KR100378901B1 - 사람위암에대한면역반응을유도할수있는펩타이드및이러한펩타이드를함유하는사람위암의예방또는치료용제제 - Google Patents
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Abstract
사람 위암에 대해 효과적인 CTL을 유도하는 펩타이드가 제공된다.
특정 아미노산 서열을 갖는 펩타이드는 위암 세포를 표적화하는 세포독성 T세포를 유도한다. 따라서, 이러한 펩타이드가 위암 예방 또는 치료용 제제로서 기대된다.
Description
[발명의 목적]
본 발명은, 1) 사람 위암에 대해 면역 반응을 유도할 수 있는 펩타이드, 2) 이러한 펩타이드를 암호화하는 DNA, 3) 상기 펩타이드를 함유하는 사람 위암의 예방 또는 치료용 제제, 및 4) 상기 펩타이드를 암호화하는 DNA를 갖는 재조합 바이러스 또는 재조합 세균을 함유하는 사람 위암의 예방 또는 치료용 백신을 제공한다.
[발명이 속하는 기술분야 및 그 분야의 종래기술]
본 발명은, 생체내 또는 시험관내에서 사람 위 세포에 대해 CTL(세포독성 T 임파구; Kikuchi Kokichi, Medical Immunology, revised 3rd edition)을 유도할 수 있는 펩타이드, 및 이러한 펩타이드를 암호화하는 DNA에 관한 것이다. 더욱 특정하게는, 본 발명은, HLA-A31 항원(사람 백혈구 항원; Yamamura Yuichi 및 Tada Tomio의 Modern Immunology, 2nd edition)에 결합함으로써 사람 위 세포에 대해 CTL을 제시할 수 있는 펩타이드 및 이러한 펩타이드를 암호화하는 DNA에 관한 것이다.
추가로. 본 발명은, 생체내 또는 시험관내에서 사람 위암 세포에 대해 CTL을 유도할 수 있는 펩타이드를 함유하는 사람 위암의 예방 또는 치료용 제제, 및 상기 펩타이드를 암호화하는 DNA를 갖는 재조합 바이러스 또는 재조합 세균을 함유하는 사람 위암의 예방 또는 치료용 백신에 관한 것이다.
악성 종양의 약물요법을 위하여, 종양 세포에 직접적으로 손상을 가하는 화학치료제, 또는 숙주의 면역성을 비-특이적으로 활성화시키고 숙주의 생체보호적 기능을 향상시켜 치료를 수행하는 면역치료제를 사용하여 왔다. 하지만, 악성 종양, 특히 소화기 종양을 완전하게 치유시킬 수 있는 제제는 전무한 실정이다.
최근, 동물, 주로 마우스의 종양을 사용한 연구 결과, 다양한 종양 세포 내에 존재하는 종양-관련 항원 및 종양-특이적 항원에 대한 항원-특이적 면역 반응을 증강시킴으로써 종양이 완전히 치유될 수 있음이 밝혀졌다. 임상적으로, 이러한 치료는 상기 종양-특이적 항원에 대한 항원-특이적 면역 반응을 증강시킴으로써 수행되었다.
종양 항원-특이적 면역 반응을 증강시켜 종양을 치료하는 제제 또는 접근 방법에 대해서는, 종양 세포 내에서 발현되며 주로 B세포에 의해 인지되는 항원에 대한 모노클로날 항체가 사용되고; 종양 특이적 면역 반응은, 환자에게 방사선 또는 백신과 같은 의약으로 불활성화시킨 그들 자신의 종양 세포 또는 이의 가용성 분획을 투여함으로써 유발되며; 종양 세포의 면역원성을 향상시키기 위하여 바이러스 또는 다양한 사이토킨 유전자를 종양 세포내로 도입시키고 이같이 처리된 종양 세포를 환자에게 투여함으로써 종양 특이적 면역 반응이 유도된다는 것이 공지되어 있다.
하지만, CTL을 포함하는 T 세포가 생체내에서 주로 종양 거부에 작용한다는 것이 명백해지고 있다. 현재에는 B-세포-인지 항원에 대한 항체를 사용하는 치료가 제한적임이 분명해졌다.
추가로, T 세포 집단 상에 존재하는 2가지 작용성 아집단(Th1 및 Th2서브세트)이 활성화되는 상태에서 T 세포와 관련된 면역 반응은 강화적으로 또는 억제적으로 작용함이 밝혀졌고, 다수의 항원을 함유하는 종양 세포 자체의 면역은 차라리 때때로 종양 세포에 대한 면역 반응을 다소 억제하는 것으로 나타났다.
또한, 불활성화된. 종양 세포의 접종과 관련하여, 생체내 재활성을 통한 종양의 재성장의 가능성은 완전히 부인될 수는 없다. 따라서, 안전성의 문제가 남게된다.
상기한 문제점들을 극복하기 위하여, 종양 거부에 중추적인 역할을 하는 것같은 CTL을 활성화시키는 항원 단백질을 동정하여 이러한 항원 단백질을 사용하여 CTL을 활성화시키는 방법을 고려하게 되었다.
최근의 연구 성과를 통하여, 세포내에서 프로테아제에 의해 단편화되며 8 내지 12개의 항원-단백질-유도된 아미노산을 포함하는 펩타이드가 HLA 항원에 결합함으로써 CTL에 대한 항원-제시 분자로서 작용하게 되어 결과적으로 CTL이 유도된다는 것이 밝혀졌다.
따라서, 암 항원 펩타이드에 대하여, HLA분자에 결합하여 종양 세포에 대해 CTL을 유도하는 펩타이드를 발견할 수 있다면, 이러한 펩타이드는 암 예방 또는 치료용 제제로서 사용될 수 있을 것으로 간주된다.
상기 고려한 바를 토대로 하여, CTL을 유도할 수 있는 암 항원 펩타이드가 연구되었다. 하지만, 흑색종 종양에 존재하는 암 항원인, 예를 들면, MAGE 계열, Mart-1, 티로시나제, gp100과 같은 단백질로부터 유도된 펩타이드만이 현재까지 밝혀졌다. 위암과 같은 소화기 암과 관련하여, CTL을 유도할 수 있는 암 항원 펩타이드의 존재 및 암 항원 펩타이드의 구조는 아직 알려져 있지 않다.
본 발명자들은, 종양 항원을 인지하는 CLT이 종양 세포에 대해 생체보호적기작으로서 중요한 역할을 한다는 사실에 집중하였다. 즉, 본 발명자들은, 백신의 일부로서 사용될 수 있는 펩타이드를 이용하거나 당해 펩타이드를 암호화하는 DNA를 함유하는 형질전환체를 이용한 CTL의 유도는 암을 예방하거나 치료하는데 유용하다는 사실을 염두해 두고 연구를 수행하였다.
HLA 항원이 암 항원 펩타이드에 결합하고 CTL에 대한 항원-제시 분자로서 작용함으로써 CTL이 유도된다는 것이 공지되어 있다. 따라서, 만일 위암 세포와 반응성인 CTL을 활성화시킬 수 있는 펩타이드를 발견해 낼 수 있다면, 이것을 위암 예방용 또는 치료용 제제로서 사용할 수 있다고 간주된다.
본 발명자들은 위암 세포와 특이적으로 반응하여 HLA-A31을 억제하는, 위암환자로부터 유래된 CTL 세포주(Tc-HST-2)를 확립하는데 성공하였으며, 이러한 CTL이 작용하는, 동일한 환자로부터 유래된 위암 세포주(HST-2)를 확립하는데 성공하였다(J. I. Meth. 154, 235-243, 1992 and Cancer 75, 1484-1489, 1995).
하지만, 이 CTL이 종양 항원을 인지하는지의 여부 및 이 CTL이 어떠한 항원을 인지하는지는 명확하지 않다. 무엇보다도, 위암을 포함하는 소화기 암에 특이적으로 존재하고, CTL을 유도할 수 있는 암 항원 펩타이드의 존재는 전혀 해명된바 없었으며, 이의 본질 또한 명백하지 않았다.
따라서, 본 발명자들은, 위암 세포 HST-2의 세포 표면 상에 존재하는 HLA-결합 펩타이드를 정제하고, CTL 세포주 Tc-HST-2를 활성화하는 펩타이드를 동정하였다. 추가로, 이같이 동정된 펩타이드를 통상적인 방식으로 화학적으로 합성하였다. 이로써, 이러한 펩타이드가 CTL 세포주 Tc-HST-2를 실질적으로 활성화시킨다는 것이 최초로 확인되었다. 또한, 이러한 펩타이드가 HST-2 이외의 위암 세포내에서 발현됨이 밝혀졌다.
이들 결과로부터, 상기한 펩타이드가 위암 예방용 또는 치료용 제제로서 사용될 수 있음이 명백해졌다. 이러한 발견을 통해, 본 발명이 완성되었다.
즉, 본 발명은, 1) 사람 위암 세포내에 존재하는 위암 항원 단백질의 단편(이 단편은 HLA 분자에 결합하여 위암 세포를 표적화하는 세포독성 T세포를 유도할 수 있다)인 펩타이드, 2) 상기 펩타이드를 함유하는 사람 위암의 치료 또는 예방용 제제, 3) 상기 펩타이드를 암호화하는 DNA, 및 4) 이러한 DNA를 갖는 재조합 바이러스 또는 재조합 세균을 함유하는 사람 위암의 예방 또는 치료용 백신에 관한 것이다.
도 1은 역상 HPLC 칼럼에서 HST-2 위암 세포로부터 HLA-결합된 펩타이드의 용출 패턴을 나타낸다. 도 1에서, 직선은 아세토니트릴 농도를, 곡선은 각각의 농도에서 OD210에서의 흡광도를 나타낸다.
도 2는 HST-2-유래된 HLA-결합된 펩타이드를 사용하는 경우 Tc-HST-2의 특이적 세포독성을 나타내는 그래프이다. 여기서, ○는 HST-2를 사용하는 경우의 특이적 세포독성을 나타내고, ◆는 표적 세포로서, HLA-A31-양성 KG-1 세포를 사용하는 경우의 세포독성을 나타낸다. 모든 시험은 표적 세포 대 CTL의 비가 1:100인 상태에서 수행한다.
도 3은 역상 HPLC 칼럼에 의한, 도 2에 나타낸 CTL 유도성을 보이는 12번째 분획의 용출 패턴이다. 도 3에서, 직선은 아세토니트릴의 농도를 나타내고 곡선은 각각의 농도에서 OD210에서의 흡광도를 나타낸다.
도 4는 HST-2-유래된 HLA-결합된 펩타이드를 사용하는 경우 Tc-HST-2의 특이적 세포독성을 나타내는 그래프이다. 여기서, □ 는 표적 세포로서 HST-2를 사용하는 경우의 특이적 세포독성을 나타내고, ◆는 표적 세포로서 HLA-A31-양성 CCRF-CEM 세포를 사용하는 경우 세포독성을 나타낸다. 모든 시험은 표적 세포 대 CTL의비가 1:100인 상태에서 수행한다.
도 5는 펩타이드 1(서열 목록의 서열 1의 펩타이드), 펩타이드 1-9(서열 목록의 서열 2의 펩타이드), 펩타이드 1-8(서열 목록의 서열 3의 펩타이드), 및 펩타이드 1-7(서열 목록의 서열 4의 펩타이드)을 사용하는 경우의 TNF-방출 방법에 의해 측정된 Tc-HST-2의 CTL유도성을 나타내는 그래프이다.
TNF-민감성 Wehi 세포는 TNF의 방출에 의해 손상되며, 나머지 세포에 의한 MTT의 도입은 감소한다. 펩타이드의 농도는 10mM, 1mM, 및 0.1mM이다. 모든 시험에서, HST-2는 표적 세포로서 사용되었고, 표적 세포 대 CTL의 비는 1:100이다. ■ 는 펩타이드 1을 부가하는 경우의 세포독성을 나타내고, □ 는 펩타이드 1-9를 부가하는 경우의 세포독성을 나타내며, △는 펩타이드 1-8을 부가하는 경우의 세포독성을 나타내고, ○는 펩타이드 1-7을 부가하는 경우의 세포독성을 나타낸다. 파선은 펩타이드를 부가하지 않은 경우의 세포독성을 나타낸다.
도 6은 MKN28 A31(+)cl-2 세포 및 MKN28 A31(+)cl-5세포를 사용하는 경우의 Tc-HST-2의 세포독성을 나타내는 그래프인데, 상기 세포들은 HLA-A31 및 친주 MKN28 위암 세포를 인공적으로 발현시킴으로써 수득되는 아세포주이다. 모든 시험은 표적 세포 대 CTL의 비가 1.100인 상태에서 수행한다.
본 발명은 하기에 상세하게 기술되어 있다.
사람 위암 세포내에 존재하는 위암 항원 단백질의 단편인 펩타이드를 동정하기 위해(이때, 단편은 HLA 분자에 결합하고 위암 세포를 표적화하는 세포독성 T세포를 유도할 수 있다), (1) 시험관내에서 대량으로 성장시킬 수 있는, 발견된 HLA-타입의 사람 암 세포주 및 (2) 상술한 암세포주와 반응하여 세포독성을 나타내고 HLA 분자 및 T 세포 수용체를 억제하며, 시험관내에서 대량으로 성장시킬 수 있는 CTL 세포주를 확립하는 것이 필수 불가결하다.
시험관내에서 대량으로 성장시킬 수 있는, 발견된 HLA-타입의 사람 위암 세포주로서, 예를 들면, 본 발명자에 의해 확립된 HST-2 세포를 사용할 수 있다[J.Immunmol. Meth., vol. 154, pp 235-243 (1992); and Jpn. J. Cancer Res., 84, pp. 906-913 (1993)]. 이 세포주는 위암에 걸린 환자의 암종 복수증으로부터 형성된 위 인환세포 암종주이다.
추가로, 상술한 암세포주와 반응하여 HLA 분자 및 T세포 수용체를 억제하며 세포독성을 나타내고 시험관내에서 대량으로 성장시킬 수 있는 CTL 세포주로서, 본 발명자들에 의해 확립된 Tc-HST-2 세포를 사용할 수 있다[J. Immunol Meth , vol. 154, pp. 235-243 (1992); and Jpn. J. Cancer Res., 84, pp. 906-913 (1993).
문헌[Cancer, vol. 75, pp. 1484-1489(1995)]에는 이러한 CTL 세포주가 HST-2 세포와 특이적으로 반응하고 HST-2 항원 및 HLA-A31 항원을 동시에 인지한다고 기술되어 있다.
HST-2 세포를 사용하여, Tc-HST-2 세포주의 CTL 활성을 유도할 수 있는 위암항원 펩타이드를 함유하는 HLA-결합된 펩타이드를 수득할 수 있다. 즉, HST-2 세포를 통상의 항온처리 조건하에서, 예를 들면, 태 송아지 혈청을 함유하는 RPMI1640 배지내에서 항온처리한다. 그런 다음, 배양물을 인산염-완충 염수(PBS)로 세척한다. 이후, 세포 표면 상에 존재하는 HLA 분자-결합된 펩타이드를 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA) 용액으로 효율적으로 추출한다. TFA를 사용한 HLA-결합된 펩타이드의 추출은 문헌[Science, vol. 249, pp. 283-287(1990)]에 기재되어 있다.
Tc-HST-2 세포의 CTL 활성을 유도할 수 있는 위암 항원 펩타이드는 역상 크로마토그래피에 의해 상기 HLA-결합된 펩타이드로부터 정제될 수 있다. 이러한 위암 항원 펩타이드의 정제는 하기 실시예중에 기술될 것이다.
역상 크로마토그래피를 통해 분리되는 HLA-결합된 펩타이드 분획중의 Tc-HST-2-반응성 위암 항원 펩타이드는 문헌[Science, vol. 249, pp. 283-287(1990)]에 기재된 바와 동일한 방식으로 각각의 분획의 CTL 유도성을 측정함으로써 확인될 수 있다.
즉, HLA-A31-양성 HST-2 또는 KG-1 세포를51Cr을 함유하는 크롬산나트륨으로 방사성 표지한 후, 역상 크로마토그래피를 통해 분리된 HLA-결합된 펩타이드와 혼합한다. 혼합물을 37℃에서 3시간 동안 항온처리하고, Tc-HST-2를 여기에 가한다. 수득한 혼합물을 12시간 동안 추가로 항온처리한다. CTL 유도성은 상등액중 방출된51Cr의 방사성 활성을 측정함으로써 검출될 수 있다.
역상 크로마토그래피를 통해 분리된 Tc-HST-2 세포의 CTL 활성을 유도할 수 있는 위암 항원 펩타이드에 있어서, 이의 아미노산 서열을 고체상-기술 단백질 서열분석기를 사용하여 통상의 방식으로 결정할 수 있다. 예를 들면, 서열 목록의 서열 1로 나타낸 펩타이드를 CTL 유도성을 나타내는 펩타이드로서 언급할 수 있다.
당연히, 서열 목록의 서열 1로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 본 발명에 사용할 수 있다. 추가로, 서열 목록의 서열 1로 나타낸 아미노산 서열 일부의 변형으로 수득된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 또한 사용할 수 있으며, 이 단편은 HLA 분자에 결합하여, 위암 세포를 표적화하는 세포독성 T 세포를 유도할 수 있다.
본 발명에서 서열 목록의 서열 1로 나타낸 아미노산 서열 일부를 변형시킴으로써 수득된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드의 특정 예로서, (1) 서열 목록의 서열 1로 나타낸 아미노산 서열중의 하나 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시켜 수득된 아미노산 서열, (2) 서열 목록의 서열 1로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 펩타이드의 N-말단 또는 C-말단으로부터 하나 이상의 아미노산을 결실시켜 수득된 아미노산 서열, 및 (3) 전체 아미노산 서열의 일부에 서열 목록의 서열 1로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 들 수 있다.
본 발명의 펩타이드는, 수 개의 아미노산을 결합시킴으로써 형성된 펩타이드로부터 다수의 아미노산을 결합시킴으로써 형성된 펩타이드에 이른다.
서열 목록 서열 1로 나타낸 아미노산 서열의 일부를 변형시킴으로서 수득된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드라도 위암 세포를 표적화하는 세포독성 T 세포를 유도할 수 없는 경우에는 본 발명에 사용될 수 없다.
예를 들면, 서열 목록의 서열 2로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 펩타이드는 본 발명에 사용될 수 있으나, 서열 목록의 서열 3 또는 4로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 펩타이드는 CTL, 유도성을 갖지 않기 때문에 사용될 수 없다(하기 실시예참조).
상기 펩타이드의 제조 방법은 특정하게 제한되지 않는다. 펩타이드는 고체-상 펩타이드 합성법 또는 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조할 수 있다.
특정하게, 서열 목록의 서열 1 또는 2로 나타낸 위암 세포를 표적화하는 CTL-유도성 펩타이드는 통상의 고체상 펩타이드 합성 기술로 합성할 수 있다. 이는 또한 이러한 펩타이드를 구성하는 아미노산을 암호화하는 DNA를 적절한 발현 벡터내로 도입하고 이와 같이 형질전환된 BCG 세균 또는 에스케리치아 콜라이 속에 속하는 세균을 항온처리함으로써 제조될 수 있다.
서열 목록의 서열 1 또는 2로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 암호화하는 DNA는 아미노산 서열로부터 추론될 수 있다. 각각의 아미노산 서열의 상응하는 코돈은 당해 분야의 숙련가들에게는 본질적으로 널리 공지되어 있다.
본 발명의 모든 펩타이드는 역상 HPLC에 의해 정제되며, 역상 HPLC를 통해,이들이 단일 성분들임이 확인되었다. 그런 다음, 당해 펩타이드를 질량 분석을 통해 동정하였으며, CTL 검정에 사용하였다.
본 발명의 펩타이드는 위암 세포-특이적 CTL 세포주인 Tc-HST-2에 대한 CTL 활성을 유도할 수 있다. CTL 유도성은 상술한 크롬-방출 방법 또는 TNF-방출 방법에 의해 측정할 수 있다[Immunogenetics, vol. 35, p. 145(1992)].
즉, TNF-방출 방법에 있어서, HLA-A31-양성 HST-2 또는 KG-1 세포를 본 발명의 펩타이드와 혼합하고, 혼합물을 37℃에서 3시간 동안 항온처리한다. 이후, Tc-HST-2를 여기에 가하고, 수득된 혼합물을 12시간 동안 추가로 항온처리한다. 상등액에 방출된 TNF의 활성을 측정하여 CTL 유도성을 검출한다.
TNF 활성은 문헌[lmmunogenetics, vol. 35, p. 145(1992)]에 기재된 방법으로 측정할 수 있다.
즉, TNF-민감성 Wehi164 세포를 시험 샘플과 혼합하고, 혼합물을 24시간 동안 항온처리한다. 그후, MTT [3-(4,5-디메틸티아졸-z-일)-2,5-디페닐테트라졸륨브로마이드] 용액을 배양물에 가하고, 생성된 혼합물을 3시간 동안 추가로 항온처리한다. 미토콘드리아 내에서 전환된 포르마잔이 산 프로판을 중에서 용해된 후, 이의 양을 OD570에서의 흡광도 측면에서 측정하여 TNF 활성을 검출한다.
본 발명의 펩타이드, 예를 들면, 서열 목록의 서열 1로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 펩타이드는 T 세포 에피토프로서 위암 세포-특이적 CTL을 유도할 수 있다. 따라서, 이는 사람 위암을 예방하거나 치료하는데 유용한 제제로서 몹시 기대될 수 있는 것이다.
실제 사용에 있어서, 본 발명의 펩타이드는 1) 그대로, 2) 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 희석제와 함께, 또는 3) 필요한 경우 하기 애쥬번트와 함께, 주사기를 사용하여 또는 스프레이 등에 의한 점막으로부터의 피하 흡수를 통해 투여될 수 있다. 담체란, 사람 혈청 알부민 등을 의미하고, 희석제는 PBS, 증류수 등을 의미한다.
본 발명에 있어서, 사람 위암을 예방하거나 치료하기 위한 제제는, 사람 위암 세포중에 존재하는 위암 항원단백질의 단편인 펩타이드 0.01 내지 100중량%, 바람직하게는 0.1 내지 95중량%를 함유하는데, 이 단편은 HLA 분자, 특정하게는 HLA-A31 분자와 결합하여, 위암 세포를 표적화하는 세포독성 T 세포를 유도할 수 있다.
이 제제는, 본 발명의 펩타이드의 양이 1회 투여에 0.01mg 내지 100mg이 되도록 하는 용량으로 성인에게 투여된다. 하지만, 이 범위는 표준에 불과한 것으로, 결정적인 것은 아니다.
제제의 제형은 특별하게 한정되지 않는다. 사카라이드와 같은 비히클을 함유하는 과립제 또는 동결건조된 제제가 또한 유용하다.
이러한 제제는 상술한 바와 같은 투여시에 심각한 급성 독성을 나타내지 않는다.
CTL 유도성을 향상시키기 위해 본 발명의 제제에 부가되는 애쥬번트로는 미생물, 예를 들면 BCG, ISCOM [Nature, vol. 344, p. 873(1990)], 사포닌 타입의 QS-21 [J. Immunol., vol. 148, p. 1438(1992)], 리포좀 및 수산화 알루미늄을 들 수 있다.
또한, 면역 활성화제를 애쥬번트로서 사용할 수 있다. 이의 예로는 렌티난, 쉬조필란 및 피시바닐이 포함된다. T 세포의 성장 또는 분화를 향상시킬 수 있는 사이토킨, 예를 들면 IL-2, IL-4, IL-12, IL-1, IL-6 및 TNF를 또한 애쥬번트로 사용할 수 있다.
상술한 문헌 및 문헌[Science, vol. 255, p. 333(1992)]에는 CTL 등의 면역반응이 상술한 방법으로 생체내에서 유도될 수 있다고 기술되어 있다.
추가로, 상술한 항원 펩타이드를 환자로부터 수거한 세포 또는 동일한 HLA 반수체형을 갖는 세포에 시험관내에서 부가하여, 항원을 제시하게 만든 후, 이들 세포를 환자와 혈관에 투여하여 환자 체내에서 CTL을 효율적으로 유도한다. 또한 추가로, 상기한 펩타이드를 환자의 말초혈 임파구에 부가하고, 펩타이드-함유 임파구를 시험관내에서 항온처리함으로써 시험관내에서 CTL을 유도할 수 있으며, 그런 다음, 수득된 임파구를 환자의 혈관으로 재투여할 수 있다. 이러한 세포 투여를 통한 치료는 이미 암 치료법으로서 실시되고 있으며, 이는 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지되어 있다.
본 발명에 의해 규명된 위암 항원 펩타이드를 암호화하는 DNA를 적절한 벡터에 삽입한다; 이러한 재조합 DNA를 함유하는 백시니아 바이러스와 같은 바이러스 또는 BCG와 같은 세균은 사람 위암의 예방 또는 치료용 생백신으로서 사용될 수 있다.
즉, (1) 서열 목록의 서열 1로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 암호화하는 DNA, 또는 (2) 서열 목록의 서열 1로 나타낸 아미노산 서열의 일부를 변형시킴으로써 수득된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 암호화하는 DNA(예를 들면, 서열 목록의 서열 2로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 펩타이드)를 재조합 바이러스 또는 재조합 세균내에서 발현되는 항원 단백질 유전자내로 삽입하는 경우, 이 펩타이드 서열은 항원 단백질의 일부로서 발현된 다음, 세포내에서 프로세싱된 후, HLA 항원에 대해 제시되어, 이를 인지하는 CTL을 유도할 수 있게 된다.
제제의 용량 및 투여 방법은 통상적인 BCG 백신의 예방접종 또는 투여에서와 동일하다.
실시예
본 발명은 하기 실시예를 참조로 하여 더욱 구체적으로 설명된다. 하지만, 본 발명은 이에 제한되지는 않는다.
실시예 1
HST-2로부터의 Tc-HST-2 반응성 펩타이드의 정제 및 이의 동정
HST-2 세포(2×105개 세포/ml)를, 175㎠ 플라스틱 인큐베이터(cat No. 3028,Falcon사 제조)내에 10% FCS-함유 RPMI1640 배지(2mM 글루타민, 5×10-5M 2ME, 100단위/ml의 페니실린, 100㎍/ml 스트렙토마이신 및 16mM NaHCO3함유) 50ml중에 접종하고, 공기중의 5% CO2가스의 존재하에 37℃에서 4일간 항온처리한다.
항온처리를 완결한 후, 형성된 상등액을 제거하고, 잔사를 PBS(-)로 세척한다. 그런 다음, 0.1% TFA 용액 20ml를 여기에 부가하고, 혼합물을 4℃에서 30분 동안 항온처리한다. HLA-결합된 펩타이드를 HLA 분자로부터 방출시킨다. 방출된 HLA-결합된 펩타이드를 10,000g에서 15분간 원심분리하여 이로부터 세포 잔사를 분리한다.
상기한 바와 같이, HST-2를 항온처리함으로써 수득된 HLA-결합된 펩타이드 용액 20ml를 동결건조하고, 0.1% TFA 용액 5ml중에 용해한다. 이러한 HLA-결합된 펩타이드 용액 1ml를 액상 HPLC 칼럼(μ BONDSHERE, 5μ C18-300A, 19mm × 150mm)으로 처리한다. 역상 HPLC 칼럼을 미리 0.1% TFA-함유 증류수로 평형시킨 다음, 목적하는 물질을 0.1% TFA 중의 아세토니트릴의 농도를 0에서 80%로 선형 증가시켜 용출시킨다. 이 방법은 1ml/분의 유속에서 수행한다. 용출액을 각각 1ml의 양으로 수거한다.
상기 방법을 총 10회 반복한다. 동일한 체류 시간을 나타내는 분획을 회수하고, 동결건조시킨다. 상술한 방법에서는 HPLC의 용출 패턴에 있어 유의적 차이가 발견되지 않았다. HPLC의 용출 패턴을 도 1에 나타낸다.
Tc-HST-2 세포에 대한 HPLC 용출 분획의 CTL 유도성을 하기와 같이 측정한다. 즉, 표적 세포로서 HLA-A31 항원을 발현하는 1×106개 HST-2 또는 KG-1 세포를 1×107개 세포/ml의 세포수에 도달할 때까지 10% FCS-함유 RPMI 배지중에 현탁시킨다. 현탁액에51Cr을 함유하는 크롬산나트륨 및 PBS의 혼합물 100㎕를 부가하고, 수득된 혼합물을51Cr-표지화를 위해 5% CO2의 존재하에 37℃에서 3시간 동안 항온처리한다.51Cr-표지된 세포(1×104개 세포)를 용액 100㎕ 중에 현탁시킨다. 여기에 HPLC를 통해 분리된 HLA-결합된 펩타이드를 함유하는 용액 3㎕를 부가하고, 혼합물을 동일 조건하에서 3시간 동안 추가로 항온처리하면, HLA-결합된 펩타이드가 HLA분자에 결합하게 된다.
연속적으로, Tc-HST-2 세포(2.5×105개 세포/ml)를 여기에 100㎕의 양으로 부가하고, 혼합물을 동일 조건하에 12시간 동안 항온처리한다. 항온처리한지 12시간 후, 형성된 100㎕ 상등액을 회수하고, 이러한 상등액에 방출된51Cr의 방사성-활성을 γ -카운터로 측정하여, CTL 활성을 측정한다.
특이적 세포독성은 (각각의 웰의 측정치-최소 방출치)/(최대 방출치-최소 방출치) × 100의 식에 의해 계산된다.
상기 식에서, 최소 방출치는 표적 세포 단독으로 채워진 웰의 측정치 및 표적 세포로부터 천연적으로 방출되는51Cr의 값을 나타내고, 최대 방출치는 표적 세포에 1% 트리톤 x-100 계면활성제를 부가함으로써 세포가 파괴되는 경우의 방출치를 나타낸다.
결과는 도 2에 도시되어 있다. 도 2로부터 명백한 바와 같이, CTL 유도성은 HPLC를 통해 용출되는 12번째 분획중에서 관측된다.
Tc-HST-2의 CTL 유도성이 확인된 12번째 분획을 역상 HPLC 칼럼(μ BONDSHERE, 5μ C18-300A, 19mm × 150mm)으로 추가로 처리한다. 역상 HPLC 칼럼은 미리 0.1% TFA-함유 증류수로 평형시킨 다음, 목적하는 물질을 0.1% TFA 함유 용출액 중의 아세토니트릴의 농도를 0에서 40%로 선형 증가시켜 용출시킨다. 이 방법은 1ml/분의 유속으로 수행한다. 용출액을 각각 1ml 양으로 수거한다.
상기 방법을 총 10회 반복한다. 동일한 체류 시간을 나타내는 분획을 회수하고, 동결건조시킨다. 상술한 방법에서는 HPLC의 용출 패턴에 있어 유의적 차이는 발견되지 않았다. HPLC의 용출 패턴을 도 3에 나타낸다.
HPLC 용출 분획에서 Tc-HST-2 세포의 CTL유도성을 상기 방법으로 측정한다. 결과는 도 4에 도시된다. 도 4로부터 명백해지는 바와 같이, CTL 유도성은 HPLC를 통해 용출되는 17번째 분획에서 확인된다.
CTL 유도성이 확인된 17번째 분획을 분석용 역상 HPLC 칼럼(ZORBAX, ODS 칼럼, 4mm × 250mm)으로 분리한다. 역상 HPLC 칼럼은 미리 0.1% TFA-함유 증류수로 평형시킨 다음, 목적하는 물질을 0.1% TFA 함유 용출액 중 아세토니트릴의 농도를 0에서 60%로 선형 증가시켜 용출시킨다. 이 방법을 1ml/분의 유속에서 수행하여, 주 피크를 수득한다.
주 피크를 취하고, 단백질 서열 분석기(477A, 제조원: ABI)에 도입한다. 아미노산 서열을 에드만 분해 방법으로 측정한다. N-말단으로부터의 아미노산 서열은 서열 목록의 서열 1에 나타낸다.
실시예 2
위암 항원 펩타이드의 합성 및 CTL 유도성의 측정
서열 목록의 서열 1과 동일한 아미노산 서열을 갖는 합성 펩타이드 1 및 이러한 합성 펩타이드 1의 N-말단으로부터의 9번 내지 7번 아미노산을 함유하는 3가지 타입의 펩타이드, 즉, 펩타이드 1-9(서열 목록의 서열 2의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드), 펩타이드 1-8(서열 목록의 서열 3의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드), 및 펩타이드 1-7(서열 목록의 서열 4의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드)를 자동 펩타이드 합성기(477A, 제조원: ABI)를 사용하여, 매뉴얼의 프로토콜에 따라 합성한다.
이들 합성 펩타이드를 수지로부터 절단하고, TFA 및 무수 에테르의 혼합물로 재침전시킨다. 이들은 역상 HPLC를 통해 단일 성분인 것으로 확인되었으며, 질량분광계로 추가로 확인하였다. 연속하여, 이들을 TNF-방출 방법을 사용하여 CTL 검정을 수행한다.
즉, HLA-A31 항원을 발현하는 1×104개 HST-2 세포를 표적 세포로서 용액 100㎕ 중에 현탁시키고, 상기 4개의 합성 펩타이드 각각 5㎕를 여기에 부가하여 10μM, 1μM 또는 0.1μM의 최종 농도에 도달하게 한다. 혼합물을 동일 조건하에 3시간 동안 추가로 항온처리함으로써, HLA 분자에 HLA-결합 펩타이드가 결합하게 한다. 연속적으로, Tc-HST-2 세포(1×106개 세포/ml)를 여기에 100㎕의 양으로 부가하고, 수득한 혼합물을 동일 조건하에 12시간 동안 추가로 항온처리한다.
항온처리한지 12시간 후, 형성된 상등액 30㎕을 회수하고, 상등액중에 방출된 TNF 활성을 측정하여, CTL 유도성을 검출한다. TNF 활성을 다음 방법으로 측정한다.
즉, TNF-민감성 세포인 7×104개 Wehi164 세포를 용액 120㎕ 중에 현탁시키고, 상기 현탁액 30㎕를 여기에 부가한다. 혼합물을 24시간 동안 항온처리한다. 항온처리가 완료된 후, MTT 5mg/ml를 각각 10㎕의 양으로 각각의 웰에 가하고, 생성된 혼합물을 3시간 동안 추가로 항온처리한다. 이어서, 0.01% 염산을 함유하는 프로판올 150㎕을 여기에 가해 항온처리 동안 형성된 포르마잔을 용해시킨다. 이후, 570nm의 파장에서 흡광도를 측정하여 TNF 활성을 검출한다.
결과는 도 5에 나타낸다. 도 5로부터 명백한 바와 같이, Tc-HST-2의 CTL유도성을 합성 펩타이드 1 및 1-9에서 확인한다.
실시예 3
사람 MKN28 위암 세포주에서의 위암 항원 펩타이드의 발현.
Tc-HST-2에 의해 인지되는 위암 항원 펩타이드가 HST-2 이외의 위암 세포주에서 발현되는지의 여부를 확인하기 위하여, HLA-A31-음성 사람 위암 세포주인 MKN28에 대한 Tc-HST-2에 의해 부여된 세포독성을51Cr-방출 방법에 의해 검출한다.51Cr-방출 방법에 의한 CTL 활성의 검출은 실시예 1과 동일한 방식으로 수행한다. 결과는 도 6에 나타낸다. Tc-HST-2는 HLA-A31을 발현하지 않은 MKN28 세포에 대해 세포독성을 나타내지 않았다. 반면, Tc-HST-2는, 도 6에 나타난 바와 같이, HLA-A31 유전자를 함유하는 플라스미드 pBJ-A31을 HLA-A31을 발현시키기 위해 전기천공법에 의해 MKN28 내로 형질감염시켜 형성된 MKN28의 아세포주인 MKN28 A31(+)cl-2 및 MKN28 A31(+)cl-5에 대해 상당한 세포독성을 나타내었다.
상기 결과로부터, Tc-HST-2에 의해 인지되는 위암 항원 펩타이드가 또한 MKN28에서도 발현되고, 이 펩타이드가 HLA-A31 분자에 결합되어 Tc-HST-2에 의해 인지되는 것이 확인되었다.
본 발명의 펩타이드는 사람 위암 세포에 대해 생체내 또는 시험관내에서 CTL을 유도할 수 있고, 이러한 펩타이드 자체 및 이를 포함하는 제제는 사람 위암을 예방하거나 치료하기 위한 제제로서 매우 기대될 수 있다. 추가로, 생체내 또는 시험관내에서 사람 위암 세포에 대해 CTL을 유도할 수 있는 펩타이드를 암호화하는 DNA를 갖는 재조합체를 함유하는 바이러스 또는 세균은 사람 위암의 예방 또는 치료용 백신으로서 매우 만족스러운 약제학적 효과를 나타낸다.
서열 목록
서열 1
서열 길이: 10
서열 유형: 아미노산
형태 : 선형
서열 유형: 펩타이드
공급원: 사람
서열:
서열 2
서열 길이: 9
서열 유형: 아미노산
형태 : 선형
서열 유형: 펩타이드
공급원: 사람
서열:
서열 3
서열 길이: 8
서열 유형: 아미노산
형태 : 선형
서열 유형: 펩타이드
공급원: 사람
서열:
서열 4
서열 길이: 7
서열 유형: 아미노산
형태 : 선형
서열 유형: 펩타이드
공급원: 사람
서열:
Claims (6)
- 사람 백혈구 항원(HLA) 분자에 결합하여 위암 세포를 표적화하는 세포독성 T세포를 유도할 수 있는, 사람 위암 세포중에 존재하는 위암 항원 단백질의 단편인, 서열 목록의 서열 1 또는 2의 아미노산 서열을 포함하고 9 내지 12개의 아미노산 잔기로 이루어진 펩타이드
- 제1항에 있어서, HLA 분자가 HLA-A31인 펩타이드.
- HLA 분자에 결합하여 위암 세포를 표적화하는 세포독성 T 세포를 유도할 수 있는, 사람 위암 세포중에 존재하는 위암 항원 단백질의 단편인, 서열 목록의 서열1 또는 2의 아미노산 서열을 포함하고 9 내지 12개의 아미노산 잔기로 이루어진 펩타이드를 함유하는, 사람 위암의 예방 또는 치료용 제제.
- 제3항에 있어서, HLA 분자가 HLA-A31인 제제.
- 제1항의 펩타이드를 암호화하는 DNA.
- 제5항의 DNA를 갖는 재조합 바이러스 또는 재조합 세균을 함유하는, 사람 위암의 예방 또는 치료용 백신.
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