DE2010759B2 - Eckige Klammer auf beta-Ala hoch 1- eckige Klammer zu -ACTH (1-18>NH tief 2, seine Salze mit Säuren und Komplexe mit Schwermetallen und Polyaminosäuren, sowie diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel - Google Patents
Eckige Klammer auf beta-Ala hoch 1- eckige Klammer zu -ACTH (1-18>NH tief 2, seine Salze mit Säuren und Komplexe mit Schwermetallen und Polyaminosäuren, sowie diese Verbindungen enthaltende ArzneimittelInfo
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Description
Rx-^-Alanyl-L-tyrosyl-L-seryl-L-metiiionyly-Rz-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-argmyl-L-tryptophyl-glycyl-N'-R^L-lysyl-L-pro!yl-L-vaJy]-glycy]-N£-R3-L-]ysyl-N'-R3-L-lysyl-L-arginyl-L-argininamid,
in der R1 und R3 Aminoschut/gruppen darstellen
und R2 eine Carboxylschutzgruppe ist.
3. Verbindung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß R1 und R3 jeweils eine
tert.-Butyloxycarbonyl-, tert.-Amyloxycarbonyl-,
2-(p-Diphenyl)-isopropyloxycarbonyl-, Benzyloxycarbonyl-, p-Methoxybenzyloxycarbonyl-, p-Nitro-benzyloxycarbonyl-.
Formyl-, Tosyl- oder Tritylgruppe und R2 ein niederer Alkylester- oder
niederer Arylalkylesterrest ist.
4. Arzneipräparate, enthaltend eine Verbindung gemäß Anspruch 1 und übliche Trägelstoffe und
bzw. oder Verdünnungsmittel und bzw. oder Hilfsstoffe ,5
40
45
Aus verschiedenen Laboratorien sind Synthesen einer großen Anzahl von Corticotropin(ACTH)-Peptidanalogen
berichtet worden. Bei den Peptidanalogen sind einzelne Aminosäuren der natürlichen Sequenz
gegen andere Aminosäuren ausgetauscht, z. B. die erste Aminosäure Serin gegen Glycin oder D-Serin,
die vierte Aminosäure Methionin gegen Valin oder Norleucin, die fünfte Aminosäure Glutaminsäure
gegen Glutamin, die 17. und 18. Aminosäure Arginin
gegen Lysin oder Ornithin oder die 25. Aminosäure Asparaginsäure gegen Valin. Obwohl viele corticotrope
Peptide mit einer geringfügig veränderten Aminosäuresequenz bisher synthetisiert worden sind,
zeigte bis auf ein paar Ausnahmen keines dieser Peptide eine größere Aktivität als das natürliche
Corticotropin. Von besonderem Interesse ist das Peptid D-Ser'-NLe^VaF-ACTHa^SKNH;,, das
einen D-Serinrest am Aminoende an Stelle des nativen L-Serins, einen Valinamidrest am Carboxylende an
Stelle des Asparaginsäurerestes und in Stellung 4 an Stelle des Methioninrestes beim Corticotropin
einen Norleucinrest enthält. Dieses Peptid ist nach den Angaben der Literatur biologisch aktiver als das
native Corticotropin; vgl. Experientia, 22, 526 (1966). Es scheint sehr wahrscheinlich, daß das beim
D-Se^-NLe4-VaI25-ACTH(I -25)-NH2 beobachtete
Anwachsen der Aktivität eine Folge der verringerten Anfälligkeit des Peptides gegenüber der Wirkung
von Aminopeptidase und Carboxypeptidase ist. Dies ist auf die Gegenwart einer D-Aminosäure am Aminoende
und eines Valinamids am Carboxylende und auf die Tatsache zurückzuführen, daß die Oxydation von
Methionin in Stellung 4 zu Methioninsulfoxid bei Inaktivierung nicht auftreten kann, da der Methioninrest
durch einen Norleucinrest ersetzt ist. D-Se^-NLe4-Val2S-ACTH(l-25)-NH2 ist zwar ein ausgezeichnetes
corticotropes Peptid mit hoher biologischer Aktivität, es ist nicht das Idealmittel, da es
einige Probleme bei seiner Anwendung in der Humanmedizin mit sich bringt Da D-Se^-NLe^-Val25-ACTH(
1 -25)-NH2 drei modifizierte Aminosäuren, d h.
D-Serin-, Norleucin- und Valinreste enthält, besteht die Gefahr einer anaphylaktischen Reaktion beim
Verabreichen an Menschen wegen dieses Unterschiedes in der Aminosäuresequenz zwischen menschlichem
Corticotropin und dem synthetischen Peptid. Es ist bekannt, daß die anaphylaktische Reaktion häufig
auftritt, wenn im Handel erhältliches, aus Hypophysen von Tieren, wie Schweinen. Rindern oder
Schafen, stammendes Corticotropin Menschen verabreicht wird. Diese unerwünschte Erscheinung kann
eine Folge der strukturellen Unterschiede in den Aminosäuresequenzen in den Stellungen 25 bis 33
zwischen menschlichem und tierischem Corticotropin sein und kann auch auf bestimmte proteinähnliche
Verunreinigungen, die nicht vollkommen aus dem natürlichen, aus den genannten tierischen Quellen
stammenden Corticotropin entfernt werden können, zurückzuführen sein. Weiter weiß man, daß die Reaktivität
der Hydroxylgruppe des Serins, die Labilität der Seryl-Peptidbitidung unter alkalischen Bedingungen,
die Neigung zu /f-Eliminationsreaktionen unter Bildung
von Dehydro-Peptiden und die N — O-Acyl-Verschiebung
die Herstellung von Serin enthaltenden Peptiden sehr erschweren, die wegen Labilität unter
alkalischen Bedingungen oft von Racemisierungsprodukten begleitet sind. Außerdem erfordert die
Synthese einer langen Peptidkette einen großen Aufwand an Arbeitszeit und Arbeitskraft. Deswegen ist
es sehr wünschenswert, ein hochaktives corticotropes Peptid herzustellen, dessen Aminosäuresequenz so
kurz wie möglich ist.
In der Zeitschrift J. Am. Chem. Soc, 87, 2696 (1965)
und J. Biochem. (Tokio), 58, 512 (1965) ist die Synthese eines corticotropen, hochaktiven Octadekapeptidamids
beschrieben, das den ersten 18 Aminosäureresten des Corticotropins entspricht, mit der
einen Ausnahme, daß das Carboxylende in das Amid übergeführt wurde. Außerdem gelang es, ein Octadekapeptid
zu synthetisieren, in dem das aminoterminale Serin des Corticotropins durch einen Glycinrest ersetzt
und dessen Carboxylende in das Amid übergeführt ist; vgl. Bull. Chem. Soc. Japan., 43, 196 (1970). Beide
Peptide weisen eine hohe corticotrope Aktivität auf. In vivo entsprechen die steroidgenetischen Aktivitäten
bei intravenöser Verabreichung an Ratten denen von Schafcorticotropin. Jedoch ist die steroidgenetische
Aktivität in vitro etwas geringer als die von Schafcorticotropin.
Aufgabe der Erfindung war es daher, neue corticotrope
Peptide zu schaffen, die ausgeprägte biologische Eigenschaften, stimulierende Wirkung auf die Nebennierenrinde,
lipolytische Ak'ivität und melanozytenstimulierende Aktivität aufweisen, die alle höher sind
als die Aktivitäten von natürlichem Corticotropin und von bisher bekannten synthetischen Corticotropin-Peptiden.
Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst.
Gegenstand der Erfindung ist somit das Octadekapeptid der Formel I
/i-Alanyl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyi-L-valylglycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-arginyl-L-argininamid
' -■"
(abgekürzt mit [/S-AIa1J-ACTH(I-IShNH2 bezeichnet),
seine Salze mit Säuren und Komplexe mit Zink, Kobalt, Nickel, Kupfer, Eisen, Poly-L-glutaminsäure,
Poly-D-glutaminsäure, Poly-DL-glutaminsäure,
PoIy-L- asparaginsäure. Poly - dl - asparaginsäure. Copoly-L-glutamyl-tyrosin oder deren Gemische.
Wenn nichts anderes angegeben ist, so weisen alle im folgenden beschriebenen Aminosäuren die L-Konfiguration
auf. Die Abkürzungen für Aminosäuren, Peptide und ihre Derivate stimmen mit den Empfehlungen
der IUPAC-IUB-Nomenklaturkommission
überein.
Das Octadekapeptid der Erfindung hat eine länger anhaltende corticotrope Aktivität, was wahrscheinlich
auf die Widerstandsfähigkeit gegen die Wirkung von Aminopeptidase zurückzuführen ist. Weiterhin wurde
festgestellt, daß die Komplexe des Octadekapeptids eine langanhaltende Aktivität aufweisen.
Im allgemeinen werden Polypeptide nach verschiedenen Verfahren hergestellt, indem die Aminosäurereste
nacheinander oder vorher synthetisierte Peptidbruchstücke zu einer angegebenen Sequenz verknüpft
werden. Dabei können die Aminosäure oder die Peptideinheit durch bekannte Verfahren mit weiteren
Aminosäuren oder Peptidbruchstücken verknüpft werden.
Zur Herstellung des Octadekapeptids der Erfindung und seiner Zwischenprodukte werden alle freien,
funktionellen, an der Reaktion nicht teilnehmenden Gruppen vorteilhaft durch Reste geschützt, die leicht
durch z. B. Säurehydrolyse, spaltende Hydrierung oder Hydrolyse entfernt werden können. Die Carboxylgruppe
wird vorzugsweise durch Veresterung, z. B. mit einem niederen aliphatischen Alkohol, wie Methanol.
Äthanol, Propanol, Isopropanol oder lert.-Butanol, oder einem niederen Arylalkylalkohol,
wie Benzylalkohol, p-Nitrobenzylalkohol oder
p-Methoxybenzylalkohol, oder durch Amidbildung
geschützt. Die Aminogruppe wird vorzugsweise durch Gruppen, wie die tert.-Iiutyloxycarbonyl-, die
tert.-Amyloxycarbonyl-, die p-Methoxybenzyloxycarbonyl-,
die Benzyloxycarbonyl-, die p-Nitrobenzyloxyearbonyl-, die Trityl-, die 2-(p-Diphenyl)-isopropyloxycarbonyl-
oder die Formylgruppe geschützt. Zum (>o Schutz der Guanidinogruppe im Arginin wird vorzugsweise
die Nitro- oder Tosylgruppe verwendet, jedoch ist es nicht immer notwendig, die Guanidinogruppe
des Arginine während der Reaktion zu schützen. Ebenso wird die ε-Aminogruppe des Lysins vor-'ugsweise
durch die tert.-Butyloxycarbonyl-, die tert.-Amyloxycarbonyl-, die Benzyloxycarbonyl- oder
die 2-(p-DiphenyI)-isopropyloxycarbonylgruppe geschützt. Außerdem wird die y-Carboxylgruppe dei
Glutaminsäure vorzugsweise in Form eines niederer Esters, wie den Methyl-, Äthyl-, Propyl- oder tert.-Butylester
oder eines niederen Arylalkylesters, wie deri Benzyl-, p-Nitrobenzyl- oder p-Methoxybenzylestei
oder durch Amidbildung geschützt. Die Iminogruppe von Histidin kaun z. B. durch die Benzyloxycarbonyl-
oder die Benzylgruppe geschützt werden.
Als Kondensationsverfahren für die Bildung dei Peptidbindung können z. B. folgende Verfahren Verwendung
finden: das Dicyclohexylcarbodiimidverfahren, das Azidverfahren, das Aktivesterverfahren, ζ. Β
mit dem Cyanomethyl-, p-Nitrophenylthiol-, p-Nitrophenyl-,
N-Hydroxysuccinimid-, 8-Chinolyl- oder
1-Piperidylester, das gemischte Anhydridverfahren,
das N-Carboxyanhydridverfahren, das Tetraäthylpyrophosphitverfahren, das Äthylchlorphosphitverfahren,
eine Kombination dieser Verfahren und andere, auf dem Gebiet der Peptidchemie üblicherweise
verwendete Verfahren. Das Octadekapeptid kann auch nach der sogenannten Synthese in fester Phase
hergestellt werden, bei der die Synthese vom Carboxy I-ende des Peptids ausgeht, das esterähnlich an ein
Polymer gebunden ist und die Aminosäuren nacheinander angehängt werden. Alle genannten Verfahren
können zur Bildung aller Peptidbindungen des Octadekapeptids der Erfindung und seiner Zwischenprodukte
verwendet werden.
Wie vorstehend erwähnt, gibt es eine Reihe von verschiedenen Wegen zur Herstellung des Octadekapeptids
aus Aminosäuren oder Peptideinheiten. Zum Beispiel kann nach einem Verfahren das Octadekapeptid
dadurch hergestellt werden, daß man ein Dekapeptid der allgemeinen Formel II
R^/ii-Alanyl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-
;-R2-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-1 arginyl-L-tryptophyl-glycin
;-R2-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-1 arginyl-L-tryptophyl-glycin
in der R1 eine Aminoschutzgruppe und R2 eine
Carboxylschutzgruppe ist, mit einem Octapeptid der allgemeinen Formel III
N'-Rj-i-Lysy'i-L-prolyl-L-valyl-glycyl-N£-R3-L-lysyl-N£-R3-L-lysyl-L-arginylargininamid
in der R3 eine AminoschutTgruppe ist, in einem inerten
Lösungsmittel, wie Dimethylformamid, Dimethylsulfoxyd, Pyridin, Dimethoxyäthan, Hexamethylphosphortriamid,
Dioxan oder einem Gemisch dieses Lösungsmittels 2 bis 96 Stunden bei Temperaturen
von -20 bis 500C in an sich bekannter Weise kondensiert
und die Schutzgruppen aus dem erhaltenen Octadekapeptid der allgemeinen Formel IV
Rj-ß-L-Alanyi-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyly-Rj-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-N'^-L-lysyl-L-proly]-L-valyl-glycyl-NE-R3-L-lysyl-Nc-R3-L-lysyl-arginyl-argininamid
(IV)
in der R1, R2 und R3 die oben angegebene Bedeutung
haben, in an sich bekannter Weise, wie Säurehydrolyse, hydrierende Spaltung oder Hydrolyse, entfernt.
Im folgenden Syntheseschema ist ein bevorzugtes Verfahren für die Herstellung des Octadekapeptids
angegeben.
Syntheseschema für das Octadekapeptid
BOC-/J-AIa · OH + H · Tyr · OMe BOC-Ser · OH + H · Met · OMe
(V)
BOC-,5-AIa-Tyr-OMe
(VI)
NH2NH, · H2O
BOC — /?-Ala · Tyr · NHNH2
(VIfI)
BOC-Ser Met OMe (VII)
HH
+ H · Ser · Met · OMe (IX)
BOC — /Ϊ-Ala · Tyr · Ser ■ Met · OMe
(X) I
NH2NH2 · H2O
BOC- /J-AIa · Tyr · Ser · Met · NHNH2
(XI) NO2
BOC —Arg · Trp · GIy · OMe (XII)
HCOOH NO2
BOC-Phe · OH + H · Arg · Trp · GIy - OMe
(XIII)
NO2
BOC- Phe · Arg · Trp · GIy · OMe (XIV)
HCOOH
f 1I °2 ·
Z — His · ONP + H · Phe -Arg · Trp · GIy · OMe
(XV)
NO2
OBu1
Z —His · Phe -Arg - Trp · GIy · OMe
(XVI)
(i) OH" (ii) HF
Z—Glu —ONP + H · His · Phe · Arg · Trp · GIy · OH
(XVII)
OBu1
Ζ — Glu · His · Phe -Arg · Trp · GIy · OH
(XVIII)
OBu1
H - Glu · Hfe · Pfae · Ais -Tfp · GIy OH
(XIX)
PCI) + (XIX) (ο
OBu1
BOC — 0-AIa ■ Tyr · Ser · Met · GIu · His · Phe · Arg · Trp · GIy · OH
(XX)
NHS, DCCI OBu1 BOC
BOCBOC
BOC-ii-Ala-TyrSer-Met-GluHis-Phe-ArgTrp-Gly-ONHS + HLysPro-ValGlyLys-Lys-Arg-Arg-R'
OBu1
CXXII)
BOC BOC BOC
BOC — 0-Ala · Tyr · Ser · Met ■ GIu · His · Phe · Arg · Trp · GIy · Lys · Pi ο · VaI · GIy · Lys · Lys · Arg ■ Arg · R'
CXXIlI)
(i) saure Hydrolyse (ii) Chromatographie an CMC
H — /J-AIa · Tyr ■ Ser · Met · GIu · His · Phe · Arg · Trp · GIy ■ Lys · Pro · VaI · GIy ■ Lys · Lys ■ Arg · Arg · R'
(XXIV)
In obigem Schema werden folgende Abkürzungen verwendet:
CMC = Carboxymethylcellulose,
DCCI = N.N'-Dicyclohexylcarbodiimid,
NHS = N-Hydroxysuccinimid,
BOC = tert-Butyloxycarbonyl,
OBu' = terL-Butylester,
R' = NH2,
Z = Benzyloxycarbonyl,
ONP = p-Nitrophenylester.
Wie aus obigem Syntheseschema hervorgeht, kann das typische N-terminale Dekapeptid der Formel XX
tert. - Butyloxycarbonyl - β - alanyl - tyrosyl - serylmethionyl
-γ- tert. - butyl - glutamyl - histidyl - p'benylalanyl-arginyl-tryptophyl-glycin,
das eine neue Verbindung darstellt und als Zwischenprodukt für die
Herstellung des Octadekapeptids der Erfindung ist, hergestellt werden, indem tert.-Butyloxycarbonyl-/i-alanyl-tyrosyl-seryl-nlethionin-hydrazid
(XI) mit γ - tert. - Butyl - glutamyl - histidyl - phenylalanylarginyl-tryptophyl-glycin
(XIX) nach dem Azidverfahren umgesetzt wird. Das Tetrapeptidhydrazid tert. - Butyloxycarbonyl - β - alanyl - tyrosyl - serylmethionin-hydrazid
(XI) ist ebenfalls eine neue Verbindung und als Zwischenprodukt bei der Herstellung
des Octadekapeptids der Erfindung wertvoll. Es kann hergestellt werden, indem die tert.-Butyloxycarbonylgruppe
mit Hilfe eines Agens, das die tert.-Butyloxycarbonylgruppe
einführt, wie tert.-Butylazidformiat, tert.-Butyl-p-nitrophenylcarbonat oder Chlorameisensäure-tert.-butylester,
in 0-Alanin eingefilhrt wird,
das erhaltene tert-Butyloxycarbonyl-jff-alanin (V) mit
Tyrosinmethylester kondensiert wird, der erhaltene Dipeptidmethylester (VT) mit Hydrazinhydrat in das
entsprechende Hydrazid (VIII) übergeführt wird, das tert. - Butyloxycarbonyl - β - alanyl - tyrosin - hydrazid
nach dem Azidverfahren mit Seryl-methionin-methylester
(DC) umgesetzt und der Tetrapeptidester (X) mit Hydrazinhydrat in das entsprechende Hydrazid (XI)
übergeführt wird. Das entsprechende tert.-ButyIo χ >
carbonyl'/i-alanyl-tyrosyl-serylmethionin kann auf
ähnliche Weise, wie oben beschrieben, erhalten werden.
Das Hexapeptid y-tert.-Butyl-glutamyl-histidylphenylalanyl-arginyl-tryptophyl-glycin
(ΧΓΧ) ist in Bull. Chem. Soc. Japan., 38, 1148 (1965) beschrieben.
Dieses Hexapeptid kann nach einem verbesserten Verfahren synthetisiert werden, was in hohem Maße
zur Steigerung der Ausbeute und des Reinheitsgrades bei der Herstellung des Octadekapeptids beiträgt.
Das verbesserte Verfahren zur Herstellung des Hexupeptids (XIX) umfaßt die Verwendung von Ameisensäure
zur Entfernung der tert-Butyloxycarbonylgruppe
von den geschützten Tryptophanpeptiden ohne Zersetzung von Tryptophan und die Verwendung
von Fluorwasserstoff zur Entfernung der Nitrogruppe vom Nitroargininrest ohne Beeinträchtigung des säurelabilen Tryptophanrestes. Es ist bekannt, daß in
saurem Medium tryptophanhaltige Peptide oft nur in sehr geringer Ausbeute erhalten werden, was auf die
Bildung von Nebenprodukten zurückzuführen ist; vgl. HeIv. Chim. Acta, 41, 1867 (1958), und J. Am.
Chem. Soc, 82, 2062 (1960). Es ist ebenfalls bekannt, daß die Reduktion eines Nitroargininrestes in einer
Peptidkette häufig eine lange Hydrierungszeit erfordert — vgl. Can. J. Chem., 38, 1946 (1960) — und
daß die katalytisch^ Reduktion häufig auf der Stufe von Aminoguanidin stehenbleibt; vgl. HeIv. Chim.
Acta, 44, 2042 (1961). Bei der Herstellung des Hexapeptids
(XIX) mit den genannten Aminosäureresten gelangt man zu einer hohen Ausbeute ohne Nebenreaktionen,
wenn man das verbesserte Verfahren anwendet. Das Hexapeptid (XIX) wird dadurch hergestellt, daß
man die tert.-Butyloxycarbonylgruppe des N" - tert. - Butyloxycarbonyl - N° - nitroarginyl - tryptophyl-glycin-methylesters
CXII) mit Ameisensäure abspähet, das erhaltene Tripeptid (XIII) mit tert.-Butyloxycarbonyl-phenylalanin
nach dem Dtcyclohexyl-
carbodiimidverfahren kondensiert, die tert.-Butyloxycarbonylgruppe
aus dem entstandenen Tetrapeptid tert. - Butyloxycarbonyl - phenylalanyl - N° - nitroarginyl-tryptophyl-glycin-methylester
(XIV) mit Amei-
309 549/426
sensäure abspaltet, das entstandene Tetrapepiid PCV)
mit N",N'm - Dibenzyloxycarbonyl - histidin - ρ - nitrophenylester
zum entsprechenden Pentapeptid N",N'm - Dibenzyloxycarbonyl - histidyl - phenylalanyl-NG-nitro-arginyl-tryptophyl-glycin-methylester
PiVI) umsetzt, diesen verseift, dann mit Fluorwasserstoff behandelt und hierauf das erhaltene Pentapeptid
(XVII) mit N"-BenzyIoxycarbonyl-y-tert.-butyl-glutaminsäure-p-nitrophenylesler
kondensiert, und das entstandene N" - Benzyloxycarbonyl - γ - tert. - butylglutamyl
- histidyl - phenylalanyl - arginyl - tryptoph ylglycin P(VIII) hydriert.
Bei der vorstehend geschilderten Reaktion wird die Abspaltung der tert.-Butyloxycarbonylgruppe mit
Ameisensäure während etwa 2 bis 4 Stunden bei Temperaturen von etwa 20 bis 60" C unter Verwendung
von etwa der 5- bis 15fachen Gewichtsmenge Ameisensäure,
bezogen auf das tert.-Buty'oxycarbonylpeptid, durchgeführt. Die Nitrogruppe wird durch Lösen
des Nitroarginylpepiids in Fluorwasserstoff (etwa der
5- bis lOfachen Gewichtsmenge des Peptids) und 30-bis 60n.:nutiges Stehenlassen der Lösung bei Temperaturen
von etwa 0 bis 25°C entfernt.
Das typische C-terminale Octapeptid der allgemeinen Formel
NMert.-Butyloxycarbonyl-lysyl-prolyl-valyl-
glycyl-NMert-butyloxycarbonyl-lysyl-N'-
tert.-butyloxycarbonyl-lysyl-arginyl-Y,
in der Y ein Argininamidrest ist, kann nach dem in Bull. Chem. Soc. Japan., 39, 882 (1966), beschriebenen
Verfahren hergestellt werden. So kann das Octadekapeptid dadurch hergestellt werden, daß man
tert. - Butyloxycarbonyl - β - alanyl - tyrosyl - serylmethionyl
- γ - tert. - butyl - glutamyl - histidyl - phenylalanyl-arginyl-tryptophyl-glycin
mit Ne-tert.-Butyloxycarbonyl-lysyl-prolyl-valyl-glycyl-N'-tert.-butyloxycarbonyl
- lysyl - Ne - tert. - butyloxycarbonyl - lysylarginyl-Y,
in dem Y die oben angegebene Bedeutung hat, nach dem Dicyclohexylcarbodiimidverfahren, dem
N-Hydroxysuccinimidesterverfahren oder einer Kombination dieser Verfahren während 2 bis 96 Stunden
bei Temperaturen von - 20 bis 50° C umsetzt und alle Schutzgruppen aus dem erhaltenen geschützten Octadekapeptid
tert. - Butyloxycarbonyl - ß- alanyl - tyrosylseryl - methionyl - γ - tert. - butyl - glutamy! - histidylphenylalanyl-arginyl-tryptophyl-glycyl-NMert.-butyloxycarbonyl
- prolyl - valyl - glycyl - Ne - tert. - butyloxycarbonyl
- lysyl - lysyl - Νε - tert. - butyloxycarbonyllysyl-arginyl
Y, in dem Y die oben angegebene Bedeutung hat, in einem sauren Medium, wie einem
Halogenwasserstoff, einer Halogenwasserstoffsäure, Trifluoressigsäure, Ameisensäure, Essigsäure oder einem
Gemisch derselben bei Temperaturen von etwa —10 bis 400C in einer Reaktionszeit von 10 bis 90 Minuten
entfernt
Nach einem anderen Verfahren kann das Octadekapeptid durch Kondensation des Tetrapeptide
tert. - Butyloxycarbony! - β - alanyl - tyrosyl - serylmethionin
mit einem Tetradekapeptid der allgemeinen Formel γ - tert. - Butyl - ghitamyl(oder glutaminyl)-histidyl
- phenyl - alanyl - arginyl - tryptophyl - glycyl-N" - tert. - butyloxycarbonyl - lysyl - prolyl - valylgfycyl-NMert.-butyloxycarbonyl-lysyl-NMert.-butyloxycarbonyl-lysyl-arginyl-Y,
in der Y die oben angegebene Bedeutung hat, in bekannter Weise hergestellt werden.
Ebenso erhält man das Octadekapeptid der Erfindung, indem man tert.-ButyloxycarDonyl-/S-alanyltyrosyl
- seryl - methionyl - γ - tert. - butyl - glutamylhistidyl
- phenylalanyl - arginyl - tryptophyl - glycyl-Ne - tert. - butyloxycarbonyl - lysyl - prolyl - valyl - glycin
mit Nc- tert. - Butyloxycarbonyl - lysyl - Nc- tert. - buty 1-oxycarbonyl-lysyl-arginyl-Y,
in dem Y die oben angegebene Bedeutung hat, in bekannter Weise kondensiert.
■ o Alle bei diesen Verfahren verwendeten Schutzgruppen
können durch katalytische Reduktion, Reduktion mit Natrium in flüssigem Ammoniak, Hydrolyse
oder Behandlung mit einem sauren Medium, wie Trifluoressigsjure, Essigsäure, Ameisensäure, einem
Halogenwasserstoff, z. B. Fluorwasserstoff, Bromwasserstoff oder Chlorwasserstoff, einer Halogenwasserstoffsäure,
z. B. Fluorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure oder Chlorwasserstoffsäure, oder ein
Gemisch dieser Verbindungen, entfernt werden.
Das nach den vorstehenden Verfahren hergestellte Octadekapeptid kann nach bekannten Verfahren,
wie Säulenchromatographie mit Ionenaustauscherharzen, lonenaustauschercellulose oder Sephadexionenaustauscher
oder Gegenstromverteilungsverfahren gereinigt werden.
Je nach den verwendeten Reaktionsbedingungen erhält man das Octadekapeptid der Erfindung in
Form der freien Base oder seines Salzes mit einer Säure. Diese Salze können hergestellt werden, indem
man das Octadekapeptid mit einer anorganischen Säure, wie einer Halogenwasserstoffsäure, z. B. Fluorwasserstoffsäure,
Bromwasserstoffsäure oder Chlorwasserstoffsäure, einem Halogenwasserstoff, z. B.
Chlorwasserstoff. Bromwasserstoff oder Fluorwasserstoff. Schwefelsäure oder Phosphorsäure, oder mit
einer organischen Säure, wie Essigsäure, Ameisensäure, Propionsäure, Glykolsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure,
Oxalsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Weinsäure, Citronensäure.
Benzoesäure, Zimtsäure, Methansulfonsäure, Benzolsulfonsäure oder Toloulsulfonsäure in bekannter Weise
umsetzt.
Das Octadekapeptid zeigt ausgeprägte biologische Aktivität, z. B. eine stimulierende Wirkung auf die
Nebennierenrinde, lipolytische und melanozytenstimulierende Wirkung, die höher ist, als die von natürlichem
Corticotropin und von verwandten, bekannten Peptiden.
Das Octadekapeptid der Erfindung ist deshalb besonders bei der Behandlung von akutem und chronischem Gelenkrheumatismus und allergischen Krankheiten verschiedener Organe von Tieren und Menschen wertvoll. Verschiedene pharmakologische Eigenschaften des Octadekapeptids sowie dessen biologische
Das Octadekapeptid der Erfindung ist deshalb besonders bei der Behandlung von akutem und chronischem Gelenkrheumatismus und allergischen Krankheiten verschiedener Organe von Tieren und Menschen wertvoll. Verschiedene pharmakologische Eigenschaften des Octadekapeptids sowie dessen biologische
SS Daten sind nachstehend angegeben.
Die corticotrope Aktivität des Octadekapeptids der Erfindung wurde nach fünf verschiedenen Verfahren
bestimmt, wobei als Vergleichssubstanzen natives Schafcarticotropin (0,-ACTH)5ACTH(I-IS)-Nh2 und
GIy-ACTH(I-IS)-NH2 dienten. Die ascorbinsäureentziehende
Aktivität der Nebennierenrinde von hypophysenektomierten Ratten wurde nach dem in United
States Pharmacopeia XVlI, 147 (1965), beschriebenen Verfahren bestimmt. Die in vitro-steroidbildende
Gs Aktivität wurde nach dem Verfahren von Saffran
und S c h a 11 y (Endoerinol, 56,523 [1955]) bestimmt.
Die in vivo-steroidbüdende Aktivität bei intravenöser
Verabreichung an hypophysenektomierte Ratten wur-
de nach dem Verfahren von L i ρ s c ο m b und Nelson (Endocrinol., 71, 13 [1962]) mit einer
kleineren Modifikation (A. Tanaka und C. H. Li, Endocrinol. Japonica, 13, 180 [1966]) bestimmt. Die
in vivo-steroidbildende Aktivität wurde auch an der mit Dexamethason-Pentobarbital betäubten Maus
bestimmt (A. T a η a k a und N. Nakamura, »Integrative mechanism of neuroendocrine system«, Hokkaido
University Medical Library Series, Vol. 1, 49 [1968]). Zusätzlich wurde die steroidbildende Aktivität
bei intramuskulärer Verabreichung an hypophysenektomierte Ratten bestimmt, wobei ein Präparat von
0,05 ml/Ratte in den Rattenschenkelmusk :1 injiziert
wurde und 30 Minuten nach der Injektion eine Blutprobe aus der abdominalen Aorta entnommen wurde.
Während des ganzen Experimentes wurde der »Third USP Corticotropin Reference Standard« als Standard
verwendet und die Bildung von 11-Hydroxycarticosteroiden
(11-OHCS) nach dem fluoreometrischen
Verfahren von Peterson (J. Biol. Chem., 225, 25
[1957]) bestimmt. Bei jedem Bestimmungsverfahren wurden üblicherweise mehrere Messungen durchgeführt,
und die unabhängig voneinander erhaltenen Werte wurden nach dem statistischen Verfahren von
Sheps und Moore ausgewertet (J. Pharmacol.
Extl. Therap., 128, 99 [I960]). Die Ergebnisse dieser
Bestimmungen mit dem Octadekapeptid der Erfindung werden im folgenden mit den Ergebnissen von
bekannten Corticotropinpeptiden und von natürlichem Corticotropin verglichen.
Tabelle I
Adrenocorticotrope Aktivitäten von Schafcorticotropin und verwandten, synthetischen Octadekapeptiden
Adrenocorticotrope Aktivitäten von Schafcorticotropin und verwandten, synthetischen Octadekapeptiden
Verfahren
Adrenale ascorbinsäureentziehende Wirkung
In vitro-Steroidgenese
In vivo-Stero.dgenese
In vivo-Steroidgenese bei
mit Dexamethason-Nembutal
mit Dexamethason-Nembutal
betäubter Maus
peripherem Blut von hypophysenektomierter Ratte
Verabreichungsart
subkutan
in vitro
intravenös
intravenös
intramuskulär Peptid
la
45,4
13,7
92,0
13,7
92,0
Ib
25,6
20,8
167
20,8
167
70 bis 168
35,4
135
237
125 bis 285
259
124
«,-ACTH
120
120
100 bis 180
Anmerkung · Die Aktivitäten werden ausgedrückt in USP-Einheiten/mg, in bezug auf den »Third USP Corticotropin Reference Standard«.
Die Abkürzungen bedeuten: Ia = ACTH(I-18)—NH21Ib = Gly1—ACTH(I-18)—NH2,! = (/5-Ala1)—ACTH(I-18)—NH„«, = natives
Schafcorticotropin.
Wie aus Tabelle I hervorgeht, hat das Octadekapeptid 1 der Erfindung in jeder Beziehung eine hohe
nebennierenstimulierende Aktivität. Die in vivosteroidbildende Aktivität von Peptid I liegt bei intravenöser
Verabreichung in der gleichen Größenordnung wie Ia und Ib und as-ACTH. Jedoch weist das
Peptid I eine auffallend höhere Aktivität als Ia und Ib auf, wenn sie durch die in vitro-Steroidgenese und
den adrenalen Ascorbinsäureentzug bestimmt wird. Außerdem ist es bemerkenswert, daß das Verhältnis
von subkutaner Verabreichung oder bei in vitro-Bestimmung zur intravenösen Verabreichung für das
Peptid I den Wert 1:0,5 ist, während die Verhältnisse für die Peptide Ia und I b den Wert 1:7 bzw. 1:8 haben.
Peptid I gleicht in dieser Hinsicht mehr als Ia und Ib dem nativen Hormon (O5-ACTH), welches das Verhältnis
1:1 aufweist.
Fig. 1 zeigt, daß (0-AIa1J-ACTH(I-IS)-NH- (I)
langer aktiv bleibt als Gly*-ACTH(1-18)-NH: (Ib)
und natürliches ACTH, wenn die Peptide I und I b in einer Dosis von 5 ^g/Ratte (1 mg Peptid/ml) und
natürliches ACTH (J 25 Millieinheiten) intramuskulär in den Schenkelmuskel von hypophysenektomierten
Ratten injiziert werden, wobei die steroidbildende Aktivität durch den 11-Hydroxycorticosteroid-(11-OHCS)-Spiegel
im Plasma ausgedrückt wird.
Das Octadekapeptid O?-Ala')-ACTH(1-18)-NH2 [I)
weist eine ausgeprägt hohe lipolytische Aktivität auf,
die in Tabelle II mit den Aktivitäten von synthetischen Peptiden verglichen wird: ACTH(I-18) NH2
tfa), CRy1-ACTH(l-lS)-NH2 (Ib) und Schafcorticotropin
(α,-ACTH).
In vitro-lipolytische Aktivität von natürlichem
Corticotropin und verwandten synthetischen
Octadekapeptiden
Minimale wirksame Dosis | 6 mg/50 mg Gewebe) | 1 | «,-ACTH | |
(10- | Ib | |||
Ia | 0,62 | 6,0 | ||
Adipöses | 6,3 | |||
Rattengewebe.... | 3,0 | 0,065 | 7,1 | |
Adipöses | 0,35 | |||
Kaninchengewebe | 0,004 | |||
Verhältnis | 10 | 1 | ||
Ratte/Kaninchen | 20 | |||
(annähernd) | 750 |
Anmerkung: Die lipolytische Aktivität wurde nach dem von T a η a k a et al beschriebenen Verfahren (Arch. Biochcm. Biopbys,
99. 294 [19621) mit Rattenepitfdymal- und Kaninchenperirenalfett gewebe bestimmt. Das Ansteigen der Konzentration von f. ei en
Fettsäuren im Medium und im Gewebe dient als Parameter. Die Aktivität wird ausgedrückt durch die minimale wirksame Dosis
pro 50 mg Gewebe.
Wie aus Tabelle II hervorgeht, ist die lipolytische Aktivität des Octadekapeptids I der Erfindung ungeföihr
lOmal größer als die von Ia, Ib und α,-ACTH,
wenn sie an der Ratte bestimmt wird Im Vergleich zur Ratte kann beim Kaninchen eise geringere Menge
von Peptid I die gleiche Aktivität ausüben. Dasselbe Verhältnis wird bei den anderen Peptiden Ia und Ib
beobachtet. Es ist jedoch festzustellen, daß das Ver-
3644
hältnis der minimalen wirksamen Dosis beim Fettgewebe der Ratte zur Dosis beim Fettgewebe des
Kaninchens für das Peptid I kleiner ist als für Ib und Ia. Dies bedeutet, daß das Peptid I der Erfindung
dem natürlichen Hormon verwandter ist als die Peptide I a und Ib.
Die Fig. 2 und 3 geben die Inaktivierung von
Peptid I und Ib als lipolytische Mittel in frischem Plasma und in Puffer, der Bruchstücke von Rattenmuskulator
enthält, wieder. Dabei wurde im Fall von Plasma kein signifikanter Unterschied zwischen
Peptid I und I b festgestellt, während im Gewebe die Inaktivierung von Peptid I gegenüber der von Ib
merklich verzögert war. Die Inaktivierung der lipolytischen Aktivität durch Plasma und durch Gewebe
wurde auf folgende Weise durchgeführt. Eine Peptidprobe wurde in frischem Plasma von betäubten Ratten
oder in Krebs-Ringer-Bicarbonatpuffer gelöst, der Rinderserumalbumin, Bruchstücke von Rattenschenkelmuskulatur
und Glucose enthielt. Das Gemisch u>
wurde dann bei 37° C inkubiert und die lipolytische Aktivität nach dem oben angegebenen Verfahren
nach Inkubationszeiten von 0,5, 1, 2 und 4 Stunden bestimmt.
Die biologische Halbwertszeit von (/f-Ala1)-ACTH(1-18)-NH2
(I), das intravenös hypophysenektomierien Ratten mit einem Gewicht von 200 bis
250 g injiziert worden war, wurde bestimmt. Zu verschiedenen Zeiten nach der Injektion wurden Blutproben
aus der abdominalen Aorta entnommen. Das abgetrennte Plasma wurde auf einen pH-Wert von
4 bis 5 mit 1 η-Salzsäure eingestellt, und als Parameter für die verbleibende biologische Aktivität im
Plasma wurde die in vitro-lipolytische Aktivität unter
Verwendung von epidymalem Rattenfettgewebe, wie oben erwähnt, bestimmt Die Ergebnisse sind im
Vergleich zu den lipolytischen Aktivitäten von natürlichem
Corticotropin (ACTH) und GIy1-ACTH(I-18)-NH2
(Ib) in folgender Tabelle wiedergegeben.
Zeit nach | viiro-lipolytische Aktivität | Tabelle III | ± 0,028 | (100%) | Erzeugung von freien Fettsäuren, u Äq,100 mg | 0,179 | ± | I | (100%) | |
Injektion, | ± 0,447 | (83%) | 2,148 | ± | 0,076 | (49%) | ||||
In | Minuten | ± 0,556 | (77%) | 1,140 | ± | 0,i28 | (29%) | |||
0 | ± 0,337 | (77%) | 0,751 | ± | 0,099 | (32%) | ||||
0,5 | ± 0,364 | (33%) | 0,815 | ± | 0,053 | (13%) | ||||
1 | von (S-AIa1U-ACTH(I-IS)-NH2, GIy1-ACTH(I-IS)-NH2 | ± 0,180 | 0,431 | ± | 0,090 | (16%) | ||||
2 | und natürlichem Corticotropin (intravenöse Injektion) | — | (9%) | 0,487 | ± | 0,079 | (17%) | |||
4 | ± 0,056 | (3%) | 0,512 | ± | 0,J80 | |||||
8 | ± 0,028 | 0,055 | ||||||||
12 | — | |||||||||
16 | ||||||||||
32 | natürl. ACTH | |||||||||
0,129 | ||||||||||
3,082 | Ib | |||||||||
2,587 | 0,094 ± 0,016 | |||||||||
2,409 | 3,004 ± 0,236 (100%) | |||||||||
2,396 | 1,217 ± 0,139 (39%) | |||||||||
1,108 | 1,622 ± 0,239 (53%) | |||||||||
0,777 ±0,113 (24%) | ||||||||||
0,380 | 0,243 ± 0,087 (5%) | |||||||||
0,212 | C252 ± 0,063 (5%) | |||||||||
0,263 ± 0,079 (6%) | ||||||||||
— | ||||||||||
Aus den oben angegebenen Werten wurde die Halbwertszeit von natürlichem ACTK, Ib und I der
lipolytischen Aktivität zu 266 Sekunden, 117 Sekunden bzw. 188 Sekunden bestimmt. Eine Darstellung der
lipolytischen Aktivität dieser Peptide ist in F i g. 4 gegeben. Es ist ersichtlich, daß (/3-AIa1J-ACTIh(I-IS)-NHj (I)
im Plasma signifikant länger als GIy^ACTH(I-IS)-NH2 (Ib) beständig ist.
In ähnlicher Weise wurde die biologische Halbwertszeit von I bei intramuskulärer Injektion an hypophysenektomierten
Ratten gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV und in F i g. 5 wiedergegeben.
Lipolytische Aktivität von natürlichem Corticotropin (ACTH), Ο1/-ΑΰΤΗ(1-18)-ΝΗ2 (Ib)
und (/J-AIa1 )»ACTH(I-18)-NH2 (I) bei intramuskulärer Injektion
und (/J-AIa1 )»ACTH(I-18)-NH2 (I) bei intramuskulärer Injektion
Zeit nach | natürl. ACTH | (48,5%) | (68,6%) | Erzeugung von freien Fettsäuren, μ Aq/100 mg | (57,7%) | 0,193 | ± | 1 | (100%) |
Injektion, | 0,097 ± 0,032 | (93,9%) | (56,7%) | (100%) | 0,060 | (54,9%) | |||
Minuten | 0,922 ± 0,540 | 1,797 ± 0,392 (100%) | (22,2%) | (50,9%) | — | (97,9%) | |||
0 | 1,693 ± 0,356 | 1,264 ± 0,320 | (6,6%) | (56,2%) | 3,630 | ± | — | (92,8%) | |
2 | 1,061 ± 0,396 | (64,5%) | 2,080 | ± | 0,631 | (49,0%) | |||
5 | 0,474 ± 0,302 | (45,0%) | 3,558 | ± | 0,285 | ||||
10 | 0,209 ± 0,056 | 3,382 | ± | 0,407 | |||||
20 | 1,876 | ± | 0,542 | ||||||
30 | 0,337 | ||||||||
60 | |||||||||
90 | |||||||||
Ib | |||||||||
0,033 ± 0,033 | |||||||||
— | |||||||||
1,772 ± 0,322 | |||||||||
3,047 ± 0,229 | |||||||||
1,568 ± 0,235 | |||||||||
1,727 ± 0,429 | |||||||||
1,977 ± 0,098 | |||||||||
1,390 ± 0,121 | |||||||||
Anmerkung: Die Zahlen in Klammern geben die relative lipolytische Aktivität in bezug auf den 10-Niinuten-Wert nach der Injektion
für jedes Hormon wieder.
Die Halbwertszeit von ACTH, Ib und 1 wurde zu 1389,4516 bzw. 4516 Sekunden bestimmt. Es ist festzustellen,
daß die Halbwertszeit des Octadekapeplids I der Erfindung ungefähr u eimal so lang ist, wie die von
natürlichem Corticotropin, wie aus F i g. 5 hervorgeht. >
DieAngreifbarkeitvont/J-Ala1
>-ACTH(l -18)-NH, (I)
durch Schweinenieren-Leucinaminopeptidase (LA P) wurde mit der von ACTH(1-18)-NH2 (Ia) und
GIy-ACTH(I-IS)-NH2 ab) verglichen.
Fig. 6 zeigt die Wirkung von mit Diisopropylfluorphosphat
(DFP)-behandelter Aminopeptidase auf die Peptide I, Ia und Ib. Aus Fi g. 6 geht hervor, daß
das Octadekapeptid I der Erfindung über einen längeren Zeitraum hinweg als die bekannten Peptide Ia
und Ib ohne eine rasche Inaktivierung durch einen Angriff der Aminopeptidase im Gewebe beständig
bleibt, weswegen das Peptid I für therapeutische Zwecke sehr wertvoll ist. Die Untersuchungen der
Angreifbarkeit der synthetischen Peptide werden im folgenden näher beschrieben.
Es war in Vorversuchen festgestellt worden, daß ein Präparat von handelsüblicher LAP (^-AIa1)-ACTH(I-IO)-OH.
das aus dem entsprechenden geschützten Dekapeptidtert.-ButyIoxycarbona!-/S-alap >
1-tyrosyl - seryl - methionyl - > - tert - butyl - glutamylhistidyl-phenylalanyl-arginyl-tryptophyl-glycin
(XVl) durch Behandlung mit Ameisensäure hergestellt u urde.
und M-AIa1 )-ACTH(l-18>-NH2 (I), aber nicht
/f-AIanyl tyrosyl-seryl-methioninhydra/id, das aus
tert. - Biityloxycarbonyl - β - alanyl - tyrosyl - seryl- v>
methionin-h vdrazid (Vll)durch Behandlung mit Ameisensäure
hei gestellt wurde, hydrolytisch spaltet. Durch einen Aminosäureanalysator wurde in den en/jmatischen
Spaltprodukten kein /ϊ-Alanin entdeckt. Deshalb
muß die beobachtete Hydrolyse auf die Gegen- 3s wart einer Endopeptidasenverunreinigung in der LAP-Präparation
zurückzuführen sein. Diese scheinbare Empfindlichkeit von /J-Alanylpeptiden gepenüber dem
LAP-Präparat verschwand vollständig, wenn das Enzympräparat vorher mit Diisopropylfluorphosphat
(DFP) behandelt worden war. Durch die DFP-behandelte LAP wurde das Ser'-Peptid (la) schneller
als das Gly'-Peptid (Ib) hydrolysiert, während am
/S-AIa1-Peptid (I) innerhalb der Meßgenauigkeit keine
Hydrolyse beobachtet wurde.
Die DFP-behandelte LAP wurde dadurch erhalten, daß man eine Suspension des Enzyms in zu 75° 0 gesättigter
Ammoniumsulfatlösung bei 4° C gegen eine 0,005-m Magnesiumchloridlösung dialysierte, die 5 mg
Enzym enthaltende LA P-Suspension mit 0,0005-m Tris-Puffer auf das fünffache verdünnte, die verdünnte
Enzymlösung mit 0,08 ml l-m Diisopropylfluorphosphat in Isopropanol versetzte, das Gemisch 45 Minuten
bei 37°C inkubierte und dann das Gemisch bei 4°C gegen 0,0005-m Tris-Puffer dialysierte
Die LAP-Aktivität der Enzymlösung wurde bei einem pH-Wert von 8,3 und 25°C gemäß Tuppy
et al (Z. Physiol. Chem. 329, 278 [1962]) mit einigen Modifikationen unter Verwendung von L-Leucinp-nitroanilid
(LNA) als Substrat bestimmt. Eine LAP-Einheit wurde vorläufig als die Enzymmenge
definiert, die bei 400 ηΐμ gegenüber einer Leercuvette
einen Extinktionszuwachs von 0,001 pro Minute erzeugt. Es wurden 1-cm-Cuvetten in einem Hit:achi-Spektrophotometer
verwendet. fts
Für die Messungen der Spaltung des synthetischen Substrates durch LAP wurde ein Gemisch aus 1 Teil
O,lmillimolarer Lösung des Substrates in Wasser,
1 Teil 0,05-m Tris-Puffer vom pH-Wert 8,3 und ein halben Teil Enzym (4,88 Einheiten/ml LNA al
Substrat) bei 37° C inkubiert. Aus dem inkubiertei Gemisch wurden 0,5 ml Proben entnommen und so
fort mit jeweils 0,5 ml Ninhydrin-Reagens vermisch! Das Gemisch wurde dann im kochenden Wasserbai
15 Minuten lang erhitzt. Nach dem Abkühlen un< geeignerer Verdünnung mit 50%igem Äthanol wurdi
die Absorption bei 570 πΐμ mit einem Hitachi-Spektro
photometer gemessen. Bei jeder Durchführung de; Versuchs wurden zur Kontrolle Inkubatioßjgemisctu
ohne Substrat oder ohne Enzym bestimmt. Bei da Ninhydrinreaktion wurde auch eine Standardlösuni
von L-Leucin jeweils als Bezug getestet. Die Ergebnisse der enzymatischen Spaltung der Peptide I, Ia und It
durch DFP-behandelte LAP sind in Fig. 6 wiedergegeben, wobei die Aminosäurefreisetzung als Leucinkonzentration
angegeben ist.
Die Bestimmung der in vitro-melanozytenstimulierenden
Aktivität von (^f-AIa1 J-ACTH(I-18)-NH2 wurde
nach einem von K. Shizume.A. B. Lerner und T. B. Fitzpatrick (Endocrinol., 54, 553 [1954])
angegebenen Verfahren unter Verwendung von Rana pipiens als Versuchstier durchgeführt, wobei mit den
Aktivitäten von GIy^ACTH(I-IS)-NH2 und
ACTHd-24)-OH (Synacthen®. Ciba Co.,) verglichen
wurde. Als Bezugswert wurde natürliches reines a-melanozytenstimulierendes Hormon (a-MSH) verwendet.
Die Ergebnisse sind in Tabelle V wiedergegeben.
In vitro-iTielanozytenstimulierende Aktivität von
MH(MS)-NH2, Giy-ACTHdlSN
undACTH(l-24)-OH
(/?-Ala')-ACTH(l-18)-NH2
Gly'-ACTHd-l S)-NH2...
ACTH(I-24)-OH
Gly'-ACTHd-l S)-NH2...
ACTH(I-24)-OH
MSH-Aktivität, Einheiten/g
9,6
6,7 2,1
10° 10"
108
Die melanozytenstimulierende Aktivität von (/MACTHd-iej-NHj ist auffallend höher als
die von GI^-ACTH(I-IS)-NHj undACTH(l-24)-OH.
Da natürliches Schweinecorticotropin nach R. G. S h e ρ h e r d et al, (J. Am. Chem. Soc, 78,5051 [1956])
eine melanozytenstimulierende Aktivität von 1,7· 10 Einheiten/g aufweist, ist die melanozytenstimulierende
Aktivität von (0-Ala')-ACTH(l-18)-NH2 der Erfindung
ungefähr 50tnal so groß wie die von natürlichem Schweinecorticotropin.
Das Octadekapeptid der Erfindung kann in die entsprechenden Schwermetallkomplexe, z. B. mit Zinkchlorid,
Zinkhydroxid, Zinkacetat, Zinksulfat, Kupferchlorid, Nickelchlorid, Kobaltchlorid oder Eisenchlorid,
in Komplexe mit Polyaminosäuren, ζ. Β. Poly-L-g!utaminsäure, Poly-D-glutaminsäure, PoIy-DL-glutaminsäure,
Poly-L-asparaginsäure, PoIy-D-asparaginsäure,
Poly-DL-asparaginsäure oder Copoly-L-glutamyl-Tyrosin
oder in gemischte Komplexe übergeführt werden, die eine länger anhaltende Aktivität
im Blut als das freie Octadekapeptid zeigen. Wenn z. B. ein Zinkkomplex von (/3-AIa1 )-ACTH(1-18)-NH2)
der aus 0,5 mg Peptid, 0,25 ml
einer 40mfltimolaren Zinkchloridlösung, 4,5 mg Natriumchlorid
und 0,25 ml einer 40millimolaren Dinatriumhydrogenphosphatlösung
besteht, durch intramuskuläre Injektion an Ratten in einer Dosis von
5 μΙ/Ratte verabreicht wurde, betrug die Menge an ll-Hydroxycorticosteroid im Plasma 2 Stunden nach
der Injektion 80 μg/ml, während im Fall einer Präparation
ohne Zinkchlorid nur 6 ^g/ml Corticosteroid gefunden wurden. Deshalb ist es vorteilhaft, diese
Komplexe für therapeutische Zwecke zu verwenden. Man erhält diese Komplexe, indem man das Octadekapeptid
mit einer Schwermetallverbindung oder einer Polyaminosäure oder einem Gemisch derselben in
einem Gewichtsverhältnis von etwa 1:0,1 bis 20 unter schwach sauren Bedingungen, insbesondere bei
einem pH-Wert von 6,5 bis 7,0, behandelt. Bei der Behandlung
von Polyaminosäuren beträgt das bevorzugte Molekulargewicht der Polyaminosäuren etwa 1000
bis 100000, insbesondere 2000 bis 6000. Bei der Herstellung
der Komplexe können gegebenenfalls geeignete Träger, Konservierungsmittel, Puffer, Stabilisatoren
und isotonisierende Verbindungen zugesetzt werden.
Das Octadekapeptid der Erfindung, seine Salze mit Säuren und Komplexe kann oral oder parenteral in
üblichen Darreichungsformen verabreicht werden, z. B. als Injektionspräparate, Flüssigkeiten, Suspensionen,
Emulsionen, Aerosole oder Tabletten, im Gemisch mit Trägern, Stabilisatoren, Emulgatoren,
Konservierungsmitteln, Puflern, isotonisierenden Verbindungen
und/oder Netzmitteln.
Die wirksame Dosis kann von Ärzten leicht unter Zugrundelegung der hier angegebenen Werte bestimmt
werden. Zum Beispiel beträgt eine typische klinische Dosis des Octadekapeptids der Erfindung
ungefähr 0,2 bis 0,8 Einheiten/kg fur eine normale erwachsene Person. Das OUadekapeptid der Erfindung
wird vorzugsweise in Form eines Injektionspräparates verabreicht.
Die Beispiele erläutern die Erfindung. In den Beispielen verhalten sich Gewichtsteile zu Volumteilen
\vie Gramm zu Millimeter.
Herstellung von
Ne-tert.-Butyloxycarbonyl-0-alanyl-tyrosylseryl-methionin-hydrazid
(XI)
1. N"-tert.-Butyloxycarbonal-/}-aianin (V)
8,91g /9-Alanin werden in 100 ml 1 n-Natriumhydroxydlösung
gelöst. Die Lösung wird mit 21 g Natriumhydrogencarbonat und 70 g Dioxan versetzt.
Die Lösung wird bei 50 C gerührt, und eine Lösung von 17,2 g Azidameisensäure-tert.-butylester in 30 ml
Dioxan wird tropfenweise zugesetzt. Das Gemisch wird 41,5 Stunden bei der gleichen Temperatur gerührt
und hierauf unter vermindertem Druck auf etwa 100 ml eingedampft. Die konzentrierte Lösung wird
mit Eis gekühlt und mit 180 ml 4 η-Salzsäure auf pH 2 eingestellt. Die Lösung wird mit ungefähr 100 ml
eiskaltem Essigsäureäthylester ausgeschüttelt, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter
vermindertem Druck bis zu einem sirupösen Rückstand eingedampft. Der Rückstand wird aus Essigsäureäthylester/Petroläther
kristallisiert Man erhält 12,6 g des gewünschten Produktes vom K 77 bis 78°C.
QH15NO4:
Berechnet
gefunden .
gefunden .
C 50,78, H 7,99, N 7,40;
C 50,99, H 8,06, N 7,47.
C 50,99, H 8,06, N 7,47.
2. N*-tert-Butyloxycarbonyl-/S-alanyliyrosin-methylester
(VI)
3,48 g Tyrosinmethylester-hydrochlorid werden in 15 ml Wasser gelöst. Die Lösung wird mit 5 ml
ίο 50%iger Kaliumcarbonatlösung unter Eiskühlung
versetzt, und das Gemisch wird bei 4° C 40 Minuten stehengelassen. Die gebildeten Kristalle werden abfiltnen,
mit kaltem Wasser gewaschen und im Exsikkator getrocknet. Man erhält 2,55 g Tyrosinmethylester.
Andererseits werden 1,89 g des oben erhaltenen Ne-tert.-Butyloxycarbonyl-/?-alanins in wasserfreiem
Tetrahydrofuran gelost. Die Lösung wird auf - 100C
abgekühlt. Diese Lösung wird anschließend langsam und unter Rühren mit 2,04 g n-tert.-Butyldmin und
1,19 g Chlorameisensäureäthylester versetzt. Nach 10 Minuten wird eine Suspension von 1,95 g des oben
erhaltenen Tyrosinmethylesters in 2ü ml wasserfreiem Tetrahydrofuran zugesetzt. Das Gemisch wird 30 Minuten
bei -100C und 2,5 Stunden bei Raumtemperatur
gerührt. Anschließend wird das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abgedampft. Der erhaltene
Rückstand wird in Essigsäureäthylester gelöst, anschließend mit 1 η-Salzsäure, Wasser, 5%iger Natriumhydrogencarbonatlösung
und Wasser gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels durch Eindampfen unter
vermindertem Druck wird der erhaltene Rückstand zur Ausfällung von Kristallen mit Äther versetzt.
Man läßt 20 Stunden stehen, filtriert die gebildeten Kristalle ab und trocknet im Exsikkator. Man erhält
2,99 g des Dipeptidesters. Nach dem Umkristallisieren aus Methanol/Äther erhält man Kristalle vom
F. 141 bis 142°C; [α]? = +8,2±0,5° (c = 1,020,
Methanol).
Q8H26N2O6:
Berechnet .
gefunden ..
gefunden ..
C 59,00, H 7,15, N 7,65;
C 59,03, H 7.12, N 7,63.
C 59,03, H 7.12, N 7,63.
3. N"-tert.-Butyloxycarbonyl-/i-alanyl-tyrosinhydrazid
(VIII)
2,56 g NMert-Butyloxycarbonyl-zi-alanyl-tyrosinraethylester
(VI) werden in 26 ml wasserfreiem Ä thanol gelöst. 1,7ml Hydrazinhydrat werden der lösung
zugesetzt, und das Gemisch wird 5 Stunden bei Raumtemperatur und 20 Stunden bei 4° C gehalten. Die
gebildeten Kristalle werden abfiltriert, mit Äthanol und Äther gewaschen und getrocknet. Man erhält
2,54 g des gewünschten Dipeptid-hydrazids. Nach dem Umkristallisieren aus heißem Wasser erhält man
Kristalle vom F. 213,5 bis 215°C; [a]|? = +3,6±0,6° (c = 0,978, 50%ige Essigsäure).
to C17H16N4O5:
Berechnet .
gefunden ..
gefunden ..
C 55,72, H 7,15, N 15,29;
C 55,74, H 7,11, N 15,30.
C 55,74, H 7,11, N 15,30.
4. N"-tert.-Butyloxycarbonyl-/}-alanyl-tyrosylseryl-methionin-methylester
(X)
1,10g NMert-Butyloxycarbonyl-j3-aianyl-tyrosinhydrazid
(VIII) werden in 7,5 ml kalter 1 n-Salzsäure gelöst. Die Lösung wild bei ungefähr — 100C gehalten
und mit 3,6 ml 2-m kalter Natriumnitritlösung versetzt.
Man läßt das Gemisch 4 Minuten stehen, schüttelt das entstandene Azid mit Äther aus, wäscht
mit 1-m Natriumhydrogencarboiiatlösung und trocknet
übei wasserfreiem NatiisiTnsulfat. Nach dem Entfernen
des Lösungsmittels durch Eindampfen unter vermindertem Druck bei einer Badtemperatur von
ungefähr 10° C wird der entstandene Rückstand in kaltem Acetonitril gelöst Man gibt 0,756 g Serylmeiüionin-methylester
(IX) zu, der nach den Vor-Schriften der Literatur: Bull. Chem. Soc. Japan, 39,
1171 (1966), hergestellt wurde, und läßt das Gemisch
48 Standen stehen. Das Lösungsmittel wird durch Eindampfen unter vermindertem Druck entfernt,
und der Rückstand wird durch Zugabe von Essigsäureäthylester und portionsweise Zugabe von Wasser
gelöst. Die Lösung wird anschließend mit 1-n kalter Salzsäure, Wasser, 5%:;;er Natriujihydrogencarbonatlösung
und Wasser gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels
durch Eindampfen unter vermindertem Druck wird das entstandene gelatinöse Produkt abfiltriert, mit
kaltem Essigsäureäthylenester und Äther gewaschen und getrocknet. Man erhält 1,20 g des gewünschten
Tetrapeptidmethylesters. Das Produkt wird durch Umfallen aus Essigsäureäthylester gereinigt. F. 121,5
bis 123°C. [a] S3 = -13,0 ± 0,6c (c = 0,997, Methanol)
Rf 0,53 (bei Dünnschichtchromatographie im Lösungsmittelsystem Methanol zu Essigsäure = 15:85).
C26H40N4O9S:
Berechnet ... C 52,41, H 6,90, N 9,58, S 5,48;
gefunden .... C 52,94, H 6,85, N 9,65, S 5,48.
gefunden .... C 52,94, H 6,85, N 9,65, S 5,48.
5. N"-tert.-Butyloxycarbonyl-/S-alanyl-tyrosylseryl-methionin-hydrazid
(XI)
0,97 g N"-tert.-ButyIoxycarbonyl-/3-alanyl-tyrosylseryl-methionin-methylester
(X) werden in 6 ml Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird mit 0,5 ml Hydrazinhydrat versetzt, und das Gemisch wird
43 Stunden bei 4° C stehengelassen. Die Lösung wird mit Essigsäureäthylester versetzt. Es entsteht ein
gelatinöses Produkt, das abnitriert, mit kaltem Essigsäureäthylester
gewaschen und getrocknet wird. Man erhält 1,01 g des gewünschten Tetrapeptid-hydrazkis.
Nach dem Umkristallisieren aus Wasser erhält man Kristalle vom F. 186,5 bis 188° C; La]? = - 20,1 ± 0,5c
(c = 1,346, 50%iges Methanol).
C25H40O3N6S ■ H2O:
Berechnet ... C 49,82, H 7,02, N 13,94, S 5,32;
gefunden .... C 49,72, H 7,05, N 14,50, S 5,15.
gefunden .... C 49,72, H 7,05, N 14,50, S 5,15.
Herstellung von
y-tert.-Butyl-glutamyl-histidyi-phenylalanylarginyl-tryptophyl-glycin
(XIX)
Produkts vom F. 107 bis 11Γ C; [α] ί? = +13,0 ± 0,5°
(c = 2,062, Methanol).
C20H28N8O5 · HCOOH - V2H2O:
Berechnet ... C47,45, H 5,88, N 21,08;
gefunden .... C 47,25, H 6,03, N 20,90.
Berechnet ... C47,45, H 5,88, N 21,08;
gefunden .... C 47,25, H 6,03, N 20,90.
2 tert.-Butyloxycarbonyl-phenylalanyl-NG-nitroarginyl-tryptophyl-glycin-methylesicr
(XIV)
Diese Verbindung wird genau nach den Angabcder Literatur: Bull. Chem. Soc. Japan., 38, 1148
(1965), synthetisiert, mix der Ausnahme, daß das oben
erhaltene Tripeptidesterformiat an Stelle des Trifluoracetats
verwendet wird. Man erhält 4,06 g der gewünschten Verbindung, indem man 4,81 g NG-Nitroarginyl-tryptophyl-glycin-methylester-formiai
mit 4,42 g tert.-Butyloxycarbonyl-phenylalanin-dicyclohexyl-aminsalz
in Acetonitril nach dem Dicyclohexylcarbodiimidverfahren umsetzt. Man erhält ein
Produkt vom F. 176 bis 177 C; [α]? = -20,4±2°
(c = 2, Methanol).
C34H45N9O9:
Berechnet
gefunden .
gefunden .
55 C 56,42, H 6,27, N 17,42;
C 56,34, H 6,22. N 17,58.
C 56,34, H 6,22. N 17,58.
3. Phen ylalanyl-NG-nitro-arginyl-tryptophylglycin-methylester-formiat
(XV)
1,81 g tert.-Butyloxycarbonyl-phenylalanyl-NG-nitro-arginyl-tryptophyl-glycin-methylester
(XIV) werden in 18 ml Ameisensäure gelöst. Die Lösung wird 3,5 Stunden bei Raumtemperatur gehalten. Nach
dem Entfernen der Ameisensäure wird der Rückstand aus n-Butanol kristallisiert. Das kristalline Produkt
wird abfiltriert, mit Äther gewaschen und im Exsikkator getrocknet. Man erhält 1,71 g vom F. 124 bis
125,50C: [ap/ = -9,0 ±0,5° (c = 0,977, Methanol).
C29H37N9O7
Berechnet
gefunden .
gefunden .
HCOOH-V2H2O:
.. C 54,38, H 6,28, N 17,84;
.. C 53,00, H 6,iO, N 17,79.
.. C 53,00, H 6,iO, N 17,79.
1. Nitroarginyl-tryptophyl-glycin-methylesterformiat
(XIII)
5,77 g tert.-Butyloxycarbonyl-NG-nitro-arginyltryptophyl-glycin-methylester
(XII) werden in 50 ml 98 bis 100%iger Ameisensäure gelöst. Die Lösung wird 3,5 Stunden stehengelassen. Danach wird die
Ameisensäure durch Eindampfen bei einer Badtemperatur von 40 bis 45° C entfernt und der Rückstand
in Wasser gelöst. Die Lösung wird mit Äther gewaschen und lyophilisiert. Man erhält 4,86 g des gewünschten
4. N*,N' "-Dibenzyloxycarbor.yl-histidyl-phenyl-
alanyl-NG-nitrc-arginyl-tryptophyl-glycin-
methylester (XVI)
Man erhält dieses Peptid nach dem in Bull. Chem. Soc. Japan., 38, 1148 (1965), angegebenen Verfahren,
mit der Ausnahme, daß an Stelle des entsprechenden Trifluoracetats das oben erhaltene Tetrapeptidesterformiat
verwendet wird. Man stellt den Pentapeptidester aus 2,60 g Phenylalanyl-Na-nitro-arginyltryptophyl-glycin-methylester-formiat
und 1,91 g Na,N' "-Dibenzyloxycarbonyl-histidin-p-nitrophenylester
her. Man erhält 2,70 g [a] I' = -22,3 ±0,3° (c = 2,084, Dimethylformamid;.
C51H56N12O12 · H2O:
Berechnet ... C 58,50, H 5,58, N 16,05;
gefunden .... C 58,63, H 5,70, N 15,89.
gefunden .... C 58,63, H 5,70, N 15,89.
5. Histidyl-phenylalanyl-arginyl-tryptophyl-
glycin-monoacetat (XV5I)
1,44 g Na,Nlm - Dibenzyloxycarbonyl - histidylphenylalanyl
- NG - nitro - arginyl - tryptophyl - glycinmethy'ester
(XVl) werden in 90%igem Dioxan hydrolysiert und aus Essigsäure lyophilisiert. Man erhält
1,35 g Benzyloxycarbonyl - histidyl - phenyl - alanyl-NG-nitro-arginyl-tryptophyl-glycin
entsprechend dem
in Bull. Chem. Soc. Japan., 38, 1148 (1965), angegebenen
Verfahren.
0,72 g des oben erhaltenen Pentapeptids und 0,72 Volumteile Anisol werden in 7 bis 8 ml wasserfreiem
Fluorwasserstoff bei einer Badtemperatur von Trockeneis/Aceton-Gemisch gelöst. Danach wird das
Geraisch 30 Minuten bei 00C gerührt. Nach dem Entfernen
des Fluorwasserstoffes durch Eindampfen wird der Rückstand 15 Stunden über Natriumhydroxydplätzchen
getrocknet. Der Rückstand wird in 20 ml Wasser gelöst und die Lösung gründlich mit Essigsäureäthylester
gewaschen und dann über eine kleine »Amberlite® CG-400« (Acetatform)-Säule gegeben.
Die Säule wird portionsweise mit Wasser gewaschen Die wäßrigen Eluate werden vereinigt und lyophilisieit.
Man erhält 0,64 g Ali"01= 279 ΐημ (Ei™66,2), 288 πΐμ
(Ei ™53,5) und ^x"-*'""= 280 πΐμ (E1,^65,0), 288 πΐμ
(E'cm54,5). Papierchromatographie in n-Butanol zu
Essigsäure zu Pyridin zu Wasser = 30:6:20:24 Volumteile.
Es treten eine Hauptkomponente vom Rf 0,47 bis
0,53 und zwei Spuren auf, die alle auf Ninhydrin-, Pauly- und Ehrlichreagenzien reagieren. Nur die
Hauptkomponente reagiert mit Sakaguchireagens.
6. Benzyloxycarbonyl-y-tert-butyl-glutamyl-
histidyl-phenylalanyl-arginyl-tryptophyl-glycin-
monoacetat (XVlII)
Eine Lösung von 0,83 g der Verbindung (XVII) und 0,28 mlTriäthylaminin 10 ml 90%igem Dimethylformamid
wird bei 00C gerührt und mit 0,46 g Benzyloxycarbonyl
-γ- tert. - butyl - glutaminsäure - ρ - nitrophenylester versetzt. Das Gemisch wird 15 Stunden
bei 4°C gerührt. Eine zusätzliche Menge von 0,46 g des aktiven Esters wird zugegeben, und das Gemisch
wird bei 4° C gehalten, bis das Pentapeptid (XVII) sich durch Dünnschichtchromatographie nicht mehr
nachweisen läßt. Das Reaktionsgemisch wird dann tropfenweise in 100 ml eiskalten Essigsäursäthylester
gegeben. Man erhält einen gelatinösen Niederschlag, der abfiltriert, mit Essigsäureäthylester gewaschen
und im Exsikkator getrocknet wird. Das aus Essigsäure/Wasser ausgefällte Produkt ist das gewünschte
Hexapeptid. Man erhält 0,84 g [α]? = -26,6 ±0,5°
(c = 1,377, 50%ige Essigsäure),
CH3COOH · 7H2O:
Berechnet ... C 52,86, H 6,74, N 13,98;
gefunden .... C 52,73, H 6,85, N 13,92.
gefunden .... C 52,73, H 6,85, N 13,92.
7. y-tert-Butyl-glutamyl-histidyl-phenylalanylarginyl-tryptophyl-glycin-monoacetat
(XIX)
0,265 g der Verbindung XVIII werden in 10 ml 50%iger Essigsäure gelöst und in Gegenwart von
Palladiumschwarz 2,5 Stunden hydriert. Nach dem Abfiltrieren des Katalysators wird das Filtrat unter
vermindertem Druck bei einer Badtemperatur von 45 bis 50° C eingedampft. Der Rückstand wird aus
Essigsäure lyophilisieit und über Natriumhydroxydplätzchen im Exsikkator getrocknet Man erhält
©,22 g. Das Produkt verhält sich bei der Dünnschidlitchromatographie
in n-Butanol zu Essigsäure zu Wasser = 4:1:2 einheitlich.
,CH3COOH-SH2O:
... C 49,53, H 7,21, N 15,40;
... C49,46, H 6,77, N 15.49.
... C49,46, H 6,77, N 15.49.
Berechaet
Herstellung von
tert-Butyloxycarbonyl-^-alanyl-tyrosyl-
seryl-methionyl-y-tert.-butyl-glutamyl-histidyl-
phenylalanyl-arginyl-tryptophyl-glycin (XX)
Eine Lösung von 0,45 g der Verbindung XI in 4,5 Volumteilen 90%igem Dimethylformamid wird
in einer Kochsalz/Eis-Mischung gekühlt und mit 2,0 ml eiskalter 1 η-Salzsäure und 0,83 ml eiskalter
ίο l-m Natriumnitritlösung versetzt. Das Gemisch wird
4 Minuten gerührt und dann mit 20 ml eiskalter gesättigter Natriumchloridlösung und eiskaltem Essigsäureäthylester
versetzt. Die wäßrige Schicht wird abgetrennt und 2mal mit Essigsäureäthylester ausgeschüttelt.
Die organischen Phasen werden vereinigt, mit 5%iger kalter Natriumhydrogencarbonatlösung
gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und zu einer Lösung von 0,50 gXIXundO,21 ml Triäthylamin
in 15 ml Dimethylformamid gegeben. Das Gemisch wird bei einer Badtemperatur von 10 bis 15° C unter
vermindertem Druck zur Entfernung des Essigsäureäthylesters eingedampft. Die erhaltene klare Lösung
wird 15 Stunden bei 4° C stehengelassen. Eine zusätzliche
Menge von Azid, das aus 0,23 g XI nach dem oben beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, wird
zugesetzt, und das Reaktionsgemisch wird weitere 24 Stunden bei 4° C gehalten. Anschließend wird das
Gemisch tropfenweise in 200 ml eiskalten Essigsäureäthylester gegeben. Man erhält einen amorphen
Niederschlag, der abfiltriert, mit Essigsäureäthylester gewaschen und im Exsikkator getrocknet wird. Man
erhält 0,69 g. Nach Unifällen aus Dimethylformamid/ Methanol (2:5) erhält man das reine Dekapeptidderivat;
[α]ί? = -19,4 ±0,7" (c = 0,882, Dimethylformamid).
Bei der Dünnschichtchromatographie in Dimethylformamid zu Essigsäureäthylester zu Essigsäure
= 15:10:2 verhält sich das Produkt einheitlich (Rf = 0,54 bis 0,57).
C68H94N16O17S-SH2O:
Berechnet ... C 51,57, H 7,00, N 14,15, S 2.02:
gefunden .... C 51,62, H 6,66, N 14,06, S 2,64.
gefunden .... C 51,62, H 6,66, N 14,06, S 2,64.
Herstellung von
/3-Alanyl-tyrosyl-seryl-methionyl-glutamyl-
histidyl-phenylalanyl-arginyl-tryptophyl-glycyl-
lysyl-propyJ-valyl-glycyl-lysyl-I/syl-arginyl-
argininamid (XXIV)
Eine Lösung von 0,37 g der Verbindung XX in
10 ml Dimethylformamid wird bei 0°C mit 0,25 ml eiskalter 1 η-Salzsäure versetzt. Die Lösung wird
sofort in 200 ml eiskaltes Gemisch aus Essigsäureäthylester und Äther (1:1) gegeben. Der erhaltene
Niederschlag wird abfiltriert, mit Äther gewaschen
und im Exsikkator getrocknet. Die erhaltenen 0,36 g werden in 5 ml Dimethylfonnamid gelöst, und dazu
werden 0,115 g N-Hydroxysuccinimid und 0,21 g NJ^'-Dicyclohexylcarbodiimid nacheinander zugegeben.
Das Gemisch wird 15 Stunden bei 4° C stehengelassen.
Nach dem Abfiltrieren der Harnstoffverbindung wird das Filtrat in ein eiskaltes Gemisch aus
200 ml Äthylacetat und Äther (1:1) gegeben. Der Niederschlag wird abfiltriert, mit Äther gewaschen
und im Exsikkator getrocknet Man erhält 03 g des
aktiven Esters des Dekapeptids.
0,23 g des Triacetate von NMert.-Butyloxycarbonyllysyl
- prolyl - valyl-glycyl-N'-tert -butyloxycarbonyllysyl
- N' - tert. - butyloxycarbonyl - lysyl - arginyl-
argininamid werden in 3 ml Dimethylformamid gelöst
und mit 0,24 ml Triäthylamin versetzt. Dazu wird eine
Lösung von 0,39 g des oben erhaltenen aktiven E>ekapeptidesters
in Dimethylformamid gegeben und das Reaktions»emisch (Gesamtvolumen etwa 5 ml) wird
60 Stunden bei 4° C stehengelassen. Man erhält das Rohprodukt des geschützten Octadekapeptidü als
amorphen Feststoff, wenn das Reaktionsgemisch zu 100 ml kaltem Essigsäureäthylester gegeben wird.
Ausbeute 0,55 g.
0,55 g des geschützten Peptids werden zum Entfernen der Schutzgruppen in 6 ml 90%iger Trifluoressigsäure
gelöst. Die Lösung wird 60 Minuten bei Raumtemperatur gehalten. Danach wird das Lösungsmittel
durch Eindampfen unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wird in Wasser gelöst und die
Lösung über eine »Amberlite · CG-400« (Acetatform)-Säule
(2,2 χ 7 cm) gegeben. Die Säule wird portionsweise mit Wasser gewaschen. Die wäßrigen Lösungen
werden vereinigt und unter vermindertem Druck auf 10 bis 15 ml eingedampft. Zu der eingedampften
Lösung wird 1 ml 1 m Mercaptoäthanollösung gegeben, und das Gemisch wird 15 Stunden bei 37 C
inkubiert und lyophilisiert. Man erhält 0,51 g Rohpeptid ohne Schutzgruppen, das zur weiteren Reinigung
an einer mit Carboxymethylcellulose (CMC. »Serva®« 0,6 Milliäquivalent/g) beschickten Säule
chromatographiert wird, wobei 4000 ml eines Ammoniumacetatpuffers vom pH-Wert 6,8 mit einem linearen
Konzentrationsgradienten von 0.05 bis 0,4 m verwendet warden. Die dem Hauptgipfel entsprechenden
Fraktionen 166 bis 245 mit je 15 ml werden vereinigt, und der Hauptteil des Lösungsmittels wird
unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wird wiederholt bis zur Gewichtskonstanz lyophilisiert.
Man erhält 0,22 g des teilweise gereinigten Octadekapeptids. 0,2 g des Produktes werden zur
weiteren Reinigung an einer CMC-Säule (2.2 χ 18 cm:
»Serva *«. 0,6 Milliäquivalent/g) unter Verwendung von 2000 ml eines Ammoniumacetatpuffers vom
pH-Wert 6,8 mit einem linearen Konzentrationsgradienten von 0,05 bis 0,8 tn chromatographiert.
Die dem Hauptgipfel entsprechenden Fraktionen 125 bis 160 von je 7,5 ml werden vereinigt, eingedampft
und lyophilisiert. Man erhält 0,17 g des reinen Peptids ß- Alanyl - tyrosyl - seryl -methionyl - glutamyl - histidylphenylalaüj!
- arginyl-tryptophyl glycy! lysyl - pr ■.->!>!-
valyl - glycyl - lysyl - lysyl - arginyl - argininamid:
[a]'o = -54,0 ± 1,8 U '-- 0,515, 0,1 n-Essigsäure),
a,,,,,n.oh= 28Οπ1μ (Ej^23,0), JSVJ?1= 288,5 πΐμ
id::„nNa<)H= 281,5 ΐημ(Ε··^24,9),288ηΐμ
Das Produkt verhält sich bei der Papierchromatographie mit n-Butanol zu Essigsäure zu Pyridin zu
Wasser = 30:6:20:24 als Laufinittel gegenüber Ninhydrin-, Pauly-, Ehrlich-, Sakagachi- und Methioninreagens
(PtJ6) und bei der Papierelektrophorese (600 V/36 cm in 2 n-Essigsäure) einheitlich. Das Verhältnis
der Aminosäuren bei saarer Hydrolyse ist folgendes: Ser 0,75, GIu 0,90, Pro Q£l, GIy 1,89.
VaI 1,00, Met 0,96, Tyr 1,01, Phe 0,97, /S-AIa 1,00,
Lys 2,83, His 0,92, Arg 2,82, Trp 0,55, NH3 1,42. Das
Trp/Tyr-Verhältnis im intakten Octadekapeptid bestimmt
man spektrophotometrisch zu 1,16:1.
5 Gewichtsteile (/J-AJa'j-ACTHCl-lSj-NHj-acetat
werden in 2,5 Gewichtsteilen 40millimolarer Zinkchloridlösung
gelöst. Die Lösung wi'd mit 2,5 Volumteilen einer 45 Gewichtsteile Natriumchlorid enthaltenden
40millimolaren Dmatriumhydrogenphosphatlösung versetzt. Man eirhält eine Suspension des
Zinkchlorid-Komplexes.
Dieses Präparat wird in Dosen von 5 μΙ/Ratte
hypophysektomierten Ratten intramuskulär injiziert. Nach 2 Stunden wurde die 11 -Hydroxycorticosteroid-Menge
in Plasma zu 80μg/100ml bestimmt. Im
ίο Gegensatz dazu erhielt man bei der Verabreichung eines auf die gleiche Weise erhaltenen Präparates,
das aber kein Zinkchlorid enthielt, eine 11-Hydroxycorticosteroid-Menge
von 6 μg/100 ml.
Die Bestimmung wurde nach dem in Endocrinol. Japonica, 13, 180 (1966), beschriebenen Verfahren
durchgeführt.
Verwendet man Kobaltchlorid, Kupferchlorid, Nickelchlorid oder Eisenchlorid an Stelle von Zinkchlorid,
so erhält man die entsprechenden Komplexe.
B e i s ρ i e 1 3
10 Gewichtsteile (/J-AIa1 )-ACTH(l-18)-NH2-acetat
werden in 2 Gewichtsteilen destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung wird unter Rühren mit einer
Lösung von 20 Gewichtsteilen Poly-L-asparaginsäure vom Molekulargewicht 3000 versetzt, die vor der
Verwendung mit 3 Volumteilen 0,1 n-Natriumhydroxydlösung neutralisiert worden war. So erhält
man eine Suspension eines weißen Niederschlags. Die gewünschte Suspension des Komplexes erhält man,
wenn man zu der oben erhaltenen Suspension 5 Volumteile einer m/l 5-Dinatriumhydrogenphosphat/Dikaliumhydrogenphosphatlösung,
die 90 Gewichtsteile Natriumchlorid enthält, zusetzt.
Das Präparat wird in einer Dosis von 5 μΙ/Ratte in
hypophysektomierte Ratten intramuskulär injiziert. 2 Stunden nach der Injektion wurde die 11-Hydroxycorticosteroidmenge
im Plasma zu 45 μg/100 ml bestimmt, während die Menge bei Verabreichung einer
auf die gleiche Weise erhaltenen Präparation, die aber keine Poly-L-asparaginsäure enthielt, 6 μg/100 ml be-
truS· Beispiel 4
5 Gewichtsteile (/i-Ala')-ACTH(l-18)-NH2-acetat
werden in 1,5 Volumteilen destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung wird mit 1 Volumteil einer Lösung von
5 Gewichtsteilen einer Poly-L-glutaminsäure vom Molekulargewicht 1500 bis 2000 versetzt, die vorher
mit 0,1 -n Natriumhydroxydlösung neutralisiert worden war. Man erhält so eine Suspension des Komplexes.
Durch Zugabe von 2,5 Volumteilen eines 90 Gewichtsteile Natriumchlorid enthaltenden
m/30 Phosphatpuffers zu der Suspension erhält man das gewünschte Präparat des Komplexes.
5 Gewichtsteile (/J-AIa1 )-ACTH(l-18)-NH2-acetat
werden in 15 Volumteilen einer lOOmillimolaren Zinkchloridlösung gelöst. Andererseits werden 5 Gewichtsteile
einer Poly-L-glutaminsäure vom Molekulargewicht 1500 bis 2000 mit 1 Volumteil 0,1-η Natriumhydroxydlösung
neutralisiert und mit 45 Gewichtsteilen Natriumchlorid und mit 25 Volumteilen einer 40millimolaren Dinatriumhydrogenphosphat-
lösung versetzt. Die so erhaltenen Lösungen des Octadekapeptids und der Polyglutaminsäure werden
vereinigt. Man erhält eine Suspension des gewünschten Komplexes.
309 549/426
Hierzu 2 Blatt Zeichnungen
Claims (2)
1. β - Alanyl - l - tyrosyl - l - seryl - L - methionyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-
L - tryptophyl - glycyl - L - lysyl - l - prolyl - l - valylglycyl
- L- lysyl - L- lysyl - l- arginyl - L - argininamid, seine Salze mit Säuren und Komplexe mit Zink,
Kobalt, Nickel, Kupfer, Eisen, Poly-L-glutaminsäure,
Poly-D-glutaminsäure, PoIy-E L-glutamin- )0
säure, Poly-L-asparaginsäure, Poly-DL-asparaginsäure,
Copoly-L-glutamyl-tyrosin oder deren Gemische.
2. Verbindung der allgemeinen Formel
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