SE457352B - Humaninterferon-beslaektad peptid, humaninterferon-antikropp jaemte framstaellning och anvaendning daerav samt maerkt peptid jaemte framstaellning av denna - Google Patents

Description

457 352 10 15 20 25 30 35 2 Pro: Prolin CBzl: Bensyloxigrupp NHS: N-Hydroxisuccinimidgrupp Z: Karbobensoxigrupp Su: Succinimidgrupp Tos: p-Toluensulfonylgrupp Boc: tert-Butoxikarbonylgrupp Ett interferon är ett glykoprotein eller ett protein, med antiviral aktivitet, vilket frigöres av en cell som svar på viral infektion, och man tror att sådana sjukdomar som förorsakas av virala infek- tioner kan förhindras och botas genom administrering av interferon, varför interferon blivit föremål för uppmärksamhet under de senaste åren.

Humaninterferoner som är kända idag klassificeras i tre typer, dvs interferon-a (Leukocytinterferon, Lymfoblastoidinterferon), interferon-B (Fibrob1astinter- feron) och interferon-Y (Immuninterferon). Det har emellertid inte utvecklats någon teknologi för rening av interferon för erhållande av respektive bestånds- delar i form av ett enda glykoprotein eller protein.

Kort förklaring av ritningarna Fig l visar kurvor, vilka anger specificiteten hos humaninterferon-d-antikroppen som erhållits enligt föreliggande uppfinning. Fig 2 visar kalibrèringskurvor i fluorescenspolarisationsimmunoanalyssystem enligt föreliggande uppfinning.

Ett ändamål med föreliggande uppfinning är att tillhandahålla nya antikroppar, vilka kan användas för teknologin avseende rening och separering av human- interferon-a, särskilt lymfoblastoidinterferon.

Ett annat ändamål med föreliggande uppfinning är att tillhandahålla antigener för framställning av nämnda antikroppar. 7 Ett ytterligare ändamål med föreliggande uppfinning är att tillhandahålla ett sätt att erhålla haptener 10 15 20 25 30 35 457 352 3 som är lämpliga för framställning av nämnda antigener.

Ett ytterligare annat ändamål med föreliggande uppfinning är att tillhandahålla ett nytt sätt att analysera humaninterferon-a och -B med användning av nämnda antigener och antikroppar.

Som resultat av omfattande forskning har förelig- gande uppfinnare upptäckt att nya antigener av human- interferon-a kan framställas med användning av en ny C-terminal peptid av humant lymfoblastoidinterferon, varvid nämnda nya C-terminala peptid nyligen synte- tiserades av föreliggande uppfinnare; och nya anti- kroppar med specificiteter för humaninterferon-a kan framställas med användning av nämnda antigener; vidare kan ifrågavarande humaninterferon-d renas genom affi- nitetskromatografi med användning av nämnda nya anti- kroppar; och analys av humaninterferon-a eller -8 kan utföras med användning av nämnda nya antigener och nya antikroppar.

Föreliggande uppfinning fullbordades med de ovan nämnda, nyfunna kunskaperna, varför enligt föreliggande uppfinning nämnda antikroppar med specificiteter för humaninterferon-a, som är användbara för rening och analys av interferonet, fördelaktigt kan framställas i industriell skala, med användning av syntetiska peptider, vilka lätt kan tillverkas i stor skala.

Sålunda etablerar föreliggande uppfinning nya tek- nologier avseende rening och analyssystem av human- interferon-a och -B.

Den nya syntetiska peptiden som erhålles med föreliggande uppfinning är en syntetisk peptid, som valts bland en peptid, vilken representeras av den allmänna formeln 2, R2-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys-Glu-OH (2) [vari R2 är en väteatom, en grupp med formeln H-Thr- 457 352 10 15 zoo 25 30 35 4 -Asn-Leu-Gln-, en grupp med formeln H-Ser-Leu-Ser-Thr- -Asn-Leu-Gln-, eller en grupp med formeln H-Tyr-Ser- -Leu-Ser-Thr-Asn-Leu-Gln-]; varvid den nämnda nya i syntetiska peptiden är en peptid som motsvarar en C-terminal peptid hos humant lymfoblastoidinterferon eller derivat därav [en peptid som representeras av den allmänna formeln (2)].

Var och en av de nämnda syntetiska peptiderna kan lätt framställas med användning av aminosyror som är kommersiellt tillgängliga och genom ett enkelt förfarande. Nämnda syntetiska peptid har den specifika aminosyrauppställningen, så att från en peptid vilken representeras av den allmänna formeln (2) ett antigen med ett tydligt kognitionssäte för identifiering av humaninterferon-a, samt en antikropp med hög selek- tivitet kan framställas i stor skala. Vidare kan en antikropp med hög specificitet för humaninterferon-a stabilare erhållas i stor skala med användning av antigenet som framställts från den ovannämnda syn- tetiska peptiden som en hapten, än med användning av ett naturligt interferon-a eller interferon-B.

Nya syntetiska peptider enligt föreliggande upp- finning kan framställas genom ett sätt som vanligen användes vid syntetisering av en peptid, närmare be- stämt t ex ett sätt som beskrivits i "The Pehtides", Vol. 1, (1966) av Schröder och Lübke, Academic Press, New York, USA, eller i “PEPTIDE GOSEI" (Synthesis of peptid), av Izumiya et al., Maruzen and Co., Ltd. (1975). Sådana sätt exemplifieras som azidmetod, klorid- metod, syraanhydrídmetod, blandad anhydridmetod, dicyklo- hexylkarbodiimid (DCC) metod, aktiv estermetod (p-nit- rofenylestermetod, N-hydroxisuccinimidestermetod, cyanometylestermetod och liknande), en metod som ut- nyttjar Woodwards reagens K, karbodiimidazolmetod, oxidations-reduktionsmetod, DCC/additiv [N-hydroxi- -5-norbornen-2,3-díkarboxiimid (HONB), l-hydroxibenso- triazol (HOBt), N-hydroxisuccinimid (HOSU) metod och n» m 10 15 20 25 30 35 457 352 5 liknande. Vid utförande av de ovannämnda metoderna kan både fastfassyntesmetod och vätskefassyntesmetod tillämpas, och vätskefassyntesmetoden föredrages.

Den nya syntetiska peptiden i föreliggande uppfin- ning framställs genom en konventionell metod för synte- tisering av en polypeptid som ovan nämnts, t ex genom en s k "stegvis"-metod, nämligen genom kondensering av en aminosyra steg för steg med den terminala aminosy- ran i peptiden eller genom koppling av peptider som uppdelats i flera fragment. Mera preciserat framställs nämnda peptid genom kondensering av ett utgångsmaterial som har reaktiv karboxylgrupp motsvarande ett fragment som uppdelats i tvà delar vid den önskade positionen, med ett annat utgångsmaterial som har reaktiv aminogrupp motsvarande ett annat fragment, genom ett förfarande som allmänt användes vid peptidsyntes. När den sålunda erhållna kondenserade produkten har skyddsgrupper kan den önskade peptiden framställas genom avlägsnande av skyddsgrupperna genom ett vanligt förfarande. När asparaginsyra, lysin eller arginin användes i reak- tionssteget för framställning av peptiden enligt förelig- gande uppfinning kan nämnda aminosyra företrädesvis skyddas medelst skyddsgruppper och i slutsteget i ett sådant fall avlägsnas i allmänhet hela skydds- grupperna från den skyddade peptiden i vilkèn minst en konstitutionell aminosyrarestgrupp är skyddad.

I reaktíonsstegen för syntetisering av peptider enligt föreliggande uppfinning bör varje funktionell grupp som inte har att göra med syntetíseringsreaktionen i allmänhet skyddas med skyddsgrupp, och skyddsgruppen avlägsnas från den skyddade gruppen efter reaktionen.

Därtill aktiveras vanligen en funktionell grupp som deltar i reaktionen. Förfaranden för utförande av nämnda reaktioner är kända och de reagens som användes för reaktionerna kan väljas bland dem som är kända på området. 457 352 10 15 20 25 30 35 6 Exempel på skyddsgrupper för aminogrupp är karbo- bensoxigrupp, tert-butyloxikarbonylgrupp, tert-amyloxi- karbonylgrupp, isobornyloxikarbonylgrupp, p-metoxiben- syloxikarbonylgrupp, 2-klorobensyloxikarbonylgrupp, adamantyloxikarbonylgrupp, trifluoroacetylgrupp, fta- lylgrupp, formylgrupp, o-nitrofenylsulfenylgrupp, dífenylfosfinotioylgrupp och liknande.

Exempel på skyddsgrupper för karboxigrupp är en alkylester (såsom en metylester, etylester, propyl- ester, butylester, tert-butylester eller liknande), en bensylester, en p-nitrobensylester, en p-metoxi- bensylester, en p-klorobensylester, en benshydrylester, karbobensoxihydrazid, tert-butyloxikarbonylhydrazid, tritylhydrazid och liknande.

Exempel pá skyddsgrupp för guanidinogrupp hos arginin är nitrogrupp, tosylgrupp, p-metoxibensensul~ fonylgrupp, karbobensoxigrupp, isobornyloxikarbonyl- grupp, adamantyloxikarbonylgrupp och liknande. Vidare kan nämnda guanidinogrupp skyddas i form av ett salt med en lämplig syra, såsom bensensulfonsyra, toluen- sulfonsyra, klorvätesyra eller svavelsyra.

Treoninets hydroxigrupp och serinets hydroxigrupp kan skyddas exempelvis genom esterifiering eller eteri- fiering, om så är nödvändigt. Exempel på skyddsgrupp I som är lämplig för esterifiering är en lägre alkanoyle grupp, såsom acetylgrupp, en aroylgrupp, såsom bensoyl- grupp, en grupp som härstammar från karbonsyra, såsom bensoyloxikarbonylgrupp, etyloxikarbonylgrupp och liknande. Exempel på skyddsgrupp som är lämplig för eterifiering är bensylgrupp, tetrahydropyranylgrupp, tert-butylgrupp och liknande.

Metionin kan skyddas i form av sulfoxid.

Exempel på aktiverad karboxylgrupp är en motsvarande syrakloríd, syraanhydrid eller blandad anbydrid, azid, en aktiverad ester (en ester av metylalkohol, etylalko- hol, bensylalkohol, pentaklorofenol, p-nitrofenol, N-hydroxisuccinimid, 1-hydroxibensotriazol, N-hydroxi- 10 15 20 25 30 35 457 352 7 -5-norbornen-2,3-dikarboxiimid och liknande) samt liknande.

Reaktionen för bildning av peptidbindning kan utföras i närvaro av ett kondensationsmedel, t ex ett karbodiimidreagens, såsom dicyklohexylkarbodiimid, karbodiimidazol eller liknande, eller tetraetylpyro- fosfit eller liknande.

En ny syntetisk peptid enligt föreliggande uppfin- ning framställs specifíkt genom Metoden (B) såsom nedan anges: Metod B [Förfarande för framställning av en peptid som represen- teras av den allmänna formeln (2)] B-(Il: När R2 är en väteatom. s I A-ÄYH-B (55) F I H-elu-G (56) \ E F f I A-Lys-Glu-G (57) E F H-Lås-sin-oH (58) Å-Ser-B (59) E A-ser-Lås-alu-ca (60) i E H-ser-Lås-ein-oH (61) 457 352 8 C .L-AÉg-a (62) C E 5 I _! '_ __ f \ A-Arg-Ser-Lys-alu-Cn (03) E H-Arg-Ser-Lås-Glu-CE (54) - f»- *- I A-ner-Leu-3 (og) lO v Ef A-Ser--eu-Arg-Ser-Lys-Glu-G3 (56) \ lä 15 E-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys-Glu-CE (67) F .f-x-Gíu-a (68) \/ 20 H A-Gíu-Ser~Leu-Arg-Ser-Lås-Glu-CH (59) E-Glu-Ser-Leu-årg-Ser-Lys-Glu-CH (70) 25 [vari peptiden (65)*framstäl1ts genom följande steg, A-Ser-3 (59) i, H-Leu-e (98) Å-Ser-Leu-G (99) 30 ALser-Leu-B (65 ) * 1 35 457 352 9 B-(I1)= När R2 är en grupp med formeln H-Thr-Asn-Leu-Gln-.

H-Gln-G (71) L A-Leu-B A-Leu-Gln-G (72) (73) V 10 H-Leu-Gln-G (74) / A-Asn-3 (75) A-Asn-Leu-Gln-G (76) 15 f H-Asn-Leu-Gln-G (77) 7 A-Thr-B (78) A-Thr-Asn-Leu-Gln-G (79) zo \/ A-Thr-Asn-Leu-Gln-3 ll __ 1 -Glu-Ser-Leu-årg~Ser-Lys-Glu~Cš Lfl (21) A-Thr-Asn-Leu-Gln-Glu-Ser-Leu~årg-Ser- 25 Lås-slu-cï _ (az) \ L E-Thr-Asn-Leu-Gln-Glu-Ser-Eeu-;rg-šer- Lys-Gzu-CH (sz) 30 B-(III): När R2 är en grupp med formeln H-Ser-Leu-Ser-Thr-Asn-Leu-Gln-. 35 457 352 lO 15 20 25 30 35 W E-Leu-Ser-G (36) i .à-ser-s (se) A-Ser-Leu-Ser-G \B7) L A-Ser-Leu-Ser-3 (98) -., ,., :-Thr-Asn-Leu-:ln-Glu-Ser- š Leu-fxrg-ser-Lys -Glu-cza (39) _ 1 $ E A-Ser-Leu-Ser-Thr-Asn-Leu-Gln- 5lu»Ser-Leu-Arg-Ser-Lys-Glu-GH (EC) z 1 I H $ Q H-Ser-Leu-Ser-Thr-Asn-Leu-Gln- Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys-Glu-CH (91) B-(IV): När R2 är ep grupp med formeln E-?yr-Ser-Leu-Ser-?hr-Asn-Leu-Gln-. Å-Ser-Leu-Ser-G (87) H-Ser-Leu-Ser-G (92) $ ë-Tfrr-B (93) A-ïyr-Ser-Leu-Ser-G (94) i 10 15 20 25 30 35 457 352 ll A-Tyr-Ser-Leu-Ser-B (95) H-Thr-Asn-Leu-Gln-Glu-Ser- Leu-Arg-Ser-Lïs-Glu-OH (89) E A-Tyr-Ser-Leu-Ser-Thr-Asn-Leu-G1n- Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys-Glu-OH (96) l L? H-Tyr-Ser-Leu-Ser-Thr-Asn-Leu-Gln- Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys-Glu-OH (97) [I de ovannämnda metoderna B-(I) till (IV) är A en skyddsgrupp för aminogruppen, B en aktiv grupp av hydroxigruppen eller av karboxylgruppen och C en skydds- grupp för guanidinogruppen hos arginin, E en skydds- grupp för E-aminogrupp i lysinet, F en skyddsgrupp för Y-karboxylgruppen i glutaminsyra, och_G en skydds- grupp för karboxylgruppen.

I de ovannämnda metoderna är som en grupp A, tert-butoxikarbonylgrupp (Boc), karbobensoylgrupp (Z), p-metoxibensyloxikarbonyl eller liknande före- dragen; som en aktiv grupp av karboxylgruppen repre- senterat av B är en aktiv ester såsom N-hydroxisuccin- imidogrupp, en blandad syraanhydrid såsom isobutyloxi- karbonylgrupp, azidgrupp eller liknande föredragen; som en grupp C nitrogrupp, tosylgrupp eller liknande föredragen; som en grupp E en tosylgrupp eller liknande föredragen, som en grupp F en bensyloxigrupp eller liknande föredragen och som en grupp G en alkylester- restgrupp, tert-butoxíkarbonylhydrazid eller liknande föredragen.

I den ovannämnda metoden B-(I) kan reaktionen mellan en aminosyra (55) och en aminosyra (56), reak- 457 352 10 15 20 25 30 35 12 tionen mellan en peptid (58) och en aminosyra (59), reaktionen mellan en peptid (61) och en aminosyra (62), reaktionen mellan en peptid (64) och en aminosyra (65), reaktionen mellan en peptid (67) och en aminosyra (68) samt reaktionen mellan en aminosyra (59) och en aminosyra (98); och i den ovannämnda metoden B-(II) kan reaktionen mellan en aminosyra (71) och en aminosyra (72), reaktionen mellan en peptid (74) och en aminosyra (75), reaktionen mellan en peptid (77) och en aminosyra (78) samt reaktionen mellan en peptid (80) och en peptid (81); och i den ovannämnda metoden B-(III) kan reaktionen mellan en aminosyra (72) och en aminosyra (84), reaktionen mellan en peptid (86) och en aminosyra (59) samt reaktionen mellan en peptid (88) och en peptid (89); och i den ovannämnda metoden B-(IV) kan reaktionen mellan en peptid (92) och en aminosyra (93) samt reaktionen mellan en peptid (95) och en peptid (89) utföras i närvaro av ett lösningsmedel.

Som lösningsmedel kan vilket som helst lösningsmedel som kan användas i en peptidkondensationsreaktion användas, t ex en vattenhaltig eller en vatteninne~ hållande dimetylformamid, dimetylsulfoxid, pyridin, kloroform, dioxan, diklormetan, tetrahydrofuran, etyl- acetat, N-metylpyrrolïdon, hexametylfosfortriamid eller en blandning av dessa lösningsmedel.

Förhållandet mellan de använda mängderna av de två i en reaktion ingående aminosyrorna är inte särskilt begränsat och det kan väljas från ett vidsträckt omrâde, varvid vanligen en ekvivalent mängd till 5 gånger mängden, företrädesvis en ekvivalent mängd till 1,5 gånger mängden kan användas.

Reaktionstemperaturen kan väljas från ett område som användes för en reaktion för bildning av peptid- bindning, vanligen vid ca -40 till ca GOOC, företrä- desvis vid ca -20 till ca 40°C. Reaktionen utföres vanligen under flera minuter till ca 30 h. 10 15 20 25 30 35 457 352 13 Reaktionen för avlägsnande av skyddsgruppen A som förekommer i peptider, vilka erhållits i de ovan- nämnda reaktionerna, utföres genom någon metod som är allmänt använd på detta omrâde. Ifråga om denna reaktionsmetod för avlägsnande av skyddsgrupper exem- plifieras en reduktiv metod (hydrogenering med an- vändning av palladium, palladiumsvart eller liknande som en katalysator; en reduktion med användning av natriummetall i flytande ammoniak), en acidolys (aci- dolys med användning av trifluoroättiksyra, fluor- vätesyra, metansulfonsyra, bromvätesyra eller liknande som en stark syra) och liknande.

Den ovannämnda hydrogeneringen med användning av en katalysator kan utföras under l atmosfärs tryck av vätgas, vid O till 40°C. Katalysatorn användes i allmänhet i en mängd av 100 mg till 1 g, och reak- tionen fullbordas i allmänhet på 1 till 48 h.

Den ovannämnda acidolysen utföres i frånvaro av ett lösningsmedel, vid O till 30°C, företrädesvis vid O till 20°C, och reaktionen fullbordas vanligen på l5 min till 1 h. Syran kan vanligen användas i en mängd av 5 till lO gånger utgángsmaterialets mängd.

I den ovannämnda reduktionen med användning av natriummetall i flytande ammoniak användes natriummetall i en sådan mängd att reaktionsblandningens färg hålles permanent blå under 30 s till 10 min. Reduktionen utföres vanligen vid -40°C till -70°C.

Skyddsgruppen C som ingår i vissa peptider i de ovannämnda reaktionerna kan även avlägsnas genom ovannämnda reduktiva metod. Därtill kan reaktionen för avlägsnande av skyddsgrupperna E, F och G utföras genom ett förfarande som är lika förfarandet för av- lägsnande av skyddsgruppen C som ovan nämnts.

I de ovannämnda metoderna B-(I) till B-(IV) kan (56), (59), (62), (68), (71), (72), (93) och (98) vara kommersiellt aminosyrorna (55), (75), (78), (84), tillgängliga kända produkter. I de ovannämnda metoderna 457 352 10 15 20 25 30 14 B-(I) till B-(IV) kan även peptiderna (65), (80), (88) och (95) vara kommersiellt tillgängliga kända produkter eller kan även de som erhållits genom stan- dardanhydridmetod eller genom azidmetod användas.

Den blandade anhydridmetoden utföres i ett lämpligt lösningsmedel i närvaro av en basisk förening med användning av en alkylhalogenkarboxylsyra. Som alkylhalo- genkarboxylsyra exemplifieras metylkloroformiat, metyl- bromoformiat, etylkloroformiat, etylbromoformiat, iso- butylkloroíormiat och liknande. Som den basiska före- ningen exemplificras organiska basiska föreningar, såsom trietylamid, trimetylamin, pyridin, dimetylanilin, N-me- tylmorfolin, 1,5-diazabicykl0[4,3,0]nonen-5 (DBN), 1,5- -diazabicyklo[S,4,0]undeken-5 (DBU), l,4-diazabicyklo- [2,2,2]oktan (DABCO) föreningar, såsom kaliumkarbonat, natriumkarbonat, ka- och liknande; oorganiska basiska liumvätekarbonat, natriumvätekarbonat och liknande.

Det i denna reaktion använda lösningsmedlet kan väljas bland alla lösningsmedel som användes i en blandad an- hydridreaktion, och exempel på detta är halogenerade kolväten, såsom metylenklorid, kloroform, dikloroetan och liknande; aromatiska kolväten, såsom bensen, toluen, xylen och liknande; etrar, såsom dietyleter, tetrahyd- rofuran, dimetoxietan och liknande; estrar, såsom metyl- acetat, etylacetat-och liknande; aprotiska golära lös- ningsmedel såsom N,N-dimetylformamid, dimetylsulfoxid, hexametylfosfortriamid och liknande. Reaktionen utföres vid -20 till l00°C, företrädesvis vid -20 till SOOC, och fullbordas i allmänhet på 5 min till lO h, företrä- desvis på 5 min till 2 h.

. I azidbildningsreaktionen aktiveras först karboxyl- gruppen med en alkohol, såsom metylalkohol, etylalko- hol eller liknande, varpå den aktiverade karboxylgruppen bringas att reagera med hydrazinhydrat i ett lämpligt lösningsmedel. Som lösningsmedel kan dioxan, dimetylform- amid, dimetylsulfoxid eller en blandning av dessa lös- ningsmedel exemplifieras. Hydrazinhydrat kan användas 10 15 20 25 30 35 457 352 15 i allmänhet i en mängd av 5 till 20 ggr den molära mäng- den, företrädesvis 5 till 10 ggr den molära mängden i förhållande till mängden av den aktiverade karboxyl- gruppen. Reaktionen utföres vanligen vid under 50°C, företrädesvis vid -zo till 3o°c. sålunda kan en före- ning, vari den terminala aminosyrans karboxylgrupp är substituerade med hydrazin (hydrazinderivat) framstäl- las. En förening, i vilken den terminala aminosyrans karboxylgrupp är substituerad med azid, framställs genom att i ett lämpligt lösningsmedel, i närvaro av en syra, bringa det ovannämnda hydrazinderivatet att reagera med en salpetersyraförening. Som syran användes vanligen klorvätesyra. Som lösningsmedlet kan dioxan, dimetyl- formamid, dimetylsulfoxid eller en blandning av dessa lösningsmedel användas. Som salpetersyraförening kan natriumnitrit, isoamylnitrit, nitrosylklorid eller liknande användas. Salpetersyraföreningen användes i allmänhet i en ekvimolär till tvâ gånger den molära mängden, företrädesvis en ekvimolär till 1,5 ggr den molära mängden av hydrazinderivatet. Reaktionen utföres vanligen vid -20 till OOC, företrädesvis vid -20 till -lO°C, och den fullbordas pà ca 5 till 10 min.

Peptiden (81), som användes i den ovannämnda metoden B-(II), kan erhållas genom avlägsnande av skyddsgrupperna A,och F från peptiden (69), och peptiden (89), som användes i den ovannämnda metoden B-(III), kan erhållas genom avlägsnande av skyddsgruppen A fràn peptiden (82). Reaktionen för avlägsnande av skyddsgrupperna kan ske enligt den ovannämnda metoden.

Peptiderna enligt föreliggande uppfinning, som framställts enligt de ovannämnda metoderna, isoleras och renas från reaktionsblandningarna genom vanliga metoder för isolering av peptider, t ex extraktion, fördelning och kolonnkromatografi samt liknande.

Såsom ovan förklarats erhålles syntetiska peptider enligt föreliggande uppfinning, dvs C-terminal peptid av humant lymfoblastoidinterferon, och derivat därav. 457 352 10 15 20 25 30 35 16 Sålunda erhållna syntetiska peptider kan användas som märkta antigener, vilka användes vid radioimmunoana- lys (RIA) eller fluorescenspolarisationsimmunoanalys- system, genom införing av ett vanligt märkningsmedel, 1251, 1311 eller liknande, t ex en radioaktiv jod, såsom en fluorokrom, såsom fluorescein-isotiocyanat (FITC), tetrametylrodaminisotiocyanat (TRITC), ett substituerat rodaminisotiocyanat (XRITC), rodamin B-isotiocyanat, diklorotriazinfluorescein (DTAF) eller liknande, eller ett enzym eller liknande.

Införingen av en radioaktiv jod utföres genom be- handling av en peptid som har en tyrosylgrupp, bland de syntetiska peptider som ovan nämnts, genom en vanlig joderingsmetod, t ex en oxidativ joderingsmetod, med användning av kloramin T [jfr W. M. Hunter och F. C.

Greenwood: Nature, låg, sid 495 (l962); Biochem. J., šg, sid 114, (l963)]. Den ovannämnda joderingsmetoden utföres i ett lämpligt lösningsmedel, t ex O,2M-fosfat- buffertlösning (pH = 7,4), i närvaro av Kloramin T, vid rumstemperatur under lO till 30 s. Den radioaktiva joden kan användas i en mängd av ca l millicurie per l nanomol av tyrosinmolekyl som ingår i peptiden, till- esammans med 10 till lOO nanomoler av Kloramin T, när en atom av den radioaktiva joden skall införas i tyro- sinmolekylen. Pà liknande sätt, när två atomer av den radioaktiva joden skall införas i tyrosinmolekylen, kan 2 millicurier av den radioaktiva joden användas per l nanomol av tyrosinmolekyl som ingår i peptiden, tillsammans med 10 till 100 nanomoler av Kloramin T.

En sålunda framställd peptid, som märkts med den radioaktiva joden, kan isoleras och renas genom konven- tionella metoder för isolering, t ex extraktion, fördel- ning, kolonnkromatografi, dialys eller liknande. Om så krävs kan den märkta peptiden lagras i lyofiliserad form.

Peptiden som märkts med en fluorokrom framställes genom införing av fluorokromen i N-terminalen eller 10 15 20 25 30 35 457 352 17 aminogruppen i den syntetiska peptidens molekyl, i en lämplig buffertlösning i ett alkaliskt tillstånd, före- trädesvis vid pH 8 till 12. Ifràga om buffertlösningen finns det inte någon särskild begränsning, och den kan väljas från ett vidsträckt område, så länge som pH-vär- det från buffertlösningen är i det ovannämnda interval- let. Ifràga om buffertlösningarna kan en boratbuffert- lösning, en bikarbonatbuffertlösning, en glycinbuffert- lösning, en Barbital-buffertlösning, en trisbuffertlös- ning, en ammediolbuffertlösning, Ringer's buffertlösning och liknande exemplifieras. I fall peptiden och/eller fluorokromen inte är lösliga i buffertlösningen, kan märkningsreaktionen utföras genom tillsättning av ett vanligt lösningsmedel, t ex metanol, etanol, aceton, dimetylformamíd eller liknande, till reaktionssystemet.

Märkningsreaktionen får vanligen fortgå vid ca O till 40°C, företrädesvis vid O till ZOOC, och är full- bordad på flera minuter till ca 48 h.

Det finns ingen begränsning av förhållandet av mängden fluorokrom och det kan väljas från ett vidsträckt område, och vanligen användes l till lO ggr den molära mängden, företrädesvis 2 till 4 gånger den molära mäng- den av fluorokrom per en aminogrupp som ingår i pepti- den. En sålunda erhållen peptid, som är märkt med en fluorokrom, kan isoleras och renas samt lagras på ett sätt som är lika det för peptiden som märkts med den radioaktiva joden.

Hitintills har interferoner analyserats indirekt genom biologiska mätmetoder på basis av fysiologiska aktiviteter därav. [Finter, N. B. i Interferon and Inter- feron Inducers (ed. Finter, N. B.), sid l35-170 (North- -Holland, Amsterdam, l973)]. Den biologiska mätmeto~ den erfordrar sålunda levande celler och levande virus, som har förmåga att infektera cellerna, och interfe- ronernas potens analyseras genom bestämning, direkt eller indirekt, av graden av celldöd som förorsakas av virusinfektionen. Sådana biologiska mätmetoder ger 457 352 10 15 20 25 30 35 18 emellertid osäkra och spridda resultat, eftersom de i metoden använda materialen är levande organismer.

Om därtill någon substans med antiviral aktivitet, annan än interferonerna som skall analyseras, finns i test- provet, då blir sådan biologisk mätmetod för analysering av interferoner meningslös. Därtill kan selektiv analys av humaninterferon-a eller humaninterferon-ß inte ut- föras genom sàdan biologisk mätmetod. Därtill erford- rar sådan biologisk mätmetod flera dygn för erhållande av resultaten med för komplicerade operationer, varför en sådan metod inte uppfyller de medicinska världens krav.

Olikt en sådan biologisk mätmetod kan den nya meto- den för analysering av humaninterferoner enligt före- liggande uppfinning, i enlighet med radioimmunoanalys- metoden (RIA-metoden) eller fluorescenspolarisations- immunoanalyssystemet med användning av märkta antigener (märkta peptider) analysera humaninterferon-u eller humaninterferon-ß selektivt, enkelt, snabbt och med stor noggrannhet.

En fluorescenspolarisationsimmunoanalysmetod är 'redan väl känd, men det har emellertid inte varit känt att denna metod kan tillämpas på kvalitativ bestämning av interferoner. Detta'berodde på att en renad inter-, feron märkt med fluorokrom knappast har framställts, och även om denna renade interferon märkt med fluoro- krom kunde erhållas, kan en sådan märkt substans med hög molekylvikt endast uppvisa mindre förändringar i polarisationsgrad (P-värde), varför en adekvat känslig- het vid kvalitativ bestämning inte kunde erhållas.

I motsats till det ovanstående kan peptider märkta med fluorokrom enligt föreliggande uppfinning uppvisa en stor förändring i polarisationsgrad (P-värde), och de är användbara, märkta substanser för analys av human- interferon-a eller humaninterferon-ß med GU adekvat noggrannhet vid kvalitativ bestämning. Enligt framstegen 10 20 25 30 35 457 352 19 med sådana peptider märkta med fluorokrom kan faktiskt kvalitativ bestämning av humaninterferon-u eller humanin- terferon-ß genom tillämpning av det ovannämnda fluore- scenspolarisationsimmunoanalyssystemet utföras.

Metoden för analysering av interferoner genom fluo- rescenspolarisationsimmunoanalys förklaras i detalj nedan.

Sekvensen av mätningsprocedurer och -operationer är inte i grunden olik den som användes i en vanlig metod med fluorescenspolarisationsimmunoanalyssystem.

Sättet att analysera interferoner enligt förelig- gande uppfinning kan utföras med användning av standard- antigen och antikroppen gentemot denna samt peptiden märkt med fluorokrom. Ifràga om standardantigenen kan ett naturligt humaninterferon-u självt eller ett na- turligt humaninterferon-ß självt, eller en peptid som representeras av den allmänna formeln (2) med antigenicitet som är ekvivalent med humaninterferon-u användas. När nämnda peptid användes kan po- tensen hos interferonet i ett okänt prov lätt beräknas med kännedom om kors-reaktiviteten hos human-interfe- ron-a eller -ß och peptiden gentemot antikroppen, fore testet. Med tanken pà ansträngningarna, kostnaderna och operationerna för erhållande av en renad produkt av standardantigenet är användningen av peptíden rätt' så fördelaktig.

Ifråga om antikroppen av interferon som användes i analysmetoden enligt föreliggande uppfinning kan någon antikropp gentemot humaninterferon-u eller -ß eller en peptid som representeras av de allmänna formlerna (2)_ användas, och företrädesvis, såsom sena- re kommer att förklaras, användes en antikropp med hög specificitet gentemot humaninterferon-u, vil- ken framställs med användning av peptiden, som repre- såsom senteras av de allmänna formlerna (2), hapten. 457 352 10 15 20 25 30 35 20 Beträffande sekvensen av mätningsprocedurer fram- ställs en första serie av utspädda prover av standard- antigenet genom utspädning av antigenet med en lämplig utspädningslösning. Beträffande den utspädda lösningen finns det inte någon särskilt begränsning därav, och varje typ av spädmedel som är lämpligt för denna typ av metod kan användas. Specifikt kan en buffertlösning med ett pH-värde av 5 till 10, företrädesvis av 7 till 8, t ex en boratbuffertlösning, en tris-HCl-buffertlös- ning, en fosfatbuffertlösning, en ättiksyrabuffertlös- ning, en citronsyra-fosforsyrabuffertlösning, en gly- cinbuffertlösning eller liknande användas. Därtill kan till utspädningslösningen sättas ett ämne för inhibe- ring av adsorption, såsom bovinserumalbumin (BSA), na- triumazid såsom ett konserveringsmedel, och ett vanligt additiv såsom EDTA, natriumklorid eller liknande.

Därefter sättes en förutbestämd mängd av antikrop- pen och en förutbestämd mängd av peptiden märkt med en fluorokrom till de respektive proverna av serierna av utspädd standardantigen för uppgöring av prover, varpå dessa prover får stå vid O till 37°C i 30 min till"48 h, och styrkan av vertíkalpolariserad fluores- cens (IVS) och styrkan av horisontalpolariserad fluores- cens (IHS) mätes genom en vanlig metod. Mätningarna av nämnda polariserade fluorescens kan lätt utföras med användning av en vanlig apparat för mätning av styr- kan av polariserat ljus, t ex en kommersiellt tillgäng- lig “FS-501" (tillverkad av Union-Giken-Sha, Co., Ltd).

Genom ett förfarande som är lika det som ovan för- klarats för framställning av serierna av utspädda stan- dardantigenprover framställs en serie av referenspro- ver som inte innehåller peptiden märkt med en fluoro- krom, och styrkan av vertikalpolariserad fluorescens (IVR) och styrkan av horisontalpolariserad fluorescens (IHR) mätes. 5 10 15 20 25 *so 35 457 352 21 Sedan erhålles en standardkurva av polarisationsgra- den (P-värdet) mot koncentrationen av prover i serien av utspätt standardantigen.

Polarisationsgraden (P-värdet) beräknas genom föl- jande formel, (I - I P = (Ivs ' Ins) ns HR) (I X l0O (%) ~ 1 vs ' IVR) + (las HR) Istället för standardantigenproverna kan med an- vändning av prover som innehåller humaninterferon-a eller -ß av okänd koncentration, humaninterferon~u eller -ß som finns i proverna analyseras från standardkurvan genom beräkning av P-värdet, som erhållits på liknande sätt. ' När ett naturligt humaninterferon-d eller -ß an- vändes som standardantigenet kan potensen hos inter- feronet i provet erhållas från standardkurvan.

När en peptid som representeras av den all- männa formeln (2) användes som standardantigenet erhålles korsreaktiviteten av humaninterferon-u eller -ß och peptiden gentemot antikroppen före testet, var- på man omvandlar till interferonets potens.¶ De syntetiska peptiderna enligt föreliggande upp- finning kan användas som haptener för framställning av humaninterferon-a -eller -ß-antigen.

Sättet att framställa humaninterferon-u -eller -ß- antigen skall nu förklaras.

. Humaninterferon-u - eller -ß-antigenet framställs genom att en syntetisk peptid som användes såsom hap- tenen bringas att reagera med en bärare i närvaro av en ett bindningsreagens för hapten-bärare.

Som bärare som skall bindas till haptenen använ- des i det ovannämnda sättet ett naturligt eller synte- tiskt protein med hög molekylvikt, vilket allmänt an- 457 352 10 15 20 25 30 35 22 vändes vid framställning av ett vanligt antigen, t ex djurserumalbuminer, såsom hästserumalbumín, bovinse- rumalbumin, kaninserumalbumin, humanserumalbumin, får- ïserumalbumin och liknande; djurserumglobuliner, såsom hästserumglobulin, bovinserumglobulin, kaninserumglo- bulin, humanserumglobulin, fårserumglobulin och lik- nande; djurtyroglobulin, såsom hästtyroglobulin, bovin- tyroglobulin, kanintyroglobulin, humantyroglobulin, färtyroglobulin och liknande; djurhemoglobuliner såsom hästhemoglobulin, bovinhemoglobulin, kaninhemoglobulin, humanhemoglobulin, fàrhemoglobulin och liknande; djur- hemocyaniner; proteiner extraherade fràn ascaris [själva ascarisextrakten har beskrivits i japanska patentet Kokai (utlagd) nr Sho-16414/1981, J. Immun., lll, 260-268 (l973); J. Immun., låg, 302-308 (l979); J. Immun., gå, 893-900 (1967) och Am. J. Physiol., låg, 575-578 (1960), eller produkter erhållna därav genom ytterligar rening]; polylysin, polyglutaminsyra, lysin-glutaminsyra-sampoly- mer, sampolymer som innehåller lysin eller ornitin och liknande.

Som bindningsreagens för hapten-bäraren kan de 22som*konventionellt användes vid framställning av"van1iga antigener väljas från ett vidsträckt område, särskilt sådana alifatiska dialdehyder, såsom glyoxal, malon- dialdehyd, glutaraldehyd, succinaldehyd, adipoaldehyd' och liknande som kan göra tvärbindningar mellan två aminogrupper; sådana dimaleimidföreningar, såsom N,N'- -o-fenylendimaleimid, N,N'-m-fenylendimaleimid och lik- nande, som kan göra tvärbindningar mellan två tiolgrup- per; sådana maleimidokarboxyl-N-hydroxisuccinimidoes- terföreningar, såsom metamaleimido-bensoyl-N-hydroxi- suoc in imidoester , 4- (male imidometyl) -cyk lohexan-l-kar- boxyl-N'-hydroxisuccinimidoester och liknande som kan göra tvärbindning mellan aminogrupp och tiolgrupp; sådana dehydrokondensationsmedel, sàsom N,N-dicyklohexylkar- boaiimia (Dec), N-etyl-N'-aimet§f1aminokarboanm1a, l-etyl- -3-diisopropylaminokarbodiimid, l-cyklohexyl-3-(2-mor- 10 15 20 25 30 35 457 352 23 folinyl-4~etyl)karbodiimid och liknande som användes för en vanlig reaktion för bildning av peptidbindning, dvs för kombinering av aminogrupp med karboxylgrupp; vidare sådanadiazonium-aryl-karboxylsyror, såsom p-di- azoniumfenylättiksyra och liknande som kan användas i kombination med ett vanligt reagens för peptidbind- ning, t ex det ovannämnda dehydrokondensationsmedlet.

Reaktionen för framställning av antigener enligt föreliggande uppfinning utföres exempelvis i ett vat- tenhaltigt lösningsmedel eller en vanlig buffertlös- ning med pH-värde av 7-10, företrädesvis pH-värde av 8-9, vid O-4O0C, företrädesvis vid rumstemperatur, van- ligen under ca l-24, företrädesvis ca 3-5 h. Som typiska i reaktionen använda buffertlösningar exempelifieras följande: 0,2 N-natriumhydroxid - 0,2 M borsyra - 0,2 M ka- liumklorid - buffertlösning, 0,2 M natriumkarbonat - 0,2 M borsyra - 0,2 M ka- liumklorid - buffertlösning, 0,05 M natriumtetraborat - 0,2 M borsyra - 0,05 M gnatriumklorid - buffertlösning, O,l M kaliumdihydrofosfat - 0,05 M natriumtetra- borat - buffertlösning I den ovannämnda reaktionen kan förhållandet av mängderna av en hapten, ett bindningsmedel för hapten- -bärare, och en bärare ordentligt bestämmas, och i all- mänhet användas 2-6 gånger viktsmängden, företrädesvis 3-5 gånger viktsmängden av bäraren i förhållande till haptenen, och 5-10 gånger den molära mängden av bind- ningsmedlet för hapten-bärare i förhållande till hap- tenen. Enligt den ovannämnda reaktionen kan ett human- interferon-a- eller -ß-antigen, som består av en bärare och en hapten, vilka båda kombinerats genom ett bind- ningsmedel för hapten-bärare, erhållas.

Efter det att reaktionen är fullbordad kan det sålunda erhållna antigenet isoleras och renas enkelt genom en vanlig dialysmetod, gelfiltreringsmetod, frak- 457 352 10 15 20 25 30 35 24 tionerad utfällningsmetod och liknande. Vidare kan anti- genet lagras i en konventionell lyofiliserad form.

Sålunda erhålles humaninterferon-u- eller -ß-anti- genkompositionen, som består av en av de föreliggande syntetiska peptiderna och bäraren. Nämnda antigen är en komposition i vilken i allmänhet genomsnittligt 5-20 moler av peptiderna är kombinerade med l mol av pro- teinet. Från nämnda antigen kan en antikropp med hög specificitet för humaninterferon-a eller -B framställas med god reproducerbarhet. Bland antigenkompositionerna uppvisar särskilt en med bindningsförhållandet av prote- in:peptid=l:8 till 1:15 hög specificitet och är mest föredragen, ty från den kan en antikropp med hög potens och hög känslighet framställas.

Framställning av antikroppen med användning av antigenet som erhållits såsom ovan angivits utföres på följande sätt. Nämnda antigen administreras åt ett däggdjur och en antikropp som alstras i däggdjurskrop- pen uppsamlas.

Det finns inte någon särskild begränsning beträf- fande val av däggdjur som skall användas vid framställ- ning av antikroppen, och i allmänhet användes företrädes- vis kanin eller marsvin. Vid framställningen av antikrop- pen spädes en förutbestämd mängd av antigenet, som er- hållits såsom ovan, med en fysiologisk saltlösning till en lämplig koncentration, och denna utspädda lösning spädes ytterligare genom blandning med ett fullständigt Freund's hjälpmedel för att framställa en suspension, varefter suspensionen administreras åt ett däggdjur.

Exempelvis administreras denna suspension intrakutant åt en kanin i en mängd av O,t till 5 mg av antigenet vid varje administrering, och administreringarna fort- sättes varannan vecka under 2 till lO månader, före- trädesvis under 4 till 6 månader för att åstadkomma immunisering. För uppsamling av antikropparna uttages blodet från det immuniserade djuret vid den tidpunkt 10 15 20 25 30 35 457 352 25 när en stor mängd av antikropparna alstras i djurkroppen efter administreringen av suspensionen, i allmänhet l till 2 veckor efter den sista administreringen av suspensionen. Det från djuret uttagna blodet behandlas genom centrifugalseparation för att separera serumet och erhålla antikroppen. I enlighet med förfarandet enligt uppfinningen, på basis av antigenets specifika egenskaper, kan en antikropp med utmärkt specificitet för humaninterferon-a eller -ß, med hög potens och hög känslighet erhållas.

Sålunda erhållen antikropp enligt föreliggande uppfinning har en utmärkt specificitet för humaninter- feron-u eller -ß och är användbar beroende på att den har förmåga att analysera humaninterferon-a eller -ß i RIA-metoden med hög noggrannhet. Vidare kan antikrop- pen användas i en enzymimmunoanalys (EIA)-metod, en fluorescensimmunoanalys (FIA) eller liknande genom märk- ning av antikroppen med ett enzym eller med en flurokrom.

Därtill kan antikroppen användas som utgàngsmaterial för framställning av ett adsorptionsmedel för användning i affinitetskromatografi genom immobilisering av anti- kroppen på en lämplig olöslig bärare.

Genom användning av adsorptionsmedlet för nämnda affinitetskromatografi kan humaninterferon-u isoleras och renas_fràn en ràprodukt av interferoner genom val av den typ av antikropp som skall användas.

När adsorptionsmedlet, i vilket humaninterferon-a -anti- kroppen är ímmobiliserad, användes, adsorberas human- interferon-a selektivt därpå. Sedan kan från adsorp- tionsmedlet, som innehåller humaninterferon-a adsorberat därpå, desorption av humaninterferon-a utföras under milda betingelser genom en enkel operation, varför hög renhet hos humaninterferon-a kan erhållas kvali- tativt utan förlust av aktiviteten därav.

Adsorptionsmedlet för affinitetskromatografi kan framställas genom en metod som nedan anges.

Vid immobilisering av humaninterferon-antikrop- 457 352 '10 15 20 25 30 35 26 pen på en olöslig bärare kan vilken som helst konven- tionell metod för immobilisering av bio-material ut- nyttjas, och bland sådana kovnentionella metoder före- drages användningen av cyanbromid-aktiverad-polysacka- ridmetod. Cyanbromid-aktiverad-polysackaridmetod be- handlar först en olöslig bärare med cyanbromid, varpå den sålunda erhållna aktiverade bäraren kopplas med en biosubstans under milda betingelser för att immo- bilisera biosubstansen. Vid behandling av den olösliga bäraren med cyanbromid kan behandlingen utföras vid pH ll-12 med användning av en basisk förening, t ex natriumhydroxid, natriumvätekarbonat eller liknande, vid rumstemperatur i ett lösningsmedel, t ex vatten, acetonitril eller liknande, under ca l till l2 min.

-Förhållandet mellan mängden av cyanbromid till mängden av den olösliga bäraren kan i allmänhet vara en ekvi- valent viktsmängd. Som den olösliga bäraren kan någon känd olöslig bärare med låg ospecifik adsorptionsför- måga till vanlig biosubstans, med hög porositet, med funktionella grupper som har förmåga att immobilise- ra biosubstansen under milda betingelser, samt till- räckligt kemiskt och fysikaliskt stabil användas. Exem- pelvis kan bärare av cellulosatyp, såsom aminoetylcellu- losa, karboximetylcellulosa, bromacetylcellulosa, p- -anilinocellulosa och liknande; bärare av typen tvär- bunden dextran, såsom Sephadex, CM-Sephadex (tillverkad av Pharmacia Fine Chemicals, Inc) och liknande; bära- re av agarostyp, såsom Sepharose 2B, Sepharose 4B, Sepha- rose 6B (tillverkade av Pharmacia Fine Chemicals, Inc) och liknande användas.

Vid koppling av sålunda erhållen cyanbromid-akti- verad bärare.med humaninterferon-antikroppen kan 30-80 gånger viktsmängden av en cyanbromid-aktiverad bärare bringas att reagera med en humaninterferon-antikropp i ett lämpligt lösningsmedel, såsom O,lM natriumväte- karbonat-vattenlösning (som innehåller O,5M natriumklo- 10 15 20 457 352 27 rid, pH = 8,4), vid 1 allmänhet o till 4o°c, företrä- desvis vid 2 till 8OC, under ca lO till 20 h. Ett ad- sorptíonsmedel för affinitetskromatografi enligt uppfin- ningen har sålunda framställts. Detta adsorptionsmedel kan lagras i ett lämpligt lösningsmedel, t ex en fysiolo- gisk saltlösning.

I avsikt att förklara föreliggande uppfinning i detalj beskrives nedanstående exempel på framställningar av peptider enligt föreliggande uppfinning, antigener och antikroppar erhållna därav, men föreliggande upp- finning är emellertid inte begränsad till endast dessa exempel.

I de följande exemplen på framställning har Rf-vär- det bestämts med användning av följande blandade lös- ningsmedel och tunnskiktskromatografi på silikagel.

I..... l-butanol-ättiksyra-vatten (4:l:5) f RfII.... 1-butanoi-pyr:din-ättiksyra-vatten (1s=1o=3=12) 457 352 10 15 20 25 30 35 28 [syntes av peptider] Framställningsexempel B 1- Ffamsfiällflifls av ß~ßyslïeëlzêlsl9ëëllïflàël 4,l8 g av H-Glu(OBzl)-OBzl.Tos löstes i 30 ml di- metylformamid (DMF), varpå l,2l ml av trietylamin (TEA) tillsattes och blandningen omrördes under kylning. Å andra sidan löstes 4,35 g av Z-Lys(Tos)-OH i 30 ml tet- rahydrofuran (THF), och 0,98 ml N-metylmorfolin sattes därtill, varpå denna blandning kyides till -1s°c och under omröring tillsattes droppvis 1,27 ml isobutyl- kloroformiat. 30 s efter tillsättningen sattes den ovan- nämnda kylda DMF-lösningen därtill och denna blandning nmrördes vid o°c its nin, sedan vid 4o°c 1 ett vatten- bad i l min och vidare vid l5°C i 30 min. THF och DMF avlägsnades ur reaktionsblandningen under reducerat tryck, varpå den sålunda erhållna återstoden extrahera- des med etylacetat. Extraktet tvättades med ln citron- syra, en mättad vattenlösning av natriumklorid, en mät- tad vattenlösning av natriumvätekarbonat och en mät- tad vattenlösning av natriumklorid, i nämnd ordning, och torkades med vattenfritt natriumsulfat, varpå etyl- acetatet avlägsnades genom destillation. Den erhållna oljiga återstoden stelnade vid tillsättning av etyl- eter och àterutfälldes ur etylacetat-eter för att ge 5,37 g av den önskade produkten.

R I. 0,96 fII Rf : 0,90 Elementaranalys (för C4OH45N3O9S) Beräknat 64,59 % C" 6,10 % H 5,65 % N Funnet 64,13 % C 5,95 % H 5,63 % N Zía). Framställning av H-LysíÉg§l:§ln:Q§ 5,21 g av z-Lys(Tas)-Gin(oBzi)-oßzi löstes 1 en blandning av 80 ml metanol med 20 ml av lO % ättiksyra, och en liten mängd palladiumsvart sattes därtill och omrördes över natten under införing av vätgas. Efter 10 15 20 25 30 35 457 352 29 det att reaktionen var fullbordad avlägsnades kataly- satorn genom vakuumfiltrering, och filtratet destil- lerades under reducerat tryck för att ge återstoden; Till återstoden hälldes vatten och sedan lyofilisera- de man för att erhålla den önskade produkten.

Rfïš 0,29 Rf : 0,52 gi§l¿_Fram§tällning av Z-Ser-Lys1¶os)~§lg:Q§ 2,13 g av Z-Ser-NHNH2 löstes i 20 ml DMF och 4,20 ml av 6n-klorvätesyra/dioxan tillsattes, varpå blandningen kyidas till -1s°c och 1,13 ml isoamyinitrit tillsattes under omröring. Efter det att reaktionsblandningen upp- visade negativ reaktion vid hydrazidtest tillsattes droppvis en kall lösning av 3,53 ml trietylamin med 1,20 ml DMF för att neutralisera reaktionsblandningen.

Denna blandning, som innehöll aziden, sattes till en kall DMF-lösning av H-Lys(Tos)-Glu-OH som erhållits i det ovan angivna steget 2(a) med 1,96 ml trietylamin, varpå denna blandning omrördes vid -io till -1s°c 1 2 h och vid 4oC i 20 h. Dimetylformamiden avlägsnades genom destillation, varpå den sålunda erhållna åter- stoden extraherades med etylacetat, varefter etylace- tatskiktet tvättades med ln citronsyra och en mättad vattenlösning av natriumklorid, samt torkades med vat- tenfritt natriumsulfat, och etylacetatet avlägsnadesa genom destillation under reducerat tryck. Den sålunda erhållna återstoden stelnade vid tillsättning av etyl- eter och àterutfälldes ur etylacetat-eter för att ge 4,14 g av den önskade produkten.

RfI= 0,64 RfII: 0,65 Elementaranalys (för C29H38N4OllS.l/ZHZO) Beräknat 52,80 % C 5,96 % H 8,49 % N Funnet 52,87 % C 5,69 % H 8,46 % N 457 352 10 15 20 25 30 35 30 §¿§l¿_§ramställning av H-Ser-Lys1Tgs1-Gluïgg 4,03 g av Z-Ser-Lys(Tos)-Glu-OH löstes i en bland- ning av 60 ml metanol med 40 ml lO % ättiksyra och en liten mängd palladiumsvart tillsattes, varpå blandningen omrördes över natten under införande av vätgas. Efter det att reaktionen var fullbordad avlägsnades kataly- satorn genom filtrering, och filtratet destillerades under reducerat tryck, varpå återstoden hälldes i vat- ten och neutraliserades för att ge den önskade produk- ten.

Rfï. 0,23 RfII= 0,48 2.021rííëfilêšëllílšëitëíf-šäèšíilflílz2.:âsš:ëyëiï9šl:šlë:9ë H-Ser-Lys(Tos)-Glu-OH som erhållits i det ovan- nämnda steget 3(a) löstes i 20 ml dimetylformamid, och 1,74 ml trietylamin tillsattes, varpå blandningen om- rördes under kylning. Å andra sidan löstes 2,41 g av Z-Arg(NO2)-OH i 20 ml tetrahydrofuran, och 0,70 ml N-metylmorfolin sattes därtill, varpå blandningen kyl- des till -l5°C, och under omröring tillsattes droppvis fO,86 ml isobutylkloroformiat. 30 s efter denna till- sättning tillsattes den ovannämnda kalla dimetylforma- midlösningen, varpå hela blandningen omrördes vid OOC i 5 min, och sedan vid l5°C i 30 min. Tetrahydrofuran och dimetylformamid avlägsnades genom destillation under reducerat tryck, varpå den sålunda erhållna återstoden extraherades med butanol som mättats med 2 % ättiksyra.

Extraktet tvättades 5 gånger med 2 % ättiksyra som mät- tats med n-butanol och destillerades under ett redu- cerat tryck för att avlägsna ättiksyran genom ersätt- ningen med vatten, vidare för att avlägsna vatten genom ersättning med metanol. Den sålunda erhållna oljiga återstoden stelnade vid tillsättning av etyleter och återutfälldes ur etylacetat-metanol för att ge 4,09 9 av den önskade produkten. 10 15 20 25 30 35 457 352 31 R I; 0,42 fII Rf : 0,65 Elementaranalys (för C35H49N90l4S.l/2H20) Beräknat 48,83 % C 5,85 % H 14,54 % N funnet 49,22 2 c 5,05 s H 14,11 % N š;_Éšê@§§äll“ɧ9 av ë:§ef"LÉE:NHNH 2,54 g av Z-Ser-NHNH2 amid, och 5,00 ml 6n klorvätesyra/dioxan tillsattes, varpå blandningen kyldes till -l5°C. Sedan tillsattes 2 löstes i 20 ml dimetylform- under omröring 1,34 ml isoamylnitrit. Efter det att reaktionsblandningen uppvisade negativ reaktion vid hydrazintest tillsattes en kall lösning av 1,40 ml di- metylformamid med 4,20 ml trietylamin droppvis i små mängder för att neutralisera reaktionsblandningen. Den- na reaktionsblandning som innehöll aziden sattes till 15 ml av en kall dimetylformamidlösning, som innehöll 1,96 9 av H-Leu-0C2H5.HCl och 1,40 ml trietylamin, var- pà hela blandningen omrördes vid -10 till -lS°C i 2 h och vid 4°C i 20 h. Dimetylformamid avlägsnades genom destillation under reducerat tryck och den sålunda er- hållna återstoden extraherades med etylacetat, varpå etylacetatskiktet tvättades med ln citronsyra, en mät- tad vattenlösning av natriumklorid, en mättad vattenlös- ning av natriumvätekarbonat och en mättad vattenlös~ ning av natriumklorid, i nämnd ordning, samt'torkades med vattenfritt natriumsulfat, varpå etylacetatet av- lägsnades genom destillation under reducerat tryck.

Till den sålunda erhållna återstoden sattes petroleum- eter och tvättades genom dekantering. Den sålunda er- hållna oljiga substansen torkades under reducerat tryck i en exsicator och den torkade produkten löstes i 50 ml metanol, varpå 2,50 ml av 100 % hydrazin-monohydrat tillsattes under iskylning, varefter reaktionsproduk- ten fick stå vid rumstemperatur i 20 h. Metanolen av- lägsnades sedan genom destillation under reducerat tryck.

Den sålunda erhållna återstoden stelnade vid tillsätt- 457 352 lO 15 20 25 30 35 32 ning av etyleter och torkades i en exsicator. Den tor- ra produkten tvättades med vatten för att avlägsna över- skott av hydrazin~monohydrat och àterutfälldes ur meta- nol-etylacetat för att ge 2,68 g av den önskade pro- dukten.

R I; 0,73 fII Rf . 0,76 Elementaranalys (för Cl7H26N405) Beräknat 55,73 % c 7,15 % H 15,29 % N Funnet 55,72 % C 7,01 % H 15,42 % N 5Åšl;-ÉšëE§ÉšlšBšE¶_š!_§ZꚶI§ÉEIEY§lÉ9§lIÉÉEIQÉ 2,00 g av Z-Arg(NO)2-Ser-Lys(Tos)-Glu-OH suspen- derades i en blandning av 30 ml metanol med 30 ml av 50 % ättiksyra, och en liten mängd palladiumsvart till- sattes, varpå blandningen omrördes i 36 h under infö- ring av vätgas. Efter det att reaktionen var fullbordad avlägsnades katalysatorn genom filtrering i vakuum och filtratet destillerades under reducerat tryck för att ge en återstod, vilken hälldes i vatten och lyofilise- rades. l8 h efter lyofiliseringen löstes den lyofili- serade produkten med vatten, varpå lösningen återigen lyofiliserades för att ge den önskade produkten. 0,05 af = 6,41 g âlä1i_Er§@§§ëlla;2s_ëy_ë:ês§:ë§2:êz9:§s§:L2šl29§l:§l9: -OH l,03 g av Z-Ser-Leu-NHNH2 löstes i 15 ml dimetyl- formamid, varpå l,4l ml av 6n klorvätesyra/dioxan yt- terligare tillsattes, och blandningen kyldes till ~l5OC, varpå 0,38 ml isoamylnitrit tillsattes under omröring.

Efter det att reaktionsblandningen uppvisade negativ reaktion vid hydrazidtest tillsattes droppvis en kall lösning av 0,40 ml dimetylformamid med l,l8 ml trietyl- amin i små mängder för att neutralisera reaktionsbland- ningen. Denna reaktionsblandning som innehöll aziden sattes till 10 ml dimetylformamidlösning, som innehöll 10 l5 20 25 30 35 457 352 33 H-Arg-Ser-Lys(Tos)-Glu-OH, och som erhållits i det ovan angivna steget 5(a), samt 0,66 ml trietylamin, varpå hela blandningen onröraes vid -10 till -1s°c 1 2 n och vid 4°C i 20 h. Dimetylformamiden avlägsnades genom destillation under reducerat tryck, och den sålunda erhållna återstoden extraherades med n-butanol som mät- tats med vatten, varpå butanolskiktet tvättades 5 gånger med vatten som mättats med n-butanol och lösningsmedlet avlägsnades genom destillation. Återstoden stelnade vid tillsäftning av etyleter, och återfälldes ur meta- nol-etylacetat för att ge l,92 g av den önskade produk- ten.

R I: 0,33 fII Rf : O,b9 Elementaranalys (för C44H66NlO0l5S.2H2O) Beräknat 50,66 % C 6,76 % H 13,43 % N Funnet 50,57 % C 6,51 % H 13,34 % N §lëll_Ešë¶§EëllEi99_ë!_ë:§§š:E§9:èE9:§§E:&!§lE9§l:§šB: :QE 1,84 g av Z-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys(Tos)-Glu-OH sus- penderades i en blandning av 30 ml metanol med 30 ml av lO % ättiksyra, och en liten mängd palladiumsvart sattes till suspensionen, som sedan omrördes i 13 h under införande av vätgas. Efter det att reaktionen var fullbordad avlägsnades katalysatorn genom sugfiltre- Filtratet destillerades se- dan under reducerat tryck, och den sålunda erhållna återstoden hälldes i vatten, varpå den lyofiliserades för att ge den önskade produkten.

R I: o,o9 Rfïï- o ss f " ' ring för att ge filtratet.

:EY§lI9âl:§l9:9ë H-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys(Tos)-Glu-OH, som erhållits i det ovan angivna steget 6(a) löstes i 20 ml dimetyl- formamid, varpå 0,51 ml trietylamin tillsattes under 457 352 lO 15 20 25 30 35 34 iskylning. Vidare tillsattes 0,95 g Boc-Glu(OBzl)-CNHS och hela blandningen omrördes vid rumstemperatur i 24 h.

Dimetylformamiden avlägsnades genom destillation under reducerat tryck, varpå den sålunda erhållna återstoden extraherades med n-butanol som mättats med vatten, var- på butanolskiktet tvättades 5 gånger med vatten som mättats med n-butanol. Butanolskiktet underkastades destillation under reducerat tryck, varpå den erhållna återstoden stelnade vid tillsättningen av etyleter och återutfälldes ur metanol-etylacetat för att ge l,7O g avïden önskade produkten.

R : 0,42 fII Rf = 0,60 Elementaranaiys (för cæaalullolgsznzo) Beräknat 51,82 s c 6.97 % a 12,55 *a N runner 51,27 s c 6,58 s n 12,47 s, N Z1al¿_§ram§tällning ay_§oc-Glu-Ser:Leu-Arg:§er-Lys1Tg§¿: 150 mg av Boc-Glu(OBzl)-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys(Tos)- -Glu-OH löstes i en blandning av 30 ml metanol med 30 ml av lO % ättiksyra, och till denna lösning sattes en' liten mängd palladiumsvart, varpå blandningen omrördes i 18 h under införande av vätgas. Efter det att reak- tionen var fullbordad avlägsnades katalysatorn genom sugfiltrering och filtratet underkastades destillation under reducerat tryck. Till den sålunda erhållna äter- stoden sattes vatten och sedan lyofiliserade man för att erhålla den önskade produkten. 71b1. Framställning av H-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys1Tg§l: Boc-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys(Tos)-Glu-OH, som er- hållits i det ovan angivna steget 7(a), löstes i tet- rahydrofuran, och lösningen fick stå vid rumstempera- tur i l5 min. 30 ml av vattenfri eter sattes till lös- ningen varpå den sålunda bildade fällningen uppsamla- des genom filtrering, tvättades med vattenfri eter, 10 15 20 25 30 35 457 352 35 och sedan torkades fällningen under reducerat tryck i en exsicator som innehöll kaliumhydroxid-fosforpent- oxid som torkmedel. Sålunda.erhölls den önskade pro- dukten. _--__-________ _-.-______...._____--__ ___-__ ___-_..

-OH H-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys(Tos)-Glu-OH, som erhål- lits i det ovan angivna steget 7(b), löstes i flytan- de ammoniak som innan torkats med metalliskt natrium, varpå små bitar av metalliskt natrium sattes till lös- ningen under omröring tills reaktionsblandningens färg förändrades till blått och hölls i 30 s till l min.

Vidare tillsattes kristaller av NH4Cl till reaktions- blandningen, ett överskott av metalliskt natrium neu- traliserades, varefter ammoniaken avlägsnades fullstän- digt genom destillation vid rumstemperatur, och sedan underkastades produkten gelfiltrering på Sephadex G-25 -gel med användning av 50 % ättiksyra som eluerings- medel för att ge 58 mg av den önskade produkten. Denna produkt kallas härefter [Peptid EJ.

R I: 0,04 I fII Rf : 0,34 Elementaranalys (för C34H61NllOl4.C2H4O2.3H2O) Beräknat 44,95 % C' 7,44 % H 16,02 % N Funnet 45,05 3 C 7,11 % H 15,84 % N ëlëlliâšsæësëllaiaa-ëiuäfilafllëlilíêes 16,00 g av Z-Gln-NHNHBOC suspenderades i 100 ml metanol varpå en liten mängd palladiumsvart tillsat- tes och blandningen omrördes i 18 h under införande av vätgas. Efter det att reaktionen var fullbordad av- lägsnades katalysatorn genom sugfiltrering och filtra- tet underkastades destillation under reducerat tryck.

Den sålunda erhållna återstoden torkades under redu- cerat tryck i en exsicator för att ge den önskade pro- dukten.

R I; 0,37 fII R : 0,58 f 457 352 10 15 20 25 30 35 36 §1§l. Framställning av §:Leu-§ln-NHNHBOC H-Gln-NHNHBOC, som erhållits i det ovan angivna = steget 8(a), löstes i 50 ml tetrahydrofuran, varpå 5,51 g av Z-Leu-ONHS sattes därtill under iskylning.

Sedan omrördes reaktionsblandningen vid rumstemperatur i l8 h. Tetrahydrofuran avlägsnades genom destillation under reducerat tryck, varpå den erhållna återstoden extraherades med etylacetat. Etylacetatskiktet tvätta- des med ln citronsyra, en mättad vattenlösning av na- triumklorid, en mättad vattenlösning av natriumväte- karbonat och en mättad vattenlösning av natriumklorid i nämnd ordning, och det tvättade etylacetatskiktet torkades med vattenfritt natriumsulfat, varpå etylace- tatet avlägsnades genom destillation. Den erhållna oljiga återstoden stelnade vid tillsättning av etyl- eter, och den fasta substansen återutfälldes ur meta- nol-etyleter för att ge 6,04 g av den önskade produk- ten.

R I; 0,81 fII Rf : 0,86 Elementaranalys (för C24H37N5O7) Beräknat 56,79 % C 7,35 % H 13,80 % N funnet 56,67 s; c 7,15 s n 13,75 så N âlëlašsëæäëëllsifls aVJi-Leu-Glfl-NENÉBOC 2,79 g av Z-Leu-Gln-NHNHBOC suspenderades i 80 ml metanol och en liten mängd palladiumsvart sattes till denna suspension, varpå suspensionen omrördes i 32 h under införande av vätgas. Efter det att reaktionen ' var fullbordad avlägsnades katalysatorn genom sugfil- trering, varpå filtratet underkastades destillation under reducerat tryck. Den erhållna återstoden torka- des under reducerat tryck i en exsicator för att ge 1 den önskade produkten.

R I: 0,33 RfII! 0,56 i 10 l5 20 25 30 35 457 352 ÉÅPÄ;_§E궧ÉÉÉÄEÉEQ-ÉY_ÉZ§§EíêÉEI§ÄEIÜÉÉÉÉ9E H-Leu-Gln-NHNHBoc, som erhållits i det ovan an- givna steget 9(a), löstes i 30 ml dimetylformamid, var- på lösningen kyldes under omröring. Å andra sidan lös- tes l,6l g av Z-Asn-OH i 30 ml tetrahydrofuran, och till denna lösning sattes 0,62 ml N-metylmorfolin, var- efter blandningen kyldes till -l5°C. Sedan tillsattes droppvis 0,80 ml isobutylkloroformiat under omröring. 30 s efter tillsättningen av isobutylkloroformiat till- sattes dimetylformamidlösningen av H-Leu-Gln-NHNHBoc, som tidigare framställts, varpå hela blandningen omrör- des vid o°c 1 5 min, därpå vid 4o°c 1 1 min 1 vatten- bad, och vidare vid l5OC i 30 min. Från reaktionsbland- ningen avlägsnades tetrahydrofuran och dimetylformamid genom destillation under reducerat tryck. Den sålunda erhållna återstoden extraherades med etylacetat. Ex- traktet tvättades med ln citronsyra, en mättad vatten- lösning av natriumklorid, en mättad vattenlösning av natriumvätekarbonat och en mättad vattenlösning av na- triumklorid i nämnd ordning, och torkades sedan med vattenfritt natriumsulfat, varpå etylacetatet avlägs- "nades genom destillation. Den erhållna oljiga återsto- den stelnade vid tillsättning av etyleter och àterut- fälldes ur metanol-etylacetat för att ge 2,55 g av den önskade produkten.

I _ R ; 0,63 fII Rf : 0,77 Elementaranalys (för C28H43N709) Beräknat 53,10 % C 6,97 % H 15,77 % N Funnet 53,67 % C 6,63 % H 15,68 % N Qlâlrßïšëlllëšëllfiåêíêlf-šfšëšflëlïê 1,28 g av Z-Thr-OH löstes i 30 ml tetrahydrofu- ran och till denna lösning sattes 0,58 g N-hydroxisuc- cinimid (NHS), varefter blandningen iskyldes, och se- dan tillsattes l,O5 g av N,N-dicyklohexylkarbodiimid (DCC) till blandningen. Hela blandningen omrördes vid 457 352 lO 15 20 25 30 35 38 4°C i 24 h, varefter den bildade fällningen avlägsna- des genom filtrering och filtratet underkastades destil- lation under reducerat tryck. Till den erhållna åter- stoden sattes etyleter och tvättades genom dekantering.

Den erhållna oljiga substansen torkades under reduce- rat tryck i en exsicator för att ge den önskade pro- dukten. 2 lO1b1. Framställning av H-Asn-Leu-Gln-NHNHBOC 2,43 g av Z-Asn-Leu-Gln-NHNHBoc suspenderades i 80 ml metanol och en liten mängd palladiumsvart sat- tes till suspensionen. Suspensionen omrördes i 18 h under införande av vätgas. Efter det att reaktionen var fullbordad avlägsnades katalysatorn genom sugfil- trering, varpå filtratet underkastades destillation under reducerat tryck för att avlägsna lösningsmedlet.

Den erhållna återstoden torkades under reducerat tryck i en exsicator för att ge den önskade produkten. 0,31 f : 0,64 101%- Framställflinš aylïšëš:êâítëêkêlfizlllfiliïëfäš H-Asn-Leu-Gln-NHNHBoc, som erhållits i det ovan angivna steget lO(b), löstes i 30 ml dimetylformamid, och till denna lösning sattes 20 ml dimetylformamid- lösning av Z-Thr-ONHS; som erhållits i det ovan angiv- na steget lO(a), under iskylning, varpå hela blandningen ømrördes vid rumstemperatur i l8 h. Dimetylformamiden avlägsnades genom destillation under reducerat tryck, varpå den erhållna återstoden stelnade vid tillsätt- ning av ln citronsyra och återutfälldes ur metanol-etyl- acetat för att ge 2,12 g av den önskade produkten.

I R : 0,82 fn Rf : 0,79 É Elementaranalys (för C32H5ON8Oll) Beräknat 53,18 % C 6,97 % H l5,50 % N 2 Funnet 52,85 % C 6,95 % H 15,28 % N 5 10 l5 20 25 30 35 457 552, 39 lilëlilëëæëëëllaiestëyl:lfëaêëacêsszêleflïëië2 O,9l g av Z-Thr-Asn-Leu-Gln-NHNHBoc löstes i 8 ml TFA och fick stå vid rumstemperatur i l5 min. 80 ml vattenfri eter sattes till denna lösning och den bil- dade fällningen uppsamlades snabbt genom filtrering, tvättades med vattenfri eter och torkades under redu- cerat tryck i en exsicator, som innehöll kaliumhydroxid- -fosforpentoxid som torkmedel, för att ge den önskade produkten.

Rfï; o, 34 lllëlnïëëmäëëlleiasnëyil:QlQlQEzll:§s§:ësu:ê§9:§§§: :ë!šl29§l:§lB:Q§_ 1,00 g av Boc-Glu(OBzl)-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys(Tos)- -Glu-OH löstes i 8 ml TFA och fick stå vid rumstempera- tur i 15 min. Till denna lösning sattes 80 ml vatten- fri eter och den bildade fällningen uppsamlades snabbt genom filtrering, tvättades med vattenfri eter, tor- kades under reducerat tryck i en exsicator, som inne- höll kaliumhydroxid-fosforpentoxid som torkmedel, för att ge den önskade produkten.

R _ 0,24 fix Rf _ 0,44 àšlêl- Ffamsfiällfliflg ä! Z“TEf-AsffëšëzšškšLEÅQEELL: :§§E:ë§B:êš9:§§E:E¥§lE9§l:§lB:9ä Z-Thr-Asn-Leu-Gln-NHNH2, som erhölls i det ovan angivna steget ll(a), löstes i lO ml dimetylformamid, vidare sattes därtill 0,63 ml 6n klorvätesyra/dioxan, varpå blandningen kyldes till -l5°C. Sedan tillsattes 0,17 ml isoamylnitrit till blandningen under omröring.

Efter det att reaktionsblandningen uppvisade en negativ reaktion i hydrazintest, tillsattes droppvis 0,53 ml trietylamin med 0,40 ml kall dimetylformamidlösning, i små mängder, för att neutralisera reaktionsblandningen.

Denna lösning, som innehöll azidföreningen, sattes till 10 ml av en kall dimetylformamidlösning, som innehöll H-Glu(0Bzl)-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys(Tos)-Glu-OH, vilken erhållits i det ovan angivna steget ll(b), samt 0,24 ml lO 15 20 25 30 35 457 352 40 trietylamin. Hela blandningen fick reagera vid -lO till -l5°C i 2 h och sedan vid 4°C i l8 h under omröring.

Vidare, på samma sätt som i förfarandet i det ovan an- givna steget ll(a), sattes produkten som erhållits genom behandling av 1,16 g Z-Thr-Asn-Leu-Gln-NHNHBoc med TFA, till den ovan angivna reaktionsprodukten och blandningen fick reagera vid samma temperatur i 24 h under omröring.

Dimetylformamid avlägsnades genom destillation under reducerat tryck, varpå den erhållna återstoden extra- herades med n-butanol som mättats med vatten, tvätta- des med vatten som mättats med n-butanol 5 gånger, var- på extraktet underkastades destillation under reducerat tryck. Den erhållna återstoden stelnade vid tillsättning av etyleter, återutfälldes ur metanol-etylacetat, och fällningen tvättades med het metanol för att ge den önskade produkten. lllëlašrëussëllaißa-ëi/Jifšë:êëai-satêlazêlauêsaësu: -Arg-Ser-Ly§1¶os1-Glu-Og Z-Thr-Asn-Leu-Gln-Glu(OBzl)-Ser~Leu-Arg-Ser-Lys- (Tos)-Glu-OH, som erhållits i det ovan angivna steget ll(c), suspenderades i en blandning av 50 ml metanol med 50 ml av 30 % ättiksyra, och små mängder av palla- diumsvart sattes till suspensionen, vilken sedan omrör- des i 18 h under införande av vätgas. Efter det att reaktionen var avslutad avlägsnades katalysatorn genom sugfiltrering och filtratet underkastades destillation under reducerat tryck. Efter det att metanolen full- ständigt avlägsnats genom destillation underkastades den erhållna koncentrerades vätskan gelfiltrering med Sephadex G-25 med användning av 50 % ättiksyra som elue- ringsmedel för uppsamling av den önskade fraktionen för att ge 740 mg av den önskade produkten.

I- 0,11 Rf : '0,35 10 15 20 25 30 35 457 352' 41 Elementaranalys (för C66H99Nl7O23.C2H4O2.2H2O) Beraknat 48,91 % C 7,08 % H 15,64 % N Funnet 48.82 % C 6,63 % H 15,74 % N l2. Framstëllning av H-Thr:g§n:Leu-Gln-Glu-Ser:§§u-Arg: :§s§:å2§:§lE:9ë 51,0 mg av H-Thr-Asn-Leu-Gln-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser- -Lys(Tos)-Glu-OH löstes i flytande ammoniak som tidi- gare torkats med metalliskt natrium, varpå små bitar av metalliskt natrium sattes till lösningen under om- röring tills reaktionsblandningens färg ändrades till blått och kvarhölls i 30 s till l min. Vidare tillsat- tes kristaller av NH4Cl till reaktionsblandningen och ett överskott av metalliskt natrium neutraliserades.

Efter att ammoniaken fullständigt avlägsnats genom de- stillation vid rumstemperatur underkastades reaktions- produkten gelfiltrering med Sephadex G-25-gel med an- vändning av 50 % ättiksyra som elueringsmedel, för upp- samling av den önskade fraktionen, och fraktionen lyofi- liserades genom tillsättning av vatten efter koncen- tration för att ge 32 mg av den önskade produkten (pep- tid enligt föreliggande uppfinning). Härefter kallas denna produkt [Peptid Fl.

Rfï: 0,01 Rfïl: 0,37 Elementaranalys (för C53H93Nl7O2l.C2H4O.3H2ö) Beräknat 46,57 % C 7,32 % H 16,79 % N Funnet 46,10 % C 6,98 % H 16,82 % N lå;-EEÉEÉÉÉlÄEÉE¶_ÉY_ÉIÉÉHI§ÉEIQÉÉ3 1,81 g av H-Ser-OCH3.HCl löstes i 25 ml dimetyl- formamid, varpå l,62 ml trietylamín sattes till lös- ningen och blandningen iskydles till -lOOC. Till den- na blandning sattes 4,21 g av Z-Leu-ONHS under omrö- ring, och reaktionen fick fortgå i 18 h under omröring.

Dimetylformamiden avlägsnades genom destillation, var- på den erhållna återstoden extraherades med etylacetat och etylacetatet tvättades med vatten, torkades med 457 352 10 15 20 25 30 35 42 vattenfritt natriumsulfat, varefter etylacetatet av- lägsnades genom destillation under reducerat tryck.

Den erhållna återstoden stelnade vid tillsättning av etyleter och återutfälldes ur etylacetat-eter för att ge 2,68 g av den önskade produkten.

R I: 0,81 fII Rf : 0,82 Elementaranalys (för Cl8H26N2O6) Beräknat 59,00 % C 7,15 % H 7,65 % N Funnet 58,62 % C 7,03 % H 7,65 % N lg1§1¿_§gamställning av H-Lgg:Ser-OCH3.HCl 4,20 g av Z-Leu-Ser-OCH3 ning av 40 ml metanol med ll,46 ml ln-klorvätesyra, suspenderades i en bland- varpå en liten mängd palladiumsvart sattes till suspen- sionen, vilken sedan omrördes i l8 h under införande av vätgas. Efter det att reaktionen var fullbordad av- lägsnades katalysatorn genom sugfiltrering och filtra- tet underkastades destillation under reducerat tryck.

Vidare sattes till den erhållna återstoden vatten och destillation under reducerat tryck upprepades 3 ggr.

Den sålunda erhållna återstoden torkades under redu- cerat tryck i en exsicator som innehöll fosforpentoxid som torkmedel, för att ge den önskade produkten.

Rfl: 0,38 lg1§l_Framställning_ay Z-Ser-Leu-Ser-Q§§3 3,19 g av Z-Ser-NHNH2 löstes i 25 ml dimetylform- amid och 6,30 ml 6n-klorvätesyra/dioxan sattes till lösningen, vilken kyldes till -l5°C, varpå 1,69 ml iso- amylnitrit tillsattes. Efter det att reaktionsbland~ ningen uppvisade en negativ reaktion i hydrazintestet tillsattes droppvis l,76 ml av en kall dimetylformamid- lösning med 5,29 ml trietylamin i små mängder för att neutralisera reaktionsblandningen. Denna reaktionsbland- ning, som innehöll en azidprodukt, sattes till 20 ml kall dimetylformamidlösning, som innehöll H-Leu-Ser- -OCH3.HCl erhàllen i det ovan angivna steget l4(a), 10 15 20 25 30 35 457 352 43 och 1,60 ml trietylamin. Hela blandningen omrördes vid -io till -1s°c 1 2 h, sedan vid 4°c 1 is h. Dimetyi- formamid avlägsnades genom destillation under reduce- rat tryck och den erhållna återstoden stelnade vid till- sättning av vatten, samt återutfälldes ur metanol-etyl- acetat för att ge 4,11 g av den önskade produkten.

R I: o,16 fII Rf : 0,79 Elementaranalys (för C2lH3lN3O8) Beräknat 55,62 % C 6,89 % H 9,27 % N Funnet 55,48 % C 6,92 % H 9,18 % N ÉâiffåëïlïåÉÉHEÉEELÉY-ÉZÉÉEIÉÉEIÉÉEIIÉÉÜÉ 2,00 g av Z-Ser-Leu-Ser-OCH3 nol, varpå 1,10 ml av 100 % NH NH .H O sattes till lös- 2 2 2 ningen under iskylning, och reaktionsblandningen fick 2 löstes i 40 ml meta- stå vid rumstemperatur i 18 h. Efter det att reaktionen var fullbordad avlägsnades lösningsmedlet genom destil- lation under reducerat tryck, och den erhållna återsto- den stelnade vid tillsättning av eter, varpå ett över- skott av NH2NH2.H20 avlägsnades genom tillsättning av vatten, och sedan återutfälldes ur metanol-etylacetat för erhållande av 1,91 g av den önskade produkten.

R I; 0,43 fII Rf : 0,73 Elementaranalys (för C2OH3lN5O7) _ ' Beräknat 52,97 % C 6,89 % H 15,44 % N Funnet 52,85 % C 6,70 % H 15,44 % N 1§lël=_EEë9§Eël19i§¶_ë¥_ë:§§E:ë§E:§§E:ÉEš:ê§E:E§E:§1E: :§;2:§s§:ës2:êr9:§s§:ë2§lE9§l:§l2:9ë 70,42 mg av Z-Ser-Leu-Ser-NHNH2 löstes i 5 ml di- metylformamid, och till denna lösning sattes 0,78 ml av 10 gånger utspädd dimetylformamidlösning av 6n klor- vätesyra/dioxan, varpå blandningen kyldes till -l5°C och 0,20 ml av en 10 gånger utspädd dimetylformamidlös- ning av isoamylnitrit tillsattes under omröring. Efter det att reaktionsblandningen uppvisade en negativ reak- 10 15 20 25 30 35 457 352 44 tion i hydrazidtest tillsattes droppvis 0,65 ml av lO gånger utspädd dimetylformamidlösning av trietylamin i en liten mängd för att neutralisera reaktionsbland- ningen. Denna reaktionsblandning, som innehöll azid- produkt, sattes till 5 ml av en kall dimetylformamid- lösning, som innehöll l5l mg av H-Thr-Asn-Leu-Gln-Glu- -Ser-Leu-Arg-Ser-Lys(Tos)-Glu-OH och 0,29 ml av 10 gäng- er utspädd dimetylformamidlösning av trietylamin. Hela blandningen omröraes vid -io till -1s°c 1 2 h, och sedan vid 4°C i 4 h. Vidare sattes därtill ll7,36 mg av Z-Ser- -Leu-Ser-NH NH 2 2 Dimetylformamid avlägsnades genom destillation och blandningen fick reagera i 24 h. under reducerat tryck, varpå den erhållna återstoden extraherades med n-butanol som mättats med vatten, var- efter extraktet tvättades lO gånger med vatten som mät- tats med n-butanol och tvättades vidare 5 gånger med 2 % ättiksyra som mättats med n-butanol. Éxtraktet under- kastades destillation under reducerat tryck och till den erhållna återstoden sattes vatten, varpå blandningen underkastades destillation under reducerat tryck. Efter det att n-butanolen avlägsnats fullständigt genom des- -Ktillation lyofiliserades produkten, varpå den lyofili- serade produkten återutfälldes ur etylacetat-eter för att ge den önskade produkten. l§í§l¿_§ram§t§llning_av H-§§r-Leu-Ser-Thr:§sñ-Leu-Gln- :§lE:§§E:åêB:êE9:§§š:EY§:§l2:9§ l5O mg av Z-Ser-Leu-Ser-Thr-Asn-Leu-Gln-Glu-Ser- -Leu-Arg-Ser-Lys(Tos)-Glu-OH löstes i flytande ammo- niak, som tidigare torkats med metalliskt natrium, var- på små bitar av metalliskt natrium sattes till lösningen under omröring, tills reaktionsblandningens färg ändra- des till blått och bibehölls i 30 s till l min. Vidare tillsattes kristaller av NH2Cl till reaktionsblandningen, och ett överskott av metalliskt natrium neutraliserades.

Efter det att ammoniaken fullständigt avlägsnats genom destillation vid rumstemperatur underkastades reaktions- produkten gelfiltrering med Sephadex G-25-gel med använd-- 10 15 20 25 30 35 457 552 45 ning av 50 % ättiksyra som elueringsmedel, varpå den önskade fraktionen uppsamlades och den önskade frak- tionen lyofiliserades genom tillsättning av vatten efter koncentration, för att ge 94 mg av den önskade produk- ten [peptid enligt uppfinningenl. Denna produkt kallas härefter [Peptid G].

R : 0,02 fII Rf : 0,39 Elementaranalys (för C65Hl20N2OO26.C2H4O2.H2O) Beräknat 48,19 % C 7,24 % H 16,78 % N Funnet 47,93 % C 6,93 %iH l6,49 % N lZl§ll_Ešau§Eëll§i§s_ay_ë:E2r:9§a 1,04 g av Z-Tyr~OH löstes i 30 ml tetrahydrofuran och till denna lösning sattes 0,38 9 av N-hydroxisuccin- imid, varpå reaktionsblandningen iskyldes, och 0,68 g dicyklohexylkarbodiimid tillsattes under iskylning.

Hela blandningen omrördes vid 4°C i 18 h. Den bildade fällningen avlägsnades genom sugfiltrering och filtra- tet underkastades destillation under reducerat tryck.

Till den erfiällna återstoden sattes etyleter och petro- leumeter, varpå man dekanterade och torkade för att erhålla den önskade produkten. lZ1§l¿_Framställnigg_av HfSer:Qgu-Ser:Q§§3 l,OO g av Z-Ser-Lèu*%er-OCH3, som erhållits i det ovan angivna steget_l4(b), suspenderades i 20 ml meta- nol med 20 ml av lO %-ig ättiksyra, varpå en liten mängd palladiumsvart sattes till suspensionen. Suspensionen omrördes i l4 h under införanden av vätgas. Efter det att reaktionen var fullbordad avlägsnades katalysatorn genom sugfiltrering, varpå filtratet underkastades des- tillation under reducerat tryck. Sedan sattes vatten till återstoden och man lyofiliserade för att erhålla den önskade produkten.

I 0,35 R : RfII! 0,65 10 15 20 25 30 35 457 352 46 }71c¿. Framställning_ay Z-Tyr-Ser-Leu-Ser-OCH3 H-Ser-Leu-Ser-OCH3, som erhållits i det ovan an- givna steget l7(b), löstes i lO ml dimetylformamid och 0,31 ml trietylamin tillsattes under iskylning. Till denna blandning sattes en kall dimetylformamidlösning av Z-Tyr-OSu, som erhållits i det ovan angivna steget l7(a), under omröring. Hela blandningen omrördes vid rumstemperatur i 18 h, varpå dimetylformamiden avlägs- nades genom destillation under reducerat tryck. Åter- stoden stelnade vid tillsättning av vatten och återut- fälldes ur metanol-eter, därpå ur metanol-etylacetat, för att ge 1,08 g av den önskade produkten.

R I; 0,78 R : 0,82 Elementaranalys (för C3OH4ON4Clo) Beräknat 58,43 % C 6,54 % H 9,09 % N Funnet 58,14 % C 6,58 % H 9,16 % N l7Ådl- Framställninï av ZIÉYEI§ÉšIÉÉEI§ÉšIɧ§É2 1,00 g av Z-Tyr-Ser-Leu-Ser-OCH3 löstes i metanol, varpå under iskylning 0,82 ml av lOO % NH2NH2.H2O till- -sattes och blandningen fick stå vid rumstemperatur if 18 h. Metanolen avlägsnades genom destillation under reducerat tryck och återstoden stelnade vid tillsätt- ning av etyleter. Sedan tvättades med vatten för avlägs- ning av överskott Nfi NH .H O samt àterutfälldes ur meta- 2 2 2 nol-eter, och tvättades med het metanol för att ge 0,81 g av den önskade produkten.

R : 0,45 R : 0,76 Elementaranalys (för C29H4ON6O9) Beraknat 56,48 % C 6,54 % H 13,63 % N Funnet 56,l2 % C 6,57 % H 13,58 % N ÉÉÅÉÄ;_ɚ붧ÉÉÄÃBÉEH-šY_ÉIÉYÉIÉÉÉZÉÉEZÉÉEIÉÉEIÉÉEIÉÉEI :§;§:§lu:§§r:ë§2:êä9:§s;:E2§lE9§l:§l9:9ë 42,3 mg av Z-Tyr-Ser-Leu-Ser-NHNH2 löstes i 4 ml dimetylformamid, varpå 0,34 ml av lO gånger utspädd v» 10 15 20 25 30 35 457 552 47 dimetylformamidlösning av 6n klorvätesyra/dioxan till- sattes och blandningen kyldes till -l5°C. Sedan till- sattes 0,09 ml av 10 gånger utspädd dimetylformamidlös- ning av isoamylnitrit under omröring. Efter det att reaktionsblandningen uppvisade en negativ reaktion vid hydrazintest tillsattes droppvis 0,29 ml av lO gånger utspädd dimetylformamidlösning av trietylamin i små mängder för att neutralisera reaktionsblandningen. Reak- tionsblandningen som innehöll azidprodukt sattes till 4 ml av en kall dimetylformamidlösning, som innehöll 50,0 mg av H-Thr-Asn-Leu-Gln-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys- (Tos)-Glu-OH och O,lO ml av 10 gånger utspädd dimetyl- formamidlösning av trietylamin. Hela blandningen omrör- des vid -io till -1s°c 1 2 n och därpå vid 4°c 1 la n.

Sedan tillsattes en produkt som omvandlades, 42,3 mg av Z-Tyr-Ser-Leu-Ser-NHNH till azid, och fick reage- 2! ra i 24 h. Dimetylformamiden avlägsnades genom destil- lation under reducerat tryck, varpå den erhållna åter- stoden extraherades med 30 ml av n-butanol som mättats med vatten, och extraktet tvättades 10 gånger med vat- _ten som mättats med n-butanol och tvättades därpå Si gånger med 2 % ättiksyra som mättats med n-butanol.

De organiska skikten uppsamlades och underkastades destil- lation under reducerat tryck för att avlägsna n-butanol. Återstoden lyofiliserades, och återutfälldes'med etyl- acetat-eter för att ge den önskade produkten. lêlëli-EEêwëEëllêiE¶-ë!_ë:ÉYš:§§E:ë§E:§§š:ï§E:ê§E:E§B: :§l9:§lE:§§š:E§B:êE¶:§§E:E¥§:§šE:9ë Z-Tyr-Ser-Leu-Ser-Thr-Asn-Leu-Gln-Glu-Ser-Leu-Arg- -Ser-Lys(Tos)-Glu-OH löstes i flytande ammoniak som tidigare torkats med metalliskt natrium, varpå små bitar av metalliskt natrium sattes till lösningen under om- röring tills reaktionsblandningens färg ändrades till blått och bibehölls i 30 s till l min. Vidare tillsat- tes kristaller av NH4Cl till reaktionsblandningen för 457 352 10 15 20 25- 30 35 48 att neutralisera ett överskott av metalliskt natrium, och efter det att ammoniaken fullständigt avlägsnats genom destillation vid rumstemperatur underkastades reaktionsprodukten gelfiltrering.med Sephadex G-25-gel med användning av 50 % ättiksyra som elueringsmedel för att ge 33 mg av den önskade produkten. Denna produkt kallas härefter [Peptid HJ.

R I: 0,02 fII Rf : 0,35 Elementaranalys (för C74Hl23N2lO28.C2H402_4H20) Beräknat 47,71 % C 7,30 % H 15,79 % N Funnet 47,32 % C 7,24 % H 15,82 % N [Framställning av märkta peptider] âšëmeëëlleiesësëefßesLëiuæëelsë-Eseëiêizl H-Tyr-Ser-Leu-Ser-Thr-Asn-Leu-Gln-Glu-Ser-Leu-Arg- -Ser-Lys-Glu-OH, dvs Peptid H, märktes genom en metod med användning av Kloramin-T enligt följande.

Till 20 ul av 0,5 M-fosfatbuffertlösning (pH 7,0), som innehöll 5 ug av den ovannämnda peptiden [Peptid H1, sattes 0,5 M-fosfatbuffertlösning, som innehöll 1 uCi av Na [1251] (bärarfri N.E.N.), varpå 20 ul av 0,5 M-fos- fatbuffertlösning, som innehöll 70 mg/ml av.Kloramin-T tillsattes. Blandningen omrördes vid rumstemperatur i73O s, varpå reaktionen avslutades genom tillsättning av 50 nl av 0,5 M-fosfatbuffertlösning, som innehöll 60 mg/ml av natriummetabisulfit (Na2S2O5). Sedan sattes till denna reaktionsblandning 100 ul av kall l % natrium- jodid-vattenlösning, varpå reaktionsblandningen behand- lades med användning av Sephadex G-25-kolonn (l,Ox3O cm) (elueringsmedel: 0,05 M-fosfatbuffertlösning, pH 7,4, som innehöll 0,25 % av BSA, 10 mM av EDTA och 0,02 % Sålunda erhölls en peptid H som märkt med av NaN3). 125 H .

I-markt Peptid H1. l25I. Härefter kallas denna produkt [ 10 15 20 25 30 35 457 352 49 Éšëfllššëššêißfiššëêflïlšêl-ÉLEÉEÉLLBÉPEÉÉwÉÉIÉ Till 20 ul av 0,5 M-fosfatbuffertlösning (pH 7,0), som innehöll 5 ng av Peptid H, sattes 0,5 M-fosfatbuf- fertlösning, som innehöll l uCi av Na [1251] (bärarfri N.E.N.), varpå 20 ul av 0,5 M-fosfatbuffertlösning, som innehöll 70 mg/ml av Kloramin-T, tillsattes. Bland- ningen omrördes vid rumstemperatur i 30 s, varefter reaktionen avslutades genom tillsättning av 50 ul av 0,5 M-fosfatbuffertlösning, som innehöll 60 mg/ml av natriummetabisulfit (Na2S2O5). Sedan sattes till denna reaktionsblandning 100 ul av kall l % natriumjodid-vat- tenlösning, varpå blandningen behandlades med användning av Sephadex G-25-kolonn (l,0x3O cm) 0,05 M-fosfatbuffertlösning, pH 7,4, som innehöll 0,25 % av BSA, l0 mM av EDTA och 0,02 % av NaN3). Sålunda er- (elueringsmedel: hölls 1251~märkt Peptia H.

Esënställniflaseëemøel_ë!_märk2_E§2:ië_:â (l) l mg av Peptid G löstes i l ml av 0,2 M-natrium- bikarbonat-buffertlösning (pH = 9,5). Sedan tillsattes l mg FITC och blandningen fick reagera vid 2500 i l h.

~ Efter det att reaktionen var avslutad underkastades reaktionsblandningen silikagel-TLC (elueringsmedel=buta- nol:ättiksyra:vatten=4:l:5) för att rena produkten, och 0,1 mg av FITC-märkt peptid erhölls. Härefter kalf las denna produkt IFITC-märkt Peptid G1.

I R ; 0,13 fII Rf : 0,49 (2) l mg av Peptid G löstes i l ml av 0,2 M natrium- bikarbonat-buffertlösning (pH = 9,5). Sedan tillsattes l mg diklorotriazinfluorescein, varpå reaktionen utför- des vid 25°C i l h. Sedan underkastades rcaktionsbland- ningen silikagel-TLC (elueringsmedel=butanol:ättiksy- ra:vatten=4:l:5). Sålunda erhölls 0,1 mg av en renad produkt av DTAF-märkt peptid. Denna produkt kallas här- efter DTAF-märkt Peptid G3.

I Rf . 0,12 457 352 10 15 20 25 30 35 50 [Framställning av antigen] §šêE§ÉëlåEÅB¶§ÉëÉEEÉ}Jt Símg av Peptid-E, som framställdes i Framställnings- eXemPel B'7 (C) i Syntes av peptid, och 15 mg av BSA löstes i 2 ml av 0,1 M ammoniumacetatbuffertlösning (pH 7,0). Till denna lösning sattes O,ll ml av 0,1 M glutaraldehydlösning, och blandningen omrördes vid rums- temperatur i 5 h. Sedan dialyserades denna reaktions- blandning med l liter vatten vid 4°C i 48 h. Under dia- lysen byttes vatten 5 ggr. Den dialyserade lösningen, som innehöll peptid-proteinsammansättning, lyofilise- rades för att ge l5 mg av humaninterferon-u-antigen (härefter kallas denna produkt [Antigen-a-C-IJ).

Detta Antigen-u-C-I är ett antigen i vilket i ge- nomsnitt lO moler av Peptid E är kombinerade med l mol BSA.

Sammansättningsförhàllandet av Peptid E till BSA i Antigen-a-C-I beräknades enligt följande, dvs efter fastställande av frånvaro av antingen oreagerad BSA eller oreagerad Peptid E i Antigen-u-C-I genbm ytter- ligare gelfiltrering med användning av Sephadex G-50 (elueringsmedel; fysiologisk saltlösning, bestämning; OD 280 nm; elueringshastighet: 3 ml/h; separeringsmängd: l ml vardera), och sedan separerades och bestämdes mäng- den av en fraktion av Peptid E som kombinerats med BSA (en peptid-proteinsammansättning), respektive en frak- tion av en annan produkt (en dimer av Peptid-E), var- efter en kalibreringskurva av standardkoncentrationen av nämnda dimer av Peptid-E framställdes i avsikt att bestämma mängden av dimeren, varefter mängden av dimeren subtraherades från mängden av Peptid E, vilken användes som utgàngsmaterial, och det subtraherade värdet av mängden av Peptid E anses vara all den mängd av Peptid E som kombinerats med BSA. 10 15 20 25 30 35 457 352 51 Sammansättningsförhàllandet av en syntetisk pep- tid till BSA beräknades på liknande sätt för var och en av de erhållna antigenerna i respektive Framställ- ningsexempel enligt föreliggande uppfinning. ÉE궧Éë}šEiE¶§É§ÉEE§l_ê 5 mg av Peptid F, som framställdes i Framställ- ningsexempel B-12 i syntesen av peptid, och 5 mg av BSA löstes i 2 ml av 0,1 M ammoniumacetatbuffertlös- ning (pH 7,0). Till denna lösning sattes O,ll ml av O,l M glutaraldehydlösning, och blandningen omrördes vid rumstemperatur i 5 h. Sedan dialyserades denna bland- ning med 1 liter vatten vid 4°c 1 48 n. under aialysen byttes vatten 5 gånger. Den dialyserade lösningen, som innehöll peptid-proteinsammansättning, lyofiliserades för att ge 9 mg av humaninterferon-a-antigen. Härefter kallas denna produkt [Antigen-u-C-II].

Detta Antigen-Q-II är ett antigen i vilket i genom- snitt 9 moler av Peptid F är kombinerade med l mol BSA. 5 mg av Peptid G, som framställdes i Framställnings- ÉE⶧ÉÉll§ÉE9§ÉëÉEEÉl_3 *exempel B-16 (b) i syntes av peptid, och 25 mg av BSA löstes i 4 ml vatten. Till denna lösning sattes 200 mg av dicyklohexylkarbodiimid (DCC), och blandningen om- rördes vid rumstemperatur i 5 h. Sedan dialyserades denna reaktionsblandning med 2 liter vattenvvid 4OC i 48 h. Under dialysen byttes vatten 5 gånger. Den dia- lyserade lösningen, som innehöll peptid-proteinsamman- sättning, lyofiliserades för att ge 28 mg av humanin- terferon-a-antigen (härefter kallas denna produkt [Anti- gen-u-C-III]).

- Det erhållna Antigenet-u-C-III är ett antigen i vilket i genomsnitt l2 moler av Peptid G är kombinera- de med l mol BSA.

Ešëa§§ëllni99§s§sa2sl_â_ 4 mg av Peptid H som framställdes i Framställnings- exempel B-l8 (b) i syntes av peptid, och 20 mg av BSA 457 552 10 15 20 25 30 35 52 löstes i 0,1 M ammoniumacetatbuffertlösning (pH 7,0)- Till denna lösning sattes O,ll ml av 0,1 M-glutaralde- hydlösning, och blandningen omrördes vid rumstempera- tur i 5 h. Denna reaktionsblandning dialyserades med l liter vatten vid 4°C i 48 h. Under dialysen byttes vatten 5 gånger. Den dialyserade lösningen, som inne- höll peptid-proteinsammansättning, lyofiliserades för erhållande av 20 mg av humaninterferon-Q-antigen (här- efter kallas denna produkt [Antigen-a-C-IVJ).

Antigen-a-C-IV är ett antigen i vilket i genom- snitt 9 moler av Peptid H är kombinerade med l mol BSA.

Framstëllningsexempel jL 4 mg av Peptid G, som framställdes i Framställnings- exempel B-16 (b) i syntes av peptid, och 20 mg av BSA löstes i 0,1 M ammoniumacetatbuffertlösning (pH 7,0).

Iill denna lösning sattes O,ll ml av O,l M glutaralde- hydlösning, och blandningen omrördes vid rumstemperatur i 5 h. Denna reaktionsblandning dialyserades med l liter vatten vid 4OC i 48 h. Under dialysen byttes vatten 5 ggr. Den dialyserade lösningen, som innehöll peptid- -proteinsammansättning, lyofiliserades för att ge 21 mg av humaninterferon-u-antigen (härefter kallas denna produkt íAntigen-u-C-V]). f Det erhållna Antigen-a-C-V är ett antigen i vilket i genomsnitt 8 moler av Peptid G är kombinerade med l mol av BSA.

[Framställning av antikropp] ÉšêE§ÉëlÄEÉE¶§É§ÉEPÉš_š- 100 ng av Antigen-a-C-III, som erhållits i Fram- ställningsexempel 3 i framställning av antigen, löstes i 1,5 ml fysiologisk saltlösning, varpå till denna lös- ning sattes 1,5 ml av ett fullständigt Freund's hjälp- 10 15 20 25 30 35 457 352 53 medel för framställning av en suspension. Denna suspen- sion administrerades subkutant åt var och en av 7 kani- ner (som var och en hade en kroppsvikt av 2,5 till 3,0 kg), och samma mängd av suspensionen administrerades åt samma kaniner varannan vecka 6 gånger. Därtill admini- strerades ytterligare samma mängd av suspensionen åt samma kaniner varje månad 3 gånger. 7 dygn efter den sista administreringen av suspensionen uttogs blodet ur kaninerna. Blodet underkastades centrifugalseparation för erhållande av serumet, vilket innehöll humaninter- feron-u-antikropp (härefter anges denna produkt som [Antikropp-o-C-IIIJ). Éëâßëšëålêíë9§êë§EB§l_2:É__ Med användning av Antigen-u-C-I, Antigen-a-C-II, och Antigen-u-C-IV, vilka erhållits i Framställnings- exemplen 1, 2 resp 4 i framställning av antigen, och genom ett förfarande som var lika det som beskrivits i det ovan angivna Framställningsexemplet 1 i fram- ställning av antikropp, erhölls sera, som vart och ett innehöll respektive humaninterferon-a-antikropp (här- efter anges dessa produkter som [Antikropp-0~C~I1, [An- tikropp-a-C-II] resp [Antikropp-a-C-IVJ). ÉšëE§Éëš}EÉE¶§ÉëɶEÉl__§ 30 ng av Antigen-h-C-III, som erhölls i Framställ- ningsexempel 3 i framställning av antigen, löstes i 1,5 ml fysiologisk saltlösning, varpå till denna lös- ning sattes l,5 ml av ett fullständigt Freund's hjälp- medel för framställning av en suspension. Denna suspen- sion administrerades subkutant åt en kanin (som hade en kroppsvikt av 2,7 kg), och samma mängd av suspen- sionen administrerades åt kaninen varannan vecka 5 gånger.

Vidare administrerades ytterligare samma mängd av suspen- àt samma kanin med 3 veckors mellanrum 5 gånger. efter den sista administreringen av suspensionen sionen 7 dygn uttogs och blodet underkastades en blodet ur kaninen, centrifugalseparation för erhållande av serumet, vilket 457 352 lO l5 20 25 30 54 innehöll humaninterferon-u-antikropp (härefter kallas denna produkt [Antikropp-u-C-V1).

Framställningsexempel 6 Med användning av 60 ug av Antigen-u-C-III, som erhölls i Framställningsexempel3 i framställning av antigen, och genom ett förfarande som var lika det som beskrevs i det ovan angivna Framställningsexemplet 5, i framställning av antikroppar, erhölls serumet, som innehöll humaninterferon-u-antikropp (härefter kallas denna produkt [Antikropp-u~C-VI]). fljšëfßëtëllaiesësësassl__l Med användning av 30 ng av Antigen-n~C-V, som er- hölls i Framställningsexempel l i framställning av antigen, och genom ett förfarande som var lika det som beskrevs i det ovan angivna Framställningsexemplet 5, i framställning av antikroppar, samt med användning av 2 kaniner (som hade en kroppsvikt av 2,5 till 3,0 kg) erhölls serumet vilket innehöll humaninterferon-u- -antikropp (härefter kallas denna produkt [Antikropp- -u-c-VIIIJ) .

Framställningsexempel 8 Med användning av 60 ng av Antigen-u-C-V, som er- hölls i Framställningsexempel l i framställning av antigen, och genom ett förfarande som var lika det som beskrevs i det ovan angivna Framställningsexemplet S, i framställning av antikroppar, immuniserades 5 kaniner (som var och en hade en kroppsvikt av 2,5 till 3,0 kg) och blodet som uttogs ur kaninerna underkastades en centrifugalseparation för erhållande av serat, som vart och ett innehöll resp interferon-u-antikropp (härefter anges resp produkt som [Antikropp-d-C-IX], [Antikropp- -u-C-X1, [Antikropp-u-C-XI), [Antikropp-a-C-XII], och [Antikropp-u-C-XIII). rv 10 15 20 25 30 35 457 352 55 Analys av titern av antikroppar Titern av Antikropp-a-C-I - Antikropp-a-C-XIII analyserades pà följande sätt: Varje antikropp späddes med fysiologisk saltlösning för preparering av serier av utspädda prover därav, med 1o, 1ø2, 1o3, 104, 105 koncentration (begynnelsekoncentration). Till 100 nl , ......-faldig utspädnings- av var och en av dessa utspädda prover sattes 0,1 ml av en utspädd lösning av l25I-märkt Peptid H [som er- hållits i Framställningsexempel av märkt peptid -2-l, som ovan nämnts, och späddes för framställning av en utspädd lösning med ca 9500 cpm radioaktivtet och 0,2 ml av 0,05 M~fosfatbuffertlösning (pH = 7,4) höll 0,25 % BSA, 10 nM-EDTA och 0,02 % NaN3], varpå aenna 1ösning inkuberades vid 4°c 1 24 h. men resu1te~ 125 I [som inne- rande produkten av antikroppen kombinerad med -märkt Peptid H, som bildats i den inkuberade lösningen, iso- lerades från den oreagerade (icke kombinerade) l25I- -märkta peptiden H genom en dextranaktiverad kolmetod och en centrifugalseparationsmetod (vid 400 i 30 min: 3000 r/min).

Kombinationsförhàllandet (%) av antikroppen till I-märkt Peptid H i den resulterande produkten bestäm- des genom räkning av radioaktivitet hos varje prov i serien av utspädda_koncentrati0ner. Data för kombina-I tionsförhållandet (%) som erhållits fràn respektive prover i serierna av utspädda koncentrationer plotta- 125 des på ett diagram, i vilket ordinatan visar kombina- tionsförhållandet (%) av antikroppen till 1251-märkt Peptid H, medan abskissan visar den utspädda koncen- trationen av antikroppen (begynnelsekoncentration).

Från det plottade diagrammet erhölls en utspädd koncen- tration av antikroppen som uppvisade 50 % av kombina- tionsförhàllandet, vilket är titern av antikroppen.

Resultaten visas i tabell 1. 457 352 10 15 20 25 30 _35 56 g§BELL 1 Antikropp Titer Antikropp Titer a-C-I 2 500 u-C-VIII l 200 0-C-II 4 200 0-C-IX 6 000 a-C-III 50 OOO Q-C-X l 100 u-C-IV l 200 u-C-XI 2 200 a-C-V 10 400 m-C-XII 3 600 a-C-VI 2 600 u-C-XIII l 000 u~C-VII 400000 Såsom framgår av resultaten som visas i tabell 1 har den C-terminala peptiden av humaninterferon-Q, som representeras av den allmänna formeln (2) och derivat därav, stark antigenicitet jämfört med den hos andra peptider. Exempelvis kan man se från titern av Anti- kropp-a-C-IX - Antikropp-u-C-XIII att de användbara antikropparna kan produceras i de flesta djur som man administrerat antigenet ät.

Test av specificitet hos Antikropp-u-C-III för human- 1-interferoh-u, ~ (a) Vid utförande av specificitetstestet användes följande material såsom prover som skulle testas: (1) Humaninterferon-ß (framställt av Tokyo Metro- politan Institute of Medical Science, specifik aktivi- tet: 3 x 106 U/mg av protein), i olika koncentrationer. (2) Peptid G, som erhållits i Framställningsexempel B-l6 (b) i syntes av peptid, dvs en peptidkedja av human- interferon-a. (3) Human interferon-u (lymfoblastoídinterferon, framställt av Hayashibara Biochemibal Research Labora- tory). _ Å andra sidan användes som standardspädmedel 0,05 M-fosfatbuffertlösning (pH = 7,4), som innehöll 0,25 % BSA, 5 mm EDTA och o,o2 % NaN3. w 10 15 20 25 30 35 457 352 57 Till varje teströr sattes 0,2 ml av standardspäd- medlet, 0,1 ml av provet som skulle testas, 0,1 ml av Antikropp-a-C~III, som erhållits i Framställningsexem- ”SI-märkt pel 1 iframställning av antikropp och 0,1 ml av Peptid H [som erhållits i Framställningsexempel av märkt peptid-2-l, som ovan nämnts, och som utspätts för fram- ställning av en utspädd lösning med ca 2800 cpm av radio- aktivitetj. Vart och ett av teströren, som innehöll den ovannämnda blandningen, inknberadee vid 4°c i 72 n, varpå 0,1 ml av normalt grisserum sattes till den inku- berade blandningen. Därefter tillsattes 0,5 ml av en suspension av aktivt kol som överdragits med dextran, och hela blandningen fick sta vid 4°c i 30 min sedan underkastades hela blandningen en centrifugalseparation vid 4oC i 30 min och vid 3000 r/min för isolering av den resulterande produkten av antikroppen kombinerad 1251-märkt peptid från den oreagerade (icke kom- 1251 med binerade) -märkta peptiden.

Radioaktivteten hos varje peptid mättes. Bindnings- förhållandet (%) av 1251 vid varje koncentration och utspädning bestämdes genom att bindningsförhàllandet (Bo) som motsvarade titern av använd antikropp togs som lO0 %.

Såsom framgår av de erhållna resultaten från detta -märkt peptid och varje prov test är reaktiviteten hos Antikropp-u-C-III'för human- interferon-u klart olika reaktiviteten hos Antikropp-a- -C-III för humaninterferon-ß, vilket betyder att Anti- kropp-a-C-III är en antikropp med hög specificitet med låg sammanpassningsegenskap i förhållande till human- interferon-B.

, Därtill utfördes liknande test på specificiteter hos Antikropp-d-C-I, Antikropp-C-II, Antikropp-C-IV - Antikropp-C-VII och Antikropp-u-C-IX - Antikropp-a- -C-XIII, och det bekräftades att dessa antikroppar har höga specificiteter för humaninterferon-u. (b) Liknande test utfördes pà Antikropp-a-C-VIII, som i det ovannämnda testet (a). Resultaten visas i 457 352 10 15 20 25 58 fig l, där ordinatan visar relativa bindningsprocen- ten [(%) = B/BO x lOO], medan abskissan visar koncen- trationen av proverna som skulle testas (Peptid G, som erhållits i Framställningsexempel B-l6 (b) i syntes av peptid, dvs en peptidkedja av humaninterferon-a, humaninterferon-a [lymfoblastoidinterferon, framställt av Hayashibara Biochemical Research Laboratory, och leukocytinterferon erhålles från National Institute of Health] samt humaninterferon-ß (specifik aktivitet: 3 x 106 U/mg av protein, framställt av Tokyo Metropo- litan Institute of Medical Science). I fig 1 är kurva (a) Peptid G, är kurva (b) humaninterferon-Q (framställt av Hayashibara Biochemical Research Laboratory), är kurva (c) humaninterferon-u (erhållet från National Institute of Health) och är kurva (d) humaninterferon-ß (framställt av Tokyo Metropolitan Institute of Medical _ Science). Såsom framgår av de i fig 1 visade kurvorna är reaktiviteten hos Antikropp-u-C-VIII för humaninter- feron-a klart olika reaktiviteten hos Antikropp-u-C-VIII för humaninterferon-ß, vilket betyder att Antikropp-a- -C-VIII är en antikropp med hög specificitet och den sammanfaller inte med humaninterferonlß förrän vid en koncentration av 1,0 x 106 U/ml. 10 15 2o_ 25 30 35 457 552 59 Analys av humaninterferon-n genom fluorescenspolari- sationsimmunoanalzs iêl_ÉEë@§ÉÉll9ÉE9_ê!_ÉlE9E9Eš9EÉëšKÉ_EÉEÉš§lë§EÉE9 DTAF-märkt Peptid G (erhållen i Framställnings- exempel av märkt peptid-5 (2)] löstes i 0,1 M natrium- fosfatbuffertlösning (pH = 7) [som innehöll 0,9 vikt/vol% av NaCl och 0,05 vikt/vol% av BSA] för framställning 9 M DTAF- av en lösning med en koncentration av 1,5 x lO -märkt Peptid G (härefter kallas denna lösning [Lös- ning A']). lël_ïëëf_fetëlla_ias_az-ålsetekzemæëälsizesetiëïsâsšsnë: lë§ElE9_ɧä_PliD§É§§É_ En lösning med samma sammansättning som i Lösning-A', med undantag för att den inte innehöll DTAF-märkt Peptid G framställdes (härefter kallas denna lösning [Lösning -B']). lsl_šäëf_fflsi=ëlla_ins_ëy_ëeëiëëeseëlëäaißs Antikropp-u-C-VIII (titer = l200) [erhàllen i Fram- ställningsexempel - 7 i framställning av antikropp] späddes 40-faldigt med fysiologisk saltlösning (härefter kallas denna lösning [Lösning-C']). g lëlljšëfßëëëllaiaa-ëyßëëeëslaliasfëlëëßins En utspädningslösning (pH = 7,0), som innehöll 9,89 g/liter av H3B03; 4,32 g/liter av Na2B4O7.lOH2O,. 9 g/liter av NaCl, 0,005 vikt/vol% av NaN3 och 0,01 vikt/vol% av BSA, framställdes. (Härefter kallas denna lösning [Lösning-D']). lêl-Esëaëšëllsiastëy-s§_§sz;s_§y_2§§2ëꧧ_lëënèasë: (l) Peptid G [erhållen i Framställningsexempel B-l6(b) i framställning av peptid] löstes i 0,1 M na- triumfosfatbuffertlösning (pH = 6,5), som innehöll 0,9 Vint/vol% av NaCl och 0,05 vikt/vol% av BSA, för fram- 457 552 lO 15 - 20 25 30 35 60 ställning av en lösning med en koncentration av 5 u9/liter av Peptid G. Sedan späddes denna lösning med Lösning-D' för framställning av en serie av utspädda lösningar med koncentrationer av 200, 66,7, 22,2, 7,4, 2,5, 0,8 och 0 nM av Peptid G. (2) Med användning av humaninterferon-a (Cantell) och ett förfarande som var lika det som beskrivits i (1) ovan, framställdes en serie av utspädda lösningar av humaninterferon-d. Koncentrationerna av en serie 5, 3,2 x 106, av utspädda lösningar är 6,4 x 10 0,1 x 106, 1,6 x 106, 0,8 x 106, 0,4 x 106, 0,2 x 106, 0,05 x 106 och 0 U/ml av humaninterferon-u. 1fl_§estämning av polarisationsgra§_í§:y§rd§l Till 0,1 ml av var och en av de utspädda lösningar- na som framställts i fe)-(l), sattes 0,2 ml av Lösning-A' och 0,2 ml av Lösning-C' för framställning av en prov- lösning av Peptid G.

På samma sätt framställdes en referensprovlösning av Peptid G med användning av 0,1 ml av Lösning~B' istäl- let för Lösning-A'.

På samma sätt som ovan framställdes en serie av utspädda provlösningar av humaninterferon-u och en serie av utspädda referensprovlösningar därav från serier- na av utspädda lösningar som beskrivits i (e)-2.

Vidare framställdes en provlösning av antikropp för blindtest genom blandning av 0,2 ml av Lösning-A' med 0,3 ml av Lösning-D', och en referensprovlösning av antikropp för blindtest framställdes genom bland- ning av 0,2 ml av Lösning-B' med 0,3 ml av Lösning-D'.

Var och en av dessa provlösningar och referensprov- lösningar inkuberades vid 4°C i 12 h, varpå det pola- riserade ljuset i fluorescensen bestämdes medelst en apparat för mätning av fluorescenspolarisationsintensi- tet. Polarisationsgraden (P-värde) för var och en av serierna av utspädda provlösningar beräknades med hjälp av följande formel: 10 15 207" 25 30 35 457 352 61 P (Ivs " IvR) ° (Ins ' IHR) = x lOO (%) (Ivs ' IvR) + (las ' IHR) [där IVS: styrkan av vertikalpolariserad fluorescens av provet IHS: styrkan av horisontalpolariserad fluorescens av provet IVR: styrkan av vertikalpoleriserad fluorescens av re- ferensprovet IHR: styrkan av horisontalpolaríserad fluorescens av referensprovetl.

Resultaten visas i fig 7, där den relativa bind- ningsprocenten [B/Bo (%)] beräknats från följande for- mel x 100 (%) [där P: polarisationsgrad för provet P - polarisationsgrad för provet med noll koncentra- tion P : polarisationsgrad erhàllen fràn provlösningen av antikropp för blindtest] Från fig 2 framgår att koncentrationen som mot- svarar 5O %-värdet av B/BO är 36 nM i Peptid G och lika som i det ovan angivna förfarandet erhölls koncentra- tionen, som motsvarade 50 %-värde av B/B som o! 1,0 x 107 U/ml. Sedan erhölls förhållandet av dessa 457 352 10 15 20 25 30 35 62 värden, dvs 2,78 x 105 U/ml/nM, som sammanpassnings- förhållandet.

På samma sätt bestämdes P-värdet och B/BO-värdet för provlösningen av humaninterferon-a av okänd kon- centration, och potensen analyserades från fig 2.

[Framställning av immobiliserade antikroppar] Framställningsexempel 1 (a) 1,0 ml av Antikropp-0-C-VIII (erhållen i Fram- ställningsexempel' 7 i framställning av antikropp) lös- tes i 2,0 ml destillerat vatten, varefter 3 ml av en mättad ammoniumsulfat-vattenlösning tillsattes och den resulterande blandningen fick stå vid 4°c 1 3 h. Till denna blandning sattes sedan 3 ml destillerat vatten, varpå den fick stå vid 4OC i 3 h. Den resulterande bland- ningen underkastades en centrifugalseparation (3500 r/min), vid 4oC i 15 min, varpå den erhållna fällningen löstes i destillerat vatten för att ge 10 ml av anti- kropp-vattenlösningen (ODZBO = 1,526). Därefter dialy- serades lösningen av antikroppen med destillerat vatten 3 gånger, och dialyserades vidare med O,1M-natriumbi- karbonat-vattenlösning (pH = 8,4), som innehöll 0,5 M- -natriumklorid, för erhållande av 10 ml av antikropp- -vattenlösningen (ODZSO = 0,511). ' (b) 1 g av torr cyanbromid-aktiverad Sepharos 4B tvättades med 200 ml av lmM-klorvätesyra, och till denna tvättade Sepharos 4B sattes 30 ml av O,l M natriumbikar- bonat-vattenlösning, som innehöll 0,5 M natriumklorid, och 7 ml av den ovannämnda dialyserade antikroppslös- ningen, varpå den resulterande blandningen inkuberades vid rumstemperatur i 2 h. Efter inkubationen filtrerades blandningen genom ett glasfilter, varpå den erhållna gelen löstes i 40 ml av lM monoetanolamin-Cl (pH = 3,35), 10 15 20 25 30 35 457 352 63 och inkuberades vid rumstemperatur i 2 h. Denna lösning tvättades cirkulerande med 0,1 M-acetatbuffertlösning (pH = 4,0), som innehöll 0,5 M-natriumklorid, och tvättades vidare med 0,lM boratbuffertlösning, som innehöll 0,5 M natriumklorid. Genom suspendering i en fysiologisk saltlösning erhölls en adsorberad produkt av humaninterferon-a-antikropp som immobiliserats pá Sepharos 4B. Från det faktum att 35 ml av filtratet, som erhållits från filtreringen av den adsorberade produkten genom ett glasfilter, uppvisade 0D28O = 0,004, fastställdes att det mesta av antikroppen hade immobilíserats pà Sepharos 4B. äsafßsëëllaiasëszfemesLš (a) Med användning av Antikropp-u-C-I - -Antikropp- -u-C-VII och Antikropp-o-C-IX - Antikropp-u-C-XIII (erhållna i Framställningsexemplen l-8 i framställning av antikropp) istället för Antikropp-u-C-VIII, som användes i det ovan angivna Framställningsexemplet 1, erhölls följande respektive antikropp-vattenlösningar: Antikropp-vatten- Använd anti- OD280 lösning kropp J ~ a-c-III 1,511 K a-C-I 1,502 L a-C-II l,5l2 M Q-C-IV 1,506 N a-C-V 1,513 O u-C-VI 1,507 P u-c-VII 1,513 Q a-C-IX 1,502 ' R a-c-x 1,501 S u-C-XI l,509 T u-C-XII 1,507 U a-C-XIII 1,506 457 352 10 15 QO 25 30 35 64 (b) Med användning av var och en av antikropp-vat- tenlösningarna, som erhållits i det ovan angivna steget (a), och genom användning av ett förfarande som var lika det som beskrevs i det ovannämnda Framställnings- exemplet l (b), erhölls motsvarande adsorberade pro- dukter av humaninterferon-u som imobiliserats på Sepharos 4B. Från det faktum att var och en av filtra- ten, som erhållits från filtreringarna genom glasfilter, uppvisade ca OD28o = 0,004, fastställdes att det mesta av antikropparna i respektive produkter hade immobili- serats på Sepharos 4B.

Framställningsexempel 3_ En bit filtrerpapper (Toyo Filter Paper nr 2, till- verkat av Toyo Filter Paper Co., Ltd) skars i små pap- persbitar med en storlek av 0,5 cm x 0,5 cm, och ca l g av dem uppvägdes. Dessa små filtrerpappersbitar (cellulosa) sattes i 100 ml av en vattenlösning, som innehöll l g cyanbromid, och blandningens pH-värde hölls vid ca pH ll,O - ll,5 genom tillsättning av en lösning av natriumhydroxid, för att aktivera cellulosan vid rumstemperatur under 6-8 min. Efter det att aktiveringen var fullbordad filtrerades reaktionsblandningen för att avlägsna reaktionsvätskan, varpå det resulterande fasta materialet tvättades flera gånger med iskall O,5M natriumbikarbonatbuffertlösning (pH = 8,4), som innehöll O,5M natriumklorid, och sedan suspenderades det tvättade fasta materialet i samma buffertlösning. Till denna suspension sattes antikropp-vattenlösningen (0D28O = 1,502), som erhållits genom ett förfarande som var lika det som beskrevs i det ovannämnda Framställningsexemplet l (a), varefter den resulterande blandningen behand- lades genom ett förfarande som var lika det som beskrevs 7 (b) för erhållande av en adsorberad produkt av humaninterfe- i det ovan angivna Framställningsexemplet l ron-u-antikropp som immobiliserats på cellulosan. Från 10 15 20 25 30 457 352 65 det faktum att filtratet, som erhållits fràn filtre- ringen av den adsorberade produkten med användning av = 0,004, fastställdes ett glasfilter, uppvisade OD att dct mesta av antikroppenzïgmobiliserats pà cellu- losan. šäëliesëlleiæsëeëemeelß- l g av ett tvärbundet dextran (Sephadex G-25) suspenderades i lO ml vatten för att framställa ett tvärbundet dextran suspenderat i en vattenhaltig suspen- sion. Till denna suspension sattes 10 ml av 2M natrium- bikarbonatvattenlösning och sedan omrördes jämnt. Där- efter ökades omröringshastigheten och 500 ul av en ace- tonitrillösning av cyanbromid (2 g/ml) tillsattes pà en gång och omrördes kraftigt under l till 2 min, varpå reaktionsblandningen filtrerades för avlägsning av reak- tionsvätskan, genom ett glasfilter. Det erhållna fasta materialet tvättades flera gånger med 0,lM natriumbikar- bonat-buffertlösning (pH = 8,4), som innehöll O,5M na- triumklorid. Efter tvättning suspenderades det fasta materialet i samma buffertlösning, och antikropp-vat- tenlösningen (ODZBO = 1,505) (som erhållits genom ett förfarande som var lika det som beskrevs i framställ- ningsexempel l (a) som ovan nämnts) tillsattes därtill och behandlades genom ett förfarande som var_lika det- som beskrevs i ovannämnda Framställningsexempel l (b) för erhållande av en adsorberad produkt av humaninter- feron-g-antikropp som immobilíserats på tvärbundet dex- tran. Från det faktum att filtratet, som erhållits från filtreringen av den adsorberade produkten genom ett glasfilter, uppvisade OD28o = 0,004, fastställdes att det mesta av antikroppen immobiliserats på det tvär- bundna dextranet.

[Rening av humaninterferoner] 0,5 ml (l0,l mg av proteiner) av humaninter- feron-Q (ODZBO = 20,2 framställt av National Institute 457 352 10 15 20 25 30 35 66 of Health) löstes i fysiologisk saltlösning, och använ- des vid affinitetskromatografi med användning av adsor- berad produkt av humaninterferon-a-antikropp som im- mobiliserats på Sepharos 4B [erhållet i Framställnings- exemplet l (b) i framställning av immobiliserade an- tikroppar] och eluerades med 0,lM fosfatbuffertlösning (pH = 7,4), som innehöll 0,l5M natriumklorid. När eluat- et blev ODZBO berade produkten med O,5M ättiksyra-buffertlösning (pH = 0,002 eller lägre, eluerades den adsor- = 2,5), som innehöll O,5M natriumklorid för att isolera det rena de humaninterferonet-a från den adsorberade produkten.

Före behandlingen med användning av affinitetskro- matografi uppvisade humaninterferonet-a det omvandla- de OD-värdet = lO,l [ett värde som erhållits vid 1 mg av proteiner när OD tet av l x l06 pg/ml vid en immunitetsreaktion av humaninterferon-a, 280 = l] och uppvisade även aktivi- enheter/ml samt koncentration av 23 000 i motsats till efterbehandlingen med användning av affi- nitetskromatografi, då det omvandlades OD-värdet av humaninterferonet-a var 0,060, och uppvisade även akti- vitet av 8,2 x 105 19 792 pg/ml vid en immunitetsreaktion av humaninter- enheter/ml samt koncentration av feron-u. Därför var den specifika aktiviteten före be- handlingen med användning av affinitetskromatografi 9,9 x 104 enheter/mg, medan den specifika aktiviteten efter behandling med användning av affinitetskromato- grafi var 1,37 x 107 enheter/mg, vilket är ett signi- fikant värde av 138 gånger högre ifråga om den specifika _aktiviteten. Såsom framgår av resultaten som erhållits med användning av den adsorberade produkten (immobi- liserad antikropp på bäraren) är det möjligt att rena humaninterferon-a till en l38 gånger högre renhet och utbytet därav kan även uppnås kvantitativt. 10 457 352 67 Med användning av var och en av de immobiliserade antikropparna, som erhållits i Framställningsexemplen 2-4 i framställning av immobiliserad antikropp, enligt föreliggande uppfinning, visades utmärkta prestanda ifråga om isolering och rening av humaninterferoner genom behandling med affinitetskromatografi.

Claims (14)

1. ._ .f-ø... .__. ..._,...f.,.._ Ä57i3s2 68 PATENTKRAV l. Humaninterferon-besläktad peptid, k ä n n e - t e c k n a d därav, att den representeras av den allmänna formeln (2) 5 R2-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys-Glu-OH (2) [vari R2 är en väteatom, en grupp med formeln H-Thr- -Asn-Leu-Gln-, en grupp med formeln H-Ser-Leu-Ser- -Thr-Asn-Leu-Gln-, eller en grupp med formeln H-Tyr- 10 -Ser-Leu-Ser-Thr-Asn-Leu-Gln-].

2. Humaninterferon-besläktad peptid enligt kra- vet l, k ä n n e t e c k n a d därav, att den är H- -Ser-Leu-Ser-Thr-Asn-Leu-Gln~Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys- -Glu-on. ' 15

3. Humaninterferon-antikropp, k ä n n e t e c k- n a d därav, att den erhållits genom uppsamling av en antíkropp, som alstrats i en däggdjurskropp genom administrering åt däggdjuret av ett humaninterferon- -antigen, vilket framställts genom att en humaninter- 20 feron-besläktad peptid, som representeras av den all- I? männa formeln (2) R2-Glu-Ser-Leu~Arg-Ser-Lys-Glu-OH (2) 25 [vari R2 är en väteatom, en grupp med formeln H-Thr- -Asn-Leu-Gln-, en grupp med formeln H-Ser-Leu-Ser- -Thr-Asn-Leu-Gln-, eller en grupp med formeln H-Tyr- -Ser-Leu-Ser-Thr-Asn~Leu-G1n-], som en hapten bringats att reagera med en bärare i närvaro av ett bindemedel 30 för hapten-bärare.

4. Humaninterferon-antikropp enligt kravet 3, k ä n n e t e c k n a d därav, att humaninterferon- -antigenet framställts med användning av en bärare :av »q 10 15 20 25 30 35 457 352m 69 som valts ur den grupp som består av ett djurserum- albumin, ett djurserumglobulin, ett djurtyroglobulin, ett djurhemoglobulin, ett djurhemocyanin, ett ascaris- extrakt, en polylysin, en polyglutaminsyra, en lysin- -glutaminsyrasampolymer, en lysin-innehållande sampo- lymer och en ornitininnehållande sampolymer, och ett bindemedel för hapten-bärare som valts ur den grupp som består av en alifatisk dialdehyd, en dima1eimid~ förening, en maleimidokarboxyl-N-hydroxisuccinimido- esterförening och karbodiimid. i

5. Humaninterferon-antikropp enligt kravet 4, k ä n n e t e c k n a d därav, att djuret är ett däggdjur som valts från den grupp som består av en kanin och ett marsvin.

6. Humaninterferon-antikropp enligt kravet 5, k ä n n e t e c k n a d därav, att humaninterferon- -antikroppen som alstrats i en däggdjurskropp erhål- lits genom administering åt däggdjuret av ett human- interferon-antigen i blandning med ett Freund's adjuvans. '

7. Humaninterferon-antikropp enligt kravet 6, k ä n n e t e c k n a d därav, att humaninterferon- -antikroppen, som alstrats i en däggdjurskropp, erhål- lits genom administrering åt en kanin av ett human- interferon-antigen som framställts med användning av en peptid, vilken representeras av den allmänna formeln H-Ser-Leu-Ser-Thr-Asn-Leu-G1n-Glu-Ser-Leu-Arg- -Ser-Lys-Glu-OH som hapten; glutaraldehyd som bindemedel för hapten- -bärare och bovinserumalbumin som bärare.

8. Humaninterferon-antikropp enligt kravet 6, k ä n n e t e c k n a d därav, att humaninterferon- -antikroppen, som framställts i en däggdjurskropp, 457 352 10 15 20 25 30 35 70 erhållits genom administrering åt en kanin av ett humaninterferon-antigen, vilket framställts med an- vändning av en peptid som representeras av den allmänna formeln H-Ser-Leu-Ser-Thr-Asn-Leu-Gln~G1u-Ser-Leu-Arg- -Ser-Lys-Glu-OH som hapten; N,N-dicyklohexylkarbodiimid som bindemedel för hapten-bärare och bovinserumalbumin som bärare.

9. Sätt att framställa en humaninterferon-anti- kropp, k ä n n e t e c k n a t därav, att man uppsamlar en antikropp, som alstrats i en däggdjurskropp genom administrering åt däggdjuret av ett humaninterferon-an- tigen, vilket framställts genom att en humaninterfe- ron-härstammande peptid, som representeras av den allmänna formeln (2) R2-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys-Glu-OH (2) [vari R2 är en väteatom, en grupp med formeln H-Thr- -Asn-Leu-Gln-, en grupp med formeln H-Ser-Leu-Ser- -Thr-Asn-Leu-Gln-, eller en grupp med formeln H-Tyr- -Ser-Leu-Ser-Thr-Asn-Leu-Gln-], som en hapten bringats att reagera med en bärare i närvaro av ett bindemedel för hapten-bärare.

10. Användning av en human interferon-antikropp som erhållits genom uppsamling av antikropp, vilken alstrats i en däggdjurskropp genom administrering åt däggdjuret av ett human interferon-antigen, som framställts genom att en human interferon-besläktad peptid som representeras av den allmänna formeln R2-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys-Glu-OH (2) [vari R2 är en väteatom, en grupp med formeln H-Thr- -Asn-Leu-Gln-, en grupp med formeln H-Ser-Leu-Ser- -Thr-Asn-Leu-Gln-, eller en grupp med formeln H-Tyr- u. 10 15 20 25 30 35 457 352 71 -Ser-Leu-Ser-Thr-Asn-Leu-G1n-], som ett hapten, bringats att reagera med en bärare i närvaro av ett bindemedel för hapten-bärare, för framställning av ett absorptionsmedel för affini- tetskromatografi genom immobilisering av humaninter- feron-antikroppen pà en olöslig bärare.

11. ll. Användning av en humaninterferon-antikropp enligt kravet 10, varvid humaninterferon-antigenet framställts genom att en peptid som representeras av formeln H-Ser-Leu-Ser-Thr-Asn-Leu-Gln-Glu-Ser-Leu~Arg- -Ser-Lys-Glu-OH som hapten, bringats att reagera med bovinserumalbu- min som bärare i närvaro av glutaraldehyd som binde- medel för hapten-bärare, varvid humaninterferon-anti- genet administrerats åt en kanin och interferon-anti- kroppen som alstrats i kaninkroppen uppsamlats fràn kaninen, varpå interferon-antikroppen immobiliserats på agarosbärare som aktiverats med BrCN. g _ _

12. Märkt peptid, k ä n n e t e c k n a d därav, att tyrosyl i den humaninterfcron-besläktade peptiden som representeras av formeln H-Tyr-Ser-Leu-Ser-Thr-Asn-Leu-Gln-G1u-Ser-Leu- -Arg-Ser-Lys-Glu-OH är märkt med 1251.

13. Märkt peptid, k ä n n e t e c k n a d därav, att den humaninterferon-besläktade peptiden som rep- resenteras av formeln H~Ser-Leu-Ser-Thr-Asn-Leu-Gln-Glu-Ser-Leu-Arg- -Ser-Lys-Glu-OH 457 352 72 är märkt med en fluorokrom som valts från den grupp som består av fluorescein-isotiocyanat, tetrametyl- rodaminisotiocyanat och diklorotriazinfluorescein.

14. Sätt att framställa en märkt peptid, k ä n -' 5 n e t e c k n a d därav, att en humaninterferon-här- stammande peptid som representeras av formeln H-Tyr-Ser-Leu-Ser-Thr-Asn-Leu-Gln-Glu-Ser-Leu- -Arg-Ser-Lys-Glu-OH 10 bringas att reagera med radioaktiv jod eller en fluo- rokrom. '15 1.1