EA035461B1 - Терапевтические вакцины против hpv16 - Google Patents
Терапевтические вакцины против hpv16 Download PDFInfo
- Publication number
- EA035461B1 EA035461B1 EA201790976A EA201790976A EA035461B1 EA 035461 B1 EA035461 B1 EA 035461B1 EA 201790976 A EA201790976 A EA 201790976A EA 201790976 A EA201790976 A EA 201790976A EA 035461 B1 EA035461 B1 EA 035461B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- vector
- nucleic acid
- polypeptide
- hpv16
- seq
- Prior art date
Links
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims description 157
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 title description 17
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 169
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 162
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 156
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 99
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 92
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 92
- 241000341655 Human papillomavirus type 16 Species 0.000 claims abstract description 85
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 claims abstract description 78
- 101710125507 Integrase/recombinase Proteins 0.000 claims abstract description 45
- 101000622322 Human papillomavirus type 16 Regulatory protein E2 Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 349
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 claims description 112
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 82
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 70
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 55
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 53
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 42
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 38
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 claims description 19
- 208000018777 Vulvar intraepithelial neoplasia Diseases 0.000 claims description 19
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 19
- 206010008263 Cervical dysplasia Diseases 0.000 claims description 17
- 206010046905 Vaginal dysplasia Diseases 0.000 claims description 17
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 17
- 208000007951 cervical intraepithelial neoplasia Diseases 0.000 claims description 16
- 206010051999 Anogenital dysplasia Diseases 0.000 claims description 14
- 208000009608 Papillomavirus Infections Diseases 0.000 claims description 14
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 14
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 14
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 claims description 12
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 10
- 108010034634 Repressor Proteins Proteins 0.000 claims description 10
- 102000009661 Repressor Proteins Human genes 0.000 claims description 10
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 10
- 206010057444 Oropharyngeal neoplasm Diseases 0.000 claims description 8
- 208000002471 Penile Neoplasms Diseases 0.000 claims description 8
- 208000013139 vaginal neoplasm Diseases 0.000 claims description 8
- 201000006612 cervical squamous cell carcinoma Diseases 0.000 claims description 7
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 6
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 5
- 210000002255 anal canal Anatomy 0.000 claims description 2
- 208000034254 Squamous cell carcinoma of the cervix uteri Diseases 0.000 claims 1
- 208000019065 cervical carcinoma Diseases 0.000 claims 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 77
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 51
- 239000012634 fragment Substances 0.000 abstract description 15
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 abstract description 13
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 abstract description 8
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 abstract description 6
- 229940021747 therapeutic vaccine Drugs 0.000 abstract description 5
- 108091008819 oncoproteins Proteins 0.000 abstract description 2
- 102000027450 oncoproteins Human genes 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 113
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 62
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 49
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 40
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 40
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 36
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 31
- 102100028972 HLA class I histocompatibility antigen, A alpha chain Human genes 0.000 description 24
- 102100028971 HLA class I histocompatibility antigen, C alpha chain Human genes 0.000 description 24
- 108010075704 HLA-A Antigens Proteins 0.000 description 24
- 108010052199 HLA-C Antigens Proteins 0.000 description 24
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 24
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 24
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 24
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 23
- 102100028976 HLA class I histocompatibility antigen, B alpha chain Human genes 0.000 description 22
- 108010058607 HLA-B Antigens Proteins 0.000 description 22
- 101100540311 Human papillomavirus type 16 E6 gene Proteins 0.000 description 22
- 230000004044 response Effects 0.000 description 22
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 22
- 101000767631 Human papillomavirus type 16 Protein E7 Proteins 0.000 description 21
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 21
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 20
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 20
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 19
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 19
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 19
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 19
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 15
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 15
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 15
- 102100025064 Cellular tumor antigen p53 Human genes 0.000 description 13
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 13
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 13
- 102100038042 Retinoblastoma-associated protein Human genes 0.000 description 12
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 12
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 12
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 12
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 12
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 11
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 11
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 11
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 11
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 11
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 11
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 11
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 10
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 10
- 238000003114 enzyme-linked immunosorbent spot assay Methods 0.000 description 10
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 10
- 238000011748 CB6F1 mouse Methods 0.000 description 9
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 9
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 8
- 206010061424 Anal cancer Diseases 0.000 description 8
- 208000007860 Anus Neoplasms Diseases 0.000 description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 8
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 8
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 8
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 8
- 201000011165 anus cancer Diseases 0.000 description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 8
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 8
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 8
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 8
- 206010031096 Oropharyngeal cancer Diseases 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 7
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 7
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 7
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 7
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 7
- 201000006958 oropharynx cancer Diseases 0.000 description 7
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 7
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 7
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 7
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 7
- 101150061166 tetR gene Proteins 0.000 description 7
- 206010046885 vaginal cancer Diseases 0.000 description 7
- 238000011510 Elispot assay Methods 0.000 description 6
- 208000022361 Human papillomavirus infectious disease Diseases 0.000 description 6
- 208000032271 Malignant tumor of penis Diseases 0.000 description 6
- 206010034299 Penile cancer Diseases 0.000 description 6
- 206010041848 Squamous cell carcinoma of the cervix Diseases 0.000 description 6
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 6
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 6
- 229960002566 papillomavirus vaccine Drugs 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 6
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 6
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 6
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 5
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 5
- 102000003945 NF-kappa B Human genes 0.000 description 5
- 108010057466 NF-kappa B Proteins 0.000 description 5
- 208000037581 Persistent Infection Diseases 0.000 description 5
- 208000004354 Vulvar Neoplasms Diseases 0.000 description 5
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 5
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 5
- 208000020082 intraepithelial neoplasia Diseases 0.000 description 5
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 5
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 5
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 5
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 101150024821 tetO gene Proteins 0.000 description 5
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 5
- 206010059313 Anogenital warts Diseases 0.000 description 4
- 208000000907 Condylomata Acuminata Diseases 0.000 description 4
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 4
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 4
- 206010047741 Vulval cancer Diseases 0.000 description 4
- 208000025009 anogenital human papillomavirus infection Diseases 0.000 description 4
- 201000004201 anogenital venereal wart Diseases 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 4
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 4
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 4
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 4
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 4
- 230000009826 neoplastic cell growth Effects 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 4
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 4
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 4
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 4
- 201000005102 vulva cancer Diseases 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101100102460 Human papillomavirus type 16 E2 gene Proteins 0.000 description 3
- -1 IP10 Proteins 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 3
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 3
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 3
- 210000003679 cervix uteri Anatomy 0.000 description 3
- 230000005757 colony formation Effects 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 229960002751 imiquimod Drugs 0.000 description 3
- DOUYETYNHWVLEO-UHFFFAOYSA-N imiquimod Chemical compound C1=CC=CC2=C3N(CC(C)C)C=NC3=C(N)N=C21 DOUYETYNHWVLEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 229940035032 monophosphoryl lipid a Drugs 0.000 description 3
- 210000003899 penis Anatomy 0.000 description 3
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 3
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 2
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 241000205701 Human adenovirus 26 Species 0.000 description 2
- 241000598171 Human adenovirus sp. Species 0.000 description 2
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 2
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 2
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 2
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 2
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 2
- NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N Methyl isobutyl ketone Chemical compound CC(C)CC(C)=O NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000010292 Peptide Elongation Factor 1 Human genes 0.000 description 2
- 108010077524 Peptide Elongation Factor 1 Proteins 0.000 description 2
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 2
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 2
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 2
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 238000010364 biochemical engineering Methods 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 208000015698 cervical squamous intraepithelial neoplasia Diseases 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 2
- 210000005175 epidermal keratinocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 2
- 210000003953 foreskin Anatomy 0.000 description 2
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000008696 hypoxemic pulmonary vasoconstriction Effects 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 231100001222 nononcogenic Toxicity 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 description 2
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 2
- 229940068968 polysorbate 80 Drugs 0.000 description 2
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 2
- 229940021993 prophylactic vaccine Drugs 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 230000000754 repressing effect Effects 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 2
- ODLHGICHYURWBS-LKONHMLTSA-N trappsol cyclo Chemical compound CC(O)COC[C@H]([C@H]([C@@H]([C@H]1O)O)O[C@H]2O[C@@H]([C@@H](O[C@H]3O[C@H](COCC(C)O)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](COCC(C)O)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](COCC(C)O)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](COCC(C)O)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O3)[C@H](O)[C@H]2O)COCC(O)C)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]3O[C@@H]1COCC(C)O ODLHGICHYURWBS-LKONHMLTSA-N 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OJHZNMVJJKMFGX-RNWHKREASA-N (4r,4ar,7ar,12bs)-9-methoxy-3-methyl-1,2,4,4a,5,6,7a,13-octahydro-4,12-methanobenzofuro[3,2-e]isoquinoline-7-one;2,3-dihydroxybutanedioic acid Chemical compound OC(=O)C(O)C(O)C(O)=O.O=C([C@@H]1O2)CC[C@H]3[C@]4([H])N(C)CC[C@]13C1=C2C(OC)=CC=C1C4 OJHZNMVJJKMFGX-RNWHKREASA-N 0.000 description 1
- YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N (6E,10E,14E,18E)-2,6,10,15,19,23-hexamethyltetracosa-2,6,10,14,18,22-hexaene Chemical compound CC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- FBFJOZZTIXSPPR-UHFFFAOYSA-N 1-(4-aminobutyl)-2-(ethoxymethyl)imidazo[4,5-c]quinolin-4-amine Chemical compound C1=CC=CC2=C(N(C(COCC)=N3)CCCCN)C3=C(N)N=C21 FBFJOZZTIXSPPR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000008482 12E7 Antigen Human genes 0.000 description 1
- 108010020567 12E7 Antigen Proteins 0.000 description 1
- VUFNLQXQSDUXKB-DOFZRALJSA-N 2-[4-[4-[bis(2-chloroethyl)amino]phenyl]butanoyloxy]ethyl (5z,8z,11z,14z)-icosa-5,8,11,14-tetraenoate Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(=O)OCCOC(=O)CCCC1=CC=C(N(CCCl)CCCl)C=C1 VUFNLQXQSDUXKB-DOFZRALJSA-N 0.000 description 1
- FVFVNNKYKYZTJU-UHFFFAOYSA-N 6-chloro-1,3,5-triazine-2,4-diamine Chemical compound NC1=NC(N)=NC(Cl)=N1 FVFVNNKYKYZTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 241000701242 Adenoviridae Species 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 241000710929 Alphavirus Species 0.000 description 1
- 101100519158 Arabidopsis thaliana PCR2 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 102000008096 B7-H1 Antigen Human genes 0.000 description 1
- 108010074708 B7-H1 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 231100000699 Bacterial toxin Toxicity 0.000 description 1
- 241000701822 Bovine papillomavirus Species 0.000 description 1
- 102100037084 C4b-binding protein alpha chain Human genes 0.000 description 1
- 101710159767 C4b-binding protein alpha chain Proteins 0.000 description 1
- 229940116741 CD137 agonist Drugs 0.000 description 1
- 229940123189 CD40 agonist Drugs 0.000 description 1
- 102000008203 CTLA-4 Antigen Human genes 0.000 description 1
- 108010021064 CTLA-4 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 229940045513 CTLA4 antagonist Drugs 0.000 description 1
- 102100029968 Calreticulin Human genes 0.000 description 1
- 108090000549 Calreticulin Proteins 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 102000009016 Cholera Toxin Human genes 0.000 description 1
- 108010049048 Cholera Toxin Proteins 0.000 description 1
- 241000724565 Chorella virus Species 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 241000557626 Corvus corax Species 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 238000011238 DNA vaccination Methods 0.000 description 1
- 206010058314 Dysplasia Diseases 0.000 description 1
- 101710146739 Enterotoxin Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 206010061978 Genital lesion Diseases 0.000 description 1
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Natural products NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 241000282575 Gorilla Species 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 102000008949 Histocompatibility Antigens Class I Human genes 0.000 description 1
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 241000701124 Human adenovirus 35 Species 0.000 description 1
- 101100209954 Human papillomavirus type 16 L1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100049401 Human papillomavirus type 16 L2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000954493 Human papillomavirus type 16 Protein E6 Proteins 0.000 description 1
- 241000257303 Hymenoptera Species 0.000 description 1
- 108700002232 Immediate-Early Genes Proteins 0.000 description 1
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 1
- 102100026878 Interleukin-2 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 102000017578 LAG3 Human genes 0.000 description 1
- 108010054278 Lac Repressors Proteins 0.000 description 1
- 101150030213 Lag3 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000186781 Listeria Species 0.000 description 1
- 241000186779 Listeria monocytogenes Species 0.000 description 1
- 206010024641 Listeriosis Diseases 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000712079 Measles morbillivirus Species 0.000 description 1
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 description 1
- 241000186366 Mycobacterium bovis Species 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 108700019961 Neoplasm Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000048850 Neoplasm Genes Human genes 0.000 description 1
- 108020004485 Nonsense Codon Proteins 0.000 description 1
- 108700001237 Nucleic Acid-Based Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 108091007494 Nucleic acid- binding domains Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 241000282577 Pan troglodytes Species 0.000 description 1
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 description 1
- 206010034133 Pathogen resistance Diseases 0.000 description 1
- 102100037935 Polyubiquitin-C Human genes 0.000 description 1
- 102100029812 Protein S100-A12 Human genes 0.000 description 1
- 101710110949 Protein S100-A12 Proteins 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000710961 Semliki Forest virus Species 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229940124613 TLR 7/8 agonist Drugs 0.000 description 1
- BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N Tetramethylsqualene Natural products CC(=C)C(C)CCC(=C)C(C)CCC(C)=CCCC=C(C)CCC(C)C(=C)CCC(C)C(C)=C BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108050004197 Trp repressor Proteins 0.000 description 1
- 108010056354 Ubiquitin C Proteins 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000000260 Warts Diseases 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- YRKCREAYFQTBPV-UHFFFAOYSA-N acetylacetone Chemical compound CC(=O)CC(C)=O YRKCREAYFQTBPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 108700010877 adenoviridae proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N alumane Chemical class [AlH3] AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- NTGGOTYRTOXKMQ-UHFFFAOYSA-K aluminum;potassium;phosphate Chemical compound [Al+3].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O NTGGOTYRTOXKMQ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 210000001776 amniocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 210000000436 anus Anatomy 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004436 artificial bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000001106 artificial yeast chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000688 bacterial toxin Substances 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000004067 bulking agent Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000315 carcinogenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 230000010307 cell transformation Effects 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000002380 cytological effect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 210000000852 deltoid muscle Anatomy 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N dodecahydrosqualene Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000009513 drug distribution Methods 0.000 description 1
- 210000003162 effector t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000147 enterotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000655 enterotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 230000001667 episodic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000012395 formulation development Methods 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 238000011239 genetic vaccination Methods 0.000 description 1
- 210000004392 genitalia Anatomy 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000009931 harmful effect Effects 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 201000010536 head and neck cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000002998 immunogenetic effect Effects 0.000 description 1
- 229960001438 immunostimulant agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003022 immunostimulating agent Substances 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000013383 initial experiment Methods 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 229960005386 ipilimumab Drugs 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 1
- 239000006194 liquid suspension Substances 0.000 description 1
- 238000011551 log transformation method Methods 0.000 description 1
- 238000001325 log-rank test Methods 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000006384 oligomerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 210000003300 oropharynx Anatomy 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 108010083127 phage repressor proteins Proteins 0.000 description 1
- 229940124531 pharmaceutical excipient Drugs 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 229940023143 protein vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000003314 quadriceps muscle Anatomy 0.000 description 1
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 208000037922 refractory disease Diseases 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 229940031439 squalene Drugs 0.000 description 1
- TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N squalene Natural products CC(=CCCC(=CCCC(=CCCC=C(/C)CCC=C(/C)CC=C(C)C)C)C)C TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003153 stable transfection Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 102000055501 telomere Human genes 0.000 description 1
- 108091035539 telomere Proteins 0.000 description 1
- 210000003411 telomere Anatomy 0.000 description 1
- 108010044241 tetanus toxin fragment C Proteins 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 238000004454 trace mineral analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 1
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 1
- 241000990167 unclassified Simian adenoviruses Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 229940124856 vaccine component Drugs 0.000 description 1
- 210000001215 vagina Anatomy 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 230000017613 viral reproduction Effects 0.000 description 1
- 229960004854 viral vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000003905 vulva Anatomy 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
- A61P11/04—Drugs for disorders of the respiratory system for throat disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
- A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
- C07K14/01—DNA viruses
- C07K14/025—Papovaviridae, e.g. papillomavirus, polyomavirus, SV40, BK virus, JC virus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/58—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation
- A61K2039/585—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation wherein the target is cancer
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/10043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/20011—Papillomaviridae
- C12N2710/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/20011—Papillomaviridae
- C12N2710/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/20011—Papillomaviridae
- C12N2710/20071—Demonstrated in vivo effect
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/10—Plasmid DNA
- C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
- C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Otolaryngology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Pregnancy & Childbirth (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Oncology (AREA)
Abstract
Настоящее изобретение относится к оригинальным конструкциям на основе нуклеиновых кислот и полипептидам, которые можно использовать в терапевтических вакцинах против HPV16. Такие полипептиды содержат практически все возможные Т-клеточные эпитопы онкобелков E6 и E7 HPV 16, но при этом они имеют сильно уменьшенную (по сравнению с E6 и E7 wt) , вплоть до необнаруживаемой, трансформирующую активность, посредством включения фрагментов белков E6 и E7, которые были переупорядочены, и в то же время содержат минимальное количество нежелательных неоэпитопов. Настоящее изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, содержащий последовательность, изложенную под SEQ ID NO:1. В некоторых вариантах осуществления кодируемый полипептид дополнительно содержит по меньшей мере один эпитоп белка E2 вируса папилломы человека (HPV), например белок E2 HPV 16.
Description
Настоящее изобретение относится к области медицины и более конкретно к конструкциям на основе нуклеиновых кислот и полипептидам, которые можно применять в терапевтических вакцинах против вируса папилломы человека 16 типа.
Предпосылки изобретения
Семейство вирусов папилломы человека (HPV) состоит из более чем 100 типов (также называемых подтипами), которые способны инфицировать кератиноциты кожи или слизистых оболочек. Более 40 типов HPV обычно передаются половым путем, и инфекции HPV аногенитальной области являются широко распространенными как у мужчин, так и у женщин. Некоторые типы HPV, передающиеся половым путем, могут вызывать появление остроконечных бородавок. Хронические инфекции, вызываемые типами HPV высокого риска (например, 16, 18, 31, 45 типами), отличными от тех, которые вызывают кожные бородавки, могут прогрессировать до предраковых поражений и инвазивного рака, например, шейки матки, вульвы, влагалища, пениса, ротоглотки и ануса. Большинство инфекций, вызываемых HPV, самопроизвольно проходят в течение одного-двух лет после инфицирования. У здоровых индивидуумов циркулирующие CD4+ Т-клетки типов Th1 и Th2, специфичные в отношении вирусных ранних белков Е2, Е6 и Е7 HPV-16, а также Е6-специфичные CD8+ Т-клетки мигрируют в кожу при контрольном заражении антигеном, что указывает на то, что успешная защита против инфекции, вызываемой HPV-16, обычно связана с системным эффекторным Т-клеточным ответом на эти вирусные ранние антигены. У меньшинства (~1%) инфицированных индивидуумов инфекция HPV сохраняется, что в конечном итоге приводит к опухолевым поражениям половых органов. Среди HPV высокого риска HPV16 и HPV18 являются основной причиной рака шейки матки, вместе вызывая приблизительно 70% случаев, а также эти два типа играют важную роль в других HPV-индуцированных опухолях, таких как анальный рак и рак ротоглотки. Во всем мире HPV является одним из наиболее серьезных инфекционных агентов, вызывающих рак.
Вакцинация против HPV считается оправданной стратегией снижения заболеваемости инфекцией, вызываемой HPV, или ее последствий (Van der Burg и Melief, 2011, Curr Opinion Immunol 23: 252-257).
Профилактические вакцины против HPV на основе вирусоподобных частиц (VLP), образованных (оболочечным) белком L1 HPV 16 и 18 типов, очень эффективны для предупреждения хронической инфекции и связанного с ней заболевания, вызываемых HPV16 и HPV18. Считается, что эти вакцины обеспечивают стерильный иммунитет посредством индукции нейтрализующих антител против белков L1. Добавление VLP на основе L1 из дополнительных типов HPV высокого риска может дополнительно увеличить широту защиты, предоставляемой такими вакцинами.
Однако в то время как такие вакцины могут предупреждать начальную инфекцию (т.е. они обеспечивают профилактику), отсутствуют данные о положительном эффекте в отношении установленных половых поражений, вызванных HPV16 и HPV18, поэтому они не считаются терапевтическими вакцинами против HPV (Hildesheim et al., 2007, JAMA 298: 743-53).
Несмотря на внедрение таких профилактических вакцин, большое количество людей уже заражены или все еще подвержены риску заражения хроническими инфекциями HPV высокого риска и, следовательно, рискуют получить рак. Терапевтические вакцины для ликвидации установившихся инфекций HPV и связанных с ними заболеваний являются насущной неудовлетворенной потребностью медицины.
Были описаны некоторые попытки решить эту проблему. Например, клинические испытания проводили в отношении различных стратегий вакцинации, таких как белок слияния, состоящий из белка теплового шока (Hsp) из Mycobacterium bovis и Е7 HPV-16 или состоящий из белка слияния Е6, Е7 и L2 из HPV-16 и HPV-18, химерные VLP L1-E7, рекомбинантные вирусы осповакцины, экспрессирующие либо Е6 и Е7 вирусов HPV-16 и HPV-18, либо Е2 вируса папилломы крупного рогатого скота, ДНК-вакцины, экспрессирующие CTL-эпитопы Е6 и Е7 HPV-16 и HPV-18, живые аттенуированные возбудители листериоза, листерия моноцитогенная (Lm) , которые секретируют антиген Е7 HPV-16, и синтетические длинные пептиды (SLP), содержащие пептиды Е6 и Е7 HPV-16. Хотя некоторые из этих подходов показывают некоторую, но ограниченную клиническую эффективность, большинство из них потерпело неудачу, что свидетельствует о необходимости совершенствования существующих в настоящее время стратегий.
Интеграция ранних белков HPV Е6 и Е7 является необходимой стадией в процессе от инфицирования до рака, и для поддержания опухолевого фенотипа раковых клеток шейки матки необходима непрерывная экспрессия Е6 и Е7. Поэтому Е6 и Е7 считаются хорошими мишенями для терапевтической вакцинации. Как уже упоминалось, некоторые исследования показали, что терапевтическая вакцинация женщин, инфицированных HPV высокого риска, может вызывать регрессию существующих поражений. Kenter et al показали стойкую и полную регрессию у 47% пациентов с интраэпителиальной неоплазией вульвы (VIN) с помощью SLP, полученных из белков Е6 и Е7 HPV16, и адъюванта в качестве терапевтической вакцины (Kenter et al., 2009, N Engl J Med 361: 1838-47). Аналогичным образом исследование, в котором белковую вакцину (TA-CIN, состоящую из белка слияния Е6, Е7 и L2 HPV16) объединяли с местной иммуномодуляцией у 2/3 пациентов с VIN, показало полную регрессию у 63% пациентов (Daayana et al., 2010, Br J Cancer 102: 1129-36). Возможные недостатки синтетических длинных пептидов в качестве вакцины включают технологичность производства в широком масштабе и связанные с этим затраты, потребность в потенциально высокоактивном адъюванте и связанные с этим неблагоприятные эффекты, связанные с иммунизацией (особенно боль и припухлость). В связи с высоким уровнем дискомфорта ма- 1 035461 ловероятно, что SLP будут использоваться на ранней стадии заболевания, когда самопроизвольный иммунный клиренс все еще высок. Аналогичным образом в связи с необходимостью местного лечения имиквимодом в случае лечения TA-CIN переносимость является важным вопросом, так как большинство женщин испытывают местные и системные побочные эффекты, продолжающиеся на протяжении лечения имиквимодом, что может повлиять на повседневную деятельность.
Возможной альтернативой является применение прививок на основе нуклеиновых кислот, таких как ДНК-вакцины или вирусные вакцины, кодирующие белок Е6 и/или Е7 HPV, для вакцинации.
Однако белки Е6 и Е7 HPV обладают онкогенным потенциалом, и, таким образом, вакцинация посредством вакцин, которые содержат нуклеиновые кислоты, кодирующие эти белки, создает риск индуцирования клеточной трансформации вследствие возможности длительной экспрессии антигенов.
Поэтому в случае генетической вакцинации можно применять неонкогенные/детоксифицированные варианты Е6 и/или Е7, чтобы исключить любой риск клеточной трансформации в результате вакцинации. Е6 и Е7 дикого типа без онкогенного потенциала обычно получают при помощи делеции и/или замены остатков, которые, как известно, важны для функционирования этих белков (например, Smahel et al., 2001, Virology 281:231-38; Yan et al., 2009, Vaccine 27: 431-40; Wieking et al., 2012, Cancer Gene Ther 19: 667-74; WO 2009/106362). Однако недостатком этих подходов является то, что они несут риск удаления важных Т-клеточных эпитопов из белков и/или введения новых нежелательных Т-клеточных эпитопов в них и, таким образом, могут не приводить к необходимому иммунному ответу.
В альтернативной стратегии для устранения онкогенного потенциала Е6 и Е7 HPV16 были сконструированы перетасованные варианты (т.е. полипептиды, в которых фрагменты белка дикого типа переупорядочены) белков Е6 и Е7 (например, Ohlschlager et al., 2006, Vaccine 24: 2880-93; Oosterhuis et al., 2011, Int J Cancer 129: 397-406; Oosterhuis et al., 2012, Hum Gen Ther 23: 1301-12). Однако эти подходы по-прежнему требуют получения, составления и введения многочисленных молекул для обеспечения включения всех возможных эпитопов обоих белков Е6 и Е7, что приводит к субоптимальной логистике и относительно высоким затратам, и, кроме того, с помощью описанных стратегий вводят потенциально сильные неприродные эпитопы, которые не присутствуют в Е6 и Е7, и поскольку иммунные ответы могут быть перенаправлены от соответствующих эпитопов Е6/Е7 к таким неприродным эпитопам, описанные конструкции могут не иметь оптимальных иммунологических характеристик.
Таким образом, в данной области остается потребность в терапевтических вакцинах против HPV, предпочтительно имеющих меньше недостатков описанных ранее подходов.
Краткое описание изобретения
В настоящем изобретении предусматривают молекулы нуклеиновой кислоты, которые кодируют полипептиды, содержащие практически все возможные Т-клеточные эпитопы онкобелков Е6 и Е7 HPV16, но при этом они имеют сильно уменьшенную (по сравнению с Е6 и Е7 wt), вплоть до необнаруживаемой, трансформирующую активность, посредством включения фрагментов белков Е6 и Е7, которые были переупорядочены, и в то же время содержат минимальное количество нежелательных неоэпитопов. Эти молекулы отличаются от молекул, ранее представленных другими исследователями.
В настоящем изобретении предусматривают молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид, который содержит последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 1.
Кодируемый полипептид может дополнительно содержать лидерную последовательность.
В определенных вариантах осуществления кодируемый полипептид дополнительно содержит по меньшей мере один эпитоп белка Е2 вируса папилломы человека (HPV), например белок Е2 HPV16. Белок Е2 может быть подвергнутым мутации для уменьшения связывания ДНК, например посредством делеции или мутации (мутаций) в своем ДНК-связывающем домене. В определенных вариантах осуществления кодируемый полипептид содержит последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 5.
В определенных вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты является кодон-оптимизированной, например для экспрессии в клетках человека.
В определенных вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты содержит последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 6.
В настоящем изобретении также предусматривают вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты в соответствии с настоящим изобретением, где последовательность, кодирующая полипептид, функционально связана с промотором.
В определенных вариантах осуществления вектор представляет собой ДНК-вектор, такой как плазмида. В других вариантах осуществления вектор представляет собой вирусный вектор, такой как вектор на основе MVA или рекомбинантный аденовирусный вектор. В определенных предпочтительных вариантах осуществления вектор представляет собой рекомбинантный аденовирус.
В определенных вариантах осуществления промотор в векторе функционально соединен с репрессорной операторной последовательностью, с которой репрессорный белок может связываться для репрессии экспрессии промотора в присутствии указанного репрессорного белка. В определенных вариантах осуществления репрессорная операторная последовательность представляет собой последовательность TetO или последовательность CuO.
- 2 035461
В настоящем изобретении также предусматривают композицию вакцины, содержащую вектор в соответствии с настоящим изобретением и фармацевтически приемлемый наполнитель.
В настоящем изобретении также предусматривают способ индуцирования иммунного ответа в отношении HPV, в частности HPV16, у субъекта, при этом способ включает введение субъекту композиции вакцины в соответствии с настоящим изобретением. В настоящем изобретении также предусматривают вакцину в соответствии с настоящим изобретением для применения в индуцировании иммунного ответа в отношении HPV, в частности HPV16.
В определенных вариантах осуществления вакцину вводят субъекту более одного раза.
В настоящем изобретении также предусматривают способ лечения любого из хронической инфекции, вызванной HPV (в частности хронической инфекции, вызванной HPV16), интраэпителиальной неоплазии вульвы (VIN), интраэпителиальной цервикальной неоплазии (CIN), интраэпителиальной неоплазии влагалища (VaIN), анальной интраэпителиальной неоплазии (AIN), рака шейки матки, такого как плоскоклеточная карцинома шейки матки (SCC), рака ротоглотки, рака полового члена, рака влагалища или рака анального канала у субъекта, при этом способ включает введение субъекту вакцины в соответствии с настоящим изобретением. В настоящем изобретении также предусматривают вакцину в соответствии с настоящим изобретением для применения в лечении любого из хронической инфекции, вызванной HPV (в частности хронической инфекции, вызванной HPV16), интраэпителиальной неоплазии вульвы (VIN), интраэпителиальной цервикальной неоплазии (CIN), интраэпителиальной неоплазии влагалища (VaIN), анальной интраэпителиальной неоплазии (AIN), рака шейки матки, такого как плоскоклеточная карцинома шейки матки (SCC), рака ротоглотки, рака полового члена, рака влагалища или рака анального канала у субъекта.
В настоящем изобретении также предусматривают полипептид, содержащий последовательность, изложенную под SEQ ID NO: I, SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 5.
Краткое описание графических материалов
Фиг. 1. Экспрессия белков слияния Е6 и Е7 HPV16. Клетки HEK-293T временно трансфицировали ДНК-векторами, экспрессирующими трансгены, указанные на фигуре выше. Через 24 ч после трансфекции клетки собирали и клеточные экстракты анализировали при помощи SDS-PAGE и вестерн-блоттинга с антителом против Е7 HPV16 (верхняя секция). Загрузочный контроль, показывающий NF-kB (нижняя секция), подтверждает аналогичную загрузку клеточных лизатов на всех дорожках. Слева показан маркер молекулярного веса. Предполагаемые размеры белков слияния: E6E7SH прим. 38 кДа; E2E6E7SH и E6E7E2SH прим. 75 кДа, LSE2E6E7SH прим. 78 кДа.
Фиг. 2. Образование колоний в мягком агаре. (А) Схематическое изображение постановки анализа в мягком агаре. (В) Иллюстративные изображения с микроскопа при 40-кратном увеличении клеток в агаре через шесть недель после посева. Белые стрелки указывают на колонии, наблюдаемые у трансфицированных E7wt клеток. (С) Определение количества колоний через шесть недель после посева в агар с использованием Gelcount™ и сопутствующего программного обеспечения. *: р<0,05 (модель регрессии Пуассона); **: не наименьшая эффективность (обобщенная линейная модель с пределом не меньшей эффективности, составляющим 5%).
Фиг. 3. E6E7SH с утраченными активностями Е6 и Е7. (А) Иллюстративный вестерн-блоттинг, на котором видно отсутствие разрушения р53 при помощи E6E7SH. Клетки человека NCI-H1299 с нефункциональным р53 совместно трансфицировали плазмидой, экспрессирующей р53, в комбинации с плазмидой, экспрессирующей Е6 HPV16 дикого типа, E6E7SH, или пустым вектором. Отсутствие TF указывает на нетрансфицированные клетки. Через 24 ч после трансфекции готовили клеточные лизаты и 30 мкг общего белка загружали в гель. Верхняя секция - окрашивание р53, средняя секция - окрашивание Е6, нижняя секция - окрашивание NF-kB (загрузочный контроль). (В) Количественная оценка уровней р53 в четырех независимых анализах. Сигнал р53 нормализовали по отношению к сигналу NF-кВ. (С) Вестерн-блоттинг, на котором видно отсутствие разрушения pRb при помощи E6E7SH. Клетки Saos-2 с нефункциональным pRb трансфицировали плазмидой, экспрессирующей pRb, в комбинации с плазмидой, экспрессирующей Е7 HPV16 дикого типа, E6E7SH, или пустым вектором. Отсутствие TF указывает на нетрансфицированные клетки. Через 24 ч после трансфекции готовили клеточные лизаты и 10 мкг общего белка загружали в гель. Верхняя секция - окрашивание pRb, средняя секция - окрашивание Е7, нижняя секция - окрашивание NF-кВ (загрузочный контроль). (D) Количественная оценка уровней pRb в четырех независимых анализах. Сигнал pRb нормализовали по отношению к сигналу NF-кВ. *: р<0,05 (модели дисперсионного анализа ANOVA); **: не наименьшая эффективность (тестирование основано на доверительном интервале, составляющем 95%, полученном из моделей дисперсионного анализа ANOVA. Предел не меньшей эффективности составлял 75%).
Фиг. 4. E6E7SH не иммортализует первичные эпидермальные кератиноциты человека. Первичные эпидермальные кератиноциты человека трансдуцировали лентивирусами, кодирующими любое из открытой рамки считывания Е6 и Е7 дикого типа из HPV16 (E6E7wt), последовательности E6E7SH или eGFP. Нетрансдуцированные донорные клетки использовали в качестве контроля. Только экспрессия E6E7wt индуцирует иммортализацию первичных кератиноцитов, что подтверждается увеличенной про- 3 035461 должительностью жизни и активацией hTERT примерно на 200 день (не показано) . Обозначение в виде крестика указывает, что клетки погибали при старении, и их нельзя было в дальнейшем культивировать.
Подробности см. в примере 2. Аналогичные результаты были получены у двух дополнительных доноров (не показаны).
Фиг. 5. Иммунный ответ, индуцированный E6E7SH после ДНК-иммунизации - анализ IFNy ELISPOT. (А) Схема иммунизации. Мышей линии CB6F1 иммунизировали ДНК-плазмидами, экспрессирующими E6E7SH, или плазмидами, не экспрессирующими трансген (контроль). Через две недели после иммунизации мышей умерщвляли и выделенные спленоциты стимулировали в течение ночи пептидными пулами из олигонуклеотидов из 15 нуклеотидов, аналогичными Е7. (В) Е7-специфические иммунные ответы у отдельных мышей, измеренные с помощью анализов IFNy ELISPOT, предоставлены как пятнообразующие единицы (SFU) на 106 спленоцитов.
Фиг. 6. Иммуногенность E6E7SH - анализ IFNy ELISPOT. (A) Схема иммунизации. Мышей иммунизировали аденовекторами со вставками, которые указаны. Е7-специфические ответы анализировали при помощи IFNy ELISPOT в момент времени две недели (В) и в момент времени восемь недель (С) (представлены как пятнообразующие единицы (SFU) на 106 спленоцитов). Темные кружочки представляют мышей, иммунизированных дозой, составляющей 1х 1010 vp, а светлые кружочки представляют мышей, иммунизированных с помощью 5х109 vp. Черная полоса представляет собой среднее геометрическое ответов. Пунктирная линия указывает нижний предел обнаружения в анализе ELISPOT. Апостериорный статистический анализ ANOVA с поправками Бонферрони выполняли с данными с логарифмическим преобразованием. *: р<0,05. Подробности см. в примере 3.
Фиг. 7. Иммуногенность E2E6E7SH - Е7-тетрамерном окрашивании. (А) Схема иммунизации. Мышей линии CB6F1 иммунизировали с помощью 1х1010 vp аденовекторов, экспрессирующих трансгены, которые указаны. Через две недели после иммунизации мышей умерщвляли и выделенные спленоциты анализировали на присутствие клеток CD8+, способных взаимодействовать с тетрамерами E749-57 -H2-Db (В) Процент положительных по Е7-тетрамеру CD8+ Т-клеток указан на оси у. Апостериорный статистический анализ ANOVA с поправками Бонферрони выполняли на данных с логарифмическим преобразованием, различия между различными вариантами E6E7SH не были статистически значимыми.
Фиг. 8. Иммуногенность E2E6E7SH - анализ IFNy ELISPOT. (А) Схема иммунизации. Мышей линии CB6F1 иммунизировали аденовекторами, экспрессирующими трансгены, указанные внизу секций В и С. Через две недели после иммунизации мышей умерщвляли и выделенные спленоциты стимулировали в течение ночи пептидными пулами из олигонуклеотидов из 15 нуклеотидов, аналогичными Е2 (В), Е6 (не показано) или Е7 (С). Ответы представлены как SFU на 106 спленоцитов. Апостериорный статистический анализ ANOVA с поправками Бонферрони выполняли с данными с логарифмическим преобразованием. Ответ Е2, индуцированный аденовекторами, кодирующими только Е2, выше, чем ответ, индуцированный полипептидами по настоящему изобретению, которые включают фрагменты Е6 и Е7. Различия были значимыми для Е2 по сравнению с E2E6E7SH и для Е2 по сравнению с E6E7E2SH (*: р<0,05). Апостериорный статистический анализ ANOVA с поправками Бонферрони выполняли с данными с логарифмическим преобразованием.
Фиг. 9. Устойчивые ответы у иммунизированных мышей. (А) Схема иммунизации. Мышей линии CB6F1 иммунизировали с помощью 1 х 1010 vp векторов Ad35, экспрессирующих варианты LSE2E6E7SH, E2E6E7SH, E6E7SH, или с помощью аденовекторов, не экспрессирующих трансген (пустых). Образцы крови брали каждые две недели для определения процента Е7-специфических CD8+ Т-клеток путем тетрамерного окрашивания. (В) Иммунные ответы через две недели после иммунизации. Вектор, включающий лидерную последовательность, индуцировал более высокий ответ, чем векторы без лидерной последовательности; LSE2E6E7SH по сравнению с E2E6E7SH (*: р<0,05). (С) Кинетика ответов. Апостериорный статистический анализ ANOVA с поправками Бонферрони выполняли с данными с логарифмическим преобразованием с использованием массива данных 2 недели. Ответ в отношении Е7, индуцируемый молекулами, включающими Е2, имеет тенденцию быть более высоким по сравнению с молекулой без Е2, хотя результаты не были статистически значимыми.
Фиг. 10. Применение различных аденовирусных векторов для усиления видов иммунного ответа. (А) Схема иммунизации. Мышей линии CB6F1 иммунизировали с помощью вектора Ad26, экспрессирующего E2E6E7SH HPV16 (HPV16-Tx), или с помощью вектора Ad26, не экспрессирующего трансген (пустого) . Через две недели иммунизацию повторяли с помощью векторов на основе Ad35, как указано ниже на фигуре. Через четыре недели после второй иммунизации мышей умерщвляли и образцы крови использовали для определения процента Е7-специфических CD8+ Т-клеток путем тетрамерного окрашивания (В) * обозначает сравнение Ad26.HPV16-Tx/Ad35.HPV16-Tx и Ad26.HPV16-Тх/пустой Ad35, p<0,05 (Т-критерий Стьюдента для данных с логарифмическим преобразованием, с α=0,01 для множественных сравнений).
Фиг. 11. Клеточная иммуногенность E2E6E7SH у макаков-резус. (А) Схема иммунизации. Макаковрезус иммунизировали на 0 день. Восемь животных получали Ad26.HPV16-E2E6E7SH и два контрольных животных получали пустой Ad26 посредством внутримышечного пути иммунизации (i.m.). Бустер- 4 035461 ную иммунизацию (Ad26.HPV16-E2E6E7SH или пустым Ad26) проводили через 8 недель. Через 16 недель животные получали вторую бустерную иммунизацию при помощи векторов Ad35, экспрессирующих тот же E2E6E7SH, в то время как контрольные животные получали пустой Ad35. Доза аденовекторов составляла IxIO11 vp при каждой иммунизации. Взятие крови выполняли на нескольких моментах времени. (В) Клеточные иммунные ответы в РВМС измеряли с помощью IFNy ELISPOT. РВМС стимулировали при помощи пептидных пулов, соответствующих Е2, Е6 или Е7 HPV16 и отображали количество пятнообразующих единиц (SFU) в 1x106 РВМС. У животных с пустым контролем (n=2) не было выявлено ответа. Подробности см. в примере 4.
Фиг. 12. Терапевтический эффект аденовекторов, экспрессирующих HPV16-E2E6E7SH. (А) Инъекция ТС-1 и схема иммунизации. Мышам линии CB6F1 подкожно вводили 1x105 ТС-1 клеток на 0 день. Через шесть дней, когда опухоли можно было пальпировать, мышей иммунизировали двумя SLP, предусматривающими иммунодоминантные эпитопы Е6 и Е7 HPV16 (т.е. Е6 HPV16, а.к. 41-65 (KQQLLRREVYDFAFRDLCIVYRDGN; SEQ IDNO:18) и Е7 HPV16 а.к. 43-77 (GQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIR; SEQ ID NO:19) ) в концентрации, составляющей 150 мкг, в конечном объеме, составляющем 200 мкл, 0,9% солевого раствора, дополненного 5 нмоль ODN1826-CpG (В) или Ad26.HPV16-E2E6E7SH (С). Контрольные мыши получали либо только CpG (D), либо пустой Ad26 (E). Всех мышей подвергали бустерной иммунизации на 20 день. Мышей, которые получали векторы Ad26 при первичной иммунизации, впоследствии иммунизированы соответствующими векторами Ad35. Другие мыши получали SLP с добавленным CpG в качестве адъюванта или исключительно CpG, как при первичных иммунизациях. (В-Е) Измерение опухоли у мышей, которым вводили ТС-1. Объем опухоли рассчитывали как (ширина2 х длина)/2. Мышей умерщвляли, когда объемы опухолей превышали 1000 мм3. Двух мышей должны были умертвить из-за потери веса более чем на 20% (обозначены звездочками). (F-G) Увеличенное изображение секций В и С в первые 35 дней. (Н) Выживаемость после инъекции ТС-1. Выживание мышей, обработанных Ad.HPV16-E2E6E7SH существенно повышалась по сравнению с мышами, иммунизированными SLP и CpG (логарифмический ранговый критерий р<0,05). Три мыши, иммунизированные Ad.HPV16-E2E6E7SH, не имели опухолей в конце эксперимента (на 92 день).
Фиг. 13. При использовании аденовирусных векторов, несущих трансгены, кодирующие либо Ag HPV, либо LSE2E6E7SH, видны повышенные выходы вирусов в клетках, способных репрессировать экспрессию трансгена. (А) Анализ выхода вируса для векторов Ad35. Клетки PER.C6, PER.C6/CymR и PER.C6/TetR инфицировали векторами Ad35, несущими трансгены, которые кодируют GFP-Luc или HPVAg. Эти трансгены находятся под управлением промоторов CMV, содержащих либо CuO, либо TetO. Выходы вируса определяли через четыре дня после инфицирования Ad35 с помощью способа на основе гексон-специфичной qPCR. (В) Анализ выхода вируса для векторов Ad26. Клетки PER.C6 и PER.C6/TetR инфицировали векторами Ad26, несущими трансгены, которые кодируют GFP-Luc, HPVAg или LSE2E6E7SH и все из которых находятся под управлением промоторов CMV, содержащих TetO. Выходы вируса определяли через три дня после инфицирования Ad26 с помощью способа на основе гексон-специфичной qPCR. Подробности см. в примере 6.
Фиг. 14. Применение репрессорной системы для репрессии экспрессии трансгена в ходе продукции вектора предотвращает нестабильность кассеты трансгена в аденовирусном векторе, несущем трансген, кодирующий HPVAg. Вектор Ad35, экспрессирующий HPVAg, под контролем CMVCuO спасали посредством трансфекции ДНК на клеточных линиях либо PER.C6, либо PER.C6/CymR. Полученные в результате вирусные бляшки собирали - по пять на клеточную линию - и использовали для последовательных циклов инфицирования соответствующих клеточных линий. А) Анализ целостности области векторной кассеты трансгена с помощью ПЦР после 10 пассажей вируса. Продукты ПЦР, полученные из вирусных изолятов, пассированных на PER.C6 и PER.C6/CymR, показаны соответственно на средней и правой секциях. Наблюдаемые полноразмерные продукты ПЦР, полученные для пассированных на PER.C6 вирусных изолятов 1, 2, 4 и 5, и таковые, обнаруженные для изолятов с 1 по 5, пассированных на PER.C6/CymR, анализировали посредством секвенирования ДНК по Сэнгеру. При помощи анализа следов хроматограммы (не показано) выявили, что все изоляты, выращенные на PER.C6, но не те, которые выращены на PER.C6/CymR, характеризовались либо небольшими делециями со сдвигом рамки считывания, либо мутациями с образованием преждевременного стоп-кодона в кодирующей последовательности для HPVAg. В) Анализ способности векторов экспрессировать HPVAg после семи вирусных пассажей. Клетки А549 трансдуцировали вирусными изолятами, выращенными на PER.C6 и PER.C6/CymR, и экспрессию HPVAg анализировали при помощи вестерн-блоттинга с использованием специфичного для Е7 HPV16 антитела. Прогнозируемый размер HPVAg составляет 83 кДа. Подробности см. в примере 6.
Подробное описание изобретения
В настоящем изобретении предусматривают молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид, который содержит SEQ ID NO:1. Полипептид представляет собой полипептид слияния, и в данном документе иногда упоминается как полипептид по настоящему изобретению или полипептид слияния по настоящему изобретению. Этот полипептид пригоден для получения иммунного ответа в отношении белков Е6 и Е7 HPV16, и, таким образом, молекулу нуклеиновой кислоты можно применять в каче- 5 035461 стве терапевтической вакцины для предупреждения хронической инфекции HPV16 и связанных с ней заболеваний.
Полипептид по настоящему изобретению представляет собой тщательно разработанную молекулу, которая содержит практически полные аминокислотные последовательности Е6 и Е7 HPV16 (отсутствует только одна аминокислота с С-конца нативного белка Е6 HPV16) в виде фрагментов, которые переупорядочены и частично перекрываются таким образом, что (по сути) присутствуют все Т-клеточные эпитопы белков Е6 и Е7 HPV16. Другими исследователями ранее были описаны молекулы с некоторым потенциалом, как у вакцин HPV (например Kenter et al., 2009, N Engl J Med 361: 1838-47; Daayana et al. , 2010, Br J Cancer 102: 1129-36; Smahel et al., 2001, Virology 281: 231-38; Yan et al., 2009, Vaccine 27: 43140; Ohlschlager et al., 2006, Vaccine 24: 2880-93; Oosterhuis et al., 2011, Int J Cancer 129: 397-406; EP1183368, WO 2013/083287), но каждая из этих молекул имеет один или несколько недостатков. Оригинальные полипептидные молекулы по настоящему изобретению являются преимущественными по меньшей мере в одном и, как правило, в нескольких аспектах относительно описанных ранее подходов. В частности, преимущества молекул и/или векторов по настоящему изобретении включают в себя следующее: (i) они имеют необходимый профиль безопасности, так как нуклеиновая кислота имеет сильно уменьшенную (по сравнению с нативными белками Е6 и Е7), вплоть до необнаруживаемой, трансформирующую активность; (ii) они представляют собой молекулы с одной нуклеиновой кислотой, которые легко получать в промышленном масштабе экономически осуществимым образом и не вызывают логистических проблем, в отличие от подходов с многочисленными молекулами; (iii) кодируемые полипептиды содержат практически все Т-клеточные эпитопы нативных белков Е6 и Е7 HPV16; (iv) разработка кодируемых полипептидов сводит к минимуму внедрение нежелательных потенциально сильных неоэпитопов (т.е. эпитопов, не присутствующих в нативных белках Е6 и Е7); и (v) в определенных вариантах осуществления они не зависят от высокоактивных адъювантов для повышения необходимого иммунного ответа. Таким образом, молекулы по настоящему изобретению представляют собой большой шаг вперед путем объединения различных выгодных характеристик в единую разработку и являются превосходными кандидатами, в первую очередь для терапевтической вакцинации против HPV16. Эти молекулы также могут работать как профилактические вакцины против HPV16, а это означает, что они, вероятно, способны предупреждать хроническую инфекцию, вызываемую HPV16, у вакцинированных субъектов.
В определенных вариантах осуществления путем тщательной разработки количество неоэпитопов с длиной, составляющей девять аминокислот, с прогнозируемой аффинностью связывания, составляющей <50 нМ, в отношении 20 наиболее распространенных HLA-A, 20 наиболее распространенных HLA-B и 20 наиболее распространенных HLA-C аллелей, было минимизировано только до 1. Это является значительным улучшением по сравнению с конструкциями, описанными другими исследователями, которые для одного перетасованного белка Е6 уже содержали более 30 таких неоэпитопов, и такие конструкции, вероятно, будут содержать еще несколько неоэпитопов в последовательностях, которые были присоединены к этим конструкциям для предупреждения потери эпитопов (Ohlschlager et al., 2006, Vaccine 24: 2880-93). Следовательно, конструкции по настоящему изобретению характеризуются значительно улучшенным иммунологическим профилем, поскольку вероятность измененного иммунного ответа по сравнению с нативными Е6 и Е7 была сведена к минимуму в молекулах по настоящему изобретению по сравнению с подходами, описанными другими исследователями.
Специалисты в данной области могут при помощи традиционных методик делать нуклеотидные замены, которые не влияют на полипептидную последовательность, кодируемую полинуклеотидами, описанными для отражения частоты использования кодонов любым конкретным организмом-хозяином, в котором полипептиды будут экспрессироваться. Следовательно, если конкретно не указано иное, то нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность включает все нуклеотидные последовательности, которые являются вырожденными версиями друг друга и которые кодируют одну и ту же аминокислотную последовательность. Нуклеотидные последовательности, которые кодируют белки, и РНК могут включать интроны.
В предпочтительном варианте осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид в соответствии с настоящим изобретением, является кодон-оптимизированной для экспрессии в клетках млекопитающих, предпочтительно клетках человека. Способы оптимизации по кодонам известны или были описаны ранее (например, WO 96/09378). Последовательность считается кодон-оптимизированной, если по меньшей мере один кодон, не являющийся предпочтительным, по сравнению с последовательностью дикого типа замещен кодоном, который является более предпочтительным. В данном документе кодон, не являющийся предпочтительным, представляет собой кодон, который используется менее часто в организме, чем другой кодон, кодирующий такую же аминокислоту, и кодон, являющийся более предпочтительным, представляет собой кодон, который используется более часто в организме, чем кодон, не являющийся предпочтительным. Частоту использования кодонов для конкретного организма можно найти в таблицах частоты использования кодонов, таких как в http://www.kazusa.or.jp/codon. Предпочтительно более одного кодона, не являющегося предпочтительным, например более 10, 40, 60, 80% кодонов, не являющихся предпочтительными, предпочтительно большинство (например, по меньшей мере 90%) или
- 6 035461 все кодоны, не являющиеся предпочтительными, замещают кодонами, которые являются более предпочтительными. Предпочтительно наиболее часто используемые кодоны в организме используют в кодоноптимизированной последовательности. Замещение предпочтительными кодонами, как правило, приводит к более высокой экспрессии.
Последовательности нуклеиновых кислот можно клонировать с помощью стандартных методик молекулярной биологии или получать de novo путем синтеза ДНК, который можно осуществлять с помощью стандартных процедур с участием компаний, предоставляющих услуги в области синтеза ДНК и/или молекулярного клонирования (например, GeneArt, GenScripts, Invitrogen, Eurofins).
Специалисту в данной области будет понятно, что в белке можно производить изменения, например с помощью замен, делеций, добавлений аминокислот и т.д., например с помощью традиционных методик молекулярной биологии. В целом консервативные замены аминокислот можно применять без потери функции или иммуногенности полипептида. Это можно проверять на основании традиционных методик, хорошо известных специалисту в данной области.
В определенных вариантах осуществления кодируемый полипептид в соответствии с настоящим изобретением дополнительно содержит лидерную последовательность, также называемую сигнальной последовательностью или сигнальным пептидом. Она представляет собой короткий (длиной, как правило, составляющей 5-30 аминокислот) пептид, присутствующий на N-конце большинства вновь синтезируемых белков, которые предназначены для поступления в секреторный путь. Наличие такой последовательности может приводить к увеличению экспрессии и иммуногенности. Неограничивающими примерами, которые можно применять, являются лидерный пептид IgE (см., например, US 6733994); например, характеризующийся последовательностью MDWTWILFLVAAATRVHS (SEQ ID NO: 7), или лидерный пептид HAVT20, например, характеризующийся последовательностью MACPGFLWALVISTCLEFSMA (SEQ ID NO: 9). Один из них может быть необязательно присоединен к N-концу полипептида по настоящему изобретению. В других вариантах осуществления полипептид в соответствии с настоящим изобретением не содержит лидерную последовательность.
Существуют различные типы HPV (идентифицированы более 120 типов, и они указаны по их номеру), и в целом для каждого типа, который должен быть охвачен вакциной, может быть необходимым включение в вакцину специфичных к этому типу антигенов, несмотря на то, что для определенных антигенов может существовать некоторая перекрестная реактивность. 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73 и 82 типы являются канцерогенными HPV высокого риска, передающимися половым путем, и могут приводить к развитию интраэпителиальной цервикальной неоплазии (CIN) , интраэпителиальной неоплазии вульвы (VIN), интраэпителиальной неоплазии влагалища (VaIN), интраэпителиальной неоплазии полового члена (PIN) и/или анальной интраэпителиальной неоплазии (AIN). HPV в соответствии с настоящим изобретением (т.е. HPV, из которого получают фрагменты Е6 и Е7 в кодируемом полипептиде) представляет собой HPV16. Его можно применять для субъектов, инфицированных HPV16. В определенных вариантах осуществления его также можно подходящим образом комбинировать с вакцинами против других типов HPV. В определенных вариантах осуществления такая комбинация представляет собой комбинацию с вакциной против HPV типа высокого риска, описанного выше, например с вакциной против HPV18. В других вариантах осуществления вакцину по настоящему изобретению комбинируют с вакциной против одного или нескольких из HPV-18, -31, -33, -35, -39, -45, -51, -52, -56, -58, -59, 68, -73 или -82. Такие комбинации можно, например, применять, если точный тип инфекции, вызванной HPV, еще не определен, или если желателен иммунный ответ с профилактическим эффектом против более чем одного типа HPV. Также предусматривают комбинации вакцин по настоящему изобретению с вакцинами против типов HPV, которые вызывают остроконечные бородавки, такие как HPV6 и/или HPV11. Последовательности таких типов HPV и белков, кодируемых ими (например, Е6, Е7, Е2), доступны специалисту в данной области из общедоступных баз данных, таких как база данных последовательностей GenBank, представленная Национальным центром биотехнологической информации (NCBI).
Полипептид в соответствии с настоящим изобретением содержит SEQ ID NO: 1, и в одном варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты в соответствии с настоящим изобретением содержит SEQ ID NO: 2.
В данном документе последовательности приведены в направлении от 5' к 3' или от N- к С-концу, как принято в данной области.
Полипептид в соответствии с настоящим изобретением содержит эпитопы белков Е6 и Е7 HPV16. В определенных вариантах осуществления полипептид в соответствии с настоящим изобретением дополнительно содержит (и, следовательно, нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, дополнительно кодирует) по меньшей мере один дополнительный антиген или эпитоп (эпитопы) такого дополнительного антигена. Такой дополнительный антиген предпочтительно представляет собой антиген HPV, предпочтительно такого же типа HPV, что и белки Е6 и Е7 в полипептиде, т.е. HPV16. Такой дополнительный антиген может, таким образом, представлять собой белок HPV или его иммуногенный фрагмент, и в определенных вариантах осуществления содержит белок Е2 или его фрагмент, содержащий по меньшей мере один эпитоп Е2 HPV, предпочтительно из HPV16. Такие дополнительные антигены или эпитопы могут быть помещены внутрь между двумя фрагментами Е6 и/или Е7 в полипептиде, содержащем SEQ
- 7 035461
ID NO:1, но предпочтительно слиты на N-конце или С-конце с полипептидом Е6/Е7, содержащим SEQ ID NO:1. Альтернативно или дополнительно могут присутствовать аминокислотные последовательности, которые стимулируют иммунный ответ. Таким образом, в определенных вариантах осуществления в настоящем изобретении предусматривают молекулы нуклеиновой кислоты в соответствии с настоящим изобретением, кодирующие полипептид, содержащий SEQ ID NO:1, и при этом полипептид дополнительно содержит по меньшей мере один другой антиген, например белок Е2 HPV или по меньшей мере один его эпитоп, но предпочтительно большее количество эпитопов. Одним преимуществом добавления антигена Е2 по настоящему изобретению является то, что Е2, как известно, экспрессируется на ранних стадиях инфекции/при низкой степени повреждений, когда экспрессия Е6 и Е7 все еще очень низкая. В ходе развития рака шейки матки экспрессия Е2 утрачивается, и в результате возрастают уровни Е6 и Е7 (Yugawa и Kiyono, 2009, Rev Med Virol 19: 97-113). Объединение эпитопов из Е2, Е6 и Е7 в одной вакцине обеспечивает лечение широкой целевой группы пациентов, начиная с пациентов с хронической инфекцией до пациентов с инвазивным раком шейки матки (или другими вызванными HPV16 видами рака). В определенных вариантах осуществления белок Е2 представляет собой белок Е2 дикого типа. В других определенных вариантах осуществления белок Е2 характеризуется делецией или одной или несколькими мутациями в своем ДНК-связывающем домене (по сравнению с белком Е2 дикого типа). Последовательность белка Е2 HPV16 (NP_041328.1) можно найти в базе данных белков NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/protein) под номером NP_041328.1. Несколько одиночных аминокислотных замен в Е2, таких как G293V, К299М или C300R в С-концевой части этого белка, как известно, подавляют связывание ДНК. Преимущество применения варианта или фрагмента Е2, лишенного ДНК-связывающей способности, заключается в том, что он может предотвращать непредсказуемые транскрипционные изменения путем прямого связывания с ДНК клетки-хозяина в клетках, где он экспрессируется. Белок Е2 или его часть или вариант можно добавлять внутрь, но предпочтительно к N-концу или к С-концу полипептида по настоящему изобретению, имеющего SEQ ID NO:1. В одном варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению кодирует полипептид, содержащий SEQ ID NO:3. В одном из вариантов осуществления молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению содержит SEQ ID NO:4. В другом варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению кодирует полипептид, содержащий SEQ ID NO:5. В одном из вариантов осуществления молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению содержит SEQ ID NO:6.
Также возможно производить дополнительные слияния оригинальных полипептидов по настоящему изобретению с дополнительными белками, например с так называемыми белками-носителями, такими как кальретикулин, белок теплового шока-70 Mycobacterium Tubercelosis, IP10 или фрагмент С столбнячного токсина (см. Oosterhuis et al., Human Gene Ther, 2012, выше, для большего количества примеров), которые могут дополнительно усиливать иммунные ответы на эпитопы Е6 и Е7 (и необязательно Е2) HPV. Таким образом, в настоящем изобретении также предусматривают такие дополнительные белки слияния и кодирующие их нуклеиновые кислоты.
В определенных вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты в соответствии с настоящим изобретением включена в вектор. Термин вектор, используемый в данном документе, как правило, представляет собой носитель для искусственного переноса чужеродного генетического материала в другую клетку, где он может быть реплицирован и/или экспрессирован, и в соответствии с настоящим изобретением может представлять собой любую молекулу нуклеиновой кислоты, которая включает молекулу нуклеиновой кислоты в соответствии с настоящим изобретением. Его можно получать в соответствии с обычными методами молекулярной биологии, такими как клонирование. Обычно такие векторы можно размножать по меньшей мере в одном типе подходящих хозяев, таких как бактерии, дрожжи, клетки насекомых, клетки млекопитающих и т.п. Четыре основных типа векторов представляют собой плазмиды, вирусные векторы, космиды и искусственные хромосомы. Сам вектор обычно представляет собой последовательность ДНК, которая состоит из вставки (трансген, в настоящем изобретении нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид слияния по настоящему изобретению) и последовательности, которая служит в качестве остова вектора. Цель вектора, который передает генетическую информацию в другую клетку, как правило, заключается в том, чтобы выделить, размножить или экспрессировать вставку в клетке-мишени. Предпочтительно последовательность, кодирующая полипептид, функционально связана с промотором в векторе. Подразумевают, что термин функционально связанный обозначает, что нуклеотидная последовательность, представляющая интерес, связана с промотором способом, который обеспечивает экспрессию нуклеотидной последовательности (например, в клетке-хозяине, когда вектор введен в клетку-хозяина). Регуляторные последовательности экспрессии могут быть функционально связаны с трансгеном. В определенных вариантах осуществления векторы разработаны для экспрессии трансгена в клетке-мишени и, как правило, имеют промоторную последовательность, которая управляет экспрессией трансгена. В определенных вариантах осуществления могут присутствовать один или несколько из обычно используемых элементов вектора, таких как последовательности терминатора транскрипции, хвостовые последовательности полиаденилирования, последовательности Kozak, UTR, точки начала репликации, множественные сайты клонирования, генетические маркеры, устойчивость к антибиотикам и другие последовательности, и специалист в данной области
- 8 035461 может разработать вектор таким образом, чтобы он обладал требуемыми свойствами, например для репликации в определенных клетках с целью распространения и размножения вектора и экспрессии трансгена вектора в клетках-мишенях, в которые вводят вектор. Векторы, содержащие нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид слияния в соответствии с настоящим изобретением, предпочтительно разработанные для экспрессии в клетках млекопитающих, пригодны в качестве вакцины в соответствии с настоящим изобретением. В определенных вариантах осуществления вектор в соответствии с настоящим изобретением представляет собой плазмиду, космиду, искусственную хромосому дрожжей, бактериальную искусственную хромосому, вирусный вектор или т.п. Специалист в данной области осведомлен о том, что для достижения экспрессии гена в клетках-хозяевах можно использовать различные промоторы. Некоторые хорошо известные и наиболее часто используемые промоторы для экспрессии в эукариотических клетках включают в себя промоторы, полученные из вирусов, таких как аденовирус, например промотор Е1А, промоторы, полученные из цитомегаловируса (CMV), такие как предранний (IE) промотор CMV, называемый в данном документе промотором CMV, получаемый, например, из pcDNA, Invitrogen, промоторы, полученные из вируса обезьян 40 (SV40), например получаемые из pIRES, № по кат. 631605, BD Sciences, и т.п. Из эукариотических клеток также можно получать подходящие промоторы, такие как промоторы генов металлотионеинов (МТ), промотор гена фактора элонгации 1α (EF-1a), промотор гена убиквитина С или UB6, промотор гена актина, промотор гена иммуноглобулина, промоторы генов теплового шока и т.п. (см., например, WO 2006/048459). Неограничивающим примером подходящего промотора для получения экспрессии в эукариотических клетках является промотор CMV (патент США № 5385839), например предранний промотор CMV, например, содержащий нуклеотиды от -735 до +95 из энхансера/промотора предраннего гена CMV, например промотора CMV, как предусмотрено в данном документе, с последовательностью, изложенной под SEQ ID NO:13. Сигнал полиаденилирования, например сигнал полиА гена бычьего гормона роста (US 5122458), может располагаться позади трансгена (трансгенов).
Также можно добавлять дополнительные регуляторные последовательности. Термин регуляторная последовательность используют взаимозаменяемо с регуляторным элементом в данном документе, и он относится к сегменту нуклеиновой кислоты, как правило, но без ограничения ДНК, которая модулирует транскрипцию последовательности нуклеиновой кислоты, с которой она функционально связана, и, таким образом, действует как транскрипционный модулятор. Регуляторная последовательность часто содержит последовательности нуклеиновых кислот, которые являются транскрипционными доменами связывания, которые распознаются доменами связывания нуклеиновых кислот транскрипционных белков и/или факторов транскрипции, энхансерами или репрессорами и т.д. Например, возможно функционально связать репрессорную последовательность с промотором, при этом репрессорная последовательность может быть связана репрессорным белком, который может уменьшать или предотвращать экспрессию трансгена в линии клеток-продуцентов, которая экспрессирует этот репрессорный белок. Это может улучшить генетическую стабильность и/или уровни экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты при пассировании и/или при продуцировании в больших количествах в линии клеток-продуцентов. Такие системы были описаны в уровне техники. Например, регуляторная последовательность может включать одну или несколько последовательностей операторов оперона тетрациклина (tetO), так что экспрессия ингибируется в присутствии белка-репрессора оперона тетрациклина (tetR). В отсутствие тетрациклина белок tetR способен связываться с сайтами tetO и репрессировать транскрипцию гена, функционально связанного с сайтами tetO. Однако в присутствии тетрациклина конформационное изменение белка tetR предотвращает его связывание с операторными последовательностями, что обеспечивает транскрипцию функционально связанных генов. В определенных вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты, например когда она присутствует в рекомбинантном аденовирусном векторе, по настоящему изобретению может необязательно включать tetO, функционально связанный с промотором, так что экспрессия одного или нескольких трансгенов ингибируется в рекомбинантных аденовирусах, которые продуцируются в линии клеток-продуцентов, в которых экспрессируется белок tetR. Впоследствии экспрессия не будет ингибироваться, если рекомбинантный аденовирус вводить субъекту или в клетки, которые не экспрессируют белок tetR (например, международная заявка на выдачу патента WO 07/073513). В других определенных вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, например, когда она присутствует в рекомбинантном аденовирусе, может необязательно включать систему переключения генов с использованием кумата, в которой регуляция экспрессии опосредуется связыванием репрессора (CymR) с сайтом оператором (CuO), расположенным ниже промотора (например, Mullick et al. ВМС Biotechnol. 2006 6:43). Используемый в данном документе термин репрессор относится к объектам (например, белкам или другим молекулам), обладающим способностью ингибировать, препятствовать, замедлять и/или репрессировать продукцию гетерологичного белкового продукта рекомбинантного вектора экспрессии. Например, путем воздействия на сайт связывания в подходящем месте вдоль вектора экспрессии, как, например, в экспрессионной кассете. Примеры репрессоров включают tetR, CymR, lac-репрессор, trp-репрессор, galpenpeccop, лямбда-репрессор и другие соответствующие репрессоры, известные в уровне техники.
Примеры применения операторной/репрессорной системы tetO/tetR и операторной/репрессорной
- 9 035461 системы CuO/CymR предусмотрены в данном документе. Репрессия экспрессии трансгена вектора в ходе размножения вектора может предотвратить трансгенную нестабильность и может увеличить выходы векторов, имеющих трансген по настоящему изобретению, в ходе продуцирования. Следовательно, в некоторых вариантах осуществления векторы по настоящему изобретению имеют промотор, который может быть репрессирован посредством связывания репрессорного белка, например путем обеспечения промотора, который функционально соединен с репрессорной операторной последовательностью (например, в неограничивающих вариантах осуществления последовательностью, содержащей TetO, например, последовательностью, изложенной под SEQ ID NO:11, или последовательностью, содержащей CuO, например последовательностью, изложенной под SEQ ID NO:12), с которой репрессорный белок (например, белок TetR, например, имеющий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:15, или белок CymR, например, имеющий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:17), может связываться.
В определенных вариантах осуществления вектор представляет собой молекулу плазмидной ДНК или ее фрагмент. Их можно применять для ДНК-вакцинации. Также в качестве векторов можно использовать другие платформы, например живые аттенуированные штаммы Listeria monocytogene с двойной делецией.
В других вариантах осуществления вектор представляет собой рекомбинантный вирусный вектор, который может быть способным к репликации или неспособным к репликации. В определенных вариантах осуществления вирусный вектор содержит рекомбинантный ДНК-геном. В определенных вариантах осуществления вектор по настоящему изобретению представляет собой, например, рекомбинантный аденовирус, рекомбинантный ретровирус, рекомбинантный поксвирус, такой как вирус осповакцины, например модифицированный вирус коровьей оспы анкара (MVA), рекомбинантный альфавирус, такой как вирус леса Семлики, рекомбинантный парамиксовирус, такой как рекомбинантный вирус кори, или другой рекомбинантный вирус. В определенных вариантах осуществления вектор в соответствии с настоящим изобретением представляет собой вектор на основе MVA.
В предпочтительных вариантах осуществления вектор в соответствии с настоящим изобретением представляет собой рекомбинантный аденовирус. Преимущества аденовирусов при применении в качестве вакцин включают легкость манипулирования, хорошую технологичность производства в широком масштабе и отличные показатели безопасности, основанные на многолетнем опыте исследований, разработок, производства и клинических испытаний с многочисленными аденовирусными векторами, о которых сообщалось. Аденовирусные векторы, которые применяют в качестве вакцин, как правило, обеспечивают хороший иммунный ответ на белок, кодируемый трансгеном, в том числе клеточный иммунный ответ. Аденовирусный вектор в соответствии с настоящим изобретением может быть основан на любом типе аденовируса и в некоторых вариантах осуществления представляет собой аденовирус человека, который может принадлежать любому серотипу. В других вариантах осуществления он представляет собой обезьяний аденовирус, такой как аденовирус шимпанзе или гориллы, который может принадлежать любому серотипу. В определенных вариантах осуществления вектор в соответствии с настоящим изобретением представляет собой аденовирус человека серотипа 5, 26 или 35. Получение рекомбинантных аденовирусных векторов хорошо известно в области техники. В определенных вариантах осуществления аденовирусный вектор в соответствии с настоящим изобретением является дефектным по меньшей мере по одному существенно важному функциональному гену участка Е1, например участка Е1а и/или участка E1b, аденовирусного генома, который требуется для вирусной репликации. В определенных вариантах осуществления аденовирусный вектор в соответствии с настоящим изобретением является дефектным по меньшей мере по части участка Е3, не являющегося существенно важным. В определенных вариантах осуществления вектор является дефектным по меньшей мере по одному существенно важному функциональному гену участка Е1 и по меньшей мере по части участка Е3, не являющегося существенно важным.
Аденовирусные векторы, способы их конструирования и способы их размножения хорошо известны в уровне техники и описаны, например, в патентах США №№ 5559099, 5837511, 5846782, 5851806, 5994106, 5994128, 5965541, 5981225, 6040174, 6020191 и 6113913 и Thomas Shenk, Adenoviridae and their Replication, M.S. Horwitz, Adenoviruses, Chapters 67 and 68 соответственно, в Virology, В. N. Fields et al., eds., 3d ed., Raven Press, Ltd., New York (1996), а также других источниках, упомянутых в данном документе. Как правило, конструирование аденовирусных векторов включает применение общепринятых методик молекулярной биологии, таких как описанные, например, в Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), Watson et al., Recombinant DNA, 2d ed., Scientific American Books (1992) и Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, NY (1995), а также других источниках, упомянутых в данном документе.
Особенно предпочтительными серотипами для рекомбинантного аденовируса являются человеческий серотип 35 или человеческий серотип 26. Получение векторов rAd26 описано, например, в WO 2007/104792 и в Abbink et al., 2007 Virology 81: 4654-63. Иллюстративные последовательности генома Ad26 указаны в GenBank под номером доступа EF 153474 и под SEQ ID NO:1 из WO 2007/104792. Получение векторов rAd35 описано, например, в патенте США № 7270811, в WO 00/70071 и в Vogels et al.,
- 10 035461
2003, J Virol 77: 8263-71. Иллюстративные последовательности генома Ad35 указаны в GenBank под номером доступа АС_000019 и на фиг. 6 из WO 00/70071.
В определенных вариантах осуществления аденовирус является репликативно-дефектным, например, потому что он содержит делецию в участке Е1 генома. Как известно специалисту, в случае делеций существенно важных участков из генома аденовируса функциональные элементы, кодируемые этими участками, должны быть обеспечены в транс-положении, предпочтительно клеткой-продуцентом, т.е. если части или целые участки Е1, Е2 и/или Е4 удалены из аденовируса, то они должны присутствовать в клетке-продуценте, например встроены в ее геном или находятся в форме так называемого вспомогательного аденовируса или вспомогательной плазмиды. Аденовирус также может иметь делецию в участке Е3, который не является существенным для репликации, и, следовательно, такую делецию не следует восполнять.
Клетка-продуцент (также иногда называемая в уровне техники и в данном документе как пакующая клетка, или дополняющая клетка), которую можно использовать, может представлять собой любую клетку-продуцент, в которой требуемый аденовирус может быть размножен. Например, размножение векторов но основе рекомбинантного аденовируса осуществляют в клетках-продуцентах, которые восполняют дефициты в аденовирусе. Предпочтительно такие клетки-продуценты имеют в своем геноме по меньшей мере последовательность Е1 аденовируса, и, таким образом, они способны к дополнению рекомбинантных аденовирусов с делецией в участке Е1. Можно использовать любую Е1-дополняющую клетку-продуцент, как, например, клетки сетчатки глаза человека, иммортализированные с помощью Е1, например клетки 911 или PER.C6 (см. патент США № 5994128), E1-mрαнсформировαнные амниоциты (см. патент ЕР № 1230354), Е1-трасформированные клетки А549 (см., например, WO 98/39411, патент США № 5891690), GH329:HeLa (Gao et al., 2000, Hum Gene Ther 11: 213-19), 293 и т.п. В определенных вариантах осуществления клетками-продуцентами являются, например клетки HEK293, или клетки PER.C6, или клетки 911, или клетки IT293SF и т.п. Продуцирование аденовирусных векторов в клеткахпродуцентах описано в Kovesdi et al., 2010, Viruses 2: 1681-703.
В определенных вариантах осуществления E1-дефектный аденовирус содержит кодирующую последовательность E4-orf6 из аденовируса подгруппы С, такого как Ad5. Это обеспечивает возможность размножения таких аденовирусов в хорошо известных дополняющих линиях клеток, которые экспрессируют гены Е1 Ad5, таких как клетки 293 или клетки PER.C6 (см., например Havenga et al., 2006, J Gen Virol 87: 2135-43; WO 03/104467, включенный в данный документ посредством ссылки в полном объеме).
Гетерологичная нуклеиновая кислота (также называемая в данном документе трансгеном) в векторах по настоящему изобретению представляет собой нуклеиновую кислоту, которая в естественных условиях не присутствует в векторе, и в соответствии с настоящим изобретением нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид слияния по настоящему изобретению, считается гетерологичной нуклеиновой кислотой, когда она присутствует в векторе. Ее вводят в вектор с помощью, например, стандартных методик молекулярной биологии. Например, ее можно клонировать в удаленный участок Е1 или Е3 аденовирусного вектора или в участок между участком Е4 и rITR. Трансген обычно функционально связан с последовательностями, контролирующими экспрессию. В предпочтительных вариантах осуществления трансген клонируют в участок Е1 аденовирусного вектора.
Продуцирование векторов, таких как ДНК-векторы или рекомбинантные аденовирусные векторы, может быть выполнено в соответствии с различными способами, хорошо известными специалисту в данной области. Как правило, продуцирование предусматривает размножение в культивируемых клетках с получением значительного количества векторного материала с последующим сбором вектора из клеточной культуры и обычно с последующей дополнительной очисткой вектора с удалением других веществ и получением очищенных векторов, которые могут быть составлены в фармацевтические композиции (например, Hoganson et al., 2002, BioProcessing J 1: 43-8; Evans et al., 2004, J Pharm Sci 93:2458-75). Например, способы сбора аденовируса из культур клеток-продуцентов, например, были подробно описаны в WO 2005/080556. Например, в WO 2010/060719 и WO 2011/098592, оба из которых включены в данный документ посредством ссылки, описаны подходящие способы получения и очистки больших количеств рекомбинантных аденовирусов.
В определенных аспектах в настоящем изобретении также предусматривают полипептид, кодируемый молекулой нуклеиновой кислоты в соответствии с настоящим изобретением. Такой полипептид содержит SEQ ID NO:1. В определенных вариантах осуществления такой полипептид может содержать SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:5. Характеристики такого полипептида описаны выше. Такой полипептид можно, например, непосредственно применять в качестве вакцины против HPV.
В настоящем изобретении дополнительно предусматривают вакцины, содержащие молекулы нуклеиновой кислоты, векторы или полипептиды в соответствии с настоящим изобретением, где варианты осуществления для каждого из этих аспектов могут включать варианты, описанные выше. В предпочтительных вариантах осуществления вакцина в соответствии с настоящим изобретением содержит молекулу нуклеиновой кислоты в соответствии с настоящим изобретением. В дополнительных предпочтительных вариантах осуществления вакцина содержит вектор в соответствии с настоящим изобретением, предпочтительно ДНК-вектор, вектор на основе MVA или рекомбинантный аденовирусный вектор.
- 11 035461
В определенных вариантах осуществления вакцина в соответствии с настоящим изобретением содержит дополнительные активные ингредиенты, например нуклеиновую кислоту, кодирующую по меньшей мере один эпитоп белка Е6 и/или Е7 по меньшей мере одного типа HPV, отличного от
HPV16, например типа HPV высокого риска, такого как HPV18, -31, -33, -35, -39, -45, -51, -52, -56, -58,
-59, -68, -73 или -82.
Термин вакцина относится к средству или композиции, содержащим активный компонент, эффективный для индукции у субъекта профилактической и/или терапевтической степени иммунитета в отношении определенного патогена или заболевания, в данном случае терапевтически против HPV. Вакцина, как правило, содержит молекулу нуклеиновой кислоты или вектор в соответствии с настоящим изобретением и фармацевтически приемлемый наполнитель. После введения субъекту полипептид, кодируемый молекулой нуклеиновой кислоты в соответствии с настоящим изобретением, будет экспрессироваться в организме субъекта, что приведет к возникновению иммунного ответа в отношении антигенных фрагментов Е6 и/или Е7, которые присутствуют в полипептиде. Преимущество молекул по настоящему изобретению заключается в том, что присутствуют практически все Т-клеточные эпитопы Е6 и Е7 HPV16, и, таким образом, Т-клеточный ответ в отношении любого эпитопа, присутствующего в Е6 или Е7 дикого типа, может быть обеспечен при помощи вакцины. Кроме того, вакцина обладает всеми преимуществами безопасности и эффективности, которые описаны выше для молекул нуклеиновой кислоты в соответствии с настоящим изобретением.
Для введения людям при осуществлении настоящего изобретения на практике могут быть использованы фармацевтические композиции, содержащие вектор и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель. В настоящем контексте термин фармацевтически приемлемый означает, что носитель или наполнитель в используемых дозах и концентрациях не вызовет каких-либо нежелательных или вредных эффектов у субъектов, которым их вводят. Такие фармацевтически приемлемые наполнители хорошо известны в уровне техники (см. Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Company [1990]; Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S. Frokjaer и L. Hovgaard, Eds., Taylor & Francis [2000]; и Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press [2000]). Наполнитель, как правило, представляет собой фармакологически неактивное вещество, составленное с активным ингредиентом лекарственного препарата. Наполнители обычно используют для увеличения объемов составов, которые содержат сильнодействующие активные ингредиенты (которые часто называют объемообразующими средствами, заполнителями или разбавителями), чтобы обеспечить удобное и точное распределение лекарственного средства при получении лекарственной формы. Они также могут служить для различных терапевтическиусиливающих целей, таких как облегчение абсорбции лекарственного средства или растворимость, или других фармакокинетических факторов. Наполнители могут также быть пригодны в производственном процессе для упрощения обращения с активным веществом, относящегося, например, к обеспечению текучести порошка или обеспечению неадгезионных свойств, в дополнение к поддержанию стабильности in vitro, как, например, для предупреждения денатурации в течение ожидаемого срока хранения. Выбор подходящих наполнителей также зависит от пути введения и лекарственной формы, а также от активного ингредиента и других факторов.
Очищенные молекулу нуклеиновой кислоты, вектор или полипептид предпочтительно составляют и вводят в виде стерильного раствора, хотя также возможно использование лиофилизированных препаратов. Стерильные растворы получают при помощи стерилизующей фильтрации или с помощью других способов, известных per se в уровне техники. Затем растворы лиофилизируют или расфасовывают в контейнеры, предназначенные для лекарственных форм. рН раствора обычно находится в диапазоне от рН 3,0 до 9,5, например от рН 5,0 до 7,5. Как правило, молекула нуклеиновой кислоты, или вектор, или полипептид находится в растворе с подходящим буфером, при этом раствор вектора может также содержать соль. Необязательно может присутствовать стабилизирующее средство, такое как альбумин. В определенных вариантах осуществления добавляют детергент. В определенных вариантах осуществления вакцину можно составлять в виде инъекционного препарата. Эти составы, содержащие эффективные количества молекулы нуклеиновой кислоты, вектора или полипептида, являются либо стерильными жидкими растворами, жидкими суспензиями, либо лиофилизированными вариантами и необязательно содержат стабилизаторы или наполнители.
Например, рекомбинантный аденовирусный вектор можно хранить в буфере, который также используют для Adenovirus World Standard (Hoganson et al., 2002, Bioprocessing J 1: 43-8): 20 мМ Трис, рН 8, 25 мМ NaCl, 2,5% глицерина. Другой пригодный состав буфера, который подходит для введения людям, представляет собой 20 мМ Трис, 2 мМ MgCl2, 25 мМ NaCl, сахароза 10% вес./об., полисорбат-80 0,02% вес./об. Другой состав буфера, который подходит для рекомбинантного аденовируса, содержит 10-25 мМ цитратного буфера, рН 5,9-6,2, 4-6% (вес./вес.) гидроксипропил-бета-циклодекстрина (HBCD), 70-100 мМ NaCl, 0,018-0,035% (вес./вес.) полисорбата-80 и необязательно 0,3-0,45% (вес./вес.) этанола.
Безусловно можно использовать множество других буферов, при этом хорошо известны некоторые примеры подходящих составов для хранения и для фармацевтического введения очищенных векторов.
- 12 035461
В определенных вариантах осуществления композиция, содержащая вектор, дополнительно содержит один или несколько адъювантов. Адъюванты, как известно в уровне техники, дополнительно повышают иммунный ответ в отношении применяемой антигенной детерминанты. Термины адъювант и иммуностимулятор используют в данном документе взаимозаменяемо и их определяют как одно или несколько веществ, вызывающих стимуляцию иммунной системы. В данном контексте адъювант используют для усиления иммунного ответа на полипептиды, кодируемые молекулами нуклеиновых кислот в векторах по настоящему изобретению. Примеры подходящих адъювантов включают соли алюминия, такие как гидроксид алюминия, и/или фосфат алюминия, и/или алюминия-калия фосфат; композиции, представляющие собой масляные эмульсии (или композиции типа масло-в-воде), в том числе водные эмульсии сквалена, например MF59 (см., например, WO 90/14837); сапониновые составы, например QS21, и комплексы с иммуностимулирующими свойствами (ISCOM) (см., например, US 5057540; WO 90/03184, WO 96/11711, WO 2004/004762, WO 2005/002620); бактериальные или микробные производные, примерами которых являются монофосфорил-липид A (MPL), 3-O-деацетилированный MPL (3dMPL), олигонуклеотиды, содержащие мотив CpG, ADP-рибозилирующие бактериальные токсины или их мутанты, такие как термолабильный энтеротоксин LT E. coli, холерный токсин СТ и т.п. Также возможно использование адъюванта, кодируемого вектором, например путем использования гетерологичной нуклеиновой кислоты, которая кодирует слияние домена олигомеризации С4-связывающего белка (C4bp) с антигеном, представляющим интерес (например, Solabomi et al., 2008, Infect Immun 76: 3817-23), или путем использования вектора, кодирующего и трансген, представляющий интерес, и агонист TLR-3, такой как гетерологичная dsRNA (например, WO 2007/100908), или т.п.
В других вариантах осуществления композиции по настоящему изобретению не содержат адъюванты.
Фармацевтические композиции можно вводить субъекту, например субъекту-человеку. Как известно квалифицированному практику, общая доза активного компонента вакцины, предоставляемая субъекту при однократном введении, может варьировать и для аденовируса, как правило, составляет от 1х107 вирусных частиц (vp) до 1х1012 vp, предпочтительно от 1x108 vp до 1х 1011 vp, например от 3x108 до 5х1010 vp, например от 109 до 3х1010 vp. Для ДНК-вакцины общее количество ДНК на введение может, например, составлять от 1 мкг до 10 мг. При использовании для введения генной пушки обычно используют более низкие количества, например 10 мкг. Для внутримышечной инъекции обычно используют более высокие количества, например до 5 мг.
Введение фармацевтических композиций можно осуществлять с использованием стандартных путей введения. Неограничивающие варианты осуществления включают парентеральное введение, такое как инъекция, например внутрикожная, внутримышечная и т.д., или подкожное, или чрескожное введение, или введение через слизистые, например интраназальное, пероральное, интравагинальное, ректальное и т.п. В одном варианте осуществления композицию вводят посредством внутримышечной инъекции, например, в дельтовидную мышцу руки или латеральную широкую мышцу бедра. В определенных вариантах осуществления вакцина представляет собой ДНК-вакцину, и ее можно вводить, например, внутрикожно, например посредством ДНК-татуирования (см., например, Oosterhuis et al., 2012, Curr Top Microbiol Immunol 351: 221-50). Этот путь также возможен для аденовирусных векторов. В определенных вариантах осуществления композиция в соответствии с настоящим изобретением содержит аденовирусный вектор, и ее вводят путем внутримышечной инъекции. Специалисту известны различные возможности введения композиции, такой как вакцина, для индуцирования иммунного ответа к антигену (антигенам), присутствующему (присутствующим) в вакцине.
Субъект, используемый в данном документе, предпочтительно представляет собой млекопитающее, к примеру грызуна, например мышь, или отличного от человека примата, или человека. Субъект предпочтительно является субъектом-человеком.
Вакцины по настоящему изобретению можно использовать для лечения пациентов с одной из различных стадий заболеваний, вызванных HPV (в частности, 16 типом), от эпизодической и хронической инфекции, вызванной HPV, как таковой (например, при обнаружении с помощью ДНК-тестирования HPV), таким образом, до формирующихся предраковых поражений, а также интраэпителиальной цервикальной неоплазии (CIN, также известной как дисплазия шейки матки и интерстициальная неоплазия шейки матки, которая представляет собой потенциально предопухолевую трансформацию и аномальный рост (дисплазию) чешуйчатых клеток на поверхности шейки матки) вплоть до и включая рак шейки матки, например плоскоклеточную карциному шейки матки (SCC). Кроме того, мишенями могут быть другие HPV-индуцированные неоплазии, такие как интраэпителиальная неоплазия вульвы (VIN), интраэпителиальная неоплазия влагалища (VaIN), интраэпителиальная неоплазия полового члена (PIN), анальная интраэпителиальная неоплазия (AIN), а также более поздние стадии рака ротоглотки (также известный как рак головы и шеи), рака полового члена, вагинального рака, рака вульвы и анального рака. Вакцины по настоящему изобретению, таким образом, могут целенаправленно воздействовать на широкий спектр HPV-индуцированных поражений и, вероятно, являются наиболее эффективными на предраковых стадиях HPV-индуцированного заболевания, например при (хронической) инфекции и/или стадиях неоплазии, когда экспрессия Е2, Е6 и/или Е7 является наивысшей. Также возможно комбинировать лечение с ис
- 13 035461 пользованием вакцины по настоящему изобретению с соединениями, которые противодействуют или могут преодолевать механизмы ускользания от иммунологического надзора клеток прогрессирующего рака, например антителами к PD1/PD-L1, антителами к CTLA-4, такими как ипилимумаб, антителами к LAG-3, антителами к CD25, IDO-ингибиторами, CD40 агонистичными антителами, CD137 агонистичными антителами и т.д. (см., например, Hamid и Carvajal, 2013, Expert Opinion Biol Ther 13: 847-861; Mellman et al., 2011, Nature Rev 480: 480-89). Способ терапевтической вакцинации в принципе можно также применять для лечения внешних остроконечных бородавок или их предшественников в том случае, если вакцина содержит дополнительно кодирующие последовательности Е6 и/или Е7 типа HPV, вызывающего внешние остроконечные бородавки, и ее вводят субъекту, инфицированному таким типом HPV.
Используемый в данном документе термин лечение означает введение вакцины для индукции терапевтического иммунного ответа в отношении клеток, которые экспрессируют (эпитопы) Е6 и/или Е7 HPV16 у пациента, что приводит, по меньшей мере, к снижению уровня и предпочтительно полному устранению инфекции, вызванной HPV16, что приводит в результате, по меньшей мере, к замедлению и предпочтительно к прекращению прогрессирования вызванного HPV16 заболевания, такого как виды неоплазии и/или ее симптомы. Предпочтительно лечение с помощью вакцины приводит также к ремиссии более поздних стадий HPV-индуцированных видов рака. Предпочтительно вводить вакцину пациентам с установившейся инфекцией, вызванной HPV известного типа, таким образом, можно вводить вакцину, которая кодирует полипептид соответствующего типа HPV. При отсутствии скрининга вакцину можно также вводить той части населения, которая, вероятно, будет инфицирована HPV, т.е. сексуально активным людям. Также возможно вводить вакцину по настоящему изобретению субъектам, которые не были инфицированы HPV16, например для профилактических целей, возможно, в комбинации с вакциной против другого типа HPV, которым был заражен пациент, или альтернативно неинфицированным субъектам. Вакцину по настоящему изобретению можно также вводить субъекту, которого подвергают дополнительному лечению другими способами, например хирургическому вмешательству (устранению поражения, вызванного инфекцией, вызванной HPV16) или лечению имиквимодом (содержащим агонист TLR-7/8, см., например, Dayaana et al., 2010, Br J Cancer 102: 1129-36). Эффект лечения можно оценить либо с помощью цитологического тестирования, либо с помощью тестирования на наличие HPV.
Вакцинация включает введение вакцины по настоящему изобретению субъекту или пациенту по меньшей мере один раз. Также возможным является обеспечение одного или нескольких бустерных введений одной или нескольких дополнительных вакцин. При проведении бустерной вакцинации, как правило, такую бустерную прививку будут вводить одному и тому же субъекту в промежуток времени от одной недели до одного года, предпочтительно от двух недель до четырех месяцев, после введения иммуногенной композиции с тем же антигеном субъекту, что и в первый раз (которое в данном случае называется первичной вакцинацией). В альтернативных бустерных режимах также возможным является введение различных векторов, например одного или нескольких аденовирусов различных серотипов или других векторов, таких как на основе MVA, или ДНК, или белка субъекту в качестве первичной или бустерной вакцинации. В определенных вариантах осуществления одну и ту же форму вакцины по настоящему изобретению вводят, по меньшей мере, дважды одному и тому же пациенту согласно режиму прайм-буст, например с тем же рекомбинантным аденовирусом (таким как Ad26) в соответствии с настоящим изобретением. В определенных вариантах осуществления вакцину по настоящему изобретению вводят, по меньшей мере, дважды согласно режиму прайм-буст, но вектор в вакцине отличается, например при использовании двух разных серотипов аденовирусных векторов, например первичную вакцинацию проводят рекомбинантным Ad26, а бустерную - с помощью рекомбинантного Ad35 или vice versa; или первичную вакцинацию проводят при помощи ДНК, а бустерную - аденовирусным вектором или vice versa; или первичную вакцинацию проводят аденовирусным вектором, а бустерную - с помощью вектора на основе MVA или vice versa. В определенных вариантах осуществления вакцину в соответствии с настоящим изобретением вводят по меньшей мере три раза согласно режиму прайм-буст-буст. В режим могут быть добавлены дополнительные бустерные введения.
Также одним аспектом настоящего изобретения является индуцирование CTL-ответа в отношении HPV16 у субъекта, включающее введение субъекту вакцины в соответствии с настоящим изобретением.
В настоящем изобретении также предусматривают следующие неограничивающие варианты осуществления:
1) нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, содержащий SEQ ID NO:1;
2) нуклеиновая кислота в соответствии с вариантом осуществления 1, где полипептид дополнительно содержит по меньшей мере часть белка Е2 HPV;
3) нуклеиновая кислота в соответствии с вариантом осуществления 2, где по меньшей мере часть белка Е2 HPV получают из белка Е2 HPV16;
4) нуклеиновая кислота в соответствии с вариантом осуществления 2, где полипептид содержит по меньшей мере часть белка Е2, слитую с N-концевой стороной полипептида с SEQ ID NO:1;
5) нуклеиновая кислота в соответствии с вариантом осуществления 2, где полипептид содержит по меньшей мере часть белка Е2, слитую с С-концевой стороной полипептида с SEQ ID NO:1;
6) нуклеиновая кислота в соответствии с вариантом осуществления 3, где полипептид содержит по
- 14 035461 меньшей мере часть белка Е2, слитую с N-концевой стороной полипептида с SEQ ID NO:1;
7) нуклеиновая кислота в соответствии с вариантом осуществления 3, где полипептид содержит по меньшей мере часть белка Е2, слитую с С-концевой стороной полипептида с SEQ ID NO:1;
8) нуклеиновая кислота в соответствии с вариантом осуществления 2, где по меньшей мере часть белка Е2 содержит вариант белка Е2 с мутацией, которая подавляет способность связывания ДНК у Е2;
9) нуклеиновая кислота в соответствии с вариантом осуществления 3, где по меньшей мере часть белка Е2 содержит вариант белка Е2 с мутацией, которая подавляет способность связывания ДНК у Е2;
10) нуклеиновая кислота в соответствии с вариантом осуществления 4, где по меньшей мере часть белка Е2 содержит вариант белка Е2 с мутацией, которая подавляет способность связывания ДНК у Е2;
11) нуклеиновая кислота в соответствии с вариантом осуществления 5, где по меньшей мере часть белка Е2 содержит вариант белка Е2 с мутацией, которая подавляет способность связывания ДНК у Е2;
12) нуклеиновая кислота в соответствии с вариантом осуществления 6, где по меньшей мере часть белка Е2 содержит вариант белка Е2 с мутацией, которая подавляет способность связывания ДНК у Е2;
13) нуклеиновая кислота в соответствии с вариантом осуществления 7, где по меньшей мере часть белка Е2 содержит вариант белка Е2 с мутацией, которая подавляет способность связывания ДНК у Е2;
14) вектор, содержащий нуклеиновую кислоту в соответствии с вариантом осуществления 1, где последовательность, кодирующая полипептид, функционально связана с промотором;
15) вектор, содержащий нуклеиновую кислоту в соответствии с вариантом осуществления 2, где последовательность, кодирующая полипептид, функционально связана с промотором;
16) вектор, содержащий нуклеиновую кислоту в соответствии с вариантом осуществления 3, где последовательность, кодирующая полипептид, функционально связана с промотором;
17) вектор, содержащий нуклеиновую кислоту в соответствии с вариантом осуществления 4, где последовательность, кодирующая полипептид, функционально связана с промотором;
18) вектор, содержащий нуклеиновую кислоту в соответствии с вариантом осуществления 5, где последовательность, кодирующая полипептид, функционально связана с промотором;
19) вектор, содержащий нуклеиновую кислоту в соответствии с вариантом осуществления 6, где последовательность, кодирующая полипептид, функционально связана с промотором;
20) вектор, содержащий нуклеиновую кислоту в соответствии с вариантом осуществления 7, где последовательность, кодирующая полипептид, функционально связана с промотором;
21) вектор, содержащий нуклеиновую кислоту в соответствии с вариантом осуществления 8, где последовательность, кодирующая полипептид, функционально связана с промотором;
22) вектор, содержащий нуклеиновую кислоту в соответствии с вариантом осуществления 9, где последовательность, кодирующая полипептид, функционально связана с промотором;
23) вектор, содержащий нуклеиновую кислоту в соответствии с вариантом осуществления 10, где последовательность, кодирующая полипептид, функционально связана с промотором;
24) вектор, содержащий нуклеиновую кислоту в соответствии с вариантом осуществления 11, где последовательность, кодирующая полипептид, функционально связана с промотором;
25) вектор, содержащий нуклеиновую кислоту в соответствии с вариантом осуществления 12, где последовательность, кодирующая полипептид, функционально связана с промотором;
26) вектор, содержащий нуклеиновую кислоту в соответствии с вариантом осуществления 13, где последовательность, кодирующая полипептид, функционально связана с промотором;
27) вектор в соответствии с вариантом осуществления 14, где вектор представляет собой аденовирус;
28) вектор в соответствии с вариантом осуществления 15, где вектор представляет собой аденовирус;
29) вектор в соответствии с вариантом осуществления 16, где вектор представляет собой аденовирус;
30) вектор в соответствии с вариантом осуществления 17, где вектор представляет собой аденовирус;
31) вектор в соответствии с вариантом осуществления 18, где вектор представляет собой аденовирус;
32) вектор в соответствии с вариантом осуществления 19, где вектор представляет собой аденовирус;
33) вектор в соответствии с вариантом осуществления 20, где вектор представляет собой аденовирус;
34) вектор в соответствии с вариантом осуществления 21, где вектор представляет собой аденовирус;
35) вектор в соответствии с вариантом осуществления 22, где вектор представляет собой аденовирус;
36) вектор в соответствии с вариантом осуществления 23, где вектор представляет собой аденовирус;
37) вектор в соответствии с вариантом осуществления 24, где вектор представляет собой аденовирус;
38) вектор в соответствии с вариантом осуществления 25, где вектор представляет собой аденовирус;
39) вектор в соответствии с вариантом осуществления 26, где вектор представляет собой аденовирус;
40) вектор в соответствии с вариантом осуществления 27, где аденовирус представляет собой аденовирус человека серотипа 26;
41) вектор в соответствии с вариантом осуществления 28, где аденовирус представляет собой аденовирус человека серотипа 26;
42) вектор в соответствии с вариантом осуществления 29, где аденовирус представляет собой аденовирус человека серотипа 26;
43) вектор в соответствии с вариантом осуществления 30, где аденовирус представляет собой аденовирус человека серотипа 26;
- 15 035461
44) вектор в соответствии с вариантом осуществления 31, где аденовирус представляет собой аденовирус человека серотипа 26;
45) вектор в соответствии с вариантом осуществления 32, где аденовирус представляет собой аденовирус человека серотипа 26;
46) вектор в соответствии с вариантом осуществления 33, где аденовирус представляет собой аденовирус человека серотипа 26;
47) вектор в соответствии с вариантом осуществления 34, где аденовирус представляет собой аденовирус человека серотипа 26;
48) вектор в соответствии с вариантом осуществления 35, где аденовирус представляет собой аденовирус человека серотипа 26;
49) вектор в соответствии с вариантом осуществления 36, где аденовирус представляет собой аденовирус человека серотипа 26;
50) вектор в соответствии с вариантом осуществления 37, где аденовирус представляет собой аденовирус человека серотипа 26;
51) вектор в соответствии с вариантом осуществления 38, где аденовирус представляет собой аденовирус человека серотипа 26;
52) вектор в соответствии с вариантом осуществления 39, где аденовирус представляет собой аденовирус человека серотипа 26;
53) вектор в соответствии с вариантом осуществления 28, где аденовирус представляет собой аденовирус человека серотипа 35;
54) вектор в соответствии с вариантом осуществления 29, где аденовирус представляет собой аденовирус человека серотипа 35;
55) вектор в соответствии с вариантом осуществления 30, где аденовирус представляет собой аденовирус человека серотипа 35;
56) вектор в соответствии с вариантом осуществления 31, где аденовирус представляет собой аденовирус человека серотипа 35;
57) вектор в соответствии с вариантом осуществления 32, где аденовирус представляет собой аденовирус человека серотипа 35;
58) вектор в соответствии с вариантом осуществления 33, где аденовирус представляет собой аденовирус человека серотипа 35;
59) вектор в соответствии с вариантом осуществления 34, где аденовирус представляет собой аденовирус человека серотипа 35;
60) вектор в соответствии с вариантом осуществления 35, где аденовирус представляет собой аденовирус человека серотипа 35;
61) вектор в соответствии с вариантом осуществления 36, где аденовирус представляет собой аденовирус человека серотипа 35;
62) вектор в соответствии с вариантом осуществления 37, где аденовирус представляет собой аденовирус человека серотипа 35;
63) вектор в соответствии с вариантом осуществления 38, где аденовирус представляет собой аденовирус человека серотипа 35;
64) вектор в соответствии с вариантом осуществления 39, где аденовирус представляет собой аденовирус человека серотипа 35;
65) композиция вакцины, содержащая вектор в соответствии с вариантом осуществления 14 и фармацевтически приемлемый наполнитель;
66) композиция вакцины, содержащая вектор в соответствии с вариантом осуществления 15 и фармацевтически приемлемый наполнитель;
67) композиция вакцины, содержащая вектор в соответствии с вариантом осуществления 16 и фармацевтически приемлемый наполнитель;
68) композиция вакцины, содержащая вектор в соответствии с вариантом осуществления 17 и фармацевтически приемлемый наполнитель;
69) композиция вакцины, содержащая вектор в соответствии с вариантом осуществления 18 и фармацевтически приемлемый наполнитель;
70) композиция вакцины, содержащая вектор в соответствии с вариантом осуществления 19 и фармацевтически приемлемый наполнитель;
71) композиция вакцины, содержащая вектор в соответствии с вариантом осуществления 20 и фармацевтически приемлемый наполнитель;
72) композиция вакцины, содержащая вектор в соответствии с вариантом осуществления 21 и фармацевтически приемлемый наполнитель;
73) композиция вакцины, содержащая вектор в соответствии с вариантом осуществления 22 и фармацевтически приемлемый наполнитель;
74) композиция вакцины, содержащая вектор в соответствии с вариантом осуществления 23 и фармацевтически приемлемый наполнитель;
- 16 035461
75) композиция вакцины, содержащая вектор мацевтически приемлемый наполнитель;
76) композиция вакцины, содержащая вектор мацевтически приемлемый наполнитель;
77) композиция вакцины, содержащая вектор мацевтически приемлемый наполнитель;
78) композиция вакцины, содержащая вектор мацевтически приемлемый наполнитель;
79) композиция вакцины, содержащая вектор мацевтически приемлемый наполнитель;
80) композиция вакцины, содержащая вектор мацевтически приемлемый наполнитель;
81) композиция вакцины, содержащая вектор мацевтически приемлемый наполнитель;
82) композиция вакцины, содержащая вектор мацевтически приемлемый наполнитель;
83) композиция вакцины, содержащая вектор мацевтически приемлемый наполнитель;
84) композиция вакцины, содержащая вектор мацевтически приемлемый наполнитель;
85) композиция вакцины, содержащая вектор мацевтически приемлемый наполнитель;
86) композиция вакцины, содержащая вектор мацевтически приемлемый наполнитель;
87) композиция вакцины, содержащая вектор мацевтически приемлемый наполнитель;
88) композиция вакцины, содержащая вектор мацевтически приемлемый наполнитель;
89) композиция вакцины, содержащая вектор мацевтически приемлемый наполнитель;
90) композиция вакцины, содержащая вектор мацевтически приемлемый наполнитель;
91) композиция вакцины, содержащая вектор мацевтически приемлемый наполнитель;
92) композиция вакцины, содержащая вектор мацевтически приемлемый наполнитель;
93) композиция вакцины, содержащая вектор мацевтически приемлемый наполнитель;
94) композиция вакцины, содержащая вектор мацевтически приемлемый наполнитель;
95) композиция вакцины, содержащая вектор мацевтически приемлемый наполнитель;
96) композиция вакцины, содержащая вектор мацевтически приемлемый наполнитель;
97) композиция вакцины, содержащая вектор мацевтически приемлемый наполнитель;
98) композиция вакцины, содержащая вектор мацевтически приемлемый наполнитель;
99) композиция вакцины, содержащая вектор мацевтически приемлемый наполнитель;
100) композиция вакцины, содержащая вектор в фармацевтически приемлемый наполнитель;
101) композиция вакцины, содержащая вектор в фармацевтически приемлемый наполнитель;
102) композиция вакцины, содержащая вектор в фармацевтически приемлемый наполнитель;
103) композиция вакцины, содержащая вектор в фармацевтически приемлемый наполнитель;
104) композиция вакцины, содержащая вектор в фармацевтически приемлемый наполнитель;
105) композиция вакцины, содержащая вектор в фармацевтически приемлемый наполнитель;
в соответствии с вариантом осуществления 24 и фар· в соответствии с вариантом осуществления 25 и фар· в соответствии с вариантом осуществления 26 и фар в соответствии с вариантом осуществления 27 и фар в соответствии с вариантом осуществления 28 и фар в соответствии с вариантом осуществления 29 и фар в соответствии с вариантом осуществления 30 и фар· в соответствии с вариантом осуществления 31 и фар· в соответствии с вариантом осуществления 32 и фар· в соответствии с вариантом осуществления 33 и фар· в соответствии с вариантом осуществления 34 и фар· в соответствии с вариантом осуществления 35 и фар· в соответствии с вариантом осуществления 36 и фар· в соответствии с вариантом осуществления 37 и фар· в соответствии с вариантом осуществления 38 и фар· в соответствии с вариантом осуществления 39 и фар· в соответствии с вариантом осуществления 40 и фар в соответствии с вариантом осуществления 41 и фар в соответствии с вариантом осуществления 42 и фар в соответствии с вариантом осуществления 43 и фар в соответствии с вариантом осуществления 44 и фар в соответствии с вариантом осуществления 45 и фар в соответствии с вариантом осуществления 46 и фар в соответствии с вариантом осуществления 47 и фар в соответствии с вариантом осуществления 48 и фар соответствии с вариантом осуществления 49 соответствии с вариантом осуществления 50 соответствии с вариантом осуществления 51 соответствии с вариантом осуществления 52 соответствии с вариантом осуществления 53 соответствии с вариантом осуществления 54 и и и и и и
- 17 035461
106) композиция вакцины, содержащая вектор фармацевтически приемлемый наполнитель;
107) композиция вакцины, содержащая вектор фармацевтически приемлемый наполнитель;
108) композиция вакцины, содержащая вектор фармацевтически приемлемый наполнитель;
109) композиция вакцины, содержащая вектор фармацевтически приемлемый наполнитель;
110) композиция вакцины, содержащая вектор фармацевтически приемлемый наполнитель;
111) композиция вакцины, содержащая вектор фармацевтически приемлемый наполнитель;
112) композиция вакцины, содержащая вектор фармацевтически приемлемый наполнитель;
113) композиция вакцины, содержащая вектор фармацевтически приемлемый наполнитель;
114) композиция вакцины, содержащая вектор фармацевтически приемлемый наполнитель;
115) композиция вакцины, содержащая вектор фармацевтически приемлемый наполнитель;
116) способ индуцирования иммунного ответа в отношении HPV у субъекта, включающий введение субъекту композиции вакцины в соответствии с любым из вариантов осуществления 65-115;
117) способ лечения хронической инфекции, вызванной HPV (16 типом), включающий введение вакцины в соответствии с любым из вариантов осуществления 65-115 субъекту, который страдает хронической инфекцией, вызванной HPV;
118) способ лечения интраэпителиальной неоплазии вульвы (VIN) (на фоне инфекции, вызванной HPV 16 типа), включающий введение вакцины в соответствии с любым из вариантов осуществления 65115 субъекту, который страдает VIN;
119) способ лечения рака вульвы (на фоне инфекции, вызванной HPV 16 типа), включающий введение вакцины в соответствии с любым из вариантов осуществления 65-115 субъекту, который страдает в соответствии с вариантом осуществления 55 и в соответствии с вариантом осуществления 56 и в соответствии с вариантом осуществления 57 и в соответствии с вариантом осуществления 58 и в соответствии с вариантом осуществления 59 и в соответствии с вариантом осуществления 60 и в соответствии с вариантом осуществления 61 и в соответствии с вариантом осуществления 62 и в соответствии с вариантом осуществления 63 и в соответствии с вариантом осуществления 64 и раком вульвы;
120) способ лечения интраэпителиальной цервикальной неоплазии (CIN) (на фоне инфекции, вызванной HPV 16 типа), включающий введение вакцины в соответствии с любым из вариантов осуществления 65-115 субъекту, который страдает CIN;
121) способ лечения рака шейки матки (на фоне инфекции, вызванной HPV 16 типа), включающий введение вакцины в соответствии с любым из вариантов осуществления 65-115 субъекту, который страдает раком шейки матки;
122) способ лечения рака ротоглотки (на фоне инфекции, вызванной HPV 16 типа), включающий введение вакцины в соответствии с любым из вариантов осуществления 65-115 субъекту, который страдает раком ротоглотки;
123) способ лечения интраэпителиальной неоплазии полового члена (PIN) (на фоне инфекции, вызванной HPV 16 типа), включающий введение вакцины в соответствии с любым из вариантов осуществления 65-115 субъекту, который страдает PIN;
124) способ лечения рака полового члена (на фоне инфекции, вызванной HPV 16 типа), включающий введение вакцины в соответствии с любым из вариантов осуществления 65-115 субъекту, который страдает раком полового члена;
125) способ лечения интраэпителиальной неоплазии влагалища (VaIN) (на фоне инфекции, вызванной HPV 16 типа), включающий введение вакцины в соответствии с любым из вариантов осуществления 65-115 субъекту, который страдает VaIN;
126) способ лечения рака влагалища (на фоне инфекции, вызванной HPV 16 типа), включающий введение вакцины в соответствии с любым из вариантов осуществления 65-115 субъекту, который страдает раком влагалища;
127) способ лечения анальной интраэпителиальной неоплазии (AIN) (на фоне инфекции, вызванной HPV 16 типа), включающий введение вакцины в соответствии с любым из вариантов осуществления 65115 субъекту, который страдает AIN;
128) способ лечения рака анального канала (на фоне инфекции, вызванной HPV 16 типа), включающий введение вакцины в соответствии с любым из вариантов осуществления 65-115 субъекту, который страдает раком анального канала;
129) полипептид, содержащий SEQ ID NO:1;
130) полипептид в соответствии с вариантом осуществления 129, где полипептид дополнительно содержит по меньшей мере часть белка Е2 HPV;
131) полипептид в соответствии с вариантом осуществления 130, где по меньшей мере часть белка
- 18 035461
Е2 HPV получают из белка Е2 HPV16;
132) полипептид в соответствии с вариантом осуществления 130, где по меньшей мере часть белка
Е2 является слитой с N-концевой стороной полипептида с SEQ ID NO:1;
133) полипептид в соответствии с вариантом осуществления 130, где по меньшей мере часть белка
Е2 является слитой с С-концевой стороной полипептида с SEQ ID NO:1;
134) полипептид в соответствии с вариантом осуществления 131, где по меньшей мере часть белка Е2 является слитой с N-концевой стороной полипептида с SEQ ID NO:1;
135) полипептид в соответствии с вариантом осуществления 131, где по меньшей мере часть белка Е2 является слитой с С-концевой стороной полипептида с SEQ ID NO:1;
136) полипептид в соответствии с вариантом осуществления 130, где по меньшей мере часть белка Е2 содержит вариант белка Е2 с мутацией, которая подавляет способность связывания ДНК у Е2;
137) полипептид в соответствии с вариантом осуществления 131, где по меньшей мере часть белка Е2 содержит вариант белка Е2 с мутацией, которая подавляет способность связывания ДНК у Е2;
138) полипептид в соответствии с вариантом осуществления 132, где по меньшей мере часть белка Е2 содержит вариант белка Е2 с мутацией, которая подавляет способность связывания ДНК у Е2;
139) полипептид в соответствии с вариантом осуществления 133, где по меньшей мере часть белка Е2 содержит вариант белка Е2 с мутацией, которая подавляет способность связывания ДНК у Е2;
140) полипептид в соответствии с вариантом осуществления 134, где по меньшей мере часть белка Е2 содержит вариант белка Е2 с мутацией, которая подавляет способность связывания ДНК у Е2;
141) полипептид в соответствии с вариантом осуществления 135, где по меньшей мере часть белка Е2 содержит вариант белка Е2 с мутацией, которая подавляет способность связывания ДНК у Е2;
142) нуклеиновая кислота в соответствии с вариантом осуществления 3, кодирующая полипептид согласно SEQ ID NO:3;
143) нуклеиновая кислота в соответствии с вариантом осуществления 3, кодирующая полипептид согласно SEQ ID NO: 5;
144) вектор, кодирующий нуклеиновую кислоту в соответствии с вариантом осуществления 142, где последовательность, кодирующая полипептид, функционально связана с промотором;
145) вектор, кодирующий нуклеиновую кислоту в соответствии с вариантом осуществления 143, где последовательность, кодирующая полипептид, функционально связана с промотором;
146) вектор в соответствии с вариантом осуществления 144, где вектор представляет собой адено вирус;
147) вектор в соответствии с вариантом осуществления 145, где вектор представляет собой адено- вирус;
148) вектор в соответствии с вариантом осуществления 146, где аденовирус представляет собой аденовирус человека серотипа 26;
149) вектор в соответствии с вариантом осуществления 147, где аденовирус представляет собой аденовирус человека серотипа 26;
150) вектор в соответствии с вариантом осуществления 146, где аденовирус представляет собой аденовирус человека серотипа 35;
151) вектор в соответствии с вариантом осуществления 147, где аденовирус представляет собой аденовирус человека серотипа 35;
152) композиция вакцины, содержащая вектор фармацевтически приемлемый наполнитель;
153) композиция вакцины, содержащая вектор фармацевтически приемлемый наполнитель;
154) композиция вакцины, содержащая вектор фармацевтически приемлемый наполнитель;
155) композиция вакцины, содержащая вектор фармацевтически приемлемый наполнитель;
156) композиция вакцины, содержащая вектор фармацевтически приемлемый наполнитель;
157) композиция вакцины, содержащая вектор фармацевтически приемлемый наполнитель;
158) композиция вакцины, содержащая вектор фармацевтически приемлемый наполнитель;
159) композиция вакцины, содержащая вектор соответствии соответствии соответствии соответствии соответствии соответствии соответствии соответствии вариантом осуществления вариантом осуществления вариантом осуществления вариантом осуществления вариантом осуществления вариантом осуществления вариантом осуществления вариантом осуществления
144 и
145 и
146 и
147 и
148 и
149 и
150 и
151 и фармацевтически приемлемый наполнитель;
160) способ индуцирования иммунного ответа в отношении HPV у субъекта, включающий введение субъекту композиции вакцины в соответствии с любым из вариантов осуществления 152-159;
161) способ лечения интраэпителиальной неоплазии вульвы (VIN), включающий введение вакцины в соответствии с любым из вариантов осуществления 152-159 субъекту, который страдает VIN;
162) способ лечения рака вульвы, включающий введение вакцины в соответствии с любым из вари-
- 19 035461 антов осуществления 152-159 субъекту, который страдает раком вульвы;
163) способ лечения интраэпителиальной цервикальной неоплазии (CIN), включающий введение вакцины в соответствии с любым из вариантов осуществления 152-159 субъекту, который страдает CIN;
164) способ лечения рака шейки матки, включающий введение вакцины в соответствии с любым из вариантов осуществления 152-159 субъекту, который страдает раком шейки матки;
165) способ лечения рака ротоглотки, включающий введение вакцины в соответствии с любым из вариантов осуществления 152-159 субъекту, который страдает раком ротоглотки;
166) способ лечения интраэпителиальной неоплазии полового члена (PIN), включающий введение вакцины в соответствии с любым из вариантов осуществления 152-159 субъекту, который страдает PIN;
167) способ лечения рака полового члена, включающий введение вакцины в соответствии с любым из вариантов осуществления 152-159 субъекту, который страдает раком полового члена;
168) способ лечения интраэпителиальной неоплазии влагалища (VaIN), включающий введение вакцины в соответствии с любым из вариантов осуществления 152-159 субъекту, который страдает VaIN;
169) способ лечения рака влагалища, включающий введение вакцины в соответствии с любым из вариантов осуществления 152-159 субъекту, который страдает раком влагалища;
170) способ лечения анальной интраэпителиальной неоплазии (AIN), включающий введение вакцины в соответствии с любым из вариантов осуществления 152-159 субъекту, который страдает AIN;
171) способ лечения рака анального канала, включающий введение вакцины в соответствии с любым из вариантов осуществления 152-159 субъекту, который страдает раком анального канала.
При осуществлении на практике данного изобретения будут использовать, если не указано иное, общепринятые методики иммунологии, молекулярной биологии, микробиологии, клеточной биологии и рекомбинантной ДНК, которые находятся в компетенции специалистов в данной области. См., например, Sambrook, Fritsch и Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, 1989; Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel FM, et al., eds, 1987; серия Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); PCR2: A Practical Approach, MacPherson MJ, Hams BD, Taylor GR, eds, 1995; Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow и Lane, eds, 1988.
Настоящее изобретение дополнительно поясняется в приведенных далее примерах. Примеры не ограничивают настоящее изобретение каким-либо образом. Они служат лишь для пояснения настоящего изобретения.
Примеры
Пример 1. Конструкция оригинального полипептида, содержащего практически все CTL-эпитопы Е6 и Е7 HPV16.
Авторы настоящего изобретения разработали новый, неонкогенный полипептид (и кодирующую его нуклеиновую кислоту), который содержит практически все CTL-эпитопы белков Е6 и Е7 HPV16 и характеризуется минимальным количеством ожидаемых/прогнозируемых сильных неоэпитопов (неоэпитопы в значении эпитопов, отсутствующих в белках дикого типа Е6 и Е7 HPV16). Полипептид по настоящему изобретению (также иногда называемый в данном документе E6E7SH) содержит последовательность, представленную под SEQ ID NO:1. Кодон-оптимизированная нуклеиновая кислота, кодирующая этот полипептид, представлена под SEQ ID NO:2.
Молекулы по настоящему изобретению представляют собой отдельные молекулы, что обеспечивает преимущества в получении по сравнению со стратегиями, в которых применяют многочисленные молекулы. Кроме того, полипептид по настоящему изобретению содержит практически все предполагаемые CTL-эпитопы, которые присутствуют в Е6 и Е7 дикого типа HPV16, и в то же время имеют минимальное количество ожидаемых/прогнозируемых сильных неоэпитопов, которые могут быть потенциально иммунодоминантными и, таким образом, перенаправляют иммунный ответ от соответствующих CTLэпитопов дикого типа. Таким образом, конструкции по настоящему изобретению являются иммунологически более благоприятными, чем молекулы, описанные другими исследователями, которые либо не имеют возможных CTL-эпитопов и/или содержат большее количество неоэпитопов или более сильные неоэпитопы.
Например, конструкция с SEQ ID NO:1 содержит только один неоэпитоп с длиной девять аминокислот с прогнозируемой аффинностью связывания, составляющей <50 нМ, в отношении 20 наиболее распространенных HLA-A, 20 наиболее распространенных HLA-B и 20 наиболее распространенных HLA-C аллелей:
(HLA-A*01:01,
- 20 035461
HLA-A*02:01, HLA-A*11:01, HLA-A* 3 0:01, HLA-A*33:03, HLA-B*07:04, HLA-B*35:01, HLA-B*40:06, HLA-B*51:01, HLA-C*04:01, HLA-C*03:03, HLA-C*05:01, HLA-C*12:03,
HLA-A*02:03, HLA-A* 2 3:01,
HLA-A*30:02, HLA-A* 3 4:01,
HLA-B*08:01, HLA-B*37:01,
HLA-B*44:02, HLA-B*52:01, HLA-C*03:04, HLA-C*08:01, HLA-C*14:02,
HLA-C*04:03
HLA-A*02:06,
HLA-A*24:02,
HLA-A* 31:01,
HLA-A*68:01,
HLA-B*13:01,
HLA-B*39:01,
HLA-B*44:03,
HLA-B*53:01,
HLA-C*01:02,
HLA-C*15:02,
HLA-C*03:02,
HLA-C*17: (
HLA-A*02:07,
HLA-A* 2 6:01,
HLA-A*32:01,
HLA-A*68:02,
HLA-B*15:01,
HLA-B*40:01,
HL-B*46:01,
HLA-B*58:01,
HLA-C*07:01,
HLA-C*12:02, HLA-C*16:01, 1, HLA-C*1HLA-A*03:01, HLA-A*29:02, HLA-A*33:01, HLA-B*07:02, HLA-B*18:01, HLA-B*40:02, HLA-B*48:01, HLA-C*07:02, HLA-C*06:02, HLA-C*02:02, HLA-C*08:02, :03), как определено с помощью способов ANN (Lundegaard et al., 2008, Nucl Acids Res 36: W509-12) и SMM (Peters et al., 2003, Bioinformatics 19: 1765-72) для HLA-A и HLA-B и способа NetMHCpan (Hoof et al., 2009, Immunogenetics 61: 1-13) для HLA-C инструмента прогнозирования для пептидного связывания с молекулами МНС I класса на веб-сайте IEDB (http://tools.immuneepitope.org/analyze/html/mhc_binding.html, версия 2009-09-01В).
В качестве неограничивающего примера при использовании инструмента прогнозирования SMM на веб-сайте IEDB, перетасованные последовательности Е6 и Е7, описанные Oosterhuis et al., 2011, Int J Cancer 129: 397-406 и Ohlschlager et al., 2006, Vaccine 24: 2880-93, содержат девять потенциальных сильных уникальных неоэпитопов (ANN или SMM IC50 <50 нМ) для 20 наиболее распространенных HLA-A и -В в основной части. Это даже исключает добавления, используемые в этом подходе (в котором добавления будут также приводить к дополнительным неоэпитопам и могут упустить более нативные эпитопы МНС II из-за ограниченной длины перекрывания). Действительно, по имеющимся сведениям улучшенная молекула, содержащая вариант с перетасованными белками Е6 и Е7, которые описаны в WO 2013/083287, содержит 22 уникальных неоэпитопа длиной девять аминокислот с прогнозируемой IC50 <50 нМ (ANN, SMM или NetMHCPan) для 20 наиболее распространенных HLA-A, 20 наиболее распространенных HLA-B и 20 наиболее распространенных HLA-C аллелей.
Следовательно, оригинальные молекулы по настоящему изобретению, несомненно, благоприятны тем, что они имеют гораздо меньшее количество прогнозируемых неоэпитопов по сравнению с другими известными подходами, где Е6 и Е7 перетасованы для удаления функциональности.
Синтезировали нуклеиновую кислоту, кодирующую разработанную, таким образом, авторами настоящего изобретения молекулу E6E7SH HPV16 (т.е. полипептид, характеризующийся аминокислотной последовательностью, представленной под SEQ ID NO:1), последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую SEQ ID NO:2, и фланкированную сайтом HindIII и последовательностью Kozak на 5'-конце и сайтом XbaI на 3'-конце (синтез под заказ и стандартное молекулярное клонирование в Invitrogen Life technologies, Германия).
Синтезированные фрагменты клонировали с использованием HindIII и XbaI в стандартный вектор экспрессии pCDNA2004.Neo, несущий как бактериальный маркер устойчивости (к ампициллину), так и маркер устойчивости млекопитающих (к неомицину), для получения плазмидных векторов, кодирующих молекулу по настоящему изобретению, т.е. для экспериментов на основе (временных) трансфекций.
Эти молекулы могут быть использованы как таковые, а также в качестве основы для последующих молекул, в которых предусмотрены дополнительные признаки. В качестве неограничивающих примеров были получены некоторые дополнительные варианты, которые описаны ниже.
Последовательность белка слияния E6E7SH HPV16 можно комбинировать с последовательностями других ранних белков HPV16 для целенаправленного воздействия на организмы индивидуумов с хронической инфекцией и для расширения иммунного репертуара у иммунизированного индивидуума. Предполагают, что иммунные ответы в отношении Е2 играют важную роль в устранении инфекций, вызванных HPV16 (de Jong et al., 2002, Cancer Res 62: 472-479). Слияние Е2 с E6E7SH даст компонент вакцины, который несет антигены против стадий HPV-ассоциированного рака от хронической инфекции до инвазивного рака или рецидивирующего/рефрактерного заболевания после операции LEEP. Таким образом, в качестве неограничивающего примера таких вариантов осуществления авторы настоящего изобретения приводят последовательность, кодирующую белок слияния E6E7SH с Е2 на его N-конце. В последовательности Е2 можно выполнять модификации для подавления активности связывания ДНК, которая может влиять на экспрессию генов в клетках, экспрессирующих белок слияния. Авторы настоящего изобретения подвергали мутации глицин в положении 293, лизин в положении 299 и цистеин в положении 300 белка Е2 wt HPV16 соответственно на валин, метионин и аргинин. Каждая из этих мутаций сама по себе
- 21 035461 уже полностью подавляет связывание Е2 с последовательностями ДНК, которые несут Е2-связывающие домены (Prakash et al., 1992, Genes Dev 6: 105-16).
Полученный полипептид обозначают как E2E6E7SH HPV16, и он содержит SEQ ID NO:3. Получали кодон-оптимизированную последовательность, кодирующую этот полипептид, и она представлена под
SEQ ID NO:4.
Авторы настоящего изобретения также сконструировали вариант, в котором тот же мутантный белок Е2 сливали с С-концом полипептида слияния E6E7SH HPV16, что приводило к образованию полипептида, представленного как E6E7E2SH HPV16, который содержит SEQ ID NO:5. Последовательность, кодирующая эту конструкцию, представлена как SEQ ID NO:6.
Для целей контроля авторы настоящего изобретения также сконструировали последовательности, кодирующие полипептид, который содержит последовательности дикого типа для полноразмерных Е6 и Е7 HPV16, в качестве белка слияния (Е6 от а.к. 1 до 158, непосредственно слитый с Е7 от а.к. 1 до 98, обозначенный в данном документе E6E7wt).
Авторы настоящего изобретения также исследовали влияние добавления лидерных последовательностей к полипептиду. В качестве неограничивающего примера последовательность, кодирующую лидерную последовательность IgE, см., например, US 6733994 (последовательность лидерного пептида представлена под SEQ ID NO:7), сливали с N-концом некоторых конструкций, например в конструкции E6E7wt, которая представлена LSE6E7wt, и в конструкции E2E6E7SH, которая представлена LSE2E6E7SH. Под их влиянием существенно (р<0,05) увеличивалась иммуногенность по сравнению с таким же антигеном без последовательности LS, что измеряли при помощи Е7-тетрамерного анализа у иммунизированных мышей (как, например, можно видеть на фиг. 9).
Последовательности, которые кодируют полипептиды E6E7SH по настоящему изобретению, с Е2 или без него, могут, например, экспрессироваться с ДНК-конструкций, с РНК или с вирусных векторов. На фиг. 1 показана экспрессия в клетках HEK-293T при временной трансфекции ДНК-векторами, экспрессирующими трансгены, которые описаны выше. После трансфекции клетки собирали и клеточные экстракты анализировали при помощи SDS-PAGE и вестерн-блоттинга с антителом к Е7 HPV16. При этом эксперименте видна экспрессия ожидаемых белков слияния соответствующего размера после трансфекции векторов экспрессии.
Аденовирусные векторы можно использовать для экспрессии Е6Е7, либо с Е2, либо без него, и с дополнительными последовательностями или без них для повышения иммуногенности кодируемого белка слияния.
Гены, кодирующие контроль, представляющий собой Е6Е7\\1 HPV16, или оригинальные последовательности HPV, описанные выше, подвергали генной оптимизации для экспрессии у человека и синтезировали согласно Geneart. Последовательность Kozak (5' GCCACC 3') включали непосредственно перед стартовым кодоном ATG и два стоп-кодона (5' TGA ТАА 3') добавляли в конце соответствующей кодирующей последовательности. Гены вставляли в плазмиду pAdApt35BSU и в плазмиду pAdApt26 (Havenga et al., 2006, J Gen Virol 87, 2135-43) по сайтам HindIII и XbaI.
Все аденовирусы выращивали в клетках PER.C6 при помощи однократной гомологичной рекомбинации и получали, как описано ранее (относительно rAd35: Havenga et al., 2006, J Gen Virol 87: 2135-43; относительно rAd26: Abbink et al., 2007, J Virol 81: 4654-63). Клетки PER.C6 (Fallaux et al., 1998, Hum Gene Ther 9: 1909-17) поддерживали на среде Игла в модификации Дульбекко (DMEM) с 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), дополненной 10 мМ MgCl2.
Вкратце, клетки PER.C6 трансфицировали с помощью Ad векторных плазмид с использованием липофектамина согласно инструкциям, представленным производителем (Life Technologies). Клетки собирали через один день после достижения полного цитопатического эффекта (СРЕ), подвергали замораживанию-размораживанию, центрифугировали в течение 5 мин при 3000 об/мин и хранили при -20°С. Вирусы очищали методом бляшкообразования и амплифицировали в клетках PER.C6, культивируемых в отдельной лунке 24-луночного планшета для культуры тканей. Дальнейшую амплификацию проводили в клетках PER.C6, культивируемых в колбе для культуры тканей Т25 и затем в колбе для культуры тканей Т175. Неочищенные лизаты, приготовленные из клеток, полученных после культивирования в колбе Т175, 3-5 мл, использовали для инокуляции в 24хТ1000 пятислойных колбах для культуры тканей, содержащих слои клеток PER.C6 с 70% конфлюэнтностью. Вирус очищали при помощи способа двухэтапной очистки с использованием CsCl. В заключение вирус хранили в аликвотах при -85°С.
Ad35.HPV16-E6E7wt и Ad35.HPV16-E6E7SH являются векторами на основе рекомбинантного аденовируса серотипа 35 (Ad35), содержащими кодон-оптимизированные нуклеотидные последовательности для экспрессии соответственно белка слияния белков Е6 и Е7 дикого типа HPV16 (E6E7wt) и оригинального белка слияния, который описан выше (E6E7SH, с аминокислотной последовательностью, представленной под SEQ ID NO:1). Объединенные последовательности Е6 и Е7 помещали под контроль промотора CMV в область Е1 генома аденовируса с удаленными Е1, Е3. Ad26.HPV16-E6E7wt и Ad26.HPV16-E6E7SH являются эквивалентными векторами на основе рекомбинантного аденовируса серотипа 26.
- 22 035461
Аналогичным образом были получены рекомбинантные аденовирусные векторы на основе Ad26 и Ad35, которые кодируют вариант E2E6E7SH HPV16 (SEQ ID NO:3). Аналогично были получены Ad26 и Ad35, кодирующие вариант E6E7E2SH HPV16 (SEQ ID NO:5). Также был получен вектор Ad35, кодирующий белок слияния E2E6E7SH с лидерной последовательностью IgE на N-конце, названный Ad35.HPV16-LSE2E6E7SH. Также был получен контрольный аденовирус с E6E7wt, слитый с лидерной последовательностью IgE на N-конце.
Рекомбинантные аденовирусы получали на клетках PER.C6 и очищали центрифугированием на градиентах хлорида цезия.
Дополнительные примеры конструкций по настоящему изобретению, которые были связаны с репрессорными системами, предусмотрены в следующем ниже примере.
Пример 2. Отсутствие трансформирующей активности у оригинальных конструкций.
Белки Е6 и Е7 дикого типа HPV16 обладают онкогенным потенциалом, который проявляется как трансформирующая активность в определенных анализах, как, например, колониеобразование при анализе с мягким агаром (Massimi и Banks, 2005, Methods Mol Med 119: 381-395). Полипептид E6E7SH, который описан в примере 1, содержит фрагменты белков Е6 и Е7 в переупорядоченном виде. Предполагают, что это приведет к устранению онкогенного потенциала, что может быть определено, например, по значительно сниженной трансформирующей активности по сравнению с любым из белков Е6 и Е7 wt в таких анализах.
Другие исследователи сообщали, что генно-перетасованные варианты Е6 и Е7 HPV16 действительно теряли свой онкогенный потенциал (Ohlschlager et al., 2006, Vaccine 24: 2880-93; Henken et al., 2012, Vaccine 30: 4259-66), демонстрируя, что перетасовка генов нейтрализует функции белков Е6 и Е7 дикого типа.
Для оценки потери онкогенных свойств авторы настоящего изобретения оценивали способность конструкций E6E7SH по настоящему изобретению придавать способность расти в мягком агаре клеткам NIH 3Т3 (как описано, например, Massimi и Banks, 2005, Methods Mol Med 119: 381-395). Трансфекция клеток NIH3T3 с помощью плазмиды, экспрессирующей Е7 дикого типа HPV16, неизменно приводила к колониеобразованию. В этих анализах экспрессия только Е6 дикого типа HPV16 не вызывала колониеобразование выше фонового уровня. Это соответствует опубликованным наблюдениям, что E7wt намного эффективнее, чем E6wt в таком анализе (Sedman et al., 1991, J Virol 65: 4860-66). Трансфекция с помощью конструкции E6E7SH по настоящему изобретению не приводила к росту колоний клеток в мягком агаре (фиг. 2) в четырех независимых экспериментах, что показало, что нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептид по настоящему изобретению, E6E7SH, утратили трансформирующую способность, которая связана с Е7.
Онкогенный потенциал Е6 и Е7 связан с их способностью снижать уровни клеточных белков р53 и pRb соответственно. Анализы разрушения Р53 и pRb проводили для демонстрации того, что нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид по настоящему изобретению, E6E7SH, конструкцию, не обладает биологической активностью, связанной с Е6 и Е7 дикого типа на молекулярном уровне. Вкратце, E6wt HPV16 и конструкция E6E7SH по настоящему изобретению экспрессировали в клетках NCI-H1299, у которых отсутствовал эндогенный р53, для анализа разрушения р53. Для анализа разрушения pRb E7wt HPV16 и конструкцию E6E7SH экспрессировали в клетках Saos-2 с нефункциональным pRb. Как можно видеть на фиг. 3, совместная экспрессия р53 с E6wt, но не с E6E7SH, приводит к снижению уровней р53 (секции А и В).
Аналогично на секциях 3С и 3D показано, что совместная экспрессия pRb с E7wt, но не с E6E7SH, приводит к снижению уровней pRB. Из этих данных видно, что нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид по настоящему изобретению, не обладает способностью колониеобразования в мягком агаре и не ограничивает биологические активности полипептидов Е6 и Е7 дикого типа, а именно инактивацию р53 и pRb соответственно.
Для дополнительной демонстрации безопасности конструкций нуклеиновых кислот, кодирующих полипептид по настоящему изобретению, авторы настоящего изобретения использовали первичные кератиноциты крайней плоти человека, которые являются естественными клетками-мишенями для HPVопосредованной трансформации. Для иммортализации первичных кератиноцитов человека требуется действие как Е6, так и Е7 дикого типа (Munger et al., 1989, J Virol 63: 4417-21). Этот анализ, вероятно, является физиологически наиболее важным анализом in vitro для демонстрации безопасности конструкций по настоящему изобретению (Massimi и Banks, 2005, Methods Mol Med 119: 381-395). Клетки, трансдуцированные лентивирусами, экспрессирующими Е6 и Е7 дикого типа HPV16 (E6E7wt), индуцируют иммортализацию первичных кератиноцитов, что подтверждается увеличением их продолжительности жизни по сравнению с нетрансдуцированными контрольными клетками (фиг. 4) и активацией hTERT, каталитической субъединицы теломеразы (данные не показаны). Экспрессия полипептида по настоящему изобретению (E6E7SH) не способна продлить продолжительность жизни по сравнению с GFPтрансдуцированными или нетрансдуцированными кератиноцитами. Аналогичные результаты были получены у двух дополнительных независимых доноров (данные не показаны). Все эти данные указывают на то, что конструкции по настоящему изобретению утратили способность индуцировать иммортализа- 23 035461 цию первичных кератиноцитов человека, которые считаются в значительной степени физиологической моделью.
Другая конструкция, в которой фрагменты Е6 и Е7 HPV16 рекомбинировали в другом порядке, также была неспособна к иммортализации первичных кератиноцитов крайней плоти человека.
Однако для этой конструкции наблюдалась увеличенная продолжительность жизни до примерно 120-150 дней. Это указывает на некоторую непредсказуемость в этой области и показывает превосходство оригинальных молекул в соответствии с настоящим изобретением в этом аспекте, связанном с безопасностью.
Все вместе эксперименты в данном примере предоставляют убедительные доказательства отсутствия трансформирующей активности нуклеиновых кислот, кодирующих полипептиды в соответствии с настоящим изобретением, и, таким образом, значительно улучшенной безопасности в сравнении с конструкциями Е6 и Е7 HPV16.
Пример 3. Иммунные ответы в отношении оригинальных конструкций E6E7SH.
Авторы настоящего изобретения получали ДНК-векторы и аденовирусные векторы, которые описаны в примере 1.
Авторы настоящего изобретения использовали линию мышей CB6F1 для оценки иммунных ответов, основываясь на первоначальных экспериментах, в которых мышей иммунизировали ДНКплазмидами, кодирующими Е2, или Е6, или Е7 дикого типа, и иммунизация антигенами Е2, Е6 и Е7 HPV16 индуцировала более широкий клеточный иммунный ответ у CB6F1, чем у мышей линии C57BL/6 или мышей линии Balb/c. В отдельном эксперименте мышей иммунизировали ДНК-векторами, кодирующими молекулы по настоящему изобретению, и оценивали клеточные иммунные ответы. Специфические в отношении Е7 HPV16 иммунные ответы можно оценивать у мышей, иммунизированных ДНКплазмидами, экспрессирующими E6E7SH (фиг. 5).
Следующие данные, показанные в этом примере, получены из экспериментов с мышами, которым были введены аденовирусные векторы.
Для оценки иммуногенности, индуцированной вакциной, мышей линии CB6F1 иммунизировали с помощью аденовекторов (Ad35), экспрессирующих E6E7wt, LSE6E7wt, E6E7SH, и аденовекторов, не кодирующих трансген (пустых). Тестировали две дозы для введения мышам: 5х 109 вирусных частиц (vp) и 1х 1010 vp. Через две и восемь недель после иммунизации мышей умерщвляли и выделенные спленоциты стимулировали в течение ночи пептидными пулами из олигонуклеотидов из 15 нуклеотидов Е7 HPV16. Е7-специфические ответы через две недели и через восемь недель анализировали с помощью IFNY ELISPOT. Данные представлены на фиг. 6.
Из результатов видно, что иммунизация мышей с помощью Ad35.HPV16-E6E7SH индуцирует Е7специфические иммунные ответы, которые измерены с помощью анализа ELISPOT. Кроме того, из результатов на фиг. 6 видна возможность усиления иммунного ответа в отношении экспрессируемого аденовирусом трансгена путем добавления N-концевой лидерной последовательности к трансгену.
Затем исследовали эффект добавления Е2 к полипептиду E6E7SH в отношении иммуногенности. Векторы Ad35 кодировали полипептиды, которые характеризовались наличием Е2, слитым либо с Nконцом (E2E6E7SH), либо с С-концом (E6E7E2SH). Мышей линии CB6F1 иммунизировали дозой, составляющей 1х1010 vp. На фиг. 7 (Е7-тетрамерное окрашивание) и фиг. 8 (секция С, IFNy ELISPOT) показаны иммунные ответы в отношении Е7, которые для оригинальных конструкций, включающих Е2, имели тенденцию к повышению по сравнению с конструкцией без Е2, хотя различия не были статистически значимыми. Ответ в отношении Е2 был выше для аденовирусных векторов, кодирующих только Е2, по сравнению с ответом на аденовирусные векторы, у которых Е2 слит с оригинальным полипептидом E6E7SH (фиг. 8В), причем различия значимы между Е2 и E2E6E7SH и между Е2 и E6E7E2SH (рзначение: <0,05).
Можно сделать вывод, что оригинальные конструкции, которые дополнительно включают Е2, могут все еще обеспечивать иммунный ответ в отношении Е7 и, кроме того, также обеспечивать иммунный ответ в отношении Е2, таким образом увеличивая широту иммунного ответа по сравнению с конструкциями, которые не включают Е2.
Было показано, что добавление лидерной последовательности приводит к более высоким Е7специфическим ответам при слиянии с N-концом белка слияния Е6 и Е7 дикого типа (фиг. 6С). Аналогичным образом определяли влияние лидерной последовательности на иммуногенность белка слияния E2E6E7SH.
Таким образом, для иммунизации мышей использовали векторы Ad35, кодирующие оригинальный полипептид, с N-концевым Е2 или без него, и вектор Ad35, кодирующий LSE2E6E7SH, и образцы крови брали с двухнедельными интервалами для оценки Е7-специфических иммунных ответов (фиг. 9) Как показано на фиг. 7 и 8, присутствие Е2, слитого с E6E7SH либо на N-конце, либо на С-конце, приводило к увеличению иммунных ответов. Добавление лидерной последовательности IgE дополнительно увеличивало Е7-специфический ответ (фиг. 9В). Со временем устойчивые иммунные ответы наблюдали для всех трех аденовирусных векторов, которые кодировали оригинальные молекулы в соответствии с на- 24 035461 стоящим изобретением, а наивысший ответ после иммунизации соответствовал самым высоким ответам в течение всего эксперимента.
Можно сделать вывод, что ответы, которые индуцируются оригинальной конструкцией, которая дополнительно включает N-концевой Е2, могут быть увеличены путем добавления определенных последовательностей, например лидерной последовательности IgE, которые нацеливают кодируемый белок на конкретные клеточные компартменты.
Клеточный иммунный ответ в отношении пептида по настоящему изобретению можно индуцировать различными типами аденовирусных векторов. В предыдущем эксперименте авторы настоящего изобретения использовали векторы Ad35, а в эксперименте на фиг. 10 мышей иммунизировали аденовирусным вектором Ad26, экспрессирующим E2E6E7SH. Из данных видно, что иммунизация с помощью вакцины на основе Ad26 также индуцировала Е7-специфические Т-клетки. Кроме того, из результатов видно, что вторая иммунизация с помощью аденовирусного вектора Ad35, экспрессирующего E2E6E7SH, дополнительно усиливала клеточный иммунный ответ (фиг. 10).
Пример 4. Иммуногенность оригинальных конструкций у макаков-резус.
Для оценки способности аденовирусных векторов, экспрессирующих оригинальную последовательность по настоящему изобретению, индуцировать иммунные ответы у приматов, отличных от человека, макаков-резус иммунизировали при помощи внутримышечной инъекции аденовекторов (Ad26), экспрессирующих E2E6E7SH, или аденовекторов, не кодирующих трансген (пустых), с дозой, составляющей 1х 1011 vp. Через восемь недель после иммунизации иммунные ответы усиливали посредством иммунизации векторами Ad26, экспрессирующими тот же антиген. На 16 неделе животные получали еще одну инъекцию, содержащую векторы Ad35, экспрессирующие тот же антиген. Образцы крови брали на нескольких моментах времени, а выделенные белые клетки крови стимулировали в течение ночи пулами пептидов, соответствующими Е2, Е6 или Е7 HPV16. Специфические ответы оценивали с помощью ZFNy ELISPOT. Данные представлены на фиг. 11. Кроме того, на 10 и 18 неделе после первичной иммунизации оценивали клеточный иммунный ответ, специфичный в отношении пептидов, охватывающих новые сочетания в настоящем изобретении. Индукция ответа IFNy у всех животных была ниже предела обнаружения, составляющего <50 SFU на 1 х 106 РВМС (данные не показаны).
Из данных видно, что иммунизация приматов, отличных от человека, с помощью Ad26.HPV16E2E6E7SH приводила к клеточным иммунным ответам в отношении всех трех белков HPV16, которые присутствуют в кодируемом трансгене, но не в отношении новых сочетаний. Ответы могут быть усилены за счет дополнительной иммунизации с помощью Ad26.HPV16-E2E6E7SH, а дополнительная бустерная доза на 16 неделе с соответствующим вектором Ad35 дополнительно увеличивала иммунные ответы, специфичные в отношении Е2, Е6 и Е7 HPV16.
Позднее введение на 72 неделе бустерной дозы Ad26.HPV16-E2E6E7SH снова приводило к увеличению клеточного иммунного ответа в отношении HPV16, который спадал через несколько недель (не показан).
В отдельном эксперименте (не показан) макаков-резус иммунизировали путем внутривлагалищного введения комбинации двух аденовирусных векторов, один из которых экспрессирует E6E7SH HPV16, а другой - белок L1 HPV16. Низкие, но обнаруживаемые клеточные ответы измеряли в периферических мононуклеарных клетках крови как в отношении Е6, так и в отношении Е7. В этих экспериментах были выявлены сильные клеточные иммунные ответы в отношении L1.
Пример 5. Терапевтическая эффективность на мышиной модели опухоли.
Полипептид по настоящему изобретению способен индуцировать HPV16-специфический клеточный иммунный ответ у животных, который может оказывать терапевтический эффект на клетки, экспрессирующие Е6 и/или Е7 HPV16. Терапевтическую иммунизацию, т.е. иммунизацию после начала роста опухоли, можно применять для демонстрации эффективности варианта терапевтической вакцины против HPV. Терапевтический эффект векторов Ad26 и Ad35 исследовали на мышах, которым инъецировали клетки ТС-1 (клетки мыши, экспрессирующие Е6 и Е7 HPV16) (Lin et al., 1996, Cancer Res 56: 216). Клетки ТС-1 образуют солидную опухоль в течение от нескольких дней до недель после подкожной инъекции мышам. Без вакцины опухоли быстро росли и достигали предопределенного размера, составляющего 1000 мм3, в течение 30 дней (секции D и Е). После достижения данного размера мышей умерщвляли по соображениям этики.
Вместе с иммунизацией по схеме прайм-буст при помощи SLP (использованные в качестве положительного контроля; Kenter et al., 2009, N Engl J Med 361:1838-47; Zwaveling et al., 2002, J Immunol 169:350-8) или аденовирусных векторов, экспрессирующих HPV16-E2E6E7SH, наблюдали заметное снижение роста опухолей, индуцированных ТС-1 (фиг. 12, секции В и С). Более детальное изучение первых 30 дней после первичных иммунизаций (секции F и G) показывает, что иммунизация аденовекторами, экспрессирующими E2E6E7SH, характеризуется существенно большим воздействием на рост опухолей, чем иммунизация при помощи SLP. Начальная скорость роста является намного более низкой, и в большинстве случаев опухоли сжимались. У 3 из 11 мышей, иммунизированных аденовирусными векторами, опухоли были полностью устранены, что отображено на графике выживания (секция Н).
- 25 035461
В заключение, иммунизация аденовирусными векторами, экспрессирующими полипептид по настоящему изобретению, значительно снижала рост опухолей или полностью устраняла установившиеся опухоли в общепринятой модели контрольного заражения для рака, индуцированного HPV16.
Пример 6. Применение репрессорных систем для улучшения продуктивности и генетической стабильности аденовирусных векторов, экспрессирующих антигены, полученные из HPV.
Ранее сообщалось, что трансгены, помещенные в аденовирусные векторы под контролем сильных конститутивно активных промоторов, могут, в зависимости от свойств трансгенного продукта, отрицательно воздействовать на продукцию векторов (Yoshida & Yamada, 1997, Biochem Biophys Res Commun 230:426-30; Rubinchik et al., 2000, Gene Ther 7:875-85; Matthews et al., 1999, J Gen Virol 80:345-53; Edholm et al., 2001, J Virol 75:9579-84; Gall et al., 2007, Mol Biotechnol 35:263-73). Примеры затруднений в отношении продуктивности векторов, зависящей от трансгенов, включают недостаточные спасение и рост векторов, низкие конечные выходы векторов и в ряде случаев быстрое увеличение количества вирусных мутантов с дефектными кассетами трансгена. Для решения этих затруднений при помощи множества исследований изучали возможность подавления экспрессии трансгенов векторов во время репликации векторов в клетках-продуцентах (Matthews et al., 1999, J Gen Virol 80:345-53; Edholm et al. , 2001, J Virol 75:9579-84; Gall et al., 2007, Mol Biotechnol 35:263-73; Cottingham et al., 2012, Biotechnol Bioeng 109:71928; Gilbert et al., 2014, J Virol Methods 208:177-88). В связи с этим, в случае Ad-векторов ранее внедряли различные репрессорные системы, и в самом деле было показано, что они улучшают продуктивность векторов и генетическую стабильность векторов, кодирующих различные типы (ингибиторных) трансгенов.
Обнаружили, что у некоторых из аденовирусных векторов, описанных в данном документе, а также у некоторых других аденовирусных векторов, кодирующих определенные варианты антигенов HPV, проявлялись некоторые из затруднений в отношении продуктивности векторов, зависящей от трансгенов, описанных выше, и, таким образом, их возможно можно дополнительно улучшать в этом отношении. Авторы настоящего изобретения, таким образом, желали изучить, может ли применение систем для репрессии экспрессии трансгенов векторов улучшить характеристики продукции Ad-векторов, экспрессирующих антигены, полученные из HPV, как те, что описаны в данном документе. С этой целью авторы настоящего изобретения внедряли две существующие системы репрессора-оператора, т.е. TetR/TetO (Yao & Eriksson, 1999, Hum Gene Ther 10:419-22, EP0990041B1) и CymR/CuO (Mullick et al., 2006, BMC Biotechnol 6:43), в платформу аденовирусного вектора по настоящему изобретению. Как систему TetR/TetO, так и систему CymR/CuO ранее применяли другие исследователи для улучшения продуктивности аденовирусных векторов посредством сайленсинга трансгенов векторов во время репликации векторов (Gall et al., 2007, Mol Biotechnol 35:263-73; Cottingham et al., 2012, Biotechnol Bioeng 109:719-28; Gilbert et al., 2014, J Virol Methods 208:177-88). Внедрение этих двух систем включало выработку аденовирусных векторов, экспрессирующих гены, представляющие интерес, под контролем промоторов CMV, содержащих последовательность либо TetO, либо CuO. Более того, внедрение предусматривало получение линий клеток, стабильно экспрессирующих соответствующие родственные репрессорные белки (т.е. TetR или CymR).
Получали несколько векторов на основе Ad26 и Ad35 с удаленным Е1, в которых последовательности, кодирующие гетерологичные полипептиды, были функционально связаны с промотором CMV, содержащим последовательности либо оператора TetO, либо опрератора CuO. Вначале определенные последовательности, содержащие либо TetO, либо CuO (SEQ ID NO:11 и SEQ ID NO:12 соответственно) вставляли возле сайта инициации транскрипции (TSS) промотора CMV (SEQ ID NO:13) плазмид pAdapt26 и pAdapt35.Bsu (Abbink et al., 2007, J Virol 81:4654-63; Havenga et al., 2006, J Gen Virol 87:213543). Последовательности, содержащие оператор, вставляли в точно те же положения промотора CMV, как было ранее описано для двух систем (Yao & Eriksson, 1999, Human Gene Ther 10:419-22; EP0990041B1; Mullick et al., 2006, BMC Biotechnol 6:43; EP1385946B1). В частности, сходные с TSS (как первоначально установлено; Stenberg et al., 1984, J. Virol. 49: 190-9), последовательности, содержащие TetO и CuO, вставляли непосредственно ниже положений -20 и +7 соответственно. В SEQ ID NO:13 эти два положения соответствуют положениям 716 и 742 соответственно. Полученные промоторы CMV, содержащие операторы, называют соответственно CMVTetO и CMVCuO. Далее различные трансгены включали ниже (модифицированных) промоторов CMV полученных конструкций с использованием сайтов рестрикции HindIII и XbaI. Эти трансгены включали гены, кодирующие белок слияния зеленого флуоресцентного белка и люциферазы (GFP-Luc), LSE2E6E7SH из настоящего изобретения и другой полипептид с определенным сходством с LSE2E6E7SH (конструкцию, называемую в данном примере HPVAg). HPVAg содержит ту же самую лидерную последовательность, как и присутствующая в LSE2E6E7SH, а также последовательности Е2, Е6 и Е7 HPV16. С применением способов, которые описаны в данном документе, полученные модифицированные плазмиды pAdapt26 и pAdapt35.Bsu использовали для получения аденовирусных векторов, экспрессирующих вышеупомянутые репортер и трансгены HPV под контролем промотора либо CMVTetO, либо CMVCuO.
Линии клеток, экспрессирующих либо TetR, либо CymR, получали путем стабильной трансфекции клеток PER.C6® с использованием соответственно плазмиды pcDNA™6/TR (LifeTechnologies, V1025-20)
- 26 035461 и производного pcDNA™6/TR, у которых последовательность, кодирующая TetR (SEQ ID NO:14, которая кодирует полипептид SEQ ID NO:15), заменена на кодон-оптимизированную последовательность, кодирующую CymR (SEQ ID NO:16, которая кодирует полипептид SEQ ID NO:17). Получение стабильных линий клеток выполняли в основном, как описано у поставщика pcDNA™6/TR, с использованием анализа, основанного на временной трансфекции, для скрининга в отношении клонов клеток, способных репрессировать экспрессию генов, которые находятся под управлением CMVTetO или CMVCuO. Полученные линии клеток PER.C6/TetR и PER.C6/CymR анализировали в отношении их способности репрессировать экспрессию трансгена во время репликации векторов в этих клетках. Из экспериментов, проводимых с векторами, экспрессирующими GFP-Luc под контролем промоторов CMV, содержащих операторы, видно по меньшей мере 10-кратное снижение экспрессии гена люциферазы на протяжении полного цикла репликации вируса в линиях клеток, экспрессирующих репрессор, соответствующий соответственным последовательностям оператора (данные не показаны). Это подтверждает то, что линии клеток PER.C6/TetR и PER.C6/CymR были способны репрессировать экспрессию трансгена вектора в случае репликации аденовирусных векторов.
Эффект опосредованной TetR и CymR репрессии экспрессии трансгена аденовектора на выходы векторов изучали в отношении векторов на основе Ad35, экспрессирующих HPVAg (фиг. 13А). С этой целью линии клеток PER.C6, PER.C6/TetR и PER.C6/CymR, высеянные при 3х 105 клеток на лунку в лунки 24-луночного планшета, подвергали инфицированию в четырех параллельных анализах - по 1000 вирусных частиц на клетку и на протяжении 3 ч - при помощи векторов, экспрессирующих HPVAg из либо промотора CMVTetO, либо промотора CMVCuO. В качестве контролей проводили параллельные инфицирования соответствующими векторами, экспрессирующими GFP-Luc вместо HPVAg. Через четыре дня после инфицирования неочищенные вирусные лизаты получали, подвергая содержимое лунок (т.е. инфицированные клетки и среду) двум циклам замораживания-размораживания. Титры аденовекторов последовательно определяли при помощи протокола, основанного на количественной ПЦР, специфичной к последовательности гексонов Ad35, при котором используют очищенный вектор Ad35 с известным титром вирусных частиц в качестве стандарта. Из результатов видно, что векторы Ad35, кодирующие HPVAg, содержащие как TetO, так и CuO, в сравнении с контрольными векторами, экспрессирующими GFP-Luc, проявляли сниженные выходы векторов для нормальных клеток PER.C6. Для сравнения, при получении в клетках, экспрессирующих их родственные репрессоры (т.е. TetR и CymR соответственно), те же самые векторы давали выходы такие же высокие, как и те, что получены с контрольными векторами. Из этих данных видно, что репрессия экспрессии трансгена во время продукции векторов в клеткахпродуцентах может быть выгодной для продуктивности векторов Ad35, переносящих HPVAg в качестве трансгена.
Эффект того, что репрессия экспрессии трансгена аденовектора может влиять на выходы векторов, также изучали для векторов, полученных из аденовируса серотипа 26 (Ad26) (фиг. 13В). В анализе, выполненном, по сути, как описано выше для векторов Ad35, векторы Ad26, несущие трансгены, контролируемые промотором CMVTetO, кодирующие либо GFP-Luc, HPVAg либо LSE2E6E7SH, использовали для инфицирования клеток PER.C6 и PER.C6/TetR при 1500 вирусных частицах на клетку. Через три дня области инфицирования собирали и титры вирусных частиц определяли при помощи способа, основанного на количественной ПЦР, специфичной к последовательности гексонов Ad26. Из результатов видно, что для клеток PER.C6 выходы векторов, кодирующих HPVAg и LSE2E6E7SH, являются более низкими, чем наблюдаемые для контрольных векторов, кодирующих GFP-Luc. В противоположность этому, для клеток PER.C6/TetR оба эти вектора показали титры, которые являются такими же высокими, как и те, что получали для контрольного вектора. Вместе с результатами выше (для векторов Ad35) из этих данных видно, что репрессия экспрессии трансгена во время продукции аденовектора повышает выходы векторов, экспрессирующих HPVAg и LSE2E6E7SH.
Авторы настоящего изобретения наблюдали существенные затруднения, касающиеся генетической стабильности аденовирусного вектора, который нес трансген для HPVAg, управляемый промотором CMV. Например, было обнаружено, что после нескольких циклов пассирования данного вектора в PER.C6 большая часть популяции вектора состояла из мутантного вектора, который характеризовался крупной делецией в последовательности, кодирующей HPVAg (данные не показаны).
Авторы настоящего изобретения полагали, что использование репрессорной системы экспрессии трансгена, как, например, одной из двух, описанных выше, может предотвратить затруднения в отношении генетической стабильности, связанные с трансгенами, как, например, HPVAg, которые являются ингибиторными для роста векторов. Чтобы изучить это, векторы на основе Ad35 с экспрессией HPVAg, управляемой промотором CMVCuO, оценивали в отношении стабильности кассеты трансгена при росте вектора либо в клетках PER.C6, либо в клетках PER.C6/CymR (фиг. 14). Коротко, ДНК вектора трансфицировали в две различные линии клеток и полученным вирусным бляшкам обеспечивали возможность роста под агарозным слоем. Для каждой из двух трансфекций выделяли пять вирусных бляшек и дополнительно раздельно пассировали в той же линии клеток (т.е. в той же, которую использовали для трансфекций) в течение десяти последовательных вирусных пассажей. Целостность трансгена оценивали с
- 27 035461 помощью ПЦР-амплификации кассеты трансгена при вирусном пассаже номер десять (VPN10) и последующего анализа полученных продуктов ПЦР при помощи гель-электрофореза и секвенирования по Сэнгеру. В дополнение, в VPN7 пассированные вирусные клоны оценивали в отношении их способности экспрессировать HPVAg. Это осуществляли с использованием пассированых вирусных изолятов для инфицирования клеток А549 при 1000 вирусных частицах на клетку, с лизисом клеток через 48 ч после инфицирования и последующим анализом экспрессии HPVAg при помощи вестерн-блоттинга с использованием моноклонального антитела, направленного против Е7 HPV16 (Santa-Cruz Biotechnology). Из результатов анализов гель-электрофореза и секвенирования видно, что каждый из всех пяти вирусных изолятов, которые пассировали в PER.C6, характеризовались либо небольшими делециями со сдвигом рамки считывания, либо мутациями с образованием преждевременного стоп-кодона в пределах кассеты трансгена. Для сравнения, такие делеции или мутации нельзя выявить ни в одном из изолятов векторов, которые пассировали в линии клеток, экспрессирующей CymR (PER.С6/CymR). В соответствии с этими данными все размноженные в PERO6/CymR изоляты векторов были способны экспрессировать HPVAg, в то время как векторы, выращенные в PER.C6, полностью утрачивали эту способность, что позволяет предположить наличие дефектных кассет трансгена для этих векторов. В заключение, из данных авторов настоящего исследования видно, что использование репрессорной системы, как, например, системы CymR/CuO, для репрессии экспрессии трансгена вектора в ходе размножения вектора является эффективным средством для предотвращения серьезной нестабильности кассеты трансгена, как, например, той, которую наблюдали для векторов, несущих трансген, экспрессирующий HPVAg.
- 28 035461
Ссылки.
Abbink Р, Lemckert AA, Ewald BA, Lynch DM, Denholtz M, Smits S, Holterman L, Damen I, Vogels R, Thorner AR, O'Brien KL, Carville A, Mansfield KG, Goudsnit J, Havenga MJ, Barouch DH (20Э7) Comparative seroprevalence and immunogenicity of six rare serotype recombinant adenovirus vaccine vectors from subgroups В and Ii. J V:rol 81:4654-4663
Ausubcl ΞΊ4 (1995) Short protocols in molecular biology: a compendium of methods from Current protocols In molecular biology. Wiley, [Cnichester]
Cottingham MG, Carrell l·', Morris GJ, Turner AV, Vaughan AM, Kapulu MC, Colloca S, Srani L, Gilbert SC, Hill AV (2012) Preventing spontaneous genetic, rearrangements in the transgene cassettes of adenovirus vectors. Biotechnol Bioeng 109:719-728
Daayana S, Elkord E, Winters U, Pawlita M, Roden R, Stern PL, Kitchener EC (2010) Phase II trial of imiquimed and HPV therapeutic vaccination in patients with vulval intraepithelial neoplasia. Br J Cancer 102:1129-1136 de Jong A, van der Burg SH, Kwappenberg KM, van der Hulst JM, Franken KL, Geluk A, van Meijgaarden KE, Drijfhout JW, Kenter C, Vermeij F, Melief CJ, Offringa. R (20C2) Frequent detection of human papillomavirus 16 E2-specific T-helper immunity in healthy subjects. Cancer Res 62:472-479
Edholm D, Mol in M, Bajak E, Akusjarvi G (2001) Adenovirus vector designed for expression of toxic proteins. J Virol 75;9579-9584
Evans RK, Nawrocki DK, Isopi LA, Williams DM, Casimiro DR, Chin S, Chen M, Zhu DM, Shiver JW, Volkin DB (2004) Development of stable liquid formulations for adenovirus-based vaccines. J Pharr Sci 93:2458-2475
Fallaux FJ, Bout A, van dor Voice I, van don Wol_onbcrg DJ, Heii I r KM, Keegan C, Auger C, Cramer SJ, van Ormondl H, van der Eb AJ, Valerio D, Hocbcn RC (1998) New helper colls and matched
- 29 035461 car_y region 1-dolotcd adenovirus vectors prevent generation of replication-competent adenoviruses. Hum Gene Ther 9d9C9-1917
Frokjaar S, Hovgaard L (2000) Pharmaceutical formu_ation development. c:f peptides and praLeins. Taylor & Francis, London
Ga'. 1 JG, Ilizarova A, ELLyRedcy D, McVey Zuber M, Kovesd i T, Aughtman B, ting CR, Brcugn RF. (20(17) Rescue and production of vaccine and therapeutic adenovirus vectors expressing inhibitory transgenes. Mc_ Biotecnnc_ 35:263-273
Gao GP, Zngdahl RK, Wilson JM (2C00) A coll lino for highyic_d production of El-dclotcd adenovirus vectors wiehour eho emergence of replication-competent virus. Hum C-ene Ther 11:213219
Gennaro AR (1990) Remington's pharmaceutical sciences. Mack
Gilbert R, Gullbadt C, Gagnon D, Bernier A, Bourget. L, Elahi SM, Kamen A, Massie В (2014) Establishment and validation of new complementing cells for production of El-del eted adenovirus vectors in serum-free suspensdn culture. J Virol Methods 206:177-180
Harald 0, Carvajal RD (2013) And-programmed death-1 and anti-prograrmed death-ligand 1 andcdics in cancer therapy. Expert Opir. Biol Ther 13:847-861
Harlow E, Lane D (1988) Antibodies: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, New York
Havenga M, Vogels R, Zdjdgeest D, Radosevic K, Mueller S, Sieuwerts M, Weichold F, Ramen T, Kaspers J, Lemckert A, van Meerendonk M, van der Vlugt. R, Hodman. T., Hone R, S<eiky Y, Mintardjo R, Gillissen G, Barouch D, Sadoff J, Goudsmit C (2006) Novel replication-incompetent adenoviral В-group vectors: high vector stability and yield in FER.C6 cells. J Gon Virol 87:21352143
Henken FE, Oosterhuis K, Ohlschlager P, Bosch L, Hodjberg Σ, Haanen IB, Steenbergen RD (2012) Preclinical safety evaluation of DNA vaccines encoding modified HPVle E6 and E7. Vaccine 30:4259-4266
Hi Idesnein A, Herrero R, Wacnolde'·· S, Rodrigues. AC, Solomon E, Bratti MC, Schiller JT, Gonza_ez P, Dubin G, Porras C,
- 30 035461
Cimenez Sil, Lowy DR (2007) Effect of human papillomavirus 26/18
Ll viruslike particle vaccine among young women with preexisting infection: a randomized trial. JAMA 298:743-753
Hocanson DR, Ma JC, Asato L, Ong M, Printz MA, Huyghe BO, Sosnowshi ЗА, D'Andrea MJ (2002) Development of a stable adenoviral vector formulation. Bioprocess J 1:43-48
Hoof I, Peters B, Sidney J, Pedersen LE, Sette A, Lund 0, Buus S, Nielsen M (2009) KetMHCpan, a method for MHC class I binding prediction beyond humans. Tirmunogeneti cs 61:1-13
Horwitz MS (1996) Adenoviruses. B: Fields BN, Knipe DM, Baines JD (eds) Virology. Raven Press LLd, New York
Renter GG, Welters MJ, Valentijn AR, Lowik MJ, 3erends-van der Meer DM, Vloon AP, Essahsah F, Fathers LM, Offringa R, Drijfhout JW, Wafclman AR, Oostondorp J, Flcurcn GJ, van dcr Burg SH, Melief CJ (2009) Vaccination against HPV-16 oncoproteins for vulvar intraepithelial neoplasia. N Engl J Med 361 :1838-18 47
Kibbe All (2000) Handbook of pharmaceutical excipients. Pharmaceutical Press, London
Kovesdi I, Hedley SJ (2C10) Adenoviral producer cells. Viruses 2:1681-1703
Lin KY, Guarnieri EG, Staveley-0'Carroll RE, Levitsky HI, August JT, Pardoll DM, Wu TC (1996) Treatment of established tumors with a novel vaccine that enhances major histocompatibility class II presentation of tumor antigen. Cancer Res 56:21-26
Lundegaard C, Lamberth K, Harndah_ M, 3uus Ξ, Lund 0, Nielsen M (2008) NetMHC-3.0: accurate web accessible predictions of human, mouse and monkey MHC class T affinities for peptides of lengt.n 8-11. Nucleic Acids Res 36:W509-512
Massimi F, Banks L (2005) i'ransforma Lion Assays for HFV Oncoproteins. B: Davy 0, Dccrbar J (eds) Human Papillomaviruses: Methods and Protocols. Vol 119: Methods in Molecular Medicine Springer, Berlin, pp 381-395
Matthews DA, Cummings D, Evelegh C, Graham FL, Prevec L (1999) Development and use of a 293 cell line expressing lac
- 31 035461 repressor for the rescue of recombinant adenoviruses expressing high levels of rabies virus glycoprotein. J Gen Virol 80 ( Pt
2):345-353
McPherson MJ, Haines 3D, Taylor GR (1995) PCR 2: a practical approach. IRL Press at Oxford University Press, Oxford
Mellman I, Coukos G, Dranoff G (2011) Cancer iimrunctherapy cones of age. Nature 460:480-489
Mulllck. A, Xu Y, Warren R, Ko a Lrouiuani s M, Guilbault C, Broussau S, Malenfanr F, Bourget L, Lamoureux L, Lo R, Caron AW, ₽i_otto A, Massie В (2006) The cumatc gene-switch: a system for regulated expression in mammalian cells. BMC Biocechnol 6:43
Munge-~ K, Phelps WC, Bubo V, Howley PM, Schlegel R (1989) The E6 and E'/ genes of the human papi-lcmavfrus type 16 togetner are necessary and sufficient for transformation of primary human keratinocytes. J Virol 63:4417-4421
Ogun SA, Dumon-Seignovert L, Marchand JB, Holder AA, Hill F (2008) The oligomerization domain of C4-oinding protein (C4bp) acts as an adjuvant, and rhe fusion protein comprised of the 19ki_odalLon meroooiLe surface protein 1 fused with Lhe murine C4bp domain protects mice against malaria. Infect Immun 76:38173823
Oosterhuis K, Aleyd E, Vrijland X, Schumacher TN, Haanen JB (2012a) Rational Design оГ DNA Vaccines for Lhe Induction cP Human Papillomavirus Type 16 E6- and E7-Specific Cynotoxlc TCo_l Responses. Hum Gone Ther 23:1301-1312
Oosterhuis K, Ohlschlager B, van der. Berg JH, Toebes M, Gomez R, Schumacher TN, Haanen JB (2C11) Precl ini cal development of highly effective and safe EKA vaccines directed against HPV 16 E6 and E7. int J Career 129:397-406
Oosterhuis K, van den 3erg JH, Schumacner TN, Haanen JB (2012b) DNA vaccines ana intraderma. vaccination by DNA tattooing. Curr Top Microbiol Immunol 351:221-256
Peters B, Tong W, Sidney J, Sette A, Weng Z (2003) Examining the independent minding assumption for binding of peptide epitopes to MHC-I molecules. Bioinformatics 19:1765-1772
Prakash S3, Grossman SR, Pepinsky RB, Laimins LA, Androphy
- 32 035461
EC (1992) Amino acids necessary for DNA contact and dimerization inply novel ir.ct.ifs in rhe papillomavirus E2 trans-activator.
Genes Dev 6:105-116
Rubinchik S, Ding R, Qin AJ, Zhang F, Dong J (2000) Adenoviral vector which delivers FasL-GFP fusion protein regulated by the Le L-inc.ucible expression system. Gene Ther 7:975-885
Sambrook GFEFMT (1989) Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.
Sedman SA, Barbosa MS, Vass КС, Hubbert KL, Haas JA, Lowy DR, Schiller JT (1991) The full-length E6 protein cf human papillomavirus type 16 has transforming and trans-activating activities and cooperates weth E7 to immortalize keracinocyLes in culture. J Virol 65:4860-4866
Shenk T (1996) Adenovtridae and their Replication. B: Fields BN, Knlpe DM, Baines ND (eds) Virology. Raven Press Ltd, New York
Smahel M, Sima P, Ludvikova V, Vonka V (2001) Modified I'PVl6 E7 Genes as DNA Vaccine against E/-Containing Oncogenic Cells. V_rology 281:231-238 van der Burg SH, Melief GJ (2011) Therapeutic vaccination against human pap'lloma virus induced malignancies. Cu‘--r Opin Immunol 23:252-257
Watson JD (1992) Recombinant DNA. Scientific American Books, New York
Kicking BG, Vermeer DW, Spanos WC, Lee KM, Vermeer P, Lee WT, Xu Y, Gabitzsch ES, Balcaitis S, Balint υΡ, Jr., Jcnes FR, Leo JH (2C12) A non-oncogcnic HPV 16 E6/E7 vaccine enhances treatment ot HPV expressing tumors. Cancer Gene Ther 19:667-6/4
Yau J, Reichenbach DK, Corb_LL N, Hokey DA, Ramanathan MP, McKinney KA, Weiner DB, Sewell D (2009) Induction of antitumor immunity in v_vo following delivery of a novel HPV-16 DNA vaccine encoding an E6/F.7 fusion ant:gen. Vaccine 27:431-440
Yao F, Eriksson E (1999) A novel tetracycline-inducible viral replication switch. Hum Gone Ther 10:419-427
Yoshida Y, Hamada H (1991) Adencvirus-medaated inducible
- 33 035461 gene expression through tetracycline-controllable transaclivaior with nuclear localization signal. Biochen Biophys Res Commun
230:426-430
Yugawa T, Kiyono T (20C9) Molecular mechanisms cf cervical carcinogenesis by high-risk human papillomaviruses: novel functions of E6 and E7 oncoproteins. Rev Med Virol 19:97-113
Zwavcling Ξ, Ferreira Mota SC, Nouta J, Johnson M, Lipford GB, Offringa 3., van der Burg SH, Melief CJ (2002) Established human papillomavirus type 16-expressing tumors are effectively eradicated following vaccination with long peptides. J Inmunol 169:350-350
Последовательности
SEQ ID NO:1 (HPV16-E6E7SH, аминокислотная последовательность оригинального полипептида Е6/Е7 HPV16)
| MFQKRTAMFQ DPQERPRKLP QLCTELQTTI | HDIILECVYC | KQQLEDE1DG | ||
| PAGQAEPERA | EYNIVTFCCK | CDGTLRLCVQ | STHVDIRTLE | 3LLMGTLG1V |
| CPICSQKPGT | TLEQQYNKPL | CDLLIRC1NC | QKPLCPEEKQ | RHLDKKQRFH |
| NTRGRWTGRC | MSCCRSSRTR | RTTQMEGDTP | '’TJTEYMTGTQ | ΡΕΤΤηΤ,ΥΟνΓ. |
| QLNDSSEEED | EIDGFAGQAE | PDRAHYN1VT | FCCQLCTELQ | TTIHDIILEC |
| VYCKQQLLRR | EVYDFAFRDL | CP7YRDGNPY | AVCDKCLKFY | SKISEYREYC |
| YSLYGTTLEQ | QYNRPLCDLL IR: | 2INCQK |
SEQ ID NO:2 (HPV16-E6E7SH, нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность оригинального полипептида Е6/Е7 HPV16)
| ATGCACCA: | GA AACGGACC! | 1C CAGGTTCCAG | GACCCCCAGG | AACGGCCCAG |
| AAAGCTGCCC | CAGCTGCGCA | CCGAGCTGCA | GACCACCArC | CACGACATCA |
| TCCTGGAATG | CGTGTACTGC | AAGCAGCAGC | TGGAAGATGA | GATCGACGGC |
| CCTGCTGGCC | AGGCCGAACC | CGACAGAGCG | CACYACAATA | TCGTGACCTT |
| CTGGTGCAAG | TGCGACAGCA | CCGGGCGGGT | GTGCGGGCAG | AGCACCCACG |
| TGGACACCCG | GACCCTGGAA | GATCGGCTGA | TGGGCACCCT | GGGCATCGTG |
| TGCCCCAmCT | GCAGCCAGAA | GCCCGGCACC | ACCCmGGAAC | AGCAGTACAA |
| CAAGCCCCTG | TGCGACCTOC | TGACCGGTG | CATCAACTGC | CAGAAACCCC |
| TGTGCCCCGA | GGAAAAGCAG | CGGCACCTGG | ACAAGAAGCA | GCGGTTCCAC |
| AACATCCGGG | GCAGATGGAC | AGGCAGATGG | ATGAGCTGCT | GCAGAAGCAG |
| CCGGACCAGA | GGGGAAACCC | AGA^GCACGG | CGACACCCCC | ACCCmGCACG |
| AGTACACGCT | GGACCTGCAG | CCCGAGACAA | CCGACCTGTA | CTGCTACGAG |
| CAGCTGAACG | ACAGCAGCGA | GGAAGAGGAC | GAGATTGACG | GACCCGCTGG |
| ACAGGCCGAG | CCTGACCGGG | CTCACTATAA | CATGGTGACA | TTTTGCTGTC |
| AGCTCTGTAC | TGAACTCCAG | ЛСЛЛСЛЛТТС | ACGATATTAT | TCTCGZiATGT |
| GTGTATTGTA | AACAGCAGCT | CGTGGGGAGA | GAGGTGTACG | ACTTCGCCTT |
| CCGGGAGCTG | TGCATCGTGT | ATCGGGACGG | CAACCCCTAC | GCCGTGTGCG |
| ACAAGTGCCT | GAAGTTCTAC | AGCAAGATCA | GCGAGTACCG | GCACTACTGC |
| TACAGCCTGT | ACGGAACAAC | ACTGGAACAG | CAGTATAACA | AACCACTCTG |
TGATCTGCTG ATTCGCTGTA TCAATTGTCA GAAGTGATAA
- 34 035461
SEQ ID NO:3 (E2E6E7SH HPV16, аминокислотная последовательность оригинального полипептида Е2/Е6/Е7 HPV16)
M^TT.CQRT.NVCaRKTT.TH^ENESTDT.RRHTOYWYHMRT.F.CATYYKRRF.YGFKETNrHQW ΡΤΕΑν3ΚΝ1<ΑΕΰΑ1Ε_ΰΕΤΕΕΊ1 YNSQYSBEKW'i'LGDVSLEVYLTAPTGClKKHGY'i'VEVOEJG DECNTMHYTNWTHIYICEEASVTWEGQVDYYGLYYVHEGZRTYFVQFKDDAEKYSKNKVWEVH AGGQVILCPTSVFSSNEVSSPEIZRQHLANHPAATHTKAVALGTEETQTTIQRPRSEPDTGNPC HTTKLLHRLkSVDSAPILTAFNSSPZKGRINCNSNTTPIVHLKVDANTLMRLRYRFKKHCTLYTAV SSTWHWTGHNVKHKSAIVTLTYDSEWQRDQFLSQVKIPKTZTVSTGFMSIMHQKRTAMFQDPQE RPRKLPQLCTELQTTIHRIILECVYCKQQLEDEIDGPAGGAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLC VQSTIIVDIRTLEDELMGTLGIVCPICSQKPGTTLEQQYNKPLCDLLIRCINCQKPLCPEEKQRII LDKKQRFHNIRGRWTGRCMSCCRSSRTRRETQMHGDTP'TLEEYMLDLQPETTDLYCYEQLNDSS EEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCQLCTELQTTIHDTΞLECVYCKQQLLRREVYDFAFRZA CIVYRDGNPYAVCDKCLKFYSKISEYRHYCYSLYGTTLEQQYNKPLCPLLIRCZNCCK
SEQ ID NO:4 (E2E6E7SH HPV16, нуклеотидная последовательность, кодирующая оригинальный полипептид Е2/Е6/Е7 HPV16)
ATGGAAACCCTGTGCCAGCGGCTGAACGTGTGCCAGGACAAGATCCTGACCCACTACGA GAACGACAGCACCGACCTGCGGGACCACATCGACTACTGGAAGCACATGCGGCTGGAATGCGCC ATCTACTACAAGGCCAGAGAGATGGGCTTCAAGCACATCAACCACCAGGTGGTGCCCACCCTGG CCGTGTCCAAGAACAAGGCCCTGCAGGCCATCGAGCTGCAGCTGACCCTGGAAACCATCTACAA CAGCCAGTACAGCAACGAGAAGTGGACCCTGCAGGACGTGTCCCTGGAAGTGTACCTGACCGCT CCCACCGGCTGCATCAAGAAACACGGCTACACCGTGGAAGTGCAGTTCGACGGCGACATCTGCA ACAC CAT G CAC TAGAC СААС T G GAC С CACAT С TACAT С T GC GAAGAG GC CAG C G T GAC C G T G G T GGAAGGCCAGGTGGACTACTACGGCCTGTACTACGTGCACGAGGGCATCCGGACCTACTTCGTG CAGTTCAAGGACGACGCCGAGAAGTACAGCAAGAACAAAGTGTGGGAGGTGCACGCTGGCGGCC AGGTCATCCTGTGCCCCACCAGCGTGTTCAGCAGCAACGAGGTGTCCAGCCCCGAGATCATCCG GCAGCACCTGGCCAATCACCCTGCCGCCACCCACACAAAGGCCGTGGCCCTGGGCACCGAGGAA ACCCAGACCACCATCCAGCGGCCCAGAAGCGAGCCCGACACCGGCAATCCCTGCCACACCACCA
- 35 035461
AGCTGCTGCACCGGGACAGCGTGGACAGCGCCCCTATCCTGACCGCCTTCAACAGCAGCCACAA GGGCCGGATCAACTGCAACAGCAACACCACCCCCATCGTGCACCTGAAGGTGGACGCCAACACC CTGATGCGGCTGCGGTACAGATTCAAGAAGCACTGCACCCTGTACACCGCCGTGTCCTCCACCT GGCACTGGACCGGCCACAACGTGAAGCACAAGAGCGCCATCGTGACCCTGACCTACGACAGCGA GTGGCAGCGGGACCAGTTCCTGAGCCAGGTCAAAATCCCCAAGACCATCACCGTGTCCACCGGC TTCATGAGCATCATGCACCAGAAACGGACCGCCATGTTCCAGGACCCCCAGGAACGGCCCAGAA AGCTGCCCCAGCTGTGCACCGAGCTGCAGACCACCATCCACGACATCATCCTGGAATGCGTGTA CTGCAAGCAGCAGCTGGAAGATGAGATCGACGGCCCTGCTGGCCAGGCCGAACCCGACAGAGCC CACTACAATATCGTGACCTTCTGCTGCAAGTGCGACAGCACCCTGCGGCTGTGCGTGCAGAGCA CCCACGTGGACATCCGGACCCTGGAAGATCTGCTGATGGGCACCCTGGGCATCGTGTGCCCCAT CTGCAGCCAGAAGCCCGGCACCACCCTGGAACAGCAGTACAACAAGCCCCTGTGCGACCTGCTG ATCCGGTGCATCAACTGCCAGAAACCCCTGTGCCCCGAGGAAAAGCAGCGGCACCTGGACAAGA AGCAGCGGTTCCACAACATCCGGGGCAGATGGACAGGCAGATGCATGAGCTGCTGCAGAAGCAG CCGGACCAGACGGGAAACCCAGATGCACGGCGACACCCCCACCCTGCACGAGTACATGCTGGAC CTGCAGCCCGAGACAACCGACCTGTACTGCTACGAGCAGCTGAACGACAGCAGCGAGGAAGAGG ACGAGATTGACGGACCCGCTGGACAGGCCGAGCCTGACCGGGCTCACTATAACATCGTGACATT TTGCTGTCAGCTCTGTACTGAACTCCAGACAACAATTCACGATATTATTCTCGAATGTGTGTAT TGTAAACAGCAGCTCCTGCGGAGAGAGGTGTACGACTTCGCCTTCCGGGACCTCTGCATCGTGT ATCGGGACGGCAACCCCTACGCCGTGTGCGACAAGTGCCTGAAGTTCTACAGCAAGATCAGCGA GTACCGGCACTACTGCTACAGCCTGTACGGAACAACACTCGAACAGCAGTATAACAAACCACTC TGTGATCTGCTGATTCGCTGTATCAATTGTCAGAAGTGATAA
SEQ ID NO:5 (E6E7E2SH HPV16, аминокислотная последовательность, кодирующая оригинальный полипептид Е6/Е7/Е2 HPV16)
MHQKRTAMFQDPQERPRKLPQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLEDEIDGPAGQAEPDR AHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKPGTTLEQQYNKPLCDL LIRCINCQKPLCPEEKQRHLDKKQRFHNIRGRWTGRCMSCCRSSRTRRETQMHGDTPTLHEYML DLQPETTDLYCYEQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCQLCTELQTTIHDIILECV YCKQQLLRREVYDFAFRDLCIVYRDGNPYAVCDKCLKFYSKISEYRHYCYSLYGTTLEQQYNKP LCDLLIRCINCQKMETLCQRLNVCQDKILTHYENDSTDLRDHIDYWKHMRLECAIYYKAREMGF KHINHQWPTLAVSKNKALQAIELQLTLETIYNSQYSNEKWTLQDVSLEVYLTAPTGCIKKHGY TVEVQFDGDICNTMHYTNWTHIYICEEASVTWEGQVDYYGLYYVHEGIRTYFVQFKDDAEKYS KNKVWEVHAGGQVILCPTSVFSSNEVSSPEIIRQHLANHPAATHTKAVALGTEETQTTIQRPRS EPDTGNPCHTTKLLHRDSVDSAPILTAFNSSHKGRINCNSNTTPIVHLKVDANTLMRLRYRFKK HCTLYTAVSSTWHWTGHNVKHKSAIVTLTYDSEWQRDQFLSQVKIPKTITVSTGFMSI
- 36 035461
SEQ ID NO:6 (E6E7E2SH HPV16, нуклеотидная последовательность, кодирующая оригинальный полипептид Е6/Е7/Е2 HPV16)
ATGCACCAGAAACGGACCGCCATGTTCCAGGACCCCCAGGAACGGCCCAGAAAGCTGCC CCAGCTGTGCACCGAGCTGCAGACCACCATCCACGACATCATCCTGGAATGCGTGTACTGCAAG CAGCAGCTGGAAGATGAGATCGACGGCCCTGCTGGCCAGGCCGAACCCGACAGAGCCCACTACA ATATCGTGACCTTCTGCTGCAAGTGCGACAGCACCCTGCGGCTGTGCGTGCAGAGCACCCACGT GGACATCCGGACCCTGGAAGATCTGCTGATGGGCACCCTGGGCATCGTGTGCCCCATCTGCAGC CAGAAGCCCGGCACCACCCTGGAACAGCAGTACAACAAGCCCCTGTGCGACCTGCTGATCCGGT GCATCAACTGCCAGAAACCCCTGTGCCCCGAGGAAAAGCAGCGGCACCTGGACAAGAAGCAGCG GTTCCACAACATCCGGGGCAGATGGACAGGCAGATGCATGAGCTGCTGCAGAAGCAGCCGGACC AGACGGGAAACCCAGATGCACGGCGACACCCCCACCCTGCACGAGTACATGCTGGACCTGCAGC CCGAGACAACCGACCTGTACTGCTACGAGCAGCTGAACGACAGCAGCGAGGAAGAGGACGAGAT TGACGGACCCGCTGGACAGGCCGAGCCTGACCGGGCTCACTATAACATCGTGACATTTTGCTGT CAGC T С T GTAC T GAAC T С CAGACAACAAT T CAC GATAT TAT T С T C GAAT GTGTGTATT GTAAAC AGCAGCTCCTGCGGAGAGAGGTGTACGACTTCGCCTTCCGGGACCTCTGCATCGTGTATCGGGA CGGCAACCCCTACGCCGTGTGCGACAAGTGCCTGAAGTTCTACAGCAAGATCAGCGAGTACCGG CACTACTGCTACAGCCTGTACGGAACAACACTCGAACAGCAGTATAACAAACCACTCTGTGATC TGCTGATTCGCTGTATCAATTGTCAGAAGATGGAAACCCTGTGCCAGCGGCTGAACGTGTGCCA GGACAAGATCCTGACCCACTACGAGAACGACAGCACCGACCTGCGGGACCACATCGACTACTGG AAGCACATGCGGCTGGAATGCGCCATCTACTACAAGGCCAGAGAGATGGGCTTCAAGCACATCA ACCACCAGGTGGTGCCCACCCTGGCCGTGTCCAAGAACAAGGCCCTGCAGGCCATCGAGCTGCA GCTGACCCTGGAAACCATCTACAACAGCCAGTACAGCAACGAGAAGTGGACCCTGCAGGACGTG TCCCTGGAAGTGTACCTGACCGCTCCCACCGGCTGCATCAAGAAACACGGCTACACCGTGGAAG TGCAGTTCGACGGCGACATCTGCAACACCATGCACTACACCAACTGGACCCACATCTACATCTG CGAAGAGGCCAGCGTGACCGTGGTGGAAGGCCAGGTGGACTACTACGGCCTGTACTACGTGCAC GAGGGCATCCGGACCTACTTCGTGCAGTTCAAGGACGACGCCGAGAAGTACAGCAAGAACAAAG TGTGGGAGGTGCACGCTGGCGGCCAGGTCATCCTGTGCCCCACCAGCGTGTTCAGCAGCAACGA GGTGTCCAGCCCCGAGATCATCCGGCAGCACCTGGCCAATCACCCTGCCGCCACCCACACAAAG GCCGTGGCCCTGGGCACCGAGGAAACCCAGACCACCATCCAGCGGCCCAGAAGCGAGCCCGACA CCGGCAATCCCTGCCACACCACCAAGCTGCTGCACCGGGACAGCGTGGACAGCGCCCCTATCCT GACCGCCTTCAACAGCAGCCACAAGGGCCGGATCAACTGCAACAGCAACACCACCCCCATCGTG CACCTGAAGGTGGACGCCAACACCCTGATGCGGCTGCGGTACAGATTCAAGAAGCACTGCACCC TGTACACCGCCGTGTCCTCCACCTGGCACTGGACCGGCCACAACGTGAAGCACAAGAGCGCCAT CGTGACCCTGACCTACGACAGCGAGTGGCAGCGGGACCAGTTCCTGAGCCAGGTCAAAATCCCC AAGACCATCACCGTGTCCACCGGCTTCATGAGCATCTGATAA
SEQ ID NO:7 (аминокислотная последовательность лидерного пептида IgE)
MDWTWIL FLVAAAT RVHS
SEQ ID NO:8 (нуклеотидная последовательность, кодирующая лидерный пептид IgE) ATGGACTGGACCTGGATCCTGTTCCTGGTGGCTGCCGCAACCCGGGTGCACAGC
SEQ ID NO:9 (аминокислотная последовательность лидерного пептида аа HAVT20) MACPGFLWALVISTCLEFSMA
SEQ ID NO:10 (нуклеотидная последовательность, кодирующая лидерный пептид HAVT20)
ATGGCCTGCCCCGGCTTTCTGTGGGCCCTGGTCATCAGCACCTGTCTGGAATTCAGCAT
GGCC
SEQ ID NO:11 (2xTetO-содержащая последовательность)
GAGCTCTCCCTAT CAG Т G AT AGAG АТ С Т С С С Т АТ С AG Т GAT AGAGAT С G Т С GAC
- 37 035461
SEQ ID NO:12 (CuQ-содержащая последовательность)
AACAAACAGACAATСTGGTСTGTTTGTA
SEQ ID NO:13 (промотор CMV, присутствующий в плазмидах pAdApt26 и pAdApt35)
TCAATATTGGCCATTAGCCATATTATTCATTGGTTATATAGCATAAATCAATATTGGCT
AT T GGCCAT T G CATAC GTTGTATC CATAT CATAATAT G TACAT T TATAT T G GC T CAT G T CCAAC AT TAC CGC CAT GTT GACAT T GAT TAT T GAC TAG T TAT TAATAG TAAT CAAT TAC GG G G T CAT TA GTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGAC CGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGG GACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAA GTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATT ATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGC TATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGG GGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGG ACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTG GGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGC TGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGCGGCCGGGAACGGTGCATTG GA
SEQ ID NO:14 (TetR, нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность полипептида TetR, экспрессируемого pcDNA™6/TR)
ATGTCTAGATTAGATAAAAGTAAAGTGATTAACAGCGCATTAGAGCTGCTTAATGAGGT CGGAATCGAAGGTTTAACAACCCGTAAACTCGCCCAGAAGCTAGGTGTAGAGCAGCCTACATTG TATTGGCATGTAAAAAATAAGCGGGCTTTGCTCGACGCCTTAGCCATTGAGATGTTAGATAGGC ACCATACTCACTTTTGCCCTTTAGAAGGGGAAAGCTGGCAAGATTTTTTACGTAATAACGCTAA AAGTTTTAGATGTGCTTTACTAAGTCATCGCGATGGAGCAAAAGTACATTTAGGTACACGGCCT ACAGAAAAACAGTAT GAAAC Т С Т С GAAAATСAAT TAGCCTTTTTATGC СAACAAGG Т Т Т Т ТСАС TAGAGAATGCATTATATGCACTCAGCGCTGTGGGGCATTTTACTTTAGGTTGCGTATTGGAAGA Т СAAGAGCАТ СAAG Т С G С ТAAAGAAGAAAGGGAAACАС С ТАС ТAC TGATAGTATGCCGC CAT ТА TTACGACAAGCTATCGAATTATTTGATCACCAAGGTGCAGAGCCAGCCTTCTTATTCGGCCTTG AATTGATCATATGCGGATTAGAAAAACAACTTAAATGTGAAAGTGGGTCCGCGTACAGCGGATC ССGGGAATТСAGАТСТТАТТАА
SEQ ID NO:15 (TetR, аминокислотная последовательность полипептида TetR, экспрессируемого pcDNA™6/TR)
MSRLDKSKVINSALELLNEVGIEGLTTRKLAQKLGVEQPTLYWHVKNKRALLDALAIEM LDRHHTHFCPLEGESWQDFLRNNAKSFRCALLSHRDGAKVHLGTRPTEKQYETLENQLAFLCQQ GFSLENALYALSAVGHFTLGCVLEDQEHQVAKEERETPTTDSMPPLLRQAIELFDHQGAEPAFL FGLELIICGLEKQLKCESGSAYSGSREFRSY
- 38 035461
SEQ ID NO:16 (CymR, нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность полипептида CymR)
ATGTCTCCCAAACGACGGACTCAAGCGGAAAGGGCAATGGAAACTCAGGGTAAGCTGAT
TGCCGCGGCTCTGGGAGTGCTGCGAGAGAAAGGGTATGCCGGGTTTCGCATAGCCGACGTTCCT
GGAGCTGCAGGCGTAAGCAGAGGAGCCCAATCTCATCACTTTCCGACCAAGCTGGAGCTTTTGC
TGGCTACCTTCGAATGGCTGTACGAGCAGATCACGGAAAGGAGTCGTGCTAGGCTGGCCAAGCT
GAAACCCGAGGATGATGTCATTCAGCAGATGCTGGACGATGCAGCCGAGTTCTTCCTGGACGAC
GACTTCAGCATCAGTCTCGACCTCATCGTAGCCGCAGATCGCGATCCAGCTTTGCGCGAGGGCA
TACAGAGAACAGTCGAGCGGAATCGGTTTGTGGTGGAGGACATGTGGCTTGGTGTTCTGGTGAG
CAGAGGCCTCTCACGGGATGATGCCGAGGACATCCTGTGGCTGATCTTTAACTCCGTCAGAGGG
ТТGGCAGTGAGGTСССТТТGGCAGAAGGACAAAGAACGGTТТGAACGTGTGCGAAACТСААСАС
TCGAGATTGCTAGGGAACGCTACGCCAAGTTCAAGAGATGA
SEQ ID NO:17 (CymR, аминокислотная последовательность полипептида CymR)
MSPKRRTQAERAMETQGKLIAAALGVLREKGYAGFRIADVPGAAGVSRGAQSHHFPTKL
ELLLATFEWLYEQITERSRARLAKLKPEDDVIQQMLDDAAEFFLDDDFSISLDLIVAADRDPAL
REGIQRTVERNRFWE DMWLGVLVSRGL S RDDAE DILWLIFNSVRGLAVRS LWQKDKER FERVR
NSTLEIARERYAKFKR
SEQ ID NO:18 (E6 HPV16, а.к. 41-65)
KQQLLRREVYDFAFRDLCIVYRDGN
SEQ ID NO:19 (E7 HPV16, а.к. 43-77)
GQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIR
Claims (17)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид HPV16 E6E7SH, содержащий SEQ ID NO:1.
- 2. Молекула нуклеиновой кислоты по п.1, где кодируемый полипептид дополнительно содержит лидерную последовательность.
- 3. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп.1 или 2, где кодируемый полипептид дополнительно содержит по меньшей мере один эпитоп белка Е2 вируса папилломы человека (HPV).
- 4. Молекула нуклеиновой кислоты по п.3, где кодируемый полипептид содержит белок Е2 HPV16, который характеризуется делецией или мутацией в своем ДНК-связывающем домене.
- 5. Молекула нуклеиновой кислоты по п.4, где кодируемый полипептид содержит SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:5.
- 6. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-5, где последовательность нуклеиновой кислоты является кодон-оптимизированной.
- 7. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-6, содержащая SEQ ID NO:2.
- 8. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-7, содержащая SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:6.
- 9. Вектор экспрессии, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-8, где последовательность, кодирующая полипептид, функционально связана с промотором.
- 10. Вектор по п.9, где вектор представляет собой рекомбинантный аденовирус.
- 11. Вектор по п.9 или 10, где промотор функционально соединен с репрессорной операторной последовательностью, с которой репрессорный белок может связываться для репрессии экспрессии промотора в присутствии указанного репрессорного белка.
- 12. Композиция вакцины для индукции иммунного ответа в отношении HPV, содержащая вектор по любому из пп.9-11 и фармацевтически приемлемый эксципиент.
- 13. Способ индуцирования иммунного ответа в отношении HPV у пациента, включающий введение пациенту композиции вакцины по п.12.
- 14. Способ по п.13, включающий введение вакцины по п.12 пациенту более одного раза.
- 15. Способ лечения хронической инфекции, вызванной HPV, интраэпителиальной неоплазии вульвы (VIN), интраэпителиальной цервикальной неоплазии (CIN), интраэпителиальной неоплазии влагалища (VaIN), анальной интраэпителиальной неоплазии (AIN), рака шейки матки, такого как плоскоклеточная карцинома шейки матки (SCC), рака ротоглотки, рака полового члена, рака влагалища или рака анального канала у пациента, включающий введение пациенту вакцины по п.12.
- 16. Полипептид HPV16 E6E7SH для индукции иммунного ответа в отношении HPV, содержащий SEQ ID NO:1.
- 17. Полипептид по п.16, содержащий SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:5.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP14191660 | 2014-11-04 | ||
| PCT/EP2015/075516 WO2016071306A1 (en) | 2014-11-04 | 2015-11-03 | Therapeutic hpv16 vaccines |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA201790976A1 EA201790976A1 (ru) | 2017-09-29 |
| EA035461B1 true EA035461B1 (ru) | 2020-06-19 |
Family
ID=52020908
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA201790976A EA035461B1 (ru) | 2014-11-04 | 2015-11-03 | Терапевтические вакцины против hpv16 |
Country Status (33)
| Country | Link |
|---|---|
| US (4) | US9701721B2 (ru) |
| EP (2) | EP3421046A1 (ru) |
| JP (2) | JP6325751B2 (ru) |
| KR (1) | KR20170083562A (ru) |
| CN (1) | CN107075521B (ru) |
| AR (1) | AR102527A1 (ru) |
| AU (2) | AU2015341926B2 (ru) |
| BR (1) | BR112017009177A2 (ru) |
| CA (1) | CA2965562C (ru) |
| CL (1) | CL2017001089A1 (ru) |
| CO (1) | CO2017004838A2 (ru) |
| CY (1) | CY1121377T1 (ru) |
| DK (1) | DK3215187T3 (ru) |
| EA (1) | EA035461B1 (ru) |
| ES (1) | ES2697903T3 (ru) |
| HR (1) | HRP20181895T1 (ru) |
| HU (1) | HUE040440T2 (ru) |
| IL (1) | IL251895B (ru) |
| LT (1) | LT3215187T (ru) |
| MA (2) | MA46378A (ru) |
| MD (1) | MD3215187T2 (ru) |
| MX (1) | MX2017005788A (ru) |
| MY (1) | MY181175A (ru) |
| NZ (1) | NZ730802A (ru) |
| PL (1) | PL3215187T3 (ru) |
| PT (1) | PT3215187T (ru) |
| RS (1) | RS58080B1 (ru) |
| SA (1) | SA517381457B1 (ru) |
| SG (1) | SG11201702997YA (ru) |
| SI (1) | SI3215187T1 (ru) |
| TW (2) | TWI694147B (ru) |
| WO (1) | WO2016071306A1 (ru) |
| ZA (1) | ZA201703055B (ru) |
Families Citing this family (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EA035461B1 (ru) | 2014-11-04 | 2020-06-19 | Янссен Вэксинс Энд Превеншн Б.В. | Терапевтические вакцины против hpv16 |
| EA037295B1 (ru) | 2015-08-20 | 2021-03-05 | Янссен Вэксинс Энд Превеншн Б.В. | Терапевтические вакцины против hpv18 |
| MX2018013340A (es) * | 2016-05-02 | 2019-08-21 | Janssen Vaccines & Prevention Bv | Combinaciones de vacunas terapeuticas para el vph. |
| CN106632694B (zh) * | 2017-01-24 | 2021-02-12 | 南京益康生物医药有限公司 | 一种重组蛋白及药物组合物与应用 |
| AU2018335252A1 (en) | 2017-09-23 | 2020-02-27 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Paramyxoviridae expression system |
| US20200399348A1 (en) * | 2018-02-20 | 2020-12-24 | Emory University | HPV Proteins, Antibodies, and Uses in Managing Abnormal Epithelial Cell Growth |
| US20210038709A1 (en) * | 2018-03-12 | 2021-02-11 | Sqz Biotechnologies Company | Methods for treating hpv-associated diseases |
| WO2020016394A1 (en) * | 2018-07-20 | 2020-01-23 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Recombinant adenoviral vector expressing zika antigen with improved productivity |
| CN108939064B (zh) * | 2018-08-06 | 2021-12-10 | 南京颂悦生物科技有限公司 | 基于重组减毒绵羊李斯特菌的宫颈癌治疗性疫苗 |
| CN108992665B (zh) * | 2018-08-06 | 2021-11-19 | 南京颂悦生物科技有限公司 | 基于重组减毒单增李斯特菌的宫颈癌治疗性疫苗 |
| JP2022523564A (ja) | 2019-03-04 | 2022-04-25 | アイオーカレンツ， インコーポレイテッド | 機械学習を使用するデータ圧縮および通信 |
| MX2022002883A (es) | 2019-09-20 | 2022-03-25 | Transgene | Combinacion de un poxvirus que codifica para polipeptidos de virus de papiloma humano (vph) e interleucina 2 (il-2) con un anticuerpo anti ligando 1 de muerte programada (pd-l1). |
| US20230277645A1 (en) * | 2020-04-02 | 2023-09-07 | Inovio Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for treating vulvar dysplasia |
| WO2021209897A1 (en) | 2020-04-13 | 2021-10-21 | Janssen Biotech, Inc. | Psma and steap1 vaccines and their uses |
| AU2021270777A1 (en) * | 2020-05-12 | 2022-11-10 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Administration of homologous adenoviral vectors |
| KR20230125200A (ko) * | 2020-11-24 | 2023-08-29 | 마 무초우 조 | 인간 유두종 바이러스에 대한 dna 백신 및 이를 사용하는 방법 |
| CA3235779A1 (en) * | 2021-10-22 | 2023-04-27 | Jian Yan | Compositions and methods for treating anal high-grade squamous intraepithelial lesion (hsil) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20070014810A1 (en) * | 2003-12-31 | 2007-01-18 | Denise Baker | Inducing cellular immune responses to human papillomavirus using peptide and nucleic acid compositions |
| WO2009106362A1 (de) * | 2008-02-25 | 2009-09-03 | Cichon Guenter | Dna-vakzine zur therapie und prophylaxe von gebärmutterhalskrebs und seinen prämalignen vorstufen |
| WO2013083287A1 (en) * | 2011-12-06 | 2013-06-13 | Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung Des Öffentlichen Rechtes | Hpv derived polynucleic acids for therapy |
Family Cites Families (49)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3584341D1 (de) | 1984-08-24 | 1991-11-14 | Upjohn Co | Rekombinante dna-verbindungen und expression von polypeptiden wie tpa. |
| US5168062A (en) | 1985-01-30 | 1992-12-01 | University Of Iowa Research Foundation | Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence |
| US5057540A (en) | 1987-05-29 | 1991-10-15 | Cambridge Biotech Corporation | Saponin adjuvant |
| NZ230747A (en) | 1988-09-30 | 1992-05-26 | Bror Morein | Immunomodulating matrix comprising a complex of at least one lipid and at least one saponin; certain glycosylated triterpenoid saponins derived from quillaja saponaria molina |
| JPH0832638B2 (ja) | 1989-05-25 | 1996-03-29 | カイロン コーポレイション | サブミクロン油滴乳剤を含んで成るアジュバント製剤 |
| FR2705686B1 (fr) | 1993-05-28 | 1995-08-18 | Transgene Sa | Nouveaux adénovirus défectifs et lignées de complémentation correspondantes. |
| US5851806A (en) | 1994-06-10 | 1998-12-22 | Genvec, Inc. | Complementary adenoviral systems and cell lines |
| EP1548118A2 (en) | 1994-06-10 | 2005-06-29 | Genvec, Inc. | Complementary adenoviral vector systems and cell lines |
| US5965541A (en) | 1995-11-28 | 1999-10-12 | Genvec, Inc. | Vectors and methods for gene transfer to cells |
| US5846782A (en) | 1995-11-28 | 1998-12-08 | Genvec, Inc. | Targeting adenovirus with use of constrained peptide motifs |
| US5559099A (en) | 1994-09-08 | 1996-09-24 | Genvec, Inc. | Penton base protein and methods of using same |
| US5786464C1 (en) | 1994-09-19 | 2012-04-24 | Gen Hospital Corp | Overexpression of mammalian and viral proteins |
| AUPM873294A0 (en) | 1994-10-12 | 1994-11-03 | Csl Limited | Saponin preparations and use thereof in iscoms |
| ATE278794T1 (de) | 1995-06-15 | 2004-10-15 | Crucell Holland Bv | Verpackungssysteme für humane, menschliche adenoviren, zur verwendung in die gentherapie |
| US5837511A (en) | 1995-10-02 | 1998-11-17 | Cornell Research Foundation, Inc. | Non-group C adenoviral vectors |
| CA2177085C (en) | 1996-04-26 | 2007-08-14 | National Research Council Of Canada | Adenovirus e1-complementing cell lines |
| WO1998039411A1 (en) | 1997-03-04 | 1998-09-11 | Baxter International Inc. | Adenovirus e1-complementing cell lines |
| US6020191A (en) | 1997-04-14 | 2000-02-01 | Genzyme Corporation | Adenoviral vectors capable of facilitating increased persistence of transgene expression |
| US5972650A (en) | 1997-06-26 | 1999-10-26 | Brigham And Women's Hospital | Tetracycline repressor regulated mammalian cell transcription and viral replication switch |
| US5981225A (en) | 1998-04-16 | 1999-11-09 | Baylor College Of Medicine | Gene transfer vector, recombinant adenovirus particles containing the same, method for producing the same and method of use of the same |
| US6113913A (en) | 1998-06-26 | 2000-09-05 | Genvec, Inc. | Recombinant adenovirus |
| NZ515582A (en) | 1999-05-17 | 2003-11-28 | Crucell Holland B | Adenovirus derived gene delivery vehicles comprising at least one element of adenovirus type 35 |
| US6913922B1 (en) | 1999-05-18 | 2005-07-05 | Crucell Holland B.V. | Serotype of adenovirus and uses thereof |
| FR2794370B1 (fr) | 1999-06-03 | 2003-10-17 | Biovector Therapeutics | Fragments proteiques polyepitopiques, leur obtention et leurs utilisations notamment en vaccination |
| CA2384987A1 (en) * | 1999-09-16 | 2001-03-22 | Zycos Inc. | Nucleic acids encoding polyepitope polypeptides |
| DE19955558C2 (de) | 1999-11-18 | 2003-03-20 | Stefan Kochanek | Permanente Amniozyten-Zelllinie, ihre Herstellung und Verwendung zur Herstellung von Gentransfervektoren |
| AU2002211490A1 (en) | 2000-10-04 | 2002-04-15 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Compositions and methods of using capsid protein from flaviviruses and pestiviruses |
| CN100537773C (zh) | 2000-11-23 | 2009-09-09 | 巴法里安诺迪克有限公司 | 改良安卡拉痘苗病毒变体 |
| WO2002088346A2 (en) | 2001-05-01 | 2002-11-07 | National Research Council Of Canada | A system for inducible expression in eukaryotic cells |
| ATE447037T1 (de) | 2002-04-25 | 2009-11-15 | Crucell Holland Bv | Mittel und verfahren zur herstellung von adenovirusvektoren |
| SE0202110D0 (sv) | 2002-07-05 | 2002-07-05 | Isconova Ab | Iscom preparation and use thereof |
| SE0301998D0 (sv) | 2003-07-07 | 2003-07-07 | Isconova Ab | Quil A fraction with low toxicity and use thereof |
| EP1718738A2 (en) | 2004-02-23 | 2006-11-08 | Crucell Holland B.V. | Virus purification methods |
| MX2007004595A (es) | 2004-11-08 | 2007-08-15 | Chromagenics Bv | Seleccion de celulas hospederas que expresan proteinas en altas concentraciones. |
| WO2007073513A2 (en) | 2005-11-10 | 2007-06-28 | Genvec, Inc. | Method for propagating adenoviral vectors encoding inhibitory gene products |
| MY154956A (en) | 2006-02-28 | 2015-08-28 | Vaxart Inc | Chimeric adenoviral vectors |
| WO2007104792A2 (en) | 2006-03-16 | 2007-09-20 | Crucell Holland B.V. | Recombinant adenoviruses based on serotype 26 and 48, and use thereof |
| MX2009008118A (es) * | 2007-01-30 | 2009-10-13 | Transgene Sa | Polipeptido e2 del virus del papiloma usado para vacunacion. |
| DK2350268T3 (en) | 2008-11-03 | 2015-03-23 | Crucell Holland Bv | PROCEDURE FOR PRODUCING ADENOVIRUS VECTORS |
| GB0823497D0 (en) | 2008-12-24 | 2009-01-28 | Isis Innovation | Immunogenic composition and use thereof |
| KR101820980B1 (ko) | 2010-02-15 | 2018-01-22 | 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. | Ａｄ 26 아데노바이러스 벡터를 제조하는 방법 |
| US9000139B2 (en) * | 2010-08-13 | 2015-04-07 | Genexine, Inc. | Composition for preventing or treating cervical cancer having human papillomavirus plasmodium and immunity enhancer |
| US20130122038A1 (en) | 2011-11-14 | 2013-05-16 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department | Heterologous prime-boost immunization using measles virus-based vaccines |
| US8932607B2 (en) | 2012-03-12 | 2015-01-13 | Crucell Holland B.V. | Batches of recombinant adenovirus with altered terminal ends |
| US9119813B2 (en) | 2012-03-22 | 2015-09-01 | Crucell Holland B.V. | Vaccine against RSV |
| SG11201701506PA (en) | 2014-09-03 | 2017-03-30 | Bavarian Nordic As | Recombinant modified vaccinia virus ankara (mva) filovirus vaccine |
| EA035461B1 (ru) | 2014-11-04 | 2020-06-19 | Янссен Вэксинс Энд Превеншн Б.В. | Терапевтические вакцины против hpv16 |
| EA037295B1 (ru) | 2015-08-20 | 2021-03-05 | Янссен Вэксинс Энд Превеншн Б.В. | Терапевтические вакцины против hpv18 |
| MX2018013340A (es) * | 2016-05-02 | 2019-08-21 | Janssen Vaccines & Prevention Bv | Combinaciones de vacunas terapeuticas para el vph. |
-
2015
- 2015-11-03 EA EA201790976A patent/EA035461B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2015-11-03 WO PCT/EP2015/075516 patent/WO2016071306A1/en active Application Filing
- 2015-11-03 MX MX2017005788A patent/MX2017005788A/es unknown
- 2015-11-03 EP EP18182588.6A patent/EP3421046A1/en active Pending
- 2015-11-03 MA MA046378A patent/MA46378A/fr unknown
- 2015-11-03 MA MA40902A patent/MA40902B1/fr unknown
- 2015-11-03 MD MDE20170071T patent/MD3215187T2/ro unknown
- 2015-11-03 AU AU2015341926A patent/AU2015341926B2/en active Active
- 2015-11-03 NZ NZ730802A patent/NZ730802A/en not_active IP Right Cessation
- 2015-11-03 SI SI201530481T patent/SI3215187T1/sl unknown
- 2015-11-03 CA CA2965562A patent/CA2965562C/en active Active
- 2015-11-03 SG SG11201702997YA patent/SG11201702997YA/en unknown
- 2015-11-03 LT LTEP15791556.2T patent/LT3215187T/lt unknown
- 2015-11-03 HU HUE15791556A patent/HUE040440T2/hu unknown
- 2015-11-03 DK DK15791556.2T patent/DK3215187T3/en active
- 2015-11-03 RS RS20181369A patent/RS58080B1/sr unknown
- 2015-11-03 PT PT15791556T patent/PT3215187T/pt unknown
- 2015-11-03 PL PL15791556T patent/PL3215187T3/pl unknown
- 2015-11-03 ES ES15791556T patent/ES2697903T3/es active Active
- 2015-11-03 KR KR1020177014129A patent/KR20170083562A/ko active IP Right Grant
- 2015-11-03 CN CN201580060062.4A patent/CN107075521B/zh active Active
- 2015-11-03 EP EP15791556.2A patent/EP3215187B1/en active Active
- 2015-11-03 BR BR112017009177-1A patent/BR112017009177A2/pt active Search and Examination
- 2015-11-03 JP JP2017523902A patent/JP6325751B2/ja active Active
- 2015-11-03 MY MYPI2017701524A patent/MY181175A/en unknown
- 2015-11-04 TW TW104136379A patent/TWI694147B/zh not_active IP Right Cessation
- 2015-11-04 TW TW109113009A patent/TWI731654B/zh not_active IP Right Cessation
- 2015-11-04 US US14/932,789 patent/US9701721B2/en active Active
- 2015-11-04 AR ARP150103569A patent/AR102527A1/es unknown
-
2017
- 2017-04-25 IL IL251895A patent/IL251895B/en active IP Right Grant
- 2017-05-02 CL CL2017001089A patent/CL2017001089A1/es unknown
- 2017-05-03 ZA ZA201703055A patent/ZA201703055B/en unknown
- 2017-05-03 SA SA517381457A patent/SA517381457B1/ar unknown
- 2017-05-15 CO CONC2017/0004838A patent/CO2017004838A2/es unknown
- 2017-05-22 US US15/601,278 patent/US10071151B2/en active Active
-
2018
- 2018-04-12 JP JP2018076758A patent/JP6606571B2/ja active Active
- 2018-08-08 US US16/058,411 patent/US10555996B2/en active Active
- 2018-11-14 HR HRP20181895TT patent/HRP20181895T1/hr unknown
- 2018-11-15 CY CY20181101210T patent/CY1121377T1/el unknown
- 2018-12-21 AU AU2018282463A patent/AU2018282463B2/en active Active
-
2020
- 2020-01-29 US US16/775,709 patent/US11040096B2/en active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20070014810A1 (en) * | 2003-12-31 | 2007-01-18 | Denise Baker | Inducing cellular immune responses to human papillomavirus using peptide and nucleic acid compositions |
| WO2009106362A1 (de) * | 2008-02-25 | 2009-09-03 | Cichon Guenter | Dna-vakzine zur therapie und prophylaxe von gebärmutterhalskrebs und seinen prämalignen vorstufen |
| WO2013083287A1 (en) * | 2011-12-06 | 2013-06-13 | Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung Des Öffentlichen Rechtes | Hpv derived polynucleic acids for therapy |
Non-Patent Citations (9)
| Title |
|---|
| BRANDSMA, J.L. SHLYANKEVICH, M. ZELTERMAN, D. SU, Y.: "Therapeutic vaccination of rabbits with a ubiquitin-fused papillomavirus E1, E2, E6 and E7 DNA vaccine", VACCINE, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 25, no. 33, 24 July 2007 (2007-07-24), AMSTERDAM, NL, pages 6158 - 6163, XP022168615, ISSN: 0264-410X, DOI: 10.1016/j.vaccine.2007.06.012 * |
| C. LUNDEGAARD, K. LAMBERTH, M. HARNDAHL, S. BUUS, O. LUND, M. NIELSEN: "NetMHC-3.0: accurate web accessible predictions of human, mouse and monkey MHC class I affinities for peptides of length 8-11", NUCLEIC ACIDS RESEARCH, INFORMATION RETRIEVAL LTD., vol. 36, no. Web Server, 19 May 2008 (2008-05-19), pages W509 - W512, XP055179516, ISSN: 03051048, DOI: 10.1093/nar/gkn202 * |
| KOEN OOSTERHUIS, PETER �HLSCHL�GER, JOOST H. VAN DEN BERG, MIREILLE TOEBES, RAQUEL GOMEZ, TON N. SCHUMACHER, JOHN B. HAANEN: "Preclinical development of highly effective and safe DNA vaccines directed against HPV 16 E6 and E7", INTERNATIONAL JOURNAL OF CANCER, UNION INTERNATIONALE CENTRE LE CANCER., vol. 129, no. 2, 15 July 2011 (2011-07-15), pages 397 - 406, XP055031276, ISSN: 00207136, DOI: 10.1002/ijc.25894 * |
| MOISE, L. ; BULLER, R.M. ; SCHRIEWER, J. ; LEE, J. ; FREY, S.E. ; WEINER, D.B. ; MARTIN, W. ; DE GROOT, A.S.: "VennVax, a DNA-prime, peptide-boost multi-T-cell epitope poxvirus vaccine, induces protective immunity against vaccinia infection by T cell response alone", VACCINE, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 29, no. 3, 10 January 2011 (2011-01-10), AMSTERDAM, NL, pages 501 - 511, XP027575654, ISSN: 0264-410X * |
| MOSCICKI, A.B.: "HPV Vaccines: Today and in the Future", JOURNAL OF ADOLESCENT HEALTH, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 43, no. 4, 1 October 2008 (2008-10-01), AMSTERDAM, NL, pages S26 - S40, XP026640804, ISSN: 1054-139X, DOI: 10.1016/j.jadohealth.2008.07.010 * |
| OHLSCHLAGER, P. ; PES, M. ; OSEN, W. ; DURST, M. ; SCHNEIDER, A. ; GISSMANN, L. ; KAUFMANN, A.M.: "An improved rearranged Human Papillomavirus Type 16 E7 DNA vaccine candidate (HPV-16 E7SH) induces an E7 wildtype-specific T cell response", VACCINE, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 24, no. 15, 5 April 2006 (2006-04-05), AMSTERDAM, NL, pages 2880 - 2893, XP028011167, ISSN: 0264-410X, DOI: 10.1016/j.vaccine.2005.12.061 * |
| Q. ZHANG, P. WANG, Y. KIM, P. HASTE-ANDERSEN, J. BEAVER, P. E. BOURNE, H.-H. BUI, S. BUUS, S. FRANKILD, J. GREENBAUM, O. LUND, C. : "Immune epitope database analysis resource (IEDB-AR)", NUCLEIC ACIDS RESEARCH, INFORMATION RETRIEVAL LTD., vol. 36, no. Web Server, 19 May 2008 (2008-05-19), pages W513 - W518, XP055179474, ISSN: 03051048, DOI: 10.1093/nar/gkn254 * |
| SASMITA MISHRA, BIANCA J. LAVELLE, JOE DESROSIERS, MATT T. ARDITO, FRANCES TERRY, WILLIAM D. MARTIN, ANNE S. DE GROOT, STEPHEN H. : "Dendritic Cell-Mediated, DNA-Based Vaccination against Hepatitis C Induces the Multi-Epitope-Specific Response of Humanized, HLA Transgenic Mice", PLOS ONE, vol. 9, no. 8, pages e104606, XP055247057, DOI: 10.1371/journal.pone.0104606 * |
| STEVEN F. MOSS; LEONARD MOISE; DONG SOO LEE; WOOJIN KIM; SONGHUA ZHANG; JINHEE LEE; ARLIN B. ROGERS; WILLIAM MARTIN; ANNE S. DE GR: "HelicoVax: Epitope-based therapeuticvaccination in a mouse model", VACCINE, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 29, no. 11, 27 December 2010 (2010-12-27), AMSTERDAM, NL, pages 2085 - 2091, XP028152754, ISSN: 0264-410X, DOI: 10.1016/j.vaccine.2010.12.130 * |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11040096B2 (en) | Therapeutic HPV16 vaccines | |
| US10844096B2 (en) | Therapeutic HPV18 vaccines | |
| AU2017259259B2 (en) | Therapeutic HPV vaccine combinations |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG TJ TM |