CN109706144A - 一种治疗性hpv核酸疫苗 - Google Patents

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吴必杰
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Abstract

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种治疗性HPV核酸疫苗及其制备方法。本发明的HPV E6/E7微环DNA中包含HPV16和HPV18亚型的E6和E7蛋白的核苷酸序列，并通过对E6和E7序列的剪切和重排消除其致癌能力；通过在E6和E7重排序列上游增加Flt3L序列区，增强了HPV E6/E7的免疫原性。同时，本发明采用的微环DNA具有以下优点：1)不整合入宿主细胞基因组，不会诱发新的突变，较病毒载体更为安全；2)可在工程细菌内大量扩增，制备工艺简单，产业化生产成本低；3)表达外源基因较传统质粒稳定，高效。本发明的HPV E6/E7微环DNA用于制备疫苗对于HPV感染的治疗有重要意义。

Description

一种治疗性HPV核酸疫苗
本专利为发明“一种治疗性HPV核酸疫苗”的分案申请，原案申请号为：201810186910.1，申请日期为20180307。
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种治疗性HPV核酸疫苗。
背景技术
宫颈癌占女性妇科恶性肿瘤的第二位，现已成为威胁女性健康的重要疾患，中国每年死于宫颈癌的人数将近5万，宫颈癌的病因研究一直为国内外学者所重视，研究发现引起宫颈癌的关键是HPV的感染。HPV属于乳头瘤病毒科乳头瘤病毒属，是球形、双链环状DNA病毒。HPV主要通过直接或间接接触污染物品或通过性传播感染人类。HPV的感染有宿主特异性和组织特异性，只能感染人类的皮肤和粘膜受损的基底细胞。
HPV至今已鉴定明确的大约有200多个亚型，根据其致病和预后不同又可分为高危型HPV(HR-HPV)和低危型HPV(LR-HPV)，其中HR-HPV 15种，包括HR-HPV16、18、31、33、35、39、45、5l、52、56、53、58型等，感染后可引起癌前病变和宫颈癌。其中HPV16和HPV18是最主要的流行株。HPV 16型和HPV 18型可导致约70％的宫颈癌病例、80％的肛门癌、60％的阴道肿瘤和40％的外阴癌。只有持续的HR-HPV的感染才是宫颈癌的主要因素。
HR-HPV的持续感染，使HR-HPV DNA与宿主宫颈基底膜细胞DNA整合，引起HR-HPVE2片段(E2基因参与转录调节，E2蛋白是主要的病毒转录因子)的缺失，E2片段的缺失加快宫颈病变的进展，增加恶性转化的可能性，主要原因是E2片段的缺失引起HPV E6/E7mRNA表达，E6/E7蛋白促进﹑维持HR-HPV DNA与宫颈基底细胞DNA整合，使宫颈基底细胞异常增生，HPVE6/E7mRNA干扰正常细胞周期，导致细胞基因组不稳定，转录生成的E6/E7蛋白，可以灭活抑癌蛋白P53、RB和P21等，使正常的宿主细胞向恶性方向转化，E6/E7蛋白可以使HPV逃避宿主的免疫监视以及干扰机体免疫反应。E6/E7蛋白为癌蛋白，因此可以针对E6/E7蛋白开发治疗HPV感染的药物，以防发展为宫颈癌。
DNA疫苗，是将外源目的基因构建于真核表达载体，可直接注射到动物体内的第三代疫苗。其使外源基因在活体内表达，产生的抗原激活机体的免疫系统，从而诱导特异性的体液免疫和细胞免疫应答。
目前预防性疫苗Gardasil/Cervarix可有效预防HPV感染，但对于已有HPV感染或癌前病变者并无明显治疗作用，故有必要开发针对HPV感染相关癌前病变的治疗性疫苗。
因此本发明开发一种治疗HPV感染的HPV E6/E7微环DNA疫苗，E6/E7的致癌能力已被消除，并增强了其免疫原性，并且所用的微环DNA(MC)是安全、高效的理想载体。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种HPV E6/E7核苷酸片段，其消除E6/E7致癌能力，并保存E6/E7的免疫原性。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
本发明选择了HPV最主要的流行株HPV16和HPV18，通过对其编码E6和E7蛋白的核苷酸序列的剪切和重排消除其编码的蛋白的致癌能力，同时保留了E6和E7的抗原决定簇，保持其免疫原性。
具体为：
HPV E6/E7核苷酸片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示。其中SEQ ID NO:1为HPV16E6/E7的核苷酸片段，SEQ ID NO:2为HPV18E6/E7的核苷酸片段，SEQ ID NO:3为HPV16/18E6/E7的核苷酸片段。
三种HPV E6/E7核苷酸片段编码三种氨基酸序列的三维结构变形的E6/E7融合多肽。
本发明首先对HPV E6、E7的抗原决定簇进行分析，确定其抗原决定簇。后将抗原决定簇的位置重排，并确认重排后的融合多肽消除了致癌能力。经过筛选，上述SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的核苷酸序列对应的融合多肽符合既保留免疫原性又消除致癌能力的要求。
作为优选的方案，HPV E6/E7核苷酸片段的核苷酸序列为SEQ ID NO:3所示。
本发明的目的之二在于提供一种目的一的核苷酸编码的融合蛋白，其由HPV E6/E7蛋白剪切重排得到，消除了E6/E7蛋白的致癌能力，并保留E6/E7蛋白的免疫原性。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
融合蛋白由目的一的HPV E6/E7核苷酸片段编码得到。
本发明的融合蛋白为三维结构变形的E6/E7融合多肽。
本发明的目的之三在于提供一种包含目的一HPV E6/E7片段的DNA重组片段，以及该DNA片段编码的融合蛋白。上述DNA片段包含能增强HPV E6/E7重组片段的免疫原性的免疫增前肽序列。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
一段包含目的一HPV E6/E7片段的DNA重组片段，包含信号肽序列区、Flt3L序列区、目的一的HPV E6/E7片段，其中信号肽序列区、Flt3L序列区、目的一的HPV E6/E7片段依次连接；Flt3L序列区的的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
本发明的E6/E7融合多肽是在细胞核内表达的蛋白，其免疫力弱。因此，由信号肽序列表达的信号肽诱导三维结构变形的E6/E7融合蛋白分泌至细胞外，从而增强抗原特异性体液免疫应答及细胞免疫应答。
上述信号肽可使用包括哺乳动物等的高等真核细胞内的信号肽，如tPA(组织型纤溶酶原激活物)、HSV gDs，或可使用生长激素等的分泌信号序列。作为优选的方案，上述信号肽使用tPA。
进一步，本发明的tPA信号肽序列区的核苷酸序列为SEQ ID NO:7所示。
免疫增强肽指激活与免疫应答相关的细胞(如，树突状细胞等)以增强免疫应答的肽。Flt3L为本发明的免疫增强肽，用于增强HPV-E6/E7重组片段的免疫原性。
作为优选的方案，目的三的DNA重组片段还包含连接区，所述连接区连接Flt3L序列区和目的一的片段。
进一步优选的，上述连接区的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
作为优选的方案，目的三的DNA重组片段还包含标签区，所述标签区与目的一的片段连接并位于其下游。
进一步优选的，上述标签区的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
作为优选的方案，上述目的三的DNA重组片段尾端还包含终止密码子。
综上所述，目的三的DNA重组片段最优的连接方案为：tPA信号肽序列区-Flt3L序列区-连接区-HPV16/18E6/E7片段-his标签区-终止密码子，核苷酸序列为SEQ ID NO:8所示。该DNA片段编码的融合蛋白不能灭活抑癌蛋白P53、RB和P21等，并具有免疫原性，可引起免疫应答反应。
本发明的目的之四在于提供一种包含目的三DNA重组片段的重组微环DNA，使用的微环DNA是安全、高效的理想载体。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
目的三的DNA重组片段使用的载体为微环DNA，其采用的微环DNA是亲本质粒(parentalplasmid，PP)体内位点特异性重组的产物。在携带真核表达框的亲本质粒两侧插入重组酶识别位点，诱导体内相关重组酶表达，该重组酶将识别位点中间的DNA序列切断，亲本质粒被分成2个超螺旋分子，即具有复制功能的小质粒(miniplasmid，MP)和携带真核表达框的微环(minicircle，MC)DNA。
微环DNA是传统质粒在大肠杆菌中通过位点特异性重组得到的一种新颖的小环超螺旋表达框，其缺乏抗性标记基因、复制原点等细菌序列，增强了在临床应用上的安全性，可在体内长期表达高水平的转基因产物。MC在结构、转基因表达的持久性、细胞内的稳定性上，与共价键密闭环状DNA(cccDNA)相同，使MC成为安全、高效的理想载体。
与传统质粒和病毒载体比较，微环DNA在哺乳动物细胞内表达外源基因具有一系列独特的优势：1)不整合入宿主细胞基因组，不会诱发新的突变，较病毒载体更为安全；2)可在工程细菌内大量扩增，制备工艺简单，产业化生产成本低；3)去除了传统质粒中的抑制信号，表达外源基因较传统质粒稳定，高效。
微环DNA包含WPRE元件(美洲旱獭肝炎病毒翻译后调节元件)，属于转录后调节元件，可以显著提高目标基因的表达。转录后调控元件的优化是DNA疫苗优化设计的一种策略。可以显著地增强缺失内含子的抗原基因的表达，同时诱导出理想的免疫反应，具有以顺式作用方式调控以及位置灵活可变的特点。具体机理包括可以促进转录物出核，还可以通过上调初级转录物的多聚腺苷化，来增加胞内信使RNA总量，最终改进转移基因的表达效率。
因此，本发明的重组微环DNA具有安全、高效、制备简单、易于产业化的优点。
本发明的目的之五在于提供一种目的四的重组微环DNA的制备方法，其制备简单，易于工业化生产。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
目的四的重组微环DNA的制备方法包括以下步骤：
1)设计两端加BglII和SalI酶切位点的目的三的HPV E6/E7重组片段，并合成，得目的基因；
2)用BglII和SalI同时双酶切步骤1)的目的基因和ZY781载体，回收，连接，即得亲本质粒；
3)用上述亲本质粒转化大肠杆菌ZYCY10P3S2T，过夜培养，质粒酶切及测序验证插入正确的片段；
4)将上述菌液接入含kana的TB培养液中，37℃过夜培养，取过夜培养的菌液与Minicle Induction Mix按等体积混合，于32℃反应5-8h，反应结束后，离心提质粒，即获得含有权利要求3所述DNA片段的重组微环DNA；
其中，步骤4)中Minicle Induction Mix的制备方法为：向100ml LB培养基中加入1M NaOH 4ml和20％阿拉伯糖200μl，混合后经0.22μm滤膜过滤。
本发明的目的之六在于提供一种目的四的重组微环DNA在制备治疗HPV感染药物的用途。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
本发明的重组微环DNA已消除HPV E6/E7的致癌性，并增强HPV E6/E7重组片段的免疫原性，作为载体的微环DNA能够在体内稳定表达，并且更为安全，因此，可用于制备治疗HPV感染的药物。
作为优选的方案，上述治疗HPV感染的药物为重组微环DNA核酸疫苗。
本发明的目的之七在于提供一种目的一的核苷酸片段在用于制备治疗HPV感染的药物的用途。
作为优选的方案，上述治疗HPV感染的药物为核酸疫苗。
本发明的目的之八在于提供一种目的三的DNA重组片段在用于制备治疗HPV感染的药物的用途。
作为优选的方案，上述治疗HPV感染的药物为核酸疫苗。
本发明的目的之九在于提供一种目的二的融合蛋白在用于制备治疗HPV感染的药物的用途。
本发明的目的之十在于提供一种目的三的融合蛋白在用于制备治疗HPV感染的药物的用途。
本发明的目的之十一在于提供一种药物，其有效成分为目的四的重组微环DNA，并包含赋予它的药学的载体。
作为优选的方案，上述药物为核酸疫苗。
本发明的有益效果在于：本发明提供的HPV E6/E7片段，通过对E6和E7序列的剪切和重排消除其致癌能力；本发明的HPV E6/E7的重组片段通过HPV E6/E7片段上游增加Flt3L序列区，增强了HPV E6/E7的免疫原性。本发明采用的微环DNA具有以下优点：1)不整合入宿主细胞基因组，不会诱发新的突变，较病毒载体更为安全；2)可在工程细菌内大量扩增，制备工艺简单，产业化生产成本低；3)表达外源基因较传统质粒稳定，高效。本发明的HPV E6/E7微环DNA可用于制备治疗HPV感染的核酸疫苗，对于宫颈癌的预防有重要意义。
具体实施方式
以下将对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1微环DNA的制备
1.试剂准备
1)TB培养液：将蛋白胨12g、酵母提取物24g和甘油4ml溶解在900ml水中。待各组分溶解后高压灭菌。冷却至60℃，再加入100ml经高压灭菌或用0.22μm滤膜过滤的170mmol/LKH2PO4和0.72mol/L K 2HPO4的混合液，即得。
2)Minicle Induction Mix：向100ml LB中加入1M NaOH 4ml和20％阿拉伯糖200μl，混合后经0.22μm滤膜过滤。
2.重组微环DNA的制备
1)设计两端加BglII和SalI酶切位点的SEQ ID NO:8所示的HPV E6/E7重组片段，并合成，得目的基因；
2)将上述目的基因片段和ZY781载体用BglII和SalI同时双酶切，胶回收后按常规方法将目的片段克隆至载体ZY781的多克隆位点上，得重组质粒，即为亲本质粒(PP)；
3)用上述亲本质粒转化大肠杆菌ZYCY10P3S2T，过夜培养，提取质粒后质粒酶切电泳及质粒测序验证插入正确的片段；
4)将上述测序正确的大肠杆菌接入含50μg/ml kana的TB培养液中，37℃，250rpm过夜培养；
5)取过夜培养的菌液与Minicle Induction Mix按等体积混合，于32℃，250rpm反应5h-8h。反应完结束后，离心，提取质粒，即为重组微环DNA质粒。
获得的重组微环DNA已消除HPV E6/E7的致癌性，并增强HPV E6/E7重组片段的免疫原性，作为载体的微环DNA能够在体内稳定表达，并且更为安全，因此，可用于制备治疗HPV感染的核酸疫苗。
3.重组微环DNA的大量制备
1)菌株大量培养：将上述重组微环DNA的制备中步骤3)已转入亲本质粒并测序正确的大肠杆菌ZYCY10P3S2T大量发酵培养；
2)微环DNA生成：将上述大肠杆菌接入含50μg/ml kana的TB培养液中，37℃，250rpm过夜培养后与Minicle Induction Mix按等体积混合，于32℃，250rpm反应5h-8h。反应完结束后，离心，提取质粒，即为重组微环DNA。
制备得到的重组微环DNA可作为治疗性HPV感染的核算疫苗。
本发明的HPV E6/E7微环DNA疫苗用于治疗HPV感染，具有在体内安全、稳定的优点，且治疗效果明显。重组微环DNA制备简单，成本较低，适用于产业化生产。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
<110>江苏润洁生物科技有限公司
<120>一种治疗性HPV核酸疫苗
<160> 8
<170> PatentIn Version 2.1
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tgctacgaga ggccctacaa gctgcccgac ctgtgcaccg agctgtacaa cctgctgatc 780
aggtgcctga ggtgccagaa gcccggcggc ggcggcagcg gcggcggcgg cagcggcggc 840
ggcggcagcg ccttcaagga cctgttcgtg gtgtacaggg acagcatccc ccacgccgcc 900
tgccacaagt gcatcgactt ctacagcagg ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc 960
ggcggcggcg gcagcctgca ggacatcgag atcacctgcg tgtactgcaa gaccgtgctg 1020
gagctgaccg aggtgttcga gggcggcggc ggcagcggcg gcggcggcag cggcggcggc 1080
ggcagcgagc tgaggcacta cagcgacagc gtgtacggct acaggggcca gtgccacagc 1140
tgctgcaacc ccaaggccac cctgcaggac atcgtgctgc acctggacgg cgtgaaccac 1200
cagcacctgc ccgccggcgg cggcggcagc ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc 1260
gacctgaggg ccttccagca gctgttcctg aacaccctga gcttcgtgtg cccctggggc 1320
ggcggcggca gcggcggcgg cggcagcggc ggcggcggca gcaggcacac catgctgtgc 1380
atgtgctgca agtgcgaggc caggatcgag ctggtggtgg agagcggcgg cggcggcagc 1440
ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc aacgagatcc ccgtggacct gctgtgccac 1500
gagcag 1506
<210> 4
<211> 471
<212> DNA
<213>Flt3L序列
<400> 4
atcacccagg actgctcctt ccaacacagc cccatctcct ccgacttcgc tgtcaaaatc 60
cgtgagctgt ctgactacct gcttcaagat tacccagtca ccgtggcctc caacctgcag 120
gacgaggagc tctgcggggg cctctggcgg ctggtcctgg cacagcgctg gatggagcgg 180
ctcaagactg tcgctgggtc caagatgcaa ggcttgctgg agcgcgtgaa cacggagata 240
cactttgtca ccaaatgtgc ctttcagccc ccccccagct gtcttcgctt cgtccagacc 300
aacatctccc gcctcctgca ggagacctcc gagcagctgg tggcgctgaa gccctggatc 360
actcgccaga acttctcccg gtgcctggag ctgcagtgtc agcccgactc ctcaaccctg 420
ccacccccat ggagtccccg gcccctggag gccacagccc cgacagcccc g 471
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213>连接区
<400> 5
ggcggcggca gcggcgat 18
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213>HIS标签
<400> 6
catcatcacc atcatcat 18
<210> 7
<211> 69
<212> DNA
<213> 信号肽tPa
<400> 7
atggatgcta tgaaacgggg cctgtgctgc gtgctgctcc tgtgcggcgc tgtgtttgtg 60
agccctagc 69
<210> 8
<211>2085
<212> DNA
<213> HPV16/18 E6/E7重组片段
<400> 8
atggatgcta tgaaacgggg cctgtgctgc gtgctgctcc tgtgcggcgc tgtgtttgtg 60
agccctagca tcacccagga ctgctccttc caacacagcc ccatctcctc cgacttcgct 120
gtcaaaatcc gtgagctgtc tgactacctg cttcaagatt acccagtcac cgtggcctcc 180
aacctgcagg acgaggagct ctgcgggggc ctctggcggc tggtcctggc acagcgctgg 240
atggagcggc tcaagactgt cgctgggtcc aagatgcaag gcttgctgga gcgcgtgaac 300
acggagatac actttgtcac caaatgtgcc tttcagcccc cccccagctg tcttcgcttc 360
gtccagacca acatctcccg cctcctgcag gagacctccg agcagctggt ggcgctgaag 420
ccctggatca ctcgccagaa cttctcccgg tgcctggagc tgcagtgtca gcccgactcc 480
tcaaccctgc cacccccatg gagtccccgg cccctggagg ccacagcccc gacagccccg 540
ggcggcggca gcggcgatag gaagctgccc cagctgtgca ccgagggcgg cggcggcagc 600
ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc tacaacaagc ccctgtgcga cctgctgatc 660
aggtgcatca actgccagaa gcccctgtgc cccggcggcg gcggcagcgg cggcggcggc 720
agcggcggcg gcggcagcaa cccctacgcc gtgtgcgaca agtgcctgaa gttctacagc 780
aagggcggcg gcggcagcgg cggcggcggc agcggcggcg gcggcagcca gaccaccatc 840
cacgacatca tcctggagtg cgtgtactgc aagcagcagc tgctgaggag ggaggtgtac 900
gacttcgcct tcagggacct gtgcatcgtg tacggcggcg gcggcagcgg cggcggcggc 960
agcggcggcg gcggcagcag cgagtacagg cactactgct acagcctgta cggcaggtgc 1020
atgagctgct gcaggaccct gcacgagtac atgctggacc tgggcggcgg cggcagcggc 1080
ggcggcggca gcggcggcgg cggcagccac tacaacatcg tgaccttctg ctgcaagtgc 1140
gacagcaccc tgaggctgtg cgtgcagagc acccacgtgg acatcggcgg cggcggcagc 1200
ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc ctgatgggca ccctgggcat cgtgtgcccc 1260
atcaccaccg acctgtactg ctacgagagg ccctacaagc tgcccgacct gtgcaccgag 1320
ctgtacaacc tgctgatcag gtgcctgagg tgccagaagc ccggcggcgg cggcagcggc 1380
ggcggcggca gcggcggcgg cggcagcgcc ttcaaggacc tgttcgtggt gtacagggac 1440
agcatccccc acgccgcctg ccacaagtgc atcgacttct acagcagggg cggcggcggc 1500
agcggcggcg gcggcagcgg cggcggcggc agcctgcagg acatcgagat cacctgcgtg 1560
tactgcaaga ccgtgctgga gctgaccgag gtgttcgagg gcggcggcgg cagcggcggc 1620
ggcggcagcg gcggcggcgg cagcgagctg aggcactaca gcgacagcgt gtacggctac 1680
aggggccagt gccacagctg ctgcaacccc aaggccaccc tgcaggacat cgtgctgcac 1740
ctggacggcg tgaaccacca gcacctgccc gccggcggcg gcggcagcgg cggcggcggc 1800
agcggcggcg gcggcagcga cctgagggcc ttccagcagc tgttcctgaa caccctgagc 1860
ttcgtgtgcc cctggggcgg cggcggcagc ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc 1920
aggcacacca tgctgtgcat gtgctgcaag tgcgaggcca ggatcgagct ggtggtggag 1980
agcggcggcg gcggcagcgg cggcggcggc agcggcggcg gcggcagcaa cgagatcccc 2040
gtggacctgc tgtgccacga gcagcatcat caccatcatc attaa 2085

Claims (10)

1.重组微环DNA，其特征在于，所述微环DNA包含DNA重组片段；
所述DNA重组片段包含信号肽序列区、Flt3L序列区、HPV E6/E7片段，其中信号肽序列区、Flt3L序列区、连接区、权利要求1所述的HPV E6/E7片段依次连接；
所述HPV E6/E7片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示；
所述Flt3L序列区的的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
2.根据权利要求1所述的重组微环DNA，其特征在于，所述连接区的核苷酸序列如SEQID NO:5所示。
3.根据权利要求1所述的重组微环DNA，其特征在于，所述DNA重组片段还包含标签区，所述标签区与所述的HPV E6/E7片段连接并位于其下游。
4.根据权利要求3所述的重组微环DNA，其特征在于，所述标签区的核苷酸序列如SEQID NO:6所示。
5.根据权利要求1所述的重组微环DNA，其特征在于，所述DNA片段尾端还包含终止密码子。
6.根据权利要求1所述的重组微环DNA，其特征在于，所述信号肽序列区为选自组织型纤溶酶原激活物tPa、HSV gDs及生长激素的分泌信号肽对应的核苷酸序列中的一种或多种。
7.权利要求1-6任一项所述的重组微环DNA的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)设计两端加BglII和SalI酶切位点的所述DNA重组片段，并合成，得目的基因；
2)用BglII和SalI同时双酶切步骤1)的目的基因和ZY781载体，回收，连接，即得亲本质粒；
3)用上述亲本质粒转化大肠杆菌ZYCY10P3S2T，过夜培养，质粒酶切及测序验证插入正确的片段；
4)将上述菌液接入含kana的TB培养液中，37℃培养后与Minicle Induction Mix按等体积混合，于32℃反应5-8h，反应结束后，离心提质粒，即获得含有权利要求3所述DNA片段的重组微环DNA；
其中，步骤4)中Minicle Induction Mix的制备方法为：向100ml LB培养基中加入1MNaOH 4ml和20％阿拉伯糖200μl，混合后经0.22μm滤膜过滤。
8.权利要求1-6任一项所述的重组微环DNA在用于制备治疗HPV感染的药物的应用。
9.一种治疗HPV感染的药物，其特征在于，所述药物为权利要求1-6任一项所述的重组微环DNA以及赋予它的药学的载体。
10.根据权利要求9所述的药物，其特征在于，所述药物为核酸疫苗。
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