DE2804567A1 - Polypeptide, verfahren zu ihrer herstellung und sie enthaltende arzneimittel - Google Patents
Polypeptide, verfahren zu ihrer herstellung und sie enthaltende arzneimittelInfo
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Description
VON KREISLER SCHÖNWALD MEYER EISHOLD
FUES VON KREISLER ? KELLER SELTING
PATENTANWÄLTE Dr.-fng. von Kreisler 11973
Dr.-tng. K. Schönwald, Köln Dr.-Ing. Th. Meyer, Kötn
Dr.-Ing. K. W. Etshold, Bad Soderr Dr. J. F. Fues, Köln
Dipt.-Chem. Alefc von Kreisler, Köln Dipl.-Chem. Carola Keller, Köln Dipl.-Ing. G. Selling, Köln
Dipt.-Chem. Alefc von Kreisler, Köln Dipl.-Chem. Carola Keller, Köln Dipl.-Ing. G. Selling, Köln
5 KÖLN T
DEICHMANNHAUS AM HAUPTBAHNHOF
2. Februar- 1978 AvK/Ax
Sloan-Kettering Institute for Cancer Research
York Avenue, New York N.Y., V.St.A.
Polypeptide, Verfahren zu ihrer Herstellung und sie enthaltende Arzneimittel
909820/0521
Die Erfindung betrifft allgemein neue Polypeptide, Verfahren zur Herstellung der neuen Polypeptide und
Anwendungsgebiete der Polypeptide.
Zahlreiche Polypeptide sind bekanntlich aus verschiedenen Organen von Tieren isoliert worden. Ungefähr bis
zum vergangenen Jahrzehnt war jedoch sehr wenig über den Thymus, ein Organ, das beim Menschen bei der Geburt
etwa 0,8% seines Körpergewichts ausmacht, bekannt, obwohl bisher angenommen wurde, daß eine neuromuskuläre
Blockierungssubstanz im Thymus vorhanden war.
Trotz sehr starkem Interesse an möglichen Funktionen des Thymus und frühzeitiger Spekulation und Versuchen
war bis vor kurzem wenig über die Funktion des Thymus bekannt. Man weiß jedoch heute, daß der Tnymus ein
Verbindungsorgan (compound organ) sowohl mit epithelialen (endokrinen) und lymphoiden (immunologischen)
Verbindungen ist und bei den Iminunitätsfunktionen des Körpers eine Rolle spielt. Der Thymus ist bekanntlich
ein Verbundorgan, das aus einem vom dritten Branchialbogen stammenden Epithelialstroma und Lymphozyten besteht,
die aus Stammzellen kommen, die ihren Ursprung in hämopoetischen Geweben haben; siehe Goldstein und
Mitarbeiter "The Human Thymus", Heinemann, London 1969.
Lymphozyten werden innerhalb des Thymus differenziert
und treten als reife, vom Thymus abgeleitete Zellen,
sog. T-Zellen aus, die zum Blut, zur Lymphdrüse, zur Milz und zu den Lymphknoten zirkulieren. Die Induktion
der Differenzierung von Stammzellen innerhalb des '
Thymus scheint durch Sekretionen der Epithelialzellen !
des Thymus ausgelöst zu werden, jedoch verhinderten Schwierigkeiten mit biologischen Versuchen bisher die
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vollständige Isolierung und strukturelle Charakterisierung etwaiger Hormone, die vorhanden sein können.
Es ist seit einiger Zeit bekannt, daß Beziehungen zwischen dem Thymus und den Immunitätscharakteristiken
des Körpers bestehen, so daß großes Interesse für Substanzen, die vom Thymus isoliert worden sind, gezeigt
wurde. In dieser Hinsicht wurden in den letzten Jahren verhältnismäßig zahlreiche Artikel auf der
Grundlage der wissenschaftlichen Arbeit veröffentlicht,
die Stoffe, die im Rinderthymus vorhanden sind, betrifft. Von der Anmelderin wurde eine Anzahl von
Artikeln veröffentlicht, die die Forschung auf diesem
Gebiet betreffen. Einschlägige Veröffentlichungen erschienen beispielsweise in "The Lancet", 20.7.1968, ·
Seite 119-122; "Triangle", Band 11, Nr.K1972) 7-14; Annals of the New York Academy of Sciences 183 (1971)
230-240; Clinical and Experimental Immunology 4, Nr.2 (1969) 181-189;"Nature"247 (1974) 11-14; Proceedings
of the National Academy of Sciences USA 71 (1974) 1474-1478; "Cell" 5 (1975) 361-365 und 367-370; "Lancet"
2 (1975) 256-259; "Proceedings of the National Academy of Sciences USA" 72 (1975) 11-15;"Biochemistry" 14
(1974) 2214-2218 und "Nature" 255 (1975) 423-424.
In der Veröffentlichung von Goldstein und Manganaro in "Annals of the New York Academy of Sciences" 183
(1971) 230-240 wird über die Anwesenheit eines Thymus-Polypeptids berichtet, das einen myasthenischen neuromuskulären
Block bei Tieren hervorruft, der der menschlichen Krankheit Myasthenia gravis analog ist. Ferner j
wird in diesem Artikel festgestellt, daß zwei unter- '. schiedliche Effekte durch gesonderte Polypeptide im ;
Rinderthymus hervorgebracht werden. Es wurde angenommen>
daß eines dieser Polypeptide, als "Thymotoxin" bezeich-i net, Myositis verursacht, jedoch wurde ferner darauf '
hingewiesen, daß dieses Polypeptid nicht isoliert ;
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2804587 ήθ
worden war, obwohl es sich als Polypeptid mit einem Molekulargewicht von etwa 7000 erwies, eine starke
reine positive Ladung hatte und am Ionenaustauscherharz "CM-Sephadex" bei pH 8,0 zurückgehalten wurde.
In der Veröffentlichung in "Nature" 247 (4.1.1975) 11
werden als Thymin I und Thymin II identifizierte Produkte beschrieben, die sich als neue Polypeptide
erwiesen, die vom Rinderthymus isoliert wurden und spezielle Anwendungen auf verschiedenen therapeutischen
Gebieten haben. Auf Grund des Gebrauchs ähnlicher Namen für andere Produkte, die bereits vom Thymus isoliert
worden waren, werden diese Produkte Thymin I und Thymin II nun als Thymopoietin I und Thymopoietin II
bezeichnet. Diese Produkte und Verfahren zu ihrer Herstellung werden in der US-Patentanmeldung Nr.606 843
vom 22.8.1975 beschrieben.
Die US-PS 4 002 602 (Teilfortsetzung der US-Patentanmeldung 449 686) beschreibt langkettige Polypeptide,
die als ubiquitäres imrmnonetisches Pol^nentid (UBIP)
bezeichnet werden. Dieses Peptid wurde später in Ubiquitin umbenannt. Dieses Polypeptid ist ein 74-Aminosäurepolypeptid,
das durch seine Fähigkeit gekennzeichnet ist, in vitro in Konzentrationen von Nanogramm die
Differenzierung sowohl von T-Zellen- als auch B-Zellen-Immunocyten
aus Vorstufen, die im Knochenmark oder in der Milz vorhanden sind, auszulösen. Das Polypeptid ist
somit wertvoll bei der Therapie von mangelnder Funktion , des Thymus oder Immunitätsmängeln.
i Die US-PS 4 002 740 beschreibt synthetisierte Trideca- .
peptidmischungen, die die Fähigkeit haben, die Diffe- ι
renzierung von T-Lymphozyten, aber nicht von Komplement-! rezeptor-B-Lymphozyten auszulösen. Dieses Polypeptid ;
zeigte somit viele der Eigenschaften der langkettigen Polypeptide, die gemäß der vorstehend genannten US-
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Patentanmeldung Nr.606 843 isoliert und als Thymopoietin
bezeichnet wurden.
Gegenstand der Erfindung ist ein synthetisiertes, aus fünf Aminosäuren bestehendes Polypeptid mit einer ganz
bestimmten Sequenz mit aktiven Stellen (a definite active site sequence), das, v/ie gefunden wurde, viele
der Eigenschaften des isolierten langkettigen Polypeptids aufweist, das in den vorstehend genannten Veröffentlichungen
und in der US-PS 4 002 602 als ubiquitäres immunopoetisches Polypeptid (UBIP) bezeichnet
wird.
Erfindung stellt sich demgemäß die Aufgabe, neue Polypeptide, die biologisch wichtig sind und die
Fähigkeit haben in Konzentrationen von Nanogramm die Differenzierung sowohl von T-Vorstufenzellen als auch
B-Vorstufenzellen auszulösen und hierdurch äußerst wertvoll in den Immunitätssystemen von Mensch und Tier
sind, verfügbar zu machen.
Die Erfindung ist ferner auf neue Zwischenprodukte, Verfahren zur Synthetisierung der neuen Polypeptide
gemäß der Erfindung sowie auf Zubereitungen und Verfahren für die Verwendung in biologischen Wirkungen
gerichtet.
Die vorstehend genannten Aufgaben und Vorteile werden
gemäß der Erfindung durch neue Polypeptide verwirklicht,
die als aktive Stelle die Sequenz
-X-Y-Z-GLN-LYS- I
aufweisen, worin X für TYR oder ALA, Y für ASN oder ALA ,
und Z für ILE oder ALA steht. :
Die Erfindung umfaßt ferner neue Polypeptid-Harzzwischen
produkte, die bei der Herstellung der Polypeptide gemäß der Erfindung gebildet werden und die Sequenz
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α-R -X-Y-Z-GLN-LYS-Harz
aufweisen, sowie diese vom Harz und anderen Schutzgruppen befreiten Peptid-Zwischenprodukte. In dieser .
Sequenz haben X, Y und Z die oben genannten Bedeutungen, während R^, R„ und R, Schutzgruppen an den angegebenen
Aminosäuren bedeuten, wenn diese Gruppen notwendig sind. Das Harz ist ein in fester Phase vorliegendes Polymerisat,
das als Träger für die Reaktion wirksam ist. Die Erfindung ist ferner auf ein Verfahren zur Herstellung
der Polypeptide gemäß der Erfindung durch Peptidsynthese in der festen Phase sowie auf Arzneimittel gerichtet,
die die Polypeptide enthalten und Menschen und Tieren verabreicht werden, um biologische Wirkungen darauf
auszuüben.
Wie bereits erwähnt, bezieht sich die Erfindung auf neue Polypeptide mit therapeutischem Wert auf verschiedenen
Gebieten, Zwischenprodukte, die bei der Herstellung der Polypeptide gebildet werden, Arzneimittel, die
die Peptide gemäß der Erfindung enthalten, und Verfahren zur Herstellung der Polypeptide.
Als hauptsächliche Ausführungsform umfaßt die Erfindung Polypeptide, die die folgende Aminosäuresequenz als
aktive Stelle aufweisen:
I. X-Y-Z-GLN-LYS
Hierin steht X für TYR oder ALA, Y für ASN oder ALA und Z für ILE oder ALA, wobei die Aminosäuresequenz, in
der X für TYR, Y für ASN und Z für ILE steht, besonders bevorzugt wird.
Als weitere Ausführungsform ist die Erfindung auf Penta-,
peptide gerichtet, die die vorstehend genannte Sequenz als aktive Stelle aufweisen und durch die folgende j
allgemeine Formel beschrieben werden können:
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II. R-NH-X-Y-Z-GLN-LYS-COR'
Hierin haben X, Y und Z die oben genannten Bedeutungen, während R und R1 die biologische Aktivität der grundlegenden
aktiven Sequenz nicht wesentlich beeinflussende Substituenten an der Pentapeptidsequenz sind. Unter ■
dieser Angabe ist zu verstehen, daß die endständigen Aminosäuren an dieser Pentapeptidkette ohne Abweichung
vom Rahmen der Erfindung modifiziert werden können, v/enn funktioneile Gruppen oder Derivate (R und R' )
IC an diese endständigen Aminosäuren gebunden werden, ohne
die biologische Aktivität des Moleküls wesentlich zu beeinflussen. Es ist somit festzustellen, daß die endständigen
Amino- und Carbonsäuregruppen nicht wie bei einigen Polypeptiden für die biologische Aktivität des
Pentapeptids wesentlich sind. In den Rahmen der Erfindung fallen daher auch diese Pentapeptide, die endständig
unsubstituiert sind und die endständig durch eine oder mehrere funktionelle Gruppen, die die hier
offenbarte biologische Aktivität nicht wesentlich beeinflussen, substituiert sind.
Diese Feststellung ist so zu verstehen, daß diese funktionellen Gruppen eine normale Substitution wie Acylierung
an der freien Aminogruppe und Amidierung an der freien Carbonsäuregruppe sowie die Substitution zusätzlicher
Aminosäuren und Polypeptide einschließen.
Von diesen Aspekten aus erweisen sich die Pentapeptide gemäß der Erfindung als außergewöhnlich, da die Pentapeptide
die gleiche biologische Aktivität wie langkettige natürliche Peptide aufweisen, in denen diese
Pentapeptidsequenz einen Teil bildet oder darin vor- ! handen ist. Es wird daher angenommen, daß die Aktivitätsvoraussetzungen
des Moleküls durch Stereochemie
des Moleküls, d.h. die besondere "Faltung" des Moleküls erzeugt werden. In diesem Zusammenhang ist zu j
bemerken, daß Polypeptidbindungen nicht starr, sondern
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flexibel sind und in flächiger Form, als Schraube oder Helix u.dgl.- vorliegen können. Als Ergebnis ist das
gesamte Molekül flexibel und "faltet sich" in ganz bestimmter Weise. Gemäß der Erfindung wurde gefunden,
daß das Pentapeptid sich in der gleichen Weise wie das langkettige natürliche Polypeptid "faltet" und daher
die gleichen biologischen Eigenschaften aufweist. Aus diesem Grunde kann das Pentapeptid mit verschiedenen
funktioneilen Gruppen substituiert werden, so lange die Substituenten die biologische Aktivität nicht
wesentlich beeinträchtigen oder die natürlichen "Falten" des Moleküls nicht stören.
Die Fähigkeit des Moleküls, seine biologische Aktivität und natürliche Faltung zu bewahren, wird eindeutig
dadurch veranschaulicht, daß die Pentapeptidsequenz gemäß der Erfindung die gleichen biologischen Eigenschaften
wie das in der US-PS 4 002 602 als Ubiquitin beschriebene, von 74 Aminosäuren gebildete natürliche
Peptid aufweist. In diesem Langkettigen Polypeptid kann das Pentapeptid gemäß der Erfindung innerhalb des Moleküls,
jedoch nur in Kombination mit den anderen dort beschriebenen Aminosäuren identifiziert werden. Diese
Patentschrift ist jedoch der direkte Nachweis, daß das Pentapeptid gemäß der Erfindung die aktive Stelle darstellt,
da die biologischen Aktivitäten die gleichen sind und die Aminosäuren und die an den endständigen
Aminosäuren substituierten Peptidketten die biologischen Charakteristiken des grundlegenden Pentapeptidfragments
nicht beeinträchtigen.
Die vorstehenden Ausführungen lassen erkennen, daß R ; und R1 in der Formel II ein beliebiger Substituent
sein können, der die biologische Aktivität der grund- J legenden aktiven Sequenz nicht wesentlich beeinträch- j
tigt. Für die Zwecke der Beschreibung können somit R und R1 beliebige der folgenden Substituenten sein:
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R R'
Wasserstoff OH
NHR
C6-C20-Alkaryl N(R)2
C6-C20-Aralkyl OR7
C^C^Alkanoyl HAL
C^C^Alkenyl
Hierin stehen R7 für C1-C7-AIkYl, C1-C7
C^-C^-Alkinyl, Cc-Con-Aryl oder Cc-C-A-Alkaryl und
χ / b d<J b <cU
HAL für Halogen, vorzugsweise Cl.
Wie bereits erwähnt, können R und R1 auch neutrale
Aminosäuregruppen oder Reste von Polypeptidketten mit 1 bis 20 C-Atomen sein. Illustrativ sind die folgenden
Gruppen:
R R'
ASP GLU
SER SER
LEU THR
SER-ASP LEU
LEU-SER-ASP HIS
LEU-ASP VAL
LEU-SER ARG
GLU-SER
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R1
GLU-THR
glu-ser-leu
glu-ser-thr
glu-ser-thr-leu
glu-ser-thr
glu-ser-thr-leu
glu-ser-thr-leu-his
glu-ser-thr-leu-his-leu
glu-ser-thr-leu-his-leu-val
glu-ser-thr-leu-his-leu-val-leu glu-ser-thr-leu-his-leu-val-leu-arg glu-ser-thr-leu-his-leu-val-leu-arg-leu glu-ser-thr-leu-his-leu-val-leu-arg-leu-arg
glu-ser-thr-leu-his-leu
glu-ser-thr-leu-his-leu-val
glu-ser-thr-leu-his-leu-val-leu glu-ser-thr-leu-his-leu-val-leu-arg glu-ser-thr-leu-his-leu-val-leu-arg-leu glu-ser-thr-leu-his-leu-val-leu-arg-leu-arg
Gemäß einer spezielleren Ausführungsform umfaßt die
Erfindung neue Pentapeptide mit der folgenden Sequenz:
in. R-HN-TYR-ASN-ILE-GLN-LYS-COR'
Hierin steht R für Wasserstoff, C1-C7-AlJCyI, z.B.
Methyl oder Äthyl, C ~ -C. --Aryl, z.B. Phenyl, oder
C.-Cy-Alkanoyl, z.B. Acetyl oder Propionyl, und R1
steht für OH, NH2, NHR, N(R)2 oder Chlor. Besonders
bevorzugt werden Polypeptide, in denen R Wasserstoff
und R« OH ist.
In den Rahmen der Erfindung fallen ferner die pharmazeutisch unbedenklichen Salze der Pentapeptide. Als
Beispiele von Säuren, die Salze mit den Pentapeptiden bilden können, seien genannt: anorganische Säuren, z.B,
Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Perchlorsäure, Salpetersäure,
Thiocyansäure, Schwefelsäure und Phosphorsäure, und organische Säuren, z.B. Ameisensäure,
Essigsäure, Propionsäure, Glykolsäure, Milchsäure,
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Brenztraubensäure, Oxalsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Anthranilsäure, Zimt- f-
\f J ι
säure, Naphthalinsulfonsäure und SuIfanylsäure.
In der vorstehenden Struktur werden die Aminosäurekomponenten des Peptids der Einfachheit halber durch
Abkürzungen gekennzeichnet. Die folgenden Abkürzungen werden verwendet:
L-Tyrosin TYR
L-Asparagin · ASN
L-Aspartic acid ASP
L-Isoleucin ILE
L-Serin SER
L-Glutamin GLN
L-Leucin LEU
L-Lysin LYS
L-Glutaminsäure GLU
L-Threonin THR
L-Histidin HIS
L-Valin VAL
L-Arginin ARG
L-Alananin ALA
Die Polypeptide gemäß der Erfindung sind durch fünf j
Aminosäuren gebildete Peptide, die, wie festgestellt wurde, ähnliche Eigenschaften wie das aus 74 Amino- i
säuren gebildete, vom Rinderthymus isolierte und in >
der US-PS 4 002 602 beschriebene Polypeptid Ubiquitin , (oder UBIP) aufweisen. Die Peptide gemäß der Erfindung j
zeichnen sich insbesondere durch ihre Fähigkeit aus, ! die selektive Differenzierung von T-Vorstufenzellen :
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sowie B-Vorstufenzellen in Nanogramm-Konzentrationen
auszulösen.
Es wurde gefunden, daß die Polypeptide gemäß der Erfindung die Differenzierung von Immunocyten-Vorstufenzellen
in vitro in der gleichen Weise wie die langkettigen Polypeptide auslösen, die in der US-PS
4 CC2 602 beschrieben werden. So hat sich gezeigt, daß die Polypeptide gemäß der Erfindung selbst in Nanogrammkonzentrationen
die Differenzierung sowohl der T-Vorstufenzellen, gemessen durch die Vermehrung der
Thymus-Differenzierungsantigene TL und THY-I (θ) , als
auch der B-Vorstufenzellen auslösen, gemessen durch die Vermehrung von Rezeptoren für das Komplement, ein
charakteristisches Merkmal der B-Zellen.
Um die Bedeutung der differenzierenden biologischen
Eigenschaften der Polypeptide gemäß der Erfindung verständlich zu machen, ist zu bemerken, daß die Funktion
des Thymus in Relation zur Immunität grob als Bildung von aus dem Thymus stammenden Zellen oder Lymphozyten,
sog.T-Zellen, angegeben werden kann. Die T-Zellen
bilden einen großen Anteil der Gesamtmenge der zirkulierenden kleinen Lymphozyten. Die T-Zellen weisen
immunologische Spezifität auf und sind direkt an durch Zellen vermittelten Immunreaktionen (z.B. Homograft—
Reaktionen) als Nervenendorganzellen (effector cells) beteiligt. Die T-Zellen sondern jedoch keine humoralen
Antikörper ab, da diese Antikörper durch Zellen abgesondert werden, die direkt vom Knochenmark unabhängig
vom Einfluß des Thymus stammen. Diese letzteren Zellen '· werden als B-Zellen bezeichnet. Für viele Antigene
erfordern jedoch die B-Zellen die Anwesenheit von entsprechend reaktiven T-Zellen, bevor sie Antikörper ■
bilden können, ^er Mechanismus dieses Prozesses der ,
Zusammenarbeit der Zellen ist noch nicht völlig geklärt,
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Auf der Grundlage dieser Erklärung kann festgestellt werden, daß, in funktioneilen Ausdrücken, der Thymus
für die Entwicklung der zellulären Immunität und zahlreiche Reaktionen der humoralen Antikörper notwendig
ist und diese Systeme beeinflußt, indem er im Thymus die Differenzierung von hämopoetischen Stammzellen
zu T-Zellen auslöst. Dieser induktive Einfluß wird durch Vermittlung von Sekretionen der Epithelialzellen
des Thymus, d.h. der Thymus-Hormone ausgeübt.
Um die Funktion des Thymus und des Zellsystems der
Lymphozyten sowie die Zirkulation von Lymphozyten im
Körper zu verstehen, ist ferner darauf hinzuweisen, daß die Stammzellen im Knochenmark entstehen und den
Thymus durch den Blutstrom erreichen. Innerhalb des Thymus werden die Stammzellen zu immunologisch kompetenten
T-Zellen differenziert, die zum Blutstrom wandern und zusammen mit den B-Zellen zwischen den Geweben,
Lymphgefäßen und dem Blutstrom zirkulieren.
Die Zellen des Körpers, die Antikörper abscheiden, entwickeln sich auch aus hämopoetischen Stammzellen,
jedoch wird ihre Differenzierung nicht durch den Thymus
bestimmt. Sie werden daher als vom Knochenmark stammende Zellen oder B-Zellen bezeichnet. Bei Vögeln werden
sie in einem dem Thymus analogen Organ differenziert, das als Bursa von Fabricius bezeichnet wird. Bei Säugetieren
wurde kein gleichwertiges Organ entdeckt, und es wird angenommen, daß die B-Zellen innerhalb des
Knochenmarks differenzieren. Die physiologischen Substanzen, die diese Differenzierung diktieren, bleiben
vollständig unbekannt. j
Wie bereits erwähnt, sind die Polypeptide gemäß der i
Erfindung für die Behandlung von Mensch und Tier ,
therapeutisch wertvoll. Da die neuen Polypeptide die j
Fähigkeit haben, die Differenzierung der in den hämo- I
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poetischen Geweben gebildeten lymphopoetischen Stammzellen zu vom Thymus stammenden Zellen oder
T-Zellen auszulösen, die in die Immunreaktion des Körpers einzugreifen vermögen, haben die Produkte gemäß
der Erfindung vielfache therapeutische Anwendungen. Da die Verbindungen die Fähigkeit haben, einige der
genannten Funktionen des Thymus auszuüben, finden sie in verschiedenen Thyrcusfunktions- und Immunitätsbereichen
Anwendung. Ein primäres Anwendungsgebiet ist die Behandlung des DiGeorge-Syndroms, eines Zustandes,
bei dem das Fehlen des Thymus angeboren ist. Durch Injektion der Polypeptide wird dieser Mangel überwunden,
Eine weitere Anwendung finden die Polypeptide bei Agammaglobulinämie, die auf einem Defekt des mutmaßliehen,
die B-Zellen differenzierenden Hormons des Körpers beruht. Durch Injektion der Polypeptide wird
dieser Defekt ausgeschaltet. Auf Grund ihrer biologischen Eigenschaften sind die Polypeptide, die bei
niedrigen Konzentrationen äußerst aktiv sind, dadurch wertvoll, daß sie die kollektive Immunität des Körpers
dadurch unterstützen, daß sie die therapeutische Stimulation der zellulären Immunität und humoralen
Immunität steigern oder unterstützen und hierdurch wertvoll für die Behandlung von Krankheiten werden, bei
denen chronische Infektionen in vivo, z.B. fungöse Infektionen oder Mycoplasmainfektionen, Tuberkulose,
Lepra, akute und chronische Virusinfektionen u.dgl. auftreten. Ferner werden die Peptide für wertvoll auf
jedem Gebiet gehalten, auf dem zelluläre oder humorale Immunität umstritten ist, insbesondere dann, wenn
Immunitätsmängel wie beispielsweise bei dem oben genannten DiGeorge-Syndrom vorliegen. Auf Grund der
Eigenschaften der Polypeptide sind sie ferner wertvoll !
in vitro durch Auslösung der Entwicklung von Ober- ι flächenantigenen der T-Zellen, durch Auslösung der
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Entwicklung der funktionellen Fähigkeit, Empfindlichkeit
für Mitogene und Antigene und Mitwirkung der Zellen in der Steigerung der Fähigkeit der B-Zellen,
Antikörper zu bilden, zu erreichen. Sie sind in vitro wertvoll durch Auslösung der Entwicklung der B-Zellen,
gemessen an der Entwicklung der Oberflächenrezeptoren für das Komplement. Die Peptide sind ferner dadurch
wertvoll, daß sie die unkontrollierte Proliferation
von Lymphozyten, die auf Ubiquitin ansprechen, hemmen.
Eine wichtige Eigenschaft des Polypeptids ist seine Fähigkeit in vivo, Zellen mit den Eigenschaften von
T-ZeIlen wiederherzustellen, sowie seine Fähigkeit in
vivo, Zellen mit den Eigenschaften von B-Zellen wiederherzustellen.
Eine weitere wichtige Eigenschaft der Peptide gemäß der Erfindung besteht darin, daß sie bei sehr niedrigen
Konzentrationen äußerst wirksam sind. So wurde festgestellt, daß die Peptide bereits bei Konzentrationen
von 10 Nanogramm/ml wirksam und bei Konzentrationen von etwa 0,05 bis 1 ug/ml maximal wirksam sind. Als
Träger eignen sich alle für diesen Zweck bekannten Träger einschließlich normaler Kochsalzlösungen vorzugsweise
mit einem Protein als Verdünnungsmittel, z.B. Rinderserumalbumin, um Verluste durch Adsorption an
Glasgeräte bei diesen niedrigen Konzentrationen zu verhindern. Die Peptide gemäß der Erfindung sind in
einer Dosierung oberhalb von etwa 0,1 mg/kg Körpergewicht wirksam. Für die Behandlung des DiGeorge-Syndroms'
können die Polypeptide in einer Dosis von etwa 0,1 bis , 10 mg/kg Körpergewicht verabreicht werden. Im allgemeinen
kann eine Dosis im gleichen Bereich für die \ Behandlung der anderen genannten Zustände oder Krank- ,
heiten angewendet werden. ι
Die Polypeptide gemäß der Erfindung wurden nach ahn- ;
liehen Verfahren hergestellt, wie sie von Merrifield '
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in Journal of American Chemical Society 85 (1963) 2149 bis 2154 beschrieben werden. Die Synthese bestand aus
der stufenweisen Anlagerung von geschützten Aminosäuren an eine wachsende Peptidkette, die durch kovalente
Bindungen an ein festes Harzteilchen gebunden war. Durch diese Arbeitsweise wurden Reagentien und
Nebenprodukte durch Filtration entfernt, und die Umkristallisation von Zwischenprodukten war überflüssig.
Das allgemeine Konzept dieses Verfahrens beruht auf der Bindung der ersten Aminosäure der Kette an ein festes
Polymerisat durch eine kovalente Bindung und die einzelne, stufenweise Anlagerung der nachfolgenden Aminosäuren,
bis die gewünschte Sequenz zusammengesetzt ist. Abschließend erfolgt die Entfernung des Peptids vom
festen Träger und die Entfernung der Schutzgruppen. Bei diesem Verfahren wird eine wachsende Peptidkette
erhalten, die an ein vollständig unlösliches festes Teilchen gebunden ist, so daß sie in einer zweckmäßigen
Form für die Filtration und die Entfernung von Reagentien und Nebenprodukten durch Waschen vorliegt.
Die Aminosäuren können an beliebige geeignete Polymerisate gebunden werden, die lediglich in den verwendeten
Lösungsmitteln unlöslich sein und eine beständige physikalische Form, die leichte Filtration ermöglicht,
auf v/eisen müssen. Das Polymerisat muß eine funktioneile Gruppe enthalten, an die die erste geschützte
Aminosäure durch eine kovalente Bindung fest gebunden werden kann. Für diesen Zweck eignen sich die verschiedensten
Polymerisate, z.B. Cellulose, Polyvinylalkohol, Polymethacrylat und sulfoniertes Polystyrol, jedoch
wurde für die Synthese gemäß der Erfindung ein chlormethyliertes
Copolymerisat von Styrol und Divinylbenzol ', verwendet. !
Die verschiedenen funktioneilen Gruppen an der Amino- >
säure, die aktiv waren, aber nicht an den Reaktionen
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teilnehmen sollten, waren durch übliche Schutzgruppen, wie sie auf dem Gebiet der Polypeptide verwendet werden,
während der gesamten Reaktion geschützt. Beispielsweise waren die funktioneilen Gruppen an Tyrosin und Lysin
durch Schutzgruppen geschützt, die bei Vollendung der Sequenz entfernt werden konnten, ohne das als Endprodukt
gebildete Polypeptid nachteilig zu beeinflussen. Die Synthese wurde insofern nach einer Modifikation
der Feststoffsynthese durchgeführt, als Fluorescamin
verwendet wurde, um durch ein Anzeichen von positiver Fluoreszenz zu bestimmen, ob die Kupplung
vollständig war (siehe Felix und Mitarbeiter in Analyt. Biochem. 52 (1973) 377). Wenn vollständige Kupplung
nicht angezeigt wurde, wurde die Kupplung mit der gleichen geschützten Aminosäure wiederholt, bevor die
Schutzgruppen entfernt wurden.
Bei dem allgemeinen Verfahren wurde zunächst das an seinen Aminogruppen' geschützte L-Lysin in absolutem
Alkohol, der ein Amin enthielt, zum Harz verestert.
Das gekuppelte Aminosäureharz wurde dann filtriert, mit Alkohol und Wasser gewaschen und getrocknet. Die Schutzgruppe
an der a-Aminogruppe der Aminosäure Lysin (z.B. t-BOC, d.h. t-Butyloxycarbonyl) wurde dann entfernt,
ohne andere Schutzgruppen zu beeinflussen. Das hierbei erhaltene gekuppelte Aminosäureharz, das die freie
Aminosäure enthielt, wurde dann mit einem geschützten L-Glutamin, vorzugsweise a-t-BOC-L-Glutamin umgesetzt, ■
um das L-Glutamin zu kuppeln. Die Reaktionen wurden J dann mit geschütztem L-Isoleucin, L-Asparagin und :
L-Tyrosin wiederholt, bis das vollständige Molekül ' gebildet v/ar. Die Aufeinanderfolge von Reaktionen wurde j
wie folgt durchgeführt: j
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Harz
α-BQC-Lys-COOH
a- BQC- Ly s- H a r ζ
Entfernuna der Schutzqruppe an der α-Aminogruppe
H2N-Lys-Harz
Ct-BOC-L-GIn
- I2
α-BOC-Gln-Lys-Harz
Entfernung der Schutzgruppe der α-Aminogruppe
H N-Gln-Lys- Harz
I a-BOC-Ile-COOH
I
I
a-BOC-Ile-Gln-Lys-Harz
[ Entfernunq der Schutzgruppe der D-Aminogruppe
1 h
H2N-IIe-GIn-LyS- Harz
a-BOC-Asn-COOH
α-BOC-Asn-Ile-Gln-Lys-.Harz
j Entfernung der Schutzgruppe der α-Aminogruppe
H N-Asn-Ile-Gln-Lys-:Harz
a-R -Tyr-COOH
-R -Tyr-Asn-Ile-Gln-Lys-Harz
I Entfernung aller Schutzgruppen
H N-Tyr-Asn-Ile-Gln-Lys-COOH
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In der vorstehenden Reaktionsfolge sind R^ und R„
Schutzgruppen an den verschiedenen reaktionsfähigen Seitenketten an den Aminosäuren, die nicht beeinflußt
oder entfernt werden, wenn die Schutzgruppe an der oc-Aminogruppe entfernt wird, um die weitere Reaktion
zu gestatten. CC-R3 ist eine Schutzgruppe der o.-Aminogruppe.
Vorzugsweise steht in dem vorstehenden, als Zwischenprodukt gebildeten Pentapeptidharz R^, für eine
Schutzgruppe wie Op oder 6-Dichlorbenzyl, R2 für 6-2-Chlorbenzyloxycarbonyl
und R., für t-Butyloxycarbonyl. Als Harze eignen sich alle Warze, die vorstehend als
für das Verfahren geeignet genannt wurden. In der vorstehenden Reihe von Reaktionen werden die Peptide, bei
denen ALA an die Stelle von TYR, ASN oder ILE tritt, in der gleichen Weise hergestellt.
Nachdem das letzte Zwischenprodukt gebildet worden ist, wird das Peptid-Harz gespalten, um die Schutzgruppen
R1, Rp und R- und das Harz zu entfernen. Die Schutzgruppen
wurden nach üblichen Methoden, z.B. durch Behandlung mit wasserfreiem Fluorwasserstoff, entfernt,
worauf das erhaltene freie Peptid isoliert wurde.
Wie bereits erwähnt, ist es bei der Durchführung des Verfahrens notwendig, die Aminogruppen zu schützen oder
blockieren, um die Reaktion zu steuern und die gewünschten Produkte zu erhalten. Zu den geeigneten Schutzgruppen
für die Aminogruppen, die erfolgreich verwendet werden können, gehören die Salzbildung zum Schutz von
stark basischen Aminogruppen oder Urethan-Ersatz- ;
schutzgruppen (urethane protecting substitutes), z.B. ;
Benzyloxycarbonyl und t-Butyloxycarbonyl. Vorzugsweise ■
werden t-Butyloxycarbonyl (tEOC) oder t-Amyloxycarbonyl'
(AOC) zum Schutz der a-Aminogruppe in den reagierenden j
Aminosäuren am Carboxylende des Moleküls verwendet, I
da die Schutzgruppen BOC und AOC (t-Amyloxycarbonyl) ;
sich nach dieser Reaktion und vor der anschließenden '
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Stufe (in der die a-Aminogruppe selbst umgesetzt wird)
durch verhältnismäßig milde Einwirkung von Säuren <z.B. Trifluoressigsäure) leicht entfernen lassen. Diese
Behandlung beeinflußt im übrigen keine Gruppen, die zum Schutz anderer reaktionsfähiger Seitenketten verwendet
werden. Die a-Aminogruppen können somit durch Umsetzung mit einem beliebigen Material geschützt werden,
das die Aminogruppen für die anschließende Reaktion bzw. die anschließenden Reaktionen schützt, aber
später unter Bedingungen, die das Molekül nicht anderweitig beeinträchtigen, entfernt werden können. Als
Beispiele solcher Materialien sind organische Carbonsäurederivate zu nennen, die die Aminogruppe acylieren.
Im allgemeinen kann jede der Aminogruppen durch Umsetzung
mit einer Verbindung, die eine Gruppe der Formel
O
U
U
R- 0—C —
enthält, worin R eine Gruppe ist, die verhindert, daß
die Aminogruppe anschließende Kupplungsreaktionen eingeht und ohne Zerstörung des Moleküls entfernt werden
kann, geschützt werden. Beispielsweise ist R ein geradun kettiger oder verzweigter Alkylrest, der gesättigt
sein kann und vorzugsweise 1 bis 10 C-Atome enthält, ein Arylrest vorzugsweise mit 6 bis 15 C-Atomen, ein
Cycloalkylrest vorzugsweise mit 5 bis 8 C-Atomen, ein Aralkylrest vorzugsweise mit 7 bis 18 C-Atomen, ein
Alkarylrest vorzugsweise mit 7 bis 18 C-Atomen oder ein Heterocyclus, z.B. Isonicotinyl. Die Aryl-, Aralkyl-
und Alkarylkomponenten können außerdem beispielsweise durch einen oder mehrere Alkylreste mit 1 bis etwa 4
C-Atomen weiter substituiert werden. Bevorzugt als ; Gruppen für R werden beispielsweise t-Butyl, t-Amyl, ;
Fhenyl, Tolyl, XyIyI und Benzyl . Besonders bevorzugte
spezielle Schutzgruppen für die Aminogruppe sind bei- i spielsweise Eenzyloxycarbonyl, substituiertes Benzyl- j
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oxycarbonyl, worin der Phenylring durch ein oder mehrere Halogenatome, z.B. Cl oder Br, substituiert
ist, Nitro, niedere Alkoxyreste, z.B. Methoxy, niedere
Alkylreste, tertiäres Eutyloxycarbonyl, tertiäres Amyloxycarbonyl, Cyclohexyloxycarbonyl, Vinyloxycarbonyl,
Adamantyloxycarbonyl und Biphenylisopropoxycarbonyl. Ferner können als Schutzgruppen beispielsweise
Isonicotinyloxycarboaylr Phthaloyl, p-Tolylsulfonyl
und Formyl verwendet werden.
Bei der Durchführung des allgemeinen Verfahrens gemäß
der Erfindung wird das Peptid durch Umsetzung der freien a-Aminogruppe mit einer Verbindung, die geschützte
Aminogruppen enthält; aufgebaut. Für die Reaktion
oder Kupplung wird die Verbindung, die angegriffen wird, an ihrer Carboxylgruppe aktiviert, so daß
die Carboxylgruppe dann mit der freien a-Aminogruppe an der angefügten Peptidkette reagieren kann. Um die
Aktivierung zu erreichen, kann die Carboxylgruppe in eine beliebige reaktionsfähige Gruppe, z.B. einen
Ester, ein Anhydrid, ein Azid oder Säurechlorid, umgewandelt werden.
Es ist ferner zu bemerken, daß während dieser Reaktionen die Aminosäurekomponenten sowohl Aminogruppen
als auch Carboxylgruppen enthalten, und daß gewöhnlich ■ eine Gruppe in die Reaktion eingeht, während die andere'
geschützt ist. Vor der Kupplungsstufe wird die Schutzgruppe
an der a-Aminogruppe oder endständigen Amino- gruppe des angegriffenen Peptids unter Bedingungen j
entfernt, die andere Schutzgruppen, z.B. die Gruppe :
an der h -Aminogruppe des Lysinmoleküls, nicht wesentlich
beeinträchtigen. Bevorzugt als Verfahren für die ί Durchführung dieser Stufe ist eine milde Acidolyse
beispielsweise durch Umsetzung mit Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur.
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Es ist einleuchtend, daß die vorstehend beschriebene Reihe von Verfahrensstufen zur Bildung des speziellen
Pentapeptids der folgenden Formel führt:
H2N-TYR-ASN-ILE-GLN-LYS-COOh
Dieses Pentapeptid umfaßt ferner die Sequenz des PoIypeptids gemäß der Erfindung mit basischen aktiven
Stellen. Das substituierte Pentapeptid der Formel II, worin die endständigen TYR- und LYS-Aminosäuregruppen
in der oben beschriebenen Weise weiter substituiert werden können, wird dann durch Umsetzung mit diesem
basischen Pentapeptid mit für die Herstellung der gewünschten Derivate geeigneten Reagentien hergestellt.
Die Reaktionen dieser Art, z.B. Acylierung, Veresterung und Amidierung, sind dem Fachmann natürlich bekannt.
Ferner werden andere Aminosäuren, d.h. Aminosäuregruppen, die die biologische Aktivität des basischen
Pentapeptidmolekuls nicht beeinträchtigen, an die Peptidkette durch die gleiche Folge von Reaktionen,
durch die das Pentapeptid synthetisiert wurde, an eines der Enden der Peptidkette angelagert.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert. In diesen Beispielen verstehen sich die
Teile als Gewichtsteile, falls nicht anders angegeben.
Für die Herstellung des Polypeptids gemäß der Erfindung wurden die folgenden Materialien im Handel bezogen:
a-BOC-L-Glutamin-0-nitrophenylester
a-BOC-t-2-Chlor-benzyloxycarbonyl-L-lysin
a-BOC-asparagin
a-BOC-L-Isoleucxn
a-BOC-L-Isoleucxn
a-BOC-0-2,6-Dichlorbenzyl-L-tyrosin
Z\i diesen Reagentien bedeutet BOC t-Butyloxycarbonyl.
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Reagehtien von "Sequenal"-Qualität für Bestimmungen
der Aminosäuresequenz, Dicyclohexylcarbodimid, Fluorescamin und das Harz wurden ebenfalls im Handel bezogen»
Als Harz wurde ein Polystyroldivi-nylbenzolharz verwendet, <3as eine Teilchengröße von 37-74 um hatte und
1% Diviny!benzol und 0,75 mMol Chlorid pro g Harz
enthielt.
Zur Herstellung des Polypeptids wurden 2 mMol a-BOC-c-2-chlorbenzyloxycarbony1-L-Lysin
24 Stunden bei 80°C zu 2 mMol chiormethyliertem Harz in absolutem Alkohol, der 1 mMol Triethylamin enthielt, verestert.
Dss erhaltene gekuppelte Aminosäureharz wurde filtriert, mit absolutem Alkohol gewaschen und getrocknet. Anschließend
wurden andere α-BOC-Aminosäuren in der gleichen Weise an die von der Schutzgruppe befreite
a-Aminogruppe des Peptid-Harzes in der richtigen Reihenfolge gekuppelt, wobei das Polypeptid gemäß der Erfindung
unter Verwendung äquivalenter Mengen Dicyclohexylcarbodiimid mit Ausnahme von a-BOC-L-Glutamin-0-nitrophenylester,
der direkt gekuppelt wurde, erhalten wurde. Nach jeder Kupplungsreaktion wurde ein aliquoter
Teil des Harzes mit Fluorescamin getestet. Wenn positive Fluoreszenz festgestellt wurde, wurde die Kupplung als
unvollständig angesehen und mit der gleichen schützenden Aminosäure wiederholt. Als Ergebnis der verschiedenen
Kupplungsreaktionen wurde als Zwischenprodukt das Pentapeptid-Harz hergestellt.
In einer Kelf-Spaltapparatur (Peninsula Laboratories, '
Inc.) wurden dieses Peptid-Harz gespalten und die
Schutzgruppen unter Verwendung von wasserfreiem Fluor- ι
wasserstoff bei 0°C für 60 Minuten mit 1,2 ml Anisol i
pro g Peptid-Harz als Radikalfänger entfernt. Das ;
Peptidgemisch wurde gefriergetrocknet und mit wasser- j
freiem Äther gewaschen. Das Peptid wurde an P-6 Bio-Gel
in 1 η-Essigsäure chromatographiert. Für das erhaltene '
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Polypeptid wurde festgestellt, daß es eine Reinheit von 94% und die folgende Sequenz hatte:
H2N-TYR-ASN-ILE-GLN-LYS-COOh
Zur Ermittlung der Aktivität und der Eigenschaften des
Folypeptids wurden Bestimmungen an gesunden, 5 bis 6 Wochen alten nu/nu-Mäusen beiderlei Geschlechts durchgeführt,
die auf einer BALB/c-Grundlage gezüchtet (wobei Thymocyten das Thy-1,2-Oberflächenantigen ausdrücken)
und unter üblichen Bedingungen gehalten wurden. Für die Antiseren wurden Anti-Thy-1,2-Seren in
Thy-1-Mäusen beiderlei Geschlechts (Thy-1 congenic mice) hergestellt.
Für die Auslösung der Differenzierung von Thy-1 -T-Zellen
oder CR+-B-Zellen in vitro wurde die Induktion
der Thymocytendifferenzierung von Prothymocyten in vitro durchgeführt, wie von Komuro und Boyse beschrieben
(Lancet 1 (1973) 740), wobei das Auftreten von Thy-1,2 als Anzeichen der Differenzierung der T-ZeIlen
diente. Die Induktion der Differenzierung der CR -B-ZeIlen
von CR~-B-Zellenvorstufen in vitro erfolgte unter ähnlichen Bedingungen, wobei als Kriterium des
Tests die Fähigkeit der CR+-P-Zellen diente, Schafserythrocyten,
die mit subagglutinierenden Mengen von Kaninchen-Antikörpern und nicht-lytischem-Komplement
bedeckt (coated) waren, zu binden. Milzzellenpopulationen von gesunden nu/nu-Mäusen, an diskontinuierlichen
Rinderserumalbumin-Gradienten fraktioniert, wurden als Quelle beider Vorstufentypen (Thy-1~ und
CR~) verwendet, weil sie sehr wenig oder keine Thy-1+- Zellen und geringe Anzahlen von CR+-Zellen aufweisen.
Als Ergebnis dieser Bestimmung wurde gefunden, daß das Polypeptid eine Selektivität von Wirkungen ähnlich
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derjenigen von Ubiquitin in der Induktion der Differenzierung von T-Lymphozyten und von Komplementrezeptoren-(CR+)-B-Lymphozyten
zeigten. Das Pentapeptid führte die Differenzierung von Thy-1 -T-Zellen in
Konzentrationen von 10 ng bis 1 ,ug/ml sowie die Differenzierung
von CR -B-Zellen in Konzentrationen von 10 ng bis 1,ug/ml herbei.
Das auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise hergestellte Pentapeptid wurde durch Umsetzung mit Acetylchlorid
nach bekannten Verfahren acyliert, wobei das folgende acylierte Derivat erhalten wurde:
A. CH3CONH-TyR-ASN-ILE-GLN-LYS-COOH
Beispiel 4
Das gemäß Beispiel 1 hergestellte Pentapeptid wurde auch durch Umsetzung mit Ammoniak nach bekannten Verfahren amidiert, wobei das folgende Derivat erhalten wurde:
Das gemäß Beispiel 1 hergestellte Pentapeptid wurde auch durch Umsetzung mit Ammoniak nach bekannten Verfahren amidiert, wobei das folgende Derivat erhalten wurde:
B. H9N-TYR-ASN-ILE-GLN-LYS-CONh0
Die Identifizierung erfolgte durch Dünnschichtchromatographie
und Elektrophorese, wobei die folgenden Werte erhalten wurden:
DünnSchichtchromatographie:
Probe: 30 ug
Kieselgel (Brinkman-Glasplatte, 5x20 cm,0,25 mm dick) R^ : n-Bu0H : Pyridin : HOAc : H3O 30 : 15 : 3 : 12
Probe: 30 ug
Kieselgel (Brinkman-Glasplatte, 5x20 cm,0,25 mm dick) R^ : n-Bu0H : Pyridin : HOAc : H3O 30 : 15 : 3 : 12
2
Rf : EtOAc : Pyridin : HOAc : H3O 5 : 5:1: 3 R^ : EtOAc : n-Bu0H : HOAc : H3O 1 : 1:1: 1 Spray-Reagenz: Pauly, Ninhydrin & I_
Rf : EtOAc : Pyridin : HOAc : H3O 5 : 5:1: 3 R^ : EtOAc : n-Bu0H : HOAc : H3O 1 : 1:1: 1 Spray-Reagenz: Pauly, Ninhydrin & I_
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3&
Verbindungen:
Dünnschicht-Chromatographie
Elektrophorese Peptid wanderte zur Kathode
Ac-Tyr-Asn-Ile-Gln-Lys Tyr-Asn-Ile-Gln-Lys-NH2
0.47 0.87 0.54 0.48 0.87 0.37
- 1.35 cm
- 6.60 cm
10
Elektrophorese:
Whatmen-Papier 3 mm (11,5 cm χ 56,5 cm)
Probe: 100 ug
pH 5,6, Pyridin-Acetat-Pufferlösung
lOCO V, 1 Stunde
Spray-Reagens: Pauly und Ninhydrin
Das acetylierte Pentapeptid von Beispiel 3 zeigte, wenn es in einer Konzentration von 1 ug/ml in 14%iger
Twomey-Lcsung verwendet wurde, maximale und minimale
Aktivitäten, die mit dem basischen Pentapeptid von Beispiel 1 vergleichbar waren.
Das amidierte Pentapeptid von Beispiel 4 zeigte bei Verwendung in einer Konzentration von 1 ug/ml in 6%iger
Twomey-Lösung eine Aktivität, die mit derjenigen des
basischen Pentapeptids von Beispiel 1 vergleichbar war.
Das gemäß Eeispiel 1 hergestellte basische Pentapeptid wird mit einer stöchiometrischen Menge Methylalkohol
unter Veresterungsbedingungen umgesetzt. Das Pentapeptid der folgenden Formel wird gebildet und isoliert:
H2N-TYR-ASN-ILE-GLN-LYS-COOCh3
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280Λ567
Eeispiel 6
Das gemäß Beispiel 1 hergestellte Pentapeptid wird mit einer stöchiometrischen Menge Chlorwasserstoff umgesetzt,
wobei das Acetylhalogenidderivat der folgenden Formel gebildet wird:
H2N-TYR-ASN-ILe-GLN-LYS-COCI
Das gemäß Beispiel 1 hergestellte Pentapeptid wird mit Diethylamin in stöchiometrischen Mengen unter bekannten
Reaktionsbedingungen umgesetzt, wobei das folgende aminosubstituierte Derivat gebildet wird:
H2N-TYR-ASN-ILE-GLN-LYS-COn(C2H5)2
Das gemäß Beispiel 1 hergestellte Pentapeptid wird mit Äthylchlorid unter Alkylierungsbedingungen umgesetzt,
wobei das substituierte Derivat der folgenden Formel gebildet wird:
C2H5NH-TYR-ASN-ILE-GLN-LYS-COOh
Beispiel 9
Das gemäß Beispiel 8 hergestellte Methylaminopolypeptid wird mit Ammoniak in stöchiometrischen Mengen unter Amidierungsbedingungen umgesetzt, wobei das Amidopolypeptid der folgenden Formel gebildet wird:
Das gemäß Beispiel 8 hergestellte Methylaminopolypeptid wird mit Ammoniak in stöchiometrischen Mengen unter Amidierungsbedingungen umgesetzt, wobei das Amidopolypeptid der folgenden Formel gebildet wird:
CH3NH-TYR-ASN-ILe-GLN-LYS-CONH2
Beispiel 10 :
Das gemäß Beispiel 1 hergestellte Pentapeptid wird unter Alkylierungsbedingungen mit Phenylchlorid umge- '
setzt, wobei das phenylsubstituierte Polypeptid der I
folgenden Formel gebildet wird:
C H1-NH-TYR-ASN-ILe-GLN-LYS-COOC2H5
6 5
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Ji
Beispiel 11
Das gemäß Beispiel 3 hergestellte acetylierte Pentapeptid wird mit wasserfreiem Ammoniak unter Amidierungsbedingungen
umgesetzt, wobei das folgende PoIypeptid gebildet wird:
CH3CONH-TYR-ASN-ILE-GLN-LYS-CONIi2
Unter Anwendung der vorstehend für die Verlängerung der Polypeptidkette beschriebenen Reaktionsmethoden
v/erden die folgenden Polypeptide hergestellt, die die aktive Aminosäuresequenz enthalten, aber an den endständigen
Aminogruppen und Carboxylsäuregruppen durch R und R1 substituiert sind, wobei die basische Aminosäure
der Formel
R-NH-TYR-ASN-ILE-GLN-LYS-COR1
erhalten wird, die durch die in der folgenden Tabelle genannten Aminosäuren substituiert ist:
| Beispiel Nr. | R | ASP | R1 | OH |
| 12 | SER-ASP | OH | ||
| 13 | LEU-SER-ASP | OH | ||
| 14 | LEU-SER-ASP | GLU | ||
| 15 | LEU-SER-ASP | GLU-SER | ||
| 16 | LEU-SER-ASP | GLU-SER-THR | ||
| 17 | LEU-SER-ASP | GLU-SER-THR-LEU | ||
| 18 | LEU-SER-ASP | GLU-SER-THR-LEU-HIS | ||
| 19 | LEU-SER-ASP | GLU-SER-THR-LEU-HIS-LEU | ||
| 20 | ASP | GLU | ||
| 21 | ASP | GLU-SER | ||
| 22 | LEU-SER-ASP | GLU-SER-THR-LEU-HIS-LEU-VAL-LEU-ARG | ||
| 23 |
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Die gemäß den Beispielen 5 bis 23 hergestellten PoIypeptidderivate
bewahren die für die basische Aminosäuresequenz beschriebene biologische Aktivität.
Nach dem in Beispiel 1 beschriebenen stufenweisen Verfahren v/erden die folgenden Pentapeptide hergestellt:
Beispiel 24 H2N-ALA-ASN-ILE-GLN-LYs-COOH
Beispiel 25 H2N-TYR-ALA-ILE-GLN-LYS-COOh
Beispiel 26 H2N-TYR-ASN-ALA-GLN-LYS-COOH
Zur Bestimmung der pharmakologlschen Aktivität und der
pharmakologischen Eigenschaften dieser Pentapeptide wurde die Induktion von Th-I-(T-ZeIlen)-Antigen am
Knochenmark von Küken zur Testung der Peptide bei einer Konzentration von 1 .ug/ml angewendet. Diese Methode
wird von Brand und Mitarbeitern in "Science" 193 (Juli 1976) 319-321 beschrieben. Bei dieser Methode
werden die zusammengegebenen Zellen von Femur und Tibiotarsus von gerade ausgeschlüpften Küken des Stammes
SC (Hy-Linie) durch Ultrazentrifugierung an einem fünfschichtigen diskontinuierlichen Rinderserumalbumin—
(BSA)-Gradienten (11) fraktioniert. Zellen aus jeder Grenzfläche werden gewaschen und für die Inkubation
in einer Konzentration von 5x10 Zellen pro ml mit dem Peptid (0,1 ug/ml im Medium RPMI 1630 suspendiert, das
mit 15 mMol Hepes, 5% γ-globulinfreiem fetalem Kalbs-
serum, Desoxyribonuclease (14-18 Einheiten/ml), Heparin'
(5 Einheiten/ml), Penicillin (ICO Einheiten/ml) und :
Streptomycin (100 ug/ml) ergänzt ist. Kontrollproben i v/erden mit BSA (1 pg/ml) oder Medium allein inkubiert. |
Nach der Inkubation werden die Zellen im Zytotoxizi- ·
tätstest unter Verwendung von Küken- und Meerschweinchenkomplementfraktionen geprüft. Der Anteil von Bu-I+-
bzw. Th-1+-Zellen in jeder Schicht wird als Zytotoxizi-i
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zitätsindex '1OO (a-b)/a berechnet, wobei a und b die
Prozentsätze lebensfähiger Zellen in der Komplementkontrolle
bzw. im Testpräparat sind. Der Prozentsatz von induzierten Zellen wird durch Subtraktion der
Mittelwerte bei den Kontrollinkubationen ohne Induk-tionsmittel
(gewöhnlich 1 bis 3%) von denen der Test-Induktionen ermittelt.
Als Ergebnis der Charakterisierungen dieser Art wurde gefunden, daß die gemäß den Beispielen 24, 25 und 26
hergestellten Pentapeptide die folgenden Prozentsätze
von Induktionen von Th-1-(T-Zellen)-Antigen am Kochenmark von Küken zeigen:
24 12% 25 15%
25 21%
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Claims (33)
1) Polypeptidfragment, das die Fähigkeit hat, die Diffe-"-'""
renzierung sowohl von T-Lymphozyten als auch Komplementrezeptor(CR"1")-B-Lymphozyten
zu bewirken und die aktive Gruppe
-X-Y-Z-GLN-LYS-
enthält, worin X für TYR oder ALA, Y für ASN oder ALA und Z für ILE oder ALA steht.
2) Polypeptid mit der biologischen Fähigkeit, die Differenzierung sowohl von T-Lymphozyten als auch Komplementrezeptor
(CR )—B-Lymphozyten zu bewirken, und die
Sequenz
R-NH-X-Y-Z-GLN-LYS-COR1
aufweist, worin X für TYR oder ALA, Y für ASN oder ALA
und Z für ILE oder ALA steht und R und R1 endständige Gruppen am Polypeptid sind, die die biologische Aktivität
nicht wesentlich beeinträchtigen, und seine pharmazeutisch unbedenklichen Salze, wobei R und R1 aus
den folgenden Gruppen ausgewählt sind:
R R'
Wasserstoff OH
C1-C7 -Alkyl NH2
C5-C12-Aryl
NHR
C6-C20-Alkaryl N(R)2
Cc-C„r.-Aralkyl OR7
0 ZU I
HAL
GLU
SER '
ι THR j
LEU ι
his :
VAL
2B04567
R R1
LEU-SER-ASP ARG
LEU-ASP GLU-SER
LEU-ASP GLU-THR
GLU-SER-LEU
GLU-SER-THR
GLU-SER-THR-LEU
GLU-SER-THR-LEU-HIS
GLU-SER-THR-LEU-HIS-LEU
GLU-SER-THR-LEU-HIS-LEU-VAL
GLU-SER-THR-LEU-HIS-LEU-VAL-LEU
GLU-SER-THR-LEU-HIS-LEU-VAL-LEU-ARG
GLU-SER-THR-LEU-HIS-LEU-VAL-LEU-ARG-LEU
GLU-SER-THR-LEU-HIS-LEU-VAL-LEU-ARG-LEU-ARG
worin R7 für C1-C7-AIlCyI, C^C^Alkenyl, C^Cj
Cg-C2O-Aryl, Cg-C^-Aralkyl oder Cg-C20-Alkaryl und
HAL für Halogen steht.
3) Pentapeptid mit der Sequenz
R-HN-TYR-ASN-ILE-GLN-LYS-COR' t
worin R für Wasserstof f, C1-C7-Alkyl, C^-C.. p-Aryl oder
C1-C?-Alkanoyl und R1 für OH, NH2, NHR, N(R)2 oder
Chlor steht, und seine pharmazeutisch unhedenklichen Salze.
4) Polypeptid mit der Sequenz
H2N-TYR-ASN-ILE-GLN-LYS-COOh
und seine pharmazeutisch unbedenklichen Salze.
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5) Polypeptid nach Anspruch 2f dadurch gekennzeichnet,
daß R für V/asserstoff und R1 für OH. steht.
6) Polypeptid nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet,
daß R für CH3CO- und R1 für OH steht.
7) Polypeptid nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet,
daß R für CH3 und R· für OH steht.
8) Polypeptid nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet,
daß R für H und R1 für NH2 steht.
9) Polypeptid nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß R für H und R1 für Cl steht.
10) Polypeptid nach Anspruch 2f dadurch gekennzeichnet, "
daß R für H und R' für N(C3H5)2 steht.
11) Polypeptid nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß R für CH3CO- und R· für NH2 steht.
12) Polypeptid nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß R für H und Rr für -OCH3 steht.
13) Polypeptid nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß R für H und R1 für OC3H5 steht.
14) Polypeptid nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß R für Phenyl und R' für -OH steht.
15) Polypeptid nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß R für C2H5 und R« für OC2H5 steht.
16) Polypeptid nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß R für CH, und R' für -NH9 steht.
17) Polypeptid nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß R für ASP und R' für -OH steht.
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-A-
18) Polypeptid nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß R für SER-ASP und R· für -OH steht.
19) Polypeptid nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß R für LEU-SER-ASP und R' für -OH steht.
20) Polypeptid nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß R für LEU-SER-ASP und R1 für GLU steht.
21) Polypeptid nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet,
daß R für LEU-SER-ASP und R· für GLU-SER steht.
22) Polypeptid nach AnSprUch 2, dadurch gekennzeichnet,
daß R für LEU-SER-ASP und R1 für GLU-SER-THR steht.
23) Polypeptid nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, ■ daß R für LEU-SER-ASP und R1 für GLU-SER-THR-LEU steht.
24) Polypeptid nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß R für LEU-SER-ASP und R· für GLU-SER-THR-LEU-HIS
steht.
25) Polypeptid nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß R für ASP und R' für GLU steht.
26) Polypeptid nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß R für ASP und R' für GLU-SER steht.
27) Polypeptid nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß R für Wasserstoff und Rf für GLU-SER-THR-LEU-HIS-LEU-VAL-LEU-ARG-LEU-ARG
steht.
28) Zwischenprodukt-Polypeptid mit der Sequenz
R1 R9
I1 I
R3-TYR-ASN-ILE-GLN-LYS-Harz
worin R1 und R? Schutzgruppen an reaktionsfähigen
Seitenketten sind, R3 eine Schutzgruppe an der a-Aminogruppe
und das Harz ein unlösliches Polymerisat ist,
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das eine beständige physikalische Form aufweist und durch eine kovalente Bindung an die benachbarte Aminosäure
gebunden ist.
29) Zv/ischenprodukt-Polypept^id nach Anspruch 28, worin R,
für 0-2,6-Dichlorbenzyl, Rp für c-2-Chlorbenzyloxycarbonyl
und FU für Eutyloxycarbonyl steht.
30) Arzneimittel, enthaltend eine therapeutisch wirksame
Menge eines Polypeptids nach Anspruch 1 bis 29 in einem pharmazeutisch unbedenklichen Träger.
31) Verfahren zur Herstellung des aktiven Peptidse'gments
nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man L-Lysin, das an seinen Aminogruppen geschützt ist,
durch kovalente Bindung zu einem unlöslichen Harzpolymerisat verstert, die die oc-Aminogruppe schützende
Gruppe von der L-Lysinkomponente entfernt, das Produkt mit einem L-Glutamin mit geschützter (X-Arninogruppe
umsetzt und hierdurch das L-Glutamin an das L-Lysinharz kuppelt, die Schutzgruppe der o:-Aminogruppe von
der L-Glutaminkomponente entfernt, das Produkt mit L-Isoleucin oder L-Alanin mit geschützter Aminogruppe
umsetzt und hierdurch das L-Isoleucin oder L-Alanin an das L-Glutamin-L-Lysin-Harz kuppelt, die Schutzgruppe
der a-Aminogruppe entfernt und das Produkt mit L-Asparagin oder L-Alanin mit geschützter a-Aminogruppe
umsetzt und hierdurch das L-Asparagin oder L-Alanin an das L-Isoleucin- bzw. L-Alanin-L-Glutamin-L-Lysin-Harz
kuppelt, die Schutzgruppe der a-Aminogruppe entfernt und das Produkt mit L-Tyrosin oder L-Alanin mit '
geschützter cu-Aminogruppe umsetzt und hierdurch das :
L-Tyrosin oder L-Alanin an das L-Asparagin- oder L- , Alanin-L-Isoleucin- oder L-Alanin-L-Glutamin-L-Lysin- ■
Harz kuppelt, alle Schutzgruppen der Aminogruppen vom ί Peptid entfernt und das Produkt vom Harzpolymerisat ,
abtrennt. '
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32) Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet,
daß die reaktionsfähigen Seitenketten an den reagierenden
Aminosäuren während der Reaktion geschützt sind,
33) Verfahren nach Anspruch 31 und 32, dadurch gekennzeichnet, daß man als Harzpolymeres Cellulose, Polyvinylalkohol,
Polymethacrylat, sulfoniertes Polystyrol oder ein chlormethyliertes Copolymerisat von Styrol und
Divinylbenzol verwendet.
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