CN101389642B - 环状抗微生物肽 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及环状阳离子肽以及它们在治疗微生物感染中的用途。

Description

环状抗微生物肽
发明领域
本发明涉及环状阳离子肽及其在治疗微生物感染中的应用。 
发明背景 
抗微生物肽(AMP)形成了真核生物免疫性的基础，并且提供了抵抗微生物破坏皮肤和粘膜表面的第一道防线。天然的AMP的例子包括防御素以及cathelicidin肽家族。这些AMP的长度、序列及结构各异，但它们最主要的共同点在于分子小，带阳离子净电荷以及两性结构。也已经从多种细菌、真菌、植物、无脊柱动物和脊柱动物中分离出小的、阳离子抗微生物肽，因此抗微生物肽看来也在原核生物的防御中发挥了作用。 
天然的AMP表现出抗革兰氏阳性菌和革兰氏阴性细菌、酵母、真菌以及包膜病毒的广谱活性。病原微生物看来没有获得对这些阳离子肽的抗性，而且同样地，AMP已经保守地作为重要的天然免疫宿主防御分子经历了几千年的演化。因此不难理解，AMP已经成为用于多种感染的治疗剂的潜在研究目标。然而，AMP面临着技术上的挑战，并且其在重组系统生产的成本高，具有强效的趋化作用和炎性生物学功能，这些都阻碍了天然的AMP成为治疗剂。 
在我们的共同未决申请中，我们已经表明富含某些碱性残基，如赖氨酸或精氨酸的线性肽具有抗微生物活性，特别是抗真菌活性。然而，仍然还需要能够用于治疗和预防微生物感染的药物。 
发明内容
根据本发明的第一个方面，其中提供了包含2至约200个D和/或L-氨基酸的肽，所述氨基酸可以是相同的或不同的，选自疏水性氨基酸和/或阳离子氨基酸，并且其中的肽是环状的。该环状肽可以包含3至约100个D和/或L-氨基酸，例如3至50个D和/或L-氨基酸，包含4至约50个D和/或L-氨基酸。 
本发明的肽可以用于预防和治疗微生物感染。 
由于本发明的环状肽的有效性高，对蛋白水解稳定，对盐实质上不敏感，无肝毒性，无溶血作用并且易于合成，因此它们有希望作为治疗剂。 
本发明的肽的阳离子电荷被认为可以促进肽与微生物膜上的极性头部基团结合。通过环化使带电基团以更加密集的形式(confirmation)得到稳定，相信这样增强了这种吸引从而增强肽的抗微生物作用。 
在本发明更具体的方面中，提供了包含根据式I的氨基酸的肽： 
((X)l(Y)m)n    (I) 
其中l和m为0至10的整数，但l和m不能都为0；n为1至10的整数；X和Y可以是相同或不同的，为选自疏水性氨基酸和/或阳离子氨基酸的氨基酸，并且作为药物使用的该肽为环状肽。 
肽可以包含2至50个氨基酸，例如3、4、5、6或7直到50个氨基酸，包括3、4、5、6或7直到10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸。 
在本发明的优选方面中，肽包含2至15个氨基酸，例如3到15个氨基酸。优选地，肽包含5至13个氨基酸。进一步优选的是包含3至7个氨基酸，例如7个氨基酸的肽。 
正如技术人员所知的，主要根据氨基酸侧链的化学和物理性质，可以将氨基酸分为不同的种类。例如，一些氨基酸通常被认为是亲水性或极性氨基酸，而其它的则被认为是疏水性或非极性氨基酸。疏水性氨基酸可以选自包括甘氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丙氨酸、色氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、酪氨酸以及苏氨酸的疏水氨基酸组；阳离子氨基酸可以选自鸟氨酸、组氨酸、精氨酸和赖氨酸。本发明使用的术语“疏水性”和“阳离子的”是指疏水性大于或等于-1.10和/或依据Fauchere和Pliska Eur.J.Med Chem.10∶39，1983所描述的方法，净电荷大于或等于0的氨基酸。疏水性或非极性氨基酸也可以是指具有在生理pH下不带电荷的非极性侧链的氨基酸，并且该侧链通常与水溶液不相容。氨基酸可以是天然的或合成的。 
在本发明的优选方面中，X和/或Y为选自组氨酸、鸟氨酸、精氨酸和赖氨酸的阳离子氨基酸。优选的X和/或Y为精氨酸或赖氨酸。 
X和/或Y可以是本发明定义的疏水性氨基酸或阳离子氨基酸的光学异构体，如D或L-氨基酸。优选的X和/或Y为D-氨基酸。 
在本发明的优选方面中，式I所示的肽包含至少90％，例如至少95％，如97-99％，或者甚至100％的D-氨基酸。 
在本发明的优选方面中，式I所示的肽包含至少90％，例如至少95％，如97-99％，或者甚至100％的L-氨基酸。 
本发明也包括上述氨基酸的已知异构体(结构异构体、立体异构体、构象和构型异构体)，肽模拟物(peptidomimetics)以及结构类似物，以及天然修饰的(例如翻译后修饰)或化学修饰的、包括但不限于磷酸化、糖基化、磺酰化和/或羟基化的上述氨基酸。 
一般来说，本发明的肽不包括以下氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸，天冬酰胺、谷氨酰胺或丝氨酸，但是即使这些氨基酸存在，本发明的某些肽仍可以具有生物活性。 
在本发明的更优选方面中，X和Y是相同的。优选地，X和Y是相同的并且为赖氨酸和精氨酸。     
在式(I)所示的肽中，l和m可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，并且n可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。 
在式(I)所示的肽中，l可以是1，n可以是1并且m可以介于4和9之间，例如m可以是3、4、5、6、7、8或9。 
在式(I)所示的肽中，l、n和/或m可以介于1和5之间，例如1、2、3、4或5。 
在式(I)所示的肽中，l和m可以是介于0和7之间的整数，并且n可以是介于1和10之间的整数。 
在式(I)所示的肽中，l和m可以是0、1或2，并且n可以是介于1和10之间的整数。 
在式(I)所示的肽中，X和Y可以是相同的，l可以是0，m可以是1，并且n可以是3、4、5、6、7、8、9或10。 
在式(I)所示的肽中，X和Y可以是相同的，l和m可以是1，并且n可以是2、3、4或5。 
在式(I)所示的肽中，X和Y可以是相同的，l可以是1，m可以是2，并且n可以是1、2、3或4。 
在式(I)所示的肽中，X和Y可以是相同的，l和m可以是2，并且n可以是1、2、3或4。 
在本发明更具体的方面中，提供了包含根据式II的氨基酸的环状肽： 
(X)n    (II) 
其中X和n如上所述。优选的X为赖氨酸、精氨酸和鸟氨酸。优选的n为介于3和15之间的整数。 
在本发明的一个实施方案中，X为精氨酸。 
在本发明的备选实施方案中，X为赖氨酸。 
在本发明的另外的备选实施方案中，X为鸟氨酸。 
本发明的肽可以包含一个或多个半胱氨酸残基，例如多达6个半胱氨酸残基，如1、2、3、4、5或6个半胱氨酸残基。 
此外，肽的氨基酸序列可以被修饰从而形成肽的变异体，该变异体包括肽中的至少一个氨基酸残基替代另一个氨基酸残基，包括使用D型而不是L型的替代。 
肽的一个或多个氨基酸残基可以被替换成另一个，以改变、增强或保留肽的生物活性。这样的变异体可以具有例如至少具有约10％相应的非变异体肽的生物活性。经常使用保守性氨基酸，即替换上述具有相似的化学和物理性质的氨基酸。因此，例如保守性氨基酸替换可以包括赖氨酸替换精氨酸、鸟氨酸或组氨酸；或者精氨酸替换赖氨酸或异亮氨酸，鸟氨酸替换组氨酸；或者一种疏水性氨基酸替换另一种。在进行替换后，筛选变异体的生物学活性。 
就通常的术语而言，本发明使用的术语“肽”是指通过肽键连接起来的多个氨基酸残基。该术语可以与多肽和蛋白质互换使用，并且意义相同。 
在本发明的一个实施方案中，环状肽选自： 
K-K-K-K-K-K-K 
R-R-R-R-R-R-R 
本发明的肽通常是合成的肽。肽可以是分离的、纯化的肽或者它们的变异体，这些可以是体外合成的，例如通过固相肽合成方法、通过酶催化的肽合成或者借助重组DNA技术。 
在本发明更具体的方面中，提供了制备根据本发明的肽的方法，该方法包括通过肽与偶联剂的反应将式(I)或式(II)所示的肽环化。 
偶联剂可以是任何能够在线性形式的肽的两个末端(C末端和N末端)氨基酸残基之间，例如两个氨基酸骨架或侧链之间形成肽键的试剂。对偶联剂的选择会影响偶联的效率，从而影响环状肽的产量。表1显示了本发明的方法中所用的偶联剂，而技术人员将意识到其它已知的偶联剂也可以 用于本发明。优选的偶联剂为HATU-O-(7-偶氮苯并三氮唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯。 
优选地，肽与偶合剂之间的反应是发生在碱存在情况下。碱可以包括但并不限于N-甲基吗啉(NMM)或二异丙基乙胺(DIEA)。优选地，反应发生在碱性pH下，例如pH介于8.5-9之间。在肽与偶联剂反应之前，可以将肽修饰成包括保护基团的肽。保护基团可以包括：Pbf(2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基)，tBu(叔丁基醚)，Mtr(甲氧三甲苯磺酰基)，Pmc(2，2，5，7，8-五甲基苯并二氢吡喃-6-磺酰氯)，Mbh(4，4-二甲氧基苄基氢化物，4，4-dimethyloxybenzylhydride)，Tmob(2，3，4-三甲氧苄基)，Aloc(烯丙氧羰基)，Fmoc(9-芴甲氧羰基)和Boc(叔丁氧羰基)。当与偶联剂的反应之后，可以通过在弱酸性条件下的裂解去除保护基团，例如在三氟醋酸(TFA)溶液的存在下。 
在肽的骨架环化过程中，线性肽C末端的肽与偶联剂的活化基团相接触，并且随着反应进行，在该氨基酸的α碳上形成酮-烯醇式中间体。因此，当从邻位碳上去除活化基团时，烯醇(enol)(或烯醇，alkenol)中间体可以导致两种对映异构体的形成，并形成了肽键。通过所使用的偶联剂一经活化，这种外消旋化，即单一氨基酸对映异构体的形成(例如右旋形式和左旋形式(即分别为d和l异构体))以及作为整体的肽的非对映异构体的形成，就可以发生在环化位置上。由于希望本发明的肽是纯对映异构体，因此应减少或避免不希望的非对映异构体的产生。为了减少和避免这种非对映异构体的产生，以及生产出纯非对映异构体的肽，本发明的肽可以被修饰成包括非手性部分的肽，该部分避免了环化过程中肽的外消旋化。 
因此在本发明的更优选方面中，本发明的肽或本发明的方法定义的肽被修饰成包括避免环化过程中形成肽的非对映异构体的部分。本发明使用的“外消旋的肽”是指在肽环化之前，包含一定量的(通常是等量的)肽C末端氨基酸的各自的光学异构体，例如右旋的和左旋的形式(即分别为d和/或l异构体)的肽。被引入肽的部分通常为非手性氨基酸，可以是天然形成的氨基酸或氨基酸类似物。非手性氨基酸可以选自甘氨酸、β-丙氨酸、3-氨基丙酸、4-氨基丁酸、5-氨基戊酸和6-氨基己酸。在本发明的一个实施方案中，在C末端将肽修饰成包括非手性氨基酸，例如甘氨酸。 
除如上所述将本发明的肽修饰成C末端包括一部分外，在肽的环化过程中形成的两种对映体的比例取决于几个因素，如环化过程(即与偶联剂 反应)中使用的溶剂、环化反应时间(incubation time)和温度，以及用于促进环化的活化基团。 
本发明还涉及通过本发明的方法可以获得的环化的肽。 
在本发明的一个实施方案中，环状肽包含选自下列氨基酸序列的氨基酸序列： 
K-K-K-K-K-K-K 
R-R-R-R-R-R-R 
O-O-O-O-O-O-O 
DR-DR-DR-DR-DR-DR-DR 
DO-DO-DO-DO-DO-DO-DO 
DK-DK-DK-DK-DK-DK-DK 
为了鉴定对哺乳动物细胞的不希望的毒性很小或者没有不希望的毒性的活性肽，可以制备单一的肽或肽库(libraries of peptides)，并且可以筛选单一的肽或这些肽库的肽的抗微生物活性和毒性，包括但并不限于抗真菌、抗细菌、抗病毒、抗原生动物、抗寄生虫活性以及毒性。 
本发明的肽可以以不同形式存在，如以游离酸、游离碱、酯和其它前药、盐或互变异构体，例如，并且本发明包括了这些化合物所有的变体形式。 
因此，本发明包括了本发明的肽或肽变异体的盐或前药。 
本发明的肽可以以药学上可接受的盐的形式给药。本发明的药学上可接受的盐可以通过常规化学方法由母体肽合成，该母体肽包含碱性或酸性部分。一般来说，这些盐是通过在水或在有机溶剂、或两者的混合物中，有机酸或碱形式的肽与化学计量的适合的碱或酸反应来制备的；通常地，非水介质象醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈是优选的。适合的盐类的列表见于Remington′s Pharmaceutical Sciences，17th ed.，Mack PublishingCompany，Easton，Pa.，US，1985，p.1418，因此引入其披露的内容作为参考；还参见Stahl等编的“Handbook of Pharmaceutical Salts Properties Selectionand Use”，Verlag Helvetica Chimica Acta和Wiley-VCH，2002。 
因此，本发明包括了本发明的肽的药学上可接受的盐，其中通过制备母体化合物的酸或碱的盐对其进行修饰，所述盐例如常规的无毒盐或者由无机或有机酸或碱形成的季铵盐。这样的酸加成盐的例子包括醋酸盐、己二酸盐、藻酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、 柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、环戊丙酸盐、二葡萄糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、延胡索酸盐、葡糖庚酸盐(glucoheptanoate)、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、草酸盐、棕榈酸盐(palmoate)、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯丙酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐以及十一酸盐。碱性盐包括铵盐，碱金属盐如钠盐和钾盐，碱土金属盐如钙盐和镁盐，含有机碱的盐类如双环己胺盐、N-甲基-D-谷氨酰胺，以及含氨基酸如精氨酸、赖氨酸的盐，等等。此外，含氮的碱性基团可以被以下试剂季铵化，低级卤代烷烃，如氯甲烷、氯乙烷、氯丙烷、氯丁烷、溴甲烷、溴乙烷、溴丙烷、溴丁烷、碘甲烷、碘乙烷、碘丙烷和碘丁烷；二烷基硫酸盐，如二甲基硫酸盐、二乙基硫酸盐、二丁基硫酸盐和二戊基硫酸盐；长链卤化物，如氯代癸烷、溴代癸烷、碘代癸烷、月桂基氯、月桂基溴、月桂基碘、肉豆蔻基氯、肉豆蔻基溴、肉豆蔻基碘、硬脂氯、硬脂基溴和硬脂基碘；卤代芳香烷，如溴代苯甲烷和溴代苯乙烷以及其它。 
本发明的肽或肽的变异体的羧酸盐可以按照常规方式制备，即通过肽与一当量或多当量的目标碱接触，例如金属氢氧化物碱，如氢氧化钠；金属碳酸盐或碳酸氢盐，如碳酸钠或碳酸氢钠；或者胺类碱，如三乙胺、三乙醇胺等。 
本发明包括用于所述肽的药物活性形式的前药，例如其中一个或多个功能基团被保护或衍生化，但其在体内可以转化为功能基团，如可以在体内被转化为游离酸的羧酸酯，或可以转化为游离氨基的被保护的氨基的情形。本发明使用的术语“前药”特指在体内被迅速转化为母体结构的结构，例如在血液中水解。 
本发明更具体的方面提供了包含药学上有效量的本发明的肽，或两种或多种不同的本发明的肽的药物组合物。 
组合物也包括药学上可接受的载体、赋形剂和稀释剂。本发明使用的短语“药学上可接受的”是指在合理的医学判断范围内，适宜用于与人类的组织接触，或者在某些情况下与动物的组织接触，而不产生过量毒性、刺激和过敏反应、或其它问题或并发症，并且具有相称的合理效益/风险比的那些化合物、原料、组合物和/或剂型。 
本发明的肽特别用作抗微生物的肽，例如抗细菌、真菌、酵母、寄生虫、原生动物和病毒。本发明可以使用术语“抗微生物的肽”来定义任何具有杀微生物和/或抑菌活性的肽，并且非唯一地包括所述的任何具有抗细菌、抗真菌、抗霉菌、抗寄生虫，抗原生动物、抗病毒、抗感染、抗传染和/或杀菌、杀藻、杀阿米巴、杀微生物、杀细菌、杀真菌、杀寄生虫、杀原生动物性质的肽。 
在优选的方面，本发明提供了根据本发明的肽在制备用于治疗微生物感染的药物中的用途。 
“微生物感染”是指由细菌、寄生虫、原生动物、病毒或真菌包括酵母等引起的感染。“病原体”通常被定义为任何引发疾病的生物体。 
细菌性病原体可以来源于选自以下组，但不局限于以下组的细菌种类，包括：葡萄球菌属，例如金黄色葡萄球菌(例如金黄色葡萄球菌NCTC10442)，表皮葡萄球菌；衣原体属，例如沙眼衣原体，肺炎衣原体和鹦鹉热衣原体；肠球菌属，例如粪肠球菌；化脓链球菌；利斯特菌属；假单胞菌属；分枝杆菌属，例如结核分枝杆菌；肠杆菌属；弯曲杆菌属；沙门氏菌属；链球菌属，例如A或B群链球菌，肺炎链球菌；螺杆菌属，例如幽门螺杆菌；奈瑟菌属，例如淋病奈瑟菌，脑膜炎奈瑟菌；伯氏疏螺旋体；志贺氏菌属，例如弗氏志贺菌；大肠杆菌(大肠杆菌O157：H7 NCTC12900)；嗜血杆菌属，例如流感嗜血杆菌；土拉弗朗西斯菌；芽胞杆菌属，例如炭疽杆菌；梭状芽胞杆菌属，例如肉毒杆菌；耶尔森菌属，例如鼠疫耶尔森菌；密螺旋体属；伯克霍尔德菌属，例如洋葱伯克霍尔德菌，鼻疽伯克霍尔德菌和类鼻疽伯克霍尔德菌。 
在根据本发明的优选用途中，细菌病原体为金黄色葡萄球菌和大肠杆菌。 
病毒性病原体可以来源于选自以下组，但不局限于以下组的病毒，包括：人类免疫缺陷病毒(HIV 1型和2型)；人类T细胞白血病病毒(HTLV1型和2型)；埃博拉病毒；人乳头瘤病毒(例如HPV-2、HPV-5、HPV-8、HPV-16、HPV-18、HPV-31、HPV-33、HPV-52、HPV-54和HPV-56)；乳多空病毒；鼻病毒；脊髓灰质炎病毒(polioviras)；疱疹病毒；腺病毒；EB病毒；流感病毒；乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒，天花病毒，轮状病毒或SARS冠状病毒。 
寄生虫病原体可以来源于选自以下组，但不局限于以下组的寄生虫： 锥虫属(克氏锥虫和布氏锥虫)，利什曼原虫属，贾第虫属，毛滴虫属，内阿米巴属，耐格里原虫属，棘阿米巴属，血吸虫属，疟原虫属，隐孢子虫属(Crytosporidium spp.)，等孢子球虫属，小袋虫属，罗阿丝虫，蛔虫，犬恶丝虫属，弓形体属例如鼠弓形体。 
在根据本发明的优选用途中，微生物感染为真菌感染。 
真菌病原体可以来源于选自以下属，但不局限于以下属的真菌(包括酵母)：念珠菌属(例如白色念珠菌)，表皮癣菌属，外瓶柄霉菌属，小孢霉属，发癣菌属(例如红色发癣菌和趾间发癣菌)，癣属(Tinea spp.)，曲霉菌属，芽生菌属，芽生裂殖菌属(Blastoschizomyces spp.)，球孢子菌属，隐球菌属(例如新型隐球菌)，组织胞浆菌属，副球孢子菌属(Paracoccidiomyces spp.)，孢子丝菌属，犁头霉属，Cladophialophora属，产色芽生菌属，瓶霉菌属，Lacazia属，Arthrographis属，支顶孢菌属，马都拉放线菌属，Apophysomyces属，单囊霉属，团担子菌属，白僵菌属，金孢子菌属，耳霉属，小克银汉霉属，新月菌属，地霉属，粘束孢属，小球腔菌属(Leptosphaeria spp.)，马拉塞霉菌属(例如糠秕马拉塞霉菌)，毛霉菌属，新龟甲属，诺卡尔菌属，诺卡尔土壤菌属，拟青霉属，茎点霉属，毛孢子菌属，肺孢子虫属，伪霉样真菌属，核菌属(Pyrenochaeta spp)，根毛霉属，根霉属，红酵母属，酵母菌属，足放线病菌属，帚霉属，掷孢酵母属，共头霉属，木霉属，毛孢子菌属，单格孢属(Ulocladium spp.)，黑粉菌属，轮枝孢菌属，万吉拉菌属(Wangiella spp.)。 
在根据本发明的优选用途中，真菌病原体属于发癣菌属或隐球菌属。例如真菌病原体可以是红色发癣菌，趾间发癣菌或新型隐球菌。 
真菌感染可以是全身性的、局部的、皮下的、皮肤的或粘膜感染。 
尽管某些非皮肤真菌，如酵母也能引起皮肤感染，但是皮肤和指(趾)甲的局部真菌感染通常是由皮肤真菌引起的。皮肤真菌感染可以包括癣感染，例如须癣(胡须)，头癣(头)，体癣(身体)，股癣(腹股沟)，面部癣(面部)，手癣(手)，脚癣(足)，甲癣(指(趾)甲)，花斑癣(糠疹)，难辨认癣和黑癣。这些感染可以由表皮癣菌属、小孢霉属和发癣菌属(红色发癣菌和趾间发癣菌)的真菌引起。 
皮肤真菌感染可以是皮肤、基质层(lamina)、角质层、甲(指甲和趾甲)或毛发的感染。特别提及的是由发癣菌属、表皮癣菌属或小孢霉属的皮肤真菌引起的皮肤真菌感染。皮肤真菌的例子包括絮状表皮癣菌，犬小 孢霉，奥杜尼小孢霉，石膏样小孢霉，矮小孢子菌，铁锈色小孢子菌，扭曲小孢子菌，黄褐色小孢霉，红色发癣菌，须发癣菌变种趾间发癣菌，须发癣菌变种结节须发癣菌(Trichophyton mentagrophytes var nodulare)，断发癣菌，苏丹发癣菌(Trichophyton Soudanese)，堇色发癣菌，麦格尼发癣菌(Trichophyton megnini)，舍恩莱茵发癣菌，鸡发癣菌，krajdenii发癣菌，yaoundei发癣菌，马发癣菌，erinacei发癣菌和疣状发癣菌。 
在本发明的特定实施方案中，皮肤真菌感染为甲真菌病。术语“甲真菌病”包括但不限于，远端侧位甲下型，浅表白色型，近端白色甲下型，继发营养不良型，原发营养不良型，endonyx型，念珠菌型(例如甲真菌病与慢性粘膜皮肤疾病)甲真菌病和甲癣。 
与甲真菌病有关的非皮肤真菌性真菌包括曲霉菌属，头孢子菌属，尖镰孢菌，短尾帚霉(Scopularis brevicaulis)，柱霉菌属。 
本发明的肽是对多种病原生物体均有效的抗微生物肽。此外，本发明的肽也可以用于其它病征的治疗，包括但不限于与粘膜感染有关的病征，例如囊性纤维化，胃肠道、泌尿生殖系统、泌尿系(肾脏感染或膀胱炎)或呼吸系统的感染。 
本发明的肽也可以用于治疗或预防通常与皮肤相关的感染，其中包括创伤、溃疡和损伤，例如皮肤创伤如割伤或烧伤，以及相关的病征。 
在本发明优选的方面中，肽用于治疗细菌性皮肤感染或“脓皮病”。 
术语“治疗”涉及本发明所述的肽在使经受(感染性)疾病痛苦的患者受益方面的作用，包括改善患者的症状或延缓疾病发展。 
本发明使用的术语“创伤治疗”可以包括创伤愈合和相关的情形，以及促进、增加或加速组织愈合的治疗，包括手术后瘢疤形成、烧伤、溃疡、银屑病，加速组织重塑(tissue remodelling)，例如整形手术或器官移植术后。 
因此，在本发明更具体的方面中提供了本发明的肽施用或附着的基质。优选的基质适合施用于创伤或者向创伤部位输送。优选的基质使得本发明的肽从基质转移至创面，以实现其抗生素的作用。基质可以是敷料，例如创伤用敷料。敷料可以包括纤维材料，或者可以是胶原样材料。 
本发明的肽也可以用作消毒剂或用在消毒剂中。在这种情况下，肽或本发明的药物组合物可以单独或与其它消毒剂组合施用于待处理的表面。本发明使用的“待处理表面”可以是本发明定义的基质或者医疗装置。 
在更具体的方面中，本发明提供了治疗或预防受试者微生物感染的方法，其中包括给予所述受试者治疗有效量的根据本发明的肽。 
在本发明的优选方法中，微生物感染为真菌感染。在本发明的方法中，肽局部施用于所述受试者的皮肤或指(趾)甲。 
本发明所述的肽、组合物和方法可以治疗哺乳动物、鸟类和其它动物。这些哺乳动物和鸟类包括人，狗，猫和家畜，如马、牛、绵羊、山羊、鸡、火鸡等。此外，本发明所述的肽、组合物和方法也可以治疗植物。 
当受试者为动物时，本发明的方法可以施用于具有指(趾)甲样特征的部位，包括但不限于蹄、爪和脚。 
除了肽治疗之外，本发明的方法可以包括可以增强肽向指(趾)甲渗透的治疗。这是通过化学和物理方法实现的。物理治疗例如指(趾)甲刻蚀(nail etching)，或锉掉指(趾)甲背面层，可以增强本发明的肽的渗透性。增强本发明的肽的指(趾)甲渗透性的化学方法是通过破坏指(趾)甲板角蛋白中的物理或化学键来实现的。指(趾)甲软化剂包括但不限于尿素和水杨酸，其增强指(趾)甲的水合作用以降低指(趾)甲的密度，因此可以提高本发明的肽的渗透性。包含巯基基团的化合物会裂解指(趾)甲角蛋白中的二硫键，并且可以导致去稳定化和提高药物的渗透性。 
在更具体的方面中，本发明提供了治疗受试者创伤的方法，其中包括向创伤施用治疗有效量的根据本发明的肽或基质。 
为了获得理想的效果，肽及其变异体或组合可以以单剂量或分剂量给药，例如至少约0.01mg/kg至约500-750mg/kg，至少约0.01mg/kg至约300-500mg/kg，至少约0.1mg/kg至约100-300mg/kg或者至少约1mg/kg至约50-100mg/kg体重，或者至少约1mg/kg至20mg/kg体重，尽管其它剂量也可以提供有益的效果。给药剂量将随着各种因素而变化，包括但不限于所选择的肽及其临床效果、疾病、体重、身体状况、健康状况、哺乳动物的年龄、要实现的是治疗还是预防，以及肽是否经过化学修饰。 
根据本发明，给予治疗剂可以是单剂量、多剂量、连续的或间歇的方式，这取决于例如接受者的生理状况，给药的目的是治疗还是预防，以及专业技术人员已知的其它因素。给予本发明的肽实质上是在预定的时间期间连续的，或者可以是以一系列间隔的剂量的形式。局部和全身给药都考虑在内 
为了制备组合物，可以合成肽或以其它方式获得肽，根据需要和期望 进行纯化，然后经冻干和稳定化。然后调节肽至适当的浓度，并且任选地与其它试剂组合。单位剂量中包含的特定肽的绝对重量可以有很大的变化。例如，可以给予约0.01至约2g或约0.01至约500mg的至少一种本发明的肽，或特异性针对特定细胞类别的多种肽。备选地，单位剂量可以从约0.01g至约50g，从约0.01g至约35g，从约0.1g至约25g，从约0.5g至约12g，从约0.5g至约8g，从约0.5g至约4g或者从约0.5g至约2g来变化。 
因此，一种或多种包含本发明的治疗性肽的适宜的单位剂型可以通过多种途径给药，包括口服，肠道外(包括皮下、静脉内、肌肉内和腹腔内)，直肠，皮肤，透皮，胸内，肺内，鼻内(呼吸的)途径。治疗性肽也可以配制成脂质制剂或用于缓释(例如使用微囊化，参见WO94/07529和美国专利No.4,962,091)。如果适合，剂型可以是离散的单位剂型以便于使用，并且可以通过药学领域熟知的任何方法来制备。这些方法可以包括治疗剂与液体载体、固体基质、半固体载体，细分散的固体载体或它们的组合混合，以及随后根据需要将产品加入所需的输送系统或成型后进入所需的输送系统的步骤。 
当本发明的治疗性肽被制成用于口服给药时，它们通常与药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合以形成药物制剂或单位剂型。为了口服给药，肽可以以呈现为粉末、颗粒、溶液、悬浮液、乳液，或者处在天然的或合成的聚合物或树脂中用于从口香糖中摄入活性成分。活性肽也可以呈现为丸剂、冲剂或糊剂。口服给药的本发明的治疗性肽液可以被配制成缓释剂型，例如肽可以被包衣、微囊化或者置于其它缓释输送的装置中。在这样的制剂中，活性成分总量占制剂重量的0.1-99.9％。 
包含本发明的治疗性肽的药物制剂可以使用熟知且容易获得的成分通过本领域的方法制备。例如，肽可以与常用的赋形剂、稀释剂或载体一起配制成片剂、胶囊、溶液、悬浮液、粉末和气雾剂等。适于这些制剂的赋形剂、稀释剂和载体的例子包括缓冲剂以及填充剂和膨胀剂，如淀粉、纤维素、蔗糖、甘露醇以及硅的衍生物。也可以包括粘合剂，如羧甲基纤维素、羟甲基纤维素、羟丙甲基纤维素以及其它纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮。可以包括的保湿剂如甘油，崩解剂如碳酸钙和碳酸氢钠。还可以包括延迟溶出的试剂，如石蜡。也可以包括再吸收促进剂(Resorption accelerators)，如季铵化合物。可以包括表面活性剂，如鲸蜡 醇、甘油单硬脂酸酯。可以加入的吸附载体如高岭土和膨润土；还可以包括的润滑剂如滑石、硬脂酸钙和硬脂酸镁，以及固体聚乙二醇；也可以加入防腐剂。本发明的组合物也可以包含增稠剂，如纤维素和/或纤维素衍生物。它们也可以包含树胶如黄原胶、瓜尔胶或carbo胶或阿拉伯胶，或备选的聚乙二醇、有机皂土和蒙脱土等。 
例如，包含本发明的肽的片剂或囊片(caplets)可以包括缓冲剂，如碳酸钙、氧化镁和碳酸镁。适宜的缓冲剂还包括醋酸盐、柠檬酸盐、硼酸盐和磷酸盐等。囊片和片剂也可以包括非活性成分，如纤维素、预胶化淀粉、二氧化硅、羟丙甲基纤维素、硬脂酸镁，微结晶纤维素、淀粉、滑石、二氧化钛、苯甲酸、柠檬酸、玉米淀粉、矿物油、聚丙二醇、磷酸钠、硬脂酸锌等。包含至少一种本发明的肽的硬或软明胶胶囊可以包含非活性成分如明胶、微结晶纤维素、十二烷基硫酸钠、淀粉、滑石和二氧化钛等，以及液体载体如聚乙二醇(PEGs)和植物油。此外，包含至少一种或多种本发明的肽的肠衣囊片或片剂被设计成防止在胃内崩解，并且十二指肠内更加中性到碱性的环境下溶解。 
本发明的治疗性肽也可以被配制成酏剂或溶液以便于口服给药，或者配制成适于肠道外给药的溶液，例如肌肉内、皮下、腹膜内或静脉内的途径。本发明的治疗性肽的药物制剂也可以采用水溶液或无水溶液或分散体的形式，或者备选的乳剂、悬浮剂或软膏的形式。 
因此，治疗性肽可以配制成用于肠道外给药的制剂(例如，通过注射，例如团注或连续输注)，并且可以以单位剂量的形式存在于安瓿、预填充的注射器、小体积输注容器或多剂量容器中。活性肽和其它成分可以在油性或水性载体中形成悬浮液、溶液或乳液，并且可以包含调节剂(formulatory agent)，如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。备选地，活性肽和其它成分可以是粉末形式，这是通过无菌固体的无菌分离，或由用适合的载体，例如使用前无菌无热原的水构成的溶液经冻干而获得的。 
这些制剂可以包含本领域熟知的药学上可接受的载体(carriers)、载体(vehicles)和辅剂。例如，能够使用一种或多种从生理学的观点而言可接受的有机溶剂来制备溶液，除水之外，所述溶剂选自丙酮，醋酸，乙醇，异丙醇，二甲基亚砜，乙二醇醚如以名称为“Dowanol”销售的产品，聚二醇类和聚乙二醇，C1-C4短链酸的烷基酯，乳酸乙酯或乳酸异丙酯，脂肪酸甘油三酯如以名称为“Miglyol”出售的产品，肉豆蔻酸异丙酯 (isopropyl mytrisate)，动物油，矿物油和植物油以及聚硅氧烷。 
包含本发明的肽的溶剂或稀释剂可以包括酸性溶液，二甲基亚砜，N-(2-巯基丙酰)甘氨酸，2-正壬基-1，3-二氧戊环和乙醇。优选的溶剂/稀释剂是酸性溶剂，例如醋酸、柠檬酸、硼酸、乳酸、丙酸、磷酸、苯甲酸、丁酸、苹果酸、丙二酸、草酸、琥珀酸或酒石酸。 
还考虑了包括一种或多种本发明的肽以及一种或多种其它抗微生物或抗真菌剂的组合产品，所述其它抗微生物或抗真菌剂例如多烯类，如两性霉素B、两性霉素B脂质复合物(ABCD)、两性霉素B脂质体(L-ABM)以及制菌霉素脂质体；唑类和三唑类，伏立康唑、氟康唑、酮康唑、伊曲康唑、泊沙康唑(pozaconazole)等；葡聚糖合成酶抑制剂，如卡泊芬净，米卡芬净(FK463)和V-棘白菌素(LY303366)；灰黄霉素；烯丙基胺类，如特比萘芬；氟胞嘧啶或其它抗真菌剂，包括本发明描述的那些。此外，可以考虑肽与局部抗真菌剂组合起来，局部抗真菌剂如环吡酮胺，卤普罗近，托萘酯，十一烯酸酯(盐)，局部用制菌霉素，阿莫罗芬，布替萘芬，萘替芬，特比萘芬以及其它局部药物。 
此外，肽可以配制成缓释剂型等。制剂的组成能使该制剂能够在一定的时间内释放活性肽，例如在肠道或呼吸道的特定部分释放。包衣，包膜和保护性基质可以由例如聚合物质，如聚乳酸-乙醇酸，脂质体，微乳，微粒，纳米颗粒或蜡制成。这些包衣、包膜和保护性基质用于包覆留置装置，例如支架、导管、腹膜透析管、排液装置(draining devices)等。 
对于局部给药，如本领域已知的那样，可以将活性药物配制成直接应用于靶点区域。主要为局部应用而配制的形式采用了例如乳膏，乳液，凝胶，粉末，分散体，微乳，调节得更稠或更稀的洗剂，浸渍的药垫，软膏或棒，气雾剂(例如喷雾或泡沫)，皂，洗涤剂，皂类洗剂或皂块的形式。其它用于该目的的常规形式包括医用敷料，涂层绷带(coated bandages)，或其它聚合物覆盖物，软膏，乳膏，洗剂，糊剂，凝胶，喷雾剂和气雾剂。因此，可以通过贴剂和绷带输送本发明的治疗性肽以用于皮肤给药。备选地，也可以将肽配制成粘性聚合物，如聚丙烯酸酯或丙烯酸酯/醋酸乙烯酯共聚物的一部分。为了适于长期应用，可能希望使用带微孔的和/或透气的衬底层，这样可以使皮肤的水合作用和浸渍降到最小。衬底层可以是任何能够提供所需的保护和支持功能的厚度。适宜的厚度一般为约10至约200微米。 
局部给药可以是指(趾)甲涂层或漆的形式。例如，抗真菌的肽可以配制成用于局部给药的溶液，其中包含乙酸乙酯(NF)，异丙醇(USP)以及聚[甲基乙烯基醚/马来酸]单丁酯的异丙醇溶液。 
局部应用的药物制剂可以包含例如生理上可接受的缓冲盐溶液，该溶液包含约0.001mg/ml和100mg/ml之间，例如0.1mg/ml和10mg/ml之间的一种或多种特异性针对于将被治疗的适应症或疾病的本发明的肽。 
例如，软膏和乳膏可以用水性或油性基质配制，其中加入适宜的增稠剂和/或胶凝剂。洗剂可以用水性或油性基质配制，并通常还含有一种或多种乳化剂，稳定剂，分散剂，悬浮剂，增稠剂或着色剂。活性肽也可以通过电离子导入来输送，例如美国专利Nos.4,140,122；4,383,529或4,051,842中所公开的方法。局部制剂中存在的本发明的肽的重量百分比要取决于多种因素，但通常会为制剂总重量的0.01％至95％，并且典型的是0.1-85％重量。 
滴剂，如滴眼剂或滴鼻剂，可以采用一种或多种水性或非水性基质中的治疗性肽来配制，该基质中还包含一种或多种分散剂，增溶剂或悬浮剂。液体喷雾剂可以是以泵驱动的，或者是便于从加压包装中输送出来的。滴剂可以通过简单的眼用带盖滴管瓶(eye dropper-capped bottle)，通过适于输送液体内容物液滴的塑料瓶，或者通过特定形状封闭容器来输送。 
治疗性肽可以被进一步配制成用于口腔和咽喉局部给药。例如，活性成分可以配制成进一步含有调味基质，通常是蔗糖和阿拉伯胶或西黄蓍胶的锭剂(lozenge)；包含惰性基质如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶中的组合物的锭剂(pastilles)；以及包含适宜液体载体中的本发明组合物的漱口水。 
用于本发明的药物制剂的载体和/或稀释剂的特定的非限制性例子包括水和生理上可接受的缓冲盐溶液，如pH 7.0-8.0的磷酸缓冲盐溶液。 
本发明的肽也可以经呼吸道给药。就吸入或吹入给药而言，组合物可以采用干粉形式，例如治疗剂与适宜的粉状基质如乳糖或淀粉的粉状混合物。当以气雾剂或吸入的形式给药时，本发明的治疗性肽也可以以水溶液给药。因此，其它的气雾剂药物制剂可以包含例如生理上可接受的缓冲盐溶液，溶液中包含介于约0.001mg/ml和100mg/ml之间，例如0.1和100mg/ml之间，如0.5-50mg/ml，0.5-20mg/ml，0.5-10mg/ml，0.5-5mg/ml或1-5mg/ml的一种或多种特异性针对将被治疗的适应症或疾病的本发明 的肽。 
贯穿本申请的说明书和权利要求书，词语“包括(comprise)”和“包含(contain)”以及这些词语的变体，例如“包括(comprising)”和“包括(comprises)”意味着“包括但不限于”，并且不想要排除(和排除)其它部分、附加物、组分、整数或步骤。 
贯穿本申请的说明书和权利要求书，单数包含了复数，除非上下文另有需要。特别地，当使用不定冠词时，说明应被理解为考虑了复数以及单数，除非上下文另有需要。 
与本发明特定的方面、实施方案或实施例一起被描述的技术特征、整数、特性、化合物、化学基团(chemical moieties)或基团将被理解为可适用于本发明描述的其它方面、实施方案或实施例，除非与之不相容。 
实施例 
材料和方法 
实施例1
通过将1eq的被保护的肽和1eq(eq＝相等的体积)的HATU以100mg/ml的浓度溶于DMF(二甲基甲酰胺)中，使7个氨基酸的多赖氨酸肽进行环化。为了提高pH值，加入2.5eq的DIEA(二异丙基乙胺)，并且通过HPLC跟踪反应过程。当反应完成时，在水中沉淀肽，并且另外进行水洗。然后将肽干燥并用氢氟酸去保护以形成最终的环状肽。此后，在冻干之前使用离子交换色谱以醋酸替换氢氟酸溶剂。 
实施例2
通过将1eq的被保护的肽与5eq的NaHCO3(碳酸氢钠)和2eq的PyBOP以28.5mg/ml的浓度溶于DMF中，使7个氨基酸的多精氨酸肽进行环化。通过TLC追踪反应，并且当反应完成时在水中沉淀肽，并且另外进行水洗。然后将肽干燥并用氢氟酸去保护以形成最终的环状肽。此后，在冻干之前使用离子交换色谱以醋酸替换氢氟酸溶剂。 
实施例3
7个氨基酸的多精氨酸肽的环化： 
溶液1：将57mg的HBTU(Mwt＝379.3，0.15毫摩尔)或57mg的HATU(M＝380.3，0.15毫摩尔)和60μl的0.92mg/ml NMM(n-甲基吗啉，Mwt＝101.2，0.55毫摩尔)溶于2.86 ml的DMF中。 
溶液2：将288mg的H-[Arg(Pbf)]7-OH(Mwt＝2877.6，0.1毫摩尔)(7个氨基酸的多精氨酸肽)溶于0.71ml的DMF中。 
在30分钟内将溶液2滴加到溶液1中。用湿pH试纸检查pH值，并且pH值必须为8.5-9。在室温下搅拌反应混合物过夜*。混合物经真空浓缩。加入NaHCO3(5％)溶液。被保护的环肽的沉淀经过滤并用水洗涤。得到150-200mg。在TFA/水(95/5，v/v)(1g被保护的肽用10ml)中进行Pbf基团的裂解。浓缩混合物并加入IPE沉淀粗产品。得到100-110mg粗环状Arg。 
(*使用HATU进行的偶联在5小时后完成。NMM的量取决于H-[Arg(Pbf)]7-OH中过量的TFA)。 
合成的环状肽至少有纯度为95％的对映体，并且趋向于在97-99％之间变化。根据该方法合成的环状肽至少有纯度为95％的对映体。 
肉汤稀释抗真菌易感性试验
采用临床实验室标准研究所(Clinical Laboratory Standard Institute，CLSI，以前为NCCLS)认可的标准，确定相关真菌菌株对环化的肽的敏感性。使用“丝状真菌的肉汤稀释抗真菌易感性试验的参考方法，认可的标准M38-P)”测试真菌的易感性。使用“酵母的肉汤稀释抗真菌易感性试验的参考方法，认可的标准-第二版M27-A)”测试酵母的易感性。 
肉汤稀释抗细菌易感性试验
采用临床实验室标准研究所(CLSI，以前为NCCLS)认可的标准，确定相关细菌菌株对环化的肽的敏感性。使用“厌氧生长细菌的稀释抗微生物易感性试验的参考方法，认可的标准-第七版M7-A7，)测试细菌的易感性。 
溶血试验
将所研究的肽以所需浓度等分成三份置于Nunc 96孔板中，并且以1：1进行连续稀释(100μl)。将100μl经洗涤的(50ml HBSS洗涤3次)聚 集的人红细胞(RBC)(1×108RBC/ml)加到测试孔中，并在37℃下孵育3小时。孵育后，再向所有的孔中加入100μl的HBSS，并将孔板在4℃下孵育过夜。移出100μl上清液，并置于新的微量滴定板中，在450/620nm下用Sunrise孔板读数仪(Tascam)读数。还包括了单独的缓冲液，缓冲液与RBC，以及水与RBC作为对照孔(设4个复孔)。用Graph Pad(Prismsoftware)对数据绘图并进行统计分析。 
结果 
环化的肽的序列
被分析的肽的序列如下： 
肽1：环状-K-K-K-K-K-K-K 
肽2：环状-R-R-R-R-R-R-R 
肽3：环状-K-K-K-K-K-K-K-G 
肽4：环状-R-R-R-R-R-R-R-G 
肽5：环状-O-O-O-O-O-O-O-G 
肽6：  环状-DR-DR-DR-DR-DR-DR-DR-G 
肽7：环状-DO-DO-DO-DO-DO-DO-DO-G 
肽8：  环状-DK-DK-DK-DK-DK-DK-DK-G 
前缀“D”表示在肽的合成中使用的氨基酸为D-异构体。“O”代表非天然氨基酸鸟氨酸。 
已经合成了包含3、5、9、11、13或15个精氨酸或赖氨酸的环状肽，并且已经测定了活性(数据未显示)。 
环化的肽的抗细菌活性
将肽1暴露于大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的培养物中，在37℃下再培养16小时后，针对两种微生物的MIC均为1mM(表2)。在该浓度下，肽1完全抑制了大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长。 
用肽2重复该实验。肽2对大肠杆菌的MIC为0.1mM；肽2对金黄色葡萄球菌的MIC为1.0mM。这表明环化的肽对细菌活性具有显著的作用。 
而大小与肽1和肽2相对应的线性肽分别表现出的活性显著低于肽1和肽2。 
环化的肽对红色发癣菌的抗真菌活性
对红色发癣菌对肽1-8的易感性进行测试。肽1表现出的对红色发癣菌培养物的MIC为0.1mM(表2)。肽2表现出的对红色发癣菌培养物的MIC为0.25mM。 
而大小与肽1和肽2相对应的线性肽分别表现出的活性显著低于肽1和肽2。 
肽3-8具有一个被引入环状肽环的单独甘氨酸残基。因此，相对于肽1和肽2的7个氨基酸，肽3-8的长度为8个氨基酸。肽3-6都表现出抗红色发癣菌的抗真菌活性(MIC(mM)分别为4.0、2.0、4.0、1.0)。肽7-8即使在最大检测浓度(4mM)下也没有显示出抗红色发癣菌的抗真菌活性。 
肽3-6显示出抗真菌活性，但是非阳离子氨基酸甘氨酸的引入显著地减弱了抗真菌活性。例如，这可以从肽2(无甘氨酸；MIC＝0.2mM)与肽4(加入甘氨酸；MIC＝2.0mM)的活性比较看出来(表2)。该数据显示长度为7个和8个氨基酸的环状肽均有抗真菌活性，但是肽的阳离子性降低时，对红色发癣菌的抗真菌活性也降低。 
环化的肽对趾间发癣菌的抑制
对趾间发癣菌对肽2-8的易感性进行测试。肽2-8抗趾间发癣菌的抗真菌活性见于表2。肽2、4和6对趾间发癣菌有活性。 
环化的肽对新型隐球菌的抑制
使用“酵母的肉汤稀释抗真菌易感性试验的参考方法，认可的标准一第二版M27-A)”测试新型隐球菌对肽4和6-8的易感性。 
表2显示阳离子环状肽4和6-8对病原性酵母新型隐球菌具有抗真菌活性(MIC分别为1.0mM、0.5mM、2.0mM和0.5mM)。 
肽2对所选的病原微生物的抗微生物活性
表3中显示了肽2对60种所选的病原微生物的抗微生物活性。正如可以看到的，一致地看到了抗真菌，特别是皮肤真菌、短尾帚霉、糠秕马拉塞霉菌、非白色的念珠菌属和细菌大肠杆菌的最强抗微生物活性(即最小的MIC)。 
在环化的肽中使用对映异构体氨基酸的作用
表2显示了全L和全D环状阳离子肽的抑制效果的对比情况。肽4和6是包含氨基酸精氨酸(7个氨基酸)和甘氨酸(1个氨基酸)的等量全L和全D环状阳离子肽。全D型的抗红色发癣菌的抗真菌活性强于全L型(MIC分别为1.0和2.0mM)。全D型抗趾间发癣菌的抗真菌活性强于全L型(MIC分别为0.25和0.5mM)。全D型抗酵母新型隐球菌的抗真菌活性强于全L型(MIC分别为0.5和1.0mM)。这些表明该肽的全D型的活性强于全L型。 
肽3和8是包含氨基酸赖氨酸(7个氨基酸)和甘氨酸(1个氨基酸)的等量全L和全D环状阳离子肽。全L型的抗红色发癣菌的抗真菌活性强于全D型(MIC分别为4.0和＞4.0mM)。两种肽未表现出抗趾间发癣菌的抗真菌活性(两种肽的MIC均大于4.0mM)。 
环化的肽的溶血活性
在浓度超过显示抗真菌活性的浓度下，环状阳离子肽的溶血活性是可以忽略的(表4)。 
环化的肽的肝毒性
在浓度接近于显示抗真菌活性的浓度下，肽2、9和10未显示出肝毒性。 
表1：偶联剂 
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脲盐/铵盐 
HBTU：R1＝R2＝CH3；X＝CH(N型结构) 
HBPyU：R1，R2＝(CH2)4；X＝CH(未知的) 
HATU：R1＝R2＝CH3；X＝N(N型结构) 
HAPyU：R1，R2＝(CH2)4；X＝N(N型结构) 
亚铵盐 
BOMI：R1＝R2＝CH3，R3＝H；X＝CH(N型结构) 
BDMP：R1，R3＝(CH2)3，R2＝CH3；X＝CH(N型结构) 
DPMP：R1＝R2＝(CH2)4，R3＝Ph；X＝CH(未知的) 
AOMP：R1，R3＝(CH2)3，R2＝CH3；X＝N(未知的) 
鏻盐 
BOP：R1＝R2＝CH3；X＝CH 
PyBOP：R1，R2＝(CH2)4；X＝CH 
AOP：R1＝R2＝CH3；X＝N 
PyAOP：R1，R2＝(CH2)4；X＝N 
表2：环化的肽对所选病原微生物的抗微生物活性(MIC；mM) 
肽 分子量(Da) 红色发癣菌 趾间发癣菌 大肠杆菌 金黄色葡萄球菌 新型隐球菌
1 879.2 0.1 ND 1.0 1.0 ND
2 1093.3 0.25 ＜0.125 0.1 0.25 ND
3 954.3 4.0 ＞4.0 ND ND ND
4 1150.4 2.0 0.5 ND ND 1.0
5 856.1 4.0 ＞4.0 ND ND ND
6 1150.4 1.0 0.25 ND ND 0.5
7 856.1 ＞4.0 ＞4.0 ND ND 2.0
8 954.3 ＞4.0 ＞4.0 ND ND 0.5
表3：肽2对所选病原微生物的抗微生物活性(MIC；mM) 
真菌 编号 MIC(mM) 细菌 编号 MIC(mM)
红色发癣菌 NCPF118 0.25 金黄色葡萄球菌1 NCTC10442 0.25
红色发癣菌 7个临床分离株2 0.5-1.0 金黄色葡萄球菌3 NCTC6571 ＞1.9
趾间发癣菌 NCPF335 ＜0.125 金黄色葡萄球菌2 NCTC10778 ＞1.9
须发癣菌 DM2006 978 0.5 金黄色葡萄球菌2 ATCC12598 0.95
须发癣菌 DM2006 1023 0.5 金黄色葡萄球菌2 NCTC8325 ＞1.9
糠秕马拉塞霉菌 DSM6170 0.031 金黄色葡萄球菌1 Col 0.95
短尾帚霉 NCPF2177 0.5 金黄色葡萄球菌1 N315 0.95
短尾帚霉 DM2006 1025 0.5 金黄色葡萄球菌1 ANS46 0.95
[0197] 
黑曲霉 NCPF2022 0.5 金黄色葡萄球菌1 MW2 0.95
土曲霉 NCPF2729 ＞2 金黄色葡萄球菌 16个临床分离株4 ＞3.8
尖镰孢霉 NCPF2722 ＞2 绿脓杆菌 ATCC27853 ＞1.9
新月菌属 DM2006294 ＞2 绿脓杆菌 DSM50071 ＞2
新月菌属 DM2006495 ＞2 绿脓杆菌 ATCC27853 ＞2
新月菌属 DM20061026 ＞2 洋葱伯克霍尔德菌 ATCC25609 ＞1.9
白色念珠菌 NCTC3179 ＞2 大肠杆菌 NCTC12900 0.1
白色念珠菌 ATCC24433 ＞2      
白色念珠菌 ATCC90028 ＞2      
白色念珠菌 AM2003-020 ＞2      
白色念珠菌 IHEM3742 ＞2      
白色念珠菌 s20122.073 ＞2      
克鲁斯念珠菌 NCPT3953 0.128-0.256      
克鲁斯念珠菌 ATCC6258 0.125      
近平滑念珠菌 ATCC22019 0.25      
近平滑念珠菌 ATCC90018 1.0      
1MRSA(甲氧西林抗性的金黄色葡萄球菌) 
2参考编号：DM2006517；DM2006902；DM2006932；DM2006953；DM20061008；DM20061093；DM2006 1377 
3MSSA(甲氧西林敏感性的金黄色葡萄球菌) 
4参考编号：97.2935.K；98.1695.K；97.2637.D；98.2028.X；05.5240.R；00.9523.R；03.8996.T；98.1515.F；00.5472.R；00.1039.P；02.6225.E；03.3200.J；01.7995.S；03.8951.G；00.9521.M；97.1636.D 
表4：所选的肽对红细胞的溶血活性 
肽 最大测试浓度(mM) 溶血
1    
2 73.7 无
3 10.0 无
4 10.0 无
5 10.0 无
6 5.0 无
7 1.0 无
8 1.0 无

Claims (13)

1.由7个精氨酸氨基酸构成的环状肽在制备用于治疗真菌感染的药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述氨基酸是D-氨基酸。
3.根据权利要求1所述的用途，其中所述氨基酸是L-氨基酸。
4.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中所述真菌感染为皮肤真菌感染。
5.根据权利要求4所述的用途，其中所述皮肤真菌感染是由发癣菌属、表皮癣菌属或小孢霉属的皮肤真菌引起的。
6.根据权利要求5所述的用途，其中所述皮肤真菌为发癣菌属。
7.根据权利要求6所述的用途，其中所述皮肤真菌为趾间发癣菌。
8.根据权利要求6所述的用途，其中所述皮肤真菌为红色发癣菌。
9.根据权利要求1-3中任一项所述的用途，其中所述感染为甲真菌病。
10.根据权利要求4所述的用途，其中所述感染为甲真菌病。
11.根据权利要求1-3中任一项所述的用途，其中所述感染为癣感染。
12.根据权利要求4所述的用途，其中所述感染为癣感染。
13.根据权利要求9所述的用途，其中所述感染为癣感染。
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