CN113521286A - 冠状病毒蛋白酶抑制剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

提供一种针对冠状病毒蛋白酶的抑制剂及其用途。本发明通过构建新的冠状病毒NSP5蛋白酶抑制剂筛选系统，鉴定了一类能够抑制NSP5蛋白酶活性的小分子化合物，这些化合物通过抑制β冠状病毒的主要蛋白酶活性，使病毒复制相关的酶与蛋白不能产生，从根本上阻止了病毒的形成。

Description

冠状病毒蛋白酶抑制剂及其应用
技术领域
本发明涉及病毒蛋白酶抑制剂，尤其是针对冠状病毒蛋白酶的一类抑 制剂及其用途。
背景技术
冠状病毒是具有囊膜的正链RNA病毒，能够感染鸟类和哺乳类动物， 并引起相关的疾病。其中，新型冠状病毒(SARS-CoV2)、严重呼吸道综 合征病毒(SARS virus)和中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus，MERS-CoV)均属于冠状病毒科β 冠状病毒属，它们在本世纪对人类生命健康造成严重的威胁。2019年底 爆发的新型冠状病毒感染引起患者发生肺炎及其他相关症状，被命名为 2019冠状病毒病(COVID19)，其中,“CO”代表Corona(冠状),“VI” 代表Virus(病毒),“D”代表Disease(疾病),“19”代表疾病发现的年份2019 年。目前COVID19已导致超过一亿人感染，数百万人死亡。至今，临床 上尚无特效药物对上述病毒引起的疾病进行有效治疗。
冠状病毒编码的病毒蛋白分为结构蛋白(structural protein)和非结 构蛋白(NSP，nonstructural protein)。结构蛋白与病毒RNA共同形成 冠状病毒颗粒，非结构蛋白主要参与冠状病毒在细胞中的复制。冠状病毒 的药物靶点主要针对病毒复制相关的酶，例如冠状病毒RNA聚合酶 (NSP12)以及蛋白酶(NSP3和NSP5)。尽管针对冠状病毒RNA聚合 酶(NSP12)的抑制剂瑞德西韦(Remdesivir)已被紧急用于新冠病毒导 致肺炎的临床治疗，但其治疗效果有限。β冠状病毒编码两个蛋白酶，分 别是NSP3木瓜样蛋白酶(Papain-likeprotease,PLpro)和NSP5主要蛋 白酶(Main protease,Mpro，也称为Chymotrypsin-likeprotease， 3CLpro,3C样蛋白酶)。冠状病毒基因组首先被翻译成两种多聚蛋白pp1a
至今还没有开发出针对冠状病毒主要蛋白酶(Main protease)的抑 制剂作为药物用于临床治疗冠状病毒导致的肺炎。已有一些研究针对 NSP5主要蛋白酶开展抑制剂的筛选或鉴定，但这些筛选通常是将冠状病 毒NSP5蛋白酶进行原核表达并纯化蛋白，在体外建立酶活检测平台，利 用蛋白酶对底物多肽的切割活性检测蛋白酶功能，并基于此平台筛选抑制 其酶活的小分子化合物；或基于已知的NSP5蛋白酶的晶体结构进行分子 模拟，设计小分子候选药物。然而，上述方法存在重大缺陷，即病毒在体 内复制时，多个病毒蛋白会形成蛋白复合物，当NSP5蛋白酶与其他病毒 蛋白相互作用时，其构象会受到其他相互作用蛋白影响而发生改变，从而 改变其底物识别的特异性和酶活性。上述方法仅利用NSP5蛋白酶自身在 体外进行抑制剂筛选，并未考虑其他病毒非结构蛋白对NSP5构象和活性 的影响，极有可能由于NSP5自身在体外的构象与酶活与体内形成复合体 时的构象和酶活不一致而导致体外筛选出的抑制剂在体内抑制效果并不 理想，不能发展成有效的治疗药物。鉴于此，急需建立一种新的筛选平台， 该平台需要充分考虑NSP5相互作用蛋白对NSP5蛋白酶特异性和活性的 影响。并利用该平台筛选有效的NSP5主要蛋白酶的抑制剂，用于冠状病毒引起的疾病的治疗。
发明内容
为了解决上述筛选方法的缺陷，发明人经过巧妙设计，建立了一套新 的冠状病毒NSP5蛋白酶抑制剂筛选系统，用于寻找冠状病毒NSP5蛋白 酶的小分子抑制剂，并鉴定了若干抑制NSP5蛋白酶活性的小分子化合物。 这些化合物能有效抑制β冠状病毒的NSP5主要蛋白酶的活性，有望发展 成为冠状病毒临床治疗的药物。
新型冠状病毒SARS-CoV2的NSP5蛋白酶氨基酸序列(SEQ ID NO: 1)如下：
1 SGFRKMAFPS GKVEGCMVQV
21 TCGTTTLNGL WLDDVVYCPR
41 HVICTSEDML NPNYEDLLIR
61 KSNHNFLVQA GNVQLRVIGH
81 SMQNCVLKLK VDTANPKTPK
101 YKFVRIQPGQ TFSVLACYNG
121 SPSGVYQCAM RPNFTIKGSF
141 LNGSCGSVGF NIDYDCVSFC
161 YMHHMELPTG VHAGTDLEGN
181 FYGPFVDRQT AQAAGTDTTI
201 TVNVLAWLYA AVINGDRWFL
221 NRFTTTLNDF NLVAMKYNYE
241 PLTQDHVDIL GPLSAQTGIA
261 VLDMCASLKE LLQNGMNGRT
281 ILGSALLEDE FTPFDVVRQC
301 SGVTFQ
新型冠状病毒SARS-CoV2的NSP5与严重呼吸道综合征病毒(SARS coronavirus)的NSP5在氨基酸序列上具有96％的一致性，与中东呼吸 综合征冠状病毒NSP5在氨基酸序列上具有80％的一致性。因此，能够 抑制新型冠状病毒NSP5活性的化合物也很有可能作用于严重呼吸道综 合征病毒和中东呼吸综合征冠状病毒。
本发明提供如下技术方案：
发明人经研究发现，冠状病毒NSP4蛋白与NSP5蛋白在体内具有相 互作用。NSP4蛋白是多跨膜蛋白，定位于胞浆，参与病毒复制，具体功 能尚不明确。NSP5蛋白单独表达时定位于胞浆和细胞核中。如果将NSP4 与NSP5融合表达(融合蛋白命名为NSP45)，NSP4和NSP5蛋白具有共 定位，主要定位于细胞浆中，这与已知冠状病毒在细胞浆复制的认知是一 致的。由于冠状病毒非结构蛋白NSP4与NSP5就是由NSP5蛋白酶进行 切割进而产生独立的NSP4和NSP5蛋白，NSP4和NSP5之间存在天然 的NSP5蛋白酶识别切割位点，例如TSAVLQSGFR。这样，根据这一原 理设计的NSP45融合蛋白自身即可作为NSP5蛋白酶的底物被NSP5蛋 白酶切割，形成两个独立的病毒蛋白NSP4和NSP5(图1，箭头为切割 位点)。如果在蛋白表达体系中加入抑制剂，能够抑制NSP5蛋白酶活性， 不发生切割，获得的是未切割的分子量较大的NSP45融合蛋白。NSP4 蛋白具有多个跨膜区，如果用全长NSP4在大肠杆菌和细胞中表达非常低， 很难检测，尤其在细胞中，基本检测不到。发明人经过多次试验，表达了 一系列NSP4蛋白N端缺失突变体，发现缺失NSP4 N端270个氨基酸的 NSP45蛋白能在细菌和细胞中较好地表达，适合用于融合蛋白的构建和 其后的活性检测。
在第一方面，本发明提供一种冠状病毒蛋白酶抑制剂，其是caspase 抑制剂并显示出抑制冠状病毒蛋白酶的活性。
如第一方面所述的抑制剂，其不是已知具有抑制冠状病毒蛋白酶活性 的caspase抑制剂。已知具有抑制冠状病毒蛋白酶活性的caspase抑制剂， 是指在本发明之前现有技术已知的具有抑制冠状病毒蛋白酶活性的 caspase抑制剂。
如第一方面所述的抑制剂，其具有通式(I)所示的结构，
P-(X)n-FMK (I)
其中，P是氢或氨基保护基，X是各自独立的任意氨基酸，n是1-20、 1-15、1-10或1-5的整数，例如n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、 11、12、13、14、15、16、17、18、19或20，FMK(fluoromethylketone) 是氟甲基酮基团，其中当n不是1时(X)n是n个各自独立的氨基酸构成的 肽段，并且C端氨基酸与FMK一起形成氟甲基酮结构。
优选地，P是氨基保护基，例如烷基氧羰基，优选地选自甲氧羰基、 乙氧羰基、苯甲氧羰基(Cbz)、叔丁氧羰基(tBoc)、芴氧羰基(Fmoc)、 烯丙氧羰基(Alloc)和TMS乙氧羰基(Teoc)，例如是苯甲氧羰基或叔 丁氧羰基。
更优选的，所述的抑制剂选自Z-FA-FMK，BOC-D-FMK、 Z-VAD-FMK、Z-YVAD-FMK、Z-IETD-FMK和Z-DEVD-FMK，其中Z 是苯甲氧羰基，BOC是叔丁氧羰基。
如第一方面所述的抑制剂，其中所述抑制剂进一步与具有特异性结合 冠状病毒能力的分子共价或非共价连接，优选地所述具有特异性结合冠状 病毒能力的分子是冠状病毒蛋白的抗体，例如是冠状病毒结构或非结构蛋 白，如表面蛋白，具体地，例如S蛋白的抗体。
优选地，其中所述具有特异性结合冠状病毒能力的分子是 ACE2(Angiotensin-converting enzyme 2)，更优选地，是ACE2的胞外区。
优选地，所述抑制剂通过取代式(I)中的基团P进一步与具有特异 性结合冠状病毒能力的分子共价连接，优选地，所述基团P与所述具有特 异性结合冠状病毒能力的分子通过接头共价连接。
如第一方面所述的抑制剂，其中所述冠状病毒是冠状病毒科β冠状病 毒属病毒，例如是SARS-CoV-2、SARS-CoV或MERS-CoV，具体地所 述蛋白酶是NSP5蛋白酶，优选地选自SARS-CoV-2NSP5蛋白酶、 SARS-CoV NSP5蛋白酶和MERS NSP5蛋白酶，特别是SARS-CoV-2NSP5蛋白酶。
本发明的第二方面提供一种药物组合物，其包含如第一方面所述的抑 制剂，以及药学上可接受的载体。
本发明的第三方面提供一种抑制冠状病毒蛋白酶活性的方法，其包括 使所述冠状病毒蛋白酶与第一方面所述抑制剂或第二方面所述药物组合 物相接触。
本发明的第四方面提供一种治疗冠状病毒感染或冠状病毒所致疾病 的方法，其包括向有此需要的对象施用如第一方面所述的抑制剂或如第二 方面所述的药物组合物。还提供如第一方面所述的抑制剂或如第二方面所 述的药物组合物在制备治疗冠状病毒感染或冠状病毒所致疾病的药物中 的用途。还提供用于治疗冠状病毒感染或冠状病毒所致疾病的抑制剂或药 物组合物。
如第四方面所述的方法，其中所述冠状病毒所致疾病选自新型冠状病 毒(SARS-CoV-2)所致疾病、严重呼吸道综合征病毒(SARS-CoV)所 致疾病和中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)所致疾病，优选为新 型冠状病毒所致疾病或严重呼吸道综合征病毒所致疾病，更优选为新型冠 状病毒所致疾病。
本发明的第五方面提供一种筛选病毒蛋白酶抑制剂的方法，包括
1)提供所述病毒蛋白酶及其底物，所述底物包含所述病毒蛋白酶的 识别切割位点；
2)使步骤1)所述病毒蛋白酶及其底物与候选物质相接触；和
3)检测病毒蛋白酶切割前底物的减少和/或切割后产物的出现和/或增 加。
如第五方面所述的方法，其中所述病毒蛋白酶及其底物位于一条多肽 链上以融合蛋白的形式存在。
如第五方面所述的方法，其中步骤1)的底物是所述蛋白酶在自然状 态下的底物，所述底物与所述蛋白酶具有相互作用。
如第五方面所述的方法，其中所述病毒蛋白酶是冠状病毒蛋白 酶，具体地所述病毒蛋白酶是NSP5蛋白酶，优选地选自新型冠状病毒NSP5蛋白酶、严重呼吸道综合征病毒NSP5蛋白酶和中东呼吸综合征冠 状病毒NSP5蛋白酶，更优选新型冠状病毒NSP5蛋白酶。
附图说明
图1示NSP5蛋白酶自我切割系统。
图2示新型冠状病毒NSP5抑制剂的筛选。Western印迹结果显示切割/ 未切割产物。
图3示SARS病毒NSP5抑制剂的筛选。Western印迹结果显示切割/未切 割产物。
具体实施方式
实施例1新型冠状病毒NSP5抑制剂的筛选
1.材料与试剂
化合物名称及供应商
1)Z-FA-FMK
全称
benzylN-[1-[(4-fluoro-3-oxobutan-2-yl)amino]-1-oxo-3-phenylpropan-2 -yl]carbamate
化学式C21H23FN2O4，购自Selleck公司，货号S7391
2)FMK
全称
1-[4-amino-7-(3-hydroxypropyl)-5-(4-methylphenyl)pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-6-yl]-2-fluoroethanone
化学式C18H19FN4O2，购自MCE公司，货号HY-52101A
3)FMK 9a
全称
N-[(2S)-1-[(3-fluoro-2-oxopropyl)amino]-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]naphthalene-1-carboxamide
化学式C23H21FN2O3，购自MCE公司，货号HY-100522
4)Boc-D-FMK
全称
methyl5-fluoro-3-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]-4-oxopentanoate
化学式C11H18FNO5，购自MCE公司，货号HY-13229
5)Z-VAD-FMK/Z-VAD(OMe)-FMK
全称
methyl(3S)-5-fluoro-3-[[(2S)-2-[[(2S)-3-methyl-2-(phenylmethoxycarbonylamino)butanoyl]amino]propanoyl]amino]-4-oxopentanoate
化学式C22H30FN3O7，购自Selleck公司，货号S7023
6)Z-VAD(OH)-FMK
全称
(3S)-5-fluoro-3-[[(2S)-2-[[(2S)-3-methyl-2-(phenylmethoxycarbonylamino)butanoyl]amino]propanoyl]amino]-4-oxopentanoic acid
化学式C21H28FN3O7，购自Selleck公司，货号S8102
7)Z-YVAD-FMK
全称
methyl(3S)-5-fluoro-3-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-3-(4-hydroxyphenyl)-2-(p henylmethoxycarbonylamino)propanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]ami no]propanoyl]amino]-4-oxopentanoate
化学式C31H39FN4O9，购自MCE公司，货号HY-P1009
8)Z-IETD-FMK
全称
methyl(4S)-5-[[(2S,3R)-1-[[(3S)-5-fluoro-1-methoxy-1,4-dioxopentan-3-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxobutan-2-yl]amino]-4-[[(2S,3S)-3-methyl-2-(phenylmethoxycarbonylamino)pentanoyl]amino]-5-oxopentanoate
化学式C30H43FN4O11，购自Selleck公司，货号S7314
8)Z-LEHD-FMK
全称
methyl(4S)-5-[[(2S)-1-[[(3S)-5-fluoro-1-methoxy-1,4-dioxopentan-3-yl]a mino]-3-(1H-imidazol-5-yl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-4-[[(2S)-4-methyl -2-(phenylmethoxycarbonylamino)pentanoyl]amino]-5-oxopentanoate； 2,2,2-trifluoroacetic acid化学式C34H44F4N6O12，购自Selleck公司， 货号S7313
9)Z-DEVD-FMK
全称
methyl(4S)-5-[[(2S)-1-[[(3S)-5-fluoro-1-methoxy-1,4-dioxopentan-3-yl]a mino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-4-[[(2S)-4-methoxy-4-oxo-2-(phenylmethoxycarbonylamino)butanoyl]amino]-5-oxopentanoate
化学式C30H41FN4O12，购自Selleck公司，货号S7312
2.克隆构建
新冠病毒NSP45融合蛋白核酸分子由北京擎科新业生物有限公司合成，其 核酸序列(SEQ ID NO:2)如下：
1 ATGGATTACA AGGATGACGA CGATAAGCTA ATTCAACCTA TTGGTGCTTT GGACATATCA
61 GCATCTATAG TAGCTGGTGG TATTGTAGCT ATCGTAGTAA CATGCCTTGC CTACTATTTT
121 ATGAGGTTTA GAAGAGCTTT TGGTGAATAC AGTCATGTAG TTGCCTTTAA TACTTTACTA
181 TTCCTTATGT CATTCACTGT ACTCTGTTTA ACACCAGTTT ACTCATTCTT ACCTGGTGTT
241 TATTCTGTTA TTTACTTGTA CTTGACATTT TATCTTACTA ATGATGTTTC TTTTTTAGCA
301 CATATTCAGT GGATGGTTAT GTTCACACCT TTAGTACCTT TCTGGATAAC AATTGCTTAT
361 ATCATTTGTA TTTCCACAAA GCATTTCTAT TGGTTCTTTA GTAATTACCT AAAGAGACGT
421 GTAGTCTTTA ATGGTGTTTC CTTTAGTACT TTTGAAGAAG CTGCGCTGTG CACCTTTTTG
481 TTAAATAAAG AAATGTATCT AAAGTTGCGT AGTGATGTGC TATTACCTCT TACGCAATAT
541 AATAGATACT TAGCTCTTTA TAATAAGTAC AAGTATTTTA GTGGAGCAAT GGATACAACT
601 AGCTACAGAG AAGCTGCTTG TTGTCATCTC GCAAAGGCTC TCAATGACTT CAGTAACTCA
661 GGTTCTGATG TTCTTTACCA ACCACCACAA ACCTCTATCA CCTCAGCTGT TTTGCAGAGT
721 GGTTTTAGAA AAATGGCATT CCCATCTGGT AAAGTTGAGG GTTGTATGGT ACAAGTAACT
781 TGTGGTACAA CTACACTTAA CGGTCTTTGG CTTGATGACG TAGTTTACTG TCCAAGACAT
841 GTGATCTGCA CCTCTGAAGA CATGCTTAAC CCTAATTATG AAGATTTACT CATTCGTAAG
901 TCTAATCATA ATTTCTTGGT ACAGGCTGGT AATGTTCAAC TCAGGGTTAT TGGACATTCT
961 ATGCAAAATT GTGTACTTAA GCTTAAGGTT GATACAGCCA ATCCTAAGAC ACCTAAGTAT
1021 AAGTTTGTTC GCATTCAACC AGGACAGACT TTTTCAGTGT TAGCTTGTTACAATGGTTCA
1081 CCATCTGGTG TTTACCAATG TGCTATGAGG CCCAATTTCA CTATTAAGGGTTCATTCCTT
1141 AATGGTTCAT GTGGTAGTGT TGGTTTTAAC ATAGATTATG ACTGTGTCTCTTTTTGTTAC
1201 ATGCACCATA TGGAATTACC AACTGGAGTT CATGCTGGCA CAGACTTAGAAGGTAACTTT
1261 TATGGACCTT TTGTTGACAG GCAAACAGCA CAAGCAGCTG GTACGGACACAACTATTACA
1321 GTTAATGTTT TAGCTTGGTT GTACGCTGCT GTTATAAATG GAGACAGGTGGTTTCTCAAT
1381 CGATTTACCA CAACTCTTAA TGACTTTAAC CTTGTGGCTA TGAAGTACAATTATGAACCT
1441 CTAACACAAG ACCATGTTGA CATACTAGGA CCTCTTTCTG CTCAAACTGGAATTGCCGTT
1501 TTAGATATGT GTGCTTCATT AAAAGAATTA CTGCAAAATG GTATGAATGGACGTACCATA
1561 TTGGGTAGTG CTTTATTAGA AGATGAATTT ACACCTTTTG ATGTTGTTAGACAATGCTCA
1621 GGTGTTACTT TCCTCGAAGG CGGCGGGGGA GAACAAAAGC TGATATCCGAGGAAGACCTC
1681 GAG
其对应氨基酸序列(SEQ ID NO:3)如下：
1 MDYKDDDDKL IQPIGALDIS
21 ASIVAGGIVA IVVTCLAYYF
41 MRFRRAFGEY SHVVAFNTLL
61 FLMSFTVLCL TPVYSFLPGV
81 YSVIYLYLTF YLTNDVSFLA
101 HIQWMVMFTP LVPFWITIAY
121 IICISTKHFY WFFSNYLKRR
141 VVFNGVSFST FEEAALCTFL
161 LNKEMYLKLR SDVLLPLTQY
181 NRYLALYNKY KYFSGAMDTT
201 SYREAACCHL AKALNDFSNS
Figure BDA0003164535260000111
Figure BDA0003164535260000112
Figure BDA0003164535260000113
Figure BDA0003164535260000114
Figure BDA0003164535260000115
Figure BDA0003164535260000116
Figure BDA0003164535260000117
Figure BDA0003164535260000118
Figure BDA0003164535260000119
Figure BDA00031645352600001110
Figure BDA00031645352600001111
Figure BDA00031645352600001112
Figure BDA00031645352600001113
Figure BDA00031645352600001114
Figure BDA00031645352600001115
Figure BDA00031645352600001116
Figure BDA00031645352600001117
561 E
其中，下划线部分为NSP4(N端缺失270个氨基酸)，方框部分为NSP5 识别位点，双下划线部分为NSP5，N端带有Flag标签，C端带有Myc 标签。该序列命名为Flag-NSP45(COV2)-Myc。
将Flag-NSP45-Myc核酸序列构建入pet28a载体(Novagen)，获得 表达质粒pet28-Flag-NSP45(CoV2)-Myc，经测序鉴定序列正确。然后， pet28-Flag-NSP45(CoV2)-Myc质粒被转化入大肠杆菌BL21感受态细胞 用于蛋白表达及抑制剂筛选。克隆构建、转化实验等按照分子克隆标准操 作进行。
NSP5蛋白酶的第145位半胱氨酸残基位于蛋白酶活性中心，其突变 会影响NSP5蛋白酶活性。因此，在质粒pet28-Flag-NSP45(CoV2)-Myc 中引入点突变NSP45-C145A，构建突变体 pet28-Flag-NSP45-C145A(CoV2)-Myc作为对照，
3.抑制剂的筛选
细菌接种培养：转化了pet28-Flag-NSP45(CoV2)-Myc质粒或 pet28-Flag-NSP45-C145A(CoV2)-Myc的BL21大肠杆菌用LB培养基培 养，37℃震荡培养至OD600为1.0-1.2。
蛋白诱导表达：在培养物中加入IPTG至终浓度0.7mM，诱导目的 蛋白表达，同时，实验组加入不同化合物(终浓度为50uM，溶剂为DMSO) 对照组加入等量的DMSO，继续震荡培养。测试的化合物为：1)DMSO, 2)Z-FA-FMK,3)FMK,4)FMK 9a,5)BOC-D-FMK,6)Z-VAD-FMK,7) Z-VAD(OH)-FMK,8)Z-YVAD-FMK,9)Z-IETD-FMK,10)
Z-LEHD-FMK,11)Z-DEVD-FMK。
收集：37℃诱导2h后，离心菌液，收集菌体沉淀。
制备蛋白样品：用1xSDS蛋白上样缓冲液(Invitrogen)重悬菌体沉 淀，煮沸10分钟。
按照标准操作进行Western免疫印迹实验：使用Myc抗体(MBL 公司)检测NSP45融合蛋白及其切割状况。NSP45融合蛋白的预测分子 量为60KDa，其中NSP5分子量为34KDa。如图2所示，Z-FA-FMK， FMK 9a，BOC-D-FMK，Z-VAD-FMK，Z-YVAD-FMK，Z-IETD-FMK 和Z-DEVD-FMK不同程度地抑制了NSP45的自我切割，在60KDa处有 未切割的大分子条带。其中Z-VAD-FMK具有很强的抑制效应； Z-IETD-FMK和Z-DEVD-FMK具有中等抑制效应；Z-FA-FMK，FMK9a，BOC-D-FMK和Z-YVAD-FMK具有较弱抑制效应。而测试的其他化 合物(FMK，Z-VAD(OH)-FMK，Z-LEHD-FMK)基本不能抑制NSP45 的自我切割，在33KDa处出现明显的NSP5条带，而60KDa处无明显条 带。在DMSO(DMSO不能抑制蛋白酶活性)对照条带中，60KDa处基 本无信号，而在NSP5位置处有明显条带，说明在没有抑制剂的情况下， NSP45融合蛋白基本被完全切割，筛选体系构建成功。
对NSP45的切割活性具有良好的抑制作用的化合物具有以下结构：
Z-VAD-FMK
Figure BDA0003164535260000131
Z-IETD-FMK
Figure BDA0003164535260000141
Z-DEVD-FMK
Figure BDA0003164535260000142
Z-FA-FMK
Figure BDA0003164535260000143
FMK 9a
Figure BDA0003164535260000144
BOC-D-FMK
Figure BDA0003164535260000151
Z-YVAD-FMK
Figure BDA0003164535260000152
体内试验也证实了以上化合物能够在体内抑制NSP5对病毒非结构 蛋白的切割，使病毒无法正常复制，进而抑制了病毒的产生。因此，这些 化合物可以用于制备治疗新型冠状病毒引起疾病的药物。
实施例2严重呼吸道综合征病毒(SARS)NSP5抑制剂的筛选
1.材料与试剂
所用试剂和细胞系同实施例1。
2.克隆构建
SARS病毒NSP45融合蛋白核酸分子由北京擎科新业生物有限公司 合成，其核酸序列如(SEQ ID NO:2)所示，其对应氨基酸序列如(SEQ ID NO:3)所示，该序列命名为Flag-NSP45(SARS)-Myc。
克隆构建、转化实验等按照分子克隆标准操作进行。构建获得原核表 达质粒pet28-Flag-NSP45(SARS)-Myc以及无蛋白酶活性的突变体 pet28-Flag-NSP45-C145A(SARS)-Myc作为对照。
3.抑制剂的筛选
具体方法参见实施例1。其中，用pet28-Flag-NSP45(SARS)-Myc质 粒替代pet28-Flag-NSP45(CoV2)-Myc质粒。
Western免疫印迹实验结果如图3所示。其中，Z-FA-FMK，FMK 9a，BOC-D-FMK，Z-VAD-FMK，Z-YVAD-FMK，Z-IETD-FMK和 Z-DEVD-FMK不同程度抑制了NSP45的自我切割，在60KDa处出现未 切割的大分子条带。其中Z-VAD-FMK具有较强的抑制效应；
Z-IETD-FMK和Z-DEVD-FMK具有中等抑制效应，Z-FA-FMK，FMK 9a，BOC-D-FMK和Z-YVAD-FMK具有较弱抑制效应。而其他化合物 (FMK，Z-VAD(OH)-FMK，Z-LEHD-FMK)基本不能抑制NSP45的自 我切割，仅在在33KDa处出现NSP5条带。在DMSO(DMSO不能抑制 蛋白酶活性)对照条带中，60KDa处基本无信号，而在NSP5位置处有 明显条带，说明在没有抑制剂的情况下，NSP45融合蛋白基本被完全切 割，筛选体系构建成功。
体内试验也证实了以上化合物能够在体内抑制NSP5对非结构蛋白 的切割，使病毒无法正常复制，进而抑制了病毒的产生。因此，这些化合 物可以用于制备治疗严重呼吸道综合征病毒(SARS)引起的疾病的药物。
实施例3更多化合物的筛选
利用上述NSP5抑制剂筛选系统，发明人选择更多的化合物进行了筛 选。所检测的化合物购自Sellck公司，货号L2500。试验方法同实施例1。 没有在本实施例中检测的化合物中发现能够抑制NSP5蛋白酶活性的化 合物。本实施例所检测的化合物如表1所示：
表1
Plate layout：L2500-01
Figure BDA0003164535260000171
试验方法同实施例1。没有在本实施例中检测的化合物中发现能够抑 制NSP5蛋白酶活性的化合物，说明实施例1筛选到的化合物对NSP5蛋 白酶活性的抑制是特异性的。

Claims (17)

1.一种冠状病毒蛋白酶抑制剂，其是caspase抑制剂并显示出抑制冠状病毒蛋白酶的活性。
2.如权利要求1所述的抑制剂，其不是已知具有抑制冠状病毒蛋白酶活性的caspase抑制剂。
3.如权利要求1或2所述的抑制剂，其具有通式(I)所示的结构，
P-(X)n-FMK (I)
其中，P是氢或氨基保护基，X是各自独立的任意氨基酸，n是1-20、1-15、1-10或1-5的整数，例如n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20，FMK(fluoromethylketone)是氟甲基酮基团，其中当n不是1时(X)n是n个各自独立的氨基酸构成的肽段，并且C端氨基酸与FMK一起形成氟甲基酮结构。
4.如权利要求3所述的抑制剂，其中，P是氨基保护基，例如烷基氧羰基，优选地选自甲氧羰基、乙氧羰基、苯甲氧羰基(Cbz)、叔丁氧羰基(tBoc)、芴氧羰基(Fmoc)、烯丙氧羰基(Alloc)和TMS乙氧羰基(Teoc)，例如是苯甲氧羰基或叔丁氧羰基。
5.如权利要求3或4所述的抑制剂，其选自Z-FA-FMK，BOC-D-FMK、Z-VAD-FMK、Z-YVAD-FMK、Z-IETD-FMK和Z-DEVD-FMK，其中Z是苯甲氧羰基，BOC是叔丁氧羰基。
6.如权利要求1至5任一项所述的抑制剂，其中所述抑制剂进一步与具有特异性结合冠状病毒能力的分子共价或非共价连接，优选地所述具有特异性结合冠状病毒能力的分子是冠状病毒蛋白的抗体，例如是冠状病毒结构或非结构蛋白，如表面蛋白，具体地，例如S蛋白的抗体。
7.如权利要求6所述的抑制剂，其中所述具有特异性结合冠状病毒能力的分子是ACE2(Angiotensin-converting enzyme 2)，优选地，是ACE2的胞外区。
8.如权利要求6或7所述的抑制剂，其中所述抑制剂通过取代式(I)中的基团P进一步与具有特异性结合冠状病毒能力的分子共价连接，优选地，所述基团P与所述具有特异性结合冠状病毒能力的分子通过接头共价连接。
9.如权利要求1至8任一项所述的抑制剂，其中所述冠状病毒是冠状病毒科β冠状病毒属病毒，例如是SARS-CoV-2、SARS-CoV或MERS-CoV，具体地所述蛋白酶是NSP5蛋白酶，优选地选自SARS-CoV-2 NSP5蛋白酶、SARS-CoV NSP5蛋白酶和MERS NSP5蛋白酶，特别是SARS-CoV-2 NSP5蛋白酶。
10.一种药物组合物，其包含如权利要求1至9任一项所述的抑制剂，以及药学上可接受的载体。
11.一种抑制冠状病毒蛋白酶活性的方法，其包括使所述冠状病毒蛋白酶与权利要求1至9任一项所述抑制剂或权利要求9所述药物组合物相接触。
12.一种治疗冠状病毒感染或冠状病毒所致疾病的方法，其包括向有此需要的对象施用如权利要求1至9任一项所述的抑制剂或如权利要求10所述的药物组合物。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述冠状病毒所致疾病选自新型冠状病毒(SARS-CoV-2)所致疾病、严重呼吸道综合征病毒(SARS-CoV)所致疾病和中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)所致疾病，优选为新型冠状病毒所致疾病或严重呼吸道综合征病毒所致疾病，更优选为新型冠状病毒所致疾病。
14.一种筛选病毒蛋白酶抑制剂的方法，包括
1)提供所述病毒蛋白酶及其底物，所述底物包含所述病毒蛋白酶的识别切割位点；
2)使步骤1)所述病毒蛋白酶及其底物与候选物质相接触；和
3)检测病毒蛋白酶切割前底物的减少和/或切割后产物的出现和/或增加。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述病毒蛋白酶及其底物位于一条多肽链上以融合蛋白的形式存在。
16.如权利要求14或15所述的方法，其中步骤1)的底物是所述蛋白酶在自然状态下的底物，所述底物与所述蛋白酶具有相互作用。
17.如权利要求14至16任一项所述的方法，其中所述病毒蛋白酶是冠状病毒蛋白酶，具体地所述病毒蛋白酶是NSP5蛋白酶，优选地选自新型冠状病毒NSP5蛋白酶、严重呼吸道综合征病毒NSP5蛋白酶和中东呼吸综合征冠状病毒NSP5蛋白酶，更优选新型冠状病毒NSP5蛋白酶。
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