BRPI0707154B1

BRPI0707154B1 - Composição de vacina

Info

Publication number: BRPI0707154B1
Application number: BRPI0707154-0A
Authority: BR
Inventors: Arne Forsgren; Kristian Riesbeck
Original assignee: Arne Forsgren; Kristian Riesbeck
Priority date: 2006-01-17
Filing date: 2007-01-17
Publication date: 2019-05-07
Also published as: WO2007084053A1; SG175492A1; US20140350220A1; EA015561B1; NO20082827L; CN104436180B; IL192674A0; JP6008747B2; ES2809167T3; CN101374859A; US20150071956A1; IL259316B; BRPI0707154A2; CA2636566C; US20090246219A1; US8617565B2; SG10201600336RA; BRPI0707154B8; JP2009523790A; JP2016135770A

Abstract

proteína de haemophilus influenzae exposta na superfície (proteína e; pe). a presente invenção refere-se a uma proteína exposta na superfície (proteína e; pe), um fator de virulência, que pode ser detectada em haemophilus influenzae, tendo uma sequência de aminoácidos conforme descrita em seq id no 1, um fragmento imunogênico da dita proteína exposta na superfície, e uma proteína imunogênica recombinante (pe (a)) ou suas variantes truncadas com base na dita proteína exposta na superfície. as sequências de ácidos nucléicos, as vacinas, os plasmídios e os fagos, os hospedeiros não humanos, as sequências de ácidos nucléicos recombinantes, as proteínas de fusão e os produtos de fusão são também descritos. um método de produzir a dita proteína ou os seus fragmentos truncados de modo recombinante é também descrito.

Description

Campo da invenção

A presente invenção refere-se à proteína exposta na superfície E, um fator de virulência, que existe em todos os Haemophílus ínfluenzae encapsulados e não tipificáveis.

Antecedentes da invenção

Tanto o Haemophílus ínfluenzae tipo b (Hib) quanto o H. ínfluenzae não tipificável (NTHi) causam uma variedade de doenças em crianças e em adultos. O Hib causa meningite bacteriana e outras infecções invasivas em crianças abaixo da idade de 4 anos, enquanto que o NTHi foi isolado de casos de otite média, sinusite, epiglotite, traqueobronquite, e pneumonia e pode causar a sepse neonatal. Não há atualmente nenhuma vacina comercialmente disponível contra o NTHi, porém diversas vacinas estão em uso contra o Hib. Estas vacinas consistem no polissacarídeo capsular de Hib, o ribitol fosfato de polirribosila, conjugado a diversos veículos de proteínas (complexo da membrana externa meningocócica, toxóide tetânico, toxina diftérica mutante não-tóxica, ou toxóide diftérico) para superar a resposta imune fraca ao polissacarídeo capsular em crianças mais jovens do que 18 meses de idade. As proteínas da membrana externa (OMPs) de H. ínfluenzae são também consideradas serem veículos do ribitol fosfato de polirribosila, visto que elas são mostradas serem alvos dos anticorpos hospedeiros após as infecções com Hib e NTHi. Os anticorpos para as OMPs P1, P2, P4, P5, e P6 e uma proteína de 98 kDa foram testados na proteção ín vivo e em ensaios bactericidas ín vítro contra as infecções por H. ínfluenzae, com os anticorpos para P1, P4, e P6 mostrando atividade biológica contra as cepas de H. ínfluenzae tanto homólogas quanto heterólogas. A ausência de proteção heteróloga dos anticorpos para as outras OMPs é parcialmente devida à diversidade antigênica destas proteínas entre as diferentes cepas de H. ínfluenzae. Um antígeno ideal deve, portanto, estar tanto exposto sobre a superfície bacteriana quanto

Petição 870180161048, de 10/12/2018, pág. 10/18 antigenicamente bem conservado. Neste laboratório, uma proteína de membrana de 42 kDa (proteína D) que está amplamente distribuída e antigenicamente conservada entre ambas as cepas de Hib e NTHi foi isolada, clonada, seqüenciada, e mostrada ser um fator de patogenicidade e uma candidata de vacina possível (1 -5).

Duas décadas atrás, o Haemophilus influenzae e o M. catarrhalis foram mostrados exibirem uma forte afinidade pela IgD humana tanto solúvel quanto ligada à superfície (6). A ligação da IgD parece ser equiparada a uma interação similar com a IgD ligada à superfície no nível celular, um fenômeno que explica os fortes efeitos mitogênicos sobre os linfócitos humanos pelo H. influenzae e pelo M. catarrhalis (7-9). Uma proteína da membrana externa ligada a IgD de H. influenzae (proteína D) foi isolada e clonada, e mostrada ser um importante fator de patogenicidade (1-5). Entretanto, a proteína D não se liga universalmente a todos os mielomas de IgD (10).

Sumário da invenção

Em vista do fato que o H. influenzae foi verificado ser tal causa principal de infecções nas vias aéreas superiores e inferiores, há uma necessidade atual de desenvolver vacinas que possam ser usadas contra o H. influenzae.

O objetivo da presente invenção foi, portanto, descobrir em qual modo o H. influenzae interage com as células no corpo e interage com o sistema imune, e ser capaz de proporcionar um novo tipo de vacina.

De acordo com um aspecto, a presente invenção proporciona uma proteína exposta na superfície, a qual pode ser detectada no Haemophilus influenzae, tendo uma seqüência de aminoácidos de acordo com a ID de Seqüência N- 1, ou um fragmento, homólogo, equivalente funcional, derivado, degenerado ou produto de hidroxilação, sulfonação ou glicosilação ou outro produto de processamento secundário da mesma.

De acordo com um outro aspecto, a presente invenção proporciona um fragmento imunogênico da dita proteína exposta na superfície, fragmento este que pode ser detectado no Haemophilus influenzae, ou em suas variantes de ocorrência natural ou artificialmente modificadas.

De acordo com um aspecto adicional, a presente invenção proporciona uma proteína imunogênica recombinante baseada na proteína exposta na superfície acima mencionada, onde os aminoácidos nas posições 1 a 21 da ID de Sequência N- 1 foram removidos ou substituídos por um ou 5 mais aminoácidos. Em uma modalidade, os aminoácidos nas posições 1 a 21 da ID de Seqüência N-' 1 foram substituídos por uma seqüência de 0 a 21 aminoácidos opcionais. Em uma outra modalidade, a proteína imunogênica recombinante tem uma seqüência de aminoácidos de acordo com a ID de Seqüência N-' 2, ou um fragmento, homólogo, equivalente funcional, deriva10 do, degenerado ou produto de hidroxilação, sulfonação ou glicosilação ou outro produto de processamento secundário da mesma.

De acordo com um aspecto adicional, a presente invenção proporciona um peptídeo tendo uma seqüência de aminoácidos de acordo com a ID de Seqüência N'² 3, ou um fragmento, homólogo, equivalente funcional, 15 derivado, degenerado ou produto de hidroxilação, sulfonação ou glicosilação ou outro produto de processamento secundário da mesma.

De acordo com ainda um aspecto adicional, a presente invenção proporciona um peptídeo tendo uma seqüência de aminoácidos de acordo com a ID de Seqüência N^s 4, ou um fragmento, homólogo, equivalente fun20 cional, derivado, degenerado ou produto de hidroxilação, sulfonação ou glicosilação ou outro produto de processamento secundário da mesma.

De acordo com mais um aspecto adicional, a presente invenção proporciona um peptídeo tendo uma seqüência de aminoácidos de acordo com a ID de Seqüência N- 5, ou um fragmento, homólogo, equivalente fun25 cional, derivado, degenerado ou produto de hidroxilação, sulfonação ou glicosilação ou outro produto de processamento secundário da mesma.

De acordo com um aspecto adicional, a presente invenção proporciona um peptídeo tendo uma seqüência de aminoácidos de acordo com a ID de Seqüência N- 6, ou um fragmento, homólogo, equivalente funcional, 30 derivado, degenerado ou produto de hidroxilação, sulfonação ou glicosilação ou outro produto de processamento secundário da mesma.

De acordo com ainda um aspecto adicional, a presente invenção proporciona um peptídeo tendo uma seqüência de aminoácidos de acordo com a ID de Seqüência N- 7, ou um fragmento, homólogo, equivalente funcional, derivado, degenerado ou produto de hidroxilação, sulfonação ou glicosilação ou outro produto de processamento secundário da mesma.

De acordo com mais um aspecto adicional, a presente invenção proporciona um peptídeo tendo uma seqüência de aminoácidos de acordo com a ID de Seqüência N- 8, ou um fragmento, homólogo, equivalente funcional, derivado, degenerado ou produto de hidroxilação, sulfonação ou glicosilação ou outro produto de processamento secundário da mesma.

De acordo com um aspecto adicional, a presente invenção proporciona um peptídeo tendo uma seqüência de aminoácidos de acordo com a ID de Seqüência N- 9, ou um fragmento, homólogo, equivalente funcional, derivado, degenerado ou produto de hidroxilação, sulfonação ou glicosilação ou outro produto de processamento secundário da mesma.

De acordo com um outro aspecto, a presente invenção proporciona um peptídeo tendo uma seqüência de aminoácidos de acordo com a ID de Seqüência N² 10, ou um fragmento, homólogo, equivalente funcional, derivado, degenerado ou produto de hidroxilação, sulfonação ou glicosilação ou outro produto de processamento secundário da mesma.

De acordo com um outro aspecto, a presente invenção propor¹ ciona o uso de pelo menos uma proteína, fragmento ou peptídeo, conforme descrito acima, para a produção de um medicamento para a profilaxia ou o tratamento de uma infecção. Em uma modalidade, a infecção é causada pelo Haemophilus influenzae, e em uma outra modalidade, o Haemophilus in25 fluenzae é encapsulado ou não tipificável. Ainda em uma outra modalidade, o dito uso é para a profilaxia ou o tratamento de otite média, sinusite ou infecções do trato respiratório inferior, em crianças bem como em adultos com, por exemplo, doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD).

De acordo com um aspecto, a presente invenção proporciona 30 um medicamento compreendendo pelo menos uma proteína, fragmento ou peptídeo, conforme descrito acima, e um ou mais adjuvantes, veículos, excipientes, aglutinantes, veículos, conservantes, agentes de tamponamento, agentes emulsificantes, agentes de umedecimentos, ou compostos que facilitam a transfecção, farmaceuticamente aceitáveis.

De acordo com um outro aspecto, a presente invenção proporciona uma composição de vacina compreendendo pelo menos uma proteína, 5 fragmento ou peptídeo, conforme descrito acima. Em uma modalidade, a dita composição de vacina compreende pelo menos um di-, tri- ou multímero da dita proteína, fragmento ou peptídeo. Em uma outra modalidade, a composição de vacina adicionalmente compreende um ou mais adjuvantes, veículos, excipientes, aglutinantes, veículos, conservantes, agentes de tamponamento, 10 agentes emulsificantes, agentes de umedecimentos, ou compostos que facilitam a transfecção, farmaceuticamente aceitáveis. Ainda em uma outra modalidade, a dita composição de vacina compreende pelo menos uma vacina adicional, e em mais uma outra modalidade, ela compreende uma porção imunogênica de uma outra molécula, onde a porção imunogênica de uma 15 outra molécula pode ser escolhida a partir do grupo compreendendo a Proteína D de H. influenzae (EP 594 610), MID de Moraxella catarrhalis (WO 03/004651, WO 97/41731 e WO96/34960), UspA1 ou UspA2 de Moraxella catarrhalis (WO93/03761), e a proteína da membrana externa ou a cápsula de carboidrato, de qualquer patógeno do trato respiratório, ou oligonucleotí20 deos de DNA, tais como o motivo de CpG.

Em um aspecto, a presente invenção refere-se a uma seqüência de ácidos nucléicos codificando uma proteína, fragmento ou peptídeo, conforme descrito acima, bem como seus homólogos, polimorfismos, degenerados e variantes de remoção. Em uma modalidade, a dita seqüência de áci25 dos nucléicos está fundida a pelo menos um outro gene.

Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a um plasmídio ou fago compreendendo uma seqüência de ácidos nucléicos como descrita acima.

Em mais uma outra modalidade, a presente invenção refere-se a 30 um hospedeiro não humano compreendendo pelo menos um plasmídio conforme descrito acima e capaz de produzir uma proteína, fragmento ou peptídeo, conforme discutido acima, bem como seus homólogos, polimorfismos, degenerados e variantes de remoção, hospedeiro este que é escolhido entre bactérias, leveduras e plantas. Em uma modalidade, o dito hospedeiro é a E coli.

Ainda em um outro aspecto, a presente invenção proporciona uma proteína de fusão ou polipeptídeo, em que uma proteína, fragmento ou peptídeo conforme descrito acima é combinado com pelo menos uma outra proteína, pelo uso de uma seqüência de ácidos nucléicos recombinante conforme discutida acima. Em uma modalidade, a dita proteína de fusão é um di-, tri ou multímero de uma proteína, fragmento ou peptídeo conforme discu10 tido acima.

Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um produto de fusão, em que uma proteína, fragmento ou peptídeo conforme descrito acima está covalentemente, ou por qualquer outro meio, ligado a uma proteína, carboidrato ou matriz.

Em mais um outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método de isolamento de uma proteína, fragmento ou peptídeo conforme descrito acima, o dito método compreendendo as etapas:

a) desenvolver o Haemophilus influonzae ou a E coli compreendendo o DNA codificando para a dita proteína, fragmento ou peptídeo, cole- tar as bactérias e isolar as membranas externas ou os corpos de inclusão;

b) solubilizar os corpos de inclusão com um agente de solvatação forte;

c) adicionar um agente de renaturação; e

d) dializar a suspensão resultante contra um tampão com um pH 25 de 8 a 10.

Em uma modalidade do dito método, o agente de solvatação é o cloridrato de guanídio, e em uma outra modalidade, o agente de renaturação é a arginina.

Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a um medi30 camento ou uma composição de vacina conforme discutida acima, compreendendo a dita proteína de fusão ou polipeptídeo, ou o dito produto de fusão.

Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um método de prevenir ou tratar uma infecção em um indivíduo, compreendendo administrar uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um medicamento ou uma composição de vacina conforme descrita acima. Em uma modalidade, a dita infecção é causada pelo Haemophilus influenzae, tanto 5 encapsulado quanto não tipificável, e em mais uma outra modalidade, a infecção é escolhida a partir do grupo que consiste em otite média, sinusite ou infecções do trato respiratório inferior.

A presente invenção refere-se à Proteína E, em particular aos polipeptídeos de Proteína E e aos polinucleotídeos de Proteína E, aos 10 materiais recombinantes e aos métodos para a sua produção. Em um outro aspecto, a invenção refere-se aos métodos para a utilização de tais polipeptídeos e polinucleotídeos, incluindo a prevenção e o tratamento de doenças microbianas, entre outras. Em um aspecto adicional, a invenção refere-se aos ensaios diagnósticos para detectar doenças associadas com 15 infecções microbianas e condições associadas com tais infecções, tais como os ensaios para detectar a expressão ou a atividade dos polinucleotídeos ou polipeptídeos de Proteína E.

Diversas alterações e modificações dentro do espírito e do escopo da invenção descrita tornar-se-ão prontamente aparentes para 20 aqueles versados na técnica a partir da leitura das descrições que se • seguem e a partir da leitura das outras partes da presente descrição. Descrição das figuras figura 1. A proteína E de Haemophilus influenzae de 16,3 kDa é detectada por uma proteína de mieloma de IgD(À). Em A, demonstra-se a 25 análise de citometria de fluxo da expressão de pE no H. influenzae 772. Mostram-se as análises de SDS-PAGE e transferência Western blot (B) e de eletroforese em gel de poliacrilamida-SDS bidimensional (C) das proteínas da membrana externa tratadas com Empigen® de H. influenzae MinnA. Os extratos das proteínas da membrana externa são mostrados antes (S) e 30 depois da separação sobre Q-Sepharose (C). A seta no painel C indica a localização predita para a pE com base em uma transferência Western blot (usando IgD(À) como uma sonda) de um gel correspondente. Em A, as bactérias foram carregadas com a proteína de mieloma de IgD(À), seguido por incubação com o pAb anti-lgD conjugado ao FITC em coelho e análise de citometria de fluxo. Em B, mostram-se o SDS-gel (corante) colorido com azul de Coomassie e a transferência Western blot sondada com a IgD(X) de 5 mieloma humana, seguido por incubação com os anticorpos policlonais antilgD humana em cabra conjugados à peroxidase da raiz forte. As amostras foram fervidas na presença de 2-mercaptoetanol por 10 min antes da carga.

figura 2. Perfis de citometria de fluxo de E. coli que expressa a pE comparada ao H. influenzae 3655 tipo selvagem e um mutante deficiente 10 de pE. A E. coli abrigando um vetor pUC18 vazio (A) é comparada às bactérias transformadas com pUC18 contendo DNA genômico de H. influenzae 772 (genes HI0175 a HI0178) (B). Mostra-se a expressão de pE no H. influenzae não tipificável 3655 tipo selvagem (C) e no mutante correspondente (D). A cepa de E. coli JM83 e o H. influenzae foram 15 desenvolvidos em culturas líquidas durante a noite. A E. coli foi incubada com a IgD(X) de mieloma humana sobre gelo. Após 1 h e lavagens, o pAb anti-lgD humana em coelho conjugado ao FITC foi adicionado por uns 30 min adicionais, seguido por etapas de lavagens e análise de citometria de fluxo subseqüente. O mesmo procedimento foi feito com o H. influenzae 20 3655 ou o mutante de pE derivado usando os anticorpos policlonais anti-pE em coelho específicos e o pAb anticoelho em cabra conjugado ao FITC.

figura 3. Expressão de pE de H. influenzae e espécies relacionadas como revelada por citometria de fluxo e um soro de mieloma de IgD(À). Vinte e duas cepas de NTHi e 27 cepas da espécie de haemophilus 25 ou bactérias relacionadas foram analisadas. As bactérias foram desenvolvidas até a fase estacionária e incubadas com uma IgD(X) de mieloma humana sobre gelo. Após 1 h e lavagens, os anticorpos policlonais (pAb) anti-lgD humana em coelho conjugados ao FITC foram adicionados por uns 30 min adicionais, seguidos por etapas de lavagens e análises de 30 citometria de fluxo subseqüentes.

figura 4. A pE é expressa em NTHi e H. influenzae encapsulado conforme revelado por transferências Western blot. As proteínas bacterianas a partir das cepas indicadas foram preparadas usando Empigen® e submetidas a uma SDS-gel, seguida por transferência Western blot sondada com a IgD(À) de mieloma humana e o pAb policlonal anti-lgD humana em cabra conjugado à peroxidase da raiz forte como anticorpos de detecção.

figura 5. pE22-160 recombinante com base na seqüência de

NTHi 772 em comparação com a pE nativa a partir do H. influenzae MinnA. Em A, a seqüência amino terminal do fragmento A derivado de pE comparada com a seqüência amino terminal predita da proteína nativa pE. Em B, mostra-se uma ilustração esquemática de pE(A) com a marca de 10 Histidina. Em C, o tamanho e a pureza são demonstrados em uma PAGE colorida com Coomassie. Em De E, um extrato da proteína da membrana externa (OMP) a partir do H. influenzae MinnA é comparado à pE(A) produzida de modo recombinante em um gel colorido com Coomassie e na Transferência Western blot, respectivamente. Em A, a seqüência de 15 peptídeos de sinal foi removida além do resíduo de aminoácido glutamina 21.

Nove aminoácidos foram derivados do vetor de expressão pET26(+), conforme indicado. Os números representam as posições dos aminoácidos, começando a partir do início traducional de pE. A pE(A) recombinante foi produzida em E. coli, purificada, e submetida à degradação de Edman para 20 analisar o sítio de divagem de peptidase de sinal. Em De E, dois géis foram corridos simultaneamente, um foi colorido com azul-brilhante de Coomassie e um foi manchado sobre as membranas Immobilon-P, sondados com a proteína de mieloma de IgD(X) humana, seguido por incubação com os anticorpos secundários conjugados à peroxidase da raiz forte apropriados. A 25 fração de OMP foi purificada usando Empigen®, conforme descrito em Material e Métodos.

figura 6. A proteína E é extraordinariamente conservada. Mostrou-se a freqüência das mutações pontuais em 13 a 31 cepas de Haemophilus. influenzae (Tabela 2) incluindo os isolados tanto encapsulados 30 quanto não tipificáveis. Os resultados foram obtidos por seqüenciamento usando iniciadores de flanqueio. Todas as seqüências foram comparadas à seqüência de pE do H. influenzae Rd que foi usada como uma seqüência de referência e é mostrada aqui.

figura 7. O perfil de hidropatia da pE. As partes hidrofóbicas e hidrofílicas dos resíduos de aminoácidos individuais são indicadas. O peptídeo de sinal é também traçado. O dado foi obtido por utilização de um método padrão conforme descrito (21).

figura 8. SDS-PAGE demonstrando a pE22-160 recombinante (fragmento A) e uma série de fragmentos truncados designados B a H. Em A, mostra-se um esboço dos diferentes fragmentos, enquanto em B, demonstra-se urna SDS-PAGE. O DNA codificando as diversas proteínas foi ligado ao vetor de expressão pET26(+) e expresso de modo recombinante em E. coli. As proteínas superexpressas resultantes foram purificadas sobre resinas de níquel e submetidas à separação sobre uma SDS-PAGE, seguida por coloração com azul-brilhante de Coomassie.

figura 9. Uma cepa mutante deficiente de pE (NTHi 3655) tem uma capacidade 100 a 1.000 vezes menor de induzir a otite média aguda em ratos. A infecção foi induzida em ratos machos Sprague-Dawley por uma incisão ventral na linha do meio no pescoço, seguida por injeção na cavidade média da orelha dos números indicados de bactérias em 0,05 ml. O dado mostrado é do dia 3 da provocação e é representativo de cinco 20 animais em cada grupo.

figura 10. Concentrações médias dos anticorpos de IgG e IgA dirigidos contra a pE em soros de grupos de idades diferentes. Os anticorpos anti-pE foram analisados por um ELISA de sanduíche usando a pE(A) recombinante como moderador. A pureza da pE(A) foi conforme indicada na 25 Figura 5.

figura 11. A pE é conservada extraordinariamente dentro de diferentes cepas de haemophílus. O gene pe foi seqüenciado no H. ínfluenzae encapsulado tipo a (n = 2), b (n = 2), c (n = 2), d (n = 1), e (n = 2), e f (n = 3), no NTHi (n = 8), no H. ínfluenzae biovar aegypticus (n = 6) e no H.

aegypticus (n = 5), usando iniciadores de flanqueio. Rd indica a cepa de H. ínfluenzae Rd (Hi0178) e 772 a cepa de NTHi 772. Os números 65 a 577 correspondem às cepas resumidas na Tabela 1.

Descrição da invenção

Antes de explicar a presente invenção em detalhe, é importante entender que a invenção não está limitada neste pedido aos detalhes das modalidades e das etapas descritas neste documento. Os exemplos mencionados são ilustrativos da invenção, porém não a limitam de modo algum. A invenção é capaz de outras modalidades e de ser praticada ou realizada em uma variedade de modos. É para ser entendido que a fraseologia e a terminologia empregadas neste documento são para o propósito de descrição e não de limitação.

O presente pedido descreve a clonagem e a expressão de uma nova proteína da membrana externa de H. influenzae, designada proteína E (pE). A proteína foi descoberta usando um soro de mieloma de IgD (λ) humana com afinidade específica pela pE.

Para maximizar a produção da pE recombinante, manufaturouse um fragmento de pE truncado consistindo nos resíduos de aminoácidos Iisina22 até lisinal 60. O peptídeo de sinal N-terminal incluindo o aminoácido glutamina21 foi, assim, removido e substituído pelo peptídeo líder, além de nove resíduos que se originam do vetor pET26(+). A pE truncada (et al.„ pE22-160) foi designada pE(A).

A presente invenção compreende a proteína da membrana externa de Haemophilus pE e os peptideos derivados da pE pE22-60, pE2295, pE22-125, pE41-68, pE56-125, pE56-160, pE86-160, pE115-160, e os seus di-, tri- ou oligômeros. Em particular, as sequências da pE ou os peptideos derivados que são expostos na superfície recebem uma maior prioridade.

Assim, as composições de vacina de acordo com a presente invenção compreendem, como componentes imunogênicos, uma proteína exposta na superfície, a qual pode ser detectada em todos os Haemophilus influenzae, um fragmento imunogênico da dita proteína exposta na superfície, uma proteína imunogênica recombinante baseada na dita proteína exposta na superfície, uma proteína imunogênica recombinante tendo uma seqüência de aminoácidos de acordo com a ID de Seqüência N^s 2, e/ou um peptídeo tendo uma seqüência de aminoácidos de acordo com as ID de Seqüência N-s 3-10, ou um fragmento, homólogo, equivalente funcional, derivado, degenerado ou produto de hidroxilação, sulfonação ou glicosilação ou outro produto de processamento secundário das mesmas. As 5 composições de vacina podem também compreender uma proteína de fusão ou polipeptídeo, ou um produto de fusão de acordo com a presente invenção, como componentes imunogênicos. Os componentes imunogênicos são capazes de produzir um anticorpo ou outra resposta imune para o Haemophilus influenzae, onde os anticorpos produzidos inibem a 10 patogênese da bactéria Haemophilus influenzae para as células do paciente.

Uma dose imunogênica de uma composição de vacina de acordo com a invenção é uma que gera, após a administração, uma resposta imune humoral e/ou celular detectável em comparação com uma resposta imune padrão antes da administração.

As seqüências nucléicas, usadas nas composições de vacina da presente invenção para gerar os antígenos, podem ser inseridas em qualquer de uma ampla variedade de vetores de expressão, por uma variedade de procedimentos. Tais procedimentos são considerados serem conhecidos por aqueles versados na técnica.

As composições de vacina são facilmente efetuadas usando métodos e técnicas bastante conhecidos, e podem ser administradas em uma variedade de modos, de preferência em um modo parenteral ou intranasal. As formulações adequadas para a administração parenteral ou intranasal incluem as soluções de injeções estéreis aquosas e não-aquosas, 25 as quais podem conter antioxidantes, tampões, bacteriostatos e solutos que tornam a formulação isotônica com o fluido corpóreo do paciente em questão; e as suspensões estéreis aquosas e não-aquosas, as quais podem incluir os agentes de suspensão ou os agentes espessantes. O ingrediente imunogênico ativo é freqüentemente misturado com excipientes que sejam 30 farmaceuticamente aceitáveis, por exemplo, a água, a solução salina, a dextrose, o glicerol, o etanol, ou similar. Além disso, a composição de vacina pode também conter quantidades pequenas de substâncias auxiliares, tais como agentes de umedecimentos ou emulsificantes, agentes de tamponamento de pH, aglutinantes, veículos ou conservantes.

As composições de vacina podem também incluir adjuvantes para intensificar a imunogenicidade da composição, tais como os Adjuvantes 5 de Freund e outros sistemas conhecidos na técnica. Os componentes imunogênicos das composições de vacina, et al., as proteínas, os fragmentos, os peptídeos, as proteínas de fusão ou os polipeptídeos, ou os produtos de fusão da presente invenção, podem ser formulados na vacina como formas neutras ou de sais.

A dosagem das composições de vacina dependerá da atividade específica da vacina e pode ser prontamente determinada por experimentação de rotina. As composições de vacina são administradas em tal quantidade conforme for terapeuticamente eficaz e imunogênica, e a quantidade depende do paciente.

A invenção refere-se aos polipeptídeos e polinucleotídeos de

Proteína E conforme descritos em maior detalhe abaixo. Em particular, a invenção refere-se aos polipeptídeos e polinucleotídeos de Proteína E de H. influenzae não tipificável. Os polipeptídeos de Proteína E têm uma seqüência de sinal e estão expostos na superfície das bactérias. O peptídeo 20 de sinal está localizado a partir do resíduo 1 até o resíduo 20 do polipeptídeo • de Proteína E.

Uma referência à Proteína E neste documento é uma referência a quaisquer dos peptídeos, fragmentos imunogênicos, fusões, polipeptídeos ou proteínas da invenção, discutidos neste documento (tais 25 como a SEQ ID NO: 1 com ou sem a seqüência de sinal). Um polinucleotídeo codificando a Proteína D refere-se a qualquer seqüência de polinucleotídeos codificando quaisquer dos peptídeos, fragmentos imunogênicos, fusões, polipeptídeos ou proteínas da invenção, discutidos neste documento.

O termo compreendendo, neste documento, altemativamente pode ser substituído pelo termo consistindo em.

A invenção refere-se especialmente aos polinucleotídeos e polipeptídeos codificados de Proteína E listados neste documento.

Entende-se que as seqüências descritas na Listagem de

Seqüências abaixo como DNA representam uma exemplificação de uma modalidade da invenção, visto que aqueles versados reconhecerão que tais seqüências podem ser empregadas proveitosamente nos polinucleotídeos em geral, incluindo os ribopolinucleotídeos.

As seqüências dos polinucleotídeos de Proteína E são especificadas em SEQ ID NO: 11 (a partir da cepa de ntHi 772). As seqüências dos polipeptídeos codificados de Proteína E são especificadas 10 nas SEQ ID NOs:1 (a partir da cepa de ntHi 772). 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10.

Polipeptídeos

Em um aspecto da invenção, proporcionam-se polipeptídeos de H. influenzae (em particular, o /7. influenzae não tipificável) referidos neste documento como Proteína E e polipeptídeos de Proteína E, bem como as 15 suas variantes biológica, diagnostica, profilática, clínica ou terapeuticamente úteis, e as composições que os compreende.

A presente invenção adicionalmente proporciona:

(a) um polipeptídeo isolado, o qual compreende uma seqüência de aminoácidos que tem pelo menos 85% de identidade, preferivelmente pelo menos 90% de identidade, mais preferivelmente pelo menos 95% de identidade, mais preferivelmente ainda pelo menos 97-99% de identidade, ou identidade exata, com aquela de qualquer seqüência de SEQ ID NOs: 110;

(b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo isolado 25 compreendendo uma seqüência de polinucleotídeos, a qual tem pelo menos

85% de identidade, preferivelmente pelo menos 90% de identidade, mais preferivelmente pelo menos 95% de identidade, ainda mais preferivelmente pelo menos 97-99% de identidade, ou identidade exata, com qualquer seqüência de SEQ ID NO: 11 sobre o comprimento inteiro da seqüência 30 selecionada de SEQ ID NO: 0; ou (c) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo isolado compreendendo uma seqüência de polinucleotídeos codificando um polipeptídeo que tem pelo menos 85% de identidade, preferivelmente pelo menos 90% de identidade, mais preferivelmente pelo menos 95% de identidade, ainda mais preferivelmente pelo menos 97-99% de identidade, ou identidade exata, com a seqüência de aminoácidos de qualquer seqüência de SEO ID NOs: 1-10.

Os polipeptídeos de Proteína E proporcionados nas SEQ ID NOs: 1-10 são os polipeptídeos de Proteína E a partir das cepas de H. influenzae não tipificáveis. Determinaram-se seqüências de Proteína E adicionais a partir das cepas de H. influenzae listadas na Tabela 1.

A invenção também proporciona um fragmento imunogênico de um polipeptídeo de Proteína E, ou seja, uma porção contígua do polipeptídeo de Proteína E que tem a mesma, ou substancialmente a mesma, atividade imunogênica que o polipeptídeo compreendendo a seqüência de aminoácidos correspondente, selecionada a partir de SEQ ID NOs: 1-10; isto 15 quer dizer, o fragmento (se necessário quando acoplado a um veículo) é capaz de causar uma resposta imune, que reconhece o polipeptídeo de Proteína E. Alternativamente, ou além disso, o fragmento imunogênico pode conservar uma função de ligação a IgD da proteína de tamanho natural (conforme descrito na seção de Exemplo, por exemplo, a capacidade de 20 ligar a IgD(À) a partir do Sito de Ligação (Birmingham, Inglaterra). Tal • fragmento imunogênico pode incluir, por exemplo, o polipeptídeo de Proteína E não tendo uma seqüência líder N-terminal, e/ou um domínio de transmembrana e/ou um domínio de âncora C-termlnal. Em um aspecto preferido, o fragmento imunogênico de Proteína E de acordo com a invenção 25 compreende substancialmente todo o domínio extracelular de um polipeptídeo que tem pelo menos 85% de identidade, preferivelmente pelo menos 90% de identidade, mais preferivelmente pelo menos 95% de identidade, mais preferivelmente ainda pelo menos 97-99% de identidade, com aquele de uma seqüência selecionada a partir de SEQ ID NOs: 1-10 30 sobre o comprimento inteiro da dita seqüência.

Um fragmento é um polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácidos que é inteiramente a mesma que parte, porém não toda, de qualquer seqüência de aminoácidos de qualquer polipeptídeo da invenção. Como com os polipeptídeos de Proteína E, os fragmentos podem estar livres, ou compreendidos dentro de um polipeptídeo maior do qual eles formam uma parte ou região, mais preferivelmente como uma região contínua única 5 em um polipeptídeo maior único. Um fragmento pode, portanto, ser mais curto do que a seqüência nativa de tamanho natural, ou, se compreendido dentro de um polipeptídeo maior, pode ser uma seqüência nativa de tamanho natural ou uma proteína de fusão mais longa.

Os fragmentos preferidos incluem, por exemplo, os polipeptídeos de truncamento tendo uma porção de uma seqüência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NOs: 1-10 ou de suas variantes, tal como uma série contínua de resíduos que inclui uma seqüência de aminoácidos amino- e/ou carboxila-terminal. As formas de degradação dos polipeptídeos da invenção produzidas por, ou em, uma célula hospedeira são também preferidas. Adicionalmente preferidos são os fragmentos caracterizados por características estruturais ou funcionais, tais como os fragmentos que compreendem a hélice alfa e as regiões formadoras da hélice alfa, a folha beta e as regiões formadoras da folha beta, a curva e as regiões formadoras de curvas, a espiral e as regiões formadoras de espirais, as regiões 20 hidrofílicas, as regiões hidrofóbicas, as regiões anfipáticas alfa, as regiões antipáticas beta, as regiões flexíveis, as regiões formadoras de superfície, a região de ligação ao substrato, e as regiões de alto índice antigênico.

Os fragmentos preferidos adicionais incluem um polipeptídeo isolado compreendendo uma seqüência de aminoácidos tendo pelo menos 25 15, 20, 30, 40, 50 ou 100 aminoácidos contíguos de uma seqüência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NOs: 1-10, ou um polipeptídeo isolado compreendendo uma seqüência de aminoácidos tendo pelo menos 15, 20, 30, 40, 50 ou 100 aminoácidos contíguos, truncados ou removidos de uma seqüência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NOs: 1-10.

Os fragmentos ainda preferidos adicionais são aqueles que compreendem um epitopo de célula B, por exemplo, aqueles fragmentos/peptídeos descritos no Exemplo 10.

Os fragmentos dos polipeptídeos da invenção podem ser empregados para produzir o polipeptídeo de tamanho natural correspondente por síntese de peptídeos; portanto, estes fragmentos podem ser empregados como intermediários para produzir os polipeptídeos de tamanho natural da invenção.

Particularmente preferidas são as variantes nas quais diversos, 5-10, 1-5, 1-3, 1-2 ou 1 aminoácido é substituído, removido, ou adicionado em qualquer combinação.

Os polipeptídeos, ou os fragmentos imunogênicos, da invenção podem estar na forma da proteína madura ou podem ser parte de uma proteína maior, tal como um precursor ou uma proteína de fusão. É freqüentemente vantajoso incluir uma seqüência de aminoácidos adicional que contenha seqüências secretórias ou líderes, pró-seqüências, seqüências que auxiliem na purificação, tais como resíduos múltiplos de histidina, ou uma seqüência adicional para a estabilidade durante a produção recombinante. Ademais, considera-se também a adição de polipeptídeo exógeno ou extremidade lipídica ou seqüências de polinucleotídeos para aumentar o potencial imunogênico da molécula final.

Em um aspecto, a invenção refere-se às proteínas de fusão geneticamente engenheiradas, solúveis, compreendendo um polipeptídeo da presente invenção, ou um fragmento dele, e diversas porções das regiões constantes de cadeias pesadas ou leves de imunoglobulinas de diversas subclasses (IgG, IgM, IgA, IgE). É preferida como uma imunoglobulina a parte constante da cadeia pesada da IgG humana, particularmente a lgG1, onde a fusão ocorre na região de articulação. Em uma modalidade particular, a parte de Fc pode ser removida simplesmente por incorporação de uma seqüência de clivagem, a qual pode ser clivada com o fator de coagulação sanguíneo Xa.

Ademais, esta invenção refere-se aos processos para a preparação destas proteínas de fusão por engenharia genética, e ao uso delas para o exame, a diagnose e a terapia de fármacos. Um aspecto adicional da invenção também se refere aos polinucleotídeos codificando tais proteínas de fusão. Os exemplos de tecnologia de proteínas de fusão podem ser encontrados nos Pedidos de Patentes Internacionais N⁹s

WO94/29458 e WO94/22914.

As proteínas podem estar quimicamente conjugadas, ou ser expressas como proteínas de fusão recombinantes, permitindo que níveis aumentados sejam produzidos em um sistema de expressão, em comparação com a proteína não fundida. O par de fusão pode auxiliar em proporcionar epítopos auxiliadores T (par de fusão imunológico), preferivelmente epítopos auxiliadores T reconhecidos por seres humanos, ou 10 auxiliar na expressão da proteína (reforçador da expressão) em rendimentos maiores do que a proteína recombinante nativa. De preferência, o par de fusão será tanto um par de fusão imunológico quanto um par reforçador da expressão.

Os pares de fusão incluem a proteína D de Haemophilus 15 influenzae (EP 594610) e a proteína não estrutural do vírus influenza, NS1 (hemaglutinina). Um outro par de fusão é a proteína conhecida como Omp26 (WO 97/01638). Um outro par de fusão é a proteína conhecida como LytA. De preferência, a porção C terminal da molécula é usada. A LytA é derivada de Streptococcus pneumoniae, que sintetiza uma N-acetil-L-alanina amidase, 20 amidase LytA, (codificada pelo gene lytA (Gene, 43 (1986) páginas 265272)1, uma autolisina que degrada especificamente certas ligações na cadeia principal de peptidoglicano. O domínio C-terminal da proteína LytA é responsável pela afinidade pela colina ou por alguns análogos de colina, tais como DEAE. Esta propriedade tem sido explorada para o desenvolvimento 25 de plasmídios de expressão de C-LytA de E. coli, úteis para a expressão de proteínas de fusão. A purificação das proteínas híbridas contendo o fragmento de C-LytA em sua extremidade de amino foi descrita [Biotechnology: 10, (1992), páginas 795-798}. É possível usar a porção de repetição da molécula de LytA encontrada na extremidade de C terminal que 30 começa no resíduo 178, por exemplo, os resíduos 188 - 305.

A presente invenção também inclui as variantes dos polipeptídeos antes mencionados, ou seja, os polipeptídeos que variam dos referentes por substituições de aminoácidos conservativas, pelo que um resíduo é substituído por um outro com características similares. Tais substituições típicas são entre Ala, Vai, Leu e lie; entre Ser e Thr; entre os resíduos ácidos Asp e Glu; entre Asn e Gin; e entre os resíduos básicos Lys e Arg; ou os resíduos aromáticos Phe e Tyr.

Os polipeptídeos da presente invenção podem ser preparados em qualquer modo adequado. Tais polipeptídeos incluem os polipeptídeos isolados de ocorrência natural, os polipeptídeos produzidos de modo recombinante, os polipeptídeos sinteticamente produzidos, ou os 10 polipeptídeos produzidos por uma combinação destes métodos. Os meios para preparar tais polipeptídeos são bastante entendidos na técnica.

É mais preferido que um polipeptídeo da invenção seja derivado do H. influenzae não tipificável, entretanto, ele pode preferivelmente ser obtido a partir de outros organismos do mesmo gênero taxonômico. Um 15 polipeptídeo da invenção pode também ser obtido, por exemplo, a partir de organismos da mesma família ou ordem taxonômica.

Polinucleotídeos

É um objetivo da invenção proporcionar polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos de Proteína E, particularmente polinucleotídeos 20 que codificam os polipeptídeos neste documento designados Proteína E.

• Em uma modalidade particularmente preferida da invenção, os polinucleotídeos compreendem uma região codificando os polipeptídeos de Proteína E compreendendo as seqüências especificadas em SEQ ID NO: 11, que incluem o gene de tamanho natural, ou uma variante do mesmo.

Os polinucleotídeos de Proteína E proporcionados na SEQ ID

NO: 11 são os polinucleotídeos de Proteína E da cepa de H. influenzae não tipificável 772. Outras seqüências foram determinadas de genes codificando a proteína E das cepas de /7. influenzae listadas na Tabela 1.

Como um aspecto adicional da invenção, proporcionam-se moléculas de ácidos nucléicos isoladas codificando e/ou expressando os polipeptídeos e os polinucleotídeos de Proteína E, particularmente os polipeptídeos e os polinucleotídeos de Proteína E de H. influenzae não tipificável, incluindo, por exemplo, os RNAs não processados, os RNAs de ribozimas, os mRNAs, os cDNAs, os DNAs genômicos, os B- e Z-DNAs. As modalidades adicionais da invenção incluem os polinucleotídeos e os polipeptídeos biológica, diagnostica, profilática, clínica ou terapeuticamente úteis, e as suas variantes, e as composições que os compreendem.

Um outro aspecto da invenção refere-se aos polinucleotídeos isolados, incluindo pelo menos um gene de tamanho natural, que codifica um polipeptídeo de Proteína E tendo uma sequência de aminoácidos deduzida de SEQ ID NOs: 1-10, e ao polinucleotídeos exatamente relacionados a eles e suas variantes.

Em uma outra modalidade particularmente preferida, a invenção refere-se ao polipeptídeo de Proteína A de um H. ínfluenzae não tipificável compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NOs: 1-10 ou uma variante da mesma.

Utilizando a informação proporcionada neste documento, tal como uma seqüência de polinucleotídeos especificada em SEQ ID NO: 11, pode ser obtido um polinucleotídeo da invenção codificando os polipeptídeos de Proteína E usando métodos padrões de clonagem e exame, tais como aqueles para a clonagem e o seqüenciamento de fragmentos de DNA cromossòmico a partir de bactérias, usando células da cepa de H. ínfluenzae não tipificável 3224A (ou 772) como material de partida, seguidos por obtenção de um clone de tamanho natural. Por exemplo, para obter uma seqüência de polinucleotídeos da invenção, tal como uma seqüência de polinucleotídeos dada na SEQ ID NO: 0, tipicamente uma biblioteca de clones de DNA cromossòmico da cepa de H. ínfluenzae não tipificável 3224A (ou 772) em E. coli, ou algum outro hospedeiro adequado, é sondada com um oligonucleotídeo radiomarcado, preferivelmente um 17-mero ou maior, derivado de uma seqüência parcial. Os clones que carregam DNA idêntico àquele da sonda podem então ser distinguidos usando condições de hibridização severas. Por seqüenciamento dos clones individuais assim identificados por hibridização com iniciadores de seqüenciamento projetados a partir da seqüência de polipeptídeos ou de polinucleotídeos original, é então possível prolongar a seqüência de polinucleotídeos em ambas as direções, para determinar uma seqüência de gene de tamanho natural.

Convenientemente, tal seqüenciamento é efetuado, por exemplo, usando

DNA de fita dupla desnaturado, preparado a partir de um clone de plasmídio.

As técnicas adequadas são descritas por Maniatis, T., Fritsch, E.F. e Sambrook et al., MOLECULAR CLONING. A LABORATORY MANUAL, 2^âEd.; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova York (1989). (vide, em particular, Screening By Hybridization 1.90 e Sequencing Denatured Double-Stranded DNA Templates 13.70). O seqüenciamento de

DNA genòmico direto pode também ser efetuado para obter uma seqüência de gene de tamanho natural. Ilustrativo da invenção, o polinucleotídeo especificado em SEO ID NO: 11 foi descoberto em uma biblioteca de DNA derivada de H. influenzae não tipificável.

Além disso, cada seqüência de DNA especificada em SEQ ID

NO: 11 contém um quadro de leitura aberto codificando uma proteína tendo aproximadamente o numero de resíduos de aminoácidos apresentados em SEQ ID NO: 1, com um peso molecular deduzido que pode ser calculado usando os valores de pesos moleculares dos resíduos de aminoácidos bastante conhecidos para aqueles versados na técnica.

Os polinucleotídeos de SEQ ID NO: 0, entre o códon de • iniciação e o códon de interrupção, codificam, respectivamente, o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1.

Em um aspecto adicional, a presente invenção proporciona um polinucleotídeo isolado compreendendo ou consistindo em:

(a) uma seqüência de polinucleotídeos que tem pelo menos 85% de identidade, preferivelmente pelo menos 90% de identidade, mais preferivelmente pelo menos 95% de identidade, ainda mais preferivelmente pelo menos 97-99% de identidade, ou identidade exata, com qualquer seqüência de polinucleotídeos de SEQ ID NO: 11 sobre o comprimento inteiro da seqüência de polinucleotídeos de SEQ ID NO: 0; ou (b) uma seqüência de polinucleotídeos codificando um polipeptídeo que tem pelo menos 85% de identidade, preferivelmente pelo menos 90% de identidade, mais preferivelmente pelo menos 95% de identidade, ainda mais preferivelmente pelo menos 97-99% de identidade, ou 100%. de identidade exata, com qualquer seqüência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NOs: 1-10 (ou seu fragmento), sobre o comprimento inteiro da seqüência de aminoácidos a partir de SEQ ID NOs: 1-10 (ou fragmento).

Um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo da presente invenção, incluindo os homólogos e os ortólogos de espécies diferentes do H. influenzae não tipificável, pode ser obtido por um processo que compreende as etapas de examinar uma biblioteca apropriada, sob condições de hibridização severas (por exemplo, usando uma temperatura na faixa de 45 65^SC e uma concentração de SDS de 0,1 -1 %), com uma sonda marcada ou detectável consistindo em, ou compreendendo, qualquer seqüência selecionada a partir de SEQ ID NO: 11 ou um fragmento dela; e isolar um gene de tamanho natural e/ou clones genômicos contendo a dita seqüência de polinucleotídeos.

A invenção proporciona uma seqüência de polinucleotídeos idêntica, sobre o seu comprimento inteiro, a uma seqüência de codificação (quadro de leitura aberto) especificada em SEQ ID NO: 11. Também é proporcionada pela invenção uma seqüência de codificação para um polipeptídeo maduro ou um fragmento dele, sozinha, bem como uma seqüência de codificação para um polipeptídeo maduro ou um fragmento em quadro de leitura com uma outra seqüência de codificação, tal como uma seqüência codificando uma seqüência líder ou secretória, uma seqüência de pré-, ou pró- ou pré-pró-proteína. O polinucleotídeo da invenção pode também conter pelo menos uma seqüência de não codificação, incluindo, por exemplo, porém não limitada a pelo menos uma seqüência de não codificação em 5' e 3', tal como as seqüências transcritas, porém não traduzidas, os sinais de terminação (tais como os sinais de terminação dependentes de rô e independentes de rô), os sítios de ligação de ribossomos, as seqüências de Kozak, as seqüências que estabilizam o mRNA, os íntrons, e os sinais de poliadenilação. A seqüência de polinucleotídeos pode também compreender seqüência de codificação adicional codificando aminoácidos adicionais. Por exemplo, uma seqüência marcadora que facilite a purificação do polipeptídeo fundido pode ser codificada. Em certas modalidades da invenção, a seqüência marcadora é um peptídeo de hexa-histidina, conforme proporcionado no vetor de pQE (Qiagen, Inc.) e descrito em Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sei., USA 86: 821-824 (1989), ou uma marca de peptídeo de HA (Wilson et al., Cell 37: 767 (1984), ambos os quais podem ser úteis na purificação da seqüência de polipeptídeos fundida a eles. Os polinucleotídeos da invenção também incluem, porém não estão limitados aos polinucleotídeos compreendendo um gene estrutural e suas seqüências naturalmente associadas que controlam a expressão do gene.

A seqüência de nucleotídeos codificando o polipeptídeo de Proteína E de SEQ ID NOs: 1-10 pode ser idêntica à seqüência de codificação de polinucleotídeos correspondente de SEQ ID NO: 11 (ou estar compreendida dentro de SEQ ID NO: 11). Alternativamente, ela pode ser qualquer seqüência, a qual, como um resultado da redundância (degeneração) do código genético, também codifica um polipeptídeo de SEQ ID NOs: 1-10.

O termo polinucleotídeo codificando um polipeptídeo, conforme usado neste documento, abrange os polinucleotídeos que incluem uma seqüência codificando um polipeptídeo da invenção, particularmente um polipeptídeo bacteriano e mais particularmente um polipeptídeo da Proteína E de H. influenzae não tipificável tendo uma seqüência de aminoácidos especificada em quaisquer das seqüências de SEQ ID NOs: 1-10 ou seus fragmentos. O termo também abrange os polinucleotídeos que incluem uma região continua única ou regiões descontínuas codificando o polipeptídeo (por exemplo, os polinucleotídeos interrompidos por fago integrado, uma seqüência de inserção integrada, uma seqüência de vetor integrada, uma seqüência de transposon integrada, ou devido à edição do RNA ou à reorganização do DNA genômico), juntamente com regiões adicionais, que também podem conter seqüências de codificação e/ou de não-codificação.

A invenção adicionalmente refere-se às variantes dos polinucleotídeos descritos neste documento que codificam as variantes de um polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácidos deduzida de quaisquer das seqüências de SEQ ID NOs; 1-10. Os fragmentos de polinucleotídeos da invenção podem ser usados, por exemplo, para sintetizar os polinucleotídeos de tamanho natural da invenção.

Os fragmentos preferidos são aqueles polinucleotídeos que codificam um epitopo de célula B, por exemplo, os fragmentos/peptídeos descritos no Exemplo 10, e os genes recombinantes, quiméricos, compreendendo os ditos fragmentos de polinucleotídeos.

As modalidades particularmente preferidas, adicionais, são os polinucleotídeos codificando as variantes de Proteína E, que têm a seqüência de aminoácidos do polipeptídeo de Proteína E de qualquer seqüência a partir de SEQ ID NOs; 1-10, em que diversos, alguns, 5 a 10, 1 a 5, 1 a 3, 2, 1 ou nenhum resíduo de aminoácido é substituído, modificado, removido e/ou adicionado, em qualquer combinação. São especialmente preferidas entre estas as substituições, as adições e as remoções silenciosas, que não alteram as propriedades e as atividades do polipeptídeo de Proteína E (por exemplo, aquelas propriedades descritas na seção de Exemplos aqui contida).

As modalidades preferidas adicionais da invenção são os polinucleotídeos que são pelo menos 85% idênticos, sobre o seu comprimento inteiro, aos polinucleotídeos codificando os polipeptídeos de Proteína E tendo uma seqüência de aminoácidos especificada em quaisquer das seqüências de SEQ ID NOs: 1-10, e aos polinucleotídeos que são complementares a tais polinucleotídeos. Alternativamente, são mais altamente preferidos os polinucleotídeos que compreendem uma região que é pelo menos 90% idêntica, sobre o seu comprimento inteiro, aos polinucleotídeos codificando os polipeptídeos de Proteína E e aos polinucleotídeos complementares a eles. Com relação a isto, os polinucleotídeos pelo menos 95% idênticos, sobre o seu comprimento inteiro, aos mesmos são particularmente preferidos. Além disso, aqueles com pelo menos 97% são altamente preferidos entre aqueles com pelo menos 95%, e entre estes, aqueles com pelo menos 98% e pelo menos 99% são particular e altamente preferidos, com pelo menos 99%. sendo o mais preferido.

As modalidades preferidas são os polinucleotídeos codificando os polipeptídeos que conservam substancialmente a mesma função ou atividade biológica que o polipeptídeo maduro codificado por uma seqüência de DNA selecionada a partir de SEQ ID NO: 11 (por exemplo, aquelas atividades descritas na seção de Exemplos aqui contida).

De acordo com certas modalidades preferidas da invenção, proporcionam-se polinucleotídeos que hibridizam, particularmente sob condições severas, para seqüéncias de polinucleotídeos de Proteína E, tais como aqueles polinucleotídeos de SEQ ID NO: 11.

A invenção adicionalmente refere-se aos polinucleotídeos que hibridizam para as seqüéncias de polinucleotídeos proporcionadas neste 15 documento. Com relação a isto, a invenção especialmente se refere aos polinucleotídeos que hibridizam, sob condições severas, para os polinucleotídeos descritos neste documento. Conforme usados aqui, os termos condições severas e condições de hibridização severas significam que a hibridização ocorre somente se houver pelo menos 95%, e 20 preferivelmente pelo menos 97%, de identidade entre as seqüéncias. Um • exemplo específico de condições de hibridização severas é a incubação durante a noite a 42²C em uma solução compreendendo: 50%. de formamida, 5x SSC (NaCI a 150 mM, citrato de trissódio a 15 mM), fosfato de sódio a 50 mM (pH 7,6), 5x solução de Denhardt, sulfato de dextrana a 10%, e 20 25 microgramas/ml de DNA de esperma de salmão cortado, desnaturado, seguida por lavagem do suporte de hibridização em 0,1x SSC em torno de 65-C. As condições de hibridização e lavagem são bastante conhecidas e exemplificadas em Sambrook, etal., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edição, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), particularmente o 30 Capítulo 11 nele. A hibridização em solução pode também ser usada com as seqüéncias de polinucleotídeos proporcionadas pela invenção.

A invenção também proporciona um polinucleotídeo consistindo em, ou compreendendo, uma seqüência de polinucleotídeos obtida por exame de uma biblioteca apropriada contendo o gene completo para uma seqüência de polinucleotídeos especificada em quaisquer das seqüências de SEQ ID NO: 11, sob condições de hibridização severas, com uma sonda tendo a seqüência da dita seqüência de polinucleotídeos especificada na seqüência correspondente de SEQ ID NO: 11 ou um fragmento do mesmo; e isolamento da dita seqüência de polinucleotídeos. Os fragmentos úteis para obter tal polinucleotídeo incluem, por exemplo, as sondas e os iniciadores completamente descritos alhures neste documento.

Conforme discutido alhures neste documento com relação aos ensaios de polinucleotídeos da invenção, por exemplo, os polinucleotídeos da invenção, podem ser usados como uma sonda de hibridização para o RNA, o cDNA e o DNA genômico, para isolar os cDNAs de tamanhos naturais e os clones genômicos codificando a Proteína E, e para isolar o cDNA e os clones genômicos de outros genes que tenham uma alta identidade, particularmente alta identidade de seqüência, com os genes de Proteína E. Tais sondas geralmente compreenderão pelo menos 15 resíduos de nucleotídeos ou pares de bases. De preferência, tais sondas terão pelo menos 30 resíduos de nucleotídeos ou pares de bases e podem ter pelo menos 50 resíduos de nucleotídeos ou pares de bases. As sondas particularmente preferidas terão pelo menos 20 resíduos de nucleotídeos ou pares de bases e terão menos do que 30 resíduos de nucleotídeos ou pares de bases.

Uma região de codificação dos genes de Proteína E pode ser isolada por exame utilizando uma seqüência de DNA proporcionada em SEQ ID NO: 11 para sintetizar uma sonda de oligonucleotídeo. Um oligonucleotídeo marcado tendo uma seqüência complementar àquela de um gene da invenção é então usado para examinar uma biblioteca de cDNA, DNA genômico ou mRNA, para determinar com quais membros da biblioteca a sonda hibridiza.

Existem diversos métodos disponíveis e bastante conhecidos para aqueles versados na técnica para obter os DNAs de tamanhos naturais, ou aumentar os DNAs curtos, por exemplo, aqueles baseados no método de

Amplificação Rápida das extremidades de cDNA (RACE) (vide, por exemplo,

Frohman, et al., PNAS USA 85: 8998-9002, 1988). As modificações recentes da técnica, exemplificadas pela tecnologia de Marathon’ (Clontech

Laboratories Inc.), por exemplo, têm simplificado significativamente a pesquisa por cDNAs mais longos. Na tecnologia de Marathon®, os cDNAs são preparados a partir de mRNA extraído de um tecido escolhido e uma seqüência 'adaptadora¹ ligada a cada extremidade. A amplificação de ácido nucléico (PCR) é então realizada para amplificar a extremidade de 5' 10 inexistente do DNA, usando uma combinação de iniciadores de oligonucleotídeos específicos para genes e específicos para adaptadores. A reação de PCR é então repetida usando os iniciadores aninhados, ou seja, iniciadores projetados para anelar dentro do produto amplificado (tipicamente um iniciador especifico para adaptador que anela 3' adicional 15 na seqüência adaptadora e um iniciador específico para gene que anela 5' adicional na seqüência de gene selecionada). Os produtos desta reação podem então ser analisados por seqüenciamento de DNA e um DNA de tamanho natural construído por união do produto diretamente ao DNA existente para dar uma seqüência completa, ou realização de uma PCR de 20 tamanho natural separada, usando a nova informação de seqüência para o • projeto do iniciador de 5'.

Os polinucleotídeos e os polipeptídeos da invenção podem ser empregados, por exemplo, como reagentes de pesquisa e materiais para a descoberta de tratamentos de, e diagnósticos para, doenças, 25 particularmente doenças humanas, como adicionalmente discutido neste documento em relação aos ensaios de polinucleotídeos.

Os polinucleotídeos da invenção, que são oligonucleotídeos derivados de uma seqüência de SEQ ID NO: 11, podem ser usados nos processos aqui contidos conforme descritos, porém preferivelmente para a 30 PCR, para determinar se os polinucleotídeos identificados aqui, na totalidade ou em parte, são ou não transcritos em bactérias no tecido infectado. Reconhece-se que tais seqüências também terão utilidade na diagnose do estágio de infecção e tipo de infecção o patógeno atingiu.

A invenção também proporciona polinucleotídeos que codificam um polipeptídeo que é a proteína madura mais aminoácidos amino ou carboxila terminais adicionais, ou aminoácidos dentro do polipeptídeo 5 maduro (quando a forma madura tiver mais do que uma cadeia de polipeptídeo, por exemplo). Tais seqüências podem desempenhar uma função no processamento de uma proteína a partir do precursor até uma forma madura, podem permitir o transporte de proteínas, podem prolongar ou encurtar a meia-vida da proteína ou podem facilitar a manipulação de 10 uma proteína para ensaio ou produção, entre outras coisas. Conforme geralmente for o caso in vivo, os aminoácidos adicionais podem ser processados da proteína madura por enzimas celulares.

Para todo polinucleotídeo da invenção proporciona-se um polinucleotídeo complementar a ele. É preferido que estes polinucleotídeos 15 complementares sejam inteiramente complementares a cada polinucleotídeo com o qual eles são complementares.

Uma proteína precursora, tendo uma forma madura do polipeptídeo fundida a uma ou mais pró-seqüências, pode ser uma forma inativa do polipeptídeo. Quando as pró-seqüências forem removidas, tais 20 precursores inativos geralmente são ativados. Algumas ou todas as próseqüências podem ser removidas antes da ativação. Geralmente, tais precursores são chamados pró-proteínas.

Além das representações padrões A, G, C, T/U para os nucleotídeos, o termo N pode também ser usado na descrição de certos 25 polinucleotídeos da invenção. N significa que quaisquer dos quatro nucleotídeos DNA ou RNA podem aparecer em tal posição designada na seqüência de DNA ou RNA, exceto que é preferido que N não seja um ácido nucléico que, quando tomado em combinação com as posições de nucleotídeos adjacentes, quando lido na quadro de leitura correto, teria o 30 efeito de gerar um códon de terminação prematuro em tal quadro de leitura.

Em resumo, um polinucleotídeo da invenção pode codificar uma proteína madura, uma proteína madura mais uma seqüência líder (que pode ser referida como uma pré-proteína), um precursor de uma proteína madura tendo uma ou mais pró-seqüências que não são as sequências líderes de uma pré-proteína, ou uma pré-pró-proteína, que é um precursor para uma pró-proteína, tendo uma seqüência líder e uma ou mais pró-seqüências, que geralmente são removidas durante as etapas de processamento que produzem as formas ativas e maduras do polipeptídeo.

De acordo com um aspecto da invenção, proporciona-se o uso de um polinucleotídeo da invenção para propósitos terapêuticos ou profiláticos, em particular a imunização genética.

O uso de um polinucleotídeo da invenção na imunização genética preferivelmente empregará um método adequado de distribuição, tal como a injeção direta de DNA de plasmídio nos músculos (Wolff et al., Hum Mol Genet (1992) 1: 363, Manthorpe et al., Hum. Gene Ther. (1983) 4: 419), a distribuição de DNA formando complexo com os veículos de proteínas específicos (Wu et al., J Biol Chem. (1989) 264: 16985), a coprecipitação de DNA com fosfato de cálcio (Benvenisty e Reshef, PNAS USA, (1986) 83: 9551), a encapsulação de DNA em diversas formas de lipossomos (Kaneda et al.. Science (1989) 243: 375), o bombardeio de partículas (Tang et al., Nature (1992) 356:152, Eisenbraun et al., DNA Cell Biol (1993) 12: 791) e a infecção in vivo usando os vetores retrovirais clonados (Seeger et al., PNAS USA (1984) 81: 5849).

Vetores, Células Hospedeiras, Sistemas de Expressão

A invenção também se refere aos vetores que compreendem um polinucleotídeo ou polinucleotídeos da invenção, às células hospedeiras que são geneticamente engenheiradas com os vetores da invenção e à produção dos polipeptídeos da invenção por técnicas recombinantes. Os sistemas de tradução sem células podem também ser empregados para produzir tais proteínas usando os RNAs derivados das construções de DNA da invenção.

Os polipeptídeos recombinantes da presente invenção podem ser preparados por processos bastante conhecidos para aqueles versados na técnica, a partir de células hospedeiras geneticamente engenheiradas compreendendo os sistemas de expressão. Desse modo, em um aspecto adicional, a presente invenção refere-se aos sistemas de expressão que compreendem um polinucleotídeo ou polinucleotídeos da presente invenção, às células hospedeiras que são geneticamente engenheiradas com tais sistemas de expressão, e à produção dos polipeptídeos da invenção por técnicas recombinantes.

Para a produção recombinante dos polipeptídeos da invenção, as células hospedeiras podem ser geneticamente engenheiradas para incorporar sistemas de expressão ou porções deles ou os polinucleotídeos da invenção. A introdução de um polinucleotídeo na célula hospedeira pode 10 ser efetuada pelos métodos descritos em muitos manuais padrões de laboratórios, tais como Davis, et al., BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, (19861 e Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2- Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), tais como, a transfecção com fosfato de cálcio, a 15 transfecção mediada por DEAE-dextrana, a transvecção, a microinjeção, a transfecção mediada por lipídio catiônico, a eletroporação, a conjugação, a transdução, a carga de raspagem, a introdução balística e a infecção.

Os exemplos representativos de hospedeiros apropriados incluem as células bacterianas, tais como as células de estreptococos, 20 estafilococos, enterococos, E. coli, streptomyces, cianobactérias, Bacillus subtilis, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae e Moraxella catanhalis; as células fúngicas, tais como as células de uma levedura, Kluveromyces, Saccharomyces, Pichia, um basidiomiceto, Candida albicans e Aspergillus; as células de insetos, tais como as células de Drosophila S2 e 25 Spodoptera Sf9; as células de animais, tais como as células de CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, 293, CV-1 e melanoma de Bowes; e as células de plantas, tais como as células de uma gimnosperma ou angiosperma.

Uma grande variedade de sistemas de expressão pode ser usada para produzir os polipeptídeos da invenção. Tais vetores incluem, 30 entre outros, os vetores cromossômicos-, epissômicos- e vírus-derivados, por exemplo, os vetores derivados de plasmídios bacterianos, de bacteriófagos, de transposons, de epissomos de leveduras, de elementos de inserção, de elementos cromossôrnicos de leveduras, de vírus, tais como os baculovírus, os papovavírus, tais como o SV40, os vírus de vacínia, os adenovírus, os vírus do vírus de ave (fowlpox), os vírus da pseudo-raiva, os picornavírus, os retrovírus, e os alfavírus, e os vetores derivados das combinações deles, tais como aqueles derivados elementos genéticos de plasmídios e de bacteriófagos, tais como os cosmídios e os fagomídios. As construções de sistemas de expressão podem conter regiões de controle que regulam, bem como produzem, a expressão. Geralmente, qualquer sistema ou vetor adequado para manter, propagar ou expressar os polinucleotídeos e/ou para expressar um polipeptídeo em um hospedeiro pode ser usado para a expressão com relação a isto. A seqüência de DNA apropriada pode ser inserida no sistema de expressão por qualquer de uma variedade de técnicas bastante conhecidas e de rotina, tais como, por exemplo, aquelas descritas em Sambrook et ai., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, (supra).

Nos sistemas de expressão recombinantes em eucariotos, para a secreção de uma proteína traduzida no lúmen do retículo endoplasmático, no espaço periplásmico ou no ambiente extracelular, sinais de secreção apropriados podem ser incorporados no polipeptídeo expresso. Estes sinais podem ser endógenos para o polipeptídeo ou eles podem ser sinais heterólogos.

Os polipeptídeos da presente invenção podem ser recuperados e purificados de culturas de células recombinantes por métodos bastante conhecidos, incluindo a precipitação com sulfato de amònio ou etanol, a extração com ácido, a cromatografia de troca aniônica ou catiônica, a cromatografia de fosfocelulose, a cromatografia de interação hidrofóbica, a cromatografia por afinidade, a cromatografia de hidroxilapatita e a cromatografia de lectina. Mais preferivelmente, a cromatografia por afinidade de metal iônico (IMAC) é empregada para a purificação. Podem ser empregadas técnicas bem-conhecidas para a reduplicação das proteínas para regenerar a conformação ativa quando o polipeptídeo for desnaturado durante a síntese, o isolamento e ou a purificação intracelular.

O sistema de expressão pode também ser um microorganismo vivo recombinante, tal como um vírus ou bactéria. O gene de interesse pode ser inserido no genoma de um vírus ou bactéria recombinante viva. A inoculação e a infecção in vivo com este vetor vivo resultarão na expressão in vivo do antígeno e na indução das respostas imunes. Os vírus e as bactérias usados para este propósito são, por exemplo: os poxvírus (por exemplo, vacínia, vírus de ave (fowlpox), canarypox), os alfavírus (vírus Sindbis, Vírus da Floresta de Semliki, Vírus da Encefalite Equina Venezuelana), os adenovírus, o vírus adeno-associado, os picornavírus (poliovírus, rinovírus), os vírus da herpes (vírus varicella zoster), a Listeria, a Salmonella, a Shigella, o BCG, os estreptococos. Estes vírus e bactérias podem ser virulentos, ou atenuados em diversos modos para obter vacinas vivas. Tais vacinas vivas também formam parte da invenção.

Ensaios Diagnósticos, Prognósticos, de Sorotipificação e Mutação

Esta invenção está também relacionada ao uso dos polinucleotídeos e polipeptídeos de Proteína E da invenção, para uso como reagentes diagnósticos. A detecção dos polinucleotídeos e/ou dos polipeptídeos de Proteína E em um eucarioto, particularmente um mamífero, e especialmente um ser humano, proporcionará um método diagnóstico para a diagnose de doença, o estadiamento de doença ou a resposta de um organismo infeccioso aos fármacos. Os eucariotos, particularmente os mamíferos, e especialmente os seres humanos, particularmente aqueles infectados ou suspeitos de estarem infectados com um organismo compreendendo os genes de Proteína E ou as proteínas, podem ser detectados no nível de ácido nucléico ou aminoácido por uma variedade de técnicas bastante conhecidas, bem como pelos métodos proporcionados neste documento.

Os polipeptídeos e os polinucleotídeos para o prognóstico, a diagnose ou outra análise podem ser obtidos a partir dos materiais corpóreos de um indivíduo putativamente infectado e/ou infectado. Os polinucleotídeos a partir destas fontes, particularmente o DNA ou o RNA, podem ser usados diretamente para a detecção ou podem ser amplificados enzimaticamente por utilização de PCR ou qualquer outra técnica de amplificação, antes da análise. O RNA, particularmente o mRNA, o cDNA e o DNA genômico podem também ser usados nos mesmos modos. Usando a amplificação, pode ser feita a caracterização da espécie e da cepa do 5 organismo infeccioso ou residente, presente em um indivíduo, por uma análise do genótipo de um polinucleotídeo selecionado do organismo. As remoções e as inserções podem ser detectadas por uma alteração no tamanho do produto amplificado, em comparação com um genótipo de uma seqüência de referência selecionada a partir de um organismo relacionado, 10 preferivelmente uma espécie diferente do mesmo gênero ou uma cepa diferente da mesma espécie. As mutações pontuais podem ser identificadas por hibridização do DNA amplificado às seqüências de polinucleotídeos de Proteína E marcadas. As seqüências perfeitamente ou significativamente correlacionadas podem ser distinguidas dos dúplices imperfeitamente ou 15 mais significativamente mal correlacionados por digestão com DNase ou RNase, para o DNA e o RNA, respectivamente, ou por detecção das diferenças nas temperaturas de fusão ou na cinética de renaturação. As diferenças nas seqüências de polinucleotídeos podem também ser detectadas por alterações na mobilidade eletroforética dos fragmentos de 20 polinucleotídeos em géis, em comparação com uma seqüência de referência.

• Isto pode ser realizado com ou sem agentes de desnaturação. As diferenças de polinucleotídeos podem também ser detectadas por seqüenciamento de DNA ou RNA direto. Vide, por exemplo, Myers et al., Science, 230: 1242 (1985). As alterações das seqüências em posições específicas também 25 podem ser reveladas por ensaios de proteção de nuclease, tais como o ensaio de proteção de RNase, V1 e S1, ou um método de divagem química. Vide, por exemplo, Cotton et al., Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 85:4397-4401 (1985).

Em uma outra modalidade, um arranjo de sondas de 30 oligonucleotídeos compreendendo as seqüências de nucleotídeos da Proteína E ou os seus fragmentos pode ser construído para conduzir o exame eficiente de, por exemplo, mutações genéticas, serótipo, classificação taxonômica ou identificação. Os métodos de tecnologia de arranjos são bemconhecidos e têm aplicabilidade geral e podem ser usados para abordar uma variedade de questões na genética molecular, incluindo a expressão do gene, a ligação genética, e a variabilidade genética (vide, por exemplo, Chee et al., Science, 274: 610 (1996)).

Assim, em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a um kit diagnóstico que compreende:

(a) um polinucleotídeo da presente invenção, preferivelmente quaisquer das seqüências de nucleotídeos de SEQ ID NO: 11, ou um fragmento do mesmo;

íb) uma seqüência de nucleotídeos complementar àquela de (a);

(c) um polipeptídeo da presente invenção, preferivelmente quaisquer dos polipeptídeos de SEQ ID NOs: 1-10 ou um fragmento do mesmo; ou (d) um anticorpo para um polipeptídeo da presente invenção, preferivelmente para quaisquer dos polipeptídeos de SEQ ID NOs: 1-10. Será apreciado que em qualquer tal kit, (a), íb), (c) ou (d) pode compreender um componente substancial. Tal kit serà de uso no diagnóstico de uma doença ou suscetibilidade a uma Doença, entre outros.

Esta invenção também se refere ao uso dos polinucleotídeos da presente invenção corno reagentes diagnósticos. A detecção de uma forma mutada de um polinucleotídeo da invenção, preferivelmente qualquer seqüência de SEQ ID NO: 11, a qual está associada com uma doença ou patogenicidade, proporcionará uma ferramenta diagnostica que pode suplementar, ou definir, um diagnóstico de uma doença, um prognóstico de um curso da doença, uma determinação de um estágio da doença, ou uma suscetibilidade a uma doença, que resulta da subexpressão, superexpressão ou expressão alterada do polinucleotídeo. Os organismos, particularmente os organismos infecciosos, carregando mutações em tal polinucleotídeo podem ser detectados no nível de polinucleotídeo por uma variedade de técnicas, tais como aquelas descritas alhures neste documento.

As células de um organismo carregando mutações ou polimorfismos (variações alélicas) em um polinucleotídeo e/ou polipeptídeo da invenção podem também ser detectadas, no nível de polinucleotídeo ou polipeptídeo, por uma variedade de técnicas, para permitir a sorotipificação, por exemplo. Por exemplo, a RT-PCR pode ser usada para detectar 5 mutações no RNA. É particularmente preferido usar a RT-PCR em conjunção com os sistemas de detecção automatizados, tais como, por exemplo, o GeneScan. O RNA, o cDNA ou o DNA genômico pode também ser usado para o mesmo propósito, a PCR. Como um exemplo, os iniciadores de PCR complementares a um polinucleotídeo codificando os 10 polipeptídeos de Proteína E podem ser usados para identificar e analisar as mutações.

A invenção adicionalmente proporciona iniciadores com 1, 2, 3 ou 4 nucleotídeos removidos da extremidade de 5' e/ou de 3¹. Estes iniciadores podem ser usados para, entre outras coisas, amplificar o DNA 15 e/ou o RNA de Proteína E, isolados de uma amostra derivada de um indivíduo, tal como um material corpóreo. Os iniciadores podem ser usados para amplificar um polinucleotídeo isolado de um indivíduo infectado, de modo tal que o polinucleotídeo possa então ser submetido a diversas técnicas para a elucidação da seqüência de polinucleotídeos. Neste modo, 20 as mutações na seqüência de polinucleotídeos podem ser detectadas e • usadas para diagnosticar e/ou prognosticar a infecção ou o seu estágio ou curso, ou para sorotipificar e/ou classificar o agente infeccioso.

A invenção adicionalmente proporciona um processo para diagnosticar uma doença, preferivelmente as infecções bacterianas, mais 25 preferivelmente as infecções causadas por H. influenzae não tipificável, compreendendo determinar a partir de uma amostra derivada de um indivíduo, tal como um material corpóreo, um nível aumentado de expressão do polinucleotídeo tendo uma seqüência de quaisquer das seqüências de SEQ ID NO: 11. A expressão aumentada ou diminuída do polinucleotídeo de 30 Proteína E pode ser medida usando qualquer um dos métodos bastante conhecidos na técnica para a quantificação dos polinucleotídeos, tais como, por exemplo, a amplificação, a PCR, a RT-PCR, a proteção de RNase,

Northern blot, a espectrometria e outros métodos de hibridização.

Além disso, um ensaio diagnóstico de acordo com a invenção, para detectar a superexpressão dos polipeptídeos de Proteína E comparados às amostras de tecido de controle normais, pode ser usado para detectar a presença de uma infecção, por exemplo. As técnicas de ensaio que podem ser usadas para determinar os níveis de polipeptídeos de Proteína E, em uma amostra derivada de um hospedeiro, tal como um material corpóreo, são bem-conhecidas para aqueles versados na técnica. Tais métodos de ensaio incluem os radioimunoensaios, os ensaios de ligação competitiva, a análise por Western blot, os ensaios de sanduíche de anticorpo, os ensaios de detecção de anticorpos e ELISA.

Os polinucleotídeos da invenção podem ser usados como componentes de arranjos de polinucleotídeos, preferivelmente arranjos ou redes de alta densidade. Estes arranjos de alta densidade são particularmente úteis para propósitos diagnósticos ou prognósticos. Por exemplo, uma série de sítios, cada um compreendendo um gene diferente, e adicionalmente compreendendo um polinucleotídeo ou polinucleotídeos da invenção, pode ser usada para sondar, tal como usando hibridização ou amplificação de ácido nucléico, usando sondas obtidas ou derivadas de uma amostra corpórea, para determinar a presença de uma seqüência de polinucleotídeos particular ou seqüência relacionada em um indivíduo. Tal presença pode indicar a presença de um patógeno, particularmente o H. influenzae não tipificável, e pode ser útil em diagnosticar e/ou prognosticar a doença ou um curso da doença. Uma rede compreendendo diversas variantes de qualquer seqüência de polinucleotídeos de SEQ ID NO: 11 é preferida. Também são preferidas diversas variantes de uma seqüência de polinucleotídeos codificando qualquer seqüência de polipeptídeos de SEQ ID NOs: 1-10.

Anticorpos

Os polipeptídeos e os polinucleotídeos da invenção, ou as suas variantes, ou as células expressando os mesmos podem ser usadas como imunógenos para produzir anticorpos imunoespecíficos para tais polipeptídeos ou polinucleotídeos, respectivamente. Alternativamente, mimótopos, particularmente os mimótopos de peptídeos, de epitopos dentro da seqüência de polipeptídeos podem também ser usados como imunógenos para produzir anticorpos imunoespecíficos para o polipeptídeo 5 da invenção. O termo imunoespecífico significa que os anticorpos têm substancialmente maior afinidade pelos polipeptídeos da invenção do que sua afinidade por outros polipeptídeos relacionados na técnica anterior.

Em certas modalidades preferidas da invenção, proporcionam-se anticorpos contra os polipeptídeos ou os polinucleotídeos de Proteína E.

Os anticorpos gerados contra os polipeptídeos ou os polinucleotídeos da invenção podem ser obtidos por administração dos polipeptídeos e/ou dos polinucleotídeos da invenção, ou de fragmentos contendo epitopos de um ou outro ou de ambos, análogos de um ou outro ou de ambos, ou células expressando um ou outro ou ambos, a um animal, 15 preferivelmente um não humano, usando protocolos de rotina. Para a preparação dos anticorpos monoclonais, pode ser usada qualquer prática conhecida na técnica que proporcione anticorpos produzidos por culturas de linhagens celulares continuas. Os exemplos incluem diversas técnicas, tais como aquelas em Kohler, G. e Milstein, C., Nature 256: 495-497 (1975);

Kozbor et al., Immunology Today 4: 72 (1983); Cole et al., págs. 77-96 em • MONOCLONAL ANTIBODIES AND CÂNCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc. (1985).

As técnicas para a produção de anticorpos de cadeias individuais (Patente U.S. N- 4.946.778) podem ser adaptadas para produzir 25 anticorpos de cadeias individuais para os polipeptídeos ou os polinucleotídeos desta invenção. Também, os camundongos transgênicos, ou outros organismos ou animais, tais como outros mamíferos, podem ser usados para expressar os anticorpos humanizados, imunoespecíficos para os polipeptídeos ou os polinucleotídeos da invenção.

Alternativamente, a tecnologia de exibição em fagos pode ser utilizada para selecionar os genes de anticorpos com atividades de ligação em relação a um polipeptídeo da invenção, a partir de repertórios de genes v amplificados por PCR de linfócitos de seres humanos examinados quanto a possuírem antiproteína E, ou a partir de bibliotecas simples (McCafferty, et al., (1990), Nature 348, 552-554; Marks, et al., (1992) Biotechnology 10, 779783). A afinidade destes anticorpos pode também ser melhorada, por exemplo, através de rearranjo das cadeias (Clackson et al., (1991) Nature 352: 628).

Os anticorpos acima descritos podem ser empregados para isolar ou identificar os clones expressando os polipeptídeos ou os polinucleotídeos da invenção, para purificar os polipeptídeos ou os 10 polinucleotídeos, por exemplo, através de cromatografia por afinidade.

Assim, entre outros, os anticorpos contra os polipeptídeos de Proteína E ou os polinucleotídeos de Proteína podem ser empregados para tratar as infecções, particularmente as infecções bacterianas.

As variantes de polipeptídeos que incluem as variantes 15 antigênica, epitópica ou imunologicamente equivalentes formam um aspecto particular desta invenção.

De preferência, o anticorpo, ou a sua variante, é modificado para torná-lo menos imunogênica no indivíduo. Por exemplo, se o indivíduo for um ser humano, o anticorpo pode mais preferivelmente ser humanizado, 20 onde a região, ou regiões, determinante de complementaridade do anticorpo derivado do hibridoma foi transplantada em um anticorpo monoclonal humano, por exemplo, conforme descrito em Jones et al. (1986), Nature 321, 522-525 ou Tempest et al., (1991) Biotechnology 9, 266-273.

Antagonistas e Agonistas - Ensaios e Moléculas

Os polipeptídeos e os polinucleotídeos da invenção podem também ser usados para avaliar a ligação de substratos e ligantes de pequenas moléculas em, por exemplo, células, preparações sem células, bibliotecas químicas, e misturas de produtos naturais. Estes substratos e ligantes podem ser substratos e ligantes naturais ou podem ser miméticos estruturais ou funcionais. Vide, por exemplo, Coligan et al., Current Protocols in Immunologv 1(2): Capítulo 5 (1991).

Os métodos de exame podem simplesmente medir a ligação de um composto candidato ao polipeptídeo ou ao polinucleotídeo, ou às células ou às membranas contendo o polipeptídeo ou o polinucleotídeo, ou a uma proteína de fusão do polipeptídeo por meio de uma marca direta ou indiretamente associada com o composto candidato. Alternativamente, o método de exame pode envolver a competição com um competidor marcado.

Ademais, estes métodos de exame podem testar se o composto candidato resulta em um sinal gerado por ativação ou inibição do polipeptídeo ou do polinucleotídeo, usando sistemas de detecção apropriados para as células compreendendo o polipeptídeo ou o polinucleotídeo. Os inibidores da 10 ativação são geralmente testados na presença de um agonista conhecido e é observado o efeito sobre a ativação pelo agonista pela presença do composto candidato. O polipeptídeo constitutivamente expresso e/ou os polipeptídeos e os polinucleotídeos constitutivamente expressos podem ser empregados nos métodos de exame para agonistas ou inibidores invertidos, 15 na ausência de um agonista ou inibidor, testando se o composto candidato resulta na inibição da ativação do polipeptídeo ou do polinucleotídeo, conforme possa ser o caso. Além disso, os métodos de exame podem simplesmente compreender as etapas de misturar um composto candidato com uma solução contendo um polipeptídeo ou polinucleotídeo da presente 20 invenção, para formar uma mistura, medir a atividade dos polipeptídeos e/ou dos polinucleotídeos de Proteína E na mistura, e comparar a atividade dos polipeptídeos e/ou dos polinucleotídeos de Proteína E da mistura com um padrão. As proteínas de fusão, tais como aquelas preparadas a partir da porção de Fc e os polipeptídeos de Proteína E, como aqui antes descrito, 25 podem também ser usadas para os ensaios de exame de alta produção, para identificar os antagonistas do polipeptídeo da presente invenção, bem como de polipeptídeos filogeneticamente e/ou funcionalmente relacionados (vide D. Bennett et al., J Mol Recognition, 8:52-58 (1995); e K. Johanson et al., J Biol Chem, 270(16):9459-9471 (1995)).

Os polinucleotídeos, os polipeptídeos e os anticorpos que se ligam a, e/ou interagem com, um polipeptídeo da presente invenção podem também ser usados para configurar os métodos de exame, para detectar o efeito dos compostos adicionados sobre a produção de mRNA e/ou polipeptídeo nas células. Por exemplo, um ensaio ELISA pode ser construído para medir os níveis de polipeptídeo secretados ou associados às células, usando anticorpos monoclonais e policlonais, por métodos-padrão 5 conhecidos na técnica. Isto pode ser usado para descobrir agentes que possam inibir ou aumentar a produção de polipeptídeo (também chamados antagonista ou agonista, respectivamente) a partir de células ou tecidos adequadamente manipulados.

A invenção também proporciona um método de examinar os 10 compostos, para identificar aqueles que aumentam (agonista) ou bloqueiam (antagonista) a ação dos polipeptídeos ou polinucleotídeos de Proteína E, particularmente aqueles compostos que são bacteriostáticos e/ou bactericidas. O método de examinar pode envolver as técnicas de alta produção. Por exemplo, para examinar os agonistas ou os antagonistas, 15 uma mistura de reação sintética, um compartimento celular, tal como uma membrana, envoltório celular ou parede celular, ou uma preparação de quaisquer destes, compreendendo os polipeptídeos de Proteína E e um substrato ou ligante marcado de tal polipeptídeo, é incubada na ausência ou na presença de uma molécula candidata que pode ser um agonista ou 20 antagonista de Proteína E. A capacidade da molécula candidata de agonizar ou antagonizar o polipeptídeo de Proteína E é refletida na ligação diminuída do ligante marcado ou na produção diminuída do produto a partir de tal substrato. As moléculas que ligam livremente, et al., sem induzir os efeitos do polipeptídeo de Proteína E, são mais prováveis de serem bons 25 antagonistas. As moléculas que ligam bem e, conforme possa ser o caso, aumentam a taxa de produção de produto a partir do substrato, aumentam a transdução de sinal, ou aumentam a atividade do canal químico são agonistas. A detecção da taxa ou do nível de, conforme possa ser o caso, produção de produto a partir de substrato, da transdução de sinal, ou da 30 atividade do canal químico pode ser aumentada por utilização de um sistema relator. Os sistemas relatores que podem ser úteis com relação a isto incluem, porém não estão limitados ao substrato marcado, colorimétrico, convertido no produto, um gene relator que é sensível a alterações na atividade do polinucleotídeo ou do polipeptídeo de Proteína E, e ensaios de ligação conhecidos na técnica.

Um outro exemplo de um ensaio para agonistas de Proteína E é um ensaio competitivo que combina a Proteína E e um agonista potencial com as moléculas de ligação à Proteína E, as moléculas de ligação à proteína E recombinantes, os substratos ou os ligantes naturais, ou os miméticos de substratos ou ligantes, sob condições apropriadas para um ensaio de inibição competitiva. A Proteína E pode ser marcada, de modo tal 10 que o número de moléculas de Proteína E ligadas a uma molécula de ligação ou convertidas em produto possa ser determinado exatamente, para avaliar a eficácia do antagonista potencial.

Os antagonistas potenciais incluem, entre outros, as moléculas orgânicas pequenas, os peptídeos, os polipeptídeos e os anticorpos que se 15 ligam a um polinucleotídeo e/ou polipeptídeo da invenção e, desse modo, inibem ou extinguem a sua atividade ou expressão. Os antagonistas potenciais também podem ser moléculas orgânicas pequenas, um peptídeo, um polipeptídeo, tal como uma proteína ou anticorpo exatamente relacionado que liga sítios iguais sobre uma molécula de ligação, tal como 20 uma molécula de ligação, sem induzir as atividades induzidas da Proteína E, • desse modo impedindo a ação ou a expressão dos polipeptídeos e/ou dos polinucleotídeos de Proteína E por exclusão dos polipeptídeos e/ou dos polinucleotídeos de Proteína E da ligação.

Os antagonistas potenciais incluem uma molécula pequena que 25 se liga ao, e ocupa o, sítio de ligação do polipeptídeo, desse modo impedindo a ligação às moléculas de ligação celulares, de modo tal que a atividade biológica normal é impedida. Os exemplos de moléculas pequenas incluem, porém não estão limitados às moléculas orgânicas pequenas, peptídeos ou moléculas similares a peptídeos. Os outros antagonistas 30 potenciais incluem as moléculas sem sentido (vide Okano, J. Neurochem.

56: 560 (1991); OLIGODEOXYNUCLEOTIDES AS ANTISENSE

INHIBITORS OF GENE EXPRESSION, CRC Press, Boca Raton, FL (1988), quanto a uma descrição destas moléculas). Os antagonistas potenciais preferidos incluem os compostos relacionados à, e as variantes da, Proteína

E.

Em um aspecto adicional, a presente invenção refere-se às proteínas de fusão solúveis, geneticamente engenheiradas, compreendendo um polipeptídeo da presente invenção, ou um fragmento dele, e diversas porções das regiões constantes das cadeias pesadas ou leves de imunoglobulinas de diversas subclasses (IgG, IgM, IgA, IgE). É preferida como uma imunoglobulina a parte constante da cadeia pesada da IgG humana, particularmente a lgG1, onde a fusão ocorre na região de articulação. Em uma modalidade particular, a parte de Fc pode ser removida simplesmente por incorporação de uma seqüência de divagem, a qual pode ser clivada com o fator de coagulação sanguíneo Xa. Além disso, esta invenção refere-se aos processos para a preparação destas proteínas de fusão por engenharia genética, e ao uso delas para o exame, a diagnose e a terapia de fármacos. Um aspecto adicional da invenção também se refere aos polinucleotídeos codificando tais proteínas de fusão. Os exemplos de tecnologia de proteínas de fusão podem ser encontrados nos Pedidos de Patentes Internacionais N-s WO94/29458 e WO94/22914.

Cada uma das seqüências de polinucleotídeos proporcionadas neste documento pode ser usada na descoberta e no desenvolvimento de compostos antibacterianos. A proteína codificada, com a expressão, pode ser usada como um alvo para o exame de fármacos antibacterianos. Adicionalmente, as seqüências de polinucleotídeos codificando as regiões amino terminais da proteína codificada ou as seqüências de Shine-Delgarno ou outras que facilitam a tradução do mRNA respectivo podem ser usadas para construir as seqüências sem sentido, para controlar a expressão da seqüência de codificação de interesse.

A invenção também proporciona o uso do polipeptídeo, do polinucleotídeo, do agonista ou do antagonista da invenção para interferir com a interação física inicial entre um patógeno, ou patógenos, e um hospedeiro eucariótico, preferivelmente mamífero, responsável pela seqüela da infecção. Em particular, as moléculas da invenção podem ser usadas: na prevenção da adesão de bactérias, em particular as bactérias gram-positivas e/ou gram-negativas, às proteínas da matriz extracelular, eucarióticas, preferivelmente mamíferas, sobre dispositivos residentes, ou às proteínas da 5 matriz extracelular em feridas; para bloquear a adesão bacteriana entre as proteínas da matriz extracelular, eucarióticas, preferivelmente mamíferas, e as proteínas Proteína E bacterianas que mediam o dano ao tecido e/ou; para bloquear a progressão normal da patogênese em infecções iniciadas diferentemente pela implantação de dispositivos residentes ou por outras 10 técnicas cirúrgicas.

De acordo com mais um outro aspecto da invenção, proporcionam-se agonistas e antagonistas de Proteína E, preferivelmente agonistas e antagonistas bacteriostáticos ou bactericidas.

Os antagonistas e os agonistas da invenção podem ser 15 empregados, por exemplo, para impedir, inibir e/ou tratar doenças.

Em um aspecto adicional, a presente invenção refere-se aos mimótopos do polipeptídeo da invenção. Um mimótopo é uma seqüência de peptídeos, suficientemente similar ao peptídeo nativo (seqüencial e estruturalmente), que é capaz de ser reconhecida por anticorpos que 20 reconhecem o peptídeo nativo; ou é capaz de produzir anticorpos que ¹ reconhecem o peptídeo nativo quando acoplados a um veículo adequado.

Os mimótopos de peptídeos podem ser projetados para um propósito particular, por adição, remoção ou substituição de aminoácidos eleitos. Assim, os peptídeos podem ser modificados para os propósitos de 25 facilidade de conjugação a um veículo de proteína. Por exemplo, pode ser desejável para alguns métodos de conjugação química incluir uma cisteína terminal. Além disso, pode ser desejável para os peptídeos conjugados a um veículo de proteína incluir uma extremidade hidrofóbica distai da extremidade conjugada do peptídeo, de modo tal que a extremidade não 30 conjugada, livre, do peptídeo permaneça associada com a superfície cia proteína veículo. Desse modo apresentando o peptídeo em uma conformação que mais exatamente assemelha-se àquela do peptídeo conforme encontrado no contexto da molécula nativa inteira. Por exemplo, os peptídeos podem ser alterados para terem uma cisteína N-terminal e uma extremidade amidada hidrofóbica C-terminal. Alternativamente, a adição ou a substituição de uma forma de estereoisômero D de um ou mais dos aminoácidos (inverso seqüências) pode ser efetuada para criar um derivado benéfico, por exemplo, para aumentar a estabilidade do peptídeo. Os mimótopos podem também ser retrosseqüéncias das seqüências de peptídeos naturais, pelo fato que a orientação da seqüência está invertida. Os mimótopos podem também ser de caráter retroinverso. Os retro, inverso e retroinverso peptídeos são descritos em WO 95/24916 e WO 94/05311.

Alternativamente, os mimótopos de peptídeos podem ser identificados usando anticorpos que sejam capazes, eles próprios, de ligarem-se aos polipeptídeos da presente invenção, usando técnicas tais como a tecnologia de exposição em fagos (EP 0 552 267 B1). Esta técnica gera um grande número de seqüências de peptídeos, as quais copiam a estrutura dos peptídeos nativos e são, portanto, capazes de ligarem-se aos anticorpos antipeptídeos nativos, porém podem não necessariamente, elas próprias, compartilhar homologia de seqüência significativa com o polipeptídeo nativo.

Vacinas

Um outro aspecto da invenção refere-se a um método para induzir uma resposta imunológica em um indivíduo, particularmente um mamífero, preferivelmente os seres humanos, o qual compreende inocular o indivíduo com o polinucleotídeo e/ou o polipeptídeo de Proteína E, ou um fragmento ou variante deles, adequado para produzir anticorpo e/ou resposta imune de células T para proteger o dito indivíduo da infecção, particularmente a infecção bacteriana e mais particularmente a infecção por H. influenzae não tipificável. Também são proporcionados métodos pelos quais tal resposta imunológica torna lenta a replicação bacteriana. Mais um outro aspecto da invenção refere-se a um método de induzir a resposta imunológica em um indivíduo, o qual compreende distribuir para tal indivíduo um vetor de ácido nucléico, seqüência ou ribozima, para orientar a expressão dos polinucleotídeos e/ou dos polipeptídeos de Proteína E, ou um fragmento ou uma variante deles, para expressar os polinucleotídeos e/ou os polipeptídeos de Proteína E, ou um fragmento ou uma variante deles, in vivo para induzir uma resposta imunológica, tal como, para produzir anticorpo 5 e/ou resposta imune de células T, incluindo, por exemplo, as células T produtoras de citocinas ou as células T citotóxicas, para proteger o dito indivíduo, preferivelmente um ser humano, de doença, quer esta doença já esteja estabelecida dentro do indivíduo, quer não esteja. Um exemplo de administrar o gene é por sua aceleração nas células desejadas como um 10 revestimento sobre partículas ou de outro modo. Tal vetor de ácido nucléico pode compreender o DNA, o RNA, uma ribozima, um ácido nucléico modificado, um híbrido de DNA/RNA, um complexo de DNA-proteína ou um complexo de RNA-proteína.

Um aspecto adicional da invenção refere-se a uma composição 15 imunológica que, quando introduzida em um indivíduo, preferivelmente um ser humano, capaz de ter induzida dentro dele uma resposta imunológica, induz uma resposta imunológica em tal indivíduo a um polinucleotídeo de Proteína E e/ou polipeptídeo codificado a partir dele, onde a composição compreende um polinucleotídeo de Proteína E recombinante e/ou 20 polipeptídeo codificado a partir dele e/ou compreende DNA e/ou RNA que codifica e expressa um antígeno do dito polinucleotídeo de Proteína E, do polipeptídeo codificado a partir dele, ou de outro polipeptídeo da invenção. A resposta imunológica pode ser usada terapêutica ou profilaticamente e pode tomar a forma de imunidade de anticorpo e/ou imunidade celular, tal como a 25 imunidade celular que se origina das células T CTL ou CD4+.

Os polipeptídeos de Proteína E, ou um fragmento deles, podem ser fundidos com uma co-proteína ou porção química, que pode ou não, sozinha, produzir anticorpos, porém que é capaz de estabilizar a primeira proteína e produzir uma proteína fundida ou modificada que terá 30 propriedades antigênicas e/ou imunogênicas, e preferivelmente propriedades protetoras. Assim, a proteína recombinante fundida, de preferência, adicionalmente compreende uma co-proteína antigênica, tal como a lipoproteína ou a proteína D de Haemophilus influenzae (EP 594610), a Glutationa-S-transferase (GST) ou a beta-galactosidase, ou qualquer outra co-proteína relativamente grande que solubilize a proteína e facilite a sua produção e purificação. Além disso, a co-proteína pode atuar como um 5 adjuvante no sentido de proporcionar um estímulo generalizado do sistema imune do organismo que recebe a proteína. A co-proteína pode ser unida à extremidade de amino ou carbóxi da primeira proteína.

Em uma composição de vacina de acordo com a invenção, os polipeptídeos e/ou os polinucleotídeos de Proteína E, ou um fragmento, ou 10 um mimótopo, ou uma variante deles, podem estar presentes em um vetor, tal como os vetores recombinantes vivos descritos acima, por exemplo, os vetores bacterianos vivos.

São também adequados os vetores não vivos para os polipeptídeos de Proteína E, por exemplo, as vesículas ou bolhas da 15 membrana externa bacteriana. As bolhas da OM são derivadas da membrana externa da membrana de duas camadas das bactérias Gramnegativas e foram documentadas em muitas bactérias Gram-negativas (Zhou, L et al. 1998. FEMS Microbiol. Lett, 163:223-228), incluindo a C. trachomatis e a C. psittaci. Uma lista não exaustiva de patógenos 20 bacterianos, descritos produzir bolhas, também inclui: Bordetella pertussis, Borrelia burgdorferi, Brucella melitensis, Brucella ovis, Esherichia coli, Haemophilus influenzae, Legionella pneumophila, Moraxella catarrhalis, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Pseudomonas aeruginosa e Yersinia enterocolitica.

As bolhas têm a vantagem de proporcionar proteínas da membrana externa em sua conformação nativa e são, assim, particularmente úteis para vacinas. As bolhas podem também ser melhoradas para uso em vacinas por engenharia da bactéria, de modo a modificar a expressão de uma ou mais moléculas na membrana externa.

Assim, por exemplo, a expressão de uma proteína imunogênica desejada na membrana externa, tal como os polipeptídeos de Proteína E, pode ser introduzida ou supra-regulada (por exemplo, por alteração do promotor). Em vez, ou além disso, a expressão das moléculas da membrana externa que não sejam relevantes (por exemplo, antígenos não protetores ou proteínas imunodominantes, porém variáveis) ou prejudiciais (por exemplo, moléculas tóxicas, tais como LPS, ou indutores potenciais de uma resposta autoimune) pode ser infra-regulada. Estas abordagens são discutidas em mais detalhe abaixo.

As regiões de flanqueio de não codificação dos genes da Proteína E contêm elementos reguladores importantes na expressão do gene. Esta regulação ocorre no nível tanto transcricional quanto traducional. A seqüência destas regiões, a montante ou a jusante do quadro de leitura aberto do gene, pode ser obtida por seqüenciamento de DNA. Esta informação de seqüência permite a determinação de motivos reguladores potenciais, tais como os diferentes elementos promotores, as seqüências terminadoras, os elementos de seqüências induzíveis, os repressores, os elementos responsáveis pela variação de fases, a seqüência de shinedalgarno, as regiões com estrutura secundária potencial envolvida na regulação, bem como outros tipos de motivos ou seqüências reguladoras. Esta seqüência é um aspecto adicional da invenção.

Esta informação de seqüência permite a modulação da expressão natural dos genes da Proteína E. A supra-regulação da expressão do gene pode ser efetuada por alteração do promotor, da seqüência de shine-dalgarno, dos elementos repressores ou operadores potenciais, ou de quaisquer outros elementos envolvidos. Também, a infra-regulação da expressão pode ser obtida por tipos similares de modificação. Alternativamente, por alteração das seqüências de variação de fases, a expressão do gene pode ser colocada sob o controle da variação de fases, ou ela pode ser desacoplada desta regulação. Em uma outra abordagem, a expressão do gene pode ser colocada sob o controle de um ou mais elementos induzíveis, permitindo a expressão regulada. Os exemplos de tal regulação incluem, porém não estão limitados à indução por mudança de temperatura, adição de substratos indutores, como os carboidratos selecionados ou os seus derivados, elementos em traços, vitaminas, cofatores, íons de metais, etc.

Tais modificações conforme descritas acima podem ser introduzidas por diversos meios diferentes. A modificação das seqüências envolvidas na expressão do gene pode ser realizada in vivo por mutagênese aleatória, seguida por seleção quanto ao fenótipo desejado. Uma outra abordagem consiste no isolamento da região de interesse e sua modificação por mutagênese aleatória, ou substituição sítio-dirigida, mutagênese por inserção ou remoção. A região modificada pode então ser introduzida novamente no genoma bacteriano por recombinação homóloga, e o efeito sobre a expressão do gene pode ser avaliado. Em uma outra abordagem, os dados de seqüência da região de interesse podem ser usados para substituir ou remover toda ou parte das seqüências reguladoras naturais. Neste caso, a região reguladora alvejada é isolada e modificada de modo a conter os elementos reguladores de um outro gene, uma combinação de elementos reguladores de diferentes genes, uma região reguladora sintética, ou qualquer outra região reguladora, ou remover as partes selecionadas das seqüências reguladoras do tipo selvagem. Estas seqüências modificadas podem então ser introduzidas novamente na bactéria, via recombinação homóloga, no genoma. Uma lista não exaustiva dos promotores preferidos que poderíam ser usados para a supra-regulação da expressão do gene inclui os promotores porA, porB, IbpB, tbpB, p110, Ist, hpuAB de N. meningitidis ou N. gonorroheae; ompCD, copB, IbpB, ompE, UspA1; UspA2; TbpB de M. Catarrhalis; p1, p2, p4, p5, p6, IpD, tbpB, D15, Hia, Hmw1, Hmw2 de H. influenzae.

Em um exemplo, a expressão do gene pode ser modulada trocando-se o seu promotor por um promotor mais forte (através de isolamento da seqüência a montante do gene, modificação in vitro desta seqüência, e introdução novamente no genoma por recombinação homóloga). A expressão supra-regulada pode ser obtida em ambas as bactérias, bem como nas vesículas da membrana externa, liberadas (ou preparadas) da bactéria.

Em outros exemplos, as abordagens descritas podem ser usadas para gerar cepas bacterianas recombinantes com características aperfeiçoadas para aplicações de vacinas. Estas podem ser, porém não estão limitadas às cepas atenuadas, cepas com expressão aumentada de antígenos selecionados, cepas com nocautes (ou expressão diminuída) de 5 genes interferindo com a resposta imune, cepas com expressão modulada de proteínas imunodominantes, cepas com liberação modulada de vesículas da membrana externa.

Assim, também é proporcionada pela invenção uma região a montante modificada dos genes da Proteína E, região a montante 10 modificada esta que contém um elemento regulador heterólogo que altera o nível de expressão das proteínas Proteína E localizadas na membrana externa. A região a montante de acordo com este aspecto da invenção inclui a seqüência a montante dos genes da Proteína E. A região a montante inicia imediatamente a montante dos genes da Proteína E e continua normalmente 15 até uma posição não mais do que cerca de 1000 bp a montante do gene a partir do códon de iniciação de ATG. No caso de um gene localizado em uma seqüência policistrônica (operon), a região a montante pode iniciar imediatamente precedendo o gene de interesse, ou precedendo o primeiro gene no operon. De preferência, uma região a montante modificada de 20 acordo com este aspecto da invenção contém um promotor heterólogo em ¹ uma posição entre 500 e 700 bp a montante do ATG.

O uso das regiões a montante descritas para supra-regular a expressão dos genes da Proteína E, um processo para atingir isto através de recombinação homóloga (por exemplo, conforme descrito em WO 01/09350 25 incorporado por referência neste documento), um vetor compreendendo uma seqüência a montante adequada para este propósito, e uma célula hospedeira assim alterada são todos aspectos adicionais desta invenção.

Assim, a invenção proporciona polipeptídeos de Proteína E, em uma bolha bacteriana modificada. A invenção adicionalmente proporciona 30 células hospedeiras modificadas, capazes de produzir os vetores de bolhas à base de membranas não vivas. A invenção adicionalmente proporciona vetores de ácidos nucléicos compreendendo os genes da Proteína E tendo uma região a montante modificada contendo um elemento regulador heterólogo.

São adicionalmente proporcionados pela invenção os processos para preparar as células hospedeiras e as bolhas bacterianas de acordo com 5 a invenção.

São também proporcionados por esta invenção as composições, particularmente as composições de vacinas, e os métodos compreendendo os polipeptídeos e/ou os polinucleotídeos da invenção e as seqüências de DNA imunoestimuladoras, tais como aqueles descritas em Sato, Y. et al., 10 Science 273: 352 (1996).

São também proporcionados por esta invenção os métodos que utilizam o polinucleotídeo descrito ou os seus fragmentos particulares, os quais tenham sido mostrados codificar regiões não variáveis das proteínas da superfície celular bacterianas, nas construções de polinucleotídeos 15 usadas em tais experimentos de imunização genética em modelos de animais de infecção com H. influenzae não tipificável. Tais experimentos serão particularmente úteis para identificar os epitopos de proteínas capazes de provocar uma resposta imune profilática ou terapêutica. Acredita-se que esta abordagem permitirá a preparação subseqüente de anticorpos 20 monoclonais de valor particular, derivados do órgão requerido do animal que resiste ou depura a infecção com êxito, para o desenvolvimento de agentes profiláticos ou tratamentos terapêuticos da infecção bacteriana, particularmente a infecção por H. influenzae não tipificável, em mamíferos, particularmente os seres humanos.

A invenção também inclui uma formulação de vacina que compreende um polipeptídeo e/ou polinucleotídeo recombinante imunogênico da invenção, juntamente com um veículo adequado, tal como um veículo farmaceuticamente aceitável. Visto que os polipeptídeos e os polinucleotídeos podem ser decompostos no estômago, cada um é 30 preferivelmente administrado parenteralmente, incluindo, por exemplo, a administração que é subcutânea, intramuscular, intravenosa, ou intradérmica. As formulações adequadas para a administração parenteral incluem as soluções de injeções estéreis aquosas e não-aquosas, as quais podem conter antioxidantes, tampões, compostos bacteriostáticos e solutos que tornam a formulação isotônica com o fluido corpóreo, preferivelmente o sangue, do indivíduo; e as suspensões estéreis aquosas e não-aquosas, as 5 quais podem incluir agentes de suspensão ou agentes espessantes. As formulações podem ser apresentadas em recipientes de dose de unidade ou de múltiplas doses, por exemplo, ampolas vedadas e frascos pequenos, e podem ser armazenadas em uma condição secada por congelamento, requerendo somente a adição do veículo líquido estéril imediatamente antes 10 do uso.

A formulação de vacina da invenção pode também incluir sistemas de adjuvantes para intensificar a imunogenicidade da formulação. De preferência, o sistema de adjuvante produz preferencialmente um tipo de resposta TH 1.

Uma resposta imune pode ser amplamente distinguida em duas categorias extremas, sendo uma resposta imune humoral ou mediada por célula (tradicionalmente caracterizada por mecanismos de proteção efetores de anticorpos e celulares, respectivamente). Estas categorias de resposta têm sido chamadas respostas do tipo TH1 (resposta mediada por célula), e 20 respostas imunes do tipo TH2 (resposta humoral).

¹ As respostas imunes do tipo TH1 extremas podem ser caracterizadas pela geração de linfócitos T citotóxicos, restritos de haplótipos, específicos para antígenos, e respostas de células exterminadoras naturais. Nos camundongos, as respostas do tipo TH1 são freqüentemente 25 caracterizadas pela geração de anticorpos do subtipo lgG2a, enquanto que no ser humano, estas correspondem aos anticorpos do tipo lgG1. As respostas imunes do tipo TH2 são caracterizadas pela geração de uma faixa ampla de isótipos de imunoglobulina, incluindo nos camundongos a lgG1, a IgA, e a IgM.

Pode ser considerado que a força impulsora atrás do desenvolvimento destes dois tipos de resposta imune são as citocinas. Os altos níveis de citocinas do tipo TH1 tendem a favorecer a indução das respostas imunes mediadas por células ao antígeno dado, enquanto que os altos níveis de citocinas do tipo TH2 tendem a favorecer a indução das respostas imunes humorais ao antígeno.

A distinção das respostas imunes do tipo TH1 e TH2 não é absoluta. Na realidade, um indivíduo suportará uma resposta imune que seja descrita como sendo predominantemente TH1 ou predominantemente TH2. Entretanto, é freqüentemente conveniente considerar as famílias de citocinas em termos daquilo descrito nos clones das células T CD4 +ve de murinos por Mosmann e Coffman (Mosmann, T.R. e Coffman, R.L. (1989) TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annual Review of Immunology, 7, p145-173). Tradicionalmente, as respostas do tipo TH2 estão associadas com a produção das citocinas INF-γ e IL-2 pelos linfócitos T. As outras citocinas freqüentemente associadas de modo direto com a indução das respostas imunes do tipo TH1 não são produzidas pelas células T, tais como a IL-12. Em contraste, as respostas do tipo TH2 estão associadas com a secreção de IL-4, IL-5, IL-6 e IL-13.

Sabe-se que certos adjuvantes de vacinas são particularmente adequados para a estimulação das respostas de citocinas do tipo TH1 ou TH2. Tradicionalmente, os melhores indicadores do equilíbrio entre TH1:TH2 da resposta imune, após uma vacinação ou infecção, incluem a medição direta da produção das citocinas TH1 ou TH2 pelos linfócitos T in vitro, após a estimulação novamente com antígeno, e/ou a medição da razão entre IgG 1 :lgG2a das respostas dos anticorpos específicos para antígenos.

Assim, um adjuvante do tipo TH1 é um que preferencialmente estimula as populações isoladas de células T a produzirem altos níveis de citocinas do tipo TH1 quando estimuladas novamente com antígeno in vitro, e promove o desenvolvimento tanto de linfócitos T citotóxicos CD8+ quanto respostas de imunoglobulinas específicas para antígenos associadas com o isótipo do tipo TH1.

Os adjuvantes que são capazes de estimulação preferencial da resposta das células TH1 são descritos nos Pedidos de Patentes

Internacionais N⁹s WO 94/00153 e WO 95/17209.

O monofosforil lipídio 3 des-O-acilado A (3D-MPL) é um tal adjuvante. Este é conhecido da GB 2220211 (Ribi). Quimicamente, ele é uma mistura de monofosforil lipídio 3 des-O-acilado A com 4, 5 ou 6 cadeias 5 aciladas e é produzido pela Ribi Immunochem, Montana. Uma forma preferida do monofosforil lipídio 3 des-O-acilado A é descrita na Patente Européia 0 689 454 B1 (SmithKline Beecham Biologicals SA).

De preferência, as partículas de 3D-MPL são pequenas o suficiente para serem filtradas estéreis através de uma membrana de 0,22 10 mícron (Patente Européia número 0 689 454).

O 3D-MPL estará presente na faixa de 10 pg - 100 pg, preferivelmente 25-50 pg por dose, onde o antígeno tipicamente estará presente em uma faixa de 2-50 pg por dose.

Um outro adjuvante preferido compreende o QS21, uma fração não tóxica purificada de Hplc, derivada da casca de Quillaja Saponaría Molina. Opcionalmente, este pode ser misturado com o monofosforil lipídio 3 des-O-acilado A (3D-MPL), opcionalmente junto com um veículo.

O método de produção de QS21 é descrito na patente US N^e5.057.540.

As formulações de adjuvantes não reatogênicas contendo o ' QS21 foram descritas anteriormente (WO 96/33739). Tais formulações compreendendo o QS21 e o colesterol mostraram ser adjuvantes estimuladores de TH1 bem-sucedidos quando formulados juntos com um antígeno.

Os adjuvantes adicionais que são estimuladores preferenciais da resposta de células TH1 incluem os oligonucleotídeos imunomoduladores, por exemplo, as seqüências de CpG não metiladas, como descritas no WO 96/02555.

As combinações de diferentes adjuvantes estimuladores de TH1, tais como aqueles mencionados aqui acima, são também contempladas como proporcionando um adjuvante que é um estimulador preferencial da resposta de células TH1. Por exemplo, o QS21 pode ser formulado juntamente com o 3D-MPL. A razão de QS21 : 3D-MPL tipicamente será na ordem de 1 : 10 a 10 : 1; preferivelmente 1:5 a 5 : 1 e de modo freqüente substancialmente 1 : 1. A faixa preferida para a sinergia ótima é 2,5 : 1 a 1 :

de 3D-MPL: QS21.

De preferência, um veículo está também presente na composição de vacina de acordo com a invenção. O veículo pode ser uma emulsão de óleo-em-água, ou um sal de alumínio, tal como o fosfato de alumínio ou o hidróxido de alumínio.

Uma emulsão de óleo-em-água preferida compreende um óleo metabolizável, tal como o esqualeno, o alfa-tocoferol e o Tween 80. Em um aspecto particularmente preferido, os antígenos na composição de vacina de acordo com a invenção são combinados com o QS21 e o 3D-MPL em tal emulsão. Adicionalmente, a emulsão de óleo-em-água pode conter o span 85 e/ou a lecitina e/ou a tricaprilina.

Tipicamente para a administração humana, o QS21 e o 3D-MPL estarão presentes em uma vacina na faixa de 1 pg - 200 pg, tal como 10-100 pg, preferivelmente 10 pg - 50 pg, por dose. Tipicamente, o óleo-em-água compreenderá de 2 a 10% de esqualeno, de 2 a 10% de alfa-tocoferol e de 0,3 a 3%· de tween 80. De preferência, a razão de esqualeno : alfa-tocoferol é igual a, ou menor do que, 1, conforme isto proporcione uma emulsão mais estável. O span 85 pode também estar presente em um nível de 1%. Em alguns casos, pode ser vantajoso que as vacinas da presente invenção adicionalmente contenham um estabilizador.

As emulsões de óleo-em-água não tóxicas preferivelmente contêm um óleo não tóxico, por exemplo, o esqualano ou o esqualeno, um emulsificante, por exemplo, o Tween 80, em um veículo aquoso. O veículo aquoso pode ser, por exemplo, a solução salina tamponada com fosfato.

Uma formulação de adjuvante particularmente potente, envolvendo o QS21, o 3D-MPL e o tocoferol em uma emulsão de óleo-emágua, é descrita no WO 95/17210.

Embora a invenção tenha sido descrita com referência a certos polipeptídeos e polinucleotídeos de Proteína E, é para ser entendido que esta cobre os fragmentos dos polipeptídeos e polinucleotídeos de ocorrência natural, e os polipeptídeos e os polinucleotídeos similares com adições, remoções ou substituições que não afetam substancialmente as propriedades imunogênicas dos polipeptídeos ou dos polinucleotídeos recombinantes. Os fragmentos/peptídeos preferidos são descritos no Exemplo 10.

A presente invenção também proporciona uma composição de vacina polivalente compreendendo uma formulação de vacina da invenção em combinação com outros antígenos, em particular os antígenos úteis para tratar a otite média. Tal composição de vacina polivalente pode incluir um adjuvante indutor de TH-1 como aqui antes descrito.

Em uma modalidade preferida, os polipeptídeos, os fragmentos e os imunógenos da invenção são formulados com um ou mais dos seguintes grupos de antígenos: a) um ou mais polissacarídeos capsulares pneumocócicos (simples ou conjugados a uma proteína veículo); b) um ou mais antígenos que possam proteger um hospedeiro contra a infecção por M. catarrhalis; c) um ou mais antígenos de proteínas que possam proteger um hospedeiro contra a infecção por Streptococcus pneumoniae; d) um ou mais antígenos de proteínas de Haemophilus influenzae não tipificável adicionais; e) um ou mais antígenos que possam proteger um hospedeiro contra o RSV; e f) um ou mais antígenos que possam proteger um hospedeiro contra o vírus influenza. As combinações com: os grupos a) e b); b) e c); b), d), e a) e/ou c); b), d), e), f), e a) e/ou c) são preferidas. Tais vacinas podem ser vantajosamente usadas como vacinas globais para otite média.

Os antígenos de polissacarídeos capsulares pneumocócicos são preferivelmente selecionados a partir dos serótipos 1,2,3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11 A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F e 33F (mais preferivelmente a partir dos serótipos 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19Fe23F).

Os antígenos de proteínas pneumocócicas preferidos são aquelas proteínas pneumocócicas que estão expostas sobre a superfície externa do pneumococo (capaz de serem reconhecidas pelo sistema imune de um hospedeiro durante pelo menos parte do ciclo de vida do pneumococo), ou são as proteínas que são secretadas ou liberadas pelo pneumococo. Mais preferivelmente, a proteína é uma toxina, adesina, transdutor de sinal de 2 componentes, ou lipoproteína de Streptococcus pneumoniae, ou os seus fragmentos. As proteínas particularmente preferidas incluem, porém não estão limitadas à: pneumolisina (preferivelmente destoxificada por tratamento químico ou mutação) [Mitchell et al. Nucleic Acids Res. 11 de julho de 1990; 18(13): 4010 Comparison of pneumolysin genes and proteins from Streptococcus pneumoniae types 1 and 2., Mitchell et al. Biochim Biophys Acta 23 de janeiro de 1989; 1007(1): 67-72 Expression of the pneumolysin gene in Escherichia coli: rapid purification and biological properties., WO 96/05859 (A. Cyanamid), WO 90/06951 (Paton e col), WO 99/03884 (NAVA)J; PspA e suas variantes de remoção de transmembrana (WO 92/14488; WO 99/53940; US 5804193 - Briles et al.); PspC e suas variantes de remoção de transmembrana (WO 99/53940; WO 97/09994 - Briles e col); PsaA e suas variantes de remoção de transmembrana (Berry e Paton, Infect Immun dezembro de 1996;64(12):5255-62 Sequence heterogeneity of PsaA, a 37-kilodalton putative adhesin essential for virulence of Streptococcus pneumoniae); proteínas de ligação de colina pneumocócicas e suas variantes de remoção de transmembrana; CbpA e suas variantes de remoção de transmembrana (WO 97/41151; WO 99/51266); Gliceraldeído-3-fosfato - desidrogenase (Infect. Immun. 1996 64:3544); HSP70 (WO 96/40928); PcpA (SanchezBeato et al. FEMS Microbiol Lett 1998, 164:207-14); proteína similar a M, pedido de patente SB N- EP 0837130; e adesina 18627 (Pedido de patente SB N- EP 0834568). Os antígenos de proteínas pneumocócicas preferidos adicionais são aqueles descritos em WO 98/18931, particularmente aqueles selecionados em WO 98/18930 e PCT/US99/30390.

Os antígenos de proteínas de Moraxella catarrhalis preferidos que podem ser incluídos em uma vacina de combinação (especialmente para a prevenção de otite média) são: OMP106 [WO 97/41731 (Antex) e WO 96/34960 (PMC)]; OMP21; LbpA e/ou LbpB [WO 98/55606 (PMC)]; TbpA e/ou TbpB [WO 97/13785 e WO 97/32980 (PMC)]; CopB [Helminen ME, et al. (1993) Infect. Immun. 61:2003-2010]; UspA1 e/ou UspA2 [WO 93/03761 (Universidade do Texas)]; OmpCD; HasR (PCT/EP99/03824); PilQ (PCT/EP99/03823); OMP85 (PCT/EP00/01468); Iipo06 (GB 9917977.2); Iipo10 (GB 9918208.1); lipol 1 (GB 9918302.2); Iipo18 (GB 9918038.2); P6 (PCT/EP99/03038); D15 (PCT/EP99/03822); OmplAI (PCT/EP99/06781); Hly3 (PCT/EP99/03257); e OmpE.

Os antígenos de proteínas de Haemophilus influenzae não tipificável adicionais preferidos, que podem ser incluídos em uma vacina de combinação (especialmente para a prevenção de otite média), incluem: a proteína fimbrina [(US 5766608 - Ohio State Research Foundation)] e as fusões compreendendo os peptídeos a partir delas [por exemplo, as fusões de peptídeos LB1 (f); US 5843464 (OSU) ou WO 99/64067]; a,OMP26 [WO 97/01638 (Cortecs)]; a P6 [EP 281673 (Universidade do Estado de Nova York)]; a proteína D (EP 594610); a TbpA e/ou TbpB; Hia; Hsf; Hin47; Hif; Hmw1; Hmw2; Hmw3; Hmw4; Hap; D15 (WO 94/12641); P2; P5 (WO 94/26304); NlpC2 (BASB205) [WO 02/30971]; Slp (BASB203) [WO 02/30960]; e ÍOMP1681 (BASB210) [WO 02/34772].

Os antígenos do vírus influenza preferidos incluem o vírus inteiro, vivo ou inativado, o vírus influenza dividido, desenvolvido em ovos ou células MDCK, ou células Vero ou virossomos flu inteiros (como descritos por R. Gluck, Vaccine, 1992, 10, 915-920) ou as suas proteínas purificadas ou recombinantes, tais como HA, NP, NA, ou as proteínas M, ou as suas combinações.

Os antígenos de RSV (Vírus Sincicial Respiratório) preferidos incluem a glicoproteína F, a glicoproteína G, a proteína HN, ou os seus derivados.

Composições, kit e administração

Em um aspecto adicional da invenção, proporcionam-se composições compreendendo polinucleotídeos de Proteína E e/ou polipeptídeos de Proteína E para a administração a uma célula ou a um organismo multicelular.

A invenção também se refere às composições compreendendo um polinucleotídeo e/ou um polipeptídeo discutidos neste documento ou os seus agonistas ou antagonistas. Os polipeptídeos e os polinucleotídeos da invenção podem ser empregados em combinação com um veículo, ou 5 veículos, não estéril ou estéril, para uso com células, tecidos ou organismos, tal como um veículo farmacêutico adequado para a administração a um indivíduo. Tais composições compreendem, por exemplo, um aditivo de meio de cultura ou uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptídeo e/ou polinucleotídeo da invenção e um veiculo ou excipiente farmaceuti10 camente aceitável. Tais veículos podem incluir, porém não estão limitados a solução salina, solução salina tamponada, dextrose, água, glicerol, etanol e suas combinações. A formulação deve adequar-se ao modo de administração. A invenção adicionalmente se refere aos pacotes e kits diagnósticos e farmacêuticos compreendendo um ou mais recipientes enchidos com um 15 ou mais dos ingredientes das composições da invenção antes mencionadas.

Os polipeptídeos, os polinucleotídeos e os outros compostos da invenção podem ser empregados sozinhos ou em conjunção com outros compostos, tais como os compostos terapêuticos.

As composições farmacêuticas podem ser administradas em 20 qualquer maneira eficaz, conveniente, incluindo, por exemplo, a administração pelas rotas tópica, oral, anal, vaginal, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutânea, intranasal ou intradérmica, entre outras.

Na terapia, ou como um profilático, o agente ativo pode ser administrado a um indivíduo como uma composição injetável, por exemplo, 25 como uma dispersão aquosa estéril, preferivelmente isotónica.

Em um aspecto adicional, a presente invenção proporciona composições farmacêuticas compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptídeo e/ou polinucleotídeo, tal como a forma solúvel de um polipeptídeo e/ou polinucleotídeo da presente invenção, 30 peptídeo agonista ou antagonista ou composto de molécula pequena, em combinação com um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Tais veículos incluem, porém não estão limitados à solução salina, solução salina tamponada, dextrose, água, glicerol, etanol, e suas combinações. A invenção adicionalmente refere-se aos pacotes e kits farmacêuticos compreendendo um ou mais recipientes enchidos com um ou mais dos ingredientes das composições da invenção antes mencionadas. Os polipeptídeos, os polinucleotídeos e os outros compostos da presente invenção podem ser empregados sozinhos ou em conjunção com outros compostos, tais como os compostos terapêuticos.

A composição será adaptada à rota de administração, por exemplo, através de uma rota sistêmica ou uma oral. As formas preferidas de administração sistêmica incluem a injeção, tipicamente por injeção intravenosa. As outras rotas de injeção, tais como subcutâneas, intramusculares, ou intraperitoneais, podem ser usadas. Os meios alternativos para a administração sistêmica incluem a administração transmucosa e transdérmica usando penetrantes, tais como os sais biliares ou os ácidos fusídicos ou outros detergentes. Além disso, se um polipeptídeo ou outros compostos da presente invenção puderem ser formulados em uma formulação entérica ou uma encapsulada, a administração oral pode também ser possível. A administração destes compostos pode também ser tópica e/ou localizada, na forma de pomadas, pastas, géis, soluções, pós e similares.

Para a administração aos mamíferos, e particularmente aos seres humanos, espera-se que o nível de dosagem diário do agente ativo seja de 0,01 mg/kg a 10 mg/kg, tipicamente em torno de 1 mg/kg. O médico em qualquer situação determinará a dosagem real que será mais adequada para um indivíduo e variará com a idade, o peso e a resposta do indivíduo particular. As dosagens acima mencionadas são ilustrativas do caso médio. Pode haver situações individuais, obviamente, onde forem merecidas faixas de dosagens mais elevadas ou menores, e tais estão dentro do escopo desta invenção.

A faixa de dosagens requerida depende da escolha do peptídeo, da rota de administração, da natureza da formulação, da natureza da condição do paciente, e do julgamento do profissional presente. As dosagens adequadas, entretanto, estão na faixa de 0,1-100 qg/kg do paciente.

Uma composição de vacina está convenientemente na forma injetável. Os adjuvantes convencionais podem ser empregados para 5 intensificar a resposta imune. Uma dose de unidade adequada para a vacinação é 0,5-5 microgramas/kg de antígeno, e tal dose é preferivelmente administrada 1-3 vezes e com um intervalo de 1-3 semanas. Com a faixa de doses indicada, não será observado nenhum efeito toxicològico adverso com os compostos da invenção, o que impossibilitaria a sua administração aos 10 indivíduos adequados.

Entretanto, são para serem esperadas amplas variações na dosagem necessária em vista da variedade de compostos disponíveis e das eficiências diferentes das diversas rotas de administração. Por exemplo, a administração oral seria esperada requerer dosagens mais elevadas do que 15 a administração por injeção intravenosa. As variações nestes níveis de dosagens podem ser ajustadas usando rotinas empíricas-padrão para a otimização, conforme é bem-entendido na técnica.

Banco de Dados de Seqüências, Seqüências em um Meio Tangível, e Algoritmos

As seqüências de polinucleotídeos e polipeptídeos formam uma fonte valiosa de informação com a qual se determina as suas estruturas bi- e tridimensionais, bem como se identifica mais seqüências de homologia similar. Estas abordagens são mais facilmente facilitadas armazenando-se a seqüência em um meio legível por computador e então se usando os dados 25 armazenados em um programa conhecido de estrutura macromolecular ou para pesquisar um banco de dados de seqüências usando ferramentas de busca bem-conhecidas, tais como o pacote de programa GCG.

São também proporcionados pela invenção os métodos para a análise das seqüências ou das séries de caracteres, particularmente as 30 seqüências genéticas ou as seqüências de proteínas codificadas. Os métodos preferidos de análise de seqüência incluem, por exemplo, os métodos de análise da homologia da seqüência, tal como a análise da identidade e da similaridade, a análise da estrutura de DNA, RNA e proteína, a estrutura da seqüência, a análise de cladística, a análise do motivo da seqüência, a determinação do quadro de leitura aberto, a designação da base de ácido nucléico, a análise do uso do códon, a ordenação da base de ácido nucléico, e a análise de pico de cromatograma de seqüenciamento.

Um método á base de computador é proporcionado para efetuar a identificação da homologia. Este método compreende as etapas de: proporcionar uma primeira seqüência de polinucleotídeos compreendendo a seqüência de um polinucleotídeo da invenção em um meio legível por computador; e comparar a dita primeira seqüência de polinucleotídeos com pelo menos uma segunda seqüência de polinucleotídeos ou polipeptídeos, para identificar a homologia.

Um método à base de computador é também proporcionado para efetuar a identificação da homologia, o dito método compreendendo as etapas de: proporcionar uma primeira seqüência de polipeptídeos compreendendo a seqüência de um polipeptídeo da invenção em um meio legível por computador; e comparar a dita primeira seqüência de polipeptídeos com pelo menos uma segunda seqüência de polinucleotídeos ou polipeptídeos, para identificar a homologia.

Todas as publicações e referências, incluindo, porém não limitadas, as patentes e os pedidos de patentes, citadas neste relatório descritivo são incorporadas neste documento por referência em sua totalidade, como se cada publicação ou referência individual fosse específica e individualmente indicada para ser incorporada por referência neste documento como sendo inteiramente descrita. Qualquer pedido de patente para o qual este pedido reivindica prioridade é também incorporado por referência neste documento em sua totalidade, no modo descrito acima para as publicações e as referências.

Definições

A identidade, conforme conhecida na técnica, é uma relação entre duas ou mais seqüências de polipeptídeos ou duas ou mais seqüências de polinucleotídeos, conforme possa ser o caso, como determinada por comparação das seqüências. Na técnica, a identidade também significa o grau de relação de seqüências entre as seqüências de polipeptídeos ou polinucleotídeos, conforme possa ser o caso, como determinado pela correspondência entre as séries de caracteres de tais seqüências. A identidade pode ser prontamente calculada por métodos conhecidos, incluindo, porém não limitados àqueles descritos em (Computational Molecular Biologv, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte I, Griffin, A.M., e Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heine, G., Academic Press, 1987; e Sequence Analysis Iniciador, Gribskov, M. e Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; e Carillo, H., e Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988). Os métodos para determinar a identidade são projetados para dar a maior correspondência entre as seqüências testadas. Além disso, os métodos para determinar a identidade são codificados em programas de computador publicamente disponíveis. Os métodos de programas de computador para determinar a identidade entre duas seqüências incluem, porém não estão limitados ao programa GAP no pacote de programa GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN (Altschul, S.F. et al., J. Molec. Biol. 215: 403-410 (1990), e FASTA (Pearson e Lipman Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85; 2444-2448 (1988). A família de programas BLAST está publicamente disponível a partir de NCBI e outras fontes (BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S„ et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990). O algoritmo bastante conhecido de Smith Waterman pode também ser usado para determinar a identidade.

Os parâmetros para a comparação das seqüências de polipeptídeos incluem os que seguem:

Algoritmo: Needleman e Wunsch, J. Mol Biol. 48: 443-453 (1970) Matriz de comparação: BLOSSUM62 de Henikoff e Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 89:10915-10919 (1992)

Gap Penalty: 8

Gap lenght Penalty: 2

Um programa útil com estes parâmetros está publicamente disponível como o programa gap da Genetics Computer Group, Madison Wl. Os parâmetros 5 antes mencionados são os parâmetros preestabelecidos para as comparações dos peptideos (juntamente com nenhuma gap penalty para as extremidades).

Os parâmetros para a comparação de polinucleotídeos incluem os que seguem:

Algoritmo: Needleman e Wunsch, J. Mol Biol. 48: 443-453 (1970)

Matriz de comparação: correspondências = +10, correspondência inadequada = 0

Gap Penalty: 50

Gap legth penalty: 3

Disponível como: O programa gap da Genetics Computer Group, Madison Wl. Estes são os parâmetros preestabelecidos para as comparações dos ácidos nucléicos.

Um significado preferido para identidade para os polinucleotídeos e os polipeptídeos, conforme possa ser o caso, é 20 proporcionado em (1) e (2) abaixo.

• (1) As modalidades de polinucleotídeos adicionalmente incluem um polinucleotídeo isolado compreendendo uma seqüência de polinucleotídeos tendo pelo menos uma identidade de 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97 ou 100% com a seqüência de referência de SEQ ID NO: 11, onde a 25 dita seqüência de polinucleotídeos pode ser idêntica à seqüência de referência de SEQ ID NO: 11 ou pode incluir até um certo número inteiro de alterações de nucleotídeos em comparação com a seqüência de referência, onde as ditas alterações são selecionadas a partir do grupo que consiste em pelo menos uma remoção, substituição, incluindo a transição e a transversão, 30 ou inserção de nucleotídeos, e onde as ditas alterações podem ocorrer nas posições terminais 5' ou 3' da seqüência de nucleotídeos de referência ou em qualquer lugar entre estas posições terminais, intercaladas individualmente entre os nucleotídeos na seqüência de referência ou em um ou mais grupos contíguos dentro da seqüência de referência, e onde o dito número de alterações de nucleotídeos é determinado multiplicando-se o número total de nucleotídeos em SEQ ID NO: 11 pelo número inteiro definindo a porcentagem de identidade divididos por 100 e então subtraindose este produto do dito número total de nucleotídeos em SEQ ID NO: 11, ou: ⁿn - ^xn ’ (^xn · Y).

onde n_n é o número de alterações de nucleotídeos, x_r, é o número total de nucleotídeos em SEQ ID NO: 11, y é 0,50 para 50%, 0,60 para 60%, 0,70 para 70%>, 0,80 para 30%, 0,85 para 85%, 0,90 para 90%, 0,95 para 95%, 0,97 para 97%. ou 1,00 para 100%, e · é o símbolo para o operador de multiplicação, e onde qualquer produto que não seja um número inteiro de x_ne y é arredondado para o número inteiro mais próximo, antes de subtrai-lo de x_n. As alterações das seqüências de polinucleotídeos codificando os polipeptídeos de SEQ ID NOs: 1-10 podem criar mutações sem sentido, de sentido equívoco ou de deslocamento nesta seqüência de codificação e, desse modo, alteram o polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo após tais alterações.

Como forma de exemplo, uma seqüência de polinucleotídeos da presente invenção pode ser idêntica às seqüências de referência de SEQ ID NO: 11, ou seja, ela pode ser 100% idêntica, ou ela pode incluir até certo número inteiro de alterações de ácidos nucléicos, em comparação com a seqüência de referência, de modo tal que a porcentagem de identidade seja menor do que 100% de identidade. Tais alterações são selecionadas a partir do grupo que consiste em pelo menos uma deleção, substituição, incluindo a transição e a transversão, ou inserção de ácido nucléico, e onde as ditas alterações podem ocorrer nas posições terminais 5' ou 3' da seqüência de polinucleotídeos de referência ou em qualquer lugar entre estas posições terminais, intercaladas individualmente entre os ácidos nucléicos na seqüência de referência ou em um ou mais grupos contíguos dentro da seqüência de referência. O número de alterações de ácidos nucléicos para uma dada porcentagem de identidade é determinado multiplicando-se o número total de ácidos nucléicos em SEQ ID NO: 11 pelo número inteiro definindo a porcentagem de identidade divididos por 100 e então subtraindose este produto do dito número total de ácidos nucléicos em SEQ ID NO: 11, ou:

n_n <x_n - (x_n * y), onde n_n é o número de alterações de ácidos nucléicos, x_n é o número total de ácidos nucléicos em SEQ ID NO: 11, y é, por exemplo, 0,70 para 70%, 0,80 para 80%, 0,85 para 85%, etc., · é o símbolo para o operador de multiplicação, e onde qualquer produto que não seja um número inteiro de x_n10 e y é arredondado para o número inteiro mais próximo, antes de subtrai-lo de x_n.

(2) As modalidades de polipeptídeos adicionalmente incluem um polipeptídeo isolado compreendendo um polipeptídeo tendo pelo menos uma identidade de 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97 ou 100% com a 15 seqüência de referência de polipeptídeos de SEQ ID NOs: 1-10, onde a dita seqüência de polipeptídeos pode ser idêntica à seqüência de referência de SEQ ID NOs: 1-10 ou pode incluir até um certo número inteiro de alterações de aminoácidos em comparação com a seqüência de referência, onde as ditas alterações são selecionadas a partir do grupo que consiste em pelo 20 menos uma remoção, substituição, incluindo a substituição conservativa e não-conservativa, ou inserção de aminoácidos, e onde as ditas alterações podem ocorrer nas posições amino- ou carbóxi-terminais da seqüência de referência de polipeptídeos ou em qualquer lugar entre estas posições terminais, intercaladas individualmente entre os aminoácidos na seqüência 25 de referência ou em um ou mais grupos contíguos dentro da seqüência de referência, e onde o dito número de alterações de aminoácidos é determinado multiplicando-se o número total de aminoácidos em SEQ ID NOs: 1-10 pelo número inteiro definindo a porcentagem de identidade divididos por 100 e então subtraindo-se este produto do dito número total de 30 aminoácidos em SEQ ID NOs: 1-10, respectivamente, ou:

ⁿa - ^xa ’ (^xa · Y)>

onde n_a é o número de alterações de aminoácidos, x_a é o número total de aminoácidos em SEQ ID NOs: 1-10, y é 0,50 para 50%, 0,60 para 60%, 0,70 para 70%, 0,80 para 80%, 0,85 para 85%, 0,90 para 90%, 0,95 para 95%, 0,97 para 97% ou 1,00 para 100%, e · é o símbolo para o operador de multiplicação, e onde qualquer produto que não seja um número inteiro de x_ae y é arredondado para o número inteiro mais próximo, antes de subtrai-lo de x_a.

Como forma de exemplo, uma seqüência de polipeptídeos da presente invenção pode ser idêntica à seqüência de referência de SEQ ID NOs: 1-10, ou seja, ela pode ser 100%. idêntica, ou ela pode incluir até certo número inteiro de alterações de aminoácidos, em comparação com a seqüência de referência, de modo tal que a porcentagem de identidade seja menor do que 100% de identidade. Tais alterações são selecionadas a partir do grupo que consiste em pelo menos uma remoção, substituição, incluindo a substituição conservativa e não-conservativa, ou inserção de aminoácidos, e onde as ditas alterações podem ocorrer nas posições amino- ou carbóxiterminais da seqüência de referência de polipeptídeos ou em qualquer lugar entre estas posições terminais, intercaladas individualmente entre os aminoácidos na seqüência de referência ou em um ou mais grupos contíguos dentro da seqüência de referência. O número de alterações de aminoácidos para uma dada % de identidade é determinado multiplicando-se o número total de aminoácidos em SEQ ID NOs: 1-10 pelo número inteiro definindo a porcentagem de identidade divididos por 100 e então subtraindose este produto do dito número total de aminoácidos em SEQ ID NOs: 1-10, ou:

n_a <x_a - (x_a · y), onde n_a é o número de alterações de aminoácidos, x_a é o número total de aminoácidos em SEQ ID NOs: 1-10, y é, por exemplo, 0,70 para 70%, 0,80 para 80%, 0,85 para 85% etc., e · é o símbolo para o operador de multiplicação, e onde qualquer produto que não seja um número inteiro de x_ae y é arredondado para o número inteiro mais próximo, antes de subtrai-lo de x_a.

Oís) indivíduo(s)^,, ₎ quando usado(s) neste documento com referência a um organismo, significa(m) um eucarioto multicelular, incluindo, porém não limitado a um metazoário, um mamífero, um ovíparo, um bovídeo, um símio, um primata, e um ser humano.

Isolado significa alterado pela mão do homem do seu estado natural, et al., se ele ocorre na natureza, ele foi alterado ou removido de seu ambiente original, ou ambos. Por exemplo, um polinucleotídeo ou um polipeptídeo naturalmente presente em um organismo vivo não é isolado, porém o mesmo polinucleotídeo ou polipeptídeo separado dos materiais coexistentes de seu estado natural é isolado, conforme o termo é empregado neste documento. Além disso, um polinucleotídeo ou polipeptídeo que é introduzido em um organismo por transformação, manipulação genética ou por qualquer outro método recombinante é isolado, mesmo se ele ainda estiver presente no dito organismo, organismo este que pode ser vivo ou não-vivo.

O(s) polinucleotídeo(s) geralmente refere(m)-se a qualquer polirribonucleotídeo ou polidesoxirribonucleotídeo, o qual pode ser o RNA ou o DNA não modificado ou o RNA ou o DNA modificado, incluindo as regiões de fitas simples e duplas.

A variante refere-se a um polinucleotídeo ou polipeptídeo que difere de um polinucleotídeo ou polipeptídeo de referência, porém conserva propriedades essenciais. Uma variante típica de um polinucleotídeo difere na seqüência de nucleotídeos de uma outra, o polinucleotídeo de referência. As alterações na seqüência de nucleotídeos da variante podem ou não alterar a seqüência de aminoácidos de um polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo de referência. As alterações de nucleotídeos podem resultar em substituições, adições, remoções, fusões e truncamentos de aminoácidos no polipeptídeo codificado pela seqüência de referência, conforme discutido abaixo. Uma variante típica de um polipeptídeo difere na seqüência de aminoácidos de uma outra, o polipeptídeo de referência. Geralmente, as diferenças estão limitadas de modo que as seqüências do polipeptídeo de referência e a variante sejam estreitamente similares globalmente e, em muitas regiões, idênticas. Uma variante e o polipeptídeo de referência podem diferir na seqüência de aminoácidos por uma ou mais substituições, adições, remoções em qualquer combinação. Um resíduo de aminoácido substituído ou inserido pode ou não ser um codificado pelo código genético. Uma variante de um polinucleotídeo ou polipeptídeo pode 5 ser uma de ocorrência natural, tal como uma variante alélica, ou ela pode ser uma variante que não seja sabida ocorrer naturalmente. As variantes que não ocorrem naturalmente de polinucleotídeos e polipeptídeos podem ser preparadas por técnicas de mutagênese ou por síntese direta.

A(s) doença(s) significa(m) qualquer doença causada por, ou relacionada à, infecção por uma bactéria, incluindo, por exemplo, a otite média em bebês e crianças, a pneumonia em idosos, a sinusite, as infecções nosocomiais e as doenças invasivas, a otite média crônica com perda de audição, o acúmulo de fluidos no ouvido médio, o dano ao nervo auditivo, o aprendizado retardado da fala, a infecção do trato respiratório 15 superior e a inflamação do ouvido médio.

Parte experimental

Os exemplos abaixo são realizados usando técnicas-padrão, que são bem-conhecidas e rotina para aqueles versados na técnica, exceto onde de outro modo descrito em detalhe. Os exemplos são ilustrativos, 20 porém não limitam a invenção.

A presente investigação descreve o isolamento, a purificação, a caracterização, a clonagem e a expressão da nova proteína da membrana externa, chamada proteína E (pE) de H. influenzae, e da nova pE(A) recombinante truncada que foi descoberta usando um soro de mieloma de 25 IgD(X) humana.

Materiais e métodos

Reaqentes

As cepas de H. influenzae do tipo b MinnA e NTHÍ3655 foram gentilmente obtidas de Robert S. Munson Jr. (Washington University School 30 of Medicine (St. Louis, MO)). A cepa de H. influenzae não tipificável NTHÍ772 era um isolado clínico de uma cultura de esfregaço nasofaríngeo em nosso Departamento (2). Uma série de espécies de Haemophilus diferentes foi também analisada e é descrita na Tabela 1. O soro integral de mieloma de

IgD humana IgD(À) foi adquirido do The Binding Site (Brimingham,

Inglaterra). Para produzir um anti-soro anti-pE específico, os coelhos foram imunizados de modo intramuscular com 200 gg de pE22-160 recombinante [pE(A)j emulsificada em adjuvante de Freunds completo (Difco, Becton Dickinson, Heidelberg, Alemanha) ou peptídeo de pE41-68 conjugado à hemocianina de lapa de buraco de fechadura (KLH) e reforçados nos dias 18 e 36 com a mesma dose de proteína em adjuvantes de Freunds incompletos.

O sangue foi extraído 2 a 3 semanas depois. Os anticorpos policlonais resultantes foram isolados através de cromatografia por afinidade usando a pE(A) ou um peptídeo de pE específico (pE41-68) conjugado a CnBrSepharose (11). A IgD anti-humana em cabra conjugada à peroxidase da raiz forte (HRP) era da Biosource (Camarillo, CA). Os pAb anti-lgD humana em coelho eram da Dakopatts (Gentofte, Dinamarca).

A IgD anti-humana em camundongo conjugada ao isotiocianato de fluoresceína (FITC), as cadeias leves anti-humanas em coelho conjugadas à HRP (k e λ), e as imunoglobulinas policlonais anticoelho em porco conjugadas ao FITC foram adquiridas da Dakopatts.

Extração e purificação da proteína E

O H. influenzae tipo b (MinnA) foi desenvolvido durante a noite em caldo de infusão de cérebro coração (BHI) (Difco Laboratories, Detroit, Mich.) suplementado com NAD e hemina (Sigma, St. Louis, MO), cada a 10 gg/ml. Após duas lavagens, as bactérias foram extraídas em tampão de TrisHCI a 0,05 M (pH 8,8) contendo 0,5% de Empigen¹' (Calbiochem 25 Novabiochem, Bedford, MA). A suspensão bacteriana foi misturada por agitação magnética por 2 h a 37-'C. Após centrifugação a 8000 x g por 20 min a 4-C, o sobrenadante foi filtrado com filtro estéril (0,45 gm; Sterivex-HV,

Millipore). O extrato de H. influenzae em 0,5 % de Empigen^' foi aplicado a uma coluna de Q-sepharose (Amersham Pharmacia Biotech) equilibrada 30 com Tris-HCI a 0,05 M (pH 8,8) contendo uréia a 6 Μ. A coluna foi eluída usando um gradiente linear a NaCI de 0 a 1 M no mesmo tampão. As frações que foram detectadas pelo soro de mieloma de IgD(À) foram reunidas, dialisadas em tubos de membrana Spectraphor (corte de peso molecular 6-8.000; Spectrum, Laguna hills, CA) contra Tris-HCI a 0,05 M, pH

8,8, e concentradas sobre membranas de discos YM100 (corte de peso molecular 10.000; Amicon, Beverly, MA).

SDS-PAGE e detecção das proteínas sobre membranas (Western blot)

A SDS-PAGE foi corrida em voltagem constante de 150 usando géis de Bis-Tris a 10 % com corrida (MES), amostra (LDS), e tampão de transferencia, bem como um instrumento de manchar da Novex (San Diego, CA). As amostras foram regularmente aquecidas a 100²C por 10 min. Os géis foram coloridos com Azul-Brilhante de Coomassie R-250 (13; Bio-Rad, Sundbyberg, Suécia). A transferência eletroforética das bandas de proteínas do gel para uma membrana immobilon-P (Millipore, Bedford, MA) foi efetuada a 30 V por 2 a 3 h. Após a transferência, a membrana immobilon-P foi bloqueada em PBS com 0,05 % de Tween 20 (PBS-Tween) contendo 5 % de pó de leite. Após diversas lavagens em PBS-Tween, a membrana foi incubada com proteína de mieloma de IgD purificada (0,5 pg/ml, mieloma de IgD(À) hu; The Bindingsite) em PBS-Tween incluindo 2 % de pó de leite, por 1 h, na temperatura ambiente. A IgD anti-humana em cabra conjugada à HRP diluída 1/1000 foi adicionada após diversas lavagens em PBS-Tween. Após incubação por 40 min na temperatura ambiente e diversas lavagens adicionais em PBS-Tween, o desenvolvimento foi efetuado com reagentes de detecção de Western blotting ECL (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suécia).

Eletroforese em gel de poliacrilamida-SDS bidimensional (2-D PAGE) e Western blot

Após a cromatografia de troca iônica, os extratos de Empigen® de H. influenzae (MinnA) foram submetidos à focalização isoelétrica (IEF) usando o Sistema IPGphor IEF (Amersham Pharmacia Biotech) (5, 12). Para a calibração do gel, um padrão foi usado (n^s do cat. 161-0320; Bio-Rad). Os géis de poliacrilamida 2-D foram eletromanchados para filtros ImmobilonPVDF (0,45 mm; Millipore, Bedford, EUA) a 120 mA, durante a noite. Após a saturação, as etapas de incubação, bloqueio e lavagem foram efetuadas conforme descrito acima.

Análise da seqüência de aminoácidos

A análise da seqüência de aminoácidos automatizada foi efetuada com um seqüenciador de fases de gás-líquido sólido 470A da

Applied Biosystems (Foster City, CA).

Construção de uma biblioteca genômica de H. influenzae

O DNA cromossòmico foi preparado a partir da cepa 772 por utilização de uma modificação do método de Berns e Thomas (2, 13). Resumidamente, uma biblioteca genômica de H. influenzae 772 foi 10 construída a partir de 40 pg de DNA, que foi parcialmente digerido com Sau3A por 1 h. O DNA clivado foi fracionado sobre um gradiente de sacarose (14). As frações contendo os fragmentos de DNA de tamanhos apropriados (2 a 7 kbp) foram reunidas, e o DNA foi ligado ao pUC18 digerido com SamHI, seguido por transformação na Escherichia coli JM82 15 por eletroporação usando um pulsador Gene (Bio-Rad, Richmond CA). As bactérias foram preparadas sobre LB ágar suplementado com ampicilina e X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-p-D-galactopiranosídeo).

Imunoensaio da colônia, isolamento do DNA e seqüenciamento

Os transformantes de E. coli, cultivados durante a noite sobre LB .

ágar, foram transferidos para filtros de nitrocelulose (Sartorius, Gõttingen, • Alemanha) cobrindo-se as superfícies do ágar com filtros secos. As placas foram deixadas por 15 min, e as células foram lisadas por exposição ao vapor saturado de clorofórmio por 20 min. Os sítios residuais de ligação à proteína sobre os filtros foram bloqueados por incubação dos filtros em 25 solução salina balanceada com Tris contendo ovalbumina (cloridrato de Tris a 50 mM, NaCI a 154 mM, 1,5 % de ovalbumina [pH 7,4]) por 30 min. Após serem bloqueados, os filtros foram incubados com IgD(X) humana por 30 min. Os anticorpos policlonais anti-lgD humana conjugados à HRP foram adicionados após as lavagens e os filtros foram incubados por 30 min. Todas 30 as incubações foram feitas na temperatura ambiente. Finalmente, os filtros foram desenvolvidos usando o 4-cloro-1-naftol e o H₂O₂. Os clones positivos foram coletados e o DNA de plasmídio pUC18 contendo o DNA genômico de

NTHÍ772 foi purificado. O inserto de DNA de NTHÍ772 resultante foi seqüenciado usando os iniciadores de flanqueio M13+ e M13- e o kit de seqüenciamento da reação BigDye Terminator Cycle Sequencing v. 2.0 Ready (Perkin-Elmer, Foster City, Ca). A seqüência de inserto obtida (3,55 kbp) correspondia a uma extensão contendo DNA codificando a proteína HI0175, HI0176, HI0177, e finalmente HI0178 (15).

Clonagem do DNA e expressão da proteína

Todas as construções foram produzidas usando fragmentos amplificados por PCR. O DNA genômico de NTHi 772 contendo pUC18 (HI0175 até HI0178) foi usado como molde. A marca de DNA polimerase era da Roche (Mannheim, Alemanha) e as condições da PCR eram conforme recomendadas pelo fabricante. Os quadros de leitura abertos das quatro proteínas preditivas HI0175 até HI0178 foram clonados, porém somente o procedimento descrevendo a clonagem de HID (HI0178) foi incluído aqui. A pE²²'¹*⁰ [designada pE(A)] estava desprovida do peptídeo de sinal endógeno incluindo o resíduo de aminoácido glutamina²¹ e foi amplificada por PCR usando os iniciadores 5'- ctcaggatccaaaggctgaacaaaatgatgtg-3' e 5 ggtgcagattaagcttttttttatcaactg-3' introduzindo os sítios de enzimas de restrição BamHI e HindfW. Para fundir 6 resíduos de histidina codificados pelo vetor de expressão, o códon de interrupção de pE²²'¹⁶⁰ foi mutado. O quadro de leitura aberto de 417 bp resultante do gene pe foi ligado em pET26(+) (Novagen, Darmstadt, Alemanha). Para evitar a toxicidade presumida, os plasmídios resultantes foram primeiramente transformados na E. coli hospedeira DH5a. Após isso, os plasmídios codificando pE e pE(A) foram transformados no hospedeiro de expressão BL21 (DE3). Além da pE e da pE(A) de tamanho natural, uma série de variantes de pE truncadas foi produzida. Um esquema é mostrado na figura 8. Os iniciadores contendo BamHI e Hind\\\ foram usados para todas as construções. Os procedimentos para as variantes truncadas foram conforme descritos acima. Todas as construções foram seqüenciadas usando o kit de seqüenciamento da reação BigDye Terminator Cycle Sequencing v. 2.0 Ready (Perkin-Elmer, Foster City, Ca).

Para produzir as proteínas recombinantes, as bactérias foram desenvolvidas até a fase semilog (D0₆go 0,6 a Ο,θ), seguido por indução com isopropil-1-tio-p-D-galactosídeo (IPTG) a 1 mM, resultando na superexpressão de pE(A). Quando a DO_e,oo atingiu 1,5 a 1,7, as bactérias foram coletadas e os corpos de inclusão isolados de acordo com um protocolo-padrão. As proteínas recombinantes puderam ser adicionalmente purificadas através de cromatografia por afinidade usando colunas de níquel. As proteínas recombinantes purificadas foram subseqüentemente analisadas por SDS-PAGE.

Purificação do DNA de H. ínfluenzae, condições da PCR e seqüenciamento

O DNA genômico de isolados clínicos de H. ínfluenzae foi isolado usando um Kit DNeasy Tissue (Qiagen, Hilden, Alemanha). A marca de DNA polimerase era da Roche (Mannheim, Alemanha) e as condições da PCR foram como recomendadas pelo fabricante. Para isolar o gene pe, foi usado o par de iniciadores 5'-gcatttattaggtcagtttattg-3' e 5'gaaggattatttctgatgcag-3, que anelam para os genes de flanqueio HI0177, respectivamente, HI0179. Os produtos resultantes da PCR (948 bp) foram seqüenciados por deslocamento do gene usando os iniciadores acima mencionados, além dos iniciadores 5'-cttgggttacttaccgcttg-3' e 5gtgttaaacttaacgtatg-3'. A eletroforese capilar foi corrida sobre um CEQ 2000 da Beckman, usando um kit de seqüenciamento de ciclo de terminador de corante (kit CEQ DTCS, Beckman Coulter, Stockholm, Suécia). A edição e o alinhamento das seqüências de DNA resultantes foram efetuados usando PHRED (CodonCode, Deadham, EUA) e SEQUENCHER (MedProbe, Oslo, Noruega).

Produção de um H, ínfluenzae deficiente de pE (NTHi 3655 Ape)

O DNA genômico, isolado de NTHi 772, foi usado como molde. As extremidades 5' e 3' de pe incluindo as partes dos genes HI0177 e HI0179 foram amplificadas como dois cassetes (815 bp e 836 pb, respectivamente) usando a DNA polimerase DyNAzyme® II (Finnzymes, Espoo, Finlândia) introduzindo os sítios de enzimas de restrição Xhol e EcoRI, respectivamente, EcoRI e SpEl, além de seqüências de captação específicas nos clois cassetes (18). Os fragmentos resultantes da PCR foram digeridos e clonados em pBluescript SK (+/-). Um cassete de gene de resistência á canamicina (1282 bp) foi obtido de pUC4K usando o sítio de enzima de restrição para EcoRI. Após a digestão, o produto da PCR foi ligado no fragmento de gene pe truncado contendo partes dos genes HI0177 e HI0179. As cepas de H. influenzae Eagan e RM804 foram transformadas de acordo com o método M-IV de Heriott et al. (19). Os mutantes resultantes foram verificados por PCR e a expressão de pE foi analisada por transferência Western blot e citometria de fluxo.

Softwares de biologia molecular

As seqüências obtidas foram comparadas com o genoma de H. influenzae KW20 disponível (http: //www.tigr.org) (15). O peptídeo de sinal foi deduzido usando o SignalP V1.1 World Wide Web Prediction Server Center for Biological Sequence Analysis (http://www.cbs.dtu.dk/services/ SignalP/) (16). O peifil de hidrofobicidade de pE foi analisado pelo método de Kyte e Doolittle (17).

Animais, procedimentos cirúrgicos e modelo de otite média de rato

Usaram-se ratos machos Sprague-Dawley saudáveis, pesando 200-250 g. Todos os animais estavam isentos de infecções no ouvido médio, como determinado por otomicroscopia antes da operação. Nas intervenções, os ratos foram anestesiados com metoexital (Brietal®, Elli Lilly and Company, Indianápolis, IN) intravenosamente ou hidrato de cloral (apoteksbolaget, Lund, Suécia) de modo intraperitoneal. As bactérias para os experimentos com os animais foram desenvolvidas conforme acima descrito. Após a coleta por centrifugação, as bactérias foram suspensas novamente em meio de cultura novo até uma concentração de 2χ10^1υ unidades formadoras de colônias (cfu) tanto para o NTHi 3655 quanto para o mutante de pE correspondente. As preparações foram mantidas sobre gelo até o uso. Para induzir a otite média aguda (AOM), o ouvido médio foi atingido por uma incisão ventral na linha do meio no pescoço, e aproximadamente 0,05 ml da suspensão bacteriana foi instilado na cavidade do ouvido médio. A otomicroscopia foi efetuada nos dias 3 e 5 após a operação. A otite média com efusão purulenta, et al., uma efusão opaca e dilatação freqüentemente pronunciada dos vasos, no dia 3, foi referida como AOM.

Resultados

Extração e separação de uma proteína de H. influenzae (pE) que é detectada por um soro de mieloma de IgD(À)

Acreditava-se anteriormente que o H. influenzae não tipificável (NTHi) não liga a IgD (19), enquanto que o H. influenzae encapsulado liga fortemente a IgD. Descobriu-se que um soro de mieloma de IgD(X) especificamente ligava-se também ao NTHi. Um perfil de citometria de fluxo 10 típico do NTHÍ772 é mostrado na figura 1. Um forte deslocamento e uma fluorescência aumentada foram verificados na presença da proteína de mieloma de IgD(X) em comparação com o controle sem IgD.

Para analisar em detalhe a proteína da membrana externa de H. influenzae que foi detectada pelo mieloma de IgD(À), uma fração da 15 membrana externa foi solubilizada no detergente Empigen®. A figura 1B demonstra que uma atividade de ligação a IgD muito forte foi obtida sobre as Western blots por uma proteína com um peso molecular aparente de aproximadamente 16 kDa. Entretanto, nenhuma banda de proteína distinta correspondendo à atividade de ligação a IgD pôde ser detectada na SDS20 PAGE colorida com azul Brilhante de Coomassie. Após a separação sobre uma coluna O-Sepharose, o mesmo extrato da membrana externa foi aplicado à eletroforese em gel bidimensional e coloração com prata (figura 1C). Em paralelo, uma transferência Western blot correspondente sondada com a IgD(À) humana foi efetuada. A área onde a pE estava localizada pôde, 25 assim, ser cercada. Entretanto, nenhuma proteína visível foi observada (figura 1C).

Clonagem da proteína E e produção de um mutante de H. influenzae não tipificável desprovido de pE

Visto que não pudemos detectar nenhuma proteína na análise 230 D após a separação, uma biblioteca de DNA de H. influenzae foi construída usando a cepa de H. influenzae não tipificável (NTHi) 772. O DNA genômico contendo os fragmentos na faixa de 2 a 7 kbp foi ligado no pUC18, seguido por transformação na E. coli JM83. Os transformantes foram analisados quanto à ligação a IgD usando um imunoensaio de colônia consistindo em IgD(X) humana e anticorpos policlonais anti-lgD humana conjugados a HRP. Três colônias positivas foram descobertas de 20.000 colônias testadas e foram submetidas a uma segunda rodada de exame com a IgD(À). Seqüenciou-se um dos clones positivos e encontrou-se um inserto de 3,55 kb contendo DNA codificando as quatro proteínas HI0175 até HI0178 de acordo com o mapa físico do H. influenzae KW20 (15). Para verificar adicionalmente a interação específica com IgD(À), o transformante selecionado foi também analisado por citometria de fluxo. Conforme pode ser visto na figura 2B, a E. coli JM83 abrigando o DNA genômico de H. influenzae 772 correspondendo à seqüência codificando para HI0175 até HI0178 foi detectada por IgD(X), em comparação com a E. colide controle negativo transformada com um vetor vazio somente (figura 2A).

Além da análise do clone de E. coli JM83, as quatro proteínas de H. influenzae (HI0175 a HI0178) foram clonadas no vetor de expressão pET26(+) e produzidas na E. coli BL21DE3. As proteínas recombinantes resultantes foram analisadas por IgD(À) sobre transferências Western blot e a HI0178 foi verificada ser a única proteína que foi detectada por IgD(X) (dados não mostrados).

Um H. influenzae não tipificável (NTHi 3655) foi mutado por introdução de um cassete de gene da resistência à canamicina no gene codificando para pE. Os mutantes resultantes foram confirmados por PCR e a ausência da expressão de pE foi provada por análise das proteínas da membrana externa em transferências Western blot usando um anti-soro antipE específico (dados não mostrados). O mutante de NTHi 3655Δρθ foi também testado por citometria de fluxo e uma fluorescência claramente diminuída foi verificada com o mutante, em comparação com o NTHi correspondente 3655 do tipo selvagem quando analisado com um anti-soro monovalente anti-pE em coelho e um pAb secundário anticoelho em cabra conjugado ao FITC (figuras 2C e D).

A proteína E foi detectada em todos os H. influenzae, enquanto que as outras subespécies eram negativas

Para analisar a expressão de pE de isolados clínicos e cepas de tipificar de NTHi, desenvolveu-se um ensaio de citometria de fluxo de ligação direta consistindo no soro de IgD(À) e um anticorpo secundário conjugado ao FITC dirigido contra a IgD humana. Nos experimentos iniciais, as bactérias coletadas em diferentes pontos de tempo foram analisadas quanto à expressão de pE. Nenhuma diferença foi observada com relação à expressão de pE entre as bactérias de crescimento logarítmico ou de fase estacionária, sugerindo que a pE da superfície de NTHi não era dependente da fase de crescimento. As bactérias da fase estacionária foram, assim, usadas em todas as análises adicionais. A intensidade da fluorescência média (mfi) por célula bacteriana foi analisada e um total de 22 cepas de NTHi foi incluído em nosso estudo. A intensidade da fluorescência variou entre as diferentes cepas de NTHi, apesar da pE ser detectada na maior parte de NTHi neste ensaio particular usando o soro de mieloma de IgD(À) como anticorpo de detecção (figura 3).

Em outros experimentos, os anticorpos anti-pE em coelho específicos foram usados para a detecção da pE exposta na superfície. O anti-soro anti-pE específico reconheceu especificamente a pE também nas cepas encapsuladas de H. influenzae, H. aegypticus, e H. haemolyticus (dados não mostrados).

Para analisar adicionalmente os níveis de expressão de pE, os extratos da membrana externa tratados com Empigen'⁸’ de diversas espécies de haemophilus foram testados em transferências Western blot usando IgD(X) como anticorpo de detecção (Tabela 1). Nestes experimentos, nenhuma diferença entre as cepas de haemophilus de alta e baixa expressão foi verificada, et al., nas transferências Western blot, todas as cepas mostraram pE de intensidade igual e na mesma posição correspondendo a 16 kDa. O H. influenzae encapsulado (tipo a até f) também expressou a pE, como revelado pelas transferências Western blot (Tabela 1). Por exemplo, a expressão da pE em quatro cápsulas de H. influenzae tipo b (Hib) é comparada ao NTHi na figura 4. O H. aegypticus, e ο Η. haemolyticus expressaram a pE (Tabela 1), enquanto que para as outras espécies de haemophilus relacionadas, que eram negativas na citometria de fluxo (figura 3), nenhuma pE foi detectada nas análises por transferência Western blot. O anti-soro anti-pE específico reconheceu 5 especificamente a pE também nas cepas encapsuladas (dados não mostrados).

Tabela 1

Transferência Western blot

Encapsulàdo ou não tipificável (NT)	(positivo/ negativo; 0)
556 Cáps. de H. influenzae CCUG EF 6881 I tipo a	pos
557 Cáps. de H. influenzae CCUG EF 7315 I tipo a	pos
94 H.i. tipo a	pos
479 H. influenzae Minn A tipo b	pos
547 H. influenzae Eagan tipo b	pos
485 H. influenzae 85 05 30 b	pos
539 Cáps. de H. influenzae D-22 tipo b	pos
541 Cáps. de H. influenzae HK 695 tipo b	pos
542 Cáps. de H. influenzae HK 691 tipo b	pos
577 Cáps. de H. influenzae HK 713 tipo b	pos
578 Cáps. de H. influenzae HK 714 tipo b	pos
582 Cáps. de H. influenzae HK 83458 tipo b	pos
581 Cáps. de H. influenzae HK 163 tipo b	pos
580 Cáps. de H. influenzae HK 729 tipo b	pos
569 Cáps. de H. influenzae 17 B Dallas tipo b	pos
568 Cáps. de H. influenzae DL 42/2F4 tipo b	pos
579 Cáps. de H. influenzae HK 720 tipo b	pos
477 Cáps. de H. influenzae 6-460 tipo b	pos
570 Cáps. de H. influenzae DL 42 tipo b	pos
Cáps. de H. influenzae RM 804 no tipo b	pos
583 Cáps. de H. influenzae HK 705 no tipo b	pos

551	Cáps. de H. influenzae CCUG EF 4851 II tipo c	pos
552	Cáps. de H. influenzae CCUG EF 4852 II tipo c	pos
95	H.i. tipo c	pos
555	Cáps. de H. influenzae CCUG EF 6878 IV tipo d Cáps. de H. influenzae CCUG EF NCTC 8470	pos
560	tipo d	pos
96	H.i. tipo d	pos
554	Cáps. de H. influenzae CCUG EF 6877 IV tipo e	pos
88	H.i. tipo e A11/01	pos
89	H.i. tipo e A76/01	pos
90	H.i. tipo e A77/99	pos
559	Cáps. de H. influenzae CCUG EF 1551911 tipo f	pos
78	Cáps. de H.i. CCUG 15435 tipo f	pos
91	H.i. tipo f A1/01	pos
92	H.i. tipo f A58/01	pos
93	H.i. tipo f A91/01	pos
67	H.i. NT 6-9547 b.tipo I	pos
478	H. influenzae 6-601 NT	pos
484	H. influenzae 6-6200 NT NT	pos
507	H. influenzae 6-102 NT NT	pos
65	H.i.NT 7-68/99 Claren. lavage	pos
68	H.i. NT 7-758	pos
546	H. influenzae 6-9547 NT	pos
480	H. influenzae 772 NT	pos
476	H. influenzae 6-115 NT	pos
481	H. influenzae 6-504 NT	pos
482	H. influenzae 6-7702 NT	pos
483	H. influenzae 82 10 23 NT	pos
486	H. influenzae 6-121 NT	pos
506	H. influenzae 6-6267 NT	pos
540	H. influenzae D-26 NT	pos
543	H. influenzae Buffalo 1479 NT	pos

544	H. influenzae Buffalo C 7961 NT	pos
64	H.i. 56-2934 000428 NT	pos
69	H.i. 7-120/99 bronch NT	pos
70	H.i. 7-161/99 bronch NT	pos
66	H.i. S6-2952 000428 NT	pos
105	H.i. RM 3655 NT	pos
Cont. da Tabela 1
531	H. aegypticus EF 628 ΝΤ,ηο b	pos
73	H.aegypticus CCUG 25716	pos
74	H.aegypticus CCUG 26840	pos
76	H.aegypticus CCUG 39154	pos
79	H.aegypticus HK 1247	pos
80	H.aegypticus HK 1229	pos
81	H.aegypticus HK 1242	pos
82	H.i. biovar aegypticus HK 865	pos
83	H.i. biovar aegypticus HK 871	pos
84	H.i. biovar aegypticus HK 1222	pos
85	H.i. biovar aegypticus HK 1239	pos
86	doença similar ao BPF HK 1212	pos
87	doença similar ao BPF HK 1213	pos
72	H.haemolyticus CCUG 15642	pos
101	H.haemolyticus 34669/83	pos
102	H.haemolyticus 47802/88	pos
103	H.haemolyticus 937016	pos
104	H.haemolyticus 74108/81	pos
520	H. parainfluenzae Biotipo I HK 409	0
521	H. parainfluenzae Biotipo II HK 23	0
58	59004 H.parainfl.biov.lll	0
59	75834 H.parainfl.biov.lll	0
60	78909 H.parainfl.biov.lll	0
97	H. parainfluenzae 947172	0
98	H. parainfluenzae 59257/91	0

99	H. parainfluenzae 59004/91	0
100	H. parainfluenzae 977101	0
545	H.parainfluenzae Buffalo 3198 NT	0
75	H.somnus CCUG 37617	0
512	H. parasuis 9918	0
516	H. parasuis 99 19	0
527	H. parasuis EF 3712	0
524	H. paraphrophilus HK 319	0
525	H. paraphrophilus HK 415	0
517	H. paraphrophilus 12894	0
71	H.segnis CCUG 14834	0
526	H. aphrophilus HK 327	0
529	H. aphrophilus 11832 A	0
532	H. pleurapneumoniae EF 9917	0
61	39612 Eikenella corrodens	0
62	49064 Eikenella corrodens	0
63	959074 Eikenella corrodens	0
537	Actinobacillus actinomyc. HK 666	0
	P.mult.78908/90	0

A pE22-160 produzida de modo recombinante [pE(A)] é detectada por IgD(Â) Nos experimentos iniciais, tentou-se produzir de modo recombinante a pE, porém somente concentrações pequenas foram obtidas. Para maximizar a produção de proteína, construiu-se um fragmento de pE trunca5 do consistindo nos resíduos de aminoácidos Iisina22 até lisina160. O peptídeo de sinal N-terminal incluindo o aminoácido glutamina21 foi, assim, removido e substituído pelo peptídeo líder, além de nove resíduos originandose do vetor pET26(+) (figura 5A). A pE22-160 truncada foi designada pE(A) (figura 5B). Para confirmar que o produto de proteína recombinante corres10 pondia à pE do 'tipo selvagem¹, a pE(A) expressa de modo recombinante, juntamente com a pE isolada do NTHi 772, foi analisada por SDS-PAGE e transferência Western blot usando a IgD(X) como uma sonda. Conforme mostrado na figura 5D, a pE(A) recombinante correspondeu significativa82 mente a pE do tipo selvagem em SDS-PAGE. Além disso, a pE(A) produzida na E. coli pôde ser detectada até 0,01 microg pelo anti-soro de IgD(À) (figura

5E).

A pEiA) foi usada para a imunização de coelhos e, após o término do programa de imunização, como descrito em detalhe em Material e Métodos, o anti-soro anti-pE foi purificado sobre uma coluna consistindo em um peptídeo imunodominante calculado (aminoácidos pE41-68). Os anticorpos resultantes claramente detectaram a pE tanto na superfície bacteriana (figura 2C) quanto nas transferências Western blot (não mostradas).

A seqüência de DNA do gene da proteína e o quadro de leitura aberto

A seqüência de DNA e aminoácidos da pE1-160 a partir da cepa NTHi 772 é descrita na figura 6. O quadro de leitura aberto (ORF) é 160 aminoácidos de comprimento e o peptídeo de sinal predito tem um comprimento de 20 aminoácidos. A análise por computador sugere que a peptidase de sinal reconhece os resíduos de aminoácidos alanina18 até Iisina22 e cliva entre os resíduos isoleucina20 e glutamina 21 (38). Em paralelo, o perfil de hidropatia de HID (39) mostra que a pE tem um peptídeo de sinal hidrofóbico, enquanto que o restante da molécula é principalmente hidrofílico (figura 7).

Para determinar em detalhe o sítio de divagem da peptidase de sinal, a pE de tamanho natural recombinante foi submetida à degradação de Edman. Entretanto, a extremidade amino-terminal da cadeia de polipeptídeos da pE estava provavelmente bloqueada. Uma explicação possível para esta falha poderia ser que o primeiro aminoácido era um resíduo de piroglutamila, conforme anteriormente descrito para a família de proteínas de M. catarrhalis UspA (11). Entretanto, as tentativas de remover este resíduo putativo com a piroglutamato aminopeptidase falharam. Em contraste com a pE1-160 de tamanho natural, a seqüência N-terminal para pE(A) (pE22-160) que não tem o peptídeo de sinal de H. influenzae endógeno (figura 5) foi caracterizada com êxito pela degradação de Edman e verificada conter a seqüência de vetor predita, et al., a peptidase de sinal na E. coli clivada na posição correta (figura 5A).

A proteína E foi seqüenciada em uma série de espécies diferen83 tes de Haemophilus, incluindo o NTHi e o H. influenzae encapsulado (Tabela

1). De modo interessante, a pE foi conservada extraordinariamente. Somente alguns aminoácidos foram mutados pontuais e estes foram mutados na maioria das cepas seguindo um padrão especifico (figura 6 e Tabela 2).

Tabela 2. Mutações pontuais no gene pe em diferentes espécies de Haemophilus quando comparadas ao H. influenzae Rd como cepa de referência³*.

Número de mutações pontuais das cepas com mutações (%)	Número analisado
Ile20 > Thr20	18 (58%)	31
Ala23> Val23	5 (16%)	31
Glu24 > Lys24	1b) (3,2%)	31
Val28 > Met28	2 (6,5 %)	31
Ala31 > Thr31	19(61 %)	31
Pro32 > Val32	3 (9,7 %)	31
Pro32 > Ala32	5(16%)	31
Ile41 > Val41	8 (26 %)	31
Val47 > Ala47	3(10%)	30
Arg76 > Lys76	2 (7,7 %)	26
lle107> Val107	16(62%.)	26
Lys153 > Glu153	1b) (3,2%)	13
Ala154> Vai 154	2(15%.)	13
C-terminal Prolongado
(3 aa extras)
interrupção SVDKK (=Rd)c)	11 (85 %)	13
interrupção SVDKKSAP	2(15%)	13

a)O gene pe foi seqüenciado no H. influenzae encapsulado tipo a (n=2), b (n=2), c (n=2), d (n=1), e (n=2), e f (n=3), no NTHi (n=8), no H. influenzae biovar aegypticus (n=6) e no H. aegypticus (n=5), usando iniciadores de flanqueio.

b) NTHi 772 (ID da Seqüência N-:1)

c) Rd designa a cepa de H. influenzae Rd.

Diferentes fragmentos de pE podem ser facilmente produzidos em E. coli

Oito seqüências de cDNA derivadas da pE de tamanho natural foram clonadas no pET26b(+) e expressas em E. coli. As proteínas resultan84 tes foram purificadas sobre resinas de níquel com afinidade pelas marcas de histidina (figura 8). As proteínas recombinantes cobriram o produto de proteína pE maduro inteiro e os seus comprimentos e posições individuais foram como demonstrados na figura 8A e os produtos purificados são descritos na figura 8B.

A pEé um fator de virulência crucial na otite média aguda (AOM) em ratos

Para investigar a função da pE como um fator de virulência para o NTHi, os ratos foram provocados no ouvido médio com 10⁵ a 10⁹ NTHi 3655 Ape ou o NTHi do tipo selvagem 3655 (figura 9). De modo interessante, 100 a 1000 vezes mais de NTHi 3655 Ape foram requeridos para induzir uma AOM similar, em comparação com a bactéria do tipo selvagem. Assim, a pE é um fator de virulência crucial para a AOM induzida por NTHi.

A pE é altamente imunogênica em uma população definida

Para medir os níveis de anticorpos em crianças e doadores de sangue, a pE(A) recombinante foi purificada de E. coli (figura 5B) e usada em um ELISA. Os resultados das análises por ELISA dos anticorpos contra a pE(A) são mostrados na figura 9. As crianças menores de 6 meses de idade tiveram IgG e IgA detectáveis contra a pE(A). Os anticorpos de IgG mostraram níveis de pico em crianças de 5 a 10 anos de idade. Em contraste, os anticorpos de IgA aumentaram gradualmente com a idade crescente e os maiores valores foram detectados no grupo de 70 a 80 anos de idade. Epítopos Úteis

Os epítopos de células B de uma proteína estão principalmente localizados em sua superfície. Para predizer os epítopos de células B dos polipeptídeos de Proteína E, dois métodos foram combinados: predição da estrutura 2D e predição do índice antigênico. A predição da estrutura 2D foi feita usando o programa PSIPRED (de David Jones, Brunel Bioinformatics Group, Dept. Biological Sciences, Brunel University, Uxbridge UB8 3PH, UK). O índice antigênico foi calculado sobre o fundamento do método descrito por Jameson e Wolf (CABIOS 4:181-186 [1988]). Os parâmetros usados neste programa são o índice antigênico e o comprimento mínimo para um peptídeo antigênico. Um índice antigênico de 0,9 para um mínimo de 5 aminoácidos consecutivos foi usado como o limiar no programa. Os peptídeos compreendendo epitopos de células B potenciais, bons, são listados na tabela 3. Estes podem ser úteis (preferivelmente conjugados ou unidos de modo recombinante a uma proteína maior) em uma composição de vacina para a preven5 ção de infecções por ntHi, como poderíam peptídeos similares compreendendo mutações conservativas (preferivelmente 70, 80, 85, 98, 99 ou 100% idênticos às seqüências da tabela 3) ou truncados compreendendo 5 ou mais (por exemplo, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15, 20 ou 25) aminoácidos a partir deles ou extensões compreendendo, por exemplo, 1, 2, 3, 5, 10 aminoácidos 10 adicionais nas extremidades N- e/ou C-terminais do peptídeo a partir do contexto nativo de polipeptídeo de proteína E (SEQ ID NO: 1 ou seus homólogos naturais, como mostrados na Tabela 2 acima), que conservam um epitopo eficaz que pode produzir uma resposta imune em um hospedeiro contra o polipeptídeo de proteína E.

Tabela 3: Epitopos de células B potenciais a partir da SEQ ID NO: 1 (ou seus homólogos naturais)

Posição

106

123

136

Seqüência

QKAKQND

QKVKQND

QKAQQND

QKVQQND

DNQEPO PEPKRYARSVRQ QIRTDFYDEFWGQG QVRTDFYDEFWGQG APKKQKKH

PDTTL

Conclusões

A proteína da membrana externa de Haemophilus exposta na superfície pE é um fator de virulência crucial para a AOM induzida por NTHi, 20 é altamente imunogênica em uma população definida e, desse modo, é uma candidata de vacina muito adequada para uma variedade de doenças hu86 manas.

Referências

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Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Composição de vacina, caracterizada pelo fato de que compreende um polipeptídeo isolado, em que o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que varia da SEQ ID NO: 1 em pelo menos três posições, em que a(s) variação(ões) é(são) selecionada(s) do grupo que consiste em: uma deleção de um peptídeo sinal (aminoácidos 1-20) de SEQ ID NO: 1, uma substituição de Thr por lie na posição 20 de SEQ ID NO: 1, uma substituição de Vai por Ala na posição 23 de SEQ ID NO: 1, uma substituição de Glu por Lys na posição 24 da SEQ ID NO: 1, uma substituição de Met por Vai na posição 28 de SEQ ID NO: 1, uma substituição de Thr por Ala na posição 31 de SEQ ID NO: 1, uma substituição de Vai por lie na posição 41 de SEQ ID NO: 1, uma substituição de Ala por Vai na posição 47 da SEQ ID NO: 1, uma substituição de Lys por Arg na posição 76 da SEQ ID NO: 1, uma substituição de Vai por lie na posição 107 da SEQ ID NO: 1, uma substituição de Vai por Ala na posição 154 da SEQ ID NO: 1, uma adição SerAla-Pro no C-terminal da SEQ ID NO: 1, uma substituição de Vai por Pro na posição 32 da SEQ ID NO: 1 e uma substituição de Ala por Pro na posição 32 da SEQ ID NO: 1.
2. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um ou mais adjuvantes, veículos, excipientes, ligantes, transportadores, conservantes, agentes tamponantes, agentes emulsificantes, agentes umidificantes, ou compostos facilitadores de transfecção farmaceuticamente aceitáveis.
3. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo é um di-, tri- ou multímero de um polipeptídeo.
4. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende ainda uma porção imunogênica de outra molécula.
5. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que a outra molécula é uma proteína de membrana externa de um patógeno do trato respiratório.

Petição 870180161048, de 10/12/2018, pág. 11/18
6. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que a outra molécula é selecionada do grupo que consiste em pneumolisina de Streptococcus pneumoniae; MID, OMP106, UspA1, UspA2, Hly3, OmpCD e D15 de Moraxella catarrhalis; e OMP26, P6,

5 Proteína D, NlpC2 e Slp de Haemophilus influenza.
7. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo é fundido de forma recombinante com pelo menos uma outra proteína.
8. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 1,

10 caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo é ligado de forma covalente ou não covalente a uma proteína, carboidrato ou matriz.
9. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende ainda uma membrana de uma célula, que compreende a proteína.