CH652411A5 - Verfahren zur herstellung eines human-interferon-antikoerpers, danach hergestellte antikoerper und ihre verwendung. - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Antikörpern des Human-Interferons sowie die Verwendung dieser Antikörper zur Herstellung eines Adsorptionsmittels für die Affinitätschromatographie.

In der vorliegenden Erfindung werden Aminosäuren, Peptide, Schutzgruppen, aktive Gruppen etc. durch Abkürzungen und Symbole nach den Regeln der IUP AC (International Union of Pure and Applied Chemistry) und IUB (International Union of Biochemistry) bezeichnet oder durch Symbole, wie sie bekannt sind. Im Zusammenhang mit optischen Isomeren von Aminosäuren wird im allgemeinen die 1-Form (Lävo-Form) dieser Isomeren erwähnt, wenn nicht anders angegeben. Beispiele für solche Abkürzungen und Symbole sind die folgenden:

Leu: Leucin

Ile: Isoleucin

Ala: Alanin

Gin: Glutamin

Thr: Threonin

His: Histidin

Ser Serin

Gly: Glycin

Asn: Asparagin

Met: Methionin

Phe: Phenylalanin

Tyr: Tyrosin

Glu: Glutaminsäure

Lys: Lysin

Arg: Arginin

Asp: Aspartinsäure

Pro: Prolin

OBzl: Benzyloxygruppe

NHS: N-Hydroxysuccinimidogruppe

Z: Carbobenzoxygruppe

Su: Succinimidogruppe

Tos: p-Toluensulfonylgruppe

Boc: t-Butoxycarbonylgruppe

Ein Interferon ist ein Glykoprotein oder ein Protein mit einer Antivirusaktivität, das von einer Zelle als Antwort auf eine Virusinfektion freigegeben wird und man nimmt an, dass man durch Virusinfektionen verursachte Krankheiten verhindern und heilen kann, indem man Interferon verabreicht. Interferon hat deshalb seit einigen Jahren grosses Interesse gefunden.

Human-Interferone werden derzeit in drei Typen unterteilt, nämlich in Interferon-a (Leucocyten-Interferon, Lym-phoblastoid-Interferon), Interferon-ß (Fibroblast-Interferon) und Interferon-y (Immun-Interferon). Man hat bisher jedoch noch keine Technik entwickelt, um Interferon zu reinigen und die jeweiligen Bestandteile in Form eines einzelnen Glykopro-teins oder Proteins zu isolieren.

In den Zeichnungen zeigen:

Fig. 1 und 2 Kurven, welche die Spezifität des Interferon-a-Antikörpers, der nach der vorliegenden Erfindung erhalten wurde, angeben.

Fig. 3 und 4 Kurven, die die Spezifität eines gemäss der Erfindung erhaltenen Human-Interferon-ß-Antikörpers anzeigen,

Fig. 5 eine Kurve, in welcher die Beziehung zwischen der Konzentration der ersten bis zur dreizehnten Peptidkette von Human-Interferon-ß- und dem relativ gebundenen Prozentsatz (%) hinsichtlich eines erfindungsgemäss erhaltenen Hu-man-Interferon-ß-Antikörpers dargestellt ist,

Fig. 6 bis 10 Kalibrierungskurven bei einem Fluoreszenz-polarisations-Immunoassay-System, welches durch die vorliegende Erfindung ermöglicht wird.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung neuer Antikörper zur Verfügung zu stellen, die bei der Technologie zur Reinigung und Trennung von Human-Inter-feron-a, insbesondere von Lymphoblastoid-Interferon, oder s von Human-Interferon-ß verwendet werden können.

Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, ein neues Verfahren zur Herstellung eines Adsorptionsmittels für die Affinitätschromatographie unter Verwendung der Antikörper aufzuzeigen.

io Es wurde gefunden, dass man neue Antigene aus Human-Interferon-a oder -ß herstellen kann, unter Verwendung von neuem N-terminierten Peptid oder C-terminierten Peptid von Human-Lymphoblastoid-Interferon oder unter Verwendung eines neuen N-terminierten Peptids von Human-Interferon-ß, i5 wobei das neue N-terminierte Peptid und C-terminierte Peptid von den Erfindern neu synthetisiert wurden. Es wurde weiterhin gefunden, dass man neue Antikörper mit einer Spezifität gegenüber Human-Interferon-a oder -ß unter Verwendung dieser Antigene herstellen kann. Weiterhin wurde gefunden, 20 dass man das beabsichtigte Human-Interferon-a oder -ß unter Verwendung der neuen Antikörper durch Affinitätschroma-tografie reinigen kann.

Die vorliegende Erfindung beruht auf den vorerwähnten neuen Erkenntnissen. Erfindungsgemäss kann man die Anti-25 körper, die gegenüber Human-Interferon-a oder -ß spezifisch sind und die man zum Reinigen für die Bestimmung von Interferon verwenden kann, vorteilhaft technisch herstellen, indem man synthetische Peptide der nachfolgend wiedergegebenen Formeln, die in grossem Masse hergestellt werden kön-30 nen, verwendet.

Das neue synthetisch erhaltene Peptid ist ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Peptid der allgemeinen Formel (I)

35 R'-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH

(I)

worin R1 ein Wasserstoffatom, eine Gruppe der Formel H-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Asn-Arg-Arg-Ala-, eine Gruppe der Formel H-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Asn-40 Arg-Arg-Ala- oder eine Gruppe der Formel H-Tyr-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Asn-Arg-Arg-Ala-bedeutet, ein Peptid der allgemeinen Formel (II)

45

R2-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys-Glu-OH

(II)

worin R2 ein Wasserstoffatom, eine Gruppe der Formel H-Thr-Asn-Leu-Gln-, eine Gruppe der Formel H-Ser-Leu-Ser-Thr-Asn-Leu-Gln-, eine Gruppe der Formel H-Tyr-Ser-Leu-Ser-Thr-Asn-Leu-Gln- bedeutet, und ein Peptid der allgemei-50 nen Formel (III)

R3-Leu-Gln-Arg-Ser-Ser-OH

(III)

worin R3 ein Wasserstoffatom, eine Gruppe der Formel H-55 Phe-, eine Gruppe der Formel H-Leu-Gly-Phe- oder eine Gruppe der Formel H-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe- bedeutet.

Das neue synthetische Peptid ist somit ein Peptid entsprechend einem N-terminierten Peptid von Human-Lymphopla-stoid-Interferon oder ein Derivat davon (ein Peptid der allge-60 meinen Formel (I)), ein Peptid entsprechend einem C-terminierten Peptid von Human-Lymphoblastoid-Interferon oder ein Derivat davon (ein Peptid der allgemeinen Formel (II)), oder ein Peptid entsprechend einem N-terminierten Peptid von Human-Interferon-ß- oder ein Derivat davon (ein Peptid 65 der allgemeinen Formel (III)).

Jedes der vorerwähnten synthetischen Peptide kann unter Verwendung von auf dem Markt erhältlichen Aminosäuren in einfacher Weise hergestellt werden. Das synthetische Pep-

652411 4

tid hat eine spezifische Aminosäureanordnung, so dass man gruppe, eine t-Amyloxycarbonylgruppe, eine Isobornyloxy-

aus einem Peptid der allgemeinen Formel (I) oder aus einem carbonylgruppe, eine p-Methoxybenzyloxycarbonylgruppe,

Peptid der allgemeinen Formel (II) ein Antigen mit einer kla- eine 2-ChIorobenzyloxycarbonylgruppe, eine Adamantyloxy-

ren Erkennungsstelle (Cognition site) zur Identifizierung von carbonylgruppe, eine Trifluoroacetylgruppe, eine Phthalyl-

Human-Interferon-a, und aus einem Peptid der allgemeinen 5 gruppe, eine Formylgruppe, eine o-Nitrophenylsulfenyl-

Formel (III) ein Antigen mit einer klaren Erkennungsstelle gruppe, eine Diphenylphosphinothioylgruppe und derglei-

zur Identifizierung von Human-Interferon-ß, sowie einen An- chen in Frage.

tikörper mit hoher Selektivität in grossem Massstab herstellen Als Schutzgruppe für die Carboxylgruppe kommt beikann. spielsweise ein Alkylester (z.B. eine Estergruppe von Methyl,

Also kann man einen Antikörper hoher Spezifität gegen xo Ethyl, Propyl, Butyl, t-Butyl oder dergleichen), ein Benzyl-

Human-Interferon-a oder -ß stabiler und in grossem Mass- ester, ein p-Nitrobenzylester, ein p-Methoxybenzylester, ein stab unter Verwendung eines aus dem vorerwähnten syntheti- p-Chlorobenzylester, ein Benzhydrylester, Carbobenzoxyhy-

schen Peptid erhaltenen Antigens als Hapten gewinnen, als drazid, t-Butyloxycarbonylhydrazid, Tritylhydrazid und der-

unter Verwendung eines natürlichen Interferon-a oder Inter- gleichen in Frage.

feron-ß. is Als Schutzgruppe für die Guanidinogruppe von Arginin

Man kann die Peptide der Formeln (I), (II) und (III) nach kommt beispielsweise eine Nitrogruppe, eine Tosylgruppe,

einer allgemein zur Synthese von Peptiden angewendeten Me- eine p-Methoxybenzolsulfonylgruppe, eine Carbobenzoxy-

thode herstellen, beispielsweise nach einem Verfahren, das in gruppe, eine Isobornyloxycarbonylgruppe, eine Adamantyl-

«The Peptides», Band 1 (1966) von Schröder und Luhke, oxycarbonylgruppe und dergleichen in Frage. Weiterhin

Academic Press, New York, USA, oder in «Peptide Gosei» 20 kann die Guanidinogruppe auch in Form eines Salzes mit ei-

(Synthesis of peptide) von Izumiya et al., Maruzen and Co., ner geeigneten Säure geschützt werden, z.B. mit Benzolsul-

Ltd. (1975), beschrieben wird. Beispiele für solche Verfahren fonsäure, Toluolsulfonsäure, Salzsäure oder Schwefelsäure,

sind die Azidmethode, die Chloridmethode, die Säureanhy- Die Hydroxygruppe von Threonin und von Serin muss dridmethode, die Mischanhydridmethode, die Dicyclohexyl- z.B. erforderlichenfalls durch Veresterung oder Veretherung carbodiimid (DCC)-methode, Aktivestermethode (p-Nitro- 25 geschützt werden. Geeignete Schutzgruppen für eine Vereste-

phenylestermethode, N-Hydroxysuccinimidestermethode, rang sind solche mit Niedrigalkanoylgruppen, wie eine Acet-

Cyanomethylestermethode und dergleichen), eine Methode ylgruppe, eine Aroylgruppe, eine Benzoylgruppe, eine unter Verwendung von Woodward-Reagenz K, die Carbodi- Gruppe, die sich von einer Carbonsäure ableitet, wie eine imidazolmethode, Oxidations-Reduktions-Methode, DCC/ Benzoyloxycarbonylgruppe, eine Ethyloxycarbonylgruppe

Additiv [N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboxyimid 30 und dergleichen. Als Schutzgruppe für eine Veretherung ist

(HONB), 1-Hydroxybenzotriazol (HOBt), N-Hydroxysuc- beispielsweise eine Benzylgruppe, eine Tetrahydropyranyl-

cinimid (HOSu)]-Methode und dergleichen. gruppe oder eine t-Butylgruppe geeignet.

Bei der Durchführung der vorerwähnten Methoden kann Methionin kann in Form des Sulfoxids geschützt werden,

man entweder eine Festphasen-Synthesemethode oder eine Als aktivierte Carboxylgruppe kommt beispielsweise ein

Flüssigphasen-Synthesemethode anwenden, wobei die Syn- 35 entsprechendes Säurechlorid, Säureanhydrid oder Mischan-

thesemethode in der Flüssigphase bevorzugt wird. hydrid oder ein Azid, ein aktivierter Ester (ein Ester von

Die erwähnten Peptide erhält man nach einer der vorer- Methylalkohol, Ethylalkohol, Benzylalkohol, Pentachloro-

wähnten Synthesemethoden für Polypeptide, z.B. durch eine phenol, p-Nitrophenol, N-Hydroxysuccinimid, 1-Hydroxy-

«stufenweise» Methode, bei welcher man eine Aminosäure benzotriazol, N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboxyimid schrittweise mit der endständigen Aminosäure in dem Peptid 40 und dergleichen) in Frage.

kondensiert oder indem man Peptide, die in verschiedene Die Peptidbindungsbildungsreaktion kann durchgeführt

Fragmente aufgeteilt sind, kuppelt. Insbesondere kann man werden in Gegenwart eines Kondensierungsmittels, z.B. eines solche Peptide herstellen, indem man ein Ausgangsmaterial Carbodiimidreagenzes, wie Dicyclohexylcarbodiimid, Carbo-

mit reaktiven Carboxylgruppen, entsprechend dem einen diimidazol oder dergleichen, oder von Tetraethylpyro-

Fragment, das man bei der Aufteilung in zwei Teile an der ge- 45 phosphit.

wünschten Position erhält, mit einem anderen Ausgangsma- Die Peptide der Formeln (I), (II) und (III) können insbe-

terial kondensiert, das reaktive Aminogruppen hat, die dem sondere nach einer der nachfolgenden Methoden A und C

anderen Fragment entsprechen. Wenn dieses kondensierte hergestellt werden.

Produkt Schutzgruppen aufweist, kann man das gewünschte

Peptid herstellen, indem man die Schutzgruppen in üblicher 50 Methode A

Weise entfernt. Verwendet man Aspartinsäure, Lysin oder Verfahren zur Herstellung eines Peptids der allgemeinen For-

Arginin bei der Reaktionsstufe zur Herstellung eines Peptids, mei (I)

so kann die Aminosäure vorteilhaft durch Schutzgruppen bei A-(I): Wenn R! ein Wasserstoffatom bedeutet.

der letzten Stufe geschützt werden, wobei die gesamten

Schutzgruppen dann von dem geschützten Polypeptid, bei 55 A-Ala-B (2)

dem wenigstens eine konstitutionale Aminosäure-Restgruppe J. H-Gln-OH (3)

geschützt ist, entfernt werden. A-Ala-Gln-OH (4)

Bei den Reaktionsschritten zur Synthese der Peptide kann j man jede funktionelle Gruppe, die nicht an der Synthesereak- H-Ala-Gln-OH (5)

tion teilnimmt, mit einer Schutzgruppe versehen und die 60 I A-Leu-B (6)

Schutzgruppe wird von der geschützten Gruppe nach der A-Leu-Ala-Gln-OH (7)

Umsetzung entfernt. Weiterhin wird eine an der Reaktion j teilnehmende funktionelle Gruppe im allgemeinen aktiviert. H-Leu-Ala-Gln-OH (8)

Verfahren zur Durchführung dieser Reaktionen sind bekannt j, A-Leu-B (6)

und ebenso sind auch Reagentien, die man für diese Reaktio- 65 A-Leu-Leu-Ala-Gln-OH (9)

nen anwenden kann, bekannt. J.

Als Schutzgruppen für Aminosäuren kommen beispiels- H-Leu-Leu-Ala-Gln-OH (10)

weise eine Carbobenzoxygruppe, eine t-Butyloxycarbonyl- j. A-Ile-B (11)

5

652 411

A-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH

i

H-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH

4 A-Leu-B A-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH

i

H-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH

(12)

(13) (6)

(14)

(15)

A-(II): Wenn R1 eine Gruppe der Formel H-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Asn-Arg-Arg-Ala- bedeutet.

C

A-Arg-B

| H-Ala-B

C

I

A-Arg-Ala-B

i

C

I

H-Arg-Ala-B

C

I

A-Arg-B

C C I I A-Arg-Arg-Ala-B

1

C C I I H-Ar g-Ar g-Ala-B A-Asn-B

C C

I I

A-Asn-Ar g-Ar g-Ala-B

A-Asn-Arg-Arg-Ala-B

\ H-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH A-Asn-Arg-Arg-Ala-Leu-Ile-Leu-JLeu-Ala-Gln-OH

H-Asn-Arg-Arg-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH

I —(36)* A-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Asn-Arg-Arg-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH

I

H-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Asn-Arg-Arg-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH

[worin (36)* durch die folgende Stufe hergestellt wird

A-Leu-B

\ H-Gly-B A-Leu-Gly-B

H-Leu-Gly-B

| A-Ser-B A-Ser-Leu-Gly-B

H-Ser-Leu-Gly-B

| A-Thr-His-B A-Thr-His-Ser-Leu-Gly-B

A-Pro-B

\ H-Gln-B A-Pro-Gln-B

1

s H-Pro-Gln-B

| A-Leu-B-A-Leu-Pro-Gln-B

I

H-Leu-Pro-Gln-B io | A-Asp-B A-Asp-Leu-Pro-Gln-B

1

D

(37)

(38)

(39)

(40) (6)

(41)

(42)

(43)

(44)

(16)

(17) ' 4

15 A-Asp-Leu-Pro-Gln-B (45)

(18) H-Asp-Leu-Pro-Gln-B (46)

\ A-Ser-B (32)

A-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-B (47) 20 I H-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Asn-Arg-Arg-

(19) t Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH (28) A-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Asn-Arg-Arg-Ala-Leu-IIe-Leu-Leu-Ala-Gln-OH (48)

(16) 25 H-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Asn-

Arg-Arg-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH (49)

(20) A-(IV): Wenn R1 eine Gruppe der Formel H-Tyr-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Asn-Arg-Arg-Ala-be-

, deutet.

A-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-B (47)

H-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-B (50)

| A-Tyr-B (51)

A-Tyr-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-B (52) I H-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Asn-Arg-Arg-

T Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH (28) A-Tyr-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser-Leu-Gly-

Asn-Arg-Arg-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH (53)

H-Tyr-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Asn-Arg-Arg-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH (54)

30

(21)

(22)

(23)

(24) (15)

(25)

(26)

35

40

(27)

(28)'

45

(6)«

(29)

(30)

(31)

(32) «o

(33)

(34)

(35) (36)*]65

A-(III): Wenn R1 eine Gruppe der Formel H-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr- His-Ser-Leu-Gly-Asn-Arg-Arg-Ala- bedeutet.

Bei den vorerwähnten Methoden A-(I) bis A-(IV) ist A eine Schutzgruppe für die Aminogruppe, B eine aktive Gruppe für die Hydroxygruppe oder Carboxylgruppe, C eine Schutzgruppe für die Guanidinogruppe des Arginins und D eine Schutzgruppe für die Aspartinsäure.

Bei dem vorerwähnten Verfahren wird als Gruppe A eine t-Butoxycarbonylgruppe (Boc), eine Carbobenzoylgruppe (Z) oder eine p-Methoxybenzyloxycarbonylgruppe oder dergleichen bevorzugt. Als aktive Gruppe der Carbonylgruppe, dargestellt durch B wird beispielsweise ein aktiver Ester, wie eine N-Hydroxysuccinimidogruppe, ein Mischsäureanhydrid, wie eine Isobutyloxycarbonylgruppe, eine Azidgruppe und dergleichen, bevorzugt, und als Gruppe C wird eine Nitro-gruppe, eine Tosylgruppe und dergleichen bevorzugt, während als Gruppe D eine Benzyloxygruppe bevorzugt wird.

Bei der vorerwähnten Methode A-(I) kann die Umsetzung einer Aminosäure (2) mit einer Aminosäure (3) in Gegenwart eines Lösungsmittels durchgeführt werden. Als Lösungsmittel kann jedes verwendet werden, das bei einer Peptidkonden-sationsreaktion verwendet werden kann, z.B. wasserfreies oder wasserhaltiges Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Pyridin, Chloroform, Dioxan, Dichlormethan, Tetrahydro-furan, Ethylacetat, N-Methylpyrrolidon, Hexamethylphos-photriamid oder Mischungen dieser Lösungsmittel.

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Das Verhältnis, in dem die Aminosäure (3) mit einer Ami- Die Schutzgruppe von C bei einem Peptid (23) und die nosäure (2) umgesetzt wird, ist nicht besonders begrenzt und Schutzgruppe von D bei einem Peptid (45) kann auch nach kann in einem weiten Bereich liegen. Im allgemeinen verwen- der vorerwähnten reduktiven Methode entfernt werden, det man eine Äquivalente bis zur 5-fachen Menge und vorzugsweise eine Äquivalente bis zur 1,5-fachen Menge. s Die Aminosäuren (2), (6), (11), (16), (22), (32), (37), (43)

Die Reaktionstemperatur wird so ausgewählt wie sie bei und (51), die für die vorerwähnten Methoden A-(I) bis A-(IV)

einer Peptidbindungsbildungsreaktion geeignet ist. Sie liegt verwendet werden, können bekannte, im Handel erhältliche im allgemeinen bei —40 bis etwa 60 °C und vorzugsweise bei Produkte sein. Peptide (18), (23), (35), (36), (44), (47) und etwa — 20 bis etwa 40 °C. Die Umsetzung wird im allgemei- (52), wie sie bei den vorerwähnten Methoden A-(I) bis A-(IV)

nen einige Minuten bis etwa 30 Stunden durchgeführt. io verwendet werden, können gleichfalls im Handel erhältliche

Bei der vorerwähnten Methode A-(I) kann die Umsetzung Produkte sein oder solche, die man durch die Mischanhydrideines Peptids (5) mit einer Aminosäure (6), die Umsetzung ei- methode oder durch die Azidbildungsmethode gewinnt. Die nes Peptids (8) mit einer Aminosäure (6), die Umsetzung eines Mischanhydridmethode wird in einem geeigneten Lösungs-Peptids (10) mit einer Aminosäure (11) und die Umsetzung ei- mittel in Gegenwart einer basischen Verbindung unter Vernes Peptids (13) mit einer Aminosäure (6) in ähnlicher Weise is wendung einer Alkylhalogencarbonsäure durchgeführt. Ge-wie die Umsetzung einer Aminosäure (2) mit einer Amino- eignete Alkylhalogenkarbonsäuren sind beispielsweise Meth-säure (3) erfolgen. ylchloroformiat, Methylbromoformiat, Ethylchloroformiat, Bei der vorerwähnten Methode A-(II) kann die Umset- Ethylbromoformiat, Isobutylchloroformiat und dergleichen, zung einer Aminosäure (16) mit einer Aminosäure (17), die Als basische Verbindung kommen beispielsweise organische Umsetzung eines Peptids (19) mit einer Aminosäure (16), die 2oBasen, wie Triethylamin, Trimethylamin, Pyridin, Dimethyl-Umsetzung eines Peptids (21) mit einer Aminosäure (22), die anilin, N-Methylmorpholin, l,5-Diazabicyclo[4,3,0]nonen-5 Umsetzung eines Peptids (24) mit einem Peptid (15), die Um- (DBN), l,5-Diazabicyclo[5,4,0]-undecen-5 (DBU), 1,4-Di-setzung eines Peptids (26) mit einem Peptid (36), die Umset- azabicyclo[2,2,2]octan (DABCO) und dergleichen in Frage, zung einer Aminosäure (6) mit einer Aminosäure (29), die sowie auch anorganische basische Verbindungen, wie Kali-Umsetzung eines Peptids (31) mit einer Aminosäure (32) und 25 umkarbonat, Natriumkarbonat, Kaliumhydrogenkarbonat, die Umsetzung eines Peptids (34) mit einem Peptid (35) in Natriumhydrogenkarbonat und dergleichen. Das bei dieser ähnlicher Weise wie die vorerwähnte Umsetzung erfolgen. Umsetzung verwendete Lösungsmittel kann jedes Lösungs-

Bei der vorerwähnten Methode A-(III) kann die Umset- mittel sein, wie es bei einer Mischanhydridreaktion verwendet zung einer Aminosäure (37) mit einer Aminosäure (38), die wird. Beispiele hierfür sind'halogenierte Kohlenwasserstoffe,

Umsetzung eines Peptids (40) mit einer Aminosäure (6), die 30 wie Methylenchlorid, Chloroform, Dichlorethan und derglei-

Umsetzung eines Peptids (42) mit einer Aminosäure (43), die chen; aromatische Kohlenwasserstoffe, wie Benzol, Toluol,

Umsetzung eines Peptids (46) mit einer Aminosäure (32) und Xylol und dergleichen; Ether, wie Diethylether, Tetrahydro-

die Umsetzung eines Peptids (47) mit einem Peptid (28) sowie furan, Dimethoxyethan und dergleichen; Ester, wie Methyl-

bei der vorerwähnten Methode A-(IV) die Umsetzung eines acetat, Ethylacetat und dergleichen; aprotische polare Lö-

Peptids (50) mit einer Aminosäure (51), die Umsetzung eines 35 sungsmittel, wie N,N-Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid,

Peptids (52) mit einem Peptid (28) in ähnlicher Weise durch- Hexamethylphosphortriamid und dergleichen. Die Umset-

geführt werden wie bei der vorerwähnten Umsetzung. zung wird bei — 20 bis 100 °C und vorzugsweise - 20 bis

50 °C durchgeführt und ist im allgemeinen in 5 Minuten bis Die Entfernungvon Schutzgruppen von Abei den Pepti- 10 Stunden, vorzugsweise 5 Minuten bis 2 Stunden, beendet, den (4), (7), (9), (12), (14), (18), (20), (25), (27), (30), (33), (39) 40 Bei der Azidbildungsreaktion wird zunächst eine Carbonai), (45), (47), (48) und (53), wie sie nach den vorerwähnten säure mit einem Alkohol, wie Methylalkohol, Ethylalkohol, Reaktionen erhalten werden, wird in bekannter Weise durch- Benzylalkohol und dergleichen, aktiviert und die aktivierte geführt. Eine bekannte Entfernungsreaktion ist beispielsweise Carboxylgruppe wird dann mit Hydrazinhydrat in einem ge-die reduktive Methode (eine Hydrierung unter Verwendung eigneten Lösungsmittel umgesetzt. Geeignete Lösungsmittel von Palladium, Palladiumschwarz und dergleichen als Kata- 45 sind beispielsweise Dioxan, Dimethylformamid, Dimethyl-lysator; eine Reduktion unter Verwendung von metallischem sulfoxid oder Mischungen dieser Lösungsmittel. Hydrazin-Natrium in flüssigem Ammoniak), eine Acidolyse (Acidolyse hydrat wird im allgemeinen in einer 5- bis 20-fachen molaren unter Verwendung von Trifluoressigsäure, Fluorwasserstoff, Menge und vorzugsweise 5- bis 10-fachen molaren Menge, Methansulfonsäure, Bromwasserstoff oder dergleichen als bezogen auf die Menge der aktivierten Carboxylgruppe, angestarke Säure) und dergleichen. 50 wendet. Die Umsetzung wird im allgemeinen unterhalb 50 °C Die vorerwähnte Hydrierung unter Verwendung eines und vorzugsweise bei — 20 bis 30 ° C durchgeführt. Auf diese Katalysators kann unter 1 Atmosphäre Wasserstoff bei 0 bis Weise wird eine Verbindung erhalten, in welcher die Carbox-40 °C durchgeführt werden. Der Katalysator wird im allge- ylgruppe der endständigen Aminosäure durch Hydrazin meinen in einer Menge von 100 mg bis 1 g angewendet und (Hydrazinderivat) substituiert ist. Eine Verbindung, bei wel-die Umsetzung wird im allgemeinen in 1 bis 48 Stunden 55 eher die Carboxylgruppe der endständigen Aminosäure beendet. durch ein Azid substituiert ist, erhält man, indem man in ei-Die vorerwähnte Acidolyse kann in Abwesenheit eines nem geeigneten Lösungsmittel in Gegenwart einer Säure das Lösungsmittels bei 0 bis 30 °C und vorzugsweise 0 bis 20 °C vorerwähnte Hydrazinderivat mit einer Salpetrigsäureverbin-durchgeführt werden und die Umsetzung ist im allgemeinen dung umsetzt. Als Säure wird im allgemeinen Salzsäure vérin 15 Minuten bis 1 Stunden beendet. Die Säure kann in einer 60 wendet. Geeignete Lösungsmittel sind Dioxan, Dimethyl-5- bis 10-fachen Menge, bezogen auf die Menge des Aus- formamid, Dimethylsulfoxid oder Mischungen dieser Lö-gangsmaterials, verwendet werden. sungsmittel. Als Salpetrigsäureverbindung kommen Natri-Bei der vorerwähnten Reduktion unter Verwendung von umnitrit, Isoamylnitrit, Nitrosylchlorid und dergleichen in metallischem Natrium in flüssigem Ammoniak wird das me- Frage. Die Salpetrigsäureverbindung wird im allgemeinen in talliscile Natrium in einer solchen Menge angewendet, dass 6S äquimolarer bis zur zweifachen molaren Menge und vorzugs-die Farbe des Reaktionsgemisches ständig während 30 Se- weise in äquimolarer bis zur 1,5-fachen molaren Menge, bekunden bis 10 Minuten blau bleibt. Die Reduktion wird im zogen auf das Hydrazinderivat, angewendet. Die Umsetzung allgemeinen bei —40 bis —70 °C durchgeführt. wird im allgemeinen bei —20 bis 0°C und vorzugsweise bei

- 20 bis 10 °C durchgeführt und ist in etwa 5 bis 10 Minuten beendet.

Methode B

Verfahren zur Herstellung eines Peptids der allgemeinen Formel ( II)

B-(I): Wenn R2 ein Wasserstoffatom ist.

E

A-Ser-Leu-G A-Ser-Leu-B

652 411

(99)

(65)*]

A-Ly s-B

F

I

H-Glu-G

E F I I A-Ly s-Glu-G

(

E

I

H-Lys-Glu-OH A-Ser-B

E

I

A-Ser-Ly s-Glu-OH

H-Ser-Lys-Glu-OH

C

I

A-Arg-B

C E I I

A-Arg-Ser-Lys-Glu-OH

E

I

H-Arg-Ser-Ly s-Glu-OH

A-Ser-Leu-B

E

I

A-Ser-Leu-Arg-Ser-Ly s-Glu-OH

E

I

H-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys-Glu-OH

E

I

A-Glu-B

A-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Ly s-Glu-OH

H-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys-Glu-OH

B-(II): Wenn R2 eine Gruppe der Formel H-Thr-Asn-Leu-Gln- bedeutet.

H-Gln-G

(55) io I A-Leu-B

A-Leu-Gln-G

1

(56) H-Leu-Gln-G

| A-Asn-B 15 A-Asn-Leu-Gln-G \

(57) H-Asn-Leu-Gln-G A-Thr-B

A-Thr-Asn-Leu-Gln-G

(58)

(59)

A-Thr-Asn-Leu-Gln-B

H-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys-Glu-OH

(60) 25 A-Thr-Asn-Leu-Gln-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-

E

I

Ly s-Glu-OH

(61) 1

30 H-Thr-Asn-Leu-Gln-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys-Glu-OH

(71)

(72)

(73)

(74)

(75)

(76)

(77)

(78)

(79)

(80)

(81)

(82)

(83)

(62)

B-(III): Wenn R2 eine Gruppe der Formel H-Ser-Leu-Ser-Thr-Asn-Leu-Gln- bedeutet.

35 A-Leu-B (72)

(63) \ H-Ser-G (84) A-Leu-Ser-G (85)

I

H-Leu-Ser-G (86)

40 | A-Ser-B (59)

A-Ser-Leu-Ser-G (87)

(64) |

A-Ser-Leu-Ser-B (88)

(65)* H-Thr-Asn-Leu-Gln-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-

45 Ly s-Glu-OH (89)

(66)

A-Ser-Leu-Ser-Thr-Asn-Leu-Gln-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Ly s-Glu-OH

50

(67)

(68) 55

(69)

(70)

H-Ser-Leu-Ser-Thr-Asn-Leu-Gln-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys-Glu-OH

(90)

(91)

60

[worin Peptid (65)* durch die folgende Stufe hergestellt wird:

65

A-Ser-B

\ . H-Leu-G

(59) (98)

B-(IV): Wenn R2 eine Gruppe der Formel H-Tyr-Ser-Leu-Ser-Thr-Asn-Leu-Gln- bedeutet.

A-Ser-Leu-Ser-G (87)

I

H-Ser-Leu-Ser-G (92)

| A-Tyr-B (93)

A-Tyr-Ser-Leu-Ser-G (94)

A-Tyr-Ser-Leu-Ser-B (95) H-Thr-Asn-Leu-Gln-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-

Ly s-Glu-OH (89)

652411

8

A-Tyr-Ser-Leu-Ser-Thr-Asn-Leu-Gln-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Ly s-Glu-OH (96)

H-Tyr-Ser-Leu-Ser-Thr-Asn-Leu-Gln-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys-Glu-OH (97)

Bei den vorerwähnten Methoden B-(I) bis B-(IV) bedeutet E eine Schutzgruppe für eine e-Aminogruppe des Lysins, F eine Schutzgruppe für eine y-Carboxylgruppe der Glutaminsäure und G eine Schutzgruppe für die Carboxylgruppe und A, B und C haben die vorher angegebenen Bedeutungen. Bei den vorerwähnten Methoden wird als Gruppe E eine Tosyl-gruppe oder dergleichen bevorzugt, als Gruppe F eine Benzyl-oxygruppe oder dergleichen und als Gruppe G bevorzugt man eine Alkylester-Restgruppe, t-Butoxycarbonyl und dergleichen. Bei der vorerwähnten Methode B-(I) erfolgt die Umsetzung der Aminosäure (55) mit einer Aminosäure (56), die Umsetzung eines Peptids (58) mit einer Aminosäure (59), die Umsetzung eines Peptids (61) mit einer Aminosäure (62), die Umsetzung des Peptids (64) mit einer Aminosäure (65), die Umsetzung eines Peptids (67) mit einer Aminosäure (68) und die Umsetzung einer Aminosäure (59) mit einer Aminosäure (98), sowie bei der vorerwähnten Methode B-(II) die Umsetzung einer Aminosäure (71) mit einer Aminosäure (72), die Umsetzung eines Peptids (74) mit einer Aminosäure (75), die Umsetzung eines Peptids (77) mit einer Aminosäure (78) und die Umsetzung eines Peptids (80) mit einem Peptid (81), sowie bei der vorerwähnten Methode B-(III) die Umsetzung einer Aminosäure (72) mit einer Aminosäure (84), die Umsetzung eines Peptids (86) mit einer Aminosäure (59) und die Umsetzung eines Peptids (88) mit einem Peptid (89), sowie bei der vorerwähnten Methode B-(IV) die Umsetzung eines Peptids (92) mit einer Aminosäure (93) und die Umsetzung eines Peptids (95) mit einem Peptid (89) in ähnlicher Weise wie bei der Umsetzung einer Aminosäure (2) mit einer Aminosäure (3) bei der vorerwähnten Methode A.

Die Entfernungsreaktion der Schutzgruppe A oder C von den Peptiden, die man nach den vorerwähnten Reaktionen erhält, wird in ähnlicher Weise durchgeführt wie dies für die vorerwähnte Methode A erklärt wurde. Weiterhin kann man die Entfernungsreaktion der Schutzgruppen E, F und G in ähnlicher Weise durchführen, wie dies für die Entfernung der Schutzgruppe C vorher erläutert wurde.

Aminosäuren (55), (56), (59), (62), (68), (71), (72), (75), (78), (84), (93) und (98), wie sie bei den vorerwähnten Methoden B-(I) bis B-(IV) verwendet werden, können bekannte, im Handel erhältliche Produkte sein. Peptide (65), (80), (88) und (95), wie sie bei den vorerwähnten Methoden B-(I) bis B-(IV) verwendet werden, können ebenfalls bekannte, im Handel erhältliche Produkte sein oder solche, die man nach der Mischanhydridmethode oder der Azidmethode erhält. Solche Methoden sind bereits in der vorerwähnten Methode A erläutert worden.

Peptid (81), das bei der vorerwähnten Methode B-(II) erwähnt wird, kann man erhalten, indem man die Schutzgruppen A und F von Peptid (69) entfernt, und das Peptid (89), das bei der vorerwähnten Methode B-(III) verwendet wird, erhält man durch Entfernen der Schutzgruppe A vom Peptid (82). Die Entfernungsreaktionen für die Schutzgruppen können nach den vorerwähnten Methoden erfolgen.

Methode C

Verfahren zur Herstellung eines Peptids der allgemeinen Formel (III)

C-(I): Wenn R3 ein Wasserstoffatom bedeutet.

A-Leu-Gln-B

H-Ar g-Ser-Ser-OH

C

I

A-Leu-Gln-Arg-Ser-Ser-OH

1

H-Leu-Gln-Arg-Ser-Ser-OH

(101)*

(102)

(103)

(104)

[worin das Peptid (101)* durch die folgende Stufe hergestellt wird:

A-Ser-B 15 | H-Ser-OR4 A-Ser-Ser-OR4

1

H-Ser-Ser-OR4 C

20

A-Arg-B

A-Arg-Ser-Ser-OR4

25 I

C

I

A-Arg-Ser-Ser-OH

I

C

30

H-Ar g-Ser-Ser-OH

(121)

(122)

(123)

(124)

(125)

(126)

(127) (101)*]

35 C-(II): Wenn R3 eine Gruppe der Formel H-Phe- bedeutet. C

40

H-Leu-Gln-Ar g-Ser-Ser-OH A-Phe-B

C

I

A-Phe-Leu-Leu-Gln-Arg-Ser-Ser-OH

H-P]

ie-Leu-Gln-Arg-Ser-Ser-OH

(105)

(106)

(107)

(108)

45

C-(III): Wenn R3 eine Gruppe der Formel H-Leu-Gly-Phe-bedeutet.

C

I

50 H-Phe-Leu-Gln-Ar g-Ser-Ser-OH ( 10)

A-Leu-Gly-B (110)

C

I

A-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Ar g-Ser-Ser-OH (111)

55 I

H-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Arg-Ser-Ser-OH (112)

C-(IV): Wenn R3 eine Gruppe der Formel H-Tyr-Asn-Leu-60 Leu-Gly-Phe- bedeutet.

C

I

H-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Ar g-Ser-Ser-OH A-Tyr-Asn-Leu-B

C

I

A-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Ar g-Ser-Ser-OH

65

(113) (114)*

(115)

9 652411

4 Bevorzugte Verfahren zur Herstellung des Peptids (114)

H-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Arg-Ser-Ser-OH aus dem Peptid (134) sind beispielsweise die Mischsäurean-

(116) hydridmethode, die Azidbildungsmethode, wie dies auch für die Methode A schon erwähnt wurde.

[worin das Peptid (114)* durch folgende Stufe hergestellt 5 Die nach den vorerwähnten Methoden erhaltenen Peptide wird: können in üblicher Weise aus dem Reaktionsgemisch isoliert und gereinigt werden, z.B. durch Extraktion, Teilung und A-Asn-B (128) Säulenchromatografie.

| . H-Leu-OR4 (12)

A-Asn-Leu-OR4 (130) io Wie erwähnt, erhält man synthetische Peptide, nämlich

\ N-terminierte Peptide von Human-Lymphoblastoid-Interfe-

H-Asn-Leu-OR4 (131) ron, C-terminierte Peptide von Human-Lymphoblastoid-In-

| . A-Tyr-B (132) terferon, N-terminierte Peptide von Human-Interferon-ß und

A-Tyr-Asn-Leu-OR4 (133) Derivate davon.

\ ls Die erhaltenen synthetischen Peptide können als mar-

A-Tyr-Asn-Leu-OH (134) kierte Antigene für eine Radio-Immuno-Assay (RIA) oder

| bei einer Fluoreszenzpolarisations-Immuno-Assay verwendet

A-Tyr-Asn-Leu-B (114)*] werden, indem man ein übliches Markierungsmittel, z.B. ra dioaktives Jod, wie I25J oder 131J, oder ein Fluorochrom, wie C-(V): Wenn R3 eine Gruppe der Formel H-Met-Ser-Tyr- 20 Fluoreszinisothiocyanat (FITC), Tetramethylrhodaminiso-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe- bedeutet. thiocyanat (TRITC), ein substituiertes Rhodaminisothiocy-

C anat (XRITC), Rhodamin B-isothiocyanat, Dichlorotriazin-

I fluoreszein (DTAF), ein Enzym oder dergleichen, einführt.

H-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Ar g-Ser-Ser-OH

I (117)25 Die Einführung von radioaktivem Jod erfolgt, indem man

T A-Met-Ser-B (118) ein Peptid mit einer Tyrosylgruppe unter den synthetischen

A-Met-Ser-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln- Peptiden, die vorher erwähnt wurden, mit einer üblichen Jo-

Arg-Ser-Ser-OH (119) dierungsmethode behandelt, z.B. durch eine oxidative Jodie-

I rang unter Verwendung von Chloramin T (cf. W.M. Hunter

C I 30 und F.C. Greenwood: Nature, 194, Seite 495 (1962); Bio-

I ehem. J., 89, Seite 114 (1963)). Diese Jodierangsmethode wird

H-Met-Ser-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Arg- in einem geeigneten Lösungsmittel, z.B. 0,2 M Phosphatpuf-

Ser-Ser-OH (120) ferlösung (pH 7,4) in Gegenwart von Chloramin T bei Raum-

Bei den vorerwähnten Methoden C-(I) bis C-(V) bedeutet temperate während 10 bis 30 Sekunden durchgeführt. Das R4 eine Niedrigalkylgruppe und A, B und C haben die vorher 35 radioaktive Jod kann in einer Menge von etwa 1 Millicurie angegebenen Bedeutungen. pro 1 Nanomol Tyrosinmolekül, das in dem Peptid enthalten

Die Umsetzung eines Peptids (100) mit einem Peptid ist, zusammen mit 10 bis 100 Nanomolen Chloramin T ver-

(101), eines Peptids (105) mit einer Aminosäure (106), eines wendet werden, wenn ein Atom des radioaktiven Jods in das Peptids (109) mit einem Peptid (110), eines Peptids (113) mit Tyrosinmolekül eingeführt wird. Werden zwei Atome an ra-einem Peptid (114), eines Peptids (117) mit einem Peptid 4o dioaktivem Jod in das Tyrosinmolekül eingeführt, dann kann (118), einer Aminosäure (121) mit'einer Aminosäure (122), ei- man 2 Millicurie radioaktives Jod pro 1 Nanomol des in dem nes Peptids (124) mit einer Aminosäure (125), einer Amino- Peptid enthaltenen Tyrosinmoleküls einführen, zusammen säure (128) mit einer Aminosäure (129) und eines Peptids mit 10 bis 100 Nanomolen Chloramin T.

(131) mit einer Aminosäure (132) kann in ähnlicher Weise er- Das mit dem radioaktiven Jod markierte Peptid kann in folgen wie die Umsetzung einer Aminosäure (2) mit einer 45 üblicher Weise isoliert und gereinigt werden, z.B. durch ExAminosäure (3) bei der vorerwähnten Methode A. traktion, Teilung, Säulenchromatografie oder Dialyse etc...

Die Entfernungsreaktion der Schutzgrappen A oder C Erforderlichenfalls kann man das markierte Peptid im lyo-von den jeweiligen Peptiden, wie man sie bei den vorerwähn- phonierten Zustand aufbewahren.

ten Reaktionen erhält, kann in ähnlicher Weise erfolgen, wie Ein mit einem Fluorochrom markiertes Peptid erhält dies für die Methode A schon erläutert wurde. 50 man, indem man das Fluorochrom in die endständige oder

Die Hydrolyse eines Peptids (126) oder (133) zur Herstel- Aminograppe des Moleküls des synthetischen Peptids in einer lung der Peptide (127) oder (134) kann in Gegenwart einer geeigneten Pufferlösung und unter alkalischen Bedingungen, Mineralsäure, wie Salzsäure, Schwefelsäure, oder von Alkali, vorzugsweise bei pH 8 bis 12, einführt. Die Pufferlösung ist wie Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid, in einemLö- nicht besonders beschränkt und kann in einem weiten Bereich sungsmittel, wie Methanol, Ethanol oder Dioxan, erfolgen. 55 gewählt werden, soweit der pH der Pufferlösung sich im obi-Die Umsetzung wird im allgemeinen bei 20 bis 500 C während gen Bereich bewegt.

30 Minuten bis 3 Stunden durchgeführt. Als Pufferlösung kommen beispielsweise in Frage eine

Das bei der vorerwähnten Methode C-(II) verwendete Boratpufferlösung, eine Bikarbonatpufferlösung, eine Gly-Peptid (105) erhält man, indem man die Schutzgrappe A vom zinpufferlösung, eine Barbitalpufferlösung, eine Trispufferlö-Peptid (102) entfernt. In gleicher Weise kann man das bei der 60 sung, eine Ammediolpufferlösung, Ringer's-Pufferlösung Methode C-(III) verwendete Peptid (109) durch Entfernen der und dergleichen. Falls das Peptid und/oder Fluorochrom in Schutzgruppe A vom Peptid (107) und das Peptid (113), wie der Pufferlösung nicht löslich ist, kann man die Markierungs-es bei der Methode C-(IV) verwendet wird, durch Entfernen reaktion auch durch Zugabe eines gemeinsamen Lösungsmit-der Schutzgruppe A von dem Peptid (111) herstellen, und das tels, z.B. Methanol, Ethanol, Aceton, Dimethylformamid Peptid (117), das bei der Methode C-(V) verwendet wird, er- 65 und dergleichen, zu dem Reaktionssystem durchführen.

hält man durch Entfernen der Schutzgruppe A von dem Pep- Die Markierungsreaktion verläuft im allgemeinen bei tid (115). Die Entfernungsreaktion der Schutzgruppen wird in etwa 0 bis 40 °C und vorzugsweise 0 bis 20 °C und ist in eini-ähnlicher Weise durchgeführt, wie schon vorher dargelegt. gen Minuten bis etwa 48 Stunden beendet.

652 411 10

Es besteht keine besondere Beschränkung hinsichtlich der einer Fluoreszenzpolarisations-Immuno-Assay üblicherweise Menge des Fluorochroms. Dieses Verhältnis kann in einem angewendet werden.

weiten Bereich gewählt werden und im allgemeinen verwendet Das Verfahren zur Bestimmung von Interferonen kann man die 1- bis 10-fache molare Menge und vorzugsweise 2- unter Verwendung von Standard-Antigen und der entspre-bis 4-fache molare Menge des Fluorochroms pro eine in dem 5 chenden Antikörper sowie von mit Fluorochrom markierten Peptid enthaltene Aminogruppe. Das so mit einem Fluoro- Peptiden durchgeführt werden. Als Standardantigen kann ein chrom markierte Peptid kann isoliert und gereinigt und gela- natives Human-Interferon- oder ein natives Human-Interfe-gert werden, in ähnlicher Weise wie ein mit einem radioakti- ron-B oder ein Peptid der allgemeinen Formeln (I) bis (III) ven Jod markiertes Peptid. mit einem Antigenitätsäquivalent gegenüber Human-Interfe-

Bisher sind Interferone indirekt durch biologische Mess- io ron-a oder -ß verwendet werden. Verwendet man das Peptid, methoden auf Basis ihrer physiologischen Aktivität bestimmt dann kann die Wirksamkeit von Interferon in einer unbe-worden (Finter, N.B. in Interferon and Interferon Inducers, kannten Probe in einfacher Weise bestimmt werden, wenn herausgegeben von Finter, N.B., Seiten 135 bis 170, Nord- man die Kreuzreaktivität von Human-Interferon-a oder -ß Holland, Amsterdam 1973). Die biologische Messmethode und des Peptids gegen den Antikörper vor dem Test kennt, erforderte lebende Zellen und lebende Viren, welche die Zel- is Berücksichtigt man die Mühen, Kosten und die Arbeitsweise, len infizieren können, und die Wirksamkeit der Interferone wie sie zur Erzielung eines gereinigten Produktes bei einem wurde untersucht, indem man direkt oder indirekt das Aus- Standardantigen erforderlich sind, dann liegen die Vorteile mass der getöteten Zellen, verursacht durch die Vireninfek- bei der Verwendung des Peptids auf der Hand.

tion, mass. Eine solche biologische Messung ergibt jedoch un- Als Antikörper zu dem Interferon, wie es bei der erwähnstabile und streuende Ergebnisse, weil die bei dieser Methode 20 ten Assay-Methode verwendet wird, kann jeder Antikörper verwendeten Materialien lebende Organismen sind. Wenn gegenüber Human-Interferon-a oder -ß oder ein Peptid der ausserdem irgendeine Substanz mit Antivirenaktivität ausser allgemeinen Formeln (I) bis (III) verwendet werden und Vörden zu untersuchenden Interferonen in den Testproben vor- zugsweise wird, wie später noch erklärt wird, ein Antikörper handen ist, dann werden solche biologische Messmethoden als Hapten verwendet, der eine hohe Spezifität gegenüber Hu-zur Bestimmung von Interferonen bedeutungslos. Weiterhin 25 man-Interferon-a oder -ß aufweist und der unter Verwendung kann man mit diesen biologischen Messmethoden keine se- des Peptids der allgemeinen Formeln (I) bis (III) hergestellt lektive Bestimmung von Human-Interferon-a oder Human- wurde.

Interferon-ß durchführen. Darüber hinaus fordert eine biolo- Die Reihenfolge der Messverfahren ist so, dass zuerst eine gische Messmethode einige Tage Zeit, um anhand der ablau- Reihe von verdünnten Proben von Standardantigen durch fenden komplizierten Verfahrensweisen Ergebnisse zu erzie- 30 Verdünnung des Antigens mit einem geeigneten Lösungsmit-len und eine solche Methode entspricht nicht den Erfordernis- tel hergestellt wird. Hinsichtlich des Verdünnungslösungsmit-sen der Medizin. tels besteht keine besondere Begrenzung und man kann hier

Zum Unterschied von einer solchen biologischen Mess- jeden geeigneten Typ verwenden. Insbesondere kann man ei-methode verläuft die neue Methode zur Bestimmung von Hu- ne Pufferlösung mit einem pH von 5 bis 10 und vorzugsweise man-Interferon, bei welcher man eine Radio-Immuno-Assay 35 7 bis 8, z.B. eine Boratpufferlösung, eine Tris-HCl-Pufferlö-(RIA) oder eine Fluoreszenzpolarisations-Immuno-Assay sung, eine Phosphatpufferlösung, eine Essigsäurepufferlö-unter Verwendung von markierten Antigenen (markierten sung, eine Zitronensäure-Phosphorsäure-Pufferlösung, eine Peptiden) anwendet, Human-Interferon-a oder Human-Inter- Glyzinpufferlösung und dergleichen, verwenden. Um eine feron-ß selektiv, einfach und schnell und mit grosser Genau- Adsorption zu inhibieren, kann man zu der Verdünnungslö-igkeit. 40 sung Rinderserumalbumin oder Natriumazid zugeben und

Eine Fluoreszenzpolarisations-Immuno-Assay ist be- als Konservierungsmittel EDTA, Natriumchlorid und der-kannt, jedoch war nicht bekannt, dass man eine solche Me- gleichen. Dann gibt man vorbestimmte Mengen an Antikör-thode zur qualitativen Bestimmung von Interferonen anwen- per und vorbestimmte Mengen an mit einem Fluorochrom den kann. Dies beruht auf der Tatsache, dass ein gereinigtes, markierten Peptid zu den jeweiligen Proben der Verdün-mit einem Fluorochrom markiertes Interferon bisher prak- 45 nungsserien des Standardantigens, wobei man jetzt Proben tisch nicht hergestellt wurde und wenn man ein derartig gerei- erhält, die man dann bei 0 bis 37 0 C 30 Minuten bis 48 Stun-nigtes, mit einem Fluorochrom markiertes Interferon hätte den stehen lässt, worauf man dann die Stärke der senkrech-erhalten können, hätte eine solche markierte Substanz mit ei- ten, polarisierten Fluoreszenz (IVs) und die Stärke der hori-nem grossen Molekulargewicht nur eine kleine Veränderung zontalen polarisierten Fluoreszenz (IHs) in üblicher Weise hinsichtlich des Polarisationsgrades (P-Wert) ergeben und 50 misst. Die Messung der polarisierten Fluoreszenz kann in eineine befriedigende empfindliche, qualitative Bestimmung facher Weise unter Verwendung üblicher Vorrichtungen zur wäre nicht möglich gewesen. Messung der Stärke von polarisiertem Licht durchgeführt

Dagegen kann man den mit einem Fluorochrom markier- werden, z.B. mit der im Handel erhältlichen Vorrichtung «FS ten Peptiden eine grosse Änderung des Polarisationsgrades 501» (hergestellt von Union-Giken-Sha, Co., Ltd.).

(P-Wert) erzielen und die fluorochrommarkierten Peptide 55 Nach einem ähnlichen wie dem vorstehend genannten sind brauchbare markierte Substanzen zur Bestimmung von Verfahren zur Herstellung von Verdünnungsserien von Human-Interferon-a oder Human-Interferon-ß und zwar mit Standardantigenproben, kann man eine Reihe von Ver-einer befriedigenden qualitativen Genauigkeit. Aufgrund der gleichsproben herstellen, welche kein mit Fluorochrom mar-Entwicklung von mit Fluorochrom entwickelten Peptiden kiertes Peptid enthalten und die Stärke der senkrechten pola-wird eine qualitative Bestimmung von Human-Interferon-a 60 risiertenFluoreszenz (Ivr) und die Stärke der horizontalen po-oder Human-Interferon-ß unter Anwendung der vorerwähn- Iarisierten Fluoreszenz (IHR) wird gemessen, ten Fluoreszenzpolarisations-Immuno-Assay möglich. Man erhält dann eine Standardkurve des Polarisierungs grades (P-Wert) gegen die Konzentration der Probe in der Verfahren zur Bestimmung von Interferon durch eine Verdünnungsserie des Standardantigens. Der Polarisierungs-Fluoreszenzpolarisations-Immuno-Assay werden nachfol- 65 grad (P-Wert) wird gemäss folgender Formel berechnet:

gend beschneben. /r y \ /t j \

Die Reihenfolge der Messverfahren und Operationen ist p = vs~ HS^—l hs~ hrJ x 100(%)

dabei nicht grundsätzlich von solchen verschieden, wie sie bei (Ivs~Ivr) + (Ihs~Ihr)

11 652 411

Anstelle einer Standardantigenprobe kann man unter hin auch Diazoniumarylcarboxylsäuren, wie p-Diazonium-Verwendung von Proben, die Human-Interferon-a oder -ß phenylessigsäure und dergleichen. Diese werden in Kombina-unbekannter Konzentration enthalten, das in den Proben ent- tion mit einem üblichen Peptidbindungsbildungsmittel, z.B. haltene Human-Interferon-a oder -ß aus der Standardkurve dem vorerwähnten Dehydrokondensierungsmittel, verbestimmen, indem man in ähnlicher Weise den P-Wert be- 5 wendet.

rechnet. Die Umsetzung zur Herstellung eines Antigens wird bei-

Wird ein natives Human-Interferon-a oder -ß als Stan- spielsweise in einer wässrigen Lösung oder in einer üblichen dardantigen verwendet, so kann man die Stärke des Interfe- Pufferlösung mit einem pH von 7 bis 10 und vorzugsweise 8

rons in der Probe aus der Standardkurve erhalten. bis 9 bei 0 bis 40 °C und vorzugsweise bei Raumtemperatur

Wird ein Peptid der allgemeinen Formeln (I) bis (III) als 10 durchgeführt. Die Umsetzung erfolgt während 1 bis 24, vor-

Standardantigen verwendet, so stellt man vor dem Versuch zugsweise 3 bis 5 Stunden.

die Kreuzreaktivität von Human-Interferon-a oder -ß und des 0,2M Natriumhydroxid - 0,2M Borsäure - 0,2M Kali-

Peptids gegenüber dem Antikörper fest und berechnet daraus umchloridpufferlösung,

die Stärke an Interferon. 0,2M Natriumkarbonat - 0,2M Borsäure - 0,2M Kali-

Die synthetischen Peptide können als Haptene zur Her- 15 umchloridpufferlösung,

Stellung von Human-Interferon-a- oder -ß-Antigen verwendet 0,05M Natriumtetraborat - 0,2M Borsäure - 0,05M Na-

werden. triumchloridpufferlösung, und

Verfahren zur Herstellung von Human-Interferon-a- oder 0,1M Kaliumdihydrophosphat - 0,05M Natriumtetrabo-

-ß-Antigen werden nachfolgend erläutert. ratpufferlösung.

Human-Interferon-a- oder ß-Antigen erhält man, indem 20 Bei der vorerwähnten Umsetzung kann das Verhältnis der man ein als Hapten verwendetes synthetisches Peptid mit ei- Mengen eines Haptens zu einem Haptenträgerbindungsmittel nem Träger in Gegenwart eines Hapten-Trägergebundenen und einem Träger in geeigneter Weise bestimmt werden, wo-

Reagenzes umsetzt. bei im allgemeinen die 2- bis 6-fache Gewichtsmenge und vor-

Als an das Hapten zu bindenden Träger, wie er für die zugsweise 3- bis 5-fache Gewichtsmenge des Trägers, bezogen vorerwähnte Methode verwendet wird, kommt ein natür- zs auf das Hapten, verwendet wird und die 5- bis 10-fache mo-

liches oder synthetisches Protein mit hohem Molekularge- lare Gewichtsmenge des Hapten-Träger-Bindungsmittels, be-

wicht, wie es üblicherweise zur Herstellung von Antigenen zogen auf das Hapten, verwendet wird. Gemäss der vorer-

verwendet wird, in Frage, z.B. tierisches Serumalbumin, wie wähnten Reaktion kann man ein Human-Interferon-a- oder

Pferdeserumalbumin, Rinderserumalbumin, Kaninchense- -ß-Antigen aus einem Träger und einem Hapten, die beide rumalbumin, Schafserumalbumin oder auch Humanserumal- 30 durch ein Hapten-Träger-Bindungsmittel vereint sind, er-

bumin, sowie auch animale Serumglobuline, wie Pferdese- halten.

rumglobulin, Rinderserumglobulin, Kaninchenserumglobu- Nach Beendigung der Umsetzung kann man das so erhal-

lin, Schafserumglobulin und Humanserumglobulin. Ferner- tene Antigen in einfacher Weise isolieren und reinigen, indem hin auch animalische Thyroglobuline, wie Pferdethyroglobu- man eine übliche Dialyse oder Gelfiltration oder fraktionierte lin, Rinderthyroglobulin, Kaninchenthyroglobulin, Schaf- 35 Fällung durchführt. Gewünschtenfalls kann man das Antigen thyroglobulin oder Humanthyroglobulin oder animalische in üblicher Weise in lyophilisierter Form aufbewahren.

Hämoglobuline, wie Pferdehämoglobulin, Rinderhämoglo- Auf diese Weise erhält man Human-Interferon-a- oder -ß-

bulin, Kaninchenhämoglobulin, Schafhämoglobulin und Antigen-Zusammensetzungen aus einem der synthetischen

Humanhämoglobulin; animalische Hämocyanine; Proteine, Peptide und dem Träger. Das Antigen ist eine Zusammenset-

extrahiert von Ascariden (Ascaridenextrakte selbst, wie sie in 40 zung, bei der im allgemeinen durchschnittlich 5 bis 20 Mole

JA-OS 16 414/1981, J. Immun., 111,260-268 (1973); J. Im- des Peptids mit 1 Mol des Proteins kombiniert sind und von mun., 122,302-308 (1979); J. Immun., 98,893-900 (1967) dem Antigen kann man einen Antikörper mit einer hohen und Am. J. Physiol., 199,575-578 (1960) beschrieben werden, Spezifität gegenüber Human-Interferon-a oder -ß mit guter oder Produkte, die man daraus durch weitere Reinigung er- Wiederholbarkeit herstellen. Von den Antigenzusammenset-

hält); Polylysin, eine Polyglutaminsäure, ein Lysin-Glutamin- 45 zungen ist insbesondere ein solches mit einem Bindungsver-

säure-Copolymer - ein Copolymer enthaltend Lysin oder Or- hältnis von Protein zu Peptid von 1:8 bis 1:15 mit einer hohen nithin. Spezifität bevorzugt, weil man daraus einen Antikörper mit

Als Hapten-Träger-Bindungsmittel kommen die üblicher- hoher Wirksamkeit und hoher Empfindlichkeit herstellen weise bei der Herstellung von Antigenen verwendeten in kann.

Frage, insbesondere aliphatische Dialdehyde, wie Glyoxal, 50 Zubereitungen von Antikörpern unter Verwendung eines Malondialdehyd, Glutaraldehyd, Succinaldehyd, Adipoalde- wie oben erhaltenen Antigens, kann man wie folgt herstellen, hyd usw., die Vernetzungsbindungen zwischen zwei Amino- Hierzu wird das Antigen einem Säugetier verabreicht und der gruppen bilden können; Dimaleimidverbindungen, wie N,N'- in dem Säugetier erzeugte Antikörper wird dann gesammelt. o-Phenylendimaleimid, N,N'-m-Phenylendimaleimid und Es besteht keine besondere Beschränkung bei der Ausdergleichen, und solche, die Vernetzungsbindungen zwischen 55 wähl des Säugetiers für die Herstellung des Antikörpers, wo-zwei Thiolgruppen bilden können; Maleimidocarboxyl-N- bei man im allgemeinen jedoch Kaninchen oder Meer-hydroxysuccinimidoester-Verbindungen, wie Metamaleimi- schweinchen bevorzugt. Bei der Bildung des Antikörpers wird dobenzoyl-N-hydroxysuccinimidoester,4-(Maleimidometh- eine vorbestimmte Menge des wie oben erhaltenen Antigens yl)-cyclohexan-1 -carboxyl- N'-hydroxysuccinimidoester und mit einer physiologischen Kochsalzlösung auf eine geeignete dergleichen, d.h. solche, die Vernetzungsbindungen zwischen 60 Konzentration verdünnt und diese verdünnte Lösung wird Aminogruppen und Thiolgruppen herstellen können; Dehy- dann weiter verdünnt, indem man Freund's Adjuvant (com-drokondensierungsmittel, wie N,N-Dicyclohexylcarbodiimid plete Freund's adjuvant) unter Herstellung einer Suspension (DCC), N-Ethyl-N'-dimethylaminocarbodiimid, l-Ethyl-3- abmischt und die Suspension dann dem Säugetier verab-diiSopropylaminocarbodiimid, l-Cyclohexyl-3- (2-morpho- reicht. Beispielsweise kann man eine solche Suspension intra-linyl-4-ethyl)- carbodiimid und dergleichen, solche, die für 65 kutan einem Kaninchen in einer Menge von 0,5 bis 5 mg des eine gemeinsame Peptidbindungsbildungsreaktion, wie sie Antigens pro Verabreichung verabreichen und die Verabrei-beispielsweise beim Kombinieren einer Aminogruppe mit ei- chungen werden jede zweite Woche während 2 bis 10 Monaner Carboxylgruppe vorliegt, verwendet werden und weiter- ten und vorzugsweise 4 bis 6 Monaten durchgeführt, um eine

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Immuniserung zu bewirken. Zum Sammeln des Antikörpers anilinozellulose und dergleichen, oder einen Träger vom Typ nimmt man von dem immunisierten Tier zu dem Zeitpunkt, eines vernetzten Dextrans, wie Sephadex, CM-Sephadex (herbei dem eine grosse Menge des Antikörpers nach der Verab- gestellt von der Pharmacia Fine Chemicals Inc.) und derglei-reichung der Suspension in dem Tier gebildet wurde, im allge- chen verwenden oder auch einen agaroseartigen Träger, wie meinen 1 bis 2 Wochen nach der letzten Verabreichung der 5 Sepharose 2B, Sepharose 4B, Sepharose 6B (hergestellt von Suspension, Blut ab. Das dem Tier entnommene Blut wird Pharmacia Fine Chemicals Inc.).

mit einer Zentrifuge behandelt und das Serum zum Erhalt des Beim Kuppeln des so erhaltenen cyanogenbromidakti-Antikörpers abgetrennt. Erfindungsgemäss kann man auf- vierten Trägers mit Human-Interferon-Antikörper kann die grand der besonderen Eigenschaften des Antigens einen Anti- 30- bis 80-fache Gewichtsmenge des cyanogenbromidakti-körper mit einer ausgezeichneten Spezifität gegenüber Hu- io vierten Trägers mit dem Human-Interferon-Antikörper in ei-man-Interferon-a oder -ß mit hoher Wirksamkeit und hoher nem geeigneten Lösungsmittel, wie einer wässrigen 0, IM Na-Empfindlichkeit erhalten. triumhydrogenkarbonatlösung (enthaltend 0,5M Natrium-Die erfindungsgemäss erhaltenen Antikörper weisen eine chlorid, pH = 8,4), bei im allgemeinen 0 bis 40 °C und vorausgezeichnete Spezifität gegenüber Human-Interferon-a zugsweise bei 2 bis 8 °C während 10 bis 20 Stunden angewen-oder -ß auf und sind zur Bestimmung von Human-Interfe- is det werden. Auf diese Weise erhält man ein Adsorbens für ron-a oder -ß in RIA-Methoden mit hoher Genauigkeit geeig- eine Affmitätschromatographie gemäss der vorliegenden Er-net. Weiterhin kann man den Antikörper bei einer Enzym- findung. Dieses Adsorbens kann in einem geeigneten Lö-Immuno-Assay (EIA)-Methode, einer Fluoreszenz-Immuno- sungsmittel, z.B. in einer physiologischen Kochsalzlösung, Assay (FIA)-Methode oder bei einer ähnlichen Methode, bei aufbewahrt werden.

welcher der Antikörper mit einem Enzym oder mit einem 20 Zur näheren Erklärung der Erfindung und der Peptide

Fluorochrom markiert wurde, verwenden. Weiterhin kann werden Beispiele von Zubereitungen für Peptide, Antigene man den Antikörper als Ausgangsmaterial zur Herstellung ei- und Antikörper gezeigt.

nes Adsorbens, der für die Affinitätschromatographie ver- In den nachfolgenden Herstellungsbeispielen wird der Rf-

wendet wird, anwenden, indem man den Antikörper auf ei- Wert unter Verwendung der folgenden Mischlösungsmittel nem geeigneten unlöslichen Träger immobilisiert. 25 mittels einer Dünnschichtchromatographfie auf Kieselgel be-

Unter Verwendung eines Adsorbens für die Affinitäts- stimmt

Chromatographie kann man Human-Interferon-a oder -ß aus Rf1:1-Butanol-Essigsäure-Wasser (4:1:5)

einem Rohprodukt des Interferons isolieren und reinigen, in- Rf": 1-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (15:10:3:12) dem man die Art des verwendeten Antikörpers gezielt auswählt. Verwendet man ein Adsorbens, an dem Human-Inter- 3° Synthese von Peptiden feron-a-Antikörper immobilisiert ist, dann wird Human-In- Herstellungsbeispiel A-l terferon-a selektiv daran adsorbiert und in gleicher Weise (1) Herstellung von Z-Ala-Gln-OH wird dann, wenn man Human-Interferon-ß-Antikörper auf Zu einer Lösung von 4,80 g Z-Ala-OSu in 60 ml Tetra-einem Adsorbens immobilisiert, das Human-Interferon-ß se- hydrofuran wurde eine Lösung aus 2,19 g H-Gln-OH in lektiv daran adsorbiert. Dann wird von dem Adsorbens, das 35 40 ml Wasser und 2,10 ml Triethylamin gegeben und die Mi-Human-Interferon-a oder -ß adsorbiert enthält, das Human- schung wurde 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Te-Interferon-a oder -ß unter milden Bedingungen in einfacher trahydrofuran und Wasser wurden abdestilliert und der Weise desorbiert und auf diese Weise kann man ein hochrei- Rückstand wurde mit n-Butanol extrahiert. Das n-Butanol-nes Human-Interferon-a oder -ß qualitativ ohne Aktivitäts- extrakt wurde mit 2%-iger Essigsäure gewaschen und dann verlust gewinnen. 40 wurde das Butanol abdestilliert. Die ausgefallene Substanz Das Adsorbens für die Affinitätschromatographie kann wurde durch Filtrieren gesammelt und aus Methylen-Ethyl-in der nachfolgend beschriebenen Weise erhalten werden. acetat umkristallisiert, wobei man 3,87 g Z-Ala-Gln-OH

Beim Immobilisieren von Human-Interferon-Antikörper erhielt auf einem unlöslichen Träger können übliche Methoden zum RF1:0,41

Immobilisieren eines Biomaterials angewendet werden. Eine 45 Rf11:0,56 bevorzugte Methode ist dabei die cyanogenbromidaktivierte

Polysaccharidmethode. Bei der cyanogenbromidaktivierten Elementaranalyse für CI6H2iN306 Polysaccharidmethode wird zunächst ein unlöslicher Träger mit Cyanogenbromid behandelt und der so erhaltene akti- Berechnet (%): C 54,69 H 6,02 N 11,96

vierte Träger wird dann mit einer Biosubstanz unter milden 50 Gefunden (%): 54,50 6,31 11,62

Bedingungen zum Immobilisieren der Biosubstanz behandelt.

Bei der Behandlung des unlöslichen Trägers mit Cyanogen- (2a) Herstellung von H-Ala-Gln-OH

bromid kann die Behandlung bei einem pH von 11 bis 12 un- 3,50 g Z-Ala-Gln-OH wurden in 50 ml Wasser und 30 ml ter Verwendung einer basischen Verbindung, z.B. von Natri- Methanol gelöst und die Mischung wurde katalytisch unter umhydroxid oder Natriumhydrogenkarbonat, bei Raumtem- 55 Verwendung von Palladium als Katalysator reduziert, wobei peratur in einem Lösungsmittel, z.B. Wasser, Acetonitril und man H-Ala-Gln-OH erhielt.

dergleichen, während etwa 1 bis 12 Minuten durchgeführt Rf1:0,04

werden. Das Mengenverhältnis von Cyanogenbromid zur

Menge des unlöslichen Trägers hegt im allgemeinen bei glei- (2b) Herstellung von Z-Leu-Ala-Gln-OH

chen Gewichtsmengen. Als unlöslicher Träger kann jeder un- 60 3,97 g Z-Leu-OSu, das gemäss (2a) erhaltene H-Ala-

lösliche Träger verwendet werden, der eine niedrige nicht-spe- Gln-OH und 1,39 ml Triethylamin wurden in 50 ml Dimeth-

zifische Adsorptionsfahigkeit gegenüber Biosubstanzen auf- ylformamid gelöst und die Mischung wurde 20 Stunden bei weist, der eine hohe Porosität hat und der funktionelle Grup- Raumtemperatur gerührt. Dimethylformamid wurde abde-

pen aufweist, die in der Lage sind, die Biosubstanz unter mil- stilliert und der Rückstand wurde mit Ethylacetat extrahiert,

den Bedingungen zu immobilisieren und dabei auch ausrei- 65 Das Extrakt wurde mit 1N Zitronensäure dreimal und mit chend chemisch und physikalisch stabil ist. Beispielsweise Wasser fünfmal gewaschen. Ethylacetat wurde abdestilliert kann man einen zelluloseartigen Träger, wie Aminoethylzel- und zu dem Rückstand wurde Ether gegeben und der ausge-

lulose, Carboxymethylzellulose, Bromoacetylzellulose, Para- fallene Niederschlag wurde filtriert und getrocknet und dann

13

652 411

aus Methanol-Ethylacetat umkristallisiert, wobei man 2,15 g Z-Leu-Ala-Gln-OH erhielt.

Rf1:0,49 Rf11:0,62

Elementaranalyse für C22H32N4O7

Berechnet (%): C 56,88 H 6,94 N 12,06

Gefunden (%): 65,41 6,80 12,18

(3a) Herstellung von H-Leu-Ala-Gln-OH

Zu 2,10 g Z-Leu-Ala-Gln-OH wurden 20 ml einer 25% Bromwasserstoff enthaltenden Essigsäurelösung gegeben und die Mischung wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur stehen gelassen. Nach Beendigung der Umsetzung wurde zum Reaktionsgemisch trockener Ether gegeben, wobei man H-Leu-Ala-Gln-OH erhielt.

Rf1:0,10

(3b) Herstellung von H-Leu-Leu-Ala-Gln-OH

196 g Z-Leu-OSu, 0,63 ml Triethylamin und das vorstehend erhaltene H-Leu-Ala-Gln-OH wurden in 50 ml Dimeth-ylformamid gelöst und 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach dem Abdestillieren von Dimethylformamid wurde zum Rückstand IM Zitronensäure gegeben und die ausgefallenen Kristalle wurden durch Filtrieren gesammelt. Die Kristalle wurden bis zum Erhalt eines neutralen Filtrats gewaschen und dann getrocknet. Die getrockneten Kristalle wurden mit Methanol-Ethylacetat umkristallisiert, wobei man 1,63 g Z-Leu-Leu-Ala-Gln-OH erhielt.

Rf1:0,58 Rf11:0,64

Elementaranalyse für C28H43N508

Berechnet (%): C 58,22 H 7,50 N 12,12

Gefunden (%): 57,85 7,90 11,96

(4a) Herstellung von H-Leu-Leu-Ala-Gln-OH

Zu 1,50 g Z-Leu-Leu-Ala-Gln-OH wurden in 20 ml 25% Bromwasserstoff enthaltende Essigsäure gegeben und die Mischung wurde bei Raumtemperatur 1 Stunde gerührt. Zu dem Reaktionsgemisch wurde trockener Ether gegeben und der ausgefallene Feststoff wurde durch Filtrieren gesammelt, wobei man H-Leu-Leu-Ala-Gln-OH erhielt.

Rf1:0,19

(4b) Herstellung von Z-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH

1,41 g Z-Ile-OSu, das vorstehend erhaltene H-Leu-Leu-Ala-Gln-OH und 0,36 ml Triethylamin wurden in 50 ml Dimethylformamid gelöst und die Mischung 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach dem Abdestillieren von Dimethylformamid wurde IN Zitronensäure zum Rückstand gegeben und die ausgefallenen Kristalle wurden durch Filtrieren gesammelt und mit heissem Methanol gewaschen, wobei man 1,17 g Z-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH erhielt.

Rf1:0,61 Rf11:0,71

Elementaranalyse für C34H54N609

Berechnet (%): C 59,11 H 7,87 N 12,16

Gefunden (%): 59,23 7,80 12,02

(5a) Herstellung von H-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH

Zu 1,10 g Z-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH wurden 15 ml Essigsäure, enthaltend 25% Bromwasserstoff, gegeben und die Mischung wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt.

Nach Beendigung der Umsetzung wurde trockener Ether zum Reaktionsgemisch gegeben, wobei man H-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH erhielt.

Rf1:0,25

5

(5b) Herstellung von Z-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH

0,69 g Z-Leu-OSu, das oben erhaltene H-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH und 0,22 ml Triethylamin wurden in 50 ml Dimethylformamid gelöst und die Mischung wurde 20 Stunden

10 bei Raumtemperatur gerührt. Nach dem Abdestillieren von Dimethylformamid wurde zum Rückstand IN Bernsteinsäure gegeben und der ausgefallene Niederschlag wurde durch Filtrieren gesammelt und mit Wasser gewaschen, bis das Filtrat neutral war, und dann getrocknet. Das trockene

15 Material wurde mit heissem Methanol gewaschen, wobei man 1,10 g Z-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH erhielt.

Rf1:0,58 Rf11:0,71

20Elementaranalyse für C4oH65N7Oio

Berechnet (%): C 59,75 H 8,15 N 12,19

Gefunden (%): 59,60 8,02 11,92

25 (6) Herstellung von H-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH

0,50 g Z-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH wurden in 50 ml Methanol und 10 ml 10%-iger Essigsäure gelöst und die Mischung wurde unter Verwendung von Palladium als Katalysator reduziert, wobei man H-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH

30 erhielt. Dieses Produkt wird nachfolgend als Peptid A bezeichnet.

Rf1:0,23 Rf11:0,61

35 Elementaranalyse für C^HsjNyOg^^O

Berechnet (%): C 54,45 H 8,99 N 13,89

Gefunden (%): 54,30 8,81 13,98

40 Herstellungsbeispiel A-2 (1) Herstellung von Boc-Ala-NHNHZ

4,99 g Boc-Ala-OH, 4,36 g NH2-NH-Z und 5,44 g Di-cyclohexylcarbodiimid wurden in 150 ml Tetrahydrofuran gelöst und die Mischung wurde 20 Stunden bei 4 °C gerührt.

45 Die im Reaktionsgemisch gebildete feste Masse wurde abfiltriert und das Filtrat wurde destilliert und zu dem dabei erhaltenen Rückstand wurde Ether gegeben. Der Niederschlag wurde durch Filtrieren gesammelt und aus Ether und Petrol-ether umkristallisiert, wobei man 7,03 g Boc-Ala-NHNHZ

50 erhielt.

Rf1:0,79 Rf11:0,81 Elementaranalyse für Ci6H23N305

ss Berechnet (%): C 56,96 H 6,87 N 12,45

Gefunden (%): 56,81 6,49 12,34

(2a) Herstellung von H-Ala-NHNHZ

3,00 g Boc-Ala-NHNHZ wurden in 10 ml Trifluoressig-

60 säure gelöst und 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen und dann wurde die Trifluoressigsäure abdestilliert und getrocknet, wobei man H-Ala-NHNHZ erhielt.

Rf":0,51

65 (2b) Herstellung von Boc-Arg(N02)-Ala-NHNHZ

2,84 g Boc-Arg(N02)-OH wurden in 40 ml einer 0,91 ml N-Methylmorpholin enthaltenden Tetrahydrofuranlösung gelöst und die Mischung wurde auf — 15 °C gekühlt und dazu

652411

14

wurden unter kräftigem Rühren während 30 Sekunden 1,17 ml Isobutylchloroformiat gegeben. Zu dem Reaktionsgemisch wurde eine Lösung von H-Ala-NHNHZ in 20 ml Dimethylformamid gegeben sowie 1,24 ml Triethylamin und dann wurde 1 Minute gerührt. Man Hess das Reaktionsgemisch 5 Minuten bei 0 °C stehen und erwärmte dann 2 Minuten auf 40 °C und rührte anschliessend 15 Minuten bei Raumtemperatur. Nach dem Abdestillieren von Tetrahydrofuran und Dimethylformamid wurde der Rückstand mit Ethylacetat extrahiert. Das Extrakt wurde mit IN Zitronensäure gewaschen und anschliessend mit einer gesättigten wässrigen Natriumhydrogenkarbonatlösung und im Anschluss daran mit einer gesättigten Kochsalzlösung. Nach dem Abdestillieren des Ethylacetats wurde aus Ethylacetat-Ether umkristallisiert, wobei man 3,70 g Boc-Arg(N02)-Ala-NHNHZ erhielt.

Rf1:0,68

Rf11:0,79

(4b) Herstellung von Boc-Asn-Arg(N02)-Arg(N02)-Ala-NHNHZ

H-Arg(N02)-Arg(N02)-Ala-NHNHZ wurde in 50 ml Dimethylformamid gelöst und zu dieser Lösung wurden 0,56 ml 5 Triethylamin und 2,17 g Boc-Asn-ONHS gegeben und die Mischung Hess man 20 Stunden bei Raumtemperatur stehen. Dimethylformamid wurde abdestilliert und der Rückstand wurde mit Butanol extrahiert. Das Extrakt wurde mit 2%-iger Essigsäure zweimal gewaschen und dann mit Ether loausgefällt und die Kristalle wurden durch Filtrieren gesammelt und aus Methanol-Essigsäure umkristallisiert, wobei man 2,64 g Boc-Asn-Arg(N02)-Arg(N02)-Arg-NHNHZ erhielt.

Rf1:0,40 15 Rf«: 0,72

Elementaranalyse für C32H51N150,3

Elementaranalyse für C22H34N808

Berechnet (%): Gefunden (%):

C 49,06 49,40

H 6,36 6,72

N 20,80 20,43

Berechnet (%): C 45,01

2oGefunden (%): 44,80

H 6,02 5,85

N 24,60 24,12

(3a) Herstellung von H-Arg (N02)-Ala-NHNHZ

3,67 g Boc-Arg(N02)-Ala-NHNHZ wurden in 15 ml Trifluoressigsäure gelöst und 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen. Dann wurde trockener Ether zugegeben und die auskristallisierten Kristalle wurden abfiltriert, wobei man H-Arg(N02)-Ala-NHNHZ erhielt.

Rf1:0,20

(4c) Herstellung von Boc-Asn-Arg-Arg-Ala-NHNH2

2,50 g Boc-Asn-Arg(N02)-Arg(N02)-Ala-NHNHZ wurden in einer Mischung aus 30 ml Methanol mit 30%-iger Es-25 sigsäure gelöst und die Lösung wurde katalytisch unter Verwendung von PaUadium als Katalysator reduziert, wobei man 2,20 g Boc-Asn-Arg-Arg-Ala-NHNH2 erhielt.

Rf1:0,06 Rf11:0,40

30

Elementaranalyse für C24H47N1307-2CH3C02H-H20

(3b) Herstellung von Boc-Arg(N02)-Arg(N02)-Ala-NHNHZ

2,17 g Boc-Arg(N02)-OH wurden in einer Lösung von 50 ml Tetrahydrofuran, enthaltend 0,69 ml N-Methylmor-pholin, gelöst und auf -15 °C gekühlt und dazu wurden 0,89 ml Isobutylchloroformiat gegeben und die Mischung wurde 30 Minuten kräftig gerührt. Zu der Mischung wurde das vorerwähnte H-Arg(N02)-Ala-NHNHZ in 30 ml Dimethylformamid sowie 0,95 ml Triethylamin gegeben und dann rührte man 1 Minute. Die Reaktonsmischung wurde 5 Minuten auf 0 °C und dann 2 Minuten auf 40 °C erwärmt und anschHessend 15 Minuten bei Raumtemperatur gerührt.

Nach dem AbdestilHeren von Tetrahydrofuran und Dimethylformamid wurde der Rückstand mit Ethylacetat extrahiert. Das Extrakt wurde mit IN Zitronensäure und einer wässrigen gesättigten Natriumhydrogenkarbonatlösung in dieser Reihenfolge gewaschen und dann wurde Ethylacetat abdestilliert. Beim Umkristallisieren aus Ethylacetat-Ether erhielt man 3,70 g Boc-Arg(N02)-Arg(N02)-Ala-NHNHZ.

Rf1:0,58 Rf11:0,75

Berechnet (%): Gefunden (%):

C 43.80 43,51

H 7,48 7,62

N 23,71 23,45

35

Elementaranalyse für C28H45N13O11

Berechnet (%): Gefunden (%):

C 45,46 45,13

H 6,13 5,71

N 24,61 24,51

(5) Herstellung von Z-Leu-Gly-OC2Hs

1,86 ml N-Methylmorpholin wurden in 60 ml Tetrahy-40 drofuran gelöst und zu der Lösung wurden 4,85 g Z-Leu-OH gegeben. Die Mischung wurde auf — 15 °C gekühlt und dann wurden während 30 Sekunden unter kräftigem Rühren 2,41 ml Isobutylchloroformiat zugegeben. Zu dieser Reaktionsmischung wurden 40 ml einer Dimethylformamidlö-45 sung, enthaltend 2,54 g H-Gly-OC2H5 und 2,56 ml Triethylamin gegeben und 1 Minute gerührt. Nach dem Erwärmen des Reaktionsgemisches während 5 Minuten auf 0 °C und 2 Minuten auf 40 °C wurde 15 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Tetrahydrofuran und Dimethylformamid wurden so abdestilHert und zu dem Rückstand wurde IM Zitronensäure gegeben und die Kristalle wurden durch Filtrieren gesammelt. Die Kristalle wurden mit Wasser gewaschen bis das Filtrat neutral war und dann getrocknet und aus Ethylacetat-Ether umkristaHisiert, wobei man 4,68 g Z-Leu-Gly-OC2H5 erhielt. Rf1:0,80 Rf1:0,77

55

Elementaranalyse für C18H26N205

(4a) Herstellung von H-Arg(N02)-Arg(N02)-Ala-NHNHZ 3,00 g Boc-Arg(N02)-Arg(N02)-Ala-NHNHZ wurden in 20 ml Trifluoressigsäure gelöst und die Lösung wurde 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen und dann aus trockenem Ether kristalHsiert. Die Kristalle wurden durch Filtrieren gesammelt, wobei man H-Arg-(N02)-Arg(N02)-Ala-NHNHZ erhielt.

Rf.'Ojll so Berechnet (%): Gefunden (%):

C 61,70 61,51

H 7,48 7,32

N 7,99 7,80

(6a) Herstellung von H-Leu-Gly-OC2Hs

3,12 g Z-Leu-Gly-OC2H5 wurden in 50 ml Methanol und 65 8,90 ml IN Salzsäure gelöst und die Lösung wurde unter Verwendung von Palladium als Katalysator katalytisch reduziert, wobei man H-Leu-Gly-OC2H5 erhielt.

Rf: 0,41

15

652 411

(6b) Herstellung von Z-Ser-Leu-Gly-OC2H5

2,48 g Z-Ser-NHNH2 wurden in 20 ml Dimethylformamid und 4,89 ml 6N Salzsäure/Dioxan gelöst und nach dem Kühlen der Reaktionsmischung auf —15 °C wurden 1,31 ml Isoamylnitrit zugegeben und dann 5 Minuten gerührt. Dann wurde durch Zugabe von 4,11 ml Triethylamin zum Reaktionsgemisch die Mischung neutralisiert. Zu dem Reaktionsgemisch wurden 10 ml einer das oben erwähnte H-Leu-Gly-OC2H5 enthaltenden Dimethylformamidlösung sowie 1,24 ml Triethylamin gegeben und dann wurde 20 Stunden bei 4 °C gerührt. Nach dem Abdestillieren von Dimethylformamid wurde der Rückstand mit Ethylacetat extrahiert und das Extrakt wurde mit IN Zitronensäure und anschliessend mit einer gesättigten wässrigen Natriumchloridlösung gewaschen und das Extrakt wurde über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Nach dem Entfernen von Ethylacetat erhielt man nach dem Umkristallisieren aus Ethylacetat 2,64 g Z-Ser-Leu-Gly-OC2H5.

Rf1:0,78 Rf11:0,85

Elementaranalyse für C29H43N9C9

Berechnet (%): Gefunden (%):

C 52,64 52,55

H 6,55 6,44

N 19,05 19,09

Elementaranalyse für C2iH31N307

C 57,65 57,60

Berechnet (%): Gefunden (%):

H 7,14 6,88

N 9,60 9,63

(7a) Herstellung von H-Ser-Leu-Gly-OC2H5

2,50 g Z-Ser-Leu-gly-OC2H5 wurden in 10 ml Essigsäure und 50 ml Methanol gelöst und die Mischung wurde unter Verwendung von Palladium als Katalysator katalytisch reduziert, wobei man H-Ser-Leu-Gly-OC2H5 erhielt.

Rf1:0,31

(7b) Herstellung von Z-Thr-His-Ser-Leu-Gly-OC2H5

2,54 g Z-Thr-His-NHNH2 wurden in 20 ml Dimethylformamid und 4,19 ml 6N Salzsäure/Dioxan gelöst und nach dem Kühlen der Mischung auf -15 °C wurden 0,84 ml Isoamylnitrit zugegeben und dann wurde 5 Minuten gerührt. Zum Neutralisieren der Reaktionsmischung wurden 3,51 ml Triethylamin zugegeben. Zu diesem Reaktionsgemisch wurden 20 ml einer das vorher erhaltene H-Ser-Leu-Gly-OC2H5 enthaltenden Dimethylformamidlösung sowie 0,79 ml Triethylamin gegeben und dann wurde 20 Stunden bei 4 °C gerührt. Nach dem Abdestillieren von Dimethylformamid wurde der Rückstand mit Butanol extrahiert und das Extrakt mit Wasser gewaschen. Das Lösungsmittel wurde abdestilliert und der Rückstand wurde aus Methanol-Ethylacetat umkristallisiert, wobei man 4,31 g Z-Thr-His-Ser-Leu-Gly-OC2H5 erhielt. Rf1 :0,35 Rf11:0,71

(8b) Herstellung von H-Asn-Arg-Arg-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH

0,78 g Boc-Asn-Arg-Ala-NHNH2 wurden in 8 ml Dimethylformamid und 1,03 ml 6N Salzsäure/Dioxan gelöst 10 und nach dem Kühlen der Lösung auf -15 ° C wurden 0,16 ml Isoamylnitrit zugegeben und dann 5 Minuten gerührt. Zum Neutralisieren des Reaktionsgemisches wurden 0,78 ml Triethylamin zugegeben. Dieses Reaktionsgemisch wurde zu einer Mischung aus dem Peptid A, d.h. aus H-Leu-15 Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH, 0,87 ml Triethylamin, 20 ml Dimethylformamid und 10 ml Hexamethylphosphortriamid gegeben und die Mischung wurde dann 24 Stunden bei 4 °C gerührt. Dann wurden 0,39 g von Boc-Asn-Arg-Arg-Ala-NHNH2, das in das Azid überführt worden war, zu der Mi-2o schung gegeben und 48 Stunden gerührt. Dimethylformamid wurde abdestilliert und der Rückstand wurde mit Butanol extrahiert. Das Extrakt wurde mit Wasser gewaschen und Butanol wurde abdestilliert. Der Rückstand wurde aus Ether umkristallisiert und die ausgefallenen Kristalle wurden durch 25 Filtrieren gesammelt, mit Wasser gewaschen und über Phos-phorpentoxid getrocknet. Das so erhaltene Boc-Asn-Arg-Arg-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH wurde in 3 ml Trifluoressigsäure gelöst und 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen und dann wurde zum Ausfällen der Kristalle 30 Ether zugegeben und die Kristalle wurden durch Filtrieren gesammelt. Nach dem Trocknen der Kristalle wurden diese unter Verwendung von Sephadex G-25 (Eluierungsmittel: 50%-ige Essigsäure) gereinigt, wobei man 120 mg H-Asn-Arg-Arg-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH erhielt. 35 Rf1; 0,01 Rf11:0,35

Elementaranalyse für CsiH94N18013-2CH3C00H'5H20

4o Berechnet (%): Gefunden (%):

C 47,95 47,66

H 8,19 8,41

N 18,30 18,62

r ! 25 M D

185,44 (C = 0,57, IM Essigsäure)

Elementaranalyse für C31H45N703-H20

Berechnet (%): Gefunden (%):

C 64,00 64,48

H 8,11 8,10

N 16,85 16,54

(8a) Herstellung von Z-Thr-His-Ser-Leu-Gly-NHNH2

4,30 g Z-Thr-His-Ser-Leu-Gly-OC2H5 wurden in 20 ml Methanol gelöst und zu der Lösung wurden 3,18 ml Hydra-zinmonohydrat gegeben und die Mischung liess man 20 Stunden bei Raumtemperatur stehen. Nach Beendigung der Umsetzung gab man zum Reaktionsgemisch Ether und dann wurden die ausgefallenen Kristalle durch Filtrieren gesammelt und getrocknet. Die Kristalle wurden mit heissem Methanol gewaschen, wobei man 2,55 g Z-Thr-His-Ser-Leu-Gly-NHNH2 erhielt.

Rf1:0,17 Rf11:0,57

45 (9) Herstellung von H-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Asn-Arg-Arg-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH

125 mg Z-Thr-His-Ser-Leu-Gly-NHNH2 wurden in 10 ml Dimethylformamid und 0,125 ml 6N Salzsäure/Dioxan gelöst und auf — 15 °C gekühlt und dann wurden 0,025 ml Iso-50 amylnitrit zugegeben und 5 Minuten gerührt. Zum Neutralisieren der Reaktionsmischung wurden 0,105 ml Triethylamin gegeben. Diese Mischung wurde dann zu einer Mischung aus 10 ml Dimethylformamidlösung, enthaltend 110 mg H-Asn-Arg-Arg-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH sowie 0,013 ml 55 Triethylamin gegeben und dazu gab man ausserdem 6 ml Hexamethylphosphortriamid und die ganze Mischung wurde dann 24 Stunden bei 4 °C gerührt. Dann wurde das Azidpro-dukt aus 125 mg Z-Thr-His-Ser-Leu-Gly-NHNH2 zu der Reaktionsmischung gegeben und 48 h gerührt. Dimethylform-60 amid wurde abdestilliert und der Rückstand wurde mit Butanol extrahiert. Das Extrakt wurde mit Wasser gewaschen und Butanol abdestilliert und der Rückstand wurde aus Methanol-Ethylacetat umkristallisiert. Das so erhaltene Z-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Asn-Arg-Arg-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-65 Ala-Gln-OH wurde in 50 ml Methanol und 10 ml 10%-iger Essigsäure gelöst und unter Verwendung von Palladium als Katalysator katalytisch reduziert. Der Katalysator wurde abfiltriert und Methanol wurde abdestilliert und der Rückstand

652411

16

wurde unter Verwendung von Sephadex G-25 (Eluiermittel: 50%-ige Essigsäure) gereinigt unter Erhalt von 125 mg H-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Asn-Arg-Arg-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH. Dieses Produkt wird nachfolgend als Peptid B bezeichnet.

Rf1:0,01 Rf11:0,38

Elementaranalyse für C72HI27N25O20-2CH3COOH-4H2O

Berechnet (%): C 49,21 H 7,77 N 18,87

Gefunden (%):

Elementaranalyse für C29H44N6O8

49,60

7,92

18,54

[a]

25 D

— 66,76 (C = 0,42, IM Essigsäure)

Herstellungsbeispiel A-3

(la) Herstellung von H-Gln-NHNHBoc

7,00 g Z-Gln-NHNHBoc wurden in 50 ml Methanol gelöst und unter Verwendung von Palladium als Katalysator katalytisch reduziert, wobei man H-Gln-NHNHBoc erhielt. Rf1:0,37

(1b) Herstellung von Z-Pro-Gln-NHNHBoc

4,41 g Z-Pro-OH wurden in 50 ml Tetrahydrofuran und 1,80 ml N-Methylmorpholin gegeben und die Lösung wurde auf —15 °C gekühlt. Dazu wurden 2,34 ml Isobutylchloroformiat gegeben und dann wurde 30 Sekunden kräftig gerührt. Dann wurden zu dem Reaktionsgemisch 30 ml einer Dimethylformamidlösung, die H-Gln-NHNHBoc, das gemäss Stufe (la) erhalten worden war, enthielt, zugegeben und 1 Minute gerührt. Die gesamte Mischung wurde 5 Minuten auf 0 °C erwärmt und weitere 2 Minuten auf 40 °C und dann wurde 15 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Tetrahydrofuran und Dimethylformamid wurden abdestilliert und der Rückstand wurde mit Ethylacetat, enthaltend eine kleine Menge an Butanol, extrahiert. Das Extrakt wurde mit IN Zitronensäure, einer gesättigten wässrigen Natriumhydrogenkarbonatlösung und einer gesättigten wässrigen Natriumchloridlösung in dieser Reihenfolge gewaschen und dann nochmals mit heissem Ethylacetat gewaschen, wobei man 5,67 g Z-Pro-Gln-NHNHBoc erhielt.

Rf1:0,60 Rf11:0,76

Elementaranalyse für C23H33N5O7

Berechnet (%): Gefunden (%):

C 56,20 55,97

H 6,77 6,68

N 14,25 14,15

(2a) Herstellung von H-Pro-Gln-NHNHBoc

5,50 g Z-Pro-Gln-NHNHBoc wurden in 50 ml Methanol gelöst und unter Verwendung von Palladium als Katalysator katalytisch reduziert, wobei man H-Pro-Gln-NHNHBoc erhielt.

Rf1:0,09

(2b) Herstellung von Z-Leu-Pro-Gln-NHNHBoc

4,05 g Z-Leu-ONHS wurden zu 100 ml Dimethylformamidlösung von H-Pro-Gln-NHNHBoc, erhalten nach Stufe (2a), gegeben und dann wurden 1,56 ml Triethylamin zugegeben und die Mischung wurde bei Raumtemperatur 20 Stunden stehen gelassen. Dimethylformamid wurde abdestilliert und der Rückstand wurde mit Ethylacetat extrahiert. Das Extrakt wurde mit IN Zitronensäure und anschliessend mit einer gesättigten wässrigen Natriumchloridlösung gewaschen und aus Ethylacetat-Ether umkristallisiert, wobei man 3,72 g Z-Leu-Pro-Gln-NHNHBoc erhielt.

Rf1:0,68 Rf11:0,80

Berechnet (%): Gefunden (%):

C 57,60 57,21

H 7,33 7,08

N 13,90 13,58

(3a) Herstellung von H-Leu-Pro-Gln-NHNHBoc

3,50 g Z-Leu-Pro-Gln-NHNHBoc wurden in 50 ml Methanol gelöst und unter Verwendung von Palladium als Katalysator katalytisch reduziert, wobei man H-Leu-Pro-ioGln-NHNHBoc erhielt.

Rf11:0,14

(3b) Herstellung von Z-Asp(OCH2-C6Hj)-Leu-Pro-Gln-1 sNHNHBoc

2,27 g Z-Asp(OCH2-C6H5)-OH wurden in 30 ml Tetrahydrofuran und 0,65 ml N-Methylmorpholin gelöst und nach Kühlen der Lösung auf -15 °C wurden unter kräftigem Rührenwährend 30 sek. 0,84 ml Isobutylchloroformiat zugege-2oben. Zum Reaktionsgemisch wurden 20 ml einer H-Leu-Pro-Gln-NHNHBoc, erhalten nach der obigen Stufe (3a), enthaltenden Dimethylformamidlösung sowie 0,81 ml Triethylamin gegeben und die Mischung wurde 1 Minute gerührt. Dann wurde die Reaktionsmischung 5 Minuten auf 0 °C und 2 Mi-25 nuten auf 40 °C erwärmt und anschliessend 15 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Tetrahydrofuran und Dimethylformamid wurden abdestilliert und der Rückstand wurde mit Ethylacetat extrahiert. Das Extrakt wurde mit IN Zitronensäure, einer gesättigten wässrigen Lösung von Natriumhydro-30 genkarbonat und dann mit einer gesättigten wässrigen Natriumchloridlösung in der genannten Reihenfolge gewaschen und das Lösungsmittel wurde abdestilliert. Beim Umkristallisieren aus Ethylacetat-Petrolether erhielt man 4,00 g Z-Asp-(OCH2-C6H5)-Leu-Pro-Gln-NHNHBoc.

35 Rf1; 0,68 Rf11:0,77

Elementaranalyse für C^H^N^ !

"0 Berechnet (%): Gefunden (%):

C 59,32 58,88

H 6,84 6,65

N 12,11 11,72

(4a) Herstellung von H-Asp-Leu-Pro-Gln-NHNHBoc 2,00 g Z-Asp-(OCH2-C6H5)-Leu-Pro-Gln-NHNHBoc 45 wurden in 50 ml Methanol und 10 ml 10%-iger Essigsäure gelöst und unter Verwendung von Palladium als Katalysator katalytisch reduziert, wobei man H-Asp-Leu-Pro-Gln-NHNHBoc erhielt.

Rf1:0,08

50

(4b) Herstellung von Z-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-NHNHBoc 0,75 g Z-Ser-NHNH2 wurden in 15 ml Dimethylformamid mit 1,48 ml 6N Salzsäure/Dioxan gelöst und nach dem 55 Kühlen der Lösung auf —15 °C wurden 0,39 ml Isoamylnitrit zugegeben und dann 5 Minuten gerührt und anschliessend wurde das Reaktionsgemisch mit 1,24 ml Triethylamin neutralisiert. Das Reaktionsgemisch wurde zu einer Mischung aus 10 ml einer Dimethylformamidlösung, enthaltend H-60 Asp-Leu-Pro-Gln-NHNHBoc, erhalten gemäss Stufe (4a), und 0,34 ml Triethylamin gegeben und die Mischung wurde 20 Stunden bei 4 °C gerührt. Dimethylformamid wurde abdestilliert und der Rückstand wurde mit Butanol extrahiert. Das Extrakt wurde mit Wasser gewaschen und Butanol wurde ab-65 destilliert. Beim Umkristallisieren aus Methanol-Ethylacetat erhielt man 1,52 g Z-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-NHNHBoc. Rf1:0,45 Rf11:0,67

17

652411

(5) Herstellung von H-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser-Leu-Gln-Asn-Arg-Arg-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH

116 mg Z-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-NHNHBoc wurden mit 2 ml Trifluoressigsäure (TFA) zur Entfernung der Butoxycar-bonylgruppe behandelt und dann wurde wasserfreier Ether zum Reaktionsgemisch gegeben, wobei ein Niederschlag ausfiel. Der Niederschlag wurde durch Filtrieren gesammelt, getrocknet und in 5 ml Dimethylformamid zusammen mit 0,072 ml 6N Salzsäure/Dioxan gelöst. Nach dem Kühlen der Reaktionsmischung auf —15 °C wurden 0,019 ml Isoamylnitrit zur Mischung gegeben und dann wurde 5 Minuten gerührt und anschliessend wurde die Mischung durch Zugabe von 0,081 ml Triethylamin neutralisiert. Dieses Reationsge-misch wurde zu einer Mischung aus 80 mg Peptid B, d.h. H-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Asn-Arg-Arg-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH, 5 ml Dimethylformamid und 6 ml Hexameth-ylphosphortriamid gegeben und 20 Stunden bei 4 °C gerührt. Dann wurden zu dem Reaktionsgemisch 116 mg eines Azid-produktes von Z-Ser-Asp-Leu-pro-Gln-NHNHBoc gegeben und anschliessend rührte man 28 Stunden. Dimethylformamid wurde abdestilliert und der Rückstand wurde mit Butanol extrahiert. Das Extrakt wurde mit Wasser gewaschen und Butanol wurde abdestilliert. Der Rückstand wurde aus Petrolether umkristallisiert und die ausgefallenen Kristalle wurden durch Filtrieren gesammelt und aus Methanol-Ethylacetat umkristallisiert. Das so erhaltene Z-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Asn-Arg-Arg-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH wurde in 30 ml Methanol mit 30 ml 10%-iger Essigsäure gelöst und unter Verwendung von Palladium als Katalysator katalytisch reduziert. Der Katalysator wurde abfiltriert und das Lösungsmittel abdestilliert. Der Rückstand wurde unter Verwendung von Sephadex G-25 und anschliessend LH-20 (Eluierlösungsmittel: 1/1000 N Salzsäure) gereinigt, wobei man 58 mg H-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Asn-Arg-Arg-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH erhielt. Dieses Produkt wird nachfolgend als Peptid C bezeichnet.

Rf1:0,01 Rf1:0,37

Elementaranalyse für C95HI63N31Ö29-2CH3C00H-7H20

Ethylacetat erhielt man 588 mg Z-Tyr-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-NHNHBoc.

Rf1:0,51 Rf1:0,69

Elementaranalyse für C52H69N9015

Berechnet (%): Gefunden (%):

C 58,91 58,53

H 6,56 6,22

N 11,89 12,28

10

Berechnet (%): C 48,54 H 7,61

Gefunden(%): 48,14 7,50

[a] q : - 85,70 (C = 0,23, IM Essigsäure)

N 17,72 17,48

(2) Herstellung von H-Tyr-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Asn-Arg-Arg-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH

44 mg Z-Tyr-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-NHNHBoc wurden in 3 ml Dimethylformamid zusammen mit 0,0225 ml 6N i5 Salzsäure/Dioxan gelöst und nach Kühlen der Mischung auf -15 °C wurden 0,0060 ml Isoamylnitrit zugegeben und dann wurde 5 Minuten gerührt und anschliessend wurde die Mischung mit 0,0252 ml Triethylamin neutralisiert.

Das Reaktionsgemisch wurde zu einer Lösung, die aus 20 5 ml einer Dimethylformamidlösung, enthaltend 25 ml Peptid B, z.B. H-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Asn-Arg-Arg-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH, und 2 ml Hexamethylphosphortri-amid gegeben und die gesamte Mischung wurde 20 Stunden bei 4 °C gerührt. Anschliessend wurde das Azidprodukt von 25 44 mg Z-Tyr-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-NHNHBoc zum Reaktionsgemisch gegeben und 24 Stunden gerührt. Das Lösungsmittel wurde abdestilliert und der Rückstand wurde mit einer Mischung aus Butanol-Wasser extrahiert und dann aus Ether umkristallisiert und die Kristalle wurden durch Filtrieren ge-3o sammelt. Das so erhaltene Z-Tyr-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Asn-Arg-Arg-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH wurde in 30 ml Methanol gelöst und unter Verwendung von Palladium als Katalysator katalytisch reduziert. Der Katalysator wurde abfiltriert und Methanol wurde abde-35 stilüert und der Rückstand wurde unter Verwendung von Sephadex G-25 (Eluiermittel: 50%-ige Essigsäure) und dann unter Verwendung von LH-20 (Eluiermittel: 1/1000N Salzsäure) gereinigt, wobei man 18 mgH-Tyr-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Asn- Arg-Arg-Ala-Leu-Ile-Leu-40 Leu-Ala-Gln-OH erhielt. Dieses Produkt wird nachfolgend als Peptid D bezeichnet.

Rf : 0,01 Rf1:0,38

45 Elementaranalyse für Ci04Hi69N32O3r2CH3COOH-5H2O

Berechnet (%): Gefunden (%):

C 50,40 50,72

H 7,32 7,67

N 17,41 17,03

Herstellungsbeispiel A-4

(la) Herstellung von H-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-NHNHBoc 1,03 g Z-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-NHNHBoc wurden in 50 ml Methanol gelöst und dann unter Verwendung von Palladium als Katalysator katalytisch reduziert, wobei man H-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-NHNHBoc erhielt.

Rf : 0,06

(lb) Herstellung von Z-Tyr-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-NHNHBoc

0,79 g Z-Tyr-ONHS wurden zu 20 ml einer Dimethylformamidlösung, enthaltend H-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-NHNHBoc, erhalten nach Stufe (la), gegeben und die Mischung wurde 20 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen. Nach dem Abdestillieren von Dimethylformamid wurde der Rückstand mit Ethylacetat extrahiert. Das Extrakt wurde mit IN Zitronensäure und danach mit einer wässrigen gesättigten Lösung von Natriumchlorid gewaschen und Ethylacetat wurde abdestilliert. Beim Umkristallisieren aus Methanol-

50

[a]

25 D

• 77,88 (C = 0,22, IM Essigsäure)

Herstellungsbeispiel B

(1) Herstellung von Z-Lys(Tos)-Glu(OBzl)-OBzl 55 4,18 g H-Glu(OBzl)-OBzl-Tos wurden in 30 ml Dimethylformamid (DMF) gelöst und dazu wurden 1,21 ml Triethylamin (TEA) gegeben und die Mischung wurde unter Kühlen gerührt. Weiterhin wurden 4,35 g Z-Lys(Tos)-OH in 30 ml Tetrahydrofuran und 0,98 ml N-Methylmorpholin zu-60 gegeben und die Mischung wurde auf — 15 °C gekühlt und unter Rühren wurden tropfenweise 1,27 ml Isobutylchloroformiat zugegeben. 30 Sekunden nach der Zugabe wurde die oben hergestellte gekühlte DMF-Lösung zugegeben und diese Mischung wurde 5 Minuten bei 0 °C, 1 Minute auf einem 65 40 °C warmem Wasserbad und 30 Minuten bei 15 °C gerührt. THF und DMF wurden unter vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand wurde mit Ethylacetat extrahiert. Das Extrakt wurde mit IN Zitronensäure, einer gesättigten

652 411 18

wässrigen Natriumchloridlösung, einer gesättigten wässrigen Lösung von Natriumhydrogenkarbonat und dann einer gesättigten wässrigen Natriumchloridlösung in der genannten Reihenfolge gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und Ethylacetat wurde abdestilliert. Der ölige Rückstand wurde durch Zugabe von Ethylether verfestigt und aus Ethylacetat-Ether umkristallisiert, wobei man 5,37 g des gewünschten Produktes erhielt.

Rf1:0,96 Rf11:0,90

Elementaranalyse für C40H45N3O9S

Berechnet (%): Gefunden (%):

C 64,59 64,13

H 6,10 5,95

N 5,65 5,63

(2a) Herstellung von H-Lys(Tos) -Glu-OH

5,21 g Z-Lys(Tos)-Glu(OBzl)-Obzl wurden in einer Mischung aus 80 ml Methanol mit 20 ml einer 10%-igen Essigsäure gelöst und eine geringe Menge an Palladiumschwarz wurde dazugegeben und dann wurde über Nacht unter Einleiten von Wasserstoffgas gerührt. Nach Beendigung der Umsetzung wurde der Katalysator durch Vakuumfiltration entfernt und das Filtrat wurde unter vermindertem Druck destilliert, wobei man einen Rückstand erhielt. Zu diesem Rückstand wurde Wasser gegeben und dann wurde lyophilisiert, wobei man das gewünschte Produkt erhielt.

Rf1:0,29 Rf11:0,52

(2b) Herstellung von Z-Ser-Lys(Tos)-Glu-OH

2,13 g Z-Ser-NHNH2 wurden in 20 ml DMF gelöst und dazu wurden 4,20 ml 6N Salzsäure/Dioxan gegeben und die Mischung wurde auf —15 °C gekühlt. Dazu wurden unter Rühren 1,13 ml Isoamylnitrit gegeben. Nachdem die Reaktionsmischung einen negativen Hydrazidtest ergab, wurde zum Neutralisieren des Reaktionsgemisches tropfenweise eine Lösung aus 3,53 ml Triethylamin in 1,20 ml DMF gegeben. Die das Azid enthaltende Mischung wurde zu einer kalten DMF-Lösung von H-Lys(Tos)-Glu-OH, erhalten gemäss Stufe (2a), zusammen mit 1,96 ml Triethylamin gegeben und die Mischung wurde bei —10 bis — 15 °C 2 Stunden und dann 20 Stunden bei 4 °C gerührt. Dimethylformamid wurde abdestilliert und der Rückstand wurde mit Ethylacetat extrahiert und die Ethylacetatschicht wurde mit IN Zitronensäure und mit einer gesättigten wässrigen Lösung von Natriumchlorid gewaschen und dann über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und das Ethylacetat wurde unter vermindertem Druck abdestilliert. Der Rückstand wurde durch Zugabe von Ethylether verfestigt und aus Ethylacetat-Ether umkristallisiert, wobei man 4,14 g des gewünschten Produktes erhielt. Rf1:0,64 Rf11:0,65

der Rückstand wurde zu Wasser gegeben und lyophilisiert, wobei man das gewünschte Produkt erhielt.

Rf1:0,23 Rf11:0,48

5

(3b) Herstellung von Z-Arg(N02)-Ser-Lys(Tos)-Glu-OH

Das gemäss voriger Stufe (3a) erhaltene H-Ser-Lys(Tos)-Glu-OH wurde in 20 ml Dimethylformamid gelöst und dazu wurden unter Rühren und Kühlen 1,74 ml Triethylamin gege-10 ben. Weiterhin wurden 2,41 g Z-Arg(N02)-0H in 20 ml Tetrahydrofuran gelöst und dazu wurden 0,70 ml N-Methyl-morpholin gegeben und die Mischung wurde auf — 15 °C gekühlt und dann gab man unter Rühren 0,86 ml Isobutylchloroformiat tropfenweise zu. 30 Sekunden nach der Zugabe is wurde die oben erwähnte Kaliumdimethylformamidlösung zugegeben und die ganze Mischung wurde 5 Minuten bei 0 °C und dann 30 Minuten bei 15 °C gerührt. Tetrahydrofuran und Dimethylformamid wurden unter vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand wurde mit 2% Essigsäure 20 enthaltendem Butanol extrahiert. Das Extrakt wurde fünfmal mit 2% Essigsäure enthaltendem n-Butanol extrahiert und dann unter vermindertem Druck destilliert, wobei die Essigsäure entfernt und durch Wasser ersetzt wurde und anschliessend wurde Wasser durch Methanol ersetzt. Der ölige Rück-25 stand wurde durch Zugabe von Ethylether verfestigt und aus Ethylacetat-Methanol umkristallisiert, wobei man 4,09 g des gewünschten Produktes erhielt.

Rf1:0,42 Rf11:0,65

30

Elementaranalyse für C35H49N90i4S-l/2H20)

35

Berechnet (%): Gefunden (%):

C 48,83 49,22

H 5,85 6,05

N 14,64 14,11

Elementaranalyse für C29H38N40iiS-l/2H20

Berechnet (%): Gefunden (%):

C 52,80 52,87

H 5,96 5,69

N8,49 8,46

(3a) Herstellung von H-Ser-Lys(Tos)-Glu-OH

4,03 g Z-Ser-Lys(Tos)-Glu-OH wurden in einer Mischung aus 60 ml Methanol mit 40 ml 10%-iger Essigsäure gelöst und dazu wurde eine kleine Menge an Palladiumschwarz gegeben und dann wurde über Nacht und unter Einleiten von Wasserstoffgas gerührt. Nach Beendigung der Umsetzung wurde der Katalysator durch Vakuumfiltration entfernt und das Filtrat wurde unter vermindertem Druck destilliert und

(4) Herstellung von Z-Ser-Leu-NHNH2

2,54 g Z-Ser-NHNH2 wurden in 20 ml Dimethylformamid gelöst und dazu wurden 5,00 ml 6N Salzsäure/Dioxan gegeben und die Mischung wurde auf -15 °C gekühlt. Dazu 40 wurden 1,34 ml Isoamylnitrit unter Rühren gegeben. Nachdem die Reaktionsmischung einen negativen Hydrazintest ergab, wurde tropfenweise eine kalte Lösung von 1,40 ml Dimethylformamid mit 4,20 ml Triethylamin in geringen Mengen zugegeben, um die Reaktionsmischung zu neutralisieren. 45 Das Reaktionsgemisch, enthaltend das Azid, wurde zu 15 ml einer kalten Dimethylformamidlösung, enthaltend 1,96 gH-Leu-OC2H5-HCl und 1,40 ml Triethylamin, gegeben und die ganze Mischung wurde bei —10 bis —15 °C während 2 Stunden und dann bei 4 °C während 20 Stunden gerührt. Dimeth-50 ylformamid wurde unter vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand wurde mit Ethylacetat extrahiert und die Ethylacetatschicht wurde mit IN Zitronensäure, einer gesättigten wässrigen Lösung von Natriumchlorid, einer gesättigten wässrigen Lösung von Natriumhydrogenkarbonat und ei-55 ner gesättigten wässrigen Lösung von Natriumchlorid in der genannten Reihenfolge gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und dann wurde Ethylacetat durch Destillation unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde mit Petrolether gewaschen und dekantiert. Die 60 ölige Substanz wurde unter vermindertem Druck in einem Exxkator getrocknet und das trockene Produkt wurde in 50 ml Methanol gelöst und dazu wurde unter Eiskühlung 100%-iges Hydrazinmonohydrat gegeben und das Reaktionsprodukt liess man dann 20 Stunden bei Raumtempera-65 tur stehen. Methanol wurde unter vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand wurde durch Zugabe von Ethylether verfestigt und in einem Exikator getrocknet. Das trok-kene Produkt wurde mit Wasser zur Entfernung des Über-

19

652 411

schusses an Hydrazinmonohydrat gewaschen und aus Methanol-Ethylacetat umkristallisiert, wobei man 2,68 g des gewünschten Produktes erhielt.

Rf :0,73 Rf11:0,76

Elementaranalyse für CI7H26N405 Berechnet (%): C 55,73

Gefunden (°/

55,72

H 7,15 7,01

N 15,29 15,42

(5a) Herstellung von H-Arg-Ser-Lys(Tos)-Glu-OH

2,00 g Z-Arg(N02)-Ser-Lys(Tos)-Glu-OH wurden in einer Mischung aus 30 ml Methanol mit 30 ml einer 50%-igen Essigsäure suspendiert und dazu wurde eine geringe Menge an Palladiumschwarz gegeben und dann wurde die Mischung 36 Stunden unter Einleitung von Wasserstoffgas gerührt. Nach Beendigung der Umsetzung wurde der Katalysator durch Filtrieren im Vakuum entfernt und das Filtrat wurde unter vermindertem Druck destilliert und der Rückstand wurde zu Wasser gegeben und lyophilisiert. 18 Stunden nach der Lyophilisierung wurde das lyophilisierte Produkt in Wasser gelöst und die erhaltene Lösung wurde nochmals unter Erhalt des gewünschten Produktes lyophilisiert.

Rf1:0,05 Rf": 0,41

(5b) Herstellung von Z-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys(Tos)-Glu-OH

1,03 g Z-Ser-Leu-NHNH2 wurden in 15 ml Dimethylformamid gelöst und dazu wurden 1,41 mg 6N Salzsäure/Dioxan gegeben und die Mischung wurde auf -15 °C gekühlt und dazu wurden 0,38 ml Isoamylnitrit unter Rühren gegeben. Nachdem die Reaktionsmischung einen negativen Hydrazid-test ergab, wurde eine kalte Lösung aus 0,40 ml Dimethylformamid mit 1,18 ml Triethylamin tropfenweise zugegeben, um das Reaktionsgemisch zu neutralisieren. Das das Azid enthaltende Reaktionsgemisch wurde zu 10 ml einer kalten Dimethylformamidlösung, enthaltend H-Arg-Ser-Lys (Tos)-Glu-OH, erhalten in Stufe (5a), sowie 0,66 ml Triethylamin gegeben und die ganze Mischung wurde 2 Stunden bei -10 bis -15 °C und dann 20 Stunden bei 4 °C gerührt. Dimethylformamid wurde unter vermindertem Druck abgedampft und der Rückstand wurde mit n-Butanol, das mit Wasser gesättigt war, extrahiert und die Methanolschicht wurde fünfmal mit mn-Butanol gesättigtem Wasser gewaschen und das Lösungsmittel wurde abdestilliert. Der Rückstand wurde durch Zugabe von Ethylether verfestigt und dann aus Methanol-Ethyl-acetat umkristallisiert, wobei man 1,92 g des gewünschten Produktes erhielt.

Rf1:0,33 Rf11:0,69

(6b) Herstellung von Boc-Glu(OBzl)-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys (Tos)-Glu-OH

H-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys(Tos)-Glu-OH, erhalten in Stufe (6a), wurde in 20 ml Dimethylformamid gelöst und dazu wur-s den unter Eiskühlung 0,51 ml Triethylamin gegeben. Anschliessend gab man 0,95 g Boc-Glu(OBzl)-ONHS hinzu und die ganze Mischung wurde 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Dimethylformamid wurde unter vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand wurde mit wasserge-xosättigtem n-Butanol extrahiert und die Butanolschicht wurde fünfmal mit mit n-Butanol gesättigtem Wasser gewaschen. Die Butanolschicht wurde unter vermindertem Druck destilliert und der Rückstand wurde durch Zugabe von Ethylether verfestigt und dann aus Methanol-Ethylacetat umkristalli-15 siert, wobei man 1,70 g des gewünschten Produktes erhielt. Rf: 0,42 Rf': 0,60

Elementaranalyse für C53H81N11018S-2H20

20

Berechnet (%): Gefunden (%):

C 51,82 51,27

H 6,97 6,58

N 12,55 12,47

Elementaranalyse für C44H66NI0Oi5S-2H2O

Berechnet (%): Gefunden (%):

C 50,66 50,57

H 6,76 6,51

N 13,43 13,34

(6a) Herstellung von H-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys(Tos)-Glu-OH 1,84 g Z-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys(Tos)-Glu-OH wurden in einer Mischung aus 30 ml Methanol und 30 ml 10%-iger Essigsäure suspendiert und dazu wurde eine kleine Menge an Palladiumschwarz gegeben und dann wurde 13 Stunden unter Einleitung von Wasserstoffgas gerührt. Nach Beendigung der Umsetzung wurde der Katalysator durch Absaugen entfernt. Das Filtrat wurde unter vermindertem Druck destilliert und der erhaltene Rückstand wurde zu Wasser gegeben und lyophilisiert, wobei man das gewünschte Produkt erhielt. Rf : 0,09 Rf1:0,53

(7a) Herstellung von Boc-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys(Tos)-25 Glu-OH

150 ml Boc-Glu(OBzl)-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys(Tos)-Glu-OH wurden in einer Mischung aus 30 ml Methanol mit 30 ml 10%-iger Essigsäure gelöst und dazu wurde eine kleine Menge an Palladiumschwarz gegeben und dann wurde unter 30 Einleitung von Wasserstoffgas 18 Stunden gerührt. Nach Beendigung der Umsetzung wurde der Katalysator durch Absaugen entfernt und das Filtrat wurde unter vermindertem Druck destilliert und der erhaltene Rückstand wurde zu Wasser gegeben und lyophilisiert, wobei man das gewünschte Pro-35 dukt erhielt.

(7b) Herstellung von H-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys(Tos)-Glu-OH

Boc-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys(Tos)-Glu-OH, erhalten in 40 Stufe (7a), wurde in Tetrahydrofuran gelöst und die Lösung liess man 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Dann wurden 30 ml wasserfreier Ether zugegeben und der gebildete Niederschlag wurde durch Filtrieren gesammelt, mit wasserfreiem Ether gewaschen und dann wurde der Niederschlag 45 unter vermindertem Druck in einem Exikator, enthaltend Ka-liumhydroxid-Phosphorpentoxid als Trocknungsmittel, getrocknet, wobei man das gewünschte Produkt erhielt.

(7c) Herstellung von H-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys-Glu-OH 50 Das in Stufe (7b) erhaltene H-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys (Tos)-Glu-OH wurde in flüssigem Ammoniak, der zuvor mit metallischem Natrium getrocknet worden war, gelöst und dann wurden zu der Lösung unter Rühren kleine Stücke an metallischem Natrium gegeben, bis sich die Farbe der Reak-55 tionsmischung nach blau verfärbte und diese Bedingungen • wurden 30 Sekunden bis 1 Minute beibehalten. Zum Reaktionsgemisch wurden Kristalle von NH4C1 gegeben und der Überschuss an metallischem Natrium wurde neutralisiert, nachdem man das Ammoniak vollständig durch Destillation 60 bei Raumtemperatur entfernt hatte. Das Reaktionsprodukt wurde mit Sephadex G-25-Gel unter Verwendung von 50%-iger Essigsäure als Eluiermittel gefiltert, wobei man 58 mg des gewünschten Produktes erhielt. Dieses Produkt wird nachfolgend als Peptid E bezeichnet.

Rf : 0,04

Rf1:0,34

65

Elementaranalyse für C34H61Nn0i4-C2H402-3H20

652411

20

Berechnet (%): C 44,95 H 7,44 N 16,02 stilliert und der Rückstand wurde mit Ethylacetat extrahiert.

Gefunden (%): 45,05 7,11 15,84 Das Extrakt wurde mit IN Zitronensäure, einer gesättigten wässrigen Natriumchloridlösung, einer gesättigten wässrigen Natriumhydrogenkarbonatlösung und wieder mit einer gesät-5 tigten wässrigen Natriumchloridlösung in der genannten Reihenfolge gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und Ethylacetat wurde abdestilliert. Der ölige Rückstand wurde durch Zugabe umkristallisiert, wobei man 2,55 g des gewünschten Produktes erhielt.

io Ri1:0,63 Rf11:0,77

(8a) Herstellung von H-Gln-NHNHBoc

16,00 g Z-Gln-NHNHBoc wurden in 100 ml Methanol suspendiert und eine kleine Menge an Palladiumschwarz wurde dazugegeben und dann wurde 18 Stunden unter Einleitung von Wasserstoffgas gerührt. Nach Beendigung der Umsetzung wurde der Katalysator durch Absaugen entfernt und das Filtrat wurde unter vermindertem Druck destilliert und der Rückstand wurde unter vermindertem Druck in einem Exikator getrocknet, wobei man das gewünschte Produkt erhielt.

Rf1:0,37 Rf°: 0,58

(8b) Herstellung von Z-Leu-Gln-NHNHBoc

Das in Stufe (8a) erhaltene H-Gln-NHNHBoc wurde in 50 ml Tetrahydrofuran gelöst und dazu wurden unter Eiskühlung 5,51 g Z-Leu-ONHS gegeben und die Reaktionsmischung wurde 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Tetrahydrofuran wurde unter vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand wurde mit Ethylacetat extrahiert und die Ethylacetatschicht wurde mit IN Zitronensäure, einer gesättigten wässrigen Natriumchloridlösung, einer gesättigten wässrigen Natriumhydrogenkarbonatlösung und dann wieder mit einer gesättigten wässrigen Natriumchloridlösung in der genannten Reihenfolge gewaschen und anschliessend mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und Ethylacetat wurde durch Destillieren entfernt. Der ölige Rückstand wurde durch Zugabe von Ethylether verfestigt und die erhaltene Festsubstanz wurde aus Methanol-Ethylether umkristallisiert, wobei man 6,04 g des gewünschten Produktes erhielt. Rf:0,81 Rf11:0,86

Elementaranalyse für C24H37N5O7

Berechnet (%): Gefunden (%):

C 56,79 56,67

H 7,35 7,15

N 13,80 13,75

Elementaranalyse für C28H43N7O9

is Berechnet (%): Gefunden (%):

C 53,10 53,67

H 6,97 6,63

N 15,77 15,68

(9a) Herstellung von H-Leu-Gln-NHNHBoc

2,79 g Z-Leu-Gln-NHNHBoc wurden in 80 ml Methanol suspendiert und dazu wurde eine kleine Menge an Palladiumschwarz gegeben und die Suspension wurde 32 Stunden unter Einleitung von Wasserstoffgas gerührt. Nach Beendigung der Umsetzung wurde der Katalysator durch Absaugen entfernt und das Filtrat wurde unter vermindertem Druck destilliert und der erhaltene Rückstand wurde unter vermindertem Druck in einem Exikator unter Erhalt des gewünschten Produktes getrocknet.

Rf1:0,33 Rf«: 0,66

(9b) Herstellung von Z-Asn-Leu-Gln-NHNHBoc

H-Leu-Gln-NHNHBoc, erhalten in der obigen Stufe (9a), wurde in 30 ml Dimethylformamid gelöst und die Lösung wurde unter Rühren gekühlt. Weiterhin wurden 1,61 g Z-Asn-OH in 30 ml Tetrahydrofuran gelöst und zu dieser Lösung wurden 0,62 ml N-Methylmorpholin gegeben und dann kühlte man auf —15 °C und gab unter Rühren 0,80 ml Isobutylchloroformiat tropfenweise zu. 30 Sekunden nach Zugabe von Isobutylchloroformiat wurde die zuvor hergestellte Lösung von H-Leu-Gln-NHNHBoc zugegeben und die gesamte Mischung wurde dann 5 Minuten bei 0 °C, 1 Minute bei 40 °C auf dem Wasserbad und weitere 30 Minuten bei 15 °C gerührt. Vom Reaktionsgemisch wurde Tetrahydrofuran und Dimethylformamid unter vermindertem Druck abde-

( 10a) Herstellung von Z-Thr-ONHS

1,28 g Z-Thr-OH wurden in 30 ml Tetrahydrofuran gelöst 2ound zu dieser Lösung wurden 0,58 g N-Hydroxysuccinimid (NHS) gegeben und die Mischung wurde eisgekühlt und dazu wurden 1,05 g N,N-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) gegeben. Die ganze Mischung wurde 24 Stunden bei 4 °C gerührt und der gebildete Niederschlag wurde abfiltriert und das Fil-25 trat unter vermindertem Druck destilliert, und zu dem dabei erhaltenen Rückstand wurde Ethylether gegeben und dann wurde durch Dekantieren gewaschen. Die erhaltene ölige Substanz wurde unter vermindertem Druck in einem Exikator unter Erhalt des gewünschten Produktes getrocknet.

30

( 10b) Herstellung von H-Asn-Leu-Gln-NHNHBoc

2,43 g Z-Asn-Leu-Gln-NHNHBoc wurden in 80 ml Methanol suspendiert und dazu wurde eine kleine Menge Palladiumschwarz gegeben und die Suspension wurde 18 Stun-35 den unter Einleitung von Wasserstoffgas gerührt. Nach Beendigung der Umsetzung wurde der Katalysator durch Absaugen entfernt und das Filtrat wurde unter vermindertem Druck destilliert und der erhaltene Rückstand wurde unter vermindertem Druck in einem Exikator getrocknet, wobei man das 40 gewünschte Produkt erhielt.

Rf: 0,31 Rf1:0,64

(10c) Herstellung von Z-Thr-Asn-Leu-Gln-NHNHBoc 45 Das in Stufe ( 1 Ob) erhaltene H-Asn-Leu-Gln-NHNHBoc wurde in 30 ml Dimethylformamid gelöst und zu dieser Lösung wurden 20 ml einer Dimethylformamidlösung von Z-Thr-ONHS, erhalten in Stufe (10a) unter Eiskühlung gegeben und die gesamte Mischung wurde 18 Stunden bei Raumtem-50 peratur gerührt. Dimethylformamid wurde unter vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand wurde durch Zugabe von IN Zitronensäure verfestigt und dann aus Methanol-Ethylacetat umkristallisiert, wobei man 2,12 g des gewünschten Produktes erhielt.

55 Rf : 0,82 Rf: 0,79

Elementaranalyse für C32H50NgOi so Berechnet (%): Gefunden (%):

C 53,18 52,85

H 6,97 6,95

N 15,50 15,28

(IIa) Herstellung von Z-Thr-Asn-Leu-Gln-NHNH2

0,91 g Z-Thr-Asn-Leu-Gln-NHNHBoc wurden in 8 ml 65 TFA gelöst und 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen. Zu dieser Lösung wurden 80 ml wasserfreier Ether gegeben und der gebildete Niederschlag wurde schnell durch Filtrieren gesammelt und mit wasserfreiem Ether gewaschen

21

652 411

und dann unter vermindertem Druck in einem Kaliumhydro-xid-Phosphorpentoxid enthaltenden Exikator getrocknet, wobei man das gewünschte Produkt erhielt.

Rf1:0,34

(IIb) Herstellung von H-Glu-(OBzl)-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys (Tos)-Glu-OH

1,00 g Boc-Glu(OBzl)-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys(Tos)-Glu-OH wurden in 8 ml TFA gelöst und 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen. Zu dieser Lösung wurden 80 ml wasserfreier Ether gegeben und der gebildete Niederschlag wurde schnell durch Filtrieren gesammelt, mit wasserfreiem Ether gewaschen und dann unter vermindertem Druck in einem Kaliumhydroxid-Phosphorpentoxid enthaltenden Exikator getrocknet, wobei man das gewünschte Produkt erhielt.

Rf1:0,24 Rf": 0,44

( 11c) Herstellung von Z-Thr-Asn-Leu-Gln-Glu(OBzl)-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys(Tos)-Glu-OH

Das in Stufe (1 la) erhaltene Z-Thr-Asn-Gln-NHNH2 wurde in 10 ml Dimethylformamid gelöst und dazu wurden 0,63 ml 6N Salzsäure/Dioxan gegeben und die Mischung wurde auf -15 ° C gekühlt und dazu wurde unter Rühren Isoamylnitrit gegeben. Nachdem die Reaktionsmischung einen negativen Hydrazintest ergab, wurden 0,53 ml Triethylamin mit 0,40 ml einer kalten Dimethylformamidlösung tropfenweise in kleinen Mengen zum Neutralisieren der Reaktionsmischung zugegeben. Die die Azidverbindung enthaltende Lösung wurde zu 10 ml einer kalten Dimethylformamidlösung, enthaltend H-Glu(Obzl)-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys(Tos)-Glu-OH, erhalten gemäss Stufe (IIb) und 0,24 ml Triethylamin gegeben und die gesamte Mischung wurde 2 Stunden bei -10 bis -15 °C und dann 18 Stunden bei 4 °C unter Rühren umgesetzt. Dann wurde ähnlich wie beim Verfahren in der Stufe (1 la) das Produkt, das erhalten worden war durch Be-handlen von 1,16 g Z-Thr-Asn-Leu-Gln-NHNHBoc mit TFA, zu dem vorerwähnten Reaktionsprodukt gegeben und unter Rühren bei den gleichen Temperaturbedingungen 24 Stunden umgesetzt. Dimethylformamid wurde unter vermindertem Druck abdestilliert und der erhaltene Rückstand wurde mit mit Wasser gesättigtem n-Butanol fünfmal gewaschen und dann wurde das Extrakt unter vermindertem Druck destilliert. Der Rückstand wurde durch Zugabe von Ethylether verfestigt und aus Methanol-Ethylacetat umkristallisiert und der Niederschlag wurde mit heissem Methanol unter Erhalt des gewünschten Produktes gewaschen.

(lld) Herstellung von H-Thr-Asn-Leu-Gln-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys (Tos)-Glu-OH

Z-Thr-As-Leu-Gln-Glu(OBzl)-Ser-Arg-Ser-Lys(Tos)-Glu-OH, erhalten in Stufe (11c), wurde in einer Mischung aus 50 ml Methanol und 50 ml 30%-iger Essigsäure suspendiert und dazu wurde eine kleine Menge Palladiumschwarz gegeben und dann rührte man 18 Stunden unter Einleitung von Wasserstoffgas. Nach Beendigung der Umsetzung wurde der Katalysator abgesaugt und das Filtrat wurde unter vermindertem Druck destilliert und nachdem das Methanol vollständig abdestilliert war, wurde die konzentrierte Flüssigkeit einer Gelfiltration unter Verwendung von Sephadex G-25 und von 50%-iger Essigsäure als Eluierungsmittel behandelt, wobei man durch Sammeln der gewünschten Fraktion 740 mg der obigen Verbindung erhielt.

Rf1:0,17 Rf": 0,35

Elementaranalyse für Q^gNnC^CyE^C^^O

Berechnet (%): Gefunden (%):

C 48,91 48,82

H 7,08 6,63

N 15,64 15,74

(12) Herstellung von H-Thr-Asn-Leu-Gln-Glu-Ser-Leu-Arg-s Ser-Lys-Glu-OH

51,0 mg H-Thr-Asn-Leu-Gln-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys (TOS)-Glu-OH wurden in flüssigem Ammoniak, der zuvor über metallischem Natrium getrocknet worden war, gelöst und dazu wurden kleine Stücke an metallischem Natrium un-îoter Rühren gegeben, bis sich die Farbe der Reaktionsmischung nach blau verfärbte und diese Farbe 30 Sekunden bis 1 Minute beibehielt. Dann wurden Kristalle von NH4C1 zum Reaktionsgemisch gegeben und der Überschuss an metallischem Natrium neutralisiert. Nachdem der Ammoniak voll-is ständig bei Raumtemperatur abdestilliert worden war, wurde das Reaktionsprodukt über Sephadex G-25-Gel einer Gelfiltration unterworfen, unter Verwendung von 50%-iger Essigsäure als Eluiermittel und die gewünschten Fraktionen wurden gesammelt und dann wurde die Fraktion durch Zugabe 20 von Wasser nach dem Konzentrieren lyophilisiert, wobei man 32 mg des gewünschten Produktes (erfindungsgemässes Peptid) erhielt. Dieses Produkt wird nachfolgend als Peptid F bezeichnet.

Rf1:0,01 25 Rf®: 0,37

Elementaranalyse für C53H93Ni702i-C2H40-3H20

Berechnet (%): 30 Gefunden (%):

C 46,57 46,10

H 7,32 6,98

N 16,79 16,82

(13) Herstellung von Z-Leu-Ser-OCH3

1,81 g H-Ser-OCH3-HCl wurden in 25 ml Dimethylformamid gelöst und zu der Lösung wurden 1,62 ml Triethylamin 35 gegeben und die Mischung wurde auf -10 °C gekühlt. Zu dem Gemisch wurden unter Rühren 4,21 g Z-Leu-ONHS gegeben und dann wurde die Mischung 18 Stunden unter Rühren umgesetzt. Dimethylformamid wurde abdestilliert und der Rückstand wurde mit Ethylacetat extrahiert und die Eth-40 ylacetatschicht wurde mit Wasser gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und anschliessend wurde Ethylacetat unter vermindertem Druck abdestilliert. Der Rückstand wurde durch Zugabe von Ethylether verfestigt und aus Ethylacetat-Ether umkristallisiert, wobei man 2,68 g 45 des gewünschten Produktes erhielt.

Rf1:0,81 Rf11:0,82

Elementaranalyse für Ci8H26N206

50

Berechnet (%): Gefunden (%):

C 59,00 58,62

H 7,15 7,03

N7,65 7,65

55 ( 14a) Herstellung von H-Leu-Ser-OCH3-HCl

4,20 g Z-Leu-Ser-OCH3 wurden in einer Mischung aus 40 ml Methanol mit 11,46 ml IN Salzsäure suspendiert und dazu wurde eine kleine Menge Palladiumschwarz gegeben und dann wurde 18 Stunden unter Einleiten von Wasserstoff-6o gas gerührt. Nach Beendigung der Umsetzung wurde der Katalysator abgesaugt und das Filtrat unter vermindertem Druck destilliert und zum Rückstand wurde Wasser gegeben und abermals unter vermindertem Druck destilliert und dies wurde dreimal wiederholt. Der erhaltene Rückstand wurde 65 unter vermindertem Druck in einem Exikator, enthaltend Phosphorpentoxid als Trocknungsmittel, getrocknet, wobei man das gewünschte Produkt erhielt.

Rf1:0,38

652 411

22

( 14b) Herstellung von Z-Ser-Leu-Ser-OCH3

3,19 g Z-Ser-NHNH2 wurden in 25 ml Dimethylformamid gelöst und zu der Lösung wurden 6,30 ml 6N Salzsäure/ Dioxan gegeben und es wurde auf —15 °C gekühlt. Dazu wurden 1,69 ml Isoamylnitrit gegeben. Nachdem die Reaktionsmischung einen negativen Hydrazintest anzeigte, wurden 1,76 ml einer kalten Dimethylformamidlösung mit 5,29 ml Triethylamin tropfenweise in geringen Mengen zum Neutralisieren des Reaktionsgemisches zugegeben.Das das Azidprodukt enthaltende Reaktionsgemisch wurde zu 20 ml einer kalten Dimethylformamidlösung, enthaltend H-Leu-Ser-OCH3-HCl, erhalten in der obigen Stufe (14a), und 1,60 ml Triethylamin gegeben und die ganze Mischung wurde 2 Stunden bei -10 bis -15 °C und dann weitere 18 Stunden bei 4 °C gerührt. Dimethylformamid wurde unter vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand wurde durch Zugabe von Wasser verfestigt und aus Methanol-Ethylacetat umkristallisiert, wobei man 4,11 g des gewünschten Produktes erhielt.

Rf : 0,76 Rf11:0,79

Elementaranalyse für C2iH3iN308

Berechnet (%): Gefunden (%):

C 55,62 55,48

H 6,89 6,92

N9,27 9,18

(15) Herstellung von Z-Ser-Leu-Ser-NHNH2

2,00 g Z-Ser-Leu-Ser-OCH2 wurden in 40 ml Methanol gelöst und dazu wurden 1,10 ml 100% NH2NH2'H20 unter Eiskühlung gegeben und die Reaktionsmischung wurde 18 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen. Nach Beendigung der Umsetzung wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand wurde durch Zugabe von Ether verfestigt und der Überschuss an NH2NH2-H20 wurde entfernt. Das Produkt wurde durch Zugabe von Wasser verfestigt und dann aus Methanol-Ethylacetat umkristallisiert, wobei man 1,91 g des gewünschten Produktes erhielt.

Rf1:0,43 Rf":0,73

Elementaranalyse für C2oH3iN507

Berechnet (%): Gefunden (%):

C52,97 52,85

H 6,89 6,70

N 15,44 15,44

( 16a) Herstellung von Z-Ser-Leu-Ser-Thr-Asn-Leu-Gln-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys (Tos)-Glu-OH

70,42 mg Z-Ser-Leu-Ser-NHNH2 wurden in 5 ml Dimethylformamid gelöst und zu dieser Lösung wurden 0,78 ml einer 10-fach verdünnten Dimethylformamidlösung von 6N Salzsäure/Dioxan gegeben und die Mischung wurde auf -15 °C gekühlt und dazu wurden 0,20 ml einer 10-fach verdünnten Dimethylformamidlösung von Isoamylnitrit unter Rühren gegeben. Nachdem die Reaktionsmischung einen negativen Hydrazidtest ergab, wurden 0,65 ml einer 10-fach verdünnten Dimethylformamidlösung von Triethylamin tropfenweise in geringen Mengen zum Neutralisieren der Reaktionsmischung zugegeben. Die das Azidprodukt enthaltende Reaktionsmischung wurde zu 5 ml einer kalten Dimethylformamidlösung, enthaltend 151 mg von H-Thr-Asn-Leu-Gln-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys(Tos)-Glu-OHund 0,29 ml einer 10-fach verdünnten Dimethylformamidlösung von Triethylamin gegeben und die ganze Mischung wurde dann 2 Stunden bei —10 bis —15 °C und weitere 18 Stunden bei 4 °C gerührt. Dann wurden 117,36 ng Z-Ser-Leu-Ser-NHNH2 zugegeben und 24 Stunden umgesetzt.

Dimethylformamid wurde unter vermindertem Druck abdestilliert und der erhaltene Rückstand wurde mit mit Wasser gesättigtem n-Butanol extrahiert und das Extrakt wurde zehnmal mit mit n-Butanol gesättigtem Wasser und weitere 5 fünfmal mit 2%-iger Essigsäure, die mit n-Butanol gesättigt war, gewaschen und das Extrakt wurde unter vermindertem Druck destilliert und der erhaltene Rückstand wurde zu Wasser gegeben und unter vermindertem Druck destilliert. Nachdem n-Butanol vollständig abdestilliert war, wurde das Pro-lo dukt lyophilisiert und das lyophilisierte Produkt wurde aus Ethylacetat-Ether umkristallisiert, wobei man das gewünschte Produkt erhielt.

( 16b) Herstellung von H-Ser-Leu-Ser-Thr-Asn-Leu-Gln-Glu-15 Ser-Leu-Arg-Ser-Lys-Glu-OH

150 ml Z-Ser-Leu-Ser-Thr-Asn-Leu-Gln-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys-(Tos)-GIu-OH wurden in flüssigem Ammoniak, der zuvor mit metallischem Natrium getrocknet worden war, gelöst und dazu wurden kleine Stücke von metallischem Na-2otrium gegeben und die Lösung wurde gerührt, bis sich die Farbe der Reaktionsmischung nach blau verfärbte und die Färbung 30 Sekunden bis 1 Minute beibehalten wurde. Dann wurden Kristalle von NH4C1 zu der Reaktionsmischung gegeben und das überschüssige metallische Natrium wurde neu-25 tralisiert. Nachdem man den Ammoniak vollständig durch Abdestillieren bei Raumtemperatur entfernt hatte, wurde das Reaktionsprodukt einer Gelfiltration mit Sephadex G-25-Gel unter Verwendung von 25%-iger Essigsäure als Eluiermittel unterworfen und die gewünschte Fraktion wurde gesammelt 3o und nach Zugabe von Wasser konzentriert und lyophilisiert, wobei man 94 mg des gewünschten Produktes (erfindungsgemässes Peptid) erhielt. Dieses Produkt wird nachfolgend als Peptid G bezeichnet.

Rf1:0,02 .

35 Rf«; 0,39

Elementaranalyse für C65Hi2oN2o026'C2H402-H20

Berechnet (%): 40 Gefunden (%):

C 48,19 47,93

H 7,24 6,93

N 16,78 16,49

(17a) Herstellung von Z-Tyr-OSu

1,04 g Z-Tyr-OH wurden in 30 ml Tetrahydrofuran gelöst und zu dieser Lösung wurden 0,38 g N-Hydroxysuccinimid 45 gegeben und die Reaktionsmischung wurde ausgekühlt. Dazu wurden unter Eiskühlung 0,68 g Dicyclohexylcarbodiimid gegeben und die gesamte Mischung wurde 18 Stunden bei 4 °C gerührt. Der gebildete Niederschlag wurde durch Absaugen entfernt und das Filtrat wurde unter vermindertem Druck 50 destilliert und zu dem Rückstand wurde Ethylether und Pe-trolether gegeben und dann dekantiert und das erhaltene Produkt wurde dann getrocknet.

(17b) Herstellung von H-Ser-Leu-Ser-OCH3 55 1,00 g Z-Ser-Leu-Ser-OCH3, erhalten in der obigen Stufe (14b), wurde in 20 ml Methanol mit 20 ml 10%-iger Essigsäure suspendiert und dazu wurde eine kleine Menge Palladiumschwarz gegeben und die Suspension wurde 15 Stunden unter Einleiten von Wasserstoffgas gerührt. Nach Beendi-60 gung der Umsetzung wurde der Katalysator abgesaugt und das Filtrat unter vermindertem Druck destilüert und zum Rückstand wurde Wasser gegeben und lyphilisiert, wobei man das gewünschte Produkt erhielt.

Rf1:0,35 65 Rf":0,65

(17c) Herstellung von Z-Tyr-Ser-Leu-Ser-OCH3

H-Ser-Leu-Ser-OCH3, das gemäss der vorhergehenden

23

652 411

Stufe (17b) erhalten worden war, wurde in 10 ml Dimethylformamid gelöst und unter Eiskühlung wurden 0,31 ml Triethylamin zugegeben. Zu dieser Mischung wurde eine kalte Dimethylformamidlösung von Z-Tyr-OSu, erhalten gemäss Stufe (17a), unter Rühren gegeben. Die gesamte Mischung wurde 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und dann wurde Dimethylformamid unter vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand durch Zugabe von Wasser verfestigt, aus Methanol-Ether umkristallisiert, nochmals aus Methanol-Ethylacetat, wobei man 1,08 g des gewünschten Produktes erhielt.

Rf1:0,78 Rf": 0,82

Elementaranalyse für C30H40N4O10

Berechnet (%): C 58,43 H 6,54 N9,09

Gefunden (%): 58,14 6,58 9,16

(17d) Herstellung von Z-Tyr-Ser-Leu-Ser-NHNH2

1,00 g Z-Tyr-Ser-Leu-Ser-OCH3 wurden in Methanol gelöst und unter Eiskühlung wurden 0,82 ml 100%-iges NH2NH2H20 dazugegeben und die Mischung wurde 18 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen. Methanol wurde unter vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand wurde durch Zugabe von Ethylether verfestigt und dann mit Wasser gewaschen um den Überschuss an NH2NH2-H20 zu entfernen und aus Methanol-Ether umkristallisiert und mit heissem Methanol gewaschen, wobei man 0,81 g des gewünschten Produktes erhielt.

Rf1:0,45 Rf": 0,76

Elementaranalyse für C29H4oN609

Berechnet (%): C 56,48 H 6,54 N 13,63

Gefunden (%): 56,12 6,57 13,58

( 18a) Herstellung vonZ-Tyr-Ser-Leu-Ser-Thr-Asn-Leu-Gln-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys ( Tos-Glu-OH

42,3 mg Z-Tyr-Ser-Leu-Ser-NHNH2 wurden in 4 ml Dimethylformamid gelöst. Dazu wurden 0,34 ml einer 10-fach verdünnten Dimethylformamidlösung von 6N HCl/Dioxan gegeben und die Mischung wurde auf -15 °C gekühlt und unter Rühren wurden dazu 0,09 ml einer auf das 10-fache verdünnten Dimethylformamidlösung von Isoamylnitrit gegeben. Nachdem die Reaktionsmischung einen negativen Hy-drazidtest zeigte, wurden 0,29 ml einer auf das 10-fache verdünnten Dimethylformamidlösung von Triethylamin tropfenweise in kleinen Mengen zum Neutralisieren des Reaktionsgemisches zugegeben. Die das Azidprodukt enthaltende Reaktionsmischung wurde zu 4 ml einer kalten Dimethylformamidlösung, enthaltend 50,0 mg H-Thr-Asn-Leu-Gln-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys(Tos)-Glu-OH sowie 0,10 ml einer um das 10-fache verdünnten Dimethylformamidlösung von Triethylamin gegeben und die ganze Mischung wurde 2 Stunden bei —10 bis -15 °C und anschliessend 18 Stunden bei 4 °C gerührt. Dazu wurden 42,3 mg Z-Tyr-Ser-Leu-Ser-NHNH2 in Form des Azides gegeben und die Umsetzung wurde 24 h durchgeführt. Dimethylformamid wurde unter vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand wurde mit 30 ml n-Butanol, das mit Wasser gesättigt war, extrahiert und das Extrakt wurde zehnmal mit Wasser, das mit n-Butan-ol gesättigt war, gewaschen und anschliessend fünfmal mit 2%-iger Essigsäure die mit n-Butanol gesättigt war. Die organischen Schichten wurden gesammelt und unter vermindertem Druck zur Entfernung von n-Butanol destilliert und der

Rückstand wurde lyophilisiert und aus Ethylacetat-Ether umkristallisiert, wobei man das gewünschte Produkt erhielt.

( 18b) Herstellung von H-Tyr-Ser-Leu-Ser-Thr-Asn-Leu-Gln-5 Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys-Glu-OH

Z-Tyr-Ser-Leu-Ser-Thr-Asn-Leu-Gln-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys(Tos)-Glu-OH wurde in flüssigem Ammoniak, der zuvor mit metallischem Natrium getrocknet worden war, gelöst und dazu wurden kleine Natriummetallstücke unter Rühren io gegeben, bis die Farbe der Reaktionsmischung sich nach blau veränderte und 30 Sekunden bis 1 Minute diese Farbe beibehielt. Dann wurden Kristalle von NH4C1 zum Reaktionsgemisch gegeben und das überschüssige metallische Natrium neutralisiert und nachdem der Ammoniak vollständig bei 15 Raumtemperatur abdestilliert worden war, wurde das erhaltene Reaktionsprodukt einer Gelfiltration mit Sephadex G-25-Gel unter Verwendung von 50%-iger Essigsäure als Eluiermittel unterworfen, wobei man 33 mg des gewünschten Produktes erhielt. Dieses Produkt wird nachfolgend als Pep-2otid H bezeichnet.

Rf1:0,02 Rf11:0,35

Elementaranalyse für C74H123N2i028-C2H402-4H20

25

Berechnet (%): C 47,71 H 7,30 N 15,79

Gefunden (%): 47,32 7,24 15,82

Herstellungsbeispiel C 30 Referenzbeispiel 1

Herstellung von Z-Ser-Ser-OMe

5,06 gZ-Ser-NHNH2 wurden in 50 ml Dimethylformamid zusammen mit 6,66 ml 6N Salzsäure/Dioxan gelöst und die Lösung wurde auf -15 °C gekühlt. Dazu wurden 2,68 ml 35 Isoamylnitrit gegeben und die Mischung wurde 5 Minuten gerührt. Anschliessend wurden zum Neutralisieren des Reaktionsgemisches 5,60 ml Triethylamin zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde zu 30 ml einer Dimethylformamidlösung, enthaltend 3,11 g H-Ser-OMe-HCl und 2,80 ml Trito ethylamin gegeben und die Mischung wurde 20 Stunden bei 4 °C gerührt. Dimethylformamid wurde abdestilliert und der Rückstand wurde mit Ethylacetat extrahiert und das Extrakt wurde mit Wasser gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Nach dem Abdestillieren des Ethylace-45 tats wurde der Rückstand durch Zugabe von Ether kristallisiert und aus Ethylacetat-Ether umkristallisiert, wobei man 3,75 g Z-Ser-Ser-OMe erhielt.

Rf1:0,64 Rf11:0,77

50

Elementaranalyse für C15H20N2O7

Berechnet (%): C 52,94 H 5,92 N8,23

Gefunden (%): 52,67 5,89 8,35

Referenzbeispiel 2 Herstellung von Z-Arg(Tos)-Ser-Ser-OMe 60 2,5 g Z-Ser-OMe wurden in 50 ml Methanol zusammen mit 7,34 ml IN Salzsäure gelöst und dann wurde in Gegenwart von 500 mg Palladiumschwarz unter 1 Atm Wasserstoffdruck bei 20 °C eine katalytische Reduktion durchgeführt, unter Erhalt von H-Ser-Ser-OMe-HCl.

65 Rf1; 0,08

3,39 g Z-Arg(Tos)-OH wurden in 40 ml Tetrahydrofuran und 0,75 ml N-Methylmorpholin gelöst und die Mischung

652 411

24

wurde auf —15 °C gekühlt und dazu wurden unter kräftigem Rühren während 30 Sekunden 0,97 ml Isobutylchloroformiat gegeben.

Das wie oben erhaltene H-Ser-Ser-OMe-HCl, 20 ml Dimethylformamid und 1,03 ml Triethylamin wurden zugegeben und gerührt, dann wurde 5 Minuten bei 0 °C und weitere 2 Minuten bei 40 °C und 15 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Nach Abdestillieren von Tetrahydrofuran und Dimethylformamid wurde der Rückstand mit Ethylacetat extrahiert und das Extrakt wurde dreimal mit IN Zitronensäure und anschliessend fünfmal mit Wasser gewaschen und dann über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde abdestilliert und der Rückstand wurde aus Methanol-Ethylacetat umkristallisiert, wobei man 3,65 g Z-Arg(Tos)-Ser-Ser-OMe erhielt.

Rf1:0,51

Rf11:0,73

Rf1:0,71 Rf11:0,80

Elementaranalyse für C20H29N3O6

Berechnet (%): Gefunden (%):

C 58,95 58,99

H 7,17 7,23

N 10,31 10,26

Elementaranalyse für C28H3gN6Oi0S

Berechnet (%): Gefunden (%):

C 51,68 51,62

H 5,88 5,82

N 12,91 12,73

Referenzbeispiel 3 Herstellung von Z-Arg(Tos)-Ser-Ser-OH

3,5 g Z-Arg(Tos)-Ser-Ser-OMe wurden in 50 ml Methanol gelöst und dazu wurden 10 ml Wasser und 8,06 ml IN Natriumhydroxid gegeben und die Mischung wurde 45 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Zum Neutralisieren der Reaktionsmischung wurden 7,24 ml IN HCl zugegeben und dann wurde Methanol abdestilliert und der Rückstand mit n-Butanol extrahiert. Das Extrakt wurde mit Wasser gewaschen und nach dem Abdestillieren von n-Butanol und Wasser wurde der Rückstand durch Zugabe von Ether kristallisiert und aus Methanol-Ethylacetat umkristallisiert, wobei man 2,60 g Z-Arg(Tos)-Ser-Ser-OH erhielt.

Rf1:0,28 Rf11:0,57

io Referenzbeispiel 6

Herstellung von Z-Tyr-Asn-Leu-OEt

3,01 g Z-Asn-Leu-OEt wurden in 50 ml Methanol und 7,4 ml IN HCl gelöst und die Lösung wurde in Gegenwart von 500 mg Palladiumschwarz bei Raumtemperatur unter 15 Atmosphärendruck reduziert, wobei man H-Asn-Leu-OEt-HCl erhielt.

Rf1:0,26

Das so erhaltene H-Asn-Leu-OEt-HCl wurde in 50 ml Di-2omethylformamid und 1,03 ml Triethylamin gelöst und dazu wurden 3,35 g Z-Tyr-ONHS gegeben und die Mischung wurde 20 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen.

Nach dem Abdestillieren von Dimethylformamid wurde zu dem Rückstand eine wässrige IM Zitronensäurelösung gege-25 ben und der Niederschlag wurde filtriert, mit Wasser gewaschen und aus Methanol-Ethylacetat umkristallisiert, wobei man 3,58 g Z-Tyr-Asn-Leu-OEt erhielt.

Rf : 0,73 Rf11:0,82

30

Elementaranalyse für C29H38N408

Berechnet (%): Gefunden (%):

C 61,04 60,84

H 6,71 6,70

N 9,82 9,39

35

Elementaranalyse für C27H36N6Oi0S- 1 /2 H20

Berechnet (%): Gefunden (%):

C50,22 50,24

H 5,77 5,62

N 13,02 13,20

Referenzbeispiel 4 Herstellung von H-Arg(Tos)-Ser-Ser-OH

1,35 g Z-Arg(Tos)-Ser-Ser-OH wurden in 50 ml Methanol und 10 ml 10%-iger Essigsäure gelöst und die Lösung wurde katalytisch in Gegenwart von 500 mg Palladiumschwarz unter 1 Atm Wasserstoffdruck reduziert, wobei man H-Arg(Tos)-Ser-Ser-OH erhielt.

Rf1:0,034

Referenzbeispiel 5 Herstellung von Z-Asn-Leu OEt

5,32 g Z-Asn-OH wurden in 60 ml Tetrahydrofuran, 10 ml Dimethylformamid und 2,04 ml N-Methylmorpholin gelöst und dazu wurden 40 ml einer Dimethylformamidlösung, enthaltend 2,64 ml Isobutylchloroformiat, 3,91 g H-Leu-OEt-HCl und 2,80 ml Triethylamin gegeben und die Mischung wurde in ähnlicher Weise, wie dies in Referenzbeispiel 2 beschrieben wurde, umgesetzt. Nach Abdestillieren des Lösungsmittels wurde zu dem Rückstand IM Zitronensäure gegeben und der Niederschlag wurde durch Filtrieren gesammelt, mit Wasser gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet und aus Ethylacetat umkristallisiert, wobei man 6,1 g Z-Asn-Leu-OEt erhielt.

Referenzbeispiel 7 Herstellung von Z-Tyr-Asn-Leu-NHNH2

2,78 g Z-Tyr-Asn-Leu-OEt wurden in 30 ml Methanol ge-40 löst und dazu wurden 1,21 ml Hydrazinhydrat gegeben und die Mischung wurde über Nacht stehen gelassen und die gebildeten Kristalle wurden abfiltriert und mit einer kleinen Menge Methanol gewaschen, wobei man 3,10 g Z-Tyr-Asn-Leu-NHNH2 erhielt.

45 Rf : 0,56 Rf51:0,75

Elementaranalyse für C27H36N607

so Berechnet (%): Gefunden (%):

C 58,26 57,91

H 6,52 6,65

N 15,10 15,12

Beispiel 1

(a) Herstellung von Boc-Leu-Gln-Arg(Tos)-Ser-Ser-OH 55 0,84 g Boc-Leu-Gln-OH wurden in 30 ml Tetrahydrofuran und 0,24 ml N-Methylmorpholin gelöst und zu dieser Lösung wurden 0,31 ml Isobutylchloroformiat und H-Arg(Tos)-Ser-Ser-OH, erhalten gemäss Referenzbeispiel 4, gegeben und die Mischung wurde dann in ähnlicher Weise wie dies beim so Referenzbeispiel 2 beschrieben wurde, umgesetzt. Nach dem Abdestllieren von Tetrahydrofuran und Dimethylformamid wurde der Rückstand mit Butanol extrahiert. Die Butanolschicht wurde mit 20%-iger Essigsäure gewaschen und dann wurde Butanol abdestilliert. Beim Umkristallisieren aus 65 Methanol-Ethylacetat erhielt man 1,54 gBoc-Leu-Glb-Arg-(Tos)-Ser-Ser-OH.

R?:0,18 Rf11:0,57

25

652 411

Elementaranalyse für C35H57N90i3SH20

Berechnet (%): Gefunden (%):

C 48,77 48,76

H 6,90 6,61

N 14,62 14,78

(b) Herstellung von H-Leu-Gln-Arg-Ser-Ser-OH

1,50 g Boc-Leu-Gln-Arg(Tos)-Ser-Ser-OH wurden mit 10 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur zur Entfernung der t-Butoxycarbonylgruppe behandelt und trockener Ether wurde zum Reaktionsgemisch zum Kristallisieren des Produktes zugegeben, wobei man H-Leu-Gln-Arg(Tos)-Ser-Ser-OH erhielt.

Rf1:0,04

H-Leu-Gln-Arg(Tos)-Ser-Ser-OH, erhalten wie oben, wurde in 25 ml flüssigem Ammoniak gelöst und dazu wurden kleine metallische Natriumstücke gegeben. Dabei veränderte sich die Farbe der Mischung nach blau. Zu dieser Mischung wurde 1 g trockenes Ammoniumchlorid gegeben und dann wurde der Ammoniak abdestüliert. Der Rückstand wurde in 50%-iger Essigsäure gelöst und diese Lösung wurde einer Gelfiltration mit Sephadex G-10 (2,2 x 85 cm, Eluiermittel: 50%-ige Essigsäure) und weiter mit LH-20 (2,2 x 80 cm, Eluiermittel: 0,001N HCl) unterworfen, wobei man ein reines H-Leu-Gln-Arg-Ser-Ser-OH erhielt. Dieses Produkt wird nachfolgend als Peptid I bezeichnet.

Rf1:0,01 Rf11:0,34

hielt. Dieses Produkt wird nachfolgend als Peptid J bezeichnet.

Rf1:0,01 Rf11:0,35

[a] p : -37,3° (C = 0,249,0,001NHC1) Elementaranalyse für C32H52N10Oi0-7H2O-CH3COOH

io Berechnet (%): Gefunden (%):

C 44,24 44,27

H 7,64 7,10

N 15,17 15,60

M

20 D

-42,5° (C = 0,230,0,00IN HCl)

Elementaranalyse für C23H43N909-4H20-CH3C00H

Berechnet (%): Gefunden (%):

C 41,60 41,20

H 7,68 7,93

N 17,46 17,91

Beispiel 3

(a) Herstellung vonZ-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Arg(Tos)-Ser-15 Ser-OH

0,39 g Z-Leu-Gly-NHNH2 wurden in 5 ml Dimethylformamid und 0,58 ml 6N HCl/Dioxan gelöst und dann wurde in ähnlicher Weise wie in Referenzbeispiel 1 eine Umsetzung durchgeführt, unter Verwendung von 10 ml einer Di-zomethylformamidlösung, enthaltend 0,15 ml Isoamylnitrit, 0,49 ml Triethylamin und 1,00 g H-Phe-Leu-Gln-ArgÇTos)-Ser-Ser-OH. Dann wurde zu dem Reaktionsgemisch eine äquivalente Menge von Z-Leu-GlyN3 gegeben und die Umsetzung wurde 20 Stunden bei 4 °C durchgeführt. Die Reak-2S tionsmischung wurde mit Methanol extrahiert und das Extrakt wurde mit 2%-iger Essigsäure und dann mit Butanol gewaschen und die Essigsäure wurde abdestilliert und der Rückstand wurde aus Ether kristallisiert. Die Kristalle wurden durch Filtrieren gesammelt und mit heissem Methanol gewa-30 sehen, wobei man 0,65 g Z-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Arg(Tos)-Ser-Ser-OH erhielt.

Rf1:0,19

Rf11:0,60

Beispiel 2

(a) Herstellung von Z-Phe-Leu-Gln-Arg(Tos)-Ser-Ser-OH H-Leu-Gln-Arg(Tos)-Ser-Ser-OH, erhalten gemäss Beispiel 1, wurde in 30 ml Dimethylformamid und 0,24 ml Triethylamin gelöst und dazu wurden 0,77 g Z-Phe-ONHS gegeben und die Mischung wurde 20 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen. Nach dem Abdestillieren von Dimethylformamid wurde der Rückstand mit Butanol extrahiert und das Extrakt wurde mit 2%-iger Essigsäure extrahiert. Die Butanolschicht wurde konzentriert und das Konzentrat wurde durch Zugabe von Ether kristallisiert und die Kristalle wurden durch Filtrierung gesammelt und mit heissem Ethanol gewaschen, wobei man 1,40 g Z-Phe-Leu-Gln-Arg(Tos)-Ser-Ser-OH erhielt.

RftO^

Rf11:0,59

35 Elementaranalyse für C55H78N120i6S-H20

Berechnet (%): Gefunden (%):

C 54,44 54,74

H 6,64 6,66

N 13,85 13,98

Elementaranalyse für C47H64N1o014S-H20

40 (b) Herstellung von H-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Arg-Ser-Ser-OH

20 mg Z-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Arg(Tos)-Ser-Ser-OH wurden in ähnlicher Weise wie in Beispiel l(b) beschrieben zur Entfernung eine Gruppe der Formel Z und einer Gruppe 45 der Formel Tos behandelt und dann wurde das Reaktionsgemisch einer Gelfiltration unter Verwendung von Sephadex G-10 (2,2 x 85 cm, Eluiermittel: 10%-ige Essigsäure) und dann unter Verwendung von LH-20 (2,2 x 80 cm, Eluiermittel: 0,001N HCl) unterworfen, wobei man 11 mg H-Leu-Gly-50 Phe-Leu-Gln-Arg-Ser-Ser-OH erhielt. Dieses Produkt wird nachfolgend als Peptid K bezeichnet.

RfrO.Ol

Rf11:0,40

Berechnet (%): Gefunden (%):

C 54,12 54,42

H 6,28 6,38

N 13,43 13,84

55

(b) Herstellung von H-Phe-Leu-Gln-Arg-Ser-Ser-OH

20 mg Z-Phe-Leu-Gln-Arg(Tos)-Ser-Ser-OH wurden mit metallischem Natrium in flüssigem Ammoniak zur Entfernung einer Gruppe der Formel Z und einer Gruppe der Formel (Tos) in ähnlicher Weise, wie dies in Beispiel l(b) beschrieben wurde, behandelt und die Reaktionsmischung wurde dann einer Gelfiltration unter Verwendung von Sephadex G-10 (2,2 x 85 cm, Eluiermittel: 10%-ige Essigsäure) und dann unter Verwendung von LH-20 (2,2 x 80 cm, Eluiermittel: 0,001N HCl) unterworfen, wobei man 12 mg eines gereinigten Produktes von H-Phe-Leu-Gln-Arg-Ser-Ser-OH erta] 20d : -27,6° (C = 0,228,0,001NHC1) Elementaranalyse für C4oH66N12Oi2-6H2OCH3COOH

Berechnet (%): 60 Gefunden (%):

C 46,92 46,89

H 7,68 7,25

N 15,63 15,51

65

Beispiel 4

(a) Herstellung von H-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Arg(Tos)-Ser-Ser-OH

600 mg Z-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Arg(Tos)-Ser-Ser-OH wurden in 50 mg Methanol und 10 mg 10%-iger Essigsäure gelöst und die Mischung wurde in Gegenwart von 500 mg Palladium bei Raumtemperatur unter Atmosphärendruck re-

652 411

26

duziert, wobei man H-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Arg(Tos)-Ser-Ser-OH erhielt.

Rf1:0,18

420 mg Z-Tyr-Asn-Leu-NHNH2 wurden in 5 ml Dimethylformamid und 0,37 ml 6N HCl/Dioxan gelöst und dann wurde unter Verwendung von 0,10 ml Isoamylnitrit und 0,31 ml Triethylamin ein Azidprodukt in ähnlicher Weise hergestellt wie in Referenzbeispiel 1 beschrieben. Das Reaktionsgemisch wurde zu einer Mischung von 10 ml Hexameth-ylphosphortriamid und H-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Arg(Tos)-Ser-Ser-OH in 10 ml Dimethylformamid gegeben und die gesamte Mischung wurde 20 Stunden bei 4 °C gerührt. Dimethylformamid wurde abdestilliert und der Rückstand wurde mit Butanol extrahiert und das Extrakt wurde mit 2%-iger Essigsäure gewaschen und Butanol abdestilliert. Der Rückstand wurde durch Zugabe von Ether kristallisiert. Das so erhaltene Z-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Arg(Tos)-Ser-Ser-OH wurde in 30 ml Methanol und 10 ml 10%-iger Essigsäure gelöst und die Lösung wurde in Gegenwart von Palladium bei Raumtemperatur unter Atmosphärendruck einer katalyti-schen Reduktion unterworfen und das Reaktionsgemisch dann unter Verwendung von Sephadex G-25 (3 x 120 cm, Eluiermittel 50%-ige Essigsäure) einer Gelfiltration unterworfen, wobei man 650 mg H-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Arg(Tos)-Ser-Ser-OH erhielt.

Rf1:0,05

Rf": 0,53

Dimethylformamid und 5 ml Hexamethylphosphortriamid gegeben und die ganze Mischung wurde 24 Stunden bei 4 ° C gerührt. Dazu wurden 318 mg Z-Met-Ser-NHNH2 gegeben und dann wurde 72 Stunden bei 4 °C gerührt. In ähnlicher 5 Weise wie in Beispiel 4(a) beschrieben, erfolgte dann die Reinigung, wobei man Z-Met-Ser-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Arg(Tos)-Ser-Ser-OH erhielt.

(b) Herstellung von H-Met-Ser-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe-lo Leu-Gln-Arg-Ser-Ser-OH

Z-Met-Ser-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Arg (Tos)-Ser-Ser-OH wurde in ähnlicher Weise wie in Beispiel l(b) beschrieben behandelt, um eine Gruppe der Formel Z und eine Gruppe der Formel Tos zu entfernen und dann i5 wurde das Reaktionsgemisch unter Verwendung von Sephadex G-25 (3 x 120 cm, Eluiermittel: 50%-ige Essigsäure) und weiterhin unter Verwendung von LH-20 (2 x 85 cm, Eluiermittel: 0,00 IN HCl) gereinigt, wobei man 119 mg H-Met-Ser-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Arg-Ser-Ser-OH erhielt. 2o Dieses Produkt wird nachfolgend als Peptid M bezeichnet. Rf1:0,01 Rf11:0,45

[a] : -15,7° (C = 0,254,0,001NHC1)

25

Elementaranalyse für C67Hio6N1802oS-5H2OCH3COOH

Berechnet (%): Gefunden (%):

C 49,75 49,80

H 7,26 6,92

N 15,13 14,91

30

Elementaranalyse für C66H98N]60]9S-2H20

Berechnet (%): Gefunden (%):

C 53,28 53,10

H 6,91 6,43

N 15,06 14,84

(b) Herstellung von H-Tyr-Asn-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Arg-Ser-Ser-OH

H-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Arg(Tos)-Ser-Ser-OH, erhalten gemäss Beispiel 4(a), wurde in ähnlicher Weise wie in Beispiel l(b) beschrieben behandelt, um eine Gruppe der Formel Tos zu entfernen und dann wurde das Reaktionsgemisch einer Gelfiltration unter Verwendung von Sephadex G-10 (2,2 x 85 cm, Eluiermittel: 10%-ige Essigsäure) und unter Verwendung von LH-20 (2,2 x 80 cm, Eluiermittel: 0,001N HCl) unterworfen, wobei man 9 mg des gereinigten Produktes von H-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Arg-Ser-Ser-OH erhielt. Dieses Produkt wird nachfolgend als Peptid L bezeichnet.

Rf1:0,41

Rf11:0,42

r t 20 M D

: -24,3° (C = 0,078,0,00IN HCl)

Aminosäureanalyse:

Asp: 0,95, Ser: 3,15, Gin: 1,03 Met: 0,92, Gly: 1,05, Leu: 3,08 Tyr: 1,00, Phe: 0,98, Arg: 0,96

35

Herstellung von Antigen

Herstellungsbeispiel 1 1 mg Peptid A, hergestellt gemäss Herstellungsbeispiel A-l für die Synthese von Peptiden, und 15 mg Rinderserum-4° albumin (nachfolgend als BSA bezeichnet) wurden in 2 ml 0,1M Ammoniumacetatpufferlösung (pH 7,0) gelöst. Zu der Lösung wurden 0,11 ml 0,IM Glutaraldehydlösung gegeben und die Mischung wurde 5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde das Reaktionsgemisch mit 11 Wasser bei « 4 °c 48 Stunden dialysiert. Während der Dialyse wurde das Wasser fünfmal gewechselt. Die die Peptid-Protein-Zusam-mensetzung enthaltende dialysierte Lösung wurde lyophilisiert, wobei man 18 mg Human-Interferon-a-Antigen (nachfolgend als Antigen-a-N-I bezeichnet) erhielt. 50 Bei diesem Antigen-a-N-I handelt es sich um ein Antigen, bei dem durchschnittlich 12 Mole des Peptids A mit einem Mol BSA kombiniert sind.

Elementaranalyse für 059^2^00)7-15H2OCH3COOH

55

Berechnet (%): Gefunden (%):

C 45,01 45,21

H 7,80 7,31

N 13,77 14,22

Beispiel 5

(a) Herstellung von Z-Met-Ser-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Arg(Tos)-Ser-Ser-OH

159 mg Z-Met-Ser-NHNH2 wurden in 5 ml Dimethylformamid und 0,21 ml 6N HCl/Dioxan gelöst und dann wurde unter Verwendung von 0,055 ml Isoamylnitrit und 0,17 ml Triethylamin in ähnlicher Weise wie in Referenzbeispiel 1 beschrieben, das Azidprodukt hergestellt. Die Reaktionsmischung wurde zu einer Mischung aus 300 mg H-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Arg(Tos)-Ser-Ser-OH, 5 ml

Herstellungsbeispiel 2 5 mg Peptid B, das gemäss Herstellungsbeispiel A-2 bei der Synthese von Peptiden hergestellt worden war und 20 mg BSA wurden in 2 ml einer 0,1 M Ammoniumacetatpufferlösung (pH 7,0) gelöst. Zu dieser Lösung wurden 0,11 ml einer 0,1M Glutaraldehydlösung gegeben und die Mischung wurde 60 5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde die Reaktionsmischung mit 11 Wasser bei 4 °C während 48 Stunden dialysiert und während der Dialyse wurde das Wasser fünfmal gewechselt. Die dialysierte Lösung, enthaltend die Pep-tid-Protein-Zusammensetzung, wurde lyophilisiert, wobei 65 man 23 mg Human-Interferon-a-Antigen (nachfolgend als Antigen-a-N-H bezeichnet) erhielt.

In diesem Antigen-a-N-II sind durchschnittlich 9 Mole des Peptids B mit 1 Mol BSA vereint.

27

652 411

Herstellungsbeispiel 3 4,5 mg Peptid C, hergestellt gemäss Herstellungsbeispiel A-3 bei der Synthese der Peptide, und 25 mg BSA wurden in 2 ml einer 0,1 M Ammoniumacetatpufferlösung (pH 7,0) gelöst. Zu dieser Lösung wurden 1,0 ml 0,1 M Glutaraldehydlösung gegeben und die Mischung wurde 5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde das Reaktionsgemissch mit 11 Wasser während 48 Stunden bei 4°C dialysiert und dabei das Wasser fünfmal gewechselt. Die dialysierte Lösung, enthaltend die Peptid-Protein-Zusammensetzung, wurde lyophilisiert, wobei man 27 mg Human-Interferon-a-Antigen (nachfolgend als Antigen-a-N-III bezeichnet) erhielt.

Bei diesem Antigen-a-N-III sind durchschnittlich 10 Mole des Peptids C mit 1 Mol BSA vereint.

Herstellungsbeispiel 4 5 mg Peptid D, das gemäss Herstellungsbeispiel A-4 bei der Synthese der Peptide erhalten worden war, und 25 mg BSA wurden in 2 ml einer 0,1 M Ammoniumacetatpufferlösung (pH 7,0) gelöst. Zu dieser Lösung wurden 0,11 ml 0,1 M Glutaraldehydlösung gegeben und die Mischung wurde 5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde das Reaktionsgemisch mit 11 Wasser während 48 Stunden bei 4 °C dialysiert und während der Dialyse wurde das Wasser fünfmal gewechselt. Die dialysierte Lösung, enthaltend die Peptid-Protein-Zusammensetzung, wurde lyophilisiert, wobei man 28 mg Human-Interferon-a-Antigen (nachfolgend als Antigen-a-N-IV bezeichnet) erhielt.

In diesem Antigen sind durchschnittlich 9 Mole des Peptids D mit 1 Mol BSA vereint.

Herstellungsbeispiel 5 4,5 mg Peptid C, des gemäss Herstellungsbeispiels A-3 bei der Synthese der Peptide erhalten worden war, und 25 mg BSA wurden in 4 ml Wasser gelöst. Zu dieser Lösung wurden 200 mg Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) gegeben und die Mischung wurde 5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde das Reaktionsgemisch mit 21 Wasser bei 4 °C während 48 Stunden dialysiert und dabei das Wasser fünfmal gewechselt. Die dialysierte Lösung, enthaltend die Peptid-Protein-Zusammensetzung, wurde lyophilisiert, wobei man 27,5 mg Human-Interferon-a-Antigen (nachfolgend als Anti-gen-a-N-V bezeichnet) erhielt.

In diesem Antigen sind durchschnittlich 12 Mole des Peptids C mit 1 Mol BSA vereint.

Herstellungsbeispiel 6 4,5 mg Peptid D, hergestellt gemäss Herstellungsbeispiel A-4 bei der Synthese der Peptide, und 25 mg BSA wurden in 4 ml Wasser gelöst. Zu dieser Lösung wurden 200 mg Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) gegeben und die Mischung wurde 5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde das Reaktionsgemisch mit 21 Wasser 48 Stunden bei 4 °C dialysiert. Dabei wurde das Wasser fünfmal gewechselt. Die die Peptid-Protein-Zusammensetzung enthaltende dialysierte Lösung wurde lyophilisiert, wobei man 29 mg Human-Interferon-a-Antigen (nachfolgend als Antigen-a-N-VI bezeichnet) erhielt.

In dem Antigen-a-N-VI sind durchschnittlich 9 Mole des Peptids D mit 1 Mol BSA vereint.

Herstellungsbeispiel 7 5 mg Peptid E, hergestellt gemäss Herstellungsbeispiel B-7c bei der Synthese der Peptide und 15 mg BSA wurden in 2 ml einer 0,1 M Ammoniumacetatpufferlösung (pH 7,0) gelöst. Zu dieser Lösung wurden 0,11 ml einer 0,1M Glutaraldehydlösung gegeben und die Mischung wurde 5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde das Reaktionsgemisch mit 11 Wasser bei 4 °C während 48 Stunden dialysiert und dabei das Wasser fünfmal gewechselt. Die dialysierte Lösung, enthaltend die Peptid-Protein-Zusammensetzung, wurde lyophilisiert, wobei man 15 mg Human-Interferon-a-5 Antigen (nachfolgend als Antigen-a-C-I bezeichnet) erhielt.

In diesem Antigen-a-C-I sind durchschnittlich 10 Mole des Peptins E mit 1 Mol BSA vereint.

Das Kombinationsverhältnis von Peptid E zu BSA im Antigen-a-C-I wurde wie folgt berechnet. Nachdem man fest-ìogestellt hatte, dass weder nicht-umgesetztes BSA noch nicht-umgesetztes Peptid E in dem Antigen-a-C-I vorhanden war, indem man eine weitere Gelfiltration unter Verwendung von Sephadex G-50 vornahm (Eluiermittel: physiologische Kochsalzlösung; Bestimmung: OD 280 nm; Eluiergeschwindigkeit: i5 3 ml/h; abgetrennte Menge: jeweils 1 ml) wurden die Mengen eines Bruchteils von Peptid E, das sich mit BSA (einer Peptid-Protein-Zusammensetzung) vereint hat, bestimmt und eine Fraktion eines anderen Produktes (eines Dimeren von Peptid E) wurde gleichfalls bestimmt und auf diese Weise wurde eine 20 Kalibrierungskurve der Standarkonzentration für das Dimere und für das Peptid E erstellt, um die Menge des Dimeren festzustellen. Dann wurde die Menge des Dimeren von der Menge des Peptids E, das als Ausgangsmaterial verwendet worden war, abgezogen und der abgezogene Wert der Menge 25 des Peptids E ist dann die Menge an Peptid E, die mit BSA kombiniert ist.

Das Kombinationsverhältnis eines synthetischen Peptids zu BSA bei jedem der in den jeweiligen Beispielen verwendeten Antigene wurde in gleicher Weise berechnet.

30

Herstellungsbeispiel 8 5 mg Peptid F, hergestellt gemäss Herstellungsbeispiel B-12 bei der Synthese der Peptide, und 5 mg BSA wurden in 2 ml einer 0,1 M Ammoniumacetatpufferlösung (pH 7,0) ge-35 löst. Zu dieser Lösung wurden 0,11 ml einer 0, IM Glutaraldehydlösung gegeben und die Mischung wurde 5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde das Reaktionsgemisch mit 11 Wasser bei 4 °C während 48 Stunden dialysiert und während der Dialyse das Wasser fünfmal gewechselt. Die 40 dialysierte Lösung, enthaltend die Peptid-Protein-Zusam-mensetzung, wurde lyophilisiert, wobei man 9 mg Human-In-terferon-a-Antigen, nachfolgend als Antigen-a-C-II bezeichnet, erhielt.

Dieses Antigen-a-C-II enthält durchschnittlich 9 Mole des 45 Peptids F kombiniert mit 1 Mol BSA.

Herstellungsbeispiel 9 5 mg Peptid G, hergestellt gemäss Herstellungsbeispiel B-16b bei der Synthese der Peptide und 25 mg BSA wurden in 50 4 ml Wasser gelöst. Dieser Lösung wurden 200 mg Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) zugegeben und die Mischung wurde 5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde das Reaktionsgemisch mit 21 Wasser von 4 °C während 48 Stunden dialysiert und während der Dialyse wurde das Wasser fünf-55 mal gewechselt. Die dialysierte Lösung, enthaltend die Pep-tid-Protein-Zusammensetzung, wurde lyophilisiert, wobei man 28 mg Human-Interferon-a-Antigen, nachfolgend als Antigen-a-C-III bezeichnet, erhielt.

Bei diesem Antigen waren im Durchschnitt 12 Mole des 60 Petids G mit 1 Mol BSA kombiniert.

Herstellungsbeispiel 10 4 mg Peptid H, hergestellt gemäss Herstellungsbeispiel B-l 8b bei der Synthese der Peptide, und 20 mg BSA wurden 65 in 0, IM Ammoniumacetatpufferlösung (pH 7,0) gelöst. Zu dieser Lösung wurden 0,11 ml 0, IM Glutaraldehydlösung gegeben und die Mischung wurde 5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit 11 Wasser bei

652411 28

4 °C während 48 Stunden dialysiert. Während der Dialyse BSA wurden in 2 ml einer 0,1M Ammoniumacetatpufferlö-wurde das Wasser fünfmal gewechselt. Die dialysierte Lö- sung (pH 7,0) gelöst. Zu dieser Lösung wurden 0,11 ml einer sung, enthaldend die Peptid-Protein-Zusammensetzung, 0,1M Glutaraldehydlösung gegeben und die Mischung wurde wurde lyophilisiert, wobei man 22 mg Human-Interferon-a- 5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde die ReAntigen, nachfolgend als Antigen-a-C-IV bezeichnet, erhielt. 5 aktionsmischung 48 Stunden bei 40 C dialysiert. Während der Das Antigen-a-C-IV enthielt im Durchschnitt 9 Mole des Dialyse wurde das Wasser fünfmal gewechselt. Die dialysierte Peptids H kombiniert mit 1 Mol BSA. Lösung, enthaltend die Peptid-Protein-Zusammensetzung,

wurde lyphilisiert wobei man 14 mg Human-Interferon-ß-

Herstellungsbeispiel 11 Antigen, nachfolgend als Antigen-ß-IV bezeichnet, erhielt.

4 mg Peptid G, das gemäss Herstellungsbeispiel B-16b bei io der Synthese der Peptide erhalten worden war, und 20 mg Herstellungsbeispiel 16

BSA wurden in 0, IM Ammoniumacetatpufferlösung (pH 8 mg Peptid M, hergestellt gemäss Herstellungsbeispiel

7,0) gelöst. Zu dieser Lösung wurden 0,11 ml 0, IM Glutaral- C-5b bei der Peptidsynthese, und 25 mg BSA wurden in 2 ml dehydlösung gegeben und dann wurde 5 Stunden bei Raum- einer 0, IM Ammoniumacetatpufferlösung (pH 7,0) gelöst,

temperato gerührt. Dann wurde die Reaktionsmischung mit is Zu dieser Lösung wurden 0,11 ml einer 0, IM Glutaraldehyd-

11 Wasser bei 4 °C während 48 Stunden dialysiert und wäh- lösung gegeben und die Mischung wurde 5 Stunden bei rend der Dialyse das Wasser fünfmal gewechselt. Die dialy- Raumtemperatur gerührt. Dann wurde die Reaktion gegen sierte Lösung, enthaltend die Peptid-Protein-Zusammenset- 11 Wasser von 4 °C während 48 Stunden dialysiert und wäh-

zung, wurde lyophilisiert, wobei man 21 mg Human-Interfe- rend der Dialyse das Wasser fünfmal gewechselt. Die dialy-

ron-a-Antigen, nachfolgend als Antigen-a-C-V bezeichnet, 20 sierte Lösung, enthaltend die Peptid-Protein-Zusammenset-

erhielt. zung, wurde lyophilisiert, wobei man 31 mg Human-Interfe-

Das Antigen-a-C-V enthielt im Durchschnitt 8 Mole Pep- ron-ß-Antigen, nachfolgend als Antigen-ß-V bezeichnet,

tid G in Kombination mit 1 Mol BSA. erhielt.

Herstellungsbeispiel 12 25 Herstellungsbeispiel 17 10 mg Peptid I, hergestellt gemäss Herstellungsbeispiel 8 mg Peptid M, hergestellt gemäss Herstellungsbeispiel C-lb bei der Synthese der Peptide und 50 mg BSA wurden in C-5b bei der Peptidsynthese, und 25 mg BSA wurden in 4 ml 2 ml einer 0, IM Ammoniumacetatpufferlösung (pH 7,0) ge- Wasser gelöst. Zu dieser Lösung wurde Dicyclohexylcarbo-löst. Zu dieser Lösung wurden 0,11 ml 0,1M Glutaraldehyd- diimid (DCC) gegeben und die Mischung wurde 5 Stunden lösung gegeben und die Lösung wurde 5 Stunden bei Raum- 30 bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde die Reaktionsmi-temperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde dann 48 schung mit 21 Wasser bei 4 °C während 48 Stunden dialysiert Stunden mit 11 Wasser von 4 °C dialysiert. Während der Dia- und während der Dialyse das Wasser fünfmal gewechselt. Die lyse wurde das Wasser fünfmal gewechselt. Die dialysierte dialysierte Lösung, welche die Peptid-Protein-Zusammenset-Lösung, enthaltend die Peptid-Protein-Zusammensetzung, zung enthielt, wurde lyophilisiert, wobei man 29 mg Humanwurde lyophilisiert, wobei man 45 mg Human-Interferon-ß- 3* Interferon-ß-Antigen, nachfolgend als Antigen-ß-VI bezeich-Antigen, nachfolgend als Antigen-ß-I bezeichnet, erhielt. net, erhielt.

Herstellungsbeispiel 13 Beispiele der Erfindung

5 mg Peptid J, welches gemäss Herstellungsbeispiel C-2b bei der Synthese der Peptide hergestellt worden war, und 40 Herstellung von Antikörpern

20 mg BSA wurden in 2 ml 0,1M Ammoniumacetatpufferlö- Herstellungsbeispiel 1

sung (pH 7,0) gelöst. Zu dieser Lösung wurden 0,11 ml 0,IM 100 Mikrogramm Antigen-a-N-I, hergestellt gemäss Her-

Glutaraldehydlösung gegeben und die Mischung wurde 5 Stellungsbeispiel 1 bei der Herstellung der Antigene, wurde in

Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsge- 1,5 ml einer physiologischen Kochsalzlösung gelöst und zu misch wurde 48 Stunden mit 11 Wasser von 4 °C dialysiert 4S dieser Lösung wurden 1,5 ml eines «Complete Freund's Ad-

und während der Dialyse das Wasser fünfmal gewechselt. Die juvant» unter Ausbildung einer Suspension gegeben. Diese dialysierte Lösung, enthaltend die Peptid-Protein-Zusam- Suspension wurde subkutan drei Kaninchen (jedes mit einem mensetzung, wurde lyophilisiert, wobei man 23 mg Human- Körpergewicht von 2,5 bis 3,0 kg) verabreicht und die gleiche

Interferon-ß-Antigen, nachfolgend als Antigen-ß-II bezeich- Menge wurde dem gleichen Kaninchen jede zweite Woche net, erhielt. 50 sechsmal verabreicht. Weiterhin wurde die gleiche Menge der

Suspension den gleichen Kaninchen dreimal monatlich ver-

Herstellungsbeispiel 14 abreicht. Sieben Tage nach der letzten Verabreichung der Sus-

4 mg Peptid K, hergestellt gemäss Herstellungsbeispiel pension wurde das Blut von den Versuchstieren entnommen.

C-3b bei der Synthese der Peptide, und 15 mg BSA wurden in Das Blut wurde einer Zentrifugentrennung unterworfen, wo-

2 ml einer 0, IM Ammoniumacetatpufferlösung (pH 7,0) ge- 55 bei man das Serum, enthaltend Human-Interferon-a-Anti-

löst. Zu dieser Lösung wurden 0,11 ml einer 0,1M Glutaral- körper, erhielt. Dieses Produkt wird nachfolgend als Antikör-

dehydlösung gegeben und die Mischung wurde 5 Stunden bei per-a-N-I bezeichnet.

Raumtemperatur gerührt. Dann wurde die Reaktionsmischung mit 11 Wasser von 4 °C während 48 Stunden dialy- Herstellungsbeispiel 2 siert und während der Dialyse wurde das Wasser fünfmal ge- 60 20 Mikrogramm Antigen-a-N-II, erhalten gemäss Herwechselt. Die dialysierte Lösung, enthaltend die Peptid-Pro- Stellungsbeispiel 2 bei der Herstellung der Antigene, wurde in tein-Zusammensetzung, wurde lyophilisiert, wobei man 1,5 ml einer physiologischen Kochsalzlösung gelöst und zu 17 mg Human-Inter-Feron-ß-Antigen, nachfolgend als Anti- dieser Lösung wurden 1,5 ml eines «Complete Freund's Ad-gen-ß-III bezeichnet, erhielt. juvant» unter Ausbildung einer Suspension gegeben. Diese

65 Suspension wurde subkutan sieben Kaninchen (jedes mit ei-

Herstellungsbeispiel 15 nem Gewicht von 2,5 bis 3,0 kg) verabreicht und die gleiche

4 mg Peptid L, das gemäss Herstellungsbeispiel C-4b bei Menge der Suspension wurde den gleichen Kaninchen jede der Synthese der Peptide erhalten worden war, und 12 mg zweite Woche sechsmal verabreicht. Weiterhin wurde die glei

29 652 411

che Menge der Suspension zusätzlich den Kaninchen monat- pension wurde subkutan drei Kaninchen (jedes mit einem lieh dreimal verabreicht. Sieben Tage nach der letzten Verab- Körpergewicht von 2,5 bis 3,0 kg) verabreicht und zwar reichung der Suspension wurde das Blut von den Versuchstie- wurde die gleiche Menge der Suspension den gleichen Kaninren entnommen. Das Blut wurde einer Zentrifugentrennung chen jede zweite Woche sechsmal verabreicht. Ausserdem unterworfen, wobei man ein Serum erhielt, welches Interfe- s wurde die gleiche Menge der Suspension zusätzlich den glei-ron-a-Antikörper enthielt. Dieses Produkt wird nachfolgend chen Kaninchen jeden Monat dreimal verabreicht. Sieben ans Antikörper-a-N-II bezeichnet. Tage nach der letzten Verabreichung der Suspension wurde das Blut von den Versuchstieren entnommen und einer Zen-Herstellungsbeispiel 3 trifugentrennung unterworfen, wobei man ein Serum erhielt,

20 Mikrogramm Antigen-a-N-III, erhalten gemäss Her- «welches Human-Interferon-a-Antikörper erhielt. Nachfol-stellungsbeispiel 3 bei der Herstellung der Antigene, wurde in gend wird dieses Produkt als Antikörper-a-N-VI bezeichnet. 1,5 ml einer physiologischen Kochsalzlösung gelöst und dazu wurden 1,5 ml eines Complete Freund's Adjuvant unter Aus- Herstellungsbeispiel 7

bildung einer Suspension gegeben. Diese Suspension wurde Unter Verwendung von 20 mg Antigen-a-N-V, erhalten subkutan sieben Kaninchen (jedes mit einem Körpergewicht 15 gemäss Herstellungsbeispiel 5 bei der Herstellung von Antige-von 2,5 bis 3,0 kg) verabreicht und die gleiche Menge der Sus- nen, und nach dem gleichen Verfahren wie im vorhergehen-pension wurde den gleichen Kaninchen jede zweite Woche den Herstellungsbeispiel 5 erhält man ein Serum, welches Hu-sechsmal verabreicht. Weiterhin wurde die gleiche Menge der man-Interferon-a-Antikörper enthält. Nachfolgend wird die-Suspension zusätzlich den gleichen Kaninchen dreimal mo- ses Produkt als Antikörper-a-N-VII bezeichnet.

natlich verabreicht. Sieben Tage nach der letzten Verabrei- 20

chung wurde den Versuchstieren Blut entnommen und das Herstellungsbeispiel 8

Blut wurde auf einer Zentrifuge getrennt, wobei man ein Se- Unter Verwendung von 100 Mikrogramm Antigen-a-

rum erhielt, das Human-Interferon-a-Antikörper enthielt. N-V, das gemäss Herstellungsbeispiel 5 bei der Herstellung Dieses Produkt wird nachfolgend als Antikörper-a-N-III be- von Antigenen erhalten worden war, und einen ähnlichen zeichnet. 25 Verfahren wie es vorher beim Herstellungsverfahren 4 be schrieben wurde, erhält man ein Serum, welches Human-In-Herstellungsbeispiel 4 terferon-a-Antikörper enthält. Dieses Produkt wird nachfol-

100 mikrogramm Antigen-a-N-III, erhalten gemäss Her- gend als Antikörper-a-N-VIII bezeichnet.

Stellungsbeispiel 3 bei der Herstellung von Antigenen wurde in 1,5 ml einer physiologischen Kochsalzlösung gelöst und 30 Herstellungsbeispiel 9

dazu wurden 1,5 ml eines Complete Freund's Adjuvant unter Unter Verwendung von 20 Mikrogramm Antigen-a-Ausbildung einer Suspension gegeben. Diese Suspension N-VI, das gemäss Herstellungsbeispiel 6 bei der Herstellung wurde subkutan drei Kaninchen (jedes mit einem Gewicht von Antigenen erhalten worden war, und einem ähnlichen von 2,5 bis 3,0 kg) verabreicht und die gleiche Menge der Sus- Verfahren, wie es vorher für Herstellungsbeispiel 3 beschrie-pension wurde den gleichen Kaninchen jede zweite Woche 35 ben wurde, erhält man ein Serum, das Human-Interferon-a-sechsmal verabreicht. Ausserdem wurde die gleiche Menge Antikörper enthält. Dieses Produkt wird nachfolgend als Ander Suspension zusätzlich den gleichen Kaninchen monatlich tikörper-a-N-IX bezeichnet.

dreimal verabreicht. Sieben Tage nach der letzten Verabreichung der Suspension wurde den Versuchstieren Blut entnommen und das Blut wurde einer Zentrifugentrennung un- 40 Herstellungsbeispiel 10 terworfen, wobei man ein Serum erhielt, das Human-Interfe- Unter Verwendung von 100 Mikrogramm Antigen-a-ron-a-Antikörper enthielt, nachfolgend wird dieses Produkt N-VI, erhalten gemäss Herstellungsbeispiel 6 bei der Herstel-als Antikörper-a-N-IV bezeichnet. lung von Antigen, und nach einem ähnlichen Verfahren wie zuvor im Herstellungsbeispiel 4 beschrieben, wurden drei Ka-Herstellungsbeispiel 5 45 ninchen immunisiert und von diesen Kaninchen wurde das

20 Mikrogramm Antigen-a-N-IV, hergestellt gemäss Her- Blut entnommen und das Blut wurde einer Zentrifugentren-stellungsbeispiel 4 bei der Herstellung von Antigenen, wurden nung unterworfen und dabei erhielt man ein Serum, das Hu-in 1,5 ml einer physiologischen Kochsazlösung gelöst und man-Interferon-a-Antikörper enthält. Dieses Produkt wird dazu wurden 1,5 ml an Complete Freund's Adjuvant unter nachfolgend als Antikörper-a-N-X bezeichnet.

Ausbildung einer Suspension gegeben. Diese Suspension 50 wurde subkutan sieben Kaninchen (jedes mit einem Körpergewicht von 2,5 bis 3,0 kg) verabreicht und zwar wurde die Herstellungsbeispiel 11 gleiche Menge der Suspension den gleichen Kaninchen jede 100 Mikrogramm Antigen-a-C-III, erhalten gemäss Herzweite Woche sechsmal verabreicht. Ausserdem wurde die Stellungsbeispiel 9 bei der Herstellung von Antigenen, wurde gleiche Menge der Suspension zusätzlich den gleichen Kanin- 55 in 1,5 ml einer physiologischen Kochsalzlösung gelöst und zu chen monatlich dreimal verabreicht. Sieben Tage nach der dieser Lösung wurden 1,5 ml von Complete Freund's Adju-letzten Verabreichung der Suspension wurde das Blut von den vant unter Ausbildung einer Suspension gegeben. Die Sus-Versuchstieren entnommen und einer Zentrifugentrennung pension wurde subkuntan 7 Kaninchen (jedes mit einem Körunterworfen, wobei man ein Serum, enthaltend Human-In- pergewicht von 2,5 bis 3,0 kg) verabreicht und die gleiche terferon-a-Antikörper, erhielt. Dieses Produkt wird nachfol- 60 Menge der Suspension wurde den gleichen Kaninchen jede gend als Antikörper-a-N-V bezeichnet. zweite Woche sechsmal verabreicht. Ausserdem wurde die gleiche Menge der Suspension zusätzlich den gleichen Kanin-jHerstellungsbeispiel 6 chen jeden Monat dreimal verabreicht. Sieben Tage nach der

100 Mikrogramm Antigen-a-N-IV, erhalten gemäss Her- letzten Verabreichung der Suspension wurde Blut von den Stellungsbeispiel 4 bei der Herstellung von Antigenen, wurde 65 Kaninchen entnommen und einer Zentrifugentrennung un-in 1,5 ml einer physiologischen Kochsalzlösung gelöst und zu terworfen, wobei man ein Serumerhielt, welches Human-In-dieser Lösung wurden 1,5 ml eines Complete Freund's Adju- terferon-a-Antikörper enthielt. Dieses Produkt wird nachfol-vant unter Ausbildung einer Suspension gegeben. Diese Sus- gend als Antikörper-a-C-III bezeichnet.

652 411 30

Herstellungsbeispiele 12 bis 14 dieser Lösung wurden 1,5 ml eines Complete Freund's Adju-

Unter Verwendung von Antigen-a-C-I, Antigen-a-C-II vant unter Ausbildung einer Suspension gegeben. Diese Sus-und Antigen-a-C-IV, die nach den Herstellungsbeispielen 7,8 pension wurde vier Kaninchen (jeweils mit einem Körperge-bzw. 10 bei der Herstellung der Antigene erhalten worden wa- wicht von 2,5 bis 3,0 kg) subkutan verabreicht und die gleiche ren, und nach einem Verfahren, wie es zuvor im Herstellungs- s Menge der Suspension wurde den gleichen Kaninchen jede beispiel 11 für die Herstellung von Antikörpern beschrieben zweite Woche sechsmal verabreicht. Ausserdem wurde die wurde, erhielt man Seren, die jeweils die entsprechenden Hu- gleiche Menge der Suspension zusätzlich den gleichen Kanin-man-Interferon-a-Antikörper enthielten. Diese Produkte wer- chen jeden Monat dreimal verabreicht. Sieben Tage nach der den nachfolgend als Antikörper-a-C-I, Antikörper-a-C-II letzten Verabreichung der Suspension wurde den Kaninchen bzw. Antikörper-a-C-IV bezeichnet. loBlut entnommen und das Blut wurde einer Zentrifugentren nung unterworfen, wobei man ein Serum erhielt, das Human-Herstellungsbeispiel 15 Interferon-ß-Antikörper enthielt. Dieses Produkt wird nach-

30 Mikrogramm Antigen-a-C-III, erhalten gemäss Her- folgend als Antikörper-ß-I bezeichnet.

Stellungsbeispiel 9 bei der Herstellung von Antigen, wurden in 1,5 ml einer physiologischen Kochsalzlösung gelöst und zu is dieser Lösung wurden 1,5 m eines Complete Freund's Adju- Herstellmgsbeispiel 20

vant unter Ausbildung einer Suspension gegeben. Diese Sus- 25 Mikrogramm Antigen-ß-II, erhalten gemäss Herstelpension wurde subkutan einem Kaninchen mit einem Kör- lungsbeispiel 13 bei der Herstellung von Antigen, wurden in pergewicht von 2,7 kg verabreicht und die gleiche Menge der 1,5 ml einer physiologischen Kochsalzlösung gelöst und zu Suspension wurde dem Kaninchen jede zweite Woche fünf- 2odieser Lösung wurden 1,5 ml eines Complete Freund's Adju-mal verabreicht. Ausserdem wurde die gleiche Menge der Sus- vant unter Ausbildung einer Suspension gegeben. Diese Suspension zusätzlich dem Kaninchen in einem Intervall von 3 pension wurde vier Kaninchen (jedes mit einem Körperge-Wochen fünfmal verabreicht. Sieben Tage nach der letzten wicht von 2,5 bis 3,0 kg) subkutan verabreicht und die gleiche Verabreichung der Suspension wurde Blut von dem Kanin- Menge der Suspension wurde den gleichen Kaninchen jede chen entnommen und das Blut wurde einer Zentrifugentren- 25 zweite Woche sechsmal verabreicht. Ausserdem wurde die nung unterworfen, wobei man ein Serum erhielt, das Human- gleiche Menge der Suspension zusätzlich den gleichen Kanin-Interferon-a-Antikörper enthielt. Dieses Produkt wird nach- chen monatlich dreimal verabreicht. Sieben Tage nach der folgend als Antikörper-a-C-V bezeichnet. letzten Verabreichung der Suspension wurde den Kaninchen

Blut entnommen und das Blut wurde einer Zentrifugentren-Herstellungsbeispiel 16 30 nung unterworfen, wobei man ein Serum erhielt, welches Hu-

Unter Verwendung von 60 Mikrogramm Antigen-a-C- man-Interferon-ß-Antikörper enthielt. Dieses Produkt wird III, welches gemäss Herstellungsbeispiel 9 bei der Herstellung nachfolgend als Antikörper-ß-II bezeichnet.

von Antigenen erhalten worden war, und nach einem gleichen

Verfahren, wie es zuvor beim Herstellungsverfahren 15 bei Herstellungsbeispiel 21

der Herstellung von Antikörpern beschrieben wurde, erhält 35 25 Mikrogramm Antigen-ß-III, erhalten gemäss Herstel-man ein Human-Interferon-a-Antikörper enthaltendes Se- lungsbeispiel 14 bei der Herstellung von Antigen, wurden in rum. Dieses Produkt wird nachfolgend als Antikörper-a- 1,5 ml einer physiologischen Kochsalzlösung gelöst und zu C-VT bezeichnet. dieser Lösung wurden 1,5 ml eines Complete Freund's Adju vant unter Ausbildung einer Suspension gegeben. Diese Sus-Herstellungsbeispiel 17 40 pension wurde subkutan vier Kaninchen (jedes mit einem

Unter Verwendung von 30 Mikrogramm Antigen-a-C-V, Körpergewicht von 2,5 bis 3,0 kg) verabreicht und die gleiche die gemäss Her stellungsbeispiel 11 bei der Herstellung von Menge der Suspension wurde den gleichen Kaninchen jede Antigenen erhalten worden waren und nach einem Verfahren zweite Woche sechsmal verabreicht. Ausserdem wurde die entsprechend dem vorstehend erwähnten Herstellungsbeispiel gleiche Menge der Suspension zusätzlich den gleichen Kanin-15 für die Herstellung von Antikörpern, wurde unter Verwen-43 chen jeden Monat dreimal verabreicht. Sieben Tage nach der dung von zwei Kaninchen (mit einem Körpergewicht von 2,5 letzten Verabreichung der Suspension wurde den Kaninchen bis 3,0 kg) Serum erhalten, das Human-Interferon-a-Antikör- Blut entnommen und das Blut wurde einer Zentrifugentren-per enthielt. Dieses Produkt wird nachfolgend als Antikör- nung unterworfen, wobei man ein Serum erhielt, welches Hu-per-a-C-VIII bezeichnet. man-Interferon-ß-Antikörper enthielt. Dieses Produkt wird so nachfolgend als Antikörper-ß-III bezeichnet.

Herstellungsbeispiel 18

Unter Verwendung von 60 Mikrogramm Antigen-a-C-V, Herstellungsbeispiel 22

das gemäss Herstellungsbeispiel 11 bei der Herstellung von 25 Mikrogramm Antigen-ß-IV, erhalten gemäss Herstel-

Antigen erhalten worden war, und nach einem Verfahren ent- lungsbeispiel 15 bei der Herstellung von Antigen, wurden in sprechend dem Herstellungsbeispiel 15 für die Zubereitung 551,5 ml einer physiologischen Kochsalzlösung gelöst und die-von Antikörpern, wurden fünf Kaninchen (jedes mit einem . ser Lösung wurden 1,5 ml von Complete Freund's Adjuvant Körpergewicht von 2,5 bis 3,0 kg) immunisiert und den Ka- unter Ausbildung einer Suspension gegeben. Die Suspension ninchen wurde Blut entnommen und dieses Blut wurde einer wurde subkutan vier Kaninchen (jeweils mit einem Körperge-Zentrifugentrennung unterworfen, wobei man Seren erhielt, wicht von 2,5 bis 3,0 kg) verabreicht, wobei die gleiche Menge die jeweils Human-Interferon-Antikörper enthielten. Diese 60 der Suspension den gleichen Kaninchen jede zweite Woche Produkte werden nachfolgend als Antikörper-a-C-IX, Anti- sechsmal verabreicht wurde. Ausserdem wurde die gleiche körper-a-C-X, Antikörper-a-C-XI, Antikörper-a-C-XÜ bzw. Menge der Suspension zusätzlich den gleichen Kaninchen Antikörper-a-C-XIII bezeichnet. monatlich dreimal verabreicht. Sieben Tage nach der letzten

Verabreichung der Suspension wurde den Kaninchen Blut Herstellungsbeispiel 19 65 entnommen und das Blut wurde einer Zentrifugentrennung

250 Mikrogramm Antigen-ß-I, erhalten gemäss Herstel- unterworfen, wobei man ein Serum erhielt, welches Human-lungsbeispiel 12 bei der Herstellung von Antigen, wurden in Interferon-ß-Antikörper enthielt. Dieses Produkt wird nach-1,5 ml einer physiologischen Kochsalzlösung gelöst und zu folgend als Antikörper-ß-IV bezeichnet.

31

652 411

Herstellungsbeispiel 23 25 Mikrogramm Antigen-ß-V, erhalten gemäss Herstellungsbeispiel 16 bei der Herstellung von Antigenen, wurden in 1,5 ml einer physiologischen Kochsalzlösung gelöst und zu dieser Lösung wurden 1,5 ml von Complete Freund's Adjuvant unter Ausbildung einer Suspension gegeben. Diese Suspension wurde subkutan vier Kaninchen (jedes mit einem Körpergewicht von 2,5 bis 3,0 kg) verabreicht und die gleiche Menge der Suspension wurde den gleichen Kaninchen jede zweite Woche sechsmal verabreicht. Ausserdem wurde die gleiche Menge der Suspension zusätzlich den gleichen Kaninchen monatlich dreimal verabreicht. Sieben Tage nach der letzten Verabreichung der Suspension wurde den Kaninchen Blut entnommen. Das Blut wurde einer Zentrifugentrennung unterworfen, wobei man ein Serum erhielt, welches Human-Interferon-ß-Antikörper enthielt. Dieses Produkt wird nachfolgend als Antikörper-ß-V ß-V bezeichnet.

Herstellungsbeispiel 24 Unter Verwendung von Antigen-ß-VI, das gemäss Herstellungsbeispiel 17 bei der Herstellung von Antigen erhalten worden war und nach einem Verfahren, das dem vorher erwähnten Herstellungsbeispiel 15 bei der Herstellung von Antikörpern entspricht, erhält man ein Serum, das einen Antikörper mit hoher Wirksamkeit und hoher Spezifität gegenüber Human-Interferon-ß enthält. Dieses Produkt wird nachfolgend als Antikörper-ß-VI bezeichnet.

Bestimmung der Titer des Antikörpers-( 1 )

Der Titer des Antikörper-a-N-I bis a-N-X wurde wie folgt bestimmt.

Jeder der Antikörper wurde mit einer physiologischen Kochsalzlösung verdünnt unter Ausbildung von Serienverdünnungsproben mit einer 10, IO2, IO3, 104, 105-fach verdünnten Konzentration (Anfangskonzentration). Zu jeweils 100 Mikrolitern dieser verdünnten Proben wurden 0,1 ml einer verdünnten Lösung von 125-J-markiertem Peptid D (das erhalten wurde gemäss dem Herstellungsbeispiel für markiertes Peptid 1 und das auf eine Verdünnung gebracht worden war, dass es eine Radioaktivität von etwa 9500 cpm aufwies) gegeben, sowie 0,2 ml einer 0,05M Phosphatpufferlösung (pH 7,4) (enthaltend 0,25% BSA und 10 mM EDTA und 0,02% NaN3) und diese Mischung wurde 24 Stunden bei 4 °C inkubiert. Man erhielt ein Produkt aus dem Antikörper, kombiniert mit dem 125J-markierten Peptid D in der inkubierten Mischung und dieses Produkt wurde von nicht-umgesetzten (nichtkombinierten) 125J-markiertem Peptid D mittels einer dextranaktivierten Kohlenstoffmethode und durch Zentrifugentrennung (bei 4 °C während 30 Minuten bei 3000 Upm) isoliert.

Das Kombinationsverhältnis (%) des Antikörpers zu dem I25J-markierten Peptid D in dem gebildeten Produkt wurde durch Messung der Radioaktivität einer jeden Probe in der Serienverdünnung festgestellt. Die Daten für das Kombinationsverhältnis (%) aus den jeweiligen Proben bei den Serienverdünnungen wurden auf ein Schaubild aufgetragen, wobei die Ordinate das Kombinationsverhältnis (%) des Antikörpers zu dem 125J-markierten Peptid D zeigt und die Abszisse die Verdünnungskonzentration des Antikörpers angibt. Aus der aufgetragenen Kurve ergibt sich bei einer Verdünnungskonzentration des Antikörpers von 50% ein Kombinationsverhältnis entsprechend dem Titer des Antikörpers. Die Ergebnisse werden in Tabelle 1 gezeigt.

Tabelle 1

Antikörper a-N-I sa-N-II a-N-III a-N-IV

Titer

10.000 12.000 120.000 200.000

Antikörper a-N-V

a-N-VII

a-N-VIII

a-N-X

Titer 150.000 180.000 42.000 28.000

Test für die Spezifität des Antikörpers a-N-IV gegenüber îoHuman-Lymphoblastoid-Interferon.

Bei der Durchführung dieses Tests für die Spezifität wurden folgende Materialien als zu untersuchende Proben verwendet:

(1) Human-Interferon-ß (hergestellt) von Tokyo Metro-ìspolitan Institute of Medicai Science, spezifische Aktivität:

3 x 106 U/mg Protein) in unterschiedlichen Konzentrationen.

(2) Peptid C, erhalten gemäss Herstellungsbeispiel A-3 von der Synthese von Peptiden miteiner Peptidkette von Hu-man-Lymphoblastoid-Interferon.

20 (3) Human-Interferon-a (hergestellt von Hayashibara Biochemical Research Laboratory, lymphoblastoides Interferon Lot. Nr. 800928).

(4) Human-Interferon-a (erhalten von Dr. Cantell, Central Public Health Lab., Finnland).

25 Weiterhin wurden Standardverdünnungsmittel, wie eine 0,05M Phosphatpufferlösung (pH 7,4), enthaltend 0,25% BSA, 5 mM EDTA und 0,02% NaN3, verwendet.

In Reagenzgläser werden jeweils 0,2 ml des Substratverdünnungsmittels 0,1 ml der zu untersuchenden Probe, 0,1 ml 30 Antikörper-a-N-IV, erhalten gemäss Herstellungsbeispiel 4 bei der Herstellung der Antikörper (Titer = 200.000) und 0,1 ml 125J-markiertes Peptid D (das gemäss Herstellungsbeispiel für das markierte Peptid-1 erhalten worden war, und das zu einer verdünnten Lösung mit etwa 2.800 cpm Radioaktivi-35 tat verdünnt worden war) gegeben. Jeder der die obige Mischung enthaltenden Reagenzgläser wird während 72 Stun-. den bei 4 ° C inkubiert und dann werden 0,1 ml normales Schweineserum dem Gemisch zugegeben und anschliessend daran 0,5 ml einer Suspension aus Aktivkohle, welche mit 40 Dextran beschichtet ist und die gesamte Mischung lässt man 30 Minuten bei 4 °C stehen. Anschliessend wird die gesamte Mischung 30 Minuten bei 3.000 Upm bei 40 C auf der Zentrifuge getrennt, um das gebildete Produkt aus dem Antikörper in Kombination mit dem I25J-markierten Peptid von dem 45 nichtumgesetzten (nicht-kombinierten) 125J-markierten Peptid zu trennen. Die Radioaktivität der einzelnen Peptide wurde gemessen. Das Bindungsverhältnis (%) von '^-markiertem Peptid und den einzelnen Proben bei den jeweiligen Konzentrationen und Verdünnungen wurde bestimmt, wobei 50 man das Bindungsverhältnis (B0) entsprechend dem Titer des verwendeten Antikörpers mit 100% einsetzt. Die Ergebnisse werden in Fig. 1 gezeigt, in welcher die Ordinate den Prozentsatz der relativ gebundenen Menge (% = B/B0 x 100) zeigt, während die Abszisse die Konzentration der zu prüfenden 55 Proben zeigt (Peptid C, das gemäss Herstellungsbeispiel A-3 bei der Synthese der Peptide hergestellt wurde und eine Peptidkette aus Human-Lymphoblastoid-Interferon, Human-In-terferon-ß und Human-Interferon-a hat). In dieser Fig. 1 bedeutet die Kurve (a) Peptid C, d.h. eine Peptidkette mit Hu-60man-Lymphoblastoid-Interferon, Kurve (b) ein Human-Interferon-a (Cantell), Kurve (c) ein Human-Interferon-a (hergestellt von Hayashibara Biochemical Research Laboratory) und Kurve (d) ein Human-Interferon-ß. Aus den in Fig. 1 gezeigten Kurven wird ersichtlich, dass die Reaktivität von An-65 tikörper-a-N-IV gegenüber Human-Interferon-a deutlich unterschiedlich ist von der Reaktivität von Antikörper-a-N-IV gegenüber Human-Interferon-ß und dies bedeutet, dass der Antikörper-a-N-IV ein Antikörper hoher Spezifität ist und

652 411

dass er bis zu einer Konzentration von 3,0 x 106 U/ml mit Human-Interferon-ß reagiert (cross match).

Bestimmung der Titer des Antikörpers- (2)

Der Titer der Antikörper -a-C-I bis Antikörper-a-C-XIII wurde wie folgt bestimmt:

Jeder der Antikörper wurde mit physiologischer Kochsalzlösung verdünnt, wobei man Serienverdünnungsproben mit einer 10, IO2, IO3,104,10s, .. .-fachen Verdünnungskonzentration (bezogen auf die Anfangskonzentration) erhielt. Zu 100 Mikrolitern jeder dieser Verdünnungsproben wurden 0,1 ml einer verdünnten Lösung von125 J-markiertem Peptid H zugegeben (diese verdünnte Probe wurde gemäss Herstel-lungsbeispiel für das markierte Peptid 2-1 hergestellt und wurde dann auf eine verdünnte Lösung mit einer Radioaktivität von etwa 9.500 cpm verdünnt), sowie 0,2 ml 0,05M Phosphatpufferlösung (pH 7,4) (enthaltend 0,25% BSA, 10 nM EDTA und 0,02% NaN3) und diese Mischung wurde 24 Stunden bei 4 °C inkubiert. Das gebildete Produkt aus dem Antikörper, kombiniert mit 125J-markiertem Peptid H, wurde aus der Mischung von dem nicht-umgesetzten (nicht-kombinierten) I2SJ-markierten Peptid H durch die dextraaktivierte Kohlenstoffmethode und Zentrifugenabtrennung (bei 4 °C während 30 Minuten, 3.000 Upm) abgetrennt.

Das Kombinationsverhältnis (%) des Antikörpers zu dem 12SJ-markierten Peptid H in dem gebildeten Produkt wurde bestimmt, indem man die Radioaktivität einer jeden Probe bei der Serienverdünnungskonzentration mass. Die Daten für das Kombinationsverhältnis (%), die man bei den jeweiligen Proben in den Serienverdünnungskonzentrationen erhielt, wurden zu einer Kurve aufgetragen, in welcher die Ordinate, das Kombinationsverhältnis (%) des Antikörpers zu dem ,2SJ-markierten Peptid H anzeigt und die Abszisse die Verdünnungskonzentration des Antikörpers (Anfangskonzentration). Aus der Kurve kann man dann eine Verdünnungskonzentration des Antikörpers, die 50% des Kombinationsverhältnisses zeigt und welche dem Titer des Antikörpers entspricht, erhalten. Die Ergebnisse werden in Tabelle 2 gezeigt.

Tabelle 2

Antikörper

Titer

Antikörper

Titer a-C-I

2.500

a-C-VIII

1.200

a-C-II

4.200

a-C-IX

6.000

a-C-III

50.000

a-C-X

1.100

a-C-IV

1.200

a-C-XI

2.200

a-C-V

10.400

a-C-XII

3.600

a-C-VI

2.600

a-C-XIII

1.000

a-C-VII

40.000

Aus den Ergebnissen der Tabelle 2 geht hervor, dass C-terminierte Peptide von Human-Interferon- der allgemeinen Formel (II) und deren Derivate eine starke Antigenität im Vergleich zu anderen Peptiden aufweisen, wie dies ersichtlich wird aus dem Titer von Antikörper-a-C-IX bis a-C-XIII und dass die brauchbaren Antikörper in den meisten Tieren, denen das Antigen verabreicht wurde, gebildet werden.

Test für die Spezifität von Antikörper-a-C-III gegenüber Human-Interferon-a

(a) Bei der Durchführung dieses Tests hinsichtlich der Spezifität wurden folgende als Proben verwendete Materialien untersucht:

(1) Human-Interferon-ß (hergestellt von Toyko Metropolitan Institute of Medicai Science, spezifische Aktivität:

3 x 106 U/mg Protein) in unterschiedlichen Konzentrationen.

(2) Peptid G, erhalten gemäss Herstellungsbeispiel 16b bei

32

der Synthese des Peptids, mit einer Peptidkette von Human-Interferon-a.

(3) Human-Interferon-a (lymphoblastoides Interferon, hergestellt von Hayashibara Biochemical Reserach Labo-sratory).

Als Standardverdünnungsmittel wurde eine 0,05M Phosphatpufferlösung (pH 7,4), enthaltend 0,25% BSA, 5 mM EDTA und 0,02 5 NaN3, verwendet.

In eine Reihe von Reagenzgläsern wurden jeweils 0,2 ml lc des Standardverdünnungsmittels, 0,1 ml der zu untersuchenden Probe, 0,1 ml Antikörper-a-C-III, erhalten gemäss Herstellungsbeispiel 11 der Zubereitungen für Antikörper, und 0,1 ml 125J-markiertes Peptid H vorgelegt (wobei das Peptid H gemäss Herstellungsbeispiel für das markierte Peptid 2-1 her-15 gestellt worden war und zu einer Lösung verdünnt wurde, die etwa 2.800 cpm Radioaktivität aufwies. Jedes der die obige Mischung enthaltenden Reagenzgläser wurde 72 Stunden bei 4 °C inkubiert und dann wurden 0,1 ml eines normalen Schweineserums zu der inkubierten Mischung gegeben und 2odaran anschliessend 0,5 ml einer Suspension von Aktivkohle, die mit Dextran beschichtet war. Man Hess die Mischung 30 Minuten bei 4 °C stehen und führte dann eine Zentrifugentrennung bei 4 °C während 30 Minuten mit 3.000 Upm durch, wodurch das gebildete Produkt aus dem Antikörper, kombi-25 niert mit dem ,25J-markierten Peptid, von dem nichtumgesetz-ten (nicht-kombinierten) 125J-markierten Peptid abgetrennt wurde. Die Radioaktivität der einzelnen Peptide wurde gemessen. Das Bindungsverhältnis (%) von 125J-markiertem Peptid und den einzelnen Proben bei den jeweiligen Konzentrationen und Verdünnungen wurde bestimmt, wobei man das Bindungsverhältnis (B0) entsprechend dem Titer des verwendeten Antikörpers mit 100% einsetzt. Aus den bei diesem Versuch ermittelten Ergebnissen geht hervor, dass die Reaktivität von Antikörper-a-C-III gegenüber Human-Interferon-a 35 eindeutig verschieden ist von der Reaktivität des Antikörpers-a-C-III gegenüber Human-Interferon-ß und das bedeutet,

dass Antikörper-a-C-III ein Antikörper hoher Spezifität ist, der nur eine niedrige Kreuzprobe (cross matching) zu Human-Interferon-ß aufweist.

40 Weiterhin wurden ähnliche Versuche hinsichtlich der Spezifität von Antikörper-a-C-I, Antikörper-a-C-II und Antikör-per-a-C-I V bis Antikörper-a-C-VII und Antikörper-a-C-IX bis Antikörper-a-C-XIII gegenüber Human-Interferon-a durchgeführt und es wurde dabei bestätigt, dass diese Anti-45 körper hochspezifisch gegenüber Human-Interferon-a sind.

(b) Ähnliche Versuche wurden mit Antikörper-a-C-VIII im obigen Versuch (a) durchgeführt. Die Ergebnisse werden in Fig. 2 gezeigt, wo die Ordinate den relativ gebundenen Prozentsatz (% = B/B0 x 100) anzeigt, während die Abszisse die 50 Konzentrationen der zu prüfenden Proben zeigt. Peptid G wurde gemäss Herstellungsbeispiel B-16b für die Synthese von Peptiden hergestellt, d.h. mit einer Peptidkette von Human-Interferon-a. Weiterhin wurde für die Untersuchungen verwendet Human-Interferon-a (lymphoblastoides Interfe-53 ron, hergestellt von Hayashibara Biochemical Research Laboratory, und Leukocyten-Interferon, erhalten vom National Institute of Health), sowie Human-Interferon-ß (spezifische Aktivität: 3 x 106 U/mg Protein, hergestellt von Tokyo Metropolitan Institute of Medicai Science). In Fig. 2 zeigt Kurve 60 (a) Peptid G an, Kurve (b) Human-Interferon- (hergestellt von Hayashibara Biochemical Research Laboratory), Kurve (c) Human-Interferon-a (erhältlich von National Institute of Health) und Kurve (d) Human-Interferon-ß (hergestellt von Tokyo Metropolitan Institute of Medicai Science). Aus den 65 Kurven in Fig. 2 wird ersichtlich, dass die Reaktivität von Antikörper-a-C-VIII zu Human-Interferon eindeutig unterschiedlich ist gegenüber der Reaktivität von Antikörper-a-C-VIII zu Human-Interferon-ß und dies bedeutet, dass Antikör-

33

652 411

per-a-C-VIII ein Antikörper mit hoher Spezifität ist und dass es keine Kreuzprobe mit Human-Interferon-ß bis zu einer Konzentration von 1,0 x io6 U/ml zeigt.

Bestimmung des Titers des Antikörpers- (3)

Der Titer von Antikörper-ß-I bis Antikörper-ß-VI wurde wie folgt bestimmt.

Jeder der Antikörper wurde mit einer physiologischen Kochsalzlösung verdünnt, unter Erhalt von Verdünnungsproben mit einer 10, IO2, IO3, IO4,105, .. .-fachen Verdünnungskonzentration. Zu 100 Mikrolitern einer jeden dieser verdünnten Proben wurden 0,1 ml einer verdünnten Lösung von 125J-markiertem Peptid M gegeben (Peptid M wurde gemäss Herstellungsbeispiel für markiertes Peptid-3 erhalten und dieses wurde verdünnt auf eine Radioaktivität von etwa 10.000 cpm), sowie 0,2 ml 0,1 M Phosphatpufferlösung (pH 7,4) (enthaltend 0,1 % BSA, 0,15M Natriumchlorid und 0,01 % NaN3) und dann wurde die Mischung 24 Stunden bei 4 °C inkubiert. Das erhaltene Produkt aus Antikörper, kombiniert mit 125J-markiertem Peptid M, das sich in der inkubierten Mischung gebildet hatte, wurde von nicht-umgesetz-tem (nicht-kombiniertem) 125J-markiertem Peptid M durch die Dextran-Aktivkohle-Methode und Zentrifugentrennung (bei 4 °C während 15 Minuten, 3.000 Upm) isoliert.

Das Kombinationsverhältnis (%) von Antikörper zu 125J-markiertem Peptid M in dem gebildeten Produkt wurde bestimmt, indem man die Radioaktivität der Proben in den Serienverdünnungskonzentrationen untersuchte. Die Daten des Kombinationsverhältnisses (%), erhalten mit den jeweiligen Proben bei den Serienverdünnungskonzentrationen (Anfangskonzentration) wurden in eine Kurve eingetragen, in welcher die Ordinate das Kombinationsverhältnis (%) des Antikörpers zu 125J-markiertem Peptid M zeigt, während die Abszisse die Verdünnungskonzentration des Antikörpers zeigt. Von den aufgezeichneten Linien wird eine Verdünnungskonzentration des Antikörpers, die 50% des kombinierten Verhältnisses, entsprechend dem Titer des Antikörpers zeigt, erhalten. Die Ergebnisse werden in Tabelle 3 gezeigt.

Tabelle 3

Antikörper

ß-V ß-VI

Titer

52.000 100.000

Test für die Spezifität von Antikörper-ß-V gegenüber Hu-man-Interferon-ß.

Bei der Durchführung dieses Versuches wurden folgende Materialien als zu untersuchende Proben verwendet:

(1) Human-Interferon-ß (spezifische Aktivität:

3 x IO6 U/mg Protein, hergestellt von Tokyo Metropolitan Institute of Medicai Science).

(2) Die 1. bis 13. Peptidkette von Human-Interferon-ß (Peptid M wurde hergestellt gemäss Beispiel 5 von Herstellungsbeispiel C für die Peptidsynthese).

(3) Human- Interferon-a (lymphoblastoides Interferon, Lot. Nr. 800928, hergestellt von Hyashibara Biochemical Research Laboratory).

Ausserdem wurde als Standardverdünnungsmittel 0, IM Natriumphosphatpufferlösung (pH 7,4), enthaltend 0,1 % BSA, 0,15M NaCl und 0,01 % NaN3, verwendet.

In Reagenzgläser wurden jeweils 0,2 ml des Standardverdünnungsmittels, 0,1 ml der zu untersuchenden Probe, 0,1 ml Antikörper-ß-V, erhalten gemäss Herstellungsbeispiel 23 für die Herstellung von Antikörpern (Radioaktivität 52.000) und 0,1 ml von 125J-markiertem Peptid M vorgelegt (dieses markierte Peptid M wurde gemäss Herstellungsbeispiel für markierte Peptide-3 erhalten und auf eine Verdünnungskonzentration gebracht, bei der es eine Radioaktivität von etwa 10.000 cpm zeigte). Die Mischung wurde dann 48 Stunden bei s 4 °C inkubiert. Zu der inkubierten Mischung wurden 0,1 ml normales Schafsserum gegeben und dann wurden zu der Mischung 0,5 ml einer Suspension von Aktivkohle, beschichtet mit Dextran, gegeben und die ganze Mischung wurde 30 Minuten bei 4 °C stehen gelassen und dann einer Zentrifugen-lo trennung bei 4 °C während 30 Minuten mit 3.000 Upm unterworfen, wobei man aus dem Produkt den Antikörper, kombiniert mit 125J-markiertem Peptid von dem nicht-umgesetzten (nicht-kombinierten) 125J-markierten Peptid abtrennte. Die Radioaktivität der einzelnen Peptide wurde gemessen. Das 15 Bindungsverhältnis (%) von !25J-markiertem Peptid und den einzelnen Proben bei den jeweiligen Konzentrationen und Verdünnungen wurde bestimmt, wobei man das Bindungsverhältnis (B0) entsprechend dem Titer des verwendeten Antikörpers mit 100% einsetzt. Die Ergebnisse werden in Fig. 3 20 gezeigt, in welcher die Ordinate den Prozentsatz der relativen gebundenen Menge (% = B/B0 x 100) zeigt, während die Abszisse die Konzentration der zu prüfenden Proben zeigt (die 1. bis 13. Peptidkette von Human-Interferon-ß (Peptid M), Human-Interferon-ß und Human-Interferon-a). In Fig. 3 25 bedeutet Kurve (a) die 1. bis 13. Peptidkette von Human-In-terferon-ß (Peptid M), Kurve (b) Human-Interferon-ß und Kurve (c) Human-Interferon-a. Aus den Kurven in Fig. 3 wird ersichtlich, dass die Reaktivität von Antikörper-ß-V gegenüber Human-Interferon eindeutig unterschiedlich ist von 30 der Reaktivität von Antikörper- ß-V gegenüber Human-In-terferon-ß und daraus lässt sich entnehmen, dass Antikörper-ß-V ein Antikörper mit hoher Spezifität ist und dass er keine Kreuzprobe mit Interferon-a bis zu einer Konzentration von 3,7 x 106 U/ml zeigt.

35 Weitere, ähnliche Versuche hinsichtlich der Spezifität von Antikörper-ß-VI gegenüber Interferon-ß wurden durchgeführt. Die Ergebnisse werden in Fig. 4 gezeigt, in welcher die Ordinate den Prozentsatz der relativen gebundenen Menge (% = B/B0 x 100) zeigt, während die Abszisse die Konzentra-40 tion der zu prüfenden Proben zeigt (die 1. bis 13. Peptidkette von Human-Interferon-ß (Peptid M), Human-Interferon-ß und Human-Interferon-a).

In Fig. 4 bedeutet Kurve (d) die 1. bis 13. Peptidkette von Human-Interferon-ß (Peptid M), Kurve (e) ist Human-Inter-45 feron-ß und Kurve (f) Human-Interferon-a.

Ähnliche Versuche wurden hinsichtlich der Spezifität von Antikörper-ß-II, Antikörper-ß-III und Antikörper-ß-IV durchgeführt. Hierfür wurden jeweils 0,2 ml des vorerwähnten Standardverdünnungsmittels, 0,1 ml der vorerwähnten zu 50 prüfenden Proben, 0,1 ml Antikörper-ß-II, Antikörper-ß-III oder Antikörper-ß-IV, sowie 0,1 ml 125J-markiertes Peptid M eingefüllt und die Umsetzung wurde dann in gleicher Weise wie vorher angegeben durchgeführt. Nimmt man die Bindungsreaktivität zwischen Antikörper-ß-V oder Antikörper-55 ß-VI, erhalten von der 1. bis 13. Peptidkette von Human-Interferon-ß (Peptid M) und das 1. bis 13. Peptid von Human-Interferon-ß (Peptid) mit 100% an, so werden die relativ gebundenen Prozentsätze (%) für die jeweiligen Antikörper in Tabelle 4 gezeigt.

60

Tabelle 4 Antikörper

65 ß_V

ß-II

ß-III

ß-IV

relativ gebundener Prozentsatz 100 25 30 50

Antikörper

ß-VI ß-II ß-III ß-IV

relativ gebundener Prozentsatz 100 25 27 70

652 411 34

Bestimmung der Empflndlichkeitsgrenze

In Reagenzgläser werden jeweils 0,2 ml eines Standardverdünnungsmittels, 0,1 ml der 1. bis 13. Peptidkette von Hu-man-Interferon-ß (Peptid M), 0,1 ml Antikörper-ß-V erhalten gemäss Beispiel 23 für die Herstellung von Antikörpern oder Antikörper-ß-VI, erhalten gemäss Beispiel 24 für die Herstellung von Antikörper, und 0,1 ml von 125J-markiertem Peptid M vorgelegt (wobei das 125J-markierte Peptid M gemäss Herstellungsbeispiel für markiertes Peptid-3 hergestellt wurde und so verdünnt wurde, dass es eine Radioaktivität von 10.000 cpm aufwies) und die Mischung wird 48 Stunden bei

4 °C inkubiert. Zu der inkubierten Mischung gibt man 0,1 ml normales Schafsserum und anschliessend daran gibt man 0,5 ml einer Suspension von Aktivkohle, die mit Dextran beschichtet ist, hinzu und lässt die Mischung dann 30 Minuten bei 4 °C stehen, worauf man dann eine Zentrifugentrennung während 30 Minuten bei 40 °C und mit 3.000 Upm durchführt und das gebildete Produkt aus dem Antikörper, der mit dem 125J-markierten Peptid kombiniert ist vom nicht-umge-setzten (nicht-kombinierten) 125J-markierten Peptid abtrennt. Die Radioaktivität der einzelnen Peptide wurde gemessen. Das Bindungsverhältnis (%) von 125J-markiertem Peptid und den einzelnen Proben bei den jeweiligen Konzentrationen und Verdünnungen wurde bestimmt, wobei man das Bindungsverhältnis (B0) entsprechend dem Titer des verwendeten Antikörpers mit 100% einsetzt. Die Ergebnisse werden in Fig. 5 gezeigt, in welcher die Ordinate den relativ gebundenen Prozentsatz (% = B/B0 x 100) zeigt, während die Abszisse die Konzentrationen der 1. bis 13. Peptidkette von Human-Interferon-ß (Peptin M), Kurve (g) die Daten, die man unter Verwendung von Antikörper-ß-V und Kurve (h) die Daten, die man unter Verwendung von Antikörper-ß-VI erhält, zeigt. Aus diesen Kurven in Fig. 5 geht hervor, dass die Minimum-sensitivitätsgrenze zur Bestimmung von Human-Interferon 13 Picogramm/ml bei Verwendung von Antikörper-ß-V und

5 pg/ml bei Verwendung von Antikörper-ß-VI beträgt.

Herstellung von immobilisierten Antikörpern

Herstellungsbeispiel 1

(a) 0,74 ml Antikörper-ß-V, erhalten gemäss Herstellungsbeispiel 23 für die Herstellung von Antikörpern, wurde in 2,26 ml destilliertem Wasser gelöst und dazu wurden 3 ml einer gesättigten, wässrigen Ammoniumsulfatlösung gegeben und die Mischung wurde 3 Stunden bei 4 °C stehen gelassen. Zu dem Gemisch wurden 3 ml destilliertes Wasser gegeben und dann liess man 3 Stunden bei 4 °C stehen. Anschliessend wurde die Mischung mit 3.500 Upm 15 Minuten bei 4 °C zentrifugiert. Das erhaltene Präzipitat wurde in destilliertem Wasser gelöst, wobei man 8 ml einer wässrigen Lösung des Antikörpers (OD280=1,157) erhielt. Die Lösung des Antikörpers wurde mit destilliertem Wasser dreimal dialysiert und anschliessend nochmals mit einer wässrigen 0, IM Natriumbikarbonatlösung, enthaltend 0,5M Natriumchlorid, wobei man 7 ml einer wässrigen Antikörper-Lösung (OD2go = 0,923) erhielt.

(b) 1 g trockene Cyanogenbromid-aktivierte Sepharose 4B wurde mit 200 ml einer wässrigen 1 mM Salzsäurelösung und dann mit 30 ml einer 0,1M wässrigen Natriumbikarbonatlösung (pH 8,4), enthaltend 0,5M Natriumchlorid, gewaschen und 7 ml der zuvor dialysierten Antikörper-Lösung wurden zu der gewaschenen Sepharose 4B gegeben und 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Das Gemisch wurde durch ein Glasfilter filtriert und das Gel in 40 ml IM Mono-ethanolamin-Cl (pH 8,36) gelöst und 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Diese Lösung wurde durch eine umlaufende 0,1 M Acetatpufferlösung (pH 4,0), enthaltend 0,5M Natriumchlorid gewaschen und anschliessend viermal mit

0,1M Boratpufferlösung (pH 8,4), enthaltend 0,5M Natriumchlorid. Beim Suspendieren in einer physiologischen Kochsalzlösung erhielt man ein immobilisiertes Produkt von Human-Interferon-ß-Antikörper-Sepharose 4B. Aus der Tatssache, dass 35 ml des Abfiltrierten aus der Filtration auf dem Glasfilter eine OD280 = 0,004 zeigten, wurde bestätigt, dass der grösste Teil des Antikörpers auf Sepharose 4B immobilisiert war.

io Herstellungsbeispiel 2

(a) 0,74 ml von Antikörper-ß-I, erhalten im Herstellungsbeispiel 19 für die Herstellung von Antikörpern, wurden in 2,26 ml destilliertem Wasser gelöst und dazu wurde eine wäss-rige Lösung von 3 ml einer gesättigten Ammoniumsulfatlö-

15 sung gegeben und die Mischung wurde 3 Stunden bei 4 °C stehen gelassen. Zu der Mischung wurden 3 ml destilliertes Wasser gegeben und dann liess man die Mischung 3 Stunden bei 4 °C stehen. Die Mischung wurde 15 Minuten bei 4 °C mit 3.500 Upm zentrifugiert und der erhaltene Niederschlag 20 wurde in destilliertem Wasser gelöst, wobei man 8 ml einer wässrigen Lösung des Antikörpers (OD280 = 1,154) erhielt. Die Lösung des Antikörpers wurde mit destilliertem Wasser dreimal dialysiert und anschliessend einmal mit einer 0, IM Natriumbikarbonatlösung (pH 8,4), enthaltend 0,5M Natri-25umchlorid, wobei man 7 ml einer wässrigen Antikörper-Lösung (OD280=0,921) erhielt.

(b) 1 g trockene Cyanogenbromid-aktivierte Sepharose 4B wurde mit 200 ml einer wässrigen 1 mM Salzsäurelösung gewaschen und dann wurde diese gewaschene Sepharose 4B

30 zu 30 ml einer 0,1M wässrigen Natriumbikarbonatlösung, enthaltend 0,5M Natriumchlorid und 7 ml der vorerwähnten dialysierten Antikörper-Lösung gegeben und die Mischung wurde dann bei Raumtemperatur 2 Stunden inkubiert. Nach dem Inkubieren wurde die Mischung auf einem Glasfilter fil-35 triert und das erhaltene Gel wurde in 50 ml IM Monoeth-anolamin-Cl (pH 8,36) gelöst und 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Diese Lösung wurde im Kreislauf mit 0,1 M Acetatpufferlösung (pH 4,0), enthaltend 0,5M Natriumchlorid, und dann mit 0,1M Boratpufferlösung, enthaltend 0,5M 40 Natriumchlorid, viermal gewaschen. Beim Suspendieren in einer physiologischen Kochsalzlösung erhält man ein adsorbiertes Produkt von Human-Interferon-ß-Antikörper, immobilisiert auf Sepharose 4B. Aus der Tatsache, dass 35 ml des beim Filtrieren auf dem Glasfilter erhaltenen Filtrats eine 45 OD280=0,004 zeigten, wurde bestätigt, dass der grösste Teil des Antikörpers auf Sepharose 4B immobilisiert wurde.

Herstellungsbeispiel 3

(a) 0,74 ml Antikörper-ß-H, erhalten in Herstellungsbei-50 spiel 20 für die Herstellung von Antikörpern, wurden in

2,26 ml destilliertem Wasser gelöst und dazu wurde eine wäss-rige, gesättigte Ammoniumsulfatlösung gegeben und die erhaltene Mischung wurde 3 Stunden bei 4 °C stehen gelassen. Dann gab man 3 ml Wasser zu dieser Mischung und liess 55 diese 3 Stunden bei 4 °C stehen. Die Mischung wurde dann mit 3.500 Upm 15 Minuten bei 4 °C zentrifugiert und der erhaltene Niederschlag wurde in destilliertem Wasser gelöst, wobei man 8 ml einer wässrigen Lösung des Antikörpers (OD28o = 1,155) erhielt. Diese Lösung des Antikörpers wurde 60 dann dreimal mit destilliertem Wasser und einmal mit 0,1M Natriumbikarbonatlösung (pH 8,4), enthaltend 0,5M Natriumchlorid, dialysiert, wobei man 7 ml einer wässrigen Antikörper-Lösung (OD280 = 0,921) erhielt.

(b) 1 g trockene Cyanogenbromid-aktivierte Sepharose 65 4B wurde mit 200 ml einer wässrigen 1 mM Salzsäure gewaschen und zu der gewaschenen Sepharose 4B wurden 30 ml einer wässrigen 0,1M Natriumbikarbonatlösung, enthaltend 0,5M Natriumchlorid, sowie 7 ml der vorerwähnten dialysier-

35 652411

ten Antikörper-Lösung gegeben und das Gemisch wurde 2 Diese Lösung des Antikörpers wurde dreimal mit destillier-Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Inkubie- tem Wasser dialysiert und weiter mit einer 0,1M wässrigen ren wurde die Mischung auf einem Glasfilter filtriert und das Natriumbikarbonatlösung (pH 8,4), enthaltend 0,5M Natri-erhaltene Gel wurde in 50 ml IM Monoethanolamin-Cl (pH umchlorid, wobei man 7 ml der wässrigen Antikörper-Lö-8,36) gelöst und bei Raumtemperatur 2 Stunden inkubiert. 5 sung (OD28o=0,920) erhielt.

Diese Lösung wurde mit einer umlaufenden Lösung von (b) 1 g trockene Cyanogenbromid-aktivierte Sepharose

0,1M Acetatpufferlösung (pH 4,0), enthaltend 0,5M Natri- 4B wurde mit 200 ml einer wässrigen 1 mM Salzsäurelösung umchlorid, gewaschen und anschliessend viermal mit 0, IM gewaschen und zu dieser gewaschenen Sepharose 4B wurden Boratpufferlösung, enthaltend 0,5M Natriumchlorid. Durch 30 ml einer 0,1M Natriumbikarbonatlösung, enthaltend Suspendieren in einer physiologischen Kochsalzlösung erhielt ioO,5M Natriumchlorid gegeben, sowie 7 ml der vorerwähnten, man ein adsorbiertes Produkt von Human-Interferon-ß-Anti- dialysierten Antikörper-Lösung. Die Mischung wurde bei körper, immobilisiert auf Sepharose 4B. Aus der Tatsache, Raumtemperatur 2 Stunden inkubiert. Nach dem Inkubieren dass 35 ml des Filtrâtes, das man erhält, wenn man das adsor- wurde die Mischung auf einem Glasfilter filtriert und das er-bierte Produkt über ein Glasfilter filtriert, eine OD280 = 0,004 haltene Gel wurde in 40 ml IM Monoethanolamin-Cl (pH zeigte, wurde bestätigt, dass der grösste Teil des Antikörpers 15 8,36) gelöst und bei Raumtemperatur 2 Stunden inkubiert, auf Sepharose 4B immobilisiert war. Die Lösung wurde durch eine umlaufende 0,1M Acetatpuf ferlösung (pH 4,0), enthaltend 0,5M Natriumchlorid, gewa-Herstellungsbeispiel 4 sehen und anschliessend noch viermal mit einer 0, IM Borat-

(a) 0,74 ml Antikörper-ß-III, erhalten in Herstellungsbei- pufferlösung, enthaltend 0,5M Natriumchlorid. Durch Susspiel 21 für die Herstellung von Antikörpern, wurden in 20 pendieren in einer physiologischen Kochsalzlösung erhielt 2,26 ml destilliertem Wasser gelöst und dazu wurden 3 ml ei- man ein adsorbiertes Produkt von Human-Interferon-ß-Anti-ner gesättigten wässrigen Ammoniumsulfatlösung gegeben körper, immobilisiert auf Sepharose 4B. Aus der Tatsache, und die Mischung wurde dann 3 Stunden bei 4 °C stehen ge- dass 35 ml des Filtrats, das man beim Filtrieren des adsor-lassen. Zu der Mischung wurden 3 ml destilliertes Wasser ge- bierten Produktes auf einem Glasfilter erhielt, eine geben und dann liess man die Mischung 3 Stunden bei 4 °C 25 OD280=0,004 zeigte, wurde bestätigt, dass der grösste Teil des stehen. Die Mischung wurde mit 3.500 Upm bei 40 C15 Mi- Antikörpers auf Sepharose 4B immobilisiert wurde.

nuten zentrifugiert und der erhaltene Niederschlag wurde destilliert und in Wasser gelöst, wobei man 8 ml einer wässrigen Herstellungsbeispiel 6 Lösung des Antikörpers (OD280 = 1,156) erhielt. Die Lösung (a) 0,74 ml Antikörper-ß-VI, erhalten in Herstellungsbei-des Antikörpers wurde dreimal gegen destilliertes Wasser dia- 30 spiel 24 für die Herstellung von Antikörpern, wurden in lysiert und anschliessend gegen eine 0,1 M wässrige Natrium- 2,26 ml destilliertem Wasser gelöst und dazu wurden 3 ml ei-bikarbonatlösung (pH 8,4), enthaltend 0,5M Natriumchlo- ner wässrigen gesättigten Ammoniumsulfatlösung gegeben rid, wobei man 7 ml der wässrigen Antikörper-Lösung und die Mischung wurde 3 Stunden bei 4 "C stehen gelassen. (OD280=0,922) erhielt. Dann wurden 3 ml destilliertes Wasser zu der Mischung gege-

(b) 1 g trockene Cyanogenbromid-aktivierte Sepharose 35 ben und diese 3 Stunden bei 4 °C stehen gelassen. Die Mi-4B wurde mit 200 ml einer wässrigen 1 mM Salzsäure gewa- schung wurde dann mit 3.500 Upm 15 Minuten bei 4 °C zen-schen und diese gewaschene Sepharose 4B wurde zu 30 ml ei- trifugiert und der erhaltene Niederschlag wurde in destillier-ner wässrigen 0,1M Natriumbikarbonatlösung, enthaltend tem Wasser gelöst, wobei man 8 ml einer wässrigen Lösung 0,5M Natriumchlorid, gegeben und dazu wurden 7 ml der des Antikörpers (OD280= 1,158) erhielt. Die Lösung des Antivorerwähnten dialysierten Antikörper-Lösung gegeben und 40 körpers wurde dreimal gegen destilliertes Wasser dialysiert die Mischung wurde dann 2 Stunden bei Raumtemperatur in- und anschliessend mit einer 0,1M Natriumbikarbonatlösung kubiert. Nach dem Inkubieren wurde die Mischung auf einem (pH 8,4) enthaltend 0,5M Natriumchlorid, wobei man 7 ml Glasfilter filtriert und das erhaltene Gel wurde in 40 ml 1M der wässrigen Antikörperlösung (OD280=0,924) erhielt. Monoethanolamin-Cl (pH 8,36) gelöst und bei Raumtempe- (b) 1 g trockene Cyanogenbromid-aktivierte Sepharose ratur 2 Stunden inkubiert. Diese Lösung wurde mit einer um- 45 4B wurde mit 200 ml einer wässrigen 1 mM Salzsäurelösung laufenden Lösung von 0,1M Acetatpuffer (pH 4,0), enthal- gewaschen und dann wurden zu dieser gewaschenen Sepha-tend 0,5M Natriumchlorid, gewaschen und dann noch vier- rose 4B 30 ml einer 0,1M Natriumbikarbonatlösung, enthal-mal mit einer 0,1M Boratpufferlösung, enthaltend 0,5M Na- tend 0,5M Natriumchlorid, gegeben, sowie 7 ml der vorer-triumchlorid. Durch Suspendieren in einer physiologischen wähnten dialysierten Antikörper-Lösung. Die Mischung Kochsalzlösung erhält man ein adsorbiertes Produkt von Hu- 50 wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem man-Interferon-ß-Antikörper, der auf Sepharose 4B immobi- Inkubieren wurde die Mischung auf einem Glasfilter filtriert lisiert ist. Aus der Tatsache, dass 35 ml des beim Filtrieren des und das erhaltene Gel wurde in 40 ml einer IM Monoeth-absorbierten Produktes auf einem Glasfilter erhaltenen Fil- anolamin-Cl (pH 8,36) gelöst und 2 Stunden bei Raumtem-trats eine OD280—0,004 zeigen, wird bestätigt, dass der gross- peratur inkubiert. Dann wurde diese Lösung mit einer umlaute Teil des Antikörpers auf Sepharose 4B immobilisiert ist. 55 fenden 0,1 M Acetatpufferlösung (pH 4,0), enthaltend 0,5M

Natriumchlorid, gewaschen und dann noch viermal mit einer Herstellungsbeispiel 5 0, IM Boratpufferlösung, enthaltend 0,5M Natriumchlorid.

(a) 0,74 ml Antikörper-ß-IV, erhalten in Herstellungsbei- Durch Suspendieren in einer physiologischen Kochsalzlösung spiel 22 für die Herstellung von Antikörpern, wurden in erhielt man das adsorbierte Produkt von Human-Interferon-

2,26 ml destilliertem W asser gelöst und dazu wurden 3 ml ei- 60 ß-Antikörper, immobilisiert auf Sepharose 4B. Aus der Tat-ner gesättigten wässrigen Ammoniumsulfatlösung gegeben sache, dass 35 ml des beim Filtrieren des adsorbierten Pro-und die Mischung wurde 3 Stunden bei 4 °C stehengelassen. duktes auf einem Glasfilter erhaltenen Filtrats eine Dann wurden 3 ml destilliertes Wasser zu der Mischung gege- OD280=0,004 zeigten, wurde bestätigt, dass der grösste Teil ben und die Mischung wurde 3 Stunden bei 4 ° C stehen gelas- des Antikörpers auf Sepharose 4B immobilisiert war.

sen. Die Mischung wurde dann mit 3.500 Upm bei 4 °C wäh- 65

rend 15 Minuten zentrifugiert und der erhaltene Niederschlag Herstellmgsbeispiel 7

wurde in destilliertem Wasser aufgelöst, wobei man 8 ml einer Ein Filterpapier (Toyo Filterpapier Nr. 2, hergestellt von wässrigen Lösung des Antikörpers (OD280 =1,153) erhielt. Toyo Filter Paper Co. Ltd.) wurde in kleine Stücke von

652 411

36

0,5 x 0,5 cm mit einem Gewicht von jeweils etwa 1 g geschnitten. Diese kleinen Filterpapierstückchen (aus Zellulose) wurden in 100 ml einer wässrigen Lösung, enthaltend 1 g Cyanogenbromid, gegeben und der pH-Wert der Mischung wurde auf etwa 11,0 bis 11,5 durch Zugabe von Natriumhydroxid eingestellt, um die Zellulose bei Raumtemperatur während 6 bis 8 Minuten zu aktivieren. Nach Beendigung der Aktivierung wurde das Reaktionsgemisch zur Entfernung der Reaktionsflüssigkeit filtriert und der erhaltene Feststoff wurde mehrere Male mit einer eiskalten 0,5M Natriumbikarbonatpufferlösung (pH 8,4), enthaltend 0,5M Natriumchlorid, gewaschen und dann wurde der gewaschene Feststoff in der gleichen Pufferlösung suspendiert. Zu dieser Suspension wurde die wässrige Antikörperlösung (OD28o=0,918), die in gleicher Weise erhalten wurde wie beim zuvor beschriebenen Herstellungsbeispiel l(a), gegeben und die Mischung wurde dann in gleicher Weise wie vorher im Herstellungsbeispiel 1 (b) beschrieben wurde, behandelt, wobei man ein adsorbiertes Produkt von Human-Interferon-ß, immobilisiert auf Zellulose, erhielt. Aus der Tatsache, dass das beim Filtrieren durch ein Glasfilter erhaltene Filtrat eine OD2g0 = 0,004 zeigte, wurde bestätigt, dass der grösste Teil des Antikörpers auf Zellulose gebunden ist.

Herstellungsbeispiel 8 1 g vernetztes Dextran (Sephaded G-25) wurde in 10 ml Wasser suspendiert. Zu dieser Suspension wurden 10 ml einer wässrigen 2M Natriumbikarbonatlösung gegeben und dabei schwach gerührt. Dann wurde die Rührgeschwindigkeit erhöht und 500 Mikroliter einer Acetonitrillösung von Cyanogenbromid (2 g/ml) wurde auf einmal zugegeben und dabei wurde kräftig während 1 bis 2 Minuten gerührt und dann wurde das Reaktionsgemisch durch ein Glasfilter filtriert und der Feststoff mehrere Male mit einer 0,1M Natriumbikarbonatpufferlösung (pH 8,4), enthaltend 0,5M Natriumchlorid, gewaschen. Nach dem Waschen wurde der Feststoff in der gleichen Pufferlösung suspendiert und die wässrige Antikör-per-Lösung (OD280=0,921), erhalten im oben erwähnten Herstellungsbeispiel l(a) wurde zugegeben und dann erfolgte die weitere Behandlung wie bei dem zuvor erwähnten Herstellungsbeispiel l(b), wobei man ein adsorbiertes Produkt von Human-Interferon-ß, immobilisiert auf vernetztem Dextran, erhielt. Das Filtrat, das man beim Filtrieren durch ein Glasfilter erhielt, zeigte eine OD2so—0,004. Dadurch wird bestätigt, dass der grösste Teil des Antikörpers auf dem vernetzen Dextran immobilisiert ist.

Herstellungsbeispiel 9 1 ml Antikörper-a-N-IV, erhalten in Herstellungsbeispiel 4 für die Herstellung des Antikörpers, wurde in 2,0 ml destilliertem Wasser gelöst und dazu wurden 3 ml einer gesättigten wässrigen Ammoniumsulfatlösung gegeben und das Gemisch liess man 3 Stunden bei 4 °C stehen. Dann wurden zu der Mischung 3 ml destilliertes Wasser gegeben und die Mischung 3 Stunden bei 4 °C stehen gelassen. Die Mischung wurde dann 15 Minuten bei 4 °C mit 3.500 Upm zentrifugiert und der erhaltene Niederschlag wurde in destilliertem Wasser gelöst, wobei man 10 ml einer wässrigen Lösung des Antikörpers (OD280= 1,538) erhielt. Anschliessend wurde die Lösung des Antikörpers dreimal mit destilliertem Wasser dialysiert und anschliessend noch mit einer 0,1 M Natriumbikarbonatlösung (pH 8,4), enthaltend 0,5M Natriumchlorid, wobei man 10 ml der wässrigen Antikörperlösung (OD280= 1,501) erhielt.

(b) 1 g trockene Cyanogenbromid-aktivierte Sepharose 4B wurde mit 200 ml einer wässrigen 1 mM Salzsäurelösung gewaschen. Die gewaschene Sepharose 4B wurde zu 30 ml einer wässrigen 0,1M Natriumbikarbonatlösung, enthaltend 0,5M Natriumchlorid, gegeben und 7 ml der zuvor erwähnten dialysierten Antikörper-Lösung wurden dazu gegeben und die erhaltene Mischung wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Inkubieren wurde die Mischung auf einem Glasfilter filtriert und das erhaltene Gel wurde in 40 ml 5 IM Monoethanolamin-Cl (pH 8,36) gelöst und dann 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Lösung wurde durch eine umlaufende 0,1M Acetatpufferlösung (pH 4,0), enthaltend 0,5M Natriumchlorid, gewaschen und anschliessend noch viermal mit einer 0,1 M Boratpufferlösung, enthaltend ioO,5M Natriumchlorid. Durch Suspendieren in einer physiologischen Kochsalzlösung erhielt man ein adsorbiertes Produkt von Human-Interferon-a-Antikörper, immobilisiert auf Sepharose 4B. Aus der Tatsache, dass 35 ml des beim Filtrieren auf dem Glasfilter erhaltenen Filtrats eine OD28o=0,004 zeig-isten, wurde bestätigt, dass der grösste Teil des Antikörpers auf Sepharose 4B immobilisiert war.

Herstellungsbeispiel 10 Unter Verwendung von Antikörper-a-N-I bis -a-N-III, 20von Antikörper-a -N-V bis Antikörper-a-N-X, erhalten in den Herstellungsbeispielen 1 bis 3 bis 5 bis 10 für die Herstellung der Antikörper, anstelle von Antikörper-a-N-IV, verwendet man den oben erwähnten Herstellungsbeispiel 9, wobei man sonst die gleiche Verfahrensweise wie im Herstel-25 lungsbeispiel 9 anwendete, wurden die nachfolgenden wässrigen Antikörper-Lösungen erhalten:

wässrige Anti verwendeter

O oo <N

Q O

körper-Lösung

30

Antikörper

A

a-N-I

1,501

B

a-N-II

1,522

C

a-N-III

1,512

D

a-N-V

1,532

35 £

a-N-VI

1,515

F

a-N-VII

1,526

G

a-N-VIII

1,513

H

a-N-IX

1,527

I

a-N-X

1,521

(b) Unter Verwendung der wässrigen in Stufe (a) erhaltenen Antikörper-Lösungen und unter Anwendung eines grundsätzlich gleichen Verfahrens, wie es im oben erwähnten Herstellungsbeispiel 9(b) beschrieben wird, wurden entspre-45 chende adsorbierte Produkte von Human-Interferon-a, immobilisiert auf Sepharose 4B, erhalten. Alle die Filtrate, die man beim Filtrieren durch ein Glasfilter erhielt, zeigten eine OD28o=0,004 und das bestätigt, dass der grösste Teil der Antikörper auf Sepharose 4B immobilisiert ist.

50

Herstellungsbeispiel 11 Ein Filterpapier (Toyo Filter Papier Nr. 2, hergestellt von Toyo Filter Paper Co. Ltd.) wurde in kleine Stücke einer Grösse von 0,5 x 0,5 cm mit einem Gewicht von etwa 1 g ge-55 schnitten. Diese Filterpapierstücke aus Zellulose wurden zu 100 ml einer wässrigen Lösung, enthaltend 1 g Cyanogenbromid, gegeben und bei einem pH-Wert von 11 bis 11,5 durch Zugabe von Natriumhydroxid gehalten, dann wurde die Zellulose bei Raumtemperatur während 6 bis 8 Minuten akti-60 viert. Nach Beendigung der Aktivierung wurde die Reaktionsmischung zur Entfernung der Reaktionsflüssigkeit filtriert und der gebildete Feststoff wurde mehrere Male mit eiskalter 0,5M Natriumbikarbonatpufferlösung (pH 8,4), enthaltend 0,5M Natriumchlorid, gewaschen und der gewa-65 schene Feststoff wurde dann in der gleichen Pufferlösung suspendiert. Zu dieser Suspension wurde eine wässrige Antikörper-Lösung (OD28o=1,502), erhalten in gleicher Weise wie zuvor in Herstellungsbeispiel 9(a) beschrieben, gegeben und

37

652411

die Mischung wurde dann in gleicher Weise wie zuvor in Her- man beim Filtrieren des adsorbierten Produktes auf einem Stellungsbeispiel 9(b) beschrieben behandelt, wobei man ein Glasfilter erhielt, eine OD28o=0,004 zeigten, wurde bestätigt, adsorbiertes Produkt aus Human-Interferon-a-Antikörper, dass der grösste Teil des Antikörpers auf Sepharose 4B immo-immobilisiert auf Zellulose, erhielt. Aus der Tatsache, dass bilisiert war.

das Filtrat, das man beim Filtrieren des absorbierten Produk- s tes durch ein Glasfilter erhielt, eine OD2go=0,004 zeigte, Herstellungsbeispiel 14

wurde bestätigt, dass der grösste Teil des Antikörpers auf Zel- (a) Wendet man im vorhergehenden Herstellungsbeispiel lulose immobilisiert war. 13 anstelle des Antikörpers-a-C-VIII Antikörper-a-C-I bis

Antikörper-a-C-VII und Antikörper-a-C-IX bis Antikörper-Herstellungsbeispiel 12 io a-C-XIII, erhalten gemäss Herstellungsbeispielen 11 bis 18

1 g vernetztes Dextran (Sephaded G-25) wurde in 10 ml für die Herstellung der Antikörper, an, so erhält man die Wasser suspendiert. Zu dieser Suspension wurden 10 ml einer nachfolgenden wässrigen Antikörper-Lösungen:

wässrigen 2M Natriumbikarbonatlösung gegeben und gründlich gerührt. Dann wurde die Rührgeschwindigkeit erhöht wässrige Anti- verwendeter OD2go und 500 Mikroliter einer Acetonitrillösung von Cyanogen- is körper-Lösung Antikörper bromid (2 g/ml) wurden auf einmal zugegeben und dabei wurde während Ibis 2 Minuten kräftig gerührt und das Re- J a-C-III 1,511

aktionsgemisch wurde dannaufeinem Glasfilter unter Ent- K a-C-I 1,502

fernung der Reaktionsflüssigkeit filtriert. Der erhaltene Fest- L a-C-II 1,512

Stoff wurde mehrere Male mit einer 0,1M Natriumbikarbo- 20 M a-C-IV 1,506

natpufferlösung (pH 8,4), enthaltend 0,5M Natriumchlorid, N a-C-V 1,513

gewaschen. Nach dem Waschen wurde der Feststoff in dee O a-C-VI 1,507

gleichen Pufferlösung suspendiert und dazu wurde eine wäss- P a-C-VII 1,513

rige Antikörperlösung (OD28o= 1,511), erhalten gemäss obi- Q a-C-IX 1,502

gern Herstellungsbeispiel 9(a), gegeben und dann erfolgte die 2s R a-C-X 1,501

weitere Behandlung wie sie zuvor für das Herstellungsbeispiel S a-C-XI 1,509

9(b) beschrieben wurde und auf diese Weise erhielt man ein T a-C-XII 1,507

adsorbiertes Produkt von Human-Interferon-a-Antikörper, U a-C-XIII 1,506

immobilisiert auf dem vernetzten Dextran. Aus der Tatsache, (b) Unter Verwendung der jeweils in Stufe (a) erhaltenen dass das beim Filtrieren des Produktes erhaltene Filtrat eine 30 wässrigen Antikörper-Lösungen und des gleichen Verfahrens, OD28o=0,004 zeigte, geht hervor, dass der grösste Teil des wie es zuvor in Herstellungsbeispiel 13(b) beschrieben wird, Antikörpers auf dem vernetzten Dextran immobilisiert wurden die entsprechenden adsorbierten Produkte von Hu-

wurde. man-Interferon-a, immobilisiert auf Sepharose 4B, erhalten.

Aus der Tatsache, dass die Filtrate, die man beim Filtrieren Herstellungsbeispiel 13 35 durch ein Glasfilter erhielt, eine OD28o=0,004 zeigten, geht

(a) 1,0 ml Antikörper-a-C-VIII, erhalten in Herstellungs- hervor, dass der grösste Teil der Antikörper in den jeweiligen beispiel 17 für die Herstellung von Antikörpern, wurde in Produkten auf Sepharose 4B immobilisiert ist.

2,0 ml destilliertem Wasser gelöst und dazu wurde eine gesättigte, wässrige Ammoniumsulfatlösung gegeben und die Mi- Herstellungsbeispiel 15 schung liess man dann bei 4 °C 3 Stunden stehen. Dann wur- 40 Ein Filterpapier (Toyo Filter Papier Nr. 2) wurde in den 3 ml destilliertes Wasser zu der Mischung gegeben und kleine Stücke einer Grösse von 0,5 x 0,5 cm mit einem Ge-die Mischung wurde 3 Stunden bei 4 °C stehen gelassen. An- wicht von etwa 1 g geschnitten. Diese Filterpapierstückchen schliessend wurde die Mischung 15 Minuten bei 4 °C mit aus Zellulose wurden in 100 ml einer 1 g Cyanogenbromid 3.500 Upm zentrifugiert und der erhaltene Niederschlag enthaltenden wässrigen Lösung gegeben und der pH der Mi-wurde in destilliertem Wasser gelöst, wobei man 10 ml einer « schung wurde durch Zugabe von Natriumhydroxid auf 11,0 wässrigen Antikörper-Lösung (OD280 = 1,526) erhielt. Die bis 11,5 gehalten, wodurch die Zellulose innerhalb von 6 bis 8 Lösung des Antikörpers wurde dreimal mit destilliertem Was- Minuten bei Raumtemperatur aktiviert wurde. Nach Beendi-ser dialysiert und dann nochmals mit einer 0,1M Natriumbi- gung der Aktivierung wurde das Reaktionsgemisch filtriert karbonatlösung (pH 8,4), enthaltend 0,5M Natriumchlorid, und die Reaktionsflüssigkeit entfernt und der Feststoff wurde wobei man 10 ml einer wässrigen Antikörper-Lösung so mehrere Male mit einer eiskalten 0,5M Natriumbikarbonat-(OD28o = 1,511) erhielt. Pufferlösung (pH 8,4), enthaltend 0,5M Natriumchlorid, ge-

(b) 1 g trockene Cyanogenbromid-aktivierte Sepharose waschen und der gewaschene Feststoff wurde in der gleichen 4B wurde mit 200 ml einer 1 mM Salzsäure gewaschen und zu Pufferlösung suspendiert. Zu dieser Suspension wurde die der so gewaschenen Sepharose 4B wurden 30 ml einer wässri- wässrige Antikörper-Lösung (OD280= 1,502), erhalten in glei-gen 0,1M Natriumbikarbonatlösung, enthaltend 0,5M Natri- 55 eher Weise wie im zuvor beschriebenen Herstellungsbeispiel umchlorid, gegeben, sowie 7 ml der vorerwähnten dialysier- 13(a), gegeben und die Mischung wurde dann in gleicher ten Antikörper-Lösung. Die Mischung wurde 2 Stunden bei Weise wie im vorhergehenden Herstellungsbeispiel 14(b) beRaumtemperatur inkubiert. Nach dem Inkubieren wurde die schrieben, behandelt, wobei man ein adsorbiertes Produkt Mischung auf einem Glasfilter filtriert und das erhaltene Gel von Human-Interferon-a-Antikörper, immobilisiert auf Zel-wurde in 40 ml IM Monoethanolamin-Cl (pH 8,36) gelöst 60 lulose, erhielt. Aus der Tatsache, dass das Filter, das man und 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Lösung beim Filtrieren des adsorbierten Produktes unter Verwen-wurde mit einer umlaufenden 0,1M Acetatpufferlösung (pH dung eines Glasfilters, eine OD28o=0,004 zeigte, geht hervor, 4,0), enthaltend 0,5M Natriumchlorid, gewaschen und an- dass der grösste Teil des Antikörpers auf der Zellulose immo-schliessend mit einer 0,1M Boratpufferlösung, enthaltend bilisiert ist.

0,5M Natriumchlorid. Durch Suspendieren in einer physiolo- 65

gischen Kochsalzlösung erhielt man ein adsorbiertes Produkt Herstellungsbeispiel 16

von Human-Interferon-a-Antikörper, immobilisiert auf Se- 1 g vernetztes Dextran (Sephadex G-25) wurde in 10 ml pharose 4B. Aus der Tatsache, dass 35 ml des Filtrats, das Wasser suspendiert. Zu dieser Suspension wurden 10 ml einer

652411 38

wässrigen 2M Natriumbikarbonatlösung gegeben und dabei rige Antikörper-Lösung (OD28o = 1,505), erhalten in gleicher schwach gerührt. Dann wurde die Rührgeschwindigkeit er- Weise wie beim vorhergehenden Herstellungsbeispiel 13(a),

höht und 500 Mikroliter einer Lösung von Cyanogenbromid wurde dazugegeben und dann wurde die in Herstellungsbei-

in Acetonitril (2 g/ml) wurde auf einmal zugegeben und dabei spiel 13(b) beschriebene Verfahrensweise durchgeführt und wurde kräftig während 1 bis 2 Minuten gerührt und dann s man erhielt ein adsorbiertes Produkt von Human-Interferon-

wurde die Reaktionsmischung auf einem Glasfilter filtriert. a-Antikörper, immobilisiert auf dem vernetzten Dextran. Aus

Der erhaltene Feststoff wurde mehrere Male mit 0,1M Natri- der Tatsache, dass beim Filtrieren des adsorbierten Produktes umbikarbonatpufferlösung (pH 8,4), enthaltend 0,5M Natri- durch ein Glasfilter das Filtrat eine OD2go=0,004 zeigte, geht umchlorid, gewaschen. Nach dem Waschen wurde der Fest- hervor, dass der grösste Teil des Antikörpers auf dem vernetz-

stoff in der gleichen Pufferlösung suspendiert und eine wäss- io ten Dextran immobilisiert ist.

C

9 Blatt Zeichnungen

Claims (5)

1. 652 411

   2

   PATENTANSPRÜCHE rischem Serumglobulin, tierischem Thyroglobulin, tierischem

   1. Verfahren zur Herstellung eines Human-Interferon-An- Hämoglobulin, tierischem Hämocyanin, einem Ascaridenex-tikörpers durch Sammeln eines in einem Säugetierkörper ge- trakt, einem Polylysin, einer Polyglutaminsäure, einem Lysin-bildeten Antikörpers, wobei der Antikörper in dem Säugetier Glutaminsäure-Copolymer, einem Lysin enthaltenden Copo-gebildet wurde, indem man dem Säugetier ein Human-Inter- 5 lymer und einem Ornithin enthaltenden Copolymer und wo-feron-Antigen verabreichte und wobei das Human-Interfe- bei das Hapten-Träger-Bindungsmittel ein Bindungsmittel ron-Antigen gebildet wurde durch Umsetzen eines Human- aus der Gruppe aliphatische Dialdehyde, einer Dimaleimid-Interferon verwandten Peptids aus der Gruppe der Peptide Verbindung, einer Maleimidcarboxyl-N-hydroxysuccinimid-der allgemeinen Formel (I) Verbindung und einem Carbodiimid ist.

   io 6. Verfahren gemäss Anspruch 5, dadurch gekennzeich-R1 -Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH (I) net, dass das Tier ein Säugetier aus der Gruppe Kaninchen und Meerschweinchen ist.

   worin R1 ein Wasserstoffatom, eine Gruppe der Formel H- 7. Verfahren gemäss Anspruch 6, dadurch gekennzeich-

   Thr-His-Ser-Leu-Gly-Asn-Arg-Arg-Ala-, eine Gruppe der net, dass der in einem Säugetier gebildete Human-Interferon-Formel H-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Asn- is Antikörper gebildet wurde, indem man dem Säugetier das Arg-Arg-Ala- oder eine Gruppe der Formel H-Tyr-Ser-Asp- Human-Interferon-Antigen durch Mischen mit einem Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Asn-Arg-Arg-Ala- be- Freund's Adjuvant verabreichte.

   deutet, einem Peptid der allgemeinen Formel (II) 8. Verfahren gemäss Anspruch 7, dadurch gekennzeich net, dass der in einem Säugetier gebildete Human-Interferon-R2-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys-Glu-OH (II) 20 Antikörper erhalten wurde, indem man einem Kaninchen ein

   Human-Interferon-Antigen verabreichte, das unter Verwen-worin R2 ein Wasserstoffatom, eine Gruppe der Formel H- dung eines Peptids der allgemeinen Formel Thr-Asn-Leu-Gln-, eine Gruppe der Formel H-Ser-Leu-Ser-

   Thr-Asn-Leu-Gln- oder eine Gruppe der Formel H-Tyr-Ser- H-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Asn-Arg-Leu-Ser-Thr-Asn-Leu-Gln- bedeutet, und einem Peptid der 25 Arg-AIa-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH allgemeinen Formel (III)

   als ein Hapten, Glutaraldehyd oder N,N-Dicyclohexylcarbo-R3-Leu-Gln-Arg-Ser-Ser-OH (III) diimid als Hapten-Träger-Bindungsmittel und Rinderserum albumin als Träger hergestellt worden ist.

   worin R3 ein Wasserstoffatom, eine Gruppe der Formel H- 30 9. Verfahren gemäss Anspruch 7, dadurch gekennzeich-Phe-, eine Gruppe der Formel H-Leu-Gly-Phe- oder eine net, dass der in einem Säugetierkörper gebildete Human-In-

   Gruppe der Formel H-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe- bedeutet, terferon-Antikörper erhalten wurde durch Verabreichen eines als ein Hapten mit einem Träger in Gegenwart eines Hapten- Human-Interferon-Antigens an ein Kaninchen, wobei das Träger-Bindungsmittels. Human-Interferon-Antigen hergestellt wurde unter Verwen-
2. 2. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeich- 35 dung eines Peptids der allgemeinen Formel net, dass das Human-Interferon-Antigen erhalten wurde durch Umsetzen eines von Human-Interferon abgeleiteten H-Ser-Leu-Ser-Thr-Asn-Leu-Gln-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys-Peptids der allgemeinen Formel (I) Glu-OH

   R'-Leu-Ue-Leu-Leu-Ala-Gln-OH (I) 40 als ein Hapten, Glutaraldehyd als Hapten-Träger-Bindungs-

   mittel und Rinderserumalbumin als Träger.

   worin R1 die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung hat, als 10. Verfahren gemäss Anspruch 7, dadurch gekennzeich-

   ein Hapten mit einem Träger in Gegenwart eines Hapten-Trä- net, dass der in dem Säugetierkörper gebildete Human-Inter-ger-Bindungsmittels. feron-Antikörper erhalten wurde durch Verabreichen von
3. 3. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeich- 45 Human-Interferon-Antigen an ein Kaninchen und wobei das net, dass der Human-Interferon-Antikörper gebildet wurde Human-Interferon-Antigen hergestellt wurde unter Verwen-durch Umsetzen eines Human-Interferon verwandten Peptids dung eines Peptids der allgemeinen Formel der allgemeinen Formel (II)

   H-Ser-Leu-Ser-Thr-Asn-Leu-Gln-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys-R2-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys-Glu-OH (II)50 Glu-OH

   worin R2 die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung hat, als als Hapten, N,N-Dicyclohexylcarbodiimid als Hapten-Trä-ein Hapten mit einem Träger in Gegenwart eines Hapten-Trä- ger-Bindungsmittel und Rinderserumalbumin als Träger. ger-Bindungsmittels. 11. Nach dem Verfahren gemäss einem der Anspräche 1
4. 4. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeich- 55 bis 10 hergestellter Human-Interferon-Antikörper.

   net, dass der Human-Interferon-Antikörper erhalten wurde 12. Human-Interferon-Antikörper nach Anspruch 11,

   durch Umsetzen eines Human-Interferon verwandten Peptids hergestellt nach dem Verfahren gemäss Anspruch 3. der allgemeinen Formel (III) 13. Verwendung des Human-Interferon-Antikörpers ge mäss Anspruch 11 zur Herstellung eines Adsorptionsmittels R3-Leu-Gln-Arg-Ser-Ser-OH (III) 60 für die Affinitätschromatographie, dadurch gekennzeichnet,

   dass man auf einem unlöslichen Träger besagten Human-In-worin R3 die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung hat, als terferon-Antikörper immobilisiert.

   ein Hapten mit einem Träger in Gegenwart eines Hapten-Trä- 14. Verwendung nach Anspruch 13 eines Human-Interfe-ger-Bindungsmittels. ron-Antikörpers gemäss Anspruch 12.
5. 5. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 2 bis 4, da- 65

   durch gekennzeichnet, dass das Human-Interferon-Antigen

   hergestellt wurde unter Verwendung eines Trägers ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus tierischem Serumalbumin, tie-

   652 411