CN101100672B - 经修饰的hpv e6-e7融合基因及其编码蛋白 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种密码子优化型的HPV16 E6-E7融合基因，和在此基础上经过定点诱变消除了潜在致癌性的融合基因，及其编码的融合蛋白。与相应野生型融合基因在哺乳动物细胞中表达量极低相比，这些经修饰(包括密码子优化及在此基础上定点诱变)的融合基因在哺乳动物细胞中的表达显著升高。另外，经过定点诱变消除了潜在致癌性的HPV16 E6-E7融合基因失去了对细胞的转化活性，具有生物安全性，为构建相关的DNA疫苗提供了良好的侯选抗原基因。
Description
技术领域
本发明属于基因工程和肿瘤治疗领域。具体而言，本发明涉及密码子优化型的HPV16E6E7融合基因及其编码蛋白，以及对所述密码子优化型的HPV16 E6E7融合基因定点诱变得到的三种消除了潜在致癌性的融合基因及其编码蛋白。
背景技术
人乳头瘤病毒(Human Papillomavires，HPV)是一类具有严格宿主范围和组织特异性的DNA病毒，主要感染人的皮肤或粘膜上皮细胞，引起感染部位发生良性和恶性病变。随着对HPV研究的深入，发现在约80％的宫颈癌与四个型别的HPV感染有关，分别是HPV16、18、31和45型，其中50％的宫颈癌与HPV16感染有关(MH Stoler.Int J Gynecol Patho，2000，19(1)：16-28)。据统计，全世界每年约有51万新发的宫颈癌病例，有20多万妇女死于宫颈癌。虽然通HPV检测可提高宫颈癌前病变筛查的敏感性，检出率可达到85％～95％(HS Cronje.Int J Gynaecol Obstet，2004，84(2)：101-108)，但在不发达国家尚难普及，而且并不能消除HPV16的感染。尽管目前临床上普遍采用的手术治疗、放疗和化疗等方法对早期宫颈癌的治愈率已达90％以上，但治疗中创伤性大，不能防止HPV16再感染的可能，并且技术条件要求相对较高，不宜在落后地区和发展中国家推广应用，而对中晚期宫颈癌的治疗则尚无良策。因此研制针对HPV16的治疗性疫苗对预防HPV感染和宫颈癌的治疗将具有十分重要的意义。
目前研制的针对HPV16相关宫颈癌的治疗性疫苗主要有重组腺病毒载体疫苗(A Astua，etal.J Virol，2005，79(20)：12807-12817)、重组痘苗病毒载体疫苗(AN Fiander，et al.Int J GynecolCancer，2006，16(3)：1075-1081)、蛋白质疫苗(X Qian，et al.Immunol Lett，2006，102(2)：191-201)、树突状细胞疫苗(TH Kang，et al.Immunol Lett，2006，106(2)：126-134)、自我复制型RNA疫苗(WF Cheng，et al.Cancer Gene Ther，2006，13(9)：873-885)和DNA疫苗等。与其它类型疫苗相比，DNA疫苗有诸多优点，因而其研究更为引人注目。
由于E6和E7在大多数宫颈癌及其癌前病变中可以持续表达，而在正常组织中并不存在，这种表达特性使得这两种蛋白成为发展HPV相关宫颈癌及癌前病变治疗性疫苗的理想靶抗原(CG Ullman and VC Emery.Rev Med Virol，1996，6(1)：39-55)。
现已有多种方式尝试提高DNA疫苗的免疫效果，如将E7基因与LAMP-1基因融合制成的DNA疫苗Sig/E7/LAMP-1增强MHC-I和MHC-II两类抗原的呈递，同时活化E7特异性的CD8+和CD4+T细胞，比单独采用野生型E7基因制备的DNA疫苗具有更好的抗肿瘤效果(H Ji，et al.Hum Gene Ther，1999，10(17)：2727-2740)；将E7基因与热休克蛋白(heat shockproteins，HSP)基因融合也可以增强E7特异性CD8+T细胞的活性及抗肿瘤效果(Y Li，et al.Vaccine，2006，24(25)：5360-5370)；融合钙网蛋白基因的DNA疫苗CRT/E6(S Peng，et al.J Virol，2004，78(16)：8468-8476)和CRT/E7(JW Kim，et al.Gene Ther，2004，11(12)：1011-1018)疫苗单独使用时均可以产生抗肿瘤效果，而同时使用CRT/E6和CRT/E7的抗肿瘤效果要比远比单用CRT/E6或CRT/E7的效果好(S Peng，et al.Gene Ther，2006，13(3)：257-265)。
因此，本发明尝试使用E6-E7融合基因和/或其编码蛋白作为目的抗原。由于野生型HPV16 E6和E7基因在哺乳动物细胞中表达量很低，所以首先参照人类基因中的优势密码子，在不改变野生型HPV16 E6蛋白(Genebank ACCESSION：AAA46939)和E7蛋白(GenebankACCESSION：AAA46940)氨基酸序列的前提下，对HPV16 E6和E7基因以融合基因的方式进行优化合成(其中E6基因位于5’端，E7基因位于3’端，两部分基因之间没有任何多余的核苷酸作为连接子)，以增强HPV16 E6E7基因在哺乳动物细胞中的表达。
另外，由于HPV16的E6和E7基因都是癌基因，二者的融合基因必然具有潜在的致癌性。本发明通过定点诱变对E6-E7融合基因进行修饰，在保证该融合基因高表达于哺乳动物细胞同时，消除其潜在的致癌性。为进一步开发HPV16疫苗提供良好的抗原基因和/或抗原蛋白。
发明内容
本发明提供了经修饰的HPV E6-E7融合基因及其编码蛋白。
所述经修饰的融合基因包括：密码子优化型的HPV E6-E7融合基因，以及在此基础上定点诱变消除了潜在致癌性的融合基因。
一个方面，本发明提供了一种密码子优化型的HPV16 E6-E7融合基因，该融合基因中使用的密码子为人类基因中使用频率最高或次高的密码子。该融合基因能够高表达于哺乳动物细胞。
我们在公开的野生型HPV16 E6蛋白(Genebank ACCESSION：AAA46939)和E7蛋白(Genebank ACCESSION：AAA46940)的氨基酸序列基础上，根据人类基因中的密码子使用频率(参考数据来源：2006年4月14日的Kazusa数据库，网址为http://www.kazusa.or.jp/codon/)，利用人类基因中使用频率最高和次高的密码子取代HPV16 E6和E7基因序列的密码子得到密码子优化型的HPV16 E6-E7融合基因，命名为ofE6E7。该融合基因编码的氨基酸序列包含完整的HPV16 E6和E7蛋白的氨基酸序列。
本发明中，所述密码子优化型E6-E7融合基因中，E6和E7编码基因可以分别位于5’和3’端或者3’和5’端。
在一个具体实施方案中，E6编码基因位于5’端，E7编码基因位于3’端，所述密码子优化型融合基因具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
另一方面，本发明提供了消除潜在致癌性的密码子优化型融合基因，该融合基因是在对本发明所述密码子优化型融合基因进行定点诱变制备得到的。所述定点诱变后的融合基因编码的氨基酸序列包括下列位点突变：L57G(CTG→GGC)和C113R(TGC→AGA)(E6部分的2个)，以及C182G(TGC→GGC)、E184G(GAG→GGC)、C216G(TGC→GGC)和C249G(TGC→GGC)(E7部分的4个)中的至少2个。
在本发明的一个实施方案中，E6编码部分位于融合基因的5’端，E7编码部分位于3’端，所述消除潜在致癌性的密码子优化型融合基因具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
另一个实施方案中，E6部分位于融合基因的5’端，E7部分位于3’端，所述消除潜在致癌性的密码子优化型融合基因具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。
另一个实施方案中，E6部分位于融合基因的5’端，E7部分位于3’端，所述消除潜在致癌性的密码子优化型融合基因具有SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。
另一方面，本发明提供了本发明所述定点诱变消除潜在致癌性的密码子优化型融合基因编码的融合蛋白。
在本发明的一个实施方案中，E6部分位于融合基因的5’端，E7部分位于3’端，所述融合蛋白中的突变位点包括：L57G、C113R、C182G(对应于E7蛋白的第24位残基)和E184G(对应于E7蛋白的第26位残基)，具有SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列。
另一个实施方案中，E6部分位于融合基因的5’端，E7部分位于3’端，所述融合蛋白中的突变位点包括：L57G、C113R、C182G(对应于E7部分的第24位残基)、E184G(对应于E7部分的第26位残基)和C216G(对应于E7部分的第58位残基)，具有SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。
另一个实施方案中，E6部分位于融合基因的5’端，E7部分位于3’端，所述融合蛋白中的突变位点包括：L57G、C113R、C182G(对应于E7部分的第24位残基)、E184G(对应于E7部分的第26位残基)、C216G(对应于E7部分的第58位残基)和C249G(对应于E7部分的第91位残基)，具有SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列。
哺乳动物细胞表达试验证明：与野生型融合基因相比，本发明所述的经修饰的融合基因(例如，SEQ ID NOs：1-4)在哺乳动物细胞中的表达水平显著提高。
细胞转化检测(软琼脂集落形成实验和裸鼠致瘤实验)证明：本发明所述的定点诱变消除潜在致癌性的密码子优化型融合基因(例如，SEQ ID NOs：2-4)失去了对细胞的转化活性，具有生物安全性，为构建相关的DNA疫苗提供了良好的抗原基因。同时，所述消除潜在致癌性的密码子优化型融合基因编码的融合蛋白也为开发疫苗提供了很好的重组多肽抗原。
因此，另一方面，本发明提供了本发明所述经修饰的融合基因在制备HPV16 DNA疫苗侯选抗原基因中的用途。
附图说明
图1显示的是VR质粒的质粒图谱。
图2显示的是重组质粒pUC-ofE6E7的双酶切鉴定结果。其中泳道1是DNA MarkerDL15000，泳道2是pUC18质粒的EcoR V和Bgl II双酶切产物，泳道3是pUC-ofE6E7质粒的Kpn I+Xba I双酶切产物。
图3显示的是重组质粒VR-ofE6E7、VR-omfE6E7-2、VR-omfE6E7-3、VR-omfE6E7-4的EcoR V和BglII双酶切鉴定结果。其中泳道1是DNA Marker DL15000，泳道2是VR质粒的EcoR V和BglII双酶切产物，泳道3是VR-ofE6E7质粒的EcoR V和Bgl II双酶切产物，泳道4是VR-omfE6E7-2质粒的EcoR V和BglII双酶切产物，泳道5是VR-omfE6E7-3质粒的EcoR V和Bgl II双酶切产物，泳道6是VR-omfE6E7-4质粒的EcoR V和Bgl II双酶切产物
图4显示的是重组质粒VR-wfE6E7、VR-wmfE6E7-2、VR-wmfE6E7-3、VR-wmfE6E7-4的EcoR V和Bgl II双酶切鉴定结果。其中泳道1是DNA Marker DL15000，泳道2是VR质粒的EcoR V和Bgl II双酶切产物，泳道3是VR-wfE6E7质粒的EcoR V和BglII双酶切产物，泳道4是VR-wmfE6E7-2质粒的EcoR V和Bgl II双酶切产物，泳道5是VR-wmfE6E7-3质粒的EcoR V和Bgl II双酶切产物，泳道6是VR-wmfE6E7-4质粒的EcoR V和Bgl II双酶切产物。
图5显示的是使用Western Blot检测质粒VR-ofE6E7、VR-omfE6E7-2、VR-omfE6E7-3、VR-omfE6E7-4与VR-wfE6E7、VR-wmfE6E7-2、VR-wmfE6E7-3、VR-wmfE6E7-4在NIH 3T3细胞中表达的融合蛋白，使用β-肌动蛋白作为对照。其中泳道1是用作阴性对照的正常NIH3T3细胞的裂解物，泳道2是VR质粒转染的NIH 3T3细胞的裂解物，泳道3是VR-wfE6E7质粒转染的NIH 3T3细胞的裂解物，泳道4是VR-ofE6E7质粒转染的NIH 3T3细胞的裂解物，泳道5是VR-wmfE6E7-2质粒转染的NIH 3T3细胞的裂解物，泳道6是VR-omfE6E7-2质粒转染的NIH 3T3细胞的裂解物，泳道7是VR-wmfE6E7-3质粒转染的NIH 3T3细胞的裂解物，泳道8是VR-omfE6E7-3质粒转染的NIH 3T3细胞的裂解物，泳道9是VR-wmfE6E7-4质粒转染的NIH 3T3细胞的裂解物，泳道10是VR-omfE6E7-4质粒转染的NIH 3T3细胞的裂解物。
图6显示的是重组质粒pcDNA-ofE6E7、pcDNA-omfE6E7-2、pcDNA-omfE6E7-3、pcDNA-omfE6E7-4的Kpn I和Xba I双酶切鉴定结果。其中泳道1是DNA MarkerDL15000，泳道2是pcDNA3.1(+)质粒的EcoR V和Bgl II双酶切产物，泳道3是pcDNA-ofE6E7质粒的Kpn I+Xba I双酶切产物，泳道4是pcDNA-omfE6E7-2质粒的KpnI+Xba I双酶切产物，泳道5是pcDNA-omfE6E7-3质粒的Kpn I+Xba I双酶切产物，泳道6是pcDNA-omfE6E7-4质粒的Kpn I+Xba I双酶切产物
图7显示的是使用Western Blot检测阳性细胞克隆3T3-ofE6E7、3T3-omfE6E7-2、3T3-omfE6E7-3和3T3-omfE6E7-4中表达的融合蛋白。其中泳道1是用作阴性对照的正常NIH3T3细胞的裂解物，泳道2是3T3-neo细胞的裂解物，泳道3是3T3-ofE6E7细胞的裂解物，泳道4是3T3-omfE6E7-2细胞的裂解物，泳道5是3T3-omfE6E7-3细胞的裂解物，泳道6是3T3-omfE6E7-4细胞的裂解物。
图8显示的是细胞3T3-ofE6E7、3T3-omfE6E7-2、3T3-omfE6E7-3、3T3-omfE6E7-4、3T3-neo以及NIH 3T3细胞(阴性对照)、TC-1细胞(阳性对照)在软琼脂中集落的形成情况。其中A是NIH 3T3细胞在软琼脂中集落的形成情况，B是3T3-neo细胞在软琼脂中集落的形成情况，C是3T3-ofE6E7细胞在软琼脂中集落的形成情况，D是3T3-omfE6E7-2细胞在软琼脂中集落的形成情况，E是3T3-omfE6E7-3细胞在软琼脂中集落的形成情况，F是3T3-omfE6E7-4细胞在软琼脂中集落的形成情况，G是TC-1细胞在软琼脂中集落的形成情况。
图9显示细胞3T3-ofE6E7、3T3-omfE6E7-2、3T3-omfE6E7-3、3T3-omfE6E7-4、3T3-neo以及NIH 3T3细胞(阴性对照)、TC-1细胞(阳性对照)对SICD小鼠的致瘤情况以及所形成的肿瘤，其中箭头所指示的位置为肿瘤生长的位置。图A部分中1为NIH 3T3细胞接种的SCID小鼠，2为3T3-neo细胞接种的SCID小鼠，3为3T3-ofE6E7细胞接种的SCID小鼠，4为3T3-omfE6E7-2细胞接种的SCID小鼠，5为3T3-omfE6E7-3细胞接种的SCID小鼠，6为3T3-omfE6E7-4细胞接种的SCID小鼠，7为TC-1细胞接种的SCID小鼠。图B部分中1-6为3T3-ofE6E7细胞接种的六只SCID小鼠分别形成的肿瘤，7为TC-1细胞接种的SCID小鼠所形成的肿瘤。
图10显示细胞3T3-ofE6E7对SICD小鼠所形成的肿瘤(对应图9中图B部分1所示的肿瘤)的病理切片，显示了所形成肿瘤的是梭形细胞肉瘤。
实施例
材料和方法
含有野生型HPV16E6基因和E7基因的pUC-E6E7质粒(插入位点为Kpn I和Xba I酶切位点之间，插入序列是Genebank ACCESSION：K02718所示核苷酸序列中第83-858位核苷酸部分，其中第83-559位核苷酸序列为E6基因核苷酸序列，第562-858位核苷酸序列为E7基因核苷酸序列)、VR质粒、pcDNA3.1(+)质粒、大肠杆菌DH5α、NIH 3T3细胞以及SCID小鼠，由中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所肿瘤病毒室所有。质粒大量提取试剂盒QIAGEN Plasmid Midi Kits购自德国QIAGEN公司。常用限制性内切酶和T4 DNALigase购自大连宝生物工程有限公司。pfu聚合酶、核酸凝胶纯化试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。脂质体转染试剂Lipofectamine 2000试剂购自美国Invitrogen公司，无血清培养基Opti-MEM购自美国Gibico公司。Protease Inhibitor Cocktail购于SIGMA公司。G418购自美国Merck公司。软琼脂
Agarose购自美国Cambrex公司。PCR反应仪为美国ABI公司的GeneAmp PCR System 2700。
本发明所涉及的分子生物学相关技术如核酸操作技术、蛋白质定性等在科学文献中都已有充分描述(如参见J·萨姆布鲁克E·F·弗里奇T·曼尼要蒂斯，分子克隆实验指南(第二版))。涉及到各种试剂(或试剂盒)的具体操作，按照各试剂(或试剂盒)的使用说明书进行。
实施例1：
HPV16 E6E7的密码子最优化
为了提高HPV16 E6E7基因在哺乳类动物细胞特别是人类细胞中的表达，本实施例对HPV16 E6E7基因进行密码子优化。
根据人类基因密码子的偏嗜性，利用人类基因中使用频率最高和次高的密码子设计出一条经密码子优化的HPV16 E6E7融合基因，命名为ofE6E7，其编码的氨基酸序列包含完整的野生型HPV16 E6蛋白(Genebank ACCESSION：AAA46939)和E7蛋白(Genebank ACCESSION：AAA46940)的氨基酸序列，并以E6蛋白氨基酸序列在氨基端、E7蛋白氨基酸序列在羧基端的方式直接融合，其中的E6蛋白氨基酸序列中第136位精氨酸和E7蛋白氨基酸序列中第32位丝氨基分别使用人类基因中使用频率次高的密码子AGG和TCC，其余均为人类基因中使用频率最高的密码子。
所述ofE6E7基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
实施例2：
合成密码子最优化的HPV16 E6E7融合基因
本实施例通过重叠延伸PCR(overlap extension PCR，OE PCR)拼接合成实施例1中所述的ofE6E7基因。
引物设计
参照密码子最优化后的ofE6E7核苷酸序列，设计合成10条含有重叠序列的长度为89个寡核苷酸左右的长链引物(A1、A2、B1、B2、C1、C2、D1、D2)，以及10条用于连接这些长链引物的长度为25个寡核苷酸左右的短链引物(p1、p2、p2、p4、p5、q1、q2、q3、q4、q5)，其中的两条短链引物(p1和q10)含有限制性内切酶Kpn I和Xba I的酶切位点。所述引物委托北京擎科生物技术有限公司合成，溶于ddH2O中，长链引物浓度为10μmol，短链引物浓度为25μmol，引物序列见表1。
表1：拼接合成密码子优化型融合基因用的引物：
| 引物 | 序列(5’-3’) |
| A1 | CCATGCACCAGAAGAGAACCGCCATGTTCCAGGACCCCCAGGAGAGACCCAGAAAGCTGCCCCAGCTGTGCACCGAGCTGCAGACCACC |
| A2 | GCGAAGTCGTACACCTCTCTTCTCAGCAGCTGCTGCTTGCAGTACACGCACTCCAGGATGATGTCGTGGATGGTGGTCTGCAGCTCG |
| B1 | GAGAGGTGTACGACTTCGCCTTCAGAGACCTGTGCATCGTGTACAGAGACGGCAACCCCTACGCCGTGTGCGACAAGTGCCTGAAGTTC |
| B2 | GTACTGCTGCTCCAGGGTGGTGCCGTACAGGCTGTAGCAGTAGTGTCTGTACTCGCTGATCTTGCTGTAGAACTTCAGGCACTTGTC |
| C1 | CCTGCTGATCAGATGCATCAACTGCCAGAAGCCCCTGTGCCCCGAGGAGAAGCAGAGACACCTGGACAAGAAGCAGAGATTCCACAAC |
| C2 | CTGGGTCTCTCTTCTGGTTCTGCTGCTTCTGCAGCAGCTCATGCATCTGCCGGTCCATCTGCCCCTGATGTTGTGGAATCTCTGCTTC |
| D1 | GAAGAGAGACCCAGCTGATGCACGGCGACACCCCCACCCTGCACGAGTACATGCTGGACCTGCAGCCCGAGACCACCGACCTGTACTG |
| D2 | GTCGGGCTCGGCCTGGCCGGCGGGGCCGTCGATCTCGTCCTCCTCCTCGGAGCTGTCGTTCAGCTGCTCGTAGCAGTACAGGTCGGTG |
| E1 | GCCCGACAGAGCCCACTACAACATCGTGACCTTCTGCTGCAAGTGCGACAGCACCCTGAGACTGTGCGTGCAGAGCACCCACGTGGAC |
| E2 | TTCAGGGCTTCTGGCTGCAGATGGGGCACACGATGCCCAGGGTGCCCATCAGCAGGTCCTCCAGGGTTCTGATGTCCACGTGGGTGCTC |
| p1 | GCGGGTACCGCCACCATGCACCAGAAG |
| 引物 | 序列(5’-3’) |
| p2 | GGTCGCACAGGGGCTTGTTGTACTGCTG |
| p3 | CAAGCCCCTGTGCGACCTGCTGATCAGATG |
| p4 | GTGGGCTCTGTCGGGCTCGGCCTGGC |
| p5 | GCGTCTAGATTCAGGGCTTCTGGCTGCAGATGG |
| q1 | CAGGTCTCTGAAGGCGAAGTCGTACAC |
| q2 | CTGAGAAGAGAGGTGTACGACTTCGCCTTC |
| q3 | CGTGCATCAGCTGGGTCTCTCTTCTGGTTC |
| q4 | GCAGAACCAGAAGAGAGACCCAGCTGATG |
| q5 | GCCAGGCCGAGCCCGACAGAGCCCACTAC |
引物的拼接
使用重叠延伸PCR(overlap extension PCR，OE PCR)来拼接合成ofE6E7序列，方法如下：
(1)由相邻的两条含有重叠序列的长链引物和位于这两条长引物两端的相应的短链引物，合成五条双链DNA，依次编号为A(使用引物p1+A1+A2+q1)、B(使用引物p2+B1+B2+q2)、C(使用引物p3+C1+C2+q3)、D(使用引物p4+D1+D2+q4)、E(使用引物p5+E1+E2+q5)。
在200μl PCR反应管中，加入以下反应物：1μl(2.5U)pfu DNA聚合酶、5μl pfu 10×缓冲液、4μl dNTP(2.5mM each)、1μl每条长链引物和1μM每条短链引物，使用ddH2O补充到50μl。在PCR仪上进行如下的PCR反应：94℃ 5分钟，40℃ 2分钟，72℃ 10秒钟；94℃ 15秒钟，40℃ 30秒钟，72℃ 20秒钟+每个循环2秒钟(共进行10个循环)；94℃ 30秒钟，60℃ 30秒钟，72℃ 45秒钟(共进行25个循环)；72℃ 10分钟。PCR反应后取全量PCR反应液进行DNA凝胶电泳并切胶回收目的DNA片段。
(2)使用引物和上一步回收的有重叠序列的DNA片段来拼接延伸DNA。具体的说，由p1+A+B+p2合成DNA片段AB，由p3+C+D+p4合成DNA片段CD，由p3+CD+E+p5合成DNA片段CDE，最后由p1+AB+CDE+p5合成全基因(包含两端的酶切位点部分)。
在200μl PCR反应管中，加入以下反应物：1μl(2.5U)pfu DNA聚合酶、5μl pfu 10×缓冲液、4μl dNTP(2.5mM each)、1μl每种短链引物(如合成AB时使用p1和p2)、等量的0.2～0.5μg回收的每种DNA片段(如合成AB时使用A和B)，使用ddH2O补充到50μl。在PCR仪上进行如下的PCR反应：94℃ 5分钟；94℃ 30秒钟，60℃ 30秒钟，72℃ 1分钟(共进行30个循环)；72℃ 10分钟。PCR反应后取全量PCR反应液进行DNA凝胶电泳并切胶回收，目的DNA大小为780bp左右。
质粒pUC-ofE6E7的构建
将最后回收所得的PCR产物全量进行Kpn I和Xba I双酶切，酶切产物纯化回收后连接同样进行双酶切的pUC18质粒，转化DH5α感受态细胞，对所选择克隆的质粒使用KpnI和Xba I双酶切，挑选含有780bp左右片段的阳性克隆，对插入片段DNA进行测序，测序结果显示为如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。选择出含有ofE6E7基因的重组质粒，命名为pUC-ofE6E7。质粒pUC-ofE6E7的酶切鉴定结果分别如图2所示。结果表明：拼接合成的ofE6E7基因正确地插入到pUC18质粒中的Kpn I和Xba I酶切位点。
实施例3：ofE6E7基因的定点诱变
本实施例对所得到的优化融合HPV16 E6E7基因ofE6E7基因进行定点诱变，制备密码子优化型的突变HPV16 E6E7融合基因，消除HPV16 E6E7基因的致癌性，以消除HPV16 E6-E7融合基因的致癌性。
具体为，在E6蛋白氨基酸序列部分中：57Leu(CTG)→Gly(GGC)和113Cys(TGC)→Arg(AGA)，在E7蛋白氨基酸序列部分中：24Cys(TGC)→Gly(GGC)、26Glu(GAG)→Gly(GGC)、58Cys(TGC)→Gly(GGC)和91Cys(TGC)→Gly(GGC)。上述E6蛋白的L57G、C113R和E7蛋白的C24G、E26G、C58G、C91G在融合蛋白的氨基酸序列(E6位于5’端，E7位于3’端，)中的相应残基位置为：L57G、C113R、C182G、E184G、C216G和C249G。本实施例共制备三种定点诱变后的密码子优化型融合基因：1)4个位点突变的突变形式，其中E6编码部分2个(L57G、C113R)，E7编码部分2个(C182G和E184G)，命名为omfE6E7-2；2)5个位点突变的突变形式，其中E6编码部分2个(L57G、C113R)，E7编码部分3个(C182G、E184G和C216G)，命名为omfE6E7-3；3)6个位点突变的突变形式，其中E6编码部分2个(L57G、C113R)，E7编码部分4个(C182G、E184G、C216G和C249G)，命名为omfE6E7-4。
引物设计
以omfE6E7-4为模板，设计九条含有突变位点的引物(Q57U、Q57L、Q113U、Q113L、Q24U、Q24L、Q58U、Q58L和Q91L)以及扩增全基因序列的上游引物E6Ueco和下游引物E7Lbgl，其中E6Ueco含有EcoR V酶切位点，E7Lbgl和Q91L含有Bgl II酶切位点。引物序列见表2。
表2：向密码子优化型融合基因引入突变位点用引物：
| 引物 | 序列(5’-3’) |
| E6Ueco | GCGGATATCGCCACCATGCACCAG |
| E7Lbgl | GCGAGATCTTTCAGGGCTTCTGGCTGC |
| Q57U | CAGAGACGGCTGCATCGTGTACAGAG |
| Q57L | ATGCAGCCGTCTCTGAAGGCGAAG |
| Q113U | CAACAGACAGAAGCCCCTGTGCCC |
| 引物 | 序列(5’-3’) |
| Q113L | GGGGCTTCTGTCTGTTGATGCATCTG |
| Q24U | TACGGCTACGGCCAGCTGAACGACAG |
| Q24L | GCTGGCCGTAGCCGTACAGGTCGGTGG |
| Q58U | ACCTTCGGCTGCAAGTGCGACAGCACC |
| Q58L | CTTGCAGCCGAAGGTCACGATGTTG |
| Q91L | TTTAGATCTTTCAGGGCTTCTGGCTGCAGATGGGGCCCACG |
突变位点的引入
以实施例2中制备得到的pUC-ofE6E7为模板，使用重叠延伸PCR依次引入所设计的突变位点。具体的说，以ofE6E7为模板，使用引物Q57U和Q57L引入L57G，使用引物Q113U和Q113引入C113R，使用引物Q24U和Q24L同时引入C182G和E184G，使用引物Q58U和Q58L引入C216G，使用引物Q91L引入C249G。同时使用引物E6Ueco和E7Lbgl扩增ofE6E7。每一步的PCR反应条件均相同。
在200μl PCR反应管中，加入以下反应物：1μl(2.5U)pfu DNA聚合酶、5μl pfu 10×缓冲液、4μl dNTP(2.5mM each)、1μl每条短链引物、等量的0.2～0.5μg回收的每种DNA片段，使用ddH2O补充到50μl。在PCR仪上进行如下的PCR反应：94℃ 5分钟；94℃ 30秒钟，60℃ 30秒钟，72℃ 1分钟(共进行30个循环)；72℃ 10分钟。最后一次PCR反应后取全量PCR反应液进行DNA凝胶电泳并切胶回收，目的DNA大小为780bp左右。
回收所得的PCR产物ofE6E7、omfE6E7-2、omfE6E7-3和omfE6E7-4全量进行EcoR V和Bgl II双酶切，酶切产物纯化回收后连接同样进行双酶切的VR质粒，转化DH5α感受态细胞，对所选择克隆的质粒使用EcoR V和Bgl II双酶切，挑选含有780bp左右片段的阳性克隆，对插入片段DNA进行测序，测序结果显示为分别如SEQ ID NO：1-4所示。选择出含有ofE6E7、omfE6E7-2、omfE6E7-3和omfE6E7-4基因的重组质粒，分别命名为VR-ofE6E7、VR-omfE6E7-2、VR-omfE6E7-3和VR-omfE6E7-4。酶切鉴定结果图3所示。结果表明：ofE6E7、omfE6E7-2、omfE6E7-3和omfE6E7-4基因都正确地插入到VR质粒的EcoR V和Bgl II酶切位点中。
实施例4：
野生型重组HPV16 E6E7基因的构建
为了检测优化型重组HPV16 E6E7基因的在哺乳动物细胞中的表达效果，本实施例构建与ofE6E7、omfE6E7-2、omfE6E7-3、omfE6E7-4相对应的野生型重组HPV16 E6E7融合基因wfE6E7、wmfE6E7-2、wmfE6E7-3和wmfE6E7-4共四种基因。其中E6蛋白氨基酸部分突变位点包括57Leu(TTA)→Gly(GGC)和113Cys(TGT)→Arg(AGA)，E7蛋白氨基酸部分突变位点包括24Cys(TGT)→Gly(GGC)、26Glu(GAG)→Gly(GGC)、58Cys(TGT)→Gly(GGC)和91Cys(TGC)→Gly(GGC)。以上所述的E6蛋白的L57G、C113R和E7蛋白的C24G、E26G、C58G、C91G依次对应于融合蛋白氨基酸序列中的L57G、C113R、C182G、E184G、C216G和C249G。相对于wfE6E7，wmfE6E7-2的突变位点包含L57G、C113R、C182G和E184G，wmfE6E7-3的突变位点包含L57G、C113R、C182G、E184G和C216G，wmfE6E7-4的突变位点包含L57G、C113R、C182G、E184G、C216G和C249G。
引物设计
以wfE6E7为模板，设计上游引物wE6Ueco和下游引物wE7Lbgl以及使E6E7基因融合的引物E6L和E7U。以wmfE6E7-4为模板，设计九条含有突变位点的引物(57U、57L、113U、113L、24U、24L、58U、58L和91L)，其中wE6Ueco含有EcoR V酶切位点，wE7Lbgl和91L含有Bgl II酶切位点。引物序列见表3。
表3.构建野生型对照融合基因用引物
| 引物 | 序列(5’-3’) |
| wE6Ueco | GCGGATATCGCCACCATGCACCAAAAG |
| wE7Lbgl | GGGAGATCTTTATGGTTTCTGAGAACAGATGGG |
| E6L | ATCTCCATGCATCAGCTGGGTTTCTCTACGTG |
| E7U | GAGAAACCCAGCTGATGCATGGAGATACACCTAC |
| 57U | TTCGGGATGGCTGCATAGTATATAGAG |
| 57L | TATGCAGCCATCCCGAAAAGCAAAG |
| 113U | AGGTGTATTAACAGACAAAAGCCACTG |
| 113L | TGTCTGTTAATACACCTAATTAACAAATC |
| 24U | AATTAAATGACAGCTCAGAGGAGGAGGATGAAATAGA |
| 24L | CTGTCATTTAATTGGCCATAGCCGTAGAGATCAG |
| 58U | GTGACTCTACGCTTCGGTTGTGCGTACAAAGCAC |
| 58L | AAGCGTAGAGTCACACTTGCAGCCAAAGGTTAC |
| 91L | GGGAGATCTTTCATGGTTTCTGAGAACAGATGGGGCCCAC |
基因的融合与突变
使用引物E6L和E7U消除野生型HPV16 E6基因的终止密码子TAA及E6基因与E7基因之间连接的两个脱氧核核苷酸TC，从而产生野生融合HPV16 E6E7基因wfE6E7，再以wfE6E7为模板，依次引入所设计的突变位点。方法如下：
(1)扩增E6基因和E7基因
以pUC-E6E7为模板，使用引物wE6Ueco和E6L扩增E6基因，wE7Lbgl和E6E7扩增E7U。在200μl PCR反应管中，加入以下反应物：1μl(2.5U)pfu DNA聚合酶、5μl pfu 10×缓冲液、4μl dNTP(2.5mM each)、0.5μg左右的质粒pUC-E6E7，使用ddH2O补充到50μl。在PCR仪上进行如下的PCR反应：94℃ 5分钟；94℃ 30秒钟，60℃ 30秒钟，72℃ 1分钟(共进行30个循环)；72℃ 10分钟。PCR反应后取全量PCR反应液进行DNA凝胶电泳并切胶回收，目的DNA大小分别为480bp左右(E6)和300bp左右(E7)。
(2)E6基因与E7基因的融合
以回收纯化的E6和E7基因为模板，使用引物wE6Ueco和wE7Lbgl扩增野生融合HPV16 E6E7基因wfE6E7。在200μl PCR反应管中，加入以下反应物：1μl(2.5U)pfu DNA聚合酶、5μl pfu 10×缓冲液、4μl dNTP(2.5mM each)、1μl每条短链引物、等量的0.2～0.5μg回收的每种DNA片段，使用ddH2O补充到50μl。在PCR仪上进行如下的PCR反应：94℃ 5分钟；94℃ 30秒钟，60℃ 30秒钟，72℃ 1分钟(共进行30个循环)；72℃ 10分钟。PCR反应后取全量PCR反应液进行DNA凝胶电泳并切胶回收，目的DNA大小780bp左右。
(3)突变位点的引入
以上一步回收后所得到的DNA为模板，使用重叠延伸PCR依次引入所设计的突变位点。具体的说，以wfE6E7模板，使用引物57U和57L引入L57G，使用引物113U和113引入C113R，使用引物24U和24L同时引入C182G和E184G，使用引物58U和58L引入C216G，使用引物91L引入C249G。每一步的PCR反应条件均相同。
在200μl PCR反应管中，加入以下反应物：1μl(2.5U)pfu DNA聚合酶、5μl pfu 10×缓冲液、4μl dNTP(2.5mM each)、1μl每条短链引物、等量的0.2～0.5μg回收的每种DNA片段，使用ddH2O补充到50μl。在PCR仪上进行如下的PCR反应：94℃ 5分钟；94℃ 30秒钟，60℃ 30秒钟，72℃ 1分钟(共进行30个循环)；72℃ 10分钟。最后一次PCR反应后取全量PCR反应液进行DNA凝胶电泳并切胶回收，目的DNA大小为780bp左右。
回收所得的PCR产物wfE6E7、wmfE6E7-2、wmfE6E7-3和wmfE6E7-4全量进行EcoR V和Bgl II双酶切，酶切产物纯化回收后连接同样进行双酶切的VR质粒，转化DH5α感受态细胞，对所选择克隆的质粒使用EcoR V和Bgl II双酶切，挑选含有780bp左右片段的阳性克隆，对插入片段DNA进行测序(测序结果未列出)。选择出含有wfE6E7、wmfE6E7-2、wmfE6E7-3和wmfE6E7-4基因的重组质粒，分别命名为VR-wfE6E7、VR-wmfE6E7-2、VR-wmfE6E7-3和VR-wmfE6E7-4。质粒VR-wfE6E7、VR-wmfE6E7-2、VR-wmfE6E7-3和VR-wmfE6E7-4的酶切鉴定结果如图4所示。结果表明：wfE6E7、wmfE6E7-2、wmfE6E7-3和wmfE6E7-4基因均正确地插入到VR质粒的EcoR V和Bgl II酶切位点中。
实施例5：
优化型重组HPV16 E6E7基因在NIH 3T3细胞中的表达
本实施例使用Western Blot检测优化型重组HPV16 E6E7基因在NIH 3T3细胞中的表达，方法如下所述。
用QIAGEN Plasmid Midi Kits质粒纯化试剂盒大量制备纯化优化型重组HPV16 E6E7基因重组质粒(VR-ofE6E7，VR-omfE6E7-2，VR-omfE6E7-3，VR-omfE6E7-4)和野生型重组HPV16 E6E7基因重组质粒(VR-wfE6E7，VR-wmfE6E7-2，VR-wmfE6E7-3，VR-wmfE6E7-4)，以及VR质粒。使用脂质体法转染NIH 3T3细胞，转染方法按Lipofectamine 2000的使用说明进行操作。转染48小时后裂解所转染的细胞，将裂解液与适当比较的5×SDS凝胶加样缓冲液混匀后进行SDS聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)，其中积层胶为5％，分离胶为12％，在110V条件下电泳1.5小时。电泳结束后，通过半干式电转印法将凝胶中蛋白转移至硝酸纤维素膜，在为36V条件下电转1小时。将硝酸纤维素膜按分子量大小进行适当裁剪后依次进行封闭、加入一抗(其中重组基因表达产物部分加入1∶200稀释的羊抗HPV16 E6多抗，β-actin表达产物部分加入1∶500稀释的兔抗β-actin抗体)、加入二抗(对应的分别加入1∶2500HRP标记的兔抗羊IgG和1∶2500HRP标记羊抗兔IgG)，最后进行DAB显色。结果如图24所示。
结果表明：优化型重组HPV16 E6E7基因ofE6E7、omfE6E7-2，、omfE6E7-3和omfE6E7-4都可以在NIH 3T3中可以表达出与理论值大小相同的36KD大小的目的蛋白，而且检测到的蛋白条带明显，表达量很高；而野生型重组HPV16 E6E7基因wfE6E7、wmfE6E7-2、wmfE6E7-3和wmfE6E7-4由于表达量低而未达到可检测的水平，没有检测到相应的目的蛋白(如图5所示)。由此可见，与野生型HPV16 E6-E7融合基因相比，密码子优化型HPV16 E6-E7融合基因在NIH 3T3中的表达量得到了极为显著的提高，从而说明基因优化后对重组HPV16 E6E7基因在哺乳动物细胞中表达效果的提高是十分明显的，同时也表明所构建的优化突变融合HPV16 E6E7基因可以表达出稳定的融合蛋白。
实施例6：
含有优化重组基因的pcDNA表达质粒的构建
本实施例以VR-ofE6E7、VR-omfE6E7-2、VR-omfE6E7-3、VR-omfE6E7-4为模板，使用引物p1和p5分别扩增ofE6E7、omfE6E7-2、omfE6E7-3和omfE6E7-4基因。
在200μl PCR反应管中，加入以下反应物：1μl(2.5U)pfu DNA聚合酶、5μl pfu 10×缓冲液、4μl dNTP(2.5mM each)、0.5μg左右的质粒，使用ddH2O补充到50μl。在PCR仪上进行如下的PCR反应：94℃ 5分钟；94℃ 30秒钟，60℃ 30秒钟，72℃ 1分钟(共进行30个循环)；72℃ 10分钟。PCR反应后取全量PCR反应液进行DNA凝胶电泳并切胶回收，目的DNA大小分别为780bp左右。
回收所得的PCR产物ofE6E7、omfE6E7-2、omfE6E7-3和omfE6E7-4全量进行EcoR V和Bgl II双酶切，酶切产物纯化回收后连接同样进行双酶切的VR质粒，转化DH5α感受态细胞，对所选择克隆的质粒使用EcoR V和Bgl II双酶切，挑选含有780bp左右片段的阳性克隆，对插入片段DNA进行测序，测序结果显示为分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQID NO：3和SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。选择出含有ofE6E7、omfE6E7-2、omfE6E7-3和omfE6E7-4基因的重组质粒，分别命名为VR-ofE6E7、VR-omfE6E7-2、VR-omfE6E7-3和VR-omfE6E7-4。酶切鉴定结果图3所示。结果表明：VR-ofE6E7、VR-omfE6E7-2、VR-omfE6E7-3和VR-omfE6E7-4基因都正确地插入到VR质粒的EcoR V和Bgl II酶切位点中。
回收所得的PCR产物ofE6E7、omfE6E7-2、omfE6E7-3和omfE6E7-4全量进行Kpn I和Xba I双酶切，酶切产物纯化回收后连接同样进行双酶切的pcDNA3.1(+)质粒，转化DH5α感受态细胞，对所选择克隆的质粒使用Kpn I和Xba I双酶切，挑选含有780bp左右片段的阳性克隆，对插入片段DNA进行测序，测序结果显示为分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。选择出含有ofE6E7、omfE6E7-2、omfE6E7-3和omfE6E7-4基因的重组质粒，分别命名为pcDNA-ofE6E7、pcDNA-omfE6E7-2、pcDNA-omfE6E7-3和pcDNA-omfE6E7-4。质粒pcDNA-ofE6E7、pcDNA-omfE6E7-2、pcDNA-omfE6E7-3和pcDNA-omfE6E7-4的酶切鉴定结果如图6所示。结果表明：ofE6E7、omfE6E7-2、omfE6E7-3和omfE6E7-4基因都正确地插入到pcDNA3.1(+)质粒的Kpn I和Xba I酶切位点中。
实施例7：
对经密码子最优化的重组HPV16 E6E7基因的软琼脂集落形成实验
为了检测优化型重组基因的安全性，本实施例对经密码子最优化的重组HPV16 E6E7基因进行软琼脂集落形成实验。
用QIAGEN Plasmid Midi Kits质粒纯化试剂盒大量制备纯化pcDNA-ofE6E7、pcDNA-omfE6E7-2、pcDNA-omfE6E7-3和pcDNA-omfE6E7-4重组质粒以及pcDNA3.1(+)质粒。使用脂质体法转染NIH 3T3细胞，转染方法按Lipofectamine 2000的使用说明进行操作。转染24h时将细胞按1∶20传代于一新的六孔板中，每种转染的细胞传6孔，继续培养至48h时换为含300μg/ml G418的细胞培养液培养，连续培养三周后换为含150μg/ml G418的细胞培养液，继续培养至第四周(共28天)，此时各组均可见抗性细胞克隆的形成。每组各挑取20个细胞克隆，吸取转移到24孔板中，使用含150μg/ml G418的细胞培养液进行扩大培养。使用Western Blot来检测含有ofE6E7、omfE6E7-2、omfE6E7-3和omfE6E7-4基因表达产物的阳性细胞克隆，分别命名为3T3-ofE6E7、3T3-omfE6E7-2、3T3-omfE6E7-3、3T3-omfE6E7-4。pcDNA3.1(+)转染后筛选出的抗G418的细胞系命名为3T3-neo。Western Blot检测结果如图7所示。
消化离心并收集五种细胞克隆(3T3-ofE6E7、3T3-omfE6E7-2、3T3-omfE6E7-3、3T3-omfE6E7-4、3T3-neo)和NIH 3T3细胞(阴性对照)、TC-1细胞(阳性对照)于含20％小牛血清的2×DMEM细胞培养液中，调整细胞浓度为2×104后，与等量的在40℃水浴的0.6％的琼脂混匀，快速加入到六孔板中，1ml/孔，使每孔最终的细胞数为1×104个，每种细胞接种三个孔，常温下自然凝固后置于37℃、5％ CO2孵箱中培养，每3天向琼脂表面滴加3～5滴细胞培养液，连续培养21天后计数软琼脂中细胞集落形成数目。
各种细胞系在软琼脂中形成的集落的如图8所示。软琼脂集落形成实验结果表明：3T3-omfE6E7-2、3T3-omfE6E7-3、3T3-omfE6E7-4、3T3-neo和NIH 3T3细胞均不能在软琼脂中形成3个细胞以上的克隆，而3T3-ofE6E7细胞和TC-1细胞均可以在软琼脂上形成含有50个细胞以上的细胞克隆。由此可以说明：3T3-ofE6E7细胞具有在软琼脂上形成克隆的能力，而T3-omfE6E7-2、3T3-omfE6E7-3和3T3-omfE6E7-4等三种细胞没有在软琼脂上形成克隆的能力，没有表现出恶性转化的性质。从而说明ofE6E7基因对NIH 3T3细胞具有转化作用，而omfE6E7-2、omfE6E7-3和omfE6E7-4基因则没有对NIH 3T3细胞的转化作用，消除了潜在致癌性，具有良好的生物安全性。
实施例8：
对经密码子最优化的重组HPV16 E6E7基因的裸鼠致瘤实验
为了进一步检测优化型重组基因的安全性，本实施例对经密码子最优化的重组HPV16E6E7基因进行软琼脂集落形成实验。
收集五种细胞克隆(3T3-ofE6E7、3T3-omfE6E7-2、3T3-omfE6E7-3、3T3-omfE6E7-4、3T3-neo)和NIH 3T3细胞(阴性对照)、TC-1细胞(阳性对照)，1×PBS清洗三次，调整细胞浓度为1×107个/ml，接种于SCID小鼠右前肢腋下皮下，1×106个细胞/鼠，每组6只SCID小鼠，培养两个月后，观察有无移植瘤的形成。
实验结果显示3T3-ofE6E7和TC-1细胞接种的SCID小鼠均有肿瘤形成，成瘤率100％，而3T3-omfE6E7-2、3T3-omfE6E7-3、3T3-omfE6E7-4、3T3-neo和NIH 3T3细胞接种的SCID小鼠均无肿瘤形成，成瘤率为0％。从而说明3T3-ofE6E7具有对SCID小鼠致瘤的能力，而3T3-omfE6E7-2、3T3-omfE6E7-3和3T3-omfE6E7-4则没有对SCID小鼠致瘤的能力。各组SCID小鼠及其体内瘤块如图9所示。取出3T3-ofE6E7接种的SCID小鼠的肿瘤组织(对应图9中B部分编号为1的肿瘤)，HE染色后显微镜下可见：梭状瘤细胞呈纺织状重叠排列，瘤细胞异型性明显，呈纤维肉瘤样外观(如图10所示)，鉴定为梭形细胞肉瘤。从而进一步说明ofE6E7基因对NIH 3T3细胞具有转化作用，而omfE6E7-2、omfE6E7-3和omfE6E7-4基因则没有对NIH 3T3细胞的转化作用，消除了潜在致癌性，具有良好的生物安全性。
序列表
<110>曾毅
<120>经修饰的HPV E6-E7融合基因及其编码蛋白
<130>
<160>7
<170>PatentIn version 3.4
<210>1
<211>771
<212>DNA
<213>HPV
<220>
<221>融合基因
<222>(1)..(771)
<400>1
atgcaccaga agagaaccgc catgttccag gacccccagg agagacccag aaagctgccc 60
cagctgtgca ccgagctgca gaccaccatc cacgacatca tcctggagtg cgtgtactgc 120
aagcagcagc tgctgagaag agaggtgtac gacttcgcct tcagagacct gtgcatcgtg 180
tacagagacg gcaaccccta cgccgtgtgc gacaagtgcc tgaagttcta cagcaagatc 240
agcgagtaca gacactactg ctacagcctg tacggcacca ccctggagca gcagtacaac 300
aagcccctgt gcgacctgct gatcagatgc atcaactgcc agaagcccct gtgccccgag 360
gagaagcaga gacacctgga caagaagcag agattccaca acatcagggg cagatggacc 420
ggcagatgca tgagctgctg cagaagcagc agaaccagaa gagagaccca gctgatgcac 480
ggcgacaccc ccaccctgca cgagtacatg ctggacctgc agcccgagac caccgacctg 540
tactgctacg agcagctgaa cgacagctcc gaggaggagg acgagatcga cggccccgcc 600
ggccaggccg agcccgacag agcccactac aacatcgtga ccttctgctg caagtgcgac 660
agcaccctga gactgtgcgt gcagagcacc cacgtggaca tcagaaccct ggaggacctg 720
ctgatgggca ccctgggcat cgtgtgcccc atctgcagcc agaagccctg a 771
<210>2
<211>771
<212>DNA
<213>HPV
<220>
<221>定点诱变融合基因
<222>(1)..(771)
<400>2
atgcaccaga agagaaccgc catgttccag gacccccagg agagacccag aaagctgccc 60
cagctgtgca ccgagctgca gaccaccatc cacgacatca tcctggagtg cgtgtactgc 120
aagcagcagc tgctgagaag agaggtgtac gacttcgcct tcagagacgg ctgcatcgtg 180
tacagagacg gcaaccccta cgccgtgtgc gacaagtgcc tgaagttcta cagcaagatc 240
agcgagtaca gacactactg ctacagcctg tacggcacca ccctggagca gcagtacaac 300
aagcccctgt gcgacctgct gatcagatgc atcaacagac agaagcccct gtgccccgag 360
gagaagcaga gacacctgga caagaagcag agattccaca acatcagggg cagatggacc 420
ggcagatgca tgagctgctg cagaagcagc agaaccagaa gagagaccca gctgatgcac 480
ggcgacaccc ccaccctgca cgagtacatg ctggacctgc agcccgagac caccgacctg 540
tacggctacg gccagctgaa cgacagctcc gaggaggagg acgagatcga cggccccgcc 600
ggccaggccg agcccgacag agcccactac aacatcgtga ccttctgctg caagtgcgac 660
agcaccctga gactgtgcgt gcagagcacc cacgtggaca tcagaaccct ggaggacctg 720
ctgatgggca ccctgggcat cgtgtgcccc atctgcagcc agaagccctg a 771
<210>3
<211>771
<212>DNA
<213>HPV
<220>
<221>定点诱变融合基因
<222>(1)..(771)
<400>3
atgcaccaga agagaaccgc catgttccag gacccccagg agagacccag aaagctgccc 60
cagctgtgca ccgagctgca gaccaccatc cacgacatca tcctggagtg cgtgtactgc 120
aagcagcagc tgctgagaag agaggtgtac gacttcgcct tcagagacgg ctgcatcgtg 180
tacagagacg gcaaccccta cgccgtgtgc gacaagtgcc tgaagttcta cagcaagatc 240
agcgagtaca gacactactg ctacagcctg tacggcacca ccctggagca gcagtacaac 300
aagcccctgt gcgacctgct gatcagatgc atcaacagac agaagcccct gtgccccgag 360
gagaagcaga gacacctgga caagaagcag agattccaca acatcagggg cagatggacc 420
ggcagatgca tgagctgctg cagaagcagc agaaccagaa gagagaccca gctgatgcac 480
ggcgacaccc ccaccctgca cgagtacatg ctggacctgc agcccgagac caccgacctg 540
tacggctacg gccagctgaa cgacagctcc gaggaggagg acgagatcga cggccccgcc 600
ggccaggccg agcccgacag agcccactac aacatcgtga ccttcggctg caagtgcgac 660
agcaccctga gactgtgcgt gcagagcacc cacgtggaca tcagaaccct ggaggacctg 720
ctgatgggca ccctgggcat cgtgtgcccc atctgcagcc agaagccctg a 771
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<211>771
<212>DNA
<213>HPV
<220>
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<212>PRT
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<220>
<221>定点诱变融合蛋白
<222>(1)..(256)
<400>5
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1 5 10 15
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20 25 30
Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu
35 40 45
Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp Gly Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly
50 55 60
Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile
65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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Thr Thr Asp Leu Tyr Gly Tyr Gly Gln Leu Asn Asp Ser Ser Glu Glu
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln Lys Pro
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<211>256
<212>PRT
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<220>
<221>定点诱变融合蛋白
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<220>
<221>定点诱变融合蛋白
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245 250 255
Claims (10)
1.一种密码子优化型的HPV16 E6-E7融合基因，该融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.消除潜在致癌性的密码子优化型融合基因，该融合基因是在对权利要求1所述融合基因定点诱变制备得到的，定点诱变后的融合基因所编码的氨基酸序列中的位点突变如下：i)L57G和C113R，以及C182G和E184G；或者ii)L57G和C113R，以及C182G、E184G和C216G；或者iii)L57G和C113R，以及C182G、E184G、C216G和C249G。
3.权利要求2所述的融合基因，该融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
4.权利要求2所述的融合基因，该融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
5.权利要求2所述的融合基因，该融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
6.权利要求2所述融合基因编码的HPV16 E6-E7融合蛋白。
7.权利要求6所述的融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。
8.权利要求6所述的融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。
9.权利要求6所述的融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示。
10.权利要求1-5中任一项所述的融合基因在制备HPV16DNA疫苗侯选抗原基因中的用途。
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