CN101701245B - 从中药中筛选sars冠状病毒主蛋白酶抑制剂的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种筛选SARS冠状病毒主蛋白酶抑制剂的方法，包括如下：A.测定来自单味中药的多种提取物的SARS冠状病毒主蛋白酶体外抑制活性；B.选择具有最好的体外抑制活性的一种提取物；和C.对步骤B所选择的提取物进行至少一轮的分离和选择。本发明筛选出的化合物对SARS冠状病毒主蛋白酶具有体外抑制活性，是极佳的可能上市的药物或潜在的药物前体。
Description
技术领域
本发明涉及药物的筛选方法及具有相同结构骨架的小分子抑制剂，更具体而言，涉及以SARS冠状病毒主蛋白酶的体外抑制活性测定为基础，从中药例如黄芩中筛选SARS冠状病毒主蛋白酶抑制剂的方法，以及由此导出的一系列黄酮类化合物抑制剂。
背景技术
SARS(Severe Acute Respiratory Sydrome)为引起严重急性呼吸道综合症(非典型性肺炎)的简称，其病原体为冠状病毒属的一种病毒(Peiris J.等.Lancet，2003，361：1319-1325)。冠状病毒是正链RNA病毒。冠状病毒属隶属于冠状病毒科。在目前已知的正链RNA病毒中，它们的基因组是最大的(Siddell，S.G.等Coronaviruses，toroviruses，and arteriviruses.in Topley & Wilson′s Microbiology andMicrobia Infections，10th edition，Vol.Virology(eds.Mahy，B.W.J.&ter Meulen，V.)823-856(Hodder Arnold，London，2005)。这个属含有约26个种；按照它们的自然宿主、基因序列以及血清型关系，这个属又可以被分为三个组群(group)：其中第一组群有TGEV，Porcine Transmissible Gastroenteritis Virus(猪传染性胃肠炎病毒)等；第二组群有SARS冠状病毒，MHV(鼠肝炎病毒)等；第三组群有AIBV，Avian Infectious Bronchitis Virus(禽传染性支气管炎病毒)等(Spaan，W.J.M.和Cavanagh，D.Coronaviridae.in Virus taxonomy，VIIIth Report of the ICTV.945-62(Elsevier-Academic Press.，London，2004)。
SARS冠状病毒2/3到3/4的基因组编码了两个复制酶多蛋白(replicasepolyproteins)pp1a和pp1ab(Ziebuhr，Snijder等.2000；Thiel，Herold等.2001；Anand，Yang等.2005；Ziebuhr 2005)，它们只有在病毒编码的蛋白酶切割成独立亚基之后才能使病毒完成正常转录、复制功能(Ziebuhr，Snijder等.2000；Anand，Yang等.2005；Bartlam，Yang等.2005)。SARS冠状病毒主要蛋白酶(mainprotease，简称主蛋白酶)在这个过程中起主要作用。如果能够抑制SARS冠状病毒主蛋白酶的水解作用，那么将会有效地抵御SARS冠状病毒对人体的侵染。因此，SARS冠状病毒的主蛋白酶是抗SARS药物筛选的一个主要靶标。
2003年爆发的SARS病毒感染在全世界造成8096例病例，774例死亡。虽然到今天为止未再发生感染，但不排除SARS及其变种卷土重来的可能性。2003年SARS病毒感染时已有用中药预防或救治的先例。从中医的辩证论治角度讲，SARS病毒感染造成的疫情与清代大面积流行的“温病”颇有相似，温病是感受温邪引起的多种急性外感热病的总称(康锁彬，徐树楠。《(吴鞠通医方精要)》，石家庄：河北科学技术出版社，14-38，2003)。清代著名温病学家，如叶天士、吴鞠通等治疗温病无不以清热解毒类中药组方论治。中药黄芩在我国已有几千年的应用历史，早在张仲景的《伤寒论)》里就有经方“黄芩汤”。黄芩性苦，味寒，归肺、胃、胆、大肠经。清热燥湿，泻火解毒，止血安胎。现代药理研究证明，黄芩对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等细菌，流感病毒、乙型肝炎病毒等病毒均有抑制作用(黄兆胜。《中药学》，北京：人民卫生出版社。79，2002)。
目前还没有以SARS冠状病毒主蛋白酶的体外抑制活性测定为基础，从清热解毒类中药例如黄芩中筛选SARS冠状病毒主蛋白酶抑制剂的应用报道。本.发明应用SARS冠状病毒主蛋白酶的体外酶活筛选方法，提供了一种从中药例如黄芩中筛选SARS冠状病毒主蛋白酶抑制剂如黄芩苷元(baicalein)及其衍生物的方法。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种筛选SARS冠状病毒主蛋白酶抑制剂的方法，包括如下：A.测定来自单味中药的多种提取物的SARS冠状病毒主蛋白酶体外抑制活性；B.选择具有最好的体外抑制活性的一种提取物；和C.对步骤B所选择的提取物进行至少一轮的分离和选择，对每轮分离所得到的各种组分测定SARS冠状病毒主蛋白酶体外抑制活性，选择具有最好的体外抑制活性的一种组分进入下一轮的分离和选择，直至所述分离和选择得到的具有最好的体外抑制活性的组分是一种化合物，将该化合物作为SARS冠状病毒主蛋白酶抑制剂。
在一个优选的实施方案中，所述SARS冠状病毒主蛋白酶体外抑制活性的测定方法包括如下：(1).向缓冲溶液中加入SARS冠状病毒主蛋白酶；(2).添加底物和待测物质到缓冲溶液中；和(3).测定待测物质的SARS冠状病毒主蛋白酶体外抑制活性。
在另一个优选的实施方案中，所述步骤C中的分离采用选自如下的一种或多种方法：超临界萃取、有机溶剂萃取、色谱分离、电泳分离和膜分离。
在另一个优选的实施方案中，所述单味中药为黄芩属(Scutellaria)单味中药。
在一个进一步优选的实施方案中，所述黄芩属单味中药选自黄芩(Scutellariabaicalensis)、粘毛黄芩(Scutellaria viscidula)、滇黄芩(Scutellaria amoena)、甘肃黄芩(Scutellaria rehderiana)、薄叶黄芩(Scutellaria ikonnikovii)、丽江黄芩(Scutellaria likiangensis)和川黄芩(Scutellaria hypericifolia)，优选黄芩。
在另一个优选的实施方案中，所述提取物是有机溶剂提取物。
在一个进一步优选的实施方案中，所述有机溶剂选自芳香烃类溶剂、脂肪烃类溶剂、脂环烃类溶剂、卤化烃类溶剂、醇类溶剂、醚类溶剂、酯类溶剂、酮类溶剂、二醇衍生物类溶剂和其他有机溶剂。
在一个更进一步优选的实施方案中，所述有机溶剂进一步选自醇类溶剂和酯类溶剂。
在另一个优选的实施方案中，所述来自单味中药的多种提取物为黄芩95％乙醇总提取物、黄芩乙酸乙酯提取物和黄芩水相大孔树脂95％乙醇提取物。
在一个进一步优选的实施方案中，所述黄芩95％乙醇总提取物、黄芩乙酸乙酯提取物和黄芩水相大孔树脂95％乙醇提取物的制备方法包括如下：(a).取一定量的黄芩，用95％乙醇溶液回流提取多次，合并提取液，浓缩得浸膏，即为黄芩95％乙醇总提取物；(b).称取一定量的步骤(a)中所得的浸膏，用双蒸水悬浮，用乙酸乙酯萃取多次，分离乙酸乙酯相和水相；合并水相，备用；合并每次乙酸乙酯萃取物，蒸除其中的乙酸乙酯，得到干膏状乙酸乙酯相样品，即为黄芩乙酸乙酯提取物；和(c).蒸除步骤(b)中萃取后的水相部分的水中溶解的少量乙酸乙酯，用大孔树脂柱层析分离，依次用水和95％乙醇溶液为流动相分别洗脱多次；弃去水洗部分，合并95％乙醇溶液洗脱部分，蒸除其中的溶剂，得干膏状样品，即为黄芩水相大孔树脂95％乙醇提取物。
在一个进一步优选的实施方案中，所述底物为荧光标记底物。
在一个更进一步优选的实施方案中，所述荧光标记底物为MCA-AVLQSGFRL(DNP)L-NH2。
本发明的另一个目的是提供根据上述任何一个实施方案所描述的方法筛选获得的SARS冠状病毒主蛋白酶抑制剂在制备用于治疗和/或预防SARS冠状病毒感染的药物中的应用。
在一个优选的实施方案中，所述SARS冠状病毒主蛋白酶抑制剂为黄芩苷元、汉黄芩素和/或木蝴蝶素。
本发明的又一个目的是提供具有如下结构通式的黄酮类化合物在制备用于治疗和/或预防SARS冠状病毒感染的药物中的应用：
其中，各个R同时或独立地选自：H、-OH、-OSO3H、-OPO3H2、-OAc、-OCH3、-OCH2CH3、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH2CH2CH3、-Oglu和-Ogal。
在一个优选的实施方案中，所述黄酮类化合物为野黄芩素、万寿菊素、杨梅素和/或刺槐亭。
本发明的再一个目的是提供一种用于治疗和/或预防SARS冠状病毒感染的药物组合物，包含治疗有效量的根据权利要求1-12任一项的方法筛选获得的SARS冠状病毒主蛋白酶抑制剂以及药学上可接受的载体。
在一个优选的实施方案中，所述SARS冠状病毒主蛋白酶抑制剂为黄芩苷元、汉黄芩素和/或木蝴蝶素。
本发明的又一个目的是提供一种用于治疗和/或预防SARS冠状病毒感染的药物组合物，包含治疗有效量的具有如下结构通式的黄酮类化合物以及药学上可接受的载体：
其中，各个R同时或独立地选自：H、-OH、-OSO3H、-OPO3H2、-OAc、-OCH3、-OCH2CH3、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH2CH2CH3、-Oglu和-Ogal。
在一个优选的实施方案中，所述黄酮类化合物为野黄芩素、万寿菊素、杨梅素和/或刺槐亭。
在本发明的上下文中，所述SARS冠状病毒主蛋白酶体外抑制活性的测定方法具体包括如下：(1).向缓冲溶液如含50mM Tris-HCl，pH 7.3、1mM EDTA的缓冲溶液中加入SARS冠状病毒主蛋白酶；(2).添加底物和待测物质到缓冲溶液中；和(3).测定待测物质的SARS冠状病毒主蛋白酶体外抑制活性；其中所述缓冲溶液可含有或不含有DTT；底物包括但不限于显色、发荧光或化学发光的底物，优选发荧光的底物，例如荧光标记的底物MCA-AVLQSGFRL(DNP)L-NH2；可通过包括但不限于比色、荧光读数或化学发光读数的方法测定待测物质的SARS冠状病毒主蛋白酶体外抑制活性；加入缓冲溶液中的SARS冠状病毒主蛋白酶、待测物质和底物的浓度可根据具体情况由本领域技术人员进行确定，例如SARS冠状病毒主蛋白酶的浓度可为0.5μM，当待测物质为混合物时，可为10-100μg/mL，当待测物质为单一化合物时，可为200μM，底物浓度可为16μM；在通过荧光读数测定待测物质的SARS冠状病毒主蛋白酶体外抑制活性时，激发波长和发射波长可分别为320nm和405nm，温度可保持在298K，可每2秒钟记录一次荧光读数。
在本发明的上下文中，所述分离采用选自如下的一种或多种方法：超临界萃取、有机溶剂萃取、色谱(层析)分离、电泳分离和膜分离，其中超临界萃取包括但不限于二氧化碳超临界萃取；有机溶剂萃取包括但不限于醇类溶剂萃取和酯类溶剂萃取，例如乙醇(95％)萃取和乙酸乙酯萃取；色谱(层析)分离包括但不限于吸附色谱(层析)分离、凝胶过滤色谱(层析)分离、离子交换色谱(层析)分离、疏水色谱(层析)分离和HPLC分离；电泳分离包括但不限于滤纸电泳、薄膜电泳、粉末电泳、细丝电泳、凝胶电泳和毛细管电泳；膜分离可采用无机膜和有机膜，无机膜包括但不限于陶瓷膜和金属膜，有机膜包括但不限于醋酸纤维素膜、芳香族聚酰胺膜、聚醚砜膜、聚氟聚合物膜。
在本发明的上下文中，所述有机溶剂包括但不限于：①芳香烃类溶剂：如.苯、甲苯、二甲苯等；②脂肪烃类溶剂：如戊烷、己烷、辛烷等；③脂环烃类溶剂：如环己烷、环己酮、甲苯环己酮等；④卤化烃类溶剂：如氯苯、二氯苯、二氯甲烷等；⑤醇类溶剂：如甲醇、乙醇、异丙醇等；⑥醚类溶剂：如乙醚、环氧丙烷等；⑦酯类溶剂：醋酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯等；⑧酮类溶剂：丙酮、甲基丁酮、甲基异丁酮等；⑨二醇衍生物类溶剂：如乙二醇单甲醚、乙二醇单乙醚、乙二醇单丁醚等；⑩其他有机溶剂：如乙腈、吡啶、苯酚等；优选醇类和/或酯类溶剂；更优选乙醇和/或乙酸乙酯。
在本发明的上下文中，所述黄芩95％乙醇总提取物、黄芩乙酸乙酯提取物和黄芩水相大孔树脂95％乙醇提取物的制备方法具体如下：(a).取一定量(如500克)的黄芩，用95％乙醇溶液(如4500毫升)回流提取3次，合并提取液，浓缩得浸膏，即为黄芩95％乙醇总提取物；(b).称取一定量(如10克)的步骤(a)中所得的浸膏，用双蒸水(如150毫升)悬浮，用乙酸乙酯(如650毫升)萃取3次，分离乙酸乙酯相和水相；合并水相，备用；合并每次乙酸乙酯萃取物，蒸除其中的乙酸乙酯，得到干膏状乙酸乙酯相样品，即为黄芩乙酸乙酯提取物；和(c).蒸除步骤(b)中萃取后的水相部分的水中溶解的少量乙酸乙酯，用大孔树脂柱层析分离，依次用水和95％乙醇溶液为流动相洗脱，水(如250毫升)洗脱例如8次，95％乙醇(如300毫升)洗脱例如5次；弃去水洗部分，合并95％乙醇溶液洗脱部分，蒸除其中的溶剂，得干膏状样品，即为黄芩水相大孔树脂95％乙醇提取物。
本发明选取SARS冠状病毒中晶体结构已知的主蛋白酶，对我国传统中药黄芩进行活性成分筛选，是从一种新的角度去研究中药学、天然产物化学和生物学，是运用各种交叉学科对中医药现代化的宝贵尝试。由于黄芩中所含的成分是相当复杂的，必须运用各种色谱方法对其粗提物进行分离纯化，目的是去除对SARS冠状病毒主蛋白酶体外活性测定中的干扰因素如蛋白、无机盐等，保留成药性较好的小分子并使之尽量集中，提高相对浓度。本发明不仅提供了可以实现这一目的制备技术方案，而且对筛选有抑制活性的样品，用各种色谱、波谱方法分离、鉴定了其中小分子抑制剂-黄芩苷元。同时还分离得到了活性较差的汉黄芩素(wogonin)和木蝴蝶素(oroxylin)。通过分析活性相对较差的汉黄芩素、木蝴蝶素与活性强的黄芩苷元化学结构上的差异，我们预测与黄芩苷元结构类似的一些黄酮类化合物也具有抑制活性，由此我们购买了几种相对在中药中含量较高的黄酮类化合物加以验证，最后我们得到了一个具有特定结构骨架的结构式，符合这个结构式的化合物很可能具有对SARS冠状病毒主蛋白酶的抑制活性。
目前，基于SARS冠状病毒主蛋白酶晶体结构为基础进行的药物筛选，所发现的小分子抑制剂绝大多数为SARS冠状病毒主蛋白酶底物类似物及其衍生物(Dariusz P.，Marcin H.，Marcin G.，等.Chem.Biol.Drug.Res.，2007，69：269-279；Haitao Y.，Wenqing X.，Xiaoyu X.，等.PLOS Biology，2005，3(10)：1742-1752)，这类多肽类抑制剂不仅造价昂贵，而且口服利用度低，在血液中的半衰期短，对制服SARS感染发病带来了难度。本发明筛选出的抑制剂-黄芩苷元，以及由此导出的黄酮类衍生物，为不含肽键的黄酮类天然产物，其对SARS冠状病毒主蛋白酶在25μM时仍具有体外抑制活性，考虑到它们为常用中药中的天然产物，其毒性及代谢吸收特性较多肽类等其它合成化合物具有不可比拟的优越性，是极佳的可能上市的药物或潜在的药物前体。这为进一步的药物设计和筛选提供了宝贵的依据和参考。
附图说明
图1显示的是本发明的黄芩的各种提取物对SARS冠状病毒主蛋白酶的抑制活性曲线图，1为对照曲线，2、3、4分别为黄芩水相大孔树脂95％乙醇提取物、黄芩95％乙醇总提取物、黄芩乙酸乙酯提取物的抑制曲线，样品浓度均为：100μg/mL。
图2显示的是本发明的黄芩乙酸乙酯提取物进一步分离组分a1-a5的抑制曲线图，1为对照，2、3、4、5、6分别为a3、a1、a2、a5、a4的抑制曲线，样品浓度均为：10μg/mL。
图3显示的是本发明的黄芩乙酸乙酯提取物进一步分离组分a4的HPLC分析图谱。
图4显示的是黄芩苷元、汉黄芩素和木蝴蝶素的抑制曲线，1为对照，2、3、4分别为汉黄芩素、木蝴蝶素和黄芩苷元的抑制曲线。样品浓度均为：200μM。
图5显示的是黄芩苷元不同浓度的抑制曲线，1、2、3、4、5、6分别为对照曲线、黄芩苷元25、50、100、150、200μM时的抑制曲线。
图6显示的是野黄芩素不同浓度的抑制曲线，1、2、3、4、5、6分别为对照曲线、野黄芩素25、50、100、150、200μM时的抑制曲线。
图7显示的是万寿菊素不同浓度的抑制曲线，1、2、3、4、5、6分别为对照曲线、万寿菊素25、50、100、150、200μM时的抑制曲线。
图8显示的是杨梅素不同浓度的抑制曲线，1、2、3、4、5、6分别为对照曲线、杨梅素25、50、100、150、200μM时的抑制曲线。
图9显示的是刺槐亭不同浓度的抑制曲线，1、2、3、4、5、6分别为对照曲线、刺槐亭25、50、100、150、200μM时的抑制曲线。
具体实施方式
本发明将根据下列实施例进行更具体的说明。然而，本发明的保护范围并不受限于下列的实施例。
实施例1.SARS冠状病毒主蛋白酶的表达、纯化
根据文献(Yang H等.Proc Natl Acad Sci.2003 Nov；100(23)：13190-5)进行SARS冠状病毒主蛋白酶的表达、纯化，该SARS冠状病毒主蛋白酶的氨基酸序列如下：
Ser Gly Phe Arg Lys Met Ala Phe Pro Ser Gly Lys Val Glu Gly Cys
1 5 10 15
Met Val Gln Val Thr Cys Gly Thr Thr Thr Leu Asn Gly Leu Trp Leu
20 25 30
Asp Asp Thr Val Tyr Cys Pro Arg His Val Ile Cys Thr Ala Glu Asp
35 40 45
Met Leu Ash Pro Ash Tyr Glu Asp Leu Leu Ile Arg Lys Ser Asn His
50 55 60
Ser Phe Leu Val Gln Ala Gly Asn Val Gln Leu Arg Val Ile Gly His
65 70 75 80
Ser Met Gln Asn Cys Leu Leu Arg Leu Lys Val Asp Thr Ser Asn Pro
85 90 95
Lys Thr Pro Lys Tyr Lys Phe Val Arg Ile Gln Pro Gly Gln Thr Phe
100 105 110
Ser Val Leu Ala Cys Tyr Asn Gly Ser Pro Ser Gly Val Tyr Gln Cys
115 120 125
Ala Met Arg Pro Asn His Thr Ile Lys Gly Ser Phe Leu Asn Gly Ser
130 135 140
Cys Gly Ser Val Gly Phe Ash Ile Asp Tyr Asp Cys Val Ser Phe Cys
145 150 155 160
Tyr Met His His Met Glu Leu Pro Thr Gly Val His Ala Gly Thr Asp
165 170 175
Leu Glu Gly Lys Phe Tyr Gly Pro Phe Val Asp Arg Gln Thr Ala Gln
180 185 190
Ala Ala Gly Thr Asp Thr Thr Ile Thr Leu Asn Val Leu Ala Trp Leu
195 200 205
Tyr Ala Ala Val Ile Asn Gly Asp Arg Trp Phe Leu Asn Arg Phe Thr
210 215 220
Thr Thr Leu Asn Asp Phe Asn Leu Val Ala Met Lys Tyr Ash Tyr Glu
225 230 235 240
Pro Leu Thr Gln Asp His Val Asp Ile Leu Gly Pro Leu Ser Ala Gln
245 250 255
Thr Gly Ile Ala Val Leu Asp Met Cys Ala Ala Leu Lys Glu Leu Leu
260 265 270
Gln Asn Gly Met Asn Gly Arg Thr Ile Leu Gly Ser Thr Ile Leu Glu
275 280 285
Asp Glu Phe Thr Pro Phe Asp Val Val Arg Gln Cys Ser Gly Val Thr
290 295 300
Phe Gln
305
1.1SARS冠状病毒主蛋白酶的表达载体构建
具体步骤包括：
1.1.1利用北京华大基因中心提供的编号为BJ01的SARS病毒毒株的cDNA文库，用PCR技术进行体外扩增，
正向引物：5′-CGGGATCCAGTGGTTTTAGGAAAATG-3′
反向引物：5′-CCGCTCGAGTCATTGGAAGGTAACACCAGA-3′
1.1.2经PCR扩增的基因片段经BamHI和XhoI双酶酶切后，用琼脂糖凝胶电泳回收大小为1kb左右的片段；
1.1.3将回收片段与T载体进行连接，然后用连接产物转化大肠肝菌(Escherichia coli)DH5α感受态细胞，并涂在LB平板(含100mg/L氨苄青霉素)上，培养过夜；
1.1.4从平板上挑取多个单克隆，分别接种于装有约5mL的LB的试管(该LB溶液中加入氨苄青霉素，使其终浓度为100mg/L)中，培养过夜，然后用质粒提取试剂盒(博大泰克公司B型质粒小量快速提取试剂盒)提取质粒，并用BamHI和XhoI酶切，然后用琼脂糖凝胶回收大小约为1kb左右的目标基因片段；
1.1.5将目标载体pGEX-4T-1(购自Pharmacia公司)用BamHI和XhoI酶切，然后用琼脂糖凝胶回收酶切的片段；
1.1.6将(1.1.4)和(1.1.5)获得的片段连接(将酶切回收后的目标基因片段和目标载体片段按照摩尔数3∶1-6∶1的比率混合，按照Takara DNA Ligation的要求在16℃反应30分钟-18小时)，转化大肠肝菌DH5α感受态细胞，涂在LB平板(含100mg/L氨苄青霉素)上培养过夜。将筛选到的阳性克隆，用于鉴定和测序。
测序结果表明，SARS冠状病毒的主蛋白酶的编码基因已被正确地克隆到pGEX-4T-1载体中。
1.2SARS冠状病毒主蛋白酶的表达与纯化
包括步骤：
1.2.1将上述步骤1.1中得到的含有编码SARS冠状病毒主蛋白酶基因的pGEX-4T-1载体转化大肠杆菌BL21(DE3)的菌株，并用LB平板(含100mg/L氨苄青霉素)筛选阳性克隆；
1.2.2在(1.2.1)中所述的LB平板上挑取阳性克隆(在含有氨苄青霉素的LB平板上生长出来的单克隆)，培养过夜，然后转入1L的LB培养基(含100mg/L氨苄青霉素)，当OD600达到0.6-0.8时，加入1mM左右的IPTG，在16℃培养12小时左右；
1.2.35000-8000rpm离心10-15分钟收集细胞，然后冰浴超声破菌20-30分钟；破菌液13000rpm-15000rpm离心20-40分钟后收集上清液；
1.2.4将上清液加入PBS预平衡的GST亲和层析柱(GE公司)中，用PBS淋洗20-30个柱床体积去除杂蛋白，最后加入2ml 0.1mg/ml左右的人类鼻病毒3C蛋白酶，在4℃酶切12-20小时，之后收集SARS冠状病毒主蛋白酶；
1.2.5将(1.2.4)获得的SARS冠状病毒主蛋白酶再用Mono Q(GE公司)阴离子交换层析进行纯化。
实施例2.制备黄芩提取物
取500克干燥粉碎的黄芩药材，用4500毫升95％乙醇回流提取，提取3次，每次2小时，合并提取液，浓缩得浸膏(即黄芩95％乙醇总提取物)；
称取此浸膏10克，用150毫升双蒸水悬浮，倾入1000毫升分液漏斗中，用乙酸乙酯萃取，每次萃取用乙酸乙酯650毫升，充分振摇，静置6小时分层，共萃取3次，分离乙酸乙酯相和水相，合并水相，备用，合并每次乙酸乙酯萃取物，乙酸乙酯萃取物用EYELA N1001型旋转蒸发仪蒸除溶剂，得干膏状黄芩乙酸乙酯萃取样品(即黄芩乙酸乙酯提取物)，备用；
萃取后的水相部分用EYELA N1001型旋转蒸发仪蒸除水中溶解的少量乙酸乙酯，用HP-20型大孔树脂柱层析分离(使用170毫升的大孔树脂，玻璃柱规格30×300mm)，依次用水、95％乙醇为流动相洗脱，其中水洗脱8次，每次洗脱250毫升，弃去水洗部分，95％乙醇洗脱5次，每次洗脱300毫升，合并95％乙醇洗脱部分，将95％乙醇洗脱部分使用EYELA N1001型旋转蒸发仪蒸除溶剂，得干膏状黄芩水相大孔树脂95％乙醇洗脱样品(即黄芩水相大孔树脂95％乙醇提取物)，备用。
实施例3.从黄芩提取物中筛选SARS冠状病毒主蛋白酶抑制剂
对上述乙酸乙酯萃取样品、水相大孔树脂95％乙醇洗脱样品和黄芩95％乙醇总提取物进行SARS冠状病毒主蛋白酶体外抑制活性实验，抑制曲线见图1。测定方法具体包括如下：(1).向含50mM Tris-HCl，pH 7.3、1mM EDTA的缓冲溶液中加入SARS冠状病毒主蛋白酶，终浓度为0.5μM，然后在不同的含有此蛋白的缓冲溶液中分别加入乙酸乙酯萃取样品、水相大孔树脂95％乙醇洗脱样品和黄芩95％乙醇总提取物，它们的浓度均为100μg/mL；(2).添加底物MCA-AVLQSGFRL(DNP)L-NH2到缓冲溶液中，终浓度为16μM；和(3).测定待测物质的SARS冠状病毒主蛋白酶体外抑制活性，其中对照曲线为只加蛋白和底物、不加黄芩各个分段样品的测定曲线，曲线越低说明抑制作用越强。
由图1的抑制曲线可知黄芩的乙酸乙酯萃取样品部分抑制活性最好。将乙酸乙酯萃取部分用Sephadex LH-20凝胶柱层析(制造商：北京慧德益科技有限责任公司)分离，以氯仿-甲醇(1∶1)为流动相洗脱，共接收合并了5个部分，为a1-a5。对这5个部分进行SARS冠状病毒主蛋白酶体外抑制活性实验，体外抑制活性曲线见图2。测定方法具体包括如下：(1).向含50mM Tris-HCl，pH 7.3、1mM EDTA的缓冲溶液中加入SARS冠状病毒主蛋白酶，终浓度为0.5μM，然后在不同的含有此蛋白的缓冲溶液中分别加入a1-a5样品，它们的浓度均为10μg/mL；(2).添加底物MCA-AVLQSGFRL(DNP)L-NH2到缓冲溶液中，终浓度为16μM；和(3).测定待测物质的SARS冠状病毒主蛋白酶体外抑制活性，其中对照曲线为只加蛋白和底物、不加a1-a5样品的测定曲线，曲线越低说明抑制作用越强。
由图2可知a4部分的抑制活性最好。将a4部分用HPLC分析，色谱图见图3。其中有3个分离开来的色谱峰，依据保留时间由小到大依次编为峰1、2、3。将a4部分用HPLC制备(HPLC分析和制备条件均为：从0分钟到35分钟流动相配比从甲醇∶水＝10∶90梯度升到甲醇∶水＝90∶10，检测波长均为254nm，其中分析时流速为1ml/min，制备时流速为3ml/min。分析柱规格为YMC-PackODS-A，AA12S11-1546WT，A-302-10，150×4.6mm I.D.，S-10μm。制备柱规格为YMC-Pack ODS-A，AA12S11-1510WT，A-322-10，150×10mm I.D.，S-10μm)，将峰1、2、3(峰1、2、3的保留时间分别为15.5、21.5、23.5分钟)分别接收分离开来分别得到化合物1(7.0mg)，化合物2(3.0mg)，化合物3(2.0mg)。
对化合物1、2、3分别作了NMR和MS测定，数据如下：
化合物1(峰1)：黄色粉末。ESIMS m/z 271[M+H]+.1H NMR(丙酮-d6，400MHz)δ8.05(2H，m，H-2′，6′)，7.59(3H，m，H-3′，4′，5′)，6.76(1H，s，H-3)，6.69(1H，s，H-8).13C NMR(甲醇-d4，100MHz)δ163.6(C-2)，105.3(C-3)，182.5(C-4)，147.0(C-5)，129.1(C-6)，153.0(C-7)，93.2(C-8)，150.6(C-9)，104.0(C-10)，131.6(C-1′)，126.3(C-2′)，129.6(C-3′)，131.7(C-4′)，129.6(C-5′)，126.3(C-6′)。其1H NMR、13CNMR数据与黄芩苷元(baicalein)数据(王红燕，肖丽和，刘丽等，沈阳药科大学学报，2003，20(5)：339-341)完全一致，并且其薄层色谱与黄芩苷元完全一致，因此确认化合物1为黄芩苷元。
黄芩苷元
化合物2(峰2)：黄色粉末。ESIMS m/z 285[M+H]+.1H NMR(丙酮-d6，400MHz)δ8.10(2H，m，H-2′，6′)，7.63(3H，m，H-3′，4′，5′)，6.81(1H，s，H-3)，6.34(1H，s，H-6).13C NMR(甲醇-d4，100MHz)δ163.5(C-2)，105.2(C-3)，182.3(C-4)，157.0(C-5)，98.9(C-6)，157.1(C-7)，128.3(C-8)，150.0(C-9)，102.9(C-10)，131.4(C-1′)，126.3(C-2′)，129.2(C-3′)，131.9(C-4′)，129.2(C-5′)，126.3(C-6′)。其1H NMR、13CNMR数据与汉黄芩素(wogonin)数据(王红燕，肖丽和，刘丽等，沈阳药科大学学报，2003，20(5)：339-341)完全一致，因此确认化合物2为汉黄芩素。
汉黄芩素
化合物3(峰3)：黄色粉末。ESIMS m/z 285[M+H]+.1H NMR(丙酮-d6，400MHz)δ8.06(2H，m，H-2′，6′)，7.58(3H，m，H-3′，4′，5′)，6.78(1H，s，H-3)，6.67(1H，s，H-8).13C NMR(甲醇-d4，100MHz)δ163.8(C-2)，104.7(C-3)，182.7(C-4)，153.2(C-5)，131.4(C-6)，157.3(C-7)，94.1(C-8)，152.9(C-9)，104.7(C-10)，131.5(C-1′)，126.3(C-2′)，129.1(C-3′)，131.8(C-4′)，129.1(C-5′)，126.3(C-6′)。其1H NMR、13CNMR数据与木蝴蝶素(oroxylin)数据(王红燕，肖丽和，刘丽等，沈阳药科大学学报，2003，20(5)：339-341)完全一致，因此确认化合物3为木蝴蝶素。
木蝴蝶素
我们对上述得到的黄芩苷元、汉黄芩素和木蝴蝶素进行了SARS冠状病毒主蛋白酶的体外抑制活性测定，测定按照如下步骤进行：在缓冲溶液(50mMTris-HCl(pH 7.3)，1mM EDTA(含或不含DTT))中加入SARS主蛋白酶(终浓度0.5μM)，黄芩苷元、汉黄芩素或木蝴蝶素(终浓度为：200μM)，迅速加入荧光标记底物(MCA-AVLQ↓SGFRL(DNP)L-NH2，终浓度16μM)。激发波长和发射波长分别为320nm和405nm，温度保持在298K，每2秒钟记录一次荧光读数(结果示于图4)(对照曲线为只加蛋白和底物、不加黄芩苷元、汉黄芩素或木蝴蝶素的测定曲线，曲线越低说明抑制作用越强)。由图4可知黄芩苷元具有很好的抑制活性，是黄芩中起抑制作用的主成分，汉黄芩素和木蝴蝶素也具有不同程度的抑制活性，但较黄芩苷元相对较弱。
改变黄芩苷元的浓度进行SARS冠状病毒主蛋白酶的体外抑制活性测定，结果见图5。测定按照如下步骤进行：在缓冲溶液(50mM Tris-HCl(pH 7.3)，1mMEDTA(含或不含DTT))中加入SARS主蛋白酶(终浓度0.5μM)，在不同含有此蛋白的缓冲溶液中加入不同浓度的黄芩苷元(终浓度由高到低分别为200、150、100、50、25μM)，迅速加入荧光标记底物(MCA-AVLQ↓SGFRL(DNP)L-NH2，终浓度16μM)。激发波长和发射波长分别为320nm和405nm，温度保持在298K，每2秒钟记录一次荧光读数。对照曲线为只加蛋白和底物、不加黄芩苷元时的测定曲线，曲线越低说明抑制作用越强。由图5可知，黄芩苷元在25μM时对SARS主蛋白酶仍然有抑制活性，考虑到黄芩苷元为常用中药黄芩中的主要天然产物，其毒性及代谢吸收特性较多肽类等其它合成化合物具有不可比拟的优越性，黄芩苷元及其改造衍生物有可能成为治疗SARS冠状病毒的有效药物。
实施例4.具有SARS冠状病毒主蛋白酶抑制活性的黄酮类结构通式的导出
比较黄芩苷元和木蝴蝶素的结构差异和抑制活性差异，可知黄酮结构母核上取代羟基被甲酯化后抑制活性显著减弱，可能由于游离的羟基使抑制剂与SARS主蛋白酶相互作用时更容易形成氢键，而且木蝴蝶素6位羟基的甲酯化可能对5位和7位羟基与氨基酸残基形成氢键产生位阻作用，从而说明游离羟基对其抑制活性是重要的；比较木蝴蝶素和汉黄芩素，虽然它们都有一个羟基被甲酯化，但木蝴蝶素三个含氧取代基相邻，其活性强于汉黄芩素，说明相邻的含氧取代可能会更有利于抑制剂与SARS主蛋白酶的相互作用。因此得出初步结论，黄酮母核上具有相邻的游离羟基的化合物可能对SARS主蛋白酶具有抑制作用。
为了验证以上结论，我们购买了在常用中药中含量较高的具有相邻的游离羟基的黄酮类化合物(购自上海顺勃生物工程技术有限公司)：野黄芩素(scutellarein)、万寿菊素(quercetagetin)、杨梅素(myricetin)和刺槐亭(robinetin)。它们的结构式如下：
野黄芩素(scutellarein) 万寿菊素(quercetagetin)
杨梅素(myricetin) 刺槐亭(robinetin)
对上述四个化合物进行SARS冠状病毒主蛋白酶的体外抑制活性测定，结果见图6-9。测定按照如下步骤进行：在缓冲溶液(50mM Tris-HCl(pH 7.3)，1mMEDTA(含或不含DTT))中加入SARS主蛋白酶(终浓度0.5μM)，在不同含有此蛋白的缓冲溶液中分别加入不同浓度的野黄芩素、万寿菊素、杨梅素或刺槐亭(终浓度由高到低均为200、150、100、50、25μM)，迅速加入荧光标记底物(MCA-AVLQ↓SGFRL(DNP)L-NH2，终浓度16μM)。激发波长和发射波长分别为320nm和405nm，温度保持在298K，每2秒钟记录一次荧光读数。对照曲线为只加蛋白和底物、不加黄芩苷元时的测定曲线，曲线越低说明抑制作用越强。
由图6-9结果可知，野黄芩素、万寿菊素、杨梅素和刺槐亭均具有强的抑制活性，它们的抑制活性强弱与浓度呈很好的相关性。并且，四种化合物均在25μM时显示出不同程度的抑制活性，验证了我们的推测。比较上述黄酮类化合物，可以用以下一个结构通式代表它们：
其中，各个R同时或独立地选自：H、-OH、-OSO3H、-OPO3H2、-OAc、-OCH3、-OCH2CH3、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH2CH2CH3、-Oglu和-Ogal。
可以预见的是，符合这个结构通式的化合物极有可能对SARS冠状病毒主蛋白酶的具有抑制作用。由于具有各种R取代基的化合物在体内代谢时可能会转化为游离羟基的化合物，而且本申请筛选的化合物具有结构的多样性和代表性，因此具有这个通式的化合物应该落入本发明的保护范围之内。
本文中所涉及的各种实验用品(包括但不限于：化学试剂、生物制品、细胞、生物体、仪器等)之中，对于那些特殊的或不易获得的，文中均已注明了制造商、参考文献或详细的制备方法；未经特别说明的，均为常规实验用品，在本申请日之前，可以通过各种方式(例如购买、自行制备等)很方便地获得。
应当理解，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，本领域的普通技术人员可以在形式和细节上对其做出各种改变和改进，而这些均被认为落入本发明的保护范围中。
Claims (1)
1.黄酮类化合物作为SARS冠状病毒主蛋白酶抑制剂在制备用于治疗和/或预防SARS冠状病毒感染的药物中的应用，其中所述黄酮类化合物为具有下述结构的野黄芩素、万寿菊素、杨梅素和/或刺槐亭：
野黄芩素(scutellarein) 万寿菊素(quercetagetin)
杨梅素(myricetin) 刺槐亭(robinetin)。
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