HUT51296A - Process for producing hn env-coded peptide for producing antibodies for inhibiting human hiv virus in mammalian - Google Patents

Description

A találmány vegyi úton szintetizált pepiidre vonatkozik, amely a humán immunhiány-vírus (HÍV) env-kódolt fehérje egyik szegmensének felel meg, amely hasznos megelőző szerként vagy vakcinaként HÍV fertőzés és betegség ellen, vonatkozik továbbá a HÍV env-kódolt szegmense elleni antitestekre.

Az alábbiakban ismertetjük a jelenlegi helyzetet ezen a területen. A humán immunhiány vírus-I-re (HIV-1), a szerzett immu'nhiány szindróma (AIDS) okozójára fajlagos antitesteket találunk HIV-vel fertőzött egyének szérumaiban CSarngadharan és munkatársai: Science 224, 506-508 (1984); Schupbach és munkatársai: Science 224, 503-505 (1984); Chang és munkatársai: Biotechnology 3., 905-911 (1985); Kenealy és munkatársai: AIDS Research and Humán Retrovírus es 3_, 95-105 (1987)3. A szérum antitestek, amelyek blokkolják a HIV-1 burjánzást (HlV-semlegesítő antitestek), vagy blokkolják a

HIV-vel fertőzött és nem-fertőzött sejtet fúzióját sejttenyészetben (fúzió-blokkoló antitestek), szintje viszonylag humorális antitestek alacsony, amikor összehasonlítjuk az általános válasszal a vírusra (vagyis a HIV-fajlagos összes szintjével) CWeiss és munkatársai: Natúré (1985); Robert-Guroff és munkatársai: Natúré 316,

72-74 (1985); Weiss és munkatársai: Natúré 324, 572-575 (1986)3. A szerepe a biológiai

HIV-semlegesítő

HIV-1 fertőzés és fúzió-blokkoló antitestek aktivitásért patogenezisében és felelős epitópok az ezért a szerkezete meghatározandó feladat marad. A HIV-1 külső burkolati glikoproteinjéről (gpl20) ismeretes, hogy megköti a humán • · «

- 3 semlegesítő antitesteket és olyan immunogénként alkalmazzák, amely képes HIV-semlegesítő antitesteket kiváltani állatokban ELasky és munkatársai: Science 233, 209-212 (1986); Matthews és munkatársai: Proc.Natl.Acad.Sei.USA 83, 9709-9713 (1986); Robey és munkatársai: Proc.Natl.Acad.Sci . USA 84, 7023-7927 (1986)3. Jelentős dolog, hogy ezekről a semlegesítő adatokról közölték, hogy típus-fajlagosak, vagyis az antitestek csak annak a HIV-l altípusnak vagy izolátumnak a burjánzását blokkolják, amelyből az immunogén származik.

Egy sor HIV-1 peptidet és fehérjét azonosítottak, amelyek semlegesítő antitesteket váltanak ki állatokban. Ezek között találunk olyan szintetikus peptideket, amelyek a gag-kódolt fehérjéből, az env-kódolt transzmembrán fehérjéből (gp41) és számos, az env-kódolt gpl20 fehérje megőrzött területeinek megfelelő peptidből eredő szekvenciáknak felelnek meg. EPutney és munkatársai: Science 234, 1392-1395 (1986); Sárin és munkatársa: Science 232, 1135-1137 (1986); Kennedy és munkatársai: J. Bioi. Chem. 262, 5769-5774 (1987); Taylor és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 2951-2955 (1987); Chanh és munkatársai: EMBO 0. 5_, 3065-3071 (1986); Ho és munkatársai: J. of Virol. 61, 2024-2028 (1987)3. A semlegesítő és fúziót blokkoló antitestek különösen nagy szintjét mutatják ki, amelyek két rekombináns fehérje révén indukálódnak. Ezek egyike glikozilezett, teljes hosszúságú env-kódolt fehérje, amelyet rovarsejt kifejező rendszert alkalmazva állítanak elő, ezt gpl60-nak nevezzük CRusche és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 6924-6928 (1987)3; egy másik rekombináns fehérje egy nem glikozilezett, Escherichia coli által termelt fehérje, amelyet PBl-nek nevezünk, és amely a gpl2O egyik területét (288.számú aminosavtól a 472. számú aminosavig a HIV-1

III.B-ben) képviseli CPutney és munkatársai: Science 234, 1392-1395)3. Az erős antitest válaszok ellenére ezeket a fehérjéket alkalmazva immunogénként a semlegesítő aktivitás korlátozott marad, és fajlagos arra a HIV-1 altípusra vagy izolátumra, amelyből az immunogén ered (pl. III B).

A PE3 (amely az env-kódolt gpl20 amino-terminálisának felel meg) és az ENV9 (amely a gpl20 karboxi-terminálisának és a gp41 legnagyobb részének felel meg) rekombináns fehérjék nem váltják ki a semlegesítő aktivitás mérhető szintjét CPutney és munkatársai: Science 234, 1392-1395 (1986)3, míg a PB1 képes indukálni a semlegesítő és fúzió-blokkoló antitestek szintjeit azonos mértékben vagy nagyobb mértékben, mint azok a szintek, amelyeket a rekombináns gpl60-at alkalmazva válthatunk ki CRusche és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 6924-6928 (1987)3.

Az alábbiakban röviden összefoglaljuk a találmányt.

Az E.coliban kifejezett PB1 HIV-1 env-eredetű fehérjéről ismeretes, hogy amikor immunogénként alkalmazzuk, magas szinten vált ki semlegesítő és fúzió-blokkoló antitesteket állatokban CPutney és munkatársai: Science 234, 1392-1395 (1986)3. Egy ilyen immunválasz állatokban azt sugallja, hogy a HÍV env ezen területe alkalmas lehet HÍV fertőzés és • « • · · · · • ·· · · • · · · betegség terápiájához vagy megelőzéséhez. Rendszeres elemzésnek láttunk abból a célból, hogy tovább pontosítsuk azokat a szegmenseket a gpl20 PB1 területén belül, amelyek érintve lehetnek a semlegesítő és fúzió-blokkoló aktivitásban. Olyan rendszeres elemzést végzünk, amelyben vegyi úton szintetizált átfedő peptidek sorozatát alkalmazzuk, amelyek a teljes PB1 területet képviselik (a gpl20 HIV-1 III B env-kódolt fehérje 288. számú aminosavától a 472. számú aminosaváig). A peptidek 15-16 aminosav hosszúságúak és az egyik a másikat 5 aminosavval fedi át. Ezeket a szintetikus peptideket alkalmazzuk, hogy vizsgálati állatokat (tengeri malac) immunizáljunk, és az így létrejövő anti-peptid antitesteket, amelyek a vizsgálati állatokban termelődnek, biológiai aktivitásra megvizsgáljuk, ide értve a HÍV semlegesítő és sejtfúzió-blokkoló aktivitást.

A HIV-1 env-kódolt PB1 területen végig húzódó szintetikus peptideket, amelyeket elemzünk, az 1. táblázatban soroljuk fel. A 18 vizsgált peptid közül csupán 1 peptid, amelyet 169-nek nevezünk, vált ki immunogénként alkalmazva olyan antitesteket, amelyek blokkolják mind a HÍV burjánzást sejttenyészetben, mind a fúziót a HIV-vel fertőzött és nemfertőzött sejtek között sejttenyészetben. Ez az észlelés jelzi, hogy az 1-69 peptid vagy a mintegy azonos hosszúságú peptidek (10-30 aminosav, vagy előnyösebben 15-25 aminosav), amelyek az 1-69 peptid szekvenciájának nagy részét magában foglalják, alkalmasak lehetnek HÍV fertőzés elleni megelőző szerként vagy vakcinaként, vagy HÍV fertőzés elleni vagy vakcina egyik alkotórészeként. Kisebb, 510 aminosavból álló peptidektől., amelyek az 1-69 peptid szekvenciájának egy részét ölelik át, várható, hogy HIVgátló antitesteket indukálnak emlősökben. Az alkalmas peptidek között találjuk a QRGPGRA, RIQRGPGRA, GPGRAFVTIG, GPGRAFV és GPGRA peptideket. Valamivel nagyobb peptidektől (mintegy 33 aminosav hosszúságúak), amelyek a HIV-1 IIIB env-kódolt peptid Cys 296 és Cys 331 aminosavai között terjednek ki (lásd a 4. táblázatot) és átölelik az 1-69 pepiidet, szintén várható, hogy HIV-gátló antitesteket váltanak ki állatokban.

Azok az antitestek, amelyek gátolják a HÍV burjánzást és blokkolják a HÍV által közvetített sejtfúziót, valószínűleg megnövekedett rezisztenciát nyújtanak HÍV fertőzés ellen. Ahogyan itt használjuk, a HIV-gátló antitestek kifejezés magában foglalja mind a semlegesítő, mind a fúzió-blokkoló antitesteket. Az a képesség, hogy kimutathassuk az ilyen

HIV-gátló antitestek jelenlétét vagy távollétét betegekben, fontos prognosztikai jelentőséggel bírhat. Az ilyen antitesteket alkalmazhatjuk immunizálására.

tartalmazó gyógyászati készítményeket

HIV-nek kitett egyének passzív

Tovább menve az ilyen antitestek valószínűleg csökkentik az AIDS betegség előrehaladásának sebességét HIV-vel fertőzött egyénekben, és potenciálisan terápiás értékük lehet a már AIDS-ban szenvedő betegekben. A jelen találmány szerinti monoklonális HIV-gátló antitestekről különösen várható, hogy ezekre a célokra alkalmasak lesznek.

• · · · · · · • · ··· ·· ·· • · · ···· ·· ······· ♦ ··

Az anti-1-69 peptid-antitestek HlV-semlegesítő és fúzióblokkoló aktivitásai, úgy tűnik, nagy mértékben arra a HÍV izolátumra korlátozódnak, amelyből a peptid szekvencia származik, mivel a HIV-1 IIIB gátlódik, de a HIV-1 RF nem. A HIV-1 IIIB 1-69 peptiddel homológ env-kódolt területek azonban a HÍV más izolátumaiból könnyen azonosíthatók aminosav szekvencia összehasonlítással (4. táblázat) és a megfelelő peptideket szintetizálhatjuk és immunogénként alkalmazhatjuk az 1-69 peptidnél leírt munkamenetet használva. Ezen kívül a HIV-1 altípusok és izolátumok, amelyek a gpl2O 296.-331. aminosav területében levő szekvenciához közeli rokon szekvenciákkal bírnak, gátlása szintén várható. Az 5025, 21.1.1.1 MAb (monoklonális antitest) (ATCC HB10041) fúzió-blokkoló aktivitást mutat egy sor HIV-1 izolátum, pl. a IIIB és MN ellen.

A megfelel valaminek kifejezés, ahogyan itt használjuk aminosav (aa) szekvenciákra utalva, az összefüggésre utal azok között az aminosavak között, amelyek igazodnak egymáshoz, amikor két vagy több aminosavszekvenciát összehasonlítunk és homológiára átvizsgálunk standard komputer programot alkalmazva; ilyen program rendelkezésre áll pl. az IntelliGenics, Inc.,-nél (Mountain View, Kalifornia) vagy a Genetics Computer Group-nál (University of Wisconsin, Biotechnology Center, Madison, Wisconsin).

A különböző HIV-1 és HIV-2 izolátumokhoz tartozó env-kódolt peptidek azon szekvenciáit, amelyek a HIV-1 IIIB 1-69 peptiddel homológ területnek felelnek meg, a 4. táblázatban ···· ·· ···· · ·· • · · · · · · • ···♦·· ·· • ♦ · ·*··· ·· ······· · ·· soroljuk fel. A IIIB 1-69 peptidnek megfelelő env-kódolt területet a 4. táblázat jegyzetében leírt munkamenetet alkalmazva azonosíthatjuk. Bár a burkolati fehérjék, amelyek különböző HÍV izolátumokból származnak, jelentősen változó területekkel bírnak az aminosavszekvenciát illetően, a fehérje általános szerkezete, beleértve pl. a Cys gyökök viszonylagos helyzetét (lásd a 4. táblázatot), jól megőrzött. Mivel a különböző HÍV izolátumokból származó env fehérjék általános szerkezeti és funkcionális tulajdonságai (pl.' a CD4 kötés) jól megőrzöttek, a más HIV-1 és HIV-2 izolátumokból származó 1-69 peptidnek megfelelő env-kódolt területektől is elvárható, hogy hasonlóképpen kiváltanak

HIV-semlegesítő pepiiddel hatékony peptidek foglalják Az ilyen megfelelő és immunizált vakcinák vagy keverékét vagy a HIV-1 IIIB 1-69 keverék előnyösen peptideket, vagy antitesteket a fertőzés elleni tartalmazhatják amelyek magukban sejtfúzió-blokkoló állatokban. A HÍV megelőző szerek koktél-ját, peptidnek megfelelő területeket, magában foglalhat 1-69 peptidnek valamivel kisebb vagy nagyobb ekvivalens peptideket, a HIV-1 izolátumok választékából. Az ilyen keverék vagy koktél potenciálisan széles ellenállást ad át HÍV sok eltérő izolátuma ellen.

A jelen találmány vonatkozik HIV-1 burkolat-eredetű 1-69 peptid elleni, HIV-gátló monoklonális antitestekre is. Pontosabban egy sor rágcsáló monoklonális antitest alakul ki az 1-69-nek nevezett, burkolat-eredetű szintetikus HIVpeptid ellen. Ezen rágcsáló monoklonális antitestek egyikéről, amely 5023,24.4.1.1 (ATCC HB10043) hibridómája ·· ···· ·· ···· · • · · · · · · • · ··· ·· ·· • · · ···· ·· ···· ·♦· · ·· alapján ismert, kimutatjuk, hogy különösen erős HIV-l vírussemlegesítő aktivitása van a IIIB izolátum ellen, és blokkolja a HIV-1 IIIB fertőzött sejtek fúzióját a nem fertőzött célsejtekkel. Egy másik monoklonális antitestről az 5025,29.1.1.1 (ATCC HB10041)-ről kimutatjuk, hogy fúzióblokkoló hatása van egy sor HIV-l izolátum ellen.

Az alábbiakban részletesen ismertetjük a találmányt.

Egy E.coli által termelt, PBl-nek nevezett fehérjéről, amely körülöleli a HIV-l IIIB env-kódolt 288.-472. aminosavakat, már korábban kimutatták, hogy HIV-semlegesítő és fúzióblokkoló hatású antitesteket vált ki immunizált állatokban CPutney és munkatársai: Science 234, 1392-1395 (1986)3. Mi szisztematikusan elemezzük a teljes PB1 területet teljesen átérő 18 átfedő szintetikus peptid (1. táblázat) készletének antigén és immunogén tulajdonságait abból a célból, hogy meghatározzuk azokat az epitópokat, amelyek HlV-semlegesítő és sejtfúzió blokkoló aktivitású antitesteket válthatnak ki.

A peptideket mint antigéneket elemezzük, hogy meghatározzuk, vájjon ezeket felismerik-e a humán HIV-l szeropozitív szérum mintákból származó antitestek (1. táblázat). Ez az elanzés feltár két peptidet, amelyet 1-69nek és 1-73-nak nevezünk, és amelyek reaktívak több

HIV-l szeropozitív szérummintával, amikor antitestek nem fajlagos kötésével hasonlítjuk össze mikrotitráló lemezeken. Számos env-kódolt peptid reaktivitását HIV-l szeropozitív szérum-mintákban levő humán • · · · · · ·

•. · ··· · · ·· • · · · ···· ·· ······· · ·· ····

- 10 elemezzük és összehasonlítjuk kontroll szérumminta reaktivitásával (2. peptid magas szintű reaktivitást ad a antitestekkel tovább HIV-1 szeronegatív táblázat) . Az 1-69 vizsgált 37 HIV-1 szeropozitív szérumminta közül 12-vel, míg a vizsgált 47 kontroll HIV-1 szeronegatív szérumminta egyikének sincs a 0,2 határérték feletti ELISA abszorbanciája. A HIV-szeropozitív szérumminták reaktivitásának frekvenciája és reaktivitásának szintje az 1-73 peptidekkel kisebb, mint az 1-69 peptiddel. A szérumoknak van bizonyos reaktivitása (a 47 mintából 3) az 1-73 peptiddel. A szérum minta az 1-69 és 1-80 peptidekkel világos és a HIV-1 szeropozitivitás, vagyis az 1ELISA fajlagosságot mutat és 1-80 peptidek és a más peptidek alkalmasak HIVhumán szérum mintákban célból. Az 1-80 peptid a

1-80 és kontroll vizsgált reaktivitásnak korrelációja van, vagy 1-80 peptidet alkalmazó HIV-fajlagos antitestekre. Az 1-69 HIV-izolátumokból fajlagos antitestek diagnosztikus vagy

HIV-1 áll.

számú való megfelelő kimutatására prognosztikus

IIIB env-kódolt fehérje 418-432 számú aminosavaiból Az 1-69 peptid a HIV-1 IIIB env-kódolt fehérje 308-322 aminosavaiból áll. A 2. táblázatban alkalmazott körülmények között az 1-68, 1-74, 1-77, 1-81 és 1-84 peptidek nagyon kevés HIV-1 szeropozitív mintát mutatnak ki (-1 vizsgált 37 mintánként). A különbségek az ELISA abszorbancia értékekben és a pozitívan reaktív szérum minták gyakoriságában egy adott peptidnél az 1. és 2. táblázatban (pl. 1-81, 1-84, 1-73 peptid) valószínűleg az 1. és 2. táblázatban alkalmazott feltételekben levő különbségeket tükrözik.

• · • · ·· · ·· • · · « « · · • · · · * · ' · ·· • ·· ····· ·· ······« · «·

- 11 Amikor a peptidek immunogenicitását vizsgáljuk (3. táblázat), úgy találjuk, hogy a peptidek közül öt (1-67, 175, 1-77, 1-80, és 1-83) nem képes nagy anti-peptid antitest titert kiváltani tengeri malacokban. Azok közül a tengeri malac szérum minták közül, amelyek jelentős szintű antipeptid antitestet tartalmaznak, csak az 1-69 peptid ellen kialakult antitestek mutatják az alábbi kimutatható aktivitásokat: 1. reaktívak env-kódolt gpl20-szal immunfoltokon (3. táblázat); képesek a gpl20-at immun-kicsapni (adatokat nem mutatunk be); 3. képesek semlegesíteni a HIV-1 IIIB burjánzást sejttenyészetben (3. táblázat); 4. képesek blokkolni a sejtfúziót a HIV-1 IIIB által fertőzött sejtek és nem fertőzött sejtek között sejttenyészetben (3. táblázat).

Amikor vírus-semlegesítő vizsgálatot alkalmazunk, az 1-69 anti-peptid szérumok 50%-os gátlást adnak 1:300 hígításban. A semlegesítő aktivitásnak ez a szintje azonos vagy nagyobb annál, mint amelyről korábban beszámoltak a HIV-fertőzött sejtekből tisztított gpl20 elleni antitesteknél, vagy a rekombináns env-eredetű fehérjék elleni antitesteknél, vagy bármilyen kémiai úton szintetizált HIV-eredetű peptid elleni antitesteknél CLasky és munkatársai: Science 233, 209-212 (1986); Matthews és munkatársai: Proc. Natl.Acad.Sci. USA

83., 9709-9713 (1986); Taylor

Proc.Natl.Acad.Sci. USA 84, 2951-2955 munkatársai: EMBO^I. 5_, 3065-3071 (1936); j. of Virol. 61, 2024-2028 (1987)3.

és munkatársai: (1987); Chanh és Ho és munkatársai: Említésre méltó és ···· ·« e··· • · · · • · · ·· • · · · • · · w · · · · <· ·· • * ·· • w ··

- 12 érdekes, hogy egy szekvencia fehérjéből, nyilvánvalóan fehérje. Úgy válasz előre úton szintetizált peptid mértékben glikozilezett képes kiváltani· egy választ, mint a natív hogy az env peptid peptid Az is területen kívül, kis, kémiai egy komplex, nagy pl. gpl20-ból, erősebb semlegesítő tűnik, hogy egy nem megfelelő immunológiai kisajátíthat egy védelmi választ. Lehetséges, más területeire fajlagos antitestek, az 1-69 területen kívül, ellentétesen hatnak egy, az env 1-69 területre fajlagos semlegesítő antitest . kötésével, lehetséges, hogy más env-kódolt epitópok, az 1-69 ellentétesen hatnak egy, az env 1-69 peptid területre fajlagos erős immunválasszal. Ismeretes, hogy a szabad vírushoz rögzített antitest sokkal valószínűbben kötődik makróiágokhoz, ezáltal növelve a fertőzötté váló makrofágok valószínűségét. Ezek a megfontolások megmagyarázhatják, miért jobb immunogén az 1-69 peptid, mint az env fehérje nagyobb szegmensei, abból a szempontból, hogy képesek állatokban HIV-gátló antitesteket kiváltani. így egy megfelelő peptid immunogén alkalmazása elkerüli a HIV fajlagos antitestek kiváltását olyan állatokban, amelyek nem rendelkeznek védő funkcióval.

Ezen kívül az anti-1-69 peptid szérumok képesek blokkolni a sejtfúziót; ez olyan tulajdonság, amelyet a HIV-vel fertőzött sejtekből tisztított gpl20-ra fajlagos kecske antitestek nem mutatnak CMatthews és munkatársai: tóc.Natl.Acad.Sci. USA 83, 9709-9713 (1986)]. A fúzióblokkoló antitestek szintje az anti- 1-69 peptid szérumokban hasonló a HIV-l szeropozitív szérumokban talált legmagasabb

- 13 ·*·« ·« ·«··· «4 • · · · · · · • 9 ·*« · ♦ β· • · · · · w»· ·· ··*·»·« · ·♦ szintekhez. CMatthews és munkatársai: Proc.Natl.Acad.Sci. USA EH, 5424-5428 (1987)3.

Az anti-1-69 peptid szérumok csak semlegesítik a HIV-l IIIBt és blokkolják a HIV-l IIIB-fertőzött sejtek fúzióját és nincs semmiféle hatásuk a HIV-l RF-re. Hahn és munkatársai és mások CHahn és munkatársai: Proc.Natl.Acad. Sci. USA 82, 4813-4817 (1985); Starcich és munkatársai: Cell 45 , 637-648 (1986); Hahn és munkatársai:Science 232, 1548-1553 (1986)3 azonosítottak előre megjósolt aminosav-változatosságú területeket a gpl20 fehérjén belül és kiszámították, hogy a vírusellenes antitestek típusa vagy izolátum-fajlagossága ezen hiper-variábilis területek felismerésének tulajdonítható. A mi eredményeink egy lehetséges semlegesítő és fúzió-blokkoló területet azonosítanak, amely 15 aminosavból áll az előre kiszámított hiper-variábilis területek egyikén belül, és támogatják az aminosav-variáció szerepét a típusban és a korlátozott semlegesítésben. A HIV1 pozitív szérumok reaktivitása ugyanezzel a pepiiddel azt jelzi, hogy ez a fehérje terület ismerődik fel és ez vált ki antitesteket a HIV-l fertőzés során.

Az antigén-területek számítógép-eredetű kalkulációjáról számolnak be gpl20-nál Modrow és munkatársai CModrow és munkatársai: J. of Virol. 61, 570-578 (1987)3. Az 1-69 peptiddel fedett terület az antigénnek kalkulált területek egyikén belül van a HIV-l IIIB izolátumnál. Az 1-73 peptid egyik részéről szintén azt kalkulálták, hogy antigén, míg a HIV-l pozitív szérumokkal reaktív másik pepiidnél, az 1-80···· 44 4· · · ·

- 14 • · * · · • ·····* • · « · · 4 · ·· »····«· « • 4 • · • 4 nál nem. Az 1-80 érdemel, mivel ez származik. így az peptid reaktivitása további vizsgálatot a peptid a gpl20 megőrzött területéből

1-80 peptid hasznos lehetne sokféle különböző HÍV izolátumok elleni válaszban kiváltott humán antitest kimutatásában, amely izolátumok env-kódolt fehérjéi szekvenciában különbözhetnek azokon a területeken, amelyek nincsenek a megőrzött területen belül.

Bár az anti-1-69 peptid szérum HIV-gátló aktivitása úgy tűnik, fajlagos a IIIB izolátumra, érdekes, hogy azok az antitestek, amelyek semlegesítést közvetítenek és sejtfúziót blokkolnak, válaszként képződnek egy egyedi rövid (15 aminosav) peptid szekvenciára. Ez az eredmény azt sugallja, hogy a vírus semlegesítésnek és a sejtfúzió-gátlásnak közös mechanizmusa lehet, mivel az env azonos 15 aminosavas területe tűnik kritikusnak mindkét folyamathoz. A HÍV burkolati fehérjékről már korábban kimutatták, hogy szerepet játszanak mind a vírus fertőzőképességében, mind a fertőzött sejtek fúziójában, és bizonyos, env-eredetű fehérjékre fajlagos emberi és állati antitestek blokkolják mind a vírus fertőzőképességet, mind a fúziót CPutney és munkatársai: Science 234, 1392-1395 (1986); Rusche és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 6924-6928 (1987)1. A mi eredményeink azt demonstrálják, hogy a mindkét aktivitásért felelős antitestek a gpl20 egy egyedi 15 aminosavas területén belül kötődhetnek. Meglepő módon a jelen találmány szerinti monoklonális antitestekről kimutatjuk, hogy mutatnak mind HIV-semlegesítési, mind fúzió-blokkoló aktivitást. Az anti1-69 peptid antitest kötődése ehhez a területhez zavarhatja ···· ·· ···· · ·· • · · · · ν * * · ··· · · ·· • · · · ···· • · ···· ··· « ·· a gpl20 és gp41 kölcsönhatását is, bár az anti-l-69-peptid által kiváltott HÍV gátlásnak más lehetséges mechanizmusai is lehetnek.

Azok a monoklonális antitestek, amelyek semlegesítik a vírust és blokkolják a fertőzött és nem fertőzött sejtek fúzióját, megnövekedett ellenállást nyújthatnak HIV-1 fertőzés ellen, miközben elkerülnek egy nem megfelelő és esetleg káros immunológiai választ.

Más HIV-1 izolátumok 1-69 peptidje vagy a burkolati fehérjéje megfelelő szegmensei elleni monoklonális antitestek alkalmazhatók, hogy passzív immunizálást vagy terápiás előnyt nyújtsanak olyan betegeknek, akik ki voltak téve AIDS vírusnak vagy meg vannak fertőzve azzal; ezek alkalmazhatók kutatási reagensekként, vagy anti-idiotípusos antitestek kifejlesztésére alkalmas antitestekként. Az antiidiotípusos antitesteket immunogénként alkalmazhatjuk, hogy immunitást fejlesszünk ki olyan antigén ellen, amely ellen az eredeti Abl antitest kialakult. HÍV fertőzés immunizálás esetében antiidiotípusos antitestekkel biztonságos alternatíva alakulhat ki a teljes vírussal végzett vagy vírus-komponensekkel végzett immunizáláshoz viszonyítva.

Egy sorozat rágcsáló monoklonális antitestet fejlesztünk ki az 1-69 szintetikus peptidre. Ezeknek a monoklonális antitesteknek egyikéről, amely hibridóma kiónja alapján 5023.24.4.1.1-ként (ATCC HB 10043) ismeretes, kimutatjuk, hogy különösen erős HIV-1 vírus-semlegesítő aktivitással bír ···· ·· ···· 4 • * 4 · « · 4 • · ··· · · ·· • · · « «··· •· ···· ··· · ««

- 1:6 a IIIB izolátum ellen és blokkolja a HIV-l IIIB-vel fertőzött sejtek fúzióját a nem fertőzött célsejtekkel. Ezek alapján várható, hogy hasznos lesz passzív immunizálás szolgáltatására olyan betegeknél, akik HIV-l IIIB izolátumnak voltak kitéve, vagy gyógyászati szerként, hogy lassítsa a betegség előrehaladását olyan betegekben, akik a vírussal voltak fertőzve. Az 5023,24.4.1.1 Mab erős Western foltképző aktivitást is mutat az env gpl20 irányában, amely ennek lehetséges hasznosítását sugallja diagnosztikai célokra. Ezek a monoklonális antitestek lehetnek beindító reagensek is, amelyeket anti-idiotípusos antitestek kifejlesztésére alkalmazhatunk vakcina-termeléshez. Ugyanezen peptid ellen kialakuló más monoklonális antitestek alacsonyabb szintű semlegesítő aktivitással bírnak; ezeket is leírjuk a későbbiekben.

Az 1. és 4. táblázatok felsorolják a peptidek szekvenciáit, egy betűs jelképeket alkalmazva az aminosavgyökök bemutatására, amint ezt Lehninger leírta CBiochemistry, 2. kiadás, 72. oldal, kiadó: Worth Publishers, Inc. (1975)3. Következésképpen az 1-69 peptid aminosavszekvenciáját RIQRGPGRAFVTIGK-nak vagy Arg-Ile-Gln-Arg-Gly-Pro-Gly-ArgAla-Phe-Val-Thr-Ile-Gly-Lys-nek azonosíthatjuk.

A különböző gyógyászati kiszereléseknek és adagolási formáknak értékes forrása az alábbi szakkönyv: Remington's Pharmaceutical Sciences, 17. kiadás; kiadó: Mack Publishing Company, Easton, PA 18042 (1985).

- 1.1 -

Az alábbiakban röviden ismertetjük az ábrákat.
1.	ábra
Az	átfedő szintetikus peptidekkel	behatárolt	HIV-1 env-
kódoló szekvencia térképe. A tömör	területet	képviselik a

megőrzött fehérje területeket, és az árnyékolt területek a hiper-variálható területek EPutney és munkatársai: Science 234, 1392-1395 <1986); Sárin és munkatársai: Science 232, 1135-1137 (1986)1.

2. ábra

Immunreaktivitás különböző monoklonális antitestek szilárd fázisú ELISA-jában 1-69 (az immunizáló peptid), valamint 1178, 1-177, 5, 1-68 és 1-70 peptidekkel. Ezeknek a peptideknek a szekvenciáját a 6. táblázatban mutatjuk be.

ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK

A peptidek szintézise és jellemzése

Átfedő peptideket készítünk a gyors, sokszoros peptid szintézis rendszert CMultiple Peptide Synthesis System (RaMPS, E.I. du Pont de Nemours and Company, Wilmington, Delaware)! alkalmazva. Ez a rendszer szilárd fázisú FMOC kémiát alkalmaz kézi formátumban. A szilárd rögzítő anyag palkoxi-benzil-alkohol gyanta a Bachem Inc.-tői (Torrance, Kalifornia). A gyanta aminhelyettesítése mintegy 0,25-0,65 ···· ·· ···· · • · · · · • ·*···« • · · · · · · • · ······· · van. A védett aminosavak pentafluor(Milligen, Bedford, Massachussets) primer aktiválási stratégiához, hidroxitámogatott vagy előformált szimmetrikus amelyek alternatív stratégiákhoz vannak kötési hatékonyságot kvalitatívan követjük mmól/g tartományban fenil észtereit alkalmazzuk a benzotriazollal anhidridekkel, fenntartva. A ninhidrinnel (Kaiser teszt) vagy izotinnal a prolinhoz adott gyököknél. Mindkét vizsgálat kimutatja a nem reagált amincsoportokat. Az egyes kapcsolásoknál a reakciókat addig hagyva, amíg a Kaiser vagy izotin vizsgálat negatív lesz, a kapcsolási hatékonyságban > 99%-ot érhetünk el. A peptidilgyanták hasítása savas hidrolízissel C-terminálisukon szabad karboxilcsoporttal bíró peptideket peptideket először egyedi jellegre fázisú kromatográfiával Pharmacia oszlopon, 20-80¾ acetonitril: víz gradienst alkalmazva. Az összes peptidet tovább elemezzük tömegspektrometriával. Egy szekvenciáját akkor tekintjük M+H fő ionja látszik. Azokat a mutatnak megkülönböztethető fő mutatnak szintetizáljuk.

eredményez. Ezeket a jellemezzük fordított FPLC PepRPC HR 5/5 gyors atom-bombázásos adott peptid tervezett jelenlevőnek, ha a számított peptideket, amelyek megkülönböztethető fő csúcsot FPLC-vel, tömeg M+H molekulaiont, eldobjuk vagy nem vagy nem és újra

Az antitestek peptidekhez kötésének kimutatása kapcsolt immunszorbens vizsgálattal (ELISA) enzimmel

Szintetikus peptideket immobilizálunk közvetlenül Immulon-II mikrotitráló lemezeken, glutáraldehidet alkalmazva. A

lemezeket 2¾ glutáraldehiddel aktiváljuk 2 órán át szobahőmérsékleten vagy 0,1¾ glutáraldehiddel 30 percig, és ionmentesített vízzel öblítjük. A glutáraldehides kezelésnek két körülményét alkalmazzuk rutinszerűen: a 2¾ glutáraldehidet azért alkalmazzuk, hogy biztosítsuk a peptid megfelelő kötését a lemezhez, és a 0,1¾ glutáraldehidet azért, hogy elkerüljük a kötőhelyek változását. 100/ti peptid-oldatot, amely 10 ytg/ml-t tartalmaz 60 mmól/1 bikarbónát pufferban (pH 6,9), adunk üregenként és inkubálunk egy éjszakán át 4 °C hőmérsékleten. A lemezeket mossuk és PBST-vel (foszfáttal pufferolt fiziológiás konyhasóoldat +0,05¾ Tween 10) blokkoljuk 1 órán át 37 °C hőmérsékleten, majd szárazon tároljuk 4 °C hőmérsékleten.

Azok a peptidek, szérumokkal, amikor vannak kapcsolva, amint (HSA) is, alkalmazzuk, mikrotitráló mikrotitráló munkamenetet glutáraldehid amelyek nem közvetlenül konjugálódnak később leírjuk.

biztosítsuk

A üregen azzal reagálnak HÍV szeropozitív a mikrotitráló lemezekhez a humán szérum albuminhoz Ezt a munkamenetet a peptid immobilizálását a peptid-HSA immobilizáljuk a kivétellel, hogy lemezhez.

lemez alkalmazva, azzal a nem szerepel a reakcióban.

konjugátumot a fenti hogy

Közvetlenül alkalmazás előtt, ahol jelezzük, a lemezeket ismét blokkoljuk 100 /11 hígítóval (PBST +5¾ szarvasmarha szérum albumin +20¾ hővel inaktivált normál kecske szérum +0,1¾ nátrium-azid +0,05¾ timerozál) 30-60 percig 37 °C hőmérsékleten. 1:20 arányban hígítóval hígított humán szérum mintákat (100 /11) adunk az egyes üregekhez és 2 órán át •··· · · ····· · · • · · · i · • * ··· · · ·.

• · · ····· • · ··*·»·· · ·· ' 20 inkubálunk szobahőmérsékleten. Az inkubálást az alkálikus foszfatázzal konjugált kecske anti humán IgG-vel (Jackson Immunoresearch Laboratories, Avondale, Pennsylvania) 1 órán át végezzük szobahőmérsékleten, o-nitro-fenil-foszfátot alkalmazva szubsztrátumként. A reakció optikai sűrűségét vagy abszorbonciáját mikrotitráló lemez leolvasót alkalmazva határozzuk meg.

Peptidek konjugálása fehérje hordozókhoz

Az immunizálás előtt a peptideket vagy ovalbuminhoz vagy kubslyuk-kagyló (keyhole limpet) hemocianinhoz konjugáljuk. Az ELISA tanulmányokhoz humán szérum albumint (HSA) alkalmazunk hordozó fehérjeként. A hordozó fehérjét (2 mg/ml) 0,5% glutáraldehiddel aktiváljuk 30-60 percen át szobahőmérsékleten, majd azonos térfogatú peptid-oldatot (2 mg/ml dimetil-szulfoxidban) adunk hozzá. A reakció egy éjszakán át zajlik 4 °C hőmérsékleten, amely után a reakciókeveréket egy éjszakán át ionmentesített vízzel vagy 0,1 mól/1 glicinnel (pH 7,0) szemben dializáljuk humán szérum albumin esetében.

Immunizálási eljárások

Tengeri malacokat és nyulakat immunizálunk standard immunizálási munkamenetet követve. A tengeri malacokat és nyulakat először 100-200 ^g peptid-hordozó fehérje konjugátummal immunizáljuk komplett Freund-féle adjuvánsban, és emlékeztető oltásokat adunk fele mennyiségű peptid···· J

- 21 hordozó fehérje konjugátummal inkomplett Freund-féle adjuvánsban ezután minden két hétben. Minden második emlékeztető oltás után szérummintákat veszünk.

HÍV semlegesítési és sejtfűziós vizsgálatok

Mintegy 500 TCID5q fertőző egység HIV-1 IIIB-t vagy HIV-1 RF-et (25 jvtl-ben) összekeverünk és inkubálunk szérumhígításokkal (25 yv^l) 30 percig 37 °C hőmérsékleten. Molt 4 sejteket (4.10^) adunk hozzá 100 y<l térfogatban és az inkubálást hat napon át folytatjuk 37 °C hőmérsékleten. A szérumminta végső hígítása 1-20. Az egyes tenyészetek teljes térfogatát naponta megkettőzzük friss tápközeg hozzáadásával (RPMI +20¾ bor jűembrió-szérum). A hatodik napon 100^1 mintát veszünk a felülúszóból és megvizsgáljuk virális gagkódolt p24 antigén szintre, antigén befogásos vizsgálatot alkalmazva( Du Pont, Wilmington, Delaware).

A sejtfúziós vizsgálatokat már korábban leírták EMatthews és munkatársai: Proc.Natl.Acad.Sci. USA 84 , 5424-5428 (1987)3. Röviden ismertetve 5000 CEM sejtet, amelyek krónikusan fertőzöttek HIV-1 IIIB-vel vagy HIV-1 RF-fel, összekeverünk 75000 Molt 4 sejttel 100ynl térfogatban, egy 96 üreges, félterületű lemezen. A szérumok végső hígítása a vizsgálatban 1 és 20 között van. 24 órával később az óriássejteket vizuálisan megszámoljuk 40-szeres nagyításban.

- 2.2 Radio-immunkicsapás

Tenyészközeget

600 Ci/mmól) (3 és ml), 8.10⁶ 500-500 Ci ciszteinnel (^^S, 600 metioninnal

Ci/mmól) jelzett sejtből, alkalmazunk a vizsgálathoz. A előadszorbeáljuk normál humán szérummal tenyészközegeket és A-fehérjeSepharose-val. A fehérjéket kicsapjuk humán HIV-1 pozitív szérumot vagy tengeri malac szérum mintákat és A-fehérjeSepharose-t alkalmazva. A fehérjéket nátrium-dodecilszulfát-PAGE-val (10%) különítjük el, és a gélt autoradiográfiának vetjük alá.

KIVITELI PÉLDÁK

1. példa

Humán antitestek kötése a HIV-1 IIIB env-nek megfelelő, kémiai úton szintetizált peptidekhez

Peptideket szintetizálunk, amint ezt az Anyagok és Módszerek című fejezetben leírtuk. Ez a munkamenet lehetővé teszi a peptidek szintézisét kielégítő mennyiségben ahhoz, hogy megvizsgálhassuk a humán antitest reaktivitást és az állatok immunizálását. A peptidek által befedett területét az 1. ábrában körvonalazzuk, és ez magában foglalja a PB1 rekombináns fehérje szekvenciáit EPutney és munkatársai: Science 234, 1392-1395 (1986)1. A peptideket 5 aminosavas átfedéssel tervezzük olyan módon, hogy 6 egymást követő aminosav valamilyen szekvenciája képviselve legyen.

Az 1. táblázatban bemutatott összes pepiidet megvizsgáljuk

2.3 reaktivitásra 12 humán HIV-1 szeropozitív szérummintával, vagyis a peptid felismerésére humán HIV-fajlagos antitestekre. Az 1. táblázat bemutatja a szérumminták számát bármely adott peptidnél, amelynek átlagos ELISA abszorbanciaja ötször nagyobb, mint a háttér-abszorbancia, amelyet a szérum-mintákkal kapunk, glutáraldehiddel kezelt, peptidet nem tartalmazó vak üregeket alkalmazva. Az 1. táblázat olyan adatokat mutat be, amelyeket 2% glutáraldehid alkalmazásával kapunk a kapcsoláshoz használt munkamenetben. Az ELISA abszorbancia az 1-69 és 1-73 peptideknél a legmagasabb és ezeknek a peptideknek vannak a legnagyobb százalékban olyan szérum-mintáik, amelyek reagálnak velük. Az alábbi peptideket tekintjük reaktívnak, határértékként 10-szer nagyobb ELISA abszorbanciát alkalmazva, mint a peptidet nem tartalmazó kontroll üregekkel kapott háttérabszorbancia (peptid-jelölés/pozitív szérumok száma); 169/5; 1-72/1; 1-73/3; 1-74/2; 1-77/1; 1-78/1; 1-81/2; 183/1; és 1-84/1.

Amikor a peptid rögzítéshez alkalmazott munkamenetben 0,1% glutáraldehidet alkalmazunk, a háttér ELISA abszorbanciák alacsonyabbak. Ebben az elemzésben az egyetlen peptid, amelynek abszorbanciái ötször nagyobbak, mint a háttér, az 1-69 peptid. A 12 szérummintából 9 reaktív az 1-69 peptiddel 1,06 + 0,47 átlagos abszorbanciával. Ha egy ELISA abszorbancia határértéke tízszer nagyobb, mint az alkalmazott háttér, a 12 szérummintából 6-ot tekintünk pozitívnak az 1-69 peptiddel, a 0,1% glutáraldehides munkamenetet alkalmazva a peptid rögzítésnél.

• · · ·

- 27+ Ezeken kívül az 1-67, 1-70, 1-71, 1-75, 1-76 és 1-79 peptideket, amelyekről úgy tűnik, hogy nem kötődnek humán antitestekhez az 1. táblázat kísérleteiben, átvizsgáljuk egy harmadik technikát alkalmazva a peptid immobilizáláshoz a mikrotitráló lemezre. Ezeket a peptideket először humán szérum albuminhoz (HSA) konjugáljuk, majd a peptid-HSA konjugátumot mikrotitráló lemezen immobilizáljuk, és megvizsgáljuk reaktivitásra HIV-1 pozitív humán szérum mintákkal ELISA segítségével. Ezek a peptid-konjugátumok nem adnak szignifikánsan nagyobb ELISA abszorbanciákat a kontroll szérumokhoz képest.

HIV-1 szeropozitív szérummintát és 49 normál HIV-1 szeronegatív szérummintát ELISA-val; az eredményeket Három normál szérum minta elemzőnk kiválasztott peptid a 2. táblázatban mutatjuk be. ad határérték feletti ELISA abszorbanciákat 1-73 pepiidet alkalmazva. A normál HIV-1 szeronegatív szérum minta egyike sem pozitív az 1-69 vagy 1 peptideket alkalmazva ELISA vizsgálatban. A vizsgált 37

HIV-t szeropozitív szérum mintából 12 pozitív az 1-69 peptidet alkalmazva az ELISA vizsgálatban, 16 pozitív az 173 peptidet alkalmazva az ELISA vizsgálatban, és 14 pozitív az 1-80 peptidet alkalmazva az ELISA vizsgálatban. A HIV-1 pozitív szérumminták reaktívabbak az 1-69 pepiiddel az 1-73 és 1-80 peptidekkel összehasonlítva, az átlagos ELISA abszorbancia értékek alapján. A nagy standard eltérés és az alacsony átlag az 1-73 peptidnél azt jelzi, hogy a HIV-1 pozitív szérumminták közül sok nem reaktívabb ezzel a * · ···· ·

- 25 peptiddel, mint néhány normál szérumminta; másrészt a nagy standard eltérés az 1-69-nél és 1-80-nál egy széles tartományt képvisel a reaktivitásban szérumról-szérumra .

Az 1-69 peptid az env-kódolt gpl20 fehérje hipervariábilis területeinek egyikéből származik CModrow és munkatársai: J.

of Virol. 61, 570-578 (1987)3, míg az 1-73 és 1-80 peptidek kevésbé variábilis szekvencia bizonyos különböző izolátumai területekről származnak, amelyek a megőrzöttségével bírnak a vírus között CModrow és munkatársai: 0. of

Virol. 61, 570-578 (1987)3. Tudva, hogy az 1-69 peptid hipervariábilis területről származik, meglepő, hogy a HIV-1 szeropozitív szérumminták viszonylag nagy százalékát pozitívnak vizsgáljuk az 1-69 peptid ELISA-t alkalmazva. Lehetséges, hogy az immunreaktivitás többsége a nagy mértékben megőrzött Gly-Pro-Gly szekvenciára fajlagos az 1 peptiden belül. Az ELISA abszorbancia értékek, amelyeket az 1-69 peptidet alkalmazva kapunk a HIV-1 pozitív szérumokkal, átlagosan nagyobbak, mint az 1-73 és 1-80 peptidekkel kapott értékek, a vizsgálatok azonban ezekkel a peptidekkel még nincsenek optimalizálva. A szérummintáknál kapott alacsonyabb ELISA abszorbanciák az 1-73 peptiddel, amint ezt a 2. táblázatban bemutatjuk és az 1. táblázattal összehasonlítjuk, a lemezek hígítóval való inkubálásának eredményei a szérumnak való kitevés előtt.

• · • ·· ·

2. példa

A HIV-l IIIB env-nek megfelelő szintetikus peptidek mint immunogének

Az 1. táblázatban felsorolt összes peptidet hordozó fehérjéhez (vagy kulcslyuk kagyló hemocianinhoz, vagy ovalbuminhoz) konjugáljuk és az egyes peptid-hordozó fehérje konjugátumokat két-két tengeri malac immunizálására alkalmazzuk. A tengeri malacokat mint nagyon alkalmas vizsgálati állat rendszert alkalmazzuk. A létrejövő tengeri malac antiszérum mintákat anti peptid reaktivitásra figyeljük ELISA eljárást alkalmazva. (Az 1-76 peptidet először tengeri malacokba injektáltuk, de az állatok elpusztultak közvetlenül az első injekció után. A peptidet azután nyulakba injektáltuk, ahol az anti-peptid antitestek káros mellékhatások nélkül alakultak ki) .

Hat hónapos időpontot választunk ellenes jellemzőinek ki a tengeri malac antiszérumok vírus (azaz HÍV semlegesítő és sejtfúzió blokkoló) vizsgálatára.

A 3. táblázatban levő adatok azt mutatják, hogy a peptidek többsége peptid-fajlagos antitesteket indukál 6 hónapra az első immunizálást követően. Bár az antitestek különböző szinten termelődnek, nincsen olyan eset, ahol az állatpárból csak az egyik állat termel antitesteket. Az 1-67, 175, 1-77, 1-80 és 1-83 peptidek nagyon alacsony szinten termelnek anti-peptid antitesteket a konjugáláshoz és immunizáláshoz alkalmazott feltételek között. Azok az • ··· «* « • * • · ·· állatok, amelyek anti-peptid antitestek jelentős szintjeit mutatják, általában már a harmadik hónapban mutatnak reaktivitást és a szint tovább növekszik az ezt követő 2-3 hónapon át.

Az egyedüli anti-peptid szérumminták, amelyek gpl20-hoz kötődnek immunfolt-csíkon, az anti-1-69 peptidek; ezek csak a HIV-1 IIIB 120/160 csíkjaival mutatnak világos reaktivitást (adatokat nem mutatunk be). Ugyancsak az anti1-69 peptid szérumminták az egyedüli szérumminták ezekből a kísérletekből, amelyek képesek a HIV-1 IIIB törzsből származó gpl20 radioimmunkicsapására (adatokat nem mutatunk be). Amikor immunfolttal vizsgálunk rekombináns Escherichia coli által termelt ENV-14 fehérjét (az ENV-14 a HIV-1 IIIB 40-511 aminosavait öleli körül) alkalmazva, amely a gpl20nak olyan területét öleli körül, amelyből a peptidek származnak, csak az 1-68, 1-69, 1-76 és 1-82 peptidekre fajlagos antiszérumokkal mutatható ki reaktivitás. Ezek közül a peptidek közül - az 1-69 kivételével - mindegyik tartalmaz lehetséges glikozilező helyeket. Lehetséges, hogy a gpl20 glikozilezése emlős sejtekben megelőzi a (nem glikozilezett) 1-68, 1-76 és 1-82 peptidekre fajlagos antitestek kötődését.

A tengeri képességükre semlegesítik malac szérummintákat is, hogy gátolják a a HIV-t, és blokkolják megvizsgáljuk

HÍV burjánzást, vagyis a sejtfúziót a HIV-vel arra a fertőzött és nem fertőzött sejtek között sejttenyészetben ···· -* ···« ♦ · · · • · · · · • ♦ · · • · ···· ··· • * * ♦ * · ··

- 23 *♦ (3. táblázat). Az egyedüli szérumminták, amelyek képesek semlegesíteni a HIV-1 IIIB-t és blokkolni a fúziót, azok, amelyek az 1-69 peptid ellen keletkeznek. Mind a semlegesítő, mind a fúzió-blokkoló aktivitásokat típusfajlagosnak jelezzük, mivel a HIV-1 IIIB-t az anti-1-69 peptid antitestek semlegesítik, míg a HIV-1 RF nem. Ugyanez igaz a sejtfúzió blokkolására is.

Amint az 5. táblázatban bemutatjuk, a kimutatható HÍV sejtfúzió blokkoló antitestek megjelenése 1-69 peptiddel immunizált állatokban nem történik meg az immunizálás kezdetétől számított 5 hónapon belül; erre az aktivitásra a maximális antitest titert az immunizálás rajtjától számított

6. hónapban kapjuk meg.

• ·· · « • « ··

- 29 * · · · « · • · ···« ···*»·· ·

	1. TÁBLÁZAT
HIV-1 szeropozitív IIIB env-kódolt	szérumminták ELISA reaktivitása a HIV-1 aminosav szekvenciáknak megfelelő

peptidekkel

PEPTID szám szekvencia

Pozitív Abszorbancia szérű- + SD^ mok·*·

1-67	LNQSVGINCTRPNNNT	0	—
1-68	RPNNNTRKSIRIQRG	1	0,23±0,00
1-69	RIQRGPGRAFVTIGK	8	0,7910,40
1-70	VTIGKIGNMRQAHCNI	0	—
1-71	QAHCNISRAKWNNTL	0	—
1-72	WNNTLKQIDSKLREQF	4	0,29^0,10
1-73	KLREQFGNNKTIIFK	10	0,8510,44
1-74	TIIFKQSSGGDPEIV	4	0,3410,10
1-75	DPEIVTHSFNCGGEF	0	—
1-76	CGGEFFYCNSTQLFNS	0	—
1-77	TQLFNSTWFDSTWST	5	0,36-0,13
1-78	STWSTKGSNNTEGSD	4	0,3010,12
1-79	TEGSATITLPCRIQQI	0	—
1-80	CRIKQIINMWQEVGK	2	0,2210,06
1-81	QEVGKAMYAPPISGQI	5	0,3710,10
1-82	PISGQIRCSSNITGL	1	0,2110,02

• ·

1-83 NITGLLLTRDGGNSNE

1-84 GGNSNNESEIFRPGG

0,29±0,06

0,3110,06

Peptid-ELISA pozitív szérumok száma 12 vizsgált szérumból

Pozitív szérumok átlagos abszorbanciája ^SD

Az ELISA vizsgálatot úgy futtatjuk, amint azt az Anyagok és Módszerek fejezetben leírtuk, a lemezekhez való rögzítésnél a 2¾ glutáraldehides munkamenetet alkalmazva.

A szérumokat akkor ítéljük pozitívnak, ha ezek a peptid vizsgálatban ötször nagyobb ELISA abszorbanciát adnak, mint a pepiidet nem tartalmazó, glutáraldehiddel kezelt kontroll üregek. Az átlagos abszorbanciát és a standard eltérést úgy számoljuk ki, hogy a reaktív szérumoknál az összes meghatározást felhasználjuk (duplikátum üregeket minden egyes szérumnál). 12 HIV-1 szeropozitív szérummintát használunk.

2. TÁBLÁZAT

Humán HIV-1 szeropozitív és szeronegatív szérum minták reaktivitásának összehasonlítása kiválasztott peptid ELISA vizsgálatokban

HÍV SZEROPOZITÍV SZÉRUMOK

NORMÁL SZERONEGATÍV

SZÉRUMOK

PEPTID	Pozitív	Abszorbancia	Pozitív	Abszorbancia
Szám	szérumok-*·	+SD2	szérumok-^	+ SD2
1-68	1	0,2110,00	0
1-69	12	0,7110,49	0
1-73	16	0,2810,13	3	0,2410,03
1-74	0		0
1-77	0		0
1-80	14	0,3410,24	0
1-81	1	0,2110,00	0
1-84	0		0

Peptid-ELISA pozitív szérumok száma 37 vizsgált szérumból

Pozitív szérumok átlagos abszorbanciája ⁺SD

Peptid-ELISA pozitív szérumok száma 47 vizsgált szérumból

Az ELISA vizsgálatokat úgy futtatjuk, mint az 1.

• · • ··• · « · · · · * · · · •4 ···· ··« • · · · · • · • · ·· • « •· • · táblázatban, azzal a kivétellel, hogy a mikrotitráló üregeket hígító nélkül blokkoljuk 1 órával a felhasználás előtt. A szérum mintákat akkor tekintjük pozitívnak, ha ezek 0,2-nél nagyobb ELISA abszorbanciát adnak. 37 HIV-1 pozitív szérummintát és 47 normál szérummintát vizsgálunk.

3. TÁBLÁZAT

PEPTID*	KORLÁTOZÓ+ HÍGÍTÁS	FÚZIÓS** VIZSGÁLAT	SEMLEGESÍTŐ# AKTIVITÁS	IMMUNFOLT
gpl20	env 14
1-67	< 20	59,ND	>	800
1-67	< 20	69,65	>	800	-	-
1-68	4000	70,78	>	800	-	+
1-68	870	88,60	>	800	-	+
1-69	5000	3,0	<	1,5	+	+
1-69	970	0,0	<	1,5	+	+
1-70	1650	66,71		800	-	-
1-70	80	68,58	>	800	-	-
1-71	3030	63,48	>	800	-	-
1-71	5310	72,72	>	800	-	-
1-72	1050	68,65	>	800	-	-
1-72	660	64,48	>	800	-	-
1-73	1020	66,62	>	800	-	-
1-73	1580	ND,ND	>	800	-	-
1-74	680	61,63	>	800	-	-
1-74	4170	68,55	>	800	-	-
1-75 +	< 20	66,70		800	-	-

3. TÁBLÁZAT

FOLYTATÁSA

	KORLÁTOZÓ*	FÚZIÓS**	SEMLEGESÍTŐ#	IMMUNFOLT
PEPTID*	HÍGÍTÁS	VIZSGÁLAT	AKTIVITÁS	gp!2O env 14

1-75	< 20	53,64	> 800	-	-
1-76'	4280	68,71	> 800	-	+
1-76	22640	65,88	> 800	-	+
1-77	< 20	N0,ND	> 800	-	+
1-77 +	< 20	53,57	> 800	-	-
1-78	10490	53,ND	> 800	-	-
1-78	12210	58,65	> 800	-	-
1-79	5430	55,49	> 800	-	-
1-79	430	61,56	> 800	-	-
1-80 +	30	63,66	800	-	-
1-80	< 20	54,53	> 800	-	-
1-81	8290	69,62	> 800	-	-
1-81	10820	55,56	> 800	-	-
1-82	3270	49,55	> 800	-	-
1-82 +	660	47,48	550	-	+
1-83 +	< 20	64,52	> 800	-	-
1-83	< 20	58,64	> 800	-	-
1-84	980	55,51	> 800	-	-
1-84	2480	65,49	> 800	-	-

Az összes peptidhez tengeri malacokat alkalmazunk ···· ·· • » · • · • · · ·· 9ΛΛ9 ···· · • · • · · · « * ♦»·· ··· « • · • · ·· ··

- 3Α kivéve az 1-76 peptidet, amelyet nyulakba injektálunk. Ezeknél 2-5 hónappal veszünk vérmintát a kezdeti injekciótól számítva, az összes többitől 6 hónap múlva veszünk vérmintát.

⁺ A korlátozó hígítást a hígítási görbéből számoljuk olyan hígításként, amelynél 0,1 abszorbancia értéket kaphatunk.

** A fúziós vizsgálati számok az 1:10 szérum-hígításnál képződött óriássejtek számát képviselik. A hozzáadott kontroll szérumok 50, 65 óriás sejttel bírnak; ND = nem végeztük el.

A semlegesítési aktivitást úgy hajtjuk végre, amint ezt az Anyagok és Módszerek fejezetben leírtuk; ez a felülúszóban jelenlevő p24 mennyisége ng/ml-ben.

··· · • · * ·

4. TÁBLÁZAT

Env-kódolt peptidek szekvenciája különböző HIV-1 és HIV-2 izolátumoknál, amely szekvenciák a HIV-1 IIIB 1-69 peptiddel homológ területnek felelnek meg.

Izolátum

BH10	I--l-69pcptid---I @trpnnntrksiriqr^pg)rafviigkignm.rqah©
HXB2	----------R--------------------.-----
BH8	----------K--------------------.-----
H3B3	----------K--------------------.-----

PV22

BRU

MAL	----g----r_. .-HF---Q-LY-T-IV-DI.-R-Y-
ÉLI	A--YQ---..Q-TPI-L-QSLY-TRSRSIIIG----
5F2	-----------. ,-YI------H-T-R-IGDI-K---
NMJ2	----T--V-R-LS-. .------R-RE.-IGII-----
RF	-----------.,-TK----VIYAT-Q-IGDI-K---
Z6	----YK---Q-..TPI-L-Q-LY-TRGRTKIIG----
Z3	----GSDKKI-QS-RI---KV-YAK-G-T...G----
NY5	--------K-G-A-..---GRTLYAREKIGDI-----
CDC4	------H----VTL. .----VWY-T-E-LGNI-----
HIV-2	-K--G-KIVKQ-MLMS-HVFHSHYQPINKRP.---W-

ROD

MN	-----Y-K--R-H-. .------Y-TKN-IGTI-----
SC	--------TR--H-. .------YAT-DI--DI-----

*··· ·« *«·· · • * · · >

• ··«··· • · · r ·♦·» ·· ·«·*··· · »· ··

Jegyzetek a 4. táblázathoz:

A HÍV env aminosavszekvenciákat az alábbi irodalmi helyről szerezzük be: Humán Retrovírusos

National Laboratory, Los Alamos, and AIDS, Los Alamos

NM (1987); ez a jelen bejelentésbe referenciaként épül be.

A HÍV env-kódolt aminosavszekvenciák homológia alapján vannak felsorakoztatva standard számítógépes programot alkalmazva, amely pl. az IntelliGenetics, Inc.-nél (Mountain View, Kalifornia) vagy a Gene'tics Computer Group-nál (University of Wisconsin, Biotechnology Center, Madison, Wisconsin) áll rendelkezésre.

A szaggatott (-) vonal azt jelzi, hogy az aminosav ennél a helynél azonos a megfelelő aminosavval, vagyis az aminosav azonos azzal, amelyet a BH1O szekvenciában felsorakoztattunk. A pont (.) azt jelzi, hogy itt kiesés van, így aminosav nincs jelen ennél a helynél. Az aminosavkieséseket azért vezetjük be, hogy lehetővé tegyük a szekvencia kiegyenlítődését.

A HIV-1 IIIB-eredetű env-kódolt 1-69 peptid szekvenciája a 308-322 számú aminosav szekvencia La Humán Retrovírusos and AIDS, Los Alamos Laboratory (1987) számozási rendszere szerint], A HÍV IIIB 1-69 pepiidnek megfelelő területről (BH10, HXB2, BH8, HXB3, PV22) más izolátumokban úgy találjuk, hogy 15-25 aminosavból álló területen belül van mintegy félúton elhelyezve két nagy mértékben megőrzött Cys gyök között (bekeretezve), amelyek a 296 és 331 aminosavszámnak felelnek meg a HIV-1 IIIB izolátumban. A

- 37 Gly-Pro-Gly szekvenciát (bekeretezve) megtaláljuk legtöbb olyan env-kódolt területben, amely különböző HÍV izolátumokból származó 1-69 pepiidnek felel meg. A HIV-l IIIB 1-69 peptidnek megfelelő env-kódolt terület egy HÍV izolátumban magában foglalja a felsorakoztatott aminosavhelyek közül a HIV-l IIIB mintegy 304-326 számú aminosavait, a fentebb leírt számítógépes program számozását alkalmazva.

5. TÁBLÁZAT

Az 1-69 peptid által kiváltott fúzió-blokkoló antitestek szintje.

Idő (hónap) az	Szérumellenes ti-	Fúzió-blokkoló
	immunizálás	tér	az 1-69 pép-	aktivitás szérum
	rajtjától szá-	tid	ELISA-ban	ellenes titere
Állat	mi tva

GP69A	0	< 20	< 10
	1	< 20	< 10
	2	470	< 10
	3	4240	< 10
	4	2080	< 10
	5	3250	< 10
	6	5000	10
	7	3200	20
	8	5430	20
	9	9370	20

···· ··	····	•	*·
• 9 «	a	•	• 9
• ·	··«	• ·	··
• · ·	9	···♦
·· ····	···	•	*·

Állat	Idő (hónap) az immunizálás rajtjától számítva	Szérumellenes titer az 1-69 peptid ELISA-ban	Fúzió-blokkoló aktivitás szérum ellenes titere
GP69B	0	< 20	< 10
	1	< 20	< 10
	2	280	< 10
	3	840	< 10
	4	730	< 10
	5	1490	10
	6	970	20
	7	910	20
	8	1650	20
	9	950	20
		3. példa

Anyagok és módszerek.

Peptidek és peptid konjugátumok

Az 1-69 peptidet, amelynek aminosavszekvenciája RIQRGPGRAFVTIGK, a Peninsula Laboratories-től szerezzük be (Belmont, Kalifornia 94002) 74¾ tisztaságú anyagként. Ezt tyúktojás fehérje ovalbuminhoz konjugáljuk glutáraldehid segítségével EReichlin M.: Methods in Enzymol. 70 , 159-165 (1980)]. Ezt a peptid-konjugátumot rövidített nevén óval···· ·· ···· · ·· • · · · · · _t · · ··· » · , • · · · ···· ·* *··· ··· · »· glut-69-nek nevezzük. (Ebben a példában a további peptidprotein konjugátumokat is hasonló módon nevezzük el). Az 169 peptidet szarvasmarha tiroglobulinhoz (BTG) is kötjük, a vízoldható karbodiimidet, az l-etil-3-(3-dimetil-aminopropiD-karbodiimidet (ECDI) alkalmazva CGoodfriend és munkatársai: Science 144, 1344-1346 (1964)]. Az összekapcsolás után a konjugátumokat foszfáttal pufferolt fiziológiás konyhasóoldattal (PBS) szemben dializáljuk, hogy eltávolítsunk minden szabad peptidet és a kapcsoló reagensek fölöslegét.

Az 1-69 peptiden kívül egy HIV-1 burkolat-eredetű szintetikus peptidet (amelyet 5. pepiidnek nevezünk), amely MRDNWRSELYKY szekvenciával bír, és amely a 475-486 aminosavszámoknak felel meg, is alkalmazunk kontroll pepiidként. Az 5. peptid elleni antitestet, amely szintén reagál a HIV-1 gpl20-szal, már korábban leírták CDurda és munkatársai: AIDS Research and Humán Retrovíruses £, 331-342 (1988)].

Immunizálás és antitest-termelés

Balb/cXC57 Bl/6 FI egereket (8 hetesek; 5020-5029 számú állatok) immunizálunk azzal a munkamenettel, amelyet French és munkatársai írnak le Clmmunology Today, 7_, 344-346 (1986)]. Röviden ismertetve egyszeri intraperitoneális inokulálással 100 y-Cg oval-glut-69 konjugátumot adunk be Freund-féle komplett adjuvánssal. Négy héttel később az egerekből vérmintát veszünk, és értékeljük a peptid-fajlagos ···· ·· ···· · • · · · e

antitest válaszokat. Az állatokat addig pihentetjük, amíg Ab titereikben csökkenés figyelhető meg, ennél a pontnál emlékeztető oltást adunk, amely 100 ^g oval-glut-69 konjugátum inkomplett Freund-féle adjuvánsban. Hasonló módon immunizáljuk az 5040-5049 számú állatokat BTG-ECDI-69-cel, és ugyanezzel emlékeztető oltást is adunk. Négy nappal a konjugátum emlékeztető dózisának beadása után az állatokat megöljük és splenocitáikat fuzionáljuk SP 2/0-Ag 14 mielóma sejtekkel (ATCC CRL 1581) tipikus hibridóma fúziós munkamenetben EGalfre és munkatársai: Natúré 277, 131-133 (1979)3. A további megfelelő fúziós partnerek között találjuk a P3/NSl/l-Ag 4-1-et (ATCC TIB 18); a P3X63Ag8U.let (ATCC CRL 1597); és a P3X63Ag8.653-at (ATCC CRL 1580).

A szóban forgó hibridek kiválasztása után - amelyet szilárd fázisú ELISA-val és Western foltképzéssel végzünk - a hibridómákat kétszer klónozzuk korlátozott hígítással (1 sejt 3 üregenként). Tömeges antitest termelést hozunk létre aszciteszként Balb/c X C57B1/6 FI egerekben. Az aszcitesz folyadékot ammóniurn-szulfátos kicsapással és A fehérje affinitáskromatográfiával tisztítjuk EEy és munkatársai Immunochemistry 15 , 429-436 (1978)3. Az immunglobulinokat IgGl típusúnak azonosítjuk, az MAb 5025,29.1.1.1 és

5023,24.5 kivételével, amelyek IgG2b típusúak.

Szilárd fázisú enzimmel kapcsolt immunszorbens vizsgálat (ELISA)

Fehérje-peptid konjugátumokat (100 ng/üreg), pl. olyanokat, ···· ·· ···· . ,» • · · · · · · • · *·· ♦ · ·· • · · · «··· • t> ···· ··« « φ₉ mint amelyeket fentebb leírtunk (pl. BTG-ECDI-69) abszorbeálunk Immulon II mikrotitráló lemezekre (Dynatech Laboratories, Inc, Chantilly, Virginia 22021) 0,1 mólos NaCO-j pufferban (pH 9,6) 4 °C hőmérsékleten 18 órán át CVoller és munkatársai: Manual of Clin. Immun. 69, 506-510 (1976)3. A lemezeket azután 0,05% Tween 20-at tartalmazó PBS-sel (foszfáttal pufferolt fiziológiás konyhasóoldat) mossuk. A hibridómákat azután átvizsgáljuk a peptidkonjugátum lemezhez kötődő antitestek termelésére olyan módon, ahogyan ezt Durda és munkatársai leírták CAIDS Research and Humán Retrovíruses £, 331-342 (1988)1; ennek az irodalmi helynek a kitanítása referenciaként épül be a jelen bejelentésbe.

Elektroforézis és Western immunfoltképzés

A HTLV-IIIB-t (1%-os TritonX-100-ban levő lizátumként) az E.I.du Pont de Nemours-tól (Wilmington, Delaware) szerezzük be BOO^g/ml fehérje koncentrációban. A lizátumot szétzúzzuk 5% 2-merkapto-etanolt tartalmazó mintapufferral 100 °C hőmérsékleten 5 percen át ELaemmli: Natúré 277, 680-685 (1970) és elektroforézisnek vetjük alá 5-15%-os akrilamid gradiens gélen (10 cmxl2 cmx0,15 cm). ¹^5^__νθ^ jelzett fehérje molekulatömeg markereket (Du Pont/NEN Research Products) is alkalmazunk a mintában. A vírusfehérjéket elektromos úton foltokként átvisszük nitrocellulózra (elektro-transzblot) és Western foltképzést végzünk lényegében olyan módon, ahogyan ezt Tsang és munkatársai leírták EMeth. in Enzymol. 92, 377-391 (1983)1. Az immunfolt···· ·· ···? · • · · β · · • · ··· · ·

·. · · · ···· *· ·«·· ··· · ·· ·· képzéshez hígító pufferként 5¾ nem zsíros tejport alkalmazunk PBS-ben, amely 4¾ normál kecske szérumot is tartalmaz.

A Western foltképző aktivitás gátlása

A korábban leírt 1-69 és 5. peptideket Western foltképző hígítóval hígítjuk 10 j<g/ml -re, mint a tisztított MAb-knél. Az antitesteket és peptideket 1:1 arányban egyesítjük és 1 órán át hagyjuk inkubálódni 22 °C hőmérsékleten. Ezeket azután Western foltképzéssel átvizsgáljuk a fentebb leírtak szerint.

Immunfluoreszcenciás mérés

HTLV-IIIB-vel fertőzött és nem fertőzött H9 sejteket, amelyeket a Massachussetts Generál Hospital Infections Disease Laboratory-ból Roy Byington szolgáltatott, rehidrálunk PBS-ben; amely 1% szarvasmarha szérum albumint is tartalmaz (PBS BSA), 22 °C hőmérsékleten 1 órán át. A lemezeket azután a primer antitesttel inkubáljuk (amely lehet hígított aszcitesz vagy hibridóma felülűszó) 2 órán át 22 °C hőmérsékleten. Erőteljes mosás után fluoreszceinezett GAM F(ab')2^_t (Du Pont/NEN Research Products) alkalmazunk az egér antitestek jelenlétének kimutatására. Szobahőmérsékleten 1 óra után a fluoreszceinezett Ab-t eltávolítjuk. A sejteket azután mossuk és 50¾ glicerin: PBSben (tériogat/térfogat) felvesszük. A lemezeket fluoreszcens mikroszkóppal megvizsgáljuk.

- 43 Semlegesítési vizsgálat

Az antitestnek azt a képességét, hogy semlegesíti a HIV-1 fertőzőképességet in vitro, lényegében a Ho D. és munkatársai által leírt munkamenet szerint mérjük EJ. Virol. 61, 2024-2028 (1987)3; ennek az irodalmi helynek a kitanítását referenciaként építjük be a jelen bejelentésbe. Hibridóma sejt felülúszót (35/<g/ml IgGl) előhígítunk RPMI1640’ tápközegben, amely 20% borjúemberió szérumot is tartalmaz (kétszeres sorozathígítás). 100 /4JL hígított antitestet adunk azonos térfogatú tisztított vírushoz, amely 50 TCID-50 egységgel egyenértékű, 1 órán át inkubáljuk 37 °C hőmérsékleten, és hozzáadjuk 1,5-2,0.10^ H9 sejthez. A tenyészeteket 7 napon át inkubáljuk 37 °C hőmérsékleten, újra tápláljuk, és további 7 napon át inkubáljuk. Ekkor a lombikokat megvizsgáljuk citopatikus hatásokra syncytiumok képződésével, és a tenyészetben jelen levő p24 HÍV gag antigén mennyiségét összehasonlítjuk a kontroll tenyészettel. A p24 mennyiségben > 90%-os csökkenés szükséges egy antitestnél, hogy pozitívnak tekintsük a semlegesítő aktivitás szempontjából.

A sejtfúzió gátlása

A sejtfúziós vizsgálatot Matthews T. és munkatársai írták le CProc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 5424-5428 (1987)3; ennek az irodalmi helynek a kitanítása referenciaként épül be a jelen bejelentésbe. Röviden ismertetve, 4000 fertőzött sejtet • · ··· ·♦ ·.

• ·· ····· ·· ....... . «·

- 4.4 (HIV-1 IIIB CEM sejtekben és HIV-1 HAT3 H9 sejtekben) 30/(1ben helyezünk el mikrotitráló üregekben. 30 /ti hígított antitestet (amint fentebb leírtuk) adunk hozzá. 30 perc múlva 37 °C hőmérsékleten 30 JA.1 folyadékot, amely 56000 SupT-1 sejtet tartalmaz RPMI tápközegben, adunk az üregekhez. A lemezeket egy éjszakán át inkubáljuk 37 °C hőmérsékleten és értékeljük syncytium képződésre (sejtfúzió) másnap reggel. Az antitest nélküli üregek 50 és 70 közti syncytiummal bírnak üregenként.

EREDMÉNYEK

A monoklonális antitestek finom fajlapossága

Az 1-69 peptid (HIV-1 IIIB 308-322 burkolati aminosavak) elleni antitesteket vizsgáljuk az immunizáló peptidre, az 169-re való immunreaktivitásra, valamint a 298-332 terület aminosavaiból való más peptidekre és a 308-322 területen belül levő különböző kisebb peptidekre való immunreaktivitásra. Az alkalmazott peptidek szekvenciáit és relatív elhelyezkedésüket a 6. táblázatban mutatjuk be. Amint a 2. ábrából látható, a monoklonális antitestek fajlagosak az immunizáló peptidre. A 2. ábrában megjegyzendő, hogy a bemutatott monoklonális antitestek egyike sem - az .' 5023,24.5 kivételével - reagál az 5. peptiddel, amely a 475-486 HIV-1 burkolati aminosavakat képviselő kontroll peptid, és nem reagálnak jelentősen az 168 és 1-70 peptidekkel sem, amelyek átfedik az 1-69 peptidet az amino- illetve karboxil végeken. A reaktivitás változó • · · · · ·· ···· ···

- 45 mértékét figyeljük meg az 1-177 és 1-178 peptidekkel, amelyek a 308-322 env aminosavak kisebb részét fedik, mint az 1-69 peptid. A kísérletben alkalmazott szilárd fázisú ELISA eljárás ELI5A mikrotitráló lemezekre burkolt szabad peptideket alkalmaz. A 2. ábrában és 7. táblázatban levő monoklonális antitestekre rövidített klón-jelölésekkel utalunk. A csonkítatlan klón-számok az alábbiak: 5021,22.2=5021,22.2.1.1; 5023,24.4=5023,24.4.1.1;

5025,29.1 = 5025,29.1.1.1; 5025,29.2 = 5025,29.2.1.1; és 5042,43.3=5042,43.3.2.1. Ez utóbbit alkalmaztuk az ATCC-nél való deponáláshoz.

A monoklonális antitestek fajlagosságát megvizsgáljuk oldatfázisú gátlással is. Ezekben a kísérletekben a monoklonális antitesteket szabad peptiddel előinkubáljuk, mielőtt ELISA vizsgálatban titrálnánk 1-69 peptiddel burkolt lemezekkel. Ezeknek a kísérleteknek az eredményeit a 7. táblázatban mutatjuk be.

6. TÁBLÁZAT

Peptid száma Szekvencia

1-68 RPNNNTRKSIRIQRG

1-69 RIQRGPGRAFVTIGK

1-70 VTIGKIGNMRQAHCNI

1-177 GPGRAFVTIG

1-17Θ QRGPGRAFV

MRDNWRSELYKY (nem része a peptidek fenti készletének)

7. TÁBLÁZAT

HIV-1 izolátum

A peptid elnevezése és szekvenciája

1-68	RPNNNTRKSIRIQRG	BH10
1-69	RIQRGPGRAFVTIGK	BH10
1-70	VTIGKIGNMRQAHCNI	BH10
1-169	TKGPGRVIYATGQIIG	RF
1-170	HIGPGRAFYTTKNIIG	MN
1-171	KRKRIHIGPGRAFYTT	MN
1-175	RIQRGPGRA	BH10
1-176	AFVTIGK	BH10
1-177	GPGRAFVTIG	BH10
1-178	QRGPGRAFV	BH10

• · · ·

		A gátláshoz	használt	peptidek
MAb	1-68	1-69 1-70 1	-169 1-170	1-171 1-175 1-177 1-178
4407.2	++	ND	ND ND	ND - ND ND
5021,22.2	-	++	- +/-	+/- ++ - ND
5023,24.4	-	+++	+/- +	- ++ +
5025’,29.1	-	++	+ +	+/- - ++ +
5025,29.2	-	+++	+/- ++	+ ++ - ++
5042,43.3	-	++	-	++ - ND

A plusz (+) jelek a gátlás szintjét jelzik: +/- jelzi a >20% gátlást 1 mg/ml szabad, oldható peptidnél, + jelzi a >90% gátlást 100 74g/ml-nél, ++ >90% 10 /tg/ml-nél, és +++ >90%

1/ig/ml-nél.

Az antitest koncentráció változó, de a 100 ng/ml nagyságrendben van.

Az antitestet különböző koncentrációjú peptiddel keverjük elő PBS:BSA-ban (1:1). 1 óra múlva 23 °C hőmérsékleten 100 keveréket adunk Immulon II lemezhez, amely vagy 1-68-cal, vagy 1-69-cel van burkolva 25 ng/50ytl/üreg koncentrációban, ahol a lemez előzőleg PBS:BSA-val van blokkolva. Az inkubálást a monoklonális antitesttel a lemezen 60 percen át végezzük 23 °C hőmérsékleten.

Egyik monoklonális antitest sem reaktív 1-176-tal és 1-70nel. A 4407.2 monoklonális antitest az 1-68-hoz készült.

Abból a célból, hogy meghatározzuk a monoklonális antitestek reaktivitását víruskomponensekkel, Western-folt elemzést hajtunk végre különböző körülmények között. Vírus lizátumokat (200 g fehérje gélenként) zúzunk szét 2merkapto etanol jelenlétében vagy távollétében és SDS-PAGEval elkülönítjük. A 2. ábrában bemutatott monoklonális antitestek Western-folt reaktivitásait redukált víruskomponensekkel és fertőzött H9 sejtek, határozzuk meg, amint idézett munka)

5020.1; 5023,24.5;

találjuk, hogy redukáló figyelünk meg antitesteket ál-vírus lizátum komponenseivel (nem amelyeket ezt Durda leírták. Az összes

5042,43.1;

reagál és az úgy víruskomponensével között. Nem vírusként dolgozunk fel), és munkatársai (fentebb monoklonális és 5042,43.2 a HIV-1 nem redukáló reaktivitást, monoklonális származó fehérjekomponenssel fajlagossági ellenőrzése érdekében antitestről kivételével 120 kD-s körülmények amikor a egy ál-vírus-készítményből vizsgáljuk. Az antitest egy IgGl monoklonális antitestet, a 2085.1-et, amely nem ismer fel semmilyen víruskomponenst, alkalmazunk. Ez a kontroll monoklonális antitest nem hajlandó reagálni semmiféle HIV-1 víruskomponenssel.

Annak igazolására, hogy az antitestek közül legerősebb, kialakított Western folt ezek közül a monoklonális az MAb 5023,24.4.1.1 által jel az RIQRGPGRAFVTIGK aminosavszekvenciának tulajdonítható, a monoklonális antitestet megvizsgáljuk az 1-69 jelenlétében vagy távollétében. A foltképző szignál gátlását látjuk a rokon 1 peptiddel, de az 5. kontroll peptiddel nem.

A * rögzített sejtekkel lemezeken végzett immunfluoreszcenciában az MAb 5023,24.4.1.1, valamint az MAb 5021,22.2.1.1; 5025,29.1.1.1 és 5042,43.3.2.1 pozitív reaktivitást mutat a HIV-1 IIIB izolátumával fertőzött H9 sejteken. A monoklonális antitesteket azután HIV-1 IIIB-vel fertőzött CEM/NKR sejteken vizsgáljuk, fluoreszcenciával aktivált sejtosztályozót alkalmazva. Az MAb 5023,24.4.1.1 reagál a HIV-1 IIIB-vel fertőzött sejtek 47%-ával; a HIV-1 MN izolátummal fertőzött sejtek csupán 5%-a tűnik festettnek 5023,24.4.1.1-gyel. Reaktivitás nem figyelhető meg a HIV-1 RF izolátummal fertőzött sejtekkel vagy nem fertőzött CEM/NKR sejtekkel. Az MAb 5052,29.1.1.1 hasonló reaktivitás!

viselkedést mutat, festettsége kisebb nagyobb (16¾). Az (mielóma fehérjék) de a HIV-1 IIIB-vel fertőzött sejtek (27¾) és a HIV-1 MN sejtek festettsége ide illő kontroll osztály antitestek viszont nem mutatnak jelentős kötődést sem a fertőzött, sem a nem fertőzött élő sejtekhez. Ez azt sugallja, hogy lehet bizonyos mértékű kereszt-reaktivitás a IIIB-től eltérő HÍV törzsekkel, de nincs jelentős reaktivitás nem fertőzött sejtekkel.

• · · · · • ·

- 50 Vírus semlegesítés

Amikor semlegesítő aktivitásra vizsgálunk és összehasonlítjuk más monoklonális antitestekkel és antiszérumokkal, a 8. táblázatban bemutatott eredményeket kapjuk.

Az MAb 5023,24.1.1.1 mutatja a legerősebb HIV-1 semlegesítő aktivitást, amely ebben az adott vizsgálati módszerben éppen olyan erős, mint amelyet a legtöbb humán semlegesítő szérumnál látunk. Az MAb 5021,22.2.1.1 szintén mutat HIV-1 3B semlegesítő aktivitást, amint ez a 8.

táblázatban látható.

8. T Á B

HTLV-3B semlegesítése 1-69 antitestekkel

Antitest

5023.22.4.1.1

5021.22.2.1.1

MOPC 21 (IgGl kontroll) negatív szérum pozitív szérum

LÁZAT peptid elleni monoklonális

Semlegesítő titer

16-32 <8 <4 (3-4+CPE l:4-nél) >4 (0 CPE l:4-nél)

- 51 Meg kell jegyeznünk, hogy a szérumminták jól meghatározott humán szérumok, és hogy a pozitív szérumnak 1/32-1-64 titere van a semlegesítésben, amikor titrálási munkamenetben vizsgáljuk. A CPE a HIV-l replikálódása révén a gazdasejtben indukált citopátiás hatásra utal (azaz a syncytiumok képződésére és sejtpusztulásra). Vizuálisan 3-4+-nak értékeljük a legsúlyosabb sejtkárosodást, amely az aktív HIV-l-nek tulajdonítható.

Sejtfúzió blokkolás

Azokat az adatokat, amelyek a HIV-l fertőzött sejtek SupT-1 célsejtekkel ^amelyeket Bolognesi D.től (Duke University) kapunk! való fúziójának gátlását mutatják be 5021,22.2.1.1; 5023,24.4.1.1; 5025,29.1.1.1; és 5042,43.3.2.1 monoklonális antitestekkel, a 9. táblázatban mutatjuk be. Meg kell jegyeznünk, hogy a SupT-1 a CD4 antigén erős kifejezője, amely a HIV-l receptora T sejteken. A HIV-l IIIB-vel és HIV1 MN-nel fertőzött sejtek elleni aktivitást értékeljük. Megjegyzésre érdemes, hogy az 5025,29.1.1.1 nem csupán az ellen a HIV-l IIIB ellen mutat fúzió-blokkoló aktivitást, amelyből az antigén származik, hanem a HIV-l MN izolátum ellen is. A korábbi beszámolók azt sugallják, hogy az ilyen HIV-gátló antitestek típus- vagy izolátum-fajlagosak.

• ···

9. TÁBLÁZAT

A syncytium-képződés (fúzió) gátlása az 1-69 peptid elleni monoklonális antitestekkel

Syncytium/üreg

Monoklonális	HIV-1	HIV-1
antitest	3B	MN
4407.2	58	61
5021,22.2.1.1	3	54
5023,24.4.1.1	0	40
5025,29.1.1.1	2	14
5042,43.3.2.1	0	56
2085.1 (IgGl kontroll)	69	49
351-56 (2b kontroll)	52	53
Sejtek MAb nélkül	76	64

Mindegyik monoklonális antitest aszcitesz-eredetű és 1/50 hígításban vizsgáljuk ezeket. Megjegyezzük, hogy az MAb 4407.2 az 1-68 peptid ellen készült, az MAb 351-56 anti-Hras

MAb; az MAb 2085	.1 a HIV-1	(3B)	burkolati fehérje	740-75
aminosavai ellen	készült.	Az	MAb	2085.1 nem	mutat
reaktivitást a	burkolattal	vagy	bármilyen	más
víruskomponenssel.	A további	IgGl	és	IgG2b kontrolioktól

várható, hogy hasonló eredményeket adnak.

···· ·· ···· • · • · ·· • ··· • · · · · • · · • * ···· ···

Az a tény, hogy az MAb 5021,22.2.1.1 reagál az 1-178 peptiddel (2. ábra) és blokkolódik az 1-175 peptiddel (7. táblázat), azt jelzi, hogy az 5021.22.2.1.1 által felismert epitóp a QRGPGRA szekvencián belül van, amely közös mind az 1-178, mind az 1-175 peptidekben.

Az a tény, hogy az MAb 5025,29.1.1.1 reagál az 1-177 és 1178 peptidekkel (2. ábra és 7. táblázat) azt jelzi, hogy az

5025.29.1.1.1 által felismert epitóp a GPGRAFV szekvencián belül van, amely közös mindkét pepiidben.

Az a felfedezés, hogy az MAb 5042,43.3.2.1-et az 1-175 peptid blokkolja (7. táblázat), azt jelzi, hogy az MAb

5042.43.3.2.1 által felismert epitóp az RIQRGPGRA szekvencián belül van.

Az a felfedezés, hogy az MAb 5023,24.4.1.1-et az 1-177 peptid blokkolja (7. táblázat), azt jelzi, hogy ez a monoklonális antitest egy, a GPGRAFTIG által képzett epitópot ismer fel.

Az összegyűjtött eredmények azt jelzik, hogy a vírus-gátló aktivitással rendelkező antitestek által felismert kritikus epitóp a GPGRA gyökök révén képződik.

Érdekes módon az MAb 5025,29.1.1.1 gátolja a HIV-1 3B-t, valamint a HIV-1 MN-t is (9. táblázat). így az 5025,29.1.1.1 felismer egy, a GPGRAFV szekvencia által képzett epitópot, amint fentebb tárgyaltuk, de felismeri a HIV-1 MN-ből • · • · ·· ···« ···· · • ·· • ·· ·· ··

- 5.4 származó megfelelő szekvenciát is, amely GPGRAFY (4. táblázat). Ennek az 1-69 peptidben levő szekvenciája alapján várható, hogy az MAb 5025,29.1.1.1 gátolja az SF2 és NM02 HIV-1 törzseket is (4. táblázat).

aminosavas peptidek, amelyek RIQRGPGRA, GPGRAFVTIG, GPGRAFV immunogének lehetnek, magukban es GPGRA amikor foglalják a epitópokat, valamely

Az 5-10 QRGPGRA, hasznos immunológiailag elfogadható hordozóhoz konjugáljuk ezeket, HÍV-gátló antitestek Hasonlóképpen más peptidektől szintén lesznek HIV-gátló emlősökben.

termelésének indukálására HÍV izolátumokból várható, antitestek való hogy hasznos termelésének emlősökben. megfelelő immunogének indukálására

Érdekes és nem várt tény elleni egyedi monoklonális és fúzió-blokkoló aktivitást antitestektől várható, hogy lehet.

a megfigyelés, hogy e 1-69 az antitest erős HIV-1 semlegesítő mutathat. Az ilyen monoklonális jelentős terápiás hasznosításuk

Az 5021,22.2.1.1; 5023,24.4.1.1; 5025,29.1.1.1; 5025,29.2.1.1; és 5042,43.3.2.1 nevű hibridóma sejtvonalakat

1989. március 1-én deponáltuk az American Type Culture Collection-nál (ATCC; Rockville, Maryland) az MPEP 608.01 (p) (C) (1) (2) és (3) és a Budapesti Szerződés előírásaival összhangban. Ezeknek a hibridóma sejtvonalaknak az ATCC deponálási számai az alábbiak: HB10040, HB10043, HB10041, HB10042, és HB10044. A tenyészetek a szabadalmi bejelentés ·· ···· · • · · · • ··· · · • · ···· ♦···»·· * ·· ·· függősége során hozzáférhetők azok számára, akiket az erre felhatalmazott vizsgáló a 37 CFR 1.14 és 35 USC 122 alapján meghatároz. A szabadalom megadásakor minden korlátozás, amely a tenyészet hozzáférhetőségére vonatkozik a nyilvánosság számára, végérvényesen megszűnik.

Amint itt alkalmazzuk, a lényegében .... áll kifejezés azt a szokásos értelmet kívánja jelenteni, hogy bár minden megadott anyag és körülmény fontos a találmány gyakorlati kivitelezése szempontjából, további meg nem nevezett anyagok és körülmények (pl. más terápiás szerek és alkotórészek) sincsenek kizárva mindaddig, amíg ezek nem gátolják a megvalósítandó találmány előnyös kiviteli módjait.

Claims (42)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. A humán immunhiányosság vírus (HÍV) burkolati fehérjéje

   15-36 aminosavának megfelelő, kémiai úton szintetizált peptid azzal jellemezve, hogy a HIV-1 IIIB burkolati fehérjéje 296-331 aminosavszámú aminosavszekvenciájából van és tartalmazza a HIV-1 IIIB 308-322 aminosavszámnak megfelelő aminosavakat.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti peptid azzal jellemezve, hogy a HIV-1 IIIB burkolati fehérje 308-322 aminosavaiból áll.
3. 3. Az 1. igénypont szerinti peptid azzal jellemezve, hogy tartalmazza az RIQRGPGRAFVTIGK aminosavszekvenciát.
4. 4. A 3. igénypont szerinti peptid azzal jellemezve, hogy az RIQRGPGRAFVTIGK aminosavszekvenciával bír.
5. 5. Az 1. igénypont szerinti peptid azzal jellemezve, hogy 15-25 aminosav hosszúságú.
6. 6. A humán immunhiányosság vírus burkolati fehérjéje 15-30 aminosavának megfelelő, kémiai úton szintetizált peptid azzal jellemezve, hogy tartalmazza a KLREQFGNNTIIFK aminosavszekvenciát.
7. 7. A humán immunhiányosság vírus burkolati fehérjéje 15-30 aminosavának megfelelő, kémiai úton szintetizált peptid ·<· • · · • ·»···· · · • · · ···· ·« ti·· ·«» · ·«

   - 57 azzal jellemezve, hogy tartalmazza a CRIKQIINMWQEVGK aminosavszekvenciát.
8. 8. Eljárás HIV-gátló antitestek termelésének indukálására emlősökben azzal jellemezve, hogy az emlősnek immunológiailag megfelelő adagolási rend szerint valamely

   1. igénypont szerinti peptidet adunk be, amely peptid immunológiailag elfogadható hordozóhoz van kötve.
9. 9. Eljárás HIV-gátló antitestek termelésének indukálására emlősökben azzal jellemezve, hogy az emlősnek immunológiailag megfelelő adagolási rend szerint valamely

   2. igénypont szerinti peptidet adunk be, amely peptid immunológiailag elfogadható hordozóhoz van kötve.
10. 10. A 8. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy legalább két különböző peptidet, amelyek mindegyike különböző HÍV izolátumokból származó szekvenciának felel meg, adunk be az emlősnek.
11. 11. A 10. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a peptidek legalább egyike tartalmazza az RIQRGPGRAFVTIGK aminosavszekvenciát.
12. 12. Eljárás HIV-fajlagos antitestek kimutatására HIV-pozitív biológiai mintában azzal jellemezve, hogy a biológiai mintát érintkezésbe hozzuk valamely 1. igénypont szerinti peptiddel és az immunreaktivitást kimutatjuk.

    • · · · · • · · · * • ···«·· • · · · 4··« ·· ··«» Itt φ ···· ·» ··
13. 13. Eljárás HIV-fajlagos antitestek kimutatására HIV-pozitív biológiai mintában azzal jellemezve, hogy a biológiai mintát érintkezésbe hozzuk valamely 2-. igénypont szerinti peptiddel és az immunreaktivitást kimutatjuk.
14. 14. Eljárás HIV-fajlagos antitestek kimutatására HIV-pozitív biológiai mintában azzal jellemezve, hogy a biológiai mintát érintkezésbe hozzuk valamely 6. igénypont szerinti peptiddel és az immunreaktivitást kimutatjuk.
15. 15. Eljárás HIV-fajlagos antitestek kimutatására HIV-pozitív biológiai mintában azzal jellemezve, hogy a biológiai mintát érintkezésbe hozzuk valamely 7. igénypont szerinti peptiddel és az immunreaktivitást kimutatjuk.
16. 16. Eljárás HIV-fajlagos antitestek kimutatására HIV-pozitív biológiai mintában azzal jellemezve, hogy a biológiai mintát érintkezésbe hozzuk legalább két 1. igénypont szerinti peptiddel, amelyek mindegyike különböző HÍV izolátumokból származó szekvenciának felel meg, és az immunreaktivitást kimutatjuk.
17. 17. A 12. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a HIV-fajlagos antitestek HIV-gátló antitestek.
18. 18. HÍV ellen védő vakcina azzal jellemezve, hogy valamely

    1. igénypont szerinti peptid hatásosan védő mennyiségét tartalmazza immunológiailag elfogadható hordozóhoz konjugálva.

    **·'* · · *··*> ·· * * · · · · • * ·τ· · « «· * · · · *·♦· *· ··»*!». t «>
19. 19. HÍV ellen védő vakcina azzal jellemezve, hogy valamely

    2. igénypont szerinti peptid hatásosan védő mennyiségét tartalmazza immunológiailag elfogadható hordozóhoz konjugálva.
20. 20. HÍV ellen védő vakcina azzal jellemezve, hogy legalább két különböző 1. igénypont szerinti peptid hatásosan védő mennyiségét tartalmazza, ahol az egyes peptidek különböző HÍV izolátumból származó szekvenciának felelnek meg, és az egyes ilyen peptidek immunológiailag elfogadható hordozóhoz vannak konjugálva.
21. 21. A humán immunhiány vírus (HÍV) burkolati fehérjéje 15-36 aminosavból álló peptidje elleni HIV-gátló monoklonális antitest azzal jellemezve, hogy a HIV-1 IIIB burkolati fehérjéje 296-331 aminosavszámának megfelelő aminosavszekvenciából van kiválasztva és tartalmazza a HIV-1 IIIB 308-322 aminosavszámnak megfelelő aminosavakat.
22. 22. A 21. igénypont szerinti HIV-gátló monoklonális antitest azzal jellemezve, hogy a peptid tartalmazza a HIV-1 IIIB burkolati fehérjéje 308-322 aminosavait.
23. 23. A 21. igénypont szerinti HIV-gátló monoklonális antitest azzal jellemezve, hogy a peptid tartalmazza az RIQRGPGRAFVTIGK aminosavszekvenciát.
24. 24. A 23. igénypont szerinti HIV-gátló monoklonális antitest ·· ···· φ ··»· • · « β · • ·♦···» * · e ·«»· ·· ···* »·· · • · ·· *· .60 azzal jellemezve, hogy a peptid 15-25 aminosav hosszúságú.
25. 25. A 24. igénypont szerinti monoklonális antitest azzal jellemezve, hogy a peptid az RIQRGPGRAFVTIGK aminosavszekvenciából áll.
26. 26. A 25. igénypont szerinti rágcsáló monoklonális antitest azzal jellemezve, hogy ez MAb 5021,22.2.1.1 (ATCC HB10040) ; 5023,24.4.1.1 (ATCC HB10043); 5025,29.1.1.1 (ATCC HB10041); 5025,29.2.1.1 (ATCC HB10042) vagy

    5042,43.3.2.1 (ATCC HB10044).
27. 27. A 26. igénypont szerinti rágcsáló monoklonális antitest azzal jellemezve, hogy az MAb 5023,24.4.1.1 (ATCC HB10043) klónszámmal van azonosítva.
28. 28. A 26. igénypont szerinti rágcsáló monoklonális antitest azzal jellemezve, hogy az MAb 5025,29.1.1.1 (ATCC HB10041) klónszámmal van azonosítva.
29. 29. Gyógyászati konpozició azzal jellemezve, hogy lényegében egy 21. igénypont szerinti monoklonális antitestből és egy gyógyászatilag elfogadható hordozóból áll.
30. 30. Gyógyászati konpozició azzal jellemezve, hogy lényegében egy 22. igénypont szerinti monoklonális antitestből és egy gyógyászatilag elfogadható hordozóból áll.

    ···· ·· ··«« φ • · · · i » · *·· · · • · ♦ « ·»·· ·· ···· »»» 4

    9 · ♦ « ·· ·♦

    51. Gyógyászati konpozició azzal jellemezve, hogy lényegében egy 23. igénypont szerinti monoklonális antitestből és egy gyógyászatilag elfogadható hordozóból áll.
31. 32. Gyógyászati konpozició azzal jellemezve, hogy lényegében egy 24. igénypont szerinti monoklonális antitestből és egy gyógyászatilag elfogadható hordozóból áll.
32. 33. Gyógyászati konpozició azzal jellemezve, hogy lényegében egy 25. igénypont szerinti monoklonális antitestből és egy gyógyászatilag elfogadható hordozóból áll.
33. 34. Gyógyászati konpozició azzal jellemezve, hogy lényegében egy 26. igénypont szerinti monoklonális antitestből és egy gyógyászatilag elfogadható hordozóból áll.
34. 35. Gyógyászati konpozició azzal jellemezve, hogy lényegében egy 44. igénypont szerinti monoklonális antitestből és egy gyógyászatilag elfogadható hordozóból áll.
35. 36. Gyógyászati konpozició azzal jellemezve, hogy lényegében egy 45. igénypont szerinti monoklonális antitestből és egy gyógyászatilag elfogadható hordozóból áll.

    HIV-1 IIIB burkolati gp!20 fehérje kimutatására tartalmazó biológiai mintában azzal biológiai mintát igénypont szerinti immunreaktivitást

    Eljárás az említett fehérjét jellemezve, érintkezésbe monoklonális hogy hozzuk antitesttel az említett valamely 22.

    és az
36. 37.

    ·♦*· ·· ···· · ·» • · · · 4 * · • · ··· · · ·« • · · · ·4·· ·· ···· ··· 4 »·

    -62.kimutatjuk.
37. 38. Eljárás HIV-1 gátlására emlősökben azzal jellemezve, hogy az emlősnél egy 29. igénypont szerinti gyógyászati kompozíció gyógyászatilag hatásos adagolási rendjét alkalmazzuk.
38. 39. Eljárás HIV-1 gátlására emlősökben azzal jellemezve, hogy az emlősnél egy 30. igénypont szerinti gyógyászati kompozíció gyógyászatilag hatásos adagolási rendjét alkalmazzuk.
39. 40. Eljárás HIV-1 gátlására emlősökben azzal jellemezve, hogy az emlősnél egy 33. igénypont szerinti gyógyászati kompozíció gyógyászatilag hatásos adagolási rendjét alkalmazzuk.
40. 41. Eljárás HIV-1 gátlására emlősökben azzal jellemezve, hogy az emlősnél egy 34. igénypont szerinti gyógyászati kompozíció gyógyászatilag hatásos adagolási rendjét alkalmazzuk.
41. 42. Öt-tíz aminosavból álló, kémiai úton szintetizált peptid azzal jellemezve, hogy ez QRGPGRA, RIQRGPGRA, GPGRAFVTIG, GPRAFV vagy GPGRA szekvenciájú peptid.
42. 43. Eljárás HIV-gátló antitestek termelésének indukálására emlősökben azzal jellemezve, hogy az emlősnek valamely 42. igénypont szerinti peptidet adunk be immunológiailag