CN102178948B - 治疗和/或预防宫颈癌的基因工程药物 - Google Patents
治疗和/或预防宫颈癌的基因工程药物 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102178948B CN102178948B CN 201110049989 CN201110049989A CN102178948B CN 102178948 B CN102178948 B CN 102178948B CN 201110049989 CN201110049989 CN 201110049989 CN 201110049989 A CN201110049989 A CN 201110049989A CN 102178948 B CN102178948 B CN 102178948B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sequence
- plasmid
- recombiant plasmid
- recombinant adenovirus
- obtains
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种治疗和/或预防宫颈癌的基因工程药物。本发明提供的疫苗，其活性成分由含有序列表的序列2所示蛋白质的编码基因的重组质粒甲和表达所述序列表的序列2所示蛋白质的重组腺病毒组成。本发明提供的疫苗对于宫颈癌的治疗和预防均由显著效果，具有很大的临床应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学和疫苗领域，具体涉及一种治疗和/或预防宫颈癌的基因工程药物。
背景技术
Human papillomavirus病毒(HPV)属于乳多空病毒科(Papovaviridae)的乳头瘤病毒属，是一种嗜上皮细胞的DNA病毒。人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)是宫颈癌的主要致病因子，约90％以上的宫颈癌发病都与HPV感染有关，宫颈癌占全世界妇女癌症死亡率的第二位，在某些发展中国家甚至位居首位。由于大约50％的宫颈癌与HPV16感染相关，因而研制针对HPV16的治疗性疫苗将对宫颈癌的治疗具有十分重要的意义。
HPV基因组主要编码2种晚期蛋白(L1和L2)和6种早期蛋白(E1、E2、E4、E5、E6和E7)。晚期蛋白为HPV衣壳结构成分，参与病毒颗粒组装。E6和E7是HPV的主要致癌蛋白，可使宿主细胞永生化并进一步发生恶性转化，HPV相关肿瘤中组成型持续表达E6和E7蛋白，E6和E7基因只存在于癌变组织中，在正常组织中不存在。由于HPV16 E6和E7基因为癌基因，直接应用于疫苗设计有潜在的危险性。为了保证疫苗的安全性，必须进行相应的基因突变以消除其致癌性。
发明内容
本发明的目的是提供一种治疗和/或预防宫颈癌的基因工程药物。
本发明提供的宫颈癌治疗和/或预防疫苗，其活性成分由含有序列表的序列2所示蛋白质的编码基因的重组质粒甲和表达所述序列表的序列2所示蛋白质的重组腺病毒组成。
所述重组质粒甲为质粒。
所述重组腺病毒具体可为培养重组细胞得到的重组腺病毒；所述重组细胞是将重组质粒乙与骨架质粒pBH Glox ΔE1\3cre共转染HEK293细胞得到的重组细胞；所述重组质粒乙是在pDC315质粒的多克隆位点插入所述序列表的序列2所示蛋白质的编码基因得到的重组质粒。
所述重组质粒甲具体可为在pVR1012质粒的多克隆位点插入所述序列表的序列2所示蛋白质的编码基因得到的重组质粒。
所述疫苗中，所述序列表的序列2所示蛋白质的编码基因具体可如序列表的序列1所示。
所述疫苗中，所述重组质粒甲和所述重组腺病毒分别单独包装。
含有序列表的序列2所示蛋白质的编码基因的重组质粒甲和表达所述序列表的序列2所示蛋白质的重组腺病毒在制备宫颈癌治疗和/或预防疫苗中的应用也属于本发明的保护范围。
所述重组质粒甲为质粒。
所述重组腺病毒具体可为培养重组细胞得到的重组腺病毒；所述重组细胞是将重组质粒乙与骨架质粒pBH GloxΔE1\3cre共转染HEK293细胞得到的重组细胞；所述重组质粒乙是在pDC315质粒的多克隆位点插入所述序列表的序列2所示蛋白质的编码基因得到的重组质粒。
所述重组质粒甲具体可为在pVR1012质粒的多克隆位点插入所述序列表的序列2所示蛋白质的编码基因得到的重组质粒。
所述应用中，所述序列表的序列2所示蛋白质的编码基因具体可如序列表的序列1所示。
所述应用中，所述重组质粒甲和所述重组腺病毒分别单独包装。
上述疫苗可采用如下方法对成人进行免疫：第一次免疫：免疫(肌肉注射)所述重组质粒甲，免疫剂量为4-5mg DNA；第二次免疫；第一字免疫2周后，免疫所述重组腺病毒，免疫(肌肉注射)剂量为2×1011病毒粒子。
实验证明，本发明提供的疫苗对于宫颈癌的治疗和预防均由显著效果，具有很大的临床应用前景。
附图说明
图1为重组质粒pDC315 HPV16 omfE6E7-3的EcoRI/BamH1酶切鉴定图；1-3：质粒pDC315 HPV16 omfE6E7-3的EcoRI/BamH1酶切产物；4：重组质粒pDC315 HPV16omfE6E7-3(未酶切)；M为Marker。
图2为重组腺病毒RCA电泳检测结果；1：pXC-1质粒的PCR产物；2：pXC-1质粒10倍稀释液的PCR产物；3：pXC-1质粒100倍稀释液的PCR产物；4：病毒上清的PCR产物；5：病毒上清10倍稀释液的PCR产物；6：病毒上清100倍稀释液的PCR产物；7：Wide Range DNA Marker(100-6000)。
图3为重组腺病毒中目的基因PCR电泳鉴定结果。1：病毒上清的PCR产物；2：病毒上清10倍稀释液的PCR产物；3：病毒上清100倍稀释液的PCR产物；4：Wide Range DNAMarker(100-6000)。
图4为重组腺病毒感染细胞后表达的目的蛋白的Western blot结果；其中A为采用E6山羊多抗作为一抗，E7山羊多抗作为一抗；1：蛋白Marker；2：重组腺病毒；3：对照腺病毒；4：未感染腺病毒的HEK293细胞。
图5为重组质粒pVR1012-HPV16omfE6E7-3的酶切鉴定图(EcoR V/Bgl II)；1-4：重组质粒pVR1012-HPV16omfE6E7-3的EcoR V/Bgl II酶切产物；M：Marker。
图6为HPV16 ofE6E7-1原核细胞表达蛋白的纯化产物(HPV16-E6E7抗原)的SDS-PAGE电泳图；M：Marker；1-3：纯化后的HPV16 ofE6E7-1融合蛋白(HPV16-E6E7抗原)。
图7为实施例3中ELISA法检测体液免疫反应的结果；A：免疫后1周(第7天)时IgG OD值(1∶1600稀释血清)；B：免疫后4周(第28天)时IgG OD值(1∶1600稀释血清)。
图8为实施例3中ELISPOT法鉴定细胞免疫的结果。
图9为重组质粒和重组腺病毒作为治疗性疫苗对肿瘤的抑制作用的结果。
图10为重组质粒和重组腺病毒作为预防性疫苗对肿瘤的抑制作用的结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。本发明所涉及到的分子生物学相关技术如核酸分子克隆技术、蛋白质表达检测等在科学文献中都已经有充分的描述(如参见J.萨姆布鲁克、E.F弗里奇、T.曼尼要蒂斯，分子克隆实验指南(第二版))，涉及到各种试剂盒的具体操作，按照其相应说明书进行。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。限制性内切酶HindIII、EcoR I、BamH I，T4连接酶，PCR EXTaq酶均购自日本TAKARA公司。质粒小提试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒、DNA产物纯化试剂盒、大肠杆菌DH5α感受态细胞购自北京天根公司。FuGENE-HD(转染试剂)购自Roch公司。Elispot set购自MABPTECH公司。E6山羊多抗和E7小鼠单抗购自santa cruz公司。山羊二抗和小鼠二抗购自rockland公司。引物均由上海生工合成。C57BL/6小鼠购自中国医学科学院实验动物所。pDC315质粒：来自加拿大Microbix Biosystems Inc.公司销售的Admax kitD(PD-01-64)。骨架质粒pBH GloxΔE1\3cre：来自加拿大Microbix Biosystems Inc.公司销售的Admax kitD(PD-01-64)。HEK 293细胞：购买自美国ATCC(CRL-1573)。pXC-1质粒(含有腺病毒E1基因)：购自加拿大MicrobixBiosystems Inc.公司(PD-01-03)。pET-32a(+)质粒：购自北京天恩泽基因技术有限公司，产品目录号为100701-2。大肠杆菌BL21(DE3)pLysS：购自天根生化科技(北京)有限公司，产品目录号为CB106-02。
pVR1012质粒(载体pVR1012)：中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所肿瘤病毒室；参考文献：陈宇、杨小松、杨萍、张帆、于湘晖、吴永革、姜春来、李惟、孔维，重组乙型肝炎痘病毒载体疫苗与DNA疫苗免疫原性比较，中国生物制品学杂志2007年9月第20卷第9期，661-663。
TC-1肿瘤细胞：由约翰霍普金斯大学的Tzyy-Choou Wu教授惠赠；参考文献：Treatment of Established Tumors with a Novel Vaccine That Enhances MajorHistocompatibility Class II Presentation of Tumor Antigen，1996，Cancerresearch。
实施例1、重组腺病毒的制备、鉴定和纯化
一、用于腺病毒包装的重组穿梭质粒的构建
1、合成序列表的序列1所示的HPV16 omfE6E7-3融合基因(序列表的序列1所示的HPV16 omfE6E7-3融合基因是将野生型HPV16 E6E7的融合基因进行密码子优化后定点突变得到的，编码序列表的序列2所示的蛋白质；参见专利“经修饰的HPV E6-E7融合基因及其编码蛋白”，申请号为200710100262.5，专利授权公告号为CN 101100672B)。
2、以步骤1合成的HPV16 omfE6E7-3融合基因为模板，用HPVE6和HPVE7组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
HPVE6：5’-GCGAATTCGCCACCATGCACCAGAA-3’(下划线标注EcoR I识别序列)；
HPVE7：5’-GCGGATCCTTCAGGGCTTCTGGCT-3’(下划线标注BamH I识别序列)。
PCR扩增的热循环条件为：95℃预变性5min；94℃50sec，57℃30sec，72℃1min，共进行30个循环，最后72℃延伸10min。
3、回收步骤2的PCR扩增产物，用限制性内切酶EcoR I和BamH I进行双酶切，得到酶切产物，回收酶切产物。
4、用限制性内切酶EcoR I和BamH I双酶切pDC315质粒，回收载体骨架(约3900bp)。
5、用T4DNA连接酶连接步骤3回收的酶切产物与步骤4回收的载体骨架，得到连接产物。
6、将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取重组菌提质粒依次进行酶切鉴定(EcoR I和BamH I)和测序鉴定。酶切鉴定结果见图1，在780bp处有酶切小片段，为阳性结果。测序结果表明，得到了重组质粒pDC315 HPV16 omfE6E7-3，即为用于腺病毒包装的重组穿梭质粒。
根据测序结果，重组质粒pDC315 HPV16 omfE6E7-3的结构描述如下：在pDC315质粒的EcoR I和BamH I酶切位点之间插入序列表的序列1所示DNA片段得到的重组质粒。
二、制备重组腺病毒
1、将重组质粒pDC315 HPV16 omfE6E7-3与骨架质粒pBH Glox ΔE1\3cre按照摩尔比1∶1混合，借助FuGENE-HD(转染试剂)转染6孔板中的HEK293细胞(配比为4ug质粒DNA：12ul转染试剂)。
2、约2周后除去细胞培养液，用PBS缓冲液收获细胞。
3、将收获的溶于PBS的细胞使用-70℃冰箱和37℃水浴锅反复冻融3-5次，得到原代病毒液。
4、用原代病毒液感染新的HEK293细胞，在发生细胞病变效应(CPE)时收获病毒，重复几次(用病毒液感染新的HEK293细胞)，扩大病毒量和提高病毒滴度，得到重组腺病毒rAd-HPV16 omfE6E7-3的病毒液(粗制腺病毒)。
用pDC315质粒代替重组质粒pDC315 HPV16 omfE6E7-3，进行步骤1至4，得到对照腺病毒的病毒液(粗制腺病毒)。
三、检测包装的重组腺病毒的复制缺陷型
本发明使用的腺病毒载体是复制缺陷的，其基因组不含复制所需的腺病毒E1基因。而在制备复制缺陷型的腺病毒的过程中，腺病毒的复制是依赖于包装细胞系HEK293表达的腺病毒E1基因的。然而，存在HEK293细胞表达的腺病毒E1基因重组到包装腺病毒基因组的可能性，从而产生可自主复制的腺病毒。因此，需要检测制备的复制缺陷型腺病毒中是否含有复制型腺病毒(RCA)。RCA的检测的方法是用PCR的方法检测制备的腺病毒DNA中是否有腺病毒E1的存在。
1、25ul步骤二得到的重组腺病毒rAd-HPV16 omfE6E7-3的病毒液加入1ul蛋白酶K(10mg)，55℃水浴1h。
2、煮沸5min。
3、10000rpm离心5min，取上清。
4、分别以上清、上清的10倍稀释液和上清的100倍稀释液为模板(以pXC-1质粒为阳性对照)，用RCA-up和RCA-down组成的引物对(RCA-up和RCA-down的靶序列是腺病毒E1基因中的部分区域，靶序列长度为1.2kb)进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
RCA-up：5’-CCTGCGAGTGTGGCGGTAAA-3’；
RCA-down：5’-CACAAGGGCGTCTCCAAGTT-3’。
PCR条件：95℃预变性5min；95℃45sec，55℃45sec，72℃1min，共进行30个循环，最后72℃延伸10min。
5、将PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，见图2。
四、检测包装的重组腺病毒的目的基因
包装的腺病毒要求是含有目的基因的DNA并在感染细胞后会表达目的蛋白(E6E7融合蛋白)，因此需要检测重组腺病毒中目的基因DNA的存在和转染细胞后目的蛋白的表达。用E6E7特异的引物PCR扩增腺病毒DNA中目的DNA是否存在；用制备的腺病毒感染HEK293细胞24小时后收细胞，用Western Blot的方法检测目的蛋白的表达。
1、检测腺病毒DNA中目的基因的存在
(1)25ul步骤二得到的重组腺病毒rAd-HPV16 omfE6E7-3的病毒液加入1ul蛋白酶K(10mg)，55℃水浴1h。
(2)煮沸5min。
(3)10000rpm离心5min，取上清。
(4)分别以上清、上清的10倍稀释液和上清的100倍稀释液为模板，用E6E7-up和E6E7-down组成的引物对(靶序列长度约为780bp)进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
E6E7-up：5’-ATGCACCAGAAGAGAACCGCCAT-3’；
E6E7-down：5’-TCAGGGCTTCTGGCTGCAGAT-3’。
PCR条件：94℃预变性5min；94℃30s，60℃30s，72℃1min，进行30个循环；最后72℃延伸10min。
(5)将PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，见图3。PCR产物的DNA电泳结果显示出在780bp处出现一条E6E7融合基因的阳性条带。
2、检测重组腺病毒感染细胞后目的蛋白的表达
(1)用HEK293细胞铺6孔板，在感染时使其覆盖率大于90％。
(2)将新鲜培养液与步骤二得到的重组腺病毒rAd-HPV16 omfE6E7-3的病毒液混匀，得到腺病毒稀释液(每孔份的量为200ul新鲜培养液与1×107pfu重组腺病毒rAd-HPV16 omfE6E7-3的病毒液混匀)；将步骤二得到的对照腺病毒的病毒液作为重组腺病毒rAd-HPV16 omfE6E7-3的病毒液的对照。
(3)吸去步骤(1)的6孔板中细胞表面的培养液，每孔加入1孔份步骤(2)的腺病毒稀释液，37℃，5％CO2培养箱中静置2小时。
(4)补加新鲜培养液至每孔2ml，在37℃，5％CO2培养箱中培养24-48小时；吸去培养液，加入预冷的PBS缓冲液，吹打细胞层，将细胞收集到离心管中；1000转/分离心5分钟沉淀细胞。
(5)在沉淀的细胞中加入细胞裂解液，冰上裂解细胞(细胞裂解液的加入量为每孔细胞100ul细胞裂解液)。
(6)蜗旋震荡5min，14000rpm 4℃离心10min，取上清进行SDS-PAGE。
(7)转膜后，5％脱脂奶粉封闭过夜。
(8)以E6山羊多抗(或E7小鼠单抗)(1∶200)室温摇床孵育60min。
(9)以PBST洗膜3次，10min/次。
(10)分别以山羊二抗(或小鼠二抗)(1∶1000)室温避光孵育45min。
(11)以PBST洗膜3次，10min/次。
(12)将膜置于PBS中，红外扫描仪机检，结果见图4。
五、纯化包装的重组腺病毒
收获的粗制腺病毒，用氯化铯不连续密度梯度法进行纯化以除掉其中混杂的细胞碎片和其他生物大分子，离心完毕后吸去乳白色的腺病毒层。由于离心后回收腺病毒液时会吸入氯化铯，因此还需除去腺病毒液中的氯化铯。将离心后的病毒液加入到100KD的超滤管中，再补加足量的PBS缓冲液，离心除去含氯化铯的液体，反复2次后剩下的即为纯化的腺病毒。
1、在离心管下层加入4M的氯化铯7ml(67g CsCl溶于100ml 10mM HEPES，pH7.4)，中间加上2.2M的氯化铯10ml(38g CsCl溶于100ml 10mM HEPES，pH7.4；10mM HEPES：1.3g HEPES溶于500ml双蒸水)，上面加入20ml步骤二得到的重组腺病毒rAd-HPV16omfE6E7-3的病毒液。
2、4℃下100000g离心12小时，中间形成的一层乳白色的腺病毒层，用注射器收集该乳白色的腺病毒层。
3、收集的腺病毒液加入到规格100KD的超滤管中，2500rpm离心30分钟。
4、加入足量的PBS缓冲液，2500rpm离心30分钟，重复2次。
5、加入含10％甘油的PBS缓冲液，即为纯化后重组腺病毒rAd-HPV16 omfE6E7-3病毒液，-70℃保存。
用步骤二得到的对照腺病毒的病毒液代替步骤二得到的重组腺病毒rAd-HPV16omfE6E7-3的病毒液，进行步骤1至5，得到纯化后对照腺病毒病毒液。
六、测定包装腺病毒的滴度
利用CELL BIOLABS，INC.公司的QuickTiter Adenovirus Titer Immunoassay Kit试剂盒测定包装腺病毒的滴度，具体操作步骤如下：
1、按照2.5×105细胞/孔的量将HEK293细胞铺于24孔板，1ml/孔，于37℃，5％CO2恒温培养箱孵育1h。
2、将步骤五得到的纯化后重组腺病毒rAd-HPV16 omfE6E7-3病毒液用培养基做10倍比稀释，并将稀释后的病毒样品按照100ul/孔的用量加入24孔板；将步骤五得到的纯化后对照腺病毒病毒液作为纯化后重组腺病毒rAd-HPV16 omfE6E7-3病毒液的对照。
3、于37℃，5％CO2恒温培养箱孵育2天。
4、缓慢去除孔内培养基，每孔加入0.5ml预冷的甲醇，-20℃孵育20min，固定HEK293细胞。
5、用1×PBS缓冲液洗固定好的细胞三次，5min/次。
6、每孔加入适量含有1％BSA的PBS缓冲液，置于摇床上室温封闭1h。
7、每孔加入0.25ml 1×anti-Hexon antibody，置于摇床上室温孵育1h。
8、用1×PBS缓冲液洗固定好的细胞三次，5min/次。
9、每孔加入0.25ml 1×二抗(HRP-conjugated)，置于摇床上室温孵育1h。
10、用1×PBS缓冲液洗固定好的细胞五次，5min/次。
11、每孔加入0.25ml新鲜配制的1×DAB工作液，置于摇床上室温孵育10min。
12、吸除DAB，用1×PBS缓冲液洗涤两次，并将每孔加入1ml 1×PBS缓冲液。
13、光镜下，10倍镜对阳性细胞(棕色)计数，每孔至少计5个视野。
14、计算每孔的阳性细胞平均数以及病毒滴度。
病毒滴度＝(每个视野平均阳性细胞数×每个孔的视野数×稀释倍数)/0.1；单位为pfu/ml。
实施例2、重组质粒pVR1012-HPV16omfE6E7-3的构建
1、合成序列表的序列1所示的HPV16 omfE6E7-3融合基因。
2、以步骤1合成的HPV16 omfE6E7-3融合基因为模板，用HPV-1和HPV-2组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
HPV-1：5’-GCGATATCGCCACCATGCACCAGAA-3’(下划线标注EcoR V识别序列)；
HPV-2：5’-GCAGATCTTTCAGGGCTTCTGGCT-3’(下划线标注Bgl II识别序列)。
3、回收步骤2的PCR扩增产物，用限制性内切酶EcoR V和Bgl II进行双酶切，得到酶切产物，回收酶切产物。
4、用限制性内切酶EcoR V和Bgl II双酶切pVR1012质粒，回收载体骨架(约4900bp)。
5、用T4DNA连接酶连接步骤3回收的酶切产物与步骤4回收的载体骨架，得到重组质粒pVR1012-HPV16omfE6E7-3。
重组质粒pVR1012-HPV16omfE6E7-3的酶切(EcoR V和Bgl II)鉴定电泳图见图5。根据测序结果，重组质粒pVR1012-HPV16omfE6E7-3的结构描述如下：在pVR1012质粒的EcoR V和Bgl II酶切位点之间插入序列表的序列1所示DNA片段得到的重组质粒。
实施例3、重组质粒和重组腺病毒对细胞免疫和体液免疫的促进作用
一、HPV16-E6E7抗原的制备
由于现实中HPV16 E6E7是以野生形式存在的，故而ELISA检测体液免疫反应所用抗原选用野生型的HPV16 E6E7。
1、重组质粒的制备
(1)合成序列表的序列3所示的DNA(HPV16 ofE6E7-1基因，编码序列表的序列4所示的蛋白质)。
(2)以步骤1合成的HPV16 ofE6E7-1基因为模板，用F1和F2组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
F1：5’-GGAATTCCATATGCACCAGAAGAGAACCG-3’(含有酶切位点Nde I)；
F2：5’-CCGCTCGAGGGGCTTCTGGCTGCAGAT-3’(含有酶切位点Xho I)。
(3)回收步骤2的PCR扩增产物，用限制性内切酶Nde I和Xho I进行双酶切，得到酶切产物，回收酶切产物。
(4)用限制性内切酶Nde I和Xho I双酶切pET-32a(+)质粒，回收载体骨架(约5400bp)。
(5)用T4DNA连接酶连接步骤3回收的酶切产物与步骤4回收的载体骨架，得到连接产物。
(6)将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取重组菌提质粒依次进行酶切鉴定(Nde I和Xho I)和测序鉴定。酶切鉴定表明在780bp处有酶切小片段，为阳性结果。测序结果表明，得到了重组质粒pET-32a(+)-HPV16 ofE6E7-1。
重组质粒pET-32a(+)-HPV16 ofE6E7-1的结构描述：在pET-32a(+)质粒的Nde I和Xho I酶切位点之间插入序列表的序列3所示DNA片段得到的重组质粒。
2、重组菌的制备
用重组质粒pET-32a(+)-HPV16 ofE6E7-1转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS，得到重组菌。
3、HPV16-E6E7抗原的制备
培养重组菌，诱导表达目的蛋白，并用Ni柱进行纯化，得到HPV16-E6E7抗原。
HPV16-E6E7抗原的SDS-PAGE图见图6。
二、ELISA法检测体液免疫反应
1、实验动物的分组处理
实验动物为C57BL/6小鼠，雌性，4～6周龄。将实验动物随机分成两组，分别进行如下处理：
第一组(DNA+Adv)：初次免疫3周(21天)后进行加强免疫；初次免疫为：大腿肌肉注射重组质粒pVR1012-HPV16omfE6E7-3，每只小鼠100ug(100ul)；加强免疫为：大腿肌肉注射实施例1的步骤五得到的纯化后重组腺病毒rAd-HPV16 omfE6E7-3病毒液，每只小鼠5×107pfu(100ul)；
第二组(PBS+PBS)：初次免疫3周(21天)后进行加强免疫；初次免疫为：大腿肌肉注射PBS缓冲液，每只小鼠100ul；加强免疫为：大腿肌肉注射PBS缓冲液，每只小鼠100ul。
2、ELISA法检测体液免疫反应
自初次免疫开始第7天和第28天，均每组取4只小鼠检测体液免疫，方法如下：
(1)血清分离
采用摘除眼球取血法对小鼠进行采血，每只小鼠能采到至少600μl全血，全部收集到无菌的EP管中，4℃静置3-5h，自然凝血，3000rpm离心5min，将血清取出分装后于-20℃冻存备用。
(2)将步骤一制备纯化的HPV16-E6E7抗原用碳酸盐缓冲包被(NaHCO32.9g，Na2CO31.5g，加双蒸水至1L，调pH值至9.6)稀释至2μg/ml，100ul/孔4℃包被过夜。
(3)用含有0.1％Tween-20的PBS缓冲液洗板3次，每孔加200ul封闭液(含1％BSA的PBST缓冲液)，37℃封闭2h。
(4)PBST缓冲液洗板3次，最后一次在滤纸上扣干。
(5)用封闭液(含1％BSA的PBST缓冲液)将血清稀释为1∶100、1∶400、1∶1600、1∶3200四个梯度，得到四种血清稀释液。
(6)每孔加100ul血清稀释液，空白组加封闭液，37℃孵育1h。
(7)PBST缓冲液洗板5次，加入1∶2000稀释的HRP标记抗小鼠IgG抗体，100ul/孔，37℃孵育1h。
(8)PBST缓冲液洗板5次(至少)，加底物TMB 100ul/孔，室温显色4-30min。
(9)每孔加入50ul 2M H2SO4中止反应，450/620nm波长测OD值。
结果见图7。结果表明，无论是免疫后1周还是免疫后4周，第一组OD450/620值要远大于第二组，且差异显著，具有统计学意义。
三、ELISPOT法鉴定细胞免疫
1、实验动物的分组处理
实验动物为C57BL/6小鼠，雌性，4～6周龄。将实验动物随机分成四组，分别进行如下处理：
第一组(DNA+DNA)：初次免疫3周(21天)后进行加强免疫；初次免疫为：大腿肌肉注射重组质粒pVR1012-HPV16omfE6E7-3，每只小鼠100ug(100ul)；加强免疫为：大腿肌肉注射重组质粒pVR1012-HPV16omfE6E7-3，每只小鼠100ug(100ul)；
第二组(DNA+Adv)：初次免疫3周(21天)后进行加强免疫；初次免疫为：大腿肌肉注射重组质粒pVR1012-HPV16omfE6E7-3，每只小鼠100ug(100ul)；加强免疫为：大腿肌肉注射实施例1的步骤五得到的纯化后重组腺病毒rAd-HPV16 omfE6E7-3病毒液，每只小鼠5×107pfu(100ul)；
第三组(Adv+Adv)：初次免疫3周(21天)后进行加强免疫；初次免疫为：大腿肌肉注射实施例1的步骤五得到的纯化后重组腺病毒rAd-HPV16 omfE6E7-3病毒液，每只小鼠5×107pfu(100ul)；加强免疫为：大腿肌肉注射实施例1的步骤五得到的纯化后重组腺病毒rAd-HPV16 omfE6E7-3病毒液，每只小鼠5×107pfu(100ul)；
第四组(PBS+PBS)：初次免疫3周(21天)后进行加强免疫；初次免疫为：大腿肌肉注射PBS缓冲液，每只小鼠100ul；加强免疫为：大腿肌肉注射PBS缓冲液，每只小鼠100ul。
2、ELISPOT法鉴定细胞免疫
自初次免疫开始第7天，均每组取4只小鼠，采用ELISpot Set检测细胞免疫，方法如下：
(1)淋巴细胞的分离
①用70％酒精喷洒小鼠使其侧卧，暴露出左侧腹部，用镊子夹起左侧腹部皮肤，用剪刀剪开，暴露出腹壁，可见靠近脊柱处腹壁下有暗红色脏器，即为脾脏，换眼科镊子夹起腹壁，用眼科剪刀将其剪开，取出脾脏。
②研磨脾脏：同时准备一无菌平皿，内置细胞滤网，将新分离的脾脏置于无菌的滤网上，在其中加入4mL小鼠淋巴细胞分离液，用无菌的玻璃试管底部于细胞滤网(200目)上充分研磨分散脾细胞。
③淋巴细胞的分离：将分散好的细胞悬液转移到15mL离心管中，并在其上轻轻覆盖一层400ul含2％FBS的1640培养液(注意保持淋巴细胞分离液与细胞培养液界面的完整)，室温800g水平离心30min。
④淋巴细胞的洗涤：离心结束后可见管中液体分成清晰的三层，上层为细胞培养液，中间为白色的淋巴细胞层，下层为淋巴细胞分离液。小心吸取中间淋巴细胞层，再加入10mL含2％FBS的1640培养液混匀，室温250g离心5min后弃上清；所得沉淀细胞用5mL含10％FBS的1640培养液重悬，一部分细胞用于后续的ELISPOT实验，另一部分用含10％DMSO，20％FBS的1640培养液冻存。
(2)包被板子(无菌)
①每孔加入50ul 70％的无菌乙醇预湿1min；
②在无菌的滤纸上拍干后再加入200ul的无菌水洗剂五次，最后一次洗剂后，在无菌滤纸上轻拍板子，以便减少乙醇残留；
③将包被抗体储存液稀释在无菌PBS缓冲液中，每孔加入100ul，盖上板盖，4℃过夜。
(3)封闭板子(无菌)
①倾倒包被液，每孔加入200ul的无菌PBS缓冲液清洗五次，最后一次清洗后，在无菌滤纸上轻拍板子。
②每孔加入200ul稀释好的封闭液(10％FBS的1640培养基)，室温孵育大于30min。
(4)多肽和细胞的准备(无菌)
①用含10％FBS的1640培养基稀释多肽(多肽E6 18-26、多肽E6 37-45、多肽E6 48-57、多肽E7 7-15、多肽E7 49-57和多肽E7 79-87，各多肽的浓度均为4uM；E6 18-26的氨基酸序列为KLPQLCTEL，E6 37-45的氨基酸序列为CVYCKQQLL，E6 48-57的氨基酸序列为EVYDFAFRDL，E7 7-15的氨基酸序列为TLHEYMLDL，E7 49-57的氨基酸序列为RAHYNIVTF、E7 79-87的氨基酸序列为LEDLLMGTL)。
②用含10％FBS的1640培养基调待测细胞浓度至4×106/ml。
(5)多肽与细胞相互作用(无菌)
①取出封闭好的板子，直接倾倒孔中的封闭液，在高压过的无菌滤纸上拍干。
②在阳性对照孔中加10ul P+I(PMA plus ionomycin)，阴性对照孔中加入50ul含10％FBS的1640培养基。
③其余孔中按照计划分别加入步骤4预先稀释好的多肽，每孔50ul。
④每孔加50ul步骤4稀释好的细胞，每孔一定要换枪头以避免多肽的互相污染。
⑤放37℃CO2中培养48小时。
(6)抗体检测：以下操作无需无菌
①倾倒孔内的细胞及培养基，用室温放置的普通PBS缓冲液洗板五次，200μl/孔。
②按照试剂盒说明的浓度，用抗体稀释液稀释检测抗体，每孔加入100μl生物素标记的检测抗体，室温孵育2小时。
③弃检测抗体，每孔用200μl PBS缓冲液洗涤5遍。按照试剂盒说明的浓度，用抗体稀释液稀释酶标的链霉亲和素，每孔加入100μl，室温孵育1小时。
④弃孔内液体，每孔200μl PBS缓冲液洗5遍，最后一遍将板倒扣在吸水纸上拍干。
⑤照试剂盒的说明，每孔加入100μl的TMB显色液，室温静置，注意避光。
⑥待斑点生长到适合的大小之后，以去离子水洗涤2遍，终止显色过程。
⑦将板倒扣在吸水纸上拍干，放在通风的地方，室温避光静置约1h，让膜自然晾干。
⑧将ELISPPOT板置于CTL自动读板仪内，调节好合适的参数，斑点计数，并记录斑点的各种参数，作统计分析。
结果见图8。自初次免疫第28天，每2×105个淋巴细胞所产生的斑点数第一组要大于第二组，且差异显著，具有统计学意义。
实施例4、重组质粒和重组腺病毒对肿瘤的抑制作用
一、重组质粒和重组腺病毒作为治疗性疫苗对肿瘤的抑制作用
1、实验动物的分组处理
实验动物为C57BL/6小鼠，雌性，4～6周龄。将实验动物随机分成三组(每组10只)，分别进行如下处理：
第一组(TDA)：实验第1天右侧腹股沟皮下注射TC-1肿瘤细胞，每只小鼠2×105个细胞(100ul)，第2天进行初次免疫，第15天(2周)进行加强免疫；初次免疫为：大腿肌肉注射重组质粒pVR1012-HPV16omfE6E7-3，每只小鼠100ug(100ul)；加强免疫为：大腿肌肉注射实施例1的步骤五得到的纯化后重组腺病毒rAd-HPV16 omfE6E7-3病毒液，每只小鼠5×107pfu(100ul)；
第二组(TD-)：实验第1天右侧腹股沟皮下注射TC-1肿瘤细胞，每只小鼠2×105个细胞(100ul)，第2天进行初次免疫，第15天(2周)进行加强免疫；初次免疫为：大腿肌肉注射重组质粒pVR1012-HPV16omfE6E7-3，每只小鼠100ug(100ul)；加强免疫为：大腿肌肉注射实施例1的步骤五得到的纯化后对照腺病毒毒液，每只小鼠5×107pfu(100ul)；
第三组(TPP)：实验第1天右侧腹股沟皮下注射TC-1肿瘤细胞，每只小鼠2×105个细胞(100ul)，第2天进行初次免疫，第15天(2周)进行加强免疫；初次免疫为：大腿肌肉注射PBS缓冲液，每只小鼠100ul；加强免疫为：大腿肌肉注射PBS缓冲液，每只小鼠100ul。
2、重组质粒和重组腺病毒作为治疗性疫苗对肿瘤的抑制作用
自注射TC-1肿瘤细胞开始，第8天、第14天、第21天、第28天、第35天和第42天测小鼠的肿瘤大小(以体积计，单位为立方厘米)。结果见图9(该组的平均值)。结果显示，第一组小鼠的肿瘤显著小于第二组和第三组，第二组小鼠的肿瘤小于第三组。
二、重组质粒和重组腺病毒作为预防性疫苗对肿瘤的抑制作用
1、实验动物的分组处理
实验动物为C57BL/6小鼠(B6：H-2b)，雌性，4～6周龄。将实验动物随机分成三组(每组10只)，分别进行如下处理：
第一组(DAT)：实验第1天进行初次免疫，第14天(2周)进行加强免疫，第21天右侧腹股沟皮下注射TC-1肿瘤细胞，每只小鼠2×105个细胞(100ul)；初次免疫为：大腿肌肉注射重组质粒pVR1012-HPV16omfE6E7-3，每只小鼠100ug(100ul)；加强免疫为：大腿肌肉注射实施例1的步骤五得到的纯化后重组腺病毒rAd-HPV16omfE6E7-3病毒液，每只小鼠5×107pfu(100ul)；
第二组(D-T)：实验第1天进行初次免疫，第14天(2周)进行加强免疫，第21天右侧腹股沟皮下注射TC-1肿瘤细胞，每只小鼠2×105个细胞(100ul)；初次免疫为：大腿肌肉注射重组质粒pVR1012-HPV16omfE6E7-3，每只小鼠100ug(100ul)；加强免疫为：大腿肌肉注射实施例1的步骤五得到的纯化后对照腺病病毒液，每只小鼠5×107pfu(100ul)；
第三组(PPT)：实验第1天进行初次免疫，第14天(2周)进行加强免疫，第21天右侧腹股沟皮下注射TC-1肿瘤细胞，每只小鼠2×105个细胞(100ul)；初次免疫为：大腿肌肉注射PBS缓冲液，每只小鼠100ul；加强免疫为：大腿肌肉注射PBS缓冲液，每只小鼠100ul。
2、重组质粒和重组腺病毒作为预防性疫苗对肿瘤的抑制作用
自注射TC-1肿瘤细胞开始，第8天、第14天、第21天、第28天、第35天和第42天测小鼠的肿瘤大小(以体积计，单位为立方厘米)。结果见图10(该组的平均值)。结果显示，第一组小鼠的肿瘤显著小于第二组和第三组，第二组小鼠的肿瘤小于第三组。
Claims (4)
1.宫颈癌治疗和/或预防疫苗，其活性成分由含有序列表的序列2所示蛋白质的编码基因的重组质粒甲和表达所述序列表的序列2所示蛋白质的重组腺病毒组成；所述重组腺病毒是培养重组细胞得到的重组腺病毒；所述重组细胞是将重组质粒乙与骨架质粒pBH Glox△E1\3cre共转染HEK293细胞得到的重组细胞；所述重组质粒乙是在pDC315质粒的多克隆位点插入所述序列表的序列2所示蛋白质的编码基因得到的重组质粒；所述重组质粒甲为在pVR1012质粒的多克隆位点插入所述序列表的序列2所示蛋白质的编码基因得到的重组质粒；所述序列表的序列2所示蛋白质的编码基因如序列表的序列1所示。
2.如权利要求1所述的疫苗，其特征在于：所述重组质粒甲和所述重组腺病毒分别单独包装。
3.含有序列表的序列2所示蛋白质的编码基因的重组质粒甲和表达所述序列表的序列2所示蛋白质的重组腺病毒在制备宫颈癌预防疫苗中的应用；所述重组腺病毒是培养重组细胞得到的重组腺病毒；所述重组细胞是将重组质粒乙与骨架质粒pBH Glox△E1\3cre共转染HEK293细胞得到的重组细胞；所述重组质粒乙是在pDC315质粒的多克隆位点插入所述序列表的序列2所示蛋白质的编码基因得到的重组质粒；所述重组质粒甲为在pVR1012质粒的多克隆位点插入所述序列表的序列2所示蛋白质的编码基因得到的重组质粒；所述序列表的序列2所示蛋白质的编码基因如序列表的序列1所示。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述重组质粒甲和所述重组腺病毒分别单独包装。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 201110049989 CN102178948B (zh) | 2011-03-02 | 2011-03-02 | 治疗和/或预防宫颈癌的基因工程药物 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 201110049989 CN102178948B (zh) | 2011-03-02 | 2011-03-02 | 治疗和/或预防宫颈癌的基因工程药物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102178948A CN102178948A (zh) | 2011-09-14 |
| CN102178948B true CN102178948B (zh) | 2013-08-07 |
Family
ID=44565354
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN 201110049989 Expired - Fee Related CN102178948B (zh) | 2011-03-02 | 2011-03-02 | 治疗和/或预防宫颈癌的基因工程药物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102178948B (zh) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102181407B (zh) * | 2011-03-02 | 2013-01-23 | 北京工业大学 | 重组腺病毒及其修饰的树突状细胞与它们的应用 |
| CN103820472A (zh) * | 2014-01-25 | 2014-05-28 | 北京工业大学 | 用于食管癌防治的hpv16，18l1重组dna疫苗 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101100672A (zh) * | 2007-06-06 | 2008-01-09 | 曾毅 | 经修饰的hpv e6-e7融合基因及其编码蛋白 |
-
2011
- 2011-03-02 CN CN 201110049989 patent/CN102178948B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101100672A (zh) * | 2007-06-06 | 2008-01-09 | 曾毅 | 经修饰的hpv e6-e7融合基因及其编码蛋白 |
Non-Patent Citations (7)
| Title |
|---|
| rBCG-HPV16 E6-E7疫苗的构建和免疫原性研究;赵立民等;《中华肿瘤防治杂志》;20061231;第13卷(第8期);第600-603页 * |
| 人乳头瘤病毒16型修饰后E6E7基因免疫原性增强;许雪梅等;《基础医学与临床》;20031231;第23卷(第3期);第269-273页 * |
| 杨峥嵘等.HPV16,18,58-mE67重组腺病毒的构建及克隆表达.《免疫学杂志》.2008,第24卷(第4期), * |
| 树突状细胞疫苗的制备及其体外诱导细胞毒性T淋巴细胞对宫颈癌CaSki细胞的杀伤作用;焦庆昉等;《肿瘤》;20110228;第31卷(第2期);第106-110页 * |
| 焦庆昉等.树突状细胞疫苗的制备及其体外诱导细胞毒性T淋巴细胞对宫颈癌CaSki细胞的杀伤作用.《肿瘤》.2011,第31卷(第2期), |
| 许雪梅等.人乳头瘤病毒16型修饰后E6E7基因免疫原性增强.《基础医学与临床》.2003,第23卷(第3期), |
| 赵立民等.rBCG-HPV16 E6-E7疫苗的构建和免疫原性研究.《中华肿瘤防治杂志》.2006,第13卷(第8期), |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102178948A (zh) | 2011-09-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Christensen et al. | Assembled baculovirus-expressed human papillomavirus type 11 L1 capsid protein virus-like particles are recognized by neutralizing monoclonal antibodies and induce high titres of neutralizing antibodies | |
| Pastrana et al. | NHPV16 VLP vaccine induces human antibodies that neutralize divergent variants of HPV16 | |
| CN111218459A (zh) | 一种以人复制缺陷腺病毒为载体的重组新型冠状病毒疫苗 | |
| US8895015B2 (en) | Norovirus capsid and rotavirus VP6 protein for use as combined vaccine | |
| JP5713533B2 (ja) | 伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ｉｂｄｖ）に由来する中空キメラ性ウイルス様粒子、これらの製造および応用 | |
| CN109182380B (zh) | 杆状病毒表达的猪瘟e2亚单位疫苗的制备方法及应用 | |
| CN107841507A (zh) | 一种高效表达的猪圆环病毒2型Cap‑穿膜肽融合蛋白基因及其应用 | |
| CN103255171B (zh) | 猪圆环病毒2型密码子优化的orf2基因的重组病毒样粒子 | |
| CN103555746B (zh) | 重组猪圆环病毒2型病毒样粒子及其制备方法和应用 | |
| WO2019047608A1 (zh) | 一种鸭坦布苏病毒e蛋白截短蛋白及应用 | |
| CN101280316B (zh) | 人宫颈癌的一种治疗性疫苗 | |
| CN103193869B (zh) | 一种牛口蹄疫病毒a型合成肽及其制备和应用 | |
| CN103740741B (zh) | Hpv18 e6和e7融合基因突变体及其相关生物材料与编码蛋白 | |
| CN102178948B (zh) | 治疗和/或预防宫颈癌的基因工程药物 | |
| CN109136198A (zh) | 一种表达鸡传染性贫血病毒vp1、vp2基因重组鸡痘病毒活载体疫苗 | |
| CN109957009B (zh) | 抗人7型腺病毒抗体2-1h及其应用 | |
| CN103360498A (zh) | 一种抗鸡传染性法氏囊病的重组蛋白亚单位疫苗 | |
| Zhang et al. | Hexon-modified recombinant E1-deleted adenoviral vectors as bivalent vaccine carriers for Coxsackievirus A16 and Enterovirus 71 | |
| CN113862284A (zh) | 一种编码重组禽流感病毒ha蛋白的基因、病毒样颗粒、疫苗及制备与应用 | |
| CN102181406A (zh) | 一种重组腺病毒及其修饰的树突状细胞与它们的应用 | |
| Pan et al. | Immunogenicity of adenovirus-derived porcine parvovirus-like particles displaying B and T cell epitopes of foot-and-mouth disease | |
| CN108727503A (zh) | VZV重组gE-鞭毛素融合蛋白及其制备方法和应用 | |
| CN106905434A (zh) | 一种包含蹄蝠肝炎病毒核心蛋白的重组融合蛋白及其制备方法和应用 | |
| AU659449B2 (en) | Recombinant varicella-zoster virus and process for constructing same | |
| CN115010813B (zh) | 一种肠道病毒71型病毒样颗粒、其制备方法及应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20130807 Termination date: 20210302 |