KR102137941B1 - 항균 펩티드 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 항균 펩티드, 펩티드를 포함하는 약학적 조성물 및 이의 미생물, 박테리아, 진균, 바이러스 및 기생충 감염을 치료 또는 예방하기 위한 용도에 관한 것이다.

Description

항균 펩티드{Antimicrobial Peptide}
본 발명은 생화학 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 항균 펩티드 분야 및 박테리아, 바이러스, 진균 및 기생충 감염에 대응하는 것에 관한 것이다.
항균 펩티드(Antimicrobial Peptide, AMP)는 자연을 통한 생물의 방어 시스템의 필수 구성요소이며 침입한 병원균에 대하 보호를 제공한다. AMP는 하나의 정의된 분자 구조(에피토프)를 표적하는 것이 아니나 세포막에서 작용하여 박테리아 및 진균을 빠르게 죽인다. 따라서, 기존의 항생제와는 반대로, 이들은 박테리아의 대사 활성과는 상관없이 효과적이다. 그들의 직접적인 살균 활성 이외에도, 항균 펩티드는 특정 펩티드가 선천성 및 후천성 면역 시스템, 염증 및 상처 치유 조절과 같은 여러 활동들, 추가적인 항진균, 항바이러스, 항기생충 및 항암 활동을 나타냄으로써 특히 매력적이다. AMP는 서열 및 2차 구조가 매우 다양하지만 몇 가지 공통의 특성을 공유한다. 그들은 보통 짧고(약 15-40개 아미노산들), 양이온성, 양쪽성이며, 주로 박테리아 막의 완전성을 손상시켜 그들의 살균 효과를 발휘한다. AMP와 표적 미생물의 음이온 막 표면과 상호작용은 막의 투과성, 세포 용해 및 사멸을 일으킨다. 일반적으로 세포질 막이 대부분의 항균성 펩티드의 주요 표적으로서, 막 내에 펩티드의 축적은 투과성을 증가시키고 장벽 기능의 손실을 일으켜 세포질 성분의 누출 및 세포 죽음을 일으키는 것으로 받아진다. 일부는 현상학적이고 다른 일부는 더 정량적인 막 투과성에 대한 다양한 분자 작용기전은 AMP의 행동을 설명하기 위해 제안되었다.
모델 시스템에서 실험적 관찰은 주로 카펫 또는 기공 모델(도 1)에 의해 합리화되었다. 카펫 모델에서 AMP는 막에 병렬 방식으로 배향된 막 표면상에 축적되어 국소 막이 얇아지고 세포막의 불안정화를 초래하여 세포 내 물질이 방출된다. 그러나, 많은 AMP는 또한 비특이적인 방식(예: 지질 클러스터링이나 지질의 극성과 비극성 그룹의 분리)으로 지질의 패킹 및 조직을 방해하거나 비-이중층 지질 군을 유도함으로써 세척제-유사 방식으로 기능을 한다는 강력한 증거가 있다. 또한, 일부 AMP들은 세포 막을 통과하고 세포 내 목표물(도 1)과 상호작용하여 박테리아/곰팡이의 생존력을 상실시킨다.
분명히, AMP의 동작 모드는, 대부분 세포 벽 상에 독특한 에피토프와 같은 단순한 표적을 가지고 있다거나, 단백질 및 RNA 합성 과정에서 병원성 박테리아가 더 빨리 내성을 가지도록 하는 기존 항생제의 동작모드와는 다르다. 기존의 항생제에 비해 항균성 펩티드의 주요 장점은 이러한 AMP에 대해 미생물의 내성이 쉽게 만들어지지 않는 것인데, 아마도 이러한 펩티드는 -기존의 항생제 대비- 하나의 정의된 분자 구조(에피토프)를 표적으로 하지 않으나, 세포막에 작용함으로써 수분 내에 박테리아 및 곰팡이를 죽이기 때문이다. 따라서 박테리아 성장 속도보다 빨라지는 빠른 살상률 및 표적의 자연성(지질 조성물의 상당한 변형은 박테리아 세포 생존에 영향을 준다) 때문에 내성 형성의 가능성이 적다. AMP에 대해 내성을 갖는 돌연변이 출현은 돌연변이율이 다른 임상적으로 실험된 항생제(예:시프로플록사신(ciprofloxacin) 및 에리트로마이신(erythromycin)) 보다 낮은 것을 나타내는 펩티드의 서브-저해 농도의 존재하에서 반복된 계대 배양 후 박테리아의 민감성을 모니터링함으로써 결정되었다. 이들 항생제의 최소 저해 농도(Minimal Inhibiting Concentration, MIC)가 모든 계대배양(64회 까지)을 통해 증가된 반면, 펩티드의 압력은 균주의 MIC를 증가시키지 않았다. 따라서, 종래의 항생제와 대조하여, AMP 존재시 내성 형성은 거의 일어나지 않는다. 더욱이, AMP는 빠르게 작용하며 생분해성인 바, 환경에서 잔류 항생제에 대한 최근 우려를 완화시킨다.
다양한 종류의 미생물 감염은 생물막 형성과 관련이 있으며, 이는 미생물이 자가제작된 중합체 매트릭스 내 구조화된 커뮤니티에서 군집하고 표면에 부착하는 곳이다. 기존 항생제의 추가적인 단점은 다음과 같은 이유로 생물막 감염의 박멸을 보장하지 않는다는 것이다;
1) 기존 항생제의 생물막으로의 불충분한 침투:
박테리아가 포함되어 있는 매트릭스는 그들을 항균 물질과 같은 외부 영향으로부터 보호한다. 대부분의 항생제는 생물막을 침투할 수 있으나, 생물막으로의 확산이 느려서 그들이 원하는 효과를 끌어내기 전에 불활성화된다.
2) 박테리아의 낮은 물질대사 활성: 생물막-관련 감염(BAI)은 자주 리팜피신(rifampicin)과 결합하여 보통 반코마이신(vancomycin)으로 처리된다. 반코마이신이 생물막을 상당히 잘 침투시키는 것으로 알려져 있더라도 - 비록 현저히 감소된 전송속도이기는 하지만- 생물막 내에 존재하는 수많은 박테리아를 저조하게 감소시킨다. 이런 항생제의 처리는 따라서 비교적 높은 실패율을 가지며, 이는 생물막 내에서 박테리아의 낮은 물질대사 활성에 의해 설명될 수 있으며, 항생제를 효과없게 만든다.
3) 항생제의 불활성화 또는 저하: BAI에서 항생제는 대부분 온몸에 투여된다. 그래서 이들은 신장 청정 및 혈액 내 및 주변 조직에서 저하된 효소에 의해 혈류로부터 제거되는 경향이 있다. 효소(박테리아에 의해 생산된)는 화합물을 직접 파괴시키거나 변형할 수 있다. 이러한 작용기전은 국소 환경에서 약물의 농도를 활발히 줄인다. 생물막에서 낮은 침투는 추가적인 문제가 있다. 전신 투여 농도를 높이는 것은 항생제의 높은 혈중 농도의 독성 때문에 가능하지 않다.
4) 박테리아는 내성을 형성한다. 항생제에 대한 박테리아의 내성의 일반적인 증가 외에, 더 깊은 층에서 감소된 항생제 농도 때문에,박테리아가 항생제 압력으로부터 벗어나는 위험이 증가되고, 이는 이들 항생제에 대한 증가된 내성을 갖는 돌연변이체의 생존을 초래한다. 반코마이신과 같은 항생제의 차선 농도는 생물막 형성을 향상시키는 것으로 보고된다. 또한, 불충분한 효과를 갖는 기존의 항생제의 반복적인 투여는 항생제 내성의 발달을 촉진한다.
5) 기존의 항생제는 전-염증성 미생물 화합물의 방출을 일으킨다: BAI 에서 임플란트-주위 조직은 박테리아에 의해 집락형성되어 나타났다. 이것은 대다수 국소 면역 반응의 탈조절 때문이다. 이는 많은 경우에, 임플란트의 교체 후라도 감염이 유지되는 이유이다. 생체 재료의 주입은 "이물 반응"으로 알려진 염증 반응을 유도하는데, 이는 호중구, 대식세포/단색세포 및 림프구의 연속적인 유입을 특징으로 하고, 다음으로 대식구가 생체물질을 감싸고 있는 다핵 이물 거대 세포에 융합되고, 새로운 섬유아세포의 형성 및 피브린의 증착이 일어나, 이물질의 섬유화/캡슐화를 일으킨다. 이러한 일련의 이벤트는 관계된 세포 타입에 의해 생산된 사이토카인과 같은 분자 신호에 의해 강력히 조절된다. 감염의 경우, 숙주 면역 시스템은 추가로 톨-유사 수용체(Toll-Like Receptors)(TLRs)와 같은 숙주세포 상에 특정 수용체에 의해 인식되는 "병원성 관련 분자 패턴(Pathogen-Associated Molecular Patterns)"(PAMPs)으로 지정된 박테리아의 분자에 의해 촉발된다. 예를 들어, 박테리아의 펩티도글리칸 또는 리포폴리사카라이드는 TLR2 및 TLR4에 의해 인식되고, 염증 반응의 강력한 유도제이다. 이물 반응 및 박테리아 감염 모두에 의한 면역 시스템의 활성은 사실상 감염에 이상적인 환경을 제공하여 숙주 면역 시스템의 염증 및 조직 파괴에 이르는 과장된 반응을 야기한다. 따라서, 생체재료 및 PAMP에 의한 동시 활성화는 면역 기능에 악영향을 미칠 수 있으며 감염에 대한 감수성을 강하게 증가시킬 수 있다.
현재, 2,000개 이상의 서로 다른 항균 펩티드 서열은, 예를 들어 세크로핀(cecropins), 디페신(defensins), 마게이닌(magainins) 및 카텔리시딘(cathelicidins)을 포함하여 알려져 있다(예를 들어, www.bbcm.univ.trieste.it/~tossi/search.htm 참조). 예를 들어, 항균 펩티드 및 단백질은 하기에 설명되어 있다:
항균 펩티드로 사용될 수 있는 인돌리시딘 유사체인 양이온성 펩티드를 개시한 US 6,503,881. 양이온성 펩티드는 동물 및 식물 등 다른 종으로부터 유래된다.
항-진균 및 항-박테리아의 히스타틴-기반의 펩티드 및 진균 및 박테리아 감염의 치료 방법을 개시하는 US 5,912,230. 펩티드는 자연적으로 일어나는 인간 히스타틴의 아미노산 서열의 정의된 일부분에 기초한다.
메틸화된 라이신이 풍부한 용균 펩티드를 개시한 US 5,717,064. 용균 펩티드는 트립신 소화 내성이며 비천연이다. 용균 펩티드는 생체 내 투여에 적합하다.
누에 체액으로부터 항균 부분으로부터 분리된 항균 펩티드를 개시한 US 5,646,014. 펩티드는 대장균, 황색 포도상 구균 및 바실러스 세레우스와 같은 몇몇 박테리아 균주에 대해 항균 활성을 나타낸다.
아주로시딘(azurocidin)의 20-44 서열을 기초로 한 펩티드를 개시한 WO 2004/016653. 이 펩티드는 이황화 다리로 연결된 루프 구조가 포함된다.
살균성 55 kDa 단백질 살균성/투과성 증가 단백질(BPI)에 기초로 한 펩티드를 개시한 US 6,495,516. 펩티드는 LPS-중화 능력을 가질 뿐만 아니라 항균 효과를 발휘한다.
다수의 질병에 사용될 수 있는, G-연결 단백질 수용체 관련 폴리펩티드를 인코딩하는 다수의 서열을 개시한 WO 01/81578.
인간 카텔리시딘의 37 C-말단 아미노산인 펩티드 LL-37에 기초한 항균 펩타이를 개시한 WO　2004/067563 및 WO 2005/040192
여러 AMP들, 답토마이슨(daptomycin) 및 DPK-060은 현재 임상적으로 사용 및/또는 개발되는데, 예를 들어, 플리미신 B, 니신, 펙시가난(pexiganan), 오미가난(omiganan), 이세가난(iseganan)이 있다. 또한, 내인성 인간 카텔리시딘 항균 펩티드 LL-37로부터 유래된 24개 아미노산 펩티드인 OP-145에 대하여 임상 2상까지 수행되어왔다. OP-145는 만성 중이염의 치료를 위한 국소 치료를 위한 독소-중화 항균 펩티드로 개발되어 왔다. 현재까지 알려진 AMP들은 여전히 몇 가지 단점이 있다. 단백질 분해가 환경에 이롭다 하더라도(잔류 AMP가 없음), 이것은 동적 순환을 방지한다. 이것은 또한 효율적인 펩티드 정리에 의해 야기된다. 또한, AMP의 정확한 작동 메커니즘은 크게 알려져 있지 않으므로, 그들의 진정한 적용 및 전체적인 잠재력을 예견하는 것은 어렵다. 예를 들어, AMP가 숙주세포와 어떻게 상호작용하여 그들의 효과를 유도하는지 잘 알려져 있지 않다. 따라서, 임상적 징후에 AMP의 사용은 국소 적용에 한정되어 있다.
녹농균(P. aeruginosa), E. 패칼리스(E. faecalis), 프로튜스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 화농성 연쇄구균(Streptococcus pyogenes), 황색 포도상 구균(S. aureus)과 같은 다양한 박테리아 모두는 카텔리시딘(cathelicidin) LL-37과 같은 여러 가지 항균 펩티드를 분해하는 프로테아제를 분비한다. 따라서, 프로테아제 내성 항균 펩티드는 치료학적 관점에서 유리하다. 또한, 많은 항균 펩티드는 박테리아, 예를 들어, 항색 포도상 구균 및 녹농균과 같은 자주 문제적 병인에서 중요한 역할을 하는 미생물에 저항하는데 효율적이지 못하며 증가된 효과를 보여주기 위해 최적화될 필요가 있다. 더욱이, 포유 동물 세포막뿐만 아니라 박테리아에 대한 AMP의 다른 특성뿐만 아니라 잠재적인 용균성 때문에, 신규 펩티드를 디자인하는데 있어서 과제 중 하나는 감염된 환자의 세포막에 비해 박테리아 또는 진균 세포와 같은 미생물에 대해 높은 특이성을 가지는 AMP의 개발, 즉 높은 치료 지수(최소 용혈성 농도/최소 항균 활성; MHC/MEC)에 의존한다.
따라서, 상대적으로 많은 수의 현재 사용 가능한 항균 펩티드가 있더라도, 여전히 미생물, 특히 항생제 및/또는 다른 항균 제제에 대해 저항 또는 내성이 있는 미생물에 대응하는데 사용될 수 있는, 신규 개선된 항균 펩티드의 증가된 필요성이 있다. 더 중요한 것은, 인간과 같은 포유동물에 도입되었을 때 알레르기를 일으키지 않고 병원성 미생물에 대해 높은 특이성을 갖는 새로운 항균 펩티드에 대해 수요가 있다.
본 발명의 목적은 종래 항생제의 단점을 극복하고 공지된 항균 펩티드보다 개선된 특성을 가지는 신규 강력한 항균 펩티드를 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 생물막 감염에서 병원성 미생물에 대해 높은 활성을 발휘하는 신규 펩티드를 제공하는 것이다.
본 발명자들은 LAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR 서열을 갖는 폴리펩티드 P10이 진균, 예를 들어 시험관 내 칸디다 알비칸(Candida albicans) 및 아스퍼질러스 니제르(Aspergillus niger) 뿐만 아니라, (약제 내성) 그람-양성(예, 황색 포도상 구균) 및 그람-음성(예, 녹농균) 박테리아에 대해 매우 효과적임을 발견했다. 도 2A 및 2B에 도시된 바와 같이, P10은 다른 테스트된 어떤 펩티드 보다 훨씬 더 효과적이다. 또한, P10은 생물(상처난 3-D 인간 피부 모델) 뿐만 아니라 플라스틱 표면에서 메티실린-내성 황색 포도상 구균의 생물막 형성을 방지할 수 있다. 아울러, P10은 독소 리포타이코산(LTA), 펩티도글리칸(PG) 및 리포폴리사카라이드(LPS)를 중화시켜서 전염증성 반응을 감소시킨다. P10은 α-헬릭스를 채택하여 극성 아미노산이 헬릭스 일측에 위치하고 친지성 아미노산이 이 반대측에 위치한 양친매성 구조를 야기한다. 프롤린 치환이 도입되어 헬릭스가 깨지는 펩티드는 비활성이었는데, 이는 폴리펩티드의 자연적 양친매성이 생물학적 활성에 중요함을 나타낸다. P10은 도 2-5로부터 명백한 바와 같이 임상적 시험을 수행한 것에서 OP-145 (P60.4Ac)보다 훨씬 더 강력한 것으로 나타났다. 도 2B 및 실시예들에 자세히 기재된 바와 같이, P10은 P60.4Ac의 IC90(0.75 μM) 보다 훨씬 낮은 IC99.9 (0.59 μM)을 갖는다. 따라서 0.59μM의 농도로 P10은 1000개의 박테리아 중 999개를 죽이는 반면, P60.4Ac은 비슷한 농도, 약간 높은 농도에서 1000개의 박테리아 중 오직 900개를 죽인다. 따라서, 비슷한 농도에서 P10을 처리한 것에 비하여 P60.4Ac을 처리한 후에 100배의 박테리아가 더 생존하였다. 더욱이, 박테리아, 진균, 바이러스 및 기생충을 포함하는 다양한 미생물에 대하여 활성을 나타내기에 P10은 넓은 활성 스펙트럼을 가지고 있다.
생물막 감염에 대한 본 발명의 항균 펩티드의 고유한 효과는 3가지 부분이 있다: 그들은 1) 생물막 형성을 방지하고 존재하는 생물막을 분산시킬 것이고, 2) 방출 부위 및 주변의 박테리아, 진균 또는 다른 미생물을 죽이며, 3) 리포타이코산(LTA), 펩티도글리칸(PG) 및 리포폴리사카라이드(LPS)와 같은 전-염증성 미생물의 내독소를 중화시키고 대식세포를 활성시켜 그들의 식세포 및 살균 활성을 증진시킴으로써 면역반응을 조율할 것이다. 이러한 면역 조절은 주입 주변 조직이 병원균에 대한 새로운 거점이 되는 것을 방지하는데 필수적이다. 본 발명의 폴리펩티드는 기존 항생제에 대해 내성을 갖는 것을 포함하여 미생물의 넓은 범위에 대해 활성화된다.
또한 i) 하나 또는 모든 아미노산이 이의 D-아미노산으로 대체된 P10 변이체(표 2), ii) 펩티드가 C-말단의 N-말단이 아세틸, 아미드, NH-(CH2-CH2-O)11-CO, 헥사노일, 데카노일, 미리스토일, 프로피오닐, 하나 또는 두개의 아미노-헥사노일 그룹을 포함하는 다른 그룹으로 연장된 P10 변이체, iii) 하나의 아미노산이 다른 L-아미노산으로 대체된 P10 변이체, 및 iv) 짧아진 P10 변이체는 P10의 활성과 필적하는 항균활성을 갖고 있으며, 이는 실시예에서 증명되었다(표 2, 3, 5, 및 6 참조).
따라서, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 생물막 내에 존재하든 안하든 내독소 중화 활성으로 입증되는 최적의 항-염증(미생물 화합물-중화) 활성, 높은 선택성 즉, 높은 항균 활성, 허용가능한 낮은 독성 및 면역-증강 활성으로 미생물에 대하여 높은 활성을 갖는다.
따라서, 본 발명은 아미노산 서열 LAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR을 포함하는 분리된 또는 재조합 폴리펩티드, 또는 상기 아미노산 서열의 변이체를 제공하는데,
상기 폴리펩티드는 항균, 항박테리아, 항바이러스, 항진균, 항기생충성 및/또는 항-염증 활성을 갖고,
상기 변이체는 16개 이상의 아미노산을 가지며:
- 다음의 아미노산 치환을 5개까지 가짐:
· L, I, V 또는 A의 그룹으로부터 선택된 일 이상의 아미노산을 상기 그룹으로부터 선택된 다른 아미노산으로 치환;
· R, K 또는 H의 그룹으로부터 선택된 일 이상의 아미노산을 상기 그룹으로부터 선택된 다른 아미노산으로 치환;
· E를 Q로 치환
· Y 또는 W를 F로 치환
· Q, N, A, S 또는 T의 그룹으로부터 선택된 일 이상의 아미노산을 상기 그룹으로부터 선택된 다른 아미노산으로 치환
- 아미노산을 대응하는 D-아미노산으로 일 이상의 치환을 가짐,
- 아미노산을 대응하는 비-천연 아미노산으로 일 이상의 치환을 가짐, 및/ 또는
- 상기 아미노산 서열로부터 16개 이상의 연속적인 아미노산들의 레트로-인버소 서열을 가짐.
본원에서 정의된 아미노산의 아미노산 서열 또는 이들의 변이체는 단일-문자 기호로 표시된다. 이러한 단일-문자 기호 및 3-문자 기호는 당업자에게 잘 알려져 있으며 다음과 같은 의미를 갖는다: A (Ala)는 알라닌, C (Cys)는 시스테인, D (Asp)는 아스파르트산, E (Glu)는 글루탐산, F (Phe)는 페닐알라닌, G (Gly)는 글리신, H　(His)는 히스티딘, I (Ile)는 이소루이신, K (Lys)는 라이신, L (Leu) 은 류신, M (Met)은 메티오닌, N (Asn)은 아스파라긴, P (Pro)는 프롤린, Q (Gln)는 글루타민, R (Arg)은 아르기닌, S (Ser)는 세린, T (Thr)은 트레오닌, V (Val)는 발린, W (Trp)는 트립토판, Y (Tyr)는 티로신이다.
본 발명의 폴리펩티드는 항균 활성을 갖으며, 바람직하게는 항박테리아, 항바이러스 및/또는 항진균 활성, 보다 바람직하게는 항-박테리아 및/또는 항진균 활성을 갖는다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드는 바람직하게 항균 및 항-염증 활성 둘다를 갖는다. 본원에서 사용된 용어 폴리펩티드의 "항균 활성"은 적어도 하나의 미생물, 예를 들어 박테리아, 바이러스 및/또는 진균의 성장 또는 증식에 대응하는 것을 의미하며, 미생물의 사멸뿐만 아니라 성장 또는 증식의 억제, 감소 또는 예방을 포함한다. 미생물은 미시적인 유기체, 즉, 일반적으로 너무 작아서 사람 눈으로 볼 수 없는 것이다. 미생물은 매우 다양하며, 박테리아, 바이러스, 진균, 고세균, 원생 동물 및 미세 조류를 포함한다. 유사하게, 본원에서 사용되는 용어 "항균 활성", "항바이러스 활성", "항진균 활성" 및 "항기생충성 활성"은 박테리아, 바이러스, 진균 및 기생충 각각의 성장 또는 증식에 대응하는 것을 의미하며, 일반적으로 그들의 사멸뿐만 아니라 억제, 감소 또는 성장 또는 증식의 예방을 포함한다. 항균, 항박테리아, 항바이러스, 항진균 및 항기생충 활성은 당해 분야에 공지된 방법에 의해 측정될 수 있다.
이러한 방법 중 하나는 이의 적용 실시예에 자세히 기재되어 있으며, 시험관 내 살상 분석을 포함한다. 이 방법에서 미생물, 예를 들어 박테리아 또는 진균을 본 발명에 따른 폴리펩티드의 다양한 농도로 예를 들어 1-2 시간 동안 배양하고, 그 후 미생물-폴리펩티드 혼합물을 적절한 배양 배지 내 또는 위에서 배양하여 동일한 방법을 추가로 거친 폴리펩티드와 배양하지 않은 미생물의 시료와 비교해서 생존 및/또는 사멸된 미생물의 수를 계산한다.
바이러스 플라크 분석법은 본 발명의 폴리펩티드의 항바이러스 활성을 평가하는데 사용될 수 있다. 즉, 바이러스 접종물은 허용 세포 단층의 감염 전에 폴리펩티드에 노출된다. 표준 간격 후에 세포 추출물 내 바이러스 역가는 새로운 세포 단층을 감염시키고 그들의 세포 단층에 미치는 영향을 정량함으로써 이들 추출물의 다수 희석물을 사용하여 결정된다.
항기생충 활성을 평가를 위해, 본 발명의 폴리펩티드 및 기생충을 표준 시간 간격 동안 배양하였다. 그런 후 기생충의 대사 활성을 직접 분석, 예를 들어 MTT 분석하거나, 기생충을 포유 동물 세포에 이전하고 배양 한 후에 이들 세포에서 기생충 증식을 현미경으로 평가한다.
본원에서 사용된 용어, 폴리펩티드의 "항-염증 활성"은 미생물, 예를 들어 박테리아, 바이러스, 진균, 및/또는 기생충에 감염된 개체에서 염증 반응을 억제, 감소 또는 예방하는 것을 의미한다. 본 발명의 폴리펩티드의 항-염증 활성은 리포타이코산(LTA), 펩티도글리칸(PG) 및/또는 리포폴리사카라이드(LPS)와 같은 전-염증성 미생물 화합물의 방출을 억제, 감소 또는 예방함으로써 달성된다. 항-염증 활성은 당업계에 알려진 방법에 의해 측정될 수 있다. 이러한 방법 중 하나의 예는 리포폴리사카라이드 중화 분석법이다. 이 방법에서, 본 발명의 폴리펩티드를 리포폴리사카라이드 1mg과 혼합하여 60분간 배양한다. 그 후, 이 혼합물을 4배 희석된 신선한 인간 혈액에 첨가하여 18시간 후에 혈액 샘플 내의 사이토카인(1L-8, 1L-12p40)의 레벨을 ELISA로 측정한다.
본원에서 사용된 아미노산 서열 LAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR의 변이체는 16개 이상의 아미노산 길이를 가지며 바람직하게는 다음의 아미노산 치환을 5개까지 가지는 것이다.
- L, I, V 또는 A의 그룹으로부터 선택된 일 이상의 아미노산을 상기 그룹으로부터 선택된 다른 아미노산으로 치환;
- R, K 또는 H의 그룹으로부터 선택된 일 이상의 아미노산을 상기 그룹으로부터 선택된 다른 아미노산으로 치환;
- E를 Q로 치환
- Y 또는 W를 F로 치환
- Q, N, A, S 또는 T의 그룹으로부터 선택된 일 이상의 아미노산을 상기 그룹으로부터 선택된 다른 아미노산으로 치환
- 일 이상의 아미노산을 대응하는 D-아미노산으로 치환
- 일 이상의 아미노산을 대응하는 비-천연 아미노산으로 치환. 상기 변이체는 L-아미노산을 다른 L-아미노산으로 치환 및/또는 L-아미노산을 이의 대응하는 D-아미노산으로 치환하는 상기 치환을 1,2,3,4, 또는 5개 가질 수 있다. 대안적으로, 상기 변이체의 모든 16개 이상의 아미노산은 이의 대응하는 D-아미노산으로 치환된다.
바람직하게 상기 변이체는 다음의 아미노산 치환을 5개까지 갖는다:
- 아미노산 1번 위치에서 L을 I, V 또는 A로 치환
- 아미노산 2번 위치에서 A을 L, V, Q 또는 I로 치환
- 아미노산 3번 위치에서 R을 K 또는 H로 치환
- 아미노산 4번 위치에서 E를 Q로 치환
- 아미노산 5번 위치에서 Y를 F 또는 W로 치환
- 아미노산 6번 위치에서 K를 R 또는 H로 치환
- 아미노산 7번 위치에서 K를 R 또는 H로 치환
- 아미노산 8번 위치에서 I를 L, V 또는 A로 치환
- 아미노산 9번 위치에서 V를 L, I 또는 A로 치환
- 아미노산 10번 위치에서 E를 Q로 치환
- 아미노산 11번 위치에서 K를 R 또는 H로 치환
- 아미노산 12번 위치에서 L을 I, V 또는 A로 치환
- 아미노산 13번 위치에서 K를 R 또는 H로 치환
- 아미노산 14번 위치에서 R을 K 또는 H로 치환
- 아미노산 15번 위치에서 W를 F 또는 Y로 치환
- 아미노산 17번 위치에서 R을 H 또는 K로 치환
- 아미노산 18번 위치에서 Q를 N, A, S 또는 T로 치환
- 아미노산 19번 위치에서 V를 L, I 또는 A로 치환
- 아미노산 20번 위치에서 L을 I, V 또는 A로 치환
- 아미노산 21번 위치에서 R을 K 또는 H로 치환
- 아미노산 22번 위치에서 T를 Q, N 또는 A로 치환
- 아미노산 24번 위치에서 R을 H 또는 K로 치환
- 1 내지 5개의 아미노산을 대응하는 D-아미노산으로 치환. 여기서 아미노산의 넘버링은 하기와 같다:
L1A2R3E4Y5K6K7I8V9E10K11L12K13R14W15L16R17Q18V19L20R21T22L23R24.
바람직하게, 본원에서 정의된 변이체는 상기 치환의 1, 2, 3, 4, 또는 5개와 같이, 상기 아미노산 치환을 4개까지 갖는 것이며, 보다 바람직하게는 상기 아미노산 치환을 3개까지 갖는 것이다. 또한, 본원에서 정의된 변이체는 적어도 바람직하게는 상기 아미노산 치환을 5개까지 가지는, 보다 바람직하게는 4개까지 가지는, 가장 바람직하게는 3개까지 가지는 아미노산 서열 YKKIVEKLKRWLRQVL을 포함한다.
상기 변이체에서 L-아미노산이 다른 L-아미노산에 의해 치환되는 5개 까지의 아미노산 치환은 바람직하게는 다음과 같다.:
- 아미노산 1번 위치에서 L을 I, V 또는 A로 치환
- 아미노산 2번 위치에서 A를 L, V 또는 Q로 치환
- 아미노산 3번 위치에서 R을 K 또는 H로 치환
- 아미노산 4번 위치에서 E를 Q로 치환
- 아미노산 5번 위치에서 Y를 F로 치환
- 아미노산 6번 위치에서 K를 R 또는 H로 치환
- 아미노산 7번 위치에서 K를 R 또는 H로 치환
- 아미노산 11번 위치에서 K를 R 또는 H로 치환
- 아미노산 12번 위치에서 L을 I, V 또는 A로 치환
- 아미노산 13번 위치에서 K를 H로 치환
- 아미노산 14번 위치에서 R을 K 또는 H로 치환
- 아미노산 15번 위치에서 W를 F로 치환
- 아미노산 17번 위치에서 R을 H로 치환
- 아미노산 18번 위치에서 Q를 N, A, S 또는 T로 치환
- 아미노산 19번 위치에서 V를 L로 치환
- 아미노산 20번 위치에서 L을 I, V 또는 A로 치환
- 아미노산 21번 위치에서 R을 K 또는 H로 치환
- 아미노산 22번 위치에서 T를 Q, N 또는 A로 치환
- 아미노산 24번 위치에서 R을 H로 치환
다른 바람직한 실시예에서, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 하기 그룹으로부 터 선택된 아미노산 서열을 포함한다:
LAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR
IAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR
VAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR
AAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR
LLREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR
LVREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR
LQREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR
LAKEYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR
LAHEYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR
LARQYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR
LAREFKKIVEKLKRWLRQVLRTLR
LAREYRKIVEKLKRWLRQVLRTLR
LAREYHKIVEKLKRWLRQVLRTLR
LAREYKRIVEKLKRWLRQVLRTLR
LAREYKKIVEKLKKWLRQVLRTLR
LAREYKKIVEKLKRFLRQVLRTLR
LAREYKKIVEKLKRWLHQVLRTLR
LAREYKKIVEKLKRWLRNVLRTLR
LAREYKKIVEKLKRWLRAVLRTLR
LAREYKKIVEKLKRWLRSVLRTLR
LAREYKKIVEKLKRWLRTVLRTLR
LAREYKKIVEKLKRWLRQLLRTLR
LAREYKKIVEKLKRWLRQVIRTLR
LAREYKKIVEKLKRWLRQVVRTLR
LAREYKKIVEKLKRWLRQVARTLR
LAREYKKIVEKLKRWLRQVLKTLR
LAREYKKIVEKLKRWLRQVLHTLR
LAREYKKIVEKLKRWLRQVLRQLR
LAREYKKIVEKLKRWLRQVLRNLR
LAREYKKIVEKLKRWLRQVLRALR
LAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLH
REYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR
LAREYKKIVEKLKRWLRQVLRT
REYKKIVEKLKRWLRQVLRT
YKKIVEKLKRWLRQVLRTLR
LAREYKKIVEKLKRWLRQVL
EYKKIVEKLKRWLRQVLR
YKKIVEKLKRWLRQVL,
선택적으로 N-말단 및/또는 C-말단이 변형된 것으로서, 바람직하게는 N- 및/또는 C-말단의 연장 그룹을 포함하고, 상기 N-말단의 변형은 바람직하게는 아세틸-, 헥사노일-, 데카노일-, 미리스토일-, NH-(CH2-CH2-O)11-CO- 및 프로피오닐-잔기로 구성된 그룹으로부터 선택된 것이고, 상기 C-말단 변형은 바람직하게 아미드-, NH-(CH2-CH2-O)11-CO-아미드- 및 하나 또는 두개의 아미노-헥사노일 그룹으로 구성된 그룹으로부터 선택된 것이다. 일 실시예에서, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 상기 아미노산 서열 중 하나로 이루어져 있다.
대안적으로, 또는 상기 기재한 바와 같이 5개까지의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환한 것뿐만 아니라, 본원에서 정의된 아미노산 서열 LAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR의 변이체는 일 이상의 L-아미노산을 이의 대응하는 D-아미노산으로 치환한 것을 포함할 수 있다. 알라닌을 A로 한 것과 같이 본원에서 대문자 단일-글자 기호로 나타낸 아미노산은 천연 발생 단백질에서 일반적으로 발견되는 L-아미노산이다. 실시예(표 2)에서 입증된 바와 같이, L-아미노산이 이의 대응하는 D-아미노산으로 치환된 폴리펩티드는 그들의 항균 활성을 유지한다. 따라서, 본원에서 정의된 바와 같은 아미노산 서열 LAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR의 변이체는 D-아미노산에 의해 아미노산의 하나 이상의 치환을 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 "대응하는 D-아미노산"은 L-아미노산의 D-아미노산 대응 부분이다. 예를 들어서, 알라닌(A)의 대응하는 D-아미노산은 D-알라닌(a), 아르기닌(R)의 대응하는 D-아미노산은 D-아르기닌(r), 아스파라긴(N)의 대응하는 D-아미노산은 D-아스파라긴(n) 등이다. 본원에 정의된 변이체의 모든 L-아미노산은 그들의 대응하는 D-아미노산으로 치환될 수 있다. 본원에서 정의된 아미노산 서열 LAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR의 변이체는 대응하는 D-아미노산에 의해 L-아미노산의 24개까지의 치환을 포함할 수 있다. 따라서, 이러한 아미노산 변이체를 포함하는 폴리펩티드에서 항균 활성이 유지되기 때문에 변이체는 전체적으로 D-아미노산으로 구성할 수 있다. 예를 들어, 변이체는 L-아미노산이 이들의 대응하는 D-아미노산으로의 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 5, 4, 3, 2 또는 1개의 치환을 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 본원에서 정의된 바와 같은 아미노산 서열 LAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR의 변이체는 아미노산 서열이 이의 대응하는 D-아미노산으로의 하나의 치환을 포함한다. 아미노산 서열에서 D-아미노산의 위치는 관련이 없다. 표 2에서 증명된 바와 같이, 하나의 아미노산이 D-아미노산으로 치환된 서열 LAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR을 갖는 모든 폴리펩티드에서 항균 활성은 유지된다. 다른 실시예에서, 변이체는 D-아미노산에 의해 모든 L-아미노산이 치환된 것을 포함한다. 역시 실시예(표 2)에서 증명된 바와 같이, 오직 D-아미노산을 포함하는 변이체인 서열 lareykkiveklkrwlrqvlrtlr (펩티드 # 1313-07)을 포함하는 폴리펩티드도 항균 활성을 갖는다. 본원에서 정의된 변이체는 추가로 아미노산 서열 LAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR의 16개 이상의 연속적인 아미노산의 레트로-인버소 펩티드를 포함할 수 있다. 바람직하게 상기 변이체는 상기 아미노산 서열의 전체 길이의 레트로-인버소 펩티드다. 레트로-인버소 펩티드는 기준 아미노산 서열의 반대되는 서열에서 D-아미노산으로 이루어진 펩티드다. 따라서 본 발명의 바람직한 변이체는 D-아미노산 서열 rltrlvqrlwrklkevikkyeral에서 16개 이상의 아미노산을 가질 수 있다. 표 2에서 증명된 바와 같이, 아미노산 서열 LAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR의 레트로-인버소를 포함하는 변이체인, 서열 lareykkiveklkrwlrqvlrtlr (펩티드 # 1241-03)을 포함하는 폴리펩티드는 항균 활성을 갖는다.
본원에서 정의된 바와 같은 아미노산 서열 LAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR의 변이체는 비-천연 아미노산에 의한 아미노산의 5개까지의 치환을 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 "비-천연 아미노산"은, 그들이 자연에서 나타나는지 여부와 상관 없이, 비-유전적으로 인코드된 아미노산을 의미한다. 본원에서 사용된 아미노산 서열의 변이체에서 나타날 수 있는 비-천연 아미노산은 β-아미노산; p-아실-L-페닐알라닌; N-아세틸 라이신; O-4-알릴-L-티로신; 2-아미노아디프산; 3-아미노아디프산;베타-알라닌; 4-터트-부틸 하이드로겐 2-아지도숙시네이트; 베타-아미노프로피온산; 2-아미노뷰티르산; 4-아미노뷰티르산; 2,4-디아미노뷰티르산; 6-아미노카프론산; 2-아미노헵탄산; 2-아미노이소부티르산; 3-아미노이소부티르산; 2-아미노피멜린산; p-아미노페닐알라닌; 2,3-디아미노뷰티르산; 2,3-디아미노프로피온산; 2,2'-디아미노피멜린산; p-아미노-L-페닐알라닌; p-아지도-L-페닐알라닌; D-알릴글리신; p-벤조일-L-페닐알라닌; 3-벤조티에닐 알라닌 p-브로모페닐알라닌; t-부틸알라닌; t-부틸글리신; 4-클로로페닐알라닌; 사이클로헥실알라닌; 시스테산; D-시트룰린; 티오-L-시트룰린; 데스모신; 엡실론-아미노 헥사노익산; N-에틸글리신; N-에틸아스파라긴; 2-플루오로페닐알라닌; 3-플루오로페닐알라닌; 4-플루오로페닐알라닌; 호모아르기닌; 호모시스테인; 호모세린; 하이드록시라이신; 알로-하이드록시라이신; 3-(3-메틸-4-니트로벤질)-L-히스티딘 메틸 에스테르; 이소데모신; 알로-이소류신; 이소프로필-L-페닐알라닌; 3-메틸-페닐알라닌; N-메틸글리신; N-메틸이소류신; 6-N-메틸라이신; O-메틸-L-타이로신; N-메틸발린; 메티오닌 술폭시드; 2-나프틸알라닌; L-3-(2-나프틸)알라닌; 이소세린; 3-페닐세린; 노르발린; 노르류신; 5,5,5-트리플루오로-DL-류신; 오르니틴; 3-클로로-티로신; N5-카르바모일오르니틴; 페니실아민; 페닐글리신; 피페리딘산; 피리딜알라닌; 1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-3-카르복실산; 베타-2-티에닐알라닌; γ-카르복시-DL-글루탐산; 4-플루오로-DL-글루탐산; D-티록신; 알로-트레오닌; 5-하이드록시-트립토판; 5-메톡시-트립토판; 5-플루오로-트립토판; 3-플루오로-발린을 포함한다.
일 실시예에서, 상기 서열의 천연 아미노산은 대응하는 비-천연 아미노산에 의해 치환된다. 본원에서 사용된, "대응하는 비-천연 아미노산"은 참조 천연 아미노산의 유도체인 비-천연 아미노산을 지칭한다. 예를 들어, 천연 아미노산은 대응하는 β-아미노산에 의해 치환된다. β-아미노산은 천연 아미노산에서와 같이 탄소보다는 β 탄소에 결합된 그들의 아미노 그룹을 가지고 있다. 예를 들어, α-알라닌은 β-알라닌으로 치환된다. 천연 아미노산이 상기 천연 아미노산의 유도체인 비-천연 아미노산으로 치환된 다른 예는 다음과 같다. 알라닌은 예를 들어 베타-알라닌, t-부틸알라닌, 2-나프틸알라닌; L-3-(2-나프틸)알라닌, 2-아미노이소부티르산으로 치환된다. 아르기닌은 예를 들어 호모아르기닌, 오르니틴, N5-카르바모일오르니틴, 3-아미노-프로피온산으로 치환된다. 아스파라긴은 예를 들어 N-에틸아스파라긴으로 치환된다. 아스파르트산은 예를 들어 4-터트-부틸-하이드로겐 2-아지도숙시네이트로 치환된다. 시스테인은 예를 들어 시스테산, 호모시스테인으로 치환된다. 글루탐산은 예를 들어 γ-카복시-DL-글루탐산; 4-플루오로-DL-글루탐산으로 치환된다. 글루타민은 예를 들어 D-시트룰린, 티오-L-시트룰린으로 치환된다. 글리신은 예를 들어 N-메틸글리신, t-부틸글리신, N-메틸글리신, D-알릴글리신으로 치환된다. 히스티딘은 예를 들어 3-(3-메틸-4-니트로벤질)-L-히스티딘 메틸 에스테르로 치환된다. 이소류신은 예를 들어 이소데스모신, N-메틸이소류신, 알로-이소류신으로 치환된다. 류신은 예를 들어 노르로이신, 데스모신, 5,5,5-트리플루오로-류신으로 치환된다. 라이신은 예를 들어 6-N-메틸리신, 2-아미노헵탄산, N-아세틸라이신, 하이드록시라이신, 알로-하이드록시라이신으로 치환된다. 메티오틴은 예를 들어 메티오닌 설폭사이드로 치환된다. 페닐알라닌은 예를 들어 p-아미노-L-페닐알라닌, 3-벤조티에닐 알라닌 p-브로모페닐알라닌, p-아실-L-페닐알라닌, 2-플루오로페닐알라닌, 3-플루오로페닐알라닌, 4-플루오로페닐알라닌으로 치환된다. 프롤린은 예를 들어 3-하이드록시프롤린, 4-하이드록시프롤린, 1-아세틸-4-하이드록시-L-프롤린으로 치환된다. 세린은 예를 들어 호모세린, 이소세린, 3-페닐세린으로 치환된다. 트레오닌은 예를 들어 D-티록신, 알로-트레오닌으로 치환된다. 트립토판은 예를 들어 5-하이드록시-트립토판, 5-메톡시-트립토판, 5-플루오로-트립토판으로 치환된다. 티로신은 예를 들어 O-메틸-L-티로신, O-4-알릴-L-티로신, 3-클로로-티로신으로 치환된다. 발린은 예를 들어 노르발린, N-메틸발린, 3-플루오로-발린으로 치환된다.
특히 바람직한 본 발명에 따른 폴리펩티드는 아미노산 서열 LAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR 또는 표 2, 3, 5 또는 6으로부터 선택된 PBS에서 최대 3.2 μM의 치사 농도(LC) 99.9를 갖는 이들의 변이체를 포함한다. 일 실시예에서, 표 2, 3, 5 또는 6로부터 선택된 PBS에서 최대 2.4μM의 LC 99.9를 갖는 폴리펩티드가 제공된다.
본 발명에 따른 폴리펩티드는 아미노산 서열 LAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR 또는 본원에서 정의된 바와 같이 이 서열의 변이체로 구성될 수 있다. 본원에서 사용된 "폴리펩티드"는 여러 개의 아미노산을 포함하는 펩티드, 폴리펩티드 및 펩티도미메틱을 의미한다. 용어 "폴리펩티드" 및 "펩티드"는 같은 의미로 사용된다. 항균 활성을 갖는 것으로 증명된 본 발명에 따른 가장 작은 폴리펩티드는 16개의 아미노산 길이를 갖는다. 그러나, 아미노산 서열 또는 이의 변이체는 커다란 폴리펩티드, 즉, 일 이상의 추가적 아미노산에 의해 N-말단 및/또는 C-말단이 연장된 폴리펩티드의 일부가 될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드의 아미노산 서열 또는 변이체는 바람직하게는 N- 및/또는 C-말단의 연장 그룹을 포함함으로써 N-말단 또는 C-말단이 변형될 수 있다. 선택적으로, 상기 아미노산 서열 또는 이의 변이체는 N- 및/또는 C-말단이 연장된다. 따라서 본 발명에 따른 폴리펩티드는 16개 이상의 아미노산을 포함하며 1000개의 아미노산까지 포함할 수 있다. 그러나, 가능한 낮은 제조 비용을 유지하기 위하여 더 작은 폴리펩티드가 바람직하다. 바람직하게, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 길이가 16-200개의 아미노산이며, 보다 바람직하게는 16-100개의 아미노산, 보다 바람직하게는 16-50개의 아미노산이다. 일 실시예에서, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 16에서 24개의 아미노산, 즉, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24 개의 아미노산을 포함한다. 상기 폴리펩티드는 바람직하게는 16-24개의 아미노산을 갖는다. 이러한 16-24개의 아미노산을 갖는 폴리펩티드는 또한 N-말단 및/또는 C-말단의 변형, 예를 들어 아세틸-, 헥사노일-, 데카노일-, 미리스토일-, NH-(CH2-CH2-O)11-CO- 및 프로피오닐-잔기로 구성된 그룹으로 선택된 N-말단의 변형 및/또는 아미드-, NH-(CH2-CH2-O)11-CO-아미드-, 및 하나 또는 두개의 아미노-헥사노일 그룹으로 구성된 그룹으로부터 선택된 C-말단의 변형을 가질 수 있다. 상이한 길이를 갖는 폴리펩티드 및 그들의 항균 활성의 예시는 실시예에서 제공된다. 일 실시예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 아미노산 서열 LAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR 또는 선택적으로 N-말단 및/또는 C-말단 변형을 갖고, 바람직하게는 N- 및/또는 C-말단의 연장 그룹을 포함하는, 본원에서 정의된 이의 변이체로 구성된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "펩티도미메틱"은 화합물이 본 발명의 폴리펩티드의 항균, 항박테리아, 항바이러스, 항진균, 항기생충 및/또는 항-염증 특성을 모방하는 비-펩티드 구조적 요소를 함유하는 화합물을 의미한다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드는 비-펩티드 구조적 요소를 포함할 수 있다. 이러한 비-펩티드 구조적 요소는 아미노산 서열 LAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR, 또는 본원에서 정의된 바와 같은 이의 변이체 내에서, 상기 서열 또는 변이체의 일 이상의 아미노산 변형의 치환의 결과로서 나타날 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 폴리펩티드는 아미노산 서열 LAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR 외부에서, 또는 본원에서 정의된 바와 같은 이의 변이체 내, 즉, 선택적으로 N- 및/또는 C-말단의 연장 그룹 내에서 비-펩티드 구조적 요소를 포함할 수 있다. 펩티도미메틱에서 비-펩티드 구조적 요소는 일반적으로 일 이상의 기존 아미노산의 변형이다. 바람직한 펩티도미메틱은 본 발명의 폴리펩티드의 구조적 변형, 예를 들어 상기 정의된 바와 같은 비천연 아미노산을 사용, 구조적 지지대, 폴리펩티드의 고리화, 등전자 교체 또는 다른 변형에 의해 얻어진다. 본 발명에 따른 폴리펩티드의 아미노산 서열은 따라서 선택적으로 일 이상의 변형을 포함한다. 이러한 폴리펩티드는 번역 후 과정과 같은 천연 공정, 또는 화학적 변형 기술에 의해 변형될 수 있다. 변형은 상기 폴리펩티드에서 폴리펩티드 주쇄, 아미노산 측쇄 및 N- 또는 C-말단을 포함하는, 임의의 위치에 삽입될 수 있다. 단일 폴리펩티드는 변형의 여러 유형 또는 단일 유형의 몇 가지 변형을 포함할 수 있다. 변형은 아세틸화, 아미드화, 아실화, 인산화, 메틸화, 탈메틸화, ADP-리보실화, 이황화 결합 형성, 유비퀴틴화, 감마-카르복실화, 당화, 수산화, 요오드화, 산화, 페길화 및 황산화를 포함한다. 또한 본 발명에 따른 폴리펩티드는 비오틴, 플루오레세인 또는 플라빈, 지질 또는 지질 유도체, 당 그룹과 같은 라벨이 제공될 수 있다. 본 발명에 따른 폴리펩티드는 표적화 잔기를 제공할 수 있다.
바람직한 실시예에서, 본 발명에 따른 폴리펩티드로서 상기 아미노산 서열 LAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR 또는 상기 본원에서 정의된 이의 변이체는 N-말단 및/또는 C-말단이 변형된다. 본 발명의 폴리펩티드는 따라서 바람직하게 N- 및/또는 C-말단의 연장 그룹을 포함한다. 본 발명의 폴리펩티드에서 사용될 수 있는 N- 및 C-말단의 연장 그룹은 당업계에 공지되어 있다. N-말단 변형의 바람직한 예는 아세틸-, 헥사노일-, 데카노일-, 미리스토일-, NH-(CH2-CH2-O)11-CO- 및 프로피오닐-잔기를 포함한다. C-말단 변형의 바람직한 예는 아미드-, NH-(CH2-CH2-O)11-CO-아미드-, 및 하나 또는 두 개의 아미노-헥사노일 그룹이다. 그러나, 다른 N- 또는 C-말단 연장 그룹은 또한 당업자에게 공지되어 있는 활성 화합물을 수득할 것이다. 일 실시예에서 상기 아미노산 서열 LAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR 또는 상기 본원에서 정의된 이의 변이체는 N-말단의 아세틸-, 헥사노일-, 데카노일-, 미리스토일-, NH-(CH2-CH2-O)11-CO- 또는 프로피오닐-잔기를 포함하고 C-말단의 아미드-, NH-(CH2-CH2-O)11-CO-아미드-, 및 하나 또는 두개의 아미노-헥사노일 그룹을 포함한다. 실시예(표 3)에서 증명된 바와 같이, 이러한 N-말단 도는 C-말단 변형을 가지는 폴리펩티드는 높은 항균 활성을 유지한다. 일 실시예에서, N-말단이 아세틸화되고 C-말단이 아미드화된 본 발명에 따른 폴리펩티드가 제공된다.
따라서 본 발명은 아미노산 서열 LAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR을 포함하는 분리된 또는 재조합 폴리펩티드, 또는 상기 아미노산 서열의 변이체, 항균, 항박테리아, 항바이러스, 항진균, 항기생충성 및/또는 항-염증 활성을 갖는 상기 폴리펩티드, 16개 이상의 아미노산을 가지며 다음의 아미노산 치환을 5개까지, 바람직하게는 3개까지, 보다 바람직하게는 1개까지 갖는 상기 변이체를 제공한다:
- 아미노산 1번 위치에서 L을 I, V 또는 A로 치환
- 아미노산 2번 위치에서 A을 L, V, Q 또는 I로 치환
- 아미노산 3번 위치에서 R을 K 또는 H로 치환
- 아미노산 4번 위치에서 E를 Q로 치환
- 아미노산 5번 위치에서 Y를 F 또는 W로 치환
- 아미노산 6번 위치에서 K를 R 또는 H로 치환
- 아미노산 7번 위치에서 K를 R 또는 H로 치환
- 아미노산 8번 위치에서 I를 L, V 또는 A로 치환
- 아미노산 9번 위치에서 V를 L, I 또는 A로 치환
- 아미노산 10번 위치에서 E를 Q로 치환
- 아미노산 11번 위치에서 K를 R 또는 H로 치환
- 아미노산 12번 위치에서 L을 I, V 또는 A로 치환
- 아미노산 13번 위치에서 K를 R 또는 H로 치환
- 아미노산 14번 위치에서 R을 K 또는 H로 치환
- 아미노산 15번 위치에서 W를 F 또는 Y로 치환
- 아미노산 17번 위치에서 R을 H 또는 K로 치환
- 아미노산 18번 위치에서 Q를 N, A, S 또는 T로 치환
- 아미노산 19번 위치에서 V를 L, I 또는 A로 치환
- 아미노산 20번 위치에서 L을 I, V 또는 A로 치환
- 아미노산 21번 위치에서 R을 K 또는 H로 치환
- 아미노산 22번 위치에서 T를 Q, N 또는 A로 치환
- 아미노산 24번 위치에서 R을 H 또는 K로 치환
- 1 내지 4개의 아미노산을 대응하는 D-아미노산으로 치환
상기 아미노산 서열 또는 상기 이의 변이체는 바람직하게는 N-말단의 아세틸-, 헥사노일-, 데카노일-, 미리스토일-, NH-(CH2-CH2-O)11-CO- 또는 프로피오닐-잔기를 포함하고 C-말단의 아미드-, NH-(CH2-CH2-O)11-CO-아미드-, 및 하나 또는 두 개의 아미노-헥사노일 그룹을 포함하는 N- 및/또는 C-말단의 연장 그룹을 포함한다. 다른 N- 또는 C-말단의 연장 그룹 역시 활성 화합물을 수득할 것이라는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 여기서, 아미노산의 넘버링은 하기와 같다:
L1A2R3E4Y5K6K7I8V9E10K11L12K13R14W15L16R17Q18V19L20R21T22L23R24. 상기 폴리펩티드는 바람직하게 16-24개의 아미노산을 갖는다.
바람직한 실시예로, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 소수성 부분을 포함한다. 양이온 (폴리)펩티드에 소수성 그룹을 첨가하는 것은 미생물 내독성을 중화시키고 미생물 세포막과 상호작용하는 능력을 개선시켜 미생물, 예를 들어 병원균을 제거할 수 있는 그들의 능력을 향상시킨다.
본원에서 전술한 바와 같이, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 당업계에 공지된 화학적 변형 기술에 의해 변형될 수 있다. 본 발명에 따른 폴리펩티드의 변형은 폴리펩티드의 합성 동안 또는 마지막에 도입될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드를 고체-상 합성 기술을 이용하여 합성할 때, N-말단의 아세틸화는 수지에 여전히 결합된 아미노산 서열을 아세트산과 반응시킴으로써 말단에서 수행될 수 있다. 다른 예로서, C-말단 아미드화는, 예를 들어 시판되는 텐타겔(Tentagel) S AM (ex Rapp, Tubingen, 독일)과 같이, 고체-상 펩티드 합성에서 특별한 종류의 수지를 사용하여 수행된다. 이러한 수지들은 화학적 절단 동안 아미드화된 (폴리)펩티드가 방출되는 화학적 핸들을 포함한다. 폴리펩티드를 변형하는 이러한 방법 및 다른 방법들은 당업자에게 공지되어 있다.
일 실시예에서, 본 발명은 아미노산 서열 LAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR을 포함하는 분리된 또는 재조합 폴리펩티드, 또는 상기 아미노산 서열의 변이체로서,
상기 폴리펩티드는 항균, 항박테리아, 항바이러스, 항진균, 항기생충성 및/또는 항-염증 활성을 갖고,
상기 변이체는 16개 이상의 아미노산을 가지며:
- 다음의 아미노산 치환을 5개까지 가짐:
· L, I, V 또는 A의 그룹으로부터 선택된 일 이상의 아미노산을 상기 그룹으로부터 선택된 다른 아미노산으로 치환;
· R, K 또는 H의 그룹으로부터 선택된 일 이상의 아미노산을 상기 그룹으로부터 선택된 다른 아미노산으로 치환;
· E를 Q로 치환
· Y 또는 W를 F로 치환
· Q, N, A, S 또는 T의 그룹으로부터 선택된 일 이상의 아미노산을 상기 그룹으로부터 선택된 다른 아미노산으로 치환, 및/EH는
- 아미노산을 대응하는 D-아미노산으로 일 이상의 치환을 가짐.
또한 본 발명은 아미노산 서열 LAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR을 포함하는 최대 6개의 폴리펩티드를 포함하는 다량체 또는 본원에서 정의된 변이체를 제공한다. 상기 다량체는 동일한 아미노산 서열을 갖는 6개까지의 폴리펩티드 단량체 또는 2개 이상의 폴리펩티드 단량체가 다른 아미노산 서열을 갖는 것에 의해 최대 6개까지의 폴리펩티드 단량체를 포함할 수 있다. 바람직한 실시예에서, 본 발명에 따른 다량체는 동일한 아미노산 서열을 갖는 본 발명에 따른 최대 6개의 폴리펩티드를 포함한다.
본 발명에 따른 폴리펩티드의 염 또한 제공된다. 이러한 염은, 이에 한정되지는 않지만, 산 부가 염 및 염기 부가 염을 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 폴리펩티드의 "약학적으로 허용가능한 염"은 원하는 폴리펩티드의 항균, 항박테리아, 항진균, 항바이러스, 항기생충 및/또는 항-염증 활성을 유지하며, 인간 또는 동물에 투여가 적합한 염을 의미한다. 폴리펩티드의 염을 제조하는 방법은 당업계에 알려져 있으며 일반적으로 폴리펩티드를 약학적으로 허용가능한 산 또는 염과 혼합, 예를 들어 용매 또는 염이 용해되지 않는 배지, 또는 진공에서 또는 동결건조에 의해 제거되는 물과 같은 용매에서 생산물의 유리산 또는 유리 염기 형태를 일 이상의 적합한 산 또는 염기의 등가물과 반응시키거나, 적절한 이온 교환 수지 상에서 기존 염의 양이온을 다른 양이온으로 교환하는 단계를 포함한다. 약학적으로 허용 가능한 산 및 염기의 예들로는 폴리펩티드의 유리 아미노 그룹과 암모늄염을 형성하는, 포름산, 아세트산, 프로피온산, 락트산, 글리콜 산, 옥살산, 피루브산, 호박산, 말레산, 말론산, 트리플루오로 아세트산, 신남산, 황산, 염산, 브롬화 수소산, 질산, 과염소산, 인산, 및 티오시안산과 같은 유기 및 무기산, 및 폴리펩티드의 유리 카르복실 그룹과 카르복시산염을 형성하는, 에틸아민, 메틸아민, 디메틸아민, 트리에틸아민, 이소프로필아민, 이소프로필아민, 및 기타 모노-, 디- 및 트리알킬아민, 및 아릴아민과 같은 염기를 포함한다.
본 발명에 따른 폴리펩티드는 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 일반적으로 사용되는 폴리펩티드의 고체-상 합성 방법, 예를 들어 당업계에 공지되어 있는 알파-아미노 그룹의 t-BOC 또는 FMOC 보호와 관련된 방법에 의해 합성될 수 있다. 여기서, 아미노산은 순차적으로 아미노산의 성장 사슬에 첨가된다. 이러한 방법은 예를 들어 Merrifield (1963), J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2156 ; 및 Atherton et al., "고체 상 펩티드 합성," IRL Press, London, (1989)에 설명되어 있다. 고체-상 합성 방법은 특히 대량생산으로 폴리펩티드 또는 70개 아미노산까지의 길이를 가진 폴리펩티드와 같은 상대적으로 짧은 길이의 합성하는데 적합하다.
대안적으로, 본 발명의 폴리펩티드는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 숙주세포에서 발현되는 당업계에 잘 알려진 재조합 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 따라서 본 발명은
- 본 발명에 따른 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공하는 단계;
- 상기 핵산 분자로 숙주 세포를 형질전환시키는 단계;
- 상기 폴리펩티드의 발현을 허용하는 조건하에 상기 숙주세포를 배양하는 단계;
- 상기 세포로부터 상기 폴리펩티드를 수득하는 단계;
- 예를 들어 N- 및/또는 C-말단의 연장 그룹을 추가함으로써 상기 폴리펩티드를 선택적으로 N-말단 또는 C-말단 변형시키는 단계를 포함하여, 본 발명에 따른 폴리펩티드의 제조 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공하며, 여기서는 본 발명에 따른 핵산 분자로서도 지칭된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 본 발명의 핵산 분자 또는 핵산 서열은 뉴클레오티드 사슬, 바람직하게는 DNA 및/또는 RNA을 포함한다.
또한, 본 발명에 따른 핵산 서열 분자를 포함하는 벡터를 제공한다. 본원에서 사용된 용어 "벡터"는 숙주세포에 이종성 핵산 서열을 도입할 수 있는 플라스미드, 박테리오파지 또는 동물 바이러스와 같은 핵산 분자를 의미한다. 본 발명에 따른 벡터는 숙주세포에서 이종 핵산 서열에 의해 인코딩되는 본 발명의 폴리펩티드의 발현 또는 생산을 허용한다. 본 발명에 따라 사용된 벡터는 예를 들어 동물 바이러스로부터 유래된 것이며, 이의 예는 뉴캐슬병 바이러스 백시니아 바이러스 (변형된 백시니아 바이러스 앙카라, MVA와 같은 약독화 유도체 포함), 뉴캐슬병 바이러스(NDV), 아데노 바이러스 또는 레트로 바이러스를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에 따른 벡터는 바람직하게는 선택된 숙주세포에서 본 발명에 따른 폴리펩티드의 전사 개시에 적합한 프로모터를 포함하는 발현 카세트를 포함한다. 진핵 숙주 세포에서 본 발명에 따른 폴리펩티드의 발현을 위한 적합한 프로모터의 예는 베타-액틴 프로모터, 면역글로빈 프로모터, 5S RNA 프로모터, 또는 포유류 숙주에 대한 사이토메갈로바이러스(CMV), 라우스 육종 바이러스(Rous sarcoma virus)(RSV) 및 시미안 바이러스 40(SV40) 프로모터와 같은 바이러스 유래의 프로모터를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
또한 본 발명에 의해 본 발명에 따른 핵산 분자 및/또는 벡터를 포함하는 재조합 숙주세포가 제공된다. 숙주세포는 본 발명에 따른 벡터와 같은 핵산 분자에 의해 형질전환된 또는 형질전환할 수 있는 세포이다. "형질전환"은 외부 핵산을 수여 세포에 도입하는 것을 지칭한다. 숙주세포의 형질전환은 상기 세포에 의한 재조합 단백질의 일시적인 발현을 초래할 수 있으며, 이는 재조합 단백질이 오직 정의된 시간 동안만 발현되는 것을 의미한다. 대안적으로, 수여세포의 형질전환은 안정적인 발현을 초래하는데, 핵산이 세포의 게놈 내로 도입되어 세포의 다음 세대로 전달되는 것을 의미한다. 추가적으로, 재조합 단백질의 유도성 발현이 달성될 수 있다. 유도성 발현 시스템은 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열의 발현을 허용하는 분자의 존재 또는 부존재를 필요로 한다. 유도성 발현 시스템의 예들로, 이에 한정되지는 않지만, 테트-온 및 테트-오프 발현 시스템(Tet-On and Tet-Off expression systems), 예를 들어 에크디손 유도성 유전자 발현 시스템과 같은 호르몬 유도성 유전자 발현 시스템, 아라비노즈-유도성 유전자 발현 시스템, 및 유도성 메탈로티오네인 프로모터를 포함하는 pMT/BiP 벡터(인비트로젠)을 사용한 초파리 유도성 발현 시스템을 포함한다. 본 발명에 따른 폴리펩티드의 제조 방법에서 사용된 숙주세포는 예를 들어 그람-양성 원핵생물, 그람-음성 원핵생물 또는 진핵생물이다. 바람직하게 상기 숙주세포는 식물 세포, 효모 세포, 포유 동물 세포 또는 곤충세포와 같은 진핵세포이며, 가장 바람직하게는 곤충 세포 또는 포유동물 세포이다. 적절한 숙주세포의 예는 옥수수 세포, 벼 세포, 좀개구리밥 세포, 담배 세포(예를 들어 BY-2 또는 NT-1 세포), 및 감자 세포와 같은 식물 세포를 포함한다. 효모 세포의 예는 사카로미세스속(Saccharomyces) 및 피치아(Pichia)이다. 곤충 세포의 예는 Tn5, SF-9 및 SF-2 세포와 같은 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포, 및 초파리 슈나이더 2(S2) 세포와 같은 초파리 세포이다. 본 발명에 따른 폴리펩티드를 발현하는데 적합한 포유동물 세포의 예는, 이에 제한되지 않으나, 아프리카 녹색 원숭이 신장 (Vero) 세포, 아기 햄스터 신장(예를 들어, BHK -21) 세포, 인간의 망막 세포(예를 들어, PerC6 세포), 인간 배아 신장 세포(예를 들어, HEK293 세포), Madin Darby 개 신장(MDCK) 세포, 닭 배아 섬유아세포(CEF), 닭 배아 신장 세포(CEK 세포), 배반 유래 배아 줄기 세포(예. EB14), 마우스 배아 섬유아세포(예를 들면, 3T3 세포), 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 및 이들 세포 유형의 변이체를 포함한다.
본 발명에 따른 방법은 바람직하게는 추가로 본 발명에 따른 폴리펩티드들을 수득, 정제 및/또는 분리하는 단계를 포함한다. 본 발명에 따라 얻어진 폴리펩티드들은 임의적으로 추가로 정제, 분리 또는 처리 단계, 예를 들어 겔 전기영동 또는 크로마토그래피 방법을 사용하여 정제한 후에 바람직하게 인간의 치료에 사용된다.
본 발명에 따른 폴리펩티드는 치료학적 및 비치료학적 적용 모두에 유용적으로 사용할 수 있는 수많은 활성이 존재한다. 특히, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 박테리아 감염, 진균 감염, 바이러스 감염과 같은 다양한 미생물 감염에 대응하고, 기생충 감염에 대응하는데 유용하다. 따라서 본 발명에 따른 폴리펩티드 또는 약학적으로 허용가능한 이들의 염, 및 일 이상의 약학적 허용가능한 담체, 희석제 및/또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 또한 본 발명에 따른 핵산 분자 또는 벡터 및 일 이상의 약학적 허용가능한 담체, 희석제 및/또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 약제로 사용하기 위한 본 발명에 따른 폴리펩티드를 제공한다. 또한 약제로 사용하기 위한 본 발명에 따른 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다. 상기 약제는 치료적 또는 예방적 제제일 수 있다.
일 실시예에서, 본 발명은 치료학적 유효한 양의 본 발명에 따른 폴리펩티드, 본 발명에 따른 약학적 조성물 또는 본 발명에 따른 핵산 분자를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 박테리아, 진균, 바이러스 및/또는 기생충 감염으로 고통받는 개체의 치료 방법을 제공한다. 또한 미생물에 감염된 개체의 치료 또는 미생물 감염의 예방을 위한 약제의 제조방법을 제공한다. 바람직한 실시예에서, 상기 미생물은 박테리아, 진균, 바이러스 또는 기생충이다. 또한 미생물, 박테리아, 진균, 바이러스 및/또는 기생충 감염 또는 미생물, 박테리아, 진균, 바이러스 및/또는 기생충 감염으로 인한 상태를 치료하는데 있어서 본 발명에 따라 사용하기 위한 폴리펩티드 및/또는 핵산분자를 제공한다.
본원에서 사용되는, "개체"는 인간 또는 동물이다. 개체는, 이에 한정되지는 않으나, 인간, 돼지, 흰족제비, 물개, 토끼, 고양이, 개, 소, 및 말과 같은 포유동물, 및 닭, 오리, 거위 및 칠면조와 같은 조류를 포함한다. 본 발명의 바람직한 실시예에서 개체는 포유동물이다. 특별히 바람직한 실시예에서 개체는 인간이다.
본 발명은 또한 상기 미생물 또는 기생충을 본 발명에 따른 폴리펩티드 또는 약학적 조성물과 접촉하는 단계를 포함하는, 미생물, 예를 들어 박테리아, 바이러스, 진균, 또는 기생충의 성장 억제하는 방법을 제공한다. 상기 접촉은 생체 내 및 시험관 내에서 수행될 수 있다.
본 발명에 따른 폴리펩티드 및 약학적 조성물은 다양한 바이러스, 박테리아 및 진균 감염과 같은 다양한 미생물 감염의 치료에 효과적이다. 예를 들어, 폴리펩티드 및 약학적 조성물은 그람-음성 및 그람-양성 박테리아를 치료하는데 효과적이다. 폴리펩티드 및 본 발명의 조성물이 처리될 수 있는 사람 또는 동물에서 감염을 일으킬 수 있는 병원성 박테리아의 예들은, 이에 한정되지는 않으나, 리스테리아, 대장균, 클라미디아, 리케차 균, 결핵균, 포도상 구균, 연쇄상구균, 폐렴구균, 수막 구균, 간균, 녹농균, 레지오넬라, 디프테리아, 살모넬라균, 간균, 비브리오 콜레라, 파상풍, 클로스트리디움, 바실러스, 예르시니아, 및 렙토스피라 박테리아를 포함한다.
본 발명의 폴리펩티드 및 조성물이 처리될 수 있는 사람 또는 동물에서 감염을 일으킬 수 있는 병원성 바이러스의 예들은 A, B 또는 C형 간염, 헤르페스 바이러스 (예를 VZV, HSV-I, HAV-6, HSV-II, CMV, 엡스타인바-바이러스), 아데노 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 플라비 바이러스, 에코 바이러스, 리노바이러스, 콕사키 바이러스, 코로나 바이러스, 호흡기 세포 융합 바이러스(RSV), 로타 바이러스, 모빌리바이러스, 풍진 바이러스, 파보 바이러스, 백시니아 바이러스, HTLV 바이러스, 뎅기열 바이러스, 파필로마 바이러스, 폴리오 바이러스, 광견병 바이러스 및 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV 바이러스; 예를 들어, 유형 I 및 II)를 포함한다.
본 발명의 폴리펩티드 및 조성물이 처리될 수 있는 사람 또는 동물에서 감염을 일으킬 수 있는 병원성 진균의 예들은, 이에 한정되지는 않으나, 칸디다(예, 알비칸스, 크루세이, 글라브라타, 트로피칼리스), 아스퍼질러스(예, 누룩곰팡이속, 니제르), 크립토콕쿠스 네오포르만스, 히스토플라스마 캡슐라툼, 속 털곰팡이목, 블라스토미세스 더마티티디스, 파라콕시디오이디즈 브라질리엔시스 및 콕시디오이데스 이미티스를 포함한다.
본 발명의 폴리펩티드 및 조성물이 처리될 수 있는 사람 또는 동물에서 감염을 일으킬 수 있는 병원성 기생충의 예들은, 이에 한정되지는 않으나, 적리 아메바, 플라스모듐(예를 들어, 원충(falciparum), 삼일열(vivax)), 아메바, 지아르디아, 대장섬모충, 아칸트아메바, 와포자충 종, 주폐포자충, 바베시아 마이크로티, 트리파노소마(예를 들어, 브루세이(brucei), 크루지(cruzi)), 리슈마니아(예를 들어, 도노바니), 및 특소포자충을 포함한다.
바람직한 실시예에서, 폴리펩티드 및 본 발명의 약학적 조성물은 메티실린-내성 황색 포도상 구균(MRSA) 및 (무내성) S. 구균, 그람-음성 박테리아 녹농균 및 진균 종 칸디다 알비칸(Candida albicans) 및 아스퍼질러스 니제르에 의해 생긴 감염을 치료하는데 효과적이다.
폴리펩티드를 포함하는 조성물은 예방적 및/또는 치료학적 처리를 위해 투여될 수 있다. 치료학적 적용에서, 폴리펩티드 또는 조성물은 이미 질환으로 고통받고 있는 개체, 바람직하게는 인간에게 감염 증상 또는 감염 및 이의 합병증으로 인한 상태에 대응하는데 충분한 양으로 투여된다. 예방적 적용에서, 폴리펩티드 또는 조성물은 개체, 예를 들어 미생물 또는 기생충 감염으로 인해 고통받을 위험이 있는 인간 또는 동물에 감염 예방 또는 적어도 감염의 발달을 억제하는데 충분한 양으로 투여된다. 폴리펩티드는 상태 또는 질환, 특히 미생물 또는 기생충 감염과 연관된 증상을 치료하기 위해 충분한 양인 치료학적 양으로 본 발명에 따른 약학적 조성물 내에 통상적으로 존재한다. 본 발명에 따른 폴리펩티드 또는 이들의 2종 이상의 조합의 통상적인 투여량은 폴리펩티드의 크기에 따라 체중 kg 당 0.01에서 10 mg 사이이다.
폴리펩티드 및 본 발명의 약학적 조성물은 특히 국소 적용, 예를 들어 피부 감염, 상처 감염 및 요로 감염에 적합하다. 본원에서 설명된 바와 같이, 생물막 형성을 예방하고 기존 생물막을 분산시킬 수 있는 본 발명의 폴리펩티드는 생물막 형성 위치 및 주위에서 박테리아, 진균 또는 다른 미생물을 사멸시키고, 전-염증성 미생물 내독소를 중화시킴으로써 면역 반응을 조절한다. 박테리아의 생물막은 감염된 피부 상처, 피부 감염 또는 요로 감염을 치유 또는 치료하는데 있어서 피부 상처 치유를 지연시키고 기존 항생제의 국소 항균 효율을 감소시킨다. 본 발명에 따른 폴리펩티드는 예를 들어 본 출원의 실시예들에서 입증된 바와 같이 특히 상처 치료에 유용하다. 실시예들은 본 발명의 폴리펩티드들이 인간의 섬유아세포의 화상 상처 감염 모델에서 생물막 내에 존재하는 박테리아아 살상에 효과가 있음을 보여준다. 일 실시예에서, 따라서 본 발명은 피부 감염, 상처 감염 및/또는 요로 감염을 치료 또는 예방에 사용하기 위한 폴리펩티드, 약학적 조성물 및/또는 본 발명에 따른 핵산 분자를 제공한다. 또한 폴리펩티드, 약학적 조성물 및/또는 본 발명에 따른 핵산 분자의 상처 치유 용도도 제공한다. 더욱이 폴리펩티드, 약학적 조성물 및/또는 본 발명에 따른 핵산 분자를 피부 감염, 상처 감염, 요로 감염 및 또는 상처 치유의 치료 또는 예방을 위한 약학적 조성물의 제조를 위한 용도를 제공한다. 본 발명은 또한 피부 감염, 상처 감염 및/또는 요로 감염으로 고통받는 개체에게 치료학적 유효량의 본 발명에 따른 폴리펩티드, 본 발명에 따른 약학적 조성물 또는 본 발명에 따른 핵산 분자를 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체를 치료하는 방법을 제공한다.
폴리펩티드 및 약학적 조성물은 또한 호중구, 대식세포/단핵세포 및 림프구의 유입 및 감염된 개체에 의한 전-염증성 미생물 화합물의 방출을 억제, 감소 또는 예방함으로써 리포타이코산, 펩티도글리칸 및 리포폴리사카라이드와 같은 전-염증성 미생물 내독소를 중화시킴에 따라 항-염증 제제로 유용하다. 따라서 염증성 화합물 전-염증성 화합물을 방출할 수 있는 세포와 본 발명에 따른 폴리펩티드를 접촉시키는 단계를 포함하는 전-염증성 화합물의 방출을 억제하는 방법도 제공한다. 상기 접촉은 생체 내 및 시험관 내에서 수행될 수 있다. 또한 항-염증 제제로 사용을 위한 본 발명에 따른 폴리펩티드를 제공한다.
본 발명의 폴리펩티드는 바람직하게는 제어 방출 및/또는 표적 전달 담체에 포함된다. 본원에서 사용되는 용어 "제어 방출"은 시간 의존적으로 본 발명의 폴리펩티드의 방출을 의미한다. 일 실시예에서, 제어 방출은 느린 방출을 의미한다. 본원에서 사용된 용어 "표적 전달"이란 부위-지향 방식으로 본 발명의 폴리펩티드의 방출을 의미한다. 제어 방출 비히클의 사용은 본 발명의 폴리펩티드의 주사와 같은 빈번한 투여를 피할 수 있는 장점이 있다. 표적 전달 비히클의 사용은 본 발명의 폴리펩티드가 효과적으로 염증 부위 또는 감염 부위와 같은 개체 몸의 관심 부위로 전달되거나 유지되는 장점이 있다. 바람직하게, 본 발명의 폴리펩티드는 박테리아, 곰팡이, 바이러스 및 기생충을 포함하는 미생물에 의해 감염된 부위에 타겟팅된다. 제어 방출 및/또는 표적 전달 담체는 당업계에 공지되어 있다. 제어 방출 및/또는 표적 전달 비히클의 예는 나노 입자, 미세 입자, 나노 캡슐, 마이크로 캡슐, 리포좀, 마이크로스피어, 하이드로젤, 폴리머, 지질 복합체, 혈청 알부민, 항체, 사이클로덱스트린 및 덱스트란이 있으나 이에 한정되지 않는다. 제어 방출의 예로 본 발명의 폴리펩티드를 이러한 담체 내 또는 표면에 혼합됨으로써 제공된다. 담체는 본 발명의 폴리펩티드를 포획하여 수성, 산성 또는 염기성 환경 또는 체액과 같은 적합한 환경에서 천천히 분해시키거나 용해시켜서 폴리펩티드를 방출하는 입자를 형성하는 물질이다. 표적 전달은 예를 들어 표면에 표적 그룹이 있는 담체를 제공함으로써 이루어진다. 이러한 표적 그룹을 포함하는 담체의 예는 항체-작용 담체, 부위-특이적 리간드를 갖는 담체 및 양 또는 음의 표면 전하를 갖는 것이다. 제어 방출 및/또는 표적 전달을 위한 바람직한 예는 나노 파티클, 즉, 직경 약 1 내지 500nm 범위의 파티클, 바람직하게는 직경 약 200nm까지인 것, 및 선택적으로 표적 그룹을 제공하는 리포좀이다.
따라서 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 제어 방출 담체 및 이러한 제어 방출 담체를 포함하는 약학적 조성물도 제공한다. 또한 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 표적 전달 담체 및 이러한 표적 전달 담체를 포함하는 약학적 조성물도 제공한다. 상기 담체는 나노 입자, 미세 입자, 나노 캡슐, 마이크로 캡슐, 리포좀, 마이크로스피어, 하이드로젤, 폴리머, 지질 복합체, 혈청 알부민, 항체, 사이클로덱스트린 및 덱스트란 으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나의 형태 이다.
바람직한 표적 전달 및 또는 제어 방출 담체는 생분해성 물질이다. 본원에서 사용된 용어 "생분해성"은 생리적 조건 하에서 분해되는 물질을 의미한다. 이는 가수 분해되는 분자 및 효소 분해를 필요로 하는 분자를 포함한다. 적합한 생분해성 물질은 PLA(폴리 락트산), PGA(폴리 글리콜 산), 폴리카프로락톤(PCA), 폴리에틸렌 옥사이드(PEO), 폴리디옥사논(PDS), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리프로필렌 푸마르산염, 락티드, 글리콜라이드 및 카프로락톤과 같은 락톤, 트리메틸렌 카보네이트 및 테트라메틸렌 카보네이트와 같은 카보네이트, 디옥사논(dioxanone), 에틸렌 글리콜, 폴리에스테르 아미드(PEA) 에틸렌 옥사이드, 에스터라미드(esteramide), γ-하이드록시발레르산(hydroxyvalerate), β-하이드록시프로피온산(β-hydroxypropionate), α-하이드록시산, 하이드록시부터레이트(hydroxybuterate), 하이드록시 알카노에이트(hydroxy alkanoate), 폴리이미드 카보네이드, 폴리우레탄, 폴리안하이드라이드, 및 이들의 조합으로부터 유래된 폴리머, 히알루론산, 키토산 및 셀룰로오스와 같은 다당류, 및 젤라틴 및 콜라겐과 같은 단백질과 같은 생분해성 물질 및 천연 생분해성 물질을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 폴리펩티드는 미생물, 예를 들어 박테리아, 바이러스, 곰팡이, 기생충의 감염에 취약한 물질의 방부제로 더 유리하게 사용될 수 있다. 이러한 물질은 본 발명의 폴리펩티드로 채워지거나 코팅되거나 또는 피복될 수 있다. 일 실시예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 의료 장치의 방부제로 사용된다. 본원에서 사용된 용어 "의료 장치"는 인간 또는 동물 몸에서 사용될 수 있으며, 의료 기기, 의료 도구, 엉덩이 및 무릎을 포함하는 인공 관절, 및 치과 보철물과 같은 보철물, 유방 보형물, 페이스 메이커, 심장 판막, 스텐트, 카테터, 귀 튜브, 부목, 의료 기기 나사와 같은 보철물, 및 상처 또는 조직 드레싱을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 이러한 의료 장치는 특별히 박테리아, 개별적 박테리아의 부착 및 생물막 내의 박테리아 부착 모두에 적합하다.
또한 본 발명의 폴리펩티드의 의료 장치 방부제로서의 용도 또한 제공된다. 더욱이 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는, 바람직하게는 의료 장치에 대한 코팅을 제공한다. 일 실시예에서, 이러한 코팅은 본 발명의 폴리펩티드의 제어 방출을 제공한다. 의료 장치의 이러한 제어방출 코팅은 코팅 물질의 분해를 통해 본 발명의 폴리펩티드의 방출이 달성되도록 바람직하게는 생분해성 물질을 포함한다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 제어 방출 코팅 또한 제공된다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 이러한 코팅 및 생분해성 물질을 포함하는 의료 장치를 제공한다. 본 발명에 따른 생분해성 코팅은 위에서 정의된 생분해성 물질을 포함한다. 특히, 이러한 생분해성 코팅은 PLA(폴리 락트산), PGA(폴리 글리콜 산), 폴리카프로락톤(PCA), 폴리에틸렌 옥사이드(PEO), 폴리디옥사논(PDS), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리프로필렌 푸마르산염, 락티드, 글리콜라이드 및 카프로락톤과 같은 락톤, 트리메틸렌 카보네이트 및 테트라메틸렌 카보네이트와 같은 카보네이트, 디옥사논(dioxanone), 에틸렌 글리콜, 폴리에스테르 아미드 (PEA) 에틸렌 옥사이드, 에스터라미드(esteramide), γ-하이드록시발레르산(γ-hydroxyvalerate), β-하이드록시프로피온산(β-hydroxypropionate), α-하이드록시산, 하이드록시부터레이트(hydroxybuterate), 하이드록시 알카노에이트(hydroxy alkanoate), 폴리이미드 카보네이드, 폴리우레탄, 폴리안하이드라이드, 및 이들의 조합으로부터 유래된 폴리머, 히알루론산, 키토산 및 셀룰로오스와 같은 다당류, 및 젤라틴 및 콜라겐과 같은 단백질로 구성된 그룹으로 선택된 물질을 포함한다.
본 발명에 따른 폴리펩티드가 강력한 항균제 일지라도, 이들은 종래의 항-감염제, 예를 들어 항생제, 항바이러스제 및 항진균제 또는 다른 항균성 펩티드, 및 항체 및 화학물질, 예를 들어 증감제, 나노입자와 같은 공지된 항균제와 결합될 수 있다. 이러한 조합은 향상된 항균 활성을 가져오거나 또는 활성의 범위를 확장할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 예를 들어 세균 감염을 치료하기 위한 페니실린, 세팔로스포린(cephalosporin), 마크로라이드(macrolide), 플루오로퀴놀론(fluoroquinolone), 술폰아미드(sulfonamide), 테트라사이클린(tetracycline) 및 / 또는 아미노글리코사이드(aminoglycoside)와 결합 될 수 있다. 바이러스 감염을 치료하기 위해 폴리펩티드는 아시클로버(aciclovir), 간시클로버(ganciclovir), 지도부딘(AZT)이나 디다노신(didanosine) 또는 오셀타미비르(oseltamivir), 페라미비어(peramivir) 또는 자나미비르(zanamivir)와 같은 뉴라미디아제(neuramidase) 억제제와 같은 항바이러스 뉴클레오시드 유사체와 결합될 수 있다. 진균 감염의 치료를 위해 본 발명의 폴리펩티드 및 조성물은 폴리엔 항진균제, 이미다졸, 트리아졸, 알릴아민, 에치노칸딘(echinocandins), 시클로피록스(ciclopirox), 플루시토신(flucytosine) 및/또는 그리세오풀빈(griseofulvin)과 결합될 수 있다. 따라서 본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩티드 및 항생제 또는 항균성 펩티드와 같은 추가적인 항균성 물질, 바람직하게는 페니실린, 세팔로스포린, 카바페넴(carbapenem), 무피로신으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 일 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함한다. 예를 들면 적합한 담체의 예로는 구멍삿갓조개 헤모시아닌(keyhole limpet haemocyanin)(KLH), 혈청 알부민(예를 들어, BSA 또는 RSA) 및 오브알부민을 포함한다. 바람직한 실시예에서 상기 적합한 담체는 용액, 예를 들어 식염수이다. 정제, 캡슐 및 이와 유사한 것에 혼입될 수 있는 부형제의 예는 다음과 같다: 트래거캔스 고무(gum tragacanth), 아카시아, 옥수수 전분 또는 젤라틴과 같은 결합제; 결정 셀룰로오스와 같은 부형제; 옥수수 전분, 호화 전분, 알긴산 및 기타 같은 종류의 것과 같은 붕해제; 마그네슘 스테아레이트(magnesium stearate)와 같은 윤활제; 수크로스, 락토스 또는 사카린과 같은 감미제; 페퍼민트, 노루발풀 오일 또는 체리와 같은 향미제. 복용 단위가 캡슐일 때, 상기 형태의 물질 이외에도 지방 오일과 같은 액체 담체를 포함할 수 있다. 다양한 다른 물질은 코팅된 형태로 존재하거나 그렇지 않으면 복용 단위의 물리적 형태를 변형시켜 존재할 수 있다. 예를 들어 정제는 쉘락(shellac), 당 또는 둘 모두로 코팅될 수 있다. 시럽 또는 엘릭시르(elixir)는 활성 화합물, 감미제로서 수크로스, 방부제로서 메틸 및 프로필 파라벤, 염료 및 체리 또는 오렌지 향의 향미제를 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 바람직하게는 인간에 사용하는 것이 적합하다.
본원에 기재된 약학적 조성물은 다양한 다른 경로로 투여될 수 있다. 예들은 본 발명에 따른 폴리펩티드를 포함하고 경구, 비강, 직장, 국소, 복강 내, 정맥 내, 근육 내, 피하, 피하, 경피, 척추 강내 및 두개 내 방법을 통한 약학적으로 허용가능한 담체를 함유하는 약학적 조성물의 투여를 포함한다. 경구 투여의 경우, 활성성분은 캡슐, 정제, 및 분말과 같은 고체 투여 형태, 또는 엘릭시르제(elixir), 시럽, 현탁액과 같은 액체 투여형태로 투여될 수 있다.
주사를 위한 무균 조성물은 주사용 비히클, 예를 들어 물 또는 참깨 오일, 코코넛 오일, 땅콩 오일, 목화씨 오일 등과 같은 천연 식물성 오일, 또는 에틸 올레이트 등과 같은 합성 지방 비히클에 본 발명의 폴리펩티드를 용해하거나 현탁함으로써 통상적인 약학적 관행에 따라 제형화될 수 있다. 완충제, 방부제, 항산화제 및 기타 같은 종류의 것이 포함될 수 있다.
바람직한 실시예로, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 국소 투여용으로 제형화된다. 본원에서 사용되는 "국소 투여"는 피부 또는 점막과 같은 신체 표면에 도포하여 미생물 또는 기생충 감염으로 인한 상태을 국부적으로 치료하는 것을 의미한다. 국소 투여에 적합한 제형의 예는 크림, 겔, 연고, 로션, 폼, 현탁액, 스프레이, 에어로졸, 분말 에어로졸을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 국소용 약제가 피부에 직접 적용되는 피내용일 수 있다. 국소용 약제는 또한 흡입용, 예를 들어 기도의 점막 상피에 적용하거나, 또는 결막에 적용하는 안약, 또는 귀에 놓는 점이액과 같은 피부 이외의 조직 표면에 적용하는 것일 수 있다. 상기 국소 투여용으로 제형화된 약학적 조성물은 바람직하게, 유화제, 희석제, 습유제, 방부제, pH 조정제 및/또는 물과 같은 국소 적용에 적합한 일 이상의 약학적 부형제를 포함한다.
본 발명에 따른 폴리펩티드는 또한 진단용도에 특별히 적합하다. 폴리펩티드는 미생물 감염, 예를 들면 미생물 독소, 예를 들어 혈액, 혈장, 점액, 상처 삼출물 및 소변과 같은 생리학적 샘플에 존재하는 LPS, LTA 및 PG를 포함하는 박테리아 독소를 검출하는데 사용할 수 있다. 더욱이, 폴리펩티드들은 이러한 샘플에서 미생물 독소의 양을 결정하는데 사용할 수 있다. 따라서 본 발명에 따른 폴리펩티드 핵산 분자의 진단 제제로서의 용도가 제공된다. 더욱이, 본 발명에 따른 폴리펩티드의 혈액, 혈장, 점액, 상처 삼출물 및 소변 시료와 같은 생리학적 샘플에서 미생물 독소, 바람직하게는 박테리아 또는 진균 독소를 검출하기 위한 용도로서 제공된다. 상기 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 비오틴, 플루오레세인 라벨, 근적외선 염료 또는 방사선 동위원소와 같은 적합한 부분에 결합될 수 있다. 이러한 라벨화된 폴리펩티드는 미생물 감염 부위로 이전하기 때문에 박테리아 감염과 같은 미생물 감염의 검출 방법으로 사용될 수 있다. 폴리펩티드에 부착된 사용된 라벨에 적합한 검출기를 사용하면, 감염 부위를 검출할 수 있다. 따라서 박테리아 감염과 같은 미생물 감염을 검출하는 방법도 본 발명에 의해 제공되어진다. 이 방법은 통상적으로 라벨된 폴리펩티드를 미생물 유기체에 감염된 또는 감염이 의심되는 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 라벨된 폴리펩티드는 감염성 유기체와 상호작용할 수 있기 때문에, 감염 부위에 축적된다. 생리학적 샘플에서 미생물 독소를 검출하기 위해, 방법은 미생물 유기체에 감염된 또는 감염이 의심되는 개체의 생리학적 샘플에 라벨된 폴리펩티드를 투여하는 단계를 포함한다. 폴리펩티드에 부착된 라벨에 민감한 다양한 검출기를 사용하여 감염 부위 또는 샘플 안에서 폴리펩티드의 축적을 검출하는 것이 가능하다.
본 발명에 따른 폴리펩티드의 또 다른 유용한 적용은 식품 보존에 있다. 따라서 본 발명에 따른 폴리펩티드의 식품 보존제로서의 용도도 제공된다. 일반적으로, 병원성 또는 부패 미생물은 식품에 60 에서 100℃의 온도를 처리하여 식품에 열적인 처리를 함으로써 파괴된다. 이러한 처리는 바람직하지 않은 관능 효과와 같은 식품에 바람직하지 않은 효과를 가져온다. 본 발명에 따른 폴리펩티드의 식품 보존제로서의 용도는 식품의 연장된 저장 수명 및/또는 향상된 안정성을 가져온다.
식품 내 병원성 미생물은 개체의 감염 또는 중독을 일으키며, 캄필로박터제주니(Campylobacter jejuni), 장티푸스균(Salmonella typhi), 파라티푸스균(Salmonella paratyphi) 및 비-장티푸스균 종(non- typhi Salmonella species), 황색 포도상 구균(Staphylococcus aureus), 대장균(Escherichia coli), 리스테리아균(Listeria monocytogenes), 쉬겔라(Shigella), 보툴리누스균(Clostridium Botulinum)과 같은 박테리아, 로타바이러스 및 노워크바이러스(Norwalk virus)와 같은 바이러스, 유구조충(Taenia solium), 무구조충(Taenia saginata) 및 선모충(Trichinella spiralis)과 같은 기생충 및 곰팡이를 포함한다. 식품의 부패는 식품의 외형, 질감, 향 및/또는 냄새가 변함을 의미하고, 락토바실러스(Lactobacillus), 류코노스토크(Leuconostoc), 슈도모나스(Pseudomonas), 미구균(Micrococcus), 플라보박테리움(Flavobacterium), 세라티아(Serratia), 엔테로박터(Enterobacter) 및 연쇄상구균(Streptococcus)과 같은 박테리아, 누룩 곰팡이(Aspergillus), 푸사리움(Fusarium), 및 클라도스포륨(Cladosporium)과 같은 균류 및 효모에 의해 야기될 수 있다.
본 발명은 다음의 비제한적 실시예에서 더욱 상세히 설명될 것이다.
생물막 감염에 대한 본 발명의 항균 펩티드의 고유한 효과는 3가지 부분이 있다: 그들은 1) 생물막 형성을 방지하고 존재하는 생물막을 분산시킬 것이고, 2) 방출 부위 및 주변의 박테리아, 진균 또는 다른 미생물을 죽이며, 3) 리포타이코산(LTA), 펩티도글리칸(PG) 및 리포폴리사카라이드(LPS)와 같은 전-염증성 미생물의 내독소를 중화시키고 대식세포를 활성시켜 그들의 식세포 및 살균 활성을 증진시킴으로써 면역반응을 조율할 것이다. 이러한 면역 조절은 주입 주변 조직이 병원균에 대한 새로운 거점이 되는 것을 방지하는데 필수적이다. 본 발명의 폴리펩티드는 기존 항생제에 대해 내성을 갖는 것을 포함하여 미생물의 넓은 범위에 대해 활성화된다.
또한 i) 하나 또는 모든 아미노산이 이의 D-아미노산으로 대체된 P10 변이체(표 2), ii) 펩티드가 C-말단의 N-말단이 아세틸, 아미드, NH-(CH2-CH2-O)11-CO, 헥사노일, 데카노일, 미리스토일, 프로피오닐, 하나 또는 두개의 아미노-헥사노일 그룹을 포함하는 다른 그룹으로 연장된 P10 변이체, iii) 하나의 아미노산이 다른 L-아미노산으로 대체된 P10 변이체, 및 iv) 짧아진 P10 변이체는 P10의 활성과 필적하는 항균활성을 갖고 있으며, 이는 실시예에서 증명되었다(표 2, 3, 5, 및 6 참조).
따라서, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 생물막 내에 존재하든 안하든 내독소 중화 활성으로 입증되는 최적의 항-염증(미생물 화합물-중화) 활성, 높은 선택성 즉, 높은 항균 활성, 허용가능한 낮은 독성 및 면역-증강 활성으로 미생물에 대하여 높은 활성을 갖는다.
도 1: 세포막 붕괴에 관한 가장 유명한 2가지 모델(카펫 및 기공 형성) 및 세포 내 환경으로 AMP의 이동을 나타내는 AMP의 행동 모드와 관련된 단계의 간소화된 도식. 주로 음이온 포스파티딜글리세롤(PG)과 중성 포스파티딜에탄올아민(PE)으로 이루어진 세포질 세균의 막에 결합하기 위해, AMP는 외막 및/또는 대부분 정전기적으로 구동되는 펩티도글리칸/리포타이코산 층(단순화를 위해 표시하지 않음) 뿐만 아니라 세포밖의 생물막 중합체를 통해 이동해야 한다.
도 2: 펩티드들의 다른 농도에 따라 배양 배지의 ml 당 MRSA의 CFU(콜로니 형성 단위) 양(A) 및 펩티드들의 IC90, IC99, IC99.99 (90%, 99% 및 99.9% 억제 농도) 값(B)으로 표시되는, 펩티드들 P60.4Ac(Nell MJ et al. Peptides (2006) 649-660) 및 펩티드들 P2, P3, P4, P5, P6, P9, P10, P11, P12, P13, P14, P15, P16, P17 및 P19에 의한 MRSA LUH14616의 살상.
도 3: 배양 배지의 ml 당 MRSA의 CFU 양을 도시한 바와 같이, P60.4Ac 및 P10의 상이한 농도에 따른 MRSA의 살상.
도 4: 피부 모델 당 MRSA LUH14616의 CFU 양(A) 및 피부 모델 당 MRSA LUH14616의 생존양(%)으로 묘사되는 열적인 상처 피부 모델 MRSA LUH14616에 대한LL-37, P60.4Ac, P10 및 무피로신의 효과.
도 5: 피부 모델 당 MRSA LUH15051의 CFU 양(A) 및 피부 모델 당 MRSA LUH15051의 생존양(%)으로 묘사되는 열적인 상처 피부 모델에서 상처 무피로신-내성 MRSA LUH15051에 대한 LL-37, P60.4AC, P10 및 무피로신의 효과.
실시예
재료 및 방법
항균 펩티드의 합성
합성 펩티드는 사전로드된 텐타겔(Tentagel) 수지, 그 자리에서의 활성을 위한 PyBop/NMM 및 Fmoc 제거를 위한 20% 피페리딘을 사용하여 통상의 Fmoc-화학법에 의해 제조하였다[Hiemstra HS et al. Proc Natl Acad Sci USA, 94, 10313-10318 (1997)]. 커플링은 6배 아실화종(acylating species)을 사용하여 60분간 수행하였다. 최종 Fmoc 제거된 펩티드는 펩티드 서열에서 C (트리에틸실란) 또는 W (에탄티올)이 존재할 때 추가 제거제를 포함하는 TFA/H2O 19/1 (v/v)로 절단하였다. 펩티드는 에테르/펜탄 1/1 (v/v) 침전 및 원심분리에 의한 생성물의 분리를 통해 분리하였다. 약 40℃에서 공기건조시킨 후, 펩티드를 아세트산/물 1/1(v/v)에서 용해시키고 동결건조시켰다. 펩티드는 UPLC-MS (Acquity, Waters)를 사용하여 순도를 체크하였고, 예상 분자량을 보여주는 Maldi-Tof 질량 분석법(Microflex, Bruker)을 사용하여 무결성을 체크하였다.
약어:
Fmoc: 9H-플루오레닐메틸옥시카보닐(9H-fluorenylmethyloxycarbonyl)
NMM: N-메틸모르폴린(N-methylmorpholin)
PyBOP: 벤조트리아졸-1-일-익시-트리스-피롤리디노-포스포늄 헥사플루오로포스페이트(Benzotriazol-1-yl-oxy-tris-pyrrolidino-phosphonium hexafluorophosphate)
TFA: 트리플루오로 아세트산(trifluoro acetic acid)
박테리아 균주
메티실린-내성 황색포도상구균(MRSA), LUH14616의 임상적 분리는 마스트리히트 대학 의료센터, 마스트릭히트, 네덜란드의 S. Croes 박사에 의해 제공되어졌으며(Croes S BMC Microbiol. 2009;9:229. doi: 10.1186/1471-2180-9-229 참조), 무피로신-내성 MRSA LUH 15051의 임상적 분리는 MEOC Heck 박사로부터 받았다(감염병 및 검사 연구소, 국립 공중 건강 및 환경기관, RIVM, 빌토벤, 네덜란드). 황색 포도상 구균 JAR은 Campoccia 등에 설명되어 있다(Int J Artif Organs. 2008 Sep;31(9):841-7).
박테리아는 사용 전까지 -80℃에서 보관하였다. 배양 트립틱 소이 브로스(TSB) 배지(Becton Dickinson, Le Pont de Clax, France) 내 혈액 한천 플레이트로부터 분리된 MRSA 콜로니를 2.5시간 배양함으로써 중간 대수 단계의 박테리아의 접종을 준비하였고, 필요한 농도로 희석하였다.
균주 ID 종 내성
LUH 14616 S. aureus 메티실린 Croes et al. 2009
LUH 15051 S. aureus 메티실린 및 무피로신 RIVM
JAR S. aureus Campoccia et al. 2008
시험관 내 살상 분석(killing assay)
중간 대수 단계의 박테리아의 시험관 내 살상 분석을 위하여 MRSA LUH14616 및 MRSA LUH 15051를 PBS 내 1 x 106 박테리아/ml의 농도로 재현탁시켰다. 다음으로, 사전에 동결 건조된 펩티드 LL-37, P60.4Ac(OP-145) 및 P10의 농도 범위에 200㎕를 첨가하였다. 다음으로, 박테리아-펩티드 혼합물을 37℃에서 1시간동안 배양하였다. 이러한 펩티드의 살상 능력을 설정하기 위하여, 현탁액을 연속적으로 희석시키고, DST 아가 플레이트 상에 플레이팅하여 생존가능한 CFU 수를 측정하였다. IC90, IC99 및 IC99.9 값을 선형 회귀 분석으로 계산하였다.
P10 변이체로 시험관 내 살상 분석하기 위해 황색 포도상 구균 JAR(1mln CFJ/ml)을 PBS 또는 PBS/인간 혈장 (1/1, v/v) 내 다양한 펩티드 농도와 함께 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 표 2-6에 도시된 것은 박테리아의 99.9% 살상(1000 CFU/ml 남음)된 결과를 나타내는 펩티드의 농도이다. LC99.9은 두 개의 독립적인 실험의 평균값이다.
인간 피부 등가물
인간 피부 등가물을 El Ghalbzouri et al. (Lab Invest. 2004 Jan;84(1):102-12)에 묘사된 대로 준비하였다. 간단히, 5x105 개의 정상적인 인간 각질세포(keratinocyte)을 섬유아세포로 채워진 래트-꼬리 콜라겐 매트릭스 상에 분주하였다. 콜라겐 매트릭스는 기저 (0.1% 아세트산, 4 mg/ml 콜라겐, Hank의 균형잡힌 염 용액 (Hank's Balanced Salt Solution (HBSS, 10x)), 1M NaOH 및 FCS)와 정상적인 인간 섬유아세포가 분주되어 있는 상부 콜라겐 층(4 mg/ml collagen, 10x HBSS, 1M NaOH, FCS 및 섬유아세포)을 만들어서 사전에 준비하였다. 3 ㎛ 공극 크기를 갖는 트랜스웰 필터(Corning 3414, Costar)를 인간 피부 등가물을 배양하는데 사용하였다. 콜라겐 매트릭스는 일주일 동안 섬유아세포 배지에서 배양하였다. 전체 두께의 인간 피부 등가물을 처음에는 37℃, 7.3% CO2에서 2 또는 3일간 각질세포 배지에서 액중 배양한 뒤 상기 설명한 각질세포 배지에서 1% FCS와 함께 2M L-세린, 10 mM L-카르니틴, 1μM DL-α토코페롤-아세테이트, 50μM 아스코르브산, 팔미트산, 리놀산 및 아라키돈산이 1:1:1 비율로 포함된 지질 보충제 및 2.4x10-5 M 소혈청 알부민으로 보충된 배지에서 배양하였다. 2일 또는 3일 후, HSE들은 공기-액체 계면에서 14일간 상기 설명한 각질세포 배지안에서 배양하였는데, 혈청은 없었고, 2M L-세린, 10 mM L-카르니틴, 1μM DL-α토코페롤-아세테이트, 50μM 아스코르브산, 25μM 팔미트산, 30μM 리놀산 및 7μM 아라키돈산(2:1:1)이 포함된 지질 보충제 및 2.4x10-5 M 소혈청 알부민으로 보충된 배지에서 배양하였다. 배지는 일주일에 2번씩 새롭게 변경하였다.
화상 상처 감염 모델 및 실험적 치료
전체 두께의 피부 모델을 0.4㎛ 공극 크기를 갖는 트랜스웰 필터 Corning 3460, Costar)를 사용하여 상기 설명한 바와 같이 재구성하였다. 공기-액체 계면에서 10일간 배양한 후, 액체 질소를 피부 등가물에 15초간 적용함으로써, 20 mm2의 화상 상처를 만들었다. 열 손상 피부 등가물은 감염 전에 37℃ 및 7.3% CO2 에서 1시간동안 배양하였다. 감염은 피부 등가물에 1x105개의 MRSA의 접종을 적용함으로써 이루어졌다. 1시간 동안 배양한 후, 비-부착 박테리아는 제거하였다. 감염 후 1 또는 8시간 후 치료를 시작하였고, LL-37, P60.4Ac 또는 P10의 1회 용량(PBS 100 ml 내 100㎍)이 주어졌다. 치료는 진행하기 전에 4 또는 24시간 동안 연장되었다. 피부 등가물을 1 ml PBS로 세척하여 모든 비-부착 박테리아를 제거하였다. 이어서 4 mm의 두 생검을 취해서 1 ml PBS에서 균질화시켰다. 균질물 및 세척액은 연속적으로 희석하여 한천 플레이트 진단 감수성 테스트(DST)에서 생존가능한 CFU 수를 측정하였다.
결과
P10의 확인
15개의 펩티드 세트를 합성하였다. 펩티드들은 컴퓨터 도움의 구조 예측을 기반으로 P60.4Ac (Nell MJ et al. Peptides (2006) 649-660)와 비교했을때 예측되는 양친매 구조를 강화하거나 또는 약화하여 설계하였다. 항-생물막 활성은 펩티드간에 매우 다양하다(높거나 낮은 활성의 항균 펩티드 모두 이러한 방법으로 생성된다.). 이는 항균적 펩티드 내에서 양친매성 헬릭스 구조의 변형과 항-생물막 활성간에 민감한 관계가 존재함이 예상되었다. 따라서, 상기 관찰에 기초하여 일련의 짧은 활성 펩티드들을 개발하였고, 그들의 항균적 활성을 평가하였다. 이러한 펩티드들의 활성은 항균적 활성이 없는 것에서부터 몰 기준으로 LL-37의 활성을 초월하는 활성을 가지는 펩티드까지 다양하였다. P60.4Ac 및 실험한 15개의 펩티드들의 서열은 하기와 같다:
P60.4Ac I G K E F K R I V E R I K R F L R E L V R P L R
P2 I A K E F K R I V E R I K R F L R E L V R P L R
P3 L A R D Y K R L V E R L K R W L R E L V R P L K
P4 I A K E F K R I L E R I K R F I R E I T R P I R
P5 T A K E Y K R I L D R I K R Y L R E L V R A I K
P6 V A K D Y R K V V D R I K R F L R Y L L R P V R
P9 L A K D Y K K I V E R L R K W L R E V L R P V K
P10 L A R E Y K K I V E K L K R W L R Q V L R T L R
P11 L A K E Y R K I F D R L K K W L R Q I V R P S K
P12 L A R E Y K R I F E R L R K W L R Q I V K P V R
P13 L A K E W R K I V D R L K R W L R D I L K A T K
P14 V A R E W K R I L E K I K R W L R D I L K A L R
P15 V A K E W R K I V D R I K R Y L R D I S K A T K
P16 T A R E W K R I L E K I R K Y L R D V S R V T R
P17 V A K D W K R I V D K V R R Y L R E V T K I L K
P19 T A K D Y R K I F E K I K K Y L K D L T R I L K
펩티드 P10은 MRSA LYH14616을 매우 효율적으로 사멸시켰다. 이는 실험한 모든 펩티드 중에서 MRSA LUH14616에 대해서 가장 높은 활성을 가진 것이며, P60.4Ac (OP-145)보다 상당히 더욱 효과적이다. 도 2A 및 B 참조. 예를 들어, P10은 IC99.9가 0.59μM인데, 이는 이 농도에서 P10이 1000개의 박테리아 중에서 999개를 죽인다는 것을 의미한다. P60.4Ac은 비슷하게 0.75μM의 조금 더 높은 농도에서 1000개의 박테리아 중 오직 900개를 죽인다(IC90 of 0.75μM). 이와 같이, 유사한 농도에서 P10을 처리한 것과 비교했을 때, P60.4Ac을 처리한 후 100배의 많은 박테리아가 살아 남았다. 따라서, P10은 P60.4Ac 보다 약 100배 더 좋은 활성을 가진다.
P10 및 변이체의 활성
펩티드 10은 LL-37 및 P60.4Ac 보다 MRSA 및 무피로신-내성 MRSA을 살상하고 열적인 상처입은 인간 피부 등가물로부터 이러한 박테리아를 제거하는데 더 효과적이었다(도 3-5).
P10은 대수 단계의 MRSA 박테리아, 정체 박테리아 및 생물막에 존재하는 박테리아에 대한 높은 효과가 있다.
또한 P10은 이에 대해 매우 효과적이다:
1) 그람-양성 박테리아, 예를 들어 메티실린-민감성 균주 뿐만 아니라 메티실린-내성의 다양한 균주(도 4 및 5 참조), 표피 포도구균(Staphylococcus epidermidis), 2) 다양한(약제-내성) 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 균주, (약제-내성) 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii )를 포함하는 그람-음성 박테리아,
3) 마이코박테리아, 및
4) 곰팡이 병원균(플루코나졸-내성) 칸디다 알비칸(Candida albicans)과 아스퍼질러스 니제르(Aspergillus niger)
하나 또는 모든 아미노산이 그들의 대응하는 D-아미노산으로 대체되거나, 또는 하나의 아미노산이 다른 L-아미노산으로 대체되는 P10 변이체는 P10의 항균 활성에 필적하는 항균 활성을 가진다. 또한 C-말단의 N-말단이 아세틸, 아미드, NH-(CH2-CH2-O)11-CO, 헥사노일, 데카노일, 미리스토일(myristoyl), 프로피오닐(propionyl), 하나 또는 두 개의 아미노-헥사노일 그룹을 포함하는 다른 그룹으로 연장된 변이체 및 짧아진 P-10 변이체는 P10의 항균 활성에 필적하는 항균 활성을 갖는다. 이러한 P10 변이체의 서열 및 활성은 표 2, 3, 5, 및 6에 기재하였다. 헬릭스를 절단하도록 도입된 프롤린 치환이 있는 펩티드는 대부분 비활성이었다(표 4 참조).
하나의 아미노산이 이의 D-아미노산(소문자) 및 대응물로 대체된 P-10의 변이체 및 레트로-인버소 펩티드의 활성. J = 아세틸, B = 아미드
펩티드 서열 LC99.9 (μM)
(PBS)		 LC99.9 (μM)
(50%혈장)
P-10 JLAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLRB 1.6 102.4
1301-1 JlAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLRB 0.6 38.4
1301-2 JLaREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLRB 0.6 38.4
1301-3 JLArEYKKIVEKLKRWLRQVLRTLRB 0.6 38.4
1301-4 JLAReYKKIVEKLKRWLRQVLRTLRB 0.6 38.4
1301-5 JLAREyKKIVEKLKRWLRQVLRTLRB 0.6 38.4
1301-6 JLAREYkKIVEKLKRWLRQVLRTLRB 0.6 38.4
1301-7 JLAREYKkIVEKLKRWLRQVLRTLRB 0.6 25.6
1301-8 JLAREYKKiVEKLKRWLRQVLRTLRB 0.6 38.4
1301-9 JLAREYKKIvEKLKRWLRQVLRTLRB 0.6 38.4
1301-10 JLAREYKKIVeKLKRWLRQVLRTLRB 0.6 38.4
1301-11 JLAREYKKIVEkLKRWLRQVLRTLRB 0.4 19.2
1301-12 JLAREYKKIVEKlKRWLRQVLRTLRB 0.6 32.0
1301-13 JLAREYKKIVEKLkRWLRQVLRTLRB 0.6 38.4
1301-14 JLAREYKKIVEKLKrWLRQVLRTLRB 0.6 38.4
1301-15 JLAREYKKIVEKLKRwLRQVLRTLRB 0.4 38.4
1301-16 JLAREYKKIVEKLKRWlRQVLRTLRB 0.6 38.4
1301-17 JLAREYKKIVEKLKRWLrQVLRTLRB 0.6 38.4
1301-18 JLAREYKKIVEKLKRWLRqVLRTLRB 0.6 38.4
1301-19 JLAREYKKIVEKLKRWLRQvLRTLRB 0.6 32.0
1301-20 JLAREYKKIVEKLKRWLRQVlRTLRB 0.6 38.4
1301-21 JLAREYKKIVEKLKRWLRQVLrTLRB 0.6 38.4
1301-22 JLAREYKKIVEKLKRWLRQVLRtLRB 0.6 38.4
1301-23 JLAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTlRB 0.4 32.0
1301-24 JLAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLrB 0.6 19.2
1241-03 rltrlvqrlwrklkevikkyeralB 3.2 >102.4
1313-07 JlareykkiveklkrwlrqvlrtlrB 1.6 25.6
펩티드가 C-말단의 N-말단이 다른 그룹으로 연장된 P-10 변이체의 활성. J = 아세틸, B = 아미드, o = NH-(CH2-CH2-O)11-CO, b = 헥사노일, j = 데카노일, u = 미리스토일, U = 프로피오닐. Z = 아미노-헥사노일
펩티드 서열 LC99.9(μM)
(PBS)		 LC99.9 (μM)
(50% 혈장)
P-10 JLAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLRB 1.6 102.4
1302-4 JLAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLRZZB 0.8 38.4
1302-5 JLAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLRoB 0.8 102.4
1302-6 JLAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLRZB 0.6 38.4
1302-7 oLAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLRB 1.6 102.4
1302-8 bLAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLRB 1.2 102.4
1302-9 jLAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLRB 1.6 >102.4
1302-10 uLAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLRB 2.0 102.4
1302-11 ULAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLRB 1.6 102.4
특정 아미노산이 2번 P (프롤린, 헬리스 절단 잔기가 되는 것으로 알려짐)로 치환됨에 따라 펩티드가 변형된 P-10 변이체의 활성. J = 아세틸, B = 아미드
펩티드 서열 LC99.9(μM)
(PBS)		 LC99.9 (μM)
(50%혈장)
P-10 JLAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLRB 1.6 102.4
1302-13 JLAREYKPIVEKLKRWPRQVLRTLRB >3.2 >102.4
1302-14 JLAREYPKIVEKLKRWLRPVLRTLRB 3.2 102.4
1302-15 JLAREYKKIVPKLKRWLRQVPRTLRB >3.2 76.8
1302-16 JLAREYKKPVEKLKRWLPQVLRTLRB >3.2 102.4
표 5. 하나의 아미노산이 다른 L-아미노산으로 대체된 P-10 변이체의 활성. J =아세틸, B = 아미드
펩티드 서열 LC99.9(μM)
(PBS)		 LC99.9 (μM)
(50% 혈장)
P-10 JLAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLRB 1.6 102.4
1302-17 JIAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLRB 1.6 102.4
1302-18 JVAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLRB 1.6 76.8
1302-19 JAAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLRB 1.6 76.8
1302-20 JLLREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLRB 1.6 102.4
1302-21 JLVREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLRB 1.2 76.8
1302-22 JLQREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLRB 1.6 76.8
1302-23 JLAKEYKKIVEKLKRWLRQVLRTLRB 1.6 102.4
1302-24 JLAHEYKKIVEKLKRWLRQVLRTLRB 1.6 102.4
1302-25 JLARQYKKIVEKLKRWLRQVLRTLRB 1.2 51.2
1302-26 JLAREFKKIVEKLKRWLRQVLRTLRB 0.8 76.8
1302-27 JLAREYRKIVEKLKRWLRQVLRTLRB 0.8 76.8
1302-28 JLAREYHKIVEKLKRWLRQVLRTLRB 1.2 102.4
1302-29 JLAREYKRIVEKLKRWLRQVLRTLRB 1.6 102.4
1302-30 JLAREYKHIVEKLKRWLRQVLRTLRB 3.2 102.4
1302-31 JLAREYKKIVERLKRWLRQVLRTLRB 3.2 102.4
1302-32 JLAREYKKIVEHLKRWLRQVLRTLRB 3.2 102.4
1302-33 JLAREYKKIVEKIKRWLRQVLRTLRB 3.2 102.4
1302-34 JLAREYKKIVEKVKRWLRQVLRTLRB 3.2 102.4
1302-36 JLAREYKKIVEKAKRWLRQVLRTLRB 3.2 76.8
1302-37 JLAREYKKIVEKLHRWLRQVLRTLRB 3.2 102.4
1302-38 JLAREYKKIVEKLKKWLRQVLRTLRB 2.4 102.4
1302-39 JLAREYKKIVEKLKHWLRQVLRTLRB 3.2 102.4
1302-40 JLAREYKKIVEKLKRFLRQVLRTLRB 1.6 76.8
1302-41 JLAREYKKIVEKLKRWLHQVLRTLRB 1.6 102.4
1302-42 JLAREYKKIVEKLKRWLRNVLRTLRB 1.6 76.8
1302-43 JLAREYKKIVEKLKRWLRAVLRTLRB 1.6 102.4
1302-44 JLAREYKKIVEKLKRWLRSVLRTLRB 1.6 76.8
1302-45 JLAREYKKIVEKLKRWLRTVLRTLRB 1.6 76.8
1302-46 JLAREYKKIVEKLKRWLRQLLRTLRB 1.6 102.4
1302-47 JLAREYKKIVEKLKRWLRQVIRTLRB 1.6 76.8
1302-48 JLAREYKKIVEKLKRWLRQVVRTLRB 1.2 76.8
1302-49 JLAREYKKIVEKLKRWLRQVARTLRB 1.6 51.2
1302-50 JLAREYKKIVEKLKRWLRQVLKTLRB 0.8 51.2
1302-51 JLAREYKKIVEKLKRWLRQVLHTLRB 1.6 102.4
1302-52 JLAREYKKIVEKLKRWLRQVLRQLRB 1.6 76.8
1302-53 JLAREYKKIVEKLKRWLRQVLRNLRB 1.6 51.2
1302-54 JLAREYKKIVEKLKRWLRQVLRALRB 0.8 51.2
1302-55 JLAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLHB 1.2 102.4
짧아진 P-10 변이체의 활성. J =아세틸, B = 아미드
펩티드 서열 LC99.9(μM)
(PBS)		 LC99.9 (μM)
(50% 혈장)
P-10 JLAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLRB 1.6 102.4
1302-56 JREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLRB 1.6 51.2
1302-57 JLAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTB 1.6 51.2
1302-58 JREYKKIVEKLKRWLRQVLRTB 1.6 76.8
1302-59 JYKKIVEKLKRWLRQVLRTLRB 1.6 51.2
1302-60 JLAREYKKIVEKLKRWLRQVLB 1.6 102.4
1302-61 JEYKKIVEKLKRWLRQVLRB 2.4 102.4
1302-62 JYKKIVEKLKRWLRQVLB 1.6 76.8
1302-63 JKKIVEKLKRWLRQB >3.2 102.4
<110> Academisch Ziekenhuis Leiden h.o.d.n. LUMC <120> Antimicrobial peptide <130> P100005PC00 <140> PCT/NL2014/050295 <141> 2014-05-09 <150> EP 13167240.4 <151> 2013-05-10 <160> 107 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antimicrobial peptide <400> 1 Leu Ala Arg Glu Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu 1 5 10 15 Arg Gln Val Leu Arg Thr Leu Arg 20 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variant AMP <400> 2 Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu Arg Gln Val Leu 1 5 10 15 <210> 3 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variant AMP <400> 3 Leu Ala Arg Glu Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu 1 5 10 15 Arg Gln Val Leu Arg Thr Leu Arg 20 <210> 4 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variant AMP <400> 4 Ile Ala Arg Glu Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu 1 5 10 15 Arg Gln Val Leu Arg Thr Leu Arg 20 <210> 5 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variant AMP <400> 5 Val Ala Arg Glu Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu 1 5 10 15 Arg Gln Val Leu Arg Thr Leu Arg 20 <210> 6 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variant AMP <400> 6 Ala Ala Arg Glu Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu 1 5 10 15 Arg Gln Val Leu Arg Thr Leu Arg 20 <210> 7 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variant AMP <400> 7 Leu Leu Arg Glu Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu 1 5 10 15 Arg Gln Val Leu Arg Thr Leu Arg 20 <210> 8 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variant AMP <400> 8 Leu Val Arg Glu Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu 1 5 10 15 Arg Gln Val Leu Arg Thr Leu Arg 20 <210> 9 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variant AMP <400> 9 Leu Gln Arg Glu Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu 1 5 10 15 Arg Gln Val Leu Arg Thr Leu Arg 20 <210> 10 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variant AMP <400> 10 Leu Ala Lys Glu Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu 1 5 10 15 Arg Gln Val Leu Arg Thr Leu Arg 20 <210> 11 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variant AMP <400> 11 Leu Ala His Glu Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu 1 5 10 15 Arg Gln Val Leu Arg Thr Leu Arg 20 <210> 12 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variant AMP <400> 12 Leu Ala Arg Gln Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu 1 5 10 15 Arg Gln Val Leu Arg Thr Leu Arg 20 <210> 13 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variant AMP <400> 13 Leu Ala Arg Glu Phe Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu 1 5 10 15 Arg Gln Val Leu Arg Thr Leu Arg 20 <210> 14 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variant AMP <400> 14 Leu Ala Arg Glu Tyr Arg Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu 1 5 10 15 Arg Gln Val Leu Arg Thr Leu Arg 20 <210> 15 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variant AMP <400> 15 Leu Ala Arg Glu Tyr His Lys Ile Val Glu Lys 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Acetylated and amidated P10 variants <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> ACETYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (24) <223> AMIDATION <400> 98 Leu Ala Arg Glu Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu 1 5 10 15 Arg Gln Val Leu Arg Ala Leu Arg 20 <210> 99 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Acetylated and amidated P10 variants <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> ACETYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (24) <223> AMIDATION <400> 99 Leu Ala Arg Glu Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu 1 5 10 15 Arg Gln Val Leu Arg Thr Leu His 20 <210> 100 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> shorth P10 variants <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> ACETYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (22) <223> AMIDATION <400> 100 Arg Glu Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu Arg Gln 1 5 10 15 Val Leu Arg Thr Leu Arg 20 <210> 101 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> shorth P10 variants <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> ACETYLATION <220> 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Leu 20 <210> 105 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> shorth P10 variants <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> ACETYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (18) <223> AMIDATION <400> 105 Glu Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu Arg Gln Val 1 5 10 15 Leu Arg <210> 106 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> shorth P10 variants <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> ACETYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (16) <223> AMIDATION <400> 106 Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu Arg Gln Val Leu 1 5 10 15 <210> 107 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> shorth P10 variants <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> ACETYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (13) <223> AMIDATION <400> 107 Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu Arg Gln 1 5 10

Claims (22)

  1. 아미노산 서열 LAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR 또는 상기 아미노산 서열의 변이체를 포함하여 길이가 16 내지 200개의 아미노산으로 구성되는 분리된 또는 재조합 폴리펩티드.
    상기 폴리펩티드는 항박테리아 활성을 갖고,
    상기 변이체는 16개 이상의 아미노산을 가지며,
    상기 변이체는 상기 아미노산 서열 LAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR로부터:
    - 다음의 아미노산 치환을 4개까지 가지거나,
    L, I, V 또는 A의 그룹으로부터 선택된 일 이상의 아미노산을 상기 그룹으로부터 선택된 다른 아미노산으로 치환;
    R, K 또는 H의 그룹으로부터 선택된 일 이상의 아미노산을 상기 그룹으로부터 선택된 다른 아미노산으로 치환;
    E를 Q로 치환
    Y 또는 W를 F로 치환
    Q, N, A, S 또는 T의 그룹으로부터 선택된 일 이상의 아미노산을 상기 그룹으로부터 선택된 다른 아미노산으로 치환
    - 아미노산을 대응하는 D-아미노산으로 일 이상의 치환을 가지거나,
    - 아미노산을 대응하는 다음의 비-천연 아미노산 치환으로 5개까지 가지거나,
    대응하는 β-아미노산으로 치환;
    천연 아미노산이 알라닌인 경우, t-부틸알라닌, 2-나프틸알라닌, L-3-(2-나프틸)알라닌 또는 2-아미노이소부티르산으로 치환;
    천연 아미노산이 아르기닌인 경우, 호모아르기닌, 오르니틴, N5-카르바모일오르니틴 또는 3-아미노-프로피온산으로 치환;
    천연 아미노산이 아스파라긴인 경우, N-에틸아스파라긴으로 치환;
    천연 아미노산이 아스파르트산인 경우, 4-터트-부틸-하이드로겐 2-아지도숙시네이트로 치환;
    천연 아미노산이 시스테인인 경우, 시스테산 또는 호모시스테인으로 치환;
    천연 아미노산이 글루탐산인 경우, γ-카복시-DL-글루탐산 또는 4-플루오로-DL-글루탐산으로 치환;
    천연 아미노산이 글루타민인 경우, D-시트룰린 또는 티오-L-시트룰린으로 치환;
    천연 아미노산이 글리신인 경우, N-메틸글리신, t-부틸글리신 또는 D-알릴글리신으로 치환;
    천연 아미노산이 히스티딘인 경우, 3-(3-메틸-4-니트로벤질)-L-히스티딘 메틸 에스테르로 치환;
    천연 아미노산이 이소류신인 경우, 이소데스모신, N-메틸이소류신 또는 알로-이소류신으로 치환;
    천연 아미노산이 류신인 경우, 노르로이신, 데스모신 또는 5,5,5-트리플루오로-류신으로 치환;
    천연 아미노산이 라이신인 경우, 6-N-메틸리신, 2-아미노헵탄산, N-아세틸라이신, 하이드록시라이신 또는 알로-하이드록시라이신으로 치환;
    천연 아미노산이 메티오틴인 경우, 메티오닌 설폭사이드로 치환;
    천연 아미노산이 페닐알라닌인 경우, p-아미노-L-페닐알라닌, 3-벤조티에닐 알라닌 p-브로모페닐알라닌, p-아실-L-페닐알라닌, 2-플루오로페닐알라닌, 3-플루오로페닐알라닌 또는 4-플루오로페닐알라닌으로 치환;
    천연 아미노산이 프롤린인 경우, 3-하이드록시프롤린, 4-하이드록시프롤린 또는 1-아세틸-4-하이드록시-L-프롤린으로 치환;
    천연 아미노산이 세린인 경우, 호모세린, 이소세린 또는 3-페닐세린으로 치환;
    천연 아미노산이 트레오닌인 경우, D-티록신 또는 알로-트레오닌으로 치환;
    천연 아미노산이 트립토판인 경우, 5-하이드록시-트립토판, 5-메톡시-트립토판 또는 5-플루오로-트립토판으로 치환;
    천연 아미노산이 티로신인 경우, O-메틸-L-티로신, O-4-알릴-L-티로신 또는 3-클로로-티로신으로 치환;
    천연 아미노산이 발린인 경우, 노르발린, N-메틸발린 또는 3-플루오로-발린으로 치환;
    또는
    - 상기 아미노산 서열로부터 16개 이상의 연속적인 아미노산의 레트로-인버소 서열을 가짐.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 변이체는,
    상기 아미노산 서열로부터 16 개 이상의 연속적인 아미노산의 레트로-인버소 서열을 갖는 것인 폴리펩티드.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 폴리펩티드는 선택적으로 N-말단이 변형되거나, C-말단이 변형되거나, 또는 이들의 조합인 것인 폴리펩티드.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 폴리펩티드는,
    N-말단의 아세틸-, 헥사노일-, 데카노일-, 미리스토일-, NH-(CH2-CH2-O)11-CO- 또는 프로피오닐-잔기를 포함하거나,
    C-말단의 아미드-, NH-(CH2-CH2-O)11-CO-아미드-, 또는 하나 또는 두 개의 아미노-헥사노일 그룹을 포함하거나,
    이들의 조합인 것인 폴리펩티드.
  5. 제1항에 있어서, 상기 변이체는 적어도 청구항 제1항에 기재된 아미노산 치환을 5개까지 가지는 아미노산 서열 YKKIVEKLKRWLRQVL 을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  6. 제1항에 따른 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자.
  7. 제6항에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  8. 제6항에 따른 핵산 분자 또는 제7항에 따른 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포.
  9. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 청구항 제6항에 따른 핵산 분자 또는 청구항 제7항에 따른 벡터 및 일 이상의 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 박테리아 감염 치료용 약학적 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 국소 투여를 위한 제형이며,
    상기 제형은 크림, 젤, 연고, 로션, 폼, 현탁액, 스프레이, 에어로졸, 분말 에어로졸인 것인 박테리아 감염 치료용 약학적 조성물.
  11. 제9항에 있어서, 항균제를 추가로 포함하는 것인 박테리아 감염 치료용 약학적 조성물.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 항균제는 페니실린, 세파모스포린(cephamosporin), 무피로신(mupirocin), 카바페넴(carbapenems)으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것인 박테리아 감염 치료용 약학적 조성물.
  13. 제9항에 있어서,
    상기 폴리펩티드가 포함된 제어 방출 담체, 상기 폴리펩티드가 포함된 표적 전달 담체, 또는 상기 폴리펩티드가 포함된 제어 방출-표적 담체를 포함하는 것인 박테리아 감염 치료용 약학적 조성물.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 담체는 나노 입자, 미세 입자, 나노 캡슐, 마이크로 캡슐, 리포좀, 마이크로스피어, 하이드로겔, 고분자, 지질 복합체, 혈청 알부민, 항체, 사이클로덱스트린 및 덱스트란으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것인 박테리아 감염 치료용 약학적 조성물.
  15. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 포함하는 의료 장치용 코팅.
  16. 치료적, 예방적 또는 진단적 제제로의 사용을 위한 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드.
  17. 치료적, 예방적 또는 진단적 제제로의 사용을 위한 제6항에 따른 핵산 분자.
  18. 박테리아 감염을 치료하는데 있어서, 제13항에 따라 사용하기 위한 폴리펩티드.
  19. 박테리아 감염을 치료하는데 있어서, 제11항에 따라 사용하기 위한 핵산 분자.
  20. 인간을 제외한 박테리아 감염으로 고통받는 개체에게 치료학적 유효량의 제9항에 따른 약학적 조성물를 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체를 치료하는 방법.
  21. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공하는 단계;
    - 상기 핵산 분자로 숙주 세포를 형질전환시키는 단계;
    - 상기 폴리펩티드의 발현을 허용하는 조건하에 상기 숙주세포를 배양하는 단계;
    - 상기 세포로부터 상기 폴리펩티드를 수득하는 단계를 포함하는 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드의 제조방법.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 폴리펩티드는 N-말단 또는 C-말단 변형된 것인 폴리펩티드의 제조방법.
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