JP3439213B2

JP3439213B2 - ストレス蛋白エピトープ

Info

Publication number: JP3439213B2
Application number: JP50603894A
Authority: JP
Inventors: ジェイムスピーターバーニイ; ルースクリスティーヌマシューズ
Original assignee: ニュウテックファーマパブリックリミテッドカンパニー
Priority date: 1992-08-18
Filing date: 1993-08-17
Publication date: 2003-08-25
Anticipated expiration: 2018-08-25
Also published as: EP0861892A1; EP0656945B1; DE69328489D1; GR3033809T3; EP0861892B1; ES2147560T3; AU4727593A; ES2231907T3; GB9217542D0; GB2270076A; EP0656945A1; PT656945E; US5777083A; WO1994004676A1; DE69328489T2; DE69333673T2; ATE192192T1; DE69333673D1; DK0656945T3; ATE280227T1

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、特に、ストレス蛋白（stress proteins）
が産生される病状の診断および治療に用いることを目的
とするストレス蛋白エピトープに関する。

環境によるストレスは、原核細胞および真核細胞の双
方において、いわゆる熱ショック（heat shock）蛋白、
すなわちストレス蛋白を引き起こすことがある（たとえ
ば、シュレジンガー（Schesinger）他による「細菌から
ヒトへの熱ショック（Heat Shock from Bacteria to Ma
n）」（コールドスプリングハーバー（Cold Spring Har
bor）社、ニューヨーク（1972年）参照）。ストレス蛋
白の機能は未だ完全には解明されていないが、いくつか
の報告によれば、特定の細胞蛋白およびウイルス蛋白の
集合および構造安定性に関与し、また、高濃度で存在す
ると逆境下において安定化作用を追加することができる
とされている。

多くの病原性生物がストレス蛋白を産生することが示
されている（ヤング（Young）他、Proc.Natl.Acad.Sci.
USA,85,4267−4270（1988）参照）。該蛋白は、感染の
ストレスに対応して産生して侵入病原を防ぐ助けになる
ものと考えられている。かくして、たとえば、ストレス
蛋白を産生する能力は、マクロファージ内の細菌性病原
の生存に関係があるとされている（クリスマス（Christ
mas）他、Cell,41,753−762（1985）、およびモーガン
（Morgan）他、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83,8053−8063
（1986））。

バーニイ（Burnie）他は、真菌および細菌（たとえ
ば、鵞口瘡カンジダ（カンジダ・アルビカンス（Candid
a albicans））やコリネバクテリウム・イエイケイウム
（Corynebacterium jeikium）に由来するストレス蛋白
は、免疫支配保存抗原（immunodominant conserved ant
igen）を構成することを見出している。カンジダ性スト
レス蛋白のカルボキシ末端の配列決定が行われ、エピト
ープLKVIRKNIVKKMIEに抗して産生した抗体は、全身性カ
ンジダ感染症の患者からの血清中の47Kdおよび92Kdのい
ずれのカンジダ性ストレス蛋白も認識することが見出さ
れている。さらに、該抗体は、他の真菌感染にかかって
いる患者の血清中のストレス蛋白、たとえば、40Kdおよ
び88/84Kdのアスペルギルス（Aspergillus）ストレス蛋
白も認識し、同様にして、細菌性感染症の患者からの血
清中のストレス蛋白、たとえば、52Kdおよび86Kdのコリ
ネフォーム（Coryneform）ストレス蛋白も認識した。カ
ンジダ性ストレス蛋白由来の他のペプチド配列が免疫原
性のあることも見出されており、たとえば、エピトープ
LSREM、LKVIRKおよびSTDEPAGESAは、全身性カンジダ症
患者からの血清と反応した。

89KDaの全ヒト熱ショック蛋白（HSP90）の配列決定が
行われ（ヒケイ（Hickey）他、Mol.Cell Biol.,９,2615
−2626,1989）、そのアミノ酸配列は、他の種の熱ショ
ック蛋白のアミノ酸配列と比較検討された。このクラス
の熱ショック蛋白はそれぞれの種の間で高度に保存され
ているようであるが、熱ショック蛋白の共通した機能性
配列（すなわち、エピトープ）の直接的な比較や確認は
未だ報告されていない。

前述したエピトープは有効であるが、そのようなガン
ジダ性HSP90（Candidal HSP90）のカルボキシ配列由来
以外の生産ルートによっても、同等あるいはそれよりも
優れた診断または治療効果を与え得ることがこのたび見
出された。

本発明に従えば、ヒトHSP90から精製される機能性エ
ピトープ、または、そのような精製エピトープに相応す
るように合成される機能性エピトープが提供され、この
機能性エピトープは、精製される場合には、不変である
かまたは特定のアミノ酸の置換によって変化するもので
あり、また、合成される場合には、精製エピトープと同
一であるかまたは特定のアミノ酸の置換によって精製エ
ピトープと異なるものであり、さらに、該機能性エピト
ープは、ストレス蛋白に抗して産生した抗体と交差反応
するものである。

本発明エピトープは、アミノ酸配列XXXLXVIRKXIVまた
はXXILXVIXXXXX（ここで、Ｘは任意のアミノ酸である）
から構成されることができ、たとえば、アミノ酸配列NK
ILKVIRKNIVからなる。

本発明エピトープは、アミノ酸配列KIRY、NNLGTI、QF
IGYPI、KKIK、SKEQVもしくはカンジダ性等価配列（Cand
idal equivalent sequence）SIKAV,GLELPEもしくはカン
ジダ性等価配列FELEES,LDKKもしくはカンジダ性等価配
列LGDQ,WTANもしくはカンジダ性等価配列WSAN,NSTMGYも
しくはカンジダ性等価配列TTMSSY,PIVETもしくはカンジ
ダ性等価配列PIIKE,またはKNDKもしくはカンジダ性等価
配列AEDKから選ばれることができる。

ストレス蛋白は、たとえば、マラリア性ストレス蛋
白、真菌性ストレス蛋白または細菌性ストレス蛋白から
なる。

真菌性ストレス蛋白は、たとえば、カンジダ性の92お
よび／もしくは47KDa蛋白、またはアスペルギルス性4
0、51および／もしくは88/84KDa蛋白、またはニューモ
シスチス・カルニイ（Pneumocystis carnii）のストレ
ス蛋白からなる。

細菌性ストレス蛋白は、たとえば、コリネフォルム
（Coryneform）の86および／もしくは52KDa蛋白または
レンサ球菌（Streptococcal）ストレス蛋白からなる。

さらに、本発明は、別の観点として、ヒトHSP90由来
または合成による機能性エピトープを製造する方法も提
供するものであり、該方法は、特定のアミノ酸の置換を
伴いもしくは伴わずに、ヒトHSP90から精製する工程ま
たは精製エピトープと同一もしくは特定のアミノ酸の置
換により精製エピトープと異なるエピトープを合成する
工程を含み、ここで、エピトープがストレス蛋白に抗し
て産生する抗体と交差反応するようにアミノ酸の置換を
選定する。

本発明に従うエピトープは機能性エピトープとして評
価されるものであり、従って、多くの機能的用途を有し
ている。特に、従来からの診断および治療方法の代替お
よび／または改良として多数の疾病の診断および治療に
用いられることができる。たとえば、本発明は、マラリ
アの診断と治療に用いることができる。このことは時事
的にも重要である。というのは、よく知られているよう
に、この病気は現在の薬剤治療では急速に効かなくなっ
ており、その結果、世界中の流行を高めているからであ
る。

本発明の機能性エピトープは、マラリア、真菌性感染
（ニューモシスチス・カルニイ（Pneumocystis carni
i）を含む）または細菌性感染に対する診断テストの基
礎を形成することができ、酵素標識イムノソルベントア
ッセイ（ELISA）、ラジオイムノアッセイまたはラテッ
クス凝集アッセイなどの免疫学的テストを用いて、当該
エピトープに特異的な抗体、従って、特定のストレス蛋
白がホスト生体中に存在するか否かを検定する。このテ
ストは、一般に、ホストからの体液をエピトープと接触
させ、結合物質を検出することによって構成される。

別の用途として、本発明に従うエピトープは、既存の
技術を用い、マラリア感染、真菌性感染および細菌性感
染の治療用の活性阻害剤を得るためのスクリーニングに
も利用することができる。

さらに別の用途として、本発明に従うエピトープは、
標準的な技術により、抗体を産生させるため、すなわち
免疫原としても用いることができ、このためには、たと
えば、任意の適当なホストに当該エピトープを注入し、
血清を集めて精製および／または濃縮後に所望のポリク
ローナル性抗エピトープ抗体を得る。ホストへの注入に
先立ち、エピトープに適当はビヒクル（媒体）を配合し
て、エピトープと共に一種またはそれ以上の薬学的に許
容できる賦形剤（佐薬）からなる組成物を提供してもよ
い。

別の態様として、抗体は、モノクローナル源であって
もよく、そして、一般的に、いずれかの免疫グロブリン
のクラスに属し、たとえば、IgGおよび／またはIgMおよ
び／またはIgAである。抗体は、たとえば、動物性のも
の（たとえば、哺乳動物由来のもの）であり、または、
マウス、ラット、もしくは好ましくはヒト由来のもので
あり、またはマウスまたはラット由来のヒト化抗体であ
る。

抗エピトープ抗体を精製するためには、本発明のエピ
トープを固定化してアフィニティ媒体として利用するア
フィニティクロマトグラフィを用いることができる。そ
のような抗エピトープ抗体は、真菌性および細菌性感染
ならびにマラリアの診断および治療のいずれにも用いる
ことができる。ストレス蛋白の作用の阻害剤として、抗
エピトープ抗体は、単独で、または、他の薬剤、たとえ
ば、他の抗真菌剤もしくは抗マラリア剤と組合わせて用
いることができる。さらに、そのようなエピトープを用
いて、真菌性またはマラリア性ストレス蛋白の他の阻害
剤を産生させることもでき（たとえば、リボザイム）、
アンチセンスRNAがストレス蛋白mRNAの翻訳を阻害す
る。

そのような抗エピトープ抗体の可能性のある用途とし
ては、支持免疫療法、たとえば、HIV陽性患者の支持免
疫療法がある。そのような患者は、免疫系が損なわれて
いるために日和見感染を受けやすい。そのような日和見
感染の例としては、カンジダ（Candida）、アスペルギ
ルス（Aspergillus）およびニューモシスチス・カルニ
イ（Pneumocystis carnii）がある。事実、HIV陽性患者
からの血清は、これらの微生物の全てのHSP90に対して
抗体陽性であることが示されている。従って、これらの
微生物やその他の感染性微生物の感染が慢性化し、患者
に死をもたらすようになる前に、それらの生物のHSP90
を認識するような抗体を患者に与えることが提案され
る。

本発明に従う特に有用な抗体は、ペプチドXXXLXVIRKX
IVまたはXXILXVIXXXXX（ここで、Ｘは任意のアミノ酸で
ある）、たとえば、ペプチドNKILKVIRKNIVを認識するも
のであり、また、ペプチドKIRY,NNLGTI,QFIGYPI,KKIK,S
KEQVもしくはカンジダ性等価配列SIKAV,GLELPEもしくは
カンジダ性等価配列FELEES,LDKKもしくはカンジダ性等
価配列LGDQ,WTANもしくはカンジダ性等価配列WSAN,NSTM
GYもしくはカンジダ性等価配列TTMSSY,PIVETもしくはカ
ンジダ性等価配列PIIKE,またはKNDKもしくはカンジダ性
等価配列AEDKの一種もしくはそれ以上を認識する抗体で
ある。

所望に応じて、診断や治療のために抗体の混合物を用
いることもでき、たとえば、ヒトストレス蛋白（もしく
はカンジダ性等価配列）のいろいろなエピトープを認識
する二種またはそれ以上の抗体の混合物、および／また
は異なるクラスの抗体の混合物、たとえば、ヒトストレ
ス蛋白（もしくはカンジダ性等価配列）の同一もしくは
異種のエピトープを認識するIgG、IgMおよびIgA抗体の
混合物を用いることもできる。

以下の実施例によって本発明を説明する。

実施例１病気の診断および治療の双方に用いる新規な手段を得
ることを目的として、種々の疾病にかかっている患者の
血清に反応させることにより、ヒトHSP90の主要抗原エ
ピトープ（免疫支配エピトープ（immunodominant epito
pes））を検討した。

試験した血清は、以下の疾病にかかった患者からのも
のである。全身性カンジダ症（47KDa陽性）、侵入性ア
スペルギルス症（88、40KDa陽性）、アレルギー性気管
支肺アルペルギルス症、アスペルギルス腫（アスペルギ
ローム）、マラリア、大便連鎖球菌（ストレプトコッカ
ス・フェカリス（Streptococcus faecalis））心内膜
炎、コリネバクテリウム・イェイケイウム（Corynebact
erium jeikium）心内膜炎および自己免疫疾患全身性狼
瘡紅斑症。

ヒトHSP90のエピトープマッピングは、ヒケイ（Hicke
y）他による、Mol.Cell Biol.,９,2615−2626（1989）
に記載された誘導アミノ酸配列に抗して行った。

実験の詳細重複するノナペプチド（nona−peptides）からなる完
全な１セットとして716のアミノ酸残基をポリエチレン
のピン上に合成した。すなわち、ペプチド１は残基１〜
９からなり、ペプチド２は残基２〜10からなり、・・・
という具合いにした。ペプチドの合成は、F_moc−保護ア
ミノ酸エステルを用いて行った。ポリエチレンのピンそ
のものは、それぞれ、F_moc−β−アラニンに結合させ
た。F_mocの保護基除去後、合成すべき配列に従い、各ピ
ンに最初のアミノ酸を結合させた。各側鎖が保護された
N,N−ジメチル−ホルムアミド溶液中で、ヒドロベンゾ
トリアゾール介在カップリング反応を行わせた。ペプチ
ドの合成は、１日当り１本のピンにF_moc保護基除去と１
個のアミノ酸付加というサイクルを繰り返して行った。
最終的なカップリング反応が終了し、F_moc保護基の除去
後、末端のアミノ酸をアセチル化してペプチドのＮ末端
の不飽和電荷を除去した。側鎖の保護基の除去は、トリ
フルオロ酢酸：フェノール：エタンジチオールの混合物
（95:2.5:2.5,v/w/v）により行った。

ピンの表面に結合しているペプチドを酵素イムノアッ
セイ（EIA）により血清を用いてテストした。ピンは、P
BS−Ｔ（リン酸緩衝塩（phosphate−buffered salin
e）、0.1％Tween）中に１％卵白アルブミン、１％ウシ
血清アルブミン（BSA）を含有する微量定量プレート
（マイクロタイタープレート）中で１時間予備コーティ
ングした。次いで、それらのピンを４℃において患者血
清（1/200）（PBS−Ｔで４回洗浄）にインキュベート
し、さらに、セイヨウワサビペルオキシダーゼ結合抗イ
ムノグロブリン（1/1000;シグマ（Sigma）社、プール
（Poole）、英国）で１時間インキュベートした。さら
に洗浄後、ピンを30分間、ABTS（0.5mg/mlのアミノ−ジ
−３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホネート、0.
03％過酸化水素を含むpH4.0のクエン酸緩衝液中）に浸
漬し、EIAプレートリーダー中でA₄₀₅測定を行った。ピ
ンは超音波処理で清浄にした。

少なくとも３個以上のウェルにおいてODがバックグラ
ウンドの少なくとも２倍である場合には、反応が特異的
であると考えた。合成した多数のペプチドは各テストに
おいて陰性対照として効果的に機能した。これらのペプ
チドの平均吸光度は低く、バックグラウンドレベルを決
定するのに用いられた（ゲイセン（Geysen）他、1987
年）。

試験した患者血清の詳細 I. 汎発性カンジダ症抗体プロフィルアスペルギルス・フュミガツス（A.fumigatus）は、8
8/84、51および40KDにバンドを有する。

HIV陽性患者の血清は、カンジダHSP90、ニューモシス
チス・カルニイ（Pneumocystis carnii）HSP9およびア
スペルギルスに対して抗体陽性である。従って、そのよ
うな患者の維持治療に抗体を使用することが提案され
る。というのは、これらの患者において抗体がなくなる
と、抗原HSP90を産生するニューモシスチス・カルニイ
（Pneumocystis carnii）およびその他の微生物のよう
な日和見感染を起こし得るからである。

II. 侵入性アスパラギルス症抗体プロフィル III. アレルギー性気管支肺アスペルギルス症 IV. アスペルギルス腫 V. ストレプトコッカス・フェカリス（Streptococcus
faecalis）心内膜炎 GB（英国特許）2034504に開示されたモノクローナル
抗体は、ストレプトコッカス・フェカリス（S.faecali
s）の90KDにおける免疫支配バンドと交差反応し、この
ペプチド（LKVIRKNIVKKMIE−cys−KLH）に抗して産生さ
れたウサギ血清も同様の反応を行った。

以前の研究（バーン（Burne）他、1985年）によれ
ば、この抗原バンドをストレプトコッカス・フェカリス
（S.faecalis）心内膜炎における主要抗原としており、
このことは、培養陰性の心内膜炎に対するテストの基礎
となり得ることを示唆している。

VI. マラリアさらにマラリアの５症例について、カンジダおよびア
スペルギルスの抽出物とイムノブロッティングさせたと
ころ、それらが真菌性HSP90と交差反応する抗体を有し
ていることが示された。

VII. コリネバクテリウム・イェイケイウム（Coryneba
cterium jeikeium） VIII. 全身性狼瘡紅斑症（SLE） IX. C.クイリエルモンジイ（C.quilliermondii）髄膜
炎／敗血症結果ヒトHSP90のエピトープマッピング結論：エピトープ1,3,4,6,7,8,11および12は、SLE患
者由来の血清に陽性応答を示した。すなわち、該エピト
ープは、自己免疫抗体を認識しており、自己抗体ドメイ
ンとして分類できるものと考えられる。

エピトープ2,5,9および10は、真菌特異的であり、この
うち、エピトープ２はカンジダ性エピトープと考えら
れ、また、エピトープ９はアスペルギルス症特異的エピ
トープと考えられる。さらに、エピトープ2,5,9および1
0は、マラリアエピトープと考えられ、、また、エピト
ープ９および10は、ストレプトコッカス・フェカリス
（S.faecalis）エピトープと考えられる。

実施例２ GB（英国特許）2034504において使用されているモノ
クローナル抗体血清を産生させるために、LKVIRKNIVKKM
IE−cysからなるペプチドを用いた。しかしながら、こ
のペプチドの詳細な免疫原性は未だ知られていない。そ
こで上記ペプチドのアミノ酸のそれぞれを置換すること
により該ペプチドを調べて、免疫原性に対する影響があ
るかを検討することにした。

まず、従来技術を利用して必要なペプチド類を合成
し、上述のモノクローナル抗体を含有するヒト血清を用
いて免疫原性を測定した。さらに、より広義なエピトー
プ、すなわちNKILKVIRKNIVも調べることにした。

プロトコールおよび抗体の濃度は実施例１において既
述した場合と同様である。

検討したペプチドペプチド１ LKVIRKNIV LKVIRKの変化について検討ペプチド２ NKILKVIRK KILKの変化について検討ペプチド３ LKVIRKNIV KNIVの変化について検討すなわち、全配列のうち、ペプチド１、ペプチド２お
よびペプチド３により、以下のような変化を調べた。

分析に用いた血清 1. LKVIRKNIVKKMIE−cysに特異的なモノクローナル抗
体、抗ペプチド１およびペプチド３。

2. ヒト血清抗体プロフィル結果 1. LKVIRKNIVKKMIE−cysに特異的なモノクローナル抗
体ペプチド１−LKVIRKNIV 30分後にELISA値測定、抗体希釈度1:200。

対照LKVIRKNIVの平均ELISA OD＝0.923。

置換されたアミノ酸これらの結果は、アミノ酸IRKの重要性を示してお
り、RKは置換することができず、これらのアミノ酸を置
換すると抗体の結合が無視し得るものになることがわか
る。

ペプチド３−LKVIRKNIV ELISAは30分後に測定、抗体希釈は1:200。

対照LKVIRKNIVの平均ELISA OD＝0.842 これらの結果は、アミノ酸KNIVの重要性を示してい
る。

全体のエピトープは、IRKNIVであり、実質上、下線を
引いたアミノ酸は置換することが不可能である。

2. ヒト血清 ELISAはすべてIgMとIgGを合わせて30分後に行った。
抗体希釈度は1:200。

ペプチド１ペプチド２ペプチド３実施例３全身性カンジダ症から回復した患者の末梢血から、イ
ムノグロブリンの重鎖および軽鎖可変領域（Ｖ）遺伝子
のライブラリーを作製した。このライブラリーを濃縮し
てLKVIRKNIVKKMIEおよびNKILKVIRKNIVKKに対して活性の
あるものをスクリーニングし、得られたヒト組換え抗体
について、全身性カンジダ症のマウスモデルを用いて治
療活性を検討した。

実験の詳細ライブラリーの作製は、本質的にはマークス（Mark
s）他による記載（J.Mol.Biol.1991;221:581−597）に
従いpCANTAB 5ベクターを用いたが、このベクターはフ
ァルマシア（Pharmacia）社（ミルトン（Milton）、ケ
インズ（Keynes）、英国）からキットの一部として市販
されている。全身性カンジダ症から回復した患者の末梢
血のmRNAから調製したcDNAから得られた重鎖および軽鎖
Ｖ遺伝子を無秩序に組換えて、Not I/Sfi Iで切断したp
CANTAB 5にサブクローニングした。この結果得られ、フ
ァージの表面に発現した一本鎖Fv断片（ScFv）を、特異
的な合成ペプチドエピトープ（LKVIRKNIVKKMIEおよびNK
ILKVIRKNIVKKを含む）に対してパンニングを行うことに
より濃縮した。次いで、ノムノブロッティング（実施例
４参照）を用いて、カンジダ・アルビカンス（Candida
albicans）の47Kd抗原に対して活性を有する個々のクロ
ーンを同定した。さらに検討を行って、陽性の強い組換
え抗体を選択した:A2（LKVIRKNIVKKMIEに対してパンニ
ングしたもの）およびB3（NKILKVIRKNIVKKに対してパン
ニングしたもの）。

メスのBalb/cマウスに、致死投与量のカンジダ・アル
ビカンス（Candida albicans）を静脈内注射した。２種
類の異なる年齢群−体重が約20gの成熟マウス群（実験
１および２）と体重が約12gの若年マウス群−について
試験した。異なる２つのバッチのヒト組換え抗体Ｂを用
いて試験した（一方は実験１、他方は実験２および３に
使用）。実験１においては、この組換え抗体をヒト組換
え抗体ＡおよびヘルパーファージM13 K07と比較して、
カンジダ（Candida）の静注の約２時間後に200μｌの生
理的食塩水、M13 K07またはヒト組換え抗体を投与し
た。実験２および３においては、カンジダ（Candida）
の静注の約１時間後に100μｌの生理的食塩水またはB3
の投与した。

結果注解若年マウスはカンジダ・アルビカンス（Candida albi
cans）に対して比較的抵抗力を有するように思われる
（類似の状況はヒトにおいても生じる）。ヒト組換え抗
体Ｂは、カンジダ（Candida）に対する治療活性を繰り
返し示したが、ヒト組換え抗体Ａはそうではない。

実施例４ヒト組換え抗体B3およびＡについて、ストレプトコッ
カス・フェカリス（Streptococcus faecalis）およびコ
リネバクテリウム・イェイケイウム（Corynebacterium
jeikeium）に対する交差反応性を調べた。

実験の詳細従来より知られた方法（マシューズ（Mattews）、Epi
demiol.Infect.1991;107:273−283;バーニイ（Burnie）
他、J.Clin.Path.1987;40:1149−1158）に従い、カンジ
ダ・アルビカンス（Candida albicans）、コリネバクテ
リウム・イェイケイウム（Corynebacterium jeikeium）
およびストレプトコッカス・フェカリス（Streptococcu
s faecalis）のイムノブロットを作製した。各ブロット
をファージの懸濁液に室温下で２時間インキュベートす
る前に、遊離−蛋白結合サイトをウシ血清アルブミン
（BSA）でゆっくり攪拌しながらブロックした。次い
で、0.05％Tween 20/生理的食塩水で30分間かけて５回
洗浄し、３％BSA中で1:1000に希釈された抗−M13抗体
（米国の5'−3'、ボウルダー（Boulder）社から市販）
に90分間インキュベートした。洗浄を繰り返し、次い
で、アルカリフォスファーゼが結合された抗ヤギ抗体
（1:1000に希釈、シグマ（Sigma）社から市販）に１時
間インキュベートした。洗浄を繰り返した後、従来法に
より（マシューズ（Mattews）、1991年）カラー基質BCI
P NBTによりブロットを展開させた。

結果 B3および（程度は低いが）A2は、カンジダ・アルビカ
ンス（Candida albicans）と同様にストレプトコッカス
・フェカリス（Streptococcus faecalis）およびコリネ
バクテリウム・イェイケイウム（Corynebacterium jeik
eium）と交差反応した。いくつかのバンドが生じた。ス
トレプトコッカス・フェカリス（S.faecalis）の場合
は、バンドは約112Kd、88−90Kdおよび32Kdであった。
コリネバクテリウム・イェイケイウム（C.jeikeium）の
場合、約160Kd、52Kd、47Kdおよび40Kdにおいてバンド
が生じた。カンジダ・アルビカンス（C.albicans）の場
合、47Kdにおいて顕著なバンドが生じた。

注解ヒト組換え抗体B3およびA2は、ストレプトコッカス・
フェカリス（S.faecalis）およびコリネバクテリウム・
イェイケイウム（C.jeikeium）と交差反応しており、こ
れらの菌およびその他のグラム陽性菌に対する治療効果
を有するものと考えられる。

実施例５ドット−免疫結合分析材料と方法ニトロセルロース膜シート（バイオラドラボラトリー
（Biorad Laboratories）製、カリフォルニア州、米
国）の上に１μｌのヒト血清をドッティングした。これ
を10分間乾燥させ、次に、pH7.5のトリス緩衝塩化ナト
リウム水溶液に溶かした３％ウシ血清アルブミンを用
い、37℃、１時間でブロックした。0.9％の重量／体積
の食塩−0.05％Tween80で５回、30分間かけて洗浄した
後、室温下に１時間、ヒト組換え抗体B3（５倍に希釈）
でインキュベートした。次いで、上述したように、30分
間洗浄した後、トリス乾燥塩化ナトリウム水溶液に溶か
した３％ウシ血清アルブミンで1:5000に希釈した抗−M1
3セイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲート（フ
ァルマシア（Pharmacia）社）でさらにインキュベート
した。さらに洗浄した後、３−アミノ−９−エチルカル
バゾール基質（0.1M酢酸ナトリウム（pH5.2）10mlに溶
かした0.4gの３−アミノ−９−エチルカルバゾール/100
mlのジメチルホルムアミドの溶液0.67ml）で展開した。
これを10μｌの30％H₂O₂・H₂O₂で活性化した。ブロット
を30分間インキュベートし洗浄した。得られた結果を１
μｌのカンジダ性抽出物（pressate）（100mg/ml）から
なる陽性対照と比較し、陰性（ゼロ）、弱く陽性（痕
跡）、および陽性（カンジダ抽出物の結果と等価）とラ
ンク分けした。

組換え抗体によるドット免疫結合分析結果対照血清（白血病を伴うか胃腸の大手術後の汎発性また
は経口カンジダの証拠のない患者からの血清）力価：ゼロ痕跡陽性血清の数： 79 ２なし痕跡患者の２例は、コリネバクテリウム・イェイケイ
ウム（Corynebacterium jeikeium）による敗血症が潜在
している５症例に由来する。

局部患部患者（口部／創傷部／膣／静脈線／尿のいずれ
かに局所患部（colonized site）を有する患者からの血
清）力価ゼロ痕跡陽性口部６１創傷部１膣１静脈 3^a 尿２ 1^b a:カンジダ・パラプシロシス（C.parapsilosis）疾患
の１症例を含む。

b:アムフォテリシンＢ（Amphotericin B）処理を必要
とした。

全身性患者（１）２種の異なる部位から少なくとも24時間後に採
取した２組の陽性の培養血液、または（２）死後に得ら
れた培養による組織培養学的証拠と定義する。

それぞれの患者について、連続してサンプルが測定で
きた場合に、検知された最大抗原力価として報告する。

注解 B3組換え抗体を用いるドット免疫結合法によって検知
された抗原は、対照血清および局所患部患者からの血清
を、全身性カンジダ症患者からの血清と識別している。

結論熱ショック蛋白に関して：免疫原としてのエピトープの機能にとって、下線を引
いたアミノ酸は不可欠であり、すなわち、取り換えるこ
とはできない。さらに、異なる疾病の患者の血清は、同
じエピトープ内で若干異なるアミノ酸を認識する抗体を
産生する。

症例24のSLE患者を陽性対照とした。これは、この患
者はカンジダ性47Kd蛋白に対して陽性ではあったが、本
発明の３種類の蛋白のエピトープのいずれも認識しなか
ったからである。

GB（英国特許）2034504に記載されているモノクロー
ナル抗体は、酵母菌感染に対するエピトープの一部分の
みを表すエピトープと反応する（カンジダ・アルビカン
ス（C.albicans）／カンジダ・トロピカリス（C.tropic
alis）／カンジダ・パラプシロシス（C.parapsilosi
s））。

カンジダ・トロピカリス（C.tropicalis）、アスペル
ギルス・フュミガツス（A.fumigatus）およびマラリア
による感染は、KILKエピトープに対する免疫反応性が高
い。マラリアおよびアスペルギルス・フュミガツス（A.
fumigatus）による感染はNIVを含むエピトープも認識す
る。

このようにして、エピトープNKILKVIRKNIVに抗して産
生させることにより、GB（英国特許）2034504に記載さ
れているものよりも活性が高く、さらに広範囲の疾病で
生じるストレス蛋白を認識する抗体を得ることができる
（すなわち、抗体B3）。

熱ショック蛋白エピトープに抗する抗体に関して： XXXLXVIRKXIVおよび／またはXXILXVIXXXXX（ここで、
Ｘは任意のアミノ酸である）に抗して産生された抗体、
特にヒト組換え抗体は、全身性カンジダ症のマウスモデ
ルにおいて防御機能を示した。

本発明は、上述の実施例に限定されるものではなく、
請求の範囲に記載される本発明の範囲から逸脱すること
なく、当業者にとって容易に想到され得るような多くの
変形が可能である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩＣ０７Ｋ 16/12 Ｃ０７Ｋ 16/12 16/14 16/14 Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者マシューズルースクリスティーヌイギリス国チェシャーエスケー９２エヌエイチウィルムスロウゴースフィールドヘイ２ (56)参考文献Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，1991，74, ｐ．20−24 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12B 15/00 - 15/90 C07K 7/08 C07K 14/00 - 16/46 ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】アミノ酸配列NKILKVIRKNIVからなるエピト
ープからなるペプチド。
【請求項２】カンジダ・アルビカンス（Candida albica
ns）、カンジダ・トロピカリス（Candida tropcalis）
またはカンジダ・パラプシロシス（Candida parapsilos
is）、アスペルギルス・フュミガツス（Aspergillus fu
migatus）、プラスモジウム・ヴィバックス（Plasmodiu
m vivax）およびプラスモジウム・ファルシパルム（Pla
smodium falciparum）のHSP90に対して誘起された抗体
と交叉反応することを特徴とする、請求項１に記載のペ
プチド。
【請求項３】カンジダ性HSP90が92および／または47KDa
のストレス蛋白を含む、請求項２記載のペプチド。
【請求項４】アルペンギルスのHSP90が40、51および／
または88/84KDaのストレス蛋白を含む、請求項２または
３記載のペプチド。
【請求項５】寄生生物または真菌の感染に対する診断テ
ストに用いられる、請求項14のいずれかに記載のペプチ
ド。
【請求項６】カンジダ・アルビカンス（Candida albica
ns）、カンジダ・トロピカリス（Candida tropcalis）
またはカンジダ・パラプシロシス（Candida parapsilos
is）、アスペルギルス・フュミガツス（Aspergillus fu
migatus）、プラスモジウム・ヴィバックス（Plasmodiu
m vivax）およびプラスモジウム・ファルシパルム（Pla
smodium falciparum）のHSP90の診断テストの製造に使
用される、請求項５に記載のペプチド。
【請求項７】診断テストが、ドットイムノソルベントア
ッセイ、ラジオイムノアッセイまたはラテックス凝集ア
ッセイである、請求項５または６記載のポリペプチド。