CN115666237A - 抗菌管状导管 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及优选地由可生物降解的聚合材料制成的管状导管，其外表面和/或内表面被具有序列(I)的抗菌肽或其盐或溶剂化物功能化：X1LX2WVX3IWX4X5(I)，其中X1、X2、X3、X4和X5独立地选自K和R，并且其中每个氨基酸独立地处于D或L构型。用至少一种抗菌肽对本发明的管状导管进行功能化的目的是解决由革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、真菌、酵母菌和/或病毒引起的污染问题。

Description

抗菌管状导管
技术领域
本发明涉及管状导管，例如其外表面和/或内表面用抗菌肽功能化的饮用吸管。
背景技术
高抗性病原体的迅速增加是食品和饮料行业以及医疗行业面临的全球性挑战。
特别是，饮用水一直被认为是人类生命健康和可持续性的主要要求之一。
然而，世界卫生组织(WHO)报告说，8.84亿人无法获得饮用水，并且220万次的死亡(主要是儿童)可归因于腹泻，腹泻是通过受污染的水和/或公共卫生或个人卫生不佳传播的。
对于免疫系统缺陷的住院患者，通常建议使用瓶装水。美国微生物学会报告说，细菌也可以在瓶装饮用水中生长。例如，在加拿大装瓶后的矿泉水中发现了每ml大约102-105个菌落形成单位(CFU/ml)的种群。这些细菌不太可能引起疾病，但瓶装水中的高水平细菌可能对诸如孕妇、新生儿、免疫功能低下的患者和老年人等弱势群体构成风险。近年来，对瓶装水的需求稳步增长，使瓶装水成为全球软饮料中增长最快的部分。
然而，一次性瓶子的大量消耗与废物和土壤污染的增加有关。只有一小部分塑料瓶被回收。与瓶装水相关的环境成本导致社会推动采用可再装瓶。
可再装瓶更环保且更具成本效益，因为消费者可以重复地再填充它们。这种再填充和重复使用水瓶的能力需要定期清洁瓶子。然而，观察与可再装水瓶相关的消费者行为表明，用户会定期给水瓶加水，而没有对其做出相应的清洁工作。此外，可再装水瓶的形状会妨碍其清洁。
饮用吸管通常暴露在环境中并反复放入用户的嘴里，可能会被微生物或其他病原体污染，从而感染或再次感染用户。
用于向人输送流体例如氧气、液体或药物的医用管也可能被微生物或其他病原体污染。事实上，为了使人在使用医用管的同时可以移动，医用管的长度在人和分配站之间延伸。因此，管子在正常使用过程中可以位于地板上、床单上或与其他人接触，从而成为微生物或其他病原体的容器，然后这些病原体可以转移到施用液体的人身上、或其他人或表面上。
沙门氏菌(Salmonella)和大肠杆菌(Escherichia coli)是食品和饮料中最常见的病原体之一，每年影响数百万人，有时会导致严重和致命的后果。症状是发烧、头痛、恶心、呕吐、腹痛和腹泻。
单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)也会污染食品和饮料。李斯特菌感染会导致孕妇流产或新生儿死亡。李斯特菌对健康，特别是在婴儿、儿童和老年人的健康，造成严重甚至有时致命的后果，对这些人群来说代表了最严重的食物感染，在食物源性感染的背景下死亡率很高。
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是造成急性化脓性感染的原因，这种感染可能发生在身体不同部位，如皮肤、骨骼系统、呼吸系统、泌尿系统、中枢神经系统。一些细菌菌株由于能够产生一些特有的外毒素，也会引起中毒和各种类型的病态表现。抗生素耐药性是葡萄球菌(Staphylococcaceae)家族的一个非常常见的特征，尤其是在医院环境中可能接触的所谓的医院感染中。这些感染的原因通常是医源性的，并且经常在具有假体和血管内植入物的受试者的血液中发现。由于广泛的耐药性，在许多情况下对多种药物产生耐药性，这些感染是一个通常难以解决的问题；现在已知并研究了许多耐抗生素病原菌，包括所谓的MRSA(耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)。
因此，需要提供适用于食品和医疗领域的卫生安全的管状导管。
申请US20150209567公开了一种由聚合材料制成的管状导管，其具有外层、内层和中间层，其中外层和/或内层结合抗菌剂，例如银。银可以处于元素或离子状态，呈纳米颗粒或沸石的形式，并且可选地与锌组合。
抗菌肽(AMP)在许多组织和细胞类型的生物体中产生，例如植物、昆虫、两栖动物和高等生物，并且是先天免疫的组成部分。它们的氨基酸组成和结构相关的化学-物理特性使它们能够选择性地与细菌膜的脂质双层相互作用，从而导致微生物死亡。抗菌肽似乎对革兰氏阴性和革兰氏阳性的人类致病菌株具有很高的活性潜力；此外，与目前使用的其他药物不同，这些肽不容易选择突变体并且不会诱导抗生素抗性现象。
近年来，已经通过从计算机分析到肽文库筛选的各种技术鉴定了许多抗菌肽。
特别地，专利申请WO2015038339描述了753个7-12-氨基酸肽的结构，表明其具有抗生物膜和/或免疫调节活性。其中描述的一些肽已经测试了它们抑制由绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(E.coli)、鲍氏不动杆菌(Acinetobacterbaumannii)、肠道沙门氏菌鼠伤寒(Salmonella enterica ssp.Typhimurium)、洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cenocepacia)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)形成的生物膜的能力；然而，在测试浓度下，这些肽对这些细菌的浮游细胞没有表现出活性。在本文中，描述了指定为HE 10的十肽，其具有序列VRLIVRIWRR(SEQ ID NO:33)。
专利申请WO2019012158公开了一些抗菌肽(包括IDR-1018-K6)作为细菌剂的用途，用于预防和/或处理具体细菌(即单核细胞增多性李斯特菌)对产品或表面的污染。该文献进一步公开了抗菌肽在治疗受试者中由单核细胞增多性李斯特菌引起的感染中的用途。
迄今为止，进行的研究和在众多数据库中可用的数据量(Wang,G.,Li,X.andWang,Z.(2016)APD3:the antimicrobial peptide database as a tool for researchand education,Nucleic Acids Research 44,D1087-D1093)表明，抗菌肽可以具有不同的结构并且靶向多种微生物。此外，在许多情况下，肽往往会在与细胞膜接触后呈现与活性相关的结构。基于二级结构的两个关键元件(α-螺旋和β-折叠)的存在与否，AMP通常分为四大类：(i)具有线性α-螺旋结构的肽，其代表最大和最佳研究的组；(ii)具有线性扩展结构的肽(没有α-螺旋或β-折叠元件)；(iii)含有β-折叠的肽和(iv)含有α-螺旋和β-折叠元件的肽。已从天然来源鉴定出数百种不同的序列，并产生了大量的类似物和合成衍生物，其规模和多样性正不断扩大(Johannes Koehbach and David J.Craik.The Vast StructuralDiversity of Antimicrobial Peptides,Trends in Pharmacological Sciences,July2019,Vol.40,No.7)。因此，似乎到目前为止，这类抗菌分子还没有明确的结构/功能关系，因此很难预测它们的活性。
大多数已知的AMP尺寸较小，一般为12至50个氨基酸残基。较长的如乳酸链球菌肽(34aa)或LL37(37aa)至少部分是结构化的，这也归功于其较长的氨基酸链。
尽管乳酸链球菌肽的抗菌作用几十年来一直为人所知，但其作用机制仍需进一步研究。这可能是由于乳酸链球菌肽根据目标细菌膜的结构特性通过不同的机制发挥作用。乳酸链球菌肽本身仅对革兰氏阳性菌有活性，但它与破坏细胞膜的治疗相结合，使其对革兰氏阴性菌也有活性(Sukrita Punyauppa-path,Parichat Phumkhachorn,PongsakRattanachaikunsopon NISIN:PRODUCTION AND MECHANISM OF ANTIMICROBIAL ACTION,Int J Cur Res Rev|Vol 7·Issue 2·2015年1月)。几项研究表明，一些结构性乳酸链球菌肽(尼生素，Nisin)基序对于细菌膜中“孔”的形成至关重要，而肽的其他部分通过抑制细胞壁合成而有助于杀菌作用。这表明乳酸链球菌肽对细菌至少有两种不同的作用机制(HBrotz and HG Sahl New insights into the mechanism of action of lantibiotics–diverse biological effects by binding to the same molecular target,Journal ofAntimicrobial Chemotherapy,2000,46 1-6)。
LL-37还基于形成细胞膜的不同脂质的结构调节其作用机制：它诱导不饱和磷脂双分子层中孔的形成，并在饱和磷脂存在下干扰膜功能，产生富含α-螺旋结构的纤维肽-脂质上层结构(Mahdi Shahmiri,Marta Enciso,Christopher G.Adda,Brian J.Smith,Matthew A.Perugini&Adam Mechler Membrane Core-Specific Antimicrobial Actionof Cathelicidin LL-37Peptide Switches Between Pore and Nanofibre Formation,Scientific Reports volume 6,Article number:38184(2016))。
因此很明显，更大的肽通常可能具有更大的折叠可变性和复杂性，换句话说，即使在氨基酸链的不同部分，它们也更有可能呈现各种二级结构。因此，很难理解和控制具有较长氨基酸序列的肽能够发挥其生物活性的机制，因为影响和/或损害它的变量更多。此外，在使用肽通过共价键对聚合物表面进行功能化的情况下，更长的氨基酸序列将在统计学上增加肽可以与目的材料(PET；PVC；PL等)结合的位点，使得分子在形成键(或在序列的几个点上的键)后可以呈现的构象不可预测，并因此也使得保持抗微生物活性的可能性不可预测。
另一方面，小分子使得自身更适合设计和/或修饰，以保持或放大具体活性。此外，抗菌肽的小尺寸显著降低了其合成和纯化的成本。然而，较短的抗菌肽比较长的抗菌肽具有更低的结构化概率，因此同样难以预测它们的活性(Ralf Mikut,Serge Ruden,MarkusReischl,Frank Breitling,Rudolf Volkmer,Kai Hilpert.Improving shortantimicrobial peptides despite elusive rules for activity Biochimica etBiophysica Acta 1858(2016)1024–1033)。
鉴于上述情况，显然需要提供适用于食品和医疗领域的管状导管，其用抗菌剂(特别是肽类型的)功能化，该管状导管能够对广谱微生物的进行有效的抗菌活性，包括革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌、真菌和酵母菌，并且还可能具有抗病毒作用。进一步的需要是上述抗菌肽具有中等长度的氨基酸链，可能比目前已知的抗菌肽短。另一个需要是上述肽的合成和纯化成本尽可能低。
发明内容
为了满足这些和其他需要，本发明人研究了几种适用于功能化由各种材料制成的管状导管的外表面和/或内表面的抗菌剂，所述材料例如聚合材料、玻璃和金属，以及确定了特别适合此目的的抗菌肽(AMP)。这些抗菌肽由通式(I)表示的氨基酸序列组成。它们特别适用于上述目的，因为它们具有广谱抗微菌活性并且以相对短的氨基酸序列为特征。
以下实验部分中的实施例1显示了RiLK1肽的合成，其代表用于本发明范围的通式(I)的肽。
RiLK1肽和所有其他式(I)的AMP肽共有这样一个事实，即它们含有结构基序W-X-X-X-W并具有相似的疏水性、亲水性、两亲性、亲合性、净电荷、鲍曼指数和无序构象倾向，这表明相似的杀菌特性(参见实施例5和6)。
实施例2a和2b显示，RiLK1肽对革兰氏阴性菌(诸如鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌)和革兰氏阳性菌(诸如金黄色葡萄球菌和单核细胞增多性李斯特菌)均表现出强杀菌活性。此外，它还显示出对真菌和酵母菌(如巴西曲霉和白色念珠菌)具有有效的抗菌活性(实施例2c)。
实施例3显示，RiLK1能够以17％的结合产率结合到由聚合物材料制成的吸管的聚合物表面，从而产生用抗菌剂功能化的吸管。此外，置于水中24小时的功能化吸管保持稳定而不会释放抗菌肽。
如实施例4所示，由用抗菌肽RiLK1功能化的聚合物材料制成的吸管对革兰氏阴性菌(如鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌)和对革兰氏阳性菌(如金黄色葡萄球菌和单核细胞增多性李斯特菌)表现出杀菌活性。
因此，本发明的第一个目的是一种包括外表面和内表面的管状导管，其中，外表面和/或内表面的至少一部分被由下式(I)组成的至少一种抗菌肽功能化。至少一种抗菌肽共价连接至存在于管状导管的外表面和/或内表面上的反应基团，或者它包含在与其附接的涂层中。
本发明的第二个目的是由式(I)组成的抗菌肽用于防止管状导管被革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、真菌、酵母菌和/或病毒污染的用途。
本发明的第三个目的是一种容器，例如瓶子、餐具盒或罐子，其设有用由式(I)组成的抗菌肽功能化的可移除吸管，其功能是降低被病原体污染的风险。更具体地，本发明容器的可移除吸管包括外表面和内表面，其中外表面和/或内表面的至少一部分被式(I)的至少一种抗菌肽功能化。
附图说明
图1显示了用RiLK1肽针对金黄色葡萄球菌(A)、单核细胞增多性李斯特菌(B)、鼠伤寒沙门氏菌(C)和大肠杆菌(D)获得的剂量反应曲线；横坐标轴显示肽浓度(μM)，纵坐标轴显示存活细胞的％，如实施例2a中所述。
图2a、图2b、图2c和图2d为每种测试细菌(即分别为金黄色葡萄球菌、单核细胞增多性李斯特菌、鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌)(在图2c和图2d中，有必要更正与鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌相关的说明文字)显示了与细菌一起温育但不添加RiLK1肽的对照板(1)、与细菌一起温育并用低于其MBC浓度的RiLK1肽处理的板(2)、与细菌一起温育并用对应于其MBC的RiLK1肽浓度处理的板(3)的照相图像，如实施例2b中所述。
图3显示了使用C18柱通过如实施例3中所述的HPLC系统获得的，在时间点＝零时存在于组合物中的RiLK1肽的反相色谱图(线A)，以及在时间点＝24小时时组合物中残留的RiLK1肽的反相色谱图(线B)。该图描绘了RiLK1肽在280nm处的吸光度值随测定为分钟(min)的洗脱时间的变化曲线。
图4显示了其中插入了吸管以进行4、6、8和24小时接触的大肠杆菌(A)、鼠伤寒沙门氏菌(B)和单核细胞增多性李斯特菌(C)的液体培养物中，表示为CFU的细菌负载的％降低。
图5显示了其中插入了吸管以进行4、6、8和24小时接触的、用细胞浓度为150CFU/mL的大肠杆菌(A)、鼠伤寒沙门氏菌(B)和单核细胞增多性李斯特菌(C)污染的自来水中，表示为CFU的细菌负载的％降低。
具体实施方式
本发明的第一个目的是一种包含内表面和外表面的管状导管，其中，外表面和/或内表面的至少一部分被由式(I)组成的至少一种抗菌肽功能化。
在优选的实施方式中，至少一种抗菌肽与存在于所述管状导管的外表面和/或内表面的至少一部分上的反应基团共价连接；或者，至少一种抗菌肽包含在附着于所述管状导管的外表面和/或内表面的至少一部分的涂层中。
如上所述，至少一种抗菌肽由如下所示式(I)表示的氨基酸序列或其盐或溶剂化物组成：
X1LX2WVX3IWX4X5 (I)
其中X1、X2、X3、X4和X5独立地选自K和R并且其中每个氨基酸独立地处于D或L构型。
应当注意的是，本说明书中表示的所有氨基酸序列均由在常规方向上从左到右的取向(即从氨基末端到羧基末端的)分子式表示。
根据优选的实施方式，上式(I)中的氨基酸均为D构型或L构型。
根据另一个优选的实施方式，在上述式(I)中，X1、X3、X4和X5中的至少一个具有R的含义；更优选地，X4和X5具有R的含义；还更优选地，X3、X4和X5具有R的含义；甚至更优选地，X1、X3、X4和X5具有R的含义。
在另一个优选实施方式中，X2具有K的含义。
在另一个优选实施方式中，X1、X3、X4和X5中的至少一个具有R的含义并且X2具有K的含义；更优选地，X4和X5具有R的含义并且X2具有K的含义；还更优选地，X3、X4和X5具有R的含义并且X2具有K的含义；甚至更优选地，X1、X3、X4和X5具有R的含义并且X2具有K的含义。
以下氨基酸序列是特别优选的：
RLX2WVRIWX4X5、RLX2WVRIWRX5、RLX2WVRIWX4K、RLKX2WVRIWKK、X1LKWVX3IWRR、X1LKWVRIWRR、RLKWVX3IWRR、X1LRWVX3IWKK、X1LRWVKIWKK、KLRWVX3IWKK，
其中X1、X2、X3、X4和X5独立地选自K和R并且其中每个氨基酸独立地处于D或L构型。
进一步优选以下具体氨基酸序列：
RLKWVRIWRR(SEQ ID NO:1)、KLRWVRIWRR(SEQ ID NO:2)、RLRWVRIWRR(SEQ ID NO:3)、KLKWVRIWRR(SEQ ID NO:4)、RLKWVKIWRR(SEQ ID NO:5)、KLRWVKIWRR(SEQ ID NO:6)、RLRWVKIWRR(SEQ ID NO:7)、KLKWVKIWRR(SEQ ID NO:8)、RLKWVRIWKR(SEQ ID NO:9)、KLRWVRIWKR(SEQ ID NO:10)、RLRWVRIWKR(SEQ ID NO:11)、KLKWVRIWKR(SEQ ID NO:12)、RLKWVKIWKR(SEQ ID NO:13)、KLRWVKIWKR(SEQ ID NO:14)、RLRWVKIWKR(SEQ ID NO:15)、KLKWVKIWKR(SEQ ID NO:16)、RLKWVRIWRK(SEQ ID NO:17)、KLRWVRIWRK(SEQ ID NO:18)、RLRWVRIWRK(SEQ ID NO:19)、KLKWVRIWRK(SEQ ID NO:20)、RLKWVKIWRK(SEQ ID NO:21)、KLRWVKIWRK(SEQ ID NO:22)、RLRWVKIWRK(SEQ ID NO:23)、KLKWVKIWRK(SEQ ID NO:24)、RLKWVRIWKK(SEQ ID NO:25)、KLRWVRIWKK(SEQ ID NO:26)、RLRWVRIWKK(SEQ ID NO:27)、KLKWVRIWKK(SEQ ID NO:28)、RLKWVKIWKK(SEQ ID NO:29)、KLRWVKIWKK(SEQ ID NO:30)、RLRWVKIWKK(SEQ ID NO:31)、KLKWVKIWKK(SEQ ID NO:32)，
其中每个氨基酸独立地处于D或L构型。
具有序列SEQ ID NO:1的肽是在本说明书的范围内指示为“RiLK1”的肽。
在本发明的上下文中，术语“溶剂化物”或“溶剂化物”是指本发明的肽与在其中进行合成反应或在其中沉淀或结晶的溶剂的复合物。例如，与水的复合物被称为“水合物”。
适用于本发明目的的盐和溶剂化物是那些不会导致根据本发明的肽的构象或稳定性发生变化，并因此不会干扰它们的生物活性的那些盐和溶剂化物。
根据本发明的优选盐是不导致本发明肽的构象或稳定性改变的药学上可接受的盐。作为说明性和非限制性实例，药学上可接受的酸加成盐包括由盐酸、氢溴酸、乙酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、三氟乙酸、琥珀酸、高氯酸、富马酸、马来酸、乙醇酸、乳酸、水杨酸、草酰乙酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、萘-2-磺酸、苯磺酸和羟乙基磺酸形成的盐。其他酸，例如草酸，虽然本身不是药学上可接受的，但可用作获得本发明的肽及其药学上可接受的盐的中间体。可接受的碱盐包括铵盐、碱金属盐(例如钾盐和钠盐)、碱土金属盐(例如钙盐和镁盐)以及与有机碱(例如二环己胺和N-甲基-D-葡糖胺)形成的盐。
优选地，根据本发明，管状导管为饮用吸管或医用管；更优选地，其是饮用吸管，其结合在容器中并且可以可选地从容器中移除，所述容器为例如瓶子、餐具盒或罐。
在优选实施方式中，管状导管是用于食物或饮料的吸管。
优选地，根据本发明，存在于管状导管的外表面和/或内表面的至少一部分上的至少一种抗菌肽的摩尔数为1至10nmol×cm2表面，更优选1.5至3nmol×cm2表面。
根据本发明，管状导管的材料优选为聚合物；通过说明性和非限制性的例子，合适的聚合物是苯乙烯嵌段共聚物、聚烯烃混合物、弹性体混合物、热塑性聚氨酯、热塑性共聚酯、热塑性聚酰胺、聚丙烯、聚乙烯、高密度聚乙烯、低密度聚乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚对苯二甲酸1,4环己烷二亚甲基酯、聚2,6萘二甲酸二苯甲酸乙二醇酯、聚烯烃、聚偏二氟乙烯、聚2,6萘二甲酸乙二醇酯、丙烯腈丁二烯苯乙烯、聚氯乙烯、聚醚嵌段酰胺、可生物降解的聚合物及其混合物。更优选地，聚合物材料是可生物降解的聚合物，例如聚乳酸(PLA)、聚己二酸-共-对苯二甲酸丁二醇酯(PBAT)、聚己内酯(PCL)、改性淀粉(
Figure BDA0003964525770000121
)或聚乙醇酸(PGA)、聚丁二酸丁二醇酯(PBS)、聚羟基链烷酸酯(PHA)(
Figure BDA0003964525770000122
材料家族)及其混合物。甚至更优选地，聚合物材料是聚乳酸。
本发明人研究了不同类型的聚合物并发现PLA特别适合用于本发明目的的功能化。PLA是一种热塑性聚合物，属于脂肪族聚酯家族，具有类似于聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)的特性。它源自糖，因此它是一种源自100％自然资源的产品，并因此具有零环境影响。PLA可以很容易地使用用于聚合物薄膜的热成型和单轴或双轴挤出的传统机器、通过注射和通过发泡进行加工。PLA是100％可生物降解和可堆肥的。PLA在标准环境条件(20℃,1Atm)下是稳定的，在高于65℃的温度和高于20％的湿度下会通过水解降解，因此生物降解时间可以因环境条件而有很大差异。在65℃和95％湿度(这是正常堆肥站的标准条件)下，基于PLA的产品在大约50天内降解。如果放在地上，基于PLA的产品会在15个月内降解，如果燃烧会在24个月内降解，如果放在水中会在48个月内降解。
优选地，根据本发明的管状导管是由PLA制成的饮用吸管或医用管；更优选地，其是由PLA制成的饮用吸管，并结合到容器中并且可选地从容器中移除，所述容器为例如瓶子、餐具盒或罐。
如上所述，本发明的一个实施方式是，其中至少一种抗菌肽共价地连接至在管状导管的外表面和/或内表面的至少一部分上存在的反应基团。
在这种情况下，肽的N末端氨基共价地连接至在管状导管的外表面和/或内表面的至少一部分上存在的至少一种化学基团，至少一种化学基团优选地选自羧基、激发的羟基自由基、活化的烷氧基或活化的醛基或酮基。
事实上，本发明人发现，当肽的N末端基团与管状导管表面上存在的化学基团共价连接时，尽管肽具有锁定构象，但仍保持杀菌活性，并且这种杀菌活性长期保持稳定。
用于将肽结合到固体支持物的技术是本领域技术人员已知的并且取决于所使用的材料而变化。主要使用的表面功能化方法是化学或物理方法。
例如，在具有金属(金、银、铂)或半导体(钛、锌、锡、锆、锗)表面的材料的情况下，可以使用硅烷化工艺。例如，这涉及使待处理的材料与硫酸(H2SO4)和过氧化氧(H2O2)的混合物反应，它们能够通过创建可容易地被更稳定的键(如Si-C或Au-S)替换的表面原子或羟基(-OH)的键来活化前述表面。在用硅烷化剂(例如氨丙基二甲基乙氧基硅烷或氨丙基三乙氧基硅烷)和用具有能够与肽的氨基形成肽共价键的两个官能团的化合物(例如戊二醛或双琥珀酰亚胺)处理后，活化的表面可以共价地结合目的肽。这些处理是典型的水溶液化学，并因此它们被称为湿法工艺，这是有利的，因为它们不需要特殊的技术设备，而只需要可以毫无困难地润湿和干燥的(优选刚性的)材料。
在塑料或聚合物表面的情况下，可以通过应用湿法工艺(例如上述那些)和干法工艺来激活它们以连接目的肽。
湿法活化，典型的水溶液化学，通常是有利的，因为它不需要特殊的技术设备，而只需要可以毫无困难地润湿和干燥的(优选刚性的)材料。然后使活化的表面与硅烷化剂(例如氨丙基二甲基乙氧基硅烷或氨丙基三乙氧基硅烷)反应，并且与具有能够与肽的氨基形成肽共价键的两个官能团的化合物(例如戊二醛或双琥珀酰亚胺)反应。
干法活化是基于待处理表面与电磁辐射(例如激光、紫外辐射、伽马射线)或与电离气体(气体等离子体)的相互作用。聚合物表面与电磁辐射的相互作用导致表面活化，从而允许随后对表面本身进行化学修饰。类似的操作原理也适用于通过气体等离子体处理来活化聚合物表面。这种方法是特别有利的，因为由于等离子体是冷的，因此经处理的材料的温度相对于室温不会达到高值。这种方法需要低压(0.1-100Pa)和存在工作气体(通常是N2、O2或Ar、CF4)。[Hegemann,Dirk,Herwig Brunner,and Christian Oehr."Plasmatreatment of polymers for surface and adhesion improvement."Nuclearinstruments and methods in physics research section B:Beam interactions withmaterials and atoms 208(2003):281-286]。
如上所述，本发明的进一步实施方式是，其中至少一种抗菌肽被包含在附着于管状导管的外表面和/或内表面的至少一部分的涂层中。
在这种情况下，功能化过程涉及将含有抗菌肽的液体抗菌组合物沉积到管状导管的表面部分上，之后使液体抗菌组合物干燥。液体抗菌组合物可以可选地包含成膜剂，其在抗菌导管的表面上形成膜，该膜有利于肽在表面上的持久性。因此，上述涂层可以包含成膜聚合物。
优选地，液体抗菌组合物中至少一种抗菌肽的浓度为10至100μM，更优选20至80μM、30至60μM、40至60μM。
优选地，管状导管在含有至少一种抗菌肽的液体抗菌组合物中的温育时间为18至36小时，更优选20至30小时。
如上所述，根据本发明的管状导管的特征适合于防止被革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、真菌、酵母菌和/或病毒污染。
因此，本发明的第二个目的是如上定义的抗菌肽用于防止管状导管被革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、真菌、酵母菌和/或病毒污染的用途。
在本上下文中，革兰氏阴性菌优选地选自弯曲杆菌(Campylobacter)，诸如例如大肠弯曲杆菌(Campylobacter coli)、简洁弯曲杆菌(Campylobacter concisus)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、直肠弯曲杆菌(Campylobacter C.rectus)；弓形杆菌(Arcobacter)，诸如例如布氏弓形杆菌(Arcobacter butzleri)、嗜低温弓形杆菌(Arcobacter cryaerophilus)；柠檬酸杆菌(Citrobacter)，诸如例如无丙二酸柠檬酸杆菌(Citrobacter amalonaticus)、布氏柠檬酸杆菌(Citrobacter braakii)、法氏柠檬酸杆菌(Citrobacter farmeri)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、吉氏柠檬酸杆菌(Citrobacter gillenii)、克氏柠檬酸杆菌(Citrobacter koseri)；肠杆菌(Enterobacter)，诸如例如产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、集聚肠杆菌(Enterobacter agglomerans)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、采后生防菌肠杆菌(Enterobacter cowanii)、日沟维肠杆菌(Enterobacter gergoviae)；埃希氏杆菌(Escherichia)，诸如例如大肠杆菌(Escherichia coli)；克雷伯杆菌(Klebsiella)；摩根氏菌(Morganella)，诸如例如摩氏摩根菌(Morganella Morganii)；变形杆菌(Proteus)，诸如例如普通变形杆菌(Proteus vulgaris)、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)；志贺氏杆菌(Shigella)，诸如例如痢疾志贺菌(Shigella dysenteriae)；沙门氏菌(Salmonella)，诸如例如伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)；耶尔森氏鼠疫杆菌(Yersinia)，诸如例如鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)、假结核耶尔森菌(Yersinia pseudotuberculosis)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersiniaenterocolitica)；粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)；产气气杆菌(Aerobacteraerogenes)；阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)；不动杆菌(Acinetobacter)，诸如例如鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、拜氏不动杆菌(Acinetobacterbeijerinckii)、别雷斯不动杆菌(Acinetobacter bereziniae)、波希不动杆菌(Acinetobacter boissieri)；莫拉克斯氏菌(Moraxella)，诸如例如卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)(同名卡他布兰汉菌(Branhamella catarrhalis))；奈瑟氏菌(Neisseria)，诸如例如脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis)；嗜血杆菌(Haemophilus)，诸如例如流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)；巴斯德菌(Pasteurella)，诸如例如多杀巴斯德菌(Pasteurella multocida)；假单胞菌(Pseudomonas)，诸如例如绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)；弧菌(Vibrio)，诸如例如霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、费氏弧菌(Vibrio fischeri)、嗜麦芽糖寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)，以及它们的组合。更优选地，革兰氏阴性菌选自鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌。
革兰氏阳性菌优选地选自放线菌(Actinobacteria)，诸如例如惠普尔养障体(Tropheryma whipplei)；芽孢杆菌(Bacillus)；肉食杆菌(Carnobacterium)；梭菌(Clostridium)；白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheria)；肠球菌(Enterococcus)，诸如例如粪肠球菌(Enterococcus faecalis)；阴道加德纳氏菌(Gardnerellavaginalis)；乳酸杆菌(Lactobacillus)；乳球菌(Lactococcus)；李斯特菌(Listeria)，诸如例如单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)；微球菌(Micrococcus)；葡萄球菌(Staphylococcus)，诸如例如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)；链球菌(Streptococcus)，诸如例如无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、绿色链球菌(Streptococcus viridans)，以及它们的组合。更优选地，革兰氏阳性菌选自单核细胞增多性李斯特菌和金黄色葡萄球菌。
真菌优选巴西曲霉(Aspergillus brasiliensis)并且酵母优选白色念珠菌(Candida albicans)。
病毒优选地是配备有衣壳和称为pericapsid的附加涂层的病毒；它们可以是DNA或RNA病毒。优选地，病毒是腺病毒、乳头状瘤病毒(HPV)、疱疹病毒、冠状病毒、流感病毒、巨细胞病毒(CMV)、HIV或埃博拉病毒。
提供以下实施例仅用于说明目的并且不限制如所附权利要求中限定的本发明的范围。
实施例
实施例1-RiLK1肽的合成
具有序列RLKWVRIWRR(SEQ ID NO:1)的RiLK1肽是通过固相肽合成使用保护基团氟甲氧羰基(Fmoc)合成的。
将取代度为0.5mmol/g的Rink-酰胺MBHA树脂用作固体载体。该树脂具有提供酰胺键并释放在C末端酰胺化的肽的接头。
在合成结束时，通过用40％(v/v)哌啶的DMF溶液处理除去保护基团，同时用由95％三氟乙酸、2.5％三异丙基硅烷和2.5％H2O(v/v/v)组成的酸性溶液处理，获得从树脂上脱附并从氨基酸侧链上除去保护基团。
在从固体支持物上脱离后，在-20℃的冷乙醚中沉淀肽。在3500rpm下将样品离心5分钟以收集沉淀物。将沉淀物溶解在CH3CN/H2O(95:5)的混合物中，冷冻并冻干。
该程序可用于合成本发明中使用的所有AMP肽。
实施例2-RiLK1的杀菌活性分析
实施例2a-评估能够具有50％细菌生长抑制(IC50)的浓度
针对革兰氏阳性(单核细胞增多性李斯特菌LM2和金黄色葡萄球菌)和革兰氏阴性(鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌)病原菌评估了RiLK1肽的杀菌活性。
对于四种细菌种类，使用如下表1和2所示选择、认证和表征的菌株。
如Wang HX and Ng TB(2003,Peptides 24:969–972)中所述，通过肉汤微量稀释测定对能够抑制50％细菌生长(IC50)的RiLK1肽的浓度进行了评估。
从每个肽稀释度的三次实验中获得标准偏差，并使用GraphPad Prism6.00版(Graph-Pad Software,La Jolla California USA)确定IC50。
所有杀菌活性测定均使用2-3log CFU(菌落形成单位)进行，其代表了可能包含在用于食品或医疗用途的管状导管中的污染水平的实际近似值。
金黄色葡萄球菌
制备了对照原液悬浮液，其中将103CFU的金黄色葡萄球菌接种到10ml BPW中。然后制备了RiLK1肽的5mM原液，并在BPW中进行系列稀释(100至1μM)并接种103CFU的金黄色葡萄球菌，然后在37℃下温育6小时。同时，制备了对照样品并且以相同方式但不添加肽进行了处理。
将50μl每种细菌悬浮液倒入血琼脂或兔血浆纤维蛋白原琼脂培养皿中，并在37℃下温育20小时。
研究的所有实验条件都使用平板计数法来估计肽的杀菌活性。具体地，对在不存在或存在单独肽稀释液的情况下，在接种有细菌悬浮液的琼脂板上生长的菌落数进行了计数并进行了比较。使用统计软件确定了标准偏差。
单核细胞增多性李斯特菌
制备了对照原液悬浮液，其中将103CFU的单核细胞增多性李斯特菌接种在10ml半弗雷泽肉汤中，并对悬浮液进行系列稀释(100至0.01μM)。然后制备了5mM肽在DMSO中的原液，并在弗雷泽肉汤中进行系列稀释(100至0.01μM)，并接种103CFU的单核细胞增多性李斯特菌，然后在37℃下温育6小时。同时，制备了对照样品并且以相同方式但不添加肽进行了处理。将50μl的每种细菌悬浮液接种在不同的培养板上：血琼脂和ALOA(Oxoid,Basingstoke,UK)，然后在37℃下温育24-48小时。每个稀释系列包括用不含肽的DMSO接种的对照板和仅用细菌接种的对照板。
鼠伤寒沙门氏菌
制备了对照原液悬浮液，其中将103CFU的鼠伤寒沙门氏菌接种在10ml BPW(Oxoid,Basingstoke,UK)中。然后制备了5mM肽的原液，并在BPW中进行系列稀释(100至1μM)，并接种103CFU的鼠伤寒沙门氏菌，然后在37℃下温育6小时。将50μl的每种细菌悬液接种在装有血琼脂或显色琼脂(Oxoid,Basingstoke,UK)中，并在37℃下温育20小时。每个稀释系列包括用不含肽的DMSO接种的对照板和仅用细菌接种的对照板。
大肠杆菌
制备了对照原液悬浮液，其中将103CFU的大肠杆菌接种到10ml BPW(Oxoid,Basingstoke,UK)中。然后制备了5mM肽的原液并在BPW中进行系列稀释(100至1μM)并接种103CFU的大肠杆菌，然后在37℃下温育6小时。将50μl的每种细菌悬浮液接种在具有血琼脂或显色琼脂(Oxoid,Basingstoke,UK)的培养皿上，并在37℃下温育20小时。每个稀释系列包括用不含肽的DMSO接种的对照板和仅用细菌接种的对照板。
图1描绘了针对金黄色葡萄球菌(A)、单核细胞增多性李斯特菌(B)、鼠伤寒沙门氏菌(C)和大肠杆菌(D)用RiLK1肽获得的剂量-反应曲线。
基于得到的剂量-反应曲线，确定了针对上述菌株的IC50值(能够抑制50％细菌生长的肽浓度)。
表1中报道的数据显示，RiLK1肽对所有测试细菌表现出强杀菌活性(IC50<2μM)；特别地，观察到对鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌和单核细胞增多性李斯特菌具有更强的杀菌活性(IC50<1.5μM)，并且观察到对单核细胞增多性李斯特菌甚至具有更强的杀菌活性(IC500.46μM)。
表1
Figure BDA0003964525770000201
实施例2b-最低杀菌浓度(MBC)的评估
如Bílikova et al,(2015,Peptides 68:190–196)中所述，进行最低杀菌浓度(MBC)的评估，即能够99.9％抑制板上细菌生长的抗菌剂的最低浓度。
下表2中报告的数据显示，RiLK1肽对所有测试细菌均表现出强杀菌活性(MBC<20μM)；特别地，观察到对单核细胞增多性李斯特菌、鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌的较强杀菌活性(MBC<5μM)，并且观察到对单核细胞增多性李斯特菌和大肠杆菌甚至更强的杀菌活性(MBC 2μM)。
表2
Figure BDA0003964525770000211
图2a中的图像代表了(1)与金黄色葡萄球菌一起温育但不添加RiLK1肽的对照板、(2)与金黄色葡萄球菌一起温育并用2μM RiLK1肽处理的板、(3)与金黄色葡萄球菌一起温育并用16μM RiLK1肽处理的板的照相图像，其表明在16μM的浓度下，该肽能够抑制几乎100％的细菌生长。
图2b中的图像代表了(1)与单核细胞增多性李斯特菌一起温育但不添加RiLK1肽的对照板、(2)与单核细胞增多性李斯特菌一起温育并用0.8μM RiLK1肽处理的板、(3)与单核细胞增多性李斯特菌一起温育并用2μM RiLK1肽处理的板的照相图像，其表明在2μM浓度下，该肽能够抑制几乎100％的细菌生长。
图2c中的图像代表了(1)与鼠伤寒沙门氏菌一起温育但不添加RiLK1肽的对照板、(2)与鼠伤寒沙门氏菌一起温育并用0.8μM RiLK1肽处理的板、(3)与鼠伤寒沙门氏菌一起温育并用2μM RiLK1肽处理的板的照相图像，其表明在2μM浓度下，该肽能够抑制几乎100％的细菌生长。
图2d中的图像代表了(1)与大肠杆菌一起温育但不添加RiLK1肽的对照板、(2)与大肠杆菌一起温育并用0.8μM RiLK1肽处理的板、(3)与大肠杆菌一起温育并用2μM RiLK1肽处理的板的照相图像，其表明在2μM浓度下，该肽能够抑制几乎100％的细菌生长。
实施例2c–针对真菌和酵母菌的活性分析
评价能够抑制真菌巴西曲霉生长的RiLK1肽浓度
是针对巴西曲霉确定了RiLK1肽的抗真菌活性。为此目的，制备了一种原种培养物，其中将105CFU的巴西曲霉接种在10ml缓冲蛋白胨水中。将参考菌株(ATCC 9341)用于这种真菌物种。将培养物与浓度为25μM的RiLK1肽在37℃下温育6小时。
同时，在不添加肽的情况下温育对照样品。将如此制备的100μl样品接种在DG18平板(Dichloran 18％甘油琼脂-ISO 21527-2)上，并在25℃下温育7天。
研究的所有实验条件都使用平板计数法来估计肽的杀真菌活性。具体而言，计数并比较了在不存在或存在单个肽稀释液的情况下，在接种有真菌悬浮液的琼脂板上生长的菌落数。使用统计软件确定每个板的三次温育的标准偏差。如Bílikova et al,(2015,Peptides 68:190–196)中所述进行最低杀真菌浓度(MFC)的评估，即能够99.9％抑制平板上真菌生长的抗真菌剂的最低浓度。
RiLK1肽对受试真菌具有很强的杀真菌活性，MFC值小于或等于25μM。需要注意的是，肽IDR-1018-K6(专利WO2019012158的对象)在相同的实验条件下针对相同的真菌并没有活性，与由RiLK1诱导的显著降低(5Log降低)相比，处理后真菌负载降低0Log。
评价能够抑制酵母白色念珠菌生长的RiLK1肽浓度
针对酵母白色念珠菌确定了RiLK1肽的抑制活性。制备了原种培养物，其中将105CFU的白色念珠菌接种在10ml缓冲蛋白胨水中。将参考菌株(ATCC 14053)用于该物种。将培养物与浓度为25μM的RiLK1肽在37℃下温育6小时。同时，在不添加肽的情况下温育对照样品。将如此制备的100μl样品接种在DG18平板(Dichloran 18％甘油琼脂-ISO21527-2)上并在25℃下温育7天。
研究的所有实验条件都使用平板计数法来估计肽的抗真菌活性。具体而言，计数并比较了在不存在或存在单独肽稀释液的情况下，在接种有培养物的琼脂板上生长的菌落数。使用统计软件确定每个板的三次温育的标准偏差。如Bílikova et al,(2015,Peptides68:190–196)中所述进行最低杀真菌浓度(MFC)的评估，即能够99.9％抑制平板上真菌生长的抗真菌剂的最低浓度。
RiLK1肽对白色念珠菌具有很强的抗真菌活性，MFC值小于或等于25μM。需要注意的是，如表3所示，肽IDR-1018-K6(描述于专利申请WO2019012158中)在相同实验条件下针对相同的真菌表现出低效率，与由RiLK1诱导的显著降低(5Log降低)相比，后处理使真菌负载降低了1.0Log。
表3
Figure BDA0003964525770000231
实施例3-用抗菌肽对吸管进行功能化
用来自Hangzhou Depai Machinery Co.,Ltd.的设备通过挤出制备了聚乳酸(PLA)吸管，用实施例1中制备的RiLKl肽对其进行功能化。具体地，首先使用氧等离子体(具有三个旋转喷嘴的大气等离子体表面处理机-Shenzhen Fangrui Technology Co.,Ltd.)通过等离子体处理(50-100W，5分钟)对吸管进行干式活化，随后在50μM RiLK1溶液中温育24小时。在该过程结束时，肽与聚乳酸吸管表面上存在的反应基团共价连接。
图3显示了使用C18柱和HPFC系统获得的反相色谱图。线A显示了在时间点＝零时，即在活化的聚乳酸吸管温育之前，组合物中存在的RiFK1肽的吸收峰。线B显示了在时间点＝24小时时，即在吸管温育24小时后，组合物中剩余的RiFK1肽的吸收峰。温育24小时后，可以估计RiFK1肽和吸管之间的键的产率并且发现为17％。已知功能化吸管的表面积为11.304cm2，计算了表面结合肽的摩尔数，发现为2.25nmol×cm2吸管。
在将用RiFK1肽功能化的吸管置于水中24小时后，通过HPFC系统在C18柱上进行的反相色谱显示肽在水中完全没有释放。
实施例4-用抗菌肽功能化的吸管的杀菌活性分析
从101–102CFU(菌落形成单位)的值开始，针对大肠杆菌(A)、鼠伤寒沙门氏菌(B)和单核细胞增多性李斯特菌(C)测试了实施例3中所述功能化的吸管；在4、6、8和24小时评估了有效性。
图5中的图表显示了将吸管插入平均为10-100CFU/ml的培养肉汤中的情况。在长达4小时的时间里，没有观察到CFU的减少，因为病原体的浓度仍然太低。在6小时时，功能化吸管对大肠杆菌(100％降低)、鼠伤寒沙门氏菌(99％降低)和单核细胞增多性李斯特菌(73％降低)发挥了抗菌作用。长达6小时，功能化吸管仍对大肠杆菌发挥抗菌作用(25％降低)。6小时后，在8小时和24小时，吸管对鼠伤寒沙门氏菌和单核细胞增多性李斯特菌的杀菌活性为零。
图6中的图表显示了将吸管插入被15-150CFU病原体/ml污染的饮用水中的真实情况。
在这种情况下，由于液体不是培养肉汤，病原体的生长要少得多，而功能化的吸管对鼠伤寒沙门氏菌(95％降低)和单核细胞增多性李斯特菌(99％降低)进行了长达24小时的杀菌活性，并且针对大肠杆菌进行了长达8小时的杀菌活恶性循环(81.5％降低)。在这方面，应该考虑的是，如果吸管被集成到用于饮用水的容器、瓶子或餐具盒中，则该容器通常会在8/12小时内清空和/或重装。
此外，从上述数据可以清楚地看出，功能化吸管是一种能够通过导致李斯特菌和沙门氏菌下降来对水进行消毒的装置，即使在24小时后它仍然对李斯特菌和沙门氏菌有效。
如分别在实施例2a和2b中报道的数据所示，作为本发明所用肽的代表的RiLK1肽对所有测试细菌均具有强杀菌活性(IC50<2μM；MBC<20μM)。
如实施例3所示，代表本发明所用肽的RiLK1肽能够以17％的结合产率结合PLA吸管的聚合物表面，产生用抗菌肽功能化的聚合物吸管；功能化吸管在水中放置24小时保持稳定，不会释放抗菌肽。
如实施例4所示，用抗菌肽RiLK1功能化并插入被病原体污染的饮用水中的PLA吸管，显示了对革兰氏阴性菌(如鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌)以及对革兰氏阳性菌(如单核细胞增多性李斯特菌)的杀菌活性。特别地，功能化的吸管对鼠伤寒沙门氏菌(95％降低)和单核细胞增多性李斯特菌(99％降低)具有长达24小时的杀菌活性，并对大肠杆菌具有长达8小时的杀菌活性(81.5％降低)。
总之，以上报道的实验数据表明，由聚合材料制成的管状导管，其外表面和/或内表面被本发明中使用的具体抗菌肽功能化，特别适用于食品和医疗领域，以防止革兰氏阴性菌和/或革兰氏阳性菌的污染。
因此，在本发明中使用的用具体抗菌肽的功能化在食品和医疗领域中具有有用的应用，例如，用于防止吸管表面上的污染，优选地在并入和可选地可从瓶子中移除的吸管表面上。
在本发明中使用的用具体抗菌肽的功能化也可有用地应用在液体食品或饮料的消毒中，例如水，它们通过吸管，优选地通过结合在瓶子中并且可选地可从瓶子中移除的吸管。
本发明中使用的抗菌肽具有选择性地与细菌膜的脂质双层相互作用，导致微生物死亡的附加优点，以及不易选择突变体和不诱导抗生素抗性现象的附加优点。
本发明中使用的聚合物具有源自100％自然资源，因此对环境的影响为零并且100％可生物降解且可堆肥的附加优点。
实施例5：本发明中使用的其他AMP肽的杀菌活性分析
测试了本发明中使用的其他AMP肽，特别是RiLK31肽(RLRWVKIWKK，SEQ ID NO:31)和RiLK3肽(RLRWVRIWRR，SEQ ID NO:3)，的杀菌活性。杀菌活性表示为：与不存在肽的对照细菌样品相比，暴露于每种肽的细菌样品中以CFU(菌落形成单位)计的活细胞百分比。所有测试均使用相同的肽浓度进行，对应于15μM。所得结果如表4所示。
表4
肽 大肠杆菌 葡萄球菌 沙门氏菌 李斯特菌
RiLK1 100％ 96.9％ 100％ 99.5％
RiLK31 100％ 83％ 100％ 98.8％
RiLK3 100％ 96％ 100％ 99％
表4显示，进一步测试的AMP肽具有与在本说明书的实验1-4中用作代表性肽的RiLK1肽相当的杀菌活性。
实施例6：通过计算分析和与现有技术的HE10肽比较来表征本发明中使用的其他AMP肽
在生物信息学中，序列比对是一种组织DNA、RNA或蛋白质序列的方法，以识别可能由序列之间的功能、结构或进化关系产生的相似性区域。氨基酸残基的比对序列通常表示为矩阵中的行[Analysis Tool Web Services from the EMBL-EBI.(2013)McWilliam H,Li W,Uludag M,Squizzato S,Park YM,Buso N,Cowley AP,Lopez R.Nucleic acidsresearch 2013Jul；41(Web Server issue):W597-600 doi:10.1093/nar/gkt376；Principles and Methods of Sequence Analysis-Sequence-Evolution-Function-NCBIBookshelf(Chapter 4)Koonin EV,Galperin MY.Sequence-Evolution-Function:Computational Approaches in Comparative Genomics.Boston:Kluwer Academic；2003；Hans G.Boman(1995).Peptide antibiotics and their role in innate immunity.Annu.Rev.Immunol.1995.13:61-92]。多序列比对突出显示可能与具体特征相关的相似区域，即比其他区域更保守的结构/功能偏好。
在蛋白质序列比对中，占据序列中具体位置的氨基酸之间的相似性程度可以解释为序列中具体保守区域或基序的近似量度。在序列的具体区域中不存在取代或仅存在高度保守的取代(即侧链具有相似生化特性的氨基酸的取代)表明，该区域可能具有结构或功能重要性[Hans G.Boman(1995).Peptide antibiotics and their role in innate immunity.Annu.Rev.Immunol.1995.13:61-92；Markéta Pazderková,Petr Malo,Vlastimil Zíma,Katerina Hofbauerová,Vladimír Kopecky Jr.,Eva
Figure BDA0003964525770000271
Pazderka,Václav Cerovsky and Lucie Bednárová(2019).Interaction of Halictine-RelatedAntimicrobial Peptides with Membrane Models.Int.J.Mol.Sci.,20,631；doi:10.3390/ijms20030631；Igor Zelezetsky,Alessandro Tossi(2006).Alpha-helicalantimicrobial peptides—Using a sequence template to guide structure–activityrelationship studies.Biochimica et Biophysica Acta 1758:1436–1449；Yang Wang,Jianbo Chen,Xin Zheng,Xiaoli Yang,Panpan M,Ying Cai,Bangzhi Zhang and YuanChena(2014).Design of novel analogues of short antimicrobial peptide anoplinwith improved antimicrobial activity.J.Pept.Sci.；20:945–951.DOI 10.1002/psc.2705]。
两个氨基酸序列中在不同的位置存在相同的氨基酸残基并不是增益，相反会导致两个肽之间的相似性得分降低，因为它会导致极大的结构和功能改变。
在比较两个肽时，识别变异和定义相似性的正确方式是对齐两个序列。这意味着将一个序列放在另一个序列之上，以便更容易突出显示哪些位置相同，哪些位置不同。进行比对后，可以从每个成对比较中提取两个定量参数，即同一性和相似性。同一性定义了比对中直接匹配的氨基酸的百分比。当一个氨基酸被相似的残基取代时会产生相似性，从而保留物理化学性质。例如，从精氨酸到赖氨酸的变化保持+1正电荷。这种变化更可能是可以接受的，因为这两个残基具有相似的性质并且不损害肽的功能。因此，两个序列的相似性百分比是同一性匹配加上相似匹配的总和。相似度取决于用于比较两个氨基酸残基的标准。
例如，RiLK1肽(RLKWVRIWRR,SEQ ID NO:1)和现有技术的HE10肽(VRLIVRIWRR,SEQID NO:33)在总共10个位置中的四个位置上彼此不同。因此，它们有60％同一性。然而，考虑到四个取代对，R>V、L>R、K>L、W>I，似乎每对中的生化性质和残基的大小显著不同。因此，如下所示，与HE10相比，RiLK1肽中前四个残基的取代显著改变了肽的物理-化学和结构特性。
RLKWVRIWRR肽-RiLK1(SEQ ID NO:1)
VRLIVRIWRR肽HE10(SEQ ID NO:33)
带下划线的残基对应于两个肽不同的位置。
如表5中清楚显示的，要求保护的RiLK1肽的疏水性、亲水性、两亲性、亲合性、净电荷和无序构象倾向与HE10显著不同。已知这些特性会强烈影响肽的特性并调节它们的物理-化学特性，从而对抗菌活性产生相应的影响[Yang Wang,Jianbo Chen,Xin Zheng,Xiaoli Yang,Panpan M,Ying Cai,Bangzhi Zhang and Yuan Chena(2014).Design ofnovel analogues of short antimicrobial peptide anoplin with improvedantimicrobial activity.J.Pept.Sci.；20:945–951.DOI 10.1002/psc.2705；Hyung-SikWon,Min-Duk Seo,Seo-Jeong Jung,Sang-Jae Lee,Su-Jin Kang,Woo-Sung Son,Hyun-Jung Kim,Tae-Kyu Park,Sung-Jean Park,and Bong-Jin Lee,Structural Determinantsfor the Membrane Interaction of Novel Bioactive Undecapeptides Derived fromGaegurin 5.J.Med.Chem.2006,49,4886-4895]。已知疏水性会影响哺乳动物细胞毒性和抗菌活性。疏水残基促进与脂肪酰基链的相互作用。相对低的疏水性防止与哺乳动物细胞中发现的两性离子膜的结合，导致低毒性。然而，细菌膜的透化需要疏水性，但一些研究表明，超过最佳疏水性水平，进一步增加会导致抗菌活性丧失和毒性增加。两亲性反映了氨基酸序列在相对面上形成结构良好的疏水和亲水结构域的可能性。鲍曼指数最初被指定为蛋白结合势，后来更名为鲍曼指数。此函数计算序列中所有残基的溶解度值的总和，并且为归一化，除以残基数。鲍曼指数提供了对肽的膜结合势的总体估计。蛋白质或肽对(本质上)无序构象的倾向在细胞调节和信号传导过程中起关键作用。在不同生物条件下，蛋白质和肽显示出边际结构稳定性，并在体内反复展开和折叠。事实上，大量研究表明，变性状态的影响，例如残余结构、排除体积和内在构象倾向，在分子识别、变构信号、折叠和稳定性中起关键作用[Peter Tompa,Eva Schad,Agnes Tantos and Lajos Kalmar(2015).Intrinsicallydisordered proteins:emerging interaction specialists.Current Opinion inStructural Biology,35:49–59.doi.org/10.1016/j.sbi.2015.08.009]。
表5
RiLK1 HE10
半衰期(秒) 855.71 835.91
疏水性 -0.56 -0.36
亲水性 -1.12 0.23
两亲性 1.35 0.98
亲合性 0.31 0.02
净电荷 5.0 4.0
鲍曼指数 4.67 3.45
无序构象的倾向性 -0.61 -0.09
因此，表5清楚地表明，本发明中使用的RiLK1肽和现有技术的HE10肽在化学-物理性质方面表现出相当大的差异。因此，60％同一性百分比(在任何情况下都应该被认为较低)似乎无论如何不能被认为预测了两个肽之间的化学-物理相似性和由此的功能相似性。
表6中的数据进一步证实了这一点，其显示了用相同算法对本发明的4种其他AMP肽进行的相同预测。这4种肽也表现出疏水性值、亲水性值、两亲性值、亲合性值、净电荷值、鲍曼指数值和无序构象倾向值彼此相似并且与RiLK1相似，但与HE10相比完全不同。
表6
RiLK1 RiLK2 RiLK4 RiLK7 RiLK23 HE10
半衰期(秒) 855.71 855.71 920.11 855.71 920.11 835.91
疏水性 -0.56 -0.56 -0.49 -0.56 -0.49 -0.36
亲水性 -1.12 -1.12 -1.06 -1.12 -1.06 0.23
两亲性 1.35 0.98
亲合性 0.31 0.31 0.31 0.31 0.31 0.02
净电荷 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 4.0
鲍曼指数 4.66 4.66 5.6 4.66 3.73 3.45
无序构象的倾向性 -0.61 -0.61 -0.62 -0.61 -0.59 -0.09
发明人还发现，存在多于一个色氨酸(W)残基——本发明所有AMP肽共有的特征——在确定抗菌特性方面起着重要作用，因为它代表了脂质双层之间界面区域的有利且独特的特征。还已知的是，色氨酸残基的侧链参与在水溶液中的肽折叠[David I.Chan,Elmar J.Prenner,Hans J.Vogel(2006).Tryptophan-and arginine-rich antimicrobialpeptides:Structures and mechanisms of action.Biochimica et Biophysica Acta1758；1184–1202doi:10.1016/j.bbamem.2006.04.006]。考虑到一级结构和二级结构对抗菌活性的影响，呈现两亲结构的能力是AMP掺入细菌膜的功能性重要特征[MarlonH.Cardoso,Karen G.N.Oshiro,Samilla B.Rezende,Elizabete S.Candido,OctávioL.Franco.The Structure/Function Relationship in Antimicrobial Peptides:WhatCan we Obtain From Structural Data？Advances in Protein Chemistry andStructural Biology·February 2018,DOI:10.1016/bs.apcsb.2018.01.008]。本发明的所有AMP肽至少在序列的中心部分插入了第二个色氨酸残基，其目的是增强螺旋的两亲性。
胶束环境(SDS)中RiFK1肽的NMR分析清楚地证明，在螺旋排列中存在界定明确的结构，其将带正电荷的侧链和疏水侧链置于相对的两侧。在这种排列中，所有带电荷的侧链都是相同取向的，并且易于与SDS胶束的带负电荷的表面相互作用。
此外，存在于表征本发明中使用的所有AMP肽的W-X-X-X-W基序中的色氨酸残基的两条侧链，位于相互堆叠的合适距离处，从而有助于稳定螺旋。
另一方面，WO2015038339中描述的HE10十肽及其所有10个氨基酸长度的类似物不含表征本发明中使用的AMP肽的W-X-X-X-W基序，并且由于上述原因，所述基序代表了杀菌活性的功能性重要特征。
因此，本发明中使用的AMP肽在结构上和功能上都与现有技术的HE10肽不相似。
序列表
<110> 马特利艾斯有限责任公司（Materias s.r.l.）
<120> 抗菌管状导管
<130> E0131456-PC1840EC
<160> 33
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AMP
<400> 1
Arg Leu Lys Trp Val Arg Ile Trp Arg Arg
1 5 10
<210> 2
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AMP
<400> 2
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<211> 10
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<213> 人工序列
<220>
<223> AMP
<400> 3
Arg Leu Arg Trp Val Arg Ile Trp Arg Arg
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<213> 人工序列
<220>
<223> AMP
<400> 4
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AMP
<400> 5
Arg Leu Lys Trp Val Lys Ile Trp Arg Arg
1 5 10
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AMP
<400> 6
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1 5 10
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AMP
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1 5 10
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<211> 10
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<213> 人工序列
<220>
<223> AMP
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<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
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<223> AMP
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<223> AMP
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Arg Leu Arg Trp Val Arg Ile Trp Lys Arg
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<220>
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<223> AMP
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<213> 人工序列
<220>
<223> AMP
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Arg Leu Arg Trp Val Arg Ile Trp Arg Lys
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AMP
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Lys Leu Lys Trp Val Arg Ile Trp Arg Lys
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Arg Leu Arg Trp Val Lys Ile Trp Arg Lys
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<212> PRT
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<220>
<223> AMP
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Lys Leu Lys Trp Val Lys Ile Trp Arg Lys
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<220>
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Arg Leu Lys Trp Val Arg Ile Trp Lys Lys
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AMP
<400> 26
Lys Leu Arg Trp Val Arg Ile Trp Lys Lys
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AMP
<400> 30
Lys Leu Arg Trp Val Lys Ile Trp Lys Lys
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Arg Leu Arg Trp Val Lys Ile Trp Lys Lys
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Lys Leu Lys Trp Val Lys Ile Trp Lys Lys
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<210> 33
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HE10
<400> 33
Val Arg Leu Ile Val Arg Ile Trp Arg Arg
1 5 10

Claims (10)

1.一种包括外表面和内表面的管状导管，其特征在于所述外表面和/或内表面的至少一部分被由具有以下通式的氨基酸序列组成的至少一种抗菌肽或其盐或溶剂化物功能化：
X1LX2WVX3IWX4X5
其中，X1、X2、X3、X4和X5独立地选自K和R并且其中每个氨基酸独立地处于D或L构型。
2.根据权利要求1所述的管状导管，其中，所述至少一种抗菌肽与存在于所述管状导管的所述外表面和/或内表面上的反应基团共价连接或者包含在附着于其上的涂层中。
3.根据权利要求1或2所述的管状导管，其中，X1、X3、X4和X5中的至少一个具有R的含义；更优选地，X4和X5具有R的含义；还更优选地，X3、X4和X5具有R的含义；甚至更优选地，X1、X3、X4和X5具有R的含义；和/或X2具有K的含义。
4.根据权利要求1或2所述的管状导管，其中，所述至少一种抗菌肽由选自以下各项组成的组的氨基酸序列组成：RLKWVRIWRR(SEQ ID NO:1)、KLRWVRIWRR(SEQ ID NO:2)、RLRWVRIWRR(SEQ ID NO:3)、KLKWVRIWRR(SEQ ID NO:4)、RLKWVKIWRR(SEQ ID NO:5)、KLRWVKIWRR(SEQ ID NO:6)、RLRWVKIWRR(SEQ ID NO:7)、KLKWVKIWRR(SEQ ID NO:8)、RLKWVRIWKR(SEQ ID NO:9)、KLRWVRIWKR(SEQ ID NO:10)、RLRWVRIWKR(SEQ ID NO:11)、KLKWVRIWKR(SEQ ID NO:12)、RLKWVKIWKR(SEQ ID NO:13)、KLRWVKIWKR(SEQ ID NO:14)、RLRWVKIWKR(SEQ ID NO:15)、KLKWVKIWKR(SEQ ID NO:16)、RLKWVRIWRK(SEQ ID NO:17)、KLRWVRIWRK(SEQ ID NO:18)、RLRWVRIWRK(SEQ ID NO:19)、KLKWVRIWRK(SEQ ID NO:20)、RLKWVKIWRK(SEQ ID NO:21)、KLRWVKIWRK(SEQ ID NO:22)、RLRWVKIWRK(SEQ ID NO:23)、KLKWVKIWRK(SEQ ID NO:24)、RLKWVRIWKK(SEQ ID NO:25)、KLRWVRIWKK(SEQ ID NO:26)、RLRWVRIWKK(SEQ ID NO:27)、KLKWVRIWKK(SEQ ID NO:28)、RLKWVKIWKK(SEQ ID NO:29)、KLRWVKIWKK(SEQ ID NO:30)、RLRWVKIWKK(SEQ ID NO:31)和KLKWVKIWKK(SEQ ID NO:32)，其中每个氨基酸独立地处于D或L构型。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的管状导管，其是饮用吸管或医用管，优选地为结合在容器中并且可选地从容器中移除的饮用吸管。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的管状导管，其中，存在于所述管状导管的外表面和/或内表面的所述至少一部分上的所述至少一种抗菌肽的摩尔数为1至10nmol×cm2所述表面，优选1.5至3nmol×cm2所述表面。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的管状导管，其由聚合材料、玻璃或金属制成。
8.根据权利要求7所述的管状导管，其由选自以下各项组成的组的聚合材料制成：苯乙烯嵌段共聚物、聚烯烃混合物、弹性体混合物、热塑性聚氨酯、热塑性共聚酯、热塑性聚酰胺、聚丙烯、聚乙烯、高密度聚乙烯、低密度聚乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚对苯二甲酸1,4-环己烷二亚甲基酯、聚2,6萘二甲酸二苯甲酸乙二醇酯、聚烯烃、聚偏二氟乙烯、聚2,6萘二甲酸乙二醇酯、丙烯腈丁二烯苯乙烯、聚氯乙烯、聚醚嵌段酰胺、可生物降解的聚合物及其混合物；优选地，其是选自以下各项的可生物降解的聚合物：聚乳酸(PLA)、聚己二酸-共-对苯二甲酸丁二醇酯(PBAT)、聚己内酯(PCL)、改性淀粉
Figure FDA0003964525760000031
或聚乙醇酸(PGA)、聚丁二酸丁二醇酯(PBS)、聚-羟基链烷酸酯(PHA)(
Figure FDA0003964525760000032
材料家族)以及它们的混合物；优选其是聚乳酸。
9.根据权利要求1、3或4中任一项所述的抗菌肽用于防止管状导管被革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、真菌、酵母菌和/或病毒污染的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其中，所述管状导管是饮用吸管或医用管，优选地是结合在容器中并且可选地从容器中移除的饮用吸管。
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