DE2010759B2 - Eckige Klammer auf beta-Ala hoch 1- eckige Klammer zu -ACTH (1-18>NH tief 2, seine Salze mit Säuren und Komplexe mit Schwermetallen und Polyaminosäuren, sowie diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel - Google Patents

Description

Rx-^-Alanyl-L-tyrosyl-L-seryl-L-metiiionyly-Rz-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-argmyl-L-tryptophyl-glycyl-N'-R^L-lysyl-L-pro!yl-L-vaJy]-glycy]-N^£-R₃-L-]ysyl-N'-R₃-L-lysyl-L-arginyl-L-argininamid,

in der R₁ und R₃ Aminoschut/gruppen darstellen und R₂ eine Carboxylschutzgruppe ist.

3. Verbindung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß R₁ und R₃ jeweils eine tert.-Butyloxycarbonyl-, tert.-Amyloxycarbonyl-, 2-(p-Diphenyl)-isopropyloxycarbonyl-, Benzyloxycarbonyl-, p-Methoxybenzyloxycarbonyl-, p-Nitro-benzyloxycarbonyl-. Formyl-, Tosyl- oder Tritylgruppe und R₂ ein niederer Alkylester- oder niederer Arylalkylesterrest ist.

4. Arzneipräparate, enthaltend eine Verbindung gemäß Anspruch 1 und übliche Trägelstoffe und bzw. oder Verdünnungsmittel und bzw. oder Hilfsstoffe ,5

40

45

Aus verschiedenen Laboratorien sind Synthesen einer großen Anzahl von Corticotropin(ACTH)-Peptidanalogen berichtet worden. Bei den Peptidanalogen sind einzelne Aminosäuren der natürlichen Sequenz gegen andere Aminosäuren ausgetauscht, z. B. die erste Aminosäure Serin gegen Glycin oder D-Serin, die vierte Aminosäure Methionin gegen Valin oder Norleucin, die fünfte Aminosäure Glutaminsäure gegen Glutamin, die 17. und 18. Aminosäure Arginin gegen Lysin oder Ornithin oder die 25. Aminosäure Asparaginsäure gegen Valin. Obwohl viele corticotrope Peptide mit einer geringfügig veränderten Aminosäuresequenz bisher synthetisiert worden sind, zeigte bis auf ein paar Ausnahmen keines dieser Peptide eine größere Aktivität als das natürliche Corticotropin. Von besonderem Interesse ist das Peptid D-Ser'-NLe^VaF-ACTHa^SKNH;,, das einen D-Serinrest am Aminoende an Stelle des nativen L-Serins, einen Valinamidrest am Carboxylende an Stelle des Asparaginsäurerestes und in Stellung 4 an Stelle des Methioninrestes beim Corticotropin einen Norleucinrest enthält. Dieses Peptid ist nach den Angaben der Literatur biologisch aktiver als das native Corticotropin; vgl. Experientia, 22, 526 (1966). Es scheint sehr wahrscheinlich, daß das beim D-Se^-NLe⁴-VaI²⁵-ACTH(I -25)-NH₂ beobachtete Anwachsen der Aktivität eine Folge der verringerten Anfälligkeit des Peptides gegenüber der Wirkung von Aminopeptidase und Carboxypeptidase ist. Dies ist auf die Gegenwart einer D-Aminosäure am Aminoende und eines Valinamids am Carboxylende und auf die Tatsache zurückzuführen, daß die Oxydation von Methionin in Stellung 4 zu Methioninsulfoxid bei Inaktivierung nicht auftreten kann, da der Methioninrest durch einen Norleucinrest ersetzt ist. D-Se^-NLe⁴-Val^2S-ACTH(l-25)-NH₂ ist zwar ein ausgezeichnetes corticotropes Peptid mit hoher biologischer Aktivität, es ist nicht das Idealmittel, da es einige Probleme bei seiner Anwendung in der Humanmedizin mit sich bringt Da D-Se^-NLe^-Val²⁵-ACTH( 1 -25)-NH₂ drei modifizierte Aminosäuren, d h. D-Serin-, Norleucin- und Valinreste enthält, besteht die Gefahr einer anaphylaktischen Reaktion beim Verabreichen an Menschen wegen dieses Unterschiedes in der Aminosäuresequenz zwischen menschlichem Corticotropin und dem synthetischen Peptid. Es ist bekannt, daß die anaphylaktische Reaktion häufig auftritt, wenn im Handel erhältliches, aus Hypophysen von Tieren, wie Schweinen. Rindern oder Schafen, stammendes Corticotropin Menschen verabreicht wird. Diese unerwünschte Erscheinung kann eine Folge der strukturellen Unterschiede in den Aminosäuresequenzen in den Stellungen 25 bis 33 zwischen menschlichem und tierischem Corticotropin sein und kann auch auf bestimmte proteinähnliche Verunreinigungen, die nicht vollkommen aus dem natürlichen, aus den genannten tierischen Quellen stammenden Corticotropin entfernt werden können, zurückzuführen sein. Weiter weiß man, daß die Reaktivität der Hydroxylgruppe des Serins, die Labilität der Seryl-Peptidbitidung unter alkalischen Bedingungen, die Neigung zu /f-Eliminationsreaktionen unter Bildung von Dehydro-Peptiden und die N — O-Acyl-Verschiebung die Herstellung von Serin enthaltenden Peptiden sehr erschweren, die wegen Labilität unter alkalischen Bedingungen oft von Racemisierungsprodukten begleitet sind. Außerdem erfordert die Synthese einer langen Peptidkette einen großen Aufwand an Arbeitszeit und Arbeitskraft. Deswegen ist es sehr wünschenswert, ein hochaktives corticotropes Peptid herzustellen, dessen Aminosäuresequenz so kurz wie möglich ist.

In der Zeitschrift J. Am. Chem. Soc, 87, 2696 (1965) und J. Biochem. (Tokio), 58, 512 (1965) ist die Synthese eines corticotropen, hochaktiven Octadekapeptidamids beschrieben, das den ersten 18 Aminosäureresten des Corticotropins entspricht, mit der einen Ausnahme, daß das Carboxylende in das Amid übergeführt wurde. Außerdem gelang es, ein Octadekapeptid zu synthetisieren, in dem das aminoterminale Serin des Corticotropins durch einen Glycinrest ersetzt und dessen Carboxylende in das Amid übergeführt ist; vgl. Bull. Chem. Soc. Japan., 43, 196 (1970). Beide Peptide weisen eine hohe corticotrope Aktivität auf. In vivo entsprechen die steroidgenetischen Aktivitäten bei intravenöser Verabreichung an Ratten denen von Schafcorticotropin. Jedoch ist die steroidgenetische Aktivität in vitro etwas geringer als die von Schafcorticotropin.

Aufgabe der Erfindung war es daher, neue corticotrope Peptide zu schaffen, die ausgeprägte biologische Eigenschaften, stimulierende Wirkung auf die Nebennierenrinde, lipolytische Ak'ivität und melanozytenstimulierende Aktivität aufweisen, die alle höher sind als die Aktivitäten von natürlichem Corticotropin und von bisher bekannten synthetischen Corticotropin-Peptiden. Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst.

Gegenstand der Erfindung ist somit das Octadekapeptid der Formel I

/i-Alanyl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyi-L-valylglycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-arginyl-L-argininamid ' -■"

(abgekürzt mit [/S-AIa¹J-ACTH(I-IShNH₂ bezeichnet), seine Salze mit Säuren und Komplexe mit Zink, Kobalt, Nickel, Kupfer, Eisen, Poly-L-glutaminsäure, Poly-D-glutaminsäure, Poly-DL-glutaminsäure, PoIy-L- asparaginsäure. Poly - dl - asparaginsäure. Copoly-L-glutamyl-tyrosin oder deren Gemische.

Wenn nichts anderes angegeben ist, so weisen alle im folgenden beschriebenen Aminosäuren die L-Konfiguration auf. Die Abkürzungen für Aminosäuren, Peptide und ihre Derivate stimmen mit den Empfehlungen der IUPAC-IUB-Nomenklaturkommission überein.

Das Octadekapeptid der Erfindung hat eine länger anhaltende corticotrope Aktivität, was wahrscheinlich auf die Widerstandsfähigkeit gegen die Wirkung von Aminopeptidase zurückzuführen ist. Weiterhin wurde festgestellt, daß die Komplexe des Octadekapeptids eine langanhaltende Aktivität aufweisen.

Im allgemeinen werden Polypeptide nach verschiedenen Verfahren hergestellt, indem die Aminosäurereste nacheinander oder vorher synthetisierte Peptidbruchstücke zu einer angegebenen Sequenz verknüpft werden. Dabei können die Aminosäure oder die Peptideinheit durch bekannte Verfahren mit weiteren Aminosäuren oder Peptidbruchstücken verknüpft werden.

Zur Herstellung des Octadekapeptids der Erfindung und seiner Zwischenprodukte werden alle freien, funktionellen, an der Reaktion nicht teilnehmenden Gruppen vorteilhaft durch Reste geschützt, die leicht durch z. B. Säurehydrolyse, spaltende Hydrierung oder Hydrolyse entfernt werden können. Die Carboxylgruppe wird vorzugsweise durch Veresterung, z. B. mit einem niederen aliphatischen Alkohol, wie Methanol. Äthanol, Propanol, Isopropanol oder lert.-Butanol, oder einem niederen Arylalkylalkohol, wie Benzylalkohol, p-Nitrobenzylalkohol oder p-Methoxybenzylalkohol, oder durch Amidbildung geschützt. Die Aminogruppe wird vorzugsweise durch Gruppen, wie die tert.-Iiutyloxycarbonyl-, die tert.-Amyloxycarbonyl-, die p-Methoxybenzyloxycarbonyl-, die Benzyloxycarbonyl-, die p-Nitrobenzyloxyearbonyl-, die Trityl-, die 2-(p-Diphenyl)-isopropyloxycarbonyl- oder die Formylgruppe geschützt. Zum (>o Schutz der Guanidinogruppe im Arginin wird vorzugsweise die Nitro- oder Tosylgruppe verwendet, jedoch ist es nicht immer notwendig, die Guanidinogruppe des Arginine während der Reaktion zu schützen. Ebenso wird die ε-Aminogruppe des Lysins vor-'ugsweise durch die tert.-Butyloxycarbonyl-, die tert.-Amyloxycarbonyl-, die Benzyloxycarbonyl- oder die 2-(p-DiphenyI)-isopropyloxycarbonylgruppe geschützt. Außerdem wird die y-Carboxylgruppe dei Glutaminsäure vorzugsweise in Form eines niederer Esters, wie den Methyl-, Äthyl-, Propyl- oder tert.-Butylester oder eines niederen Arylalkylesters, wie deri Benzyl-, p-Nitrobenzyl- oder p-Methoxybenzylestei oder durch Amidbildung geschützt. Die Iminogruppe von Histidin kaun z. B. durch die Benzyloxycarbonyl- oder die Benzylgruppe geschützt werden.

Als Kondensationsverfahren für die Bildung dei Peptidbindung können z. B. folgende Verfahren Verwendung finden: das Dicyclohexylcarbodiimidverfahren, das Azidverfahren, das Aktivesterverfahren, ζ. Β mit dem Cyanomethyl-, p-Nitrophenylthiol-, p-Nitrophenyl-, N-Hydroxysuccinimid-, 8-Chinolyl- oder 1-Piperidylester, das gemischte Anhydridverfahren, das N-Carboxyanhydridverfahren, das Tetraäthylpyrophosphitverfahren, das Äthylchlorphosphitverfahren, eine Kombination dieser Verfahren und andere, auf dem Gebiet der Peptidchemie üblicherweise verwendete Verfahren. Das Octadekapeptid kann auch nach der sogenannten Synthese in fester Phase hergestellt werden, bei der die Synthese vom Carboxy I-ende des Peptids ausgeht, das esterähnlich an ein Polymer gebunden ist und die Aminosäuren nacheinander angehängt werden. Alle genannten Verfahren können zur Bildung aller Peptidbindungen des Octadekapeptids der Erfindung und seiner Zwischenprodukte verwendet werden.

Wie vorstehend erwähnt, gibt es eine Reihe von verschiedenen Wegen zur Herstellung des Octadekapeptids aus Aminosäuren oder Peptideinheiten. Zum Beispiel kann nach einem Verfahren das Octadekapeptid dadurch hergestellt werden, daß man ein Dekapeptid der allgemeinen Formel II

R^/ii-Alanyl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-
;-R₂-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-1 arginyl-L-tryptophyl-glycin

in der R₁ eine Aminoschutzgruppe und R₂ eine Carboxylschutzgruppe ist, mit einem Octapeptid der allgemeinen Formel III

N'-Rj-i-Lysy'i-L-prolyl-L-valyl-glycyl-N^£-R₃-L-lysyl-N^£-R₃-L-lysyl-L-arginylargininamid

in der R₃ eine AminoschutTgruppe ist, in einem inerten Lösungsmittel, wie Dimethylformamid, Dimethylsulfoxyd, Pyridin, Dimethoxyäthan, Hexamethylphosphortriamid, Dioxan oder einem Gemisch dieses Lösungsmittels 2 bis 96 Stunden bei Temperaturen von -20 bis 50⁰C in an sich bekannter Weise kondensiert und die Schutzgruppen aus dem erhaltenen Octadekapeptid der allgemeinen Formel IV

Rj-ß-L-Alanyi-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyly-Rj-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-N'^-L-lysyl-L-proly]-L-valyl-glycyl-N^E-R₃-L-lysyl-N^c-R₃-L-lysyl-arginyl-argininamid (IV)

in der R₁, R₂ und R₃ die oben angegebene Bedeutung haben, in an sich bekannter Weise, wie Säurehydrolyse, hydrierende Spaltung oder Hydrolyse, entfernt.

Im folgenden Syntheseschema ist ein bevorzugtes Verfahren für die Herstellung des Octadekapeptids angegeben.

Syntheseschema für das Octadekapeptid

BOC-/J-AIa · OH + H · Tyr · OMe BOC-Ser · OH + H · Met · OMe (V)

BOC-,5-AIa-Tyr-OMe (VI)

NH₂NH, · H₂O

BOC — /?-Ala · Tyr · NHNH₂ (VIfI)

BOC-Ser Met OMe (VII)

H^H

+ H · Ser · Met · OMe (IX)

BOC — /Ϊ-Ala · Tyr · Ser ■ Met · OMe

(X) I

NH₂NH₂ · H₂O

BOC- /J-AIa · Tyr · Ser · Met · NHNH₂ (XI) NO₂

BOC —Arg · Trp · GIy · OMe (XII)

HCOOH NO₂

BOC-Phe · OH + H · Arg · Trp · GIy - OMe (XIII)

NO₂

BOC- Phe · Arg · Trp · GIy · OMe (XIV)

HCOOH

f ¹I °² ·

Z — His · ONP + H · Phe -Arg · Trp · GIy · OMe (XV)

NO₂

OBu¹

Z —His · Phe -Arg - Trp · GIy · OMe (XVI)

(i) OH" (ii) HF

Z—Glu —ONP + H · His · Phe · Arg · Trp · GIy · OH

(XVII)

OBu¹

Ζ — Glu · His · Phe -Arg · Trp · GIy · OH (XVIII)

OBu¹

H - Glu · Hfe · Pfae · Ais -Tfp · GIy OH (XIX)

PCI) + (XIX) (ο

OBu¹

BOC — 0-AIa ■ Tyr · Ser · Met · GIu · His · Phe · Arg · Trp · GIy · OH (XX)

NHS, DCCI OBu¹ BOC

BOCBOC

BOC-ii-Ala-TyrSer-Met-GluHis-Phe-ArgTrp-Gly-ONHS + HLysPro-ValGlyLys-Lys-Arg-Arg-R'

OBu¹

CXXII)

BOC BOC BOC

BOC — 0-Ala · Tyr · Ser · Met ■ GIu · His · Phe · Arg · Trp · GIy · Lys · Pi ο · VaI · GIy · Lys · Lys · Arg ■ Arg · R' CXXIlI)

(i) saure Hydrolyse (ii) Chromatographie an CMC

H — /J-AIa · Tyr ■ Ser · Met · GIu · His · Phe · Arg · Trp · GIy ■ Lys · Pro · VaI · GIy ■ Lys · Lys ■ Arg · Arg · R' (XXIV)

In obigem Schema werden folgende Abkürzungen verwendet:

CMC = Carboxymethylcellulose,

DCCI = N.N'-Dicyclohexylcarbodiimid,

NHS = N-Hydroxysuccinimid,

BOC = tert-Butyloxycarbonyl,

OBu' = terL-Butylester,

R' = NH₂,

Z = Benzyloxycarbonyl,

ONP = p-Nitrophenylester.

Wie aus obigem Syntheseschema hervorgeht, kann das typische N-terminale Dekapeptid der Formel XX tert. - Butyloxycarbonyl - β - alanyl - tyrosyl - serylmethionyl -γ- tert. - butyl - glutamyl - histidyl - p'benylalanyl-arginyl-tryptophyl-glycin, das eine neue Verbindung darstellt und als Zwischenprodukt für die Herstellung des Octadekapeptids der Erfindung ist, hergestellt werden, indem tert.-Butyloxycarbonyl-/i-alanyl-tyrosyl-seryl-nlethionin-hydrazid (XI) mit γ - tert. - Butyl - glutamyl - histidyl - phenylalanylarginyl-tryptophyl-glycin (XIX) nach dem Azidverfahren umgesetzt wird. Das Tetrapeptidhydrazid tert. - Butyloxycarbonyl - β - alanyl - tyrosyl - serylmethionin-hydrazid (XI) ist ebenfalls eine neue Verbindung und als Zwischenprodukt bei der Herstellung des Octadekapeptids der Erfindung wertvoll. Es kann hergestellt werden, indem die tert.-Butyloxycarbonylgruppe mit Hilfe eines Agens, das die tert.-Butyloxycarbonylgruppe einführt, wie tert.-Butylazidformiat, tert.-Butyl-p-nitrophenylcarbonat oder Chlorameisensäure-tert.-butylester, in 0-Alanin eingefilhrt wird, das erhaltene tert-Butyloxycarbonyl-jff-alanin (V) mit Tyrosinmethylester kondensiert wird, der erhaltene Dipeptidmethylester (VT) mit Hydrazinhydrat in das entsprechende Hydrazid (VIII) übergeführt wird, das tert. - Butyloxycarbonyl - β - alanyl - tyrosin - hydrazid nach dem Azidverfahren mit Seryl-methionin-methylester (DC) umgesetzt und der Tetrapeptidester (X) mit Hydrazinhydrat in das entsprechende Hydrazid (XI) übergeführt wird. Das entsprechende tert.-ButyIo χ > carbonyl'/i-alanyl-tyrosyl-serylmethionin kann auf ähnliche Weise, wie oben beschrieben, erhalten werden.

Das Hexapeptid y-tert.-Butyl-glutamyl-histidylphenylalanyl-arginyl-tryptophyl-glycin (ΧΓΧ) ist in Bull. Chem. Soc. Japan., 38, 1148 (1965) beschrieben. Dieses Hexapeptid kann nach einem verbesserten Verfahren synthetisiert werden, was in hohem Maße zur Steigerung der Ausbeute und des Reinheitsgrades bei der Herstellung des Octadekapeptids beiträgt. Das verbesserte Verfahren zur Herstellung des Hexupeptids (XIX) umfaßt die Verwendung von Ameisensäure zur Entfernung der tert-Butyloxycarbonylgruppe von den geschützten Tryptophanpeptiden ohne Zersetzung von Tryptophan und die Verwendung von Fluorwasserstoff zur Entfernung der Nitrogruppe vom Nitroargininrest ohne Beeinträchtigung des säurelabilen Tryptophanrestes. Es ist bekannt, daß in saurem Medium tryptophanhaltige Peptide oft nur in sehr geringer Ausbeute erhalten werden, was auf die Bildung von Nebenprodukten zurückzuführen ist; vgl. HeIv. Chim. Acta, 41, 1867 (1958), und J. Am. Chem. Soc, 82, 2062 (1960). Es ist ebenfalls bekannt, daß die Reduktion eines Nitroargininrestes in einer Peptidkette häufig eine lange Hydrierungszeit erfordert — vgl. Can. J. Chem., 38, 1946 (1960) — und daß die katalytisch^ Reduktion häufig auf der Stufe von Aminoguanidin stehenbleibt; vgl. HeIv. Chim.

Acta, 44, 2042 (1961). Bei der Herstellung des Hexapeptids (XIX) mit den genannten Aminosäureresten gelangt man zu einer hohen Ausbeute ohne Nebenreaktionen, wenn man das verbesserte Verfahren anwendet. Das Hexapeptid (XIX) wird dadurch hergestellt, daß man die tert.-Butyloxycarbonylgruppe des N" - tert. - Butyloxycarbonyl - N° - nitroarginyl - tryptophyl-glycin-methylesters CXII) mit Ameisensäure abspähet, das erhaltene Tripeptid (XIII) mit tert.-Butyloxycarbonyl-phenylalanin nach dem Dtcyclohexyl-

carbodiimidverfahren kondensiert, die tert.-Butyloxycarbonylgruppe aus dem entstandenen Tetrapeptid tert. - Butyloxycarbonyl - phenylalanyl - N° - nitroarginyl-tryptophyl-glycin-methylester (XIV) mit Amei-

309 549/426

sensäure abspaltet, das entstandene Tetrapepiid PCV) mit N",N'^m - Dibenzyloxycarbonyl - histidin - ρ - nitrophenylester zum entsprechenden Pentapeptid N",N'^m - Dibenzyloxycarbonyl - histidyl - phenylalanyl-N^G-nitro-arginyl-tryptophyl-glycin-methylester PiVI) umsetzt, diesen verseift, dann mit Fluorwasserstoff behandelt und hierauf das erhaltene Pentapeptid (XVII) mit N"-BenzyIoxycarbonyl-y-tert.-butyl-glutaminsäure-p-nitrophenylesler kondensiert, und das entstandene N" - Benzyloxycarbonyl - γ - tert. - butylglutamyl - histidyl - phenylalanyl - arginyl - tryptoph ylglycin P(VIII) hydriert.

Bei der vorstehend geschilderten Reaktion wird die Abspaltung der tert.-Butyloxycarbonylgruppe mit Ameisensäure während etwa 2 bis 4 Stunden bei Temperaturen von etwa 20 bis 60" C unter Verwendung von etwa der 5- bis 15fachen Gewichtsmenge Ameisensäure, bezogen auf das tert.-Buty'oxycarbonylpeptid, durchgeführt. Die Nitrogruppe wird durch Lösen des Nitroarginylpepiids in Fluorwasserstoff (etwa der 5- bis lOfachen Gewichtsmenge des Peptids) und 30-bis 60n.^:nutiges Stehenlassen der Lösung bei Temperaturen von etwa 0 bis 25°C entfernt.

Das typische C-terminale Octapeptid der allgemeinen Formel

NMert.-Butyloxycarbonyl-lysyl-prolyl-valyl-

glycyl-NMert-butyloxycarbonyl-lysyl-N'-

tert.-butyloxycarbonyl-lysyl-arginyl-Y,

in der Y ein Argininamidrest ist, kann nach dem in Bull. Chem. Soc. Japan., 39, 882 (1966), beschriebenen Verfahren hergestellt werden. So kann das Octadekapeptid dadurch hergestellt werden, daß man tert. - Butyloxycarbonyl - β - alanyl - tyrosyl - serylmethionyl - γ - tert. - butyl - glutamyl - histidyl - phenylalanyl-arginyl-tryptophyl-glycin mit N^e-tert.-Butyloxycarbonyl-lysyl-prolyl-valyl-glycyl-N'-tert.-butyloxycarbonyl - lysyl - N^e - tert. - butyloxycarbonyl - lysylarginyl-Y, in dem Y die oben angegebene Bedeutung hat, nach dem Dicyclohexylcarbodiimidverfahren, dem N-Hydroxysuccinimidesterverfahren oder einer Kombination dieser Verfahren während 2 bis 96 Stunden bei Temperaturen von - 20 bis 50° C umsetzt und alle Schutzgruppen aus dem erhaltenen geschützten Octadekapeptid tert. - Butyloxycarbonyl - ß- alanyl - tyrosylseryl - methionyl - γ - tert. - butyl - glutamy! - histidylphenylalanyl-arginyl-tryptophyl-glycyl-NMert.-butyloxycarbonyl - prolyl - valyl - glycyl - N^e - tert. - butyloxycarbonyl - lysyl - lysyl - Ν^ε - tert. - butyloxycarbonyllysyl-arginyl Y, in dem Y die oben angegebene Bedeutung hat, in einem sauren Medium, wie einem Halogenwasserstoff, einer Halogenwasserstoffsäure, Trifluoressigsäure, Ameisensäure, Essigsäure oder einem Gemisch derselben bei Temperaturen von etwa —10 bis 40⁰C in einer Reaktionszeit von 10 bis 90 Minuten entfernt

Nach einem anderen Verfahren kann das Octadekapeptid durch Kondensation des Tetrapeptide tert. - Butyloxycarbony! - β - alanyl - tyrosyl - serylmethionin mit einem Tetradekapeptid der allgemeinen Formel γ - tert. - Butyl - ghitamyl(oder glutaminyl)-histidyl - phenyl - alanyl - arginyl - tryptophyl - glycyl-N" - tert. - butyloxycarbonyl - lysyl - prolyl - valylgfycyl-NMert.-butyloxycarbonyl-lysyl-NMert.-butyloxycarbonyl-lysyl-arginyl-Y, in der Y die oben angegebene Bedeutung hat, in bekannter Weise hergestellt werden.

Ebenso erhält man das Octadekapeptid der Erfindung, indem man tert.-ButyloxycarDonyl-/S-alanyltyrosyl - seryl - methionyl - γ - tert. - butyl - glutamylhistidyl - phenylalanyl - arginyl - tryptophyl - glycyl-N^e - tert. - butyloxycarbonyl - lysyl - prolyl - valyl - glycin mit N^c- tert. - Butyloxycarbonyl - lysyl - N^c- tert. - buty 1-oxycarbonyl-lysyl-arginyl-Y, in dem Y die oben angegebene Bedeutung hat, in bekannter Weise kondensiert.

■ o Alle bei diesen Verfahren verwendeten Schutzgruppen können durch katalytische Reduktion, Reduktion mit Natrium in flüssigem Ammoniak, Hydrolyse oder Behandlung mit einem sauren Medium, wie Trifluoressigsjure, Essigsäure, Ameisensäure, einem Halogenwasserstoff, z. B. Fluorwasserstoff, Bromwasserstoff oder Chlorwasserstoff, einer Halogenwasserstoffsäure, z. B. Fluorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure oder Chlorwasserstoffsäure, oder ein Gemisch dieser Verbindungen, entfernt werden.

Das nach den vorstehenden Verfahren hergestellte Octadekapeptid kann nach bekannten Verfahren, wie Säulenchromatographie mit Ionenaustauscherharzen, lonenaustauschercellulose oder Sephadexionenaustauscher oder Gegenstromverteilungsverfahren gereinigt werden.

Je nach den verwendeten Reaktionsbedingungen erhält man das Octadekapeptid der Erfindung in Form der freien Base oder seines Salzes mit einer Säure. Diese Salze können hergestellt werden, indem man das Octadekapeptid mit einer anorganischen Säure, wie einer Halogenwasserstoffsäure, z. B. Fluorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure oder Chlorwasserstoffsäure, einem Halogenwasserstoff, z. B. Chlorwasserstoff. Bromwasserstoff oder Fluorwasserstoff. Schwefelsäure oder Phosphorsäure, oder mit einer organischen Säure, wie Essigsäure, Ameisensäure, Propionsäure, Glykolsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure, Oxalsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Weinsäure, Citronensäure.

Benzoesäure, Zimtsäure, Methansulfonsäure, Benzolsulfonsäure oder Toloulsulfonsäure in bekannter Weise umsetzt.

Das Octadekapeptid zeigt ausgeprägte biologische Aktivität, z. B. eine stimulierende Wirkung auf die Nebennierenrinde, lipolytische und melanozytenstimulierende Wirkung, die höher ist, als die von natürlichem Corticotropin und von verwandten, bekannten Peptiden.
Das Octadekapeptid der Erfindung ist deshalb besonders bei der Behandlung von akutem und chronischem Gelenkrheumatismus und allergischen Krankheiten verschiedener Organe von Tieren und Menschen wertvoll. Verschiedene pharmakologische Eigenschaften des Octadekapeptids sowie dessen biologische

SS Daten sind nachstehend angegeben.

Die corticotrope Aktivität des Octadekapeptids der Erfindung wurde nach fünf verschiedenen Verfahren bestimmt, wobei als Vergleichssubstanzen natives Schafcarticotropin (0,-ACTH)₅ACTH(I-IS)-Nh₂ und

GIy-ACTH(I-IS)-NH₂ dienten. Die ascorbinsäureentziehende Aktivität der Nebennierenrinde von hypophysenektomierten Ratten wurde nach dem in United States Pharmacopeia XVlI, 147 (1965), beschriebenen Verfahren bestimmt. Die in vitro-steroidbildende

Gs Aktivität wurde nach dem Verfahren von Saffran und S c h a 11 y (Endoerinol, 56,523 [1955]) bestimmt. Die in vivo-steroidbüdende Aktivität bei intravenöser Verabreichung an hypophysenektomierte Ratten wur-

de nach dem Verfahren von L i ρ s c ο m b und Nelson (Endocrinol., 71, 13 [1962]) mit einer kleineren Modifikation (A. Tanaka und C. H. Li, Endocrinol. Japonica, 13, 180 [1966]) bestimmt. Die in vivo-steroidbildende Aktivität wurde auch an der mit Dexamethason-Pentobarbital betäubten Maus bestimmt (A. T a η a k a und N. Nakamura, »Integrative mechanism of neuroendocrine system«, Hokkaido University Medical Library Series, Vol. 1, 49 [1968]). Zusätzlich wurde die steroidbildende Aktivität bei intramuskulärer Verabreichung an hypophysenektomierte Ratten bestimmt, wobei ein Präparat von 0,05 ml/Ratte in den Rattenschenkelmusk :1 injiziert wurde und 30 Minuten nach der Injektion eine Blutprobe aus der abdominalen Aorta entnommen wurde.

Während des ganzen Experimentes wurde der »Third USP Corticotropin Reference Standard« als Standard verwendet und die Bildung von 11-Hydroxycarticosteroiden (11-OHCS) nach dem fluoreometrischen Verfahren von Peterson (J. Biol. Chem., 225, 25 [1957]) bestimmt. Bei jedem Bestimmungsverfahren wurden üblicherweise mehrere Messungen durchgeführt, und die unabhängig voneinander erhaltenen Werte wurden nach dem statistischen Verfahren von Sheps und Moore ausgewertet (J. Pharmacol. Extl. Therap., 128, 99 [I960]). Die Ergebnisse dieser Bestimmungen mit dem Octadekapeptid der Erfindung werden im folgenden mit den Ergebnissen von bekannten Corticotropinpeptiden und von natürlichem Corticotropin verglichen.

Tabelle I
Adrenocorticotrope Aktivitäten von Schafcorticotropin und verwandten, synthetischen Octadekapeptiden

Verfahren

Adrenale ascorbinsäureentziehende Wirkung

In vitro-Steroidgenese

In vivo-Stero.dgenese

In vivo-Steroidgenese bei
mit Dexamethason-Nembutal

betäubter Maus

peripherem Blut von hypophysenektomierter Ratte

Verabreichungsart

subkutan

in vitro

intravenös

intravenös

intramuskulär Peptid

la

45,4
13,7
92,0

Ib

25,6
20,8
167

70 bis 168

35,4

135

237

125 bis 285

259

124

«,-ACTH

120

120

100 bis 180

Anmerkung · Die Aktivitäten werden ausgedrückt in USP-Einheiten/mg, in bezug auf den »Third USP Corticotropin Reference Standard«. Die Abkürzungen bedeuten: Ia = ACTH(I-18)—NH₂₁Ib = Gly¹—ACTH(I-18)—NH₂,! = (/5-Ala¹)—ACTH(I-18)—NH„«, = natives Schafcorticotropin.

Wie aus Tabelle I hervorgeht, hat das Octadekapeptid 1 der Erfindung in jeder Beziehung eine hohe nebennierenstimulierende Aktivität. Die in vivosteroidbildende Aktivität von Peptid I liegt bei intravenöser Verabreichung in der gleichen Größenordnung wie Ia und Ib und a_s-ACTH. Jedoch weist das Peptid I eine auffallend höhere Aktivität als Ia und Ib auf, wenn sie durch die in vitro-Steroidgenese und den adrenalen Ascorbinsäureentzug bestimmt wird. Außerdem ist es bemerkenswert, daß das Verhältnis von subkutaner Verabreichung oder bei in vitro-Bestimmung zur intravenösen Verabreichung für das Peptid I den Wert 1:0,5 ist, während die Verhältnisse für die Peptide Ia und I b den Wert 1:7 bzw. 1:8 haben. Peptid I gleicht in dieser Hinsicht mehr als Ia und Ib dem nativen Hormon (O₅-ACTH), welches das Verhältnis 1:1 aufweist.

Fig. 1 zeigt, daß (0-AIa¹J-ACTH(I-IS)-NH- (I) langer aktiv bleibt als Gly*-ACTH(1-18)-NH_: (Ib) und natürliches ACTH, wenn die Peptide I und I b in einer Dosis von 5 ^g/Ratte (1 mg Peptid/ml) und natürliches ACTH (J 25 Millieinheiten) intramuskulär in den Schenkelmuskel von hypophysenektomierten Ratten injiziert werden, wobei die steroidbildende Aktivität durch den 11-Hydroxycorticosteroid-(11-OHCS)-Spiegel im Plasma ausgedrückt wird.

Das Octadekapeptid O?-Ala')-ACTH(1-18)-NH₂ [I) weist eine ausgeprägt hohe lipolytische Aktivität auf, die in Tabelle II mit den Aktivitäten von synthetischen Peptiden verglichen wird: ACTH(I-18) NH₂ tfa), CRy¹-ACTH(l-lS)-NH₂ (Ib) und Schafcorticotropin (α,-ACTH).

Tabelle II

In vitro-lipolytische Aktivität von natürlichem

Corticotropin und verwandten synthetischen

Octadekapeptiden

	Minimale wirksame Dosis	6 mg/50 mg Gewebe)	1	«,-ACTH
	(10-	Ib
	Ia		0,62	6,0
Adipöses		6,3
Rattengewebe....	3,0		0,065	7,1
Adipöses		0,35
Kaninchengewebe	0,004
Verhältnis			10	1
Ratte/Kaninchen		20
(annähernd)	750

Anmerkung: Die lipolytische Aktivität wurde nach dem von T a η a k a et al beschriebenen Verfahren (Arch. Biochcm. Biopbys, 99. 294 [19621) mit Rattenepitfdymal- und Kaninchenperirenalfett gewebe bestimmt. Das Ansteigen der Konzentration von f. ei en Fettsäuren im Medium und im Gewebe dient als Parameter. Die Aktivität wird ausgedrückt durch die minimale wirksame Dosis pro 50 mg Gewebe.

Wie aus Tabelle II hervorgeht, ist die lipolytische Aktivität des Octadekapeptids I der Erfindung ungeföihr lOmal größer als die von Ia, Ib und α,-ACTH, wenn sie an der Ratte bestimmt wird Im Vergleich zur Ratte kann beim Kaninchen eise geringere Menge von Peptid I die gleiche Aktivität ausüben. Dasselbe Verhältnis wird bei den anderen Peptiden Ia und Ib beobachtet. Es ist jedoch festzustellen, daß das Ver-

3644

hältnis der minimalen wirksamen Dosis beim Fettgewebe der Ratte zur Dosis beim Fettgewebe des Kaninchens für das Peptid I kleiner ist als für Ib und Ia. Dies bedeutet, daß das Peptid I der Erfindung dem natürlichen Hormon verwandter ist als die Peptide I a und Ib.

Die Fig. 2 und 3 geben die Inaktivierung von Peptid I und Ib als lipolytische Mittel in frischem Plasma und in Puffer, der Bruchstücke von Rattenmuskulator enthält, wieder. Dabei wurde im Fall von Plasma kein signifikanter Unterschied zwischen Peptid I und I b festgestellt, während im Gewebe die Inaktivierung von Peptid I gegenüber der von Ib merklich verzögert war. Die Inaktivierung der lipolytischen Aktivität durch Plasma und durch Gewebe wurde auf folgende Weise durchgeführt. Eine Peptidprobe wurde in frischem Plasma von betäubten Ratten oder in Krebs-Ringer-Bicarbonatpuffer gelöst, der Rinderserumalbumin, Bruchstücke von Rattenschenkelmuskulatur und Glucose enthielt. Das Gemisch u>

wurde dann bei 37° C inkubiert und die lipolytische Aktivität nach dem oben angegebenen Verfahren nach Inkubationszeiten von 0,5, 1, 2 und 4 Stunden bestimmt.

Die biologische Halbwertszeit von (/f-Ala¹)-ACTH(1-18)-NH₂ (I), das intravenös hypophysenektomierien Ratten mit einem Gewicht von 200 bis 250 g injiziert worden war, wurde bestimmt. Zu verschiedenen Zeiten nach der Injektion wurden Blutproben aus der abdominalen Aorta entnommen. Das abgetrennte Plasma wurde auf einen pH-Wert von 4 bis 5 mit 1 η-Salzsäure eingestellt, und als Parameter für die verbleibende biologische Aktivität im Plasma wurde die in vitro-lipolytische Aktivität unter Verwendung von epidymalem Rattenfettgewebe, wie oben erwähnt, bestimmt Die Ergebnisse sind im Vergleich zu den lipolytischen Aktivitäten von natürlichem Corticotropin (ACTH) und GIy¹-ACTH(I-18)-NH₂ (Ib) in folgender Tabelle wiedergegeben.

	Zeit nach	viiro-lipolytische Aktivität	Tabelle III	± 0,028	(100%)	Erzeugung von freien Fettsäuren, u Äq,100 mg	0,179	±	I	(100%)
	Injektion,			± 0,447	(83%)		2,148	±	0,076	(49%)
In	Minuten			± 0,556	(77%)		1,140	±	0,i28	(29%)
	0			± 0,337	(77%)		0,751	±	0,099	(32%)
0,5			± 0,364	(33%)		0,815	±	0,053	(13%)
1	von (S-AIa1U-ACTH(I-IS)-NH2, GIy1-ACTH(I-IS)-NH2	± 0,180			0,431	±	0,090	(16%)
2	und natürlichem Corticotropin (intravenöse Injektion)	—	(9%)		0,487	±	0,079	(17%)
4		± 0,056	(3%)		0,512	±	0,J80
8		± 0,028				0,055
12						—
16
32	natürl. ACTH
	0,129
	3,082	Ib
	2,587	0,094 ± 0,016
	2,409	3,004 ± 0,236 (100%)
	2,396	1,217 ± 0,139 (39%)
	1,108	1,622 ± 0,239 (53%)
		0,777 ±0,113 (24%)
	0,380	0,243 ± 0,087 (5%)
	0,212	C252 ± 0,063 (5%)
	0,263 ± 0,079 (6%)
	—

Anmerkung: Die Zahlen in Klammern sind die relativen Aktivitäten in bezug auf den 0,5-Minuten-Wert für jedes Hormon.

Aus den oben angegebenen Werten wurde die Halbwertszeit von natürlichem ACTK, Ib und I der lipolytischen Aktivität zu 266 Sekunden, 117 Sekunden bzw. 188 Sekunden bestimmt. Eine Darstellung der lipolytischen Aktivität dieser Peptide ist in F i g. 4 gegeben. Es ist ersichtlich, daß (/3-AIa¹J-ACTIh(I-IS)-NHj (I) im Plasma signifikant länger als GIy^ACTH(I-IS)-NH₂ (Ib) beständig ist.

In ähnlicher Weise wurde die biologische Halbwertszeit von I bei intramuskulärer Injektion an hypophysenektomierten Ratten gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV und in F i g. 5 wiedergegeben.

Tabelle IV

Lipolytische Aktivität von natürlichem Corticotropin (ACTH), Ο1/-ΑΰΤΗ(1-18)-ΝΗ₂ (Ib)
und (/J-AIa¹ )»ACTH(I-18)-NH₂ (I) bei intramuskulärer Injektion

Zeit nach	natürl. ACTH	(48,5%)	(68,6%)	Erzeugung von freien Fettsäuren, μ Aq/100 mg	(57,7%)	0,193	±	1	(100%)
Injektion,	0,097 ± 0,032	(93,9%)	(56,7%)		(100%)			0,060	(54,9%)
Minuten	0,922 ± 0,540	1,797 ± 0,392 (100%)	(22,2%)		(50,9%)			—	(97,9%)
0	1,693 ± 0,356	1,264 ± 0,320	(6,6%)		(56,2%)	3,630	±	—	(92,8%)
2		1,061 ± 0,396		(64,5%)	2,080	±	0,631	(49,0%)
5	0,474 ± 0,302		(45,0%)	3,558	±	0,285
10	0,209 ± 0,056			3,382	±	0,407
20			1,876	±	0,542
30					0,337
60
90
	Ib
	0,033 ± 0,033
	—
1,772 ± 0,322
3,047 ± 0,229
1,568 ± 0,235
1,727 ± 0,429
1,977 ± 0,098
1,390 ± 0,121

Anmerkung: Die Zahlen in Klammern geben die relative lipolytische Aktivität in bezug auf den 10-Niinuten-Wert nach der Injektion für jedes Hormon wieder.

Die Halbwertszeit von ACTH, Ib und 1 wurde zu 1389,4516 bzw. 4516 Sekunden bestimmt. Es ist festzustellen, daß die Halbwertszeit des Octadekapeplids I der Erfindung ungefähr u eimal so lang ist, wie die von natürlichem Corticotropin, wie aus F i g. 5 hervorgeht. >

DieAngreifbarkeitvont/J-Ala¹ >-ACTH(l -18)-NH, (I) durch Schweinenieren-Leucinaminopeptidase (LA P) wurde mit der von ACTH(1-18)-NH₂ (Ia) und GIy-ACTH(I-IS)-NH₂ ab) verglichen.

Fig. 6 zeigt die Wirkung von mit Diisopropylfluorphosphat (DFP)-behandelter Aminopeptidase auf die Peptide I, Ia und Ib. Aus Fi g. 6 geht hervor, daß das Octadekapeptid I der Erfindung über einen längeren Zeitraum hinweg als die bekannten Peptide Ia und Ib ohne eine rasche Inaktivierung durch einen Angriff der Aminopeptidase im Gewebe beständig bleibt, weswegen das Peptid I für therapeutische Zwecke sehr wertvoll ist. Die Untersuchungen der Angreifbarkeit der synthetischen Peptide werden im folgenden näher beschrieben.

Es war in Vorversuchen festgestellt worden, daß ein Präparat von handelsüblicher LAP (^-AIa¹)-ACTH(I-IO)-OH. das aus dem entsprechenden geschützten Dekapeptidtert.-ButyIoxycarbona!-/S-alap > 1-tyrosyl - seryl - methionyl - > - tert - butyl - glutamylhistidyl-phenylalanyl-arginyl-tryptophyl-glycin (XVl) durch Behandlung mit Ameisensäure hergestellt u urde. und M-AIa¹ )-ACTH(l-18>-NH₂ (I), aber nicht /f-AIanyl tyrosyl-seryl-methioninhydra/id, das aus tert. - Biityloxycarbonyl - β - alanyl - tyrosyl - seryl- v> methionin-h vdrazid (Vll)durch Behandlung mit Ameisensäure hei gestellt wurde, hydrolytisch spaltet. Durch einen Aminosäureanalysator wurde in den en/jmatischen Spaltprodukten kein /ϊ-Alanin entdeckt. Deshalb muß die beobachtete Hydrolyse auf die Gegen- 3s wart einer Endopeptidasenverunreinigung in der LAP-Präparation zurückzuführen sein. Diese scheinbare Empfindlichkeit von /J-Alanylpeptiden gepenüber dem LAP-Präparat verschwand vollständig, wenn das Enzympräparat vorher mit Diisopropylfluorphosphat (DFP) behandelt worden war. Durch die DFP-behandelte LAP wurde das Ser'-Peptid (la) schneller als das Gly'-Peptid (Ib) hydrolysiert, während am /S-AIa¹-Peptid (I) innerhalb der Meßgenauigkeit keine Hydrolyse beobachtet wurde.

Die DFP-behandelte LAP wurde dadurch erhalten, daß man eine Suspension des Enzyms in zu 75° 0 gesättigter Ammoniumsulfatlösung bei 4° C gegen eine 0,005-m Magnesiumchloridlösung dialysierte, die 5 mg Enzym enthaltende LA P-Suspension mit 0,0005-m Tris-Puffer auf das fünffache verdünnte, die verdünnte Enzymlösung mit 0,08 ml l-m Diisopropylfluorphosphat in Isopropanol versetzte, das Gemisch 45 Minuten bei 37°C inkubierte und dann das Gemisch bei 4°C gegen 0,0005-m Tris-Puffer dialysierte

Die LAP-Aktivität der Enzymlösung wurde bei einem pH-Wert von 8,3 und 25°C gemäß Tuppy et al (Z. Physiol. Chem. 329, 278 [1962]) mit einigen Modifikationen unter Verwendung von L-Leucinp-nitroanilid (LNA) als Substrat bestimmt. Eine LAP-Einheit wurde vorläufig als die Enzymmenge definiert, die bei 400 ηΐμ gegenüber einer Leercuvette einen Extinktionszuwachs von 0,001 pro Minute erzeugt. Es wurden 1-cm-Cuvetten in einem Hit:achi-Spektrophotometer verwendet. fts

Für die Messungen der Spaltung des synthetischen Substrates durch LAP wurde ein Gemisch aus 1 Teil O,lmillimolarer Lösung des Substrates in Wasser, 1 Teil 0,05-m Tris-Puffer vom pH-Wert 8,3 und ein halben Teil Enzym (4,88 Einheiten/ml LNA al Substrat) bei 37° C inkubiert. Aus dem inkubiertei Gemisch wurden 0,5 ml Proben entnommen und so fort mit jeweils 0,5 ml Ninhydrin-Reagens vermisch! Das Gemisch wurde dann im kochenden Wasserbai 15 Minuten lang erhitzt. Nach dem Abkühlen un< geeignerer Verdünnung mit 50%igem Äthanol wurdi die Absorption bei 570 πΐμ mit einem Hitachi-Spektro photometer gemessen. Bei jeder Durchführung de; Versuchs wurden zur Kontrolle Inkubatioßjgemisctu ohne Substrat oder ohne Enzym bestimmt. Bei da Ninhydrinreaktion wurde auch eine Standardlösuni von L-Leucin jeweils als Bezug getestet. Die Ergebnisse der enzymatischen Spaltung der Peptide I, Ia und It durch DFP-behandelte LAP sind in Fig. 6 wiedergegeben, wobei die Aminosäurefreisetzung als Leucinkonzentration angegeben ist.

Die Bestimmung der in vitro-melanozytenstimulierenden Aktivität von (^f-AIa¹ J-ACTH(I-18)-NH₂ wurde nach einem von K. Shizume.A. B. Lerner und T. B. Fitzpatrick (Endocrinol., 54, 553 [1954]) angegebenen Verfahren unter Verwendung von Rana pipiens als Versuchstier durchgeführt, wobei mit den Aktivitäten von GIy^ACTH(I-IS)-NH₂ und ACTHd-24)-OH (Synacthen®. Ciba Co.,) verglichen wurde. Als Bezugswert wurde natürliches reines a-melanozytenstimulierendes Hormon (a-MSH) verwendet. Die Ergebnisse sind in Tabelle V wiedergegeben.

Tabelle V

In vitro-iTielanozytenstimulierende Aktivität von MH(MS)-NH₂, Giy-ACTHdlSN undACTH(l-24)-OH

Verbindung

(/?-Ala')-ACTH(l-18)-NH₂
Gly'-ACTHd-l S)-NH₂...
ACTH(I-24)-OH

MSH-Aktivität, Einheiten/g

9,6

6,7 2,1

10° 10" 10⁸

Die melanozytenstimulierende Aktivität von (/MACTHd-iej-NHj ist auffallend höher als die von GI^-ACTH(I-IS)-NHj undACTH(l-24)-OH. Da natürliches Schweinecorticotropin nach R. G. S h e ρ h e r d et al, (J. Am. Chem. Soc, 78,5051 [1956]) eine melanozytenstimulierende Aktivität von 1,7· 10 Einheiten/g aufweist, ist die melanozytenstimulierende Aktivität von (0-Ala')-ACTH(l-18)-NH₂ der Erfindung ungefähr 50tnal so groß wie die von natürlichem Schweinecorticotropin.

Das Octadekapeptid der Erfindung kann in die entsprechenden Schwermetallkomplexe, z. B. mit Zinkchlorid, Zinkhydroxid, Zinkacetat, Zinksulfat, Kupferchlorid, Nickelchlorid, Kobaltchlorid oder Eisenchlorid, in Komplexe mit Polyaminosäuren, ζ. Β. Poly-L-g!utaminsäure, Poly-D-glutaminsäure, PoIy-DL-glutaminsäure, Poly-L-asparaginsäure, PoIy-D-asparaginsäure, Poly-DL-asparaginsäure oder Copoly-L-glutamyl-Tyrosin oder in gemischte Komplexe übergeführt werden, die eine länger anhaltende Aktivität im Blut als das freie Octadekapeptid zeigen. Wenn z. B. ein Zinkkomplex von (/3-AIa¹ )-ACTH(1-18)-NH₂₎ der aus 0,5 mg Peptid, 0,25 ml

einer 40mfltimolaren Zinkchloridlösung, 4,5 mg Natriumchlorid und 0,25 ml einer 40millimolaren Dinatriumhydrogenphosphatlösung besteht, durch intramuskuläre Injektion an Ratten in einer Dosis von 5 μΙ/Ratte verabreicht wurde, betrug die Menge an ll-Hydroxycorticosteroid im Plasma 2 Stunden nach der Injektion 80 μg/ml, während im Fall einer Präparation ohne Zinkchlorid nur 6 ^g/ml Corticosteroid gefunden wurden. Deshalb ist es vorteilhaft, diese Komplexe für therapeutische Zwecke zu verwenden. Man erhält diese Komplexe, indem man das Octadekapeptid mit einer Schwermetallverbindung oder einer Polyaminosäure oder einem Gemisch derselben in einem Gewichtsverhältnis von etwa 1:0,1 bis 20 unter schwach sauren Bedingungen, insbesondere bei einem pH-Wert von 6,5 bis 7,0, behandelt. Bei der Behandlung von Polyaminosäuren beträgt das bevorzugte Molekulargewicht der Polyaminosäuren etwa 1000 bis 100000, insbesondere 2000 bis 6000. Bei der Herstellung der Komplexe können gegebenenfalls geeignete Träger, Konservierungsmittel, Puffer, Stabilisatoren und isotonisierende Verbindungen zugesetzt werden.

Das Octadekapeptid der Erfindung, seine Salze mit Säuren und Komplexe kann oral oder parenteral in üblichen Darreichungsformen verabreicht werden, z. B. als Injektionspräparate, Flüssigkeiten, Suspensionen, Emulsionen, Aerosole oder Tabletten, im Gemisch mit Trägern, Stabilisatoren, Emulgatoren, Konservierungsmitteln, Puflern, isotonisierenden Verbindungen und/oder Netzmitteln.

Die wirksame Dosis kann von Ärzten leicht unter Zugrundelegung der hier angegebenen Werte bestimmt werden. Zum Beispiel beträgt eine typische klinische Dosis des Octadekapeptids der Erfindung ungefähr 0,2 bis 0,8 Einheiten/kg fur eine normale erwachsene Person. Das OUadekapeptid der Erfindung wird vorzugsweise in Form eines Injektionspräparates verabreicht.

Die Beispiele erläutern die Erfindung. In den Beispielen verhalten sich Gewichtsteile zu Volumteilen \vie Gramm zu Millimeter.

Beispiel 1

Herstellung von

N^e-tert.-Butyloxycarbonyl-0-alanyl-tyrosylseryl-methionin-hydrazid (XI)

1. N"-tert.-Butyloxycarbonal-/}-aianin (V)

8,91g /9-Alanin werden in 100 ml 1 n-Natriumhydroxydlösung gelöst. Die Lösung wird mit 21 g Natriumhydrogencarbonat und 70 g Dioxan versetzt. Die Lösung wird bei 50 C gerührt, und eine Lösung von 17,2 g Azidameisensäure-tert.-butylester in 30 ml Dioxan wird tropfenweise zugesetzt. Das Gemisch wird 41,5 Stunden bei der gleichen Temperatur gerührt und hierauf unter vermindertem Druck auf etwa 100 ml eingedampft. Die konzentrierte Lösung wird mit Eis gekühlt und mit 180 ml 4 η-Salzsäure auf pH 2 eingestellt. Die Lösung wird mit ungefähr 100 ml eiskaltem Essigsäureäthylester ausgeschüttelt, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck bis zu einem sirupösen Rückstand eingedampft. Der Rückstand wird aus Essigsäureäthylester/Petroläther kristallisiert Man erhält 12,6 g des gewünschten Produktes vom K 77 bis 78°C.

QH₁₅NO₄:

Berechnet
gefunden .

C 50,78, H 7,99, N 7,40;
C 50,99, H 8,06, N 7,47.

2. N*-tert-Butyloxycarbonyl-/S-alanyliyrosin-methylester (VI)

3,48 g Tyrosinmethylester-hydrochlorid werden in 15 ml Wasser gelöst. Die Lösung wird mit 5 ml

ίο 50%iger Kaliumcarbonatlösung unter Eiskühlung versetzt, und das Gemisch wird bei 4° C 40 Minuten stehengelassen. Die gebildeten Kristalle werden abfiltnen, mit kaltem Wasser gewaschen und im Exsikkator getrocknet. Man erhält 2,55 g Tyrosinmethylester.

Andererseits werden 1,89 g des oben erhaltenen N^e-tert.-Butyloxycarbonyl-/?-alanins in wasserfreiem Tetrahydrofuran gelost. Die Lösung wird auf - 10⁰C abgekühlt. Diese Lösung wird anschließend langsam und unter Rühren mit 2,04 g n-tert.-Butyldmin und 1,19 g Chlorameisensäureäthylester versetzt. Nach 10 Minuten wird eine Suspension von 1,95 g des oben erhaltenen Tyrosinmethylesters in 2ü ml wasserfreiem Tetrahydrofuran zugesetzt. Das Gemisch wird 30 Minuten bei -10⁰C und 2,5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wird das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abgedampft. Der erhaltene Rückstand wird in Essigsäureäthylester gelöst, anschließend mit 1 η-Salzsäure, Wasser, 5%iger Natriumhydrogencarbonatlösung und Wasser gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels durch Eindampfen unter vermindertem Druck wird der erhaltene Rückstand zur Ausfällung von Kristallen mit Äther versetzt.

Man läßt 20 Stunden stehen, filtriert die gebildeten Kristalle ab und trocknet im Exsikkator. Man erhält 2,99 g des Dipeptidesters. Nach dem Umkristallisieren aus Methanol/Äther erhält man Kristalle vom F. 141 bis 142°C; [α]? = +8,2±0,5° (c = 1,020, Methanol).

Q₈H₂₆N₂O₆:

Berechnet .
gefunden ..

C 59,00, H 7,15, N 7,65;
C 59,03, H 7.12, N 7,63.

3. N"-tert.-Butyloxycarbonyl-/i-alanyl-tyrosinhydrazid (VIII)

2,56 g NMert-Butyloxycarbonyl-zi-alanyl-tyrosinraethylester (VI) werden in 26 ml wasserfreiem Ä thanol gelöst. 1,7ml Hydrazinhydrat werden der lösung zugesetzt, und das Gemisch wird 5 Stunden bei Raumtemperatur und 20 Stunden bei 4° C gehalten. Die gebildeten Kristalle werden abfiltriert, mit Äthanol und Äther gewaschen und getrocknet. Man erhält

2,54 g des gewünschten Dipeptid-hydrazids. Nach dem Umkristallisieren aus heißem Wasser erhält man Kristalle vom F. 213,5 bis 215°C; [a]|? = +3,6±0,6° (c = 0,978, 50%ige Essigsäure).

_to C₁₇H₁₆N₄O₅:

Berechnet .
gefunden ..

C 55,72, H 7,15, N 15,29;
C 55,74, H 7,11, N 15,30.

4. N"-tert.-Butyloxycarbonyl-/}-alanyl-tyrosylseryl-methionin-methylester (X)

1,10g NMert-Butyloxycarbonyl-j3-aianyl-tyrosinhydrazid (VIII) werden in 7,5 ml kalter 1 n-Salzsäure gelöst. Die Lösung wild bei ungefähr — 10⁰C gehalten

und mit 3,6 ml 2-m kalter Natriumnitritlösung versetzt. Man läßt das Gemisch 4 Minuten stehen, schüttelt das entstandene Azid mit Äther aus, wäscht mit 1-m Natriumhydrogencarboiiatlösung und trocknet übei wasserfreiem NatiisiTnsulfat. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels durch Eindampfen unter vermindertem Druck bei einer Badtemperatur von ungefähr 10° C wird der entstandene Rückstand in kaltem Acetonitril gelöst Man gibt 0,756 g Serylmeiüionin-methylester (IX) zu, der nach den Vor-Schriften der Literatur: Bull. Chem. Soc. Japan, 39, 1171 (1966), hergestellt wurde, und läßt das Gemisch 48 Standen stehen. Das Lösungsmittel wird durch Eindampfen unter vermindertem Druck entfernt, und der Rückstand wird durch Zugabe von Essigsäureäthylester und portionsweise Zugabe von Wasser gelöst. Die Lösung wird anschließend mit 1-n kalter Salzsäure, Wasser, 5%^:;;er Natriujihydrogencarbonatlösung und Wasser gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels durch Eindampfen unter vermindertem Druck wird das entstandene gelatinöse Produkt abfiltriert, mit kaltem Essigsäureäthylenester und Äther gewaschen und getrocknet. Man erhält 1,20 g des gewünschten Tetrapeptidmethylesters. Das Produkt wird durch Umfallen aus Essigsäureäthylester gereinigt. F. 121,5 bis 123°C. [a] S³ = -13,0 ± 0,6^c (c = 0,997, Methanol) Rf 0,53 (bei Dünnschichtchromatographie im Lösungsmittelsystem Methanol zu Essigsäure = 15:85).

C₂₆H₄₀N₄O₉S:

Berechnet ... C 52,41, H 6,90, N 9,58, S 5,48;
gefunden .... C 52,94, H 6,85, N 9,65, S 5,48.

5. N"-tert.-Butyloxycarbonyl-/S-alanyl-tyrosylseryl-methionin-hydrazid (XI)

0,97 g N"-tert.-ButyIoxycarbonyl-/3-alanyl-tyrosylseryl-methionin-methylester (X) werden in 6 ml Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird mit 0,5 ml Hydrazinhydrat versetzt, und das Gemisch wird 43 Stunden bei 4° C stehengelassen. Die Lösung wird mit Essigsäureäthylester versetzt. Es entsteht ein gelatinöses Produkt, das abnitriert, mit kaltem Essigsäureäthylester gewaschen und getrocknet wird. Man erhält 1,01 g des gewünschten Tetrapeptid-hydrazkis. Nach dem Umkristallisieren aus Wasser erhält man Kristalle vom F. 186,5 bis 188° C; La]? = - 20,1 ± 0,5^c (c = 1,346, 50%iges Methanol).

C₂₅H₄₀O₃N₆S ■ H₂O:

Berechnet ... C 49,82, H 7,02, N 13,94, S 5,32;
gefunden .... C 49,72, H 7,05, N 14,50, S 5,15.

Herstellung von

y-tert.-Butyl-glutamyl-histidyi-phenylalanylarginyl-tryptophyl-glycin (XIX)

Produkts vom F. 107 bis 11Γ C; [α] ί? = +13,0 ± 0,5° (c = 2,062, Methanol).

C₂₀H₂₈N₈O₅ · HCOOH - V₂H₂O:
Berechnet ... C47,45, H 5,88, N 21,08;
gefunden .... C 47,25, H 6,03, N 20,90.

2 tert.-Butyloxycarbonyl-phenylalanyl-N^G-nitroarginyl-tryptophyl-glycin-methylesicr (XIV)

Diese Verbindung wird genau nach den Angabcder Literatur: Bull. Chem. Soc. Japan., 38, 1148 (1965), synthetisiert, mix der Ausnahme, daß das oben erhaltene Tripeptidesterformiat an Stelle des Trifluoracetats verwendet wird. Man erhält 4,06 g der gewünschten Verbindung, indem man 4,81 g N^G-Nitroarginyl-tryptophyl-glycin-methylester-formiai mit 4,42 g tert.-Butyloxycarbonyl-phenylalanin-dicyclohexyl-aminsalz in Acetonitril nach dem Dicyclohexylcarbodiimidverfahren umsetzt. Man erhält ein Produkt vom F. 176 bis 177 C; [α]? = -20,4±2° (c = 2, Methanol).

C₃₄H₄₅N₉O₉:

Berechnet
gefunden .

55 C 56,42, H 6,27, N 17,42;
C 56,34, H 6,22. N 17,58.

3. Phen ylalanyl-N^G-nitro-arginyl-tryptophylglycin-methylester-formiat (XV)

1,81 g tert.-Butyloxycarbonyl-phenylalanyl-N^G-nitro-arginyl-tryptophyl-glycin-methylester (XIV) werden in 18 ml Ameisensäure gelöst. Die Lösung wird 3,5 Stunden bei Raumtemperatur gehalten. Nach dem Entfernen der Ameisensäure wird der Rückstand aus n-Butanol kristallisiert. Das kristalline Produkt wird abfiltriert, mit Äther gewaschen und im Exsikkator getrocknet. Man erhält 1,71 g vom F. 124 bis 125,5⁰C: [ap/ = -9,0 ±0,5° (c = 0,977, Methanol).

C₂₉H₃₇N₉O₇

Berechnet
gefunden .

HCOOH-V₂H₂O:

.. C 54,38, H 6,28, N 17,84;
.. C 53,00, H 6,iO, N 17,79.

1. Nitroarginyl-tryptophyl-glycin-methylesterformiat (XIII)

5,77 g tert.-Butyloxycarbonyl-N^G-nitro-arginyltryptophyl-glycin-methylester (XII) werden in 50 ml 98 bis 100%iger Ameisensäure gelöst. Die Lösung wird 3,5 Stunden stehengelassen. Danach wird die Ameisensäure durch Eindampfen bei einer Badtemperatur von 40 bis 45° C entfernt und der Rückstand in Wasser gelöst. Die Lösung wird mit Äther gewaschen und lyophilisiert. Man erhält 4,86 g des gewünschten

4. N*,N' "-Dibenzyloxycarbor.yl-histidyl-phenyl-

alanyl-N^G-nitrc-arginyl-tryptophyl-glycin-

methylester (XVI)

Man erhält dieses Peptid nach dem in Bull. Chem. Soc. Japan., 38, 1148 (1965), angegebenen Verfahren, mit der Ausnahme, daß an Stelle des entsprechenden Trifluoracetats das oben erhaltene Tetrapeptidesterformiat verwendet wird. Man stellt den Pentapeptidester aus 2,60 g Phenylalanyl-N^a-nitro-arginyltryptophyl-glycin-methylester-formiat und 1,91 g N^a,N' "-Dibenzyloxycarbonyl-histidin-p-nitrophenylester her. Man erhält 2,70 g [a] I' = -22,3 ±0,3° (c = 2,084, Dimethylformamid;.

C₅₁H₅₆N₁₂O₁₂ · H₂O:

Berechnet ... C 58,50, H 5,58, N 16,05;
gefunden .... C 58,63, H 5,70, N 15,89.

5. Histidyl-phenylalanyl-arginyl-tryptophyl-

glycin-monoacetat (XV5I)

1,44 g N^a,N^lm - Dibenzyloxycarbonyl - histidylphenylalanyl - N^G - nitro - arginyl - tryptophyl - glycinmethy'ester (XVl) werden in 90%igem Dioxan hydrolysiert und aus Essigsäure lyophilisiert. Man erhält 1,35 g Benzyloxycarbonyl - histidyl - phenyl - alanyl-N^G-nitro-arginyl-tryptophyl-glycin entsprechend dem

in Bull. Chem. Soc. Japan., 38, 1148 (1965), angegebenen Verfahren.

0,72 g des oben erhaltenen Pentapeptids und 0,72 Volumteile Anisol werden in 7 bis 8 ml wasserfreiem Fluorwasserstoff bei einer Badtemperatur von Trockeneis/Aceton-Gemisch gelöst. Danach wird das Geraisch 30 Minuten bei 0⁰C gerührt. Nach dem Entfernen des Fluorwasserstoffes durch Eindampfen wird der Rückstand 15 Stunden über Natriumhydroxydplätzchen getrocknet. Der Rückstand wird in 20 ml Wasser gelöst und die Lösung gründlich mit Essigsäureäthylester gewaschen und dann über eine kleine »Amberlite® CG-400« (Acetatform)-Säule gegeben. Die Säule wird portionsweise mit Wasser gewaschen Die wäßrigen Eluate werden vereinigt und lyophilisieit. Man erhält 0,64 g Ali"⁰¹= 279 ΐημ (Ei™66,2), 288 πΐμ (Ei ™53,5) und ^_x"-*'""= 280 πΐμ (E¹,^65,0), 288 πΐμ (E'cm54,5). Papierchromatographie in n-Butanol zu Essigsäure zu Pyridin zu Wasser = 30:6:20:24 Volumteile.

Es treten eine Hauptkomponente vom R_f 0,47 bis 0,53 und zwei Spuren auf, die alle auf Ninhydrin-, Pauly- und Ehrlichreagenzien reagieren. Nur die Hauptkomponente reagiert mit Sakaguchireagens.

6. Benzyloxycarbonyl-y-tert-butyl-glutamyl-

histidyl-phenylalanyl-arginyl-tryptophyl-glycin-

monoacetat (XVlII)

Eine Lösung von 0,83 g der Verbindung (XVII) und 0,28 mlTriäthylaminin 10 ml 90%igem Dimethylformamid wird bei 0⁰C gerührt und mit 0,46 g Benzyloxycarbonyl -γ- tert. - butyl - glutaminsäure - ρ - nitrophenylester versetzt. Das Gemisch wird 15 Stunden bei 4°C gerührt. Eine zusätzliche Menge von 0,46 g des aktiven Esters wird zugegeben, und das Gemisch wird bei 4° C gehalten, bis das Pentapeptid (XVII) sich durch Dünnschichtchromatographie nicht mehr nachweisen läßt. Das Reaktionsgemisch wird dann tropfenweise in 100 ml eiskalten Essigsäursäthylester gegeben. Man erhält einen gelatinösen Niederschlag, der abfiltriert, mit Essigsäureäthylester gewaschen und im Exsikkator getrocknet wird. Das aus Essigsäure/Wasser ausgefällte Produkt ist das gewünschte Hexapeptid. Man erhält 0,84 g [α]? = -26,6 ±0,5° (c = 1,377, 50%ige Essigsäure),

CH₃COOH · 7H₂O:

Berechnet ... C 52,86, H 6,74, N 13,98;
gefunden .... C 52,73, H 6,85, N 13,92.

7. y-tert-Butyl-glutamyl-histidyl-phenylalanylarginyl-tryptophyl-glycin-monoacetat (XIX)

0,265 g der Verbindung XVIII werden in 10 ml 50%iger Essigsäure gelöst und in Gegenwart von Palladiumschwarz 2,5 Stunden hydriert. Nach dem Abfiltrieren des Katalysators wird das Filtrat unter vermindertem Druck bei einer Badtemperatur von 45 bis 50° C eingedampft. Der Rückstand wird aus Essigsäure lyophilisieit und über Natriumhydroxydplätzchen im Exsikkator getrocknet Man erhält ©,22 g. Das Produkt verhält sich bei der Dünnschidlitchromatographie in n-Butanol zu Essigsäure zu Wasser = 4:1:2 einheitlich.

,CH₃COOH-SH₂O:

... C 49,53, H 7,21, N 15,40;
... C49,46, H 6,77, N 15.49.

Berechaet

Herstellung von

tert-Butyloxycarbonyl-^-alanyl-tyrosyl-

seryl-methionyl-y-tert.-butyl-glutamyl-histidyl-

phenylalanyl-arginyl-tryptophyl-glycin (XX)

Eine Lösung von 0,45 g der Verbindung XI in 4,5 Volumteilen 90%igem Dimethylformamid wird in einer Kochsalz/Eis-Mischung gekühlt und mit 2,0 ml eiskalter 1 η-Salzsäure und 0,83 ml eiskalter

ίο l-m Natriumnitritlösung versetzt. Das Gemisch wird 4 Minuten gerührt und dann mit 20 ml eiskalter gesättigter Natriumchloridlösung und eiskaltem Essigsäureäthylester versetzt. Die wäßrige Schicht wird abgetrennt und 2mal mit Essigsäureäthylester ausgeschüttelt. Die organischen Phasen werden vereinigt, mit 5%iger kalter Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und zu einer Lösung von 0,50 gXIXundO,21 ml Triäthylamin in 15 ml Dimethylformamid gegeben. Das Gemisch wird bei einer Badtemperatur von 10 bis 15° C unter vermindertem Druck zur Entfernung des Essigsäureäthylesters eingedampft. Die erhaltene klare Lösung wird 15 Stunden bei 4° C stehengelassen. Eine zusätzliche Menge von Azid, das aus 0,23 g XI nach dem oben beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, wird zugesetzt, und das Reaktionsgemisch wird weitere 24 Stunden bei 4° C gehalten. Anschließend wird das Gemisch tropfenweise in 200 ml eiskalten Essigsäureäthylester gegeben. Man erhält einen amorphen Niederschlag, der abfiltriert, mit Essigsäureäthylester gewaschen und im Exsikkator getrocknet wird. Man erhält 0,69 g. Nach Unifällen aus Dimethylformamid/ Methanol (2:5) erhält man das reine Dekapeptidderivat; [α]ί? = -19,4 ±0,7" (c = 0,882, Dimethylformamid). Bei der Dünnschichtchromatographie in Dimethylformamid zu Essigsäureäthylester zu Essigsäure = 15:10:2 verhält sich das Produkt einheitlich (Rf = 0,54 bis 0,57).

C₆₈H₉₄N₁₆O₁₇S-SH₂O:

Berechnet ... C 51,57, H 7,00, N 14,15, S 2.02:
gefunden .... C 51,62, H 6,66, N 14,06, S 2,64.

Herstellung von

/3-Alanyl-tyrosyl-seryl-methionyl-glutamyl-

histidyl-phenylalanyl-arginyl-tryptophyl-glycyl-

lysyl-propyJ-valyl-glycyl-lysyl-I/syl-arginyl-

argininamid (XXIV)

Eine Lösung von 0,37 g der Verbindung XX in

10 ml Dimethylformamid wird bei 0°C mit 0,25 ml eiskalter 1 η-Salzsäure versetzt. Die Lösung wird sofort in 200 ml eiskaltes Gemisch aus Essigsäureäthylester und Äther (1:1) gegeben. Der erhaltene Niederschlag wird abfiltriert, mit Äther gewaschen

und im Exsikkator getrocknet. Die erhaltenen 0,36 g werden in 5 ml Dimethylfonnamid gelöst, und dazu werden 0,115 g N-Hydroxysuccinimid und 0,21 g NJ^'-Dicyclohexylcarbodiimid nacheinander zugegeben. Das Gemisch wird 15 Stunden bei 4° C stehengelassen. Nach dem Abfiltrieren der Harnstoffverbindung wird das Filtrat in ein eiskaltes Gemisch aus 200 ml Äthylacetat und Äther (1:1) gegeben. Der Niederschlag wird abfiltriert, mit Äther gewaschen und im Exsikkator getrocknet Man erhält 03 g des

aktiven Esters des Dekapeptids.

0,23 g des Triacetate von NMert.-Butyloxycarbonyllysyl - prolyl - valyl-glycyl-N'-tert -butyloxycarbonyllysyl - N' - tert. - butyloxycarbonyl - lysyl - arginyl-

argininamid werden in 3 ml Dimethylformamid gelöst und mit 0,24 ml Triäthylamin versetzt. Dazu wird eine Lösung von 0,39 g des oben erhaltenen aktiven E>ekapeptidesters in Dimethylformamid gegeben und das Reaktions»emisch (Gesamtvolumen etwa 5 ml) wird 60 Stunden bei 4° C stehengelassen. Man erhält das Rohprodukt des geschützten Octadekapeptidü als amorphen Feststoff, wenn das Reaktionsgemisch zu 100 ml kaltem Essigsäureäthylester gegeben wird. Ausbeute 0,55 g.

0,55 g des geschützten Peptids werden zum Entfernen der Schutzgruppen in 6 ml 90%iger Trifluoressigsäure gelöst. Die Lösung wird 60 Minuten bei Raumtemperatur gehalten. Danach wird das Lösungsmittel durch Eindampfen unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wird in Wasser gelöst und die Lösung über eine »Amberlite · CG-400« (Acetatform)-Säule (2,2 χ 7 cm) gegeben. Die Säule wird portionsweise mit Wasser gewaschen. Die wäßrigen Lösungen werden vereinigt und unter vermindertem Druck auf 10 bis 15 ml eingedampft. Zu der eingedampften Lösung wird 1 ml 1 m Mercaptoäthanollösung gegeben, und das Gemisch wird 15 Stunden bei 37 C inkubiert und lyophilisiert. Man erhält 0,51 g Rohpeptid ohne Schutzgruppen, das zur weiteren Reinigung an einer mit Carboxymethylcellulose (CMC. »Serva®« 0,6 Milliäquivalent/g) beschickten Säule chromatographiert wird, wobei 4000 ml eines Ammoniumacetatpuffers vom pH-Wert 6,8 mit einem linearen Konzentrationsgradienten von 0.05 bis 0,4 m verwendet warden. Die dem Hauptgipfel entsprechenden Fraktionen 166 bis 245 mit je 15 ml werden vereinigt, und der Hauptteil des Lösungsmittels wird unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wird wiederholt bis zur Gewichtskonstanz lyophilisiert. Man erhält 0,22 g des teilweise gereinigten Octadekapeptids. 0,2 g des Produktes werden zur weiteren Reinigung an einer CMC-Säule (2.2 χ 18 cm: »Serva *«. 0,6 Milliäquivalent/g) unter Verwendung von 2000 ml eines Ammoniumacetatpuffers vom pH-Wert 6,8 mit einem linearen Konzentrationsgradienten von 0,05 bis 0,8 tn chromatographiert. Die dem Hauptgipfel entsprechenden Fraktionen 125 bis 160 von je 7,5 ml werden vereinigt, eingedampft und lyophilisiert. Man erhält 0,17 g des reinen Peptids ß- Alanyl - tyrosyl - seryl -methionyl - glutamyl - histidylphenylalaüj! - arginyl-tryptophyl glycy! lysyl - pr ■.->!>!- valyl - glycyl - lysyl - lysyl - arginyl - argininamid: [a]'o = -54,0 ± 1,8 U '-- 0,515, 0,1 n-Essigsäure), _a,,,,,n.oh_{= 28Οπ1μ} (Ej^23,0), JSVJ?¹= 288,5 πΐμ

id::„^nNa<)H= 281,5 ΐημ(Ε··^24,9),288ηΐμ

Das Produkt verhält sich bei der Papierchromatographie mit n-Butanol zu Essigsäure zu Pyridin zu Wasser = 30:6:20:24 als Laufinittel gegenüber Ninhydrin-, Pauly-, Ehrlich-, Sakagachi- und Methioninreagens (PtJ₆) und bei der Papierelektrophorese (600 V/36 cm in 2 n-Essigsäure) einheitlich. Das Verhältnis der Aminosäuren bei saarer Hydrolyse ist folgendes: Ser 0,75, GIu 0,90, Pro Q£l, GIy 1,89. VaI 1,00, Met 0,96, Tyr 1,01, Phe 0,97, /S-AIa 1,00, Lys 2,83, His 0,92, Arg 2,82, Trp 0,55, NH₃ 1,42. Das Trp/Tyr-Verhältnis im intakten Octadekapeptid bestimmt man spektrophotometrisch zu 1,16:1.

Beispiel 2

5 Gewichtsteile (/J-AJa'j-ACTHCl-lSj-NHj-acetat werden in 2,5 Gewichtsteilen 40millimolarer Zinkchloridlösung gelöst. Die Lösung wi'd mit 2,5 Volumteilen einer 45 Gewichtsteile Natriumchlorid enthaltenden 40millimolaren Dmatriumhydrogenphosphatlösung versetzt. Man eirhält eine Suspension des Zinkchlorid-Komplexes.

Dieses Präparat wird in Dosen von 5 μΙ/Ratte hypophysektomierten Ratten intramuskulär injiziert. Nach 2 Stunden wurde die 11 -Hydroxycorticosteroid-Menge in Plasma zu 80μg/100ml bestimmt. Im ίο Gegensatz dazu erhielt man bei der Verabreichung eines auf die gleiche Weise erhaltenen Präparates, das aber kein Zinkchlorid enthielt, eine 11-Hydroxycorticosteroid-Menge von 6 μg/100 ml.

Die Bestimmung wurde nach dem in Endocrinol. Japonica, 13, 180 (1966), beschriebenen Verfahren durchgeführt.

Verwendet man Kobaltchlorid, Kupferchlorid, Nickelchlorid oder Eisenchlorid an Stelle von Zinkchlorid, so erhält man die entsprechenden Komplexe.

B e i s ρ i e 1 3

10 Gewichtsteile (/J-AIa¹ )-ACTH(l-18)-NH₂-acetat werden in 2 Gewichtsteilen destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung wird unter Rühren mit einer Lösung von 20 Gewichtsteilen Poly-L-asparaginsäure vom Molekulargewicht 3000 versetzt, die vor der Verwendung mit 3 Volumteilen 0,1 n-Natriumhydroxydlösung neutralisiert worden war. So erhält man eine Suspension eines weißen Niederschlags. Die gewünschte Suspension des Komplexes erhält man, wenn man zu der oben erhaltenen Suspension 5 Volumteile einer m/l 5-Dinatriumhydrogenphosphat/Dikaliumhydrogenphosphatlösung, die 90 Gewichtsteile Natriumchlorid enthält, zusetzt.

Das Präparat wird in einer Dosis von 5 μΙ/Ratte in hypophysektomierte Ratten intramuskulär injiziert. 2 Stunden nach der Injektion wurde die 11-Hydroxycorticosteroidmenge im Plasma zu 45 μg/100 ml bestimmt, während die Menge bei Verabreichung einer auf die gleiche Weise erhaltenen Präparation, die aber keine Poly-L-asparaginsäure enthielt, 6 μg/100 ml be-

^truS· Beispiel 4

5 Gewichtsteile (/i-Ala')-ACTH(l-18)-NH₂-acetat werden in 1,5 Volumteilen destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung wird mit 1 Volumteil einer Lösung von 5 Gewichtsteilen einer Poly-L-glutaminsäure vom Molekulargewicht 1500 bis 2000 versetzt, die vorher mit 0,1 -n Natriumhydroxydlösung neutralisiert worden war. Man erhält so eine Suspension des Komplexes. Durch Zugabe von 2,5 Volumteilen eines 90 Gewichtsteile Natriumchlorid enthaltenden m/30 Phosphatpuffers zu der Suspension erhält man das gewünschte Präparat des Komplexes.

Beispiel 5

5 Gewichtsteile (/J-AIa¹ )-ACTH(l-18)-NH₂-acetat werden in 15 Volumteilen einer lOOmillimolaren Zinkchloridlösung gelöst. Andererseits werden 5 Gewichtsteile einer Poly-L-glutaminsäure vom Molekulargewicht 1500 bis 2000 mit 1 Volumteil 0,1-η Natriumhydroxydlösung neutralisiert und mit 45 Gewichtsteilen Natriumchlorid und mit 25 Volumteilen einer 40millimolaren Dinatriumhydrogenphosphat-

lösung versetzt. Die so erhaltenen Lösungen des Octadekapeptids und der Polyglutaminsäure werden vereinigt. Man erhält eine Suspension des gewünschten Komplexes.

309 549/426

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims (2)

Patentansprüche:

1. β - Alanyl - l - tyrosyl - l - seryl - L - methionyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl- L - tryptophyl - glycyl - L - lysyl - l - prolyl - l - valylglycyl - L- lysyl - L- lysyl - l- arginyl - L - argininamid, seine Salze mit Säuren und Komplexe mit Zink, Kobalt, Nickel, Kupfer, Eisen, Poly-L-glutaminsäure, Poly-D-glutaminsäure, PoIy-E L-glutamin- ₎₀ säure, Poly-L-asparaginsäure, Poly-DL-asparaginsäure, Copoly-L-glutamyl-tyrosin oder deren Gemische.

2. Verbindung der allgemeinen Formel