CN113244212B - 黄芩素在制备预防和/或治疗新型冠状病毒感染疾病的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了黄芩素在制备预防和/或治疗新型冠状病毒感染引起的疾病的药物中的应用。具体而言，涉及黄芩素及含有黄芩素的药物组合物在制备用于预防和/或治疗新冠病毒(SARS‑CoV‑2)感染所引起疾病的药物中的应用，所述感染疾病包括由新冠病毒引起的轻症、中症、重症感染，尤其是新冠肺炎。

Description

黄芩素在制备预防和/或治疗新型冠状病毒感染疾病的药物中的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及黄芩素在制备预防和/或治疗新型冠状病毒感染疾病药物中的应用。具体而言，涉及黄芩素及含有黄芩素的药物组合物在预防和/ 或治疗新型冠状病毒(SARS-CoV-2，此后亦简称“新冠病毒”)感染疾病的药物中的应用，包括由新冠病毒引起的轻症、中症、重症感染，包括但不限于新冠肺炎。

背景技术

冠状病毒是一类具有囊膜的RNA病毒，由单一的核糖核酸RNA构成，属于单链RNA病毒。目前大约有15种不同冠状病毒株被发现，能够感染人、鼠、猪、猫、犬、禽类脊椎动物。冠状病毒(Coronaviruses，CoVs)属冠状病毒科(Coronaviridae)，根据血清型和基因组特点分为4属：Alpha Coronavirus(α-CoV)、Beta Coronavirus (β-CoV)、Gamma Coronavirus(γ-CoV)、Delta Coronavirus(δ-CoV)，可感染人和多种动物，引起宿主呼吸道、肠道、肝和神经系统疾病，其中又以β-CoVs对人类危害最烈。2018年，国际病毒分类委员会(International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV)将Beta Coronavirus属进一步分为5个亚属，即Embecovirus、 Sarbecovirus、Merbecovirus、Nobecovirus和Hibecovirus，其中前4个亚属分别对应原Beta Coronavirus属之下的A、B、C、D等4个进化簇(lineages或clusters)，Hibecovirus 亚属则由分离于中国蝙蝠、且与Sarbecovirus亚属在系统发生上近缘的一类β-CoVs 提升而来。

2019年12月以来，多例新型冠状病毒(2019novel corona virus，2019-nCoV)感染的肺炎患者陆续被发现，该疾病已被纳入《中华人民共和国传染病防治法》规定的乙类传染病，并采取甲类传染病的预防、控制措施。2019-nCoV为β属的一种新型冠状病毒，该病毒会使患者感染肺炎，还可引起肠道、肝脏和神经系统的损害和相应症状。疫情急剧蔓延，迅速播散，但截至目前尚无特效药物。根据国家卫健委的通知，新型冠状病毒感染的肺炎统一称谓为“新型冠状病毒肺炎”，简称“新冠肺炎”，英文名为“Novel coronavirus pneumonia”，简称为“NCP”。随后，国际病毒分类委员会(International Committee on Taxonomy ofViruses,ICTV)宣布，新型冠状病毒 (2019-nCoV)的正式分类名为严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)。世界卫生组织(WHO)也同日宣布，由这一病毒导致的疾病的正式名称为COVID-19。

可感染人的冠状病毒，包括2019新型冠状病毒(SARS-CoV-2)在内共有7种，不同类型病毒的致病力不同，引起的临床表现也不尽相同。常见的RNA病毒还包括艾滋病病毒、丙型肝炎病毒、乙型脑炎病毒、流感病毒、鼻病毒、脊髓灰质炎病毒、登革热病毒、SARS病毒、MERS病毒、埃博拉病毒(Ebola virus)等。

黄芩素(化学名：5,6,7-三羟基黄酮；英文名：Baicalien)又名黄芩苷元、黄芪素，是存在于唇形科(Labiatase)植物黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi)干燥根中的主要黄酮类化合物，分子式为C₁₅H₁₀O₅，分量为270.24，具有式(I)的结构。

黄芩素为黄酮类化合物，水溶性较差，在生物体内存在生物利用度低的成药性难题。申请人通过前期研究，在中国专利ZL200710177330.8中发明了黄芩素的一种新β晶型物质，β晶型的体内生物吸收率明显高于α晶型，约为α晶型的2倍以上。黄芩素β晶型可以显著提升化合物的体内生物利用度，为研发黄芩素相关固体口服药物制剂提供了可能。

黄芩素具有多种药理作用，包括：抗菌、抗病毒、抗炎、抗变态反应、抗氧化、清除自由基、抗肿瘤、抗帕金森、抗凝、抗血栓形成和保护肝脏、心脑血管和神经元等作用。其中，黄芩素的抗病毒活性也被多次报道，如抗双链DNA病毒、疱疹病毒、少数负链呼吸道病毒、日本脑炎病毒、登革热病毒等。

中国专利申请公开号CN104203265A中记载了马来西亚大学发明的“抗黄病毒的抗病毒组合物”，其中公开了一种预防或治疗人类或动物中黄病毒感染或由其所产生的疾病的具有抗病毒活性的组合物，其特征在于该组合物中包含黄芩素、其类似物或其衍生物。该组合物可进一步包含医药上可接受的载剂。所述抗病毒活性包括对病毒附着于宿主细胞的抑制、对细胞内病毒复制的抑制、及直接杀病毒的活性。黄病毒包含登革热病毒1型、登革热病毒2型、登革热病毒3型、登革热病毒4型及日本脑炎病毒。相较于未处理的细胞，50μg/ml的黄芩素预处理Vero细胞的登革热病毒灶的数目减少～37％及登革热病毒第2型RNA产生量减少39.5％±0.8。预处理细胞中黄芩素的IC₅₀为108.8μg/ml。相较于未处理细胞，25μg/ml的黄芩素对登革热病毒灶的量减少76.6％及DENV-2RNA生产量降低90.3％±1.6，且计算的IC₅₀值为7.14μg/ml。

中国专利申请公开号CN1925863A中公开了由凡诺华(英国)有限公司发明的“用于治疗SARS的黄芩属提取物”，其中涉及了含有黄芩属中的总标准化提取物具有抗冠状病毒活性，特别是抗引起严重急性呼吸器官综合征(SARS)的那些病毒的抗病毒活性，该黄芩属提取物PYN5C在最高浓度(200μg/ml)抑制SARS-CoV感染性约50％，该效果是剂量依赖性的，在更高水平的抑制作用大于利巴韦林(100μg/ml)。

文献《Baicalein and baicalin as Zika virus inhibitors》(Archives ofVirology,164, 585-593，2019)，记载了黄芩素和黄芩苷能在感染后10小时内下调寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)的复制，而在预处理的细胞中具有明显的预防作用。黄芩素在细胞内ZIKV复制过程中表现出最高的效力，而黄芩苷对病毒进入的抑制作用最强。通过 silico内相互作用分析预测，两种化合物对ZIKV NS5表现出最强的结合亲和力，而病毒包膜糖蛋白是最不可能的靶蛋白。这些发现为进一步深入研究每种化合物的潜在抗ZIKV机制提供了重要平台。

文献《Inhibitory Effects of Baicalein on the Influenza Virus in VivoIs Determined by Baicalin in the Serum》(Biol.Pharm.Bull.33(2)238-243,2010)，记载了黄芩素在体内对流感病毒有抑制作用。对感染甲型流感病毒(H1N1)的BALB/c小鼠口服黄芩素，具有明显的预防死亡、增加平均死亡时间、抑制肺实变和降低肺病毒滴度的作用。这些作用被认为是由于血清中黄芩素的代谢产物黄芩苷。在覆盖培养基中，当黄芩苷浓度为2mg/ml时，在菌斑试验中表现出明显的抑制作用，细胞病变试验中黄芩苷的平均IC₅₀值为1.2mg/ml。结果表明，黄芩素作为一种潜在的抗流感病毒药物值得进一步研究。

文献《Human cytomegalovirus-inhibitory flavonoids:Studies on antiviralactivity and mechanism of action.》(Antiviral Research,68(3),124-134，2005)，记载了饮食类黄酮对人巨细胞病毒(HCMV)的抗病毒作用及其可能的生化作用机制。十个评价的黄酮类化合物中的九个在浓度显著低于产生生长或静止期宿主细胞的细胞毒性的浓度下阻断了HCMV复制。黄芩素是该系列药物中最有效的抑制剂(IC₅₀＝0.4-1.2μM)，阳性对照更昔洛韦也不例外。以黄芩素和染料木素为模型化合物，两种黄酮均显著降低HCMV早期和晚期蛋白水平，并降低病毒DNA合成。黄芩素可将HCMV即刻早期蛋白水平降低到接近背景水平，而染料木素则没有。染料木素(genistein)的抗病毒作用在细胞培养中是完全可逆的。在浓缩的病毒培养液中加入黄酮类物质，对 HCMV的复制没有抑制作用，说明黄芩素不能直接灭活病毒颗粒。黄芩素能阻断表皮生长因子受体酪氨酸激酶活性和HCMV核移位，而染料木素则不能。感染后24小时，染料木素处理的HCMV感染细胞继续表达即时早期蛋白，并有效磷酸化IE1-72。然而，HCMV诱导NF-κB和细胞周期调节蛋白水平的增加与即刻早期蛋白功能相关的事件是不存在的。提示黄芩素的主要作用机制可能是阻断HCMV的感染，而genistein的主要作用机制可能是阻断HCMV的即刻早期蛋白功能。

文献《Binding Aspects of Baicalein to HIV-1Integrase》(Mol.Cells,12(1),127-130， 2001)，记载了利用荧光光谱和圆二色谱(CD)研究了抑制剂黄芩素对HIV-1整合酶催化结构域In-(50-212/F185K)构象的影响。发现黄芩素与HIV-1整合酶催化核心区的疏水区结合，这种结合诱导了酶的构象变化。黄芩素与HIV-1整合酶催化结构域的结合率为2:1。

文献《Remdesivir and chloroquine effectively inhibit the recentlyemerged novel coronavirus(2019-nCoV)in vitro》(Cell Research,0:1–3,2020)，记载了瑞德西韦、磷酸氯喹、利巴韦林、硝唑尼特、萘莫司他等抗病毒药物在体外的抗SARS-CoV-2 活性，结果显示5种药物对新冠状病毒的半数有效浓度(EC₅₀)分别为0.77μm、1.13μM、109.50μM、2.12μM、22.50μM，同时报道了喷昔洛韦、法匹拉韦的EC₅₀值分别为 95.96μM，61.88μM。由实验结果可知，瑞德西韦体外抗SARS-CoV-2活性非常显著。

发明简述

本申请的一个或多个实施方式提供了黄芩素在制备用于预防和/或治疗由新型冠状病毒感染引起的疾病的药物中的用途。

本申请的一个或多个实施方式提供了用于预防和/或治疗新型冠状病毒感染的药物组合物，其包含黄芩素和药学上可接受的载体、辅料或赋形剂，和/或一种或多种另外的抗病毒剂或抗生素。

在本申请的一个或多个实施方式中，所述黄芩素为β晶型黄芩素。

在本申请的一个或多个实施方式中，所述由新型冠状病毒感染引起的疾病为新型冠状病毒肺炎。

在本申请的一个或多个实施方式中，所述新型冠状病毒为SARS-CoV-2。

在本申请的一个或多个实施方式中，所述抗病毒剂为瑞德西韦、磷酸氯喹、利巴韦林、硝唑尼特、萘莫司他、喷昔洛韦、法匹拉韦、阿比多尔和/或金刚烷胺。

在本申请的一个或多个实施方式中，所述抗生素为内酰胺类、大环内酯类、头孢类和/或磺胺类抗生素。

在本申请的一个或多个实施方式中，所述药物组合物中的黄芩素的含量为0.1至99.9重量％。

在本申请的一个或多个实施方式中，所述黄芩素的含量为50至99.9重量％。

在本申请的一个或多个实施方式中，所述黄芩素的含量为50、60、70、80、90、 99重量％

在本申请的一个或多个实施方式中，所述黄芩素的含量为80至99.9重量％。

在本申请的一个或多个实施方式中，所述药物组合物为固体制剂。

在本申请的一个或多个实施方式中，所述固体制剂包括片剂、胶囊、丸剂、注射用制剂、缓释或控释制剂。

本申请的一个或多个实施方式提供了本申请的药物组合物在制备用于预防和/或治疗由新型冠状病毒感染引起的疾病的药物中的用途。

在本申请的一个或多个实施方式中，所述新型冠状病毒为SARS-CoV-2。

在本申请的一个或多个实施方式中，所述新型冠状病毒感染包括轻症、中症和重症感染。

在本申请的一个或多个实施方式中，所述由新型冠状病毒感染引起的疾病包括由所述新型冠状病毒引起的肺炎或肠炎。

在本申请的一个或多个实施方式中，所述黄芩素抑制所述新型冠状病毒的感染、抑制所述新型冠状病毒的复制、或对新型冠状病毒引起的组织损伤具有保护和治疗作用。

在本申请的一个或多个实施方式中，其中所述黄芩素的每日给药剂量为 50-1000mg。

在本申请的一个或多个实施方式中，其中针对老人和儿童的每日给药剂量为50-800mg。

在本申请的一个或多个实施方式中，其中所述黄芩素的每日给药剂量为50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000mg。

在本申请的一个或多个实施方式中，其中所述黄芩素为β晶型黄芩素。

本申请的一个或多个实施方式提供了治疗由由新型冠状病毒感染引起的疾病的方法，其包括给予有此需要的对象治疗有效量的黄芩素或包含黄芩素的组合物。

本申请的一个或多个实施方式提供了黄芩素或包含黄芩素的组合物，其用于预防和/或治疗由新型冠状病毒感染引起的疾病的方法。

发明内容

尽管黄芩素对许多常见人类病毒的抗病毒活性已被广泛报道，但其对于新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的活性尚无人报道。本发明人在分子筛选、体外细胞和实验动物模型上，使用黄芩素对抗新冠病毒的活性取得了预料不到的技术效果，其半数有效浓度EC₅₀与瑞德西韦相当，显著高于利巴韦林、洛匹那韦-利托那韦等经典抗病毒药物，完成了本发明。

本发明的第一个方面要解决的技术问题是提供黄芩素在制药中的新用途，即黄芩素在制备预防和/或治疗新型冠状病毒感染引起的疾病的药物中的应用。

本发明中预防和/或治新冠病毒(SARS-CoV-2)感染，包括由新型冠状病毒引起的轻、中、重症感染，包括但不限于新冠肺炎(NCP)。

根据本发明，黄芩素可以制备用于预防和/或治疗新型冠状病毒感染的药物组合物，该药物组合物含有黄芩素和药学上可接受的载体，其中优选含有有效剂量的黄芩素β晶型。

与黄芩素β晶型相关的技术内容已经公开在专利文献第ZL200710177330.8中，在此声明将相关内容一并并入本发明专利文件中。

根据本发明的应用，其中预防和/或治疗新型冠状病毒感染是指具有预防性感染后抗病毒活性、直接杀病毒活性或者对病毒附着至宿主细胞的抑制。

在本发明的用途中，黄芩素的每日用药剂量在50-1000mg范围内，例如50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000mg。

本发明的另一个方面还涉及以黄芩素作为活性成份的药物组合物。该药物组合物可根据本领域公知的方法制备。可通过将黄芩素与一种或多种药学上可接受的固体或液体赋形剂和/或辅剂结合，制成适于人或动物使用的任何剂型。本发明黄芩素在其药物组合物中的含量通常在0.1％～100％重量范围内，例如1％、10％、20％、30％、 40％、50％、60％、70％、80％、90％。

本发明黄芩素可以单位剂量形式给药，给药途径可为经肠道或非肠道，如经口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、鼻腔、口腔粘膜、眼、肺和呼吸道、皮肤、阴道、直肠等。

本发明的给药剂型优选是固体剂型。固体剂型可以是片剂，包括普通片、肠溶片、含片、分散片、咀嚼片、泡腾片、口腔崩解片；胶囊剂，包括硬胶囊、软胶囊、肠溶胶囊；颗粒剂；散剂；微丸；滴丸；栓剂；膜剂；贴片、气(粉)雾剂；喷雾剂等。

本发明黄芩素可以制成普通制剂、也可制成缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。

为了将本发明黄芩素制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种赋形剂，包括稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、助流剂。稀释剂可以是淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纤维素、硫酸钙、磷酸氢钙、碳酸钙等；湿润剂可以是水、乙醇、异丙醇等；粘合剂可以是淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、微晶纤维素、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、丙烯酸树脂、卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等；崩解剂可以是干淀粉、微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、碳酸氢钠与枸橼酸、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠等；润滑剂和助流剂可以是滑石粉、二氧化硅、硬脂酸盐、酒石酸、液体石蜡、聚乙二醇等。

还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。

为了将给药单元制成胶囊剂，可以将有效成分与稀释剂、助流剂混合，将混合物直接置于硬胶囊或软胶囊中。也可将有效成分先与稀释剂、黏合剂、崩解剂制成颗粒或微丸，再置于硬胶囊或软胶囊中。用于制备本发明黄芩素片剂的各种稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、助流剂品种也可用于制备本发明黄芩素的胶囊剂。

此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂或其它添加剂。

为达到用药目的，增强治疗效果，本发明的药物可用任何公知的给药方法给药。

本发明黄芩素及含有黄芩素的药物组合物，其给药剂量依照所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的个体情况，给药途径和剂型等可以有大范围的变化。上述剂量可以一个剂量单位或分成几个剂量单位给药，这取决于医生的临床经验以及包括运用其它治疗手段的给药方案。

本发明黄芩素或组合物可单独服用，或与其他治疗药物或对症药物合并使用。当本发明黄芩素与其它治疗药物存在协同作用时，应根据实际情况调整它的剂量。

本发明涉及黄芩素及含有黄芩素的药物组合物在预防和/治疗新冠状病毒感染的药物中的应用，包括但不限于新冠肺炎。

本发明发现黄芩素在抗新冠状病毒方面的活性取得了预料不到的技术效果的至少一种：

1.本发明应用的黄芩素在分子水平的计算机虚拟筛选中，与SARS-CoV-2冠状病毒关键蛋白3CL水解酶(Mpro)活性位点中的关键的氨基酸产生较强相互作用。

2.本发明应用的黄芩素在分子水平的计算机虚拟筛选中，能够与病毒Spike蛋白与ACE2结合位点中的关键氨基酸产生较强相互作用。

3.本发明的黄芩素应用在细胞水平测试抗冠状病毒的活性时，采用100TCID50 的病毒感染剂量，在非洲绿猴肾细胞(VERO细胞)模型上，进行病毒感染力的测定，结果显示黄芩素在0.1μM、1μM两个剂量下均对新冠病毒有预料不到的显著抑制作用，其抑制能力与瑞德西韦相当。

4.本发明的黄芩素应用在SARS-CoV-2感染hACE2转基因小鼠模型上，小鼠体重没有因为感染病毒下降且维持上升，体内病毒复制被显著抑制，肺组织病变有轻度改善，可见黄芩素对SARS-CoV-2感染hACE2转基因小鼠有一定的病毒抑制和改善肺部炎症的作用。

5.本发明的黄芩素应用在体外细胞模型上对肺炎具有预料不到的药理作用，具体而言，黄芩素对Raw264.7细胞内NF-κB核转位具有显著的抑制作用，对细胞内 NF-κB磷酸化具有显著的抑制作用。

6.本发明的黄芩素应用在整体动物水平上对LPS诱导的急性肺炎损伤具有显著的治疗作用，具体表现在对模型小鼠呼吸功能的改善、组织病理变化的改善、肺组织中MPO活性的影响、支气管灌流液中炎性细胞浓度、细胞因子浓度、血清中细胞因子浓度的影响、脾脏指数的影响、以及肺组织中炎症相关基因mRNA表达水平的影响等方面。

7.本发明的黄芩素应用已完成I期临床试验研究，临床试验结果显示其具有良好的安全性。

附图说明

图1SARS-CoV-2冠状病毒3CL水解酶(Mpro)与黄芩素的相互作用图(A：三维相互作用图，B：二维相互作用图)；

图2黄芩素对Raw264.7细胞内NF-κB核转位的抑制作用；

图3黄芩素对细胞内NF-κB磷酸化的抑制作用；

图4黄芩素对肺损伤小鼠的呼气末期停顿时间的作用(A)；对肺损伤小鼠的单位体重最大呼气流量的作用(B)；对肺损伤小鼠的支气管收缩程度作用(C)；对肺损伤小鼠的呼吸频率的影响(D)；

图5黄芩素对急性肺损伤小鼠肺组织病理变化的改善作用；

图6黄芩素对急性肺损伤小鼠肺组织中MPO活性的影响；

图7黄芩素对小鼠肺支气管灌流液中炎性细胞浓度的影响；

图8黄芩素对小鼠肺支气管灌流液中细胞因子浓度的影响；

图9黄芩素对小鼠血清中细胞因子浓度的影响；

图10黄芩素对急性肺损伤小鼠脾脏指数的影响；

图11黄芩素对肺组织中炎症相关基因mRNA表达水平的影响；

图12病毒棘突糖蛋白S(Spike Glycoprotein，A，B，C)利用ACE2(D)介导病毒膜和宿主膜的融合；

图13黄芩素与病毒S-蛋白-ACE2结合位点的相互作用图；

图14模型组与黄芩素治疗组小鼠体重下降率图；

图15模型组与黄芩素治疗组肺组织病毒载量图；

图16模型组与黄芩素治疗组肺组织病变图。

具体实施方式

为示例说明本发明的技术方案，特给出以下实施例，但本发明并不仅限于此。

以下各实施例中的新冠病毒(SARS-CoV-2)均由中国医学科学院医学实验动物研究所病原中心保存并提供，黄芩素由中国医学科学院药物研究所提供，纯度>98％，均为β晶型。

实施例1

计算机虚拟对接预测黄芩素在分子水平抗冠状病毒的活性

利用SARS-CoV-2冠状病毒关键蛋白3CL水解酶(Mpro)的高分率晶体结构(注：晶体结构的坐标可由PDB蛋白质结构数据库(Protein Data Bank,PDB)下载(PDB ID:6LU7))，采用Discovery studio软件进行计算机虚拟对接，分子对接结果见表 1所示。图1所示为Mpro与黄芩素的相互作用图。

表1 黄芩素与Mpro的对接结果

黄芩素	对接能量
		构象1	34.8954
构象2	34.4027
		构象3	31.7587
构象4	31.6989
		构象5	31.4707
构象6	31.3751
		构象7	30.9768
构象8	30.9701
		构象9	30.9509
构象10	30.8861

计算机虚拟筛选的结果表明：黄芩素结合SARS-CoV-2冠状病毒关键蛋白3CL 水解酶(Mpro)的关键氨基酸包括HIS41、MET49、PHE140、CYS145、HIS163、 MET165、GLU166、GLN189。黄芩素能够与活性位点中关键的氨基酸产生相互作用，因此具有作用于该靶点的潜在利用价值。

实施例2

黄芩素对SARS-CoV-2新冠病毒感染力的影响研究

【受试药物】：药物名称及浓度见表2。

【细胞】：VeroE6细胞，由中国医学科学院医学实验动物研究所病原中心保存并提供。

【病毒】：新冠病毒(SARS-CoV-2)，滴度为105TCID50/ml，由中国医学科学院医学实验动物研究所病原中心-80℃保存。使用病毒滴度为100TCID50。

【实验方法】

(1)无菌96孔培养板，每孔加入200μl浓度为5×10⁴cell/ml Vero E6细胞，37℃下5％CO₂培养24小时；

(2)受试药物稀释成2个浓度，每个浓度5个复孔，每孔100μl，然后每孔再加入等体积100TCID₅₀病毒，作用1h；

(4)1h后，弃去96孔培养板中细胞培养液，加入上述混合液；

(5)同时设立细胞对照、空白对照(溶剂对照)和病毒对照(阴性对照)；

(6)细胞37℃，5％CO₂孵箱孵育4-5天；

(7)光学显微镜下观察细胞病变(CPE)，细胞完全病变记录为“++++”，75％病变记录为“+++”，50％病变记录为“++”，25％病变记录为“+”，未病变记录为“－”。

【实验条件】：以上实验操作均在BSL-3实验室内完成

【结果判断】：细胞不出现CPE为有效抑制病毒的浓度，出现CPE为无效。

【实验结果】

采用100TCID50的病毒感染剂量，在非洲绿猴肾细胞(VeroE6细胞)模型上，分别使用0.1μM、1μM两个剂量的黄芩素与瑞德西韦进行病毒感染力的测定研究，研究结果如表2所示。

表2 不同剂量的黄芩素与瑞德西韦对SARS-CoV-2新型冠状病毒感染力数据

【结论】

根据细胞水平的筛选结果，黄芩素在0.1μM浓度下，可抑制SARS-CoV-2对细胞的损伤，提示黄芩素具有体外抗SARS-CoV-2活性，其作用强度与瑞德西韦一致 (细胞实验在给药后作用4天以上)。

表3 黄芩素抗SARS-CoV-2作用分析

细胞实验显示0.1μM的黄芩素对细胞具有100％的保护作用。

实施例3

黄芩素在细胞水平对肺炎的药理作用研究

选择炎性刺激物细菌脂多糖(LPS)和黄芩素，利用体外细胞模型，利用体外细胞模型，考察炎性刺激物及黄芩素的细胞毒性和对小鼠巨噬细胞Raw264.7内炎症相关信号途径的影响，以确证所选黄芩素的抗炎活性。此外，采用正常人肺支气管上皮细胞BEAS-2b，观察黄芩素对正常肺细胞增殖活性的作用特点和选择性。

【样品配制】

黄芩素(Baicalein，BC)由中国医学科学院药物研究所提供，其结构如式(I) 所示，纯度>98％；Caspase-1小分子抑制剂VX-765购自上海瀚香生物科技有限公司纯度>98％；非甾体类抗炎药阿司匹林(Acetylsalicylic acid or Aspirin,ASP)和甾体类抗炎药地塞米松(Dexamethasone,DEX)购于Sigma公司，纯度>99％；化合物均用DMSO 配制成100mM的母液，于-20℃保存备用。LPS用无菌生理盐水配制成8mg/ml的母液，分装保存于-80℃备用。

【实验方法】

1.细胞的培养

小鼠巨噬细胞株Raw264.7培养于含有10％国产FBS、100U/ml青霉素和 100μg/ml链霉素的RPMI-1640培养基中；培养条件为37℃，5％CO₂，80％湿度；2 天传代一次，更换新鲜的完全培养基。正常人肺支气管上皮细胞BEAS-2b培养于含有10％进口FBS、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI-1640培养基中；培养条件为37℃，5％CO₂，80％湿度；3天传代一次，传代时更换新鲜的完全培养基。

2.细胞增殖毒性实验

将处于对数生长期的细胞种于96孔培养板，1.0×10⁴个细胞每孔，37℃，5％CO₂，湿度为80％的条件下培养24小时；用不同终浓度的LPS或化合物溶液在37℃条件下处理细胞24小时；使用MTT法检测细胞活力；使用倒置荧光显微镜拍摄经甲醛溶液固定的细胞，记录细胞的形态；用高内涵分析仪分析细胞核形态，统计细胞核的平均荧光强度。

3.细胞免疫荧光

将处于对数生长期的小鼠巨噬细胞Raw264.7种于黑色底透的96孔培养板，2.0×10⁴个细胞每孔，培养基为含有10％国产FBS、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的 RPMI-1640；37℃，5％CO₂，湿度为80％的条件下培养24小时；加入浓度为最终浓度2倍的无血清1640培养基稀释的LPS溶液，轻轻振板混匀，使黄芩素最终的浓度分别为 0.1、1、10μM，地塞米松、阿司匹林和VX-765的最终浓度分别为10μM，而LPS的终浓度为2μg/ml；甲醛固定，进行免疫荧光实验，用高内涵分析仪分析细胞内NF-κB p65 的核转位程度。

4.免疫印迹分析

利用免疫印迹分析小鼠巨噬细胞Raw264.7中NF-κB p65和TAK1的磷酸化情况。具体操作步骤如下：将处于对数生长期的小鼠巨噬细胞Raw264.7接种于35mm培养皿，1.0×10⁶个细胞每孔，培养基为含有10％国产FBS、100U/ml青霉素和100μg/ml 链霉素的RPMI-1640，2ml培养基每皿；37℃，5％CO₂，湿度为80％的条件下培养 24小时；加入浓度为最终浓度2倍的无血清RPMI-1640培养基稀释的LPS溶液，轻轻振摇混匀，使黄芩素最终的浓度分别为0.1、1.0、10μM，地塞米松、阿司匹林和VX-765 的最终浓度分别为10μM，而LPS的终浓度为1μg/ml，共1ml/皿；37℃继续培养24小时后，进行蛋白提取，利用免疫印迹(western blot)，用FluorChem 5500分析软件对条带进行灰度扫描，并对其进行定量分析。

5.统计方法

实验数据用Mean±S.D.或Mean±S.E.M.表示，采用Origin 9.0软件作用统计图；采用SPSS 22.0软件进行统计分析，用单因素方差的Bonferroni分析法和 Games-Howell分析法分析两两之间的差异性，P<0.05表示具有显著性差异。

【实验结果】

1.黄芩素对Raw264.7细胞内NF-κB核转位的抑制作用：

与LPS处理细胞相比，1.0和10μM的黄芩素对LPS诱导的NF-κB p65的核转位具有显著性抑制作用(P<0.05,P<0.01)，而0.1μM的黄芩素对LPS诱导的Raw264.7 细胞内NF-κBp65的核转位没有抑制作用，如图2示。

2.黄芩素对细胞内NF-κB磷酸化的抑制作用：

与LPS处理组细胞相比，10μM的黄芩素也能够显著性的抑制细胞内NF-κB p65 的磷酸化(P<0.05)；黄芩素对非磷酸化的NF-κB p65含量也无明显的影响，如图3 所示。

【结论】

本实验表明，黄芩素对LPS诱导致小鼠Raw264.7细胞内NF-κB p65亚基发生的核转位和NF-κB p65磷酸化也具有明显的抑制作用，10μM及以下终浓度的黄芩素对小鼠巨噬细胞Raw264.7的增殖活性没有明显影响，但在10μM以上浓度对人正常肺上皮细胞BEAS-2b的增殖活性具有明显的抑制作用。该部分结果表明黄芩素在体外具有明显的抗炎作用。

实施例4

黄芩素在整体动物水平对LPS诱导急性肺炎损伤的治疗作用

【实验动物】

BALB/c小鼠(30只)，雄性，体重为18-22g，SPF级，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号为SCXK(京)2012-0001。饲养条件：5只/笼，室温24±1℃，湿度60％～65％。实验期间自由摄食、饮水，光照12h/d。开始实验前，适应性培养3天。

【样品配制】

黄芩素由中国医学科学院药物研究所提供，纯度>98％。动物给药时，将化合物用羧甲基纤维素钠(CMC-Na)水溶液配制成浓度适合的混悬液灌胃给药(经检测混悬液中黄芩素为β晶型状态)；LPS用无菌生理盐水配制成8mg/ml的母液，分装保存于-80℃备用。

【实验方法】

1.动物分组、模型制备和给药

将BALB/c小鼠随机分为八组，分别为正常对照组、LPS模型组、阳性药阿司匹林组、阳性药VX-765、阳性药地塞米松组、黄芩素低剂量组(50mg/kg)、黄芩素中剂量组(100mg/kg)和黄芩素高剂量组(200mg/kg)，每组10只小鼠。

采用先造模后给药的方式考察黄芩素对LPS诱导急性肺损伤模型小鼠的治疗作用。急性肺损伤小鼠模型造模过程：先用少量乙醚对小鼠进行轻度麻醉，让其经鼻吸入400μg的LPS，共50μl(浓度为8mg/ml)；正常对照组小鼠经鼻吸入同体积的生理盐水。小鼠吸入后半小时和12小时，分别按照剂量给动物灌胃待评价的化合物及阳性药物。

各组小鼠在造模24小时后，进行动物肺功能监测，并取血。动物处死后进行肺支气管灌洗并收集灌洗液，最后取肺、脾、胸腺等组织器官进行测定。

2.动物肺功能监测

LPS诱导小鼠急性肺损伤造模24小时后，用EMKA清醒动物肺功能监测系统 (WholeBody Plethysmography,WBP)监测各组小鼠在清醒无束缚状态下的肺呼吸情况，统计小鼠吸气时间(TI)、呼气时间(TE)、最大吸气流量(PIF)、最大呼气流量(PEF)、潮气量(TV)、呼气量(EV)、呼吸松弛时间(RT)、每分钟呼气量(MV)、呼吸频率(F)、吸气末期停顿(EIP)、呼气末期停顿(EEP)、支气管收缩的程度(PENH)等12种呼吸功能相关的指标。

3.血清的收集

小鼠呼吸功能监测结束后，记录其体重；经皮下注射适量5％的水合氯醛溶液进行轻度麻醉，摘取眼球取血；室温静置60分钟后，4℃，5000rpm离心10分钟，收集的血清于-80℃保存备用。

4.肺气管灌流液的收集

取血后，暴露小鼠颈部气管，用0.3ml的预冷灭菌PBS进行肺气管插管灌洗，收集灌流液，每次0.3ml。三次混合后，4℃，1500rpm离心5分钟，上清保存于-80℃备用。沉淀用新的50μl预冷灭菌PBS重悬，保存4℃用于细胞分类统计。

5.组织器官的摘取

肺气管灌洗结束后，小心摘取小鼠的肺脏、胸腺和脾脏等器官，清理干净，记录其湿重。左肺装入5ml离心管再称湿重，然后80℃烘烤48小时，称干重以计算肺的湿干重比。部分左肺组织固定在4％的多聚甲醛溶液中48小时，用于病理切片分析；其余肺组织保存于液氮或-80℃冰箱中备用。用HE染色对肺组织病理进行分析。

6.一氧化氮含量的测定

采用Griess试剂法检测肺支气管灌流液中一氧化氮(Nitric oxide,NO)的含量。

7.炎症相关细胞因子的测定

采用酶联免疫吸附实验(ELISA)测定血清或肺支气管灌流液中的炎症相关细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的含量。具体步骤参考细胞因子测定试剂盒说明书进行。

8.髓过氧化物酶活性的测定

采用髓过氧化物酶活性测定试剂盒测定肺组织中髓过氧化物酶的活性。具体步骤参考试剂盒说明书进行。

9.统计方法

实验数据用Mean±S.E.M.表示，采用Origin 9.0软件作用统计图；采用SPSS 22.0软件进行统计分析，用单因素方差的Bonferroni分析法和Games-Howell分析法分析两两之间的差异性，P<0.05表示具有显著性差异。

【实验结果】

1.黄芩素对急性肺损伤小鼠呼吸功能的影响

BALB/c小鼠呼吸功能指标的监测统计结果显示，与正常对照组相比，LPS模型组小鼠的呼气末期停顿时间显著性延长(P<0.001)、单位体重的最大呼气流量显著增大 (P<0.01)、支气管收缩的程度明显加剧(P<0.001)、呼吸频率明显下降(P<0.001)。与LPS模型组相比，剂量为50mg/kg的黄芩素对肺损伤小鼠的呼气末期停顿时间有显著的缩短作用(P<0.05,图4A)；剂量为50、100mg/kg的黄芩素对肺损伤小鼠的单位体重最大呼气流量有显著性的降低作用(P<0.05,P<0.01,图4B)；剂量为50、100和200mg/kg 的黄芩素对肺损伤小鼠的支气管收缩程度加剧有明显的降低作用(P<0.05,P<0.05, P<0.05,图4C)；剂量为50、100和200mg/kg的黄芩素对肺损伤小鼠的呼吸频率没有明显影响(图4D)。

2.黄芩素对急性肺损伤小鼠肺组织病理变化的改善作用

与正常对照组相比，经鼻腔吸入LPS的BALB/c小鼠肺组织中充斥着大量的细胞，肺泡空间被大量浸润的细胞所替代，肺泡结构发生明显变化。然而，与LPS模型组相比，剂量为50、100、200mg/kg的黄芩素均对肺部细胞浸润有改善作用(图 5A)。经统计，LPS模型组的细胞浸润面积占总面积的71.83±1.61％，显著性地高于正常组的29.38±2.38％(P<0.001)；而黄芩素的低、中、高剂量组分别为44.51±2.23％、 42.25±2.79％和41.55±2.75％，显著地低于LPS模型组(P<0.001,P<0.001,P<0.001)，如图5B所示。

3.黄芩素对急性肺损伤小鼠肺组织中MPO活性的影响

与正常对照组相比，LPS模型小鼠肺组织中MPO酶的活性显著升高(P<0.001)；与LPS模型组相比，剂量为100、200mg/kg的黄芩素均能够显著性降低肺损伤小鼠肺组织中的MPO活性(P<0.05,P<0.05)，而剂量为50mg/kg的黄芩素只有降低MPO酶活性的趋势，没有统计学差异，如图6所示。

4.黄芩素对小鼠肺支气管灌流液中炎性细胞浓度的影响

与正常对照组相比，经鼻腔吸入400μg的LPS能够显著性地增加小鼠肺支气管灌流液中的总细胞(P<0.001)、中性粒细胞(P<0.001)和巨噬细胞(P<0.001)的浓度。与 LPS模型组相比，剂量为100、200mg/kg的黄芩素能够显著性地降低灌流液中的总细胞的浓度(P<0.001,P<0.001，图7A)，但剂量为50mg/kg的黄芩素对总细胞的浓度没有明显的降低作用；剂量为50、100、200mg/kg的黄芩素能够显著性地降低肺损伤小鼠肺支气管灌流液中的中性粒细胞(P<0.01,P<0.01,P<0.001，图7B)和巨噬细胞浓度(P<0.05,P<0.001,P<0.001，图7C)。

5.黄芩素对小鼠肺支气管灌流液中细胞因子浓度的影响

与正常对照组相比，经鼻腔吸入400μg的LPS能够显著性地升高小鼠肺支气管灌流液中的炎症细胞因子IL-1β(P<0.001)、IL-6(P<0.001)和TNF-α(P<0.001)的浓度。与 LPS模型组相比，剂量为50mg/kg的黄芩素能够显著性地降低灌流液中IL-6的浓度 (P<0.05，图8)。

6.黄芩素对小鼠血清中细胞因子浓度的影响

与正常对照组相比，LPS模型组小鼠的外周血清中炎症细胞因子IL-1β(P<0.001)、IL-6(P<0.001)和TNF-α(P<0.001)均显著性地升高。与LPS模型组相比，剂量为50、 200mg/kg的黄芩素能够显著性地降低血清中IL-1β的含量(P<0.05,P<0.05,图9A)，而剂量为100mg/kg的黄芩素对此只有抑制的趋势，没有统计学差异；剂量为50、 100、200mg/kg的黄芩素对小鼠血清中IL-6的浓度没有显著性的抑制作用(图9B)；剂量为100和200mg/kg的黄芩素对血清中TNF-α也具有显著性的抑制作用(P<0.01, P<0.01,图9C)，但剂量为50mg/kg的黄芩素对血清中TNF-α只具有降低的趋势，没有统计学差异。

7.黄芩素对急性肺损伤小鼠脾脏指数的影响

与正常对照组相比，LPS模型组小鼠的脾脏指数显著性地增加(P<0.001)。与LPS模型组相比，剂量为50、100mg/kg的黄芩素能够显著性地降低肺损伤小鼠的脾脏指数(P<0.05,P<0.05)，而剂量为200mg/kg的黄芩素对脾脏指数只有降低的趋势，没有统计学差异，如图10所示。

8.黄芩素对肺组织中炎症相关基因mRNA表达水平的影响

与LPS模型组相比，剂量为50、100、200mg/kg的黄芩素对炎性小体基因 NLRP3(P<0.01,P<0.01,P<0.01)、AIM2(P<0.01,P<0.01,P<0.01)和炎症因子基因 TNF-α(P<0.01,P<0.01,P<0.05)的mRNA表达水平有显著性地抑制作用；剂量为50mg/kg的黄芩素对Caspase-1(P<0.05)和IL-1β(P<0.01)的mRNA表达有明显地抑制作用，另两个剂量组的黄芩素降低作用不明显；剂量为100、200mg/kg的黄芩素对 GAPDH(P<0.05,P<0.05)基因的mRNA表达水平有显著性地升高作用，但剂量为 50mg/kg的黄芩素对此无明显的影响；与LPS模型组相比，剂量为50、100、200mg/kg 的黄芩素对NLRP1、NLRC4、ASC和IL-6等4个炎症相关基因的mRNA表达水平没有明显地抑制作用，如图11所示。

【结论】

结果显示，黄芩素能够显著性地缩短肺损伤小鼠的呼气末期停顿时间、显著性地减小单位体重的最大呼气流量、明显减轻支气管收缩的程度；黄芩素能够明显减轻肺损伤小鼠肺部细胞浸润和肺组织中MPO酶的活性；黄芩素还能够显著性地降低肺支气管灌流液中炎性细胞的浓度，在一定程度上可以降低灌流液中的细胞因子的浓度；黄芩素可以显著降低血清中IL-1β和TNF-α的浓度；黄芩素能够显著性地降低肺损伤小鼠的脾脏指数。

上述结果表明，在建立的急性肺损伤模型中，黄芩素能够降低肺损伤小鼠血清中炎症因子的含量，对LPS诱导的急性肺损伤具有一定程度上的治疗作用。

实施例5

黄芩素可干扰病毒S蛋白与ACE2结合

病毒棘突糖蛋白S(Spike Glycoprotein，图12，A，B，C)通过与宿主ACE2 (图12，D)受体蛋白结合，介导病毒膜和宿主膜的融合，实现病毒对宿主的感染。病毒进入宿主细胞后，被宿主蛋白酶裂解并大量繁殖，导致严重后果。

根据Scripps研究所报告的蛋白质结构数据(PDB code：6CS2)，病毒棘突糖蛋白S以三聚体形式与ACE2结合。因此，冠状病毒的抑制剂要么进攻ACE2与受体结合的位点，要么进攻糖蛋白S的三聚体结合面，或者进攻能导致任一种蛋白产生大的结构变化的结合口袋。

下载Scripps研究所报告的蛋白质结构数据(Protein Data Bank code：6CS2)，采用Discovery studio软件进行计算机虚拟对接，分子对接结果见表4所示。

黄芩素结合病毒Spike蛋白与ACE2的结合位点，详见图13：(A)相互作用的3D图，(B)相互作用的2D图。

表4 黄芩素与ACE2-病毒蛋白S结合的位点的对接结果

黄芩素	对接能量
		构象1	-5.10
构象2	-4.66

计算机虚拟筛选的结果表明：黄芩素进攻ACE2与受体结合的位点的关键氨基酸包括ILE(B)405、VAL(B)404、PEH(B)483、LYS(B)390、TYR(B)481、ASP(B)393。黄芩素能够与病毒S-蛋白-ACE2结合位点中的关键氨基酸产生相互作用，说明其为作用于该靶点的潜在活性化合物。

实施例6

黄芩素在小鼠模型上具有明显的抗新型冠状病毒作用

应用SARS-CoV-2感染hACE2转基因小鼠模型，评价黄芩素治疗效果。

1.材料与方法

1.1受试药物

受试物名称：黄芩素，现用现配，10mg/ml

1.2攻毒毒株

毒株名称：SARS-CoV-2

感染途径：滴鼻

感染剂量：105TCID50/只

感染体积：50微升

1.3实验动物

动物名称：hACE2转基因小鼠，SPF级，7周龄，体重16-24g

动物来源：来自中国医学科学院医学实验动物研究所

2.实验方法

2.1动物分组：

分为黄芩素组和模型组，每组6只，黄芩素200mg/kg，按照每只小鼠给予200 μl/10g计算。灌胃给药，攻毒后1小时给药，每天1次，连续给药5天，模型组按照等体积给予0.5％羧甲基纤维素钠。

表5 药物抗病毒效果实验动物分组

组别	hACE2小鼠(只)	给药剂量	感染
				黄芩素组	6	200mg/kg/d	<![CDATA[10<sup>5</sup>TICD<sub>50</sub>/只]]>
模型组	6	/	<![CDATA[10<sup>5</sup>TICD<sub>50</sub>/只 ]]>

2.2观察指标

小鼠攻毒后连续观察5天，进行一般症状观察，记录体重变化。分别在感染后第3天和第5天，每组安乐死3只小鼠检测肺组织病毒载量，第5天取1只小鼠的 1侧肺组织进行组织病理学检查。

2.3数据统计处理方法

本实验所产生的定量数据，应用统计处理软件SPSS(Version.12.0)进行方差分析。

3.实验结果

3.1一般状态观察

模型组小鼠感染后一般状态尚可，部分动物出现竖毛及体重下降，平均下降率最高为4.55％。与模型组比较，黄芩素组小鼠平均体重略有上升，上升率最高为1.59％。见图14和表6。

表6 黄芩素给药后各组小鼠体重变化

3.2病毒载量

各组小鼠感染后第3天安乐小鼠，分别取3只小鼠收集肺组织用于做载量检测，其中1只小鼠肺组织一半用于做病理检查。

模型组小鼠感染后第3天和5天肺组织载量检测结果为105.94copies/ml和104.14copies/ml。黄芩素组小鼠感染后第3天肺组织病毒载量为104.45copies/ml，显著低于模型组小鼠(p<0.01)；第5天肺组织病毒载量为103.36copies/ml，显著低于与模型组(p<0.05)。见图15和表7。

表7 黄芩素对小鼠肺组织病毒载量影响

各组受试物小鼠体重下降率与模型组比较，*p<0.05有显著性差异，**p<0.01有非常显著性差异

3.3病理诊断

SARS-CoV-2感染5天的hACE2转基因模型组小鼠肺组织呈弥漫性中度间质性肺炎改变，可见肺泡隔增宽，炎细胞浸润，血管周围少量炎细胞浸润。黄芩素治疗组小鼠肺组织呈弥漫性轻至中度间质性肺炎改变，可见肺泡隔增宽，炎细胞浸润，血管周围少量炎细胞浸润。与模型组相比，黄芩素治疗组的肺组织病变有轻微改善。图16所示为模型组与黄芩素治疗组的肺组织病变图。

表8 肺组织病理改变程度简表

注：—，未见病变；+，轻度病变；++，中度病变；+++，重度病变；++++，极重度病变。

4.实验结论

与模型组小鼠相比，黄芩素治疗组的小鼠一般表现较好，体重没有因为感染病毒下降且维持上升，体内病毒复制被显著抑制，肺组织病变有轻度改善，表明黄芩素(例如200mg/kg/d给药剂量的黄芩素)对SARS-CoV-2感染hACE2转基因小鼠有一定的抑制病毒和改善肺部炎症的作用。

Claims (2)

1.黄芩素在制备用于预防和/或治疗由SARS-CoV-2感染引起的肺炎或肺损伤的药物中的用途。

2.如权利要求1所述的用途，其中所述药物还包含药学上可接受的载体。

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