CN103656682B - 抗o型口蹄疫多肽‑核酸双效类病毒颗粒疫苗及制备方法 - Google Patents
抗o型口蹄疫多肽‑核酸双效类病毒颗粒疫苗及制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
抗O型口蹄疫多肽‑核酸双效类病毒颗粒疫苗及制备方法，涉及口蹄疫疫苗。提供一种抗O型口蹄疫的多肽‑核酸类病毒颗粒双效疫苗、疫苗的氨基酸序列和DNA序列、疫苗的制备方法和应用。所述疫苗具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。制备方法：将MS2的成熟酶蛋白和插入O型口蹄疫病毒的抗原决定簇第141～160位氨基酸基因片段的外壳蛋白基因一起连接到pET28a表达载体中构成如SEQ ID NO.2所示的DNA序列；设计引物将口蹄疫病毒3D基因如SEQ ID NO.3所示的序列的反义链扩增出来，连接到pCDF‑Duet‑1表达载体的MCS1处；然后将两个共表达载体转化到BL21(DE3)中。
Description
技术领域
本发明涉及口蹄疫疫苗，特别是涉及一种抗O型口蹄疫多肽-核酸双效类病毒颗粒疫苗及其制备方法。
背景技术
口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的危害70多种偶蹄目动物的一种急性、高度接触性、热性传染病，以传播迅速、感染性高而著称。世界动物卫生组织（OIE）和许多国家都将其列为必须报告的传染病。我国规定口蹄疫为一类动物传染病。一旦一个地区爆发口蹄疫，如果应急不当，就会大规模地流行至许多地区或国家，这给地区或国家的畜牧业造成严重的危害，带来巨大的经济损失。
口蹄疫病毒的基因型和表型具有高变异性，主要有O型、A型、C型、Asia I型、SATI型（南非I型）、SATⅡ型（南非Ⅱ型）、SATⅢ型（南非Ⅲ型）等7个血清型，此外还有80多种亚型。血清型间交叉免疫现象，即使同一血清型的不同亚型的免疫情况也不相同，这给口蹄疫的防治带来了极大的困难。
在许多国家和地区，疫苗接种是预防和控制此病的主要措施。目前广泛使用的依然是传统的灭活苗，它在一定程度上对口蹄疫的控制和预防起到了积极作用，极大地降低了该病带来的经济损失。灭活疫苗虽具有较好的免疫原性，但是也存在着不少缺点，存在很大的安全隐患，譬如生产各个环节操作要求严格，防止被致病物质污染并杜绝病毒泄漏；灭活苗免疫的动物与感染FMD的动物区分不开；同时生产需要FMDV的存在。综上所述，口蹄疫的防治需要更加安全有效的新型疫苗的出现。
类病毒颗粒（VLPs）疫苗是利用病毒载体构建的一类可以在体内和（或）体外表达成一种可以自我组装成类病毒外壳蛋白结构的一类新型疫苗。因为这种颗粒具有大小合适，可能被免疫系统识别，进而产生免疫反应；机体内半衰期较长；没有病毒核酸的存在，安全性高等优点，使得该疫苗的研发受到广大疫苗开发人员的青睐。多种在开发的类病毒颗粒疫苗经实验证实具有很不错的免疫效果。
不同亚型的口蹄疫病毒同源性很低，口蹄疫病毒的高变异型不仅让研发者感到头疼，还给例行的免疫接种带来了很多困难。口蹄疫病毒的3D基因编码的是口蹄疫病毒RNA复制所依赖的RNA聚合酶（RdRp），该酶不仅对口蹄疫病毒的复制起到关键作用（Pengyan,W.,Yan,R.,Zhiru,G.&Chuangfu,C.Inhibition of foot-and-mouth disease virusreplication in vitro and in vivo by small interfering RNA.Virology Journal5,86(2008)），此外，它还没有亚型的差异。不少的实验证实以3D基因为靶点，可以很好地抑制口蹄疫病毒的复制（Chen,W.et al.Adenovirus-mediated RNA interference againstfoot-and-mouth disease virus infection both in vitro and in vivo.Journal ofvirology2006，80,3559-3566）。申请人针对3D基因的不同位点设计的几个mi RNA经实验证实也能很好的降低3D基因的表达抑制口蹄疫病毒的增殖。
申请人前期的研究发现：如果将O型口蹄疫病毒VP1蛋白的第141-160位氨基酸的编码基因插入到MS2外壳蛋白基因的特定位点，所表达出的O型口蹄疫的关键的抗原决定簇展示在MS2类病毒颗粒表面的VLPs具有很好的免疫原性，在此基础上申请人又引入了一个共表达系统，一个表达载体上连接有可以自我组装成口蹄疫类病毒颗粒疫苗的基因，另一个共表达载体上连接有针对口蹄疫病毒的增殖具有很好感染效果的3D基因的反义核酸。此共表达系统可以表达出这类类病毒颗粒蛋白：表面既展示有抗原决定簇，内部还包裹着能有效干扰病毒复制的反义RNA。经过体内体外的研究发现，该类病毒颗粒多肽-核酸双效疫苗不仅可以引起机体产生有效的免疫应答，还能很快地抑制病毒在体内的增殖，有效地保护机体免受病毒侵害。
这类疫苗的首次提出不仅为口蹄疫的防治提供了一个新的希望，再经过一些改进和大型动物的实验将其真正开发成有效的疫苗。此外该疫苗的研究还为其他病毒疾病疫苗的研发提供了可借鉴的思路。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种能够对口蹄疫进行预防治疗的一类安全有效的抗O型口蹄疫的多肽-核酸类病毒颗粒双效疫苗。
本发明的第二个目的在于提供抗O型口蹄疫的类病毒颗粒多肽-核酸双效疫苗的氨基酸序列和DNA序列。
本发明的第三个目的在于提供一种用于制备抗O型口蹄疫的多肽-核酸类病毒颗粒双效疫苗的安全稳定的共表达系统，里面有可以将口蹄疫抗原决定簇展示到MS2类病毒颗粒表面的原核表达载体28a-CP-VP1，和连接有可以跟MS2的外壳蛋白发生相互作用而被类病毒颗粒包裹其中的3D基因的反义核酸。
本发明的第四个目的在于提供抗O型口蹄疫的多肽-核酸类病毒颗粒双效疫苗的应用。
所述抗O型口蹄疫的多肽-核酸类病毒颗粒双效疫苗具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，该序列包含有MS2外壳蛋白及O型口蹄疫病毒的VP1上优势抗原决定簇序列。所述抗O型口蹄疫的多肽-核酸类病毒颗粒双效疫由SEQ ID NO.2所示的DNA序列编码，此DNA序列包含MS2的成熟酶蛋白基因、外壳蛋白基因和O型口蹄疫病毒的VP1上的优势抗原决定簇基因序列。
所述抗O型口蹄疫的多肽-核酸类病毒颗粒双效疫苗利用大肠杆菌表达，且在大肠杆菌细胞内自主包装为类病毒颗粒结构，以类病毒颗粒形成存在。
所述抗O型口蹄疫的多肽-核酸类病毒颗粒双效疫苗除了表面所展示的O型口蹄疫重要的抗原决定簇外，内部还包裹着口蹄疫病毒的3D基因的反义RNA。该类病毒颗粒内包裹着各种亚型口蹄疫病毒共有的RNA依赖的RNA聚合酶（RdRp）3Dpol的3D基因的反义RNA。该疫苗中包裹的反义RNA序列是具有SEQ ID NO.3所示DNA序列的反义RNA序列或与之同源性较高的序列。
所述抗O型口蹄疫的多肽-核酸类病毒颗粒双效疫苗的DNA序列SEQ ID NO.2的第1254～1316位核苷酸为O型口蹄疫病毒的VP1的第141～160位抗原决定簇氨基酸对应的核苷酸；该氨基酸序列SEQ ID NO.1是将O型口蹄疫病毒VP1的第141～160位优势抗原决定簇氨基酸插入到噬菌体MS2外壳蛋白的第15位氨基酸后面。
用于制备抗O型口蹄疫的多肽-核酸类病毒颗粒双效疫苗的两种共表达载体，一种表达载体含有SEQ ID NO.2所示的DNA序列，或含有与SEQ ID NO.2所示的的DNA序列不完全同源，但能够翻译出SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的DNA序列，另一种表达载体含有SEQID NO.3所示的3D的DNA序列的反义RNA序列，或与之同源性较高的序列。
所述抗O型口蹄疫多肽-核酸双效类病毒颗粒疫苗的制备方法，包括：将MS2的成熟酶蛋白和插入了O型口蹄疫病毒的抗原决定簇第141～160位氨基酸基因片段的外壳蛋白基因一起连接到pET28a表达载体中构成如SEQ ID NO.2所示的DNA序列；设计引物将口蹄疫病毒3D基因如SEQ ID NO.3所示的序列的反义链扩增出来，连接到pCDF-Duet-1表达载体的MCS1处；然后将两个共表达载体转化到BL21(DE3)中；
1）在适宜的培养基、适宜的温度、适宜的振荡条件下培养重组工程菌，通过添加合适的诱导物诱导重组细胞表达并自主包装成类病毒颗粒结构；
2）通过离心，收集经过诱导表达的重组工程菌，反复冻融菌体3次，超声波彻底破碎菌体，15000r/min离心15min，上清即为含类病毒颗粒疫苗的产物；
3）所得表达产物的上清中加入NaCl至终浓度1mol/L，冰浴1h，离心所得的上清中再加入终浓度为10%的PEG8000，冰浴，离心得到类病毒颗粒沉淀，沉淀经氯仿洗涤后再经过蔗糖梯度超速离心得到类病毒颗粒的纯化产物；
4）经蔗糖梯度纯化后的类病毒颗粒即为抗O型口蹄疫多肽-核酸双效类病毒颗粒疫苗。
所述抗O型口蹄疫多肽-核酸双效类病毒颗粒疫苗的应用：该疫苗与相应佐剂混合后通过肌肉注射途径对动物进行免疫。
本发明具有以下突出优点：
1）本发明提供的抗O型口蹄的类病毒颗粒多肽-核酸双效疫苗，免疫后可诱导动物同时产生抗O型口蹄疫的抗体，并且可以抑制体内口蹄疫病毒的增殖。
2）该疫苗制备安全，无灭活疫苗制备过程中存在的安全隐患。
3）该疫苗为类病毒颗粒结构，O型口蹄疫病毒的抗原表位被有效呈递在类病毒颗粒的表面。因为其结构表面规则且有序，可以很好地刺激B、T细胞，引起免疫应答。
4）类病毒颗粒多肽-核酸双效疫苗的结构在体内血清中的半衰期长，稳定性好，有效期长，疫苗运输储存方便、有利于推广使用。
5）展示口蹄疫抗原决定簇的类病毒颗粒大小合适，会很好地被淋巴系统识别，产生免疫抗体。
6）类病毒颗粒多肽-核酸双效疫苗内包裹的3D基因的反义核酸可以增强抗原决定簇的免疫应答，此外还能快速降低口蹄疫病毒的复制和增殖。
附图说明
图1为CP-VP1基因构建示意图。其中pMS27模板中包括MS2的成熟酶蛋白基因、外壳蛋白基因。引物F-1-R98与F-2-F98中都含有部分O型MYA98FMDV的抗原决定簇，且相互间还有19个互补碱基。以U-CP与F-1-R98为引物可以扩增出目的CP-VP1的上游片段，以F-2-F98及D-CP为引物可以扩增出目的CP-VP1的下游片段。以扩增得到的上下游片段等量混合物为模板，以U-CP及D-CP为引物就可以搭桥获得目的CP-VP1基因片段。
图2为28a-CP-VP1和CDF-3D(M)表达载体共转化到BL21(DE3)感受态细胞中，在抗性固体培养基中进行单克隆的挑选。
图3为单克隆的PCR鉴定。单克隆既能扩增出CP-VP1(约1850bp)，也能扩增出3D的反义基因（约1400bp）。
图4为目的基因的蛋白表达SDS-PAGE图。可以看到CP-VP1-RNA大约16ku。
图5为CP-VP1-RNA类病毒颗粒中RNA的稳定性分析。可以看到包裹在VLPs内部的3D基因的反义RNA在DNase和RNase都存在的情况下依然可以稳定存在。
图6为电镜下CP-VP1-RNA的类病毒颗粒图片。用JEM2100透射电子显微镜观察，可以发现视野中是均匀分布的白色的直径大约为65nm类病毒颗粒颗粒。
图7为28a-CP-VP1及CP-VP1-RNA Western blot结果。结果显示CP-VP1和CP-VP1-RNA都能与豚鼠抗O型FMD阳性血清有特异反应。
具体实施方式
以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。
表1为实验过程中所用的的引物及其序列。
表1
1）设计两对引物（表1），利用OE-PCR（overlap extension PCR）技术（参见图1），将口蹄疫病毒的VP1上的抗原决定簇基因片段拼接于MS2外壳蛋白编码基因的特定位点，得到如SEQ ID NO.2所述DNA序列。
2）将SEQ ID NO.2所述DNA序列，通过酶切连接的方法，插入到原核表达载体pET28a的多克隆位点区，通过测序确认连接成功，读码框正确，得到疫苗的表达载体质粒28a-CP-VP1，该载体质粒含有上述SEQ ID NO.2所述DNA序列。
3）上述重组质粒转化到大肠杆菌中，获得重组基因工程菌。所述SEQ ID NO.2能插入到多种类型的表达载体并在相应的宿主细胞中表达，可以构建原核表达载体在原核生物如大肠杆菌中表达，也可以构建酵母表达载体在酵母中表达，还可以构建真核表达载体在哺乳动物细胞中表达。
4)设计引物（表1）U-3D(M)和D-3D(M)，将3D基因（SEQ ID NO.3）的反义链扩增出来，并在3’和5’端都加上了和实施2）中的CP基因可以相互作用的pac位点。连接到原核表达载体pCDF-Duet-1的MCS1处，测序正确的重组质粒命名为CDF-3D(M)。
5）将构建好了的两个重组质粒28a-CP-VP1和CDF-3D(M)共转化到BL21(DE3)的超级感受态细胞中，进行单克隆的挑选（图2）。并对单克隆进行目的基因的PCR鉴定（图3）。
重组工程菌接种于加有卡那抗性的pET28a载体专用培养基中，振荡培养至OD600约0.6，加入IPTG至终浓度为1 mmol/L，诱导目的基因表达（参见图2）。离心收集诱导后的菌体细胞，反复冻融3次，加入约1/10菌液体积的PBS缓冲液重悬菌体，超声波彻底破碎菌体，15000 r/min离心15 min，取上清液，经过NaCl和PEG8 000沉淀后，氯仿洗脱，最后再经过蔗糖梯度离心，纯化得到类病毒颗粒抗O型口蹄疫病毒疫苗。
6）类病毒颗粒的电镜观察。取10 μL纯化的类病毒颗粒疫苗样品，加在铜网的碳膜上，经2％的磷钨酸染色5 min，自然干燥2 h。用JEM2 100透射电子显微镜观察类病毒颗粒疫苗颗粒。磷钨酸染色是负染，背景为黑色，类病毒颗粒为白色（参见图3）。
7）纯化后的28a-CP-VP1类病毒颗粒蛋白，经过SDS-PAGE后进行 Western-blotting 及体外的ELISA实验均发现此类病毒颗粒可以与豚鼠的抗O型FMD阳性血清发生特异反应，证明此类病毒颗粒蛋白有很好的免疫原性（参见图4和图5）。
以下给出具体实施例：
实施例1：MS2片段与O型口蹄疫病毒抗原决定簇融合基因的获得
采用OE-PCR（overlap extension PCR）方法进行融合基因的构建，合成以下U-CP&D-CP 和F-1-R98 & F-2-F98两对引物 （见表1）。
引物中F-1-R98与F-2-F98有19碱基互补(下划线部分)。引物U-CP及引物D-CP分别引入酶切位点NheⅠ和BamHⅠ，以便酶切片段连接入原核表达载体pET28a中。
MS2 可以自我组装成类病毒颗粒的片段的获取：以U-CP与F-1-R98为引物，以以实验室保存的pMS27为模板为模板，扩增出目的序列的上半部分片段，同时以D-CP和F-2-F98为引物，以pMS27为模板扩增出目的序列的下半部分片段。
扩增出的特异性片段，通过1.5％的琼脂糖凝胶电泳后，分别回收；以回收片段为模板，D-CP和U-CP为引物进行第二轮扩增，预计扩增出的长度约为1 850 bp的片段，即是将O型口蹄疫病毒VP1的重要抗原决定簇第141～160位氨基酸的核苷酸的序列插入到MS2的CP蛋白基因的特定位点了，命名为CP-VP1。
以上的PCR扩增均采用高保真酶进行，构建过程见图1。
实施例2：CP-VP1融合基因的原核表达载体构建
CP-VP1融合基因片段，经过双酶切，与同样酶切纯化的原核表达载体pET28a连接，连接产物转化DH5α，从抗性平板上挑取的白色克隆经过酶切、测序鉴定后，正确的克隆分别命名为28a-CP-VP1。
实施例3: CDF-3D(M) 重组质粒的构建
以前期实验过程中合成的3D基因为模板，以U-3D(M)和D-3D(M)为上下游引物，扩增出3D基因的反义核酸，并连接到原核表达载体pCDF-Duet-1的MCS1处，测序正确的重组质粒命名为CDF-3D(M)。
实施例4：类病毒颗粒蛋白的表达、鉴定及纯化
将测序正确的原核表达载体28a-CP-VP1和CDF-3D(M)共转化表达菌株BL21（DE3），鉴定为阳性的克隆接种于加有卡那抗性的LB液体培养基中，振荡培养至OD600＝0.6左右，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，诱导融合基因表达。诱导条件为：温度37℃，转速为160r/min，诱导4h。诱导结束后离心收集菌体细胞，SDS-PAGE电泳检测蛋白表达情况。将经过IPTG诱导表达菌体蛋白进行SDS-PAGE电泳（参见图4），电泳结束后将蛋白电转移至尼龙膜，分别以豚鼠抗O型口蹄疫的血清为第一抗体，以辣根过氧化物酶（HRP）偶联的羊抗豚鼠IgG为第二抗体，进行Western blotting分析，确认表达蛋白具有O型口蹄疫病毒的抗原性（参见图7）。有正确蛋白表达的工程菌株，大量培养，IPTG诱导蛋白表达，条件如上所述，诱导结束后离心收集菌体细胞，反复冻融3次，加入约1/10菌液体积的PBS缓冲液重悬菌体，超声波彻底破碎菌体，15000r/min离心15min，取上清液，然后加入NaCl至终浓度1mol/L，冰浴1h，离心所得的上清中再加入终浓度为10%的PEG8000,冰浴，离心得到类病毒颗粒沉淀。沉淀经氯仿洗涤后再经过蔗糖梯度离心得到类病毒颗粒的纯化产物。
实施例4：电镜观察原核表达的融合蛋白
分别取10μL纯化的类病毒颗粒多肽-核酸双效疫苗样品加在铜网的碳膜上，经2％的磷钨酸染色5min，自然干燥2h。用JEM2100透射电子显微镜观察原核表达重组蛋白自主包装成的VLPs颗粒（图6）。
Claims (4)
1.一种抗O型口蹄疫多肽-核酸双效类病毒颗粒疫苗，其特征在于具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，该序列包含有MS2外壳蛋白及O型口蹄疫病毒的VP1上优势抗原决定簇序列；
所述疫苗的多肽部分由SEQ ID NO.1所示的DNA序列中的编码基因进行编码，此DNA序列包含MS2的成熟酶蛋白基因、外壳蛋白基因和O型口蹄疫病毒的VP1上的优势抗原决定簇基因序列；
所述疫苗利用大肠杆菌表达，且在大肠杆菌细胞内自主包装为类病毒颗粒结构，以类病毒颗粒形成存在；
类病毒颗粒除了表面所展示的O型口蹄疫重要的抗原决定簇外，内部还包裹着口蹄疫病毒的3D基因的反义RNA；
该类病毒颗粒内包裹着各种亚型口蹄疫病毒共有的RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)3Dpol的3D基因的反义RNA；
所述疫苗中包裹的反义RNA序列是SEQ ID NO.3所示DNA序列的反义RNA序列。
2.如权利要求1所述一种抗O型口蹄疫多肽-核酸双效类病毒颗粒疫苗，其特征在于该DNA序列的第1254～1316位核苷酸为O型口蹄疫病毒的VP1的第140～160位抗原决定簇氨基酸对应的核苷酸；该氨基酸序列是将O型口蹄疫病毒VP1的第140～160位优势抗原决定簇氨基酸插入到噬菌体MS2外壳蛋白的第15位氨基酸后面。
3.用于制备抗O型口蹄疫多肽-核酸双效类病毒颗粒疫苗的两种共表达载体，其特征在于，一种表达载体含有SEQ ID NO.1所示的DNA序列，或含有与SEQ ID NO.1所示的DNA序列不完全同源，但能够翻译出SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的DNA序列，另一种表达载体含有SEQ ID NO.3所示的3D的DNA序列的反义RNA序列。
4.如权利要求1或2所述一种抗O型口蹄疫多肽-核酸双效类病毒颗粒疫苗的制备方法，其特征在于，该方法包括：将MS2的成熟酶蛋白和插入了O型口蹄疫病毒的抗原决定簇第140～160位氨基酸基因片段的外壳蛋白基因一起连接到pET28a表达载体中构成如SEQ IDNO.1所示的DNA序列；设计引物将序列为SEQ ID NO.3所示的口蹄疫病毒3D基因的反义链扩增出来，连接到pCDF-Duet-1表达载体的MCS1处，然后将两个共表达载体转化到BL21(DE3)中；
a)在适宜的培养基、适宜的温度、适宜的振荡条件下培养重组工程菌，通过添加合适的诱导物诱导重组细胞表达并自主包装成类病毒颗粒结构；
b)通过离心，收集经过诱导表达的重组工程菌，反复冻融菌体3次，超声波彻底破碎菌体，15 000r/min离心15min，上清即为含类病毒颗粒疫苗的产物；
c)所得表达产物的上清中加入NaCl至终浓度1mol/L，冰浴1h，离心所得的上清中再加入终浓度为10％的PEG8 000，冰浴，离心得到类病毒颗粒沉淀，沉淀经氯仿洗涤后再经过蔗糖梯度超速离心得到类病毒颗粒的纯化产物；
d)经蔗糖梯度纯化后的类病毒颗粒即为所述抗O型口蹄疫多肽-核酸双效类病毒颗粒疫苗。
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