JPH03139285A - 酵母によるヒト神経成長因子の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 り束上立札肛九更 本発明はヒト神経成長因子製造のための組み換えＤＮＡ
技術に関する。より具体的には、ヒト神経成長因子をコ
ードするＤＮＡを含む酵母用発現ベクター、該ベクター
で形質転換された酵母及び該酵母を培地に培養するヒト
神経成長因子の製造法に関する。

来の技術及び課題 神経成長因子（ｎｅｒｖｅ　ｇｒｏｔｉｔｈ　ｆａｃｔ
ａｒ、　Ｎ　Ｇ　Ｆ　）はレヴイ　モンタルチ一二（Ｌ
ｅｖｉ−Ｍｏｎｎｔａｌｃｉｎｉ）〔アニュアルニュー
ヨークアカデミーオブサイエンス（Ａｎｎ、Ｎ、Ｙ、Ａ
ｃａｄ、Ｓｃｉ、）５５，３３０（１９５２））および
コーエン（Ｃｏｈｅｎ）ら〔プロシージングスオブザナ
ショナルアカデミーオブサイエンスユ一二ス二一（Ｐｒ
ｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）４０，１
０１４（１９５４）〕によって発見され、末梢神経系の
分化、成長および生存に必須な栄養因子である９最近、
ＮＧＦは中枢神経系において、コリン作用性ニューロン
の生存を維持する作用を有することが明らかにされてお
り〔ヘフティー（Ｈｅｆｔｉ）　ｔジャーナルオブニュ
ーロサイエンス（Ｊｏｕｒｎａ　ｏｆ　Ｎｅｕｒｏｓｃ
ｉｅｎｃｅ）６．２１５５（１９８６）　；畠中（Ｈａ
ｔａｎａｋａ）等、ディベロプメントオブブレイン　リ
サーチ　（Ｄｅｖ、Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、）川、８５（
１９８８））、アルツハイマー病と何らかの関連がある
因子として注目されている。また、老齢ラットの脳内に
ＮＧＦを投与すると、記憶障害の改善が認められる（ネ
イチャー（Ｎａｔｕｒｅ）　。

３２９．６５（１９８９））ことから、老人性痴はうの
治療薬としても期待されている。

雄マウス顎下腺より単離されたＮＧＦ　（７５ＮＧＦ）
は、α、β、γの３種のサブユニットからなる複合体（
α２βγ−であり、そのうちのβサブユニットにのみＮ
ＧＦ活性が認められている。

βサブユニット（βＮＧＦ、２．５３　　ＮＧＦ）は１
１８個のアミノ酸からなる同一のポリペプチドの２量体
であり、そのアミノ酸配列はアルゲレッティ（Ａｒｇｅ
ｌｅｔｔｉ）とブラッドショウ（Ｂｒａｄｓｈａｗ）〔
プロシージングスオブザナショナルアカデミーオブサイ
エンスユーエスーエ−（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ
、ｓｃｉ、ＵｓＡ）　、６８．２４１７（１９７１））
によって決定されている。

スコツト（Ｓｃｏｔｔ）らはマウスβＮＧＦのアミノ酸
配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプローブ
として用いて、マウス顎下腺ｃＤＮＡライブラリーから
、マウスβＮ　Ｇ　Ｆのクローニングに成功した〔ネイ
チャ（Ｎａｔｕｒｅ）　、３０２，５３８（１９８３）
〕。さらにアルリッチ（Ｕｌｌｒｉｃｈ）らはマウスβ
ＮＧＦ　　ｃＤＮＡをプローブとして用いて、ヒトゲノ
ムＤＮＡのライブラリーからＮＧＦ遺伝子をクローニン
グし、その塩基配列から推定したヒトＮＧＦのアミノ酸
配列がマウスＮＧＦのそれと９０％の相同性を有するこ
とを示した〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）　、　３０３
．８２１（１９８３））。

上記のヒトＮＧＦ遺伝子のクローニング、ヒトの脳にお
けるＮＧＦ　ｍＲＮＡの検出〔ゲーデルト（Ｇａｅｄｅ
ｒｔ）ら、モレキュラープレイン　リサーチ（Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ　Ｂｒａｉｎ　Ｒｅ５ａｒｃｈ）、１．８５
（１９８６））、抗マウスＮ　Ｇ　Ｆ抗体を用いたヒト
胎盤及び精液中のＮＧＦの検出〔ハインリッヒ　および
マイヤー（Ｈｅｉｎｒｉｃｈ　＆　Ｍｅｙａｒ）、バイ
オケミカルアンドバイオフィジカルリサーチコミュニケ
ーション（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅ
ｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、１５５．４８２（１９８８））な
どによってヒトＮＧＦの存在が間接的に証明されている
が、ヒトＮＧＦが単離され、その蛋白化学的性質が詳細
に調べられた報告はない。ガルトシュタイン（Ｇａｌｄ
ａｔｅｉｎ　）らはヒト胎盤から、ＮＧＦを単離し、そ
の分子量１等電点、生物活性がマウスβＮＧＦのそれら
と類似していることを報告しているが〔ニューロケミカ
ルリサーチ（Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａ
ｒｃｈ）（３）１７５（１９７８））、その結果には再
現性が認められていない。

このように単離、精製が困難なヒトＮ’　Ｇ　Ｆを調製
するためには遺伝子組み換え技術を用いることが望まし
いと思われる。現在までに、大腸菌を用いてヒトＮＧＦ
蛋白が生産されたことが報告されている〔イワット（Ｉ
ｗａｔ　）ら、ケミストリーアンド　ファーマシューテ
イ力ルブレチン（Ｃｈｅｍ、Ｐｈａｒｍ、Ｂｕｌｌ、）
３４４７２４（Ｌ９８６）；伊藤ら、日本薬学会昭和６
３年度大会講演要旨集、　ｐ４０６）。しかし、この場
合生産された組み換え型ヒトＮＧＦ蛋白は、マウスＮＧ
Ｆのそれに比べて極めて活性が低い。全容らはα−ファ
クターのプレ（シグナル配列）プロ領域をコードするＤ
ＮＡを用いて酵母でヒトＮＧＦ蛋白を分泌させることを
報告した〔イーストジェネテイックスアンドモレキュラ
ーバイオロジー（Ｙｅａｓｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ａｎ
ｄ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌ。

ｇｙ　Ｎｅｗｓ　ＪＡＰＡＮ、Ｎｏ　２１，１９８ｇ、
ｐ３５）が、その生産性は低く（１０μｇＩＱ程度）、
また分泌された該蛋白のごく一部のみが活性型であると
予想される。

本発明者らも、α−ファクターのプレ・プロ領域をコー
ドするＤ　Ｎ　Ａを用いて酵母でヒトＮＧＦを培地中に
分泌させたところ、清養上清にはＰＣＩ２細胞の神経突
起を伸長させる活性は認められなかった（後述の参考例
１参照）。

課題を　′するための 本発明者らは、ヒトＮＧＦのプロ領域と成熟蛋白をコー
ドするＤＮＡをシグナル配列（シグナルペプチド）をコ
ードするＤＮＡの下流に結合させた酵母用発現ベクター
を構築し、これを用いて酵母を形質転換させたところ、
得られた形質転換体が培地中に活性型のヒトＮＧＦを生
産することを見出し、さらに研究した結果１本発明を完
成した。

すなわち、本発明は （１）ヒトＮＧＦをコードするＤＮＡの５′末端に神経
成長因子のプロ領域、例えばヒトＮＧＦ等のプロ領域を
コードするＤＮＡを有するＤＮＡを含む酵母用発現ベク
ター　（２）上記（１）記載のベクターで形質転換され
た酵母、（３）上記（２）記載の酵母を培養することを
特徴とするヒトＮＧＦの製造法に関するものである。

本発明のヒトＮＧＦをコードするＤＮＡとしては、ヒト
ＮＧＦをコードするＤＮＡであればいずれでもよく１例
えばヒトＮＧＦ遺伝子のもの、または、ヒトＮＧＦのア
ミノ酸配列に基づいて化学合成したＤＮＡが挙げられる
。上記のヒトＮＧＦ遺伝子は例えばネイチャー（Ｎａｔ
ｕｒｅ）、　３０３，８２１（１９８３）に記載されて
いる方法でクローニングすることができる。

上記のようにして得られるヒトＮＧＦをコードするＤＮ
Ａは目的によりそのまま、あるいは制限醒素で切断して
使用することができる。

上記のヒトＮＧＦとしてはＣ末端にアルギニンとアラニ
ンが付加されたものでも良い。

上記で得られるヒトＮＧＦをコードするＤＮＡの５′末
端にヒトＮＧＦのプロ領域をコードするＤＮＡが既に連
結しているＤＮＡ、あるいはヒトＮＧＦをコードするＤ
ＮＡの５′末端にＮＧＦのプロ領域をコードするＤＮＡ
を連結させたＤＮＡを発現に用いる。この場合、上記の
プロ領域の５′末端にシグナル配列をコードするＤＮＡ
を連結させ、得られたシグナル配列−ＮＧＦのプロ領域
−ヒトＮＧＦをコードするＤＮＡを酵母のプロモーター
の下流に挿入することによって、ｒ＃母でのヒトＮＧＦ
の分泌生産が可能になる。シグナル配列としては酵母で
機能するものであれば何でも良く。

具体例としてはヒトＮＧＦ、マウスＮＧＦ、ウシＮＧＦ
、ニワトリＮＧＦ、ラットＮＧＦのシグナル配列、ヒト
リゾチームのシグナル配列、卵白リゾチームのシグナル
配列、卵白リゾチームのシグナル配列の変異体（改良型
シグナル配列）、サツ力ロマイセスセレビシｘ　（Ｓａ
ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のα
−ファクター、フォスターゼ、インベルターゼ、キラー
因子のシグナル配列、アスペルギルスアワモリ（Ａｓｐ
ｅｒｇｉｌｌｕｓ　ａｖａｍｏｒｉ）のグルコアミラー
ゼのシグナル配列などが挙げられる。

これらのシグナル配列をコードするＤＮＡは、動物のゲ
ノムＤＮＡライブラリー、ｃＤＮＡライブラリー、酵母
の染色体ＤＮＡ、糸状菌の染色体ＤＮＡからクローン化
して得ることもできるが。

それらのアミノ酸配列に基づいて化学合成し、でも得る
ことができる。

ＮＧＦのプロ領域としては酵母で機能するものであれば
何でも良く１例えば、ヒトＮＧＦ、マウスＮＧＦ、ウシ
ＮＧＦ、ニワトリＮＧＦ、ラットＮＧＦのプロ領域が挙
げられる。これらのプロ領域をコードするＤＮＡは、動
物のゲノムＤＮＡライブラリー、ｃＤＮＡライブラリー
からクローン化して得ることができるが、それらのアミ
ノ酸配列に基づいて化学合成しても得ることもできる。

なお、上記のＮＧＦのプロ領域としてはアミノ酸配列の
一部が挿入、付加、欠失、置換などによって変異したも
のを用いても良い。

上記のシグナル配列−ＮＧＦのプロ領域−ヒトＮＧＦを
コードするＤＮＡを用いて啓母用のヒトＮＧＦ発現ベク
ターを構築する。

ヒトＮＧＦ発現ベクターの構築に用いるベクターとして
は、酵母で機能するものであれば何でも良く、例えば、
Ｐ　Ｓ　Ｈ１９＝　ｐ　Ｓ　Ｈ１５ｔ　ｐ　Ｓ　Ｈ３２
、およびこれらの誘導体が挙げられる。

発現ベクターに用いるプロモーターとしては、酵母で機
能するものであれば何でも良く９例えば、ＧＬＤプロモ
ーター　α−ファクタープロモータ＋、ＧＡＬＩＯプロ
モーター、ＧＡＬＬプロモーター、ＰＨ０５プロモータ
ー、ＰＧＫプロモーターなどが挙げられる。

ｇトＮＧＦをコードするＤＮＡの下流にターミネータ−
を挿入することによって発現を高めることができる。こ
のターミネータ−としては、例えばＰＧＫターミネータ
−などが挙げられる。

発現ベクターを構築する方法自体は公知であり、例えば
、モレキュラークローニング（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌ
ｏｎｉｎｇ）　ｙアラポラトリーマニュアル、コールド
スプリングハーバ−ラボラトリ−（Ａ　Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ　Ｍａｎｎｕｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈ
ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）　（１９８２）に
記載されている。

このようにして作成したヒトＮＧＦ発現ベクターを用い
て酵母を形質転換する。

酵母としてはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅ　ＡＨ２２Ｒ−、Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ　ＮＡ７４−３Ａ／）乙Ｓ。

ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　Ｔ　Ｂ　３９　ｐ　＋、および
これらの変異株などが挙げられる。

形質転換の方法それ自体は公知であり、例えば、リチウ
ム法〔伊藤ら、「ジャーナル・オブ・バクテリオロジー
（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ、）　Ｊ、　１５３．１６
３（１９８３）〕、プロトプラスト法（ヒンネン（Ｈｉ
ｎｎｅｎ）ら。

プロシーデインゲス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ
−・オブ・ザ・サイエンス・ニーニスニー（Ｐｒｏｃ、
　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）　７５．１
９２７（１９７８）］などが挙げられる。

このようにして得られた形質転換株を、それ自体公知の
方法で培養する。

培地としては、例えばパークホルダー（Ｂｕｒｋｈ。

１ｄｅｒ）最小培地〔「アメリカンジャーナルオブボタ
ニー（Ａｍｅｒ、　Ｊ、　Ｂａｔ、）　、　３０，２０
６（１９４３））あるいはその改変培地〔東江（Ｔｏｈ
−ｅ、　Ａ、）ら、「ジャーナルオブバクテリオロジー
（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）　Ｊ　、１１３，７２
７（１９７３）］などが挙げられる。培養は通常１５℃
〜４０℃、好ましくは２４℃〜３０’Ｃで１０〜１６８
時間、好ましくは４８〜９６時間行なう。振どう培養で
も静地でも良いが必要に応じて通気や撹拌を加える。

本発明のヒトＮＧＦは細胞内または細胞外に生成、蓄積
する。細胞内ヒトＮＧＦを培養物から抽出するに際して
は、培養後公知の方法で細胞を集め、塩酸グアニジンや
尿素などの蛋白変性剤を含む緩衝液やトライトンｘ　−
ｉｏｏなとの界面活性剤を含む緩衝液中に細胞を懸濁さ
せたのち、遠心分離によりヒトＮＧＦを含む上澄液を得
る方法、あるいは超音波処理、サイモリエースなどの酵
素処理や凍結融解法によって細胞を破壊したのち、遠心
分離によりヒトＮＧＦを含む上澄液を得る方法などを適
宜用い得る。

これらの上澄液や細胞外に生成、蓄積したヒトＮＧＦを
分離、精製するには自体公知の分離、精製法を適切に組
み合わせて実施すればよい。これらの公知の分離、精製
法としては、塩析や溶媒沈殿法などの溶解度の差を利用
する法、透析法、退外ろ過払、および５ＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を
利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷
電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフ
ィーなどの特異的親和性を利用する方法。

逆相高速液体りａマドグラフィーなどの疎水性の差を利
用する方法１等電点電気泳動法などの等電点の差を利用
する方法などが挙げられる。

上記のようにして得られるヒトＮＧＦは免疫学的方法ま
たは生物活性に基づく方法で定量する。

前者の例としては、バイオケミカルアンドバイオフィジ
カルリサーチコミュニケーション（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、）、　１５５．
４８２（１９８８）に記載されているエンザイムイムノ
アッセイ（ＥＩＡ）が挙げられる。後者の例としては、
ニワトリ胚を椎後根神経節（ｉｉＢ胞成長因子、日本組
織培養学会側、朝食書店、１９８４年）、ラット副腎髄
質由来ＰＣ１２Ｊａｌ胞〔プレイン　リサーチ（Ｂｒａ
ｉｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）、　１３３．３５０（１９７
７））などにおける神経線維の伸長、ラット中隔野コリ
ン作動性ニューロンにおけるコリンアセチルトランスフ
ェラーゼ活性の誘導などを指標とした生物活性測定法が
挙げられる。

以上のようにして得られるヒトＮＧＦは、脳。

神経系の研究に用いる試薬として有用であり、また老人
性痴はうの治療薬としても期待できる。

ヒトＮＧＦをこれらの研究のために用いるには、たとえ
ばヒトＮＧＦを動物細胞培養用培地ＩＩＩＩＱあたり約
０．１〜１．ＯＯＯｎｇ／ｍΩ、さらに好ましくは約１
〜１１００ｎとなる量を加えることが好ましい。

なお、本発明明細書および図面において、塩基やアミノ
酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−Ｉ　Ｕ　Ｂ
　Ｃｏｎ＋ｍ１ｉｓｓｉｏｎ　ｏｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｃａｌ　Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは
当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例
を次にあげる。

またアミノ酸に関して光学異性体がありうる場合は、特
に明示しなければＬ体を示すものとする。

ＮＡ Ａ ｌａ Ａｒｇ ｓｎ ｓｐ Ｃｙｓ ｉｎ Ｇｌｕ １ｙ Ｈｉｓ １ｅ ｅｕ ｙ　Ｓ 　ｅ　　ｔ Ｐｈｅ Ｐｒ。

デオキシリボ核酸 アデニン シトニジ グアニン チミン ：アラニン ：アルギニン ：アスパラギン ：アスパラギン酸 ニジスティン ：グルタミン ：グルタミン酸 ニゲリシン ：ヒスチジン ：イソロイシン ：ロイシン ：リジン ：メチオニン ：フェニールアラニン ：プロリン Ｓａｒ　　：セリン Ｔｂｒ　　：スレオニン Ｔｒｐ　　：ｈリプトファン Ｔｙｒ　　：チロシン Ｖａｌ　　：バリン 以下に、実施例を挙げて１本発明をさらに具体的に説明
するが、本発明はこれらに限定されることはない。

また、実施例３で用いられたＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ
ｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　Ｎ　Ａ　７４−３　Ａ　（
ｐ″″）、実施例３で製造された形質転換体Ｓａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＮＡ７４−
３Ａｐ−／ｐＧＧＮ２２＆およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＮＡ　７４−３　Ａ　
ｐ”−７ｐ　ＧＧＮ３０１および実施例７で得られたＳ
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　Ｎ
　Ａ　７４−３　Ａ　ｐ″″／　ｐ　Ｇ　Ｇ　Ｎ８１４
は、財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託されており、
またこれらは通商産業省工業技術院微生物工業技術研究
所（ＦＲＩ）にブタペスト条約に基づく寄託として寄託
されている。受託口および受託番号を第１表に示す、な
お、ＦＲＩの寄託番号においてＦＥＲＭ　　Ｐ番号も併
託されているものは、当初国内寄託として寄託され、該
寄託はブタペスト条約に基づく寄託に切換えられたもの
である。

第１表 参考例１ ヒトＮＧＦのＮ末ペプチドの合成は自動ペプチド合成機
４３ＯＡ　（アプライド・バイオシステムズ社製）を用
いた固相合成法にて行なった。プログラムはｒスタンダ
ード」を用いた。基本的な合成過程等は、メリーフィー
ルドアールビー（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、　Ｒ，Ｂ、）
（１９６９）アドバンスオブエンザイモロジ−（Ａｄｖ
、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、）　３２．２２１−２９６の方法
に準じている。レジンにはＢｏｃ−Ｃｙｓ　（ＭｅＢｚ
ｌ　）　　・Ｐ　Ａ　Ｍ　−Ｐ　（０，５ｍｍｏｌ／　
ｇ　）を用い、カルボキシル末端から順次合成した。Ｂ
ｏｃ−アミノ酸としてＢｏａ−Ｖａｌ、Ｂｏａ−３ｅｒ
　　（Ｂｚｌ）＋　Ｂｏｃ−Ｐｈｅ、Ｂｏｃ−Ｇｌｕ　
（ＯＢｚｌ）、Ｂｏｃ−Ｇｌｙ、Ｂｏｃ−Ａｒｇ　（Ｔ
ｏｓ）、Ｂ、ｏｃ−Ｈｉｓ　（Ｔｏｓ）、Ｂｏｃ−ｒｌ
ｅ。

Ｂｏｃ−Ｐｒｏを用いた。アミノ末端Ｓｅｒまで合成し
たのち、ペプチドレジンを合成機から取り出し、乾燥し
た。

ペプチドレジン１ｇに１．５ｍ　Ｑのｐ−クレゾールお
よび０．５ｍ　Ｑの１．２−エタンジオチールを加え、
さらに約８ｍＱの液体フッ化水素を加えて、０°Ｃで２
時間反応させた。反応終了後、デシケータ−中でフッ化
水素を減圧除去し、０．１％の２−メルカプトエタノー
ルを含むジエチルエーテルで、続いてジエチルエーテル
で洗い、大部分の混在試薬を除去した。ペプチドを１０
ｍ　Ｑの３％酢酸で抽出し、ろ過により抽出液中に混入
しているレジンを除いた。ろ液をセファデックス（Ｓｅ
ｐｈａｄｅｘ）　Ｇ　−２５を用いるゲルろ過により精
製した。ゲルろ過条件は、カラムサイズ２，８Ｘ６０ｃ
ｎ；検出波長２３０　ｎ　ｍ　：溶媒３％酢酸；流速４
０ｍ　（１／ｈｒであった。

ペプチドを含むフラクションを集めて凍結乾燥し、得ら
れた粉末標品について逆相高速液体クロマトグラフィー
によりさらに精製した。カラムＹＭＣパック、Ａ　−３
２４０Ｄ　Ｓ　ｔｏｘ　２５０ｍｍ　；　力５ム温度２
５℃；溶呂溶媒Ａ　０．１％−トリフルオロ酢酸水−９
９，９％蒸留水；溶出溶媒ＢＯ０１％−トリフルオロ酢
酸水−９９，９％アセトニトリル；溶出プログラム　０
分（９０％Ａ＋１０％Ｂ）、３０分（６０％Ａ＋４０％
Ｂ）；溶出速度１．６ｍ　１２　／分、検出波長２３０
ｎｍ、本条件下で保持時間２９．１４分に溶出された主
ピーク画分を集めて、バイオラッドＡＧＩＸ８　（Ａｃ
ＯＨ型、１．８Ｘ５ａａ）のカラムに通し、洗液も集め
、アセトニトリルを留去した後、凍結乾燥した。白色粉
数７６１１Ｉｇを得た。薄石クロマトグラフィー：Ｒｆ
＝０．７１（アビセルゲルプレート；展開溶媒；ｎ−ブ
タノール：ＡｃＯＨ：ピリジン：水＝３０：２０：６：
４）。エルマンジーエル（Ｅｌｍａｎ、Ｇ、Ｌ、）　（
１９５９）アーキテクチュアルバイオケミストリーアン
ドバイオフィジクス（Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　
Ｂｉｏｐｈｙｓ、）８２．７０−７７法による遊離のＳ
Ｈ基の定量＝９７％。

アミノ酸分析値　　Ｓｅｔ　３．９９（４）：　Ｇｌｕ
　１．００（１）；Ｐｒｏ　０．９８（１）；　Ｇｌｙ
　１．１９（１）；　１／２Ｃｙｓ　Ｏ，８４（１）；
Ｖａｌ　１．０３（１）；　Ｉｌｇ　１．０１（１）；
　Ｐｈｅ　２．１２（２）；Ｈｉｓ　１．８４（２）、
　Ａｒｇ　Ｏ，９４（１）。回収率　７１．１％。

１／２Ｃｙｓは過ギ酸酸化法により定量した。カッコ内
は理論値を示す。

ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（１３２■）を３ｍＡの
０．１Ｍリン酸緩衝液（ＰＨ７，５）に溶解した。

この溶液に１１．２■のＮ−（γ−マレイミドブチルオ
キシ）サクシンイミド（ＧＭＢＳ）を含有するジメチル
アミド溶液（２００μΩ）をスター５−で撹拌しながら
滴下し、３０℃で３０分間反応を行った。

反応液をＱ、１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，５）−０，１
Ｍ　Ｎ　ａＣＱで溶出液とした５ｅｐｈａｄｅｘＧ−２
５（１，５Ｘ３０ａｎ）で精製し、マレイミド基が導入
されたＢＳＡ（マレイミド化ＢＳＡ）を得た。

上記のマレイミド化ＢＳＡ（２０■）を０．１Ｍリン酸
緩衝液（ｐ１４６．５）−０，１Ｍ　Ｎ　ａ　ＣＱに溶
解した。

一方、実施例１で得られたヒトＮＧＦ　Ｎ末ペプチド（
５■）を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐ）１６．０）−５ｍ
Ｍ　ＥＤＴＡに溶解した１両溶液を混合しく全容量５ｍ
Ｑ以下）、３０℃で６０分間反応を行い、ＰＢＳを加え
てヒトＮＧＦ　　Ｎ末ペプチドとＢＳＡとの複合体を含
む溶液１２ｍ　Ｑを得た。本溶液を１゜５ｒｎＱづつ分
注し、ウサギの免疫に使用した。

ヒトＮＧＦ　Ｎ末ペプチド　　の 上記で得られたヒトＮＧＦＮ末ペプチドとＢＳＡとの複
合体をＦｒｅｕｎｄのｃｏｍｐｌｅｔｅ　ａｄｊｕｖａ
ｎｔとよく混合し、その混合物をウサギの皮下に注射し
た。以後、２週問おきに上記複合体とＦｒｅｕｎｄのｉ
ｎｃｏｍｐｌｅｔｅ　ａｄｊｕｖａｎｔとの混合物を同
じウサギに注射した。

上記のようにして免疫したウサギから採取して得られた
血液を遠心分離し、抗血清を得た。得られた抗血清の抗
体価をヒトＮＧＦ　　Ｎ末ペプチド（前出）とヒト血清
アルブミンとの複合体を抗原とするＥＬＩＳＡで測定し
た結果、高い抗体価が認められた。

上記の抗血清を硫安塩析、ＤＥＡＥセルロースカラムク
ロマトグラフィーによってｍｉし、抗ヒトＮＧＦ　　Ｎ
末ペプチド抗体を得た。

実施例１　ヒトＮＧＦ　　　ベクターの構築（１）（第
２図） ヒト白血球ＤＮＡより作製されたλＥ　Ｍ　Ｂ　Ｌ　３
ゲノムライブラリー〔クロンチック（Ｃ１ｏｎｔｅｃｈ
）社〕を大腸菌Ｎ　Ｍ　５３８に感染させたのち、軟寒
天プレート上に約３Ｘ１０’クローンずつ撒いた。プラ
ークをナイロンメンブラン（アマジャム社、ハイボンド
−Ｎ）上に移した後、０．５Ｎ　ＮａＯＨ−１，５Ｍ　
Ｎ　ａ　Ｃｌ溶液に６分間浸し、ファージＤＮＡを変性
させた後、０．５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ８゜０
）−１，５Ｍ　Ｎ　ａ　Ｃｌ溶液に６分間浸した。本メ
ンプランを２ＸＳＳＣ溶液に浸し、風乾後８０℃、２時
間処理することによりＤＮＡをメンプランに固定した。

一方、既知〔アルリッチ（Ｕｌｌｒｉｃｈ、Ａ、）ら、
ネイチ’ｒ　　（Ｎａｔｕｒｅ）　３０３，８２１（１
９８３））のヒトＮＧＦ遺伝子を参考にしてヒトβＮＧ
ＦをコードするＤＮＡ　（０，３３ｋｂ）を化学合成し
、これをＤＮＡラベリングキットにツポンジーン社）を
用いて３１ｐで標識したものをプローブとした。

ＤＮＡを固定したフィルターを、＃Ａ識プローブを含む
、６ＸＳＳＣ（１ｘＳＳＣ＝０．１５Ｍ　ＮａＣｌ　、
０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム）　、　５　ＸＤｅｎ
ｈａｒｄｔ’ｓ、　０．５％ＳＤＳ、２０μｇ／ｍｕ変
性サケ精子ＤＮＡ溶液中１０ｏ＋Ｉ２中で６５°Ｃ１１
６時間、保温した。

反応後、フィルターを２ＸＳＳＣ，０，１％ＳＤＳ溶液
中で室温で５分ずつ３回、ｌＸ５ＳＣ，０，１％ＳＤＳ
溶液中で、６０℃で６０分洗浄した。洗浄したフィルタ
ーを乾燥させた後、ラジオオートグラムをとり、プロー
ブと反応するクローンを検索した。この方法により得ら
れたクローンλβＬＮ２１１３よりデイヴイス（Ｄａｖ
ｉｓ）らの方法（Ｄａｖｉｓら、「アドバンスト・バク
チリアル・ジェネティクス（Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｂａｃ
ｔｅｒｉａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）Ｊ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐ
ｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　１９
８０）によりファージＤ　Ｎ　Ａを抽出した。

次にλβＬＮ２１１３をＳｍａ　ＩとＡｐａｌで切断し
、ヒトＮＧＦ遺伝子を含むＤＮＡ　（約１　ｋｂ）を切
り呂し、プラスミドｐ　Ｂ　１ｕｅｓｃｒｉｐｔ　Ｕ　
Ｋ　（トーヨーボーより購入）のＳｍａｌ、Ａｐａ１部
位を挿入し、プラスミドｐＮＧＦＰ１０７Ｇを得た。

挿入された部分の塩基配列をシークナーゼ（トーヨーボ
ー）を用いて決定した（第１図）。決定された塩基配列
はネイチ’Ｆ　−（Ｎａｔｕｒｅ）、３０３，８２１（
１９８３）に記載されている配列と、蛋白コード領域で
は完全に一致した。

得られたプラスミドｐＮＧＦ１０７Ｇを制限酵素Ｂｃｌ
ＩおよびＡｐａＩで切断し、ヒトＮＧＦ遺伝子を含むＤ
ＮＡ断片（０，８ｋｂ）を単離した。

この０．８ｋｂ　Ｂ　ｃ　ｌ　Ｉ−Ａｐ　ａ　Ｉ断片と
化学合成アダプター（第２図参照）とを混合し、Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼで連結した後、ＸｈｏＩで切断することに
よって０．８ｋｂ　Ｘｈ　ｏ　Ｉ　　ＤＮＡ断片が得ら
れた。

このＸｈｏＩ　　ＤＮＡ断片とＸｈｏＩで切断したｐＧ
ＬＤ９０６−１　（伊藤等、ＢＢＲＣ里：２６８−２７
４　（１９８６）　：ＥＰ−Ａ−０２３５４３０）とを
Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結した。

この反応液を用いてエシェリヒア　コリ（Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　Ｄ　Ｈ１の形質転換を行い、
アンピシリン耐性の形質転換体から単離したプラスミド
をｐＧＧＮ２２８と命名した（第２図）。

実施例２ ヒトＮＧＦ発現ベクターの構築（２） 実施例１で得られたｐＧＧＮ２２８をＸｈｏＩで切断し
た後、Ｐｓｔｌで部分切断し、ヒトＮＧＦの全シグナル
配列及びプロ領域のＮ末１０アミノ酸（１０個）をコー
ドするＤＮＡを除去した０、７ＫｂのＰｓｔ−Ｘｈｏｌ
　　ＮＧＦ断片を得た。

また、改良型シグナル配列（特開昭６４−１０９８７）
及びヒトＮＧＦのプロ領域のＮ末１０アミノ酸をコード
する合成りＮＡオリゴマー（＃１〜＃６及びｍｎ１ｌ、
ｍｎ１２）をＴ４−リガーゼにより連結し、改良型シグ
ナル配列とＮＧＦのプロ領域のＮ末端１０アミノ酸をコ
ードするＸｈｏｌ−ＰｓｔＩ断片を単離した。

上記の０．７Ｋｂ　　Ｐ　ｓ　ｔ　Ｉ　−Ｘｈ　ｏ　Ｉ
　　ＤＮＡ断片及び改良型シグナル配列をコードするＸ
ｈｏｒ−Ｐｓｔｌ　　ＤＮＡ断片を結合し、０．８Ｋ　
ｂのｘｈｏＩＤＮＡ断片得た。

このＤＮＡ断片をＸｈｏＩで切断したｐＧＬＤ９０６−
１　（前出）と結合することによってヒトＮＧＦ発現ベ
クターｐＧＧＮ３０１を得た（第３図）。

実施例３　＃母の形質転換 プラスミドｐＧＬＤ９０６−１　（前出）、実施例１で
得られたヒトＮＧＦ発現ベクターｐＧＧＮ２２８および
実施例２で得られたヒトＮＧＦ発現ベクターＰＧＧＮ３
０１を用いてＩｔｏらの方法〔ジャーナルオブバクテリ
オロジー（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ）、１５３，１６３
（１９８３））に従ってＳａｃｃｈａｒｏｔｎｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　　ＮＡ？４−３Ａ　　（ρ−）
（Ｉ　ＦＯ１０４３１，ＦＥＲＭ　ＢＰ−１９４８）を
形質転換し、それぞれ形質転換体Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｓ　ｅｅｒｅｖｉｓｉａｅＮＡ７４−３Ａρ−／ｐ
ＧＬＤ９０６−１．Ｓ、　Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　　Ｎ
Ａ７４−３Ａρ−／ｐＧＧＮ２２８（ｒＦｏ　　１０４
７３．ＦＥＲＭ　　ＢＰ−２５３１）およびＳ、　ｅｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅ　ＮＡ　７４−３　Ａ　ｐ−７ｐ　Ｇ
ＧＮ３０１　　（ＩＦＯ１０４７４，ＦＥＲＭ　　ＢＰ
−２５３２）を得た。

実施例４　ヒトＮＧＦ遺伝子の発現（１）実施例３で得
られた形質転換体Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅ
ｖｉｓｉａｅ　Ｎ　Ａ　７４−３　Ａ　ｐ″″／　ｐ　
Ｇ　Ｌ　Ｄ　９０６−１およびＳ　、　ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅ　ＮＡ　７４−３　Ａ　ｐ／ｐＧＧＮ２２８をそ
れぞれ試験管中のＢｕｒｋｈ。

１ｄｅｒ　（アメリカンジャーナルオブボタニー（Ａｍ
ｅｒｉｃａｎ　Ｊｏｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｏｔａｎｙ
）　、３０．２０６（１９４３））の改変培地（１１当
り８９ｇのシヨ糖、Ｌｌｇのグルコース、５．６ｇのア
スパラギン、　０．４４ｇのＫＨ。

ＰＯ，，２ｇのウシアルブミンを含む）５ｍＱに接種し
、３０℃で３日間振どう下で培養した。得られた培養液
０．５ｍ　Ｑを４．５ｍ　Ｑの同じ培地を含む試験管に
移し、３０℃で１日間振とう下で培養した。

この培養液２　ｍ　Ｑを１８ｍ　Ｑの同じ培地を含む２
００ｍＱ容エーレンマイヤー（Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ）
フラスコに移し、°３０℃で３日間振どう下で培養した
。

上記のようにして得られた培養液を遠心分離しその上清
をセントコリン１０　（ブレースジャパン）で１０倍に
濃縮した。

プレインリサーチ（Ｂｒａｉｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）、
　１３３，３５０（１９７７）に記載されている方法に
従って濃縮液のＰＣ１２細胞に対する神経突起伸長（ｎ
ｅｕｒｉｔｅ　ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ　）活性を測定した
。Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　Ｎ　Ａ　７４−３Ａρ
″″／ｐＧＧＮ２２８の培養上清の濃縮液中には、マウ
スＮ　Ｇ　Ｆ　（２，５Ｓ　、Ｃｏ１１ａｂｏｒａｔｉ
ｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）の場合と同様に、神経突起伸
長活性が認められた。一方、　　Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅ　ＮＡ　７４−３Ａρ−／　ｐ　Ｇ　Ｌ　Ｄ　９
０６−１の培養上清の濃縮液中には同活性は認められな
かった。また、　Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａａ　ＮＡ７
４−３Ａρ−／ＰＧＧＮ２２８の培養上清の濃縮液中の
同活性は抗マウスＮＧＦ抗体（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉ
ｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）で阻害された。上記の活性に
基づき、マウスβＮ　Ｇ　Ｆ　（２，５Ｓ　、Ｃｏ１１
ａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）を標準品とし
てＮＧＦを定量したところ、　Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅ　Ｎ　Ａ　７４−３　Ａ　ｐ−／ｐＧＧＮ２２Ｂの
培地中に１．５μｇ／Ｑ　（マウスβＮＯＦとして）の
ヒトＮＧＦが生産されていることが明らかになった。Ｅ
ＩＡ［ベーリンガー社、バイオケミカルアンドバイオフ
ィジカルリサーチコミュニケーション（Ｂｉｏｃｈｅｍ
、Ｂｉｏｐｈｙｓ。

Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、）　、１５５，４８２（１９８
ｇ））でＮＧＦを定量したところ、Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅ　Ｎ　Ａ　７４−３　Ａ　ｐ／　ｐ　Ｇ　Ｇ　
Ｎ　２２８の培地中に１．３μｇ／Ｑ（マウスβＮＧＦ
として）のヒトＮＧＦが生産されていることが明らかに
なった。

実施例５　ヒトＮＧＦ遺伝子の発現（２）実施例３で得
られた形質転換体Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＮＡ７４
−３Ａρ−／　ｐ　Ｇ　Ｌ　Ｄ　９０６−１およびＳ、
　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　Ｎ　Ａ　７４−３　Ａ　ｐ″
″／　ｐ　Ｇ　Ｇ　Ｎ　３０１を実施例４に記載されて
いる培地で２４℃で３日間振どう下で培養し、その培養
液を遠心分離しその上清を得た。Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅ　Ｎ　Ａ　７４−３　Ａρ−／　ｐ　Ｇ　Ｇ　Ｎ
　３０１の培養上清にはＰＣ１２細胞に対する神経突起
伸長活性が認められたが、Ｓ、　ｃｓｒｅｖｉｓｉａｅ
　Ｎ　Ａ　７４−３　Ａ　ｐ″″／ｐＧＬＤ９０６−１
の培養上清には同活性は認められなかった。

ＥＩＡでヒトＮＧＦを定量した結果、Ｓ、　ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅ　ＮＡ７４−３Ａρ−／ｐＧＧＮ３０１の培
地には、１．７μｇ／ＱのヒトＮＧＦが生産されている
ことが明らかになった。

実施例６　ヒトＮＧＦ発現ベクターの構築（３）ヒトリ
ゾチーム発現ベクターｐＧＥＬ１２５（ヨーロッパ特許
出願公開第２５５，２３３号公報に記載の方法で製造さ
れる。）をＨｉｎｄＩ［Ｉで切断し、Ｋｌｅｎｏｗ　Ｆ
ｒａｇｍｅｎｔで平滑化したのち、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
で結合させることによってＨｉ　ｎｄＩ１１部位を持た
ないプラスミドｐＧＥＬ１２５Ｈを得た。次に、ｐ　Ｇ
　Ｅ　Ｌ１２５ＨをＸｈｏｌで切断し、Ｘｈ。

１−ＨｉｎｄＩＩｒアダプター ５’　　ＴＣＧＡＧＧＣＣＡ （、ＣＧＧＴＴＣＧＡ５’ とＴ４ＤＮＡリガーゼで連結させたのち、８．３ｋｂ　
　Ｈｉｎｄ［ＩＩ−ＢａｍＨＩ断片を得た。プラスミド
ｐ６９Ａ　Ｃセル（Ｃｅｌｌ）　、３０，９３３（１９
８２））より。−ファクター遺伝子を含む１．６ｋ　ｂ
　　Ｅ’ｃ　ｏ　ＲＩ断片を単離し、　Ｋｌｅｎｏｗ　
Ｆｒａｇｍｅｎｔで平滑化したのち、Ｂ　ａ　ｍ　ＨＩ
リンカ−５’　ＣＣＧＧＡＴＣＣＧＧとＴ４ＤＮＡリガ
ーゼで連結し、ＢａｍＨＩとＨｉ　ｎｄＩＩＩで処理し
た。得られた０、９ｋ　ｂ　　Ｂ、ａ　ｍＨＩ　−Ｈｉ
　ｎ　ｄ　ＩＩＩ断片（α−ファクター遺伝子のプロモ
ーターとプレ・プロ領域コードするＤＮＡを含む）と上
記の８．３ｋｂ　　ＨｉｎｄｌＩＩ−ＢａｍＨ夏断片と
をＴ４ＤＮＡリガーゼで連結させ、この反応液を用いて
Ｅ、ｃｏｌｉＤＨｌ　　を形質転換した。得られたアン
ピシリン耐性の形質転換体力）ら単離したプラスミドを
ｐ　Ａ　Ｌ　Ｆ　ＡｌＯ３（９，２ｋ　ｂ　）と命名し
た。

プラスミドｐＡＬＦＡ１０３より、α−ファクターのプ
ロモーターおよびプレ・プロ領域コードするＤＮＡを含
む０．９ｋｂ　　ＢａｍＨＩ−Ｈｉｎｄｍ断片を単離し
、これをファージベクターＭ　１３　ｍ　ｐ１８に挿入
した。α−ファクターのプロ領域をコードするＤＮＡの
３′末端（ＨｉｎｄＩＩ［部位）の２４塩基上流に新た
にＨｉｎｄ１１１部位を作る目的で、プロ領域第８１位
のセリンのコドンＴＣＴをＡＧＣに変換した。即ち、上
記０．９ｋ　ｂ　　Ｂ　ａ　ｍＨＩ　−ｆ（ｉｎｄｌｆ
ｆ断片を有するＭ　１３ｍ　ｐ　１８とプライマー５’
　ＴＴＴＡＴＣＣＡＡＧＣＴＴＡＣＣＣＣＴＴＣ３’　
を用いて部位特異的変異（Ａｍｅｒｓｈａｍ　　社のキ
ットを使用）を行い、目的とするクローンを得た。得ら
れたクローンから変異前のものよりも２４ｂｐ短い０．
９ｋｂ　　ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を単離し、
ｐＧＥＬ１２５Ｈ由来の８．３ｋｂ　　ＢａｍＨＩ−Ｈ
ｉｎｄＩｎ断片（前出）と連結させ、プラスミドｐＡＬ
ＦＡ３１０を得た。

Ｕ　１ｌｒｉｃｈら〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）　、
３０３，８２１（１９８３））によって明らかにされた
ヒトＮＧＦ遺伝子に基づいて化学合成されたヒトβＮＧ
Ｆをコードする０、３９ｋｂ　Ｈｉｎｄｍ−ＢａｍＨＩ
　　ＤＮＡ断片（第４図）をｐＵｃ１８関連プラスミド
に挿入して得られたプラスミドｐＮＧＦ１９より、ヒト
βＮＯＦの１１番目のアミノ酸ＧｌｕよりＣ末端側をコ
ードする０、３３ｋｂ　　ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ　　
ＤＮＡ断片を単離した。得られた０、３３ｋ　ｂ　　Ｅ
　ｃ　ｏ　ＲＩ−ＢａｍＨｒ　　ＤＮＡ断片にアダプタ
ーａｎ３およびａｎ４　（第５図−１参照）、さらにＢ
ａｍＨｌ−Ｘｈｏｌリンカ−（第５図−１参照）をＴ４
ＤＮＡリガーゼで連結させ、０．３９ｋ　ｂ　　Ｈｉ　
ｎｄｌｌｌ−ＸｈｏｌＤＮＡ断片を得た。

プラスミドｐＡＬＦＡ３１０をＨｉｎｄＩＩＩ、Ｘｈｏ
ｌで分解して小さいＨｉｎｄｌＩＩ−ＸｈｏｌＤＮＡ断
片を除去し、これと上記で得られた０、３９ｋｂ　　Ｈ
ｉｎｄｌＩＩ−Ｘｈｏｌ　　ＤＮＡ断片とを連結してｐ
ＡＮＧＦ８１１を得た。本プラスミドはα−ファクター
のプロモーターおよびプレ・プロ領域を用いるヒトＮＧ
Ｆ発現ベクター（参考例２参照）（第５図−１）である
。

上記で得られたプラ°スミドｐＡＮＧＦ８１１より、ヒ
トβＮＧＦの９２番目のＭｅｔ以後をコードするＤＮＡ
を含む０．１５ｋｂ　　Ｎｃｏｌ−Ｘｈｏｌ　　ＤＮＡ
断片を単離した。一方、実施例３で得られたプラスミド
ｐＧＧＮ３０Ｌより、卵白リゾチームの改良型シグナル
ペプチドとヒトβＮＧＦの９１番目のＴｈｒまでをコー
ドするＤＮＡを含む０．６５ｋｂＸｈｏｌ−Ｎｃｏｌ　
　ＤＮＡ断片を単離した。上記の両ＤＮＡ断片をＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼで連結し、シグナルペプチドと１１８個の
アミノ酸からなるヒトβＮＯＦをコードする０、８ｋｂ
　　ＸｈｏＩ　　ＤＮＡ断片を得た。得られた０、８ｋ
ｂ　　Ｘｈｏｌ　　ＤＮＡ断片をプラスミドｐ　Ｇ　Ｌ
　Ｄ９０６−１　（前出）のＸｈｏ１部位にＧ’　Ｌ　
Ｄプロモーターに対して正方向に挿入し、ヒトＮＧＦ発
現ベクターｐＧＧＮ８１４を得た（第５図−２）。

実施例７　酵母の形質転換 実施例６で得られたヒトＮＧＦ発現ベクターｐＧＧＮ８
１４を用いてＩｔｏらの方法（＠出）に従ってＳａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　Ｎ　Ａ　
７４−３　Ａ（ρ−）（前出）の形質転換を行ない、形
質転換体Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅ　Ｎ　Ａ　７４−３　Ａ　ｐ／ｐＧＧＮ８１４　
（Ｉ　Ｆ○　１０４８４．ＦＥＲＭ　ＢＰ−２６８９）
を得た。

実施例８　ヒトＮＧＦの生産 実施例７で得られた形質転換体Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　Ｎ　Ａ　７４−３　Ａ　ｐ
　−／　ｐ　Ｇ　Ｇ　Ｎ８１４を試験管中のＢｕｒｋｈ
ｏｌｄｅｒ　（アメリカンジャーナルオブボタニ−（Ａ
ｍｅｒｉｃａｎ　Ｊｏｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｏｔａｎ
ｙ）、３０．２０６（１９４３））の改変培地（１Ω当
り８９ｇのシヨ糖、１１ｇのグルコース、５．６ｇのア
スパラギン。

０．４４　ｇのＫＨ２ＰＯ４，２ｇのウシ血清アルブミ
ンを含む）５ｍＱに接種し、３０°Ｃで３日間振どう下
で培養した。得られた培養液０．５ｍρを４．５ｍΩの
同じ培地を含む試験管に移し、３０℃で１日間振どう下
で培養した。この培養液２ｍ［を１ｇｍ　ｆｌの同じ培
地を含む２００ｍ　Ｑ容エーレンマイヤー（Ｅｒｌｅｎ
ｍｅｙｅｒ）フラスコに移し、２４℃で６日間振どう下
で培養した。

上記のようにして得られた培養液を遠心分離しその上清
を得た。得られた培養上清４０μＱの等量の２倍濃度の
Ｓａｍｐｌｅ　ｂｕｆｆｅｒ　（Ｌａｅｍｍｌｉ、　Ｎ
ａｔｕｒｅ。

２２７、６８０（１９７０）］を加え、１００℃で５分
間加熱したのち、０．１％ＳＤＳを含む１５％ポリアク
リルアミドゲルで電気泳動を行なった。Ｂｕｒｎｅｔｔ
ｅの方法（アナリティカルバイオケミストリー（Ａｎａ
ｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、　１１
２．１９５（１９８１））に従ってゲル上の蛋白をニト
ロセルロース膜に移し、参考例１で得られたヒトＮＧＦ
のアミノ末端１５アミノ酸残基からなる合成ペプチドを
免疫原として得られたウサギ抗ヒトＮＧＦ　Ｎ末ペプチ
ド抗体とアフィニティ精製ＨＲＰ結合ヤギ抗ウサギＩｇ
Ｇ（バイオ・ランド、米国）とを用いた１７ａｓｔｅｒ
ｎブロツテイングを行った結果、１３キロダルトン（ｋ
Ｄａ）のバンドが認められた。一方、　Ｓａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＮＡ７４−３Ａ
　ｐ−／　ｐ　ＧＬＤ９０６−１の培養上清の場合には
同バンドは検出されなかった。

プレインリサーチ（Ｂｒａｉｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）、
　１３３，３５０（１９７７）に記載されている方法に
従って上記の培養上清のＰＣ１２細胞に対する神経突起
伸長（ｎｅｕｒｉｔｅ　ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ　）活性を
測定した。Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＮＡ７４−３Ａ
ρ″″／　ｐ　Ｇ　Ｇ　Ｎ８１４の培養上清中には、マ
ウスＮＧ　Ｆ　（２，５Ｓ　、Ｃｏ１１ａｂｏｒａｔｉ
ｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒａｈ）の場合と同様に、神経突起伸
長活性が認められた。上記の活性に基づき、マウスβＮ
ＧＦ（２゜５Ｓ　、Ｃｏ１１ａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ
５ｅａｒｃｈ）を標準品としてＮＧＦを定量したところ
、Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＮＡ　７４−３Ａρ−
／ｐＧＧＮ８１４の培地中にＩＯμｇ／Ｑ（マウスβＮ
ＧＦとして）のヒトＮＧＦが生産されていることが明ら
かになった。一方、　Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　Ｎ
Ａ７４−３Ａρ−／ｐＧＬＤ９０ｆｉ−１の培養上清に
は同活性は全く検出されなかった。

参考例２　α−ファクターのプロ領域をコードするＤＮ
Ａを用いたヒトＮＧＦ遺伝子の発現α−ファクター遺伝
子を含むプラスミドｐ６９Ａ〔セル（Ｃｅｌｌ）、　３
０．９３３（１９８２））よりα−ファクターのプレ・
プロ領域をコードするＤＮＡを単離した。この３′末端
にヒトＮＧＦをコードする合成りＮＡを連結させたＤＮ
Ａを、α−ファクタープロモーター（ＰＡＮＧＦ８１１
、実施例６参照）あるいはＧＬＤプロモーターの支配下
でＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
　Ｔ　Ｂ　３９ｐ　−（Ｉ　Ｆ　Ｏ１０４６７゜ＦＥＲ
Ｍ　ＢＰ−２３！１１９）または５ａｃｃｈａｒｏ＋ｎ
ｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＮＡ７４−３Ａ　Ｃ
ｐ−）（前出）を宿主として実施例と同様の条件で発現
させた。その結果、５０〜１００μｇ／Ｑ（マウスＮＧ
Ｆとして）のヒトＮＧＦ蛋白が培養上清中に生産されて
いることが、参考例１で得られたウサギ抗ヒトＮＧＦＮ
末ペプチド抗体またはウサギ抗マウスＮＧＦ抗体（Ｃｏ
ｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）とアフィ
ニティ精製ＨＲＰ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（バイオ・ラ
ンド）を用いたＷｅｓｔｅｒｎブロッティングで認めら
れたが、該培養上清にはＰＣＬ２細胞に対する神経突起
伸長活性は検出されなかった。従って、ここで得られた
ヒトＮＧＦ蛋白質は、不活性型であると考えられる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例１で得られたクローン化したヒトＮＧ
Ｆ遺伝子の塩基配列およびこれから翻訳されるアミノ酸
配列を示す。 第２図は、実施例１で得られた、ヒトＮＧＦ発現ベクタ
ーｐＧＧＮ２２ｇの構築図を示す。 第３図は、実施例２で得られた、ヒトＮ　Ｇ　Ｆ発現ヘ
クターＰＧＧＮ３０１の構築図を示す。 第４図は１合成ヒトＮＧＦ遺伝子のヌクレオチド配列で
ある。 第５図−１は、実施例６で得られた、ヒトＮＧＦ発現ベ
クターｐＡＮＧＦ８１１の構築図を示し。 第５図−２は、実施例６で得られた。ヒトＮＧＦ発現ベ
クターｐＧＧＮ８１４の構築図を示す。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒト神経成長因子をコードするＤＮＡの５′末端
   に神経成長因子のプロ領域をコードするＤＮＡを有する
   ＤＮＡを含む酵母用発現ベクター。
2. （２）プロ領域がヒト神経成長因子のものである請求項
   １記載のベクター。
3. （３）請求項１または２記載のベクターで形質転換され
   た酵母。
4. （４）請求項３記載の酵母を培養することを特徴とする
   ヒト神経成長因子の製造法。