CN118141798A - D-地衣酸抗呼吸道合胞病毒rsv感染的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了D‑地衣酸抗呼吸道合胞病毒RSV感染的应用，属于生物医药技术领域。具体地，本发明通过对小分子化合物库进行筛选，初步获得了一系列能够抑制RSV病毒的小分子药物，并进一步通过检测对RSV病毒蛋白的抑制以及体内实验确定最优小分子化合物D‑地衣酸，该化合物能够显著抑制RSV病毒复制，在特异性抗RSV病毒感染中的作用未经报道。本发明发现了新的具有抗RSV病毒的小分子抑制剂，为临床RSV特效药的开发提供有力备选，且植物来源的天然产物获取较简单，生产成本较低，若能开发成抗RSV特效药，将极大改善病患的痛苦和减轻经济负担。

Description

D-地衣酸抗呼吸道合胞病毒RSV感染的应用

技术领域

本发明涉及D-地衣酸抗呼吸道合胞病毒RSV感染的应用，属于生物医药技术领域。

背景技术

呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus，RSV)是一种全球流行的病毒感染，主要引起下呼吸道疾病，感染人群主要为婴幼儿和老年人以及免疫力低下者。感染RSV病毒后，免疫力正常的人基本可以自愈，儿童感染后多数症状会在1-2周内自行消失，但少部分可能发展成为下呼吸道感染，临床症状包括咳嗽、喘息，极少部分进一步加重出现呼吸急促和喂养困难等，严重者可发展为呼吸衰竭，累及呼吸系统外脏器，甚至导致死亡。在全球范围内，0-5岁儿童中每50例死亡人数中就有一例是因感染RSV而死亡，1-6个月儿童中每28例死亡人数中就有一例归因于感染RSV。

RSV不但给患儿、家庭带来很大负担，而且给儿科门诊和病房带来巨大压力；RSV传染性强，是流感病毒的近4倍，易在医疗机构引起院内传播，对就诊或住院的其他患儿造成威胁。长期以来对RSV感染，缺乏特异性治疗措施，特异性治疗药物尚欠缺。

自2010年以来，用于治疗RSV感染后的患者的小分子药物发现的进展速度加快，进入临床试验和通过临床试验的小分子药物数量大幅增加。领先的药物主要是靶向融合过程的化合物，它能够特异性靶向病毒表面的融合蛋白并与之结合，抑制RSV融合蛋白介导的与宿主细胞膜的融合作用，阻止病毒进入。这可以阻止RSV的复制，降低病毒载量，进而降低疾病的严重程度。目前针对RSV的小分子抗病毒药物的研发将是一个很好的替代方案，但目前并没有这样的小分子化合物被批准使用，均还处于开发的早期阶段和临床试验阶段。天然产物作为药物或作为先导化合物的研究一直广受关注，而植物来源的天然产物一直是药物开发的主要来源。本发明通过抗病毒药物筛选实验发现，化合物D-Usnic acid(右旋地衣酸，D-地衣酸)具有强大的抗RSV病毒作用，且目前尚未报道该化合物的抗RSV病毒作用。

发明内容

为解决上述问题，本发明首次发现了D-Usnic acid在抗RSV病毒感染中的应用，相对于其他能够抗RSV病毒感染的小分子药物，该化合物能够更显著地抑制RSV病毒蛋白表达，在抗RSV病毒感染中效果良好，且克服了小分子药物特异性不高的问题，在细胞或个体水平均验证其保护作用，有望用于RSV感染的特异性治疗。

本发明的第一个目的是提供右旋地衣酸在制备抗呼吸道合胞病毒感染产品中的应用。

进一步地，所述产品的形式包括但不限于药物等。

进一步地，所述产品用于预防或治疗呼吸道合胞病毒感染。

进一步地，所述产品用于抑制呼吸道合胞病毒的复制。

本发明的第二个目的是提供一种抗病毒药物，所述抗病毒药物中含有右旋地衣酸。

进一步地，所述病毒包括呼吸道合胞病毒。

进一步地，所述抗病毒药物的剂型包括但不限于片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、散剂、口服液体剂、注射剂、吸入剂等。

进一步地，溶液剂型中，右旋地衣酸的浓度不低于1μmol，最优选为5-10μmol。

进一步地，所述抗病毒药物由0.1-100％的右旋地衣酸和99.9-0％的药用辅料组成。

进一步地，所述药用辅料包括但不限于填充剂、黏合剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、润湿剂、泡腾剂、着色剂、甜味剂、芳香剂、防腐剂、分散剂、成膜剂、增塑剂、致孔剂、遮光剂、阻滞剂、溶剂等。

本发明的有益效果：

本发明通过对小分子化合物库进行高通量筛选，发现了一系列效果良好且有望特异性治疗RSV病毒感染的化合物，如D-地衣酸、鹰嘴豆芽素A、姜酮、莫能菌素钠等，其中D-地衣酸在抗RSV病毒感染中表现最为优异，能够显著抑制RSV病毒蛋白表达，抑制RSV病毒M2-2蛋白的百分比高达90.11％，并通过检测该化合物对RSV病毒复制的影响以及体内实验验证其对RSV感染的保护作用。

附图说明

图1为抗RSV病毒化合物的筛选结果。

图2为检测多个化合物对RSV活病毒感染HEP-2细胞的效果。

图3-4为5号化合物D-地衣酸对RSV病毒的影响。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

下述实施例中涉及的具体操作步骤如下：

(1)利用mCherry红色荧光蛋白确定化合物的抑制效果

将HEP-2细胞接种于96孔板，培养过夜后，加入化合物，4h后加入RSV病毒，最初选用的药物浓度均为10μmol，48h后在显微镜下观察并拍照。

(2)RT-PCR和Western blotting检测筛选出来的化合物对RSV病毒的影响

将HEP-2细胞接种于48孔板，培养过夜后，用化合物处理细胞，4h后加入病毒，48h后裂解细胞，提RNA，反转cDNA，RT-PCR检测病毒RNA水平的变化。

(3)D-地衣酸对小鼠的治疗作用

对6-8周的balb/c小鼠，经滴鼻每只小鼠接种10⁸pfu的RSV 100ul，2h后地衣酸组给小鼠灌胃地衣酸(50mg/kg/d)，对照组灌胃玉米油，连续灌胃4天，第五天取肺组织，分别提RNA，RT-qPCR，并检测IL-6、IL-8、IL-10、INF-β、TLR-3、TNF-a等细胞因子表达水平。

实施例1抗RSV病毒化合物的筛选

(1)我们选用带有mCherry红色荧光蛋白的RSV进行相关抑制库中化合物的筛选。利用软件ImageJ可以将病毒量化。利用该系统可以初步检测抑制物库中化合物是否具有抗病毒作用。

高通量筛选抗呼吸道合胞病毒的药物：mCherry基因的表达没有物种、细胞的专一性，非常适合用于抗病毒药物的高通量筛选以及病毒复制与致病机制的研究。利用反向遗传学技术可将荧光蛋白基因序列插入到病毒的基因组中，组成重组病毒，重组病毒则会携带荧光标记或者在感染细胞中释放荧光信号，这既可以对病毒进行实时追踪，完成对病毒感染细胞的过程的观察，同时也可以为抗病毒药物筛选的研究提供帮助。构建带mCherry红色荧光蛋白的RSV重组病毒，RSV感染细胞24h后在倒置荧光显微镜下观察到红色荧光，根据红色荧光的强弱判断病毒复制的情况。

mCherry荧光筛选抗RSV病毒的药物：mCherry基因插入RSV病毒基因组中，RSV的感染可由mCherry表达水平来定量。通过倒置荧光显微镜定量分析mCherry基因的表达。利用软件ImageJ可以将病毒量化。以DMSO组作为对照组，其他组都与DMSO组相比较。

筛选结果如图1所示。根据筛选结果发现5、22、32、33、34、35、37、40、57、67、72、97、103、126、131等化合物具有较明显的抑制效果，经查阅相关文献后发现，22、33、34、35、37、40、126等化合物已经有关于对RSV复制抑制的相关报道，因此我们选择了一些对RSV病毒具有较明显的抑制作用的化合物且目前尚未有与RSV相关报道的化合物5、32、57、67、72、97、103、131号进行验证，选择已经有相关报道的22号和126号进行验证我们的实验结果与相关报道的结果是否具有一致性。

(2)从前面的实验中，我们选取了5、22、32、57、67、72、97、103、126、131号化合物检测对RSV感染HEP-2细胞的效果(图2A)。在HEP-2细胞中感染RSV，然后加入各小分子药物，病毒感染48h后收集细胞，检测病毒RNA和蛋白的表达(图2B和图2C，图B中浓度单位为μmol)。我们发现了多种化合物抑制RSV病毒M2-2蛋白效果显著(表1)，因此选取其中抑制RSV复制效果较为显著稳定，且从未有过报道的5号化合物进行研究。

表1有效抑制RSV病毒的化合物信息

实施例2 5号化合物D-地衣酸抗RSV病毒作用的验证

通过CCK-8试剂盒检测D-地衣酸(图3A)对细胞毒性的影响，我们选择无细胞毒性的药物浓度研究5号化合物的抗病毒作用(图3B)。在HEP-2细胞中首先加入5号化合物，然后感染RSV，RT-PCR检测发现5号化合物显著抑制了病毒的RNA并呈剂量依赖性(图3D)。为了验证5号化合物在其他细胞系中有无抗病毒作用，我们在感染RSV的RAW267.5细胞中发现加入5号化合物可以显著抑制RSV的复制(图3E-F)。图3C的荧光图也证实了5号化合物对RSV的复制是有抑制作用的。同时我们在Balb/c小鼠体内进行了验证，5号化合物能够明显降低小鼠体内的病毒载量(图G)，并检测IL-6、IL-8、IL-10、INF-β、TLR-3、TNF-a等细胞因子表达水平降低(图H)。在小鼠肺组织的病理变化中，正常对照组小鼠肺组织形态正常(图4,a)，病毒组小鼠肺组织肺泡大小不均匀，结构被严重破坏(图4，b)，5号化合物加药组较病毒组肺组织结构损伤有所缓解，肺间隙炎症细胞浸润较病毒组也有明显的改善(图4,c)这些实验充分显示，5号化合物具有明显抑制病毒复制的作用。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.右旋地衣酸在制备抗呼吸道合胞病毒感染产品中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品的形式包括药物。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品用于预防或治疗呼吸道合胞病毒感染。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品用于抑制呼吸道合胞病毒的复制。

5.一种抗病毒药物，其特征在于，所述抗病毒药物中含有右旋地衣酸。

6.根据权利要求5所述的抗病毒药物，其特征在于，所述病毒包括呼吸道合胞病毒。

7.根据权利要求5所述的抗病毒药物，其特征在于，所述抗病毒药物的剂型包括片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、散剂、口服液体剂、注射剂、吸入剂。

8.根据权利要求7所述的抗病毒药物，其特征在于，溶液剂型中，右旋地衣酸的浓度不低于1μmol。

9.根据权利要求5所述的抗病毒药物，其特征在于，所述抗病毒药物由0.1-100％的右旋地衣酸和99.9-0％的药用辅料组成。

10.根据权利要求9所述的抗病毒药物，其特征在于，所述药用辅料包括填充剂、黏合剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、润湿剂、泡腾剂、着色剂、甜味剂、芳香剂、防腐剂、分散剂、成膜剂、增塑剂、致孔剂、遮光剂、阻滞剂、溶剂中的至少一种。