AT384812B

AT384812B - Verfahren zur herstellung neuer polypeptide

Info

Publication number: AT384812B
Application number: AT78881A
Authority: AT
Original assignee: Ortho Pharma Corp
Priority date: 1977-12-08
Filing date: 1981-02-20
Publication date: 1988-01-11
Also published as: ATA78881A

Description

Bekanntlich sind viele Polypeptide aus verschiedenen Geweben, Organen und dem Blut von Tieren isoliert worden. Viele dieser Polypeptide stehen in Beziehung zur Immunfunktion des Körpers, beispielsweise die verschiedenen Immunglobuline und das Thymushormon Thymopoetin.

Die Isolierung verschiedener derartiger Polypeptide ist in den US-PS Nr. 4, 002, 602 und Nr. 4, 002, 740 beschrieben.

Bis vor etwa 10 Jahren war über den Thymus wenig bekannt, obwohl man heute weiss, dass er eines der wesentlichen Organe ist, die für die Immunfunktion bei Säugetieren und Vögeln verantwortlich sind. Trotz grossen Interesses an möglichen Funktionen des Thymus sowie theoreti- scher Überlegungen und experimenteller Untersuchungen war bis vor kurzem über die Funktion des Thymus wenig bekannt. Jedoch weiss man jetzt, dass der Thymus ein kombiniertes Organ mit sowohl epithelialen (endocrinen) als auch lymphoiden (immunologischen) Komponenten darstellt und somit an den Immunfunktionen des Körpers beteiligt ist. Der Thymus besteht aus einem epithelialem Grundgewebe, das vom dritten Aortenbogen stammt, und Lymphozyten, die von Stammzel- len abgeleitet sind, die ursprünglich in haematopoetischen Geweben vorkommen (vgl. Goldstein,
The Human Thymus, Heinemann, London, 1969).

Lymphozyten sind innerhalb des Thymus differen- ziert und treten aus als reife, vom Thymus stammende Zellen, sogenannte T-Zellen, die durch das Blut, die Lymphe, die Milz und die Lymphknoten zirkulieren. Die Induktion der Differenzierung von Stammzellen innerhalb des Thymus scheint durch Sekretionen der Epithelzellen des Thymus vermittelt zu werden.

Es war bekannt, dass der Thymus mit den Immuneigenschaften des Körpers im Zusammenhang steht. Deshalb richtete sich grosses Interesse auf Stoffe, die aus dem Thymus isoliert worden sind. In dieser Hinsicht erschienen in den letzten Jahren zahlreiche Veröffentlichungen, die sich auf entsprechende Untersuchungen am Rinderthymus beziehen. Veröffentlichungen auf diesem
Gebiet sind beispielsweise in The Lancet, 20. Juli 1968, S. 119 bis 122 ; Triangle, Bd.

II, Nr. l [1972], S. 7 bis 14 ; Annals of the New York Academy of Sciences, Bd. 183 [1971], S. 230 bis 240 ;
Clinical and Experimental Immunology, Bd. 4, Nr. 2 [1969], S. 181 bis 189 ; Nature, Bd. 247 [1974],
S. 11 bis 14 ; Proceedings of the National Academy of Sciences USA, Bd. 71 [1974], S. 1474 bis
1478 ; Cell, Bd. 5 [1975], S. 361 bis 365 und 367 bis 370 ; Lancet, Bd. 2 [1975], S. 256 bis 259 ;
Proceedings of the National Academy of Sciences USA ; Bd. 72 [1975], S. 11 bis 15 ; Biochemistry, Bd. 14 [1974], S. 2214 bis 2218 ; Nature, Bd. 255 [1975], S. 423 bis 424, erfolgt.

Eine zweite Klasse von Lymphozyten mit Immunfunktion sind die B-Lymphozyten oder B-Zellen.

Diese sind differenziert in der Bursa Fabricius bei Vögeln und in einem bis jetzt noch nicht identifizierten Organ bei Säugetieren. Die T-Zellen und B-Zellen wirken in verschiedener Hinsicht bei der Immunität zusammen (vgl. Science, Bd. 193 [23. Juli 1976], S. 319, sowie Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, Bd. XLI [1977], S. 5).

Kürzlich wurde von J. F. Bach ein Nonapeptid aus einem vom Schwein stammenden Serum isoliert und als "facteur thymique serique" (FTS) identifiziert. Die Isolierung dieses Stoffs und seine Struktur sind in C. R. Acad. Sc. Paris, t. 283 [29. November 1976], Series D-1605 sowie in Nature, Bd. 266 [3. März 1977], S. 55, beschrieben. Die Struktur dieses Nonapeptids wurde als
GLX-ALA-LYS-SER-GLN-GLY-GLY-SER-ASN identifiziert, wobei die Gruppe"GLX"entweder Glutamin oder Pyroglutaminsäure bedeutet. Der Stoff, bei dem die Gruppe GLX diese Bedeutung hat, wurde synthetisiert. In den vorgenannten Veröffentlichungen von Bach ist beschrieben, dass sein Nonapeptid FTS in einem E-Rosetten-Versuch T-Zellen (und nicht B-Zellen) selektiv differenziert. Daraus schloss er, dass es sich bei dem Stoff um ein Thymushormon handelt.

Kürzlich wurde eine gründlichere Untersuchung der Wirksamkeit dieses Nonapeptids veröffentlicht, wonach FTS sowohl T-Zellen als auch B-Zellen differenziert und deshalb in seiner Wirksamkeit mehr Ubiquitin als Thymopoetin ähnelt (Nature,
EMI1.1

Es wurde nun gefunden, dass ein synthetisiertes 4-Aminosäure-polypeptidsegment dieses Nonapeptids FTS viele der in den vorgenannten Veröffentlichungen diskutierten Charakteristiken des Nonapeptids aufweist.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neue biologisch wertvolle Polypeptidsegmente und Polypeptide zur Verfügung zu stellen. Insbesondere besteht die Aufgabe darin, neue Polypeptid- segmente und Polypeptide zu schaffen, welche die Fähigkeit aufweisen, die Differenzierung von
T-Lymphozyten und B-Lymphozyten zu induzieren und deshalb für das Immunsystem bei Mensch und Tier wertvoll sind.

Die Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Herstellung neuer Polypeptide der allgemeinen
Formel H-X-LYS-Y-GLN-NH in der X eine Sarcosyl-, L-Alanyl- oder D-Alanylgruppe darstellt und Y für eine Seryl-, Sarcosyl-,
2-Methylalanyl- oder D-Alanylgruppe steht.

Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man an der Aminogruppe geschütztes L-Glutamin durch Verestern kovalent an ein unlösliches
Polymerisat bindet, die Schutzgruppe an der a-Aminogruppe des L-Glutamins abspaltet, die erhaltene Verbindung mit einer an ihrer a-Aminogruppe geschützten Y-Aminosäure kuppelt, die
Schutzgruppe an der a-Aminogruppe der Y-Aminosäure abspaltet, die erhaltene Verbindung mit an der a-Aminogruppe geschütztem L-Lysin zum entsprechenden L-Lysin-Y-Aminosäure-L-Glutamin- - Polymerisat kuppelt, von der a-Aminogruppe des Restes des L-Lysins die Schutzgruppe abspaltet, die erhaltene Verbindung mit einer an der a-Aminogruppe geschützten X-Aminosäure zum entspre- chenden X-Aminosäure-L-Lysin-Y-Aminosäure-L-Glutamin-Polymerisat kuppelt,

das Polymerisat vom erhaltenen Peptid mit Ammoniak in Dimethylformamid unter amidierenden Bedingungen abspal- tet und alle Schutzgruppen entfernt.

Erfindungsgemäss werden neue biologisch wirksame Polypeptidsegmente zur Verfügung gestellt, welche die Aminosäuresequenz - ALA-LYS-SER-GLN- (I) aufweisen. Die biologische Wirksamkeit dieser Polypeptidsegmente wird im allgemeinen beibehalten, wenn ein Ersatz der L-Alanylgruppe in der ersten Stellung oder der L-Serylgruppe in der dritten
Stellung oder ein Ersatz dieser beiden Gruppen durch natürliche oder synthetische Aminosäurereste erfolgt. Bestimmte dieser substituierten Polypeptidsegmente sind in besonders überraschender Weise wirksam. Eine Substitution am Ende des Polypeptidsegments führt zum entsprechenden Polypeptid.

Erfindungsgemäss werden die Polypeptidsegmente und Polypeptide durch eine Peptidsynthese in der festen Phase hergestellt.

Da erfindungsgemäss die vorgenannten Substitutionen erfolgen können, wobei die biologische Wirksamkeit der Polypeptidsegmente im allgemeinen erhalten bleibt, gehört zum Wesen der Erfindung auch die Herstellung biologisch wirksamer Polypeptidsegmente mit der Aminosäuresequenz - X-LYS-Y-GLN-, (IA) in der X und Y gleich oder verschieden sind und jeweils einen Rest einer natürlichen oder synthetischen a-Aminosäure (nachfolgend "Aminosäure") darstellen. Wenn auch davon ausgegangen werden kann, dass der grössere Teil derartiger Substitutionen durch Reste X und Y die biologische Wirksamkeit beibehält, ist es möglich, dass gewisse natürliche oder synthetische Aminosäurereste das Falten des Moleküls (vgl. unten) beeinträchtigen und so im wesentlichen die biologische Wirksamkeit beseitigen.

Derartige, diese Wirksamkeit zerstörende Substituenten fallen nicht unter die Erfindung.

Die Substituenten X und Y sind vorzugsweise natürliche Aminosäurereste, wie die L-Alanylund L-Serylgruppe, sowie synthetische Aminosäurereste, wie die Sarcosyl- und 2-Methylalanylgruppe, sowie die D-Formen der vorgenannten L-Aminosäuren. Ob eine bestimmte Substitution die biologische Wirksamkeit des Polypeptids beibehält, kann leicht durch die Untersuchung des Differenzierens von Th-l+ T-Lymphozyten und Bu-1 B-Lymphozyten gemäss dem nachfolgend

beschriebenen Hühnchen-Induktionsversuch bestimmt werden. Verbindungen, die spezifisch wirksam sind in Konzentrationen der Grössenordnung Nanogramm (ng)/ml, z. B. bei einer Konzentration von etwa 1 ng/ml oder weniger, werden gemäss diesem Versuch als biologisch wirksam angesehen.

Eine Liste entsprechender natürlicher Aminosäuren kann in vielen Veröffentlichungen gefunden werden, beispielsweise bei R. T. Morrison und R. N. Boyd, Organic Chemistry, Allyn und Bacon, 1959, Kapitel 33. Neben den natürlichen Aminosäuren, die in Proteinen gefunden werden, gibt es auch eine Reihe sogenannter synthetischer Aminosäuren, die in Proteinen nicht vorkommen, obwohl sie manchmal in der Natur zu finden sind, beispielsweise als Zwischenprodukte des Stoffwechsels. Diese synthetischen Aminosäuren können die D-Isomeren der entsprechenden optisch aktiven (L-Form) natürlichen Aminosäuren sein, oder es handelt sich um davon völlig verschiedene chemische Individuen, wie Sarcosin (N-Methylglycin) oder 2-Methylalanin. Zusammenstellungen derartiger synthetischer Aminosäuren sind gleichfalls vielfach veröffentlicht worden.

Die vorgenannten Polypeptidsegmente (IA) müssen zusätzlich endständige Substituenten an der 4-Aminosäuresequenz enthalten, wodurch das entsprechende Polypeptid gebildet wird. Diese endständigen Substituenten dürfen im wesentlichen die biologische Wirksamkeit des aktiven 4-Aminosäuresegments nicht beeinträchtigen, was durch die Fähigkeit, das Differenzieren von Th-i T-Lymphozyten und Bu-l+ B-Lymphozyten beim nachstehend beschriebenen Hühnchen-Induktionsversuch zu induzieren, bestimmt wird. Die erfindungsgemäss erhältlichen Polypeptide weisen die allgemeine Formel
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auf, in der X und Y die vorstehende Bedeutung haben.

Da das wirksame Tetrapeptidsegment innerhalb einer länglichen Sequenz in dem in der Natur vorkommenden Material, das von Bach isoliert worden ist, enthalten ist, ist davon auszugehen, dass die endständige Aminogruppe für die biologische Wirksamkeit des Tetrapeptids nicht notwendig ist, wie es für einige Polypeptide der Fall ist.

Die erfindungsgemäss erhältlichen Polypeptidsegmente sind äusserst ungewöhnlich, da sie die gleiche biologische Wirksamkeit wie das natürliche Nonapeptid aufweisen, von dem das wirk- same Tetrapeptidsegment einen Teil bildet. Es wird angenommen, dass die Erfordernisse für eine biologische Wirksamkeit des Moleküls in seiner Stereochemie begründet sind, d. h. in besonderen "Falten" des Moleküls. Es ist davon auszugehen, dass Polypeptidbindungen nicht fest sondern flexibel sind, und Polypeptide beispielsweise als Platten und Helices vorliegen können. Im Ergebnis ist das gesamte Molekül flexibel und faltet sich in bestimmter Weise.

Es wurde gefunden, dass sich die neuen Tetrapeptidsegmente wahrscheinlich in ähnlicher Weise wie das entsprechende Tetrapeptidsegment in dem natürlichen Nonapeptid falten, da sie die gleichen biologischen Charakteristiken aufweisen. Aus diesem Grund können die Tetrapeptidsegmente an den Enden durch verschiedene funktionelle Gruppen substituiert sein, solange die Substituenten die biologische Wirksamkeit oder das natürliche Falten des Moleküls nicht beeinträchtigen.

Die Fähigkeit des Moleküls, seine biologische Wirksamkeit und das natürliche Falten beizubehalten, ergibt sich klar aus der Tatsache, dass die erfindungsgemäss erhältlichen Tetrapeptidsegmente die gleichen biologischen Charakteristiken wie das naturliche 9-Aminosäurepeptid aufweisen, das als FTS von Bach beschrieben worden ist. In diesem Nonapeptid könnte eine erfindungsgemäss erhältiche Tetrapeptidsequenz innerhalb des Moleküls identifiziert werden, jedoch nur in Kombination mit den andern hier beschriebenen Aminosäuren. Da die erfindungsgemäss erhältlichen Tetrapeptidsegmente die gleiche biologische Wirksamkeit wie das Nonapeptid FTS aufweisen, ist es klar, dass die Aminosäuren und die an den endständigen Aminosäureresten des Tetrapeptidsegments substituierten Peptidketten die biologischen Charakteristiken nicht beeinträchtigen.

Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform ist X eine Sarcosylgruppe und Y eine Sarcosyloder D-Alanylgruppe.

Die Erfindung erstreckt sich auch auf die Herstellung der Salze der genannten Polypeptide.

Als Säuren, welche Salze mit den Polypeptiden bilden können, kommen anorganische Säuren, wie Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Perchlorsäure, Salpetersäure, Thiocyansäure, Schwefelsäure

und Phosphorsäure, oder organische Säuren, wie Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Glykolsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure, Oxalsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Anthranilsäure, Zimtsäure, Naphthalinsulfonsäure oder Sulfanilsäure, in Frage.

Zur Vereinfachung werden die Aminosäurekomponenten der Peptide durch Abkürzungen dargestellt, die nachfolgend angegeben sind. Die D-Aminosäuren werden durch Vorsetzen eines D vor die Abkürzung gekennzeichnet, beispielsweise D-Alanin durch D-ALA.
EMI4.1

Aminosäuren <SEP> Abkürzung
<tb> L-Alanin <SEP> ALA
<tb> L-Asparaginsäure <SEP> ASP
<tb> L-Asparagin <SEP> ASN
<tb> L-Serin <SEP> SER
<tb> L-Glutaminsäure <SEP> GLU
<tb> L-Glutamin <SEP> GLN
<tb> L-Leucin <SEP> LEU
<tb> L-Lysin <SEP> LYS
<tb> L-Threonin <SEP> THR
<tb> Glycin <SEP> GLY
<tb> L-Valin <SEP> VAL
<tb> Sarcosin <SEP> SAR
<tb> 2-Methylalanin <SEP> 2-Me-ALA
<tb>

Die erfindungsgemäss darstellbaren Polypeptide sind 4-Aminosäurepeptide (und deren substi- tuierte Derivate), von denen gefunden wurde, dass sie ähnliche Eigenschaften aufweisen wie das 9-Aminosäurepolypeptid FTS, das aus Schweineblut isoliert worden ist, wie Bach berichtet hat. Die erfindungsgemäss erhältlichen Peptide sind besonders charakteristisch in ihrer Fähigkeit, das Differenzieren von T-Vorläuferzellen als auch B-Vorläuferzellen zu induzieren.

Gewisse erfin- dungsgemäss erhältliche Polypeptide sind in einer Konzentration von 1 Picogramm (pg) /ml beim Hühnchen-Induktionsversuch wirksam.

Es wurde gefunden, dass die erfindungsgemäss erhältlichen Polypeptide die Differenzierung von Immunocyt-Vorläuferzellen in vitro in der gleichen Weise wie das von Bach beschriebene Nonapeptid induzieren. Die erfindungsgemäss erhältlichen Polypeptide induzieren das Differenzieren von T-Vorläuferzellen (gemessen unter Heranziehung des Antigens Th-1 bei der Thymus-Differen- zierung) als auch von B-Vorläuferzellen (gemessen unter Heranziehung des Antigens Bu-l).

In andern Worten, die erfindungsgemäss herstellbaren Polypeptide haben die Fähigkeit, die Differenzierung von Th-l+ T-Lymphozyten und But-l+ B-Lymphozyten zu induzieren.

Es wurde auch gefunden, dass die erfindungsgemäss erhältlichen Polypeptide die Bildung in vivo von cytotoxischen Lymphozyten nach Stimulieren durch allogene Antigene erhöhen. Das heisst, eine Verabreichung dieser Polypeptide an beispielsweise Ratten fördert die Bildung von Vorläufern von cytotoxischen Lymphozyten ; dies wird durch einen Versuch in vitro an Rattenmilchzellen gemessen. Da die Erzeugung von cytotoxischen Lymphozyten mit dem Ausmass der Transplantat- - Abstossung bei der Reaktion zwischen allogenem Transplantat und Wirt direkt korrespondiert, ist die vorgenannte Wirkung der Polypeptide ein weiterer Hinweis auf die immunologische Nützlichkeit der erfindungsgemäss erhältlichen Polypeptide.

Zum besseren Verständnis der Bedeutung der differenzierenden biologischen Charakteristiken der erfindungsgemäss erhältlichen Polypeptide wird darauf hingewiesen, dass die Funktion des Thymus bezüglich der Immunität im wesentlichen gesehen werden kann in der Bildung von vom Thymus abgeleiteten Zellen oder Lymphozyten, die "T-Zellen" genannt werden. Diese Zellen bilden einen grossen Anteil der Ansammlung von rezirkulierenden kleinen Lymphozyten. T-Zellen

sind immunologisch spezifisch und sind als Effektorzellen direkt an durch Zellen vermittelten
Immunreaktionen, wie Homotransplantat-Reaktionen, beteiligt. T-Zellen scheiden jedoch keine humoralen Antikörper ab. Diese Antikörper werden von Zellen (B-Zellen) abgeschieden, die unabhän- gig vom Einfluss des Thymus direkt vom Knochenmark abgeleitet sind.

Jedoch erfordern B-Zellen für viele Antigene die Gegenwart von geeigneten reaktionsfähigen T-Zellen, bevor eine Bildung von Antikörpern möglich ist. Der Mechanismus dieses Vorgangs des Zusammenwirkens von Zellen ist noch nicht völlig aufgeklärt.

Somit kann gesagt werden, dass der Thymus für die Entwicklung von zellulärer Immunität und vielen humoralen Antikörperreaktionen erforderlich ist und diese Systeme durch Induzieren des Differenzierens von haematopoetischen Stammzellen gegenüber T-Zellen innerhalb des Thymus beeinflusst. Dieser induktive Einfluss wird vermittelt durch Sekretionen der Epithelzellen des
Thymus, d. h. durch Thymushormone.

Um die Wirkungsweise des Thymus und des Zellsystems der Lymphozyten und deren Zirkulation im Körper zu verstehen, muss man berücksichtigen, dass die Stammzellen im Knochenmark gebildet werden und den Thymus durch den Blutstrom erreichen. Innerhalb des Thymus werden die Stammzel- len differenziert zu immunologisch fähigen T-Zellen, die zum Blutstrom wandern und, zusammen mit B-Zellen, zwischen den Geweben, Lymphgefässen und dem Blutstrom zirkulieren.

Die Zellen des Körpers, die Antikörper (B-Zellen) abscheiden, entwickeln sich aus hemato- poetischen Stammzellen, jedoch wird ihre Differenzierung nicht durch den Thymus bestimmt.
In Vögeln werden sie in einem Organ differenziert, das dem Thymus analog ist und"Bursa Fabri- cius" genannt wird. Bei Säugetieren wurde kein entsprechendes Organ gefunden. Man nimmt an, dass diese Zellen innerhalb des Knochenmarks differenziert werden. Daher werden sie "vom Knochen- mark abgeleitete Zellen"oder"B-Zellen"genannt. Die physiologischen Stoffe, die dieses Differen- zieren bestimmt, sind noch völlig unbekannt.

Die erfindungsgemäss erhältlichen Polypeptide sind therapeutisch wertvolle Verbindungen zur Behandlung von Menschen und Tieren. Da die neuen Polypeptide die Fähigkeit aufweisen, das Differenzieren von lymphopoetischen Stammzellen (die in den haematopoetischen Geweben entstehen) in vom Thymus abgeleitete Lymphozyten (T-Zellen) und immunokompetenten B-Zellen zu induzieren, die in der Lage sind, an den Immunreaktionen des Körpers einzugreifen, sind die erfindungsgemäss erhältlichen Polypeptide in mehrfacher Hinsicht therapeutisch wertvoll.

Zunächst ist festzustellen, dass diese Polypeptide in verschiedenen Bereichen der Thymusfunktionen und der Immunität angewendet werden können, da sie die Fähigkeit aufweisen, gewisse der genannten Funktionen des Thymus auszuführen. Ein wesentliches Anwendungsgebiet ist die Behandlung des DiGeorge-Syndroms, das eine angeborene Abwesenheit des Thymus darstellt.

Eine Injektion eines der erfindungsgemäss erhältlichen Polypeptide beseitigt diesen Nachteil.

Eine andere Anwendung ist bei Agammaglobulinämie gegeben, die auf eine Schädigung des mutmasslichen Hormons zur Differenzierung von B-Zellen zurückzuführen ist. Eine Injektion eines der erfindungsgemäss erhältlichen Polypeptide beseitigt diesen Nachteil.

Da die erfindungsgemäss erhältlichen Polypeptide bei niedrigen Konzentrationen extrem wirksam sind, sind sie zur Erhöhung der kollektiven Immunität des Körpers dadurch wertvoll, dass sie die therapeutische Stimulierung zellulärer und humoraler Immunität erhöhen. Sie sind wirkungsvoll bei der Behandlung von Krankheiten, bei denen in vivo chronische Infektion auftritt, wie Pilz- oder Mycoplasmainfektionen, Tuberkulose, Lepra und akute und chronische Virusinfektionen.

Weiterhin sind die erfindungsgemäss erhältlichen Peptide nutzlich auf dem Gebiet der zellulären und humoralen Immunität, insbesondere dort, wo ein Mangel an Immunität besteht, wie bei dem vorgenannten DiGeorge-Syndrom.

Auf Grund der besonderen Charakteristika der erfindungsgemäss erhältlichen Polypeptide sind sie auch in vitro sehr nützlich zur Induzierung der Bildung von Oberflächenantigenen von T-Zellen, zur Induzierung der Bildung von funktionellen Fähigkeiten zur Erreichung von Reaktionen gegenüber Mitogenen und Antigenen und beim Zusammenwirken von Zellen zur Verbesserung der Fähigkeit von B-Zellen zur Bildung von Antikörpern.

Die Polypeptide sind in vitro wertvoll dadurch, dass sie die Bildung von B-Zellen induzieren, was an Hand der Bildung von

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EMI7.1

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In der vorstehenden Reaktionsfolge bedeuten R1 eine Schutzgruppe der a-Aminogruppe und R2 und R3 Schutzgruppen an den reaktionsfähigen Seitenketten von L-Serin und L-Lysin, die nicht angegriffen oder abgespalten werden, wenn R1 abgespalten wird ; dadurch wird die weitere Reaktion möglich. Bei dem vorstehend als Zwischenprodukt auftretenden Pentapeptid-Polymerisat bedeutet Rl vorzugsweise eine tert.

Butyloxycarbonylgruppe, R2 eine gegebenenfalls substituierte Benzylgruppe, wie die 4-Chlorbenzylgruppe, und R3 eine substituierte Benzyloxycarbonylgruppe, wie die 2, 6-Dichlorbenzyloxycarbonylgruppe. Das Polymerisat ist eines der vorstehend speziell genannten Polymerisate.

Nach der Herstellung des letzten Zwischenproduktes wird das Peptid-Polymerisat gespalten, um die Gruppen R., R und R3 sowie das Polymerisat abzuspalten. Die Schutzgruppen werden in üblicher Weise abgespalten, z. B. durch Behandeln mit wasserfreiem Fluorwasserstoff, wobei das freie Peptid erhalten wird.

Es ist erforderlich, die Aminogruppen zu schützen, um die Reaktionen zu den gewünschten Endprodukten zu führen. Geeignete Aminoschutzgruppen sind beispielsweise salzbildende Gruppen
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die tert. Amyloxycarbonylgruppe (AOC) zum Schutz der a-Aminogruppe in den Aminosäuren eingesetzt, die eine Reaktion am Carboxylende des Moleküls eingehen, da diese Schutzgruppen nach der Reaktion und vor dem folgenden Reaktionsschritt (bei dem die a-Aminogruppe selbst reagiert) leicht abgespalten werden können durch relativ mild wirkende Säuren, wie Trifluoressigsäure.

Diese Behandlung beeinträchtigt nicht Schutzgruppen zum Schutz anderer reaktionsfähiger Seitenketten. Das bedeutet, dass die a-Aminogruppen durch Umsetzen mit solchen Verbindungen geschützt werden können, welche die Aminogruppen für die folgende (n) Reaktion (en) schützen, wobei diese Schutzgruppen jedoch später unter Bedingungen abgespalten werden können, bei denen das Molekül nicht anderweitig angegriffen wird. Beispiele für derartige Verbindungen sind organische Carbonsäurederivate, welche die Aminogruppe acylieren.

Im allgemeinen können die Aminogruppen durch Umsetzen mit einer Verbindung geschützt werden, welche die allgemeine Formel
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aufweist, in der R4 jeden Rest bedeutet, der die Aminogruppe davon abhält, in die nachfolgende Kupplungsreaktion einzugreifen, und der ohne Zerstörung des Moleküls wieder abgespalten werden kann. R4 bedeutet einen unverzweigten oder verzweigten, gesättigten oder ungesättigten Alkylrest mit vorzugsweise 1 bis 10 Kohlenstoffatomen und vorzugsweise substituiert durch mindestens ein Halogenatom oder eine Cyangruppe, einen Arylrest mit vorzugsweise 6 bis 15 Kohlenstoffatomen, einen Cycloalkylrest mit vorzugsweise 5 bis 8 Kohlenstoffatomen, einen Aralkylrest mit vorzugsweise 7 bis 18 Kohlenstoffatomen, einen Alkarylrest mit vorzugsweise 7 bis 18 Kohlenstoffatomen oder einen heterocyclischen Rest, wie die Isonicotinylgruppe.

Die Aryl-, Aralkyl- und Alkarylreste können auch durch einen oder mehrere Alkylreste mit 1 bis etwa 4 Kohlenstoffatomen substituiert sein. Bevorzugte Reste für R4 sind die tert. Butyl-, tert. Amyl-, Tolyl-, Xylyl- und Benzylgruppe.

Besonders bevorzugte Aminoschutzgruppen sind beispielsweise die Benzyloxycarbonylgruppe, eine substituierte Benzyloxycarbonylgruppe, in der die Phenylgruppe substituiert ist durch mindestens ein Halogenatom, wie ein Chlor- oder Bromatom, eine Nitrogruppe, ein Niederalkoxyrest, wie
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und Formylgruppe.

Zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens wird das Peptid durch Umsetzen der freien a-Aminogruppe mit einer Verbindung aufgebaut, die geschützte Aminogruppen aufweist.

Zur Kupplungsreaktion wird die zu kuppelnde Verbindung an ihrer Carboxylgruppe aktiviert,

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das 1% Divinylbenzol und 0,75 Mol Chlorid pro g Polymerisat enthält.

Zur Herstellung des Polypeptids werden 2 mMol a-BOC-L-Glutamin in absolutem Äthanol, das 1 mMol Triäthylamin enthält, 24 h bei 80 C mit 2 mMol chlormethyliertem Polymerisat verestert.

Der erhaltene Aminosäure-Polymerisat-Ester wird abfiltriert, mit absolutem Äthanol gewaschen und getrocknet. Anschliessend werden die andern a-BOC-Aminosäuren in ähnlicher Weise mit der von der Schutzgruppe befreiten a-Aminogruppe des Peptid-Polymerisats in der richtigen Sequenz gekuppelt, wobei das erfindungsgemäss erhältliche Polypeptid unter Verwendung äquivalenter Mengen von Dicyclohexylcarbodiimid erhalten wird. Nach jeder Kupplungsreaktion werden jeweils gleiche Teile des Polymerisats mit Fluorescamin geprüft. Wird positive Fluoreszenz gefunden, wird dies als Anzeichen für eine nichtvollständige Reaktion angesehen, und die Kupplungsreaktion wird mit den gleichen geschützten Aminosäuren wiederholt. Schliesslich wird nach mehreren Kupplungsreaktionen das Tetrapeptid-Polymerisat als Zwischenprodukt erhalten.

Das Peptid-Polymerisat wird gespalten, und die Schutzgruppen werden an einem Chlortrifluor- äthylen-Polymeren unter Verwendung von wasserfreiem Fluorwasserstoff bei 0 C während 60 min und 1, 2 ml Anisol pro g Peptid-Polymerisat als Spülmittel abgetrennt. Das Peptidgemisch wird mit wasserfreiem Diäthyläther gewaschen und mit wässeriger Säure extrahiert. Der Extrakt wird lyophilisiert. Das Peptid wird an Polyacrylamid in In Essigsäure chromatographiert. Das erhaltene Polypeptid ist zu 94% rein.

Als seine Sequenz wurde ermittelt : H-ALA-LYS-SER-GLN-OH Zur Identifizierung werden die Dünnschichtchromatographie und die Elektrophorese wie folgt durchgeführt : Zur Dünnschichtchromatographie wird eine Probe von 30 ug an Kieselgel (Brinkman Silica Gel mit Fluoreszenzindikator, 20 x 20 cm ; 0, 1 mm Dicke) unter Verwendung der folgenden Laufmittel behandelt : Rf : n-Butanol : Pyridin : Essigsäure : Wasser ; 30 : 15 : 3 : 12
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Die Elektrophorese wird an einer Probe von 100 tig an einem Whatman-Papier (3 mm ; 11, 5 x 56, 5 cm) unter Verwendung einer Pyridin-Acetat-Pufferlösung (PH-Wert 5, 6) und einer Spannung von 1000 V während 1 h durchgeführt.

Sprühreagenzien für die Dünnschichtchromatographie und die Elektrophorese sind Pauly und Ninhydrin.

Die folgenden Ergebnisse wurden erhalten : R f l = unbeweglich ; R = unbeweglich ; Rf3 = 0,336.

Die Elektrophorese ergab eine Wanderung von 9, 4 cm gegen die Kathode.

Beispiele 1 bis 3 : Unter Einsatz der vorstehend beschriebenen Reaktionstechniken zur Herstellung substituierter Polypeptide werden Polypeptide der allgemeinen Formel H-X-LYS-Y-GLN-NH2 hergestellt. Diese Peptidamide werden unter Einsatz eines Benzhydrylamin-Polymerisats gemäss der bekannten Technik des Arbeitens in fester Phase erhalten.
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Beispiel
<tb> 1 <SEP> BAR <SEP> D-ALA
<tb> 1A <SEP> SAR <SEP> SAR
<tb> 2 <SEP> D-ALA <SEP> D-ALA
<tb> 3 <SEP> SAR <SEP> 2-Me-ALA
<tb>

Zur Identifizierung werden Dünnschichtchromatographie und Elektrophorese in folgender Weise eingesetzt.

Zur Dünnschichtchromatographie werden Proben von 20 gag an Kieselgel (5 x 20 cm) unter Verwendung von n-Butanol : Essigsäure : Äthylacetat : Wasser (1 : 1 : 1 : 1) als Laufmittel (Rfl) und an Cellulose 6064 (Eastman, 20 x 20 cm) unter Verwendung von n-Butanol : Pyridin : Essigsäure : Wasser (15 : 10 : 3 : 12) als Laufmittel (R) eingesetzt. Die Elektrophorese erfolgt mit Proben von 50 gag an Whatman-Papier (Nr. 3 ; 5, 6 x 55 cm) unter Verwendung einer Pyridin-Acetat-Pufferlösung (PH-Wert 5, 6) und bei einer Spannung von 1000 V während 1 h. Die Verbindungen wandern gegen die Kathode.

Die folgenden Ergebnisse wurden erhalten (die Rf-Werte und die Werte der Elektrophorese werden bezüglich H-ARG-LYS-ASP-VAL-TYR-OH) angegeben :
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<tb>
<tb> Beispiel <SEP> Rf1 <SEP> Rf2 <SEP> Elektrophorese
<tb> Wanderung <SEP> Reinheit <SEP>
<tb> 1 <SEP> 0, <SEP> 44 <SEP> 0, <SEP> 68 <SEP> 2, <SEP> 07 <SEP> 98% <SEP>
<tb> 1A <SEP> 0, <SEP> 88 <SEP> 0, <SEP> 60 <SEP> 1, <SEP> 78 <SEP> 98% <SEP>
<tb> 2 <SEP> 0, <SEP> 56 <SEP> 0, <SEP> 71 <SEP> 2, <SEP> 10 <SEP> 98%
<tb> 3 <SEP> 0, <SEP> 155 <SEP> immobil <SEP> 13, <SEP> 1 <SEP> 98%
<tb>
Wirksamkeitsermittlung : Zur Bestimmung der Wirksamkeit und der Charakteristiken der gemäss den Beispielen 1 bis 3 hergestellten Tetrapeptide wird der nachfolgenden Hühnchen-Induktionsversuch durchgeführt. Dieser Versuch ist im einzelnen in Science, Bd. 193 (23.

Juli 1976), S. 319 bis 321, beschrieben.

Als Quelle für induzierbare Zellen wird Knochenmark von frisch ausgebrüteten Hühnchen gewählt, da diesem Material eine beachtliche Zahl von Bu-1-oderTh-1-Zellen fehlt. Gesammelte Zellen vom Oberschenkelknochen und Tibiotarsus von fünf neu ausgebrüteten Hühnchen des Stamms SC (Hy-Linie) werden durch Ultrazentrifugieren an einem diskontinuierlichen 5schichtigen Rinderserumalbumin-Gradienten (BSA) fraktioniert.

Zellen aus den zwei helleren Schichten werden vereinigt, gewaschen und zur Inkubation mit einer Konzentration von 5 x 106 -Zellen/mI mit der entsprechenden Konzentration des Testpolypeptids in RPMI-1630-Medium suspendiert, das ergänzt ist mit 15 mMol Hepes, 5% y-Globulin-freiem fetalem Kalbsserum, Desoxyribonuclease (14 bis 18 Einhei- ten/ml), Heparin (5 Einheiten/ml), Penicillin (100 Einheiten/ml) und Streptomycin (100 jig/ml). Kontrollproben werden mit BSA (1 ig/ml) oder mit Medium allein inkubiert. Nach der Inkubation werden die Zellen im Cytotoxizitätsversuch geprüft unter Einsatz von Hühnchen Cl und Meerschweinchen C2 bis C9 Komplimentfraktionen, wie im Stand der Technik beschrieben.

Der Anteil von Bu-1+- oder Th-1+-Zellen in jeder Schicht wird als Cytotoxizitätsindex 100x (a-b)/a berechnet, wobei a und b die Prozentsätze von lebensfähigen Zellen in den komplementären Kontroll- und Testproben darstellen. Der Prozentsatz der induzierten Zellen wird durch Subtrahieren der Mittelwerte der Kontrollinkubationen ohne induzierende Mittel (im allgemeinen 1 bis 3%) von den Werten der zu untersuchenden Induktionen erhalten.

Die spezifische Wirkung des Testpolypeptids und seine Ähnlichkeit zu Ubiquitin werden
EMI11.2
Ubiquitin inaktiviert die Ubiquitinrezeptoren und verhindert so die Induktion von Zellen durch irgendein Mittel, das über diese Rezeptoren wirkt.

Als Ergebnis dieses Versuches wird gefunden, dass die gemäss den Beispielen 1 bis 3 hergestellten Tetrapeptide eine biologische Wirksamkeit ähnlich der des Ubiquitins hinsichtlich des Induzierens der Differenzierung von Th-1-T-undBut-1-B-Lymphozyten bei Konzentrationen in der Grössenordnung von ng/ml entfalten. Für das Polypeptid

H-SAR-LYS-D-ALA-GLN-NH liegt diese Aktivität im Konzentrationsbereich von etwa 1 bis 100 pg/ml. Für das Polypeptid H-SAR-LYS-SAR-GLN-NH wird die Aktivität bei einer Konzentration von 0, 1 pg/ml beobachtet.

PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Herstellung neuer Polypeptide der allgemeinen Formel H-X-LYS-Y-GLN-NH in der X eine Sarcosyl-, L-Alanyl- oder D-Alanylgruppe darstellt und Y für eine Seryl-, Sarco- syl-, 2-Methylalanyl- oder D-Alanylgruppe steht, dadurch gekennzeichnet, dass man an der
Aminogruppe geschütztes L-Glutamin durch Verestern kovalent an ein unlösliches Polymerisat bindet, die Schutzgruppe an der a-Aminogruppe des L-Glutamins abspaltet, die erhaltene Verbin- dung mit einer an ihrer a-Aminogruppe geschützten Y-Aminosäure kuppelt, die Schutzgruppe an der a-Aminogruppe der Y-Aminosäure abspaltet, die erhaltene Verbindung mit an der a-Amino- gruppe geschütztem L-Lysin zum entsprechenden L-Lysin-Y-Aminosäure-L-Glutamin-Polymerisat kuppelt,

von der a-Aminogruppe des Restes des L-Lysins die Schutzgruppe abspaltet, die erhaltene
Verbindung mit einer an der a-Aminogruppe geschützten X-Aminosäure zum entsprechenden X-Amino- säure-L-Lysin-Y-Aminosäure-L-Glutamin-Polymerisat kuppelt, das Polymerisat vom erhaltenen
Peptid mit Ammoniak in Dimethylformamid unter amidierenden Bedingungen abspaltet und alle
Schutzgruppen entfernt.

Claims

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Polymerisat Cellulose, Polyvinylalkohol, Polymethacrylat, sulfoniertes Polystyrol oder ein chlormethyliertes Copolymerisat aus Styrol und Divinylbenzol einsetzt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 zur Herstellung des Polypeptids H-SAR-LYS-SAR-GLN-NH., dadurch gekennzeichnet, dass man an der a-Aminogruppe geschütztes L-Glutamin durch Verestern an ein unlösliches Polymerisat kovalent bindet, die Schutzgruppe an der a-Aminogruppe der L-Glutamingruppe abspaltet, das erhaltene L-Glutamin-Polymerisat mit an der a-Aminogruppe geschütztem Sarcosin kuppelt, die Schutzgruppe an der a-Aminogruppe der Sarcosingruppe abspaltet, das erhaltene Sarcosin-L-Glutamin-Polymerisat mit an der a-Aminogruppe und der E-Aminogruppe geschütztem L-Lysin kuppelt, die Schutzgruppe von der a-Aminogruppe der L-Lysingruppe abspaltet, das erhaltene, an der e-Aminogruppe der L-Lysingruppe geschützte L-Lysin-Sarcosin-L- - Glutamin-Polymerisat mit an der a-Aminogruppe geschütztem Sarcosin kuppelt,

das Polymerisat vom Peptid mit Ammoniak in Dimethylformamid unter amidierenden Bedingungen abspaltet und alle Schutzgruppen entfernt.

4. Verfahren nach Anspruch 1 zur Herstellung des Polypeptids H-SAR-LYS-SAR-GLN-NH dadurch gekennzeichnet, dass man an der a-Aminogruppe geschütztes L-Glutamin durch kovalente Bindung an ein Benzhydrylamin-Polymerisat bindet, die Schutzgruppe an der a-Aminogruppe der L-Glutamingruppe abspaltet, das erhaltene L-Glutamin-Polymerisat mit an der a-Aminogruppe geschütztem Sarcosin kuppelt, die Schutzgruppe an der a-Aminogruppe der Sarcosingruppe abspaltet, das erhaltene Sarcosin-L-Glutamin-Polymerisat mit an der a-Aminogruppe und der E-Amino- <Desc/Clms Page number 13> gruppe geschütztem L-Lysin kuppelt, die Schutzgruppe von der a-Aminogruppe der L-Lysingruppe abspaltet, das erhaltene,

an der e-Aminogruppe der L-Lysingruppe geschützte L-Lysin-Sarcosin-L- - Glutamin-Polymerisat mit an der a-Aminogruppe geschütztem Sarcosin kuppelt, und alle Schutzgruppen und das Polymerisat vom Peptid abspaltet.