CN114796256B - 环腺苷酸类化合物在制备抗寨卡病毒药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种环腺苷酸类化合物在制备抗黄病毒或抗寨卡病毒药物中的应用。所述环腺苷酸类化合物包括如下化合物中的一种：本发明首次提出环腺苷酸类化合物在制备抗黄病毒及抗寨卡病毒药物中的应用。当8‑溴环腺苷酸钠盐浓度为0.2512mM时，其对寨卡病毒的抑制率达到50％及以上，具有意想不到的技术效果，具有较好的临床应用前景。
Description
技术领域
本发明专利涉及药物技术领域，尤其是指8-溴环腺苷酸(8-Br-cAMP)在制备抗寨卡病毒感染药物中的应用。
背景技术
寨卡病毒(Zika virus，简称ZIKV)是黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属(Flavivirus)的成员之一，也是引起新生儿小头症和吉兰-巴雷综合征的最主要病原体。自1947年首次报道以来，ZIKV相关的感染性疾病已在世界范围内多次爆发与流行。目前，对于病毒性疾病的预防和治疗主要依靠疫苗和药物。然而，尚未有预防ZIKV感染的疫苗上市，并且针对ZIKV感染性疾病的治疗方法也相当有限。主要治疗手段为对症治疗、支持治疗和广谱抗病毒疗法，但是这些方法疗效有限，个体疗效差异较大，且难以推广。因此，开发特异有效的抗ZIKV药物势在必行。
环腺苷酸(cyclic AMP，cAMP)是一种具有生物活性的有机小分子化合物，它是在人体内广泛存在的一种具有生理活性的重要物质，对糖、脂肪、核酸、蛋白质的合成、代谢调节等起着重要的作用。cAMP是细胞信号传导中一种重要的第二信使，也是蛋白酶的激活剂。进入细胞的环腺苷酸在发挥生物学效应后被磷酸二酯酶降解成5-腺苷-5′-磷酸(5-AMP)失去活性，进而被分解成腺苷和磷酸。环腺苷酸药物可以促进体内心肌细胞的存活，增强心肌细胞抗损伤、抗缺血和缺氧能力；促进钙离子向心肌细胞内流动，增强磷酸化作用，促进兴奋-收缩偶联，提高心肌细胞收缩力，增加心输出量，改善心功能。因此，cAMP对心脏有着营养心肌、正性肌力、舒张血管和抗心律失常的作用。在治疗心功能不全、心绞痛和心肌梗死等方面效果良好。
综上所述，开发特异有效的抗ZIKV药物很有必要，另外基于环腺苷酸在人体内的重要作用，其适应症还有待进一步挖掘。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题之一，在本发明的第一方面，本发明提供一种环腺苷酸类化合物在制备抗黄病毒药物中的应用。
本发明还提供一种环腺苷酸类化合物在制备抗寨卡病毒药物中的应用。
在本发明的技术方案中，所述环腺苷酸类化合物包括如下化合物：
式2所示化合物、式3所示化合物是式1所示化合物的衍生物，三者有着相似的化学结构，均有抗黄病毒的功能基团，因此，能引发相似的细胞反应。因而，式2所示化合物、式3所示化合物也有制备抗黄病毒药物的潜力。
式1所示化合物为环腺苷酸，简称cAMP；式2所示化合物为8-溴环腺苷酸钠盐，简称8Br-cAMP；式3所示化合物简称Db-cAMP。
优选地，所述环腺苷酸类化合物为式2所示化合物。
在本发明的技术方案中，当式2所示化合物浓度为0.2512mM时，其对寨卡病毒的抑制率达到50％及以上。8-Br-cAMP是在cAMP基础上加入溴原子，以此来增强药物入胞后的稳定性。然而目前8-Br-cAMP的抗黄病毒作用，包括对于ZIKV的抑制作用却未见报道。
在本发明的第二方面，本发明提供一种药物组合物在制备抗黄病毒药物中的应用，所述药物组合物的活性成分包括如下化合物：
优选地，黄病毒包括寨卡病毒。
优选地，所述药物组合物添加药剂学可接受的辅料和载体，制备成药物制剂，所述辅料包括填充剂、崩解剂、粘合剂、赋形剂、稀释剂、润滑剂、甜味剂和着色剂中的至少一种。
优选地，药物制剂选自颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊剂、注射剂中的一种。
在本发明的第三方面，本发明提供一种8-溴环腺苷酸或其药用盐在制备抗寨卡病毒药物中的应用。
本发明对8-溴环腺苷酸钠盐对ZIKV的抑制活性进行评估，通过标准的病毒活性测试方法对其进行活性测试。经过大量生物学实验，发现8-溴环腺苷酸钠盐(8-Br-cAMPsodium salt)具有较好抑制ZIKV入侵和复制的过程，具体表现为可以抑制ZIKV进入细胞和抑制在细胞内的复制增殖。由此可见，8-溴环腺苷酸钠盐对于ZIKV等黄病毒有抑制作用。
与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：
1、本发明首次发现8-溴环腺苷酸钠盐在制备抗黄病毒及抗寨卡病毒药物中的应用。现有技术中，环腺苷酸一直作为用于治疗心脏疾病的化合物，本发明首次发现环腺苷酸及其衍生物在制备治疗ZIKV感染性疾病药物和其他病毒感染性疾病药物的新用途。试验结果表明，8-溴环腺苷酸钠盐对于ZIKV具有较强的抗病毒活性，可以显著的抑制ZIKV在宿主细胞A549上产生的细胞病变效应(CPE)，增加细胞存活率；能抑制ZIKV病毒的复制；在细胞水平表现出较强的抗病毒效果，当8-溴环腺苷酸钠盐浓度为0.2512mM时，其对寨卡病毒的抑制率达到50％及以上，具有意想不到的技术效果。本发明结果表明8-溴环腺苷酸钠盐及相关化合物可用于制备抗ZIKV等黄病毒感染的特异治疗药物，且这些药物具有较好的临床应用前景。
2、本发明所述的8-溴环腺苷酸钠盐及其类化合物属于小分子化合物，合成工艺简单，易于大规模生产推广。
3、从与8-溴环腺苷酸结构相似的化合物中寻找抗ZIKV的药物，易于通过构效关系研究寻找到其作用靶点，为进一步的药物开发提供一定的借鉴意义。
附图说明
图1为本发明实施例1中8-溴环腺苷酸钠盐对于ZIKV作用的A549细胞毒性检测结果分析图；
图2为本发明实施例2中8-溴环腺苷酸钠盐对于寨卡病毒在宿主A549细胞产生的细胞病变效应(CPE)影响结果图；
图3为本发明实施例2中不同浓度8-溴环腺苷酸钠盐的抗病毒活性检测结果分析图；
其中，图3A为8-溴环腺苷酸钠盐抗寨卡病毒实验(全时间加药)的示意图；图3B为8-溴环腺苷酸钠盐对寨卡病毒的抑制效果图；图3C为免疫印迹的实验结果图；图3D为细胞内8-溴环腺苷酸钠盐抗寨卡病毒的效果图；图3E为上清中8-溴环腺苷酸钠盐抗寨卡病毒的效果图；图3F为不同浓度8-溴环腺苷酸钠盐对于寨卡病毒在宿主A549细胞产生的细胞病变效应的影响效果图；图3G为不同浓度8-溴环腺苷酸钠盐抗寨卡病毒作用的免疫荧光图。
图4为本发明实施例3中8-溴环腺苷酸钠盐作为抗病毒药物的安全有效性结果分析图；
图5为本发明实施例4中8-溴环腺苷酸钠盐对于ZIKV复制的影响检测结果分析图；
其中，图5A为8-溴环腺苷酸钠盐抗寨卡病毒实验(感染后加药)示意图；图5B为免疫印迹的实验结果；图5C为细胞内8-溴环腺苷酸钠盐抗寨卡病毒的效果；图5D为上清中8-溴环腺苷酸钠盐抗寨卡病毒的效果；图5E为使用免疫印迹实验检测不同浓度8-溴环腺苷酸钠盐的抗病毒效果图；图5F为细胞样中的不同浓度8-溴环腺苷酸钠盐的抗病毒效果图；图5G为上清样中的不同浓度8-溴环腺苷酸钠盐的抗病毒效果图。
图6为本发明实施例5中8-溴环腺苷酸钠盐对于ZIKV入侵的影响检测结果分析图；
其中，图6A为8-溴环腺苷酸钠盐抗寨卡病毒实验(进入阶段加药)示意图；图6B为免疫印迹的实验结果；图6C为细胞内8-溴环腺苷酸钠盐抗寨卡病毒的效果；图6D为上清中8-溴环腺苷酸钠盐抗寨卡病毒的效果；图6E为使用免疫印迹实验检测不同浓度8-溴环腺苷酸钠盐的抗病毒效果图；图6F为细胞样中的不同浓度8-溴环腺苷酸钠盐的抗病毒效果图；图6G为上清样中的不同浓度8-溴环腺苷酸钠盐的抗病毒效果图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。使用的方法如无特别说明，均为本领域公知的常规方法，使用的耗材和试剂如无特别说明，均为市场购得。除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。
以下实施例中，结合病毒RNA水平分析，滴度测定和MTT测定细胞存活率检测方法，对8-溴环腺苷酸钠盐进行抗ZIKV活性研究实验，实施例中的数据分析采用GraphPad 7.0软件进行统计分析。可以理解的是，以8-溴环腺苷酸为先导化合物进行进一步结构优化，用于制备治疗寨卡病毒感染性疾病药物也属于本发明想要保护的范围。
实施例1 8-溴环腺苷酸钠盐的细胞毒性检测
在A549细胞中，对8-溴环腺苷酸钠盐的细胞毒性进行检测，试验过程如下：将A549细胞接种于96孔板中，在37℃，5％CO2培养箱中培养12～16h后，弃去细胞培养液，分别添加不同浓度(0.15、0.3、0.6、1.2、2.4mM)8-溴环腺苷酸的细胞维持液继续培养，每组3个复孔，对照组加等量的PBS。作用48h后用MTT染色，检测OD 490nm，分析细胞存活率。
检测结果如图1所示，由图中结果分析：Prism7软件计算药物对于细胞的半数中毒浓度(Median cyctoxic concentration，CC50)，8-溴环腺苷酸钠盐的CC50为10.22mM。因此，后续实施案例中，8-Br-cAMP使用的最大浓度为1.2mM，处于安全无毒性范围内。
实施例2 8-溴环腺苷酸钠盐对ZIKV的抗病毒活性检测
8-溴环腺苷酸钠盐对ZIKV的抗病毒活性检测，试验过程如下：将A549细胞接种到6孔板细胞培养板，在37℃，5％CO2培养箱培养12～16h后，使用不同浓度(0.15、0.3、0.6、1.2、2.4mM)的8-溴环腺苷酸进行预处理，然后加入MOI＝1的ZIKV感染细胞1h，接着使用含对应浓度的8-溴环腺苷酸的细胞维持液进行处理，阴性对照加入同体积PBS。显微镜下观察细胞病变效应(CPE)，利用免疫荧光法检测病毒感染情况，免疫印迹实验检测病毒蛋白的表达水平。利用RT-qPCR方法做绝对定量检测药物对ZIKV的抑制率。具体步骤为：每孔加入MTT50μl(5mg·ml-1)，孵育4～6h后去掉上清液，加入等体积的DMSO溶解沉淀。用酶标仪在492nm处读取所对应的吸光度(OD492值)。
8-溴环腺苷酸钠盐抑制ZIKV引起的A549细胞CPE效应如图2所示，由图中结果分析：ZIKV感染的A549细胞变圆，从细胞板壁脱离，不同浓度的实验化合物处理对于其病变效应有显著的抑制作用。实验化合物可以抑制病毒拷贝数的增加，且其抑制效果呈现出剂量依赖性。在蛋白水平的检测结果也表现出对ZIKV的抑制效果。免疫荧光法结果显示，药物处理组的病毒蛋白荧光强度均低于病毒对照组，而且随着药物处理组给药浓度的升高，对应病毒的荧光强度也随之下降。RT-qPCR检测结果如图3所示，其中，图3A为8-溴环腺苷酸钠盐抗寨卡病毒实验(全时间加药)的示意图；图3B为8-溴环腺苷酸钠盐对寨卡病毒的抑制效果图；图3C为免疫印迹的实验结果；图3D为细胞内8-溴环腺苷酸钠盐抗寨卡病毒的效果图；图3E为上清中8-溴环腺苷酸钠盐抗寨卡病毒的效果图；图3F为不同浓度8-溴环腺苷酸钠盐对于寨卡病毒在宿主A549细胞产生的细胞病变效应(CPE)；图3G为不同浓度8-溴环腺苷酸钠盐抗寨卡病毒作用的免疫荧光图。由图3B可知，使用8-溴环腺苷酸钠盐药物全时间处理细胞，对寨卡病毒有抑制效果；使用GraphPad 7.0软件计算药物的半数有效浓度(Concentration for 50％of maximal inhibit，IC50)，8-溴环腺苷酸钠盐的IC50为0.2512mM。由图3C可知，8-Br-cAMP抑制了寨卡病毒E蛋白的表达。由图3D和3E可知，8-Br-cAMP降低了寨卡病毒在细胞内和上清中的拷贝数。由图3F可知，不同浓度的8-Br-cAMP处理可以抑制寨卡病毒引起的细胞病变，并呈现剂量依赖效果。由图3G可知，不同浓度的8-Br-cAMP处理可以减低寨卡病毒的荧光强度，并呈现剂量依赖效果。综上，使用8-溴环腺苷酸钠盐药物全时间处理细胞，对寨卡病毒有抑制效果。
实施例3 8-溴环腺苷酸钠盐作为抗病毒药物的安全有效性分析
8-溴环腺苷酸钠盐作为抗病毒药物的安全有效性分析，试验过程如下：将A549细胞接种于12/6孔板细胞培养板中，于37℃，5％CO2培养箱中培养12～16h，使用含有不同浓度(0.075、0.15、0.3、0.6、1.2mM)的8-溴环腺苷酸钠盐预处理细胞1h，接着加入MOI＝1的ZIKV液感染1h后，然后使用含有对应浓度的8-溴环腺苷酸钠盐的细胞维持液进行处理，阴性对照加入同体积PBS。处理24h后，通过RT-qPCR检测抑制病毒增殖的效果。
根据绝对定量法所得病毒拷贝数计算不同浓度8-Br-cAMP对ZIKV的抑制率，通过GraphPad 7.0对所得药物对病毒的抑制率进行非线性回归分析。选择性指数(Selectivityindex，SI)是用于判断药物效果安全范围的参考指数，其体外实验的数值等于CC50/EC50的比值,当选择性指数大于1以上即视为该药物有效，指数值越大表示该药物的安全性越大。
结果分析：8-溴环腺苷酸钠盐作为抗病毒药物的安全有效性分析结果如图4所示，由图可知，结合实施例1中8-溴环腺苷酸钠盐的细胞毒性实验结果(CC50＝10.22mM)可计算出8-Br-cAMP的选择指数为40.68，该结果进一步说明了8-Br-cAMP在抑制ZIKV方面具有较大安全性和有效性。
实施例4 8-溴环腺苷酸钠盐对ZIKV复制的影响
8-溴环腺苷酸钠盐对ZIKV复制的影响，试验过程如下：将A549细胞接种于12孔板细胞培养板中，于37℃，5％CO2培养箱中培养12～16h，用MOI＝1的ZIKV液感染1h后，使用含有不同浓度(0.075、0.15、0.3、0.6、1.2mM)的8-溴环腺苷酸钠盐的细胞维持液进行处理进行处理，阴性对照加入同体积PBS，孵育24h后收样，通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法检测8-溴环腺苷酸钠盐抑制病毒复制的效果。
结果分析：检测结果如图5所示，图中，其中，图5A为8-溴环腺苷酸钠盐抗寨卡病毒实验(感染后加药)示意图；图5B为免疫印迹的实验结果；图5C为细胞内8-溴环腺苷酸钠盐抗寨卡病毒的效果；图5D为上清中8-溴环腺苷酸钠盐抗寨卡病毒的效果；图5E为使用免疫印迹实验检测不同浓度8-溴环腺苷酸钠盐的抗病毒效果图；图5F为细胞样中的不同浓度8-溴环腺苷酸钠盐的抗病毒效果图；图5G为上清样中的不同浓度8-溴环腺苷酸钠盐的抗病毒效果图。
由图5B可知，8-Br-cAMP抑制了寨卡病毒E蛋白和NS1蛋白的表达。由图5C和图5D可知，8-Br-cAMP降低了寨卡病毒在细胞内和上清中的拷贝数，图5E表明不同浓度的8-溴环腺苷酸钠盐对寨卡病毒的复制均有显著抑制作用，且呈剂量依赖的效应。
由实验结果可知，8-溴环腺苷酸钠盐对于ZIKV有较好的抑制活性。
实施例5 8-溴环腺苷酸钠盐对于ZIKV入侵的影响检测
8-溴环腺苷酸钠盐对ZIKV入侵的影响，试验过程如下：将A549细胞接种于12孔板细胞培养板中，于37℃，5％CO2培养箱中培养12～16h，用MOI＝1的ZIKV液感染1h后，使用含有不同浓度(0.075、0.15、0.3、0.6、1.2mM)的8-溴环腺苷酸钠盐的细胞维持液处理1h后弃去上清，加入不含药物的细胞维持液进行处理，阴性对照加入同体积PBS，孵育24h后收样，通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法检测8-溴环腺苷酸钠盐抑制病毒复制的效果。
结果分析：检测结果如图6所示，图中，图6A为8-溴环腺苷酸钠盐抗寨卡病毒实验(进入阶段加药)示意图；图6B为免疫印迹的实验结果；图6C为细胞内8-溴环腺苷酸钠盐抗寨卡病毒的效果；图6D为上清中8-溴环腺苷酸钠盐抗寨卡病毒的效果；图6E为使用免疫印迹实验检测不同浓度8-溴环腺苷酸钠盐的抗病毒效果图；图6F为细胞样中的不同浓度8-溴环腺苷酸钠盐的抗病毒效果图；图6G为上清样中的不同浓度8-溴环腺苷酸钠盐的抗病毒效果图。图6A为入侵阶段处理8-Br-cAMP的示意图，图6B为8-Br-cAMP抑制了寨卡病毒E蛋白和NS1蛋白的表达。图6C和图6D表明8-Br-cAMP降低了寨卡病毒在细胞内和上清中的拷贝数，图6E表明不同浓度的8-溴环腺苷酸钠盐对寨卡病毒的复制均有显著抑制作用，且呈剂量依赖的效应。
综上所述，8-溴环腺苷酸钠盐可显著的抑制ZIKV复制的活性，可以明显抑制ZIKV引起的A549细胞病变效应，增加细胞存活率；抑制病毒的复制，有潜力进一步开发为一种临床上有效对抗ZIKV等黄病毒感染的药物。
本发明通过上述实施例证实8-溴环腺苷酸钠盐在抗ZIKV等黄病毒中的作用，8-溴环腺苷酸或其药用盐能够抑制ZIKV在宿主细胞A549产生的细胞病变效应(CPE)，增加细胞存活率；抑制ZIKV在细胞内的复制增殖，有潜力发展成为有效治疗ZIKV感染的药物。本发明进一步提供8-溴环腺苷酸钠盐在制备抗ZIKV等黄病毒感染药物中的应用，所述应用还包括8-溴环腺苷酸或其钠盐添加药剂学可接受的辅料和载体，用于制备抗ZIKV等黄病毒感染的药物制剂，辅料包括填充剂、崩解剂、粘合剂、赋形剂、稀释剂、润滑剂、甜味剂或着色剂中的至少一种，根据药物剂型的需要选择不同的辅料。所述制剂是颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊剂、注射剂或分散剂。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (6)
1.一种环腺苷酸类化合物在制备抗寨卡病毒药物中的应用，其特征在于，所述环腺苷酸类化合物结构如下所示：
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，当式2所示化合物浓度为0.2512mM时，对寨卡病毒的抑制率达到50％及以上。
3.一种药物组合物在制备抗寨卡病毒药物中的应用，其特征在于，所述药物组合物的活性成分包括如下化合物：
4.根据权利要求3所述的应用，所述药物组合物添加药剂学可接受的辅料和载体，制备成药物制剂，所述辅料包括填充剂、崩解剂、粘合剂、赋形剂、稀释剂、润滑剂、甜味剂和着色剂中的至少一种。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述药物制剂选自颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊剂、注射剂中的一种。
6.一种8-溴环腺苷酸或其药用盐在制备抗寨卡病毒药物中的应用。
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