CN101111256A - 抗菌肽及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了具有可利用的、增强的或者优越性能的新型抗微生物多肽，如抗微生物活性、期望的溶血活性水平及针对革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌以及其它带有脂双层膜的细胞成分或结构组分的微生物的广谱治疗系数。同时也提供了制造和使用这些多肽来控制微生物生长及用做药用成分来治疗或预防由这些微生物所引起的感染的方法。一些多肽被公开为是利用以抗微生物肽V681为基础进行与结构相关的多肽设计而得到的，其包括在非极性表面或者极性表面的中心或附近位点进行单一的D－/L－氨基酸取代或带电氨基酸取代。还公开了带有一个或多个D－型氨基酸的多肽，包括所有氨基酸均由D－型氨基酸组成的多肽。这里所述的经过修饰的多肽可以被证实为据有以下特性的一个或多个，例如：增强的抗微生物活性、抗微生物特异性、及抵抗降解的能力。这里所述的组合物具有作为广谱抗生素的临床应用潜力。

Description

抗菌肽及其使用方法
参照相关专利申请
[0001]本申请要求于2004年12月15日提交的美国临时申请第60/636,220号的利益，所述临时申请被整体并入到本发明的内容中，而不与本发明矛盾。
联邦政府资助研发的声明
[0002]本发明获得了政府通过国家健康研究所提供的NIH基金第RO1GM61855和RO1A148717的支持。政府对本发明也享有部分权利。
发明背景
[0003]本发明涉及新型抗微生物多肽(抗菌肽)及制造和使用这些抗菌肽的方法，抗菌肽可以抑制微生物的生长，并制备成药物组合物用于治疗和预防由多种微生物所引起的感染，其中所述微生物包括革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌。
[0004]在临床上过量地使用传统抗生素已经引起许多医学上相关抗药性菌种的产生(1，2)。然而，在过去的四十年中，只有三种在结构上创新的抗生素被投入到临床实践中(恶唑烷酮类的利奈唑胺、链霉杀阳菌素和脂肽-达托霉素)，因此研发新类型抗生素具有重要意义。阳离子抗菌肽可以代表一类新型的抗生素(3-5)，虽然阳离子抗菌肽的作用模式还没有被确定，但是所有的阳离子两亲性抗菌肽都会与细胞膜相互作用，并且已经提出，细胞膜是某些抗菌肽的主要靶点，抗菌肽分子在细胞膜上的聚集会导致通透性的增加并使细胞膜丧失其屏障功能(6，7)。因此，针对这些膜活性的抗菌肽产生抗药性是几乎不可能的，原因是产生这种抗药性需要对微生物细胞膜脂成分的实质性改变。
[0005]α-螺旋型和β-折叠型抗菌肽是最主要的两大类阳离子抗菌肽(3，4，8，9)。β-折叠型抗菌肽包括由分子内二硫键固定的环形多肽，例如防卫素(10)和保护素(11)，以及具有N末端到C末端的共价键的多肽，例如短杆菌肽S(12)和短杆菌酪肽(13)。与β-折叠型抗菌肽不同，α-螺旋型抗菌肽是更加线性的分子，其在水介质中以无序结构存在，但它们通过与疏水细胞膜相互作用，呈两亲螺旋状态，例如蛾血素(14)，马加宁(15)和蜂毒肽(16)。关于这些多肽，我们已经探究了可能与抗菌活性相关的某些重要因素。
[0006]抗菌肽用作抗生素的主要障碍是其毒性或者裂解真核细胞的能力。如果抗菌肽确实作用于细胞膜，则上述障碍是必然的结果(3-6)。为了能够用作广谱抗生素，将抗真核细胞活性与抗菌活性拆分开是必要的，即增强抗菌活性的同时降低对人体细胞的毒性。
[0007]利用多肽合成的技术检验疏水性/亲水性、两亲性和螺旋性的细微改变，有助于合理设计抗菌肽的快速进展。通常，只有L-型氨基酸是存在于全部天然多肽和蛋白质中的异构体；除了在一些细菌的细胞壁中被发现外，D-型氨基酸是很少存在于天然多肽和蛋白质中的异构体。在特定条件下，D-型氨基酸破坏螺旋稳定性的特性提供了用于可控改变两亲性α-螺旋抗菌肽的疏水性、两亲性和螺旋性的系统化方法(26)。
[0008]这里，我们公开了利用两亲性α-螺旋型抗菌肽V681(28)作为结构模板，通过对其疏水和亲水表面中心用单一D-或L-氨基酸取代来系统地改变多肽两亲性\疏水性和螺旋性。肽V681已经表现出具有很优秀的抗菌活性和非常强的溶血活性(27，28)，因此可以作为我们研究的潜在的候选物。通过引入不同的D-或者L-氨基酸取代，我们这里报道疏水性/亲水性以及螺旋性对生物物理和生物学活性有引人注目的影响，并且利用该方法达到了抗菌活性和特异性的显著提高。另外，高多肽疏水性和两亲性也能引起多肽在水溶液中的强自我相互作用。我们发明了测量小的两亲分子的自我相互作用的方法，叫做高效液相色谱反相柱温度监控(29，30)，这个方法首次被应用到研究肽的形成二聚体的能力对α-螺旋型抗菌肽的生物活性的影响。通过下面的描述，本发明的优点会变得清楚。
发明内容
[0009]本发明提供了可以用作抗微生物制剂的多肽化合物和相关的方法。在本发明的实施方案中，抗微生物多肽的大小范围是指由肽键相连，长度由23个氨基酸到26个氨基酸组成的多肽，其核心部分为大约21个氨基酸。多肽化合物中的氨基酸组成可以全部是L型氨基酸构型，也可以全部是D-型氨基酸构型，或者由L-型与D-型氨基酸组成的组合。这些抗菌肽具有抗菌活性，可以杀死细菌、真菌、病毒和原生动物。这些抗菌肽总体上对任何具有细胞膜或脂双层膜组分的生物体有作用。这些抗菌肽是可以应用在人类和/或牲畜药物、兽用或者作为农业、食品及工业上试剂的有效化合物。
[0010]不希望受到任何具体理论的限制，通过对天然与人工合成抗菌肽的大量结构与活性的研究，相信一些因素对于对抗菌活性很重要。这些因素被鉴定为包括：同时存在疏水残基与碱性残基，两亲性性能将疏水残基与碱性残基分开，可诱导的或预先形成的二级结构(α-螺旋或β-折叠)。同样不希望受到任何具体理论的限制，相信通过将不同的D-型氨基酸在两亲性L-螺旋分子疏水表面中心的取代可以破坏α-螺旋结构。不同的D-型氨基酸可以将α-螺旋结构破坏到不同的程度，而这些不同程度的α-螺旋结构可以在疏水介质中再次被诱导折叠成α-螺旋。这种在特定位点的单一D-或者L-氨基酸进行取代的方法的优点为我们进一步了解抗菌肽的作用机理提供了机会。
[0011]公认的是，无论抗菌肽作用机理解释或假说最终如何修正，本发明的组合与方法依然有效、实用。
[0012]对于一些α-螺旋型或β-折叠型多肽，人们已经作了许多尝试以描绘其与抗真核细胞活性或毒性相应的特征以及与抗菌活性相应的特征。根据溶血活性所检测的，高两亲性(17-20)、高疏水性(17，20-22)及高螺旋性和β-型折叠结构(20，23，24)与高的毒性相关。相反，与溶血活性不同，抗菌活性对这些因素不那么依赖(17-21，23-25)。这里，可以通过三个途径增强对细菌的特异性(或者被定义为溶血性与抗菌活性的比值的治疗指数(TI))：提高抗菌活性；降低溶血活性并保持抗菌活性；或者在增加抗菌活性的同时降低溶血活性。
[0013]本发明提供了一种医治需要治疗的患者的方法，其包括对患者进行给药本发明的肽化合物。本发明提供一种治疗微生物感染的方法。在具体的实施方式中，微生物感染包括细菌、病毒、真菌或原生动物的一种或多种所引起的感染。在具体的实施方式中，微生物感染包括这些类型生物中的一种或多种所引起的感染，例如，两种不同的细菌所引起的感染等。
[0014]在实施方式中，本发明提供了一种提高抗菌肽抗菌活性的方法。在一个实施方式中，本发明还提供了一种降低抗菌肽溶血活性，同时保持抗菌活性或将抗菌活性的降低到最小化的方法。在一个实施方式中，本发明提供了一种提高抗菌肽的抗菌活性并降低其溶血活性，同时保持抗菌活性或将抗菌活性的降低到最小化的方法。
[0015]本发明的发明人发现了这类抗菌肽，其是基于控制改变α-螺旋型抗菌肽的疏水性/亲水性、两亲性及螺旋性，可以产生具有有用的或者增强的抗菌活性和特异性(例如提高的治疗指数)的肽的前提。这里的例子是抗菌肽衍生自26个氨基酸的抗菌肽序列的肽，其中所述26个氨基酸的序列为Ac-KWKSFLKTFKSAVKTVLHTALKISS-amide(V681，SEQ ID NO：1).。“衍生于”或者“衍生物”的概念是指发明的抗菌肽在大小上与V681抗菌肽一样或者比V681抗菌肽短，并且发明的抗菌肽具有一个或者多个氨基酸被取代，或者二者兼备；这里还描述了进一步的变化。抗菌肽化合物V681被用作框架来研究通过在多肽序列的特定位置取代一个或几个氨基酸残基，而引起的多肽疏水性/亲水性及螺旋性的改变，对抗菌肽生物活性的影响，例如，对抗菌活性和溶血活性的影响。这些取代位点包括位于两亲螺旋分子极性面和非极性面的中心或者近中心的位点，以及其它位点。抗菌肽V681被公开于Zhang等人1999和Zhang等人2001中。
[0016]在一个实施方式中，本发明提供了涉及从SEQ ID NO：2，4～14和16～25以及这里所公开的(例如实施例中所公开的)其它肽所组成的组的抗菌肽的组合物和方法。注意，SEQ ID NO：1，即肽V681，与SEQ ID NO：3和15多肽为同一序列。表1中包含在非极性面X＝13的位点上与在极性面X＝11的位点上具有取代的肽。参见表2包含其它肽类似物。
表1
表1.部分多肽序列信息汇总表
Figure A20058004749200101
[0018]表2部分多肽序列信息汇总表
 氨基酸位点
  序列编号 肽的名称 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26
  对映异构体*  L  L  L  L  L  L  L  L  L  L  L  L  L  L  L  L  L  L  L  L  L  L  L  L  L  L
  1   V681  K  W  K  S  F  L  K  T  F  K  S  A  V  K  T  V  L  H  T  A  L  K  A  I  S  S
  27   F9 to K9  K  W  K  S  F  L  K  T  K  K  S  A  V  K  T  V  L  H  T  A  L  K  A  I  S  S
  28   F5 to K5  K  W  K  S  K  L  K  T  F  K  S  A  V  K  T  V  L  H  T  A  L  K  A  I  S  S
  29   F9 to AD9  K  W  K  S  F  L  K  T  AD  K  S  A  V  K  T  V  L  H  T  A  L  K  A  I  S  S
  30   F5 to AD5  K  W  K  S  AD  L  K  T  F  K  S  A  V  K  T  V  L  H  T  A  L  K  A  I  S  S
  31   V13 to R13  K  W  K  S  F  L  K  T  F  K  S  A  R  K  T  V  L  H  T  A  L  K  A  I  S  S
32   L6-AD6，L21-AD21 K W K S F AD K T F K S A V K T V L H T A AD K A I S S
33   L6-KL6，L21-KL21 K W K S F K K T F K S A V K T V L H T A K K A I S S
  34   去除K1  W  K  S  F  L  K  T  F  K  S  A  K  K  T  V  L  H  T  A  L  K  A  I  S  S
  35   去除K1，W2  K  S  F  L  K  T  F  K  S  A  K  K  T  V  L  H  T  A  L  K  A  I  S  S
  36   去除S25，S26  K  W  K  S  F  L  K  T  F  K  S  A  K  K  T  V  L  H  T  A  L  K  A  I
37   去除I24，S25，S26 K W K S F L K T F K S A K K T V L H T A L K A
38   非极性表面重组 K I K S AD L K T L K S F K K T A A H T L F K V W S S
  39   极性面重组  S  W  S  K  F  L  K  K  F  T  K  A  K  S  H  V  L  T  T  A  L  S  A  I  K  K
*有特殊外，其他均为L型对映异构体.
[0019]在优选的实施方式中，所述分子(肽)在疏水环境中呈螺旋结构。我们已经利用圆二色谱CD监测了抗菌肽分子在50％三氟乙醇中的α-螺旋结构，50％三氟乙醇是对细胞膜疏水环境的模拟。
[0020]在一个实施方式中，成功的抗菌肽是具有期望的生物学活性的螺旋类似物，通过圆二色谱CD检测，该抗菌肽在温和环境(非变性介质，如含有100mM氯化钾，PH7的50mM磷酸缓冲液，)中具有很少的α-螺旋结构的螺旋。在一个实施方式中，该结构特征对许多可能的机理中的一种或者多种机理有重要性，例如：a)降低在温和环境中形成二聚体的能力(根据这里所描述的进行检测的)；b)允许抗菌肽分子更容易穿过细胞壁到达微生物的细胞膜。并且，在温和环境中对α-螺旋结构的破坏，仍然可以允许带正电的抗菌肽被吸引到微生物的带负电的细胞壁上(如脂多糖)，然而，特定结构的缺少可以降低细胞壁表面对抗菌肽的亲和作用，从而允许抗菌肽更易于通过细胞壁，进入到细胞膜的疏水与亲水的中间区域，在该区域抗菌肽与膜表面呈平行状态。在膜内，抗菌肽可以被细胞膜的疏水环境诱导成α-螺旋结构。由于此α-螺旋结构，我们猜测抗菌肽的非极性面可以和细胞膜的疏水部分相互作用，而其极性面上的极性基团和带正电的基团可以和细胞膜表面上磷脂带负电的基团相互作用。
[0021]在一个实施方式中，当抗菌肽呈α-螺旋结构时，抗菌肽分子呈现带净正电和两亲性。例如，α-螺旋型抗菌肽在分子的一侧有非极性或疏水表面，在分子另一侧有极性或者带正电荷的表面，即分子的两亲性。分子的两亲性可以按下述方法计算。
[0022]通过高效液相色谱反相柱RP-HPLC温度监控，在5℃～80℃的范围内，对一些抗菌肽类似物在溶液中的自我相互作用的能力进行评估。抗菌肽自我相互作用的能力是了解其抗菌活性与溶血活性的另一个重要指标。一般来说，在溶液中的高自我相互作用能力与抗菌肽较低的抗菌活性和较强的溶血活性直接相关。生物学研究表明抗菌肽强的溶血活性一般与高疏水性、高两亲性及高螺旋性呈正相关。多数情况下，带有D-型氨基酸取代的抗菌肽具有比L-型异构体更强的抗菌活性。正如这里所揭示的，抗菌肽V681针对革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌的抗菌治疗指数分别提高了90倍和23倍(用几何平均数的方法表示)。通过利用一系列选定的D-或者L-型氨基酸替换在这些两亲分子的非极性和极性面上的疏水或者亲水的氨基酸残基，我们进一步证实了本方法可以用来合理设计具有增强的活性的抗菌肽。
[0023]本发明中所例举的抗菌肽均至少含有下述两处氨基酸取代位点中的一处，两处位点在下列序列中分别用a和b表示KWKSFLKTFKaAbKTVLHTALKAISS(SEQID N0：40)，其中a和b取代位点是选自由L-亮氨酸、D-亮氨酸、L-缬氨酸、D-缬氨酸、L-丙氨酸、D-丙氨酸、甘氨酸、L-丝氨酸、D-丝氨酸、L-赖氨酸及D-赖氨酸(L-和D-光学异构形式的L、A、S、V和K，以及G)所组成的组。特别优选的抗菌肽在这里被称作NKL，D-NKD，NAD，和D-NAL，其含有下面的氨基酸序列。最优选的抗菌肽在这里被称作D-NKD。用另外一种表述方式，D-NKD也可以被表述为D-V13KD。
Figure A20058004749200121
[0024]这里，氨基酸后面的下标字母D代表该氨基酸是D-型氨基酸；与此相同的，下标L代表该氨基酸是L-型氨基酸。在抗菌肽名称中，大写母D-(非下标)表示除特指位点外，该抗菌肽全部由D-型氨基酸所组成(例如：D-NAL代表该抗菌肽除了含有非极性表面中心的L-丙氨酸取代之外全部由D-型氨酸所组成，非极性表面用大写字母N代表)。表中被框起来的氨基酸残基表示在非极性表面的中心13号位点上的不同取代序列(见图1)。
[0025]在一个实施方式中，本发明的多肽被整合在较大的多肽或者蛋白质中。在一个实施方式中，本发明的多肽以共价键或非共价键与其它组分相结合。在具体的实施方式中，所述其它组分是多聚体。
[0026]本实施方案中的抗菌肽对革兰氏阳性细菌及革兰氏阴性细菌均具有广谱抗菌活性。关于革兰氏阳性细菌与革兰氏阴性细菌的具体描述详见参考文献MedicalMicrobiology(1991)，第3版，由Samuel Baron编辑，Churchill Livingstone，NewYork。对抗菌肽敏感的细菌包括但不限于：大肠杆菌(Escherichia coli)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、干燥棒状杆菌(Corynebacterium xerosis)和炭疽杆菌(Bacillus anthracis)。本发明的抗菌肽对上述革兰氏阳性及阴性细菌的抗菌活性已经被证实，因为在本领域中熟知这些细菌被认为是革兰氏阳性及阴性细菌的模式生物，因此对这些模型细菌的生物活性可以被认为是对整个革兰氏阳性及阴性细菌家族的生物活性。
[0027]本发明的抗菌肽可以作为杀菌试剂或者抑菌试剂用来阻止传染、杀死微生物或者抑制微生物生长及其它功能，并因此可以有效治疗或者控制由这些微生物引起的感染或者造成的污染。
[0028]同时，这些抗菌肽也可以做为治疗药物或者其他活性的药物组合物，适合人类、牲畜、农业及药业使用，其包括本发明的抗菌肽中的一种或者多种以及药物上可以接受的载体。这些药物组合物可以根据本领域中已知的，进行配制和给药例如口服、注射或外用给药应用以控制和/或抑制包括革兰氏阳性及阴性细菌的宽范围微生物的感染。
[0029]在本发明的实施方式中，这里所描述的这些抗菌肽的体外抗菌活力可以精确代表其体内的抗菌活力。
[0030]药物组合物可以包含一种或更多种有治疗效用的抗菌肽及相应适当的载体。抗菌肽的治疗效用可以按本领域熟知的方法进行测定。例如，抗菌肽的使用量会根据感染的严重性、患者的年龄、身高、体重、感染的菌种和给药的途径等而变化。
[0031]本发明涉及包含杀菌有效量的一种或者多种本发明的抗菌肽以及药物上可以接受的载体的组合物。这些组合物也可以包含表面活性剂。在抗菌肽成分中添加表面活性剂有助于增强抗菌肽的抗菌效用。虽然可以使用任何适当的表面活性剂，但目前优选的表面活性剂包括：非离子表面活性剂Tween 20或者1％NP40。这些抗菌药用成分可以按不同剂型进行使用，如：表皮及静脉注射、口服或者外用。本发明中的抗菌肽在这些组合物中按重量可以占到由0.0001％～50％。
[0032]可以理解的是，作为药物应用时如通过静脉注射，药物将包含有效数量的抗菌肽并且可以根据靶点细胞的类型与其它具有特异性的分子连接。其它具有特异性的分子是指抗体、配体、受体或者其它的识别分子。在一个实施方式中，抗菌肽的选择需要考虑到实际或可能被感染宿主的免疫源性及毒性、抗菌肽的有效剂量及靶微生物对抗菌肽的敏感性的因素，这是本领域公知的。
[0033]在一个实施方式中，用本发明的抗菌肽阻止细菌生长的方法还可以包括利用这些抗菌肽与其它抗菌试剂(例如：传统抗生素)进行联合治疗或者协同治疗。这样所给药的抗菌肽的量通常依赖于细菌对抗菌肽的敏感度，诸如该细菌是革兰氏阴性还是革兰氏阳性，这对于本领域技术人员来说是容易分辨的。
[0034]在一个实施方式中，本发明还提供了一种组合物，其包含有效杀微生物量的抗菌肽以及适当的载体。这类组合物可以以多种方式用于消灭微生物，例如本领域中熟知的家庭或实验室的使用载体的制剂。
[0035]在一个实施方式中，本发明提供了包含SEQ ID NO：2的抗菌肽。在一个实施方式中，本发明提供了包含SEQ ID NO：1的衍生物的抗菌肽。在一个实施方式中，本发明提供了选自由SEQ ID NO：2，4-14，16-25及其衍生物所组成的组的抗菌肽。在一个实施方式中，衍生物是包含至少一个氨基酸残基的取代，不包括SEQ ID NO：1抗菌肽。在一个实施方式中，衍生物包括至少在氨基酸序列的一端有1个氨基酸残基的缺失。在一个实施方式中，衍生物包括至少在氨基酸序列的一端有2个氨基酸残基的缺失。在一个实施方式中，取代是指由疏水氨基酸代替亲水的氨基酸。在一个实施方式中，取代是指由亲水氨基酸代替疏水氨基酸。在一个实施方式中，取代是指用不同的亲水氨基酸代替其它的亲水氨基酸。在一个实施方式中，取代是指由不同的疏水氨基酸代替其它的疏水氨基酸。在一个实施方式中，取代是指用氨基酸残基来替换其他性质相近的氨基酸残基，例如：极性侧链、带正电的侧链、带负电的侧链等。在一个实施方式中，取代是用D-型氨基酸替代L-型氨基酸。在一个实施方式中，取代是用L-型氨基酸替代D-型氨基酸。在一个实施方式中，取代是将全部的L-型氨基酸替代为D-型氨基酸。
[0036]在一个实施方式中，抗菌肽序列KWKSFLKTFKaAbKTVLHTALKAISS(SEQID N0：40)，其中a和b指L-亮氨酸、D-亮氨酸、L-缬氨酸、D-缬氨酸、L-丙氨酸、D-丙氨酸、甘氨酸、L-丝氨酸、D-丝氨酸、L-赖氨酸及D-赖氨酸。在一个实施方式中，该抗菌肽不包括SEQ ID N0：1。
[0037]在一个实施方式中，本发明提供了这里所描述的多肽组合物，其含有多肽的片段；其中该片段的长度为至少大约14个氨基酸的连续片段、至少大约17个氨基酸的连续片段、至少大约20个氨基酸的连续片段、至少大约23个氨基酸的连续片段、至少大约24个氨基酸的连续片段或至少大约25个氨基酸长度的连续片段。在一个实施方式中，本发明提供了一种多肽组合物，其中所述组合物与这里所描述的多肽序列有至少大约70％的相似性、大约80％的相似性、大约90％的相似性或大约95％的相似性。在一个实施方式中，本发明提供了编码所述多肽的核酸序列。在一个实施方式中，本发明的肽不包括下列多肽序列中的一种或者多种：SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3，SEQID NO：15及SEQ ID NO：26。在一个具体的实施方式中，本发明的多肽不包括SEQ IDNO：1多肽。
[0038]如果这些多肽被用作抗菌药物的话，则它们可以被配制在缓冲水介质中，该水介质含有各种盐和缓冲液。这些盐的离子包括但不限于卤化物、磷酸化合物和硫酸化合物，例如：氯化纳、氯化钾或硫酸钠。可以用的不同缓冲液包括：柠檬酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、HEPES、Tris或者任何能够被治疗患者的生理条件接受的缓冲液。
[0039]如果这些肽被配制为冻干粉的形式，则可以使用不同的辅料及添加剂，用于溶液中的后继应用。辅料可以包括各种多醇、惰性粉末及其它添冲剂。
[0040]本文所使用的“治疗有效的”是指在可选用的药学上可以接受的载体中的药剂、组合物或试剂的量，即可以使被治疗患者或动物症状好转的充分剂量。“好转”是指在治疗中降低或减轻患病状态所带来的负面效应。在一个实施方式中，抗菌肽被给药给需要治疗的患者。
[0041]用于给药的药物上可以接受的载体制剂包括灭菌的水溶液、非水溶液、悬浮液、乳化液。常用的非水溶剂是丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄榄油)、注射用有机酯(如油酸乙酯)。水质载体包括水、醇水溶液、乳化液或者悬浮液如：盐水或缓冲液。注射用载体包括氯化纳溶液、Ringer右旋糖、右旋糖和氯化纳、乳酸盐化的Ringer油或不挥发性的油。活性治疗成分通常与药用辅料共同使用并与其它活性成分相匹配。合适的辅料包括水、盐水、右旋糖、甘油和乙醇或者是几种物质的混合物。静脉注射介质包括流质和营养补充剂、电解补充剂，例如常用的Ringer葡萄糖溶液等。也可含有防腐剂和其它添加剂，例如：抗氧化剂、螯合剂或者惰性气体等。抗菌肽的实用剂量、配方或成分根据不同患者的身高、体重、年龄和健康状况的情况而定，本领域技术人员可以使用描述确定临床剂量的方法和技术的下列教导以及其他已知的现有技术来确定应用的适当剂量(Spiker B.，Guide to Clinical Studies andDeveloping Protocols，Raven Press，Ltd.，New York，1984，pp.7-13，54-60；SpikerB.，Guide to Clinical Trials，Raven Press，Ltd.，New York 1991，pp.93-101；C.Craig.and R.Stitzel，eds.，Modern Pharmacology，2d ed.，Little，Brown and Co.，Boston，1986，pp.127-133；T.Speight，ed.，Avery’s Drug Treatment：Principles andPractice of Clinical Pharmacology and Therapeutics，3d ed.，Williams and Wilkins，Baltimore，1987，pp.50-56；R.Tallarida，R.Raffa and P.McGonigle，Principles inGeneral Pharmacology，Springer-Verlag，new York，1988，pp.18-20)。
[0042]在一个实施方式中，使用下列剂量：针对成人每天的合适剂量是，通常剂量范围是0.001mg/kg～100mg/kg，优选0.001mg/kg～1mg/kg。
[0043]在另一个实施方式中，本发明可以做为食品保鲜剂或者用来处理食品以控制、降低或消除潜在的致病微生物及污染物。本发明中的抗菌肽也可以用来作为消毒剂与其它灭菌产品一起使用。在一个实施方式中，应用本发明抗菌肽的治疗至少部分控制感染和污染。
[0044]在一个实施方式中，也可以将抗菌肽加入或者分散到不期望微生物生长或者出现病毒的材料中、设备上或者对象上(例如在可及表面上)来阻止细菌生长与存活，以作为通过为设备或对象施加杀菌或抑菌有效量的肽而杀菌或抑制细菌生长的方法。在一个实施方式中，这些设备和对象包括但不限于亚麻布、布料、塑料或乳胶纤维、天然橡胶、可移植设备、物体表面及贮藏设备。
[0045]在一个实施方式中，本发明提供了一种在物体表面消毒的方法，该方法包括为所述表面施加有效量的组合物的步骤，其中所述组合物包含至少一种本发明的抗菌肽。在一个实施方式中，本发明提供了消毒液，其包含本发明的至少一种抗菌肽，以及可以选择的可接受载体。
附图说明
[0046]图1表明在本研究中使用的主体多肽V681(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列及螺旋轮和螺旋网的图形。被框起来的氨基酸残基位于螺旋的极性/亲水表面，被圈起来的氨基酸残基位于非极性/疏水表面。在螺旋轮中，疏水表面用空心的弓形表示，亲水表面用实心的弓形表示。取代位点是位于亲水表面的11号位点和疏水表面的13号位点(用三角形表示)。在多肽序列中，XL和XD分别指L-型和D-型的取代氨基酸。P指亲水表面，N指疏水表面。Ac指N端乙酰化amide指C端酰胺化。氨基酸残基用单字母编码表示。
[0047]图2表明在PH7，25℃，包含100mM KCl的50mM磷酸缓冲液的条件下抗菌肽NLD，NLL(图2A)和抗菌肽NKD，NKL(图2B)的圆二色谱(CD)图谱。在图中实心符号代表抗菌肽在不含三氟乙醇水溶液中的圆二色谱CD图谱，空心符号代表含有50％三氟乙醇溶液中的图谱，使用的符号有：图2A，圆圈代表NLD，方块代表NLL；图2B菱形代表NKD，三角形代表NKL。
[0048]图3表示在PH7.4，5℃，包含100mM KCl的50mM磷酸缓冲液的条件下抗菌肽V681，D-V681(图3A)和抗菌肽D-NKD，NKL(图3B)及抗菌肽NAD，D-NAL(图3C)的圆二色谱(CD)图谱。在图中，实心符号代表抗菌肽在不含三氟乙醇水溶液中的圆二色谱CD图谱，空心符号代表含有50％三氟乙醇溶液中的图谱，使用的符号有：圆圈代表L-型多肽V681，NKL和NAD；菱形代表D-型多肽，D-V681，D-NKD，D-NAL。
[0049]图4表示抗菌肽V681温度变性的圆二色谱CD图谱。图4A表示在疏水介质中由5℃到80℃的温度范围内V681螺旋构象的变化。实验在含有50％的三氟乙醇的0.05％三氟乙酸溶液(pH 2)中进行。不同温度下的圆二色谱CD图谱以不同的线形代表；图4B：表示抗菌肽V681温度变性中的圆二色谱CD稳定性曲线。
[0050]图5表示抗菌肽V681及其类似物的反相高效液相色谱温度曲线。实验条件：高效液相色谱反相柱，narrowbore SB-C8柱(150×2.1mm内径；5μm粒径；300孔径)，A-B线性洗脱梯度为1％乙腈/min，洗脱速度为0.25ml/min。其中，A流动相为含有0.05％三氟乙酸的水，B流动相为含有0.05％三氟乙酸的乙腈。在5℃到80℃的温度变化范围内，每升温3℃收集一次实验数据。图中空心标识表示L-型氨基酸取代后的V681温度变化曲线(图5A表示极性面取代多肽，图5C表示非极性面的取代的多肽)；实心标识表示D-型氨基酸取代后的抗菌肽V681温度变化曲线(图5B表示极性面取代抗菌肽，图5D表示非极性面的取代的抗菌肽)。在所有图中，抗菌肽V681的位点取代，无论是极性面还是非极性面上，氨基酸都采用如下标识：圆圈代表Val，方块代表Leu，菱形代表Ala，三角代表Ser，反相三角代表Lys，叉(X)代表Gly。无序结构肽C1作为对照，用加号(+)表示。
[0051]图6表示多肽V681及其类似物的反相高效液相色谱温度曲线的校正曲线。温度曲线都以无序结构肽C1的保留行为为标准进行校正。分析柱和实验条件见图4。抗菌肽的保留行为都通过如下公式来进行校正：抗菌肽(tR t-tR 5)-无序结构肽C1(tR t-tR 5)。tR t表示抗菌肽或者无序结构肽C1在特定温度条件下的保留时间；tR 5表示5℃条件下的保留时间。空心标识表示L型氨基酸取代后的抗菌肽V681温度变化曲线(图6A表示极性面取代多肽，图6C表示非极性面的取代的多肽)；实心标识表示D型氨基酸取代后的抗菌肽V681温度变化曲线(图6B表示极性面取代多肽，图6D表示非极性面的取代的多肽)。在所有图中，多肽V681的取代位点，无论是极性面还是非极性面上，氨基酸都采用如下标识：圆圈代表Val，方块代表Leu，菱形代表Ala，三角代表Ser，反相三角代表Lys，叉(X)代表Gly。
[0052]图7代表更多的采用不同的方法产生的抗菌肽类似物：取代位点，取代特性，多位点取代，序列截短或者重组。图7A表示特定的多肽序列，图7B表示非极性面上氨基酸残基的序列重组，图7C表示极性面上氨基酸残基的序列重组。
[0053]图8表示抗菌肽的保留行为随着反相高效液相色谱温度升高的变化。实验条件如下：反相高效液相色谱，narrowbore SB-C8柱(150×2.1mm内径；5μm粒径；300孔径)，A-B线性洗脱梯度为0.5％乙腈每分钟，洗脱速度为0.35毫升每分钟。其中，A流动相为含有0.2％三氟乙酸的水，B流动相为含有0.2％三氟乙酸的乙腈。图8A表示多肽的保留时间随着温度改变的变化。图8B表示通过公式tR t-tR 5校正以后的抗菌肽的保留时间，tR t表示多肽或者无序结构肽C1在特定温度条件下的保留时间；tR 5表示5℃条件下的保留时间。图8C表示通过公式：多肽(tR t-tR 5)-无序结构肽C1(tR t-tR 5)校正以后的多肽的保留时间。在所有图中，都采用如下标识：圆圈表示V681和D-V681，菱形表示NAD和D-NAL，方块表示NKL和D-NKD，三角表示无序结构肽C。
[0054]图9表示多肽对人红血细胞的溶血作用。实心标识表示L-型氨基酸取代后的抗菌肽，空心标识表示D-型氨基酸取代后的多肽。在溶血研究中，不同的标识被用于代表不同浓度的抗菌肽。
[0055]图10表示多肽针对胰蛋白酶水解的稳定性。实心标识表示L-型氨基酸取代后的多肽，空心标识表示D-型氨基酸取代后的多肽。圆圈表示V681和D-V681，方块表示NKL和D-NKD，菱形表示NAD和D-NAL。
[0056]图11表示多肽NKL及其不同亮氨酸取代的类似物的非极性面螺旋网状图。非极性面上的疏水氨基酸残基用框来表示。取代的亮氨酸残基为红色，其中参与i→i+3和i→i+4疏水作用的亮氨酸为黄色。通过i→i+3和i→i+4疏水作用用黑色条带表示，图中数字表示非极性面上疏水相互作用的数目。氨基酸用单字母简称表示。
[0057]图12表示多肽的疏水性与抗菌活性(最低抑菌浓度)以及溶血活性(最低溶血浓度)的相关性。实心标识和虚线表示多肽的疏水性与溶血活性的相关性；空心标识和实线表示多肽的疏水性与抗菌活性的相关性。多肽疏水性采用室温条件下反相高效液相色谱的保留时间来表示。所画线条只作为示意用途。
[0058]图13表示抗菌肽V681和V13KL的空间填充模型。位于螺旋的非极性面上的疏水氨基酸为绿色；位于螺旋的极性面上的亲水氨基酸为灰色；多肽骨架为白色。位于螺旋的非极性面上的13位点的取代赖氨酸(V13KL)为蓝色。模型图片采用PyMOL0.98版本制作。
发明详述
[0059]总体来说，这里使用的术语和短语都有它们在本领域中被认可的含义，这可以通过引用标准教科书、杂志文献及本领域技术人员知道的知识而被发现。提供下面的定义以澄清它们在本发明中的具体应用。
[0060]这里所使用的术语“氨基酸”是指任何自然或非自然的氨基酸，无论是自然的还是人工合成的，其包括任何L-型和D-型的。该术语也包含在多肽类似物或类肽中所使用的氨基酸类似物。该术语还包括被修饰的、非自然的氨基酸、或合成的氨基酸衍生物，如：二氨基丁酸和二氨基丙酸等。
[0061]本发明的抗菌肽是由以肽键连接的氨基酸构成的。在疏水条件下，抗菌肽一般呈α-螺旋构象。抗菌肽的序列一般是按照从氨基端到羧基端。除非特别提出，氨基酸是L-型氨基酸，当多肽全部由L-型氨基酸所组成称为L-对映异构体。当多肽全部由D-型氨基酸所组成称为D-对映异构体。
[0062]术语“最低抑菌浓度”(MIC)是指抗菌药物(例如抗菌肽)在某些条件下(例如在液体培养基中)阻止细菌生长或以其它方式改变其生理功能所需的最低浓度，可通过本领域中数值的标准技术来确定针对不同细菌的最低抑菌浓度。
[0063]术语“最低溶血浓度”(MHC)是指抗菌药物或抗菌肽在一定条件下造成血细胞溶血所需的最低浓度。MHC可以利用包括人血红细胞(hRBC)在内的不同种族的血红细胞(RBC)来测定。
[0064]术语“治疗指数”(TI)是指抗菌药物的最低溶血浓度(MHC)除以最低抑血浓度(MIC)得到的比率。它的数值越大代表抗菌特异性越高。
[0065]术语“稳定性”是指在给定的环境下抵抗降解，保持和/或维持一定结构的能力。例如：抗菌肽的稳定性可以指抵抗蛋白水解酶的降解及保持α-螺旋构象。
[0066]本文中使用下列缩写：A，Ala，丙氨酸；M，Met，甲硫氨酸；C，Cys，半胱氨酸；D，Asp，天冬氨酸；E，Glu，谷氨酸；F，Phe，苯丙氨酸；G，Gly，甘氨酸；H，His，组氨酸；I，Ile，异亮氨酸；K，Lys，赖氨酸；L，Leu，亮氨酸；N，Asn，天冬酰胺；P，Pro，脯氨酸；Q，Glu，谷氨酰胺；R，Arg，精氨酸；S，Ser，丝氨酸；T，Thr，苏氨酸；V，Val，缬氨酸；W，Trp，色氨酸；Y，Tyr，酪氨酸；RP-HPLC，高效液相色谱；MIC，最低抑菌浓度；MHC，最低溶血浓度；CD，圆二色谱CD；TFE，三氟乙醇；TFA，三氟乙酸；RBC，血红细胞；hRBC，人血红细胞。
[0067]术语“抗微生物活性”是指本发明的多肽改变目标微生物的功能或生理过程的能力，例如：部分影响微生物的复制、赘生物的生长、毒素的产生、存活、休眠状态的生活力或其它属性。在实施方式中，本发明中这个定义是指抑制微生物生长。在具体的实施方式中，抗微生物活力是指本发明中的多肽杀死至少一种细菌的能力。在具体的实施方式中，所述细菌是从由革兰氏阳性或阴性细菌所组成的组中选出的。在实施方式中，该术语可以本发明中该术语可以表示为杀死微生物或者抵制微生物的生长。
[0068]短语“增强生物特性”是指按照本发明所描述的方法或者其它常规实验方法操作的，实验抗菌肽与对照抗菌肽(如V681)相比较展现出具有低的溶血活性伴随/或者高的抗菌活性，或者高的抗菌活性伴随/或者低的溶血活性。一般来说，抗菌肽的“增强生物特性”反应在“治疗指数”(TI)中，其治疗指数较对照抗菌肽为高。
[0069]术语“微生物”宽泛地指细菌、真菌、病毒和原生动物。特别的，该术语可以指具有脂双层结构的细胞或结构组分的微生物。在具体的实施方式中，所述膜是细胞膜。通常包括本领域中已知的病原菌、真菌、病毒和原生动物。细菌包括革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌及柔膜细菌家族如支原菌属(Mycoplasma)和无胆甾原体属(Acholeplasma)的种类。一些可能敏感的革兰氏阳性细菌的具体例子包括但不限于大肠杆菌(Escherichia coli)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella)、嗜血杆菌(Hemophilus influenza)、奈瑟菌(Neisseria)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)和幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)。可能敏感的革兰氏阳性细菌的例子包括但不限于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermis)、无乳链球菌(Staphylococcus agalactiae)、A组链球菌、酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、B组革兰氏阳性链球菌、干燥棒状杆菌(Corynebacterium xerosis)和单核细胞增多性李司氏菌(Listeriamonocytogenes)。可能敏感的真菌的例子包括酵母如白色念珠菌(Candidaalbicans)。可能敏感的病毒的例子包括麻疹病毒，单纯疱疹病毒(HSV-1和HSV-2)、疱疹家族成员(HIV)、丙型肝炎病毒、带状疱疹病毒、绵羊髓鞘脱落病毒、细胞巨化病毒。敏感的原生动物包括贾第虫属(Giardia)。
[0070]“治疗有效的”是指在药学上可以接受的载体中的制剂、组合物或试剂或者生理上可以接受的活性化合物的盐的量，即是指可以使被治疗患者、动物、物质或客体的不良状态好转的足够剂量。“好转”是指在接受治疗的过程中，降低或减轻病症所带来的负面效应或者降低感染。
[0071]本发明中的抗菌肽自身具有抗菌活性，或者当它们以共价键或以其它方式偶联或者结合其它分子(例如：聚乙二醇或载体蛋白如牛血清白蛋白)时具有抗菌活性，只要抗菌肽能够接触靶微生物细胞的表面，它们依然具有抗菌活性。在不破坏或大规模改变抗菌活性的前提下，依据本领域中已知的方法可以对抗菌肽分子进行修饰，只要其抗菌活性不被破坏或者基本上不受到破坏。
[0072]可以通过下述的非限制性实施例对本发明进一步加深了解。
[0073]例1，抗菌肽V681衍生物的修饰后活性。
[0074]在下面阐述的研究中，拥有序列Ac-KWKSFLKTFKSAVKTVLHTALKAISS-amide(V681，SEQ ID NO：1)的26-残基多肽被作为模板来研究由在两亲螺旋的极性和非极性表面的中心，用一个或多个氨基酸取代所引起的多肽疏水性/亲水性、两亲性及螺旋性的变化对多肽生物活性的影响。这些研究证实了：1)多肽自我相互作用参数在从头设计两亲的α-螺旋型抗菌肽的重要性；2)利用D-型氨基酸在水环境中破坏α-螺旋型结构或者利用亲水/带电荷的氨基酸在非极性表面的取代可以大大地改变抗菌特异性；3)这些取代抗菌活性，降低毒性并且增加抗菌特异性，同时保持对革兰氏阴性和阳性细菌的广谱抗菌性。
[0075]多肽V681，一个有26个氨基酸残基的，拥有一个极性和一个非极性表面的两亲抗菌肽(28)，在本研究中作为模板多肽(图1)。它的极性表面由14个氨基酸组成：6个赖氨酸、1个组氨酸、4个丝氨酸和3个苏氨酸。相比之下，其非极性表面含有12个氨基酸：3个丙氨酸、2个缬氨酸、3个亮氨酸、2个苯氨酸、1个异亮氨氨和1个色氨酸。本研究中我们选择了螺旋疏水表面中心(位点13)和亲水表面中心(位点11)作为D-/L-氨基酸取代位点，这两个位点同时也处于整个多肽序列的中心。根据我们前期模型多肽的研究(26，31，34)证实，中心位置取代对多肽二级结构的影响最大。为了研究改变疏水性/亲水性对多肽生物活性的影响，在设计V681类似物中，由20种天然氨基酸中选出5种L-型氨基酸(Leu，Val，Ala，Ser，Lys)和Gly作为取代氨基酸，它们代表一个范围较大的疏水性。这6种氨基酸疏水性的次序是Leu＞Val＞Ala＞Gly＞Ser＞Lys(26)。根据氨基酸侧链的相对疏水性(26)，亮氨酸用来取代非极性表面原有的缬氨酸以增强多肽的疏水性和两亲性；选择丙氨酸是为了降低疏水性同时保持多肽的高螺旋性；亲水氨基酸，丝氨酸被用来在V681的非极性表面降低其疏水性/两亲性；带正电荷的赖氨酸可以进一步降低多肽疏水性和两亲性。此较而言，由于V681极性表面的原有氨基酸是丝氨酸，在多肽的极性表面进行相同的氨基酸取代将对疏水性/亲水性和两亲性的改变带来不同的效果。结果是，在极性表面，亮氨酸，缬氨酸和丙氨酸可以增加多肽的疏水性，同时降低V681的两亲性，而赖氨酸可以增加其亲水性及两亲性。Kondejewski等(20，35)和Lee等(25)的前期研究，成功的短杆菌肽S类似物上D-型氨基酸取代拆分抗菌活力与溶血活力。本研究中，5个取代氨基酸的D-型异构体也被用在同一位置进行取代来改变疏水性/亲水性及两亲性，并且，更重要的是，破坏多肽的螺旋结构。由于甘氨酸没有侧链且不具光学活性，因此甘氨酸取代多肽可以作多肽异构体的参照。
[0076]由于大多数多肽类似物是由在V681的极性或非极性表面利用单一氨基酸取代得来的，多肽可能分为两大类，N-多肽(非极性表面取代)和P-多肽(极性表面取代)。每个多肽均用它的取代氨基酸来命名，例如，在V681非极性表面带有L-亮氨基酸取代的多肽叫NLL。值得注意的是，由于在非极性表面的L-缬氨酸与极性表面的L-丝氨酸是V681原有的氨基酸(图1)，多肽NVL和PSL与V681事实上是同一多肽。
[0077]在利用高效液相色谱反相柱温度监控来衡量多肽聚合能力时，一个呈无序结构的多肽(多肽C)被作为对照多肽。如前期研究所示(29)，这个序列为乙酰-ELEKGGLEGEKGGKELEK-酰胺(SEQ ID NO：26)的18个残基多肽，即使在低温5℃和强α-螺旋诱导剂50％三氟乙醇(TFE)存在的条件下，依然呈无序结构([θ]222＝-3,950)。
[0078]为了测定不同环境下的多肽二级结构，我们在近生理PH和离子长度条件下(100mM KCl的50mM磷酸缓冲液pH 7)及含有50％三氟乙醇的溶液来模拟细胞膜的疏水环境的条件下对多肽类似物进行圆二色谱(CD)的测定。天然多肽V681不含50％三氟乙醇的缓冲液环境中呈现较低的α-螺旋构象，而在50％三氟乙醇的环境中呈现很高的螺旋构象，即[θ]222由-12,900变化到50％TFE中的-27,300，代表着α-螺旋成分由45％增加至94％(表3)。表3中，在温和条件下，D-型氨基酸取代的肽通常比L-异构体的α-螺旋度低得多。正如我们模型多肽的前期研究所示(26)，D-型多肽可以忽略的二级结构的特性所表现出的极少量螺旋结构反映了单一D-型氨基酸取代的螺旋破坏特性。在非极性表面，原有的L-缬氨基酸对维持α-螺旋结构极为重要。用疏水性较低的氨基酸(L-Ala，Gly，L-Ser和L-Lys)来取代L-Val显著降低了α-螺旋结构(NVL，的[θ]222数值为-12,900而NSL，NKL，NG和NAL的数值为-1,300至-3,450)(表3)。即使利用L-Ala，20种氨基酸中具有α-螺旋倾向性最高的氨基酸(34)来取代也无法稳定α-螺旋结构。这表明维持非极性表面的疏水性对于维持α-螺旋结构至关重要。相反，在非极性表面用疏水性更强的氨基酸来取代(用L-Leu取代L-Val)可以大幅度增加α-螺旋结构([θ]222由NVL的-12,900增至NLL的-20,600)。值得注意的是，在非极性表面，温和缓冲液中L-多肽的螺旋程度与取代氨基酸的疏水性有关，即NLL＞NVL＞NAL＞NSL，NKL又一次证实了非极性表面的疏水性对于保持α-螺旋结构的重要性。在非极性表面，由于它们的螺旋破坏性，在温和介质中D-Val和D-Leu取代多肽的螺旋结构比它们的L-对映体多肽有大幅度降低，然而，在非极性表面，无论用D-或L-氨基酸进行取代，在含有50％TFE条件可诱导出很强的螺旋结构，呈现膜的疏水性和α螺旋诱导性(表3)。从表3，很清楚的，尽管D-氨基酸取代的多肽在50％TFE中被强烈诱导成螺旋结构，但它们的螺旋性仍然较其L-对映体为低，这表明即使在疏水环境中D-氨基酸与它们的L-对映体相比，依然对α-螺旋结构有破坏作用。
[0079]表3多肽V681类似物的圆二色谱数据
  肽a 温和条件b 50％三氟乙醇d
XL e   XD e XL e XD e
[θ]222     ％螺旋率c   [θ]222     ％螺旋率c [θ]222     ％螺旋率c [θ]222    ％螺旋率c
  NLNVfNANSNKNGPLPAPSfPVPKPG -20,600-12,900-3,450-1,300-1,450-2,250-10,850-13,600-12,900-7,550-5,950-4,550     714512458374745262116   -7,350-2,800-2,850-1,700-2,000-2,950-3,050-2,800-2,400-2,500     2510106710111089 -28,250-27,300-28,950-27,550-26,250-24,350-28,550-27,600-27,300-23,050-27,350     9894100959184999594809490 -25,750-26,000-24,600-22,200-23,600-26,100-27,300-26,000-20,800-27,800    89908577829094907296
a.多肽根据5℃相对于亲本类似物V681的疏水性排序。N表示非极性表面；P代表极性表面(图1)。
b.主要氨基酸残基摩尔椭圆率，[θ]222，(deg.cm2.dmol-1)，25℃在温和缓冲液(100mM KCl，50mM PO4pH7.0)中于220nm波长处测量。
c.多肽的螺旋含量(百分数)表示多肽类似物与NAL在50％三氟乙醇中的摩尔椭圆率的相对比值。
d.主要氨基酸残基摩尔椭圆率，[θ]222，(deg.cm2.dmol-1)，25℃在以三氟乙醇(TFE)1∶1(v/v)稀释的温和缓冲液中于222nm波长处测量。
e.XL和XD分别表示L-和D-氨基酸取代。
f.NVL和PSL与亲本肽V681为同一种物质。
[0080]本研究中，在极性表面的L-取代物在温和介质条件下呈现出与在非极性表面的同样取代相比截然不同的影响α-螺旋结构的效果。例如，NLL([θ]222是-20,600)不同于PLL([θ]222是-10,850)，表明Leu在非极性表面可以稳定α-螺旋结构而在极性表面则破坏螺旋结构。同样地，Val在极性表面也会破坏螺旋结构；另一方面，与其它氨基酸取代相比，Ala和Ser在非极性表面破坏螺旋结构，而在极性表面取代时稳定α-螺旋结构。综上所述，虽然Ala在所有氨基酸中具有最高的α-螺旋倾向性(34)，它的高螺旋倾向性也无法满足非极性表面对疏水的需求([θ]222对于多肽NAL，为-3,450而对于NLL为-20,600)；而在极性表面，多肽PAL在温和环境中相对于PLL表现出强螺旋结构([θ]222对PLL为-13,600，对于PLL为-10,850)(表3)。值得注意的是，在极性表面Val和Leu的取代在降低螺旋两亲性的同时增强了疏水性；然而，与原有PSL相比螺旋含量较低，表明对于增加螺旋含量而言有一个两亲性与疏水性的平衡。与非极性表面的取代相似，在温和介质中，所有极性表面的D-氨基酸取代物均破坏螺旋的稳定性；然而，添加50％TFE可以诱导产生高螺旋性。如表3所示，非极性表面取代物较极性表面类似物在温和条件的摩尔椭圆度值上表现出更大的范围，这表明非极性表面上的氨基酸残基的螺旋对于多肽的二级结构比极性表面上的氨基酸残基扮演更重要的角色。意料之中的是，由于Gly的低α-螺旋倾向性(34)，无论在极性或非极性表面它均破坏α-螺旋结构。
[0081]图2表示在非极性表面上的疏水性最强和疏水性最弱的取代物的圆二色谱CD图谱。在温和条件下，由于D-氨基酸的螺旋破坏性，多肽NLD显现较NLL低得多的螺旋性；然而，在50％TFE中，两个多肽均被诱导成完全螺旋结构(图2A)。相反，在温和条件下，由于非极性表面用D-或L-Lys替代原有的L-Val而降低疏水性及两亲性的综合作用，多肽NKL和NKD呈无序结构；而在50％TFE中，两个多肽再次被诱导成高螺旋结构，尽管NKL的螺旋性较NKD稍多一点。
[0082]接下来，我们设计了V681、NKL和NKD的类似物的对映异构体多肽。多肽V681和NKL全部是由L-型氨基酸组成，而D-V681和D-NKD全部由D-型氨基酸组成。对于多肽NAD和D-NAL，在序列位点13上分别是D-丙氨酸和L-丙氨酸(表1)。因此，D-V681、D-NKD和D-NAL在立体化学上与相应的V681、NKL和NAD完全相反。在利用高效液相色谱反相温度监控来测定多肽形成二聚体的能力时，我们设计了一个呈无序结构的对照多肽C作这标准物(53，19，29)。
[0083]为了鉴定在不同环境中D-对映异构体的二级结构，我们在温和条件(100mM KCl，50mM KH2PO4/K2HPO4，pH7.4，叫做KP缓冲液)以及50％三氟乙醇(TFE)中(模拟细胞膜的疏水环境)中圆二色谱CD测定这些多肽类似物的圆二色谱CD。如图3所示，亲本多肽V681在KP缓冲液中只呈部分螺旋；多肽NKL和NAD分别由于在疏水表面引入亲水氨基酸L-赖氨酸和D-丙氨酸的螺旋破坏作用在KP缓冲液中呈现可以忽略的二级结构。然而，在含有50％TFE时，全部3个L-多肽均充分折叠成α-螺旋结构并显示出相似的摩尔椭圆度和螺旋性(表4)。意料之中的是，D-多肽图谱与L-多肽图谱呈完全镜像关系，其摩尔椭圆度也呈正负关系的相近数值(表4)。
[0084]表4多肽类似物的生物物理数据
 肽a     疏水性b     水溶液   50％三氟乙醇     PA e
    tR5(分钟)     tR80(分钟)     [θ]222 c    ％螺旋率d   [θ]222 c    ％螺旋率d
 V681D-V681NADD-NALNKLD-NKD     96.696.681.281.274.974.9     88.888.873.273.264.764.7     -1300013050-40004000-14001500    4646141455   -2795028100-2500025050-2700026950    9910089899696     7.27.24.14.12.12.1
a.多肽序列见表1。
b.将多肽按照其总的疏水性，即在pH 2条件下，在5℃和80℃时，RP-HPLC中的保留时间(tR)的降低顺序进行排列。
c.在5℃条件下，在222nm波长处通过圆二色谱分别测定在温和条件(100mM KCl，50mM PO4 pH7.0)或含有50％三氟乙醇的温和缓冲液中的主要氨基酸残基摩尔椭圆率，[θ]222，(deg.cm2.dmol-1)。摩尔椭圆率为负值表示左手螺旋，正值表示右手螺旋。
d.多肽的螺旋含量(百分数)表示多肽类似物与NAL在50％三氟乙醇中的摩尔椭圆率的相对比值e.PA表示在RP-HPLC温度曲线中，每种多肽的二聚常数。在温度变化范围内，用最大的保留时间差值即((tR t-tR 5螺旋肽)-(tR t-tR 5对照组无序结构肽C))来表示，其中，(tR t-tR 5)表示多肽在特定温度(t)时与在5℃条件下的保留时间差.
[0085]我们下一步用高效液相色谱反相柱温度监控的技术来确定V681各种类似物自我相互作用的能力，自我相互作用是通过这些两亲性的α-螺旋的非极性表面相互作用而实现的。前期工作中，利用全部20种氨基酸取代到两亲α-螺旋模型肽的疏水表面中心我们得出这些模型肽在40％TFE中可以被最大限度诱导成α-螺旋结构，在温度变性中α-螺旋的稳定性取决于氨基酸取代(26)。为了研究V681在疏水环境中的稳定性，我们进行圆二色谱在水溶液中的温度变性实验。我们利用0.05％TFA水溶液同时含有50％TFE为介质来模拟反相柱的疏水条件(疏水的固定相和在流动相中的疏水有机试剂)，由于反相柱的疏水环境和TFE一样可以诱导α-螺旋结构。图4A表示在疏水介质中温度由5℃到80℃V681螺旋构象的变化。在5℃时50％TFE诱导V681呈完全α-螺旋结构。在温度变性中，V681的螺旋成分随着温度的增加而降低，但即使在80℃时它依然呈现明显的α-螺旋结构。图4B表明V681稳定性的转换温度Tm是79.3℃，在这里Tm表示与多肽在5℃50％TFE的条件下相比丧失50％α-螺旋结构时的温度。这些数据表明在RP-HPLC温度监控过程中，在低温如5℃时多肽呈完全螺旋状态，分配在RP-HPLC期间在80℃时，它们在水溶液中依然可以保持α-螺旋构造。另外，由于它们的优先疏水结合域，多肽结合至疏水固定相时会保持α-螺旋。总之，这些结果表明V681在疏水环境中，无论它是在溶液(例如，50％TFE)、RP-HPLC环境或膜的疏水环境，呈很稳定的α-螺旋结构。
[0086]众所周知，由多肽的二级结构而产生的疏水结合域会影响多肽与反相柱固定相相结合，这种现象在两亲性的多肽中尤为明显(26，36-39)。Zhou等(39)已经证实，由于这种优先结合域，两亲性的α-螺旋肽会比与其具有同样氨基酸组成的非两亲多肽保留时间更长。另外，RP-HPLC的色谱条件(疏水固定相，非极性洗脱剂)也可以在潜在的螺旋多肽(39-41)中以与螺旋诱导溶剂TFE相似的方式诱导并稳定螺旋结构。图1可以看出氨基酸取代位点13位于螺旋非极性表面中心，这样可以保证取代残基的支链与反相柱固定相密切接触；这样一来由不同氨基酸取代所带来的疏水性的变化可以直接反应在RP-HPLC的保留时间上。
[0087]多肽保留时间数据如表5所示，它记录了温度曲线图中5℃的保留时间，最大保留时间及在80℃的保留时间。5℃和80℃是RP-HPLC温度曲线图的温度上限和下限，在5℃多肽呈二聚体状态存在，而在80℃由于二聚物的解离二聚体分解成单体。最大保留时间代表着多肽由二聚体转变成单体的阈点。图5表示由5℃到80℃的保留时间曲线。在非极性表面取代多肽中，更多疏水性(无论是L-或D-氨基酸取代)取代的多肽在RP-HPLC期间保留时间越长，即多肽是按Lys、Gly、Ser、Ala、Val和Leu的顺序洗脱(表5)。另外，在非极性表面L-多肽比相应的D-多肽非对映体保留时间更长(图5，表5)。由于上述两亲螺旋多肽的优先结合域实际是螺旋的非极性表面，同时由于D-氨基酸螺旋的破坏作用，D-型多肽与L-型非对映体相比具有略小的优先结合域，导致RP-HPLC中较低的保留时间。相反，在极性表面多肽洗脱的顺序与取代氨基酸侧链疏水性不相关，例如PAL和PSL比PVL保留时间更长(图5)；PSD是极性表面D-氨基酸取代类似物中保留时间最长的(图5)。事实上在极性表面L-Leu或L-Ala取代L-Ser的多肽PLL和PAL具有增强的整体疏水性，这与它们的保留时间比V681长的事实相符。
[0088]虽然氨基酸L-Val比L-Ser疏水性更强，据观察多肽PVL的保留时间低于原始肽V681(L-Ser的极性表面在11位点)的事实可以归结为缬氨酸的β-侧链Val残基的螺旋破坏作用(见表3)。相反，80℃时PVL比PSL保留时间更长。由于螺旋结构在高温下变性，取代氨基酸的侧链疏水性在多肽的整体疏水性上起关健作用。与非极性表面取代多肽相似的是，极性表面D-氨基酸取代多肽比它们的L-非对映异构体的保留时间大大降低。由于优先结合域的影响非极性表面取代多肽的保留时间范围比极性表面取代多肽要广，如在5℃非极性表面L-多肽的范围为11.31分钟相对应极性表面L-多肽为2.40分钟，非极性表面D-多肽的范围为11.05分钟相对应极性表面多肽的范围为3.27分钟(表5)。
[0089]D-型多肽自我相互作用的能力也由RP-HPLC温度控制技术来测定。图8A表示的是由5℃到80℃三对多肽对映体和对照肽C的RP-HPLC保留时间的变化。意料之中的是，L-和D-多肽对映体在这个温度范围内是不可完全分离的，这是由于每对多肽无论是全L-还是全D-构象，其序列要完全相同，而且与反相柱相互作用时必须采用相同的构象。RP-HPLC的保留行为是判断多肽疏水性的常用方法(53，26)。在本研究中三对多肽的疏水性是按照V681/D-V681＞NAD/D-NAL＞NKL/D-NKD(表4)的序列排列，这与在位点13的取代氨基酸的疏水性序列相同(V681的Val＞NA的Ala＞NK的Lys)(54)。图8B中，为了着重显示多肽由5℃增加到80℃洗脱形为的不同，我们将不同温度下的多肽保留时间与在5℃的保留时间作对比。例如，多肽V681/D-V681的保留时间随着温度的升高而增加(直到大约30℃)，之后保留时间随温度进一步升高而下降。这样的温度曲线特征是多肽显示自我相互作用(53，29，19)。如图8C所示，多肽自我相互作用系数PA代表着与无序结构肽C相比多肽保留时间上的最大变化。由于肽C在水相和疏水介质中均呈单体无序状态，它由5℃到80℃内保留行为的变化仅仅体现了温度对多肽保留行为的影响，即肽保留时间随着温度的升高保留时间呈线性降低，这是由于在固定相和流动相之间高温所引起的更高的溶质扩散性和增强的质量转移(55)。因此肽C保留时间标准后，多肽保留行为仅代表多肽自我相互作用能力。PA值越高代表自我相互作用能力越强，三对多肽对应体的自我相互作用能力与多肽的疏水性直接相关，即V681/D-V681在三对多肽对应体中表现出最强的形成二聚体的能力(PA＝7.2，表4)；相反，NAD/D-NAL显示出比V681/D-V681弱的形成二聚体能力(PA＝4.1，表4)；NKL/D-NKD表现出最低的形成二聚体的能力(PA＝2.1，表4)。由表4所示多肽在80℃时的保留时间比在5℃时大为降低。除了由于上述的温度作用以外，升高温度时α-螺旋结构解开导致两亲性α-螺旋多肽的非极性表面丧失，因此随着多肽的无序结构的增多，保留时间下降。
[0090]表5在RP-HPLC温度曲线中，多肽类似物的疏水性与相互作用能力的相关性
    多肽a   tR(分钟)b     ΔtR(X-NVL)(分钟)c     PA(分钟)d
    非极性表面e   5℃   最大值     80℃     5℃     80℃
    NLLNVL fNALNSLNKLNGNLDNVDNADNSDNKD   48.1648.1043.9440.7236.8539.9645.1042.5540.4937.0234.05   50.4549.9944.8841.0836.9140.2246.3743.4341.0137.1234.05     47.0245.8341.3837.6233.2236.7443.0340.1538.0034.0830.96     0.060-4.16-7.38-11.25-8.14-3.00-5.55-7.61-11.08-14.05     1.190-4.45-8.21-12.61-9.09-2.80-5.68-7.83-11.75-14.87     4.223.632.591.821.101.643.022.632.191.461.10
    极性表面e     ΔtR(X-PsL)(分钟)c
    PLLPALPSL fPVLPKLPGPSDPADPLDPVDPKDCg   48.7848.2548.1047.8346.3845.8645.4745.1944.7342.9642.2022.74   51.2350.5749.9949.9347.9047.0946.6046.3645.8543.8342.87-     47.5146.6345.8346.1843.8943.0742.5942.5742.1440.5139.2918.64     0.680.150-0.27-1.72-2.24-2.63-2.91-3.37-5.14-5.90-     1.680.8000.35-1.94-2.76-3.24-3.26-3.69-5.32-6.54-     4.334.153.633.913.172.822.732.822.822.542.23-
a.将非极性表面L-Val的取代的多肽类似物和极性表面L-Ser取代的多肽类似物根据其相对疏水性进行排序。
b.表示多肽在温度曲线中，在5℃，80℃的保留时间以及最大的保留时间。
c.表示不同的多肽相对于亲本肽V681(NVL表示非极性表面的取代，而PSL表示极性面上的取代)的不同的保留时间，代表了多肽类似物的相对疏水性。
d.PA表示在RP-HPLC温度曲线中，每种肽的解离常数。在温度变化范围内，用最大的保留时间差值即((tRt-tR5螺旋肽)-(tRt-tR5对照肽C))来表示，其中，(tRt-tR5)表示肽在特定温度(t)时与在5℃条件下的保留时间差。
e.表示亲本两亲性肽V681极性表面(P)或非极性表面(N)的取代(参见图1)。
f.NVL和PSL是相同的肽，其位亲本肽V681。
g.多肽C表示无序结构的对照组肽，被用于计算PA值，见脚注d.。
[0091]RP-HPLC的洗脱时间经常用来衡量多肽类似物的相对疏水性(26，31)。本研究中的多肽类似物与V681相比，只具有在非极性表面或极性表面一个氨基酸取代的区别；因此表5中的保留时间数据可以用来反应多肽类似物疏水性的不同。为了更加直观的展现多肽疏水性的变化，表5中的保留时间数据被拿来与原始多肽V681在5℃和80℃的保留时间相对比。相对于V681的多肽疏水性随着在极性或非极性表面的不同氨基酸取代而产生变化。表5和图5中，对于非极性表面取代多肽，在5℃和80℃多肽的疏水性是以L-Leu＞L-Val＞L-Ala＞L-Ser＞Gly＞L-Lys的顺序排列。不管在非极性还是极性表面D-型多肽的相对疏水性比它们的L型非对映体为低，表明了D-氨基酸的螺旋破坏性导致多肽优先结合域的破坏。在非极性和极性表面，多肽在80℃时的保留范围比在5℃时要广，这意味着随着螺旋结构在80℃时变性，取代氨基酸侧链的疏水性在决定多肽类似物总体疏水性中起决定作用。
[0092]在非极性表面由于氨基酸取代而带来的多肽V681疏水性/亲水性的变化是非常巨大的。例如，由NVL到NAL，或到NSL，或到NKL的取代在80℃时疏水性的降低分别是-4.45，-8.21和-12.61分钟(表5)。事实上，在80℃时极性表面相同的取代，如PVL到PAL、到PSL和到PKL，疏水性的变化分别为+0.45，-0.35和-2.29分钟。这表明在极性表面的取代对多肽疏水性的影响要比在非极性表面的取代为低。事实上，这种影响对Ala来说大于10倍，对Ser来说大于20倍，对Lys来说大于5倍。
[0093]RP-HPLC温度监控技术自发明至今已经应用在许多不同类型的分子上，其中包括环状β-折叠多肽(30)，单体α-螺旋肽和二聚体α-螺旋肽(29)及形成超螺旋结构的二聚体螺旋肽(42)。多肽在色谱反相柱上的洗脱主要靠吸附和去吸附机理(43)，即使一个多肽强烈结合与疏水固定相上，当流动相中的乙腈的浓度达到一定高度时该多肽还是会在流动相与固定相之间进行分配。Mant等(29)提出了在螺旋多肽上应用RP-HPLC温度监控的机理。总体来说，机理基于4种假设：1)低温时有能力形成二聚体的两亲性α-螺旋分子，它一定会在反相色谱的水溶液(疏水性，非极性表面)中形成二聚体；2)在高温时由于二聚体被破坏，单体-二聚体的平衡倾向于单体；3)温度足够高时水溶液中只有单体存在；4)多肽只能以单体的形式结合到色谱柱固定相上，即二聚体只能存在溶液中，只有已被破坏的二聚体才能与色谱柱固定相相结合。
[0094]众所周知，抗菌肽的两亲性对于它的抗菌活性是十分必要的，这是因为带正电荷的极性表面可以帮助抗菌肽分子通过静电作用到达细胞膜，而多肽的非极性表面可以帮助其通过疏水相互作用插入到细胞膜内、造成靶细胞增透性增强及丧失防御功能(6，7)。因此我们相信多肽水溶液中的自我相互作用(即形成二聚体的能力)对于理解抗菌活性是非常重要的指标。如果多肽在水溶液中自我相互作用能力很强(形成二聚体并掩埋其非极性表面)，这将降低多肽分解成单体并插入到细胞膜内最终杀死靶细胞的能力。
[0095]图5表示5℃到80℃全部L-/D氨基酸取代的RP-HPLC温度曲线。如上所述二聚作用是与温度相关的，低温下多肽在PR-HPLC的分配中呈二聚体-单体平衡，二聚的游离状态是受欢迎的，解离是重新键合所必需的；因此保留时间相对低。随着温度的升高，溶液中平衡由于二聚体的分解而向单体方向移动。高溶液浓度的单体在分配期间增加结合状态的机率，所以保留时间增加。值得注意的是升高温度同时也引入其它的作用如降低流动相粘度和增加在流动相与固定相之间的质量转移等。正如无序结构对照肽C所示(图5)，这些作用随着温度的增加，保留时间会呈线性的降低。相反地，对于二聚合的多肽升高温度会破坏二聚体而转换成单体，这样保留时间会达到最大值。这一临界温度之上，我们可以观察到随着温度升高保留时间下降，这主要是由于降低流动相粘度和增加质量转移所造成。另外，正如CD测定到的，温度引起构象的变化破坏α-螺旋稳定性使其在高温条件下失去结合域，这些都导致保留时间随温度升高而下降。RP-HPLC期间为了消除这些通常的作用，图5中的数据被用来与对照肽C相比较并按照5℃的保留时间归零，后者以虚线的形式表示在图6中。
[0096]本研究中的多肽类似物在水溶液中表现出十分不同的形成二聚体的能力(图6)。图6内保留时间变动((多肽的tR t-tR 5)-(C的tR t-tR 5))的最大数值被定义为多肽自我相互作用系数(PA)，用来量化多肽在水溶液中形成二聚体的能力(表5)。正如表5中数据所示，疏水性强的多肽一般在溶液中自我相互作用能力也很强。非极性表面取代多肽的PA值与它们相对疏水性成正比，表明两亲螺旋的疏水表面的疏水性在形成二聚体的过程中起关健作用，这是由于二聚体是由两亲分子的疏水表面相互结合而形成的。相反，极性表面取代多肽的PA值与相对疏水性没有直接关系，这表明螺旋极性表面的疏水性在多肽相互作用中不起重要作用。一般来说，L-型多肽的PA值比它们的D-型非对映体明显高，表明螺旋结构在形成二聚过程中的重要性(表5)。在表5中，大多数情况下，极性表面取代多肽比利用同一氨基酸在非极性表面取代的多肽的PA值要高。这是由于极性表面取代对优先的二聚体形成域的影响不大而非极性表面取代直接影响多肽的疏水性和二聚体形成能力。
[0097]L-氨基酸取代多肽的两亲性是通过采用软件包Jemboss1.2.1版本(33)计算疏水单元得来的(32)，改性以包括我们实验室中测定的疏水性范围(细节参见实验例部分)(表6)。非极性表面取代多肽的两亲性直接与取代氨基酸侧链疏水性呈正相关，即疏水性越强两亲性越高(NLL的两亲性为6.70，NKL为5.60)；相反，极性表面多肽两亲性与取代氨基酸侧链疏水性成反相关，即氨基酸疏水性越强两亲性越低(PKL的两亲性为6.62，PLL为5.45，表6)。
[0098]天然序列V681的两亲性为6.35。为了全面地了解此数值，V681的序列可以被打乱而得到0.96的两亲性数值(KHAVIKWSIKSSVKFKISTAFKATTI，SEQ ID NO：41)或者可得到的最大数值为8.10HWSKLLKSFTKALKKFAKAITSWST(SEQ IDNO：42)。在极性和非极性表面利用单一取代所能得到的两亲性从最低值PLL的5.45变化到最高值NLL的6.70(表6)。尽管单一取代可以改变两亲性但所有多肽类似物依然保持相当程度的两亲性，例如，既使用赖氨酸取代到非极性表面，NKL的两亲性仍然为5.60。
[0099]表6多肽类似物的两亲性
    多肽     两亲性a     多肽     两亲性a
    NLLNVL bNALNGNSLNKL     6.706.355.985.855.855.60     PLLPVLPALPGPSL bPKL     5.455.826.216.356.356.62
两亲性通过采用反相高效液相色谱检测疏水系数计算疏水单元(31)(详见材料与方法)。多肽NVL和PSL与V681为同一种肽.
[00100]对于抗菌肽的抗菌机理已经提出了许多模型，其中“孔道”机理和“地毯”模型是两个最著名的理论(44)。简单的说，“孔道”基理是指两亲性的α-螺旋集中在一起形成跨膜的通道和孔洞。在通道或孔洞中螺旋的疏水表面与细胞膜脂核心相互作用，而其亲水表面互相面对形成一个水通道(45)；相反，“地毯”模型是在解释dermaseptin S的作用机理时首次提出(46)，它描述抗菌肽与磷脂极性头部基团在整个膜渗透过程中始终相互作用，这个现象只有在高浓度多肽分子存在的前提下才能产生。两个机理的主要区别是，在地毯模型中，肽位于界面上，其疏水表面与脂类疏水部分相互作用，而不是在膜的疏水核，而且都不利用它们的亲水表面形成水孔道。NMR研究显示短杆菌肽S的环β折叠肽类似物位于和膜平行的界面上，疏水表面与疏水脂肪酰基链相互作用，而带正电的残基仍然与磷脂带负电的头部基团相互作用(47)。
[00101]不管是哪一种机理，第一步都是将多肽分子吸引至膜，接着插入双分子层。如果多肽分子在水溶液中自我相互作用，水基质中自我相互作用能力低的分子就更容易透入脂膜中。由表5和表6，非极性表面疏水性较强的多肽产生更高的两亲性，在溶液中通常显示较强的自我相互作用能力；相反，对于极性表面取代的多肽，日益增强的疏水性可以降低两亲性而同时增加自我相互作用能力，这表明极性表面产生两亲性变化时，多肽两亲性在分子自我相互作用能力中不起关健作用。另外，自我相互作用能力与多肽的二级结构相关，即本研究中用其D-氨基酸对应物替代L-氨基酸来破坏多肽螺旋结构会降低PA值(表4和表5)。
[00102]多肽对人红细胞的溶血活性是鉴定多肽对高级真核细胞毒性的重要依据。如前所述，天然多肽V681(也称为NVL和PSL)具有很强的溶血活性，其最低溶血浓度(MHC值)是15.6μg/ml(表7)。本研究中，由于疏水性、两亲性和稳定性的改变，最佳变异体多肽V681的溶血活性显著降低至不可检测的活性，这比NKL改善超过32倍(表7)。
[00103]表7清楚地表明，对于非极性表面取代多肽，溶血活性与取代氨基酸的支链疏水性相关，即取代氨基酸疏水性越强多肽溶血性越强，这与我们前期β-折叠抗菌肽短杆菌肽S的结果相符(22)。例如多肽NLL的MHC值是7.8μg/ml；相反，多肽NKL的MHC值与疏水性的减少相应，已经降低到不可检测的程度。非极性表面多肽的疏水性和两亲性与其自我相互作用能力相关，因此在温和条件中多肽显示出低自我相互作用能力也同时表现出对真核细胞的低溶血活性。相反对于极性表面取代多肽，自我相互作用、疏水性/两亲性和溶血活性的关系不清楚。当然，在极性表面进行L-取代时，多肽的非极性表面仍然非常相似；因此形成二聚体的能力和其非极性表面的疏水性不太会受影响，所以溶血活性依然保持很强。
[00104]除了疏水性/两亲性以外，多肽的螺旋性对其溶血活性也有额外作用。一般来说，在非极性和极性表面，D-氨基酸取代多肽呈现出比它们的L-非对映体更低的溶血活性。例如NAL的MHC值为31.2μg/ml而NAD的数值为250μg/ml，溶血活性降低了8倍。相似地，PVL的MHC值为7.8μg/ml，而PVD的数值为125μg/ml，溶血活性降低了16倍(表7)。这种现象一般与多肽自我相互作用能力相关，由于D-非对映体多肽类似物比L-非对映体显示更低的自我相互作用能力。另外，D-取代物破坏螺旋性因此它也破坏非极性表面的疏水性。这个结果和Shai和同事的数据相吻合(23，24)，他们证实了通过多个D-氨基酸取代，多肽螺旋性大幅度降低，引起溶血性降低。因此多肽的结构对于多肽针对哺乳动物细胞的毒性非常重要，而且螺旋结构的破坏依然可以保持多肽的抗菌活性。
[00105]如表7所示，非极性表面取代多肽显示比极性表面取代(4-125μg/ml)更大范围的溶血活性(7.8μg/ml到无法测定)，再次表明螺旋非极性表面在多肽与普通细胞的生物膜相互作用中起关健作用。意料之中的是，在极性表面取代的多肽显示出比非极性表面同种氨基酸取代多肽更强的溶血活性，这是由于在两亲螺旋分子不同侧用同一氨基酸取代所带来的疏水度的变化的程度不同。本研究中，有趣的是，除了多肽PLD、PVD和PKD以外，所有极性表面取代多肽均表现出比V681更强的溶血活性。相反，在非极性表面只有多肽NLD和NLL的溶血活性比V681高。
[00106]表7中表示的是在极性和非极性表面取代的多肽针对革兰氏阴性细菌的抗菌活性。此表中我们计算6种微生物菌株的几可平均MIC值来提供多肽革兰氏阴性菌的抗菌活性的总体评价。很明显许多多肽类似物都表现出比天然多肽V681针对革兰氏阴性细菌更强的抗菌活性，例如多肽NKL和PKD在平均MIC值上分别展现出比V681高2.8倍和3.4倍的抗菌活性(比较几何平均数；表7)。一般来说，本研究中多肽类似物针对大肠杆菌菌株(UB1005  wt和DC2abs)、鼠伤寒沙门氏菌C610  abs和绿脓杆菌H187  wt的抗菌活性非常高(表7)。
[00107]对于革兰氏阴性细菌，破坏蛋白的螺旋性对于增加抗菌活性最为重要；即大多数情况下，D-氨基酸取代多肽的抗菌活性比L-非对映体要高。只有多肽NSD和NKD是例外。对于这两个多肽，较低的抗菌活性的原因可能是，综合了D-氨基酸的螺旋破坏性与在非极性表面降低疏水性及破坏两亲性多方面的因素，这突出了维持螺旋非极性表面一定的疏水性和两亲性对于生物活性的重要性，即存在α-螺旋抗菌肽的生物活性所必需的螺旋性和疏水性/两亲性的组合阈值。本研究中多肽自我相互作用能力(相对疏水性)似乎与MIC值没有直接关系；然而有趣的是，对于在极性和非极性表面利用L-疏水氨基酸(Leu、Val和Ala)取代的多肽而言，取代氨基酸的疏水性越低，多肽抗革兰氏阴性细菌的活性越强。
[00108]表8表示多肽对革兰氏阳性细菌的抗菌活性。利用D-/L-氨基酸取代，我们将多肽V681的抗革兰氏阳性细菌的活力增强了2.7倍(V681的几何平均数MIC值是6.3μg/ml，而多肽PSD是2.3μg/ml，表8)。与多肽V681相比，多数针对革兰氏阳性细菌具有增强的抗菌活性的多肽是D-氨基酸取代多肽(6个D-多肽对一个L-多肽)。令人惊奇地是，极性表面取代多肽比非极性表面取代多肽整体上表现出更强的抗菌活性。一般来说，无论在极性或非极性表面由于氨基酸取代而增加天然肽V681的疏水性将导致针对革兰氏阳性细菌的抗菌活性的降低，例如多肽NLL、PLL、PVL和PAL(表8)。在非极性表面，D-Ser和D-Lys的氨基酸取代以和抗革兰氏阴性细菌相同的方式显著弱化活性，再次表明维持螺旋非极性表面一定的螺旋性、疏水性/两亲性对于多肽抗革兰氏阳性细菌抗菌活性的重要性。
[00109]治疗指数是一个被广泛应用的代表抗菌药物特异性的参数。它是由MHC(溶血活性)和MIC(抗菌活性)的比值计算而来；因此治疗指数数值越大表示抗菌特异性越高。如上所述，天然多肽V681是一个具有良好抗菌活性同时也带有很强的溶血活性的抗菌肽；因此它的治疗指数低(针对革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌分别为1.8、2.5)，这与常见的毒素如蜂毒肽相当。本研究中通过改变多肽疏水性/亲水性、两亲性及螺旋性，我们将多肽V681针对革兰氏阴性细菌的治疗指数提高了90倍(表7)而针对革兰氏阳性细菌的治疗指数提高了23倍(表8)。如表7、表8所示，非极性表面取代多肽较极性表面取代多肽拥有更广泛的治疗指数范围，这与多肽自我相互作用的研究相符合，表明螺旋的非极性表面在抗菌机理中起重要作用。
[00110]表9总结了与天然多肽V681相比较具有提高的治疗指数的那些多肽类似物的数据。由表3和表9很清楚的看到，所有具有提高治疗指数的多肽，它们均在温和基质中具有稳定性较低的螺旋结构的那些(在非极性表面或者D-氨基酸取代的多肽或者亲水氨基酸取代的多肽)。所有类似物中治疗指数最高的是NKL，它比V681针对革兰氏阴性细菌的治疗指数提高了90倍；相反，多肽NAD是具有针对所有检测的革兰氏阳性与阴性细菌最广谱抗菌性的类似物，NAD针对革兰氏阴性细菌的治疗指数提高了42倍，针对革兰氏阳性细菌的治疗指数提高了23倍。值得注意的是这两个多肽的溶血活性都极弱；另外，多肽NKL和NAD与V681相比较，针对革兰氏阳性细菌显示改善的抗菌活性，针对革兰氏阴性细菌显示相同的抗菌活性。
[00111]为了进一步评价D-对映体多肽即D-NAL和D-NKL的生物活性，这些多肽针对人红细胞的溶血活性是在37℃条件下温育18小时测定的，其不产生溶血作用的最大多肽浓度为溶血活性的指标。天然多肽V681与多肽NKL和NAD相比，表现出很强的溶血性即7.8μg/ml(NKL为250.0μg/ml，NAD为31.3μg/ml)(表达10)。D-多肽的活性与L-对映异构体相同。
[00112]如上所述(见表5至7)，V681、NAD和NKL的溶血活性分别为15.6μg/ml、250.0μg/ml和大于250.0μg/ml，这些结果是在37℃温育12小时的条件下测得的，而不像对于D-对映体那样温育18小时测得的。因此，为了探索疏水作用的程度与不同温育时间和不同浓度的关系我们进行了溶血作用的时间研究。如图9所示，在多肽浓度为8、16、32、64、125、250和500μg/ml的条件下溶血时间研究进行了超过8个小时。细胞溶血的百分数是通过与细胞在水中全部溶血相比较利用光谱的方法测得。图9中在大多数多肽浓度下增加温育时间多肽V681、D-V681、NAD和D-NAL表现出红细胞溶血作用增强。重要的是，多肽NKL和D-NKD在极高的多肽浓度500μg/ml和保温8小时的条件下，呈现出针对人血红细胞可以忽略不计的溶血活性(小于10％)或者无溶血活性。如图9清楚的表明V681/D-V681对映异构体裂解细胞的能力远远高于NAD/D-NAL多肽对。因此，对于多肽V681和D-V681在500μg/ml的浓度下温育仅仅1个小时，溶血作用已经达到100％，而相同条件下多肽NAD和D-NAL的相应数值只有40％。另外V681和D-V681在多肽8μg/ml的浓度下只观察到溶血性的少量增高，而对于NAD和D-NAL在多肽32μg/ml的浓度下仍然未见溶血作用。有趣的是，我们活性最高的多肽，NAD/D-NAL和NKL/D-NKD，在大多数多肽浓度条件下，比较L-对映体，D-对映体一般显示出更弱的溶血活力，唯一例外的是当NAD和D-NAL的浓度达到500μg/ml，在此浓度下L-多肽的溶血活力在达到4小时之前比D-多肽要高而4小时以后比D-多肽的活力低。
[00113]本研究中所使用的绿脓杆菌是由世界各地收集来的多样化的临床分离菌株。抗生素敏感性实验显示这些绿脓杆菌菌株除了对环丙沙星的敏感性有64倍的区别，它们对其它抗生素的敏感性区别不大(Vasil，M.L.等未发表的数据)。表10中记录了抗菌肽对映异构体针对绿脓杆菌的抗菌活性。L-和D-对映体对绿脓杆菌的抗菌活性基本相差4倍。CP204，一种由肺部组织纤维化的病人身体分离得到的绿脓杆菌菌株，对抗菌肽的敏感性最强，其MIC值在7.8到31.3μg/ml范围内。6种绿脓杆菌菌株MIC值的几何平均数用来作为评估抗菌肽针对绿脓杆菌整体抗菌性的指标，将每个抗菌肽的MIC几何平均数与亲本肽V681的相应数值作比较可以得出生物活性的改善倍数。很明显，大多数情况下，全部由D-氨基酸组成的多肽的抗菌活性较它们的L-对映体稍高。
[00114]表10表示抗菌肽针对绿脓杆菌的治疗指数。通过用D-丙氨酸或L-赖氨酸取代L-缬氨酸，我们将对绿脓杆菌的抗菌活性分别提高了4.7倍(抗菌肽NAD)和16.7倍(抗菌肽NKL)。另外，对于全D-多肽对映体来说，以标准微量稀释法测定，我们进一步将对绿脓杆菌的治疗指数提高了7.3倍(肽D-NAL)和26.7倍(肽D-NKD)。在我们的时间研究中肽D-NKD显示在500μg/ml8小时后无溶血(图9)，这是溶血活性很紧要的试验。当通过标准微量稀释法测定18个小时或者在500μg/ml的肽浓度下测定8小时的时间研究测定时，均未显示差别(表10和图9)。因此，使用多肽浓度500μg/ml，与V681相比抗菌肽D-NKD的MHC值升高其治疗指数53倍。我们的结论是，由于六种肽在抗菌活性上相差不大，因此生物活性的主要差别取决于溶血活性(MHC值)的巨大差异(表10)。所以，治疗指数的提高来自溶血活性的不同。
[00115]表11显示抗菌肽针对6种不同的革兰氏阴性细菌的抗菌活性与治疗指数。很明显，总体上说，全L-多肽的针对革兰氏阴性菌的抗菌活力与它们的D-对映体相当，L-和D-对映体多肽的MIC值的差异在2倍之内。表11中，MIC的几何平均数用来计算抗菌肽针对革兰氏阴性细菌的整体抗菌性，同时它也被用来计算治疗指数。利用标准稀释法，与V681相比，抗菌肽NKL和D-NKD抗革兰氏阴性细菌的治疗指数均提高了40倍。对于治疗指数的提高，多肽溶血活性又一次扮演了主要角色。利用我们最严格的溶血活性试验，抗菌肽D-NKD在500μg/ml的浓度条件下，历经8小时，没有发现溶血活性(图9)，与V681相比其治疗指数提高了80倍。
[00116]表12记录了L-和D-对映异构体多肽针对革兰氏阳性细菌和真菌的抗菌活性。很明显，我们的抗菌肽杀死革兰氏阳性细菌十分有效。对抗菌肽对映体最不敏感的革兰氏阳性菌是粪肠球菌E.faecalis。抗菌肽裂解真菌白色念球菌C.albicans细胞效率与杀死粪肠球菌E.faecalis相当。对于革兰氏阳性菌与真菌，D-型抗菌肽再次表现出较L-对映体相同或更强的抗菌活性。虽然抗菌肽NKL/D-NKD的平均MIC值是最低的，但由于它们高的MHC值(代表低溶血或无溶血活性)，因此二者的针对革兰氏阳性细菌和真菌治疗指数仍然是最高的。与在针对革兰氏阳性菌中的相似，抗菌肽D-NKD针对革兰氏阳性菌和白色念珠菌C.albicans的治疗指数分别增加了34.7倍和16.7倍，用标准微量滴定稀释法来分别测定低溶血活性或无溶血活性。如果利用我们最严格的溶血性实验来测定，抗菌肽D-NKD在MHC值为500μg/ml的浓度下历经8小时的时间研究无溶血作用(图9)，因此该抗菌肽与V681相比其针对革兰氏阴性菌和真菌的治疗指数分虽增加了69倍和33倍。
[00117]表7多肽类似物对革兰氏阴性菌的抗菌活性(MIC)和对人血红细胞的溶血活性(MHC)
    多肽     MICa(μg/ml)     MHCc(μg/ml)     治疗指数d
    大肠杆菌UB1005wte   大肠杆菌DC2abse   鼠伤寒沙门氏菌C587wte   鼠伤寒沙门氏菌C610abse     绿脓杆菌H187wte   绿脓杆菌H188abse    几何平均数b     人血红细胞
    NLLNVL fNALNGNSL     6.47.12.52.52.5   5.04.52.52.52.5   32.020.26.45.06.4   10.15.72.52.52.0     12.76.45.06.46.4   32.020.26.410.110.1    12.78.83.84.14.2     7.815.631.2125.0125.0     0.61.88.130.230.1
    NKL g     2.5   1.6   4.0   1.3     8.0   5.0    3.1     ＞250.0     163.0
    NLDNVD     3.22.5   2.51.6   16.05.0   3.22.0     6.44.0   10.18.0    5.53.3     7.862.5     1.419.0
    NAD g     1.6   2.0   5.0   2.0     4.0   10.1    3.3     250.0     75.7
    NSDNKD     3.23.2   2.02.5   12.732.0   2.01.0     18.332.0   20.225.4    6.37.7     ＞250.0＞250.0     79.965.0
    PLLPVLPAL     16.06.46.4   5.04.04.0   32.032.020.2   12.75.04.0     20.210.110.1   32.020.216.0    16.69.78.3     4.07.815.6     0.20.81.9
    PG     5.0     2.5     12.7     3.2     4.0     10.1     5.2     7.8     1.5
    PSL f     7.1     4.5     20.2     5.7     6.4     20.2     8.8     15.6     1.8
    PKL     10.1     4.0     25.4     8.0     25.4     32.0     13.7     4.0     0.3
    PLD     5.0     2.5     10.1     3.2     4.0     10.1     5.0     31.2     6.2
    PVD     5.0     2.5     10.1     4.0     6.4     16.0     6.1     125.0     20.5
    PAD     4.0     2.5     8.0     2.0     5.0     8.0     4.3     15.6     3.6
    PSD     2.5     1.6     5.0     1.6     2.0     10.1     2.9     15.6     5.3
    PKD     3.2     1.6     3.2     1.6     2.0     6.4     2.6     31.2     11.8
a.抗菌活性(最低抑菌浓度)为三组平行测试样品的几何平均值。
b.GM表示表中所有6种细菌MIC的几何平均值。
c.溶血活性(最低溶血浓度)采用人的血红细胞(hRBC)进行测试。当在250.0μg/ml浓度时，没有检测到溶血活性，采用500μg/ml来计算治疗系数。
d.治疗系数＝MHC(μg/ml)/MIC的几何平均值(μg/ml)。数值越大，抗菌特异性越强。
e.wt表示野生株细菌，而abs表示抗生素敏感菌株。
f.NVL和PSL与亲本肽V681为同一种肽。
g.框中的结果表示对革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌具有最好广谱抗菌活性的两种多肽。
表8多肽类似物对革兰氏阳性菌的抗菌活性(MIC)和对人血红细胞的溶血活性(MHC)
  多肽   MICa(μg/ml)     MHCc(μg/ml)     治疗指数d
  金葡球菌25923wte   金葡球菌SAP0017methRe     表皮葡球菌C621wte     枯草杆菌C971wte     粪肠球菌C625wte   干燥棒状杆菌C875wte    几何平均数b     人血红细胞
  NLLNVL fNALNGNSL   32.016.08.025.416.0   25.49.05.010.112.7     8.05.03.23.24.0     3.22.22.02.02.5     32.016.016.050.850.8   2.52.52.02.01.6    10.96.34.57.47.4     7.815.631.2125.0125.0     0.72.56.916.916.9
  NKL g   64.0   64.0     5.0     1.6     64.0   1.3    11.8     ＞250.0     42.3
  NLDNVD   5.04.0   4.03.2     2.51.6     2.51.3     6.412.7   1.61.3    3.32.8     7.862.5     2.422.7
  NAD g   8.0   5.0     2.0     1.6     32.0   1.6    4.3     250.0     57.8
  NSDNKD   64.064.0   64.064.0     12.725.4     2.53.2     64.064.0   2.02.0    16.018.7     ＞250.0＞250.0     31.326.8
  PLLPVLPAL   32.016.016.0   32.012.712.7     16.08.04.0     5.02.52.5     50.820.220.2   2.51.32.0    14.86.96.6     4.07.815.6     0.31.12.4
PG     8.0     5.0     4.0     2.0     12.7     2.0     4.5     7.8     1.7
PSL f     16.0     9.0     5.0     2.2     16.0     2.5     6.3     15.6     2.5
PKL 32.0 16.0 6.4 3.2 32.0 4.0 10.5 4.0 0.4
PLD     8.0     5.0     4.0     2.0     16.0     2.0     4.7     31.2     6.7
PVD     16.0     8.0     4.0     2.5     32.0     2.0     6.6     125.0     19.0
PAD     6.4     5.0     2.5     2.0     12.7     1.6     3.8     15.6     4.1
PSD     4.0     2.5     2.0     1.3     6.4     1.0     2.3     15.6     6.7
PKD     4.0     2.5     2.0     2.0     12.7     1.0     2.8     31.2     11.0
a.多肽的抗菌活性(最低抑菌浓度)为三组平行测试样品的几何平均值。
b.GM表示表中所有6种细菌MIC的几何平均值。
c.溶血活性(最小溶血浓度)采用人的血红细胞(hRBC)进行测试。当在250.0μg/ml浓度时，没有溶血活性被检测到，采用500μg/ml来计算治疗系数。
d.治疗系数＝最低溶血浓度MHC(μg/ml)/最低抑菌浓度MIC的几何平均值(μg/ml)。数值越大，抗菌特异性越强。
e.wt表示野生株细菌，而methR对甲氧苯青霉素有抗药性的菌株。
f.NVL和PSL与亲本肽V681为同一种肽。
g.框中的结果表示对革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌具有最好广谱抗菌活性的两种肽。
表9多肽V681氨基酸取代对其生物活性的影响a.
Figure A20058004749200421
a.表中列举的为比V681治疗系数更高的肽的类似物。
b.抗菌活性(最低抑菌浓度)为表IV和表V中给定的几何平均值。
c.治疗系数＝MHC(μg/ml)/MIC(μg/ml)。数值越大，抗菌特异性越强。
d.溶血活性(最低溶血浓度)采用人的血红细胞(hRBC)进行测试。当在250.0μg/ml浓度时，没有溶血活性被检测到，采用500μg/ml来计算治疗系数。
e.表示相对于亲本肽V681，其活性提高的倍数。
f.框中的结果表示对革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌具有最好广谱抗菌活性的两种肽。
表10.多肽的溶血活性以及对绿脓杆菌的最低抑菌浓度
    多肽     溶血活性   抗菌活性     治疗指数
V681D-V681V13ADD-V13ALV13KLD-V13KD     MHC(μg/ml)a     倍数b   MIC(μg/ml)c   倍数e     MHC/MICf     倍数g
7.87.831.331.3250.0250.0h 11443232   PAO115.615.615.67.831.315.6  WR562.531.362.531.3250.062.5  PAK31.331.362.531.3125.0125.0  PA 1462.515.631.37.862.515.6  M215.631.37.815.631.331.3     CP20415.631.37.87.87.815.6   GMd27.824.822.113.949.631.2 1.01.11.32.00.60.9 0.30.31.42.25.08.0 1.01.04.77.316.726.7(53.4)h
    环丙沙星1   4  1  4  8  8     64
a.MHC表示采用标准微量稀释方法，在作用18小时以后得到的不导致溶血现象发生的最大的多肽浓度。
b.表示相对于亲本肽V681，其溶血活性提高的倍数。
c.MIC表示抑制6种绿脓杆菌生长的最低多肽浓度。多肽的抗菌活性(最低抑菌浓度)为三组或者更多平行测试样品的几何平均值。
d.GM表示对不同绿脓杆菌最低抑菌浓度的几何平均值。
e.表示相对于亲本肽V681，其抗菌活性(几何平均数)提高的倍数。
f.治疗系数为最低溶血浓度值MHC(μg/ml)与最低抑菌浓度MIC值(μg/ml)的比值。数值越大，抗菌特异性越强。
g.表示相对于亲本肽V681，其治疗系数提高的倍数。
h.在溶血时间的研究实验中，D-V13KD在500μg/ml浓度条件下作用8小时没有检测到溶血现象发生，其治疗系数提高了53.4倍。
i.不同绿脓杆菌对环丙沙星的相对感受性，数字1表示敏感性最强的品系。
表11多肽类似物对革兰氏阴性菌的抗菌活性(MIC)和对人血红细胞的溶血活性()
  多肽     MHCa(μg/ml)     MICb(μg/ml)    治疗指数f
    人血红细胞     E.coliC498wtc     E.coliC500absc  StC587wtc  StC610absc     PaH187wtc     PaH188absc   GMd     Folde    MHC/MIC     Foldg
  V681D-V681V13ADD-V13ALV13KLD-V13KD     7.87.831.331.3250.0250.0h     6.36.33.13.13.13.1     3.13.11.63.13.13.1  12.512.512.512.56.36.3  3.16.33.13.13.13.1     6.36.33.13.16.36.3     3.16.31.63.13.13.1   5.06.33.13.93.93.9     1.00.81.61.31.31.3    1.61.210.18.064.164.1     1.00.86.35.040.140.1(80.2)h
a.溶血活性(作用18小时以后不导致溶血现象发生的最大多肽浓度)是通过人血红细胞测定的。
b.多肽的抗菌活性(最低抑菌浓度)为三组平行测试样品的几何平均值。
c.E.coli表示大肠杆菌，St表示鼠伤寒沙门氏菌，Pa表示绿脓杆菌，wt表示野生株细菌，而abs抗生素敏感菌株。
d.GM表示表中所有6种细菌最小抑制浓度的几何平均值。
e.表示相对于亲本肽V681，其最低抑菌浓度几何平均数提高的倍数
f.治疗系数＝MHC(μg/ml)/MIC的几何平均值(μg/ml)。数值越大，抗菌特异性越强。
g.表示相对于亲本肽V681，其治疗系数提高的倍数。
h.在溶血时间的研究实验中，D-V13KD在500μg/ml浓度条件下作用8小时没有检测到溶血现象发生，其治疗系数提高了80.2倍。
表12多肽类似物对革兰氏阳性菌，真菌的抗菌活性(MIC)和对人血红细胞的溶血活性(MHC)
 多肽     MHCa(μg/ml)     MICb(μg/ml)   治疗指数e     MICb(μg/ml)     治疗指数f
    人血红细胞     S.aureus622wtc     S.aureus623methRe  S.epidermidisC621wtc     B.subtilisC971wtc   E.faecalisC625wtc    C.xerosisC875wtc     几何平均数d   倍数d   MHC/MIC   倍数g     C.albicans     MHC/MIC     倍数g
 V681D-V681V13ADD-V13ALV13KLD-V13KD     7.87.831.331.3250.0250.0h     3.16.31.63.112.56.3     6.36.33.13.112.56.3  6.31.61.61.66.33.1     3.11.63.11.63.11.6   6.36.312.512.550.012.5    3.13.11.61.61.61.6     4.43.52.82.87.94.0   1.01.31.61.60.61.1   1.82.211.211.231.662.5   1.01.26.26.217.634.7(69.4)h     12.56.312.512.550.025.0     0.61.22.52.55.010.0     1.02.04.24.28.316.7(33.4)h
a.溶血活性(作用18小时以后不导致溶血现象发生的最大肽浓度)是通过人血红细胞(hRBC)测定的。
b.多肽的抗菌活性(最低抑菌浓度)为三组平行测试样品的几何平均值。
c.S.aureus表示金黄色葡萄球菌，S.epidermidis表示表皮葡萄球菌，B.subtilis表示枯草杆菌，E.faecalis表示粪肠杆菌，C.xerosis表示干燥棒状杆菌，C.albicans表示白色念珠杆菌，wt表示野生株细菌，而methR对甲氧苯青霉素有抗药性的菌株。
d.GM表示表中所有6种革兰氏阳性细菌最低抑菌浓度的几何平均值。倍数表示表示相对于亲本肽V6g1，其最低抑菌浓度几何平均数提高的倍数。
e.治疗系数＝最低溶血浓度MHC(μg/ml)/最低抑菌浓度MIC的几何平均值(μg/ml).数值越大，抗菌特异性越强。
f.表示多肽对真菌白色念珠菌C.albicans的治疗系数
g.表示相对于亲本肽V681，其治疗系数提高的倍数。
h.在溶血时间的研究实验中，D-V13KD在500μg/ml浓度条件下作用8小时没有检测到溶血现象发生，其针对革兰氏阳性细菌和白色念珠菌C.albicans的治疗指数分别提高了69.4和33.4倍。
[00118]图10表示在37℃时含有胰蛋白酶的条件下(多肽与胰蛋白酶比率为20,000∶1或者20mM∶1μM)，L-和D-对映异构体多肽的稳定性。实验进行了8个小时，但是在图10中只表示多肽在前60分钟的稳定性，原因是三个L-多肽在37℃与胰蛋白酶温育1小时后就已经被100％降解。有趣的是多肽V681表现出比多肽NKL和NAD对胰蛋白酶稍强的抗水解活性；相比之下，NKL和NAD在胰蛋白酶存在下表现出相似的降解过程，在降解30分钟后三种L-多肽已经达到86％--97％的降解程度。与此截然不同的是，D-多肽对胰蛋白酶表现出绝对的稳定性(没有降解)，即使是在胰蛋白酶对多肽的摩尔浓度比高出10倍(2mM多肽∶1uM胰蛋白酶)的条件下温育8个小时。
[00119]如前所述“孔道机理”和“地毯模型”是用来解释抗菌肽抗菌机理的两种主要理论。然而本研究中两种理论中的任何一个都不能彻底的解释我们的数据。例如多肽溶血活性与非极性表面的疏水性和两亲性相关，这与“孔道机理”相符合，即多肽利用它的疏水表面与膜的疏水核心相互作用形成孔洞/通道。相反，多肽的抗菌活性与多肽的疏水性/两亲性不相关，这表明“孔道机理”不适宜用来解释这些多肽的抗菌活性。而事实上“地毯模型”可以较完整的解释多肽与细菌细胞膜的相互作用。根据以上观察，我们根据具体实验事实提出的两种理论均部分适用于本研究中，即，原核细胞与真核细胞由于其膜组分的不同，而采用不同机理。如果多肽在真核细胞脂双层的疏水核心形成孔/道，它将造成人血红细胞的溶血作用；相反对于原核细胞，多肽裂解细胞使用的是一种像地毯模型中描述的与表面活性剂很相似的方式。
[00120]实际上，多肽与生物膜的相互作用是与脂双分子层的成分直接相关的。例如，Liu等(48-50)利用一个由多个亮氨酸所组成的α-螺旋跨膜多肽，利用它证实了多肽导致磷脂酰乙醇胺(PE)双分子层膜的转换温度在比磷脂酰胆碱(PC)或者磷脂酰甘油醇(PG)脂双分子层中降低的程度更大，这表明PE膜被多肽破坏的程度更高。两性离子的PE是原核细胞膜的主要膜脂成分而PC是真核膜的主要膜脂成分(51，52)。另外，虽然真核细胞中也含有PE，由于膜脂分配的不对称性，PE只在双分子层的内侧被发现而PC主要存在于真核细胞双层的外侧。我们得出结论，α-螺旋型抗菌肽的抗菌特异性是由原核与细菌细胞脂双分子层组分的不同而造成的。
[00121]我们在本研究中选用了两个例子来证实这个假说。多肽NKL针对革兰氏阴性细菌具有最高的治疗指数，可以结合我们的模型很好的解释这个结果。例如，如果真核细胞的溶血作用必须将多肽插入到细胞膜的疏水孔中，这取决于膜的脂双分子层的组分，并通过两亲性的α-螺旋的非极性表面与膜疏水脂核心进行相互作用，那么，在疏水表面的Lys取代(NKL)破坏了肽的疏水表面进而破坏了肽的二聚体的形成以及与疏水脂的相互作用。因此，多肽就不能够穿入细胞膜的疏水核心，也不能引起溶血作用。另一方面，针对原核细胞的作用中单体肽与细胞膜中介区域的磷脂头部相互作用，多肽的抗菌活性与是否插入细胞膜的疏水核心无关。
[00122]本文举例的D-对映体多肽的生物学活性与设想的模型是一致的；每对对映体无论对原核细胞膜还是真核细胞膜都具有同样的活性，这支持了细胞膜是抗菌肽唯一的作用靶点的预测。这个模型提出真核细胞的溶血作用需要多肽插入到细胞膜的疏水核心中，垂直于膜表面，通过两亲性的α-螺旋的非极性表面与脂双层的疏水脂核心相互作用。这样，多肽就可以形成跨膜的通道/孔，而亲水面在通道的内侧，形成一个水孔(“孔道”理论)。相反，对原核细胞的抗菌活性，为保持特异性，需要多肽位于平行于膜表面的膜界面并且两亲性的α-螺旋的非极性表面与脂的疏水成分相作用，其带正电荷的残基与膜表面的磷脂荷负电荷头部基团相互作用(“地毯”理论)。这两种不同的作用模型主要是由于原核和真核细胞细胞膜脂组分的不同而造成的。我们将上述两种抗菌肽作用模型相结合提出了“细胞膜区分机理”。
[00123]利用这个模型，我们就可以很容易理解为什么本研究中NKL和D-NKD没有溶血活性但同时比亲本肽V681和D-V681具有更好的抗菌活性。因为，在它们非极性面的中心13位点(NKL和D-NKD)用Lys取代Val破坏了多肽的疏水表面，这主要是由于正电荷阻止了多肽在真核细胞膜中形成跨膜螺旋。多肽被排除在脂双层之外因此不导致溶血作用的发生。在原核细胞中多肽也无法形成跨膜螺旋，但这对于抗菌活力是不需要的。相反，多肽能进入脂双层的界面区域，这样Lys破坏多肽的疏水表面是可以被接受的，并且保持了抗菌活性。
[00124]相反，多肽NLL(亮氨酸位于取代位点)的抗菌活性比NKL要弱，而溶血活性更强(对革兰氏阴性菌，NLL的MIC值为12.7μg/ml，而NKL为3.1μg/ml；NLL的溶血浓度为7.8μg/ml，而NKL没有被检测到具有溶血活性)，这也可以用我们的组合模型来解释。因为，多肽NLL具有完整的非极性面可以插入到细胞膜的双分子层，并与疏水核心相互作用形成孔或通道(孔道理论)，因此NLL的溶血活性明显强于多肽NKL。另一方面，由于肽NLL具有更加强烈插入到细胞膜的疏水孔中的趋势，多肽NLL很少与细胞膜的水/脂界面相互作用；因此，针对革兰氏阴性细菌，其抗菌活性比多肽NKL低4倍。这也支持了“地毯”作用机理是高抗菌活性所必须的，如果多肽倾向于插入到脂双分子层的疏水孔中，其抗菌活性必将降低。
[00125]本研究揭示并证明了具有高的自我相互作用能力的多肽具有弱的抗菌活性和强的溶血活性。进一步的生物学活性研究显示，多肽的强溶血活性通常都与其高的疏水性，高的两亲性和高的螺旋型相关。在大多数情况下，D-型氨基酸取代的多肽相对于L-型非对映体，其平均抗菌活性都有所增强。V681针对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的治疗指标分别被提高了90倍和23倍。尽管抗菌肽是由在26个氨基酸残基的V681肽的11或者13位点用五个氨基酸(L，V，A，S，K)进行取代而得来的，但是可以预测其他取代，如鸟氨酸、精氨酸、组氨酸或者其他的带有正电荷的氨基酸残基在这些位点取代也可以提高多肽的抗菌活性。我们甚至可以进一步预测在多肽V681的16或者17位点进行类似的取代得到的类似肽也可以提高生物学活性。基于本研究的公开，本领域的普通技术人员都可以采用一系列的D-/L-型氨基酸残基来简单替换位于两亲性分子的非极性或极性表面的疏水中心或者亲水氨基酸残基来设计出具有增强生物活性的抗菌肽。
[00126]在本研究中发明的两种具有显著特点的特异性抗菌肽的结构特点如下所述。在NKL分子中，带正电荷的氨基酸残基，赖氨酸，被引入到疏水面的中心位置。这种取代(将原始多肽中的13位点Val改变为Lys)破坏了多肽在原始水介质中的α-螺旋结构，降低了二聚体形成作用，降低了其对正常细胞的的毒性，提高了抗菌活性，其针对革兰氏阴性细菌的治疗指标比起始序列提高了90倍。治疗指标用溶血活性与抗菌活性的比值来表示。同样的多肽针对革兰氏阳性细菌的治疗指标提高了17倍。
[00127]在多肽NAD中，一个D-Ala残基被引入到疏水面的中心位置。这种取代(将13位点的Val改变为D-Ala)破坏了多肽在原始水介质中的α-螺旋结构，降低了二聚体形成作用，测量溶血活性时降低了其对正常细胞的毒性，提高了抗菌活性，其针对革兰氏阴性细菌的治疗指标与起始序列相比提高了42倍。同一个多肽针对革兰氏阳性细菌的治疗指标提高了23倍。
[00128]α-螺旋的抗菌肽是两亲性的；如果多肽的自我相互作用能力(两个分子通过其极性面相互作用得到二聚体)在水介质中很强，多肽单体解离的能力以及穿过微生物的细胞壁并穿透生物膜杀死靶细胞的能力将大大降低。本研究中利用采用D一型对映体的多肽已经证实，多肽形成二聚体的能力与其抗菌特异性是直接相关，即破坏二聚体形成能力将有助于产生对原核和真核细胞的特异性。表9中，从多肽的温度曲线中(图8)得到的多肽的PA值反映了两亲性的α-螺旋肽相互结合/形成二聚体的能力。很明显，对于V681和D-V681，由于它们具有相同的非极性表面，因此在水溶液中表现出最强的聚合能力和最低的特异性或者说最强的裂解人血红细胞的能力。这与多肽具有完整的非极性面，更加容易在真核细胞膜上形成跨膜孔或者通道的观点相符。而对于多肽NAD和D-NAL，分别在全L-或全D-氨基酸多肽中相应的引入D-Ala和L-Ala，破坏多肽的α-螺旋结构，与V681和D-V681相比降低形成二聚体的能力，并提高了其特异性。将Lys引入到NKL和D-NKD的非极性表面13位点，可以进一步降低多肽的聚合的能力并提高其特异性。因此，如PA值所示，测定降低多肽形成二聚体的能力的缺乏，可以很好的度量多肽非溶血性的能力，同时通过保持非极性面上足够的疏水性来保证多肽的抗菌活性。重要的是，对于L-对映体多肽，D-型对映体也表现出相同的自我相互作用的能力；因此，具有类似的生物学活性也是意料之中。这进一步证实了D-型对映体多肽对人血红细胞和微生物细胞分别具有与L-型对映体多肽等量的溶血活性以及抗菌活性。这些结果进一步证实了多肽与细胞膜相互作用表现出的溶血活性和抗菌活性的过程中没有手性选择性和其它立体选择性。
[00129]表7和表8及表10和表11中，多肽NAD表现出的不同的溶血活性，(分别为12小时后测得250μg/ml和作用18小时后测得31.3μg/ml)，虽然实验采用标准的微量稀释方法(见实验方法)，但是很明显我们需要测定多肽的溶血活性与作用时间之间的关系。需要指出的是，还没有一个绝对通用的方法来检测多肽的溶血活性，因此，比较不同方法来源的实验数据也是很难的。例如，很多研究者采用温育4小时，以致使血红细胞100％裂解的多肽的最低浓度作为多肽的溶血活性(28，56)；相反，而有的研究者采用温育12小时或更长时间(例如，本研究采用18小时)，不导致血红细胞裂解的最大多肽浓度作为多肽的溶血活性(53，57)。由此可见，溶血活性的时间研究对于理解红细胞的裂解过程是十分重要的。很明显，细胞溶血的程度与作用时间直接相关，这也是NAD在两个不同的研究中得到的最低溶血浓度不同的主要原因。采用相同的实验方法，每个测试的多肽的溶血活性可以通过与对照肽(V681)相比较而得到对比。因此，我们确立了一个严格的毒性测定条件，即在500μg/ml的多肽浓度下与血红细胞相互作用8小时后，不导致溶血作用的发生作为毒性评价标准。我们认为，在如此高的多肽浓度条件下，作用这个时间可以非常精确的评价多肽的溶血活性，这个方法被认为是目前最标准的测试方法。
[00130]重要的是，我们的模型肽NAD和NKL能有效的抑制不同种类的临床分离得到的绿脓杆菌Pseudomonas aeruginosa。D-NAL肽对绿脓杆菌Pseudomonas aeruginosa表现出最高的抗菌活性；相反，D-NKD表现出最好的治疗指标主要是由于非常低的溶血活性。正如前面所提到的，绿脓杆菌是一类臭名昭著的革兰氏阴性细菌，它对目前绝大多数抗生素均表现出抗药性，因此，是对人类健康最大的威胁之一(58-60)。只有少数的抗生物对绿脓杆菌有效，包括氟喹诺酮类(61)，庆大霉素(62)，β-内酰胺类抗生素(63)，但是这些抗生素不能对所有的菌株都有效。在本研究中，抗菌肽对绿脓杆菌以及其它的革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的最低抑菌浓度分别在两个不同的实验室进行了检测；应用了不同的反应介质；接种数量也不同(详细内容见实验方法部分)，这些可以用来解释不同的多肽对绿脓杆菌的最低抑菌浓度的不同，具体实验数据见表10和表11。
[00131]通常，L-和D-型对映体多肽或者对这些多肽进行不同的氨基酸取代得到的肽，例如V681、NAD和NKL(表10-12)，它们针对绿脓杆菌Pseudomonas aeruginosa、其它革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌以及真菌的抗菌活性没有明显的差异。这些实验结果有助于更好的理解α-螺旋抗菌对映体肽的作用机理：多肽的13位点分别为Val和Lys取代时，多肽的疏水性有显著的不同。Lys的正电荷破坏了非极性面的连续性，导致多肽定位于微生物细胞膜的界面区域。这支持了地毯式机理是强抗菌活性所必须的观点，即，无论D-还是L-型多肽对映体，多肽通过一种类似表面活性剂的作用方式杀死细菌，不需要穿透到细胞膜的疏水核心中。
[00132]基于多肽的降解研究，所有D-型的多肽都能完全抵抗酶的降解作用；这也能解释D-型对映体多肽在抑制绿脓杆菌和革兰氏阳性菌方面的效果都略高于L-型对映体。L-型对映体多肽对胰蛋白酶比较敏感，特别是在序列中存在多个赖氨酸残基的情况下，例如在V681和NAD分子中有6个赖氨酸，在NKL分子中有7个赖氨酸残基，即使是在摩尔比例为20000∶1(多肽∶胰蛋白酶)的情况下，L-型多肽也会在30分钟内被很快的降解。
[00133]综上所述，通过比较L-和D-型对映体多肽的生物物理和生物学属性，我们发现L-和D-型对映体多肽对，在水溶液中具有类似的自我相互作用能力，对人血红细胞具有相似的溶血活性，对绿脓杆菌、其它革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌以及真菌具有相似的抗菌活性。这些多肽在抗菌活性和溶血活性中没有发现手性选择性。因此，这些结果支持了L-和D-型对映体多肽在作用过程中的“细胞膜区分机理”。需要注意的是D-NKD肽相对于V681亲本肽，其治疗指标大大提高，例如，对绿脓杆菌提高了53倍，对革兰氏阴性菌提高了80倍，对革兰氏阳性菌提高了69倍，对白色念珠菌提高了33倍。此外，D-NKD对蛋白水解的稳定性，广谱的抗菌活性，低的溶血毒性都证明了它是临床治疗中有潜力的治疗药物。
[00134]实施例1的实验方法。
[00135]多肽合成及纯化--如文献26所述，采用固相多肽合成方法，使用叔丁氧羰基保护的方式和MBHA树脂(0.97mmol/g)分别合成带有11位和13位取代的多肽：Ac-KWKSFLKTFKXD/L-AVKTVLHTALKAISS-amide(SEQ ID NO：43)和Ac-KWKSFLKTFKSAXD/LK-TVLHTALKAISS-amide(SEQ ID NO：44)。需要指出的是，从技术角度来说，本发明中的多肽可以采用其它的合成策略与合成方法进行合成和生产。合成的多肽的粗产物通过制备型反相高效液相色谱进行分离纯化，实验条件如下：Zorbax 300SB-C8柱(250×9.4mm内径；6.5μm粒径，300孔径；安捷伦公司)，AB线性洗脱梯度(0.2％乙腈/min)，洗脱速度为2ml/min，其中，A流动相为含有0.1％TFA的水溶液，B流动相为含有0.1％TFA的乙腈。制备得到的纯品肽采用分析型反相高效液相色谱RP-HPLC按照下述方法进行分析。多肽产物的进一步鉴定采用质谱方法和氨基酸组分分析方法。
[00136]多肽的RP-HPLC分析--采用安捷伦1100系列液相色谱进行多肽产物的分析(Little Falls，DE)。实验条件如下：Zorbax 300 SB-C8柱(150×2.1mm内径；5μm粒径；300孔径)，AB线性洗脱梯度(1％乙腈/min)，洗脱速度为0.25ml/min。其中，A流动相为含有0.05％TFA的水溶液，B流动相为含有0.05％TFA的乙腈。在5℃到80℃的温度变化范围内，每升温3℃收集一次实验数据。
[00137]螺旋结构的表征--利用Jasco J-720圆二色谱(CD)仪(Jasco，Easton，MD)，在25℃温和条件下(50mM KH2PO4/K2HPO4/100mM KCl，pH 7)，分别测定抗菌肽的平均残基摩尔椭圆度系数，和含有50％α-螺旋诱导试剂2，2，2-三氟乙醇(TFE)的溶液(50mMKH2PO4/K2HPO4/00mMKCL，pH7缓冲溶液/50％TFE)。将500μM的多肽类似物储存母液经过10倍稀释以后加入到0.02cm石英测试管中，通过190到250nm的扫描得到产物多肽的椭圆度系数。在222nm波长下测定得到的多肽的摩尔椭圆度系数被用于评估多肽的α-螺旋性。
[00138]抗菌肽V681温度变性的CD研究--将多肽V681溶解在pH2，含有0.05％TFA和50％TFE的水溶液中，然后加入到0.02cm石英管中分别在5，15，25，35，45，55，65和80℃温度条件下，从190到250nm进行扫描得到产物多肽的椭圆度系数。不同温度下的谱图被用于模拟多肽在反相高效液相色谱温度曲线分析中构象的改变。多肽在特定温度(t)和5℃时的摩尔椭圆度的比值即([θ]t-[θ]u)/([θ]5-[θ]u)相对于温度作图即可得到多肽的热变性曲线，其中，[θ]5和[θ]u分别表示多肽全折叠和完全变性状态下的摩尔椭圆度。[θ]u表示多肽在8M尿素条件下测定的摩尔椭圆度，其值为1500deg·cm2·dmol-1，代表一个完全无序结构(31)。转换温度(Tm)表示α-螺旋多肽具有50％的结构被变性时的温度，即([θ]t-[θ]u)/([θ]5-[θ]u＝0.5)，这被用于评价多肽的α-螺旋的稳定性。
[00139]多肽的两亲性的测定--多肽的两亲性的测定采用Jemboss 1.2.1版本软件包(33)计算多肽的疏水力矩(32)来得到的，我们利用本实验室检测的氨基酸疏水系数来测定多肽两亲性。本研究中涉及到的氨基酸疏水系数如下：Trp，32.31；Phe，29.11；Leu，23.42；Ile 21.31；Met，16.13；Tyr，15.37；Val，13.81；Pro，9.38；Cys，8.14；Ala，3.60；Glu，3.60；Thr，2.82；Asp，2.22；Gln，0.54；Ser，0.00；Asn，0.00；Gly，0.00；Arg，-5.01；His，-7.03；Lys，-7.03(Hodges，等未发表数据)。这些疏水系数都是在pH2条件下，利用反相高效液相色谱测定分别被20种天然氨基酸取代的无序结构多肽而得到的。事实上，在中性和酸性条件下，多肽的两亲性是真实可信的，因为V681及其类似物在其序列中不存在Asp和Glu残基。我们认为这种HPLC-检测的值比以前的检测方法更能精确的反映出20种氨基酸侧链的在亲水性和疏水性方面的差异。
[00140]抗菌活性的测定--最小抑菌浓度(MICs)是在含有10g/L胰蛋白胨和5g/L的酵母抽提液的无盐的LB(Luria-Bertani)介质中，通过一个标准的微量稀释方法测定的。主要实验方法简要如下，37℃条件下，细胞在LB培养基中生长过夜并用相同的培养基进行稀释。分别将100μl不同浓度的多肽加入到微孔培养板中，随后加入10μl细菌使其终浓度为5×105CFU/ml。培养板在37℃条件下培育24小时，MICs为抑制细菌生长的最低浓度。作为替代，最小抑菌浓度也可以通过另一种标准的微量稀释方法Mueller-Hinton(MH)介质中来实现。主要实验方法简要如下，37℃条件下，细胞在MH培养基中生长过夜并有相同的培养基进行稀释。分别将100μl不同浓度的抗菌肽加入到微孔培养板中，随后加入10μl细菌使其终浓度为1×105CFU/ml。培养板在37℃条件下培育24小时，最低抑菌浓度为抑制细菌生长的最低多肽浓度。但是，在检测临床分离的假单胞菌属绿脓杆菌时，最低抑菌浓度测定采用脑心浸液(BH1)来替代MH肉汤，此外，细菌的最终稀释浓度为1×106CFU/ml。
[00141]溶血活性的测定--方法A：将多肽样品加入到含有1％人血红细胞的磷酸盐缓冲液中(0.08M NaCl；0.043MNa2PO4；0.011M KH2PO4)，反应在37℃条件下，微孔培养板培育12小时。为了检测不产生溶血的多肽浓度，我们将多肽的样品倍比稀释。通过倍比稀释后，进行溶血测试，离心(800g)去除未裂解的血红细胞，确定不产生血红素释放的多肽浓度。释放的血红素可以在562nm通过分光光度法测定。溶血滴定度为引起血红细胞释放血红素的最高倍比稀释度。无血红素释放的空白对照组为不加任何多肽的1％血红细胞。通过方法A获得的实验结果见表5-7。方法B：将多肽样品加入到含有1％人血红细胞的pH7.4的磷酸盐缓冲液中，此缓冲液主要包含100mM NaCl；80mM Na2PO4；20mMKH2PO4。反应在37℃条件下，微孔培养板培育18小时。为了检测不引起溶血的多肽浓度，我们将多肽的样品进行倍比稀释。通过倍比稀释后，进行溶血测试，800g离心去除未裂解的血红细胞，确定不能导致血红素释放的多肽浓度。释放的血红素可以在570nm通过分光光度法测定。溶血滴定度为引起血红细胞释放血红素的最高倍比稀释度。无血红素释放的空白对照组为不加任何肽的1％血红细胞。因为在对照组中，血红细胞处于一个等渗介质中，没有检测到血红素的释放(＜1％完全溶血)。为了研究肽的溶血活性和溶血时间关系，我们分别采用不同肽浓度包括8，16，32，64，125，250和500μg/ml，在37℃条件下，分别保温0，1，2，4及8小时。利用方法B的得到的实验结果见表10-12。
[00142]治疗指数的计算(MHC/MIC比率)--最低抑菌浓度和最低溶血浓度都是采用倍比稀释的办法测定的。因此，对于个别细菌和个别多肽的治疗指数会有所不同，治疗系数最大可能相差4倍；如果具有很弱的溶血活性或者没有溶血活性，治疗系数的变化主要来源于最低抑菌浓度的不同(最大达到2倍)。
[00143]蛋白酶水解稳定性的测定--多肽的胰蛋白酶水解稳定性主要在摩尔比例为1∶20,000(trypsin∶肽＝0.1μM∶2mM)条件下测定。反应体系为pH7.4的50mM NH4HCO3。多肽和胰蛋白酶的混合物在在37℃条件下进行保温。分别在0，5分钟，10分钟，20分钟，30分钟，1，2，4，8小时的时间点取样，加入20％的三氟乙酸水溶液中止反应并用反相高效液相色谱对多肽的降解进行检测。实验条件如下：Zorbax 300 SB-C8柱(150×2.1mm内径；5μm粒径；300孔径，安捷伦公司)，AB线性洗脱梯度为1％乙腈/分钟，洗脱速度为0.25ml/分钟。其中，A流动相为含有0.2％三氟乙酸的水，B流动相为含有0.2％三氟乙酸的乙腈。多肽的峰面积的变化用来监控随着时间的变化多肽的降解程度。
[00144]实施例2.多肽的类似物及其不同位点的取代
[00145]本发明中更多的多肽是通过不同位点的取代产生的。采用“i”来指示中心位点，可以得到不同位点的取代同时保持了这些取代位于所希望的表面，例如非极性面。例如，在上文中提到的SEQ ID NO：1多肽中，可以选择的取代位点包括i，i-4，i-8，i+4和i+8。图7A表示通过特定位点取代得到的特异性突变体。我们假设多肽KL的位点i被取代形成的多肽类似物(SEQ ID NO：6)，取代位点位于非极性面的中心位点，这种多肽相对于离中心位点更远的位置的取代形成的多肽具有更强的生物学活性。按照此理论，多肽的治疗指数会依照如下顺序递减：KL13＞KL9＞KL5(这里的数字代表SEQ ID NO：1的多肽被氨基酸取代的位点)。与此相同的是，多肽的治疗指数也会依照如下顺序递减：AD13＞AD9＞AD5(这里AD13代表多肽SEQ ID NO：9)。除此理论以外，其它不同位点取代形成的多肽也具有活性并在本发明的组分和方法中适用。位点13的成功取代方式也同样的可以被用于接近疏水面中心的位点9，12，16和17上(见图1中的螺旋网状图)。
[00146]为了评价不同位点取代形成的多肽类似物的生物活性，我们使用多肽NKL作为结构框架，用疏水的亮氨酸残基替代螺旋结构中非极性面上丙氨酸残基，来系统的改变多肽的疏水性。多肽序列见表13。
[00147]表13.多肽NKL类似物的序列
    序号 命名  多肽序列a
    1234567 NKL(SEQ ID NO：6)A23L(SEQ ID NO：45)A12L(SEQ ID NO：46)A20L(SEQ ID NO：47)A12L/A23L(SEQ ID NO::48)A12L/A20L(SEQ ID NO：49)A12L/A20L/A23L(SEQ ID NO：50)  Ac-KWKSFLKTFKSAKKTVLHTALKAISS-amideAc-KWKSFLKTFKSAKKTVLHTALKLISS-amideAc-KWKSFLKTFKSLKKTVLHTALKAISS-amideAc-KWKSFLKTFKSAKKTVLHTLLKAISS-amideAc-KWKSFLKTFKSLKKTVLHTALKLISS-amideAc-KWKSFLKTFKSLKKTVLHTLLKAISS-amideAc-KWKS FLKTFKSLKKTVLHTLLKLISS-amide
a.多肽序列采用氨基酸残基的单字母编码；Ac-表示N端乙酰化，而-amide代表Cα端酰胺化；在序列中，粗体的字母代表在NKL非极性表面取代的氨基酸(详细见表1)。
[00148]图12代表亮氨酸取代的多肽类似物的螺旋网状图。由于三个Ala残基分别位于多肽V13KL非极性面上12，20和23号位点，因此在位点12、20和23得到三个单一Leu取代的多肽类似物Ala→Leu，两个双位点亮氨酸取代的多肽(A12L/A23L和A12L/A20L)以及一个三位点亮氨酸同时取代的多肽(A12L/A20L/A23L)被用来增强多肽的疏水性。在图12中，i→i+3和i→i+4位点之间的疏水相互作用用黑条带表示。图中清楚的显示，单一位点的亮氨酸取代多肽类似物，三种多肽中利用这些取代所产生的疏水作用数目顺序为A20L＞A12L＞A23L(分别表示9，8和6疏水性相互作用)；对于双取代亮氨酸残基形成的多肽类似物，A12L/A20L比A12L/A23L具有更强的疏水相互作用(11对应8疏水性相互作用)；多肽A12L/A20L/A23L在i→i+3和i→i+4之间具有最高疏水相互作用数目(12疏水性相互作用)，所有的多肽类似物性质都与设想的一样。在本研究中，多肽用亮氨酸取代位点进行命名。
[00149]对于Leu-取代的多肽，其溶血活性定义为最大浓度的肽与人红细胞接触，在37℃条件下培育18小时，没有发现溶血现象。它们的抗菌活性通过不同的临床分离的假单胞菌属绿脓杆菌Pseudomonas aeruginosa进行检测。绿脓杆菌Pseudomonas是一类自1990年以来对抗生素的抗药性越来越强的细菌，它同时产生蛋白水解酶，因此它对抗菌肽也有一定的抗性(58-60)。本研究中使用的绿脓杆菌菌株Pseudomonas aeruginosa对环丙沙星的敏感性差异较大(64倍的差异)(表14)。抗药性最强的绿脓杆菌Pseudomonasaeruginosa为CP204，一种从囊性纤维化病人身上临床分离出来的细菌，相反，它在本研究中对抗菌肽最为敏感。这证明抗菌肽的抗菌活性与抗生素的抗药性没有直接的关系。对6种绿脓杆菌的最低抑菌浓度的几何平均数见表14，用来对不同疏水性的抗菌肽的抗菌活性提供系统的评估。
[00150]表14多肽NKL类似物的生物学活性
    多肽     溶血活性     抗菌活性
    序号     命名     最低溶血浓度MHC(μg/ml)     倍数a     最低抑菌浓度MIC(μg/ml)b     倍数d
    PAO1  WR5   PAK     PA14   M2     CP204   GMc
    1234567     NKLA23LA12LA20LA12L/A23LA12L/A20LA12L/A20L/A23L环丙沙星e     250.062.531.331.315.68.04.0     1.04.08.08.016.032.062.5     31.331.315.67.815.662.5500.04  250.062.562.531.3250.0125.0500.01   125.062.531.331.315.662.5500.04     62.531.331.315.662.5125.0500.08   31.331.315.615.631.362.5500.08     7.815.615.67.87.862.5500.064   49.635.124.815.631.278.7500.0     1.01.42.03.21.60.60.1
a.表示相对于亲本肽NKL，多肽的溶血活性身高的倍数。溶血活性(作用18小时以后不导致溶血现象发生的最大多肽浓度)是通过人血红细胞测定的。
b.MIC表示抑制6种临床分离的绿脓杆菌生长的最低多肽浓度。
c.表示肽对6种绿脓杆菌的最低抑菌浓度几何平均值。
d.表示相对于亲本肽NKL，多肽的抗菌活性(几何平均值)提高的倍数。
e.不同绿脓杆菌对环丙沙星的相对感受性，数字1表示敏感性最强的品系
[00151]多肽的疏水性对其生物活性的影响见图13。通常被接受的概念认为，随着两亲性的α-螺旋肽非极性面疏水性的增加，其溶血活性和抗菌活性都随着升高(5-8)。在本研究中，清楚的表明多肽的疏水性与多肽的溶血活性相关，疏水性越强，其溶血活性也就越强，这是与以前的实验结果相符合的(53，64-66)。而抗菌活性的测试结果令人吃惊，多肽的疏水性对抗菌活性的影响主要表现在两个方面：当疏水性处于低水平时，抗菌肽疏水性的增加会引起抗菌活性的升高直到达到一个最适的疏水性；在此之后，随着抗菌肽疏水性的进一步升高超过最适疏水性，多肽的抗菌活性开始显著的减弱，在本研究中，甚至出现完全丧失抗菌活性的现象如多肽A12L/A20L/A23L(SEQ ID NO：7)(图12)。
[00152]本研究的实验结果符合我们以前提出的关于抗菌肽的唯一靶点是生物膜的“膜区分机理”。我们认为，作用的机理依赖于原核和真核细胞之间脂组分的不同。众所周知，真核细胞膜相对于原核细胞膜而言，通常特征在于两性离子的磷脂，具有大量的胆固醇和鞘磷脂，而缺少原核细胞膜中存在的内部为负电性的高跨膜电位(51-52，66-67)。因此，如果多肽能在真核细胞膜双层的疏水核心形成孔/通道，就会引起血红细胞的裂解；相反，对于原核细胞，多肽以如地毯机理中描述的去垢样机理溶解细胞(46)。
[00153]“膜区分机理”可以用来解释多肽的疏水性与溶血活性之间存在的相关性。高疏水性的多肽可以更深的插入到血红细胞膜的疏水核心中(67)，通过形成孔或者通道引起更强的溶血作用，即，A12L/A23L(多肽5)和A12L/A20L(多肽6)比单个亮氨酸取代的肽显示更强的溶血活性，A12L/A20L/A23L(多肽7)在本研究中表现出最强的溶血活性(表14)。对于多肽的抗菌活性，因为在抗菌作用过程中，多肽分子插入到细胞膜的疏水核心并不是裂解细菌细胞所必需的，多肽仅仅是平行的排列到细胞膜然后通过其疏水面与脂的疏水成分相互作用，正电荷残基与磷脂带负电的头部基团相互作用(46，47)。因此，多肽的疏水性升高在一定程度上有助于多肽分子从水环境中到达细胞膜界面并提高抗菌活性的假设是合理的。在本研究中，从多肽NKL(多肽1)到多肽A20L(多肽4)抗菌活性的改善可以表明疏水性升高的优点。相反，疏水性的进一步升高，将会引起多肽在溶液中的二聚合作用，从而引起一个促进二聚体构象的单体-二聚体的平衡。多肽二聚体折叠成α-螺旋将会抑制其通过细胞壁到达靶点膜。因此，与单个亮氨酸取代的类似物相比，多肽A12L/A23L(多肽5)和A12L/A20L(多肽6)的抗菌活性随疏水性升高而减弱。我们认为存在一个控制多肽的抗菌活性的疏水性阈值，换言之，我们可以通过调整多肽的疏水性来获得最优的抗菌活性。对于极端的例子，三亮氨酸取代的类似物，A12L/A20L/A23L(多肽7)丧失了抗菌活性可能就是由于其在水环境中非常强的二聚能力而导致的。因此，这种肽在溶液中主要以二聚体存在。相反，真核细胞中没有脂多糖细胞壁，这样，A12L/A20L/A23L(多肽7)能引起人血红细胞更加强烈的裂解，因为在疏水的脂双层环境中，二聚体迅速解体成单体并进入到脂双层结构形成通道/孔。
[00154]实施例3.各种不同带电氨基酸取代形成的多肽类似物
[00155]本发明中更多的多肽类似物是通过利用选择进行取代改变带电氨基酸的性能而得到的。例如，在上所述提到的SEQ ID NO：1多肽中，已经被确定是在13位点进行取代。选择用于取代的氨基酸优选是带电荷的氨基酸，特别是净电荷为带正电荷的氨基酸。在13位点，带电荷的残基的具体例子是Lys、Arg、Orn、His、二氨基丁酸和二氨基丙酸。Orn具有δ-氨基来替代Lys的ε-氨基，即其侧链减少一个碳原子；二氨基丁酸具有γ氨基，即其比Orn的侧链少一个碳原子；二氨基丙酸比Orn支链少两个碳原子，即具有β氨基。
[00156]在图7A中显示通过可选择的用于取代的带电残基而获得的具体的不同的多肽。在非极性表面中心位置具有带电残基的多肽能够具有活性。不希望被任何具体理论限制，我们假设中心位点用带正电荷的残基取代形成的多肽的活性可以通过正电荷残基来调节，尽管基于活性参数例如本文描述的治疗指数来预测其精确影响是困难的。
[00157]实施例4.多点取代的多肽类似物
[00158]本发明中更多的多肽是在SEQ ID NO：1多肽的基础上进行多点取代产生的。在优选的实施方式中，所述多点取代为双位取代。例如相对于上述的亲本肽，SEQID NO：1，下面的多肽都是由双取代而生成的：a)取代位点为将L6取代为AD6和将L21取代为AD21；及b)取代位点为将L6取代为KL6和将L21取代为KL21。图7A表示通过有选择的多点取代得到的不同的具体多肽。
[00159]不希望受到任何具体理论的限制，假设不在中心位点的多点取代形成的多肽(如双取代)能够依然保持活性。对于多点取代形成的特定多肽，这样的在非极性面中心的多点取代至少会与单点取代具有同样的效果。可以替换的是，我们所提供的，由去除了两个亮氨酸而得到的双取代多肽可能不像取代一个缬氨酸的单取代那么有效。根据情况，疏水性的降低会导致治疗指数的降低。另外，两个D-丙氨酸的取代会导致更强的螺旋结构的破坏；这种破坏也导致治疗指数的下降。同样的结果在两个L-Lys取代时也可能出现。
[00160]实施例5.截短的多肽类似物
[00161]本发明中更多的多肽是通过截短相关多肽序列得到的，被截短的序列诸如SEQ ID NO：1或者本发明中的SEQ ID NO：2～25中的任意一种多肽(除去那些与SEQID NO：1精确等同的如：SEQ ID NO：3和15)，或者本发明中描述的其他多肽。在截短的多肽类似物中，例如去除N端的Lys1残基或C端的Ser25和Ser26残基，不会实质影响截短后多肽的生物学活性。图7A表示通过可选择的截短多肽NKL(SEQ IDNO：6)所得到的不同的多肽。不希望受到任何具体理论的限制，假设去除N端的Lys1残基或C端的Ser25和Ser26残基，不实质影响其生物学活性。然而，相信同时去除Lys1和Trp2会实质降低了治疗指数，这是由于去除了大的疏水基团Trp。类似的，同时去除了Ser26，Ser25和Ile24会由于去除了大的疏水残基Ile，而导致治疗指数的实质下降。
[00162]更多的选择是截短SEQ ID NO：34，35，36，37的多肽序列而产生的多肽类似物，对于这些多肽中每一种分别，都是含有取代K13V(13位点的K被V取代)所得到的相应的类似多肽。
[00163]实施例6.序列重组的多肽类似物
[00164]本发明中更多的多肽是通过重组不同的氨基酸序列来产生的。对于非极性表面上的残基，进行重组以产生不同的非极性表面的多肽类似物。相信，多肽的非极性表面上的总体疏水性是影响生物学活性的重要参数。将非极性表面上疏水氨基酸残基进行重组将产生具有生物学活性的多肽。如图7A和7B中所示，序列中圈起来的氨基酸残基表示在非极性表面上重组过。
[00165]通过重组极性表面上的氨基酸残基，得到不同的极性表面多肽类似物。相信极性表面对于保持多肽分子的两亲性以及其它重要的属性如生物学活性具有重要的影响。将极性表面上的极性氨基酸残基进行重组，所得到的多肽是具有生物学活性的。在图7A和7C中，序列中圈起来的氨基酸残基表示极性表面上重组过的氨基酸残基。
[00166]在极性表面及非极性表面进行氨基酸残基的重组将不会实质改变多肽分子的两亲性或者在非极性表面上的总体疏水性或者在极性表面上的总体亲水性。尽管某一特定的序列可能是优选或首选的类似物，但是其它的多肽类似物也具有有用的生物学性能。
[00167]在特定的多肽中，除了取代的位点(例如在NKL中保留13位点为Lys)以外，可以对非极性表面上的11个氨基酸残基进行重组得到含有1个W残基(1个色氨酸残基)、2个F残基、3个L残基、3个A残基和1个I残基的任意组合的多肽序列。类似的，对极性表面上的14个氨基酸残基也可以进行重组以得到含有6个K，4个S，3个T和1个H残基的任意组合的多肽序列。
[00168]产生的多肽存在一个非极性表面整体疏水性范围。非极性表面上的疏水性可以通过文中列举的氨基酸疏水性系数的和进行计算得到。例如，特定多肽的非极性表面上疏水性变化范围为NKL或NAD±亮氨酸侧链的疏水值。按照我们的评定标准，NKL的非极性表面上的疏水性为W2，F5，L6，F9，A12，K13，V16，L17，A20，L21，A23，I24的疏水值的总和，数值为199.7。见表15。
[00169]表15.疏水系数
    项目     系数
    Trp 2     32.31
    Phe 5     29.11
    Leu 6     23.42
    Phe 9     29.11
    Ala 12     3.60
    Lys 13     -7.03
    Val 16     13.81
    Leu 17     23.42
    Ala 20     3.60
    Leu 21     23.42
    Ala 23     3.60
    Ile 24     21.31
    SUM     199.7±23.42
[00170]不同的评定标准得到不同的数值。对本发明中的多肽，按照我们的评价标准，计算其疏水表面的氨基酸残基的疏水系数总和具有重要的意义，产生具有生物学活性的多肽表面的疏水性变化范围是大约176到大约224。
[00171]极性表面上的疏水性系数总和可以用NKL多肽的疏水值±Lys残基的疏水系数值来表示。
[00172]表16.系数值
 项目   系数值
 K1   -7.03
 K3   -7.03
 S4   0.00
 K7   -7.03
 T6   +2.82
 K10   -7.03
 S11   0.00
 K14   -7.03
 T15   +2.82
 H18   -7.03
 T19   +2.82
 K22   -7.03
 S25   0.00
 S26   0.00
 SUM   -40.75±7.03
[00173]按照我们的评价标准，NKL肽极性表面上的疏水性数值可以用K1，K3，S4，K7，T6，K10，S11，K14，T15，J18，T19，K22，S25和S26的疏水值的总和来表示。产生的具有生物学活性的多肽的表面亲水性变化范围是大约-33到大约-48。
[00174]实施例7.相似的单一疏水氨基酸取代形成的多肽类似物
[00175]本发明中更多的多肽是通过单一位点相似的疏水性氨基酸残基的取代来形成的多肽类似物。采用具有类似疏水性侧链的氨基酸来进行单个疏水性氨基酸的取代通常会产生具有生物学活性的多肽。例如，表17中列出了在多肽NKL和NAD(分别为SEQ ID NO：6和9)的非极性表面上可能被取代的每一个氨基酸残基。
[00176]表17.单一位点取代的氨基酸残基
    NKL或NAD中的残基  取代的氨基酸残基
    Leu  Ile，Val，正亮氨酸，正缬氨酸
    Ile  Leu，Val，正亮氨酸，正缬氨酸
    Val  Leu，Ile，正亮氨酸，正缬氨酸
    Phe  Leu，Ile，Val，正亮氨酸，正缬氨酸
    Trp  Phe，Leu，Ile，Val，正亮氨酸，正缬氨酸
[00177]实施例8.NAD和D-NAL的多肽类似物
[00178]提供了可以用来使多肽NAD和D-NAL的溶血活性随着其非极性表面上总的疏水性的降低，而进一步降低的更多的组合物和方法。见参考文献Kondejewski，L.H.，etal.2002，J.Biol.Chem.277：67-74。例如，V16被取代成为A16；或者L17被取代成为A17；或者同时将V16，L17替换成为A16，A17。在位点13上的取代同样可以使溶血活性随着疏水性的降低而降低。多肽的疏水性降低大致顺序为：NLL＞NVL＞NAL＞NG＞NSL＞NKL，与之相关的溶血活性(μg/ml)降低，其中NLL(7.8)，NVL(15.6)，NAL(31.2)，NG(125)，NSL(125)和NKL(未检测到活性)。我们已知，存在一个疏水性临界值，过分的降低多肽的疏水性会导致其抗菌生物活性的降低。
[00179]关于所引入的文献和变更的声明
[00180]然有个别引入的参考资料的个别部分与本申请不完全相符，但是本申请中所包含的参考资料，例如专利文件包括已发表的或已授权的专利或相对应的资料；专利申请公开物；及非专利文字材料或其它源材料；已经与本申请完整地整合成一个整体(例如，参考资料被引入本发明中，除了其与本申请不相符的个别部分未被本申请采用外)。
[00181]参考资料中的附属部分以说明书或者附图的形式被引入到本申请中。
[00182]这里使用的“包含”、“包括”、“被包含”、“包含中”等术语，它们应被解释成针对所述的特征、整体、步骤或组分的出现的详细说明，但不是排除存在或者加入一种或更多种的特征、整体、步骤、组分或组合。
[00183]通过参考各种具体的优选的实施方式和技术，已经对本发明进行了描述。然而，需要理解的是，可以对本申请进行变更和修改，而保持本申请的精髓和范围。对于本领域技术人员清楚的是，除了在本发明中具体描述的组合物、方法、设备、设备部件、材料、步骤和技术以外，其它不同于这里具体描述的常规、广泛使用的组合物、方法、设备、设备部件、材料、步骤和技术在正常进行实验的前提下均可以应用到本发明中，而不需要借助额外的实验。本发明还将包含所有其它已知的、常规的组合物、方法、设备、设备部件、材料、步骤和技术。然而，如果本发明中声称包含了已存在的确定的内容和相关已经合法取得创新资格的内容，这并不是预期的；若有声明该内容被包含在我们发明范围之内，我们所指的发明范围并不包含这些内容。
[00184]只要公开了一个范围，则其所有子范围和单个数值也均被包含在其中。本发明不局限于所述的实施方式，还包括但并不局限于以实例或说明形式出现在图形或详细说明中的全部内容。
[00185]参考资料
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<160>52
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>1
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            20                 25
<210>2
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<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
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Leu His Thr Ala Leu Lys Ala Ile Ser Ser
            20                  25
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<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
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Leu His Thr Ala Leu Lys Ala Ile Ser Ser
            20                   25
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<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>4
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Leu His Thr Ala Leu Lys Ala Ile Ser Ser
            20                  25
<210>5
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>5
Lys Trp Lys Ser Phe Leu Lys Thr Phe Lys Ser Ala Ser Lys Thr Val
1                5                  10                  15
Leu His Thr Ala Leu Lys Ala Ile Ser Ser
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<210>6
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>6
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<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(13)..(13)
<223>第13位的L是D-Leu
<400>7
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<210>8
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(13)..(13)
<223>第13位的V是D-Val
<400>8
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<210>9
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(13)..(13)
<223>第13位的A是D-Ala
<400>9
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<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(13)..(13)
<223>第13位的S是D-Ser
<400>10
Lys Trp Lys Ser Phe Leu Lys Thr Phe Lys Ser Ala Ser Lys Thr Val
1               5                   10                  15
Leu His Thr Ala Leu Lys Ala Ile Ser Ser
            20                  25
<210>11
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(13)..(13)
<223>第13位的K是D-Lys
<400>11
Lys Trp Lys Ser Phe Leu Lys Thr Phe Lys Ser Ala Lys Lys Thr Val
1               5                   10                  15
Leu His Thr Ala Leu Lys Ala Ile Ser Ser
            20                  25
<210>12
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>12
Lys Trp Lys Ser Phe Leu Lys Thr Phe Lys Ser Ala Gly Lys Thr Val
1               5                   10                  15
Leu His Thr Ala Leu Lys Ala Ile Ser Ser
            20                  25
<210>13
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>13
Lys Trp Lys Ser Phe Leu Lys Thr Phe Lys Leu Ala Val Lys Thr Val
1               5                   10                  15
Leu His Thr Ala Leu Lys Ala Ile Ser Ser
            20                   25
<210>14
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>14
Lys Trp Lys Ser Phe Leu Lys Thr Phe Lys Ala Ala Val Lys Thr Val
1               5                   10                  15
Leu His Thr Ala Leu Lys Ala Ile Ser Ser
            20                  25
<210>15
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>15
Lys Trp Lys Ser Phe Leu Lys Thr Phe Lys Ser Ala Val Lys Thr Val
1               5                   10                  15
Leu His Thr Ala Leu Lys Ala Ile Ser Ser
            20                  25
<210>16
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>16
Lys Trp Lys Ser Phe Leu Lys Thr Phe Lys Val Ala Val Lys Thr Val
1               5                   10                  15
Leu His Thr Ala Leu Lys Ala Ile Ser Ser
            20                  25
<210>17
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>17
Lys Trp Lys Ser Phe Leu Lys Thr Phe Lys Lys Ala Val Lys Thr Val
1               5                   10                  15
Leu His Thr Ala Leu Lys Ala Ile Ser Ser
            20                  25
<210>18
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(11)..(11)
<223>第11位的L是D-Leu
<400>18
Lys Trp Lys Ser Phe Leu Lys Thr Phe Lys Leu A1a Val Lys Thr Val
1               5                   10                  15
Leu His Thr Ala Leu Lys Ala Ile Ser Ser
            20                  25
<210>19
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(11)..(11)
<223>第11位的A是D-Ala
<400>19
Lys Trp Lys Ser Phe Leu Lys Thr Phe Lys Ala Ala Val Lys Thr Val
1               5                   10                  15
Leu His Thr Ala Leu Lys Ala Ile Ser Ser
            20                  25
<210>20
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(11)..(11)
<223>第11位的S是D-Ser
<400>20
Lys Trp Lys Ser Phe Leu Lys Thr Phe Lys Ser Ala Val Lys Thr Val
1               5                   10                  15
Leu His Thr Ala Leu Lys Ala Ile Ser Ser
            20                  25
<210>21
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(11)..(11)
<223>第11位的V是D-Val
<400>21
Lys Trp Lys Ser Phe Leu Lys Thr Phe Lys Val Ala Val Lys Thr Val
1               5                   10                  15
Leu His Thr Ala Leu Lys Ala Ile Ser Ser
            20                  25
<210>22
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(11)..(11)
<223>第11位的K是D-Lys
<400>22
Lys Trp Lys Ser Phe Leu Lys Thr Phe Lys Lys Ala Val Lys Thr Val
1               5                   10                  15
Leu His Thr Ala Leu Lys Ala Ile Ser Ser
            20                  25
<210>23
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>23
Lys Trp Lys Ser Phe Leu Lys Thr Phe Lys Gly Ala Val Lys Thr Val
1               5                   10                  15
Leu His Thr Ala Leu LysAla Ile Ser Ser
            20                 25
<210>24
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(26)
<223>所有的氨基酸都是D-构型的
<400>24
Lys Trp Lys Ser Phe Leu Lys Thr Phe Lys Ser Ala Lys Lys Thr Val
1               5                   10                  15
Leu His Thr Ala Leu Lys Ala Ile Ser Ser
            20                  25
<210>25
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(26)
<223>除了第13位的A外，所有的氨基酸都是D-构型的
<400>25
Lys Trp Lys Ser Phe Leu Lys Thr Phe Lys Ser Ala Ala Lys Thr Val
1               5                   10                  15
Leu His Thr Ala Leu Lys Ala Ile Ser Ser
            20                  25
<210>26
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>26
Glu Leu Glu Lys Gly Gly Leu Glu Gly Glu Lys Gly Gly Lys Glu Leu
1             5                   10                 15
Glu Lys
<210>27
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>27
Lys Trp Lys Ser Phe Leu Lys Thr Lys Lys Ser Ala Val Lys Thr Val
1               5                   10                  15
Leu His Thr Ala Leu Lys Ala Ile Ser Ser
            20                  25
<210>28
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>28
Lys Trp Lys Ser Lys Leu Lys Thr Phe Lys Ser Ala Val Lys Thr Val
1               5                   10                  15
Leu His Thr Ala Leu Lys Ala Ile Ser Ser
            20                  25
<210>29
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>第9位的A是D-Ala
<400>29
Lys Trp Lys Ser Phe Leu Lys Thr Ala Lys Ser Ala Val Lys Thr Val
1               5                   10                  15Leu His Thr Ala Leu Lys Ala Ile Ser Ser
          20                   25
<210>30
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>第5位的A是D-Ala
<400>30
Lys Trp Lys Ser Ala Leu Lys Thr Phe Lys Ser Ala Val Lys Thr Val
1               5                   10                  15
Leu His Thr Ala Leu Lys Ala Ile Ser Ser
            20                  25
<210>31
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>31
Lys Trp Lys Ser Phe Leu Lys Thr Phe Lys Ser Ala Arg Lys Thr Val
1               5                   10                  15
Leu His Thr Ala Leu Lys Ala Ile Ser Ser
            20                  25
<210>32
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(26)
<223>第6位和第21位的A是D-Ala
<400>32
Lys Trp Lys Ser Phe Ala Lys Thr Phe Lys Ser Ala Val Lys Thr Val
1               5                   10                  15
Leu His Thr Ala Ala Lys Ala Ile Ser Ser
            20                   25
<210>33
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>33
Lys Trp Lys Ser Phe Lys Lys Thr Phe Lys Ser Ala Val Lys Thr Val
1               5                   10                  15
Leu His Thr Ala Lys Lys Ala Ile Ser Ser
            20                  25
<210>34
<211>25
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>34
Trp Lys Ser Phe Leu Lys Thr Phe Lys Ser Ala Val Lys Thr Val Leu
1               5                   10                  15
His Thr Ala Leu Lys Ala Ile Ser Ser
            20                   25
<210>35
<211>24
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>35
Lys Ser Phe Leu Lys Thr Phe Lys Ser Ala Val Lys Thr Val Leu His
1               5                   10                  15
Thr Ala Leu Lys Ala Ile Ser Ser
             20
<210>36
<211>24
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>36
Lys Trp Lys Ser Phe Leu Lys Thr Phe Lys Ser Ala Val Lys Thr Val
1               5                   10                  15
Leu His Thr Ala Leu Lys Ala Ile
              20
<210>37
<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>37
Lys Trp Lys Ser Phe Leu Lys Thr Phe Lys Ser Ala Val Lys Thr Val
1              5                  10                    15
Leu His Thr Ala Leu Lys Ala
               20
<210>38
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>38
Lys Ile Lys Ser Ala Leu Lys Thr Leu Lys Ser Phe Lys Lys Thr Ala
1               5                   10                  15
Ala His Thr Leu Phe Lys Val Trp Ser Ser
            20                  25
<210>39
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>39
Ser Trp Ser Lys Phe Leu Lys Lys Phe Thr Lys Ala Lys Ser His Val
1               5                   10                  15
Leu Thr Thr Ala Leu Ser Ala Ile Lys Lys
            20                   25
<210>40
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(11)..(13)
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(11)..(13)
<223>第11位和第13位的X是Gly、L-或者D-Leu、Val、Ser、Ala、Lys
<400>40
Lys Trp Lys Ser Phe Leu Lys Thr Phe Lys Xaa Ala Xaa Lys Thr Val
1               5                  10                  15
Leu His Thr Ala Leu Lys Ala Ile Ser Ser
            20                   25
<210>41
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>41
Lys His Ala Val Ile Lys Trp Ser Ile Lys Ser Ser Val Lys Phe Lys
1               5                     10                   15
Ile Ser Thr Ala Phe Lys Ala Thr Thr Ile
             20                  25
<210>42
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>42
His Trp Ser Lys Leu Leu Lys Ser Phe Thr Lys Ala Leu Lys Lys Phe
1               5                   10                  15
Ala Lys Ala Ile Thr Ser Val Val Ser Thr
            20                    25
<210>43
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(11)..(11)
<223>第11位的X是L-构型或D-构型的任何氨基酸
<400>43
Lys Trp Lys Ser Phe Leu Lys Thr Phe Lys Xaa Ala Val Lys Thr Val
1               5                  10                  15
Leu His Thr Ala Leu Lys Ala Ile Ser Ser
            20                   25
<210>44
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(13)..(13)
<223>第13位的X是L-构型或D-构型的任何氨基酸
<400>44
Lys Trp Lys Ser Phe Leu Lys Thr Phe Lys Ser Ala Xaa Lys Thr Val
1               5                  10                  15
Leu His Thr Ala Leu Lys Ala Ile Ser Ser
            20                   25
<210>45
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>45
Lys Trp Lys Ser Phe Leu Lys Thr Phe Lys Ser Ala Lys Lys Thr Val
1               5                  10                   15
Leu His Thr Ala Leu Lys Leu Ile Ser Ser
            20                  25
<210>46
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>46
Lys Trp Lys Ser Phe Leu Lys Thr Phe Lys Ser Leu Lys Lys Thr Val
1               5                  10                  15
Leu His Thr Ala Leu Lys Ala Ile Ser Ser
            20                   25
<210>47
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>47
Lys Trp Lys Ser Phe Leu Lys Thr Phe Lys Ser Ala Lys Lys Thr Val
1              5                   10                  15
Leu His Thr Leu Leu Lys Ala Ile Ser Ser
            20                  25
<210>48
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>48
Lys Trp Lys Ser Phe Leu Lys Thr Phe Lys Ser Leu Lys Lys Thr Val
1               5                  10                  15
Leu His Thr Ala Leu Lys Leu Ile Ser Ser
            20                  25
<210>49
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>49
Lys Trp Lys Ser Phe Leu Lys Thr Phe Lys Ser Leu Lys Lys Thr Val
1               5                  10                  15
Leu His Thr Leu Leu Lys Ala Ile Ser Ser
            20                  25
<210>50
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>50
Lys Trp Lys Ser Phe Leu Lys Thr Phe Lys Ser Leu Lys Lys Thr Val
1               5                  10                 15
Leu His Thr Leu Leu Lys Leu Ile Ser Ser
            20                  25
<210>51
<211>22
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>51
Lys Ser Phe Leu Lys Thr Phe Lys Ser Ala Lys Leu Lys Thr Val Leu
1              5                    10                 15
His Thr Ala Leu Lys Ala
              20
<210>52
<211>22
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(11)..(11)
<223>第11位的K是D-Lys
<400>52
Lys Ser Phe Leu Lys Thr Phe Lys Ser Ala Lys Leu Lys Thr Val Leu
1              5                   10                  15
His Thr Ala Leu Lys Ala
               20

Claims (45)

1.一种具有抗微生物活性的多肽，所述多肽具有从SEQ ID NO：1衍生的序列，并具有比SEQ ID NO：1改进的一种或者多种生物性能，其中所述的一种或者多种生物性能选自由抗菌活性、溶血活性、稳定性和针对微生物的治疗指数所组成的组。
2.根据权利要求1中所述的多肽，其中所述的多肽选自由SEQ IDNO：2，4-14，16-25，27-39SEQ ID NO：及本申请中提到的其它多肽所组成的组；这里所述的其它多肽不包括SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：15及SEQ ID NO：26的多肽。
3.根据权利要求1或2所述的多肽，其中所述多肽的整体表面疏水性范围为大约176～大约224。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的多肽，其中所述多肽的整体表面亲水性为大约-33～大约-48。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的多肽，其中所述的多肽长度为大约23～大约26个氨基酸。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的多肽，其中所述的多肽具有核心序列KSFLKTFKSAKLKTVLHTALKA(SEQ ID NO：51)。
7.根据权利要求1～5中任一项所述的多肽，其中所述的多肽具有核心序列KSFLKTFKSAKDKTVLHTALKA(SEQ ID NO：52)。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的多肽，其中所述的多肽呈D-型构象。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的多肽，其中所述的多肽选自由SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：SEQ ID NO：25所组成的组。
10.一种具有抗菌活性的多肽，所述多肽包括具有通式KWKSFLKTFKaAbKTVLHTALKAISS(SEQ ID NO：40)的序列，其中a和b是选自由L-亮氨酸、D-亮氨酸、L-缬氨酸、D-缬氨酸、L-丙氨酸、D-丙氨酸、甘氨酸、L-丝氨酸、D-丝氨酸、L-赖氨酸和D-赖氨酸所组成的组。
11.根据权利要求10所述的多肽，其中b为L-赖氨酸或D-丙氨酸。
12.根据权利要求10所述的多肽，其中b为D-赖氨酸，其它氨基酸均为D-型对映异构体。
13.根据权利要求10所述的多肽，其中b为L-丙氨酸，其它氨基酸均为D-型对映异构体。
14.多肽D-NKD(SEQ ID24)。
15.一种用于控制由微生物所引起的感染的治疗组合物，其中所述组合物包含治疗有效量的至少一种权利要求1～14任一项所述的抗菌多肽的和药剂学上可以接受的载体。
16.根据权利要求15所述的组合物，其中所述的多肽选自由权利要求10～14所述的多肽所组成的组。
17.根据权利要求15所述的组合物，其中所述的微生物选自由细菌、真菌、病毒和原生动物所组成的组。
18.一种控制微生物的方法，其包括给药治疗有效量的组合物的步骤，其中所述的组合物包括至少一种权利要求1～14任一项所述的抗微生物多肽。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述的微生物选自由革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌所组成的组。
20.根据权利要求要求18或19所述的方法，其中所述的控制是抑制所述微生物的生长、复制或感染。
21.根据权利要求18～20中任一项所述的方法，其中所述的抗微生物多肽选自由权利要求11～14所述的多肽组成的组。
22.一种治疗有需求的对象或预防由微生物引起的对象感染的方法，其中所述方法包括为所述对象注射治疗有效量的组合物的步骤，其中所述组合物包括至少一种权利要求1～14中任一项所述的抗微生物多肽和药剂学上可以接收的载体。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述的抗微生物多肽是选自由权利要求10～14所述的多肽所组成组的一种多肽。
24.根据权利要求22或23所述的方法，其中所述的微生物选自由革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌所组成的组。
25.根据权利要求22～24中任一项所述的方法，其中所述的微生物是革兰氏阳性细菌。
26.根据权利要求22～24中任一项所述的方法，其中所述的微生物是革兰氏阴性细菌。
27.一种消毒物体表面的方法，所述方法包括将有效量的组合物应用到所述表面的步骤，其中所述组合物包括至少一种权利要求1～14任一项所述的抗微生物多肽。
28.一种消毒溶液，其包含至少一种权利要求1～14任一项所述的抗菌肽以及可选择地包括可以接受的载体。
29.一种多肽，其包括SEQ ID NO：2。
30.一种多肽，其其包括SEQ ID NO：1的衍生物。
31.一种多肽，其选自由SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4～14、和SEQ ID NO：16～25所组成的组。
32.一种多肽，其包括权利要求31所述的多肽的衍生物。
33.根据权利要求30或32所述的多肽，其中所述的衍生物包括至少一个氨基酸残基被取代。
34.根据权利要求30或32所述的多肽，其中所述的衍生物包括至少一个氨基酸残基的取代，但不包括SEQ ID NO：1。
35.根据权利要求30或32所述的多肽，其中所述的衍生物包括在多肽序列的一端缺失至少一个氨基酸残基所产生的衍生物。
36.根据权利要求30或32所述的多肽，其中所述的衍生物包括在多肽序列的一端缺失至少两个氨基酸残基所产生的衍生物。
37.要求33或34所述的多肽，其中所述的取代是用疏水氨基酸残基取代亲水氨基酸残基。
38.根据权利要求33或34所述的多肽，其中所述的取代是用亲水氨基酸残基取代疏水氨基酸残基。
39.根据权利要求33或34所述的多肽，其中所述的取代是用不同的亲水氨基酸残基取代亲水氨基酸残基。
40.根据权利要求33或34所述的多肽，其中所述的取代是用不同的亲水氨基酸残基取代亲水氨基酸残基。
41.根据权利要求33或34所述的多肽，其中所述的取代是用D-型氨基酸残基取代L-型氨基酸残基。
42.根据权利要求33或34所述的多肽，其中所述的取代是用L-型氨基酸残基取代D-型氨基酸残基。
43.根据权利要求30或32所述的多肽，其中所有的残基都是D-型氨基酸残基。
44.一种多肽，其包括序列KWKSFLKTFKaAbKTVLHTALKAISS(SEQ ID NO：40)其中a和b选自由下述氨基酸所组成的组：L-亮氨酸、D-亮氨酸、L-缬氨酸、D-缬氨酸、L-丙氨酸、D-丙氨酸、甘氨酸、L-丝氨酸、D-丝氨酸、L-赖氨酸和D-赖氨酸。
45.根据权利要求44所述的多肽，其不包括SEQ ID NO：1。
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