CN107075521A - 治疗性hpv16疫苗 - Google Patents

治疗性hpv16疫苗 Download PDF

Info

Publication number
CN107075521A
CN107075521A CN201580060062.4A CN201580060062A CN107075521A CN 107075521 A CN107075521 A CN 107075521A CN 201580060062 A CN201580060062 A CN 201580060062A CN 107075521 A CN107075521 A CN 107075521A
Authority
CN
China
Prior art keywords
polypeptide
carrier
vaccine
leu
hpv
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201580060062.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107075521B (zh
Inventor
E·M·邦尼克
J·H·H·V·屈斯泰
G·C·舍佩尔
K·奥斯特胡伊斯
T·G·乌伊尔
S·卡恩
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Janssen Vaccines and Prevention BV
Original Assignee
Janssen Vaccines and Prevention BV
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=52020908&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CN107075521(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Janssen Vaccines and Prevention BV filed Critical Janssen Vaccines and Prevention BV
Publication of CN107075521A publication Critical patent/CN107075521A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107075521B publication Critical patent/CN107075521B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/04—Drugs for disorders of the respiratory system for throat disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/01—DNA viruses
    • C07K14/025—Papovaviridae, e.g. papillomavirus, polyomavirus, SV40, BK virus, JC virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/58—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation
    • A61K2039/585—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation wherein the target is cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/20011—Papillomaviridae
    • C12N2710/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/20011—Papillomaviridae
    • C12N2710/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/20011—Papillomaviridae
    • C12N2710/20071—Demonstrated in vivo effect
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Otolaryngology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Oncology (AREA)

Abstract

本发明提供了可以被用作针对HPV16的治疗性疫苗的设计的核酸构建体和多肽。这些多肽基本上包括HPV16癌蛋白E6和E7的所有可能的T细胞表位，然而通过包括已经重新排序的E6和E7蛋白的片段，同时还包含最小化数量的不希望的新表位，这些多肽具有大幅降低的(与wt E6和E7相比)直至不能检测到的转化活性。本发明提供了编码多肽的核酸分子，该多肽包括如SEQ ID NO:1所示的序列。在某些实施例中，所编码的多肽进一步包括人乳头瘤病毒(HPV)E2蛋白的至少一个表位，例如HPV16E2蛋白。

Description

治疗性HPV16疫苗
本发明涉及医学领域并且更具体的是涉及可以被用于抵抗人乳头瘤病毒类型16的治疗性疫苗的核酸构建体和多肽。
发明背景
人乳头瘤病毒(HPV)家族由大于100种类型(也称为亚型)组成，这些类型能够感染皮肤或黏膜的角质细胞。超过40种类型的HPV典型地通过性接触进行传播，并且肛殖区的HPV感染在无论男女中都非常常见。一些性传播的HPV类型可以引起生殖器疣。持续感染“高危”型HPV(例如16、18、31、45型)-不同于引起皮肤疣的那些-可以发展成癌前病变和浸润性癌，例如宫颈癌、外阴癌、阴道癌、阴茎癌、口咽癌和肛门癌。在感染后的一至两年内，大部分的HPV感染将自发清除。在健康个体中，当抗原激发时，特异性针对HPV-16的病毒早期蛋白E2、E6和E7的循环的Th1-和Th2-型CD4+T-细胞连同E6特异性的CD8+T细胞迁移到皮肤中，表明针对针对HPV-16感染的成功防御通常与这些病毒早期抗原的系统效应T-细胞应答有关。在小部分(约1％)的感染个体中，HPV感染持续，最终导致生殖器肿瘤病变。在高危HPV中，HPV16和HPV18是宫颈癌的主要原因，一起造成了约70％的病例，并且这两种类型还在其他HPV诱导的癌症如肛门癌和口咽癌中起到了主要作用。在世界范围内，HPV是引起癌症的最重要的传染性病原体之一。
抵抗HPV的疫苗接种被视为减少HPV感染发病率或影响的一种可行策略(凡德伯格(van der Burg)和梅列夫(Melief)，2011，免疫学当今观点(Curr Opinion Immunol)23:252-257)。
基于由HPV16和18型的蛋白L1(包膜蛋白)所形成的病毒样颗粒(VLP)的预防性HPV疫苗在预防HPV16和HPV18的持续感染和相关疾病的方面中非常有效。这些疫苗被认为是通过诱导抵抗L1蛋白的中和抗体提供了无菌免疫。添加来自另外的高危HPV类型的基于L1的VLP可以进一步增加此类疫苗赋予的保护宽度。
然而，当此类疫苗可以预防初始感染(即，它们引起了预防)时，不存在对由HPV16和HPV18引起的已形成的生殖器病变的有益作用的证明，因此它们不被认为是抵抗HPV的治疗性疫苗(希尔德斯海姆(Hildesheim)等人，2007，美国医学会杂志(JAMA)298:743-53)。
尽管引入了这些预防性疫苗，但是大量人群已经获得或仍处于获得持久性高危的HPV感染的风险，并且因此处于患上癌症的风险。用于根除已形成的HPV感染和相关疾病的治疗性疫苗是一项紧急未满足的医疗需要。
已经描述了一些解决这项需要的尝试。例如，已经用各种不同的疫苗接种策略进行临床试验，如，由来自牛型结核菌(Mycobacterium bovis)和HPV-16 E7的热休克蛋白(Hsp)组成的或由来自HPV-16和HPV-18的E6、E7和L2的融合蛋白组成的融合蛋白，嵌合的L1-E7VLP，表达HPV-16和HPV-18的E6和E7或牛乳头瘤病毒E2的重组牛痘病毒，表达HPV-16和HPV-18的E6和E7的CTL表位的DNA疫苗，分泌HPV-16 E7抗原的减活单核细胞增生李斯特菌(Lm)，以及包括HPV-16 E6和E7肽的合成长肽(SLP)。虽然这些方法中的一些显示出了一些但有限的临床疗效，但大多数失败了，证实了需要改善当前的策略。
整合早期HPV蛋白E6和E7是从感染到癌症的过程中一项必要的步骤，并且针对保持宫颈癌细胞的肿瘤表型，需要E6和E7的连续表达。因此，E6和E7被认为是针对治疗性疫苗接种的良好的靶标。如提到的一些研究已经显示了感染了高危HPV的女性的治疗性疫苗接种可以诱导现有病变的消退。肯特尔(Kenter)等人显示了使用衍生自HPV16 E6和E7蛋白的SLP以及佐剂作为一种治疗性疫苗的在患有外阴上皮内瘤样病变(VIN)的47％患者中的持久并完全消退(肯特尔(Kenter)等人，2009，新英格兰医学杂志(N Engl J Med)361:1838-47)。类似地，一项研究，其中在VIN 2/3患者中将基于蛋白的疫苗(TA-CIN，由HPV16 E6、E7和L2的融合蛋白组成)与局部免疫调控结合，显示出了在63％患者中的完全消退(戴雅娜(Daayana)等人，2010，英国癌症杂志(Br J Cancer)102:1129-36)。作为疫苗的合成长肽的可能缺陷包括大规模的生产及其相关成本、对潜在反应佐剂的需要以及与免疫接种相关的有关不良反应(尤其是疼痛和肿胀)。由于高度不适，当自发清除率仍然很高的时候，SLP将不可能被用于早期阶段疾病。类似地，由于在TA-CIN治疗的情况下针对局部咪喹莫特治疗的需要，耐受性是一个重要问题，因为大部分女性经历了持续咪喹莫特治疗期间的局部或全身性副作用，这可能影响日常活动。
一种可能的替代方案是使用基于核酸疫苗接种如编码用于疫苗接种的HPV E6和/或E7蛋白的DNA疫苗或病毒疫苗。
然而，HPV E6和E7蛋白具有致癌的潜力，并且因此由于抗原的拖延表达的可能性，用包括编码这些蛋白的核酸的疫苗接种造成了诱导细胞转化的风险。
因此，在基因疫苗接种的情况下，可以使用无毒的/脱毒版本的E6和/或E7，以便排除因为疫苗接种的任何细胞转化风险。通常通过针对这些蛋白功能已知重要的残基的缺失和/或取代来获得野生型E6和E7的致癌潜能丧失(例如，斯马海尔(Smahel)等人，2001，病毒学(Virology)281:231-38；扬(Yan)等人，2009，疫苗(Vaccine)27:431-40；威金(Wieking)等人，2012，癌症基因治疗(Cancer Gene Ther)19:667-74；WO 2009/106362)。然而，这些方法的缺点是它们会带来从蛋白去除重要T-细胞表位和/或将新的不希望的T-细胞表位导入蛋白中，并且因此可能不会引起所希望的免疫应答。
在去除HPV16 E6和E7的致癌潜能的可替代策略中，已经构建了E6和E7蛋白的改组版本(即，多肽，其中重新排序野生型蛋白的片段)(例如，奥施拉格等人，2006，疫苗(Vaccine)24:2880-93；奥斯特惠斯(Oosterhuis)等人，2011，国际癌症杂志(IntJ Cancer)129:397-406；奥斯特惠斯(Oosterhuis)等人，2012，人类基因治疗(Hum GenTher)23:1301-12)。然而，这些方法将仍需要生产、配制并且给予多种分子以确保包括E6和E7蛋白的所有可能性表位，这导致了次优的逻辑和相对的高成本，并且此外所描述的策略引入了不存在于E6和E7中的潜在强大的非天然表位，并且由于免疫应答可以源自与此类非天然表位相关的E6/E7表位，因此所述构建体可以不具有最优的免疫学特性。
因此，本领域仍需要抵抗HPV的治疗性疫苗，优选具有较少上述方法缺点的那些。
发明概述
本发明提供了编码多肽的核酸分子，该多肽基本上包括HPV16癌蛋白E6和E7的所有可能的T-细胞表位，然而该核酸分子，通过包括已经重新排序的E6和E7蛋白的片段，同时还包含最小化数量的不希望的新表位，具有大幅降低的(与wt E6和E7相比)直至不能检测到的转化活性。这是与之前由其他所表示的分子相反。
本发明提供了编码多肽的核酸分子，该多肽包括如SEQ ID NO:1所示的序列。
所编码的多肽可以进一步包括前导序列。
在某些实施例中，所编码的多肽进一步包括人乳头瘤病毒(HPV)E2蛋白的至少一个表位，例如HPV16 E2蛋白。可以使该E2蛋白突变以降低DNA结合，例如通过在它的DNA结合域中的缺失或突变。在某些实施例中，所编码的多肽包括如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5所示的序列。
在某些实施例中，将该核酸序列进行密码子优化，例如，用于人类细胞中的表达。
在某些实施例中，该核酸序列包括如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、或SEQ ID NO:6中所示的序列。
本发明还提供了一种包括根据本发明的核酸分子的载体，其中该编码多肽的序列可操作地连接至启动子。
在某些实施例中，该载体是DNA载体例如质粒。在其他实施例中，该载体是病毒栽体，例如，MVA载体或重组腺病毒载体。在某些优选的实施例中，该载体是重组腺病毒。
在某些实施例中，载体中的启动子可操作地偶联到阻遏物操纵基因序列上，阻遏蛋白可以结合至该阻遏物操纵基因序列上，以便在所述阻遏蛋白的存在下阻遏启动子的表达。在某些实施例中，该阻遏物操纵基因序列是TetO序列或CuO序列。
本发明还提供了疫苗组合物，该疫苗组合物包括根据本发明的载体、和药学上可接受的赋形剂。
本发明还提供了一种在受试者中诱导抵抗HPV(具体的是HPV16)的免疫应答的方法，该方法包括向受试者给予根据本发明的疫苗组合物。本发明还提供了根据本发明的疫苗，用于诱导抵抗HPV(具体的是HPV16)的免疫应答。
在某些实施例中，向受试者不止一次给予该疫苗。
本发明还提供了一种方法，用于治疗受试者的以下任一项：持续性HPV感染(具体是持续性HPV16感染)、外阴上皮内瘤样病变(VIN)、宫颈上皮内瘤样病变(CIN)、阴道上皮内瘤样病变(VaIN)、肛门上皮内瘤样病变(AIN)、宫颈癌(例如宫颈鳞状细胞癌(SCC))、口咽癌、阴茎癌、阴道癌或肛门癌，该方法包括向受试者给予根据本发明的疫苗。本发明还提供了根据本发明的疫苗，用于治疗受试者的以下任一项：持续性HPV感染(具体是持续性HPV16感染)、外阴上皮内瘤样病变(VIN)、宫颈上皮内瘤样病变(CIN)、阴道上皮内瘤样病变(VaIN)、肛门上皮内瘤样病变(AIN)、宫颈癌(如宫颈鳞状细胞癌(SCC))、口咽癌、阴茎癌、阴道癌或肛门癌。
本发明还提供了包括如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5所示序列的多肽。
附图简要说明
图1.HPV16 E6和E7的融合蛋白的表达。将HEK-293T细胞用DNA载体进行瞬时转染，该DNA载体表达图之上所指示的转基因。在转染后24hr，收获细胞并且通过SDS-PAGE和蛋白质印迹法用HPV16 E7的抗体(上图)分析细胞抽提物。显示了NF-kB的负载对照(下图)确认了所有泳道中细胞裂解物的相似的负载。分子量标记在左侧表明。这些融合蛋白的预期大小：E6E7SH约38kDa，E2E6E7SH和E6E7E2SH约75kDa，LSE2E6E7SH约78kDa。
图2.软琼脂中的菌落形成。A)软琼脂测定设置的示意图。B)在接种后六周的琼脂中以细胞40x放大率的代表性显微图像。白色箭头强调在E7wt转染细胞中所观察到的菌落。C)接种后六周，在琼脂中使用GelcountTM和相关的软件的菌落量化。*：p<0.05(泊松回归模型)；**：非劣性(具有非劣性界限为5％的广义线性模型)。
图3.E6E7SH已经失去了E6和E7活性。A)代表性蛋白质印迹证实了缺乏E6E7SH对p53的降解。将人类p53失效NCI-H1299细胞用表达p53的质粒连同表达HPV16 E6野生型、E6E7SH的质粒或空载体进行共转染。非-TF表示非转染细胞。在转染后24小时，制备细胞裂解物，并且将30μg的总蛋白装载到凝胶上。上图-p53染色，中图-E6染色，下图-NF-kB染色(装载对照)。(B)在四种独立的测定中p53水平的量化。将该p53信号标准化至NF-κB信号。C)蛋白质印迹显示缺乏E6E7SH对pRb的降解。将pRb失效Saos-2细胞用表达pRb的质粒组合表达HPV16 E7野生型、E6E7SH的质粒或空载体进行转染。非-TF表示非转染细胞。在转染后24小时，制备细胞裂解物，并且将10μg的总蛋白装载到凝胶上。上图-pRb染色，中图-E7染色，下图-NF-κB染色(装载对照)。D)在四种独立的测定中pRb水平的量化。将该pRb信号标准化至NF-κB信号。*：p<0.05(ANOVA模型)；**：非劣性(试验是基于源自ANOVA模型的95％CI’s。非劣效性界限被设为75％)。
图4.E6E7SH不永生化原代人类表皮角质形成细胞。将原代人类表皮角质形成细胞用编码HPV16(E6E7wt)的野生型E6-和E7-编码开放阅读框、E6E7SH序列或eGFP的慢病毒进行转导。非转导供体细胞被用作对照。如通过约200天的延长寿命和的hTERT激活(未显示)所示的，仅有E6E7wt的表达诱导原代角质形成细胞的永生化。十字架标志表示细胞在衰老过程中死亡并且不能进一步培养。关于详情，参见实例2。在两个另外的供体中获得相似的结果(未显示)。
图5.在DNA免疫之后由E6E7SH诱导的免疫应答-IFNγELISPOT分析。A.免疫接种方案。将CB6F1小鼠用表达E6E7SH的DNA质粒或表达非转基因的质粒(对照)进行免疫。免疫接种后两周，处死小鼠并且用对应于E7的15mer肽池刺激分离的脾细胞过夜。B.给出了以点形成单位(SFU)/106脾细胞的如通过IFNγELISPOT测定所测量的个体小鼠中E7-特异性免疫应答。
图6.E6E7SH的免疫原性-IFNγELISPOT分析。(A).免疫接种方案。将小鼠用具有如所示的插入片段的腺病毒载体进行免疫。通过IFNγELISPOT分析处于两周(B)和处于八周(C)的E7-特异性应答(表示为点形成单位(SFU)/106脾细胞)。闭环代表用1*1010vp的剂量进行免疫的小鼠，并且开环代表用5*109vp进行免疫的小鼠。黑条代表应答的几何均数。点状线表示在ELISPOT测定中的检测下限。ANOVA事后邦弗朗尼(Post-hoc Bonferroni)统计分析是在对数转换数据上进行的。*：p<0.05。关于详情，参见实例3。
图7.E2E6E7SH的免疫原性-E7-四聚体染色。(A).免疫接种方案。将CB6F1小鼠用1*1010vp的表达如所表示的转基因的腺病毒载体进行免疫。免疫接种后两周，处死该小鼠并且针对能够与E749-57-H2-Db四聚体(B)相互作用的CD8+细胞的存在分析分离的脾细胞。E7-四聚体阳性的CD8+T-细胞的百分比表示在y轴上。ANOVA事后邦弗朗尼分析是在对数转换数据上进行的，在不同的E6E7SH变体之间的差异无统计学意义。
图8.E2E6E7SH的免疫原性-IFNγELISPOT分析。(A).免疫接种方案。将CB6F1小鼠用表达图B和C下方所表示的转基因的腺病毒载体进行免疫。免疫接种后两周，处死该小鼠并且用对应于E2(B)、E6(未显示)或E7(C)的15mer肽池刺激分离的脾细胞过夜。以SFU/106脾细胞给出应答。ANOVA事后邦弗朗尼(Post-hoc Bonferroni)统计分析是在对数转换数据上进行的。由仅编码E2的腺病毒载体所诱导的E2应答高于包括E6和E7片段的本发明多肽所诱导的应答。差异对E2与E2E6E7SH和E2与E6E7E2SH是显著的(*：p<0.05)。ANOVA事后邦弗朗尼(Post-hoc Bonferroni)统计分析是在对数转换数据上进行的。
图9.在免疫的小鼠中的持续应答。(A)免疫接种方案。将CB6F1小鼠用1*1010vp的表达变体LSE2E6E7SH、E2E6E7SH、E6E7SH的Ad35载体、或用不表达转基因的腺病毒载体(空白)进行免疫。每两周取血液样品以利用四聚体染色确定E7-特异性的CD8+T-细胞的百分比。(B)免疫接种后两周的免疫应答。包括前导序列的载体诱导了比没有前导序列的载体更高的应答；LSE2E6E7SH与E2E6E7SH(*：p<0.05)。(C)应答的动力学。ANOVA事后邦弗朗尼(Post-hoc Bonferroni)统计分析是在第2周数据集的对数转换数据上进行的。尽管这些结果无统计学意义，但相比于没有E2的分子，由包括E2的分子诱导的E7应答倾向于更高。
图10.使用不同的腺病毒载体加强免疫应答。(A).免疫接种方案。将CB6F1小鼠用表达HPV16 E2E6E7SH(HPV16-Tx)的Ad26载体或用不表达转基因的Ad26载体(空白)进行免疫。两周后，用如图的下方所表示的基于Ad35的载体重复该免疫接种。在第二次免疫接种后四周，处死小鼠并且用血液样品利用四聚体染色(B)来确定E7-特异性CD8+T-细胞的百分比。*表示Ad26.HPV16-Tx/Ad35.HPV16-Tx与Ad26.HPV16-Tx/Ad35.空白的比较，p<0.05(在对数转换数据上的学生t-检验，针对多重比较，α＝0.01)。
图11.在猕猴中的E2E6E7SH的细胞免疫原性。(A)免疫接种方案。在第0天将猕猴进行免疫：通过肌肉注射免疫接种(i.m)八只动物获得了Ad26.HPV16-E2E6E7SH并且两只对照动物获得了Ad26.空白。在8周时给予加强免疫接种(Ad26.HPV16-E2E6E7SH或Ad26.空白)。在16周，动物接受了具有表达相同E2E6E7SH的Ad35载体的第二次加强免疫接种，同时对照动物接受了Ad35.空白。腺病毒载体的剂量为1*1011vp/免疫接种。在若干时间点进行抽血。(B)通过IFNγELISPOT测量PBMC中的细胞免疫应答。用对应于HPV16 E2、E6或E7的肽池刺激PBMC，并且描绘在1*106PBMC中点形成单位(SFU)的数量。空白对照动物(n＝2)显示了没有可检测到的应答。关于详情，参见实例4。
图12.表达HPV16-E2E6E7SH的腺病毒载体的治疗效果。(A)TC-1注射和免疫接种方案。在第0天用1*105TC-1细胞经皮下注射CB6F1小鼠。在六天后，当肿瘤明显时，以在200μl0.9％盐水(该盐水补充以5nmol ODN1826-CpG(B)或Ad26.HPV16-E2E6E7SH(C))的最终体积中的150μg，将小鼠用覆盖HPV16 E6和E7免疫显性表位(即，HPV16 E6，aa41-65(KQQLLRREVYDFAFRDLCIVYRDGN；SEQ ID NO:18)和HPV16 E7aa43-77(GQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIR；SEQ ID NO:19))的两个SLP进行免疫。对照小鼠接收单独的CpG(D)或Ad26.空白(E)。在第20天，所有的小鼠接收了加强免疫接种。将在初次免疫接种中接收Ad26载体的小鼠随后用对应的Ad35载体进行免疫。如在初次免疫接种中一样，其他小鼠接收以单独的CpG或CpG为佐剂的SLP。(B-E)在注射了TC-1的小鼠中的肿瘤测量。肿瘤体积计算为(宽度2*长度)/2。当肿瘤体积超过1000mm3时，处死小鼠。由于大于20％的重量损失，必须处死小鼠(用星号表示)。(F-G)针对头35天的图B和C的一个特写。(H)在TC-1注射后的存活。相比于用SLP和CpG进行免疫的小鼠，用Ad.HPV16-E2E6E7SH治疗的小鼠的存活显著增加(对数秩检验p<0.05)。在试验结束时(在第92天)，三只用Ad.HPV16-E2E6E7SH进行免疫的小鼠是无肿瘤的。
图13.携带编码HPV Ag或LSE2E6E7SH的转基因的腺病毒载体显示了关于在能够阻遏转基因表达的细胞上的增加的病毒产量。A)针对Ad35载体的病毒产量测定。用携带编码GFP-Luc或HPVAg的转基因的Ad35载体感染PER.C6、PER.C6/CymR、和PER.C6/TetR细胞。用包含CuO或TetO的CMV启动子驱动这些转基因。在感染后四天通过基于Ad35六邻体特异性qPCR的方法确定病毒产量。B)针对Ad26载体的病毒产量测定。用携带编码GFP-Luc、HPVAg、或LSE2E6E7SH的转基因的Ad26载体感染PER.C6和PER.C6/TetR细胞，所有这些转基因都通过包含TetO的CMV启动子进行驱动。在感染后三天通过基于Ad26六邻体特异性qPCR的方法确定病毒产量。关于详情，参见实例6。
图14.在载体生产过程中，使用阻遏转基因表达的阻遏物系统防止携带编码HPVAg的转基因的腺病毒载体中转基因盒的不稳定。通过对PER.C6或PER.C6/CymR细胞系的DNA转染，拯救在CMVCuO的控制下的表达HPVAg的Ad35载体。挑选所得的病毒噬斑—每细胞系五个—并且用于对各细胞系的连续感染循环。A)在10次病毒传代后通过PCR分析载体转基因盒区域的整合。将从PER.C6和PER.C6/CymR传代的病毒分离株获得的PCR产物分别示于中图和右图中。通过桑DNA格测序分析针对PER.C6传代的病毒分离株1、2、4、和5所获得的看似全长的PCR产物，以及针对PER.C6/CymR传代的分离株1至5所见到的那些。色谱图迹线(未显示)的分析揭示了在PER.C6上生长的所有的分离株，而不是在PER.C6/CymR上生长的那些，包含在HPVAg的编码序列内的移码小缺失或过早终止突变。B)在七次病毒传代后分析载体表达HPVAg的能力。用生长在PER.C6和PER.C6/CymR上的病毒分离株转导A549细胞，并且通过蛋白质印迹法使用HPV16 E7-特异性抗体分析HPVAg表达。针对HPVAg的预测大小为83kDa。关于详情，参见实例6。
发明详细说明
本发明提供了编码多肽的核酸分子，该多肽包括SEQ ID NO:1。该多肽是一种融合多肽，并且有时在此称为本发明的多肽，或本发明的融合多肽。使用该多肽产生对HPV16的E6和E7蛋白的免疫应答，并且因此该核酸分子可以被用作预防持续性HPV16感染、以及其相关疾病的治疗性疫苗。
本发明的多肽是一种精心设计的分子，该分子事实上包含以片段形式的HPV16的完整的E6和E7氨基酸序列(它只缺少一个来自天然HPV16 E6蛋白C-端的氨基酸)，该片段是重新排序的并且部分重叠的，这样使得(实质上)HPV16 E6和E7蛋白的所有的T-细胞表位出现。已经由其他人描述了具有一些作为HPV疫苗的潜能的早期分子(例如，肯特尔(Kenter)等人2009，新英格兰医学杂志(N Engl J Med)361:1838-47；戴雅娜(Daayana)等人，2010，英国癌症杂志(Br J Cancer)102:1129-36；斯马海尔(Smahel)等人，2001，病毒学(Virology)281:231-38；扬(Yan)等人，2009，疫苗(Vaccine)27:431-40；奥施拉格等人，2006，疫苗(Vaccine)24:2880-93；奥斯特惠斯(Oosterhuis)等人，2011，国际癌症杂志(Int J Cancer)129:397-406；EP1183368，WO 2013/083287)，但是这些分子中的每个具有一个或多个缺点。在至少一个并且典型的是若干方面中，相对于早期描述的方法，本发明由设计师专门设计的多肽分子是有利的。具体而言，本发明的分子和/或载体的优点包括：(i)它们具有所希望的安全谱，因为该核酸具有大幅降低的(与天然E6和E7蛋白质相比)直到不能检测到的转化活性；(ii)它们是单一核酸分子，该单核酸分子容易在工业规模上以经济上可行的手段进行生产，并且不像多分子方法，不会造成逻辑上的挑战；(iii)该编码多肽基本上包括天然HPV16 E6和E7蛋白的所有T-细胞表位；(iv)编码多肽的设计已经最小化所不希望的潜在强大的新表位的引入(即，即不存在于天然E6和E7蛋白的表位)；以及(v)在某些实施例中，它们不依赖于高度反应性的佐剂以提升所希望的免疫应答。因此，通过将各种有利特点结合在单一设计中，本发明的分子代表了一大步迈进，并且是主要针对抵抗HPV16的治疗性疫苗的优秀的候选物。这些分子还可能作为抵抗HPV16的预防性疫苗，意指它们可能预防已接种疫苗的受试者的HPV16持续感染。
在某些实施例中，通过精心设计，将针对20种最常见的HLA-A等位基因、20种最常见的HLA-B等位基因和20种最常见的HLA-C等位基因具有<50nM的预计结合亲和力的具有九个氨基酸长度的新表位的数量最小化至仅一个。这是超越其他人所描述的构建体的一个显著改进，该改进针对单次改组的E6蛋白已经包含了超过30个此类新表位，并且改进的构建体将高度可能在序列中包括甚至更多的新表位，这些序列附加至这些构建体以防止表位的丢失(奥施拉格等人，2006，疫苗(Vaccine)24:2880-93)。因此，相比于其他人描述的方法，由于相比于天然E6和E7，改变的免疫应答的偶然性已经在本发明的分子中最小化，因此本发明的构建体具有显著改进的免疫学谱。
本领域技术人员可以使用常规的技术进行核苷酸取代，这些取代不影响多核苷酸编码的多肽序列，这些多核苷酸被描述以反映有待表达这些多肽的任何具体的宿主生物体的密码子使用。因此，除非另外说明，否则“编码一种氨基酸序列的一种核苷酸序列”包括彼此呈简并型式且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质和RNA的核苷酸序列可以包括内含子。
在一个优选实施例中，对编码根据本发明的多肽的核酸进行密码子优化，以在哺乳动物细胞、优选地人类细胞中表达。密码子优化的方法已知并且已经在先前描述(例如WO96/09378)。如与一种野生型序列相比，如果至少一个非优选密码子被更优选的密码子置换，那么认为一种序列是密码子优化的。在此，一个非优选密码子是在一种生物体中不如另一个编码相同氨基酸的密码子经常地使用的一个密码子，并且一个更优选的密码子是在一种生物体中比一个非优选密码子更经常地使用的一个密码子。对于特定生物体的密码子使用的频率可见于密码子频率表中，如在http://www.kazusa.or.jp/codon中。优选的是多于一个非优选密码子，例如，超过10％、40％、60％、80％的非优选密码子，优选的是最多的(例如，至少90％)或所有非优选密码子，由更优选的密码子替代。优选地，在一种生物体中最经常使用的密码子用于一种密码子优化序列。被优选的密码子置换一般引起更高表达。
核酸序列可以使用常规的分子生物学技术克隆，或通过DNA合成重新产生，这可以通过在DNA合成和/或分子克隆领域具有业务的服务公司(例如基因艺术公司(GeneArt)、基斯奎思公司(GenScripts)、英杰公司(Invitrogen)、欧陆公司(Eurofins))使用常规程序执行。
本领域技术人员将理解，可以改变蛋白质，例如，通过氨基酸取代、缺失、添加、等等，例如使用常规的分子生物学程序。一般来说，可以在多肽的功能性或免疫原性没有损耗地应用保守性氨基酸取代。这可以根据本领域技术人员所熟知常规程序进行检测。
在某些实施例中，根据本发明的编码的多肽进一步包括一种前导序列，又称为信号序列或信号肽。它是存在于大部分注定去往分泌通路的新合成的蛋白质的N-端的短(典型地5-30个氨基酸长)肽。此种序列的存在可以导致表达和免疫原性的增加。可以使用的非限制性实例是IgE前导肽(参见，例如，US 6,733,994；例如具有序列MDWTWILFLVAAATRVHS(SEQ ID NO:7))或HAVT20前导肽(例如，具有序列MACPGFLWALVISTCLEFSMA(SEQ ID NO:9))。可以将这些中的一个任选地添加至本发明多肽的N-端。在其他实施例中，根据本发明的多肽不包括前导序列。
存在不同类型的HPV(已经识别了超过120种类型并且以编号进行指代)，并且尽管针对某些抗原可能存在一些交叉反应性，但是一般针对每种需要被疫苗覆盖的类型，类型特异性抗原可能需要被掺入疫苗中。类型16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73、和82是致癌“高危”的性传播HPV，并且可以导致发展为以下各项：宫颈上皮内瘤样病变(CIN)、外阴上皮内瘤样病变(VIN)、阴道上皮内瘤样病变(VaIN)、阴茎上皮内瘤病变(PIN)和/或肛门上皮内瘤样病变(AIN)。根据本发明的HPV(即，编码的多肽中的E6和E7片段所源自的HPV)是HPV16。它可以被用于感染有HPV16的患者。在某些实施例中，它还可以适合与抵抗其他HPV类型的疫苗结合。在某些实施例中，该结合是与如上鉴定的抵抗高危类型的HPV的疫苗结合，例如与抵抗HPV18的疫苗结合。在其他实施例中，本发明的疫苗与抵抗HPV-18、HPV-31、HPV-33、HPV-35、HPV-39、HPV-45、HPV-51、HPV-52、HPV-56、HPV-58、HPV-59、HPV-68、HPV-73、或HPV-82中的一种或多种的疫苗结合。例如，如果还不确定HPV感染的具体类型，或如果希望具有预防作用的免疫应答抵抗不止一种HPV类型，那么可以使用此类结合。还设想了将本发明的疫苗与抵抗引起生殖器疣的HPV类型的疫苗的组合，例如HPV6和/或HPV11。这些HPV类型的序列和由其编码的蛋白(例如E6、E7、E2)可在公用数据库中提供给技术人员，例如，由国家技术信息中心(National Center for of technology Information)(NCBI)所提供的GenBank序列数据库。
根据本发明的多肽包括SEQ ID NO:1，并且在一个实施例中，根据本发明的核酸分子包括SEQ ID NO:2。
在此提供了从5’至3’方向的或从N-端至C-端的序列，如本领域中所习惯的。
根据本发明的多肽包括HPV16 E6和E7蛋白的表位。在某些实施例中，根据本发明的多肽进一步包括(并且因此编码该多肽的核酸进一步编码)至少一种另外的抗原或此类另外的抗原的一个或多个表位。此类另外的抗原优选地是HPV抗原，优选地是属于在多肽中作为E6和E7蛋白的相同HPV类型，即，HPV16。因此，此种另外的抗原可以是HPV蛋白或其免疫原片段，并且在某些实施例中，包括E2蛋白或其包括HPV(优选地是HPV16)的E2的至少一个表位的片段。此类另外的抗原或表位可以内置于包括SEQ ID NO:1的多肽中的E6和/或E7的两个片段之间，但是优选是使N-端或C-端融合至包括SEQ ID NO:1的E6/E7多肽。可替代地或此外，可以存在刺激免疫应答的氨基酸序列。因此，在某些实施例中，本发明提供了根据本发明的核酸分子，该核酸分子编码包括SEQ ID NO:1的多肽，并且其中该多肽进一步包括至少一种其他抗原，例如，HPV E2蛋白或其至少一个表位，但是优选是更多个表位。针对本发明，添加E2蛋白的一个优点是已知在感染期间/在E6和E7表达仍然非常低的低度病变中E2是早期表达的。在向宫颈癌发展期间，失去了E2表达并且其结果是E6和E7水平的提高(汤川村(Yugawa)和清野(Kiyono)，2009，医学病毒学评论(Rev Med Virol)19:97-113)。将来自E2、E6和E7中的表位结合于一个疫苗中允许在一个广泛标靶群体的患者中治疗，该患者范围为患有持续感染至患有浸润性宫颈癌(或其他HPV16引起的癌症)。在某些实施例中，该E2蛋白是野生型E2蛋白。在某些其他实施例中，该E2蛋白在其DNA结合域中具有已缺失或一个或多个突变(相比于野生型E2蛋白)。HPV16 E2蛋白的序列(NP_041328.1)可以发现于NCBI蛋白数据库中(www.ncbi.nlm.nih.gov/protein)在编号NP_041328.1下。已知该蛋白的C-端部分中的E2中若干单个氨基酸变化例如G293V、K299M、或C300R废止了DNA结合。使用缺少DNA结合能力的E2的变体或片段的优点是它能够在其表达的细胞中通过直接结合至宿主细胞DNA防止不可预测的转录变化。可以内部添加该E2蛋白或其部分或片段，但是优选的是添加至具有SEQ ID NO:1的本发明的多肽的N-端或C-端。在一个实施例中，本发明的核酸分子编码包括SEQ ID NO:3的多肽。在其一个实施例中，本发明的核酸分子包括SEQ ID NO:4。在另一个实施例中，本发明的核酸分子编码包括SEQ ID NO:5的多肽。在其一个实施例中，本发明的核酸分子包括SEQ ID NO:6。
还可以进一步使本发明由设计师专门设计的多肽与另外的蛋白融合，例如，所谓的载体蛋白，例如钙网蛋白、结核分枝杆菌热休克蛋白-70、IP10、或破伤风毒素片段C(参见奥斯特惠斯(Oosterhuis)等人，人类基因治疗(Human Gene Ther)，2012，见上文，如需更多实例)，这些另外的蛋白可以进一步提高对HPV E6和E7(和任选地E2)表位的免疫应答。因此本发明还提供了此类另外的融合蛋白，以及对其进行编码的核酸。
在某些实施例中，将根据本发明的核酸分子掺入载体中。如在此使用的“载体”典型地是人工运载外源遗传物质到另一个细胞中的运载体，其中可以对它进行复制和/或表达，并且根据本发明它可以是任何包括根据本发明核酸分子的核酸分子。这些可以通过常规分子生物学技术例如克隆进行制备。典型地，此类载体可以在至少一种类型的适合宿主中进行繁殖，例如细菌、酵母菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞、以及类似物。载体的四种主要类型是质粒、病毒载体、粘粒、和人工染色体。该载体本身一般是由插入片段(转基因，在本发明中编码本发明融合多肽的核酸)和序列(该序列作为载体的“骨架”)组成的DNA序列。转移遗传信息至另一个细胞的载体的目的典型地是为了分离、扩增、或表达靶细胞中的插入片段。优选的是，编码多肽的序列可操作地连接至载体中的启动子。术语“可操作地连接”意指感兴趣的核苷酸序列以一种方式连接至启动子，该方式允许该核苷酸序列(例如，当该载体导入宿主细胞时，在宿主细胞中)表达。表达调节序列可以可操作地连接至转基因上。在某些实施例中，设计载体用来在靶细胞中表达转基因，并且该载体一般具有驱动该转基因表达的启动子序列。在某些实施例中，可以存在常规使用的载体元件(例如转录终止子序列、聚腺苷尾序列、Kozak序列、UTR、复制原点、多克隆位点、遗传标记、抗生素抗性、和另外的序列)中的一种或多种，并且本领域技术人员可以设计一种载体，这样使得其具有所希望的性质，例如用于在某些细胞中复制以繁殖并扩增载体，并且在引入该载体的靶细胞中用于载体中的转基因的表达。包括编码根据本发明的融合多肽的核酸的载体，优选的是被设计用于在哺乳动物细胞中表达的载体，适于作为根据本发明的疫苗。在某些实施例中，根据本发明的载体是一种质粒、粘粒、酵母人工染色体、细菌人工染色体、病毒载体、或诸如此类。本领域的普通技术人员知道不同的启动子可以用于获得宿主细胞中一种基因的表达。在真核细胞中用于表达的一些熟知的并且常用的启动子包括源自病毒的启动子，如腺病毒，例如E1A启动子；源自巨细胞病毒(CMV)的启动子，如CMV立即早期(IE)启动子(在此称为CMV启动子)(例如可从pcDNA获得，英杰公司(Invitrogen))，源自猿猴病毒40(SV40)的启动子(例如可从pIRES获得，目录号631605，BD科学)；以及类似物。适合的启动子还可以源自真核细胞，如金属硫蛋白(MT)启动子、延长因子1α(EF-1α)启动子、泛素C或UB6启动子、肌动蛋白启动子、免疫球蛋白启动子、热休克启动子、以及类似物(参见例如WO 2006/048459)。用于获得在真核细胞中的表达的一种适合的启动子的一个非限制性实例是一种CMV-启动子(US 5,385,839)，例如CMV立即早期启动子，例如包括来自CMV立即早期基因增强子/启动子的nt.-735到+95，例如如在此所提供的具有如SEQ ID NO:13所示的序列的CMV启动子。一种聚腺苷酸化信号，例如牛生长激素polyA信号(US 5,122,458)可以存在于该(这些)转基因后面。
还可以添加其他调节序列。在此可以将术语“调节序列”与“调节元件”互换地使用，并且是指核酸的区段，典型地但不限于DNA，该核酸的区段调节它可操作地连接的核酸序列的转录，并且因此作为转录调谐子。调节序列通常包括作为转录结合域的核酸序列，该转录结合域被转录蛋白和/或转录因子、增强子或阻遏物等等的核酸结合域进行识别。例如，可能使阻遏物序列与启动子可操作地偶联，该阻遏物序列可以被阻遏蛋白限制，该阻遏蛋白可以降低或阻止表达该阻遏蛋白的生产细胞系中的转基因的表达。当传代时和/或当其在生产细胞系中大量生产时，这可以改进核酸分子的遗传稳定性和/或表达水平。本领域已经描述了此类系统。例如，调节序列可以包括一种或多种四环素操纵基因操纵基因序列(tetO)，这样使得在四环素操纵基因阻遏蛋白(tetR)存在下抑制表达。在不存在四环素下，该tetR蛋白能够结合至tetO位点并且阻遏可操作地连接至tetO位点的基因的转录。然而，在四环素的存在下，tetR蛋白质中构象变化阻止其结合至操纵基因序列，允许发生可操作连接的基因的转录。在某些实施例中，本发明的核酸分子，例如当存在于重组腺病毒载体中，可以任选地包括可操作地连接至启动子的tetO，这样使得在重组腺病毒中抑制了一种或多种转基因的表达，这些重组腺病毒产生在表达tetR蛋白的生产细胞系中。随后，如果将重组腺病毒引入受试者或不表达tetR蛋白的细胞中，那么将不能抑制表达(例如，国际专利申请WO07/073513)。在某些其他实施例中，本发明的核酸分子，例如当存在于重组腺病毒中时，可以任选地包括cumate基因开关系统，其中调节表达是通过将阻遏物(CymR)结合至操纵基因位点(CuO)，置于启动子下游进行介导(例如，穆立克(Mullick)等人，BMC生物技术(BMC Biotechnol.)2006 6:43)。在此使用的，术语“阻遏物”是指具有抑制、干扰、延迟和/或阻遏重组表达载体的异源蛋白产物的产生的能力的实体(例如，蛋白或其他分子)。例如，通过干扰表达载体中(如在表达盒中)处于适当位置的结合位点。阻遏物的实例包括tetR、CymR、乳糖阻遏物、trp阻遏物、半乳糖阻遏物、λ阻遏物、以及其他本领域中已知的适当的阻遏物。在此提供了使用tetO/tetR操纵基因/阻遏物系统和使用CuO/CymR操纵基因/阻遏物系统的实例。阻遏在载体繁殖期间载体转基因表达可以防止转基因的不稳定性，并且可以在生产期间增加具有本发明转基因的载体的产量。因此，在一些实施例中，本发明载体具有一种启动子，该启动子可以通过阻遏蛋白的结合被阻遏，例如通过具有可操作地偶联到阻遏物操纵基因序列上的启动子(例如，在非限制性实施例中，一种包含TetO的序列，例如表示为SEQ ID NO:11的一个序列，或者包含CuO的序列，例如例如表示为SEQ ID NO:12的一个序列)，阻遏蛋白(例如，TetR蛋白，例如具有表示为SEQ ID NO:15的氨基酸序列，或着CymR蛋白，例如具有表示为SEQ ID NO:17的氨基酸序列)可以结合至该阻遏物操纵基因序列。
在某些实施例中，该载体是质粒DNA分子，或其片段。这些可以用于DNA疫苗接种。其他平台可以用作载体，例如减毒活双缺失的单核细胞增生李斯特菌菌株。
在其他实施例中，该载体是重组病毒载体，该重组病毒载体可以是可复制型或复制缺陷型的。在某些实施例中，一种病毒载体包括重组DNA基因组。在某些实施例中，根据本发明的载体例如是重组腺病毒、重组反转录病毒、重组痘病毒如牛痘病毒(例如修饰的安卡拉痘苗(MVA))、重组α病毒如塞姆利基森林病毒、重组副粘病毒，如重组麻疹病毒、或其他重组病毒。在某些实施例中，根据本发明的载体是MVA载体。
在优选的实施例中，根据本发明的载体是重组腺病毒。腺病毒用作疫苗的优点包括操作简单、优良的大规模可制造性、以及良好的安全记录，该良好的安全记录基于使用已经报道过的多种腺病毒载体在研究、开发、生产和临床试验中的多年经验。被用作疫苗的腺病毒载体通常提供了对转基因所编码的蛋白的良好的免疫应答，该免疫应答包括细胞免疫应答。根据本发明的腺病毒载体可以基于任何类型的腺病毒，并且在某些实施例中，是可以为任何血清型的人类腺病毒。在其他实施例中，它是一种猿猴腺病毒，如可以为任何血清型的黑猩猩或大猩猩腺病毒。在某些实施例中，根据本发明的载体是人类腺病毒血清型5、26或35的。重组腺病毒载体的制备在本领域中是熟知的。在某些实施例中，根据本发明的腺病毒载体在腺病毒基因组的E1区域(例如，E1a区域和/或E1b区域)的至少一个必需基因功能中是有缺陷的，E1区域属于对病毒复制的必需腺病毒基因组。在某些实施例中，根据本发明的腺病毒载体在非必须E3区域的至少部分中是有缺陷的。在某些实施例中，该载体在E1区域的至少一个必需基因功能中以及在非必须E3区域的至少部分中是有缺陷的。
腺病毒载体、其构建方法和其繁殖方法是本领域所熟知的，并且被描述于，例如，美国专利号5,559,099、5,837,511、5,846,782、5,851,806、5,994,106、5,994,128、5,965,541、5,981,225、6,040,174、6,020,191、和6,113,913，和托马斯申克(Thomas Shenk)，“(腺病毒及其复制)Adenoviridae and their Replication”，M.S.霍维茨(Horwitz)，“腺病毒(Adenoviruses)”，分别第67和68章，在病毒学(Virology)中，B.N.菲尔茨(Fields)等人，编辑，第3版，雷文出版社有限公司(Raven Press,Ltd.)，纽约(1996)，以及在此提及的其他参考资料。典型地，腺病毒载体的构建涉及使用标准分子生物技术，如在以下描述的那些，例如，萨姆布鲁克(Sambrook)等人，分子克隆，实验室手册(Molecular Cloninga,LaboratoryManual)，第2版，冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press)，冷泉港，纽约，(1989)，沃森(Watson)等人，重组DNA(Recombinant DNA)，第2版，科学美国人书刊(ScientificAmerican Books)(1992)，和奥苏贝尔(Ausubel)等人，分子生物学现代方法(CurrentProtocols in Molecular Biology)，威利国际科学出版社(Wiley IntersciencePublishers)，纽约(1995)，和在此提及的其他参考资料。
针对重组腺病毒的具体优选的血清型是人类血清型35或人类血清型26。例如在WO2007/104792中和在阿宾克(Abbink)等人，2007病毒学(Virology)81:4654-63中描述了rAd26载体的制备。Ad26的示例性基因组序列发现于GenBank登录号EF 153474中和WO2007/104792的SEQ ID NO:1中。例如，在美国专利号7,270,811中、在WO 00/70071中、和在沃格尔(Vogels)等人，2003，病毒学杂志(J Virol)77:8263-71中，描述了rAd35载体的制备。Ad35的示例性基因组序列发现于GenBank登录号AC_000019中和WO 00/70071的图6中。
在某些实施例中，该腺病毒是复制缺陷的，例如，因为它包含在基因组的E1区域中的缺失。正如本领域技术人员已知的，在缺失来自腺病毒基因组的必须区域的情况下，由这些区域编码的功能必须由菌株反式提供，优选的是由生产细胞提供，即，当E1、E2和/或E4区域的部分或全部从腺病毒中删除时，这些必须存在于生产细胞中，例如整合到其基因组中，或以所谓的辅助腺病毒或辅助质粒形式。这些腺病毒还可以具有在E3区域中的缺失，该缺失针对复制是非必要的，并且因此不必补充此种缺失。
可以使用的生产细胞(有时在本领域中以及在此还称为‘包装细胞’或‘补充细胞’)可以是任何生产细胞，其中可以繁殖所希望的腺病毒。例如，在生产细胞中完成重组腺病毒载体的繁殖，该生产细胞补充了腺病毒中的缺陷。此类生产细胞优选在其基因组中具有至少一个腺病毒E1序列，并且从而能够补充在E1区域中具有缺失的重组腺病毒。可以使用任何补充E1的生产细胞，如由E1永生化的人类网膜细胞，例如911或PER.C6细胞(参见美国专利5,994,128)、E1转化的羊水细胞(参见欧洲专利1230354)、E1转化的A549细胞(参见例如WO 98/39411，美国专利5,891,690)、GH329：海拉细胞(高(Gao)等人，2000，人类基因治疗(Hum Gene Ther)11:213-19)、293、以及类似物。在某些实施例中，这些生产细胞是，例如，HEK293细胞、或PER.C6细胞、或911细胞、或IT293SF细胞等。在(科夫斯迪(Kovesdi)等人，2010，病毒2:1681-703)中评论了生产细胞中腺病毒载体的生产。
在某些实施例中，E1缺陷的腺病毒包括亚组C的腺病毒(Ad5)的E4-orf6编码序列。这允许在表达Ad5的E1基因的熟知的补充细胞系中此类腺病毒的繁殖，如例如293细胞或PER.C6细胞(参见，例如哈文格(Havenga)等人，2006，普通病毒学杂志(J Gen Virol)87:2135-43；WO 03/104467，将其通过引用以其全文结合在此)。
在本发明的载体中“异源核酸”(在此还称为‘转基因’)是非天然存在于载体中的核酸，并且根据本发明，编码本发明融合多肽的核酸当存在于载体中时被认为是异源核酸。例如，通过标准分子生物学技术将其引入载体中。例如，可以将其克隆至腺病毒载体的缺失的E1或E3区域，或在E4区域和rITR之间的区域中。一种转基因通常可操作地连接到表达控制序列。在优选的实施例中，将转基因克隆至腺病毒载体的E1区域中。
可以根据本领域技术人员熟知的各种方法进行载体的生产，如DNA载体、或重组腺病毒载体。一般来说，生产需要在培养细胞中繁殖来产生大量的载体材料，随后从细胞培养物中获得载体，并且典型的是随后进一步纯化载体以去除其他物质并且获得纯化的载体，可以将该载体配制到药用组合物中(例如，霍根森(Hoganson)等人，2002，生物工艺杂志(BioProcessing J)1:43-8；埃文斯(Evans)等人，2004，药物科学杂志(J Pharm Sci)93:2458-75)。例如，用于从生产细胞的培养物中获得腺病毒的方法已经例如广泛描述于WO2005/080556中。例如WO 2010/060719、和WO 2011/098592，二者通过引用结合在此，描述了用于获得并纯化大量重组腺病毒的适合的方法。
在某些方面，本发明还提供了由根据本发明所述的核酸分子编码的多肽。此种多肽包括SEQ ID NO:1。在某些实施例中，此种多肽可以包括SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5。此种多肽的特征如上所述。此种多肽可以例如直接用作抵抗HPV的疫苗。
本发明进一步提供了包括根据本发明的核酸分子、载体或多肽的疫苗，其中针对这些方面中的每个的实施例可以包括如以上所描述的那些。在优选的实施例中，根据本发明所述的疫苗包括根据本发明的所述的核酸分子。在本发明的其他优选实施例中，该疫苗包括根据本发明所述的载体，优选是DNA载体、MVA载体、或重组腺病毒载体。
在某些实施例中，根据本发明所述的疫苗进一步包括活性成分，例如，编码不同于HPV16的至少一种HPV类型的E6和/或E7蛋白的至少一个表位的核酸，例如高危的HPV类型如HPV18、HPV-31、HPV-33、HPV-35、HPV-39、HPV-45、HPV-51、HPV-52、HPV-56、HPV-58、HPV-59、HPV-68、HPV-73、或HPV-82。
术语“疫苗”是指一种试剂或组合物，该试剂或组合物包含在受试者中有效诱导预防程度和/或治疗程度的免疫性抵抗某种病原体或疾病的活性组分，在此是治疗性地针对HPV。根据本发明，该疫苗典型地包括核酸分子、或载体、以及药学上可接受的赋形剂。当向受试者给予的时候，由根据本发明的核酸分子所编码的多肽将在该受试者中表达，该表达将导致对存在于该多肽中的E6和/或E7抗原片段的免疫应答。瞬时分子(instantmolecule)的优点是HPV16 E6和E7的基本上所有T-细胞表位是存在的，并且因此存在于野生型E6或E7中的任何表位的T-细胞应答可以配备到疫苗中。此外，针对根据本发明的核酸分子该疫苗具有如上所述的安全性和有效性的优点。
针对向人给予，本发明可以使用包括载体和药学上可接受的载体或赋形剂的药用组合物。在本上下文中，术语“药学上可接受的”意指该载剂或赋形剂在所采用的剂量和浓度下不会在它们给予的受试者中引起任何不必要或不良的影响。这些药学上可接受的赋形剂是本领域中众所周知的(参见雷明登氏制药科学(Remington’s PharmaceuticalSciences)，第18版，A.R.热纳罗(Gennaro)编，马克出版社(Mack Publishing Company)[1990]；肽和蛋白质的医药配制品发展(Pharmaceutical Formulation Development ofPeptides and Proteins)，S.弗罗加尔(Frokjaer)和L.霍夫高(Hovgaard)编，泰勒弗朗西斯集团(Taylor&Francis)[2000]；以及医药赋形剂手册(Handbook of PharmaceuticalExcipients)，第3版，A.凯博(Kibbe)编，英国医药出版社(Pharmaceutical Press)[2000])。赋形剂通常是用药物的活性成分配制的、药学上无活性的物质。赋形剂通常被用来增大包含有效活性成分(因此通常称为“膨胀剂”、“填料”、“稀释剂”)的配制品，以允许当生产剂型时方便并准确的分配药品。它们还可以服务各种增强治疗的目的，如促进药物吸收或溶解、或其他药物动力学考虑。赋形剂还可以在制造过程中使用，除帮助体外稳定性如在预期的保质期中防止变性以外，还来帮助处理所关心的活性物质如通过促进粉末流动性或不黏性。适当的赋形剂的选择还取决于给予途径和剂型，连同活性成分及其他因素。
尽管还可以运用冻干制品，但该纯化的核酸分子、载体或多肽优选地是作为一种无菌溶液进行配制和给予。无菌溶液是通过无菌过滤或通过本领域中自身已知的其他方法制备。这些溶液接着冻干或填充到医药剂量容器中。溶液的pH值一般在pH 3.0到9.5的范围内，例如pH 5.0到7.5。该核酸分子或载体或多肽典型地是在具有适合缓冲液的溶液中，并且该载体的溶液还可以包含一种盐。任选地稳定剂可以存在，如白蛋白。在某些实施例中，添加清洁剂。在某些实施例中，疫苗可以被配制为可注射制品。这些配制品包含有效量的核酸分子、载体或多肽(这些有效量的核酸分子、载体或多肽是无菌液体溶液、液体悬浮液或冻干的版本)，并且可任选地包含稳定剂或赋形剂。
例如，重组腺病毒载体可以储存于缓冲液中，该缓冲液还可以用于腺病毒世界标准(Adenovirus World Standard)(霍根森(Hoganson)等人，2002，生物工艺杂志(Bioprocessing J)1:43-8)：20mM Tris pH 8，25mM NaCl，2.5％甘油。适用于向人类给予的另一种有用的配制品缓冲液是20mM Tris、2mM MgCl2、25mM NaCl、蔗糖10％w/v、聚山梨酯-80 0.02％w/v。适用于重组腺病毒的另一种配制品缓冲液包括10-25mM柠檬酸盐缓冲液pH 5.9-6.2，4％-6％(w/w)羟丙基-β-环糊精(HBCD)、70-100mM NaCl、0.018％-0.035％(w/w)聚山梨酯-80、以及任选地包括0.3％-0.45％(w/w)乙醇。显而易见地，可以使用许多其他缓冲液，并且已知针对存储和针对纯化载体的药用给予的适合的配制品的若干实例。
在某些实施例中，包括载体的组合物进一步包括一种或多种佐剂。佐剂在本领域中已知来进一步提高对一种所施加的抗原决定簇的免疫应答。术语“佐剂”和“免疫刺激剂”在此可互换地使用，并且被定义为引起免疫系统刺激的一种或多种物质。在此上下文中，一种佐剂用来增强对由本发明载体中核酸分子编码的多肽的免疫应答。适合佐剂的实例包括铝盐，如氢氧化铝和/或磷酸铝和/或磷酸铝钾；油-乳液组合物(或水包油型组合物)，包括角鯊烯-水乳液，如MF59(参见例如WO 90/14837)；皂苷配制品，例如像QS21和免疫刺激复合物(ISCOMS)(参见例如US 5,057,540；WO 90/03184、WO 96/11711、WO 2004/004762、WO2005/002620)；细菌或微生物衍生物，其实例是单磷酰基脂质A(MPL)、3-O-脱酰基MPL(3dMPL)、包含CpG-基序的寡核苷酸、ADP-核糖基化细菌毒素或其突变体，如大肠杆菌热不稳定的肠毒素LT、霍乱毒素CT等等。还可以使用载体编码的佐剂，例如，通过使用编码感兴趣的抗原与C4-结合蛋白(C4bp)的低聚反应域的融合物的异源核酸(例如，索拉波米(Solabomi)等人，2008，感染与免疫(Infect Immun)76:3817-23)，或通过使用编码感兴趣的转基因和TLR-3激动剂如异源性dsRNA(例如WO 2007/100908)的载体，或诸如此类。
在其他实施例中，本发明的组合物不包括佐剂。
可以将药用组合物给予受试者，例如人类受试者。在一次给予期间向受试者提供的疫苗活性组分的总剂量可以按照技术从业人员已知的进行改变，并且针对腺病毒通常是在1x 107病毒颗粒(vp)和1x 1012vp之间，优选地是在1x 108vp和1x 1011vp之间，例如在3x108和5x 1010vp之间，例如在109和3x 1010vp之间。针对DNA疫苗，每次给予的DNA的总量可以例如是在1μg和10mg之间。如果将基因枪用于给予，典型的是使用低剂量，例如10μg。针对肌肉注射，典型地是使用较高剂量，例如高达5mg。
药用组合物的给予可以使用标准给予途径执行。非限制性实施例包括不经肠给予，如通过注射，如皮内、肌肉内等，或者皮下或经皮、或粘膜给予，例如鼻内、经口、阴道内、直肠等等。在一个实施例内，通过肌肉注射给予组合物，例如向手臂的三角肌、或大腿的股外侧肌。在某些实施例中，该疫苗是一种DNA疫苗，并且这可以例如经皮内给予，例如通过DNA纹身法(DNA tattooing)(参见，例如，奥斯特惠斯(Oosterhuis)等人，2012，微生物学和免疫学的当前主题(Curr Top MicrobiolImmunol)351:221-50)。该途径还可用于腺病毒载体。在某些实施例中，根据本发明的组合物包括腺病毒载体并且是通过肌肉注射给予。本领域的技术人员已知给予一种组合物，如一种疫苗的不同的可能性，以诱发对疫苗中的一种或多种抗原的免疫应答。
如在此所使用的受试者优选地是哺乳动物，例如啮齿动物，例如小鼠、或非人类灵长类动物或人类。优选地，该受试者为一个人类受试者。
可以将本发明的疫苗用来治疗患有由HPV引起的疾病的各种阶段之一的患者(特别是类型16)，从这样的事件和持续性HPV感染(例如，如通过HPV DNA测试所检测的)，因此在形成(预)癌病变之前，连同宫颈上皮内瘤样病变(CIN；又称宫颈非典型增生和宫颈间质瘤，该CIN是在宫颈表面上扁平细胞的可能癌变前转换和异常生长(发育异常))至多且包括子宫颈癌(如宫颈鳞状细胞癌(SCC))。此外，可以靶向其他HPV诱导的瘤形成，如外阴上皮内瘤样病变(VIN)、阴道上皮内瘤样病变(VaIN)、阴茎上皮内瘤病变(PIN)、肛门上皮内瘤样病变(AIN)，连同口咽癌(又称头颈癌)、阴茎癌、阴道肿瘤、外阴癌以及肛门癌的晚期。因此，本发明的疫苗可以靶向广泛的HPV诱导的病变，并且可能对HPV诱导的疾病的癌前阶段最有效，例如在(持续)感染和/或瘤形成阶段，其中E2、E6和/或E7的表达最高。还可以将使用本发明的疫苗来的治疗与在晚期癌细胞中可以抵消或克服免疫逃逸机制的化合物(例如，抗PD1/PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体如伊匹木单抗、抗LAG-3抗体、抗CD25抗体、IDO抑制剂、CD40激动性抗体、CD137激动性抗体等等)结合(参见例如哈米德(Hamid)和卡瓦哈尔(Carvajal)，2013，生物治疗专家意见(Expert Opinion Biol Ther)13:847-861；梅尔曼(Mellman)等人，2011，自然综述(Nature Rev)480:480-89)。治疗性疫苗接种方法还可以在原则上，在疫苗进一步包括引起外生殖器疣的HPV类型的(序列编码的)E6和/或E7的情况下，用来治疗外生殖器疣或其前体，并且向由此种HPV类型感染的受试者给予。
在此使用的，‘治疗’意指给予疫苗来诱导患者中对表达(HPV16 E6和/或E7的表位)HPV16 E6和/或E7的细胞的治疗性免疫应答，该免疫应答导致至少降低HPV16感染的水平并且优选的是完全去除HPV16感染，这导致了至少减缓并优选的是停止HPV16引起的疾病(如瘤形成和/或其症状)的进展。优选地，用疫苗治疗也导致了HPV诱导的癌症的更晚期阶段的缓和。优选的是向患有已经分型的已形成的HPV感染的患者给予疫苗，这样使得可以给予编码对应的HPV类型的多肽的疫苗。在筛选不存在下，该疫苗还可以在部分可能被HPV感染的人群中给予，即性行为活跃的人。还可能向没有被HPV16感染的受试者给予本发明的疫苗，例如用于预防性使用，可以与抵抗患者已经感染的另一种HPV类型的疫苗结合，或可替代地在非感染的受试者中。本发明的疫苗还可以向通过其他方法经受过另外的治疗的受试者给予，例如外科手术(去除了由HPV16感染引起的病变部位)、或用咪喹莫特治疗(包括TLR-7/8激动剂，参见例如戴雅娜(Dayaana)等人，2010，英国癌症杂志(Br J Cancer)102:1129-36)。可以通过细胞学或通过HPV测试测量治疗的效果。
疫苗接种包括向受试者或患者至少给予一次本发明的疫苗。还可以提供一种或多种另外疫苗的一次或多次的加强给予。如果执行一种加强疫苗接种，那么典型地，此类加强疫苗接种将在具有相同抗原的免疫原性组合物第一次给予受试者(在这些情况下这被称为‘初免接种’)后一周与一年之间，优选地在两周与四个月之间的一个时刻给予相同的受试者。在可替代的加强方案中，还可以向受试者给予不同的载体，例如一种或多种不同血清型的腺病毒、或其他载体如MVA、或DNA、或蛋白，作为初次和增强疫苗接种。在某些实施例中，在初次-加强方案中向同一位患者给予至少两次本发明相同形式的疫苗，例如，用根据本发明的相同的重组腺病毒(如Ad26)。在某些实施例中，在初次-加强方案中至少给予两次本发明的疫苗，但是疫苗的载体不同，例如使用两种不同血清型的腺病毒载体，例如用重组Ad26初免并且用重组Ad35加强，或反之亦然；或用DNA初免并且用腺病毒载体加强，或反之亦然；或用腺病毒载体初免并且用MVA载体加强，或反之亦然。在某些实施例中，在初次-加强-加强方案中，至少给予三次根据本发明的疫苗。可以将另外的加强给予添加至方案中。
本发明的一个方面还在受试者中诱导了抵抗HPV16的CTL应答，该方面包括向受试者给予根据本发明的疫苗。
本发明还提供了以下非限制性实施例：
1)一种编码多肽的核酸分子，该多肽包括SEQ ID NO:1；
2)根据实施例1所述的核酸，其中该多肽进一步包括至少部分的HPV E2蛋白；
3)根据实施例2所述的核酸，其中该至少部分的HPV E2蛋白是来自HPV16的E2蛋白；
4)根据实施例2所述的核酸，其中该多肽包括融合到具有SEQ ID NO:1的多肽的N-端侧的至少部分的E2蛋白；
5)根据实施例2所述的核酸，其中该多肽包括融合到具有SEQ ID NO:1的多肽的C-端侧的至少部分的E2蛋白；
6)根据实施例3所述的核酸，其中该多肽包括融合到具有SEQ ID NO:1的多肽的N-端侧的至少部分的E2蛋白；
7)根据实施例3所述的核酸，其中该多肽包括融合到具有SEQ ID NO:1的多肽的C-端侧的至少部分的E2蛋白；
8)根据实施例2所述的核酸，其中该至少部分的E2蛋白包括具有突变的E2蛋白变体，该突变废止了E2的DNA结合；
9)根据实施例3所述的核酸，其中该至少部分的E2蛋白包括具有突变的E2蛋白变体，该突变废止了E2的DNA结合；
10)根据实施例4所述的核酸，其中该至少部分的E2蛋白包括具有突变的E2蛋白变体，该突变废止了E2的DNA结合；
11)根据实施例5所述的核酸，其中该至少部分的E2蛋白包括具有突变的E2蛋白变体，该突变废止了E2的DNA结合；
12)根据实施例6所述的核酸，其中该至少部分的E2蛋白包括具有突变的E2蛋白变体，该突变废止了E2的DNA结合；
13)根据实施例7所述的核酸，其中该至少部分的E2蛋白包括具有突变的E2蛋白变体，该突变废止了E2的DNA结合；
14)一种包括根据实施例1所述的核酸的载体，其中编码该多肽的序列可操作地连接至启动子；
15)一种包括根据实施例2所述的核酸的载体，其中编码该多肽的序列可操作地连接至启动子；
16)一种包括根据实施例3所述的核酸的载体，其中编码该多肽的序列可操作地连接至启动子；
17)一种包括根据实施例4所述的核酸的载体，其中编码该多肽的序列可操作地连接至启动子；
18)一种包括根据实施例5所述的核酸的载体，其中编码该多肽的序列可操作地连接至启动子；
19)一种包括根据实施例6所述的核酸的载体，其中编码该多肽的序列可操作地连接至启动子；
20)一种包括根据实施例7所述的核酸的载体，其中编码该多肽的序列可操作地连接至启动子；
21)一种包括根据实施例8所述的核酸的载体，其中编码该多肽的序列可操作地连接至启动子；
22)一种包括根据实施例9所述的核酸的载体，其中编码该多肽的序列可操作地连接至启动子；
23)一种包括根据实施例10所述的核酸的载体，其中编码该多肽的序列可操作地连接至启动子；
24)一种包括根据实施例11所述的核酸的载体，其中编码该多肽的序列可操作地连接至启动子；
25)一种包括根据实施例12所述的核酸的载体，其中编码该多肽的序列可操作地连接至启动子；
26)一种包括根据实施例13所述的核酸的载体，其中编码该多肽的序列可操作地连接至启动子；
27)根据实施例14所述的载体，其中该载体是一种腺病毒；
28)根据实施例15所述的载体，其中该载体是一种腺病毒；
29)根据实施例16所述的载体，其中该载体是一种腺病毒；
30)根据实施例17所述的载体，其中该载体是一种腺病毒；
31)根据实施例18所述的载体，其中该载体是一种腺病毒；
32)根据实施例19所述的载体，其中该载体是一种腺病毒；
33)根据实施例20所述的载体，其中该载体是一种腺病毒；
34)根据实施例21所述的载体，其中该载体是一种腺病毒；
35)根据实施例22所述的载体，其中该载体是一种腺病毒；
36)根据实施例23所述的载体，其中该载体是一种腺病毒；
37)根据实施例24所述的载体，其中该载体是一种腺病毒；
38)根据实施例25所述的载体，其中该载体是一种腺病毒；
39)根据实施例26所述的载体，其中该载体是一种腺病毒；
40)根据实施例27所述的载体，其中该腺病毒是一种血清型26的人类腺病毒；
41)根据实施例28所述的载体，其中该腺病毒是一种血清型26的人类腺病毒；
42)根据实施例29所述的载体，其中该腺病毒是一种血清型26的人类腺病毒；
43)根据实施例30所述的载体，其中该腺病毒是一种血清型26的人类腺病毒；
44)根据实施例31所述的载体，其中该腺病毒是一种血清型26的人类腺病毒；
45)根据实施例32所述的载体，其中该腺病毒是一种血清型26的人类腺病毒；
46)根据实施例33所述的载体，其中该腺病毒是一种血清型26的人类腺病毒；
47)根据实施例34所述的载体，其中该腺病毒是一种血清型26的人类腺病毒；
48)根据实施例35所述的载体，其中该腺病毒是一种血清型26的人类腺病毒；
49)根据实施例36所述的载体，其中该腺病毒是一种血清型26的人类腺病毒；
50)根据实施例37所述的载体，其中该腺病毒是一种血清型26的人类腺病毒；
51)根据实施例38所述的载体，其中该腺病毒是一种血清型26的人类腺病毒；
52)根据实施例39所述的载体，其中该腺病毒是一种血清型26的人类腺病毒；
53)根据实施例28所述的载体，其中该腺病毒是一种血清型35的人类腺病毒；
54)根据实施例29所述的载体，其中该腺病毒是一种血清型35的人类腺病毒；
55)根据实施例30所述的载体，其中该腺病毒是一种血清型35的人类腺病毒；
56)根据实施例31所述的载体，其中该腺病毒是一种血清型35的人类腺病毒；
57)根据实施例32所述的载体，其中该腺病毒是一种血清型35的人类腺病毒；
58)根据实施例33所述的载体，其中该腺病毒是一种血清型35的人类腺病毒；
59)根据实施例34所述的载体，其中该腺病毒是一种血清型35的人类腺病毒；
60)根据实施例35所述的载体，其中该腺病毒是一种血清型35的人类腺病毒；
61)根据实施例36所述的载体，其中该腺病毒是一种血清型35的人类腺病毒；
62)根据实施例37所述的载体，其中该腺病毒是一种血清型35的人类腺病毒；
63)根据实施例38所述的载体，其中该腺病毒是一种血清型35的人类腺病毒；
64)根据实施例39所述的载体，其中该腺病毒是一种血清型35的人类腺病毒；
65)一种包括根据实施例14所述的载体、和一种药学上可接受的赋形剂的疫苗组合物；
66)一种包括根据实施例15所述的载体、和一种药学上可接受的赋形剂的疫苗组合物；
67)一种包括根据实施例16所述的载体、和一种药学上可接受的赋形剂的疫苗组合物；
68)一种包括根据实施例17所述的载体、和一种药学上可接受的赋形剂的疫苗组合物；
69)一种包括根据实施例18所述的载体、和一种药学上可接受的赋形剂的疫苗组合物；
70)一种包括根据实施例19所述的载体、和一种药学上可接受的赋形剂的疫苗组合物；
71)一种包括根据实施例20所述的载体、和一种药学上可接受的赋形剂的疫苗组合物；
72)一种包括根据实施例21所述的载体、和一种药学上可接受的赋形剂的疫苗组合物；
73)一种包括根据实施例22所述的载体、和一种药学上可接受的赋形剂的疫苗组合物；
74)一种包括根据实施例23所述的载体、和一种药学上可接受的赋形剂的疫苗组合物；
75)一种包括根据实施例24所述的载体、和一种药学上可接受的赋形剂的疫苗组合物；
76)一种包括根据实施例25所述的载体、和一种药学上可接受的赋形剂的疫苗组合物；
77)一种包括根据实施例26所述的载体、和一种药学上可接受的赋形剂的疫苗组合物；
78)一种包括根据实施例27所述的载体、和一种药学上可接受的赋形剂的疫苗组合物；
79)一种包括根据实施例28所述的载体、和一种药学上可接受的赋形剂的疫苗组合物；
80)一种包括根据实施例29所述的载体、和一种药学上可接受的赋形剂的疫苗组合物；
81)一种包括根据实施例30所述的载体、和一种药学上可接受的赋形剂的疫苗组合物；
82)一种包括根据实施例31所述的载体、和一种药学上可接受的赋形剂的疫苗组合物；
83)一种包括根据实施例32所述的载体、和一种药学上可接受的赋形剂的疫苗组合物；
84)一种包括根据实施例33所述的载体、和一种药学上可接受的赋形剂的疫苗组合物；
85)一种包括根据实施例34所述的载体、和一种药学上可接受的赋形剂的疫苗组合物；
86)一种包括根据实施例35所述的载体、和一种药学上可接受的赋形剂的疫苗组合物；
87)一种包括根据实施例36所述的载体、和一种药学上可接受的赋形剂的疫苗组合物；
88)一种包括根据实施例37所述的载体、和一种药学上可接受的赋形剂的疫苗组合物；
89)一种包括根据实施例38所述的载体、和一种药学上可接受的赋形剂的疫苗组合物；
90)一种包括根据实施例39所述的载体、和一种药学上可接受的赋形剂的疫苗组合物；
91)一种包括根据实施例40所述的载体、和一种药学上可接受的赋形剂的疫苗组合物；
92)一种包括根据实施例41所述的载体、和一种药学上可接受的赋形剂的疫苗组合物；
93)一种包括根据实施例42所述的载体、和一种药学上可接受的赋形剂的疫苗组合物；
94)一种包括根据实施例43所述的载体、和一种药学上可接受的赋形剂的疫苗组合物；
95)一种包括根据实施例44所述的载体、和一种药学上可接受的赋形剂的疫苗组合物；
96)一种包括根据实施例45所述的载体、和一种药学上可接受的赋形剂的疫苗组合物；
97)一种包括根据实施例46所述的载体、和一种药学上可接受的赋形剂的疫苗组合物；
98)一种包括根据实施例47所述的载体、和一种药学上可接受的赋形剂的疫苗组合物；
99)一种包括根据实施例48所述的载体、和一种药学上可接受的赋形剂的疫苗组合物；
100)一种包括根据实施例49所述的载体、和一种药学上可接受的赋形剂的疫苗组合物；
101)一种包括根据实施例50所述的载体、和一种药学上可接受的赋形剂的疫苗组合物；
102)一种包括根据实施例51所述的载体、和一种药学上可接受的赋形剂的疫苗组合物；
103)一种包括根据实施例52所述的载体、和一种药学上可接受的赋形剂的疫苗组合物；
104)一种包括根据实施例53所述的载体、和一种药学上可接受的赋形剂的疫苗组合物；
105)一种包括根据实施例54所述的载体、和一种药学上可接受的赋形剂的疫苗组合物；
106)一种包括根据实施例55所述的载体、和一种药学上可接受的赋形剂的疫苗组合物；
107)一种包括根据实施例56所述的载体、和一种药学上可接受的赋形剂的疫苗组合物；
108)一种包括根据实施例57所述的载体、和一种药学上可接受的赋形剂的疫苗组合物；
109)一种包括根据实施例58所述的载体、和一种药学上可接受的赋形剂的疫苗组合物；
110)一种包括根据实施例59所述的载体、和一种药学上可接受的赋形剂的疫苗组合物；
111)一种包括根据实施例60所述的载体、和一种药学上可接受的赋形剂的疫苗组合物；
112)一种包括根据实施例61所述的载体、和一种药学上可接受的赋形剂的疫苗组合物；
113)一种包括根据实施例62所述的载体、和一种药学上可接受的赋形剂的疫苗组合物；
114)一种包括根据实施例63所述的载体、和一种药学上可接受的赋形剂的疫苗组合物；
115)一种包括根据实施例64所述的载体、和一种药学上可接受的赋形剂的疫苗组合物；
116)一种用于在受试者中诱导抵抗HPV的免疫应答的方法，该方法包括向该受试者给予根据实施例65-115中任一项所述的疫苗组合物；
117)一种用于治疗持续性HPV(类型16)感染的的方法，该方法包括向受到持续性HPV感染的受试者给予根据实施例65-115中任一项所述的疫苗；
118)一种用于治疗外阴上皮内瘤样病变(VIN)(具有潜在的HPV类型16感染)的方法，该方法包括向患有VIN的受试者给予根据实施例65-115中任一项所述的疫苗；
119)一种用于治疗外阴癌(具有潜在的HPV类型16感染)的方法，该方法包括向患有外阴癌的受试者给予根据实施例65-115中任一项所述的疫苗；
120)一种用于治疗宫颈上皮内瘤样病变(CIN)(具有潜在的HPV类型16感染)的方法，该方法包括向患有CIN的受试者给予根据实施例65-115中任一项所述的疫苗；
121)一种用于治疗宫颈癌(具有潜在的HPV类型16感染)的方法，该方法包括向患有宫颈癌的受试者给予根据实施例65-115中任一项所述的疫苗；
122)一种用于治疗口咽癌(具有潜在的HPV类型16感染)的方法，该方法包括向患有口咽癌的受试者给予根据实施例65-115中任一项所述的疫苗；
123)一种用于治疗阴茎上皮内瘤病变(PIN)(具有潜在的HPV类型16感染)的方法，该方法包括向患有PIN的受试者给予根据实施例65-115中任一项所述的疫苗；
124)一种用于治疗阴茎癌(具有潜在的HPV类型16感染)的方法，该方法包括向患有阴茎癌的受试者给予根据实施例65-115中任一项所述的疫苗；
125)一种用于治疗阴道上皮内瘤样病变(VaIN)(具有潜在的HPV类型16感染)的方法，该方法包括向患有VaIN的受试者给予根据实施例65-115中任一项所述的疫苗；
126)一种用于治疗阴道癌(具有潜在的HPV类型16感染)的方法，该方法包括向患有阴道癌的受试者给予根据实施例65-115中任一项所述的疫苗；
127)一种用于治疗肛门上皮内瘤样病变(AIN)(具有潜在的HPV类型16感染)的方法，该方法包括向患有AIN的受试者给予根据实施例65-115中任一项所述的疫苗；
128)一种用于治疗肛门癌(具有潜在的HPV类型16感染)的方法，该方法包括向患有肛门癌的受试者给予根据实施例65-115中任一项所述的疫苗；
129)一种包括SEQ ID NO:1的多肽；
130)根据实施例129所述的多肽，其中该多肽进一步包括至少部分的HPV E2蛋白；
131)根据实施例130所述的多肽，其中该至少部分的HPV E2蛋白是来自HPV16的E2蛋白；
132)根据实施例130所述的多肽，其中至少部分的E2蛋白融合到具有SEQ ID NO:1的多肽的N-端侧；
133)根据实施例130所述的多肽，其中至少部分的E2蛋白融合到具有SEQ ID NO:1的多肽的C-端侧；
134)根据实施例131所述的多肽，其中至少部分的E2蛋白融合到具有SEQ ID NO:1的多肽的N-端侧；
135)根据实施例131所述的多肽，其中至少部分的E2蛋白融合到具有SEQ ID NO:1的多肽的C-端侧；
136)根据实施例130所述的多肽，其中该至少部分的E2蛋白包括具有突变的E2蛋白变体，该突变废止了E2的DNA结合；
137)根据实施例131所述的多肽，其中该至少部分的E2蛋白包括具有突变的E2蛋白变体，该突变废止了E2的DNA结合；
138)根据实施例132所述的多肽，其中该至少部分的E2蛋白包括具有突变的E2蛋白变体，该突变废止了E2的DNA结合；
139)根据实施例133所述的多肽，其中该至少部分的E2蛋白包括具有突变的E2蛋白变体，该突变废止了E2的DNA结合；
140)根据实施例134所述的多肽，其中该至少部分的E2蛋白包括具有突变的E2蛋白变体，该突变废止了E2的DNA结合；
141)根据实施例135所述的多肽，其中该至少部分的E2蛋白包括具有突变的E2蛋白变体，该突变废止了E2的DNA结合；
142)根据实施例3所述的核酸，该核酸编码根据SEQ ID NO:3的多肽；
143)根据实施例3所述的核酸，该核酸编码根据SEQ ID NO:5的多肽；
144)一种编码根据实施例142所述的核酸的载体，其中编码该多肽的序列可操作地连接至启动子；
145)一种编码根据实施例143所述的核酸的载体，其中编码该多肽的序列可操作地连接至启动子；
146)根据实施例144所述的载体，其中该载体是一种腺病毒；
147)根据实施例145所述的载体，其中该载体是一种腺病毒；
148)根据实施例146所述的载体，其中该腺病毒是一种血清型26的人类腺病毒；
149)根据实施例147所述的载体，其中该腺病毒是一种血清型26的人类腺病毒；
150)根据实施例146所述的载体，其中该腺病毒是一种血清型35的人类腺病毒；
151)根据实施例147所述的载体，其中该腺病毒是一种血清型35的人类腺病毒；
152)一种包括根据实施例144所述的载体、和一种药学上可接受的赋形剂的疫苗组合物；
153)一种包括根据实施例145所述的载体、和一种药学上可接受的赋形剂的疫苗组合物；
154)一种包括根据实施例146所述的载体、和一种药学上可接受的赋形剂的疫苗组合物；
155)一种包括根据实施例147所述的载体、和一种药学上可接受的赋形剂的疫苗组合物；
156)一种包括根据实施例148所述的载体、和一种药学上可接受的赋形剂的疫苗组合物；
157)一种包括根据实施例149所述的载体、和一种药学上可接受的赋形剂的疫苗组合物；
158)一种包括根据实施例150所述的载体、和一种药学上可接受的赋形剂的疫苗组合物；
159)一种包括根据实施例151所述的载体、和一种药学上可接受的赋形剂的疫苗组合物；
160)一种用于在受试者中诱导抵抗HPV的免疫应答的方法，该方法包括向该受试者给予根据实施例152-159中任一项所述的疫苗组合物；
161)一种用于治疗外阴上皮内瘤样病变(VIN)的方法，该方法包括向患有VIN的受试者给予根据实施例152-159中任一项所述的疫苗；
162)一种用于治疗外阴癌的方法，该方法包括向患有外阴癌的受试者给予根据实施例152-159中任一项所述的疫苗；
163)一种用于治疗宫颈上皮内瘤样病变(CIN)的方法，该方法包括向患有CIN的受试者给予根据实施例152-159中任一项所述的疫苗；
164)一种用于治疗宫颈癌的方法，该方法包括向患有宫颈癌的受试者给予根据实施例152-159中任一项所述的疫苗；
165)一种用于治疗口咽癌的方法，该方法包括向患有口咽癌的受试者给予根据实施例152-159中任一项所述的疫苗；
166)一种用于治疗阴茎上皮内瘤病变(PIN)的方法，该方法包括向患有PIN的受试者给予根据实施例152-159中任一项所述的疫苗；
167)一种用于治疗阴茎癌的方法，该方法包括向患有阴茎癌的受试者给予根据实施例152-159中任一项所述的疫苗；
168)一种用于治疗阴道上皮内瘤样病变(VaIN)的方法，该方法包括向患有VaIN的受试者给予根据实施例152-159中任一项所述的疫苗；
169)一种用于治疗阴道癌的方法，该方法包括向患有阴道癌的受试者给予根据实施例152-159中任一项所述的疫苗；
170)一种用于治疗肛门上皮内瘤样病变(AIN)的方法，该方法包括向患有AIN的受试者给予根据实施例152-159中任一项所述的疫苗；
171)一种用于治疗肛门癌的方法，该方法包括向患有肛门癌的受试者给予根据实施例152-159中任一项所述的疫苗。
除非另有说明，本发明的实践采用免疫学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、和重组DNA的常规技术，这些在本领域的技能之内。参见例如萨姆布鲁克(Sambrook)、弗里奇(Fritsch)和马尼亚蒂斯(Maniatis)，分子克隆：实验手册(MOLECULAR CLONING:ALABORATORY MANUAL)，第2版，1989；分子生物学现代方法(Current Protocols inMolecular Biology)，奥苏贝尔(Ausubel)FM等人编辑，1987；酶学方法(Methods inEnzymology)系列(学术出版社有限公司(Academic Press,Inc.))；PCR2：一种实用的方法(PCR2:A Practical Approach)，麦克弗森(MacPherson)MJ、海姆斯(Hams)BD、泰勒(Taylor)GR编辑，1955；抗体：实验手册(Antibodies:A Laboratory Manual)，哈洛(Harlow)和拉内(Lane)编辑，1988。
在以下实例中将进一步解释本发明。这些实例不以任何方式限制本发明。它们仅仅用以阐明本发明。
实例
实例1：构建设计的多肽，该多肽基本上包括所有的HPV16 E6和E7 CTL表位
我们设计了一种新颖的、非致瘤的多肽(和编码这种多肽的核酸)，该多肽基本上包含所有的HPV16 E6和E7蛋白的所有的CTL表位，并且具有最小数量的预计的/预测的强大的新表位(新表位意指不存在于野生型HPV16E6和E7蛋白中的表位)。本发明的多肽(有时还在此称为‘E6E7SH’)包括如在SEQ ID NO:1中所提供的序列。以SEQ ID NO:2提供编码该多肽的密码子优化的核酸。
本发明的分子是单分子，该单分子提供了超过了使用多分子的策略的生产优点。此外，本发明的多肽包括存在于HPV16的野生型E6和E7中的基本上所有假定的CTL表位，并且同时具有最小数量的预期的/预测的强大的新表位，这些新表位可以潜在地可能是免疫显性的并且因此可以从相关的野生型CTL表位转移免疫应答。因此本发明的构建体是比其他人所描述的分子(缺少可能的CTL表位和/或包含更多或更强的新表位)在免疫学上更有利。
例如，SEQ ID NO:1的构建体针对如下各项包含具有预测结合亲和力<50nM的九个氨基酸长度的仅一个新表位：20种最常见的HLA-A、20种最常见的HLA-B和20种最常见的HLA-C等位基因(HLA-A*01:01、HLA-A*02:01、HLA-A*02:03、HLA-A*02:06、HLA-A*02:07、HLA-A*03:01、HLA-A*11:01、HLA-A*23:01、HLA-A*24:02、HLA-A*26:01、HLA-A*29:02、HLA-A*30:01、HLA-A*30:02、HLA-A*31:01、HLA-A*32:01、HLA-A*33:01、HLA-A*33:03、HLA-A*34:01、HLA-A*68:01、HLA-A*68:02、HLA-B*07:02、HLA-B*07:04、HLA-B*08:01、HLA-B*13:01、HLA-B*15:01、HLA-B*18:01、HLA-B*35:01、HLA-B*37:01、HLA-B*39:01、HLA-B*40:01、HLA-B*40:02、HLA-B*40:06、HLA-B*44:02、HLA-B*44:03、HL-B*46:01、HLA-B*48:01、HLA-B*51:01、HLA-B*52:01、HLA-B*53:01、HLA-B*58:01、HLA-C*07:02、HLA-C*04:01、HLA-C*03:04、HLA-C*01:02、HLA-C*07:01、HLA-C*06:02、HLA-C*03:03、HLA-C*08:01、HLA-C*15:02、HLA-C*12:02、HLA-C*02:02、HLA-C*05:01、HLA-C*14:02、HLA-C*03:02、HLA-C*16:01、HLA-C*08:02、HLA-C*12:03、HLA-C*04:03、HLA-C*17:01、HLA-C*14:03)，如在IEDB网站(http://tools.immuneepitope.org/analyze/html/mhc_binding.html，2009-09-01B版)针对HLA-A和HLA-B使用ANN(伦德高(Lundegaard)等人，2008，核酸研究(Nucl Acids Res)36:W509-12)SMM方法(彼得斯(Peters)等人，2003，生物信息学(Bioinformatics)19:1765-72)以及针对用于肽结合至MHC类别I分子的预测工具的HLA-C的NetMHCpan方法(霍夫(Hoof)等人，2009，免疫遗传学(Immunogenetics)61:1-13)。
作为一种非限制性实例，使用在IEDB网站的SMM预测工具，该改组的E6和E7序列如由奥斯特惠斯(Oosterhuis)等人，2011，国际癌症杂志(Int J Cancer)129:397-406和奥施拉格等人，2006，疫苗(Vaccine)24:2880-93所描述的在核心部分针对20种最常见的HLA-A和-B包含每一个九氨基酸的潜在的强大的独特的新表位(ANN或SMM IC50<50nM)。这甚至不包括用于那种途径的附加物(其中附加物将进一步有助于另外的新表位，并且可能由于限制长度的‘重叠’错过了更多的天然MHC II表位)。事实上，据报道，改进的分子(包含具有改组的E6和E7蛋白(被描述于WO 2013/083287中)的变体)包含针对20种最常见的HLA-A、20种最常见的HLA-B和20种最常见的HLA-C等位基因具有预测的IC50<50nM的九个氨基酸长度的22个独特的新表位(ANN、SMM或NetMHCPan)。
因此，本发明的设计的分子相比于改组的E6和E7以去除功能性的其他已公布的方法，显然有利于具有更低数量的预测的新表位。
合成编码我们由此设计的HPV16 E6E7SH分子(即，具有如在SEQ ID NO:1中所提供的氨基酸序列的多肽)的核酸，该核酸序列包括SEQ ID NO:2，并且侧翼为在5’端的HindIII位点和Kozak序列以及在3’位点的XbaI位点(在英杰生命技术公司(Invitrogen Lifetechnologies)的委托合成以及标准分子克隆，德国)。
使用HindIII和XbaI将该合成的片段克隆到标准表达载体，pCDNA2004.Neo中，该载体具有细菌抗药性标志物(氨比西林)和哺乳类动物抗药性标志物(新霉素)，以获得编码本发明分子的质粒载体，例如用于基于(瞬时)转染的试验。
可以按照这样使用这些分子，但是还可以用作为包含附加特征的另外的分子的基础。作为非限制性实例，如下描述制备一些另外的变体。
可以将HPV16 E6E7SH融合蛋白质序列与其他HPV16早期蛋白的序列结合，以靶向患有持续感染的个体，并且以扩展免疫个体中的免疫系统全部。已经提出，抵抗E2的免疫应答在清除HPV16感染中起到了重要作用(德容(de Jong)等人，2002，癌症研究(Cancer Res)62:472-479)。E2与E6E7SH的融合将给出疫苗组分，该疫苗组分具有抵抗从持续感染到浸润性癌或在Leep手术后的复发/难治性疾病的HPV相关癌症的各阶段的抗原。因此，作为此类实施例的非限制性实例，我们制备了编码E6E7SH与E2在它的N-端的融合蛋白的序列。在E2序列中，可以使修饰废止DNA结合活性，该DNA结合活性可能在表达融合蛋白的细胞中影响基因表达。我们使wt HPV16 E2蛋白的位置293的甘氨酸、位置299的赖氨酸和位置300的半胱氨酸分别突变成缬氨酸、蛋氨酸和精氨酸。每个突变在于其自身已经完全废止了E2与具有E2的结合域的DNA序列的结合(普拉卡什(Prakash)等人，1992，基因与发育(Genes Dev)6:105-16)。
所产生的多肽称为HPV16 E2E6E7SH并且包括SEQ ID NO:3。制备编码该多肽的密码子优化序列并且在SEQ ID NO:4中提供。
我们还构建了变体，其中将相同的E2突变蛋白融合至HPV16 E6E7SH融合多肽的C-端，产生了称为HPV16 E6E7E2SH的多肽，该多肽包括SEQ ID NO:5。将编码该构建体的序列提供为SEQ ID NO:6。
出于对照的目的，我们还构建了编码多肽的序列，该序列包含针对作为一种融合蛋白的全长HPV16 E6和E7的野生型序列(将从aa 1至158的E6直接融合到从aa 1至98的E7，在此命名为E6E7wt)。
我们还测试了向该多肽添加前导序列的影响。作为一种非限制性实例，在这些构建体中的一些的N-端处融合编码IgE前导序列的序列(参见例如US6,733,994)[前导肽的序列提供于SEQ ID NO:7]，例如在E6E7wt构建体中，该E6E7wt构建体导致了LSE6E7wt，并且在E2E6E7SH构建体中，该E2E6E7SH构建体导致了LSE2E6E7SH。在免疫小鼠中如通过E7四聚体分析所测的，相比于不具有LS序列的相同抗原，其作用显著(p<0.05)提高了免疫原性(例如，可以如在图9中所见)。
在具有或不具有E2的情况下，编码本发明E6E7SH多肽的序列可以，例如从DNA构建体、从RNA或从病毒载体进行表达。图1证实了当如上所述用表达转基因的DNA载体瞬时转染后在HEK-293T细胞中的表达。在转染之后，收获细胞并且用抵抗HPV16 E7的抗体通过SDS-PAGE和蛋白质印迹法分析细胞提取物。该试验证实了当表达载体转染后，适当大小的预期融合蛋白的表达。
在具有或不具有E2的情况下，并且在具有或不具有增强所编码的融合蛋白的免疫原性的附加序列的情况下，可以使用腺病毒载体来表达E6E7。
由基因艺术公司(Geneart)，将编码HPV16 E6E7wt对照的基因或上述的HPV设计序列针对人类表达进行基因优化并且合成。Kozak序列(5’GCCACC 3’)直接包含于ATG起始密码子的前面，并且将两个终止密码子(5’TGA TAA 3’)添加至各自的编码序列的末端。将这些基因通过HindIII和XbaI位点插入pAdApt35BSU质粒和pAdApt26质粒中(哈文格(Havenga)等人，2006，普通病毒学杂志(J Gen Virol)87,2135-43)。
通过单同源重组，所有的腺病毒生产于PER.C6细胞中，并且如之前所述进行生产(针对rAd35：哈文格(Havenga)等人，2006，普通病毒学杂志(J Gen Virol)87:2135-43；针对rAd26：阿宾克(Abbink)等人，2007，病毒学杂志(J Virol)81:4654-63)。将PER.C6细胞(法劳科斯(Fallaux)等人，1998，人类基因治疗(Hum Gene Ther)9:1909-17)维持在具有10％胎牛血清(FBS)、补充以10mM MgCl2的杜氏改良培养基(DMEM)中。
简言之，根据制造商(美国生命技术公司(Life Technologies))提供的说明书使用脂质体转染，用Ad载体质粒转染PER.C6细胞。在到达完全的细胞病变效应(CPE)后一天收获细胞，冻融，在3,000rpm下离心5min，并且存储在-20℃下。将病毒进行噬斑纯化并且在培养于多孔24组织培养板的单孔中的PER.C6细胞中进行扩增。进一步扩增在培养于T25组织培养烧瓶并随后养于T175组织培养烧瓶中的PER.C6细胞中进行。将从在T175烧瓶后所获得的细胞制备的粗裂解物的3到5ml用来接种包含PER.C6细胞的70％融合层的24×T1000五层组织培养烧瓶。使用两步CsCl净化法纯化该病毒。最终，将该病毒以等分储存在-85℃下。
Ad35.HPV16-E6E7wt、和Ad35.HPV16-E6E7SH是重组腺病毒血清型35(Ad35)载体，这些载体包括密码子优化的核苷酸序列，分别用于表达野生型HPV16 E6和E7蛋白(E6E7wt)的融合蛋白、以及如上所述的设计的融合蛋白变体(E6E7SH，具有提供于SEQ ID NO:1中的氨基酸序列)。该组合的E6和E7序列置于E1、E3缺失的腺病毒基因组的E1区域中的CMV启动子控制下。Ad26.HPV16-E6E7wt、和Ad26.HPV16-E6E7SH是基于重组腺病毒血清型26的等效载体。
类似地，产生基于Ad26和Ad35的重组腺病毒载体，这些载体编码HPV16 E2E6E7SH(SEQ ID NO:3)变体。类似地，产生编码HPV16E6E7E2SH(SEQ ID NO:5)变体的Ad26和Ad35。此外，产生编码在N-端具有IgE前导序列的E2E6E7SH融合蛋白的Ad35载体，该载体命名为Ad35.HPV16-LSE2E6E7SH。还生产具有在N-端融合至IgE前导序列的E6E7wt的对照腺病毒。
用PER.C6细胞产生重组腺病毒，并且在氯化铯梯度上通过离心进行纯化。
在以下实例中提供了偶联至阻遏物系统的本发明的构建体的另外的实例。
实例2.缺少设计的构建体的转化活性
野生型HPV16 E6和E7蛋白具有致瘤潜能，该致瘤潜能在某些测定中表现为转化活性，如在软琼脂测定中的菌落形成(马西斯米(Massimi)和班克斯(Banks)，2005，分子医学方法(Methods Mol Med)119:381-395)。如在实例1中所描述的E6E7SH多肽包括以重新排序方式的E6和E7蛋白的片段。与在此类测定中wt E6和E7蛋白之一相比，预测这可以去除致瘤潜能(例如通过显著降低的转化活性测量的)。
其他文献报道了HPV16 E6和E7的基因改组变体确实已经失去了它们的致癌潜能(奥施拉格等人，2006，疫苗(Vaccine)24:2880-93；汉肯(Henken)等人，2012，疫苗(Vaccine)30:4259-66)，证实了基因改组破坏了E6和E7蛋白的野生型功能。
为了评估致瘤性的丧失，我们评估了我们的E6E7SH构建体赋予NIH3T3细胞在软琼脂中生长能力的能力(由例如马西斯米(Massimi)和班克斯(Banks)，2005，分子医学方法(Methods Mol Med)119:381-395所描述的)。具有表达野生型HPV16 E7的质粒的NIH3T3细胞的转染一致地导致菌落形成。在这些测定中，仅野生型HPV16 E6的表达不引起在背景上的菌落形成。这与所公布的观察一致，在该测定中E7wt比E6wt更有效(赛德曼(Sedman)等人，1991，病毒学杂志(J Virol)65:4860-66)。在四个独立的试验中用我们的E6E7SH构建体进行的转染并不会导致在软琼脂(图2)中细胞的菌落的生长，证实了编码本发明多肽的核酸E6E7SH已经失去了与E7相关的转化能力。
E6和E7的致瘤潜能分别是与他们降低细胞蛋白p53和pRb水平的能力有关。进行p53和pRb降解测定来证实编码本发明多肽的核酸E6E7SH构建体不具有与野生型E6和E7有关的、处于分子水平的生物活性。简言之，HPV16 E6wt和我们的E6E7SH构建体表达于NCI-H1299细胞中，这些NCI-H1299细胞针对于p53降解测定缺少内源p53。针对pRb降解测定，HPV16E7wt和E6E7SH构建体表达于pRb失效Saos-2细胞中。正如在图3中可见的，p53与E6wt但不是与E6E7SH的共同表达，导致了p53水平的降低(图A和B)。类似地，图3C和3D显示出了pRb与E7wt但不是与E6E7SH的共同表达，导致了pRB水平的降低。这些数据证实了编码本发明多肽的核酸没有能力在软琼脂中形成菌落并且不包含野生型E6和E7多肽的主要生物活性，即p53和pRb的分别失活。
为了进一步证实编码本发明多肽的核酸构建体的安全性，我们使用了原代人类包皮角质形成细胞,该原代人类包皮角质形成细胞是HPV介导的转化的天然靶细胞。原代人类角质形成细胞的永生化需要E6和E7二者野生型的作用(芒格(Munger)等人，1989，病毒学杂志(J Virol)63:4417-21)。这种测定可能是生理学上最相关的体外测定，来证实我们构建体的安全性(马西斯米(Massimi)和班克斯(Banks)，2005，分子医学方法(Methods MolMed)119:381-395)。与非转导的对照细胞(图4)和激活hTERT、端粒酶催化亚单位(数据未示出)相比，用表达来自HPV16(E6E7wt)的野生型E6和E7的慢病毒所转导的细胞诱导了原代角质形成细胞的永生化，如通过它们寿命的延长所表明的。与GFP转导的或非转导的角质形成细胞相比，本发明多肽(E6E7SH)的表达不能延长寿命。在两个另外独立的供体中获得相似的结果(数据未显示)。总之，这些数据证实了我们的构建体已经失去了诱导原代人类角质形成细胞永生化的能力，这些原代人类角质形成细胞被认为是高度具有生理意义的模型。
HPV16 E6和E7的片段以另一种顺序重组的另一种构建体也不能够永生化原代人类包皮角质形成细胞。然而，针对那种构建体观察到了长达约120-150天的延长的寿命。这表明了这一领域的一些不可预测性，并且证实了在安全性相关的方面中根据本发明的设计的分子的优越性。
该实例中的所有实验一起提供了编码根据本发明多肽的核酸缺少转化活性的强有力的证据，并且因此比HPV16 E6和E7wt构建体大大提高了安全性。
实例3.对E6E7SH设计构建体的免疫应答
如在实例1中所述，我们已经制备了DNA载体和腺病毒载体。
基于小鼠用编码野生型E2、或者E6或E7的DNA质粒免疫的初始试验，我们使用CB6F1小鼠菌株用于测量免疫应答，并且用HPV16 E2、E6和E7抗原进行免疫在CB6F1中比在C57BL/6小鼠或BALB/c小鼠中诱导出更广泛的细胞免疫应答。在一个单独的实验中，将小鼠用编码本发明分子的DNA载体进行免疫，并且测量细胞免疫应答。可以在用表达E6E7SH的DNA质粒免疫的小鼠中测量HPV16 E7特异性免疫应答(图5)。
示于该实例中的以下数据是来自用腺病毒载体进行的小鼠实验。
为了评估疫苗诱导的免疫原性，用表达E6E7wt、LSE6E7wt、E6E7SH的腺病毒载体(Ad35)或不编码转基因的腺病毒载体(空白)对CB6F1小鼠进行免疫。测试向小鼠给予的两种剂量：5*109病毒颗粒(vp)和1*1010vp。免疫接种后两周和八周，处死这些小鼠并且用HPV16 E7 15mer肽池刺激分离的脾细胞过夜。通过IFNγELISPOT分析两周和八周的E7特异性应答。数据见图6。
这显示了用Ad35.HPV16-E6E7SH免疫小鼠诱导了如通过ELISPOT分析所测量的E7特异性免疫应答。此外，图6中的结果证实了通过向转基因添加N-端前导序列提高抵抗腺病毒表达的转基因的免疫应答的可能性。
其次，对于免疫原性，测试向E6E7SH多肽添加E2的作用。Ad35载体编码具有融合至N-端(E2E6E7SH)或融合至C-端(E6E7E2SH)的E2的多肽。将CB6F1小鼠用1x 1010vp的剂量进行免疫。图7(E7四聚体染色)和图8(图C，IFNγELISPOT)显示了抵抗E7的免疫应答，尽管差异并不是统计学上有义意的，但是相比于不具有E2的构建体，包括E2的设计的构建体的免疫应答往往更高。相比于具有融合至E6E7SH设计多肽的E2的腺病毒载体的应答，针对只编码E2的腺病毒载体具有更高的对E2的应答(图8B)，其中E2与E2E6E7SH和E2与E6E7E2SH的差异是显著的(p值：<0.05)。
可以推断进一步包括E2的设计的构建体仍可以提供抵抗E7的免疫应答，并且此外还提供了对E2的免疫应答，因此比不包括E2的构建体增大了免疫应答的宽度。
当融合至野生型E6和E7的融合蛋白的N-端的时候，显示出了前导序列的添加导致更高的E7特异性应答(图6C)。类似地，确定前导序列对E2E6E7SH融合蛋白的免疫原性的作用。因此，在具有或不具有N-端E2的情况下，将编码设计的多肽的Ad35载体和编码LSE2E6E7SH的Ad35载体用来对小鼠进行免疫，并且每隔两周取血液样品来测量E7特异性的免疫应答(图9)。如图7和8所示，存在N-或C-端融合至E6E7SH的E2往往增加了免疫应答。IgE前导序列的添加进一步增加了E7特异性应答(图9B)。随着时间，针对所有三种编码根据本发明的设计的分子的腺病毒载体，观察到了持续免疫应答，并且在免疫之后的最高应答与在试验期间的最高应答一致。
推断出可以通过添加特异性序列可以增加设计的构建体(该构建体进一步包括N-端E2)所诱导的应答，例如，IgE前导序列，该IgE前导序列是将所编码的蛋白靶向特异性细胞区室。
可以用不同类型的腺病毒载体诱导抵抗本发明肽的细胞免疫应答。在先前的实验中，我们使用了Ad35载体，然而在图10的试验中，用表达E2E6E7SH的Ad26腺病毒载体对小鼠进行免疫。数据显示了用基于Ad26的疫苗的免疫也诱导了E7特异性T细胞。此外，这些结果证实了用表达E2E6E7SH的Ad35腺病毒载体的第二次免疫进一步增强了细胞免疫应答(图10)。
实例4.猕猴中设计的构建体的免疫原性
为了评估表达本发明的设计的序列的腺病毒载体诱导非人类灵长动物中免疫应答的能力，以1*1011vp的剂量，用表达E2E6E7SH的腺病毒载体(Ad26)或不编码转基因的腺病毒载体(空白)通过肌肉注射对猕猴进行免疫。在免疫后八周，用表达相同抗原的Ad26载体通过免疫加强该免疫应答。在第16周时，该动物接受了又一次的表达相同抗原的Ad35的注射。在若干时间点取血液样品并且用对应于HPV16 E2、E6或E7的肽池刺激分离的白细胞过夜。通过IFNγELISPOT测量特异性应答。数据见图11。此外，在初次免疫后的第10周和第18周，评估对本发明中的跨新颖连接的肽具有特异性的细胞免疫应答。在所有的动物中IFNγ应答的诱导是在<50SFU/1*106PBMC的检测极限以下进行的(数据未显示)。
数据显示了用Ad26.HPV16-E2E6E7SH的非人类灵长动物的免疫导致了针对出现于编码转基因中的所有三种HPV16蛋白的细胞免疫应答，但是不是针对新颖的连接。可以用Ad26.HPV16-E2E6E7SH通过另外的免疫加强应答，并且在第16周用对应Ad35载体的另外加强进一步增加了HPV16 E2、E6和E7特异性免疫应答。
在第72周再一次用Ad26.HPV16-E2E6E7SH的后期加强给予导致了HPV16细胞免疫应答的增加，该增加在几周后下降(未显示)。
在一个单独的实验中(未显示)，用两种腺病毒载体(一种表达HPV16E6E7SH并且另一种表达HPV16L1蛋白)的组合通过阴道给予对猕猴进行免疫。在外周血单核细胞中测量到针对E6和E7的低的但是可测量的细胞应答。在这些试验中，检测到了针对L1的强大的细胞免疫应答。
实例5.在小鼠肿瘤模型中的治疗效果
本发明的多肽能够诱导动物中的HPV16特异性细胞免疫应答，该细胞免疫应答可以对表达HPV16 E6和/或E7的细胞施加治疗效果。治疗性免疫，即在肿瘤已经开始生长后的免疫，可以被用来证实治疗性HPV疫苗候选物的效果。在用TC-1细胞(表达HPV16 E6和E7的小鼠细胞)注射的小鼠中测试Ad26和Ad35载体的治疗效果(林(Lin)等人，1996，癌症研究(Cancer Res)56:21-6)。在小鼠中经皮下注射后的几天至几周内TC-1细胞将形成实体瘤。在没有疫苗的情况下，肿瘤快速生长并且在30天内达到1000mm3的预定大小(图D和E)。当达到这种大小时，出于伦理原因处死小鼠。
在具有SLP(被用作阳性对照；肯特尔(Kenter)等人，2009，新英格兰医学杂志(NEngl J Med)361:1838-47；兹韦弗令(Zwaveling)等人，2002，免疫学杂志(J Immunol)169:350-8)或表达HPV16-E2E6E7SH的腺病毒载体的初次-加强免疫接种时间表下，观察到了TC-1诱导的肿瘤生长的明显降低(图12，图B和C)。在初次免疫后的第一个30天的仔细检查(图F和G)显示出了用表达E2E6E7SH的腺病毒载体的免疫比用SLP的免疫对肿瘤生长具有本质上更大的影响。初始生长速率更低并且在大多数情况下这些肿瘤缩小了。在用腺病毒载体免疫的小鼠中的11只中的3只中，完全消除了肿瘤，这体现在存活图中(图H)。
结论，在良好建立的激发模型中，针对HPV16诱导的癌症，用表达本发明多肽的腺病毒载体进行免疫显著降低了肿瘤生长或完全消除了已形成的肿瘤。
实例6：使用阻遏物系统来改进表达HPV衍生抗原的腺病毒载体的生产率和遗传稳定性
之前已经报道了在强大组成型活性启动子的控制下，插入的腺病毒载体的转基因取决于转基因产物的性质，可以负面影响载体生产(吉田(Yoshida)&山田(Yamada)，1997，生物化学与生物物理学集刊(Biochem Biophys Res Commun)230:426-30；鲁宾琪珂(Rubinchik)等人，2000，基因治疗(Gene Ther)7:875-85；马修斯(Matthews)等人，1999，普通病毒学杂志(J Gen Virol)80:345-53；艾德尔摩(Edholm)等人，2001，病毒学杂志(JVirol)75:9579-84；加尔(Gall)等人，2007，分子生物技术(Mol Biotechnol)35:263-73)。转基因依赖型载体生产率问题的实例包括低效载体挽救和生长，低最终载体产量，和，在严重的情况下，具有缺陷转基因盒的病毒突变体的快速过度生长。为了解决这些问题，多项研究探索了在生产细胞中，在载体复制期间，沉默载体转基因表达的可能性(马修斯(Matthews)等人，1999，普通病毒学杂志(J Gen Virol)80:345-53；艾德尔摩(Edholm)等人，2001，病毒学杂志(J Virol)75:9579-84了加尔(Gall)等人，2007，分子生物技术(MolBiotechnol)35:263-73；柯丁罕(Cottingham)等人，2012，生物技术与生物工程(Biotechnol Bioeng)109:719-28；吉尔伯特(Gilbert)等人，2014，病毒学方法杂志(JVirol Methods)208:177-88)。在此方面，在Ad载体的背景下，之前已经执行了不同的阻遏系统，并且事实上已经显示出了改进了编码不同类型的(抑制性)转基因的载体生产率和遗传稳定性。
已经观察到在此描述的腺病毒载体中的一些，连同一些编码某些HPV抗原变体的其他腺病毒载体显示出了在此所述的转基因依赖型载体生产率问题中的一些，并且因此可能在这一方面进一步改善。因此，我们力图调研使用系统来阻遏载体转基因表达是否可以如在此所述的那些改进表达HPV衍生抗原的Ad载体的生产特性。为此目的，我们实施了两种存在的阻遏物操纵基因系统，即TetR/TetO(尧(Yao)&埃里克松(Eriksson)，1999，人类基因治疗(Hum Gene Ther)10:419-22，EP0990041B1)和CymR/CuO(穆里克(Mullick)等人，2006，BMC生物技术(BMC Biotechnol)6:43)，进入我们的腺病毒载体平台。之前已经有其他人使用TetR/TetO和CymR/CuO系统在载体复制期间通过载体转基因沉默来改善腺病毒载体生产率(加尔(Gall)等人，2007，分子生物技术(Mol Biotechnol)35:263-73；柯丁罕(Cottingham)等人，2012，生物技术与生物工程(Biotechnol Bioeng)109:719-28；吉尔伯特(Gilbert)等人，2014，病毒学方法杂志(J Virol Methods)208:177-88)。这两种系统的实施涉及了在包含TetO或CuO序列的CMV启动子的控制下产生表达感兴趣基因的腺病毒载体。此外，该实施需要产生稳定表达各自同源阻遏蛋白(即，TetR或CymR)的细胞系。
产生若干E1缺失、基于Ad26-和Ad35-的载体，其中编码异源多肽的序列可操作地连接至包含TetO或CuO操纵基因序列的CMV启动子。首先，将某些包含TetO-或CuO-的序列(分别是SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12)插入pAdapt26和pAdapt35.Bsu质粒的CMV启动子(EQ ID NO:13)的转录起始位点(TSS)附近(阿宾克(Abbink)等人，2007，病毒学杂志(JVirol)81:4654-63；哈文格(Havenga)等人，2006，普通病毒学杂志(J Gen Virol)87:2135-43)。针对两种系统，将包含操纵基因的序列插入之前所述的CMV启动子的完全相同的位置(尧(Yao)&埃里克松(Eriksson)，1999，人类基因治疗(Human Gene Ther)10:419-22；EP0990041B1；穆里克(Mullick)等人，2006，BMC生物技术(BMC Biotechnol)6:43；EP1385946B1)。确切地，相对于TSS(按原设计；斯坦伯格(Stenberg)等人，1984，病毒学杂志(J.Virol.)49:190-9)，分别将包含TetO-和CuO-的序列直接插入位置-20和+7的下游。在SEQ ID NO:13中，这两个位置分别对应于位置716和742。分别将得到的包含操纵基因的CMV启动子称为CMVTetO和CMVCuO。其次，使用HindIII和XbaI限制性位点，将不同的转基因插入得到的构建体的(修改的)CMV启动子的下游。这些转基因包括编码绿色荧光蛋白和萤虫素酶(GFP-Luc)、来自本发明的LSE2E6E7SH、和另一种具有与LSE2E6E7SH一些类似性的的多肽(在该实例中构建体称为‘HPVAg’)的融合蛋白的基因。HPVAg包括呈现于LSE2E6E7SH中的相同的前导序列，连同HPV16的E2、E6、和E7序列。使用在此所述的方法，在CMVTetO或CMVCuO启动子的控制下，将得到的修饰的pAdapt26和pAdapt35.Bsu质粒用于产生表达上述报告基因和HPV转基因的腺病毒载体。
通过PER.细胞的稳定转染，分别使用质粒pcDNATM6/TR(生命技术公司(LifeTechnologies)，V1025-20)和pcDNATM6/TR的衍生物产生表达TetR或CymR的细胞系，在pcDNATM6/TR的衍生物中TetR编码序列(SEQ ID NO:14，编码多肽SEQ ID NO:15)被密码子优化的CymR编码序列(SEQ ID NO:16，编码多肽SEQ ID NO:17)替代。如通过pcDNATM6/TR的供应商所述的，使用基于瞬间转染的测定大规模产生稳定的细胞系，来筛选能够阻遏CMVTetO-或CMVCuO-驱动的基因的表达的细胞克隆。在这些细胞中，在载体复制期间，针对其阻遏转基因表达的能力，分析得到的PER.C6/TetR和PER.C6/CymR细胞系。在包含操纵基因的CMV启动子的控制下，在表达对应于各自操纵基因序列的阻遏物的细胞系中，用表达GFP-Luc的载体进行的实验显示了整个完整的病毒复制周期中荧光素酶基因表达减少至少10倍(数据未显示)。这证实了在复制腺病毒载体的背景下PER.C6/TetR和PER.C6/CymR细胞系能够阻遏载体转基因表达。
针对表达HPVAg的基于Ad35的载体，调研腺病毒载体转基因表达的TetR-和CymR-介导的阻遏对载体产量的影响(图13A)。为此，通过从CMVTetO或CMVCuO启动子表达HPVAg的载体，以1000病毒颗粒/细胞并且持续三小时的持续时间，使于在24孔板中以3*105细胞/孔接种的PER.C6、PER.C6/TetR、和PER.C6/CymR细胞系经受一式四份感染。作为对照，用表达GFP-Luc而不是HPVAg的对应载体进行平行感染。在感染后四天，通过使孔的内容物(即，受感染细胞和介质)经受两次冻融循环来制备粗病毒裂解物。随后通过基于Ad35六邻体序列特异性定量PCR方案确定腺病毒载体效价，该方案用已知的病毒颗粒效价作为标准使用纯化的Ad35载体。结果显示出包含TetO-和CuO-的编码HPVAg的Ad35载体，相比于表达GFP-Luc的对照载体，显示出了在正常PER.C6细胞上降低的载体产量。相比之下，当在表达它们同源阻遏物的细胞上生产时(即分别是TetR和CymR)，这些相同的载体给出了与用对照载体所获得的那些一样高的产量。这些数据表明，在载体生产期间，在生产细胞中，转基因表达的阻遏针对携带作为转基因的HPVAg的Ad35载体的生产是有益的。
针对源自腺病毒血清型26(Ad26)的载体，还调研了阻遏腺病毒载体转基因表达可能对载体产量具有的影响(图13B)。在基本上如针对Ad35载体所述进行的测定中，将携带CMVTetO启动子控制的转基因(该转基因编码GFP-Luc、HPVAg、或LSE2E6E7SH)的Ad26载体以1500病毒颗粒/细胞用来感染PER.C6和PER.C6/TetR细胞。三天后获得感染，并且通过基于Ad26六邻体序列特异性定量PCR方法确定病毒颗粒效价。这些结果显示出了对于PER.C6细胞，编码HPVAg和LSE2E6E7SH的载体的产量比用编码GFP-Luc的对照载体所获得的更低。相比之下，对于PER.C6/TetR细胞，这两种载体显示出了与对照载体所获得的一样高的效价。与以上结果一起(针对Ad35载体)，这些数据表明在腺病毒载体生产期间遏制转基因表达增加了表达HPVAg和LSE2E6E7SH的载体的产量。
我们已经观察到了关于腺病毒载体的遗传稳定性的主要问题，该腺病毒载体携带了针对HPVAg的CMV启动子驱动的转基因。例如，已经观察到在PER.C6上该载体的若干传代后，大部分的载体群由突变载体组成，该突变载体携带在HPVAg编码序列中的一个大的缺失(数据未显示)。
我们推断使用转基因表达阻遏系统，如上述两种之一，可以防止与转基因有关的遗传稳定性问题，如抑制载体生长的HPVAg。为了测试这一项，当在PER.C6或PER.C6/CymR细胞上的载体生长后，针对转基因盒稳定性评估具有CMVCuO启动子驱动的HPVAg表达的基于Ad35的载体(图14)。简言之，将载体DNA转染到两种不同的细胞系中，并且允许得到的病毒噬斑生长在琼脂糖层下。从两种转染中的每个，分离五个病毒噬斑，并且分别在相同细胞系(即，用于转染)上进一步传代，持续连续10次病毒传代。在病毒传代数10(VPN10)时，通过转基因盒的PCR扩增评估转基因完整性，并且产生的PCR产物的进一步分析是通过凝胶电泳和桑格测序进行。此外，在VPN7时，针对它们表达HPVAg的能力评估传代的病毒克隆。这通过使用传代的病毒分离株来进行，以1000病毒颗粒/细胞来感染A549细胞，在感染后的48小时裂解这些细胞，并且随后使用针对HPV16 E7(圣克鲁斯生物技术(Santa-CruzBiotechnology))的单克隆抗体通过蛋白质印迹法分析HPVAg的表达。凝胶电泳和序列分析的结果显示了已经在PER.C6上传代的所有五种病毒分离株每种在转基因盒内携带了小移码缺失或过早终止突变。相比之下，此类缺失或突变不能在任何已经在表达CymR(PER.C6/CymR)的细胞系上传代的载体分离株中检测到。与这些数据相同，所有的PER.C6/CymR繁殖的载体分离株能够表达HPVAg，然而所有的PER.C6生长的载体完全丢失了这项能力，暗示这些载体的缺陷转基因盒。总之，我们的数据证实了使用阻遏物系统，举例来说CymR/CuO系统，在载体增殖期间来阻遏载体转基因表达是一种有效的手段来防止严重的转基因盒不稳定性，如针对携带表达HPVAg的转基因的载体所见到的那种。
参考文献
阿宾克(Abbink)P，莱姆科特(Lemckert)AA，埃瓦尔德(Ewald)BA，林奇(Lynch)DM，丹霍兹(Denholtz)M，史密茨(Smits)S，霍特曼(Holterman)L，达曼(Damen)I，沃格尔(Vogels)R，索纳(Thorner)AR，奥布赖恩(O’Brien KL)，卡维尔(Carville)A，曼斯菲尔德(Mansfield)KG，古德斯密特(Goudsmit)J，哈文格(Havenga)MJ，巴鲁什(Barouch)DH(2007)来自亚组B和D的六种罕见血清型重组腺病毒疫苗载体的比较血清阳性率和免疫原性(Comparative seroprevalence and immunogenicity of six rare serotyperecombinant adenovirus vaccine vectors from subgroups B and D)，病毒学杂志(JVirol)81:4654-4663
奥苏贝尔(Ausubel)FM(1995)分子生物学的短方案：来自分子生物学的实验指南的方法概要(Short protocols in molecular biology:a compendium of methods fromCurrent protocols in molecular biology)，威利(Wiley)，[奇切斯特]
柯丁罕(Cottingham)MG，卡罗尔(Carroll)F，莫里斯(Morris)SJ，特纳(Turner)AV，沃恩(Vaughan)AM，卡普路(Kapulu)MC，科洛卡(Colloca)S，夏尼(Siani)L，吉尔伯特(Gilbert)SC，希尔(Hill)AV(2012)在腺病毒载体的转基因盒中防止自发性基因重排(Preventing spontaneous genetic rearrangements in the transgene cassettes ofadenovirus vectors)，生物技术与生物工程(Biotechnol Bioeng)109:719-728
戴雅娜(Daayana)S，艾克德(Elkord)E，温特斯(Winters)U，鲍力塔(Pawlita)M，罗登(Roden)R，斯特恩(Stern)PL，基奇纳(Kitchener)HC(2010)在患有外阴上皮内瘤样病变的患者中咪喹莫特和HPV治疗性疫苗接种的II期试验(Phase II trial of imiquimod andHPV therapeutic vaccination in patients with vulval intraepithelialneoplasia)，英国癌症杂志(Br J Cancer)102:1129-1136
德容(de Jong)A，凡德伯格(van der Burg)SH，夸本伯格(Kwappenberg)KM，凡德赫尔斯特(van der Hulst)JM，弗兰肯(Franken)KL，格鲁派(Geluk)A，凡梅加登(vanMeijgaarden)KE，德瑞胡特(Drijfhout)JW，肯特尔(Kenter)G，韦梅耶(Vermeij)P，梅列夫(Melief)CJ，奥夫伦加(Offringa)R(2002)在健康受试者中频繁检测人乳头瘤病毒16 E2特异性T-辅助细胞免疫(Frequent detection of human papillomavirus 16 E2-specificT-helper immunity in healthy subjects)，癌症研究(Cancer Res)62:472-479
艾德尔摩(Edholm)D，莫林(Molin)M，巴耶克(Bajak)E，阿库斯贾维(Akusjarvi)G(2001)针对毒性蛋白表达涉及的腺病毒载体(Adenovirus vector designed forexpression of toxic proteins)，病毒学杂志(J Virol)75:9579-9584
埃文斯(Evans)RK、拿罗基(Nawrocki)DK、伊索皮(Isopi)LA、威廉姆斯(Williams)DM、卡西米罗(Casimiro)DR、金(Chin)S、陈(Chen)M、朱(Zhu)DM、希弗(Shiver)JW、沃金(Volkin)DB(2004)基于腺病毒载体疫苗的稳定液体配制品的发展(Development ofstable liquid formulations for adenovirus-based vaccines)，药学科学杂志(JPharm Sci)93:2458-2475
法劳科斯(Fallaux)FJ，布特(Bout)A，凡德威尔德(van der Velde)I，凡德沃伦伯格(van den Wollenberg)DJ，海赫(Hehir)KM，基根(Keegan)J，奥格(Auger)C，克拉默(Cramer)SJ，凡奥蒙德(van Ormondt)H，凡德爱博(van der Eb)AJ，瓦莱里奥(Valerio)D，胡本(Hoeben)RC(1998)新辅助细胞和早期匹配区域1-缺失的腺病毒载体预防产生有复制能力的腺病毒(New helper cells and matched early region 1-deleted adenovirusvectors prevent generation of replication-competent adenoviruses)，人类基因治疗(Hum Gene Ther)9:1909-1917
S，霍夫高(Hovgaard)L(2000)肽和蛋白的药学配制品发展(Pharmaceutical formulation development of peptides and proteins)，泰勒和弗朗西斯(Taylor&Francis)，伦敦
加尔(Gall)JG，利奥诺拉(Lizonova)A，埃蒂雷迪(EttyReddy)D，麦克威(McVey)D，朱伯(Zuber)M，科夫斯迪(Kovesdi)I，奥特曼(Aughtman)B，金(King)CR，布拉夫(Brough)DE(2007)挽救并生产表达抑制性转基因的疫苗和治疗性腺病毒载体(Rescue andproduction of vaccine and therapeutic adenovirus vectors expressinginhibitory transgenes)，分子生物技术(Mol Biotechnol)35:263-273
高(Gao)GP，恩达尔(Engdahl)RK，威尔逊(Wilson)JM(2000)用于大量生产没有出现复制能力的病毒的E1缺失的腺病毒载体的细胞系(A cell line for high-yieldproduction of E1-deleted adenovirus vectors without the emergence ofreplication-competent virus)，人类基因治疗(Hum Gene Ther)11:213-219热纳罗(Gennaro)AR(1990)雷明顿药学大全(Remington’s pharmaceutical sciences)，马克出版公司(Mack)
吉尔伯特(Gilbert)R，吉尔博特(Guilbault)C，加尼翁(Gagnon)D，伯尼尔(Bernier)A，布尔热(Bourget)L，伊拉希(Elahi)SM，卡门(Kamen)A，马西(Massie)B(2014)在无血清悬浮培养中用于生产E1缺失的腺病毒载体的新补充细胞的建立与评价(Establishment and validation of new complementing cells for production ofE1-deleted adenovirus vectors in serum-free suspension culture)，病毒学方法杂志(J Virol Methods)208:177-188
哈米德(Hamid)O，卡瓦哈尔(Carvajal)RD(2013)在癌症治疗中的抗程序性死亡-1和抗程序性死亡-配体1抗体(Anti-programmed death-1and anti-programmed death-ligand 1antibodies in cancer therapy)，生物治疗专家意见(Expert Opin Biol Ther)13:847-861
哈洛(Harlow)E，拉内(Lane)D(1988)抗体：实验手册(Antibodies:a laboratorymanual)，冷泉港实验室，纽约
哈文格(Havenga)M，沃格尔(Vogels)R，祖迪吉斯特(Zuijdgeest)D，拉托塞维克(Radosevic)K，缪勒(Mueller)S，苏沃特(Sieuwerts)M，韦肖尔德(Weichold)F，达曼(Damen)I，卡斯帕斯(Kaspers)J，莱姆科特(Lemckert)A，凡米伦登克(van Meerendonk)M，凡德鲁格(van der Vlugt)R，霍特曼(Holterman)L，霍恩(Hone)D，史凯奇(Skeiky)Y，敏塔乔(Mintardjo)R，吉利森(Gillissen)G，巴鲁什(Barouch)D，萨多夫(Sadoff)J，古德斯密特(Goudsmit)J(2006)新颖没有复制能力的腺病毒B组载体：PER.C6细胞中高载体稳定性和产量(Novel replication-incompetent adenoviral B-group vectors:high vectorstability and yield in PER.C6cells)，普通病毒学杂志(J Gen Virol)87:2135-2143
汉肯(Henken)FE，奥斯特惠斯(Oosterhuis)K，奥施拉格(Ohlschlager)P，博世(Bosch)L，霍伊博格(Hooijberg)E，哈能(Haanen)JB，史丁柏根(Steenbergen)RD(2012)编码修饰的HPV16 E6和E7的DNA疫苗的临床前安全评价(Preclinical safety evaluationof DNA vaccines encoding modified HPV16 E6and E7)，疫苗(Vaccine)30:4259-4266
希尔德斯海姆(Hildesheim)A，埃雷罗(Herrero)R，瓦肖尔德(Wacholder)S，罗德里格斯(Rodriguez)AC，所罗门(Solomon)D，布拉蒂(Bratti)MC，席勒(Schiller)JT，冈萨雷斯(Gonzalez)P，杜宾(Dubin)G，波拉斯(Porras)C，吉梅内斯(Jimenez)SE，罗伊(Lowy)DR(2007)在患有事先存在的感染的青年女性中人乳头瘤病毒16/18L1病毒样颗粒疫苗的作用：随机试验(Effect of human papillomavirus 16/18 L1 viruslike particlevaccine among young women with preexisting infection:a randomized trial)，美国医学会杂志(JAMA)298:743-753
霍根森(Hoganson)DK，马(Ma)JC，阿萨多(Asato)L，翁(Ong)M，普林茨(Printz)MA，惠格(Huyghe)BG，索斯诺施(Sosnowshi)BA，D安德里亚(D’Andrea)MJ(2002)研发稳定腺病毒载体配制品(Development of a stable adenoviral vector formulation)，生物工艺杂志(Bioprocess J)1:43-48
霍夫(Hoof)I，彼得斯(Peters)B，西德尼(Sidney)J，佩德森(Pedersen)LE，塞特(Sette)A，隆德(Lund)O，布斯(Buus)S，尼耳森(Nielsen)M(2009)NetMHCpan，一种超越人类用于MHC类别I结合预测的方法(a method for MHC class I binding prediction beyondhumans)，免疫遗传学(Immunogenetics)61:1-13
霍维茨(Horwitz)MS(1996)腺病毒(Adenoviruses)。其中：菲尔茨(Fields)BN，奈普(Knipe)DM，贝恩斯(Baines)JD(编辑)病毒学(Virology)，雷文出版社有限公司(RavenPress Ltd)，纽约
肯特尔(Kenter)GG，沃尔特斯(Welters)MJ，瓦伦坦泰因(Valentijn)AR，卢威克(Lowik)MJ，贝兰德-凡德米尔(Berends-van der Meer)DM，沃鲁(Vloon)AP，伊斯萨撒(Essahsah)F，法瑟斯(Fathers)LM，奥夫伦加(Offringa)R，德瑞胡特(Drijfhout)JW，韦弗曼(Wafelman)AR，奥斯滕多普(Oostendorp)J，弗雷伦(Fleuren)GJ，凡德伯格(van derBurg)SH，梅列夫(Melief)CJ(2009)针对外阴上皮内瘤样病变的抵抗HPV-16癌蛋白的疫苗接种(Vaccination against HPV-16oncoproteins for vulvar intraepithelialneoplasia)，新英格兰医学杂志(N Engl J Med)361:1838-1847凯博(Kibbe)AH(2000)药用辅料手册(Handbook of pharmaceutical excipients)，英国医药出版社(PharmaceuticalPress)，伦敦
科夫斯迪(Kovesdi)I，赫德利(Hedley)SJ(2010)腺病毒生产细胞(Adenoviralproducer cells)，病毒(Viruses)2:1681-1703
林(Lin)KY，瓜尼埃里(Guarnieri)FG，士迪佛立-奥卡罗尔(Staveley-O’Carroll)KF，列维茨基(Levitsky)HI，奥古斯特(August)JT，帕多尔(Pardoll)DM，吴(Wu)TC(1996)用新颖的疫苗治疗以形成的肿瘤，该疫苗提高肿瘤抗原的主要组织相容性类型II的呈递(Treatment of established tumors with a novel vaccine that enhances majorhistocompatibility class II presentation of tumor antigen)，癌症研究(CancerRes)56:21-26
伦德高(Lundegaard)C，兰伯思(Lamberth)K，哈恩达尔(Harndahl)M，布斯(Buus)S，隆德(Lund)O，尼耳森(Nielsen)M(2008)NetMHC-3.0：精确网站可以预测人、小鼠和猴子MHC类型I的长度为8-11的肽的亲和力(accurate web accessible predictions ofhuman,mouse and monkey MHC class I affinities for peptides of length 8-11)，核酸研究(Nucleic Acids Res)36:W509-512
马西斯米(Massimi)P，班克斯(Banks)L(2005)针对HPV癌蛋白的转化测定(Transformation Assays for HPV Oncoproteins)。其中：戴维(Davy)C，道芭(Doorbar)J(编辑)人乳头瘤病毒：方法和方案(Human Papillomaviruses:Methods and Protocols)，第119卷：分子医学施普林格中的方法(Methods in Molecular Medicine Springer)，柏林，pp 381-395
马修斯(Matthews)DA，卡明斯(Cummings)D，伊芙莉(Evelegh)C，格雷厄姆(Graham)FL，普瑞夫斯(Prevec)L(1999)开发和利用表达乳糖阻遏物的293细胞系用于挽救表达高水平狂犬病毒糖蛋白的重组腺病毒(Development and use of a 293 cell lineexpressing lac repressor for the rescue of recombinant adenovirusesexpressing high levels of rabies virus glycoprotein)，普通病毒学杂志(J GenVirol)80(Pt 2):345-353
麦克弗森(McPherson)MJ，黑姆斯(Hames)BD，泰勒(Taylor)GR(1995)PCR 2：实用方法(PCR 2:a practical approach)，在牛津大学出版社的IRL出版社，牛津
梅尔曼(Mellman)I，古科斯(Coukos)G，德拉诺夫(Dranoff)G(2011)癌症免疫疗法的年龄(Cancer immunotherapy comes of age)。自然(Nature)480:480-489
穆里克(Mullick)A，许(Xu)Y，沃伦(Warren)R，考彻曼尼斯(Koutroumanis)M，吉尔博特(Guilbault)C，布鲁萨(Broussau)S，马朗方(Malenfant)F，布尔热(Bourget)L，拉穆勒(Lamoureux)L，洛(Lo)R，卡洛(Caron)AW，碧洛媞(Pilotte)A，马西(Massie)B(2006)cumate基因开关：在哺乳动物细胞中用于可调型表达的系统(The cumate gene-switch:a systemfor regulated expression in mammalian cells)，BMC生物技术(BMC Biotechnol)6:43
芒格(Munger)K，费尔普斯(Phelps)WC，巴布(Bubb)V，豪利(Howley)PM，施莱格尔(Schlegel)R(1989)针对原代人类角质形成细胞的转化人乳头瘤病毒16型的E6和E7一起是必需的并且是足够的(The E6 and E7 genes of the human papillomavirus type16together are necessary and sufficient for transformation of primary humankeratinocytes)，病毒学杂志(J Virol)63:4417-4421
奥贡(Ogun)SA，杜蒙-赛格诺非特(Dumon-Seignovert)L，马钱德(Marchand)JB，霍尔德(Holder)AA，希尔(Hill)F(2008)C4结合蛋白(C4bp)的低聚反应域作为一种佐剂，并且由与小鼠C4bp域融合的19千道尔顿裂体性孢子表面蛋白1组成的融合蛋白保护小鼠抵抗疟疾(The oligomerization domain of C4-binding protein(C4bp)acts as an adjuvant,and the fusion protein comprised of the 19-kilodalton merozoite surfaceprotein 1 fused with the murine C4bp domain protects mice against malaria)，感染与免疫(Infect Immun)76:3817-3823
奥斯特惠斯(Oosterhuis)K，艾丽迪(Aleyd)E，傅里兰德(Vrijland)K，舒马赫(Schumacher)TN，(哈能(Haanen)JB(2012a)用于诱导人乳头瘤病毒16型E6-和E7-特异性细胞毒性T-细胞应答的DNA疫苗的理性设计(Rational Design of DNA Vaccines for theInduction of Human Papillomavirus Type 16 E6-and E7-Specific Cytotoxic T-CellResponses)，人类基因治疗(Hum Gene Ther)23:1301-1312
奥斯特惠斯(Oosterhuis)K，奥施拉格(Ohlschlager)P，凡德伯格(van den Berg)JH，托贝斯(Toebes)M，戈麦斯(Gomez)R，舒马赫(Schumacher)TN，哈能(Haanen)JB(2011)针对HPV 16 E6和E7的高效性和高安全性的DNA疫苗的临床前发展(Preclinicaldevelopment of highly effective and safe DNA vaccines directed against HPV 16E6 and E7)，国际癌症杂志(Int J Cancer)129:397-406
奥斯特惠斯(Oosterhuis)K，凡德伯格(van den Berg)JH，舒马赫(Schumacher)TN，哈能(Haanen)JB(2012b)DNA疫苗和通过纹身的皮内疫苗接种(DNA vaccines andintradermal vaccination by DNA tattooing)，微生物学和免疫学的当前主题(Curr TopMicrobiol Immunol)351:221-250
彼得斯(Peters)B，唐(Tong)W，西德尼(Sidney)J，塞特(Sette)A，翁(Weng)Z(2003)检测针对肽与MHC-I分子结合的独立结合假设(Examining the independentbinding assumption for binding of peptide epitopes to MHC-I molecules)，生物信息学(Bioinformatics)19:1765-1772
普拉卡什(Prakash)SS，格罗斯曼(Grossman)SR，比宾斯基(Pepinsky)RB，莱米恩斯(Laimins)LA，安德罗非(Androphy)EJ(1992)在乳头瘤病毒E2反式激活蛋白中针对接触新颖基序的DNA和蕴涵新颖基序的二聚作用必须的氨基酸(Amino acids necessary forDNA contact and dimerization imply novel motifs in the papillomavirusE2trans-activator)，基因与发育(Genes Dev)6:105-116
鲁宾琪珂(Rubinchik)S，丁(Ding)R，邱(Qiu)AJ，张(Zhang)F，董(Dong)J(2000)递送由tet-诱导表达型系统调节的FasL-GFP融合蛋白的腺病毒载体(Adenoviral vectorwhich delivers FasL-GFP fusion protein regulated by the tet-inducibleexpression system)，基因治疗(Gene Ther)7:875-885
萨姆布鲁克(Sambrook)JFEFMT(1989)分子克隆：实验手册(Molecular cloning:alaboratory manual)，冷泉港实验室，冷泉港，纽约
赛德曼(Sedman)SA，巴尔博萨(Barbosa)MS，瓦什(Vass)WC，哈伯特(Hubbert)NL，哈斯(Haas)JA，罗伊(Lowy)DR，席勒(Schiller)JT(1991)人乳头瘤病毒16型的全长E6蛋白具有转化和反式激活活性并且与E7合作来永生化培养物中的角质形成细胞(The full-length E6 protein of human papillomavirus type 16 has transforming and trans-activating activities and cooperates with E7 to immortalize keratinocytes inculture)，病毒学杂志(J Virol)65:4860-4866
申克(Shenk)T(1996)腺病毒及其复制(Adenoviridae and their Replication)。其中：菲尔茨(Fields)BN，奈普(Knipe)DM，贝恩斯(Baines)JD(编辑)病毒学(Virology)，雷文出版社有限公司(Raven Press Ltd)，纽约
斯马海尔(Smahel)M，西玛(Sima)P，路得维科瓦(Ludvikova)V，冯卡(Vonka)V(2001)自拍问哦DNA疫苗抵抗包含E7的致癌细胞的修饰HPV16 E7基因(Modified HPV16 E7Genes as DNA Vaccine against E7-Containing Oncogenic Cells)，病毒学(Virology)281:231-238
凡德伯格(van der Burg)SH，梅列夫(Melief)CJ(2011)抵抗人乳头瘤病毒诱导的恶性肿瘤的治疗性疫苗接种(Therapeutic vaccination against human papillomavirus induced malignancies)，免疫学目前的观点(Curr Opin Immunol)23:252-257
沃森(Watson)JD(1992)重组DNA(Recombinant DNA)。科学美国人书刊(Scientific American Books)，纽约
威金(Wieking)BG，维梅尔(Vermeer)DW，诺斯(Spanos)WC，李(Lee)KM，维梅尔(Vermeer)P，李(Lee)WT，许(Xu)Y，盖彼茨(Gabitzsch)ES，拜耳凯提斯(Balcaitis)S，巴林特(Balint)JP，Jr.，琼斯(Jones)FR，李(Lee)JH(2012)一种非致瘤HPV 16 E6/E7疫苗提高表达肿瘤的HPV的治疗(A non-oncogenic HPV 16 E6/E7vaccine enhances treatment ofHPV expressing tumors)，癌症基因治疗(Cancer Gene Ther)19:667-674扬(Yan)J，赖兴巴赫(Reichenbach)DK，科比特(Corbitt)N，胡奇(Hokey)DA，拉马纳坦(Ramanathan)MP，麦金尼(McKinney)KA，魏纳(Weiner)DB，休厄尔(Sewell)D(2009)随着编码E6/E7融合蛋白的新颖HPV-16DNA疫苗的递送诱导体内抗肿瘤免疫(Induction of antitumor immunity invivo following delivery of a novel HPV-16 DNA vaccine encoding an E6/E7fusionantigen)，疫苗(Vaccine)27:431-440
尧(Yao)F，埃里克松(Eriksson)E(1999)一种新颖的四环素诱导的病毒复制开关(A novel tetracycline-inducible viral replication switch)。人类基因治疗(HumGene Ther)10:419-427
吉田(Yoshida)Y，哈马达(Hamada)H(1997)通过四环素控制的具有核定位信号的反式激活蛋白腺病毒调节的可诱导的基因表达(Adenovirus-mediated inducible geneexpression through tetracycline-controllable transactivator with nuclearlocalization signal)，生物化学与生物物理学集刊(Biochem Biophys Res Commun)230:426-430
汤川村(Yugawa)T，清野(Kiyono)T(2009)通过高危人乳头瘤病毒的宫颈肿瘤发生的分子机制：E6和E7癌蛋白的新颖功能(Molecular mechanisms of cervicalcarcinogenesis by high-risk human papillomaviruses:novel functions of E6 andE7 oncoproteins)，医学病毒学评论(Rev Med Virol)19:97-113
兹韦弗令(Zwaveling)S，费约翰逊雷拉莫塔(Ferreira Mota)SC，诺塔(Nouta)J，约翰逊(Johnson)M，利普福德(Lipford)GB，奥夫伦加(Offringa)R，凡德伯格(van derBurg)SH，梅列夫(Melief)CJ(2002)随着长肽的疫苗接种有效消除了已形成的人乳头瘤病毒16型表达的肿瘤(Established human papillomavirus type 16-expressing tumorsare effectively eradicated following vaccination with long peptides)，免疫学杂志(J Immunol)169:350-358
表I.序列
SEQ ID NO:1(HPV16-E6E7SH，HPV16 E6/E7设计多肽的氨基酸序列)
SEQ ID NO:2(HPV16-E6E7SH，编码HPV16 E6/E7设计多肽的氨基酸序列的核苷酸 序列)
SEQ ID NO:3(HPV16E2E6E7SH，HPV16 E2/E6/E7 设计多肽的氨基酸序列)
METLCQRLNVCQDKILTHYENDSTDLRDHIDYWKHMRLECAIYYKAREMGFKHINHQVVPTLAVSKNKALQAIELQLTLETIYNSQYSNEKWTLQDVSLEVYLTAPTGCIKKHGYTVEVQFDGDICNTMHYTNWTHIYICEEASVTVVEGQVDYYGLYYVHEGIRTYFVQFKDDAEKYSKNKVWEVHAGGQVILCPTSVFSSNEVSSPEIIRQHLANHPAATHTKAVALGTEETQTTIQRPRSEPDTGNPCHTTKLLHRDSVDSAPILTAFNSSHKGRINCNSNTTPIVHLKVDANTLMRLRYRFKKHCTLYTAVSSTWHWTGHNVKHKSAIVTLTYDSEWQRDQFLSQVKIPKTITVSTGFMSIMHQKRTAMFQDPQERPRKLPQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKPGTTLEQQYNKPLCDLLIRCINCQKPLCPEEKQRHLDKKQRFHNIRGRWTGRCMSCCRSSRTRRETQMHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLLRREVYDFAFRDLCIVYRDGNPYAVCDKCLKFYSKISEYRHYCYSLYGTTLEQQYNKPLCDLLIRCINCQK
SEQ ID NO:4(HPV16 E2E6E7SH，编码HPV16 E2/E6/E7设计多肽的核苷酸序列)
ATGGAAACCCTGTGCCAGCGGCTGAACGTGTGCCAGGACAAGATCCTGACCCACTACGAGAACGACAGCACCGACCTGCGGGACCACATCGACTACTGGAAGCACATGCGGCTGGAATGCGCCATCTACTACAAGGCCAGAGAGATGGGCTTCAAGCACATCAACCACCAGGTGGTGCCCACCCTGGCCGTGTCCAAGAACAAGGCCCTGCAGGCCATCGAGCTGCAGCTGACCCTGGAAACCATCTACAACAGCCAGTACAGCAACGAGAAGTGGACCCTGCAGGACGTGTCCCTGGAAGTGTACCTGACCGCTCCCACCGGCTGCATCAAGAAACACGGCTACACCGTGGAAGTGCAGTTCGACGGCGACATCTGCAACACCATGCACTACACCAACTGGACCCACATCTACATCTGCGAAGAGGCCAGCGTGACCGTGGTGGAAGGCCAGGTGGACTACTACGGCCTGTACTACGTGCACGAGGGCATCCGGACCTACTTCGTGCAGTTCAAGGACGACGCCGAGAAGTACAGCAAGAACAAAGTGTGGGAGGTGCACGCTGGCGGCCAGGTCATCCTGTGCCCCACCAGCGTGTTCAGCAGCAACGAGGTGTCCAGCCCCGAGATCATCCGGCAGCACCTGGCCAATCACCCTGCCGCCACCCACACAAAGGCCGTGGCCCTGGGCACCGAGGAAACCCAGACCACCATCCAGCGGCCCAGAAGCGAGCCCGACACCGGCAATCCCTGCCACACCACCAAGCTGCTGCACCGGGACAGCGTGGACAGCGCCCCTATCCTGACCGCCTTCAACAGCAGCCACAAGGGCCGGATCAACTGCAACAGCAACACCACCCCCATCGTGCACCTGAAGGTGGACGCCAACACCCTGATGCGGCTGCGGTACAGATTCAAGAAGCACTGCACCCTGTACACCGCCGTGTCCTCCACCTGGCACTGGACCGGCCACAACGTGAAGCACAAGAGCGCCATCGTGACCCTGACCTACGACAGCGAGTGGCAGCGGGACCAGTTCCTGAGCCAGGTCAAAATCCCCAAGACCATCACCGTGTCCACCGGCTTCATGAGCATCATGCACCAGAAACGGACCGCCATGTTCCAGGACCCCCAGGAACGGCCCAGAAAGCTGCCCCAGCTGTGCACCGAGCTGCAGACCACCATCCACGACATCATCCTGGAATGCGTGTACTGCAAGCAGCAGCTGGAAGATGAGATCGACGGCCCTGCTGGCCAGGCCGAACCCGACAGAGCCCACTACAATATCGTGACCTTCTGCTGCAAGTGCGACAGCACCCTGCGGCTGTGCGTGCAGAGCACCCACGTGGACATCCGGACCCTGGAAGATCTGCTGATGGGCACCCTGGGCATCGTGTGCCCCATCTGCAGCCAGAAGCCCGGCACCACCCTGGAACAGCAGTACAACAAGCCCCTGTGCGACCTGCTGATCCGGTGCATCAACTGCCAGAAACCCCTGTGCCCCGAGGAAAAGCAGCGGCACCTGGACAAGAAGCAGCGGTTCCACAACATCCGGGGCAGATGGACAGGCAGATGCATGAGCTGCTGCAGAAGCAGCCGGACCAGACGGGAAACCCAGATGCACGGCGACACCCCCACCCTGCACGAGTACATGCTGGACCTGCAGCCCGAGACAACCGACCTGTACTGCTACGAGCAGCTGAACGACAGCAGCGAGGAAGAGGACGAGATTGACGGACCCGCTGGACAGGCCGAGCCTGACCGGGCTCACTATAACATCGTGACATTTTGCTGTCAGCTCTGTACTGAACTCCAGACAACAATTCACGATATTATTCTCGAATGTGTGTATTGTAAACAGCAGCTCCTGCGGAGAGAGGTGTACGACTTCGCCTTCCGGGACCTCTGCATCGTGTATCGGGACGGCAACCCCTACGCCGTGTGCGACAAGTGCCTGAAGTTCTACAGCAAGATCAGCGAGTACCGGCACTACTGCTACAGCCTGTACGGAACAACACTCGAACAGCAGTATAACAAACCACTCTGTGATCTGCTGATTCGCTGTATCAATTGTCAGAAGTGATAA
SEQ ID NO:5(HPV16 E6E7E2SH，编码HPV16 E6/E7/E2设计多肽的氨基酸序列)
MHQKRTAMFQDPQERPRKLPQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKPGTTLEQQYNKPLCDLLIRCINCQKPLCPEEKQRHLDKKQRFHNIRGRWTGRCMSCCRSSRTRRETQMHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLLRREVYDFAFRDLCIVYRDGNPYAVCDKCLKFYSKISEYRHYCYSLYGTTLEQQYNKPLCDLLIRCINCQKMETLCQRLNVCQDKILTHYENDSTDLRDHIDYWKHMRLECAIYYKAREMGFKHINHQVVPTLAVSKNKALQAIELQLTLETIYNSQYSNEKWTLQDVSLEVYLTAPTGCIKKHGYTVEVQFDGDICNTMHYTNWTHIYICEEASVTVVEGQVDYYGLYYVHEGIRTYFVQFKDDAEKYSKNKVWEVHAGGQVILCPTSVFSSNEVSSPEIIRQHLANHPAATHTKAVALGTEETQTTIQRPRSEPDTGNPCHTTKLLHRDSVDSAPILTAFNSSHKGRINCNSNTTPIVHLKVDANTLMRLRYRFKKHCTLYTAVSSTWHWTGHNVKHKSAIVTLTYDSEWQRDQFLSQVKIPKTITVSTGFMSI
SEQ ID NO:6(HPV16 E6E7E2SH，编码HPV16 E6/E7/E2设计多肽的核苷酸序列)
ATGCACCAGAAACGGACCGCCATGTTCCAGGACCCCCAGGAACGGCCCAGAAAGCTGCCCCAGCTGTGCACCGAGCTGCAGACCACCATCCACGACATCATCCTGGAATGCGTGTACTGCAAGCAGCAGCTGGAAGATGAGATCGACGGCCCTGCTGGCCAGGCCGAACCCGACAGAGCCCACTACAATATCGTGACCTTCTGCTGCAAGTGCGACAGCACCCTGCGGCTGTGCGTGCAGAGCACCCACGTGGACATCCGGACCCTGGAAGATCTGCTGATGGGCACCCTGGGCATCGTGTGCCCCATCTGCAGCCAGAAGCCCGGCACCACCCTGGAACAGCAGTACAACAAGCCCCTGTGCGACCTGCTGATCCGGTGCATCAACTGCCAGAAACCCCTGTGCCCCGAGGAAAAGCAGCGGCACCTGGACAAGAAGCAGCGGTTCCACAACATCCGGGGCAGATGGACAGGCAGATGCATGAGCTGCTGCAGAAGCAGCCGGACCAGACGGGAAACCCAGATGCACGGCGACACCCCCACCCTGCACGAGTACATGCTGGACCTGCAGCCCGAGACAACCGACCTGTACTGCTACGAGCAGCTGAACGACAGCAGCGAGGAAGAGGACGAGATTGACGGACCCGCTGGACAGGCCGAGCCTGACCGGGCTCACTATAACATCGTGACATTTTGCTGTCAGCTCTGTACTGAACTCCAGACAACAATTCACGATATTATTCTCGAATGTGTGTATTGTAAACAGCAGCTCCTGCGGAGAGAGGTGTACGACTTCGCCTTCCGGGACCTCTGCATCGTGTATCGGGACGGCAACCCCTACGCCGTGTGCGACAAGTGCCTGAAGTTCTACAGCAAGATCAGCGAGTACCGGCACTACTGCTACAGCCTGTACGGAACAACACTCGAACAGCAGTATAACAAACCACTCTGTGATCTGCTGATTCGCTGTATCAATTGTCAGAAGATGGAAACCCTGTGCCAGCGGCTGAACGTGTGCCAGGACAAGATCCTGACCCACTACGAGAACGACAGCACCGACCTGCGGGACCACATCGACTACTGGAAGCACATGCGGCTGGAATGCGCCATCTACTACAAGGCCAGAGAGATGGGCTTCAAGCACATCAACCACCAGGTGGTGCCCACCCTGGCCGTGTCCAAGAACAAGGCCCTGCAGGCCATCGAGCTGCAGCTGACCCTGGAAACCATCTACAACAGCCAGTACAGCAACGAGAAGTGGACCCTGCAGGACGTGTCCCTGGAAGTGTACCTGACCGCTCCCACCGGCTGCATCAAGAAACACGGCTACACCGTGGAAGTGCAGTTCGACGGCGACATCTGCAACACCATGCACTACACCAACTGGACCCACATCTACATCTGCGAAGAGGCCAGCGTGACCGTGGTGGAAGGCCAGGTGGACTACTACGGCCTGTACTACGTGCACGAGGGCATCCGGACCTACTTCGTGCAGTTCAAGGACGACGCCGAGAAGTACAGCAAGAACAAAGTGTGGGAGGTGCACGCTGGCGGCCAGGTCATCCTGTGCCCCACCAGCGTGTTCAGCAGCAACGAGGTGTCCAGCCCCGAGATCATCCGGCAGCACCTGGCCAATCACCCTGCCGCCACCCACACAAAGGCCGTGGCCCTGGGCACCGAGGAAACCCAGACCACCATCCAGCGGCCCAGAAGCGAGCCCGACACCGGCAATCCCTGCCACACCACCAAGCTGCTGCACCGGGACAGCGTGGACAGCGCCCCTATCCTGACCGCCTTCAACAGCAGCCACAAGGGCCGGATCAACTGCAACAGCAACACCACCCCCATCGTGCACCTGAAGGTGGACGCCAACACCCTGATGCGGCTGCGGTACAGATTCAAGAAGCACTGCACCCTGTACACCGCCGTGTCCTCCACCTGGCACTGGACCGGCCACAACGTGAAGCACAAGAGCGCCATCGTGACCCTGACCTACGACAGCGAGTGGCAGCGGGACCAGTTCCTGAGCCAGGTCAAAATCCCCAAGACCATCACCGTGTCCACCGGCTTCATGAGCATCTGATAA
SEQ ID NO:7(IgE前导肽氨基酸序列)
MDWTWILFLVAAATRVHS
SEQ ID NO:8(编码IgE前导肽的核苷酸序列)
ATGGACTGGACCTGGATCCTGTTCCTGGTGGCTGCCGCAACCCGGGTGCACAGC
SEQ ID NO:9(aa HAVT20前导肽氨基酸序列)
MACPGFLWALVISTCLEFSMA
SEQ ID NO:10(编码HAVT20前导肽的核苷酸序列)
ATGGCCTGCCCCGGCTTTCTGTGGGCCCTGGTCATCAGCACCTGTCTGGAATTCAGCATGGCC
SEQ ID NO:11(包含2xTetO的序列)
GAGCTCTCCCTATCAGTGATAGAGATCTCCCTATCAGTGATAGAGATCGTCGAC
SEQ ID NO:12(包含CuO的序列)
AACAAACAGACAATCTGGTCTGTTTGTA
SEQ ID NO:13(存在于pAdApt26和pAdApt35质粒中的CMV启动子)
TCAATATTGGCCATTAGCCATATTATTCATTGGTTATATAGCATAAATCAATATTGGCTATTGGCCATTGCATACGTTGTATCCATATCATAATATGTACATTTATATTGGCTCATGTCCAACATTACCGCCATGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGCGGCCGGGAACGGTGCATTGGA
SEQ ID NO:14(TetR，编码由pcDNATM6/TR表达的TetR多肽的氨基酸序列的核苷酸 序列)
ATGTCTAGATTAGATAAAAGTAAAGTGATTAACAGCGCATTAGAGCTGCTTAATGAGGTCGGAATCGAAGGTTTAACAACCCGTAAACTCGCCCAGAAGCTAGGTGTAGAGCAGCCTACATTGTATTGGCATGTAAAAAATAAGCGGGCTTTGCTCGACGCCTTAGCCATTGAGATGTTAGATAGGCACCATACTCACTTTTGCCCTTTAGAAGGGGAAAGCTGGCAAGATTTTTTACGTAATAACGCTAAAAGTTTTAGATGTGCTTTACTAAGTCATCGCGATGGAGCAAAAGTACATTTAGGTACACGGCCTACAGAAAAACAGTATGAAACTCTCGAAAATCAATTAGCCTTTTTATGCCAACAAGGTTTTTCACTAGAGAATGCATTATATGCACTCAGCGCTGTGGGGCATTTTACTTTAGGTTGCGTATTGGAAGATCAAGAGCATCAAGTCGCTAAAGAAGAAAGGGAAACACCTACTACTGATAGTATGCCGCCATTATTACGACAAGCTATCGAATTATTTGATCACCAAGGTGCAGAGCCAGCCTTCTTATTCGGCCTTGAATTGATCATATGCGGATTAGAAAAACAACTTAAATGTGAAAGTGGGTCCGCGTACAGCGGATCCCGGGAATTCAGATCTTATTAA
SEQ ID NO:15(TetR，由pcDNATM6/TR表达的TetR多肽的氨基酸序列)
MSRLDKSKVINSALELLNEVGIEGLTTRKLAQKLGVEQPTLYWHVKNKRALLDALAIEMLDRHHTHFCPLEGESWQDFLRNNAKSFRCALLSHRDGAKVHLGTRPTEKQYETLENQLAFLCQQGFSLENALYALSAVGHFTLGCVLEDQEHQVAKEERETPTTDSMPPLLRQAIELFDHQGAEPAFLFGLELIICGLEKQLKCESGSAYSGSREFRSY
SEQ ID NO:16(CymR，编码CymR多肽的氨基酸序列的核苷酸序列)
ATGTCTCCCAAACGACGGACTCAAGCGGAAAGGGCAATGGAAACTCAGGGTAAGCTGATTGCCGCGGCTCTGGGAGTGCTGCGAGAGAAAGGGTATGCCGGGTTTCGCATAGCCGACGTTCCTGGAGCTGCAGGCGTAAGCAGAGGAGCCCAATCTCATCACTTTCCGACCAAGCTGGAGCTTTTGCTGGCTACCTTCGAATGGCTGTACGAGCAGATCACGGAAAGGAGTCGTGCTAGGCTGGCCAAGCTGAAACCCGAGGATGATGTCATTCAGCAGATGCTGGACGATGCAGCCGAGTTCTTCCTGGACGACGACTTCAGCATCAGTCTCGACCTCATCGTAGCCGCAGATCGCGATCCAGCTTTGCGCGAGGGCATACAGAGAACAGTCGAGCGGAATCGGTTTGTGGTGGAGGACATGTGGCTTGGTGTTCTGGTGAGCAGAGGCCTCTCACGGGATGATGCCGAGGACATCCTGTGGCTGATCTTTAACTCCGTCAGAGGGTTGGCAGTGAGGTCCCTTTGGCAGAAGGACAAAGAACGGTTTGAACGTGTGCGAAACTCAACACTCGAGATTGCTAGGGAACGCTACGCCAAGTTCAAGAGATGA
SEQ ID NO:17(CymR，CymR多肽的氨基酸序列)
MSPKRRTQAERAMETQGKLIAAALGVLREKGYAGFRIADVPGAAGVSRGAQSHHFPTKLELLLATFEWLYEQITERSRARLAKLKPEDDVIQQMLDDAAEFFLDDDFSISLDLIVAADRDPALREGIQRTVERNRFVVEDMWLGVLVSRGLSRDDAEDILWLIFNSVRGLAVRSLWQKDKERFERVRNSTLEIARERYAKFKR
SEQ ID NO:18(HPV16 E6，aa41-65)
KQQLLRREVYDFAFRDLCIVYRDGN
SEQ ID NO:19(HPV16 E7 aa 43-77)
GQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIR
序列表
<110> 荷兰库赛尔私人公司（Crucell Holland B.V.）
邦尼克，艾薇琳·玛格丽莎（Bunnik, Evelien Margaretha）
卡斯特，杰罗姆·胡波蒂娜·亨里克斯·维克多（Custers, Jerome HubertinaHenricus Victor）
舍佩尔，格里特·克里斯蒂安（Scheper, Gerrit Christiaan）
奥斯特惠斯，科恩（Oosterhuis, Koen）
尤里，吉尔·塔克（Uil, Taco Gilles）
卡恩，赛琳娜（Khan, Selina）
<120> 治疗性HPV16疫苗
<130> 0248 WO 00 ORD
<160> 19
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HPV16-E6E7SH设计的多肽
<400> 1
Met His Gln Lys Arg Thr Ala Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro
1 5 10 15
Arg Lys Leu Pro Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp
20 25 30
Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Glu Asp Glu Ile
35 40 45
Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile
50 55 60
Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln
65 70 75 80
Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu Asp Leu Leu Met Gly Thr
85 90 95
Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln Lys Pro Gly Thr Thr Leu
100 105 110
Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile
115 120 125
Asn Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp
130 135 140
Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys
145 150 155 160
Met Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg Thr Arg Arg Glu Thr Gln Met His
165 170 175
Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu
180 185 190
Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser Glu Glu
195 200 205
Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala
210 215 220
His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln
225 230 235 240
Thr Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln
245 250 255
Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp Leu Cys Ile
260 265 270
Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp Lys Cys Leu Lys
275 280 285
Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys Tyr Ser Leu Tyr
290 295 300
Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu
305 310 315 320
Ile Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys
325
<210> 2
<211> 990
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码HPV16-E6E7SH设计的多肽的nt序列
<400> 2
atgcaccaga aacggaccgc catgttccag gacccccagg aacggcccag aaagctgccc 60
cagctgtgca ccgagctgca gaccaccatc cacgacatca tcctggaatg cgtgtactgc 120
aagcagcagc tggaagatga gatcgacggc cctgctggcc aggccgaacc cgacagagcc 180
cactacaata tcgtgacctt ctgctgcaag tgcgacagca ccctgcggct gtgcgtgcag 240
agcacccacg tggacatccg gaccctggaa gatctgctga tgggcaccct gggcatcgtg 300
tgccccatct gcagccagaa gcccggcacc accctggaac agcagtacaa caagcccctg 360
tgcgacctgc tgatccggtg catcaactgc cagaaacccc tgtgccccga ggaaaagcag 420
cggcacctgg acaagaagca gcggttccac aacatccggg gcagatggac aggcagatgc 480
atgagctgct gcagaagcag ccggaccaga cgggaaaccc agatgcacgg cgacaccccc 540
accctgcacg agtacatgct ggacctgcag cccgagacaa ccgacctgta ctgctacgag 600
cagctgaacg acagcagcga ggaagaggac gagattgacg gacccgctgg acaggccgag 660
cctgaccggg ctcactataa catcgtgaca ttttgctgtc agctctgtac tgaactccag 720
acaacaattc acgatattat tctcgaatgt gtgtattgta aacagcagct cctgcggaga 780
gaggtgtacg acttcgcctt ccgggacctc tgcatcgtgt atcgggacgg caacccctac 840
gccgtgtgcg acaagtgcct gaagttctac agcaagatca gcgagtaccg gcactactgc 900
tacagcctgt acggaacaac actcgaacag cagtataaca aaccactctg tgatctgctg 960
attcgctgta tcaattgtca gaagtgataa 990
<210> 3
<211> 693
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HPV16 E2E6E7SH设计的多肽
<400> 3
Met Glu Thr Leu Cys Gln Arg Leu Asn Val Cys Gln Asp Lys Ile Leu
1 5 10 15
Thr His Tyr Glu Asn Asp Ser Thr Asp Leu Arg Asp His Ile Asp Tyr
20 25 30
Trp Lys His Met Arg Leu Glu Cys Ala Ile Tyr Tyr Lys Ala Arg Glu
35 40 45
Met Gly Phe Lys His Ile Asn His Gln Val Val Pro Thr Leu Ala Val
50 55 60
Ser Lys Asn Lys Ala Leu Gln Ala Ile Glu Leu Gln Leu Thr Leu Glu
65 70 75 80
Thr Ile Tyr Asn Ser Gln Tyr Ser Asn Glu Lys Trp Thr Leu Gln Asp
85 90 95
Val Ser Leu Glu Val Tyr Leu Thr Ala Pro Thr Gly Cys Ile Lys Lys
100 105 110
His Gly Tyr Thr Val Glu Val Gln Phe Asp Gly Asp Ile Cys Asn Thr
115 120 125
Met His Tyr Thr Asn Trp Thr His Ile Tyr Ile Cys Glu Glu Ala Ser
130 135 140
Val Thr Val Val Glu Gly Gln Val Asp Tyr Tyr Gly Leu Tyr Tyr Val
145 150 155 160
His Glu Gly Ile Arg Thr Tyr Phe Val Gln Phe Lys Asp Asp Ala Glu
165 170 175
Lys Tyr Ser Lys Asn Lys Val Trp Glu Val His Ala Gly Gly Gln Val
180 185 190
Ile Leu Cys Pro Thr Ser Val Phe Ser Ser Asn Glu Val Ser Ser Pro
195 200 205
Glu Ile Ile Arg Gln His Leu Ala Asn His Pro Ala Ala Thr His Thr
210 215 220
Lys Ala Val Ala Leu Gly Thr Glu Glu Thr Gln Thr Thr Ile Gln Arg
225 230 235 240
Pro Arg Ser Glu Pro Asp Thr Gly Asn Pro Cys His Thr Thr Lys Leu
245 250 255
Leu His Arg Asp Ser Val Asp Ser Ala Pro Ile Leu Thr Ala Phe Asn
260 265 270
Ser Ser His Lys Gly Arg Ile Asn Cys Asn Ser Asn Thr Thr Pro Ile
275 280 285
Val His Leu Lys Val Asp Ala Asn Thr Leu Met Arg Leu Arg Tyr Arg
290 295 300
Phe Lys Lys His Cys Thr Leu Tyr Thr Ala Val Ser Ser Thr Trp His
305 310 315 320
Trp Thr Gly His Asn Val Lys His Lys Ser Ala Ile Val Thr Leu Thr
325 330 335
Tyr Asp Ser Glu Trp Gln Arg Asp Gln Phe Leu Ser Gln Val Lys Ile
340 345 350
Pro Lys Thr Ile Thr Val Ser Thr Gly Phe Met Ser Ile Met His Gln
355 360 365
Lys Arg Thr Ala Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro Arg Lys Leu
370 375 380
Pro Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile Leu
385 390 395 400
Glu Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro
405 410 415
Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe
420 425 430
Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His
435 440 445
Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile
450 455 460
Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln Lys Pro Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln
465 470 475 480
Tyr Asn Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn Cys Gln
485 490 495
Lys Pro Leu Cys Pro Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp Lys Lys Gln
500 505 510
Arg Phe His Asn Ile Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met Ser Cys
515 520 525
Cys Arg Ser Ser Arg Thr Arg Arg Glu Thr Gln Met His Gly Asp Thr
530 535 540
Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr Asp
545 550 555 560
Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser Glu Glu Glu Asp Glu
565 570 575
Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn
580 585 590
Ile Val Thr Phe Cys Cys Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile
595 600 605
His Asp Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg
610 615 620
Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg
625 630 635 640
Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser
645 650 655
Lys Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr
660 665 670
Leu Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys
675 680 685
Ile Asn Cys Gln Lys
690
<210> 4
<211> 2085
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码HPV16 E2E6E7SH设计的多肽的nt序列
<400> 4
atggaaaccc tgtgccagcg gctgaacgtg tgccaggaca agatcctgac ccactacgag 60
aacgacagca ccgacctgcg ggaccacatc gactactgga agcacatgcg gctggaatgc 120
gccatctact acaaggccag agagatgggc ttcaagcaca tcaaccacca ggtggtgccc 180
accctggccg tgtccaagaa caaggccctg caggccatcg agctgcagct gaccctggaa 240
accatctaca acagccagta cagcaacgag aagtggaccc tgcaggacgt gtccctggaa 300
gtgtacctga ccgctcccac cggctgcatc aagaaacacg gctacaccgt ggaagtgcag 360
ttcgacggcg acatctgcaa caccatgcac tacaccaact ggacccacat ctacatctgc 420
gaagaggcca gcgtgaccgt ggtggaaggc caggtggact actacggcct gtactacgtg 480
cacgagggca tccggaccta cttcgtgcag ttcaaggacg acgccgagaa gtacagcaag 540
aacaaagtgt gggaggtgca cgctggcggc caggtcatcc tgtgccccac cagcgtgttc 600
agcagcaacg aggtgtccag ccccgagatc atccggcagc acctggccaa tcaccctgcc 660
gccacccaca caaaggccgt ggccctgggc accgaggaaa cccagaccac catccagcgg 720
cccagaagcg agcccgacac cggcaatccc tgccacacca ccaagctgct gcaccgggac 780
agcgtggaca gcgcccctat cctgaccgcc ttcaacagca gccacaaggg ccggatcaac 840
tgcaacagca acaccacccc catcgtgcac ctgaaggtgg acgccaacac cctgatgcgg 900
ctgcggtaca gattcaagaa gcactgcacc ctgtacaccg ccgtgtcctc cacctggcac 960
tggaccggcc acaacgtgaa gcacaagagc gccatcgtga ccctgaccta cgacagcgag 1020
tggcagcggg accagttcct gagccaggtc aaaatcccca agaccatcac cgtgtccacc 1080
ggcttcatga gcatcatgca ccagaaacgg accgccatgt tccaggaccc ccaggaacgg 1140
cccagaaagc tgccccagct gtgcaccgag ctgcagacca ccatccacga catcatcctg 1200
gaatgcgtgt actgcaagca gcagctggaa gatgagatcg acggccctgc tggccaggcc 1260
gaacccgaca gagcccacta caatatcgtg accttctgct gcaagtgcga cagcaccctg 1320
cggctgtgcg tgcagagcac ccacgtggac atccggaccc tggaagatct gctgatgggc 1380
accctgggca tcgtgtgccc catctgcagc cagaagcccg gcaccaccct ggaacagcag 1440
tacaacaagc ccctgtgcga cctgctgatc cggtgcatca actgccagaa acccctgtgc 1500
cccgaggaaa agcagcggca cctggacaag aagcagcggt tccacaacat ccggggcaga 1560
tggacaggca gatgcatgag ctgctgcaga agcagccgga ccagacggga aacccagatg 1620
cacggcgaca cccccaccct gcacgagtac atgctggacc tgcagcccga gacaaccgac 1680
ctgtactgct acgagcagct gaacgacagc agcgaggaag aggacgagat tgacggaccc 1740
gctggacagg ccgagcctga ccgggctcac tataacatcg tgacattttg ctgtcagctc 1800
tgtactgaac tccagacaac aattcacgat attattctcg aatgtgtgta ttgtaaacag 1860
cagctcctgc ggagagaggt gtacgacttc gccttccggg acctctgcat cgtgtatcgg 1920
gacggcaacc cctacgccgt gtgcgacaag tgcctgaagt tctacagcaa gatcagcgag 1980
taccggcact actgctacag cctgtacgga acaacactcg aacagcagta taacaaacca 2040
ctctgtgatc tgctgattcg ctgtatcaat tgtcagaagt gataa 2085
<210> 5
<211> 693
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HPV16 E6E7E2SH设计的多肽
<400> 5
Met His Gln Lys Arg Thr Ala Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro
1 5 10 15
Arg Lys Leu Pro Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp
20 25 30
Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Glu Asp Glu Ile
35 40 45
Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile
50 55 60
Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln
65 70 75 80
Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu Asp Leu Leu Met Gly Thr
85 90 95
Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln Lys Pro Gly Thr Thr Leu
100 105 110
Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile
115 120 125
Asn Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp
130 135 140
Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys
145 150 155 160
Met Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg Thr Arg Arg Glu Thr Gln Met His
165 170 175
Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu
180 185 190
Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser Glu Glu
195 200 205
Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala
210 215 220
His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln
225 230 235 240
Thr Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln
245 250 255
Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp Leu Cys Ile
260 265 270
Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp Lys Cys Leu Lys
275 280 285
Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys Tyr Ser Leu Tyr
290 295 300
Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu
305 310 315 320
Ile Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Met Glu Thr Leu Cys Gln Arg Leu
325 330 335
Asn Val Cys Gln Asp Lys Ile Leu Thr His Tyr Glu Asn Asp Ser Thr
340 345 350
Asp Leu Arg Asp His Ile Asp Tyr Trp Lys His Met Arg Leu Glu Cys
355 360 365
Ala Ile Tyr Tyr Lys Ala Arg Glu Met Gly Phe Lys His Ile Asn His
370 375 380
Gln Val Val Pro Thr Leu Ala Val Ser Lys Asn Lys Ala Leu Gln Ala
385 390 395 400
Ile Glu Leu Gln Leu Thr Leu Glu Thr Ile Tyr Asn Ser Gln Tyr Ser
405 410 415
Asn Glu Lys Trp Thr Leu Gln Asp Val Ser Leu Glu Val Tyr Leu Thr
420 425 430
Ala Pro Thr Gly Cys Ile Lys Lys His Gly Tyr Thr Val Glu Val Gln
435 440 445
Phe Asp Gly Asp Ile Cys Asn Thr Met His Tyr Thr Asn Trp Thr His
450 455 460
Ile Tyr Ile Cys Glu Glu Ala Ser Val Thr Val Val Glu Gly Gln Val
465 470 475 480
Asp Tyr Tyr Gly Leu Tyr Tyr Val His Glu Gly Ile Arg Thr Tyr Phe
485 490 495
Val Gln Phe Lys Asp Asp Ala Glu Lys Tyr Ser Lys Asn Lys Val Trp
500 505 510
Glu Val His Ala Gly Gly Gln Val Ile Leu Cys Pro Thr Ser Val Phe
515 520 525
Ser Ser Asn Glu Val Ser Ser Pro Glu Ile Ile Arg Gln His Leu Ala
530 535 540
Asn His Pro Ala Ala Thr His Thr Lys Ala Val Ala Leu Gly Thr Glu
545 550 555 560
Glu Thr Gln Thr Thr Ile Gln Arg Pro Arg Ser Glu Pro Asp Thr Gly
565 570 575
Asn Pro Cys His Thr Thr Lys Leu Leu His Arg Asp Ser Val Asp Ser
580 585 590
Ala Pro Ile Leu Thr Ala Phe Asn Ser Ser His Lys Gly Arg Ile Asn
595 600 605
Cys Asn Ser Asn Thr Thr Pro Ile Val His Leu Lys Val Asp Ala Asn
610 615 620
Thr Leu Met Arg Leu Arg Tyr Arg Phe Lys Lys His Cys Thr Leu Tyr
625 630 635 640
Thr Ala Val Ser Ser Thr Trp His Trp Thr Gly His Asn Val Lys His
645 650 655
Lys Ser Ala Ile Val Thr Leu Thr Tyr Asp Ser Glu Trp Gln Arg Asp
660 665 670
Gln Phe Leu Ser Gln Val Lys Ile Pro Lys Thr Ile Thr Val Ser Thr
675 680 685
Gly Phe Met Ser Ile
690
<210> 6
<211> 2085
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码HPV16 E6E7E2SH设计的多肽的nt序列
<400> 6
atgcaccaga aacggaccgc catgttccag gacccccagg aacggcccag aaagctgccc 60
cagctgtgca ccgagctgca gaccaccatc cacgacatca tcctggaatg cgtgtactgc 120
aagcagcagc tggaagatga gatcgacggc cctgctggcc aggccgaacc cgacagagcc 180
cactacaata tcgtgacctt ctgctgcaag tgcgacagca ccctgcggct gtgcgtgcag 240
agcacccacg tggacatccg gaccctggaa gatctgctga tgggcaccct gggcatcgtg 300
tgccccatct gcagccagaa gcccggcacc accctggaac agcagtacaa caagcccctg 360
tgcgacctgc tgatccggtg catcaactgc cagaaacccc tgtgccccga ggaaaagcag 420
cggcacctgg acaagaagca gcggttccac aacatccggg gcagatggac aggcagatgc 480
atgagctgct gcagaagcag ccggaccaga cgggaaaccc agatgcacgg cgacaccccc 540
accctgcacg agtacatgct ggacctgcag cccgagacaa ccgacctgta ctgctacgag 600
cagctgaacg acagcagcga ggaagaggac gagattgacg gacccgctgg acaggccgag 660
cctgaccggg ctcactataa catcgtgaca ttttgctgtc agctctgtac tgaactccag 720
acaacaattc acgatattat tctcgaatgt gtgtattgta aacagcagct cctgcggaga 780
gaggtgtacg acttcgcctt ccgggacctc tgcatcgtgt atcgggacgg caacccctac 840
gccgtgtgcg acaagtgcct gaagttctac agcaagatca gcgagtaccg gcactactgc 900
tacagcctgt acggaacaac actcgaacag cagtataaca aaccactctg tgatctgctg 960
attcgctgta tcaattgtca gaagatggaa accctgtgcc agcggctgaa cgtgtgccag 1020
gacaagatcc tgacccacta cgagaacgac agcaccgacc tgcgggacca catcgactac 1080
tggaagcaca tgcggctgga atgcgccatc tactacaagg ccagagagat gggcttcaag 1140
cacatcaacc accaggtggt gcccaccctg gccgtgtcca agaacaaggc cctgcaggcc 1200
atcgagctgc agctgaccct ggaaaccatc tacaacagcc agtacagcaa cgagaagtgg 1260
accctgcagg acgtgtccct ggaagtgtac ctgaccgctc ccaccggctg catcaagaaa 1320
cacggctaca ccgtggaagt gcagttcgac ggcgacatct gcaacaccat gcactacacc 1380
aactggaccc acatctacat ctgcgaagag gccagcgtga ccgtggtgga aggccaggtg 1440
gactactacg gcctgtacta cgtgcacgag ggcatccgga cctacttcgt gcagttcaag 1500
gacgacgccg agaagtacag caagaacaaa gtgtgggagg tgcacgctgg cggccaggtc 1560
atcctgtgcc ccaccagcgt gttcagcagc aacgaggtgt ccagccccga gatcatccgg 1620
cagcacctgg ccaatcaccc tgccgccacc cacacaaagg ccgtggccct gggcaccgag 1680
gaaacccaga ccaccatcca gcggcccaga agcgagcccg acaccggcaa tccctgccac 1740
accaccaagc tgctgcaccg ggacagcgtg gacagcgccc ctatcctgac cgccttcaac 1800
agcagccaca agggccggat caactgcaac agcaacacca cccccatcgt gcacctgaag 1860
gtggacgcca acaccctgat gcggctgcgg tacagattca agaagcactg caccctgtac 1920
accgccgtgt cctccacctg gcactggacc ggccacaacg tgaagcacaa gagcgccatc 1980
gtgaccctga cctacgacag cgagtggcag cgggaccagt tcctgagcca ggtcaaaatc 2040
cccaagacca tcaccgtgtc caccggcttc atgagcatct gataa 2085
<210> 7
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgE前导肽
<400> 7
Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val
1 5 10 15
His Ser
<210> 8
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码IgE前导肽的nt序列
<400> 8
atggactgga cctggatcct gttcctggtg gctgccgcaa cccgggtgca cagc 54
<210> 9
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HAVT20前导肽
<400> 9
Met Ala Cys Pro Gly Phe Leu Trp Ala Leu Val Ile Ser Thr Cys Leu
1 5 10 15
Glu Phe Ser Met Ala
20
<210> 10
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码HAVT20前导肽的nt序列
<400> 10
atggcctgcc ccggctttct gtgggccctg gtcatcagca cctgtctgga attcagcatg 60
gcc 63
<210> 11
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 含有2xTetO的序列
<400> 11
gagctctccc tatcagtgat agagatctcc ctatcagtga tagagatcgt cgac 54
<210> 12
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 含有CuO的序列
<400> 12
aacaaacaga caatctggtc tgtttgta 28
<210> 13
<211> 829
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CMV启动子
<400> 13
tcaatattgg ccattagcca tattattcat tggttatata gcataaatca atattggcta 60
ttggccattg catacgttgt atccatatca taatatgtac atttatattg gctcatgtcc 120
aacattaccg ccatgttgac attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg 180
gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc 240
gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat 300
agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc 360
ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga 420
cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg 480
gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacat 540
caatgggcgt ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt 600
caatgggagt ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaacaactc 660
cgccccattg acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata taagcagagc 720
tcgtttagtg aaccgtcaga tcgcctggag acgccatcca cgctgttttg acctccatag 780
aagacaccgg gaccgatcca gcctccgcgg ccgggaacgg tgcattgga 829
<210> 14
<211> 657
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码TetR多肽的nt序列
<400> 14
atgtctagat tagataaaag taaagtgatt aacagcgcat tagagctgct taatgaggtc 60
ggaatcgaag gtttaacaac ccgtaaactc gcccagaagc taggtgtaga gcagcctaca 120
ttgtattggc atgtaaaaaa taagcgggct ttgctcgacg ccttagccat tgagatgtta 180
gataggcacc atactcactt ttgcccttta gaaggggaaa gctggcaaga ttttttacgt 240
aataacgcta aaagttttag atgtgcttta ctaagtcatc gcgatggagc aaaagtacat 300
ttaggtacac ggcctacaga aaaacagtat gaaactctcg aaaatcaatt agccttttta 360
tgccaacaag gtttttcact agagaatgca ttatatgcac tcagcgctgt ggggcatttt 420
actttaggtt gcgtattgga agatcaagag catcaagtcg ctaaagaaga aagggaaaca 480
cctactactg atagtatgcc gccattatta cgacaagcta tcgaattatt tgatcaccaa 540
ggtgcagagc cagccttctt attcggcctt gaattgatca tatgcggatt agaaaaacaa 600
cttaaatgtg aaagtgggtc cgcgtacagc ggatcccggg aattcagatc ttattaa 657
<210> 15
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TetR多肽
<400> 15
Met Ser Arg Leu Asp Lys Ser Lys Val Ile Asn Ser Ala Leu Glu Leu
1 5 10 15
Leu Asn Glu Val Gly Ile Glu Gly Leu Thr Thr Arg Lys Leu Ala Gln
20 25 30
Lys Leu Gly Val Glu Gln Pro Thr Leu Tyr Trp His Val Lys Asn Lys
35 40 45
Arg Ala Leu Leu Asp Ala Leu Ala Ile Glu Met Leu Asp Arg His His
50 55 60
Thr His Phe Cys Pro Leu Glu Gly Glu Ser Trp Gln Asp Phe Leu Arg
65 70 75 80
Asn Asn Ala Lys Ser Phe Arg Cys Ala Leu Leu Ser His Arg Asp Gly
85 90 95
Ala Lys Val His Leu Gly Thr Arg Pro Thr Glu Lys Gln Tyr Glu Thr
100 105 110
Leu Glu Asn Gln Leu Ala Phe Leu Cys Gln Gln Gly Phe Ser Leu Glu
115 120 125
Asn Ala Leu Tyr Ala Leu Ser Ala Val Gly His Phe Thr Leu Gly Cys
130 135 140
Val Leu Glu Asp Gln Glu His Gln Val Ala Lys Glu Glu Arg Glu Thr
145 150 155 160
Pro Thr Thr Asp Ser Met Pro Pro Leu Leu Arg Gln Ala Ile Glu Leu
165 170 175
Phe Asp His Gln Gly Ala Glu Pro Ala Phe Leu Phe Gly Leu Glu Leu
180 185 190
Ile Ile Cys Gly Leu Glu Lys Gln Leu Lys Cys Glu Ser Gly Ser Ala
195 200 205
Tyr Ser Gly Ser Arg Glu Phe Arg Ser Tyr
210 215
<210> 16
<211> 612
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码CymR多肽的nt序列
<400> 16
atgtctccca aacgacggac tcaagcggaa agggcaatgg aaactcaggg taagctgatt 60
gccgcggctc tgggagtgct gcgagagaaa gggtatgccg ggtttcgcat agccgacgtt 120
cctggagctg caggcgtaag cagaggagcc caatctcatc actttccgac caagctggag 180
cttttgctgg ctaccttcga atggctgtac gagcagatca cggaaaggag tcgtgctagg 240
ctggccaagc tgaaacccga ggatgatgtc attcagcaga tgctggacga tgcagccgag 300
ttcttcctgg acgacgactt cagcatcagt ctcgacctca tcgtagccgc agatcgcgat 360
ccagctttgc gcgagggcat acagagaaca gtcgagcgga atcggtttgt ggtggaggac 420
atgtggcttg gtgttctggt gagcagaggc ctctcacggg atgatgccga ggacatcctg 480
tggctgatct ttaactccgt cagagggttg gcagtgaggt ccctttggca gaaggacaaa 540
gaacggtttg aacgtgtgcg aaactcaaca ctcgagattg ctagggaacg ctacgccaag 600
ttcaagagat ga 612
<210> 17
<211> 203
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CymR多肽
<400> 17
Met Ser Pro Lys Arg Arg Thr Gln Ala Glu Arg Ala Met Glu Thr Gln
1 5 10 15
Gly Lys Leu Ile Ala Ala Ala Leu Gly Val Leu Arg Glu Lys Gly Tyr
20 25 30
Ala Gly Phe Arg Ile Ala Asp Val Pro Gly Ala Ala Gly Val Ser Arg
35 40 45
Gly Ala Gln Ser His His Phe Pro Thr Lys Leu Glu Leu Leu Leu Ala
50 55 60
Thr Phe Glu Trp Leu Tyr Glu Gln Ile Thr Glu Arg Ser Arg Ala Arg
65 70 75 80
Leu Ala Lys Leu Lys Pro Glu Asp Asp Val Ile Gln Gln Met Leu Asp
85 90 95
Asp Ala Ala Glu Phe Phe Leu Asp Asp Asp Phe Ser Ile Ser Leu Asp
100 105 110
Leu Ile Val Ala Ala Asp Arg Asp Pro Ala Leu Arg Glu Gly Ile Gln
115 120 125
Arg Thr Val Glu Arg Asn Arg Phe Val Val Glu Asp Met Trp Leu Gly
130 135 140
Val Leu Val Ser Arg Gly Leu Ser Arg Asp Asp Ala Glu Asp Ile Leu
145 150 155 160
Trp Leu Ile Phe Asn Ser Val Arg Gly Leu Ala Val Arg Ser Leu Trp
165 170 175
Gln Lys Asp Lys Glu Arg Phe Glu Arg Val Arg Asn Ser Thr Leu Glu
180 185 190
Ile Ala Arg Glu Arg Tyr Ala Lys Phe Lys Arg
195 200
<210> 18
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HPV16 E6 aa41-65
<400> 18
Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp
1 5 10 15
Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn
20 25
<210> 19
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HPV16 E7 aa43-77
<400> 19
Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys
1 5 10 15
Cys Lys Cys Asp Ser Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val
20 25 30
Asp Ile Arg
35

Claims (17)

1.一种编码多肽的核酸分子，该多肽包括SEQ ID NO:1。
2.根据权利要求1所述的核酸分子，其中该编码的多肽进一步包括前导序列。
3.根据以上权利要求中任一项所述的核酸分子，其中该编码的多肽进一步包括人乳头瘤病毒(HPV)E2蛋白的至少一个表位。
4.根据权利要求3所述的核酸分子，其中该编码的多肽包括HPV16E2蛋白，该HPV16E2蛋白在它的DNA结合域中具有缺失或突变。
5.根据权利要求4所述的核酸分子，其中该编码的多肽包括SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5。
6.根据以上权利要求中任一项所述的核酸分子，其中该核酸序列经密码子优化。
7.根据以上权利要求中任一项所述的核酸分子，该核酸分子包括SEQ ID NO:2。
8.根据以上权利要求中任一项所述的核酸分子，该核酸分子包括SEQ ID NO:4或SEQID NO:6。
9.一种包括根据以上权利要求中任一项所述的核酸分子的载体，其中编码该多肽的序列可操作地连接至启动子。
10.根据权利要求9所述的载体，其中该载体是重组腺病毒。
11.根据权利要求9或10所述的载体，其中启动子可操作地偶联到阻遏物操纵基因序列上，阻遏蛋白可以结合至该阻遏物操纵基因序列上，以便在所述阻遏蛋白的存在下阻遏启动子的表达。
12.一种疫苗组合物，包括根据权利要求9-11中任一项所述的载体、和药学上可接受的赋形剂。
13.一种在受试者中诱导针对HPV的免疫应答的方法，该方法包括向受试者给予根据权利要求12所述的疫苗组合物。
14.根据权利要求13所述的方法，该方法包括多于一次地向该受试者给予根据权利要求12所述的疫苗。
15.一种用于治疗受试者中的以下各项的方法：持续性HPV感染、外阴上皮内瘤样病变(VIN)、宫颈上皮内瘤样病变(CIN)、阴道上皮内瘤样病变(VaIN)、肛门上皮内瘤样病变(AIN)、宫颈癌(如宫颈鳞状细胞癌(SCC))、口咽癌、阴茎癌、阴道癌或肛门癌，该方法包括向该受试者给予根据权利要求12所述的疫苗。
16.一种包括SEQ ID NO:1的多肽。
17.根据权利要求16所述的多肽，该多肽包括SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5。
CN201580060062.4A 2014-11-04 2015-11-03 治疗性hpv16疫苗 Active CN107075521B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP14191660 2014-11-04
EP14191660.1 2014-11-04
PCT/EP2015/075516 WO2016071306A1 (en) 2014-11-04 2015-11-03 Therapeutic hpv16 vaccines

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107075521A true CN107075521A (zh) 2017-08-18
CN107075521B CN107075521B (zh) 2021-06-08

Family

ID=52020908

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201580060062.4A Active CN107075521B (zh) 2014-11-04 2015-11-03 治疗性hpv16疫苗

Country Status (33)

Country Link
US (4) US9701721B2 (zh)
EP (2) EP3421046A1 (zh)
JP (2) JP6325751B2 (zh)
KR (1) KR20170083562A (zh)
CN (1) CN107075521B (zh)
AR (1) AR102527A1 (zh)
AU (2) AU2015341926B2 (zh)
BR (1) BR112017009177A2 (zh)
CA (1) CA2965562C (zh)
CL (1) CL2017001089A1 (zh)
CO (1) CO2017004838A2 (zh)
CY (1) CY1121377T1 (zh)
DK (1) DK3215187T3 (zh)
EA (1) EA035461B1 (zh)
ES (1) ES2697903T3 (zh)
HR (1) HRP20181895T1 (zh)
HU (1) HUE040440T2 (zh)
IL (1) IL251895B (zh)
LT (1) LT3215187T (zh)
MA (2) MA46378A (zh)
MD (1) MD3215187T2 (zh)
MX (1) MX2017005788A (zh)
MY (1) MY181175A (zh)
NZ (1) NZ730802A (zh)
PL (1) PL3215187T3 (zh)
PT (1) PT3215187T (zh)
RS (1) RS58080B1 (zh)
SA (1) SA517381457B1 (zh)
SG (1) SG11201702997YA (zh)
SI (1) SI3215187T1 (zh)
TW (2) TWI694147B (zh)
WO (1) WO2016071306A1 (zh)
ZA (1) ZA201703055B (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106632694A (zh) * 2017-01-24 2017-05-10 苏州远康生物医药有限公司 一种重组蛋白及药物组合物与应用
CN108939064A (zh) * 2018-08-06 2018-12-07 南京颂悦生物科技有限公司 基于重组减毒绵羊李斯特菌的宫颈癌治疗性疫苗
CN108992665A (zh) * 2018-08-06 2018-12-14 南京颂悦生物科技有限公司 基于重组减毒单增李斯特菌的宫颈癌治疗性疫苗
CN112105383A (zh) * 2018-03-12 2020-12-18 Sqz生物技术公司 用于治疗hpv相关疾病的方法
CN112437684A (zh) * 2018-07-20 2021-03-02 扬森疫苗与预防公司 以提高的生产率表达寨卡抗原的重组腺病毒载体

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EA035461B1 (ru) 2014-11-04 2020-06-19 Янссен Вэксинс Энд Превеншн Б.В. Терапевтические вакцины против hpv16
EA037295B1 (ru) 2015-08-20 2021-03-05 Янссен Вэксинс Энд Превеншн Б.В. Терапевтические вакцины против hpv18
MX2018013340A (es) * 2016-05-02 2019-08-21 Janssen Vaccines & Prevention Bv Combinaciones de vacunas terapeuticas para el vph.
AU2018335252A1 (en) 2017-09-23 2020-02-27 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Paramyxoviridae expression system
US20200399348A1 (en) * 2018-02-20 2020-12-24 Emory University HPV Proteins, Antibodies, and Uses in Managing Abnormal Epithelial Cell Growth
JP2022523564A (ja) 2019-03-04 2022-04-25 アイオーカレンツ， インコーポレイテッド 機械学習を使用するデータ圧縮および通信
MX2022002883A (es) 2019-09-20 2022-03-25 Transgene Combinacion de un poxvirus que codifica para polipeptidos de virus de papiloma humano (vph) e interleucina 2 (il-2) con un anticuerpo anti ligando 1 de muerte programada (pd-l1).
US20230277645A1 (en) * 2020-04-02 2023-09-07 Inovio Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treating vulvar dysplasia
WO2021209897A1 (en) 2020-04-13 2021-10-21 Janssen Biotech, Inc. Psma and steap1 vaccines and their uses
AU2021270777A1 (en) * 2020-05-12 2022-11-10 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Administration of homologous adenoviral vectors
KR20230125200A (ko) * 2020-11-24 2023-08-29 마 무초우 조 인간 유두종 바이러스에 대한 dna 백신 및 이를 사용하는 방법
CA3235779A1 (en) * 2021-10-22 2023-04-27 Jian Yan Compositions and methods for treating anal high-grade squamous intraepithelial lesion (hsil)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101617052A (zh) * 2007-01-30 2009-12-30 特兰斯吉恩股份有限公司 用于免疫的乳头瘤病毒e2多肽
WO2013083287A1 (en) * 2011-12-06 2013-06-13 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung Des Öffentlichen Rechtes Hpv derived polynucleic acids for therapy

Family Cites Families (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3584341D1 (de) 1984-08-24 1991-11-14 Upjohn Co Rekombinante dna-verbindungen und expression von polypeptiden wie tpa.
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
US5057540A (en) 1987-05-29 1991-10-15 Cambridge Biotech Corporation Saponin adjuvant
NZ230747A (en) 1988-09-30 1992-05-26 Bror Morein Immunomodulating matrix comprising a complex of at least one lipid and at least one saponin; certain glycosylated triterpenoid saponins derived from quillaja saponaria molina
JPH0832638B2 (ja) 1989-05-25 1996-03-29 カイロン コーポレイション サブミクロン油滴乳剤を含んで成るアジュバント製剤
FR2705686B1 (fr) 1993-05-28 1995-08-18 Transgene Sa Nouveaux adénovirus défectifs et lignées de complémentation correspondantes.
US5851806A (en) 1994-06-10 1998-12-22 Genvec, Inc. Complementary adenoviral systems and cell lines
EP1548118A2 (en) 1994-06-10 2005-06-29 Genvec, Inc. Complementary adenoviral vector systems and cell lines
US5965541A (en) 1995-11-28 1999-10-12 Genvec, Inc. Vectors and methods for gene transfer to cells
US5846782A (en) 1995-11-28 1998-12-08 Genvec, Inc. Targeting adenovirus with use of constrained peptide motifs
US5559099A (en) 1994-09-08 1996-09-24 Genvec, Inc. Penton base protein and methods of using same
US5786464C1 (en) 1994-09-19 2012-04-24 Gen Hospital Corp Overexpression of mammalian and viral proteins
AUPM873294A0 (en) 1994-10-12 1994-11-03 Csl Limited Saponin preparations and use thereof in iscoms
ATE278794T1 (de) 1995-06-15 2004-10-15 Crucell Holland Bv Verpackungssysteme für humane, menschliche adenoviren, zur verwendung in die gentherapie
US5837511A (en) 1995-10-02 1998-11-17 Cornell Research Foundation, Inc. Non-group C adenoviral vectors
CA2177085C (en) 1996-04-26 2007-08-14 National Research Council Of Canada Adenovirus e1-complementing cell lines
WO1998039411A1 (en) 1997-03-04 1998-09-11 Baxter International Inc. Adenovirus e1-complementing cell lines
US6020191A (en) 1997-04-14 2000-02-01 Genzyme Corporation Adenoviral vectors capable of facilitating increased persistence of transgene expression
US5972650A (en) 1997-06-26 1999-10-26 Brigham And Women's Hospital Tetracycline repressor regulated mammalian cell transcription and viral replication switch
US5981225A (en) 1998-04-16 1999-11-09 Baylor College Of Medicine Gene transfer vector, recombinant adenovirus particles containing the same, method for producing the same and method of use of the same
US6113913A (en) 1998-06-26 2000-09-05 Genvec, Inc. Recombinant adenovirus
NZ515582A (en) 1999-05-17 2003-11-28 Crucell Holland B Adenovirus derived gene delivery vehicles comprising at least one element of adenovirus type 35
US6913922B1 (en) 1999-05-18 2005-07-05 Crucell Holland B.V. Serotype of adenovirus and uses thereof
FR2794370B1 (fr) 1999-06-03 2003-10-17 Biovector Therapeutics Fragments proteiques polyepitopiques, leur obtention et leurs utilisations notamment en vaccination
CA2384987A1 (en) * 1999-09-16 2001-03-22 Zycos Inc. Nucleic acids encoding polyepitope polypeptides
DE19955558C2 (de) 1999-11-18 2003-03-20 Stefan Kochanek Permanente Amniozyten-Zelllinie, ihre Herstellung und Verwendung zur Herstellung von Gentransfervektoren
AU2002211490A1 (en) 2000-10-04 2002-04-15 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods of using capsid protein from flaviviruses and pestiviruses
CN100537773C (zh) 2000-11-23 2009-09-09 巴法里安诺迪克有限公司 改良安卡拉痘苗病毒变体
WO2002088346A2 (en) 2001-05-01 2002-11-07 National Research Council Of Canada A system for inducible expression in eukaryotic cells
ATE447037T1 (de) 2002-04-25 2009-11-15 Crucell Holland Bv Mittel und verfahren zur herstellung von adenovirusvektoren
SE0202110D0 (sv) 2002-07-05 2002-07-05 Isconova Ab Iscom preparation and use thereof
SE0301998D0 (sv) 2003-07-07 2003-07-07 Isconova Ab Quil A fraction with low toxicity and use thereof
CA2552508A1 (en) * 2003-12-31 2005-09-29 Pharmexa Inc. Inducing cellular immune responses to human papillomavirus using peptide and nucleic acid compositions
EP1718738A2 (en) 2004-02-23 2006-11-08 Crucell Holland B.V. Virus purification methods
MX2007004595A (es) 2004-11-08 2007-08-15 Chromagenics Bv Seleccion de celulas hospederas que expresan proteinas en altas concentraciones.
WO2007073513A2 (en) 2005-11-10 2007-06-28 Genvec, Inc. Method for propagating adenoviral vectors encoding inhibitory gene products
MY154956A (en) 2006-02-28 2015-08-28 Vaxart Inc Chimeric adenoviral vectors
WO2007104792A2 (en) 2006-03-16 2007-09-20 Crucell Holland B.V. Recombinant adenoviruses based on serotype 26 and 48, and use thereof
DE102008010954A1 (de) * 2008-02-25 2009-08-27 Cichon, Günter, Prof.Dr. DNA-Vakzine zur Therapie und Prophylaxe von Gebärmutterhalskrebs und seinen prämalignen Vorstufen
DK2350268T3 (en) 2008-11-03 2015-03-23 Crucell Holland Bv PROCEDURE FOR PRODUCING ADENOVIRUS VECTORS
GB0823497D0 (en) 2008-12-24 2009-01-28 Isis Innovation Immunogenic composition and use thereof
KR101820980B1 (ko) 2010-02-15 2018-01-22 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. Ａｄ 26 아데노바이러스 벡터를 제조하는 방법
US9000139B2 (en) * 2010-08-13 2015-04-07 Genexine, Inc. Composition for preventing or treating cervical cancer having human papillomavirus plasmodium and immunity enhancer
US20130122038A1 (en) 2011-11-14 2013-05-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Heterologous prime-boost immunization using measles virus-based vaccines
US8932607B2 (en) 2012-03-12 2015-01-13 Crucell Holland B.V. Batches of recombinant adenovirus with altered terminal ends
US9119813B2 (en) 2012-03-22 2015-09-01 Crucell Holland B.V. Vaccine against RSV
SG11201701506PA (en) 2014-09-03 2017-03-30 Bavarian Nordic As Recombinant modified vaccinia virus ankara (mva) filovirus vaccine
EA035461B1 (ru) 2014-11-04 2020-06-19 Янссен Вэксинс Энд Превеншн Б.В. Терапевтические вакцины против hpv16
EA037295B1 (ru) 2015-08-20 2021-03-05 Янссен Вэксинс Энд Превеншн Б.В. Терапевтические вакцины против hpv18
MX2018013340A (es) * 2016-05-02 2019-08-21 Janssen Vaccines & Prevention Bv Combinaciones de vacunas terapeuticas para el vph.

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101617052A (zh) * 2007-01-30 2009-12-30 特兰斯吉恩股份有限公司 用于免疫的乳头瘤病毒e2多肽
WO2013083287A1 (en) * 2011-12-06 2013-06-13 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung Des Öffentlichen Rechtes Hpv derived polynucleic acids for therapy

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
OHLSCHLAGER P: "An improved rearranged Human Papillomavirus Type 16 E7 DNA vaccine candidate (HPV-16 E7SH) induces an E7 wildtype-specific T cell response", 《VACCINE》 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106632694A (zh) * 2017-01-24 2017-05-10 苏州远康生物医药有限公司 一种重组蛋白及药物组合物与应用
CN106632694B (zh) * 2017-01-24 2021-02-12 南京益康生物医药有限公司 一种重组蛋白及药物组合物与应用
CN112105383A (zh) * 2018-03-12 2020-12-18 Sqz生物技术公司 用于治疗hpv相关疾病的方法
CN112437684A (zh) * 2018-07-20 2021-03-02 扬森疫苗与预防公司 以提高的生产率表达寨卡抗原的重组腺病毒载体
CN108939064A (zh) * 2018-08-06 2018-12-07 南京颂悦生物科技有限公司 基于重组减毒绵羊李斯特菌的宫颈癌治疗性疫苗
CN108992665A (zh) * 2018-08-06 2018-12-14 南京颂悦生物科技有限公司 基于重组减毒单增李斯特菌的宫颈癌治疗性疫苗
CN108992665B (zh) * 2018-08-06 2021-11-19 南京颂悦生物科技有限公司 基于重组减毒单增李斯特菌的宫颈癌治疗性疫苗
CN108939064B (zh) * 2018-08-06 2021-12-10 南京颂悦生物科技有限公司 基于重组减毒绵羊李斯特菌的宫颈癌治疗性疫苗

Also Published As

Publication number Publication date
PT3215187T (pt) 2018-11-27
CL2017001089A1 (es) 2017-12-29
US20200164057A1 (en) 2020-05-28
EP3421046A1 (en) 2019-01-02
TW201617450A (zh) 2016-05-16
HRP20181895T1 (hr) 2019-01-11
CA2965562C (en) 2023-11-21
EA201790976A1 (ru) 2017-09-29
MA40902A (fr) 2017-09-13
AU2015341926A1 (en) 2017-04-27
BR112017009177A2 (pt) 2018-12-11
TW202043476A (zh) 2020-12-01
NZ730802A (en) 2021-12-24
HUE040440T2 (hu) 2019-03-28
US20180344841A1 (en) 2018-12-06
LT3215187T (lt) 2018-12-27
PL3215187T3 (pl) 2019-04-30
CA2965562A1 (en) 2016-05-12
CN107075521B (zh) 2021-06-08
AU2018282463B2 (en) 2020-09-10
AU2015341926B2 (en) 2018-09-27
JP6325751B2 (ja) 2018-05-16
WO2016071306A1 (en) 2016-05-12
EA035461B1 (ru) 2020-06-19
IL251895B (en) 2019-08-29
EP3215187B1 (en) 2018-08-29
RS58080B1 (sr) 2019-02-28
CO2017004838A2 (es) 2017-07-28
KR20170083562A (ko) 2017-07-18
TWI694147B (zh) 2020-05-21
ZA201703055B (en) 2019-11-27
SI3215187T1 (sl) 2019-02-28
US20170281747A1 (en) 2017-10-05
CY1121377T1 (el) 2020-05-29
SG11201702997YA (en) 2017-05-30
EP3215187A1 (en) 2017-09-13
MX2017005788A (es) 2017-08-02
JP2018148890A (ja) 2018-09-27
US20160122396A1 (en) 2016-05-05
AR102527A1 (es) 2017-03-08
MD3215187T2 (ro) 2019-02-28
US11040096B2 (en) 2021-06-22
US9701721B2 (en) 2017-07-11
MY181175A (en) 2020-12-21
US10071151B2 (en) 2018-09-11
MA46378A (fr) 2019-08-07
AU2018282463A1 (en) 2019-01-24
IL251895A0 (en) 2017-06-29
JP6606571B2 (ja) 2019-11-13
JP2017534286A (ja) 2017-11-24
MA40902B1 (fr) 2018-12-31
US10555996B2 (en) 2020-02-11
TWI731654B (zh) 2021-06-21
SA517381457B1 (ar) 2021-03-11
ES2697903T3 (es) 2019-01-29
DK3215187T3 (en) 2018-12-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2018282463B2 (en) Therapeutic HPV16 vaccines
AU2019203124B2 (en) Therapeutic HPV18 vaccines
CN109922829A (zh) 治疗性hpv疫苗组合

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant