PT90376B - Processo para a preparacao de peptidos env-codificados de hiv capazes de elicitarem anticorpos que inibem hiv em mamiferos e de anticorpos monoclonais que inibem hiv mediante utilizacao desses peptidos - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

DA

PATENTE DE INVENÇÃO

N.° 90.376

REQUERENTE: Ε. I. DU PONT DE NEMOURS AND COMPANY, norte-americana, com sede em Wilmington, Estado de Delaware, Estados Unidos da América,

EPÍGRAFE: Processo para a preparação de pêptidos env-codificados de HIV capazes de elicitar anticorpos que inibem HIV em mamíferos e de anticorpos monoclonais que inibem HIV mediante utilização desses pêptidos

INVENTORES: William Robert Kenealy,

Stephen Robert Petteway, Paul John Durda,

Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 4.° da Convenção de Paris de 20 de Março de 1883.

U.S.A., 26.04.1988, sob ο N2 186,333,

20.03.1989, sob ο Ν2 324,027,

INPI MOD 113 RF 16702

Ε. I. DU PONT DE NEMOURS AND CAMPANY

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE PÉPTIDOS ENV-CODIFICADOS DE HIV CA PAZES DE ELICITAR ANTICORPOS QUE INIBEM HIV EM MAMÍFEROS E DE AN

TICORPOS MONOCLONAIS QUE INIBEM HIV MEDIANTE UTILIZAÇÃO DESSES

PÉPTIDOS

Campos de invenção

A presente invenção refere-se a um péptido sintetizado quimica mente que corresponde a um segmento do vírus da imunodeficiência hu mana (HIV) proteína env codificada utilizável como um agente profiláctico ou como uma vacina para a doença ou infecção por HIV e anticorpos monoclonais para o segmento env - codificado de HIV.

Antecedentes

Descobriram-se anticorpos específicos para o vírus-1 da imunodeficiência humana (HIV-1), o agente causador da sindrome da imunodeficiência adquirida (SIDA), no soro dos indivíduos infectados por HIV (Sarngadharan et al., Science 224, 506-508 (1984); Schupbach et al. , Science 224, 503-505 (1984); Chang et al., Biotechnology 3_, 905-911 (1985); Kenealy et al., Aids Research and Human Retroviruse 3, 95-105 (1987).

O nível dos anticorpos sêricos que bloqueiam a proliferação de HIV (anticorpos que neutralizam HIV) ou que bloqueiam a fusão de cé lulas infectadas com HIV e células não infectadas nas culturas de células (anticorpos que bloqueiam a fusão) ê relativamente baixo quando se compara com a resposta humoral total ao vírus, isto é, os níveis totais de anticorpos específicos para HIV

Weiss et al., Nature 316, 69-74 (1985); Robert-Guroff et al., Nature 316, 72-74 (1985); Weiss et al., Nature 324, 572-575 (1986).

papel dos anticorpos que neutralizam HIV e que bloqueiam a fusão na patogénese da infecção por HIV-1 e a estrutura do epitopes responsáveis por esta actividade biológica, continua por determinar. Sabe-se que o invólucro exterior glicoproteico de HIV-1 (gp 120) se liga a anticorpos neutralizantes humanos, tendo sido utilizado como um agente imunogénico capaz de despoletar anticorpos que neutralizam HIV em animais (Lasky et al., Science 233, 209-212 (1986); Matthews et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83, 9709-9713 (1986); Robey et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84, 7023-7927(1986). Notavelmente, estes anticorpos neutralizantes são referidos como sendo específicos de tipo, isto ê, anticorpos que apenas bloqueiam a proliferação do subtipo HIV-1 ou isolado do qual o agente imunogénico derivou.

Foram identificados numerosos pêptidos e proteínas de HIV que despoletam anticorpos neutralizantes nos animais. Estes incluem péptidos sintéticos que correspondem ãs sequências da proteína gag-codificada, da proteína de transmembrana env-codificada (gp 41) e diversos pêptidos que correspondem a regiões da proteína env-codificada, gp 120 (Putney et al., Science 234, 1392-1395 (1986); Sarin et al., Science 232, 1135-1137 (1986); Kennedy et al., J. Biol. Chem. 262, 5769-5774 (1987); Taylor et al., Proc♦ Natl. Acad. Sei. USA 84, 2951-2955 (1987); Chanh et al., EMBO J. 5, 3065-3071 (1986); Ho et al., J. of Virol. 61, 2024-2028 (1987).

Foi demonstrado que níveis particularmente elevados de anticorpos neutralizantes e bloqueadores da fusão são induzidos nos animais por duas proteínas recombinantes. Uma destas, ê a proteína envglicosilada de comprimento total produzida mediante utium sistema de expressão em células de insecto, designada Rusche et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84, 6924-6928 (1987) 1 e uma segunda é uma proteína não glicosilada produzida por codificada lização de por gp 160 /

E. coli, designada por PBl, que representa uma região de gp 120 (aminoácidos desde o numero 288 até ao n9 472 de HIV-1 III-B) (Putney et al., Science 234, 1392-1395 (1986). Apesar da resposta de anticorpos forte, utilizando-se estas proteínas como agentes imunogénicos, a actividade de neutralização permaneceu restrita e específica do subtipo HIV-1 ou do isolado a partir do qual o agente imunogénico derivou, isto é, III B.

As proteínas recombinantes PE 3 (que correspondem ao terminal amina de gp 120 env-codificado) e ENV 9 (que corresponde ao terminal carboxilo de gp 120 e â maior parte de gp 41) não provocam níveis mensuráveis de actividade de neutralização J^Putney et al., Science 234, 1392-1395 (1986)^J, enquanto a PB 1 era capaz de induzir níveis de anticorpos neutralizantes e bloqueadores de fusão comparáveis ou superiores dos provocados utilizando-se gp 160 recombinante j^Rusche et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84, 69246928 (1987)

Resumo da invenção

Sabe-se que a proteína PB 1 env-derivada de HIV-1 expressa por E. coli, provoca, quando utilizada como imunogénico, níveis elevados de anticorpos neutralizantes e bloqueadores da fusão em animais ^Putney et al., Science 234, 1392-1395 (1986)^ . Esta resposta imunológica nos animais, sugere que esta região env de HIV pode ser utilizável para a terapêutica ou para a prevenção da infecção e da doença por HIV. Fez-se uma análise sistemática para melhor definir segmentos na região de PB 1 de gp 120 que pode estar envolvida na actividade neutralizante e bloqueadora da fusão. Foi efectuada uma análise sistemática que utiliza uma série de péptidos sintetizados quimicamente, sobrepostos, que representam a região inteira de PB 1 (aminoácidos desde o número 288 até ao n9 472 da proteína gp 120 env-codifiçada de HIV 1 III B).

ϊ /

/ .Os péptidos apresentavam entre 15 e 16 aminoácidos de comprimento e sobrepostos entre si por cinco aminoácidos. Estes péptidos sintéticos foram utilizados para imunizar animais de ensaio (cobaias) e os anticorpos antipéptidos resultantes, produzidos nos animais de ensaio, foram analisados para determinação da actividade biológica, incluindo a actividade de neutralização e de bloqueamento da fusão celular de HIV. Os péptidos sintéticos que compreendem a região PB 1 env-codificado de HIV-1 que foram analisados, estão enumerados no Quadro 1. Dos 18 péptidos ensaiados apenas um péptido, designado por 1-69, quando utilizado como imunogênico, provocou anticorpos que bloquearam a proliferação de HIV na cultura de células e a fusão entre células infectadas por HIV e células não infectadas na cultura de células. Esta descoberta indica que o pêptido 1-69 ou péptidos de comprimento aproximado, (10 a 30 aminoácidos ou de preferência de 15 a 25 aminoácidos) incorporando a maior parte da sequência do péptido 1-69 pode ser utilizável como um agente profiláctico ou como vacina para a infecção por HIV ou como um componente de um agente profiláctico ou de uma vacina para a infecção por HIV. Pensa-se que péptidos menores, de 5 a 10 aminoácidos, que incluem parte da sequência do péptido 1-69 sejam utilizáveis para induzir anticorpos que inibem HIV em mamíferos, péptidos utilizáveis incluem QRGPGRA, RIQRGPGRA, GPGRAFVTIG, GPGR AFV e GPGRA. Também se espera que péptidos algo maiores, de cerca de 36 aminoácidos de comprimento e prolongando-se desde a Cis 296 ã Cis 331 de env-codificado de HIV-1 III B (ver Quadro 4) que incluem o péptido 1-69, originem anticorpos que inibem HIV em animais .

Os anticorpos que inibem a proliferação de HIV e que bloqueiam HIV mediado por fusão celular, provavelmente proporcionam resistência maior à infecção por HIV. Tal como aqui se utiliza a designação

Ο / .

anticorpos que inibem HIV inclui os anticorpos neutralizantes e os anticorpos bloqueadores de fusão. A capacidade para detectar a presença ou ausência destes anticorpos que inibem HIV em doentes pode apresentar valor prognóstico importante. As composições farmacêuticas que contêm estes anticorpos podem ser utilizados para imunização passiva de indivíduos expostos a HIV. Além disso, estes anticorpos provavelmente reduzem a velocidade de progressão da doença para SIDA em indivíduos infectados por HIV, assim como têm valor terapêutico potencial para doentes com SIDA. Admite-se que os anticorpos monoclonais da presente invenção que inibem HIV sejam particularmente úteis.

As actividades neutralizantes e bloqueadoras de fusão de HIV dos anticorpos antipéptidos 1-69, parecem restringir-se grandemente aos isolados de HIV a partir dos quais a sequência peptídica derivou, uma vez que HIV-1 III B foi inibido mas HIV-1 RF não foi. Contudo, a região env-codificada homóloga de péptido 1-69 de HIV-1 III B de outros isolados de HIV pode ser identificada facilmente por comparação de sequência de aminoãcidos (Quadro 4), e os péptidos correspondentes podem ser sintetizados e utilizados como agente imunogénicos aplicando-se os processos descritos para o péptido 1-69.

Além disso, pode esperar-se a inibição de subtipos de HIV-1 ou de isolados que apresentem sequências estreitamente relacianadas na região dos aminoãcidos do n9 296 a 331 de gp 120. De facto, o MAB n9 5025, 29.1.1.1. (A.T.C.C. n9 HB 10041) exibe actividade bloqueadora de fusão contra um numero de isolados de HIV-1 tal como que III B e MN.

A designação correspondente autilizada aqui em referência a sequências de aminoãcidos (aa) refere-se à relação entre aminoácidos que estão alinhados uns com os outros quando duas ou mais sequências de aminoãcidos são comparados e alinhados para homologia utilizando-se programas computurizados padrão, tais como os que

Ζ ί 53 estão disponíveis, por exemplo, na IntelliGenetics, Inc., Mountain View, CA ou Genetics Computer Groups University of Wisconsin Biotechnology Center, Madison, WI.

As sequências de pêptidos env-codificados para diferentes isolados de HIV-1 e HIV-2, que correspondem à homologia de região para o péptido 1-69 de HIV-1 III B, estão representadas no Quadro 4. A região env-codifiçada, que corresponde ao péptido 1-69 de HIV-1 III B pode ser identificada utilizando-se processos como os descritos na legenda do Quadro 4. Ainda que as proteínas do invólucro dos diferentes isolados de HIV apresentem regiões de variabilidade considerável na sequência de aminoácidos, a estrutura global da proteína, que inclui, por exemplo, a posição relativa dos resíduos de Cys (ver quadro 4), é bem conservada. Uma vez que a estrutura global a as propriedades funcionais (por exemplo a ligação de CD 4) das proteínas de env dos diferentes isolados de HIV estão bem conservados, espera-se que as regiões env-codificadas, que correspondem ao péptido 1-69 de outros isolados de HIV-1 e de HIV-2, despoletem por um modo similar anticorpos neutralizantes e bloqueadores da fusão de células, nos animais imunizados com o péptido. As vacinas eficazes ou profilácticas para a infecção HIV podem conter uma mistura ou Cocktail de pêptidos que incluam as regiões que correspondem ao péptido 1-69 de HIV-1 III B. De preferência uma mistura destas incluirá pêptidos que correspondem ao péptido 1-69 ou pêptidos equivalentes um poucc maiores ou um pouco mais pequenos, de uma variedade de isolados de HIV. Uma mistura ou cocktail destas, deverá conferir potencialmente uma larga resistência a muitos isolados distintos de HIV.

A presente invenção também se refere a anticorpos monoclonais que inibem HIV para o péptido 1-69 derivado do invólucro de HIV-1.

Em particular, surgiu uma série de anticorpos monoclonais de murino para o péptido derivado do invólucro de HIV sintético, designado por 1-69. Um destes anticorpos monoclonais de murino conhecido pelo seu clone de hibridoma n9 5023, 24.4.1.1. (ATCC n9 HB 10043), demonstrou possuir uma actividade particularmente forte para neutralização do vírus HIV-1 contra o isolado III B e para bloquear a fusão de células infectadas por HIV-1 III B com células alvo não infectadas. Outros destes MAbs, o n9 5025.29.1.1.1. (ATCC n9 HB 10041), demonstrou possuir uma actividade bloqueadora de fusão contra um dado numero de isolados de HIV-1.

Descrição pormenorizada

Demonstrou-se previamente que uma proteína produzida por E.coli designada PB 1, que contém os aminoácidos de 288 a 472 env-codificador, de HIV-1 III B, despoleta anticorpos com actividades de neutralização de HIV e bloqueadora da fusão em animais imunizados (Putney et al., Science 234, 1392-1395 (1986). Analisaram-se sistematicamente, as propriedades antigénicas e imunogênicas de um conjunto de 18 péptidos sintéticos sobrepostos (Quadro 1) abrangendo completamente a região completa de PB 1, numa tentativa para definir os epitopes capazes de despoletarem anticorpos com actividades de neutralização de HIV e de bloqueamento da fusão celular. Os péptidos foram analisados como antigénios para determinar se eram reconhecidos por anticorpos provenientes de amostras de soros seropositivos para HIV-1 humanos. (Quadro 1).

Esta análise revelou dois péptidos, designados por 1-69 e 1-73 que apresentavam reactividade com muitas amostras de soro seropositivos para HIV-1 quando comparadas com a ligação não específica de anticorpos a placas microtituladoras.

A reactividade de diversos péptidos env-codificados com anticorpos humanos nas amostras seropositivas, foi ainda analisada e comparada com amostras de soros seronegativos para HIV-1 de controlo (Quadro 2).

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O péptido deu níveis elevados de reactividade com 12 de 37 das amostras seropositivas de HIV-1 testadas enquanto nenhuma das 47 amostras de controlo seronegativas de HIV-1 testadas apresentavam absorvâncias por ELISA acima do valor de extinção de 0,2. A frequência de reactividade e o nível de reactividade das amostras seropositivas para HIV com os péptidos 1-80 e 1-73 eram menores que com o péptido 1-69. Observou-se alguma reactividade (3 de 47 amostras de soro testadas) dos soros de controlo ccm o péptido 1-73. Existe uma correlação nítida da reactividade da amostra de soro com péptidos 1-69 e 1-80, e seropositividade de HIV-1, isto é, ELISAS que utilizam o péptido 1-69 ou o péptido 1-80 mostram especificidade para anticorpos específicos de HIV. Os péptidos 1-69 e 1-80, e os péptidos correspondentes de outros isolados de HIV são utilizáveis na detecção de anticorpos específicos de HIV an amostras de soro humano para fins de diagnóstico ou prognóstico. O péptido 1-80 contém os aminoácidos do n9 418 até 432 da proteína env-codifiçada de HIV-1 III-B. 0 péptido 1-69 contém os aminoácidos desde o n9 308 até 322 da proteína env-codif içada de HIV-1 III-B. Nas condições utilizadas no Quadro 2, os péptidos 1-68, 1-74, 1-81 e 1-84 foram detectados por amostras muito francamente seropositivas de HIV-1 (menor ou igual que 1 para 37 amostras testadas) . As diferenças nos valores de observância por ELISA e a frequência de amostras de soro positivamente reactivas para um dado péptido, no Quadro 1 e 2 (por exemplo péptido 1-81, 1-84, 1-73, reflectem provavelmente diferenças nas condições utilizadas nos Quadros 1 e 2.

Quando foi investigada a imunogenicidade dos péptidos, (Quadro 3), verificou-se que 5 dos péptidos (1-67, 1-75, 1-77, 1-80 e 1-83) eram incapazes de provocar um título elevado de anticorpos antipéptidos nas cobaias. Das amostras de soro de cobaia que apresentavam níveis significativos de anticorpos antipéptido, apenas as provocadas por o péptido 1-69 tinham actividades detectãveis seguintes:

*

W- ,,

1) reactivos com gp 120 env-codificada (Quadro 3), sobre manchas imunológicas;

2) capaz de imunoprecipitar gp 120 (dados não apresentados);

3) capaz de neutralizar a proliferação de HIV-1 III B em cultura de células (Quadro 3);

4) capaz de bloquear a fusão celular entre células infectadas por HIV-1 III B e células não infectadas na cultura de células (Quadro 3) .

Quando se utilizou um teste de neutralização de vírus, o soro de antipéptido 1-69 forneceu uma inibição de 50% com uma diluição de 1:300o.

Este nível de actividade neutralizante é igual ou superior do previamente referido para anticorpos para gp 120 purificados a partir de células infectadas com HIV ou de proteínas derivadas de env recombinantes ou quaisquer péptidos derivados de HIV sintetizados por via química £ Lasky et al., Science 233, 209-212 (1986); Matthews et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83, 9709-9713 (1986); Taylor et al-, Pro. Natl. Acad. Sei. USA 84, 2951-2955 (1987); Chanh et al., EMBO J. 5, 3065-3071 (1986); Ho et al., J. of Virol. 61, 2024-2028 (1987) . É notãvel e interessante que a sequência peptídica sintetizada quimicamente pequena de uma proteína altamente glicosilada complexa, tal como gp 120, é capaz de provocar uma resposta de neutralização mais forte, aparentemente, do que a proteína natural. Parece que uma resposta imunológica inadequada se pode apropriar antecipadamente de uma resposta protectora. Ê possível que anticorpos específicos para outras regiões de env, para além da região péptida 1-69, interfiram com a ligação de anticorpos neutralizantes específicos para a região péptida 1-69 de env. Também é possível que outros epitopes env-codificados, externos à região peptídica 1-69,interfiram com uma resposta imune forte específica para a região pép/ ί

tídica 1-69 de env. Também se sabe que anticorpos ligados a vírus livres se ligam com maior probabilidade a macrõfagos, aumentando portanto a tendência para os macrõfagos ficarem infectados. Estas considerações podem explicar porque o péptido 1-69 é um agente imunogénico melhor do que segmentos maiores da proteína env, em termos de capacidade para provocar, nos animais, anticorpos que inibem HIV. Assim, a utilização de um imunogénio peptídico apropriado, evita o despoletar de anticorpos específicos para HIV num animal que não tenha a função protectora. Portanto, os soros antipêptido 1-69 foram capazes de bloquear a fusão de células, uma propriedade não exibida por anticorpos caprinos específicos para gp 120 purificados a partir de células infectadas com HIV |^Matthews et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83, 9709-9713 (1986. 0 nível de anticorpos que bloqueiam a fusão num soro antipêptido 1-69 é comparável com os níveis mais elevados encontrados em soros seropositivos para HIV-1 tthews et al., Proc. Natl. Acad. Sei USA 84, 5424-5428 (1987)

MaOs soros antipêptido 1-69 apenas neutralizaram HIV-1 III B e bloquearam a fusão de células infectadas com HIV-1 III B, mas não obtiveram qualquer efeito sobre HIV-1 RF. Hahn et al., e outros

Hahn et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82, 4813-4817 (1985); Starcich et al., Cell 45, 637-648 (1986); Hahn et al., Science 232,1548-1553 (1986) identificaram regiões de variabilidade de aminoácidos prevista na proteína gp 120 e previram que o tipo ou a especificidade do isolado de anticorpos antivirais ê devida ao reconhecimento destas regiões hipervariáveis. Os resultados da presente invenção identificaram uma potente região neutralizante e bloqueadora da fusão, que contém 15 aminoácidos numa das regiões hipervariáveis previstas e apoiam o papel da variação de aminoácidos na neutralização restrita de tipo ou de isolado. A reactividade de soros positivos para HIV-1 com este mesmo péptido indica que esta região proζ /

(11

teica é reconhecida e despoleta anticorpos durante a infecção por HIV-1.

Foram referidas, regiões antigénicas para gp 120 previstas por computador, por Modrow et al. , /_ Modrow et al., J. of Virol. 61, 570-578 (1987)J. A região abrangida pelo péptido 1-69 está numa das regiões previstas como sendo antigénicas para o isolado HIV-1 III-B. Uma fracção do péptido 1-73 também se previu ser antigénica, mas o outro péptido reactivo com soros positivos para HIV-1, 1-80, não o era. A reactividade para o péptido 1-80 merece um exame melhor, uma vez que este péptido é derivado de uma região conservada de gp 120. Assim, o péptido 1-80 deveria ser útil para a detecção de anticorpos humanos despoletados como resposta a muitos isolados de HIV distintos, cujas proteínas env-codificadas podem diferir na sequência nas regiões não incluídas na região conservada.

Ainda que a actividade inibida de HIV dos soros antipéptido 1-69 se apresente como específica para o isolado III-B tem interesse o facto de os anticorpos que mediam a neutralização e que bloqueiam afusão de células apareçam como resposta a uma sequência pêptidica curta única (15 aminoácidos). Este resultado sugere que pode existir um mecanismo comum de neutralização de vírus e de inibição da fusão celular, uma vez que a mesma região de 15 aminoácidos de env parece ser crítica em ambos os processos.

Demonstrou-se antes que as proteínas do invólucro de HIV papel na infectividae virai e na fusão de células infectadas e que certos anticorpos animais ou humanos específicos para proteínas derivadas de env bloqueiam a infectividade e a fusão de vírus/'Putney et al., Science 234, 1392-1395 (1986); Rusche et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84, 6924-6928 (1987)/7- Os presentes resultados demonstraram que os anticorpos responsáveis por estas duas actividades podem ligar-se com uma região única de 15 aminoácidos da gp. 120.

Surpreendentemente, os anticorpos monoclonais da presente invenção mostraram ter actividades de neutralização e bloqueamento da fusão de HIV. A ligação dos anticorpos antipéptido 1-69 para esta região pode também interfrir com a interacção de gp 120 e gp 41, ainda que sejam possíveis outros mecanismos de inibição de HIV por antipéptido 1-69.

Anticorpos monoclonais que neutralizam o vírus e bloqueiam a fusão de células infectadas e não infectadas, podem proporcionar uma resistência maior contra a infecção por HIV evitando entretanto uma resposta imunolõgica adequada e potencialmente nociva.

Podem ser utilizados anticorpos monoclonais para o péptido 1-69 ou para segmentos correspondentes do invólucro proteico de outros isolados de HIV-1 para proporcionar imunidade passiva ou benifício terapêutico com doentes expostos ou infectados com o vírus da SIDA, como reagentes de pesquisa ou como reagentes para desenvolverem anticorpos anti-idiotípicos. Podem ser utilizados anticorpos anti-idiotípicos como imunogénios para desenvolver a imunidade para o antigénio para o qual o anticorpo Ab 1 original se formou. No caso de imunização ã infecção por HIV com anticorpos anti-idiotípicos, pode-se proporcionar uma alternativa segura ã imunização com o vírus total ou com os componentes virais.

Desenvolvem-se uma série de anticorpos monoclonais para o péptido 1-69 sintético. Um destes anticorpos monoclonais conhecido pelo seu clone de hibridoma n<? 5023, 24. 4. 1.1. (ATCC n? HB 10043) mostrou possuir uma actividade particularmente forte de neutralização do vírus HIV-1 contra o isolado III-B e para bloquear a fusão de células, infectadas com HIV-1 III-B, com células alvo não infectadas. Deste modo, espera-se que este seja útil para proporcionar imunidade passiva em doentes expostos ao isolado de HIV-1 III-B ou como um agente terapêutico para retardar o curso da doença em doentes infectados com o vírus. O MAb n? 5023, 24. 4. 1.1. exibiu acti13 vidade acentuada por mancha de Western em relação a gp 120 env, o que sugere a sua utilidade potencial para fins de diagnóstico. Estes anticorpos monoclonais podem também constituir reagentes principais para serem utilizados no desenvolvimento anticorpos anti-idio típicos para a produção de vacina. Outros MAbs surgidos contra este mesmo péptido possuem níveis menores de actividade neutralizante; es tes também serão descritos em seguida.

Nos Quadros 1 e 4 apresentam-se as sequências de aminoãcidos (aa) de pêptidos utilizando a simbologia de uma única letra para representar os resíduos de aminoãcidos, como descrito por Lehninger, Biochemistry, 2- edição, p. 72, Worth Publishers, Inc. (1975).

Assim, a sequência de aminoãcidos do péptido 1-69 pode ser iden tificada por RIQRGPGRAFVTIGK ou por Arg-Ile-Gln-Arg-Gly-Pro-Gly-ArgAla-Phe-Val-Thr-Ile-Gly-Lys. Uma fonte importante de informação acerca das composições farmacêuticas e formas de dosagem é o Remington's Pharmaceutical Sciences, 17- edição (19 85) Mack Publishing Company, Easton, PA 18042.

Legendas das figuras

Figura 1 Mapa da sequência de HIV-1 env-codificadora coberta por pêptidos sintéticos sobrepostos. As ãreas a cheio representam regiões de proteína conservadas e as ãreas sombreadas representam regiões hipervariãveis. Putney et al., Science 234, 1392-1395 (1986); Sarin et al., Science 232, 1135-1137 (1986).

Figura 2 Imuno-reactividade em ELISA de fase sólida de vãrios MAbs com pêptidos 1-69 (o péptido de imunização), 1-178, 1-177, 5, 1-68 e 1-70. As sequências destes pêptidos estão representadas no Quadro 6.

Materiais e métodos Síntese e caracterização dos pêptidos ζ

Os péptidos sobrepostos foram preparados utilizando-se o Rapid Multiple Peptide Synthesis systema (RaMPS, E. I. du Pont de Nemours and Company, Wilmington, DE). Este sistema utiliza quimica de FOMC de fase sólida num formato manual. Os suportes sólidos eram resinas de álcool p-alcoxibenzílico da Bachem Inc. (Torrance, CA.). As substituições de amina nas resinas variavam desde aproximadamente 0,25 a 0,65 mmoles/g. Os ésteres pentafluorofenílicos dos aminoácidos protegidos (Milligen, Bedford, MA) foram utilizados para a estratégia de activação primária, com apoio de hidroxibenzotriazol ou de anidrinos simétricos preformados reservados como estratégia alternativas. As eficiências de ligação foram controladas qualitativamente por ninhidrina (Teste de Kaiser) ou por isatina, relativamente aos resíduos adicionados ãs prolinas. Ambos os testes detectaram grupos amina que não reagiram. Deixando cada ligação reagir atê ã obtenção de um teste Kaiser ou de isatina negativo, puderam-se obter eficiências de acoplamento superiores a 99%. A clivagem das resinas peptidilicas por meio de hidrólise ácida forneceu péptidos com grupos carboxílicos livres nos seus C-terminais. Estes péptidos foram caracterizados primeiro em relação à consistência de lote por cromatografia de fase inversa numa coluna Pharmacia FPLC PepRPC HR 5/5 utilizando-se um gradiente de acetonitrilo/água entre 20 e 80%. Todos os péptidos foram depois analisados por espectometria de massa de bombardeamento atómico rápido . Admitia-se que a sequência projectada de um dado péptido estava presente se um ião principal do M+H calculado era evidente. Aqueles péptidos que não exibiam nem pico principal distinguível por FPLC nem ião molecular de M+H de massa eram rejeitados e ressintetizados.

Ensaio de imunoabsorção ligada a enzima (ELISA). Detecção da ligação de anticorpos a péptidos.

( ¹⁵ rr

Imobilizaram-se directamente péptidos sintéticos sobre placas

Cr) microtituladoras Imulon^II utilizando-se glutaraldeído. As placas foram activadas com glutaraldeído a 2% durante 2 horas ã temperatura ambiente ou com glutaraldeído a 0,1% durante 30 minutos e depois lavados com ãgua desionizada. Rotineiramente, utilizavam-se duas con dições de tratamento com glutaraldeído; o glutaraldeído a 2% era utilizado para assegurar a ligação adequada do péptido ã placa, e o glutaraldeído a 0,1% para evitar a alteração dos sítios de ligação. A cada cavidade adicionaram-se 100 91I de soluções de péptido contendo 10 jig/ml de tampão de carbonato de hidrogénio e sódio 60 mM, de pH 9,6 e incubaram durante a noite à temperatura de 4°C. As placas foram lavadas e bloqueadas com PBST (solução de cloreto de sódio, tamponada com fosfato mais 0,05% de Tween^.0) durante 1 hora â temperao ° tura de 37 C. e armazenaram-se a seco, a temperatura de 4 C.

Os péptidos que não reagiram com soros seropositivos de HIV, quando directamente ligados às cavidades das placas microtituladoras utilizando-se o processo de glutaraldeído anteriormente referido. Também foram conjugados com albumina de soro humano (HSA) como se descreve a seguir. Este processo foi utilizado para assegurar a imobilização do péptido sobre a placa microtituladora. 0 conjugado péptido - HSA foi imobilizado nas cavidades da placa microtituladora utilizando-se o processo referido anteriormente com excepção de o glutaraldeído, que não foi incluído na reacção.

Imediatamente antes da utilização, quando indicado, as placas foram novamente bloqueadas com 100 jil de diluente (PBST + albumina de soro bovino a 5% + soro de caprino normal inactivado por calor a 20% + 0,1% de azeto de sódio + 0,05% de timerossal) durante 30 a 60 minutos ã temperatura de 37°C. Adicionou-se a cada cavidade 100 yil de amostras de soro humano diluído a 1:20 com o diluente e incubaram-se durante 2 horas ã temperatura ambiente. A incubação com conjugado de fosfatase alcalina - IgG de caprino anti-humana (Jackson ί

V

Immunoresearch Laboratories Avondale, PA) foi realizada durante uma hora à temperatura ambiente e desenvolveu-se a côr durante uma hora à temperatura ambiente, utilizando-se como substrato fosfato de orto-nitrofenol. A densidade optica ou a absorvância da mistura reaccional determinou-se utilizando o leitor de placas microtituladoras.

Conjugação de péptidos com proteínas veiculares

Os péptidos foram conjugados com ovalbumina ou com hemocianina de lapa antes da imunização. Para os estudos por ELISA, utilizou-se seroalbumina humana (HSA) como proteína veicular. A proteína veicular (2 mg/ml) foi activada com glutaraldeído a 0,5% durante 30 a 60 minutos, à temperatura ambiente, e em seguida adicionada com igual volume de solução do péptido (2 mg/ml em dimetilsulfõxido). A reacção teve lugar durante a noite à temperatura de 4°C., depois do que a mistura reaccional foi dialisada durante a noite contra água desionizada ou glicina 0,1 M, a pH 7,0 no caso de albumina do soro humano .

Processos de imunização

Imunizaram-se cobaias e coelhos aplicando-se protocolos de imunização convencionais. As cobaias e os coelhos foram imunizados inicialmente com 100 a 200 pg da proteína veículo conjugada com o péptido em adjuvante completo de Freund e inoculada boosted utilizando-se metade da quantidade do conjugado péptido-proteína veicular em adjuvante de Freund incompleto cada duas semanas posteriores. Após cada uma das inoculações boost recolheram-se amostras de soro.

Ensaios de neutralização de HIV e de fusão de células

Misturaram-se e incubaram-se aproximadamente 500 unidades infecciosas TCID_5q de HIV-1 III B ou de HIV-1 RF em 20 pl, com 20 pl de diluições de soro durante 30 minutos ã temperatura de 37°C. Adiciona4 ram-se 4x10 células Molt 4 num volume de 100 pl e realizou-se a incubação durante 6 dias a temperatura de 37°C. A diluição final da ζ

/

amostra de soro era de 1:20. Por adição de meio fresco (RPMI + soro de vitela fetal a 20%) o volume total de cada cultura foi duplicado diariamente. No 69 dia, retiraram-se amostras de 100 pl do sobrenadante e ensaiaram-se para determinar o nível de antigénio virai p24 de gag-codificado utilizando-se um ensaio de captura de antigénio (Du Pont, Wilmington, DE).

O ensaio de fusão de células foi descrito por Matthews et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84, 5424-5428 (1987). Resumidamente, misturaram-se 5000 células CEM cronicamente infectadas com HIV-1 III B ou com HIV-1 RF com 75 .00 0 células Molt 4 num volume de 100 pl, em metade da ãrea de uma placa de 96 cavidades. A diluição final dos soros no ensaio foi de 1:20. Decorridos 24 horas, enumeraram-se visualmente células gigantes com uma amplificação de 40x.

Radioimunoprecipitação

Para o ensaio utilizaram-se 3 ml de meios de cultura de 8x10 células marcadas com 500 pCi de metionina (^s, 600 pCi/mmoles) e 35 com 500 liCi de cisteína ( S, 600 pCi/mmoles) durante 4 horas. Os meios de cultura foram pré-absorvidos com soro humano normal e proteína A-Sepharose. As proteínas foram imunoprecipitadas utilizando-se amostras de soro humano HIV-1 positivo ou amostras de soro de cobaia e proteína A-Sepharose. As proteínas foram separadas por NaDodSo^-PAGE (a 10%) e fez-se a autoradiografia do gel.

Exemplos

Exemplo 1

Ligação de anticorpos humanos com péptidos sintetizados por via química correspondentes a env de HIV-1 III B.

Os péptidos foram sintetizados como se descreveu na rubrica Materiais e Métodos. Este processo permitiu a síntese de péptidos em quantidades suficientes para sondar a reactividade de anticorpos humanos e para a imunização de animais. A região abrangida pelos péptidos estã indicada na figura 1 e inclui a sequência da proteína reζ

combinants de PBl (Putney et al., Science 234, 1392-1395 (1986).Os péptidos foram projectados com 5 aminoácidos sobrepostos de maneira que qualquer sequência de 6 aminoácidos consecutivos esteja representada .

Todos os péptidos representados no Quadro 1 foram analisados relativamente à reactividade para 12 amostras de soro humano HIV-1 seropositivos, isto é, reconhecimento do péptido por anticorpos específicos para HIV humano. 0 Quadro 1 representa um número de amostras de soro de um dado péptido que exibiram uma média de absorvância por ELISA 5 vezes superior à absorvância de fundo ( background ), obtida com uma amostra de soro, utilizando cavidades brancas ( blank ) tratadas com glutaraldeído , que não continham péptido. 0 Quadro 1 mostra os resultados obtidos utilizando-se no processo de acoplamento glutaraldeído a 2%. As maiores absorvâncias por ELISA foram para os péptidos 1-69 e 1-73 e estes péptidos também corresponderam ã percentagem mais elevada de amostras de soro que reagiram com eles. Os péptidos que se seguem são classificados como reactivos utilizando-se uma absorvância de extensão por ELISA 10 vezes superior à absorvância de fundo obtida com as cavidades de controlo não contendo péptido (designação peptídica/número de soros positivo) : 1-69/5, 1-72/1, 1-73/3, 1-74/2, 1-77/1, 1-78/1,1-81/2, 1-83/1, e 1-84/1.

Quando se utilizou glutaraldeído a 0,1% no processo para ligação do péptido, asabsorvâncias de fundo por ELISA foram menores. Nesta análise o único péptido que apresentou absorvância superiores a 5 vezes a de fundo foi o péptido 1-69. Nove das doze amostras de soro reagiram com o péptido 1-69 com uma absorvância média de 1,06 - 0,47.

Se a absorvância da extinção por ELISA utilizada era de 10 vezes superior ã de fundo, 6 das 12 amostras de soro foram classificadas como positivas para o péptido 1-69 utilizando-se o processo de glutaraldeído

a 0,1% para a ligação do péptido.

Os pêptidos 1-67, 1-70, 1-71, 1-75, 1-76, e 1-79, que não se apresentaram como ligando-se a anticorpos humanos na experiência do Quadro 1, foram ensaiados utilizando-se uma terceira técnica para a imobilização peptídica na placa microtituladora. Estes pêptidos foram primeiramente conjugados com albumina de soro humano (HSA) e em seguida o conjugado péptido - HSA foi mobilizado na placa microtituladora e ensaiado em relação à reactividade com amostras de soro humano HIV-1 positivas por ELISA. Estes conjugados peptídicos também não forneceram absorvâncias significativamente acima das dos soros do controlo, por ELISA.

No Quadro 2 .apresentam-se os resultados de 37 amostras de soro HIV-1 seropositivos e 49 amostras de soros HIV-1 seronegativos normais, analisados utilizando-se pêptidos escolhidos por ELISA. Três amostras de soro normal forneceram absorvâncias por ELISA acima da extinção utilizando-se o péptido 1-73. Nenhuma das amostras de soros normais HIV-1 seroneç^tivos se mostraram positivas, utilizando-se os pêptidos 1-69 ou 1-80 em ELISA. Das 37 amostras de soro seropositivo para HIV-1 testadas, 12 mostraram-se positivas utilizando-se em ELISA o péptido 1-69, 16 foram positivas com o péptido 1-73 por ELISA e 14 foram positivas utilizando-se o péptido 1-80 por ELISA. As amostras de soro HIV-1 positivas foram mais reactivas com o péptido 1-69 comparativamente ao péptido 1-73 ou 1-80, com base nos valores médios de absorvância por ELISA. O desvio-padrão elevado e a média baixa para o péptido 1-73 indicam que muitas das amostras HIV-1 positivas não são mais reactivas com este péptido do que algumas amostras de soro normal. Por outro lado, o desvio-padrão elevado para 1-69 ou 1-80 ê representativo de uma larga variação de reactividade de soro para soro. O péptido 1-69 ê derivado de uma das regiões hipervariãveis da proteína gp 120 env-codificada Modrow et al., J. of Virol. 61, 570-578 (1987)I (Quadro 4) enquanto os pêptidos 1-73 e 1-80 foram

V.

derivados de regiões menos variáveis que apresentam alguma conserΓ vação de sequência entre os diferentes isolados do vírus Modrow et al., J. of Virol. 61, 570-578 (1987)

Dado que o péptido 1-69 é derivado de uma região hipervariãvel, ê surpreendente que uma percentagem relativamente elevada das amostras de soro HIV-1 seropositivas fossem consideradas como positivas utilizando-se o péptido 1-69, por ELISA. Ê possível que muita da imunoreactividade seja específica para a sequência Gly-Pro-Gly altamente conservada, com o péptido 1-69. Os valores de absorvância por ELISA obtidos quando se utilizou o péptido 1-69 para os soros HIV-1 positivos são em média superiores aos de 1-73 e 1-80, mas, contudo, os ensaios com estes péptidos não foram optimizados. As absorvâncias de ELISA menores, para as amostras de soro com o péptido 1-73, como se mostra no Quadro 2, quando comparado com o Quadro 1, constituem um resultado da incubação das placas com o diluente antes da exposição ao soro.

Exemplo 2

Péptidos sintéticos correspondentes a env de HIV-1 III B como imunogénios.

Todos os péptidos representados no Quadro 1 foram conjugados com uma proteína veicular (hemocianina de lapa ou de ovalbumina) e cada conjugado péptido-proteína veicular foi utilizado para imunizar duas cobaias. As cobaias foram escolhidas por representarem um sistema conveniente de ensaio animal. As amostras de antisoro resultantes das cobaias foram controladas relativamente ã reactividade antipeptídica utilizando-se o processo de ELISA. O péptido 1-76 foi injectado inicialmente em duas cobaias, mas os animais sucumbiram imediatamente apõs a injecção inicial. 0 péptido foi em seguida injectado em coelhos onde anticorpos antipêptido foram despoletados sem efeitos adversos. Escolheu-se um período de seis meses para o teste antiviral, / 21 isto é, a neutralização de HIV e bloqueamento da fusão celular, características dos antisoros de cobaia.

Os resultados do Quadro 3 demonstram que a maior parte dos péptidos induzem a produção de anticorpos específicos do péptido cerca de 6 meses após a primeira imunização. Ainda que tivessem sido produzidos diferentes níveis de anticorpos, não existiu qualquer caso onde apenas um animal do par produzisse anticorpos. Os péptidos 1-67, 1-75, 1-77, 1-80, e 1-83 provocaram o aparecimento de níveis muito baixos de anticorpos antipeptídicos sob as condições utilizadas para a conjugação e imunização. Os animais que produziram níveis significativos de anticorpos antipeptídicos demonstraram, de um modo geral, reactividade cerca do terceiro mês e o nível aumentou nos dois ou três meses seguintes.

As únicas amostras de soro antipeptídico que se ligaram a gp 120 em tiras de imunoblot foi o antipéptido 1-69; estes mostravam reactividade evidente com apenas as bandas 120/160 de HIV-1 III B (da dos não apresentados). As amostras de soro antipéptido 1-69 representaram também as únicas amostras de soro nestas experiências capazes de radioimunoprecipitar gp 120 proveniente da estirpe HIV-1 III B (dados não representados). Quando analisado por imuno-mancha utilizando-se a proteína produzida por Escherichia coli recombinante ENV-14 (ENV-14 abrange os aminoácidos 40 a 511 de HIV-1 III Β), que inclui a região gp 120 donde são derivados os péptidos, detectou-se reactividade apenas sobre os antisoros específicos para os péptidos 1-68, 1-69^1-76, e 1-82. Todos estes péptidos, excepto o 1-69, contêm sítios de glicolização potenciais. É possivel que a glicolização gpl20 em células de mamíferos, impeça a ligação de anticorpos específicos para (os não glicozilados) péptidos 1-68, 1-76 e 1-82. As amostras de soro de cobaia foram também testadas em relação à sua capacidade para inibir a proliferação ds HIV, isto é, de neutralizar HIV e para ί 2

bloquear a fusão de células entre células infectadas por HIV e células não infectadas, em culturas de células (Quadro 3). As únicas amostras de soro que foram capazes de neutralizar HIV-1 III B e bloquear a fusão foram as que se desenvolveram contra o péptido 1-69. Ambas as actividades de neutralização e de bloqueamento da fusão estão indicadas para o tipo específico, uma vez que HIV-1 III B foi neutralizado pelos anticorpos anti-péptido 1-69, enquanto HIV-1 RF não o foi. Isto ê também verdade para o bloqueamento da fusão de células .

Como se mostra no Quadro 5, o aparecimento de anticorpos que blo queiam a fusão de células HIV detectáveis nos animais imunizados com o péptido 1-69, não ocorre até ao 59 mês apõs o início da imunização. 0 titulo máximo de anticorpos para esta actividade foi obtido aos 6 meses apõs o início da imunização.

Quadro 1

Reactividade por ELISA de amostras de soro seropositivos HIV-1 com pêptidos que correspondem ãs sequências de aminoácidos de HIV-1

III B env-codificado.
	PÉPTIDO	Número de 12 soros testados positivos por	Absorvãncia dos soros pc
Número	Sequência	ELISA	de péptido	vos	+ <	SD
1-67	LNQSVGINCTRPNNNT		0		x
1-6 8	RPNNNTRKSIRIQRG		1	0,23	Τ’ 4»	0,00
1-69	RIQRGPGRAFVTIGK		8	0,79		.0,40
1-70	VTIGKIGNMRÇAHCNI		0
1-71	QAHCNISRAKWNNTL		0		χ
1-72	WNNTLKQIDSKLREQF		4	0,29	+ _1_	0,10
1-73	KLREQFGNNKTIIFK		10	0,85	0,44
1-74	TIIFKQSSGGDPEIV		4	0,34	T	0,10
1-75	DPEIVTHSFNCGGEF		0
1-76	CGGEFFYCNSTQLFNS		0		+ _1_
1-77	TQLFNSTWFDSTWST		5	0,36	0,13
•1-78	STWSTKGSNNTEGSD		4	0,30		0,12
1-79	TEGSATITLPCRIKQI		0		X
1-80	CRIKQIINMWQEVGK		2	0,22	τ χ	0,06
1-81	QEVGKAMYAPPISGQI		5	0,37	r χ	0,10
1-82	PISGQIRCSSNITGL		1	0,21	r χ	0,02
1-83	NITGLLLTRDGGNSNE		3	0,29	χ	0,06
1-84	GGNSNNESEIFRPGG		5	0,31	I	0,06

/ ~

Os ensaios ELISA realizaram-se como se descreveu na rubrica Materiais Métodos utilizando-se o processo de glutaraldeido a 2% para a ligação às placas. Os soros foram classificados como positivos se forneciam absorvância por ELISA no ensaio peptídico 5 vezes superior às cavidades de controlo tratadas com glutaraldeido, mas que não continham o péptido. As absorvâncias médias e o desvio-padrão foram calculados utilizando-se todas as determinações para os soros reactivos (em cavidades duplicadas para cada soro). Testaram-se 12 amostras de soro seropositivo HIV-1.

Quadro 2

Comparação da reactividade de amostras de soros humanos seronegativos e seropositivos de HIV-1 pelo método de ELISA com péptidos escolhidos.

SOROS Número do péptido	SEROPOSITIVOS HIV	SOROS SERONEGATIVOS NORMAIS Número de so-
Números de positivos de 37 soros testados por ELISA de péptido	Absorvância média de soros positivos + SD
ros de dos de	positivos 47 testa- por ELISA péptido	Absorvância média de soro positivos + SD
1-68	1	0,21 ; 0,00		0
1-69	12	0,71 + 0,49		0	—
1-73	16	0,28 + 0,13		3	0,24 + 0,0
1-74	0			0
1-77	0			0
1-80	14	0,34 + 0,24		0
1-81	1	0,21 ; 0,00		0
1-84	0			0

Os ensaios de ELISA realizaram-se como no Quadro 1, com excepção das cavidades microtituladoras terem sido bloqueadas com diluente durante uma hora antes da utilização. As amostras de soro foram classificadas como positivas se forneciam absorvâncias de ELISA superiores a 0,2. Foram ensaiadas 37 amostras de soros positivos HlV-i e 47 amostras de soros normais.

/

L.

Caracterizaçao e avaliação da actividade antiviral de anticorpos despoletados por péptidos.

Péptido* *	Diluição+ limitante	Ensaio de** fusão	Actividade de^ neutralização	Immunoblot
gp 120	env
1-67	< 20	59,ND	>800
1-67	< 20	69,65	>800	-	-
1-68	4000	70,78	>800	-	+
1-68	870	88,60	>80 0	-	+
1-69	5000	3,0	<1.5	+	+
1-69	970	0,0	<1.5	+	+
1-70	1650	66,71	800	-	-
1-70	80	68,58	>800	-	-
1-71	3030	63,48	>800	-	-
1-71	5310	72,72	>800	-	-
1-72	1050	68,65	>800	-	-
1-72	660	64,48	>800	-	-
1-73	1020	66,62	>800	-	-
1-73	1580	ND, ND	>800	-	-
1-74	680	61,63	>800	-	-
1-74	4170	68,55	>800	-	-
1-75	<20	66,70	800	-	-
1-75+	<20	53,64	>800	-	-
1-76	4280	68,71	>800	-	+
1-76	22640	65,88	>800	-	+
1-77	<20	ND, ND	>800	-	+
1-77+	<20	53,57	>800	-	-
1-78	10490	53,ND	>80 0	-	-
1-78	12210	58,65	>800	-	-
1-79	5430	55,49	>800	-	-
1-79	430	61,56	>800	-	-
1-80	30	63,66	800	-	-
1-80 +	<20	54,53	>800	-	-
1-81	8290	69,62	>800	-	-
1-81	10820	55,56	>800	-	-
1-82	3270	49,55	>800	-	-
1-82+	660	47,48	550	-	+
1-83+	<20	64,52	>80 0	-	-
1-83	*<20	58,64	>800	-	-
1-84	980	55,51	>80 0	-	-
1-84	2480	65,49	>800	-	-

Notas do Quadro 3 * As cobaias foram utilizadas para todos cs péptidos com excepção do 76 que foi injectado em coelhos. Estes foram sangrados 2 a 5 meses após a injecção inicial; todos os outros foram sangrados ao fim de 6 meses.

+ A diluição limitante foi calculada a partir das curvas de diluição /

como a diluição à qual se poderia obter uma absorvância de' 0?l.

Os números de ensaios de fusão representa o número de células gigantes formadas com uma diluição de soro a 1:10. Os soros de controlo tinham adicionada 50,65 células gigantes; ND=não efectuado. A actividade de neutralização foi realizada como se descreve na rubrica Métodos e representa a quantidade de p24 presente no sobrenadante em ng/ml.

y

Quadro 4 ( -

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				F	1	1	1	1	1	1 <	1	1	1	1 1	1	1	X	1	1
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Nota do Quadro 4

As sequências de aminoácidos env HIV foram obtidas e são totalmente referenciadas em Human Retroviruses and AIDS 1987, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM. As sequências de aminoácidos env -codificadas são alinhadas pela homologia utilizando-se programas computurizados Standard fornecidos por, por exemplo, Intelligenetics, Inc., Mountain View, CA, ou Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, Madison, WI.

Um traço (-) indica que o aminoácido naquela posição é idêntico ao aminoácido correspondente, isto é, o aminoácido que está alinhado na sequência de BH10. Um ponto (.) indica que existe um hiato e que não está presente nenhum aminoácido naquela posição. Os hiatos são introduzidos para melhorar o alinhamento da sequência. A sequência do péptido 1-69 derivado de HIV-1 III B env-codificado ê constituída pelos aminoácidos do número 308 até 322 (sistema de numeração de acordo com Human Retroviruses and AIDS 1987, Los Alamos National Laboratory). A região que corresponde ao péptido 1-69 de HIV III Β (BH10, HXB2, BH8, HXB3, PV22) em outros isolados de HIV encontra-se numa sequência de aminoácidos de 15 a 25 colocado aproximadamente a meia distância de dois resíduos Cys altamente conservados assinalados por um círculo, que correspondem ao aminoácido do número 296 ao número 331 no isolado HIV-1 III B. Uma sequência de Gly-Pro-Gly assinalada por um círculo encontra-se na maior parte das regiões env-codificadas correspondendo ao péptido 1-69 de diferentes isolados HIV. A região env-codificada num isolado HIV correspondente ao péptido 1-69 de HIV-1 III B é incluída nas posições de aminoácidos alinhados utilizando-se programas computurizados referidos anteriormente com aproximadamente os aminoãcidos desde o número 304 até 326 de HIV-1 III B.

8 /

'-τ' ) 5»

Quadro 5

Níveis de anticorpos bloqueadores de fusão despoletados pelo
péptido 1-69. Tempo(em meses) Titulo de antisoro após o início de ELISA do pépti- Animal da imunização do 1-69	Titulo de actividade da fusão	antisoro de bloqueadora
GP69A 0	c 20		<10
1	<20		<10
2	470		<10
3	4240		<10
4	2080		<10
5	3250		10
6	5000		20
7	3200		20
8	5430		20
9	9370
GP69B 0	< 20		<10
1	<20		<10
2	280		<10
3	840		<10
4	730		<10
5	1490		10
6	970		20
7	910		20
8	1650		20
9	950		20

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Exemplo 3

Preparação de anticorpos monoclonais para o péptido 1-69 Materiais e Métodos

Péptidos e péptido conjugados péptido 1-69 com a sequência de aminoácidos RIQRGPGRAFVTIGK, foi cbtido nos Península, Laboratories Belmont, CA 94002, sob a forma de uma substância 74% pura. Estava conjugado com ovalbumina de clara de ovo de galinha através de glutaraldeído Reichlin, M., Me th. in Enzimol 70: 159-165 (1980) . Este conjugado peptídico ê referido pela designação abreviada oval-glut-69. (Outros conjugados de proterna-péptido são designados por modo idêntico neste exemplo). O péptido 1-69 foi também ligado com tiroglobulina (BTG) utilizando-se a carbodiimida solúvel na ãgua,· ou l-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (ECDI) Goodfriend et al., Science 144 : 1344-1346 (1964) .

Após o acoplamento, os conjugados foram dialisados contra solução de cloreto de sódio tamponada com fosfato (PBS), para eliminar o péptido livre e o excesso de reagentes de acoplamento.

Além disso, o péptido 1-69, um péptido sintético derivado do invólucro de HIV-1 (designado por péptido número 5) com a sequência MRDNWRSELYKY, como os aminoácidos números de 475 a 486, foi incluído como péptido de controlo. Um MAb para o péptido n9 5 que também reage com gpl20 de HIV-1 tinha sido anteriormente descrito Durda et al., AIDS Research and Human Retroviruses 4_ : 331-342 (1988)

Imunização e produção de anticorpos

Ratos com oito semanas de idade, Balb/c x C57 Bl/6 Fl, animais número 5020-5029, imunizaram-se pelo processo descrito por French et al., Immunology Today 1_ : 344-346 (1986) . Resumidamente, administrou-se uma única inoculação intraperitoneal de 100 ^ig de conjugado de oval-glut-69 misturado a 1 : 1 com adjuvante completo de Freund. Decorridos quatro semanas, os ratos foram sangrados e as ;

ί · respostas do anticorpo específico para o péptido foram avaliadas. Os ratos ficaram em repouso até se observar diminuição nos seus títulos de anticorpos momento em que foram estimulados com lOO^ig de conjugado oval-glut-69 em adjuvante incompleto de Freund. De uma maneira idêntica, os animais numeros 5040 a 5049 foram imunizados e estimulados com BTG-ECDI-69. Após quatro dias de recepção da dose estimulante do conjugado, os ratos foram sacrificados e os esplenocitos foram refundidos com células de mieloma SP2/0-Ag 14 (ATCC número CRL 1581) por um processo de fusão de hibridoma típico Galfre et al., Nature 277: 131-133 (1979) . Outros parceiros de fusão apropriados incluem P3/

NSl/l-Ag4-l(ATCC n9 TIB 18); P3X63Ag8U.1(ATCC n9 CRL 1597); e P3X63 Ag8.653 (ATCC n9 CRL 1580).

A seguir à fase da selecçâo dos híbridos com interesse por ELISA de fase sólida e mancha de Western cloraram-se hibridomas duas vezes por diluição limitada (uma célula por três cavidades).

Produziram-se anticorpos Bulk como ascites nos ratos Balb/c x C57B1/6 Fl. Os líquidos ascíticos purificaram-se por precipitação com sulfato de amónio e cromatografia de afinidade para a proteína A. Ey et al., Immunochemistry 15 : 429-436 (1978) . As imunoglobulinas foram classificadas como IgGl, excepto para MAb n9 5025,

29.1.1.1 e n9 5023,24.5, que são IgG2b.

Ensaio de imunoabsorção ligada a enzima de fase sólida (ELISA)

Os conjugados péptido proteína (100 ng/cavidade) tais como os descritos anteriormente, por exemplo, BTG-ECDI-69, foram absorvidos em placas microtituladoras Immulon^II (Dynatech Laboratories, Inc.,

Chantilly, Va. 22021) em tampão de carbonato de sódio 0,1 M ph 9,6, _ o a temperatura de 4'C. durante 18 horas Voller et al., Manual of

Clin. Immun. 69 : 506-510 (1976) . Em seguida, as placas foram lavadas com Tween® 20 a 0,05% em PBS (solução de cloreto de sódio tamponada com fosfato). Os hibridomas foram testados em releção ã proζ

dução de anticorpos que se ligam ao conjugado peptidico nas placas, como descrito por Durda et al., AIDS Research and Human Retroviruses 4 : 331-342 (1988), cujo o conteúdo ê aqui incorporado como referência.

Electroforese e Imuno-Mancha de Western te 5 minutos £ Laemmli, Nature 277 : 680-685 (1970)^ e submetido

Obteve-se na E.I. du Pont de Nemours, Wilmington, DE, HTLV-III B sob a forma de um lisado em Triton^X-100 a 1%, com uma concentração de 800 ^ig/ml de proteína. O lisado foi desagregado com um tampão de . ç amostra contendo 2-mercaptoetanol a 5%, a temperatura de 100 C. durana electroforese num gel com gradiente de acrilamida de 5 a 15% (lOcm x

12cm x 0,15cm). Na amostra foram incluídos marcadores de peso molecular de proteína marcada com I (Du Pont/NEN Research Products). As proteínas virais foram electro-transferidas (electro-transblotted) para nitrocelulose e as manchas de Western foram realizadas essencialmente como descrito por Tsang et al.,

Meth. in Enzymol, 92 :

377-391 (1983)J . Como tampão diluente para as imunomanchas utilizou-se leite em põ não gordo a 5% contendo soro caprino normal a 4% em

PBS .

Inibição da actividade de coloração por manchas de Western

Os péptidos 1-69 e n9 5, referidos anteriormente, foram diluídos num diluente de mancha de Western até 10 ^ig/ml assim como os MAbs purificados. Os anticorpos e os péptidos foram associados a 1:1 e deio xados a incubar durante uma hora a temperatura de 22 C. Foram, depois, analisados em relação ã formação de manchas de Western como se referiu anteriormente.

Ensaio de imunoflurescência

Células H9 infectadas com HTLV-III B e não infectadas, fornecidas por Roy Byington de Infections Disease Laboratory do Massachusetts eneral Hospital, foram rehidratadas com PBS contendo albumina de

soro bovino a 1%, (PBS-BSA) ã temperatura de 22°C. ^{durante uma hora}' Em seguida, incubaram-se recortes (slides) com o anticorpo primário como uma ascite diluída ou sobrenadante de hibridoma durante 2 horas, ã temperatura de 22°C. Após lavagem completa, utilizou-se GAM F (ab)2 fluoresceinado (Du Pont/NEN Research Products) para detectar a presença de anticorpos murinos. Após uma hora à temperatura ambiente, removeu-se o Ab fluoresceinado. As células foram em seguida lavadas e colocadas num glicerol a 50% : PBS (V/V). Os recortes (slides) foram examinados com microscópio de fluorescência.

Ensaio de neutralização

Os anticorpos foram analisados relativamente ã sua capacidade para neutralizar a infectividade de HIV-1 in vitro, essencialmente de acordo com o processo descrito por D. Ho et al., ^J. Virol. 61:

: 2024-2028 (1987ÍJ , cuja descrição é aqui incorporada como referência. O sobrenadante das células de hibridoma (35 pg/ml IgGl) foi prediluído em meio RPMI-1640 contendo 20% de soro de vitela fetal (duas diluições em série) . Adicionaram-se 100 jil de anticorpo diluído a um volume igual de vírus purificado igual a 50 TCID-50 unidades, incubou-se durante uma hora à temperatura de 37°C. e adicionou-se

1,5-2,0x10^ células H9. As culturas foram incubadas durante sete dias à temperatura de 37°C., o meio foi reposto e incubou-se durante mais sete dias. Nesta altura, os frascos foram examinados relativamente ao efeito citopático com a formação de sincítios e a quantidade de antigénio gag HIV p 24 presente na cultura foi comparada com uma cultura de controlo. Um anticorpo para ser considerado positivo relativamente ã actividade de neutralização necessitava uma diminuição maior que 90% na quantidade de p 24.

Inibição da fusão de células

O ensaio de fusão de células foi descrito por T. Matthews et al.,

Proc ♦ Natl. Acad. Sei. USA 84, 5424-5428 (1987)J , cuja descrição ê aqui incluída como referência. De um modo resumido, 4000 células infectadas (células CEM com HIV-1 III-B e células H9 com HIV-1 HAT3) em 30 ul foram semeadas em cavidades microtituladoras. Adiconaram-se 30 ul de anticorpos diluído, como descrito anteriormente. Após 30 minutos ã temperatura de 37°C., adicionaram-se a estas cavidades 30 ul de meio RPMI contendo 56.000 células 5 upT-1. As placas foram incubadas durante a noite ã temperatura de 37°C. e avaliadas relativamente à formação de sincítios (fusão de células) de manhã. As cavidades sem anticorpos apresentavem entre 50 e 70 sincítios por cavidade .

Resultados

Elevadas espicificidades de MAb

Os MAbs para o péptido 1-69 (aminoácidos de 308 a 322 do invólucro de HIV-1 III-B) foram ensaiados relativamente a imunoreactividade para o péptido imunizante, 1-69, assim como outrs péptidos que se sobrepõem na região de aminoácidos de 298 a 332 e sobre vãrios péptidos menores incluídos na região desde 308 a 322. As sequências dos péptidos utilizados e as suas posições relativas apresentam-se no Quadro 6. Como se pode verificar na figura 2, os MAbs eram específicos para o péptido imunizante. Notar na figura 2 que nenhum dos MAbs representados, excepto o numero 5023, 24.5, reagiu com o péptido n9 5, o péptido de controlo que representa os aminoácidos de 475 a 486 do invólucro de HIV-1 nem reagiram significativamente com os péptidos 1-68 e 1-70, que se sobrepõem ao péptido 1-69 nos terminais amino e carboxilo respectivamente.

Observaram-se diversos graus de reactividade com os péptidos 1-177 e 1-178, que cobrem uma porção menor de aminoãcidos de env de 308 a 322 do que o faz o péptido 1-69. Nos ensaios de ELISA de fase sólida urilizados na experiência, usaram-se péptidos livres revestindo as placas microtituladoras ELISA. Na figura 2 e no Quadro 7, os MAbs são referidos pelas designações do clone abreviadas. Os

3.4

números dos clones não abreviados sao os seguintes:

últimos foram utilizados para depósito, na ATCC. As especificidades de MAbs foram também examinadas por inibição de fase em solução. Nestas experiências os MAbs foram prê-incubados com o péptido livre antes de serem titulados por ELISA com as placas revestidas pelo péptido 1-69. Um resumo dos resultados destas experiências está apresentado no Quadro 7.

Quadro 6

Péptido =

Sequência

1-68 RPNNNTRKSIRIQRG

1-69

RIQRGPGRAFVTIGK

1-70

VTIGKIGNMRQAHCNI

1-177

GPGRAFVTIG

1-178

QRGPGRAFV

MRDNWRSELYKY (não faz parte dos péptidos citados) •-----s f

Isolado

HIV-1

Quadro 7

Designação de péptidos e sequências

1-68 RPNNNTRKSIRIQRG BH10

1-69 RIQRGPGRAFVTIGK BH10

1-70 VTIGKIGNMRQAHCNI BH10

1-169 TKGPGRVIYATGQIIG RF

1-170 HIGPGRAFYTTKNIIG MN

1-171 KRKRIHIGPGRAFYTT MN

1-175 RIQRGPGRA BH10

1-176 AFVTIGK BH10

1-177 GPGRAFVTIG BH10

1-178 QRGPGRAFV BH10

Péptido usado para inibição

MAb 1-68 1-69 1-70 1-169 1-170 1-171 1-175 1-177 1-178

4407.2	++	-	ND	ND	ND	ND	-	ND	ND
5021,22 .2	-	++	-	-	+/-	+/-	++	-	ND
5023,24 .4	-	+++	-	+/-	+	-	-	++	+
5025,29.1	-	++	-	-	++	+/-	-	++	+
5025,29.2	-	+++	-	+/-	++	+	++	-	++
5042,43.3	-	++	-	-	-	-	++	-	ND

Os sinais (+) indicam o grau de inibição : +/- indica inibição maior que 20% a 1 mg/ml de péptido solúvel livre, + indica inibição maior que 90% a 100 pg/ml, ++ significa maior que 90% a 10 pg/ml e +++, maior que 90% a 1 pg/ml.

As concentrações de anticorpo eram variáveis mas da ordem de 100 ng/ml.

O anticorpo foi pré-misturado com concentrações variáveis de péptido em PBSjBSA a 1:1. Após cerca de 1 hora, ã temperatura de 23°C adicionaram-se 100 de mistura a uma placa Immulon II revestida com 1-68 ou com 1-69 a 25 ng/50 pl/cavidade que tinham sido bloqueadas com PBS:BSA. A incubação com MAb na placa foi de cerca de 60 minutos à temperatura de 23°C.

Todos os MAbs foram não reactivos com 1-176 e 1-70. O MAb 4407.2 era feito para o péptido 1-68.

para determinar a reactividade dos MAbs com os componentes virais, realizaram-se manchas Western sob condições diversas. Os lisados virais (200 ug de proteína por gel) foram desagregados na presença ou na ausência de 2-mercaptoetanol e separados por SDS-PAGE. As reactividades dos MAbs por manchas de Western mostram-se na figura 2 em que foram determinados como componentes de unidade virai de imitação (células H9 não infectadas processadas de um modo idêntico a ví rus) como descrito por Durda et al.. Todos os MAbs, excepto os números 5020.1; 5023,24.5; 5042,43.1 e 5042,43.2, verificaram-se ser reactivos com o componente virai de HIV-1 de cerca de 120 KD sob condições de redução e de não redução. Não se observou reactividade quando os MAbs foram testados como componentes proteicos de uma preparação que simula o vírus. Como uma especificidade de controlo para o anticorpo, utilizou-se um MAb de IgGl, n9 2085.1, que não reconheceu qualquer componente virai. Este MAb de controlo não regiu com quaisquer componentes virais de HIV-1.

Para confirmar que o sinal da mancha de Western gerado por o Mab 5023,24.1.1, o mais forte destes Mabs era devido à sequência RIQR GPGRAFVTIGK, testou-se o MAb na presença e na ausência de 1-69. A inibição do sinal da mancha verificou-se com o péptido afim, 1-69, mas não com o péptido n9 5 de controlo.

Na imunofluorescência, ccm células fixadas sobre lâminas, os MAb 5023,24.4.1.1 assim ccmo os MAb 5021,22.2.1.1, 5025,29.1.1.1, e 5042,43.3.2.1, mostraram reactividade positiva sob células H9 infectadas com isolado III B de HIV-1. Os MAbs foram on seguida testados sobre células CEM/NKR infectadas com HIV-1 III B in vivo utilizando-se um classificador de células activado por fluorescência. 0 Mab 5023,24.1.1 reagiu com 47% das células infectadas ccm HIV-1 III B; apenas 5% das células infectadas con o isolado HIV-1 MN se apresentaram coradas por 5023,24.4.1.1. Não se observou reactividade com células infectadas ccm isolado de HIV-1 RF ou ccm células.

CEM/NKR não infectadas. O MAb 5025,29.1.1.1 mostrou um esquema de recatividade idêntico, mas com uma percentagem menor de células infectadas com HIV-1 III B manchadas (27%) e uma percentagem maior (15%) de células com HIV-1 MN manchadas. Os anticorpos incluídos na classe de controlo (proteínas de mieloma), por outro lado, não exibiram ligação significativa com qualquer das células infectadas ou não infectadas in vivo. Isto sugere que deve haver algum grau de reactividade cruzada com estirpes de HIV diferentes de III B, mas nenhuma reactividade significativa com células não infectadas.

Neutralização de vírus

No Quadro 8 mostram-se os resultados que se obtiveram quando se realizaram testes relativamente ã actividade de neutralização e se compararam com outros MAbs e anti-soros. O MAb 5023,24.4.1.1 exibiu a actividade de neutralização de HIV-1 mais forte, que neste ensaio particular era tão forte como a observada com o soro humano mais neutralizante. O MAb 5021,22.2.1.1 também demonstrou actividade de neutralização para HIV-1 III B como se mostra no Quadro 8.

Quadro 8

Neutralização de HTLV-3B por MAbs para o péptido 1-69

Anticorpos

5023.24.4.1.1

5021.22.2.1.1

MOPC 21 (IgGl de controlo) Soro negativo

Soro positivo

Titulo de neutralização

16-32 <8 <4 (3-4+ CPE a 1:4) >4 (0 CPE a 1:4)

Notar que as amostras de soro sao soros humanos bem definidos e que o soro positivo tinha um título de 1/32 a 1/64 de neutralização quando testado no ensaio de titulação. CPE refere-se ao efeito citopãtico (por exemplo, formação de sincétios e morte de células ) induzido nas células hospedeiras por replicação de HIV-1. Foi classificado visualmente como 3-4+ sendo a destruição celular mais acentuada devido a HIV-1.

Bloqueamento de fusão de células

No Quadro 9 apresentam-se os resultados que demonstram a inibição da fusão de células infectadas com HIV-1 com células alvo, SupT-1, (obtidas de D. Bolognesi, Duke University) pelos MAbs 5021,22.2.1.1, 5023,24.4.1.1, 5025,29.1.1.1 e 5042,43.3.2.1. Notar que SupT-1 é um expressor elevado de um antigénio CD4 que é o receptor de HIV-1 das células T. Avaliou-se em células infectadas, a actividade contra HIV-1 III B e HIV-1 NM. Ê de notar que o MAb 5025,29.1.1.1 exibe uma actividade de bloqueamento de fusão não só contra HIV-1 III B isolado do antigénio de onde ê derivado, mas também contra o isolado HIV-1 MN. Descrições anteriores sugerem que estes anticorpos que inibem HIV são específicos do tipo ou do isolado.

Quadro 9

Inibição de formação de sincécios (fusão) por MAbs para o péptido 1-69

MAb#	#Sincêcios HIV-1 3B	/	Cavidade HIV-1 MN
4407.2	58		61
5021,22.2.1.1	3		54
5023,24.4.1.1	0		40
5025,29.1.1.1	2		14
5042,43.3.2.1	0		56
2085.1 (controlo IgGl)	69		49
351-56 (controlo 2b)	52		53
células isentas de MAb	76		64

Todos os MAbs eram de ascite e foram testados com uma diluição a 1/50. Notar que o MAb 4407.2 foi realizado para o péptido 1-68; 0 MAb 351-56 é um MAb anti-Hras; o MAb 2085.1 foi feito para os aminoácidos de 740 a 750 da proteína do invólucro de HIV-1 (3B). O MAb

2085.1 não tinha evidenciado reactividade com os componentes do invólucro ou outros componentes virais. Outros controlos IgGl e IgG2b esperam-se fornecer resultados comparáveis.

facto do MAb 5021,22.1.1 reagir com o péptido 1-178 (Figura 2) e ser bloqueado pelo péptido 1-175 (Quadro 7) indica que o epitope reconhecido por 5021,22.2.1.1 está contido na sequência QRGPGRA, comum aos dois péptidos.

facto de o MAb 5025,29.1.1.1 reagir com os páptidos 1-177 e 1-178 (Figura 2 e Qjadro 7) indica que o epitope reconhecido por 5025,

29.1.1.1 está contido na sequência GPGRAFV, que é cctnum a ambos os péptidos.

A descoberta de que MAb 5042,43.3.2.1 é blcqueado pelo péptido 1-175 (Quadro 7) indica que o epitope reconhecido eplo MAb 5042,43.3.2.1 está contido na sequência RIQRGPGRA.

A descoberta de que MAb 5023,24.4.1.1 é bloqueado pelo péptido 1-177 (Quadro 7) indica que este MAb reconhece um epitope formado pela sequência GPGRAFTIG.

Estes resultados considerados em cinjunto indicam que o epitope crítico reconhecido pelos anticorpos can actividade inibidora de vírus é formada pelos resíduos GPGRA.

Ê interessante que MAb 5025,29.1.1.1 iniba KEV-1 3B, assim ccmo HIV-1 MN (Quadro 9). Assim, o 5025,29.1.1.1 reconhece um epitope formado pela sequência GPGRAFV, ccmo descrito anteriormente mas também a sequência correspondente de HIV-1 que é GPGRAFY (Quadro 4) . Na base das sequências da região 1-69, espera-se que MAb 5025,29.1.1.1 também iniba as estirpes SF2 e H4J2 de HIV-1 (Quadro 4) .

Os péptidos de 5 a 10 aminoácidos que incluem os epitopes QRGPGRA, RIQRGPGRA, GPGRAFVTIG, GPGRAFV, e GPGRA devem ser úteis ccmo imunogénios quando conjugados can o veículo imunologicamente aceitável para a indução da produção de anticorpos que inibem HIV nos mamíferos.

Do mesmo modo, os péptidos que correspondem a outros isolados de HIV também se espera serem imunogénios utilizáveis para a indução da produção de anticorpos que inibem HIV nos mamíferos.

É interessante e inesperado observar que um único MAb para o t

péptido 1-69 pode exibir actividade de neutralização e forte bloqueamento de fusão de HIV-1. Espera-se que estes MAbs possuam utilidade terapêutica significativa.

As linhas de células de hibridoma designados por n2s. 5021,22.2. 1.1, 5023,24.1.1, 5025,29.1.1.1, 5025,29.2.1.1, e 5042,43.3.2.1, foram depositados em 1 de Março de 1989 na American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, de acordo com as disposições de MPEP 608.01 (p)(C)(1)(2) e (3) e o tratado de Budapeste. Os números de aceitação ATCC para estas linhas de células de hibridoma são HB 10040, HB 10043 HB 10041, HB 10042 e HB 10044, respectivamente. O acesso ãs culturas será permitido durante a pendência do pedido de patente de invenção por uma determinação do director (Commissioner) aqui referenciada por 37 CFR 1.14 e 35 USC 122. Após a concessão da patente de invenção todas as restrições na disponibilidade da cultura para o público devem ser irrevogavelmente eliminadas.

Tal como aqui se utiliza, a designação consistir essencialmente em deve-se entender no seu sentido corrente. Nomeadamente que todas as substâncias e condições espicificadas são muito importantes na prática da presente invenção mas que substâncias e condições adicionais não especificadas, incluindo outros agentes terapêuticos ou ingredientes, não estão excluídos desde que estas não impeçam a obtenção dos lunefícios da presente invenção.

Claims (40)

1. REIVINDICAÇÕES

   1.- Processo para sintetizar quimicamente um péptido comportando 15 a 36 aminoácidos da proteína que envolve o vírus da imunodeficiência humana (HIV), escolhidos na sequência de aminoácidos que corresponde ao aminoácido número 296 até ao aminoácido número 331 da proteína que envolve HIV-1 IIIB, e incluindo os aminoácidos que correspondem aos aminoácidos desde o número 308 até ao número 322 de HIV-1 IIIB, caracterizado pelo facto:

   a) de se escolher o aminoácido de C-terminal do péptido, de se proteger o grupo carboxilo do aminoácido mediante reacção com um radical eliminável apropriado e de se proteger qualquer grupo lateral reactivo do aminoácido com um radi42 cal eliminável apropriado;

   b) de se escolher o aminoácido seguinte a ser adicionado para formar a cadeia peptídica, de se proteger o grupo oó-amino desse aminoácido mediante reacção com um radical eliminãvel apropriado e de se proteger qualquer grupo lateral reactivo desse aminoácido com um radical eliminável apropri. ado;

   c) de se formar uma ligação peptídica entre o grupo alfa-amino do aminoácido proporcionado na fase a) e o grupo carboxilo do aminoácido proporcionado na fase b), formando-se deste modo uma cadeia peptídica;

   d) de se eliminar o grupo protector do grupo alfa-amino do N-terminal do aminoácido da cadeia peptídica; e

   e) de se escolher o aminoácido seguinte a ser adicionado à cadeia peptídica, protegendo-se o grupo alfa-amino deste aminoácido por reacção com um radical eliminável apropriado e protegendo-se qualquer grupo lateral reactivo desse aminoácido com um radical eliminável apropriado; e

   f) de se alongar a cadeia peptídica por formação de uma ligação peptídica entre o grupo amino do aminoácido de N-terminal da cadeia peptídica e o grupo carboxilo do aminoácido obtido na fase e);

   g) de se repetirem várias vezes as fases e) e f) para se obter o péptido desejado; e

   h) de se eliminarem os radicais de protecção e, facultativamen te, o radical de protecção do grupo carboxilo do aminoãcido C-terminal do péptido, ou, alternativamente, de se utilizarem as fases citadas antes para se obterem duas ou mais cadeias peptídicas mais pequenas que se podem unir por meio de uma ligação peptídica para formar o péptido desejado da presente invenção.
2. 2. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o péptido conter os aminoácidos 308 a 322 da proteína de envõlucro do HIV-1 IIIB.
3. 3. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o péptido conter a sequência de aminoãcidos

   RIQRGPGRAFVTIGK.
4. 4. - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de o péptido conter a sequência de aminoãcidos RIQRGPGRAFVTIGK.
5. 5. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o péptido exibir uma extensão de 15 a 25 aminoãcidos .
6. 6. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o péptido conter 15 a 30 aminoãcidos do envõlucro da proteína do vírus da imunodeficiência humana (HIV) comportando a sequência de aminoácidos KLREQFGNNKTIIFK.
7. 7.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o péptido conter 15 a 30 aminoácidos do envõlucro da proteína do vírus da imunodeficiência humana (HIV), comportando a sequência de aminoácidos CRIKQIINMWQEVGK.
8. 8.- Processo para a produção de anticorpos policlonais que inibem HIV em mamíferos, excepto serem humanos, caracterizado pelo facto:

   a) de se administrar, a esse mamífero uma ou mais vezes,um péptido com 15 a 36 aminoácidos da proteína do envõlucro do vírus da imunodeficiência humana (HIV), escolhidos na sequência de aminoácidos desde o aminoácido número 296 até ao aminoácido 331 da proteína do envõlucro de

   HIV-1 IIIB e incluindo os aminoácidos correspondentes aos números de 308 a 322 de HIV-1 IIIB, ligados facultativamente a um suporte veicular aceitável imunologicamente, e em uma quantidade suficiente para elicitar anticorpos para o péptido; e,

   b) de se isolar os anticorpos que inibem HIV do soro do mamífero .
9. 9.- Processo para a produção de anticorpos que inibem HIV em mamíferos, excepto seres humanos caracterizado pelo facto:

   a) de se administrar a esse mamífero, uma ou mais vezes, um péptido da proteína do envólucro de HIV IIIB, preparado de acordo com a reivindicação 2, ligado, facultativamente, a um suporte veicular aceitável imunologicamente, em uma quantidade suficiente para elicitar anticorpos para o péptido; e

   b) de se isolar os anticorpos, que inibem HIV, do soro desse mamífero.
10. 10.- Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo facto de se administrar pelo menos dois péptidos diferentes, correspondendo cada um ã sequência de um isolado de HIV diferente.
11. 11.- Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo facto de os péptidos comportarem a sequência de aminoãcidos RIQRGPGRAFVTIGK.
12. 12.- Processo para detectar anticorpos específicos para HIV em uma amostra biológica HlV-positiva, caracterizado pelo facto de se fazer contactar a amostra biológica com um péptido de acordo com a reivindicação 1 e de se detectar a imuno-reactividade.
13. 13.- Processo para detectar anticorpos específicos para HIV em uma amostra biológica HlV-positiva, caracterizado pelo facto de se fazer contactar a amostra biológica com um péptido de acordo com a reivindicação 2 e de se detectar a imuno-reactividade.
14. 14.- Processo para detectar anticorpos específicos para HIV em uma amostra biológica HlV-positiva, caracterizado pelo facto de se fazer contactar a amostra biológica comnm péptido de acordo com a reivindicação 6 e de se detectar a imuno-reactividade.
15. 15. - Processo para detectar anticorpos específicos para HIV em uma amostra biológica HlV-positiva, caracterizado pelo facto de se fazer contactar a amostra biológica com um péptido de acordo com a reivindicação 7 e de se detectar a imuno-reactividade.
16. 16. - Processo para detectar anticorpos específicos para HIV em uma amostra biológica HlV-positiva, caracterizado pelo facto de se fazer contactar pelo menos dois pêptidos de acordo com a reivindicação 1, em que cada péptido corresponde ã sequência de um isolado de HIV diferente, e de se detectar a imuno-reactividade.
17. 17. - Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo facto de os anticorpos específicos para HIV serem anticorpos que inibem HIV.
18. 18. - Processo para a preparação de uma vacina protectora con tra HIV, caracterizado pelo facto de se conjugar uma quantidade protectora eficaz de um péptido de acordo com a reivindicação 1, como ingrediente activo, com um veículo aceitável sob o ponto de vista imunológico.
19. 19. - Processo para a protecção de uma vacina protectora contra HIV, caracterizado pelo facto de se conjugar uma quantidade protectora eficaz de um péptido de acordo com a reivindicação 2, como ingrediente activo, com um veículo aceitável sob o ponto de vista imunológico.
20. 20. - Processo para a preparação de uma vacina que contém uma quantidade eficaz protectora contra HIV de pelo menos dois pêptidos diferentes de acordo coa a reivindicação 1, como ingrediente activo, correspondendo cada péptido à sequência de um isolado de HIV diferente, caracterizado pelo facto de se conjugar cada péptido com um veículo aceitável sob o ponto de vista imunológico.
21. 21. - Processo para a produção de uma linha de células do hibridoma que produz um anticorpo monoclonal que inibe HIV, caracterizado pelo facto de compreender os passos que consistem em:

    a) imunizar um mamífero, preferivelmente um murgonho, com um péptido de 15 a 36 aminoácidos da proteína de envólucro do vírus da imunodeficiência humana (HIV), escolhido de entre a sequência de aminoácidos correspondente aos aminoácidos 296 a 331 da proteína de envólucro de HIV-1 IIIB, e compreendendo os aminoácidos 308 a 322 de HIV-1 IIIB;

    b) colher do mamífero um orgão produtor do anticorpo, de preferência o baço;

    c) preparar um homogeneizado celular a partir do orgão que produz o anticorpo;

    d) fundir células provenientes do orgão que produz o anticorpo com células imortais apropriadas, de preferência células de micloma; e

    e) seleccionar uma célula lúbrida produzida a partir desta fusão que produz um anticorpo monoclonal que inibe HIV.
22. 22 - Processo de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo facto de se imunizar o mamífero com um péptido que contém os aminoácidos desde 308 até 322 da proteína de envólucro de HIV-1 IIIB.
23. 23 - Processo de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo facto de se imunizar o mamífero com um péptido que contém a sequência de aminoácidos RIQRGPGRAFVTIGK.
24. 24 - Processo de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo facto de o péptido ter um comprimento desde

    15 até 25 aminoácidos.
25. 25 - Processo de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo facto de o péptido conter a sequência de aminoácidos RIQRGPGRAFVTIGK.
26. 26 - Processo de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo facto de se identificar o anticorpo por meio de um clone designado por um número escolhido entre o grupo constituído por:

    MAb 5021,22.2.1.1 (ATCC #HB10040), 5023,24.1.1 (ATCC #HB10043),

    5025,29.1.1.1 (ATCC #10041), 5025,29.2.1.1 (ATCC #HB10042), e 5042,43.3.2.1 (ATCC #HB10044).
27. 27 - Processo de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo facto de o anticorpo monoclonal murino ser identificado pelo número de clone designado por

    MAb#5023,24.4.1.1 (ATCC #HB10043).

    -4928 - Processo de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo facto de o anticorpo monoclonal murino ser identificado por um número de clone designado por

    MAb#5025,29.1.1.1 (ATCC #HB10041).
28. 29 - Processo para a preparação de composições farmacêuticas, caracterizado pelo facto de se misturar essencialmente uma quantidade terapêutica de um anticorpo monoclonal de acordo com reivindicação 21, como ingrediente activo, com um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.
29. 30 -Processo para a preparação de composições farmacêuticas, caracterizado pelo facto de se misturar essencialmente uma quantidade terapêutica de um anticorpo monoclonal de acordo com reivindicação 22, como ingrediente activo, com um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.
30. 31 -Processo para a preparação de composições farmacêuticas, caracterizado pelo facto de se misturar uma quantidade terapêutica de um anticorpo monoclonal de acordo com reivindicação 23, como ingrediente activo, com um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.
31. 32 -Processo para a preparação de composições farmacêuticas, caracterizado pelo facto de se misturar essencialmente uma quantidade terapêutica de um anticorpo monoclonal de acordo com reivindicação 24, como ingrediente activo, com um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.
32. 33 -Processo para a preparação de composições farmacêuticas, caracterizado pelo facto de se misturar uma quantidade terapêutica de um anticorpo monoclonal de acordo com reivindicação 25, como ingrediente activo, com um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.
33. 34 -Processo para a preparação de composições farmacêuticas, caracterizado pelo facto de se misturar essencialmente uma quantidade terapêutica de um anticorpo monoclonal de acordo com reivindicação 26, como ingrediente activo, com um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.
34. 35 -Processo para a preparação de composições farmacêuticas, caracterizado pelo facto de se misturar essencialmente um anticorpo monoclonal de acordo com reivindicação 27, como ingrediente activo, com um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.
35. 36 -Processo para a preparação de composições farmacêuticas, caracterizado pelo facto de se misturar essencialmente um anticorpo monoclonal de acordo com reivindicação 28, como ingrediente activo, com um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.
36. 37 - Processo para detectar gpl20 de envólucro de HIV-1

    -51IIIB em uma amostra biológica contendo a referida proteína, caracterizado pelo facto de se fazer contactar a referida amostra biológica com um anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 22 e de se detectar a imuno-reactividade.
37. 38 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o péptido conter de 5 a 10 aminoácidos da proteína do envólucro do vírus da imunodeficiência humana (HIV), com uma sequência escolhida entre o grupo constituído por:

    QRGPGRA, RIQRGPGRA, GPGRAFVTIG, GPGRAFV e GPGRA
38. 39 - Processo para a produção de anticorpos policlonais que inibem HIV em mamíferos, excepto em seres humanos, caracterizado pelo facto:

    a) de se administrar a esse mamífero, uma ou mais vezes um péptido preparado de acordo com a reivindicação 38, ligado, facultativamente, a um suporte veicular aceitável imunologicamente, em uma quantidade suficiente para elicitar anticorpos para o péptido; e

    b) de se isolar do soro, desse mamífero, os anticorpos que inibem HIV.
39. 40 - Processo para a produção de um anticorpo monoclonal que inibe HIV de acordo com a invenção a partir de uma linha de células de hibridoma, caracterizado pelo facto de compreender os passos que consistem em:

    a) cultivar as células lúbridas sob condições de crescimento

    -52aceitáveis de modo que elas se multipliquem, e

    b) colher o anticorpo monoclonal que inibe HIV produzido pelas células lúbridas.
40. 41 - Processo de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo facto de o anticorpo monoclonal que inibe HIV assim obtido exibir imuno-reactividade com um péptido de acordo com a reivindicação 38.

    41 - Processo de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo facto de o anticorpo monoclonal que inibe HIV assim obtido exibir imuno-reactividade com um péptido de acordo com a reivindicação 1.

    41 - Processo de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo facto de o anticorpo monoclonal que inibe HIV assim obtido exibir imuno-reactividade com um péptido de acordo com a reivindicação 2.

    Lisboa, 6 de Junho de 1994

    O A0©nte Oficial da Propriedade Industria!

    A. Ο. Ρ. I.

    Rua de Miguel Lupi, 1G, dc 1200 LiSBOA

    RESUMO

    Processo para a preparação de péptidos env-codificados de HIV capazes de elicitarem anticorpos que inibem HIV em mamíferos e de anticorpos monoclonais que inibem HIV mediante utilização de£ ses péptidos

    Descreve-se um péptido sintetizado por via química comportando 15 aminoácidos, designado por péptido 1-69, o qual exibe a sequência de aminoácidos desde o aminoácido 308 até ao aminoácido 322, (RIQRGPGRAFVTIGK) da proteína env-codificada do vírus 1 (HIV-1) IIIB da imunodeficiência humana, que foi utilizado para imunizar animais. 0 péptido 1-69 provocou a formação de anticorpos nos animais imunizados, que bloqueiam a proliferação de HIV e também a fusão de células, induzida pelo HIV, em cultura de células .