal como neumonía, tuberculosis, sífilis, etc., o infecciones de etiología de parásitos tales como malaria, tripanosomiasis, leismaniasis, tricomoniasis , amibiasis, etc .. En otra modalidad, la invención proporciona vacunas para la prevención y tratamiento del cáncer en un amplio rango de especies, particularmente especies mamíferas tales como humanos, monos, vacas, perros, gatos, cerdos, caballos, etc.. las vacunas se pueden diseñar para tratar todo tipo de cáncer: linfornas, carcinomas, sarcomas, melanomas, etc.. En otra modalidad de la invención, los conjugados, composiciones y métodos de invención se pueden usar en el diseño de vacunas para el tratamiento de alergias. Los anticuerpos del isotipo IgE son componentes importantes en las reacciones alérgicas. La mayoría de las células que enlazan anticuerpos IgE en su superficie y liberan histaminas y otros mediadores de la respuesta alérgica con el enlace del antígeno específico a las moléculas IgE se enlazan en la superficie de los mastocitos. Al inhibir la producción de los anticuerpos IgE por lo tanto, es un objetivo prometedor para proteger contra las alergias. Esto debe ser posible al alcanzar una respuesta deseada en células de ayuda T. Las respuestas de células T de ayuda se pueden dividir en el tipo 1 (TH1) y respuestas de células de ayuda T de tipo 2 (TH2) (Romagnani, Inmunol . Today 18:263-266 (1997)). Las células TH1 secretan el interferon-gamma y otras citocinas . En contraste, una citocina crítica producida por células TH2 es IL-4, que impulsa la célula B para producir IgE. En muchos sistemas experimentales, el desarrollo de las respuestas TH1 y TH2 es mutuamente exclusivo ya que las células TH1 suprimen la inducción de las células TH2 y viceversa. Así, los antígenos que disparan una respuesta fuerte TH1 suprimen simultáneamente el desarrollo de la respuesta TH2 y así la producción de anticuerpos IgE. Es el hallazgo de la presente invención que AP205VLP induce una respuesta inmune de tipo TH1. Así, mediante el uso de los procesos de la invención, los AP205VLPs se pueden decorar con diversos alérgenos y usarse para inmunización. Debido al acoplamiento del alérgeno a AP205VLP, se obtendrá una respuesta TH1 - Los anticuerpos IgG protectores se producirán, y la producción de los anticuerpos IgG que provocan las reacciones alérgicas se evitará. Ya que el alérgeno se presenta por los VLP que se reconocen por un conjunto diferente de células T de ayuda que el alérgeno mismo, es probable que los anticuerpos IgG específicos de alérgenos se inducirán aun en individuos alérgicos que presentan células TH2 pre-existentes específicas para el alérgeno. La presencia de altas concentraciones de anticuerpos IgG puede evitar el enlace de los alérgenos a las células de mastocitos que enlazan el IgG con lo cual se inhibe la liberación de histaminas. Así, la presencia de anticuerpos IgG puede evitar las reacciones alérgicas mediadas por IgE. Las sustancias típicas que provocan alergias incluyen pero no se limitan a pólenes (esto es por ejemplo de pasto, ambrosía, abedul o pólenes de los cedros de montaña) , polvo de casas, ácaros, alérgenos epidérmicos de mamíferos y caspas de animales, mohos y hongos, cuerpos de insectos y venenos de insectos pelos, salivas, suero, plumas, alimentos o fármacos (por ejemplo, penicilina). Ver Shough, H. et al., EMINGTON' S PHSRMACEUTICAL SCIENCES, 19a. edición, ' (Chap. 82), Mack Publishing Company, Marck Publishing Group, Easton, Pennsylvania (1995) , los contenidos completos de la cual se incorporan aquí como referencia. En modalidades específicas, la invención proporciona métodos para evitar y/o atenuar enfermedades o condiciones que se provocan o exacerban por productos de "auto" genes (por ejemplo factores de necrosis de tumor) , esto es, "auto-antígenos" como se usan en la presente, en modalidades relacionadas, la invención proporciona métodos para la inducción de respuestas inmunológicas en individuos lo cual conduce a la producción de anticuerpos, que evitan y/o atenúan enfermedades o condiciones y se provocan o exacerban por productos de "auto" genes. Los ejemplos de tales enfermedades o condiciones incluyen enfermedad de injerto contra hospedador, reacciones alérgicas mediadas por IgE, anafilaxis, síndrome de distensión respiratoria en adultos, enfermedad de Crohn, asma alérgico, leucemia linfoblástica aguda (ALL, popr sus siglas en inglés) , linfoma que no es Hodgkin (NHL) , enfermedad de Graves, enfermedades autoinmunes inflamatori s, miastenia gravas, lupus eritematoso sistémico (SLE, popr sus siglas en inglés) , linf denopatía de enfermedad inmunoproliferativa (IPL, popr sus siglas en inglés) , linfadenopatía, angioinmuneproliferativa (AIL, popr sus siglas en inglés) , linfadenopatía de inmunoblastos (IBL, popr sus siglas en inglés) , artritis reumatoide, diabetes, esclerosis múltiple, opsteoporosis y enfermedad de Alzheimer. Como se entendería por alguien de experiencia ordinaria en la técnica, cuando se administran las composiciones de la invención a un individuo, pueden estar en una composición que contiene sales, soluciones amortiguadoras adyuvantes u otras substancias que se desean para mejorar la eficacia de la composición. Los ejemplos de materiales adecuados para su uso en la preparación de composiciones farmacéuticas, se suministran en diversas fuentes incluyendo REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (OSOL, A, ed, Mack Publishing Co . , (1990) ) . Se dice que las composiciones de la invención son farmacológicamente aceptables, si su administración se puede tolerar por un individuo receptor. Además, las composiciones de la invención se administrará en una cantidad terapéuticamente efectiva (esto es, una cantidad que produce un efecto fisiológico deseado) . Las composiciones de la presente invención se pueden administrar por diversos métodos conocidos en el arte, pero se administrarán normalmente por inyección, infusión, inhalación, administración oral, u otros métodos físicos adecuados. Las composiciones se administran alternativamente intramuscularmente intravenosamente, transmucosalmente, transdermalmente , subcutáneamente. Los componentes de las composiciones para administración incluyen soluciones acuosas estériles (por ejemplo salina fisiológica) o soluciones no acuosas y suspensiones. Ejemplos de los solventes no acuosos son propilenglicol , polietilenglicol , aceites vegetales como el aceite de olivo, y esteres orgánicos inyectables tales como el oleato de etilo. Los portadores o apositos de oclusión se pueden usar para incrementar la permiabilidad de la piel y mejorar la absorción del antígeno. Otras modalidades de la invención incluyen procesos para la producción de las composiciones de la invención y métodos de tratamiento médico que utilizan estas composiciones. Se entenderá que tanto la descripción general anterior como la descripción detallada siguiente, son solamente ejemplares y explicativas y se pretende que suministren una explicación adicional de la invención como se reivindica. Además de las tecnologías de vacunas, otras modalidades de la invención se dirigen a métodos de tratamiento médico para el cáncer y alergias, y para métodos de tratamiento de enfermedades o condiciones que se provocan o exacerban por productos de autogenes . Todas las patentes y publicaciones aquí referidas se incorporan expresamente como referencia en su totalidad.

Kits. En otras modalidades, las composiciones de la presente invención se pueden ensamblar en kits para su uso en la detección en ensayos o instalaciones industriales, en el diagnóstico o detección de enfermedades, condiciones o trastornos. Tales kits de acuerdo con la presente invención pueden comprender al menos un recipiente que contiene uno o más de los conjugados o composiciones antes descritos incluyendo los conjugados AP205 y moléculas inmunes y anticuerpos respectivamente, dirigidos contraconjugados . Los kits de la invención pueden comprender opcionalmente además al menos un recipiente adicional que puede contener por ejemplo uno o más antígenos, uno o más haptenos, una o más partículas de núcleo, uno o más conjugados/composiciones de la invención, uno o más portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables, uno o más soluciones amortiguadoras, una o más proteínas, una o m s moléculas de ácido nucleico similares. Se entenderá por alguien de experiencia ordinaria en las artes relevantes, que otras modificaciones y adaptaciones adecuadas a los métodos y aplicaciones aquí descritos son fácilmente evidentes y se pueden hacer sin alejarse del alcance de la invención o alguna modalidad de la misma. Habiendo ahora descrito la presente invención del detalle, la misma se entenderá más claramente con referencia a los siguientes ejemplos que se incluyen con ella para propósito de ilustración solamente y que no se pretenden que limiten la invención .

EJEMPLOS EJEMPLO 1: Clonación del gen de proteína de cubierta AP205 El cADN de la proteína de cubierta AP205 (CP) se agrupó a partir de dos fragmentos de cADN generados del ARN del fago AP205 usando una técnica PCR de transcripción y clonación en el plásmido 4 -TOPO pCR comercial para la secuenciación. Las técnicas de transcripción inversa son bien conocidas por aquellos expertos en el arte relevantes . El primer fragmento contenido en el plásmido p205-246 contuvo 269 nucleotidos de dirección ascendente de la secuencia CP y 74 nucleotidos que codifican los primeros 24 aminoácidos N-terminal del CP. El segundo fragmento contenido en el plásmido p205-262, contuvo 364 nucleotidos que codifican de 12-131 aminoácidos del CP y 162 nucleotidos adicionales en la dirección descendente de la secuencia CP. El plásmido 283.-58 se diseño mediante dos etapas de PCR, para fusionar ambos fragmentos CP a partir de los plásmidos p205-246 y p205-262 en una secuencia CP de longitud completa. Se usaron un cebador en la dirección ascendente pl.44 que contiene el sitio Ncol para clonarlo dentro del plásmido pQbl85 o pl.45 que contiene el sitio Xbal para clonarlo dentro del plásmido pQblO, y un cebador en la dirección ascendente pl.46 que contiene el sitio de restricción HindlII (secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción subrayada) : pl .44. 5 ' - ACCATGGCAAATAAGCCAATGCAACCG-3 ' (SEC ID NO:59) pl.44 5 ' -AATCTAGAATTTTCTGCGCACCCATCCCGG-3 ' (SEC ID NO: 60) Pl.46 5 ' -AAAAGC TTA AGC AGT AGT ATC AGA CGA TAC G-3' (SEC ID NO: 61) Dos cebadores adicionales, pl.14 que se alinean en el extremo 5' del fragmento contenido en p205-262 y pl.48 que se alinea en el extremo 3' del fragmento contenido en el plásmido p205-246 se usaron para amplificar los fragmentos en el primer PCR. Los cebadores pl.47 y p.1.48 fueron complementarios entre sí.' pl.47: 5 ' -GAGTGATCCAACTCGTTTATCAACTACATTT-TCAGCAAGTCTG-3' (SEC ID NO: 62) Pl .48 : 5 ' -CAGACTTGCTGCCCCTGTAGTTGATAAACGA-GTTGGATCACTC-3' (SEC ID NO: 63) En las primeras dos reacciones PCR se generaron dos fragmentos . El primer fragmento se generó con los cebadores p.145 y p.148 y la plantilla p205-246. El segundo fragmento se generó con los cebadores pl.47 y p.46 y la plantilla p205-262. Ambos fragmentos se usaron como plantillas para la segunda reacción PCR, una extensión de traslape de empalme con la combinación del cebador pl.45 y p.146 o p.144 y p.146. El producto de las dos reacciones PCR de la segunda etapa se digirieron con Xbal o Ncol respectivamente, y HindIII se clonó con los mismos sitios de restricción dentro de pQblO o pQbl85 respectivamente, dos vectores de expresión derivados de pGEM bajo el control del promotor operon de triptofano E. coli . Se obtuvieron dos plásmidos, pAP283-58 (SEC ID No.2) que contenían el gen que codifica para wt AP205 (SEC ID NO:l) en pQblO y pAP281-32 (SEC ID NO: 4) que contienen la secuencia del nucleótido de la SEC ID NO: 125 que codifica a la muteína con la mutación Pro5—»Thr, que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 3 en pQbl85. Las secuencias de la proteína de cubierta se verificaron mediante la secuenciación de ADN. El PAP283-58 contiene 49 nucleótidos en la dirección ascendente del codón ATG del CP, en la dirección descendente del sitio Xbal y contiene el sitio de enlace ribosomal original supuesto del mARN de la proteína de revestimiento .

EJEMPLO 2: Expresión y purificación del AP205 VLP recombinante A. Expresión del AP205 VLP recombinante La JM109 de E.coli se transformó con el plásmido pAP283-58. 5 mi del medio líquido LB con 20 g/ml de ampicilina se inocularon con una colonia sencilla y se incubaron a 37°C durante 16 a 24 horas sin agitación. El inoculo preparado se diluyó 1:100 en 100-300 mi de un medio de LB que contenía 20 µg/ml de ampicilina y se incubó a 37 °C durante toda la noche sin agitación. El segundo inoculo resultante se diluyó 1:50 en un medio 2TY que contenía glucosa y fosfato al 2% como amortiguador y se incubó a 37°C durante toda la noche en un agitador. Las células se cosecharon mediante centrifugación y se congelaron a -80°C. B. Purificación de AP205 VLP recombinante Soluciones y soluciones amortiguadoras 1. solución amortiguadora de lisis Tris-HCl 50 mM pH 8.0 con EDTA 5 mM, Tritón X100 0.1% y PMSF en 5 microgramos por mi . 2. SAS Sulfato de amonio saturado en agua 3. Solución amortiguadora NET. Tris-HCl 20 mM, pH 7.8 con 5 mi de EDTA y 150 mi de NaCl. 4. PEG polietilenglicol al 40% (p/v) 6000 en NET Lisis : Las células congeladas se resuspendieron en una solución amortiguadora de lisis en 2 ml/g de células. La mezcla se sónico con 22 kH cinco veces durante 15 segundos con intervalos de 1 minuto para enfriar la solución en hielo. El lisado se centrifugó entonces durante 20 minutos a 12 000 r.p.m. usando un rotor F34-6-38 (Ependorf) . Todas las etapas de centrifugación descritas abajo se realizaron usando el mismo rotor excepto en lo establecido en otra parte. El sobrenadante se almacenó a 4°C mientras que los desechos celulares se lavaron dos veces con una solución amortiguadora lisis. Después de la centrifugación, se concentraron los sobrenadantes del lisado y las fracciones del lavado. La precipitación de amonio-sulfato puede usarse adicionalmente para purificar AP205 VLP. En una primera etapa, se elige una concentración de amonio-sulfato en la cual AP205 VLP no precipite. El peletizado resultante se descarta. En la siguiente etapa, se selecciona una concentración de amonio-sulfato en la cual AP205 VLP precipita cuantitativamente y AP205 VLP se aisla del peletizado de esta etapa de precipitación mediante la centrifugación (14 000 r.p.m. durante 20 minutos) . El peletizado obtenido se solubiliza en la solución amortiguadora NET. Cromatografía : La proteína cápsida de los sobrenadantes concentrados se cargó en una columna 4B de sefarosa (2.8 x 70 cm) y se eluyó con una solución amortiguadora NET a 4 mi/hora/fracción. Las fracciones 28-40 se recogieron y precipitaron con sulfato de amonio saturado al 60%. Las fracciones se analizaron por SDS-PAGE e Inmunotransferencia con un antisuero específico para la proteína de cubierta AP205 VLP previo a la precipitación. El peletizado aislado mediante centrifugación se resolubilizó en una solución amortiguadora NET y se cargó en una columna 2B de sefarosa (2.3 x 65 cm) , se eluyó a 3 ml/h/fracción. Las fracciones se analizaron por SDS-PAGE y las fracciones 44-50 se recogieron, se concentraron y precipitaron con sulfato de amonio saturado al 60%. El peletizado aislado mediante centrifugación se resolubilizó en una solución amortiguadora ET y se purificó en una columna 6B de sefarosa (2.5 x 47 cm) , se eluyó en 3 ml/hora/f acción. Las fracciones se analizaron por SDS-PAGE. Las fracciones 23-27 se recolectaron, la concentración de la sal se ajustó a 0.5 M y se precipitó con PEG 6000, se añadió a una reserva al 40% en agua y a una concentración final de 13.3%. El peletizado aislado mediante centrifugación, se resolubilizó en una solución amortiguadora NET y se cargó en la misma columna 2B de sefarosa como arriba y se eluyó de la misma manera. Las fracciones se analizaron mediante SDS-PAGE. Las fracciones 43-53 se recolectaron y precipitaron con sulfato de amonio saturado al 60%. El peletizado aislado mediante centrifugación se resolubilizó en agua y la solución de la proteina obtenida se dializó extensivamente contra el agua. Aproximadamente 10 mg de la proteína purificada por gramo de célula podría aislarse. La purificación de AP 205 VLP podría mostrarse, la cual se analizó por SDS PAGE e inmunotransferencía. Las fracciones del AP205 VLP recombinantes de la primera etapa de cromatografía 4B de sefarosa así como la última etapa de cromatografía de sefarosa podrían mostrarse en la ejecución del SDS-PAGE teñida con plata reduciendo las condiciones así como la inmunotransferencia con un antisuero específico para la proteína de cubierta AP205 VLP. El examen de las partículas tipo virus en el microscopio Electrón demostró que son idénticas a las partículas del fago (Figura 1A y 1 B) . La figura 1 muestra una imagen EM de partículas del fago Ap205 mientras que una imagen EM de las partículas autoagrupadas del AP205 VLP recombinante se muestra en la figura IB. Por motivos de simplicidad, el término "partículas tipo virus AP205" y el término "AP205 VLP" como se usan dentro de la sección de ejemplos, se refieren a una partícula tipo virus expresada y purificada como se describe en el ejemplo 2 y compuesta de proteínas de cubierta que tienen una secuencia de aminoácidos como se establece en la SEC ID NO:l.

EJEMPLO 3 : Acoplamiento del antxgeno del péptido Deprl.2 y Fag al AP205 VLP e inmunización de un ratón con un péptido Derpl.2 acoplado a un AP205 VLP. ?. Acoplamiento del péptido Derpl.2 y Flag al Ap205 VLP recombinante . El péptido Derpl.2 (secuencia: CQIYPPNANKIREALAQTHSA wDer p 1 pll7", aa 117-137 (SEC ID NO: 64)) y Falg (secuencia: CGGDYKDDDDK (SEC ID NO: 65)) se sintetizaron químicamente de acuerdo a los métodos conocidos en el arte. El AP205 VLP, expresado y purificado descrito en el ejemplo 2 se resolubilizó en Hepes 20 mM, 150 mM de NaCl, solución amortiguadora H 7.4 (solución amortiguadora HBS). El AP205 VLP resolubilizado se hizo reaccionar a una concentración de 2 mg/ml (determinado en un ensayo Bradford) , con 2.85 mM SMPH (Pierce) durante 30 minutos a la temperatura ambiente (RT) . La mezcla de reacción se dializó entonces contra una solución amortiguadora HBS y reaccionó con 0.714 mM Derpl.2 o FLAG, se diluyó en la mezcla de reacción a partir de una reserva en DMSO. La reacción de acoplamiento se dejó proceder durante 2 horas a 15°C y la mezcla de reacción se dializó 2 2 horas contra un volumen HBS de 1000 veces y se congeló instantáneamente en nitrógeno líquido en alícuotas para almacenarse a -80 °C hasta su uso extenso. Una alícuota se deshielo y el acoplamiento del antígeno a una subunídad AP205 evaluada por SDS-PAGE y la concentración de la proteína medida en un ensayo Bradford. El resultado de la reacción de acoplamiento de Derp 1.2 a AP205 VLP se muestra en la figura 2. La subunidad del monómero de AP205 VLP tiene un peso molecular de 14 kDA. Luego de la derivación de AP205 VLP con el reticulado, dímeros, trímeros, tetrámeros, pentámeros y hexámeros producidos mediante una reticulación se detectan en el SDS-PAGE además de la forma monomérica de la subunidad. La figura 2 muestra el análisis SDS-PAGE de la reacción de acoplamiento AP205 VLP y ?)ß VLP al péptido Derpl.2. Las muestras se ejecutaron bajo condiciones de reducción en un gel de Tris-glicina al 16%. La Pista 1 es el marcador de la proteina con pesos moleculares correspondientes indicados en el limite izquierdo del gel, pista 2, proteína de cápsida ?ß derivada, pista 3, sobrenadante de la reacción de acoplamiento de la proteína de cápsida ?ß para el péptido Derpl.2, pista 4, peletizado de la reacción de acoplamiento de la proteína de cápsida ?)ß al péptido Derpl.2, pista 5, AP205 VLP derivado, pista 6, sobrenadante de la reacción de acoplamiento de AP205 VLP al péptido Derpl.2, pista 7, peletizado de la reacción de acoplamiento de AP205 VLP al péptido Derpl.2. Los productos de acoplamiento que corresponden al acoplamiento de 1, 2, 3, 4 y 5 péptidos por monómero se indican mediante las flechas en la figura. Un gran número de epítopos podría acoplarse al AP205 VLP que a la proteína de cápsida ?)ß. B. Inmunización de ratones con el péptido Derpl.2 acoplado al análisis AP205 VLP recombinante de respuesta inmune y determinación del subtipo IgG. El AP205 VLP acoplado al péptido Derpl.2 o ?ß VLP acoplado al péptido Derpl.2 se inyectaron s.c. en ratones (en cada 3 ratones) el día 0 y 14. El péptido Derpl.2 se acopló a la proteína de cápsida ?)ß que usan las mismas condiciones descritas bajo A para el acoplamiento al AP205 VLP. Cada ratón se inmunizó con 10 µ de vacuna diluida en PBS para 200 µ? . Los ratones se sangraron retroorbitalmente el día 20, y el título de los anticuerpos específicos para el péptido Derpl.2 se midió en una ELISA contra el péptido Derpl.2. El péptido Derp I "Der p I p52" se acopló a la ARNasa A de bovino usando el sulfa-SPDP de reticulación química. Las placas ELISA se cubrieron con preparaciones ARNasa acopladas en una concentración de 10 µ9/p?1. Las placas se bloquearon y se incubaron después con sueros de ratón diluidos en forma seriada. Los anticuerpos enlazados se detectaron con anticuerpos específicos IgG anti-ratón etiquetados enzimáticamente para los subtipos respectivos. Como un control, los sueros preinmunes del mismo ratón se probaron también (no se muestran datos) . Los resultados se muestran en la figura 3. La figura 3 muestra un análisis ELISA de los anticuerpos IgG específicos para "Derp 1.2" en sueros' de ratón inmunizados contra el péptido Derpl.2 acoplado al AP205 VLP o proteína de cápsida ?ß respectivamente. Se determinaron los títulos IgG totales aspa como los títulos del subtipo IgG. Los anticuerpos específicos Derpl.2 no podrían detectarse en cualquiera de los sueros preinmunes analizados para cada uno de los subtipos IgG. La figura muestra que para ambos AP205 y ?,ß, los subtipos típicos de una respuesta inmune Thl se inducen debido a que el título IgG2a es mucho mayor que el título IgGl . Una respuesta inmune anti-péptido específico fuerte se obtuvo con el péptido acoplado a ambos VLP. Los anticuerpos específicos para el portador se midieron también por ELISA y se compararon para ambos portadores.

EJEMPLO 4: Sistema de Expresión eucariotica modular para el acoplamiento de antígenos VLP. Este sistema se generó para añadir varias secuencias ligadoras de aminoácidos que contienen un residuo de cisteína para antígenos que acoplan VL .

A. Construcción de un sistema de expresión derivado de EBN . que codifican un enlace de aminoácidos que contiene cisteína y Fc-Tag desdoblable: El pCep-Pu ( uttke et al. J. Biol . Chem. 276:36839-48 (2001) ) se digirió con Kpn I y Bam Hi y un nuevo sitio de clonación múltiple se introdujo con los oligonucleotidos PH37 de pares básicos y PH38 que conducen al pCEp-MCS. Un sistema modular que contiene una cisteína libre flanqueada por varias glicinas, un sitio de desdoblamiento de la proteasa y la región constante del IgGl de humano se generó como sigue. El pSEC2/Hygro B (Invitrogen Cat . No. V910-20) se digirió con Bsp 1201 y Hind III y se ligó con los oligonucleótidos de pares básicos SU7 y Su8 que conducen al constructo pSec-B-MCS. El pSec-B-MCS se digirió entonces con Nhe I y Hind III y se ligó con los oligonucleótidos de pares básicos Ph29 y PH30 que conducen al constructo pSEc 29/30. El constructo pSec-FL-EK-Fc* se generó por una ligación de tres fragmentos de los siguientes fragmentos, el primer psec 29/30 se digirió con Eco RI y Hind III, el segundo se alineó con los oligonucleótidos PH31 y Ph32 y el fragmento Bgl/EcoRI con un plásmido (pSP-Fc*-Cl) que contiene una versión modificada de la región constante IgGl de humano (para detalles de la secuencia IgGl hu ver la secuencia del constructo final pCep-Xa-Fc* (figura 4?- 4C) . El constructo resultante se denominó pSec-Fl-EK-Fc* . A partir de este plásmido, la región de enlace y la parte IgGl Fe de humano se cortó por Nhe I, digirió por Pme I y clonó dentro de pCEp-MCS digerido con Nhe I y Pme I que conduce al constructo pCep-FL-EK-Fc* . Así, un vector modular se creó cuando la secuencia de enlace y el sitio de desdoblamiento de proteasa que se localiza entre los sitios Nhe I y Hind III pueden intercambiarse fácilmente con los oligonucleótidos de pares básicos. Para la generación de los vectores pCep-FL-EK-Fc* de la proteína de fusión de desdoblamiento se digirió con Nhe I y Hind III y el sitio de desdoblamiento del factor Xa N-terminal flanqueado con los aminoácidos GGGGGG (SEC ID NO: 55) se introdujo con los oligonucleótidos PH35 y PH36 de pares básicos y el sitio enterocinasa flanqueados n-terminalmente con GGGGGG (SEC ID NO: 55) se introdujo con los oligonucleotidos PH39 y PH40 de pares básicos que conducen a los constructos pCEp-Xa-Fc* (figura 4A, la secuencia de nucleótidos como se establece en la SEC ID NO: 103, secuencia de aminoácidos como se establece en la SEC ID NO: 104) y pCEp-EK-Fc* (figura 4B, la secuencia de nucleótidos como se establece en la SEC ID NO: 105, la secuencia de aminoácidos como se establece en la SEC ID NO: 106) respectivamente. El constructo pCep-SP-EK-Fc* (figura 4C, secuencia de nucleótidos como es establece en la SEC ID NO: 107, secuencia de aminoácidos como se establece en la SEC ID NO: 107, secuencia de aminoácidos como se establece en la SEC ID NO: 108) que contiene, además, un péptido de señal eucariótica que se generó mediante la ligación de tres fragmentos de pCEp-EK-Fc* digerido con pn 1/ Bam HI, los oligos PH41 y PH42 de pares básicos y los oligos PH43 y PH44 de pares básicos .

B. Producción a gran escala de la proteína de fusión: Para la producción a gran escala de las células 293-EBNA de las proteínas de fusión diferentes (Invitrogen) se transfectaron con los plásmidos de expresión pCep diferentes con un reactivo de Lipofectamina 2000 (Invitrogen Corporation; Carlsabad, CA) de acuerdo a la recomendación de los fabricantes. 24 a 36 horas después de la transfección, las células se dividieron en una relación 1 a 3 bajo la selección de puromicina (1 µ9/t?1) en D EM suplementado con FCS al 10%. Las células resistentes se expandieron entonces en un medio selectivo. Para la cosecha de las proteínas de fusión, la población celular resistente se pasó sobre placas revestidas con poli-L-lisina . Una vez que las células habían alcanzado la confluencia, se lavaron 2 veces con PBS y el medio libre de suero (DMEM) se añadió a las placas. El sobrenadante del cultivo del tejido se cosechó de 2 a 4 días y se reemplazó con un medio DMEM fresco durante un periodo de hasta un mes . Los sobrenadantes cosechados se mantuvieron a 4°C.

C. Purificación de las proteínas de fusión: Las proteínas de fusión Fe recombinantes se purificaron mediante cromatografía de afinidad usando proteína A de sefarosa CL-AB (Amersham Pharmacia Biotech AG) . De manera breve, las columnas de cromatografía se comprimieron con 1 a 3 mi de proteína de la resina A y los sobrenadantes del cultivo del tejido que contenían las proteínas recombinantes se aplicaron a la columna con una bomba peristáltica en una relación de flujo de 0.5 a 1.5 ml/minuto. La columna se lavó entonces con 20-50 mi de PBS. Dependiendo de la proteína de fusión, el desdoblamiento de la proteasa se realizó en la columna o la proteína se eluyó como se describe abajo. Las proteínas de fusión recombinantes se eluyeron con una solución amortiguadora de citrato/fosfato (pH 3.8) suplementada con 150 mM de NaCl y las fracciones que contenían la proteína se reunieron y concentraron con filtros de centrifugación ultra libres (Millipore Corporation; Bedford, MA) .

D. desdoblamiento de proteasa de proteínas de fusión recombinantes (factor Xa, enterocinasa) -. Las proteínas de fusión eluidas que contienen el sitio de desdoblamiento de la enterocinasa (EK) se desdoblaron usando el sistema E max (Invitrogen) de acuerdo a la recomendación del fabricante. La parte Fe desdoblada de la proteína de fusión se eliminó mediante la incubación con la proteína A. La enterocinasa se eliminó entonces con el sistema EK-Away (Invitrogen Corporation; Calsbad, CA) de acuerdo a la recomendación del fabricante. De manera similar, las proteínas de fusión que contienen el sitio de desdoblamiento (Xa) del factor Xa se desdoblaron usando el desdoblamiento del factor Xa de la proteasa de restricción y el kit de remoción (Roche) de acuerdo a la recomendación del fabricante. La parte Pe desdoblada se removió mediante la incubación con la proteína A y la proteasa se removió con la resina de estreptavidina proporcionada con el kit . Las proteínas de fusión recombinantes se concentraron con filtros de centrifugación ultra libres (Millipore Corporation; Bedford, MA) , cuantificadas por espectrofotometría de UV y usadas para reacciones de acoplamiento posteriores. La figura 4A-4C muestra secuencias parciales de los diferentes vectores de expresión eucarióticos diferentes usados. Solamente se muestran las secuencias modificadas. La figura 4A:pCep-Xa-Fc* : la secuencia se muestra desde el sitio Bam HI hacia adelante y las distintas características se muestran antes de la secuencia traducida (SEC ID NO:103 y la SEC ID NO: 104) . La flecha indica el sitio de desdoblamiento de la proteasa del factor Xa. La figura 4B: pCep-EK-Fc*: la secuencia se muestra desde el sitio Bam HI hacia adelante y las distintas características se muestran antes de la secuencia traducida (SEC ID NO:105 y la SEC ID NO: 106) . La flecha indica el sitio de desdoblamiento de la enterocinasa . La secuencia en la dirección descendente del sitio Hind III es idéntica a una que se muestra en la figura 4A. La figura 4C: pCep-SP-EK-Fc* : la secuencia se muestra desde el inicio del péptido de señal y se muestran diferentes características antes de la secuencia traducida (SEC ID NO:107 y la SEC ID NO: 108) . La secuencia del péptido de señal que se desdobla mediante la peptidasa de señal que se muestra en negritas. La flecha indica el sitio de desdoblamiento de la enterocinasa. La secuencia en la dirección descendente del sitio Hind III es idéntica a una que se muestra en la figura 4A. EJEMPLO 5 Expresión eucariotica y acoplamiento de resistina de ratón para AP205 VLP A. Clonación de la resistina de ratón: El ARN total se aisló a partir de 60 mg del tejido adiposo de ratón usando un kit Qiagen RNeasy de acuerdo a la recomendación del fabricante. El ARN se eluyó en 40 µ? de H20. El ARN total se usó entonces para la transcripción inversa con un cebador oligo dT usando un sistema de RT-PCR ThermoScript™ (Invitrogen Corporation; Carlsbad, CA) de acuerdo a la recomendación del fabricante. La muestra se incubó a 50°C durante 1 hora, se calentó a 85°C durante 5 minutos y se trató durante 20 minutos a 37°C con Arnaz. 2 µ? de la reacción a temperatura ambiente se usaron para la amplificación PCR de la resistina de ratón. El PCR se realizó usando TAQ de platino (Invitrogen Corporation; Carlsbad, CA) de acuerdo a la recomendación de los fabricantes usando cebadores PH19 y PH20. El cebador PH19 correspondiente a las posiciones 58-77 y el cebador PH20 correspondiente a las posiciones 454-435 de la secuencia de resistina de ratón. La mezcla PCR primero se desnaturalizó a 94 °C durante 2 minutos y de 35 ciclos se realizaron como sigue: 30 segundos a 94°C, 30 segundos a 56°C y 1 minuto a 72 °C, al final de las muestras se dejaron durante 10 minutos a 72 °C. El fragmento de PCR se purificó y succionó mediante la clonación a TA dentro de un vector pGEMTeasy (Invitrogen Corporation; Carlsbad, CA) conducido por pGEMT-mRes . Para añadir sitios de restricción apropiados, se realizó una PCR secundaria en pGEMT-mRES con los cebadores PH21 y PH22 usando el mismo programa de ciclización como se describe anteriormente. El cebador PH21 delantero contiene un sitio BAM HI y nucleótidos 81-102 de la secuencia de resistina de ratón. El cebador PH22 inverso contiene un sitio Xba I y nucleótidos 426-406 de la secuencia de resistina de ratón. Las posiciones indicadas se refieren a la secuencia de resistina de ratón Gen No. de acceso AF323080. El producto del PCR se purificó y se digirió con Bam HI y Xbal y se subclonó dentro de pcmv-Fc*-Cl, se digirió con Bam HI y Xbal y se condujo al constructo pcmv-mRes-Fc* . La estructura de lectura abierta de resistina se cortó a partir de pcmv-Res-Fc* mediante la digestión de Bam HI/Xba I y se clonó dentro de pCep-Xa-Fc* y pCep-Ek-F*c (ver EJEMPLO 4, sección B9 se digirió con Bam HI y Nhe I conduciendo a los constructos pCep-mRes-Xa-Fc* y pCep-mRes-EK-F*c respectivamente.

B. Producción, purificación y desdoblamiento de la resistina Los constructos pCep-mRes -Xa-Fc* y pCep-mRes -EK-Fc* se usaron entonces para transfectar células 293-EBNA para la producción de proteínas recombinantes como se describe en el EJEMPLO 4, sección B. Los sobrenadantes del cultivo del tejido se purificaron como se describe en el EJEMPLO 4, sección C. Las proteínas purificadas se desdoblaron entonces como se describe en el EJEMPLO 4, sección D. Las proteínas recombinantes resultantes se llamaron "resistina-C-Xa" o "Res-C-Xa" y "resistina-C-EK" o "Res-C-EK" de acuerdo al vector usado. Las proteínas purificadas se analizaron mediante SDS PAGE . Las bandas que corresponden a la resistina-C-E purificada y resistina-C-Xa purificada fueron claramente visibles en el gel . La SEC ID NO. 109, SEC ID NO: 110, SEC ID NO: 111 y la SEC ID NO: 112 muestran secuencias de las proteínas de resistina de ratón recombinantes precursoras usadas para la expresión. La resistina de ratón recombinante procesada usada para el acoplamiento, es decir, Res-C-Xa y Res-C-EK se muestra en la figura 2A y 2B de la WO 02/056905. La secuencia de señal de la resistina que se desdobló luego de la secreción de la proteína mediante la peptidasa de señal se muestra en itálicas. Las secuencias de aminoácidos que resultan de la peptidasa de señal y el desdoblamiento de la proteasa específica (factor Xa o enterocinasa) se muestran en negritas.

C. Acoplamiento de la resistina-C-Xa y la resistina- C-EK para AP205 VL . Una solución de 0.2 mi de 2mg/ml de AP205 VLP en 20 mM de Hepes, 150 mM de NaCl pH 7.4 se hizo reaccionar durante 30 minutos con 5.6 µ? de una solución de 100 mM de SMPH (Pierce) en DMSO a 25 °C agitándose con movimiento. La solución de la reacción se dializó posteriormente dos veces durante 2 horas contra 1 L de Hepes 20 mM, 150 mM de NaCl, pH 7.4 a 4°C. 8 µ? de la mezcla de reacción de la proteína cápsida AP205 dializada se hizo reaccionar entonces con 32 µ? de una solución de resistina-C-Xa (resultando en una concentración final de resistina de 0.39 mg/ml) y 13 µ? de la mezcla de reacción de la proteína de cápsida AP205 se hicieron reaccionar con 27 µ? de una solución de resistina-C-EK (resultando en una concentración final de resistina de 0.67 mg/ml) durante cuatro horas a 25°C en un agitador con movimiento. Los productos de acoplamiento se analizaron mediante SDS-PAGE e Inmunotransferencia bajo condiciones de reducción.

EJEMPLO 6: Expresión, purificación y acoplamiento de constructos Linfotoxina-ß de murino para AP205 VLP A. Introducción de enlazadores que contienen cys, expresión y purificación de linfotoxina-ß de ratón. La parte extracelular de linfotoxina-ß de ratón (LT-ß) se expresó recombinantemente con un enlazador de aminoácidos CGG en su terminación N. El enlazador contuvo una cisteína para acoplar VLP. Una versión larga (aa 49-306) y corta (aa 126-306) de la proteína se fusionaron en su Terminación N ya sea para la S-transferasa de glutatión (GST) o una etiqueta de la histidina-myc para la purificación. Un sitio de desdoblamiento de la enterocinasa (E ) se insertó para el desdoblamiento de la etiqueta.

Construcción de C-LT-P49-306 y la C-LT-pi26-306. El LT-p49-306 se amplificó por PCR con los oligos 5'LT-P y 3'LT~ a partir de una colección de cADN de un bazo de ratón insertado dentro de pFB-LIB. Para la reacción de PCR, 0.5 µg de cada cebador y 200 ng del ADN de plantilla se usaron en los 50 µ? de la mezcla de reacción (1 unidad de polimerasa de platino PFX, 0.3 mM de dNTP y 2mM de MgS04) . Los ciclos de temperaturas fueron como sigue: 94°C durante 2 minutos, seguido por 25 ciclos de 94°C (15 segundos), 68°C (1 minuto) y se siguió a 68°C durante 10 minutos. El producto del PCR se fosforiló con T4 cinasa y se ligó dentro de pEntry 1A (Tecnologies Life) que se había cortado con EcoRV y se había defosforilado . El plásmido resultante se denominó pEntrylA-LT- 49-306. Una segunda reacción de PCR se realizó con oligos 5'LT-plong-iff eJ y 3' LT- stop-Wotl resp. 5' y 3' LT- stop-Wotl usando pEntrylA-LT-P49-306 como plantilla. El oligos 5' LT- iong-MeJ y 5' LT-Pcorto- iel tuvieron un sitio interno Nhel y codones contenidos para un enlazador Cys-Gly-Gly y 3 ' LT- sto-jVotl tuvieron un sitio interno Noti y contuvo un codón de detención. Para la segunda reacción PCR, 0.5 µg de cada cebador y 150 ng del ADN de plantilla se usó en 50 µ? de la mezcla de reacción (1 unidad de polimerasa de platino PFX, 0.3 m de dNTP y 2 mM de MgS04) . Los ciclos de temperatura fueron como sigue: 94°C durante 2 minutos seguido por 5 ciclos de 94°C (15 segundos), 50°C (30 segundos), 68°C (1 minuto) seguido por 20 ciclos de 94°C (15 segundos) , 64°C (30 segundos) , 68°C (1 minuto) y seguido por 68°C durante 10 minutos. Los productos PCR se digirieron con Nhel y Notl y se insertaron dentro de pCEP-SP-GST-EK o pCEP-SP-his-myc-EK (Wuttke et al. J. Biol . Chem. 275:363839-48 (2001)). Los plásmidos resultantes se llamaron pCEP-SP-GST-EK-C-LT- 49-306, pCEP-SP-GST-EK-C-LT-pi26-306, pCEP-SP-his-myc-EK-C-LT-ß49-306, pCEP-SP-his-myc-EK-C-LT-pi26-306, respectivamente. Las posiciones GST para la glutatión-S-transíerasa, EK para enterocinasa, para su etiqueta de hexahistidina y myc para el epítopo anti c-myc. La C indica el enlace CGG que contienen la cisteína adicional . Todas las otras etapas se realizaron mediante protocolos de biología molecular estándar. Secuencia de los oligonucleótidos : 5' LT-ß: 5'-CTT GGT GCC GCA GGA TCA G-3 ' (SEC ID NO: 66) 3' LT-ß: 5'-CAG ATG GCT GTC ACC CCA C-3 ' (SEC ID NO: 67) 5' lt-piong-N el : 5 ' -GCC CGC TAG CCT GCG GTG GTC AGG ATC AGG GAC GTC G-3' (SEC ID NO: 68) 5' LT-Pcorto-M el : 5' -GCC CGC TAG CCT GCG GTG GTT CTC CAG CTG CGG ATT C-3' (SEC ID NO: 69) 5' LT- stop-Notl : 5' -CAA TGA CTG CGG CCG CTT ACC CCA CCA TCA CCG-3 ' (SEC ID NO: 70) .

B. Expresión y producción de GST-EK-C-LT-p49_306 , GST-EK-C-LT-Pi2S-306 , his-myc-EK-C-LT- p49-306 y his-myc-EK-C-LT- 12S-3os · C. Los plásmidos pCEP-SP~GST-EK-C-LT-p49-306, pCEP-SP-GST-E -C-LT-Pl26-306, pCEP-SP-his-myc-EK-C-LT-P49-306 y pCEP-SP-his-myc-EK-C-LT-pi26-306 se transfirieron dentro de células 293-EBNA (Invitrogen) para la producción de proteínas como se describe en el EJEMPLO 4. Las proteínas resultantes se llamaron GST-E -C-LT-p49-30 S í GST-EK-C-LT- i2 g-3os , his-myc-EK-C-LT-p4S-306 , y his-myc-EK-C-LT-Pi26-3os · Las secuencias de la proteína de las proteínas de fusión LT-ß se traducieron a partir de las secuencias cADN: GST-EK-C-LT- 49-306 GST-EK-C-LT~ i26-3oe his-myc-EK-C-LT-p49-3os y his-myc-EK-C-LT- i2S-3os . Las proteínas de fusión se analizaron en geles SDS-PAGE al 12% bajo condiciones de reducción. Los geles se inmunotransfirieron sobre membranas de nitrocelulosa . Las membranas se bloquearon, incubaron con un anticuerpo anti-myc de ratón monoclonal o con un anticuerpo anti-GST. Las manchas se incubaron posteriormente con IgG anti-ratón de cabra conjugado con peroxidasa de raíz de rábano o IgG anti-cabra de conejo conjugado con peroxidasa de raíz de rábano. Podría mostrarse la expresión de las proteínas de fusión LT-ß. Las proteínas de fusión LT-ß se analizaron en geles de SDS-PAGE i al 12% bajo condiciones de reducción. Los geles se tiñeron sobre membranas de celulosa. Las membranas se bloquearon, se incubaron con un anticuerpo anti-myc de ratón monoclonal (dilución 1:2000) o con un anticuerpo anti-GST (dilución 1:2000). Los productos de inmunotransferencia se incubaron posteriormente con IgG anti-ratón de cabra conjugado con peroxidasa de raíz de rábano (diluciones: 1:4000) o con IgG anti-cabra de conejo conjugado con peroxidasa de raíz de rábano (diluciones 1:4000). Los GST-EK-C-LT- p49-306 Y GST-EK-C-L ~ 126-306 podrían detectarse con el anticuerpo anti-GST a un peso molecular de 62 kDa y 48 kDa, respectivamente. El his-myc-EK-C-LT- p 9-306 y his-myc-EK-C-LT- pi26-306 podrían detectarse con al anticuerpo anti-myc a 40-56 kDa y 33-39 kDa, respectivamente. Purificación de GST-EK-C-LT- p49_30 S y GST-EK-C-LT- pi26-306 , his-myc-EK-C-LT-P49-306 y his-myc-EK-C-LT- p126-306 · Los GST-EK-C-LT- p49-306 y GST-EK-C-LT-Pi26-3os se purificaron en una columna de glutatión-sefarosa y his-myc-EK-C-LT- p49_306 y his-myc-EK-C-LT- p126 -30G se purifican en una columna de sefarosa Ni-NTA usando protocolos de purificación estándar. Las proteínas purificadas se desdoblaron con enterocinasa y se analizaron en un gel de SDS-PAGE 1 16% bajo condiciones de reducción.

D. Acoplamiento de C-LT-p49-306 y C-LT~Pi2e-306 para AP205 VLP Una solución de 120 uM AP205 VLP en 20 mM Hepes, 150 mM de NaCl pH 7.2 se hicieron reaccionar durante 30 minutos con un exceso molar de 25 veces de SMPH (Pierce) , se diluyeron a partir de una solución de reserva en DIVISO a 25°C en un agitador con movimiento. La solución de la reacción se analizó posteriormente dos veces durante 2 horas contra 1 L de 20 mM de Hepes, 150 mM de NaCl, pH 7.2 a 4°C. La mezcla de reacción AP205 VLP dializada se hizo reaccionar después con la solución C-L - 4s-3o6 C-LT-pi26-306 (concentraciones finales: 60 µ? AP205 VLP, 60 µ? C-LT- 49-3oe y C-LT-pi26.306) durante cuatro horas a 25°C en un agitador con movimiento. Los productos de acoplamiento se analizaron por SDS-PAGE e Inmunotransferencia bajo condiciones de reducción. EJEMPLO 7: Clonación, Expresión, Purificación y Acoplamiento de AP205 VLP a MIF A. Introducción de enlazadores que contienen cys, expresión, purificación del factor MIF inhibidor "de la migración de los macrófagos de rata. El factor (rMIF) inhibidor de la migración de los macrófagos de rata se expresó recombinantemente con tres enlazadores de aminoácidos diferentes Cl, C2 y C3 fusionados en su C-terminal. Cada uno de los enlazadores contuvo una cisteína para su acoplamiento al VLP. Construcción de rMIF-Cl, rMIF-C2 y rMIF-C3. Los MCS de pET22b(+) (Novagen, INc) se cambiaron a GTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGGATCCGGCTAGCGCTCGAGGGTTTAAACGGC GGCCGCATGCACC (SEC ID NO: 71) mediante el reemplazo de la secuencia original del sitio Ndel al sitio Xhol con el cebadorMCS-lF y cebadorMCS-lR oligos de pares básicos (que se combinan en pares básicos en una solución amortiguadora TrisHCl 15 mM pH 8) . El plásmido resultante se denominó pModOO, que tuvo sitios de restricción Ndel, BamHI, Nhel , Xhol, Pmel en su MCS. El par de oligos de pares básicos Bamhis6-EK-Nhe-F y Bamhis6-EKNhe-R y el par combinado del oligo lF-C-glicina-enlace y el oligo IR-C-glicina-enlace se ligaron juntos dentro del plásmido pModOO digerido con BamHI-Notl para obtener pModECl, el cual tuvo una etiqueta de hexahistidina N terminal, un sitio de desdoblamiento de la enterocinasa y un enlace de glicina del aminoácido C-terminal que contienen un residuo de cisteína. El par combinado de los oligos Bamhis6-EK-Nhe-F y Bamhi6-EKNhe R junto con el par combinado del oligo lF-C-gammal-enlace y el oligo 1R-C-gammal-enlace se ligaron dentro del plásmido pModOO digerido con BamHI-Notl para obtener pMOdEC2 el cual tuvo una etiqueta de hexahistidina N terminal, un sitio de desdoblamiento enterocinasa y un enlace yl C-terminal derivado a partir de la región de articulación de la inmunoglobulina ?? de humano que contiene un residuo de cisteína. El par combinado de los oligos Barrihis6-EK-Nhe-F y Bamhis6-EK-Nhe-R, el par combinado del oligolFA-C-gamma3 -enlace y el oligo lRA-C-gamma3-enlace , y el par combinado del oligolFB-C-gamma3 -enlace y el oligolRB-C-gamma3-enlace se ligaron juntos dentro de pModOO digerido con BamHI-Notl para obtener p odEC3 , el cual tuvo una etiqueta de hexahistidina N terminal, un sitio de desdoblamiento de enterocinasa y un enlace ?3 C terminal que contiene un residuo de cisteína, derivado a partir de la región hinge de ?3 de inmunoglobulina de ratón. El pBS-rMIF que contiene el cADN MIF de rata se amplificó por PCR con oligos rMIF-F y rMIF-Xho-R. El rMIF-F tuvo un sitio Ndel interno y rMIF-Xho-R tuvo un sitio Xhol interno. El producto del PCR se digirió con Ndel y Xhol y se ligó dentro de pModECl, pModEC2 y pModEC3 y se digirió con las mismas enzimas . Los plásmidos resultantes se llamaron pMod-rMIF-Cl , pMod-rMIF-C2 y pMod-rMIF-C3 , respectivamente. Para la reacción PCR, 15 pmol de cada oligo y 1 ng del ADN de plantilla se usó en 50 µ? de la mezcla de reacción (2 unidades de polimerasa PFX, 0.3 mM dNTP y MgS04 2 mM) . Lo s ciclos de temperatura fueron como siguen: 94°C durante 2 minutos, seguido por 30 ciclos de 94°C (30 segundos) , 60°C (30 segundos) , 68°C (30 segundos) , seguido por 68°C durante 2 minutos . Todas las otras etapas se realizaron mediante protocolos de biología molecular estándar. Secuencia de los oligonucleotidos: cebadorMCS-lF: 5 ' -TAT GGA TCC GGC TAG CGC TCG AGG GTT TAA ACG GCG GCC GCA T-3' (SEC ID NO: 72) cebadorMCS-lR: 5 ' -TCG AAT GCG GCC GCC GTT TAA ACC CTC GAG CGC TAG CCG GAT CCA-3' (SEC ID NO: 73) Bamhis6-EK-Nhe-F : 5' -GAT CCA CAC CAC CAC CAC CAC CAC GGT TCT GGT GAC GAC GAT GAC AAA GCG CTA GCC C-3' (SEC ID NO: 74) Bamhis6-Ek-Nhe-R: 5 ' -TCG AGG GCT AGC GCT TTG TCA TCG TCG TCA CCA GAA CCG TGG TGG TGG TGG TGG TGT G-3' (SEC ID NO : 75) ligador oligolF-C-glicina : 5 ' -TCG AGG GTG GTG GTG GTG GTT GCG GTT AAT AAG TTT AAA CGC-3' (SEC ID NO: 76) ligador oligolR-C-glicina : 5 ' -GGC CGC GTT TAA ACT TAT TAA CCG CAA CCA CCA CCA CCA CCC-3' (SEC ID NO: 77) ligador oligolF-C-gammal : 5' -TCG AGG ATA AAA CCC ACA CCT CTC CGC CGT GTG GTT AAT AAG TTT AAA CGC-3' (SEC ID NO: 78) ligador oligolR-C-gammal : 5'-GGC CGC GTT TAA ACT TAT TAA CCA CAC GGC GGA GAG GTG TGG GTT TTA TCC-3' (SEC ID NO : 79) ligador oligolFA-C-gamma3 : 5'-TCG AGC CGA AAC CGT CTA CCC CGC CGG GTT CTT CTG-3' (SEC ID NO: 80) ligador oligolRA-C-gamma3 : 5' -CAC CAC CAG AAG AAC CCG GCG GGG TAG ACG GTT TCG GC-3' (SEC ID NO: 81) ligador oligo2fB-C~gamma3 : 5' -GTG GTG CTC CGG GTG GTT GCG GTT AAT AAG TTT AAA CGC-3' (SEC ID NO: 82) ligador oligo2RB-C-gamma3 : 5' -GGC CGC GTT TAA ACT TAT TAA CCG CAA CCA CCC GGA G-3' (SEC ID NO: 83) r IF-F: 5' -GGA ATT CCA TAT GCC TAT GTT CAT CGT GAA CAC-3 ' (SEC ID NO: 84) RMif-Xho-R: 5' -CCC GCT CGA GAG CGA AGG TGG AAC CGT TC-3 ' (SEC ID NO: 85) i Expresión y purificación de rMIF-Cs Las células de E.colí BL21 (DE3) competentes se transformaron con los plásmidos pMod-rMIF-Cl , PMod-rMIF-C2 y pMod-rMIF-C3. Las colonias sencillas de placas de agar que contienen (Amp) de ampicilina se expandieron en el cultivo líquido (SB con 150 mM MOPS, pH 7.0, 200 µg/ml de Amp, 0.5% de glucosa) y se incubaron a 30°C con 220 r.p.m. agitándose durante toda la noche. 1 L de SB (150 mM MOPS, pH 7.0, 200 ug/ml Amp) se inocularon entonces 1:50 v/v con el cultivo durante toda la noche y se desarrollaron a OD600=2.5 a 30°C. La expresión se indujo con IPTG 2 mM. Las células se cosecharon después en un cultivo durante toda la noche y se centrifugaron a 6000 r.p.m. El peletizado celular se suspendió en una solución amortiguadora lisis (10 mM de Na2HPo4( 30 mM de NaCl, 10 mM de EDTA y 0.25% de Tween-20) con 0.8 mg/ml de lisozima, sonicada y tratada con benzonasa. 2 mi del lisado se corrió después a través de 20 mi de QXL y una columna SP XL de 20 mi. Las proteínas rMIF-Cl, rMIF-C2 y rMIF-C3 estuvieron en el flujo de paso. Las secuencias de la proteína rMIF-Cs se tradujeron a partir de las secuencias de cADN. rMIF-Cl(SEC ID NO: 114, Cl es GGGGCG (SEC ID NO: 55)) rMIF-C2(SEC ID NO: 115, C2 es PKPSTPPGSSGGAPGGCG (SEC ID NO: 116) ) . RMIF-C3(SEC ID NO: 117, C3 es DKTHTSPPCG (SEC ID NO: 118) ) La figura 5A muestra una descripción de los constructos MIF con un enlace de aminoácidos adicional que contiene un residuo de cisteína. Los MIF pueden ser una proteína de cualquier mamífero, que incluyen sin limitación MIF de humano (SEC ID NO: 119), MIF de rata (SEC ID NO: 1209 o Mlf de ratón (SEC ID NO: 121) . Las secuencias de MIF de humano que contienen el enlace Cl, C2 o C3 de los aminoácidos C-terminal se muestra en las SEC ID NO: 122-124) . La figura 5B muestra un análisis SDS-PAGE de los constructos MIF purificados que se corrieron bajo condiciones de reducción y teñidos con azul brillante de coomassie. Los constructos descritos en la figura 5A rMIF-Cl (SEC ID NO: 114); rMIF-C2 (SEC ID NO: 115), y rMIF-C3 (SEC ID NO: 117) de rata purificados se cargaron sobre el gel . EJEMPLO 8: Clonación, Expresión, Purificación y acoplamiento de RANKL A. Introducción de enlaces de aminoácidos que contienen un residuo de cisteína, expresión y purificación de RANKL de ratón. Un fragmento del activador del receptor del ligando kappa b del factor nuclear (RANKL) , que ha sido llamado factor de diferenciación osteoclasto, ligando osteoprotegerina y citocina inducida por la activación relacionada con el factor de la necrosis de tumor se expresó recombinantemente con un enlace N-terminal que contiene una cisteína para acoplarse a VLP. Construcción de los plasmidos de expresión La región de codificación C-terminal del gen RANKL se amplificó por PCR con oligos RANKL-UP y RANKL-DOWN. El RANKL-Up tuvo un sitio Apal interno y RANKL-DOWN tuvo un sitio Soy interno . El producto PCR se digirió con el Apal y el Soy y se ligó dentro del pGEX-6pl (Amersham Pharmacia) . El plásmido resultante se denominó pGEX-RANKL. Todas las etapas se realizaron mediante protocolos de biología molecular estándar y las secuencia se verificó. El plásmido pGEX-RANKL codifica a la proteína de fusión de un glutatión S-transferasa-Prescision del enlace RANKL del aminoácido que contiene cisteína en el sitio de desdoblamiento (GST-PS-C-RANKL) . El enlazador del aminoácido que contiene cisteína tuvo la secuencia GCGGG. El constructo contiene también una etiqueta de histidina entre la cisteína que contiene el enlace del aminoácido y la secuencia RANKL. Oligos : RANKL-UP: 5 ' CTGCCAGGGGCCCGGGTGCGGCGGTGGCCATCATCACCACCATCACCAGCGCTT CTCAGGAG-3 ' (SEC ID NO : 86) RANKL-DOWN: 5 ' -CCGCTCGAGTTAGTCTATGTCCTGAACTTTGAAAG-3 ' (SEC ID NO: 87) Secuencia de la proteína de GST-PS-C-RANKL y la secuencia de cADN de GST-PS-C-RANKL Expresión y purificación de C-RANKL Las células E.coli BL21 (DE3) competentes se transformaron con el plásmido pGEX-RANKL. Las colonias sencillas de las placas de agar que contienen cloramfenicol y canamicina se expandieron en el cultivo líquido (medio LB, 30 µ9/p?1 de canamicina, 50 9/??1 de cloranfenicol) y se incubaron a 30°C con 220 r.p.m. agitándose durante toda la noche. 1 L de LB (con 30 µ9/p?1 de canamicina) se inoculó después 1.100 v/v con el cultivo durante toda la noche y se hicieron crecer a OD600=1 a 24 °C. la expresión se indujo con 0.4 mM de IPTG. Las células se cosecharon después de 16 horas y se centrifugaron a 5000 r.p.m. El peletizado celular se suspendió en una solución amortiguadora de lisis (50 mM Tri-HCl, pH=8; 25% de sacarosa; lmM de EDTA, 1% de NaN3, DTT 10 mM, MgCl2 5 mM, 1 mg/ml de lisozima, 0.4 u/ml de ADnasa) durante 30 minutos. Después, 2.5 volúmenes de la solución amortiguadora A (50 mM Tris-HCl, pH=8.0, 1% de Tritón X100, 100 mM de NaCl, 0.1% de NaN3, 10 mM de DTT, 1 mM de PMSF) se añadieron y se incubaron a 37°C durante 15 minutos. Las células se sonicaron y se peletizaron a 900 r.p.m. durante 15 minutos . El sobrenadante se usó inmediatamente para una cromatografía de afinidad GST. Una columna de GST-Trap FF de 5 mi (Amersham' Pharmacia) se equilibró 'en PBS, PH 7.3 (140 mM NaCl, 2.7 mM C1 , 10 mM de Na2HP04, 1.8 K¾P04) . El sobrenadante se cargó sobre una columna FF de 5 mi GST-Trap y posteriormente la columna se enjuago con 5 volúmenes de columna de PBS. La proteína GST- PS-C-RANKL se eluyó con 50 mM Tris-HCl, pH=8.0 que contiene GSH 10 niM. La proteína purificada GST-PS-C-RAMKL se digirió usando la proteasa PreScission (Amersham Pharmacia) . La digestión se realizó a 37 °C durante 1 hora usando una relación molar de 500/1 de GST-PS-C-RANKL de PreScission. Adicionalmente , la reacción de la digestión de proteasa se intercambia con una solución amortiguadora usando una ' columna desaladora HiPrep 26/10 (Amersham Pharmacia) , las fracciones que contenían las proteínas se reunieron y se usaron inmediatamente para otra etapa de la cromatografía de afinidad GST usando las mismas condiciones reportadas antes. La purificación de C-RANKL se analizó sobre gel SDS-PAGE. El gel se tiñó con azul brillante de coomassie. El C-RANKL desdoblado se presenta durante todo el flujo (fracción no enlazada) mientras el GST-PS-C-RANKL no desdoblado, el GST-PS desdoblado y el -PreScission permanecen enlazados a la columna. La proteína C-RANKL del tamaño esperado de 22 kDa se obtienen con alta pureza. Las muestras cargadas en gel fueron las siguientes: Pista 1: Marcador de peso molecular bajo. Pista 2 y 3 : el sobrenadante de los lisados celulares de las células BL21/DE3 se transformaron con el vector vacío pGEXSpl y pGEX-RANKL respectivamente, después de dieciséis horas de inducción con IPTG 0.4 mM. Pista 4: la proteína GST-PS -C-RANKL después de la columna GST-Trap FF . Pista 5: la fracción no enlazada de la columna GST-Trap FF. Pista 6: la protelna GST-PS-C-RANKL purificada después del desdoblamiento con la proteasa PreScission. Pista 7 : la fracción no enlazada de la columna GST-Trap FF cargada con la digestión GST-RANKL que contiene el C-RANKL purificada. Pista 8: la fracción de enlace de la columna GST-Trap FF cargada con la digestión GST-PS-C-RANKL y se eluyó con GSH. B. Acoplamiento de C-RANKL para la AP205 VLP Una solución de 120 µ ??205 VLP en 20 mM Heps, 150 mM de NaCl pH 7.2 se hace reaccionar durante 30 minutos con un exceso molar de 25 veces de SMPH (Pierce) , se diluye a partir de una solución de reserva en DMSO a 25 °C en un agitador con movimiento. La solución de la reacción se dializa posteriormente dos veces durante 2 horas contra 1 L de 20 mM Hepes, 150 mM de NaCl, pH 7.2 a 4°C. la mezcla de reacción AP205 VLP dializada se hace reaccionar entonces con la solución C-RANKL (concentraciones finales: 60 µ? AP205 VLP, 60 µ? C-RANKL) durante cuatro horas a 25 °C en un agitador con movimiento. Los productos de acoplamiento se analizaron por SDS-PAGE e Inmunotransferencia bajo condiciones de reducción.

EJEMPLO 9 Clonación, expresión y purificación de IL-5 con un enlace de aminoácidos N- erminal que contiene un residuo de cisteína. Acoplamiento para VLP y elicitacion de una respuesta inmune en ratones . A. Clonación de His-C-Il-5 de ratón y expresión como anticuerpos de inclusión en E. col! El IL-5 se amplificó a partir de un clon ATTCC (pmIL5-4G, ATCC número: 37562) por PCR usando los siguientes cebadores: Spelinker3 -Fl SEC ID NO: 90) y Il5StopXho-R (SEC ID NO: 91) . El producto de este pCR se usó como plantilla para un segundo PCR con los cebadores SpeNlinke 3 -F2 (SEC ID NO: 92) y Il5StopXho-R. El inserto se digirió con Spel y Notl . Este inserto se ligó dentro de un derivado del vector pET (vector pMODEC3-8) , se digirió previamente con Nhe I y líot I, y se transformó dentro de la células TG1 de E.coli. El constructo generado mediante clonación IL5 dentro de pM0DEC3-8 comprende a partir de este N-termino una etiqueta hexa-histidina (para facilitar la purificación) , un sitio de desdoblamiento enterocinasa, un enlace de aminoácidos derivado gamma 3 (flanqueado N-terminalmente por los aminoácidos ALV y C-terminalmente por AS) que contienen un residuo de cisteina y el ADN que codifica la forma madura de la proteína IL-5. La fidelidad del procedimiento de clonación se confirmó por la secuenciación de ADN. La proteína liberada mediante el desdobl miento con enterocinasa se llama "C-IL-5-E de ratón" . El constructo que contiene IL-5 descrito anteriormente se denominó pM0DC6-TL5. (referido también como p 0DC6-JL5) y se transformó dentro de BL21-DE3 de la cepa E.coli. La proteína recombinante expresada en E.coli se denominó His-C-IL5. Las células BL21-DE3 clónales que hospedan pMODC6-IL5 se hicieron crecer durante toda la noche en 5 mi de LB que contenía 1 mg/1 de ampicilina. Una alícuota de 2.0 mi de este cultivo se diluyó dentro de 100 mi de un caldo terrífico (TB) que contenía 1 mg/1 de ampicilina. El cultivo se hizo crecer a una densidad óptica, OD6oonm, de 0.7 a 1.0 y la expresión se indujo durante 4 horas añadiendo 0.1 mi de una solución de reserva 1.0 M de Isopropil ß-D-Tiogalactopiranosida (IPTG) . Las muestras se tomaron cada 2 horas. El His-C-IL5 recombinante se expresó en una forma insoluble y se localizó en fracciones del cuerpo de inclusión de las células inducidas. La expresión de His-C-IL5 se confirmó de la siguiente manera. Una muestra de 10 mi del cultivo se tomó 4 horas después de la inducción y se centrifugó durante 10 minutos a 4000 x g. El peletizado se suspendió en 0.5 mi de una solución amortiguadora de lisis de 50 mM Tris-HCl, 2mM EDTA, 0.1% Tritón X-100 (pH 8.0). Para la suspensión se añadió 20 µ? de lisozima (40 mg/ml) y después de 30 minutos a 4°C se sónico durante 2 minutos. Una alícuota de 1.0 mi de benzonasa y 100 µ? de una alícuota de 50 mM de MgCl2 se añadieron y se incubaron durante 30 minutos a la temperatura ambiente. Después de la centrifugación durante 15 minutos a 13000 x g, el sobrenadante se descartó y el peletizado se calentó durante 5 minutos a 98 °C en 100 µ? de una solución amortiguadora cargada con SDS . Las alícuotas de 10 µ? se analizaron después por SDS-PAGE bajo condiciones de reducción. El análisis de SDS-PAGE demuestra que una banda de proteína de 17 kDa corresponde a la masa de IL-5. Como control, las células BL21-DE2 que contienen pM0DC6-IL5 se hicieron crecer en ausencia de IPTG y los extractos se prepararon a partir de la fracción celular insoluble, como se describe anteriormente. B. Purificación y repliegue de His-C-IL5 de ratón. Una expresión a gran escala de IL-5 a partir del clon pMODC6-IL5 en células BLD21-DE3 se realizó para obtener cantidades suficientes de IL-5 puro para la producción de vacunas. Los cultivos se hicieron crecer durante toda la noche y se diluyeron ya sea en volúmenes de 100 mi o 1 L del medio TB que contiene 1.0 mg/L de ampicilina. Un total de 3 litros del cultivo se preparó de esta manera y se hizo crecer a 37°C hasta ODSOonm/ reaccionó a 0.7 al tiempo que se añadió IPTG para dar una concentración final de 1.0 mM. Después de 4 horas de incubación, las células se cosecharon mediante la centrifugación durante 30 minutos a 10 000 x g. Después de cosechar, el peletizado se resuspendió en PBS (5.0 ml/g peso húmedo) y se centrifugó durante 15 minutos a 10 000 x g. El peletizado lavado se almacenó a -20 °C hasta su uso. El peletizado bacteriano se suspendió en PBS (2.0 ml/g peso húmedo) usando un homogenizador Dounce. La lisozima (0.8 mg/ml) se añadió a la suspensión y se incubó durante 30 minutos a la temperatura ambiente. La suspensión se sónico durante 1 minuto, 3 veces en hielo, después con benzonasa y MgCl2 (concentración final 10 mM) se añadieron y se incubaron durante 30 minuto a la temperatura ambiente. Se añadió Tritón X-100 a una concentración final de 1% (p/v) , la mezcla se agitó ligeramente a la temperatura ambiente durante 30 minutos. La solución se centrifugó durante 20 minutos a 20 000 xg (tubos SS34) y el sobrenadante se descartó. El peletizado que alberga los anticuerpos de inclusión se suspendió (5.0 ml/g peso húmedo) en una solución amortiguadora de lavado (PBS que contiene Urea 2M y 1% (p/v) Tritón X-100) usando un homogeneizador Dounce y se agitó durante 5 minutos. La solución se centrifugó durante 20 minutos a 20 000 x g y el sobrenadante se descartó. El peletizado se lavó y se centrifugó antes 2 veces más. Un lavado final de los cuerpos de inclusión se realizó con una solución amortiguadora de lavado en ausencia de Tritón X-100. El His-C-IL-5 presente en los cuerpos de inclusión del peletizado se solubilizó en (peso húmedo de la célula 5.0 ml/g) una solución amortiguadora (100 mM de NaH2P04, 10 mM Tris-HCl, 6.0 M de clorhidrato de guanidina, pH 8.0) y se agitó ligeramente durante 1 hora a 25°C. La suspensión se centrifugó durante 20 minutos a 20 OOO g y el sobrenadante se mezcló con la resina Ni-NTA (QIAgen, se equilibró con una solución amortiguadora de solubilización) . Después de 3 horas de agitación moderada a 4°C la solución espesa se virtió dentro de una columna de vidrio (CIO/10) y la resina se lavó con 100 mi de Na¾P04 100 mM, 10 mM Tris, 6.0 M de clorhidrato de guanidina (pH 6.3) . Una etapa de lavado adicional se realizó con 15 mi de 100 mM de naH2P04, 10 mM Tris, 6.0 M de clorhidrato de guanidina (pH 5.9). El His-C-IL5 de ratón se eluyó a partir de la resina aplicando 20 mi de NaH2P0 100 mM, Tris 10 mM, clorhidrato de guanidina 6.0 M (pH 4.5). La purificación se analizó por SDS-PAGE. Las fracciones de la etapa de elución que contienen His-C-Il se reunieron y se dializaron contra una solución amortiguadora que comprende Urea 8.0 M Na2Po4 100 mM, Tris-HCl 10 mM ( pH 8.0) a 4°C usando una membrana de corte de 10 kDa. Siguiendo l diálisis, la concentración de la proteína se determinó espectrofotométricalmente usando la siguiente fórmula; Proteína (mg/ml) = (1.55 x A28onm) - ( 0.76 x A2Sonm) · la concentración de la proteína se diluyó con una solución amortiguadora de 0.2 mg/ml. La solución se diluyó entonces con una membrana de 3.5 kDa durante 24 horas a 4°C contra la solución amortiguadora 1 vez que comprende urea 2.0 M, Na¾P04 50 mM, Glutatión reducida 5 mM, glutatión oxidado 0.5 mM, Arginina 0.5 M, 10% (v/v) de glicerol (pH 8.5) y durante 24 horas adicionales contra otra solución amortiguadora 2 veces que comprende Na¾P04 50 mM, Glutatión reducido 5 mM, glutatión oxidado 0.5 mM, Arginina 0.5 M, 10% (v/v) de-glicerol (pH 8.5) . Al final, la proteína se dializó durante 24 horas a 4°C contra PBS pH 8.0 después se centrifugó a 10 000 x g durante 30 minutos. El contenido de la proteína del sobrenadante se estimó mediante un ensayo Bradford. Para purificar adicionalmente His-C-IL5, se realizó un intercambio de anión con resina Hitrap Q (Amersham Pharmacia, Uppsala Suecia) . El His-C-IL5 se concentró a 1 mg/ml usando filtros de centrifugación (Ultrafree-15 Millipore, cortadura de 10 kDa) y se dializaron durante 14 horas contra una solución amortiguadora de fosfato 50 mM pH 8.4. La solución se cargó sobre una columna Hitrap Q y se lavó con una solución amortiguadora de fosfato 50 mM pH 8.4. El His-C-Il-5 se eluyó a partir de la columna aplicando un gradiente de NaCl de 0-1 M. El His-C-IL5 se eluyeron a partir de la columna de NaCl 100 mM. El análisis de la purificación se realizó por SDS-PAGE y las concentraciones se midieron mediante un ensayo Bradford. La estructura cuaternaria de la proteína se evaluó por SDS-PAGE realizada bajo condiciones no reducidas, las cuales revelaron que el His-C-IL5 está presente como un dimero en la preparación. C. producción de la vacuna: Acoplamiento His-C-I15 para ??205 VLP Una variedad de condiciones pueden probarse para optimizar la eficiencia de la reacción de acoplamiento. Estos incluyen la adición del agente de reducción (TECP) para His-C-IL5 y variar las relaciones molares de la subunidad del monómero AP205 VLP y His-C-Il5 en la reacción de acoplamiento. La vacuna AP205-His-C-IL-5 se produjo como sigue. El His-C-Il-5 purificado (40 µ ) se redujo durante 1 hora con una cantidad equimolar de TCEP en PBS pH 8.0. El IL-5 (20 µ?) reducido se incuba durante 4 horas a 22 °C con 10 µ? de ?)ß derivado con SMPH en un volumen total de 700 µ? . La reacción se dializa 12 horas contra PBS pH 8.0 usando una membrana de diálisis de cortadura de 300 kDa. La reacción de acoplamiento se analiza por SDS-PAGE e Inmunotransferencia con anticuerpos anti-His y anti-AP205 (antisuero de conejo policlonal) . La concentración de la proteína se mide por Bradford. La eficiencia de acoplamiento [es decir, mol de <2ß- IL5/mol del monómero ?)ß (total)] se mide por un análisis densitométrico de las bandas correspondientes en el SDS-PAGE teñidas con azul de coomassie .

D. Ensayo de la actividad IL-5 La capacidad de la linea BCLl del linfoma celular B para proliferar en la respuesta del IL-5 de murino se usó para verificar la bioactividad del His-C-IL-5 recombinante re-folded (Hrriman G.R. (1991) Current Protocols in Immunnology 6.5.1-6.5.5 John Wiley and Sons Inc.) La actividad prol iferat iva de His-C-IL5 acoplado coval entemente a AP205 VLP puede también evaluarse. Diversas formas de 11-5 recombinante se incubaron en placas de 96 pozos de fondo plano con células BCLl 2 x 104 por pozo y se incubaron durante 24 horas a 37°C, C02 al 5%. 1 µ?? de 3H-Timidina (Hartmann Analytic, Suiza) se añadió a cada pozo y las placas se incubaron durante otras 6 horas a 37°C de C02 al 5%. Las células se cosecharon, se lavaron y la incorporación de timidina se determinó contando la emisión ß con un contador de escin ilación líquida. El ensayo demostró que el HIS-C-IL5 es activo. E. Protocolo de inmunización Para generar los anticuerpos autoreact ivos- para el IL-5 de ratón, cuatro ratones BalbC se inyectaron subcutáneamente el día 0 y el día 14 con 25 µg de una vacuna AP205 -His- C - IL5 en 200 µ? de PBS . Para servir como un control negativo, cinco ratones se inmunizaron el día 0 y 14 con una mezcla simple de 6.4 µg de AP205 VLP y 16 µg de IL5 , es decir, no acoplado covalentemente (AP205 + His-C-Il-5) en PBS. Los ratones se sangraron antes de la inmunización y el día 21 del protocolo de inmunización. Los sueros se analizaron por ELISA. F. Análisis de los sueros ELISA. Las placas de ELISA Maxisorp (Nunc) se revistieron con 50 µ? de His-C-Il-5 purificados (3 µg/ml) durante 14 horas a 4°C. Las placas se lavaron 3 veces con PBS y se bloquearon con BSA al 2% en PBS durante 2 horas a 37°C se lavaron tres veces con PBS. Las diluciones de cinco Fol . de sueros se añadieron en BSA al 2%, 0.1% de FCS en PBS y se incubaron a la temperatura ambiente durante 1 hora. Las placas se lavaron posteriormente 3 veces con PBS y se incubaron con IgG anti ratón conjugado con HRP (dilución 1:1000) a la temperatura ambiente durante 1 hora. Las placas se lavaron nuevamente 3 veces con PBS y se añadió una solución desarrollada con 10 µ?/???? (Na2P04 0.066 M, ácido cítrico 0.035 M, H202 al 0.032%, 0.4% de diclorhidrato de 1,2-fenilendiamina) . Después de 5 minutos de reacción a la temperatura ambiente la ELISA se detiene con 50 µ? por pozo de ¾So4 al 5%. La absorbancia se mide con 450 nm en un espectrofotómetro Spectramax (Dispositivos moleculares) EJEMPLO 10: Clonación, expresión y clonación de la proteína de prión de ratón A. Introducción del enlace de aminoácidos que contienen un residuo de cisteína, expresión y purificación de una forma trunca de la proteína prión de ratón. Una forma trunca (aa 121-230) de la proteína prión de ratón (llamada mPrPt) se expresó recombinantemente con un enlace de aminoácidos GGGGCG (SEC ID NO: 55) fusionadas en su término C para acoplarse al AP205 VLP. La proteína se fusionó al Terminación N de un fragmento Fe de humano para la purificación. Un sitio de desdoblamiento de la enterocinasa (EK) se introdujo detrás del sitio de desdoblamiento EK para desdoblar la parte Fe de la proteína de fusión después de la purificación . Construcción de mPrPt-EK-Fc* . El PrPt de ratón se amplificó por PCR con el cebador 5'PrP-BamHI y 3 ' PrP- -hel usando el plásmido pBPCMV PrP-Fc como una plantilla. El pBPCMVPrP-Fc contuvo la secuencia del tipo salvaje de la proteína prión de ratón. El 5 ' PrP-BairiH.1 tuvo un sitio BawHI interno y contuvo un ATG y 3'PrP-.MheI tuvo un sitio Nhel interno. Para la reacción de PCR, 0.5 µ9 de cada cebador y 200 ng de la plantilla de ADN se usó en la mezcla de reacción de 50 µ? (1 unidad de polimerasa de platino PFX, 0.3 mM de dNTP y MgSo4 2 mM) . Los ciclos de la temperatura fueron como sigue : 94°C durante 2 minutos, seguido por 5 ciclos de 94°C (15 segundos) , 50°C (30 segundos) , 68°C (45 segundos) , seguido por 20 ciclos de 94°C (15 segundos) , 64°C (30 segundos) , 68°C (45 segundos) y seguido por 68°C durante 10 minutos. El producto de PC se digirió con BairíEI y Nhel y se insertó dentro de pCEP-SP-EK-Fc* que contiene la secuencia de enlace GGGGCG (SEC ID NO: 55) en el extremo 5' de la secuencia de desdoblamiento EK. El plásmido resultante se nombró pCEP-SP-mPrPt-E -Fc* . Todas las otras etapas se realizaron mediante protocolos de biología molecular estándar. Oligos : Cebador 5 ' P P-BamHI 5'-CGG GAT CCC ACC ATG GTG GGG GGC CTT GG-3' (SEC ID NO: 88) Cebador 3 ' rP-Nhel 5'-CTA GCT AGC CTG GAT CTT CTC CCG-3' (SEC ID NO: 89) expresión y purificación de mPrPt-EK-Fc* El plásmido pCEP-SP-mPrPt-EK-Fc* se transfirió dentro de 293 células EBNA (Invitrogen) y se purificaron en una columna de proteína de A-sefarosa como se describe en el EJEMPLO 4. El mPrPt después del desdoblamiento tiene la secuencia identificada en la SEC ID NO: 324 con el enlace GGGGCG en su Término C. La proteína de guión purificada mPrPt-EK-Fc* se desdobló con una enterocinasa y se analizó en un gel de SDS-PAGE al 16% bajo condiciones de reducción antes y después del desdoblamiento de la enterocinasa. El gel se tiñó con azul brillante de Coomassie. La proteína de fusión mPrPt-EK-Fc* podría detectarse como una banda de 50 kDa. La proteína mPrPt que contiene el enlace GGGGCG (SEC ID NO: 55) fusionado en su término C podría detectarse como una banda amplia entre 18 y 25 kDa. La identidad de mPrPt se confirmó mediante inmunotransferencia (no se muestran datos) . Así, el mPrPt con un enlace amino terminal C que contiene un residuo de cisteína podría expresarse y purificarse para usarse para copiar AP205 VLP . Las muestras cargadas en el gel son las siguientes. Pista 1. marcador de peso molecular. Pista 2: mPrPt-EK-Fc* antes del desdoblamiento. Pista 3: mPrPt después del desdoblamiento . B. Acoplamiento de mPrPt al AP205 VLP Una solución de 120 µ? AP205 VLP en Hepes 20 mM, NaCl 150 mM de NaCl pH 7.2 se hace reaccionar durante 30 minutos con un exceso molecular de 25 veces SMPH (Pierce) , se diluye a partir de una solución de reserva en DMSO, a 25°C en un agitador con movimiento. La solución de la reacción se dializa posteriormente dos veces durante 2 horas contra 1 Litro de 20 mM de Hepes, 150 m de NaCl, pH 7.2 a 4°C. La mezcla de la reacción ??205 VLP dializada se hace reaccionar con la solución mPrPt (concentraciones finales: 60 µ? de AP205 VLP, 60 µ? de mPrPt) durante cuatro horas a 25°C en un agitador con movimiento. Los productos de acoplamiento se analizan por SDS-PAGE e Inmunotransferencia bajo condiciones de reducción.

EJEMPLO 11. Acoplamiento de rMIF para el AP205 VLP El RMIF-C1 (SEC ID NO: 114), expresado y purificado descrito en el ejemplo 7 en 20 mM Hepes, 150 mM de NaCl pH 7.2, 0.18 mM se incubó con un equivalente molar TCEP durante 1 hora a la temperatura ambiente antes de usarse en la reacción de acoplamiento. Un mi de una solución AP205 VLP, 2.5 mg/ml se hizo reaccionar con un exceso molar de 2.3 de SMPH durante 1 hora a la temperatura ambiente. El AP205 VLP derivado se dializó dos veces 2 horas contra 2 1 de Hepes 20 mM, NaCl de 150 mM, pH 7.2 820 µ? del AP205 VLP derivado dializado (0.18 mM) se hicieron reaccionar posteriormente con 820 µ? de una solución rMIF-Cl 0.18 mM tratada previamente con TCEp como se describe anteriormente durante 3 horas a la temperatura ambiente . No fue observable un precipitado al final de la reacción de acoplamiento y las muestras se analizaron por SDS-PAGE bajo condiciones de reducción, y el gel teñido con azul brillante de coomassie. El resultado de la reacción de acoplamiento se muestra en la figura 6. El Mif tuvo un peso molecular mientras la subunidad AP205 VLP tiene un peso molecular de 14 kDa mientras rMIF-Cl tiene un peso molecular de 13. El producto de acoplamiento migra como se espera con un peso molecular aparente de 27, como se describe en la figura 6. Se muestra en la figura 6 es el resultado de la reacción de acoplamiento de rMIF-Cl para AP205 VLP. Pista 1: Marcador molecular. Pista 2: AP205 VLP. Pista 3: AP205 VLP derivado. Pista 4: AP205 VLP dializado, derivado. Pista 5: AP205 VLP dializado, derivado. Pista 6: reacción de acoplamiento de rMIF-Cl para AP205 VLP. El producto de acoplamiento se indica por una flecha en la figura. Los pesos moleculares de las proteínas del marcador se indican en el borde izquierdo del gel .

EJEMPLO 12 : Inmunización de ratas y ratones con rMIF acoplado al AP205 VLP A. Inmunización de ratones como AP205 VLP acoplados al rMIF-Cl El AP205 VLP acoplado al rMIF-Cl (a partir del ejemplo 11) se inyectó subcutáneamente en ratones hembras Balb/c (3 ratones) en el día 0 a 14. Cada ratón se inmunizó con 10 µg de una vacuna diluida en PBS a 200 µ? . Los ratones se sangraron retroorbitalmente en el día 21 y el título de los anticuerpos específicos para rMIF-Cl se midieron en una ELISA específica para rMIF-Cl como sigue. Las placas de ELISA se revistieron con rMIF-Cl a una concentración de 5 µg/ml. Las placas se bloquearon y se incubaron después con sueros de ratón diluidos en forma seriada. Los anticuerpos de enlace se detectaron con un anticuerpo iGG anti-ratón etiquetado enzimáticamente . Como control, se probó también un suero preinmune del mismo ratón.

La inmunización con rMIF-Cl acoplado al AP205 VLP condujo a una respuesta inmune específica fuerte contra rMIF-Cl (figura 7) , por medio de la cual el título promedio de los tres ratones contra rMIF-Cl se definieron como la dilución del suero proporcionando la media máxima OD de 1:31 000. Por lo tanto, el rMIF-Cl se desplegó propiamente en el AP205 VLP y de manera accesible para el sistema inmune para la generación de una respuesta inmune fuerte . Lo que se muestra en la figura 7 es el análisis por ELISA de la respuesta IGG especifica para rMIF-Cl en los sueros inmunizados con rMIF-Cl acoplados al AP205 VLP. El análisis de los sueros del día 21 de los tres ratones (MI, M2 y M#) se efectuó por duplicado. La dilución de tres veces de los sueros se aplicaron al pozo. Las preparaciones "pre imm" para el suero preinmune de un ratón se inmunizaron posteriormente con rMIF-Cl acoplado al AP205 VLP. B. Inmunización de ratas con AP205 VLP acoplados al rMIF-Cl El AP205 VLP acoplado al rMIF-Cl (a partir del ejemplo 12) se inyecta s.c. en ratas (cada tres ratas) el día 0 y 28 en ausencia de auxiliares. Cada rata se inmuniza con 50 µg de vacunas diluidas en PBS para 200 µ? . Las ratas se sangraron el día 24 y el título de los anticuerpos específicos para rMIF-Cl se midieron en una ELISA específica para rMIF-Cl como se describe arriba usando, sin embargo, un anticuerpo secundario IgG anti-Rat etiquetado enzimáticamente.

EJEMPLO 13 : Acoplamiento del peptido Angio I para AP205 VLP e Inmunización de ratones A. Acoplamiento del péptido Angio I para AP205 VLP. El péptido Angio I que tiene la secuencia de Angiotensina II (DRVYIHPF) (SEC ID NO: 13) fusionado en su terminación N a la secuencia de enlace CGG que contienen un residuo de cisteína para acoplar el VLP activado, se sintetizó químicamente. El AP205 VLP expresado y purificado como se describe en el ejemplo 2, se resolubilizó en 20 mM Hepes, 150 mM NaCl , solución amortiguadora pH 7.4 (solución amortiguadora HBS) . El AP205 VLP resolubilizado se hizo reaccionar después a una concentración de 2 mg/ml (determinada en un ensayo Bradford) , con SMPH 1.43 mM (Pierce) durante 30. minutos a la temperatura ambiente (RT9. la mezcla de la reacción se dializó entonces dos veces contra la solución amortiguadora HBS durante 2 horas a 4°C, y se hizo reaccionar con 1.144 mM del péptido Angio I (secuencia: CGGDRVYIHPF (SEC ID NO : 12) , amina libre y ácidos grasos) , diluidos en la mezcla de reacción a partir de una reserva 50mM en DMSO. La reacción de acoplamiento se dejó proceder durante 2 horas a 15°C, y la mezcla de reacción se dializó 2 X durante 2 horas contra HBS con un volumen de 100 veces, y se congeló instantáneamente en nitrógeno liquido en alícuotas para almacenar a -80°C hasta usarse. Una alícuota se desheló y el acoplamiento del antígeno para una subunidad de AP205 valorada por SDS-PAGE y la concentración de la proteína se midió por medio de un ensayo Bradford. La eficiencia de acoplamiento del péptido par AP205 VLP definido por la suma de las intensidades de las bandas que corresponden a l, 2 ó 3 péptidos acoplados por subunidad del monómero, dividido por la suma de las intensidades de las subunidades del monómero AP205 acopladas y no acopladas fue de 88%. La densidad del epítopo se midió de manera similar como una eficiencia de acoplamiento, con la modificación en la que la intensidad de las bandas de acoplamiento se multiplican por el número de subunidad por péptido acoplado en la banda respectiva en el numerador. La densidad del epítopo fue de 1.6 péptidos Angio I por subunidad de AP205 VLP. B. Inmunización de ratones con AP205 VLP acoplados al péptido Angio I El ??205 VLP acoplado al péptido Angio I producido como se describe en la parte A se inyectó s.c. en tres ratones el día 0 y 14 en ausencia de auxiliares . Cada ratón se inmunizó con 25 µg de una vacuna diluida en PBS a 200 µ? . Los ratones se sangraron retro-orbitalmente en día 21 y el título de los anticuerpos específicos para el péptido Angio I se midió por eLISA. El péptido Angio I se acopló a la RNAsa de bovino usando el químico sulfa-SPDP reticulado. Las placas de ELISA se revistieron con la ARNasa acoplada al ANgio I en una concentración de 10 µg/ml. Las placas se bloquearon y se incubaron después con sueros de ratón diluidos en serie. Los anticuerpos de enlace se detectaron con anticuerpos IgG anti-ratón etiquetados enzimá icamente . Como control, se probaron también los sueros preinmunes del mismo ratón. Los resultados se muestran en la figura 8. La figura 8 muestra un análisis de ELISA de los anticuerpos IgG específicos para el péptido Angio I en los sueros de los tres ratones (1-3) inmunizados el día 0 y 14 contra el péptido Angio I acoplado al AP205 VLP. Los títulos IgG totales se determinaron en los sueros del día 21. Los anticuerpos específicos para el Angio I no podrían detectarse en el suero preinmune analizado. Se obtuvo un título específico muy alto contra el Angio 1 de 1:69 000 en promedio (dada como la dilución que proporciona la media máxima OD a 450 nm) , demostrando que la autotolerancia contra el Angio I (un autopéptido en el ratón) se había roto. Los datos demuestran que las vacunas con una cantidad muy alta de péptidos se obtienen luego del acoplamiento de los antígenos para AP205 VL . Los datos demuestran también que títulos muy elevados contra auto-antígenos se obtienen luego del acoplamiento de esto auto-antígenos para AP205 VLP y una inmunización posterior con la vacuna resultante en ausencia de un auxiliar. Habiendo descrito completamente algunos detalles en la presente invención por medio de ilustraciones y ejemplos con el propósito de un entendimien o más claro, será obvio por un experto en el arte, que los mismos pueden llevarse a cabo modificando o cambiando la invención dentro de un rango igual de condiciones, formulaciones y parámetros sin afectar el alcance de la invención o cualquier modalidad específica de la misma, y que tales modificaciones o cambios pretenden incluirse dentro del alcance de las reivindicaciones anexadas . Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente mencionadas en esta especificación, indican el nivel de habilidad de los expertos en el arte a la cual pertenece esta invención, las cuales se incorporan aquí como referencia para el mismo alcance, así como para cada publicación individual, patente o solicitud de patente las cuales se indicaron de forma específica e individual para ser incorporadas por referencia. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes ei indicaeiones 1. Una partícula de tipo virus caracterizada porque comprende al menos una proteína seleccionada del grupo que consiste de: (a) una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO: 1; (b) una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO: 3; Y (c) una muteína de la proteína de (a) o (b) : y en donde preferiblemente la proteína es recombinante . 2. La partícula de tipo virus de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la muteína tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO: l o como se establece en SEQ ID NO: 3, en donde al menos un residuo de aminoácidos, preferiblemente tres residuos de aminoácidos, más preferiblemente dos residuos de aminoácidos y aún más preferiblemente un residuo de aminoácido se agrega, elimina o substituye, en donde preferiblemente al menos una substitución es una substitución conservadora y/o en donde preferiblemente la muteína tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO: 1, o como se establece en SEQ ID NO: 3, en donde al menos un residuo de cisterna, preferiblemente dos residuos de cisterna, se eliminan o susbtituyen, en donde preferiblemente al menos una substitución es una substitución conservadora y/o en donde preferiblemente la muteína tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO: 1 o como se establece en SBQ ID NO: 3, en donde al menos un residuo de lisina preferiblemente tres residuos de lisina, más preferiblemente dos residuos de lisina, y aun más preferiblemente una lisina, se agrega elimina o substituye, en donde preferiblemente al menos una substitución es una substitución conservadora. 3. Una muteina caracterizada porgue tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO: 3 . Una muteína de la proteína recombinante de SEQ ID NO: 1, caracterizada porque preferiblemente al menos un residuo de aminoácidos, preferiblemente tres de residuos de aminoácidos, más preferiblemente dos residuos de aminoácidos, y aun más preferiblemente un residuo de aminoácidos, se agrega, elimina o substituye, en donde preferiblemente al menos una substitución es una substitución conservadora, y/o en donde preferiblemente al menos un residuo de cisterna, preferiblemente un residuo de cisterna, se elimina o substituye, en donde preferiblemente al menos una substitución es una substitución conservadora, y/o en donde preferiblemente al menos un residuo de lisina, preferiblemente tres residuos de lisina, más preferiblemente dos residuos de lisina, y aun más preferiblemente una lisina, se agregan eliminan o substituyen, en donde preferiblemente al menos una substitución es una substitución conservadora. 5. Un vector para la producción de una partícula tipo virus AP205, caracterizado porgue comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos 80%, preferiblemente al menos 90%, más preferiblemente al menos 95%, y aun más preferiblemente 99% idéntica a aquella de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4. 6. Un vector para la producción de la proteína recombinante, con una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido fusionado a una proteína, caracterizado porque la proteína se selecciona del grupo que consiste de: (a) una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO: 1; (b) una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO (c) una muteína del polipéptido de (a) o (b) 7. Una composición caracterizada porque comprende: una partícula de núcleo seleccionada del grupo que consiste de (i) una partícula de virus AP205; y (ü) partículas tipo virus AP205; y (b) una molécula orgánica. en donde la molécula orgánica se enlaza a la partícula de núcleo, y en donde preferiblemente la molécula orgánica y la partícula de núcleo forman una configuración ordenada y repetitiva de la molécula orgánica sobre la superficie de la partícula de núcleo, y/o en donde preferiblemente la molécula orgánica se enlaza a la partícula del núcleo por medio de una tercera molécula, la tercera molécula liga la partícula del núcleo a la molécula orgánica. 8. La composición de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porgue la molécula orgánica se enlaza a la partícula de núcleo por al menos un enlace covalente, en donde preferiblemente el enlace covalente comprende un enlace de péptido, y/o en donde preferiblemente la molécula orgánica se enlaza a la partícula de núcleo por al menos un enlace covalente, en donde preferiblemente el enlace covalente comprende un enlace que no es de péptido. 9. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8, caracterizada porque la molécula orgánica comprende, o es preferiblemente, un hapteno, un antígeno o determinante antigénico, y en donde más preferiblemente la molécula orgánica es un antígeno o un determinante antigénico. 10. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7 ó 9, caracterizada porque la partícula tipo virus contiene al menos un primer sitio de colocación, y la molécula orgánica contiene al menos un segundo sitio de colocación, de manera que el segundo sitio de colocación puede tener asociación con el primer sitio de colocación para formar una configuración de antígeno ordenada y repetitiva, preferiblemente por medio de un enlace que no es de péptidos . 11. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, caracterizada porque el primer sitio de colocación comprende, preferiblemente es, un grupo amino y en donde preferiblemente el primer sitio de colocación comprende, es preferiblemente, un residuo de lisina y en donde el segundo sitio de colocación comprende, es preferiblemente, un grupo sulfhidrilo, y en donde preferiblemente el segundo sitio de colocación comprende, es preferiblemente, un residuo de cisteína y en donde preferiblemente el segundo sitio de colocación no se presenta naturalmente dentro de la molécula orgánica. 12. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7-11, caracterizada porque la composición comprende una ligadura de aminoácidos y en donde preferiblemente la ligadura de aminoácidos se enlaza al antigeno o al determinante antigénico, por medio de al menos un enlace covalente, preferiblemente por vía de al menos un enlace péptido, y en donde preferiblemente la ligadura de aminoácidos comprende un segundo sitio de colocación, y/o en donde preferiblemente la ligadura de aminoácidos se selecciona del grupo que consiste de: (a) CGG; (b) Ligador gamma 1 en la terminal N (c) Ligador gamma 3 en la terminal N (d) Regiones de articulación Ig (e) Ligadores de glicina en la terminal N (f) (G)kC(G)n con n=0-12 y k=0-5(SEQ ID NO: 93); (g) ligadores glicina-serina en la terminal N (h) (G)kC(G)m(S)i(GGGGS)n con n=0-3, k=0-5, m=0-10, 1=0- 2 (SEQ ID NO: 94) ; (i) GGC; (k) GGC-NH2 ; (1) Ligador gamma 1 en la terminal C (m) Ligador gamma 3 en la terminal C (n) Ligadores de glicina en la terminal C (o) (G)nC(G)k con n=0-12 y k=0-5 (SEQ ID NO: 95); (p) ligadores glicina-serina en la terminal C y (q) (G)m(S)i(GGGGS)n(G)0C(G)k con n=0-3, k=0-5, m=0-10, 1=0-2 y o=0-8 (SEQ ID NO: 96) . 13. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7-12, caracterizada porque la molécula orgánica se selecciona del grupo que consiste de: (a) una molécula orgánica adecuada para inducir una respuesta inmune contra células de cáncer (b) una molécula orgánica adecuada para inducir una respuesta inmune contra enfermedades infecciosas (c) una molécula orgánica adecuada para inducir una respuesta inmune contra alergernos (d) una molécula orgánica adecuada para inducir una respuesta mejorada contra auto-antígenos (e) una molécula orgánica adecuada para inducir una respuesta inmune en animales de granja o mascotas (f) una molécula orgánica adecuada para inducir una respuesta contra un fármaco, una hormona o un compuesto tóxico y (g) fragmentos, muteínas o dominios de las moléculas establecidas en (a) - (f) . 14. La composición de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 7-13, caracterizada porque la molécula orgánica es un antígeno o un determinante antigénico, o un fragmento o muteina del mismo que se selecciona del grupo que consiste de: (a) . un antígeno o determinante antigénico adecuado para inducir una respuesta inmune contra células de cáncer (b) . un antígeno o un determinante antigénico adecuado para inducir una respuesta inmune contra enfermedades infecciosas (c) . un antígeno o un determinante antigénico adecuado para inducir una respuesta inmune contra alérgenos (d) . un antígeno o un determinante antigénico adecuado para inducir una respuesta mejorada contra auto antígenos. (e) . un antígeno o determinante antigénico adecuado para inducir una respuesta inmune en animales de granja o mascotas . (f) . un antígeno. o determinante antigénico adecuado para inducir una respuesta un fármaco, una hormona, o un compuesto tóxico y (h) . fragmentos o dominios de las moléculas establecidas en (a) - (f) . 15. La composición de cualesquiera de las reivindicaciones 7 a 14, caracterizada porgue la molécula orgánica es un antígeno seleccionado del grupo que consiste de: (a) un polipéptido de VIH, (b) un polipéptido del . virus de Influenza, (c) un polipéptido del . virus de hepatitis C, (d) un polipéptido de Toxoplasma (e) un polipéptido de Plasmodium falciparum, (f) un polipéptido de Plasmodium vivax, (g) un polipéptido de Plasmodium ovale, (h) un polipéptido de Plasmodium malariae, (i) un polipéptido de células de cáncer de mama (j) un polipéptido de células de cáncer de riñon (k) un polipéptido de células de cáncer de próstata (1) un polipéptido de células de cáncer de piel (m) un polipéptido de células de cáncer de cerebro (n) un polipéptido de células de leucemia (o) un formador de perfiles recombinantes (p) un polipéptido de alergia a la picadura de abeja (q) un polipéptido de alergia a las nueces (r) un polipéptido de alergias a los alimentos (s) un polipéptido del asma o (t) un polipéptido de Clamidia (u) Her2 (v) GD2 , (w) EGF-R, ' (x) CEA, (y) CD52 (z) Melanoma humano gp 100, (aa) Melanoma humano mel nA/MART-1, (bb) Tirosinasa (ce) NA17-A nt, (dd) MAGE3 , (ee) P53, y (ff) HPV16E7; y (gg) Cualquier fragmento o muteína del antígeno de (a) hasta (z) y de (aa) a (ff) . 16. La composición de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 7-15, caracterizada porque el antígeno o determinante antigénico es un péptido, una proteina o un fragmento o muteína de una proteína o péptido, seleccionado del grupo que consiste de: a) una proteína de fosfolipasa A2 b) Una IgE humana c) Una linfotoxina d) Una proteína M2 de influenza y e) Un péptido Der p I. 17. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7-16, caracterizada porque la molécula orgánica es un antígeno o determinante antigénico, además el antlgeno o determinante antigénico es un autoantigeno o un anticuerpo anti-idiotípico o fragmentos del mismo y en donde preferiblemente el autoantígeno es una proteína, un péptido o algunos fragmentos o muteínas del mismo seleccionado del grupo que consiste de: a) una linfotoxina b) un receptor de linfotoxina c) RA KL; d) VEGF; e) VEGFR; f) Interleucina-5 ; g) Interleucina-8 ; h) Interleucina-17 ; h) Interleucinal3 ; i) angiotensina k) CCL21;

1) CXCL12 ; m) SDF-1; n) MCP-1; o) Endoglina; P) Resistina; q) GHRH; r) LHRH; s) TRH; t) MIF; ) Eotaxina; v) Bradicinina; w) BLC; x) -CSF; x) Factor de necrosis de tumor a (TNFa) ; y) péptido beta amiloide (?ß?.4

2) ; Y z) un IgE humano; y/o en donde preferiblemente el autoantígeno es una linfotoxina o un fragmento de la misma seleccionado del grupo que consiste de a) linfotoxina a(LTa); b) linfotoxina ß (?/Gß) y c) una mezcla o combinación de LTa y ?Gß . 18. La composición de conformidad con cualesquiera de las reividicaciones 7-17, caracterizada porque la. molécula orgánica es una molécula adecuada para inducir una respuesta inmune contra fármaco, hormona o toxina. 19. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7-18, caracterizada porque la molécula orgánica es una molécula adecuada para inducir una respuesta inmune contra un fármaco y en donde preferiblemente el fármaco se selecciona del grupo que consiste de: (a) codeina (b) fentanilo (c) heroína (d) morfina (e) anfetamina (f) cocaína (g) meti1endioximetanfetamina (h) metanfetamina (i) meti1fenidato (j) nicotina (k) LSD (1) mescalina (m) psilocibina y (n) tetrahidrocanabinol y/o en donde preferiblemente el fármaco es nicotina. 20. La composición de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 7-19, caracterizada porque la molécula orgánica es adecuada para inducir una respuesta inmune contra una hormona, y en donde preferiblemente la molécula orgánica es una hormona que se selecciona del grupo que comprende y consiste preferiblemente de: (a) progesterona; (b) estrógeno; (c) testosterona; (d) hormona estimuladora del folículo; (e) hormona estimuladora de la melanina; (f) adrenalina y (g) ñoradrenalina 21. La composición de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 7 a la 20, caracterizada porque la molécula orgánica es adecuada para inducir una respuesta inmune contra una toxina, y en donde preferiblemente la molécula orgánica es una toxina que se selecciona del grupo que consiste de: (a) Aflatoxina (b) Toxina de la ciguetera (c) Tetrodotoxina (d) Antibióticos y (e) Agentes anticáncer 22. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende : (a) la composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7-21 y (b) un portador farmacéuticamente aceptable. 23. Una composición de vacuna, caracterizada porque comprende una cantidad inmunológicamenté efectiva de la composición de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 7-21, y en donde preferiblemente la composición de vacuna comprende además un adyuvante. 24. Un proceso para la producción de una configuración de antígeno repetitiva, ordenada que no se presenta naturalmente caracterizada porque comprende: (a) suministrar un andamiaje molecular que comprende una partícula de núcleo seleccionada del grupo de (i) virus AP205 y (ii) partículas tipo virus AP205 y (b) suministrar una molécula orgánica adecuada para inducir una respuesta inmune, (c) proporcionar un medio de asociación de (a) y (b) , el medio contenido opcionalmente dentro de (a) y/o (b) , o como una molécula separada; y (d) combinar los elementos de (a) hasta (c) de manera tal que la molécula orgánica se asocia con el andamiaje para formar una configuración de antígeno ordenada y repetitiva 25. Una molécula de ácido nucleico caracterizada porque comprende una secuencia de nucleótidos como se establece en SEQ ID NO: 125. 26. Una célula hospedadora caracterizada porque contiene un ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 25, o un vector de conformidad con la reivindicación 5, y en donde preferiblemente la célula hospedadora es E. coli. 27. Un método para la producción de una partícula de tipo virus de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porgue comprende las etapas de (a) proporcionar un ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 25 o un vector de conformidad con la reivindicación 5 ; (b) introducir el ácido nucleico o el vector en la célula hospedadora; (c) expresar el ácido nucleico o la secuencia del vector en la célula hospedadora para obtener una proteína o una muteína que pueda formar una partícula tipo virus de conformidad con la reivindicación 1; y en donde preferiblemente la célula hospedadora es E. coli . 28. La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada porque es para su uso en un método de inmunización, preferiblemente en donde la composición comprende además un adyuvante. 29. El uso de una composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 23, para la preparación de una vacuna, en donde la vacuna se va a administrar a un sujeto; preferiblemente en donde la composición comprende además un adyuvante . 30. La composición de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 7-21, caracterizada porque se usa en un método para tratamiento o prevención de una enfermedad, trastorno o condición fisiológica en un individuo, el método comprende administrar la composición al individuo. 31. El uso de la composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7-21, para la preparación de una composición para tratamiento o prevención de una enfermedad, trastorno o condición fisiológica en un individuo, en donde la composición se va a administrar al individuo . 32. La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada por que se usa en un método para tratamiento o prevención de una enfermedad, trastorno o condición fisiológica en un individuo, el método comprende administrar la composición al individuo. 33. El uso de la composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 23, para la preparación de una vacuna para tratar o prevenir una enfermedad, trastorno o condición fisiológica en un individuo, en donde la composición de vacuna se va a administrar al individuo .