ES2912751T3 - Composiciones inmunogénicas y vacunas derivadas de proteínas receptoras de superficie bacteriana - Google Patents

Abstract

Una composición inmunogénica que comprende un polipéptido de la proteína B de unión a la transferrina (TbpB) que se puede obtener de una especie bacteriana patógena Gram-negativa, en la que el polipéptido TbpB comprende la secuencia de la SEQ.ID NO: 174.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones inmunogénicas y vacunas derivadas de proteínas receptoras de superficie bacteriana

ÁMBITO DE LA DIVULGACIÓN

La presente divulgación se refiere a composiciones y vacunas inmunogénicas y a procedimientos de fabricación y evaluación de las mismas. Más en particular, la divulgación se refiere a composiciones inmunogénicas derivadas de proteínas receptoras de superficie bacteriana y a vacunas contra organismos bacterianos Gram-negativos, incluyendo, pero sin limitarse a, organismos bacterianos pertenecientes a las familias bacterianas de Pasteurellaceae, Neisseriaceae y Moraxellaceae.

ANTECEDENTES DE LA DIVULGACIÓN

Los siguientes párrafos tienen por objeto introducir al lector en la descripción más detallada que sigue y no definir o limitar la materia reivindicada de la presente divulgación.

Las vacunas capaces de mediar una respuesta inmunitaria eficaz son importantes en las estrategias sanitarias destinadas a combatir las enfermedades causadas por patógenos microbianos. Las dos estrategias básicas para inducir una respuesta inmunitaria de efecto en el huésped implican la administración a un sujeto (huésped) de un agente "vivo" capaz de replicarse en el huésped, o la administración de materiales o sustancias que no son capaces de replicarse en el huésped. La administración de una vacuna viva puede representar un riesgo de seguridad para las personas inmunodeprimidas si el agente o un organismo contaminante se replican y afectan negativamente al sujeto inmunizado. Estos riesgos no se asocian a las vacunas basadas en patógenos enteros muertos, en extractos de patógenos o en componentes purificados, comúnmente denominadas vacunas de subunidades. Las vacunas de subunidades evitan los problemas de seguridad asociados a las vacunas vivas, pero es posible que los componentes purificados no proporcionen por sí mismos el efecto protector deseado en el sujeto contra el organismo microbiano infeccioso y requieran componentes apropiados, denominados adyuvantes, para potenciar la respuesta inmunitaria.

Los enfoques para el diseño de vacunas contra organismos bacterianos Gram-negativos se han centrado comúnmente en el uso de proteínas que están naturalmente asociadas con la membrana externa de las bacterias y expuestas en la superficie de las células bacterianas. Las dianas especialmente atractivas para la vacunación son las proteínas que se supone que son críticas para la supervivencia en el huésped, ya que no pueden perderse o alterarse drásticamente para evitar la respuesta inmunitaria del huésped. A este respecto, las proteínas receptoras de la superficie bacteriana capaces de interactuar con y unirse a las proteínas deunión al hierro del huésped, la transferrina y la lactoferrina, y de unirse a ellas, se han considerado durante algún tiempo componentes adecuados para la preparación de vacunas (1­ 3). Este grupo de proteínas receptoras de superficie, en adelante denominadas proteínas receptoras de superficie "HIBP" (proteína de unión al hierro del huésped), está presente en patógenos de humanos y animales pertenecientes a las familias bacterianas Pasteurellaceae, Moraxellaceae y Neisseriaceae (4). Por lo tanto, estas proteínas han sido reconocidas como objetivos potenciales para el desarrollo de vacunas contra una variedad de diferentes patógenos de los seres humanos y los animales de producción de alimentos (5) (6-10).

Los receptores de superficie de las HIBP se componen normalmente de dos proteínas, una lipoproteína de superficie, la proteína de unión a la transferrina B (TbpB) o la proteína de unión a la lactoferrina B (LbpB), y una proteína integral de membrana dependiente de TonB, la proteína de unión a la transferrina A (TbpA) o la proteína de unión a la lactoferrina A (LbpA) (11). Recientemente se determinaron las estructuras tridimensionales detalladas de las TbpB de Actinobacillus pleuropneumoniae, Actinobacillus suis y Neisseria meningitidis a alta resolución (12-14). Las propiedades intrínsecas de las proteínas TbpB o LbpB son bastante diferentes de las proteínas integrales de la membrana externa, TbpA y LbpA, y tienen un impacto sustancial en las estrategias utilizadas para el desarrollo de vacunas. Por ejemplo, es posible producir y purificar TbpB o LbpB en rendimientos relativamente altos a partir del citoplasma de E. coli para la generación de vacunas de subunidades. Sin embargo, estas proteínas están notablemente ausentes o son deficientes en las vacunas de vesículas de membrana externa (OMV) preparadas por extracción selectiva con detergentes debido a su eliminación durante el proceso de extracción. Por el contrario, la TbpA o la LbpA funcionales sólo pueden producirse en la membrana externa, lo que supone una limitación para la producción de altos rendimientos de proteínas purificadas para su uso en vacunas de subunidades. El enfoque alternativo de producir proteínas mal plegadas que se agregan en grandes cuerpos de inclusión y, posteriormente, intentar volver a plegar la proteína a partir de las preparaciones de cuerpos de inclusión enriquecidos, también es problemático para la producción comercial. Por lo tanto, la mayoría de las estrategias para las vacunas basadas en TbpA o LbpA normalmente implicarían la producción de OMV o el desarrollo de cepas atenuadas.

Un enfoque alternativo que se ha utilizado con éxito para los patógenos bacterianos invasivos es utilizar el polisacárido capsular extracelular como antígeno primario, y acoplarlo a un portador de proteínas para inducir la ayuda de las células T. Estas vacunas capsulares conjugadas han demostrado ser muy eficaces a la hora de proporcionar protección frente a la infección por cepas que expresan el polisacárido capsular específico, pero no proporcionan protección cruzada frente a otros tipos capsulares. Aunque las vacunas capsulares conjugadas contra los patógenos humanos H. influenzae, N. meningitidis y Streptococcus pneumoniae se desarrollaron originalmente para prevenir la infección invasiva, los estudios de transporte posteriores a la autorización han demostrado que las vacunas administradas sistémicamente eliminaban la colonización por los patógenos que expresaban los polisacáridos específicos a los que iban dirigidas (15-17). Esto tuvo el beneficio añadido de proporcionar inmunidad de rebaño, proporcionando protección a los individuos no inmunizados debido a la reducción de la frecuencia de portadores dentro de la población. Aunque no era la intención inicial de estas primeras vacunas, el potencial de conferir inmunidad de grupo se ha convertido en un criterio importante para evaluar las nuevas y futuras vacunas bacterianas. Sin embargo, determinar o predecir si las nuevas vacunas serán capaces de impactar o prevenir la colonización (portación) es un gran desafío (18).

La capacidad de evaluar si los antígenos proteicos serán finalmente capaces de proporcionar una amplia protección contra un conjunto diverso de aislados de la enfermedad es también un reto considerable (19). Los primeros esfuerzos para probar esta capacidad suelen consistir en inmunizar a otras especies animales (ratones, conejos) y analizar después las propiedades de reacción y protección cruzadas de los sueros resultantes. En el caso de los antígenos de superficie que pueden producirse fácilmente en forma soluble, como las lipoproteínas de superficie, un primer paso suele ser producir y purificar un conjunto de proteínas variantes y utilizarlas en un ELISA (ensayo de inmunosorbente enlazado a enzima) estándar para evaluar la capacidad de los antisueros de reconocer las proteínas variantes. Esto es bastante laborioso, lo que hace que el análisis de un amplio conjunto de variantes sea una empresa costosa y se basa en la suposición de que la unión del antígeno a la placa ELISA es aleatoria, de modo que todas las superficies de las proteínas pueden ser sondeadas.

Teniendo en cuenta las limitaciones de los diversos ensayos utilizados para evaluar y predecir las propiedades de protección cruzada y de reactividad cruzada de los antisueros criados contra los antígenos, la selección y el diseño de vacunas nuevas y mejoradas basadas en proteínas deben perseguirse junto con el desarrollo de ensayos mejorados, de modo que la optimización y la mejora de las vacunas en desarrollo puedan abordarse sobre una base racional.

A pesar de los considerables esfuerzos realizados a lo largo de los años desde su descubrimiento inicial (20, 21), sigue sin estar claro si las proteínas receptoras de superficie de HIBP pueden utilizarse, y cómo, para preparar vacunas eficaces contra los patógenos bacterianos Gram-negativos, y en particular si puede desarrollarse una vacuna ampliamente protectora, y cómo. Por lo tanto, existe una necesidad en el arte de mejorar las composiciones inmunogénicas y las vacunas basadas en las proteínas receptoras de superficie de HIBP contra los organismos bacterianos Gram-negativos.

Frandoloso et al. desarrollaron y caracterizaron vacunas protectoras de subunidades de Haemophilus parasuis basadas en proteínas nativas con afinidad a la transferrina porcina (Frandoloso et al. 2011 Clinical and Vaccine Immunology 18, 1, 50-58).

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La invención proporciona una composición inmunogénica que comprende un polipéptido de proteína B de unión a la transferrina (TbpB) que se puede obtener de una especie bacteriana patógena Gram-negativa, en la que el polipéptido TbpB comprende la secuencia de la SEQ.ID NO: 174.

La invención también proporciona una composición de vacuna que comprende una composición inmunogénica de acuerdo con la invención.

La invención también proporciona un procedimiento para preparar una composición inmunogénica que comprende:

(a) proporcionar una secuencia de ácido nucleico quimérico que comprenda como componentes unidos operativamente

(i) una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido TbpB que se puede obtener de una especie bacteriana patógena Gram-negativa, donde el polipéptido TbpB comprende la secuencia de la SEQ.ID NO: 174; y

(ii) una secuencia de ácido nucleico capaz de controlar la expresión en una célula huésped recombinante;

(b) introducir la secuencia de ácido nucleico quimérico en una célula huésped y cultivar la célula huésped para producir el polipéptido TbpB;

(c) recuperar el polipéptido TbpB de la célula huésped; y

(d) preparar una composición inmunogénica.

La invención también proporciona un vector de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido TbpB que se puede obtener de una especie bacteriana patógena Gram-negativa, donde el polipéptido TbpB comprende la secuencia de la SEQ.ID NO: 174.

SUMARIO DE LA DIVULGACIÓN

La presente divulgación proporciona novedosas composiciones inmunogénicas y, en particular, composiciones inmunogénicas basadas en proteínas receptoras de superficie de HIBP de especies bacterianas patógenas Gramnegativas.

En consecuencia, la presente divulgación proporciona, en al menos un aspecto, una composición inmunogénica que comprende un antígeno derivado de una proteína receptora de superficie de HIBP de una especie bacteriana patógena Gram-negativa, en la que la proteína derivada de la proteína receptora de superficie de HIBP ha sido modificada de tal manera que es incapaz de unirse sustancialmente a la proteína de unión al hierro del huésped.

La presente divulgación proporciona, en al menos un aspecto, una composición inmunogénica que comprende un polipéptido que comprende un dominio del lóbulo C o un dominio del lóbulo N de una proteína receptora de superficie de HIBP que se puede obtener a partir de u obtenida a partir de una especie bacteriana Gram-negativa u obtenida de ella, en la que el polipéptido es incapaz de unirse sustancialmente a la proteína de unión al hierro del huésped. En aspectos preferidos, la presente divulgación proporciona una composición inmunogénica que comprende un dominio del lóbulo C de un polipéptido receptor de superficie de HIBP, en el que el polipéptido es incapaz de unirse sustancialmente a la proteína de unión al hierro del huésped. En otros aspectos preferidos, la presente divulgación proporciona una composición inmunogénica que comprende una mezcla de al menos dos polipéptidos, cada uno de los cuales comprende un dominio del lóbulo C, en el que los dominios del lóbulo C se pueden obtener o se obtienen de al menos dos especies bacterianas Gram negativas, o de al menos dos cepas bacterianas Gram negativas. En otros aspectos preferidos, los dominios del lóbulo C se obtienen de las proteínas receptoras de superficie de HIBP que son antigénicamente divergentes.

En otros aspectos, la presente divulgación proporciona además una composición inmunogénica que comprende un polipéptido que comprende un dominio del lóbulo N y/o un dominio del lóbulo C de una proteína receptora de superficie de HIBP que se puede obtener a partir de u obtenida a partir de una especie bacteriana patógena Gram-negativa, donde el dominio del lóbulo N o el dominio del lóbulo C comprenden una pluralidad de hebras p conectadas por una pluralidad de dominios de bucle, y donde al menos un dominio de bucle de la pluralidad de dominios de bucle del dominio del lóbulo N o del dominio del lóbulo C ha sido modificado, y donde el polipéptido es incapaz de unirse sustancialmente a la proteína de unión al hierro del huésped. En aspectos preferidos, la modificación comprende la modificación de al menos un residuo de aminoácido dentro de un dominio de bucle.

En otros aspectos de la divulgación, se han modificado al menos dos dominios de bucle de la pluralidad de dominios de bucle dentro del dominio del lóbulo C y/o el dominio del lóbulo N de una proteína receptora de superficie de HIBP.

En otros aspectos, la presente divulgación proporciona (i) un primer polipéptido, que comprende un dominio del lóbulo N o un dominio del lóbulo C de una proteína receptora de superficie de HIBP que se puede obtener a partir de u obtenida a partir de una especie bacteriana patógena Gram-negativa, en el que el dominio del lóbulo N o el dominio del lóbulo C comprenden una pluralidad de hebras p conectadas por una pluralidad de dominios de bucle, y en el que al menos un dominio de bucle de la pluralidad de dominios de bucle del dominio del lóbulo N o del dominio del lóbulo C ha sido modificado, vinculado a (ii) un segundo polipéptido que comprende una proteína receptora de superficie de HIBP, o una porción de la misma, que se puede obtener de una especie bacteriana Gram-negativa, y en el que el polipéptido vinculado es incapaz de unirse sustancialmente a la proteína de unión al hierro del huésped. En aspectos preferidos, la porción de la proteína de superficie de HIBP es un dominio del lóbulo N o un dominio del lóbulo C. En otros aspectos preferidos, la porción de la proteína de superficie de HIBP es un dominio del lóbulo N o un dominio del lóbulo C de una proteína receptora de superficie de HIBP que se puede obtener a partir de u obtenida a partir una especie bacteriana patógena Gram-negativa, en la que el dominio del lóbulo N o el dominio del lóbulo C comprenden una pluralidad de hebras p conectadas por una pluralidad de dominios de bucle, y en la que al menos un dominio de bucle de la pluralidad de dominios de bucle del dominio del lóbulo N o del dominio del lóbulo C ha sido modificado.

En otros aspectos de la divulgación, el dominio del lóbulo C o el dominio del lóbulo N es un dominio del lóbulo C o un dominio del lóbulo N de una proteína receptora de superficie de HIBP que se puede obtener a partir de u obtenida a partir de, una especie bacteriana perteneciente a la familia bacteriana de Pasteurellaceae, Moraxellaceae o Neisseriaceae, y en otros aspectos preferidos, el dominio del lóbulo C o el dominio del lóbulo N es un dominio del lóbulo C o un dominio del lóbulo N de un polipéptido receptor de superficie de HIBP que se puede obtener a partir de u obtenido a partir de, una especie bacteriana perteneciente al género bacteriano de Actinobacillus, Neisseria, Haemophilus, Mannheimia, Histophilus, Pasteurella o Moraxella.

En otros aspectos preferidos de la divulgación, la proteína receptora de superficie de HIBP se modifica de tal manera que se elimina el polipéptido de anclaje N-terminal de la proteína receptora de superficie HIB, o una porción del mismo, y en el que el polipéptido es incapaz de unirse sustancialmente a la proteína de unión al hierro del huésped.

En otros aspectos, la presente divulgación proporciona procedimientos para preparar una composición inmunogénica. En consecuencia, la presente divulgación proporciona un procedimiento para preparar una composición inmunogénica que comprende:

(a) proporcionar una secuencia de ácido nucleico quimérico que comprenda como componentes unidos operativamente

(i) una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende un dominio del lóbulo C o un dominio del lóbulo N de una proteína receptora de superficie de HIBP que se puede obtener a partir de u obtenida a partir de una especie bacteriana Gram-negativa, o que puede obtenerse de ella, en la que el polipéptido es incapaz de unirse sustancialmente a la proteína de unión al hierro del huésped; y

(ii) una secuencia de ácido nucleico capaz de controlar la expresión en una célula huésped recombinante;

(b) introducir la secuencia de ácido nucleico quimérico en una célula huésped y cultivar la célula huésped para producir el polipéptido que comprende el dominio del lóbulo C o el dominio del lóbulo N;

(c) recuperar el polipéptido que comprende el dominio del lóbulo C o el dominio del lóbulo N de la célula huésped; y

(d) preparar una composición inmunogénica.

En otros aspectos de la divulgación, el dominio de lóbulo C o el dominio de lóbulo N comprende una pluralidad de hebras p conectadas por una pluralidad de dominios de bucle, en los que al menos un dominio de bucle de la pluralidad de dominios de bucle ha sido modificado.

En aspectos aún adicionales de la divulgación, se proporcionan procedimientos para provocar una respuesta inmunitaria en un sujeto vertebrado. En consecuencia, la presente divulgación proporciona además un procedimiento para provocar una respuesta inmunitaria en un sujeto vertebrado, comprendiendo dicho procedimiento administrar al sujeto:

(a) un inmunógeno que comprenda un polipéptido que comprenda un dominio del lóbulo C o un dominio del lóbulo N de una proteína receptora de superficie de HIBP que se puede obtener a partir de u obtenida a partir de una especie bacteriana Gram-negativa en la que el polipéptido no pueda unirse sustancialmente a la proteína de unión al hierro del huésped; o

(b) un vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un inmunógeno que comprende un polipéptido con un dominio del lóbulo C o un dominio del lóbulo N de un polipéptido receptor de superficie de HIBP que se puede obtener de una especie bacteriana Gram-negativa; y en el que el inmunógeno se administra en, o se expresa en, una cantidad suficiente para provocar una respuesta inmunitaria en el sujeto vertebrado.

En aspectos preferidos de la divulgación, el dominio de lóbulo C o el dominio de lóbulo N comprende una pluralidad de hebras p conectadas por una pluralidad de dominios de bucle, en los que al menos un dominio de bucle de la pluralidad de dominios de bucle ha sido modificado.

La presente divulgación incluye además un inmunógeno que comprende un dominio del lóbulo C o un dominio del lóbulo N de un polipéptido receptor de superficie de HIBP en el que el dominio del lóbulo C o el dominio del lóbulo N comprende una pluralidad de hebras p conectadas por una pluralidad de dominios de bucle, y en el que al menos un dominio de bucle ha sido modificado, para su uso como medicamento.

La presente divulgación incluye además un inmunógeno que comprende un dominio del lóbulo C o un dominio del lóbulo N de un receptor de superficie de HIBP utilizado en la prevención de la infección, por ejemplo mediante la prevención de la colonización, o la enfermedad por bacterias infecciosas Gram-negativas, incluyendo bacterias pertenecientes al género Actinobacillus, Neisseria, Haemophilus, Mannheimia, Histophilus, Pasteurella o Moraxella. En aspectos preferidos, el dominio del lóbulo C o el dominio del lóbulo N comprende una pluralidad de hebras p conectadas por una pluralidad de dominios de bucle, en los que al menos un dominio de bucle de la pluralidad de dominios de bucle ha sido modificado.

La presente divulgación incluye además un inmunógeno que comprende un dominio del lóbulo C y/o un dominio del lóbulo N de un polipéptido receptor de superficie de HIBP para su uso en la fabricación de un medicamento para la prevención de la infección o la enfermedad por bacterias infecciosas Gram-negativas, incluyendo bacterias pertenecientes al género Actinobacillus, Neisseria, Haemophilus, Mannheimia, Histophilus, Pasteurella o Moraxella. En aspectos preferidos, el dominio del lóbulo C o el dominio del lóbulo N comprende una pluralidad de hebras p conectadas por una pluralidad de dominios de bucle, en los que al menos un dominio de bucle de la pluralidad de dominios de bucle ha sido modificado.

Las composiciones inmunogénicas de la presente divulgación pueden utilizarse para preparar una vacuna. En consecuencia, la presente divulgación proporciona además una composición de vacuna que comprende un antígeno derivado de una proteína receptora de superficie de HIBP de una especie bacteriana patógena Gram-negativa, en la que la proteína derivada de la proteína receptora de superficie de HIBP ha sido modificada de tal manera que es incapaz de unirse sustancialmente a la proteína de unión al hierro del huésped.

En otros aspectos, la presente divulgación incluye además una composición de vacuna que comprende un polipéptido que comprende un dominio del lóbulo C o un dominio del lóbulo N de una proteína receptora de superficie de HIBP obtenida de una especie bacteriana patógena Gram-negativa en la que el polipéptido es incapaz de unirse sustancialmente a la proteína de unión al hierro del huésped.

En otros aspectos de la divulgación, la composición de la vacuna comprende un polipéptido que comprende un dominio del lóbulo C o un dominio del lóbulo N de un polipéptido receptor de superficie de HIBP en el que el dominio del lóbulo C o el dominio del lóbulo N comprende una pluralidad de hebras p conectadas por una pluralidad de dominios de bucle, y en el que al menos un dominio de bucle ha sido modificado y en el que el polipéptido es incapaz de unirse sustancialmente a la proteína de unión al hierro del huésped.

La presente divulgación proporciona además procedimientos para administrar una vacuna a un sujeto vertebrado, comprendiendo el procedimiento administrar al sujeto una vacuna que comprende un polipéptido que comprende un dominio del lóbulo C o un dominio del lóbulo N de una proteína receptora de superficie de HlBP que se puede obtener de una especie bacteriana patógena Gram-negativa, donde la vacuna se administra en una cantidad suficiente para prevenir o tratar una enfermedad causada por una especie bacteriana Gram-negativa.

La presente divulgación incluye además una vacuna que comprende un dominio del lóbulo C o un dominio del lóbulo N de un receptor de superficie de HIBP para su uso en la prevención de la infección o la enfermedad por bacterias infecciosas Gram-negativas, incluidas las bacterias pertenecientes al género Actinobacillus, Neisseria, Haemophilus, Mannheimia, Histophilus, Pasteurella o Moraxella.

En aspectos preferidos de la divulgación, el dominio de lóbulo C o el dominio de lóbulo N comprende una pluralidad de hebras p conectadas por una pluralidad de dominios de bucle, y al menos un dominio de bucle de la pluralidad de dominios de bucle ha sido modificado.

Otras características y ventajas de la presente divulgación se harán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada. Debe entenderse, sin embargo, que la descripción detallada, aunque indica aspectos preferidos de la divulgación, se da a modo de ilustración solamente, ya que varios cambios y modificaciones se harán evidentes para los expertos en la materia a partir de la descripción detallada.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La divulgación se describe en los párrafos siguientes en relación con sus figuras. Las figuras que se presentan en el presente documento se facilitan con fines ilustrativos y no pretenden limitar la presente divulgación.

La FIGURA 1 representa una alineación de las secuencias polipeptídicas de varias TbpB, especialmente la TbpB ApH49 (SEQ.ID NO: 2), Actinobacillus pleuropneumoniae ApH87 TbpB (SEQ.ID NO: 12), y AsH57TbpB (SEQ.ID NO: 28), de patógenos TbpB porcinos y modelos estructurales de las proteínas (pdb 3HOL, 3PQs y 3PQU, respectivamente). Estas tres proteínas proporcionan una buena representación de la diversidad de secuencias entre las TbpB de patógenos porcinos (FIG. 4, flechas negras grandes). El panel superior ilustra la alineación de la secuencia del polipéptido, mientras que el panel inferior ilustra los modelos estructurales. En la alineación de la secuencia, la estructura del dominio está marcada por el sombreado de fondo y etiquetada en consecuencia. Se ilustran los elementos estructurales secundarios y la nomenclatura y numeración de las hebras p ("p1" - "p31") y los bucles (L1-L32) se ilustran inmediatamente encima de las secuencias alineadas. Las subregiones para el bucle 8 (8a; 8b; y 8c) en esta figura están referidas debido al gran tamaño del bucle 8, las diferencias entre las variantes de TbpB y los elementos estructurales secundarios en algunas variantes del bucle. También se indican las áreas de la tapa del lóbulo C y del lóbulo N etiquetadas como "Área de la tapa del lóbulo C" y "Área de la tapa del lóbulo N", respectivamente, y las áreas del asa del lóbulo C y del asa del lóbulo N etiquetadas como "Asa del lóbulo C" y "Asa del lóbulo N", respectivamente. Los modelos estructurales de los tres TbpB en la alineación del panel superior se representan en el panel inferior y los dominios están etiquetados para el tercer modelo estructural (AsH57TbpB), que se representa en una orientación idéntica a la de los otros dos modelos.

La FIGURA 2 representa un dibujo esquemático de ciertas características estructurales secundarias de la secuencia de aminoácidos de un polipéptido TbpB con la nomenclatura recomendada para esta clase de proteínas. Los extremos N y C del polipéptido están indicados y etiquetados como "N" y "C" respectivamente. Las hebras p se indican con flechas y se etiquetan secuencialmente empezando por el N-terminal "p1" hasta "p31". Los dominios de bucle se indican y etiquetan de "L1" a "L32". Las secuencias de los bucles del polipéptido TbpB de A. pleuropneumoniae cepa H49 TbpB (SEQ.ID NO: 2) se incluyen en esta solicitud de patente (SEQ.ID NO: 41 a SEQ.ID NO: 106). También se indican las áreas de la tapa del lóbulo C y del lóbulo N, etiquetadas como área de la tapa del lóbulo C y área de la tapa del lóbulo N, respectivamente, y las áreas del asa del lóbulo C y del asa del lóbulo N, etiquetadas como áreas del "asa del lóbulo C" y del "asa del lóbulo N".

La FIGURA 3A representa una comparación de la magnitud de la respuesta de los anticuerpos contra la proteína TbpB intacta del patógeno humano Neisseria meningitidis (cepa B16B6 - SEQ.ID NO: 117) o la TbpB intacta del patógeno porcino Actinobacillus pleuropneumoniae (cepa H49 - SEQ.ID NO: 2) en diferentes especies huésped (ratones, conejos o cerdos) utilizando un 33% de Emulsigen D como adyuvante. El título de anticuerpos contra la TbpB de Actinobacillus pleuropneumoniae (barra gris) es ligeramente superior en ratones y conejos que contra la TbpB de Neisseria meningitidis (barra negra), pero sustancialmente inferior en cerdos. Estos resultados infieren que la unión de la transferrina del huésped puede estar influyendo en el desarrollo de la respuesta de los anticuerpos.

La FIGURA 3B representa una comparación de la magnitud de la respuesta de anticuerpos en cerdos contra la TbpB intacta del patógeno bovino Mannhemia haemolytica (cepa H196 - SEQ.ID NO: 206) o la TbpB intacta (SEQ.ID NO:2), el lóbulo N de la TbpB (SEQ.ID NO: 8) o el lóbulo C de TbpB (SEQ.ID NO: 6) del patógeno porcino Actinobacillus pleuropneumoniae (cepa H49). Los grupos de barras representan muestras de suero tomadas de cerdos individuales inmunizados el día 0 (antes de la primera inmunización), el día 21 (después de la primera inmunización), el día 42 (después de la segunda inmunización) y el día 56 (después de la tercera inmunización). Los sueros del cerdo inmunizado con TbpB intacta de M. haemolytica (Mh Intacta; cepa H196 - SEQ.ID NO: 206), se probaron con la TbpB de M. haemolytica intacta unida a la placa ELISA. Los sueros de los cerdos inmunizados con la TbpB de A. pleuropneumoniae (Ap Intacta), el lóbulo N de la TbpB (Lóbulo N de Ap) o el lóbulo C de la TbpB (Lóbulo C de Ap) se analizaron con la TbpB intacta de A. pleuropneumoniae unida a la placa ELISA.

La FIGURA 3C representa una comparación de la reactividad cruzada de los antisueros contra el dominio polipeptídico del lóbulo C de TbpB (SEQ.ID NO: 6), dominio polipeptídico del lóbulo N de TbpB (SEQ.ID NO: 8) y TbpB intacta (SEQ.ID NO: 2) del patógeno porcino Actinobacillus pleuropneumoniae (cepa H49). El grupo de barras representa la reactividad de los sueros contra la TbpB intacta de tres patógenos porcinos diferentes; Actinobacillus pleuropneumoniae cepa H49 (SEQ.ID NO: 2, barra negra), Haemophilus parasuis cepa HP5 (SEQ.ID NO: 115, barra gris oscura) y Actinobacillus pleuropneumoniae cepa H87 (SEQ.ID NO: 12, barra gris claro) que fueron seleccionadas para representar TbpBs antigénicamente diversas (FIG. 4). Los resultados ilustran la reactividad de los sueros inmunizados con TbpB intacta (primer grupo de la izquierda, etiquetado como "Intacta"), lóbulo N de TbpB (segundo grupo de la izquierda, etiquetado como "Lóbulo N"), lóbulo C de TbpB (tercer grupo de la izquierda, etiquetado como "Lóbulo C") o una mezcla del lóbulo N y del lóbulo C (cuarto grupo de la izquierda etiquetado como "Lóbulo N+C"). Se muestran las barras de error estándar de la media (SEM). Las estadísticas se realizaron mediante ANOVA con la prueba HSD (diferencia significativa honesta) de Tukeys realizada como post hoc. Las estrellas mostradas en la figura denotan pares específicos de inmunización/proteínas que difieren significativamente del lóbulo C o del lóbulo N+C probado contra H49.

La FIGURA 4 representa la diversidad de secuencias de los TbpB de los patógenos porcinos Actinobacillus pleuropneumoniae, A. suis y Haemophilus parasuis aislados de cerdos en Norteamérica, Europa y Asia. El árbol filogenético de máxima verosimilitud ilustra la relación entre 56 TbpBs basada en secuencias de nuestra colección de aislados clínicos u obtenidas de bases de datos públicas. Las secuencias de TbpB se agrupan en 3 grupos principales con aislamientos representativos indicados por las flechas (SEQ.ID NO: 2; SEQ.ID NO: 12; SEQ.ID NO: 28 y SEQ.ID NO: 107 a SEQ.ID NO: 115). Las cepas que expresan las variantes de TbpB utilizadas en el ensayo ELISA ilustrado en la FIG. 3 se indican con las estrellas negras grandes; la cepa H87 de A. pleuropneumoniae (SEQ.ID NO: 12), A. pleuropneumoniae cepa H49 (SEQ.ID NO: 2) y H. parasuis cepa HP5 (SEQ.ID NO: 115). Las flechas negras grandes representan los tres TbpB utilizados en la alineación ilustrada en la FIG. 1; A. pleuropneumoniae cepa H87 (SEQ.ID NO: 12), A. pleuropneumoniae cepa H49 (SEQ.ID NO: 2) y A. suis cepa H57 (SEQ.ID NO: 28).

La FIGURA 5 representa la unión no aleatoria del lóbulo N de TbpB (SEQ.ID NO: 8) de A. pleuropneumoniae H49 a las placas de ELISA ilustrada por la reducción sustancial de la unión de la transferrina marcada cuando se utiliza la proteína TbpB purificada para recubrir la placa de ELISA en lugar de la proteína de fusión (es decir, la proteína de unión a la maltosa (Mbp) fusionada al lóbulo N de TbpB) precursora (parte izquierda del panel A y del panel B). La figura también ilustra cómo el uso de un péptido biotinilado N-terminal supera la unión aleatoria (parte derecha del panel A y del panel B). La parte izquierda del panel A ilustra los resultados de un ensayo en el que se utiliza transferrina (Tf) marcada para medir la unión del lóbulo N de Mbp-TbpB purificado o del lóbulo N de TbpB a placas ELISA normales. La parte derecha ilustra los resultados cuando las proteínas recombinantes contienen una etiqueta peptídica N-terminal biotinilada que se utiliza para adherirse a placas ELISA recubiertas de estreptavidina. El panel B es una caricatura que ilustra lo que se cree que ocurre en los diferentes pozos de ELISA para los resultados correspondientes mostrados inmediatamente arriba en el panel A *** indica una significación estadística p < 0,001 entre el lóbulo N de la MBP y el lóbulo N, ns - no es estadísticamente significativo.

La FIGURA 6 representa el diseño y la producción de un multímero compuesto por el lóbulo C de TbpB de tres patógenos porcinos diferentes. El panel A muestra la secuencia de ADN y proteína del trímero (SEQ.ID NO: 39; SEQ.ID NO: 40) de los lóbulos C de la cepa H49 de A. pleuropneumoniae (SEQ.ID NO: 6), A. suis cepa H57 (SEQ.ID NO: 35) y A. pleuropneumoniae cepa H87 (SEQ.ID NO: 22), en ese orden. El subrayado indica la secuencia peptídica que conecta los lóbulos C individuales o que precede al primer lóbulo C. El panel B ilustra el análisis SDS-PAGE de una preparación del trímero del lóbulo C en comparación con las preparaciones del lóbulo N y del lóbulo C de la cepa M982 de N. meningitidis . se aplicó 1 |jl de muestra en los carriles 1,4 y 7, 5 j l en los carriles 2, 5 y 8 y 10 j l en los carriles 3, 6 y 9. Los pesos moleculares estándar de las proteínas (MWS) observados en estos geles son 93, 70, 63, 41, 30 y 22.

La FIGURA 7 representa la respuesta inmunitaria contra el lóbulo C de TbpB de A. pleuropneumoniae (lóbulo C H49, SEQ.ID NO: 6) en comparación con la respuesta inmunitaria contra un trímero compuesto por lóbulos C de TbpB lóbulos C de A. pleuropneumoniae H49, A. suis H57 y A. pleuropneumoniae H87 (trímero de lóbulos C, SEQ.ID NO: 40). El grupo de barras de la izquierda de la figura representa la respuesta inmunitaria contra el lóbulo C de H49, mientras que el grupo de barras de la izquierda de la figura representa la respuesta inmunitaria contra el trímero del lóbulo C. La barra negra representa la respuesta inmunitaria contra la TbpB de la cepa H49 de A. pleuropneumoniae (SEQ.ID NO: 2), la barra gris oscura representa la respuesta inmunitaria contra la TbpB de la cepa HP5 de H. parasuis (SEQ.ID NO: 115) y la barra gris claro representa la respuesta inmunitaria contra la TbpB de la cepa H87 de A. pleuropneumoniae (SEQ.ID NO: 22).

La FIGURA 8 representa las regiones de bucle del lóbulo N de la cepa H49 TbpB de Actinobacillus pleuropneumoniae (etiquetadas como "bucle 1"; "bucle 5"; "bucle 8a"; "bucle 8c" y "bucle 12") (SEQ ID. NO: 41; SEQ.ID NO: 49; SEQ.ID NO: 55; y SEQ.ID NO: 63, respectivamente) destinados a la reducción de bucles y las secuencias de los bucles originales y modificados. El bucle 8a y el bucle 8c se refieren a porciones del bucle 8 presentes en la TbpB de la cepa H49. El panel A es un modelo estructural del lóbulo N de Actinobacillus pleuropneumoniae TbpB visto de lado (en relación con la orientación dominante prevista en la superficie de la célula) con las regiones marcadas. El panel B es el mismo modelo estructural visto desde arriba para ilustrar la asociación de los bucles 1 y 5 con el dominio del asa y los bucles 8a, 8c y 12 asociados al dominio del barril. El panel C es una alineación de la TbpB nativa y de la TbpB con reducciones en las regiones del bucle objetivo. Las regiones de la secuencia que codifican los bucles están resaltadas en gris y etiquetadas con los números de los bucles.

La FIGURA 9 ilustra que la reducción del bucle de ingeniería de los lóbulos N de TbpB de la cepa H49 de A. pleuropneumoniae (SEQ.ID NO: 10), A. suis cepa H57 (SEQ.ID NO: 38) y A. pleuropneumoniae cepa H87 (SEQ.ID NO: 26) no afectó negativamente a su producción o estabilidad, pero eliminó la unión por parte de la Tf porcina. El panel superior ilustra la producción de H49 TbpB intacta (SEQ.ID NO: 2), el lóbulo N nativo de la TbpB h49 (SEQ.ID NO: 8) y los lóbulos N de TbpB de ingeniería de la cepa H49 de A. pleuropneumoniae (SEQ.ID NO: 10), A. suis cepa H57 (SEQ.ID NO: 38) o A. pleuropneumoniae cepa H87(SEQ.ID NO:26). Se expresaron como proteínas de fusión con una proteína de unión a la maltosa N-terminal con una etiqueta de polihistidina y se capturaron en una resina Ni-NTA. Las proteínas unidas se liberaron en tampón SDS-PAGE y se analizaron en un gel SDS-PAGE al 10%. El panel central representa las mismas preparaciones capturadas con una resina de afinidad consistente en transferrina porcina acoplada a Sepharose (pTf-Sepharose) y eluida en tampón SDS-PAGE. El panel inferior ilustra un ensayo de puntos con el material del panel superior eluido de la resina Ni-NTA y manchado en una resina de nitrocelulosa, bloqueada y expuesta a la transferrina porcina conjugada con rábano picante (HRP-pTf) en solución de bloqueo, y la HRP unida detectada con la incubación en el sustrato HRP.

La FIGURA 10 representa la diversidad de secuencias de las TbpB del patógeno humano Neisseria meningitidis. En esta figura se representa un subconjunto de genes tbpB secuenciados a partir de una colección de más de 100 cepas combinadas con una gran colección de secuencias disponibles en la base de datos pública BIGSDB (http://pubmlst.org/software/database/bigsdb/ - Bacterial Isolate Genome Sequence Database). La colección de secuencias representa una colección global de aislados a lo largo de un extenso periodo de tiempo de casi 50 años, por lo que se trata de una representación bastante completa de la diversidad global de TbpB. La FIG. 10A ilustra la diversidad de secuencias de los TbpB intactos. Se adjuntan las secuencias de las TbpB de las cepas indicadas con flechas, flechas dobles o líneas (SEQ.ID NO: 117; SEQ.ID NO: 124; SEQ.ID NO: 132 a SEQ.ID NO: 147; SEQ.ID NO: 177; y SEQ.ID NO: 178) para proporcionar secuencias representativas de los grupos identificados. En este árbol se identifican dos clados primarios representados por el Grupo 1 y por los Grupos 2-4, que corresponden a los linajes TbpB de isotipo I e isotipo II (22). Se representan los valores de soporte de las ramas primarias, y un "‘"identifica las ramas con un apoyo del 100%. Antígenos derivados de la TbpB de la cepa B16B6 [SEQ.ID NO: 117, flecha negra) se utilizaron para generar los antisueros analizados en la FIG. 11 y se comprobó su reactividad frente a TbpBs de las cepas ilustradas por las flechas grises (SEQ.ID NOs: 123; y s Eq .ID NO: 132 a SEQ.ID NO: 139) utilizando nuestro ensayo ELISA personalizado (FIG. 5). FIG. 10B representa la diversidad de secuencias de los lóbulos C de TbpBs que se derivaron de las secuencias de TbpB. Se adjuntan las secuencias de los lóbulos C de TbpB de las cepas indicadas con flechas o líneas (SEQ.ID NO: 119; SEQ.ID NO: 125; y SEQ.ID NO: 179 a SEQ.ID NO: 195) para proporcionar secuencias representativas. Las dos cepas indicadas por las flechas de doble cabeza se incluyeron para proporcionar una representación más completa de la diversidad del lóbulo C, pero no estaban disponibles para el análisis de los antisueros ilustrados en la FIG. 11.

La FIGURA 11 representa la reactividad de los antisueros dirigidos contra la TbpB intacta truncada (SEQ.ID NO: 148, aa 43-575) y el lóbulo C de TbpB (SEQ.ID NO: 119 aa 342- 575) derivado de B16B6, una cepa representativa del isotipo I de N. meningitidis. Los antisueros se probaron en nuestro ensayo ELISA personalizado (FIG. 5) frente a un panel de TbpBs que representan la diversidad general de secuencias de TbpBs en N. meningitidis (flechas, FIG. 10). El panel de TbpBs procede de las cepas B16B6 de N. meningitidis (SEQ.ID NO: 117), H44/76 (SEQ.ID NO: 133), S3131 (SEQ.ID NO: 132), M990 (SEQ.ID NO: 134), M978 (SEQ.ID NO: 135), M992 (SEQ.ID NO: 138), P3006 (SEQ.ID NO: 139), 120M (SEQ.ID NO: 137), MC58 (SEQ.ID NO: 136) y M982 (SEQ.ID NO: 123). Los resultados demuestran que el antisuero del lóbulo C tenía títulos más altos que el antisuero de la TbpB contra todas las TbpB, excepto las TbpB de B16B6 y H44/76.

La FIGURA 12 representa el diseño y la producción de un dímero compuesto por el lóbulo C de TbpB de dos cepas diferentes del patógeno humano Neisseria meningitidis (SEQ.ID NO: 118). El panel A muestra la secuencia de ADN y proteína para el dímero de lóbulos C de las cepas B16B6 de N. meningitidis (SEQ.ID NO: 118; y SEQ.ID NO: 119) y M982 (SEQ.ID NOS: 124; y SEQ.ID NO: 125), en ese orden. El subrayado indica la secuencia de ADN de la región peptídica que conecta los lóbulos C individuales. El panel B ilustra el análisis de SDS-PAGE de una preparación del dímero del lóbulo C en comparación con las preparaciones de los lóbulos C individuales de las cepas M982 y B16B6 de N. meningitidis .

La FIGURA 13 representa el análisis de la respuesta inmunitaria contra un dímero compuesto por el lóbulo C de TbpB de dos cepas diferentes del patógeno humano Neisseria meningitidis (SEQ.ID NO: 150). Los pares de barras representan sueros obtenidos de conejos inmunizados con adyuvante solo (ingenuo), con lóbulo C de B16B6 (SEQ.ID NO: 119), con el lóbulo C de M982 (SEQ.ID NO: 125) o el dímero de lóbulos C de B16B6 y M982 (SEQ.ID NO: 150) ilustrado en la FIG. 12. Las barras blancas representan los resultados del novedoso ensayo ELISA personalizado con M982 TbpB inmovilizada (SEQ.ID NO: 123) y la barra negra representa los resultados con la proteína B16B6 intacta inmovilizada (SEQ.ID NO: 117).

La FIGURA 14 representa la reducción de los dominios de bucle del lóbulo C del polipéptido TbpB de N. meningitidis M982. En el panel A, los modelos estructurales del lóbulo C nativo (SEQ.ID NO: 125) y el lóbulo C modificado (SEQ.ID ^{n O :} 129) para ilustrar la reducción de los cuatro bucles (L18, L21, L23 y L27). En el modelo de la izquierda (SEQ.ID NO: 125), los bucles que se han de reducir se indican con una línea negra punteada. El modelo medio (SEQ.ID NO: 129) ilustra los dominios de bucle modificados. En el modelo de la derecha, se superponen las dos estructuras anteriores para mostrar cómo se han eliminado los grandes bucles variables sin afectar a la estructura general de la proteína. El panel B es una alineación de la secuencia polipeptídica que compara las secuencias del lóbulo C nativo, los lóbulos C de ingeniería con los que se ha modificado un solo bucle y el lóbulo C en el que se han modificado los cuatro bucles (L18, L21, L23 y L27) (la secuencia etiquetada como "sin bucle"). Las regiones de la secuencia que abarcan los bucles seleccionados están resaltadas en gris y el número de bucle se indica en letra gris.

La FIGURA 15 representa la producción microbiana de los lóbulos C modificados de N. meningitidis M982 descritos en la FIG. 14. El lóbulo C de tipo salvaje (WT) (SEQ.ID NO: 125) corresponde al modelo de la izquierda en el panel A de la FIG. 14. Las otras muestras representan las proteínas con truncamientos en los bucles L18, L21, L23 y L27 y la proteína con los cuatro bucles eliminados [todos los bucles). El modelo estructural de esta proteína (SEQ.ID NO: 129) se ilustra en el centro del panel A de la FIG. 14. Los estándares de peso molecular de las proteínas (MWS) observados en este gel son 93, 70 y 41 kDa.

La FIGURA 16 representa la inmunogenicidad del lóbulo C modificado de la cepa M982 de N. meningitidis en relación con los lóbulos C nativos de la cepa M982 y B16B6. Los títulos finales de los antisueros de ratón se determinaron con nuestro ensayo ELISA personalizado. Los ratones fueron inmunizados con el lóbulo C de la cepa M982 (SEQ.ID NO: 125, primera barra), el lóbulo C TbpB de la cepa B16B6 (SEQ.ID NO: 119, segunda barra) o el lóbulo C de M982 "sin bucles" (SEQ.ID NO: 129, últimos dos compases). Los sueros se probaron contra la TbpB intacta inmovilizada de la cepa M982 (SEQ.ID NO: 123) (primera y tercera barras) o la cepa B16B6 (SEQ.ID NO: 117) (segundo y cuarto compás). Los resultados muestran que el lóbulo C modificado fue más inmunogénico, ya que dio lugar a un título más alto contra la TbpB intacta de la cepa M982 que la proteína del lóbulo C madre (comparar barras 3 y 1). Sorprendentemente, el lóbulo C modificado produjo incluso un nivel similar de reactividad a la TbpB heteróloga B16B6 que el lóbulo C de esa cepa (comparar barras 4 y 2).

La FIGURA 17 representa el diseño de proteínas híbridas que muestran regiones de TbpA en el andamio del lóbulo C de TbpB. El panel A es un modelo estructural de TbpA (SEQ.ID NO: 152) destacando las regiones seleccionadas para "trasplantar" al lóbulo C de TbpB. La hélice del bucle 3 de TbpA, el bucle 10, el bucle 11 y el bucle de tapón se muestran como regiones llenas de espacio. El panel B muestra una alineación del lóbulo C nativo (lóbulo C) (SEQ.ID NO: 125), el andamio del lóbulo C sin bucles (C sin bucles) (SEQ.ID NO: 129) y una proteína híbrida con todas las regiones de TbpA mostradas (SEQ.ID NO: 131). En la proteína híbrida, la hélice del bucle 3 de TbpA sustituye al bucle 18 del lóbulo C de TbpB, el bucle 10 de TbpA sustituye al bucle 21 del lóbulo C de TbpB, el bucle 11 de TbpA sustituye al bucle 23 del lóbulo C de TbpB y el bucle de tapón de TbpA sustituye al bucle 27 del lóbulo C de TbpB.

La FIGURA 18 representa la producción microbiana de lóbulos C híbridos TbpA-TbpB que se produjeron utilizando la estrategia descrita en la FIG 17. El panel A ilustra la producción de las proteínas de fusión recombinantes con un socio de fusión de la proteína de unión a la maltosa (Mbp) N-terminal y el panel B ilustra las proteínas después de la escisión con la proteasa TEV. La proteína de tipo salvaje (WT) es el lóbulo C nativo de M982 (SEQ.ID NO: 125) y el lóbulo menos es el lóbulo C con los cuatro bucles eliminados (SEQ.ID NO: 129) que sirve efectivamente de andamio para mostrar las regiones TbpA. El bucle 10 se refiere a la proteína con la región del bucle extracelular de TbpA insertada en el bucle 21 del lóbulo C de TbpB (SEQ.ID NO: 154). El bucle 11 se refiere a la proteína con la región del bucle extracelular de TbpA que se insertó en el bucle 23 del lóbulo C de TbpB (SEQ.ID NO: 156). La hélice 3 se refiere al segmento del bucle extracelular 3 de TbpA que se insertó en el bucle 27 del lóbulo C de TbpB (SEQ.ID NO: 158). El bucle de tapón se refiere a la región del dominio de tapón de TbpA que se insertó en el bucle 18 del lóbulo C de TbpB (SEQ.ID NO: 160). Los pesos moleculares estándar de las proteínas (MWS) observados en estos geles son 93, 70, 53, 41 y 22.

La FIGURA 19 representa la inmunogenicidad del lóbulo C modificado de la cepa M982 de N. meningitidis en comparación con el lóbulo C modificado con regiones de bucle extrañas de TbpA empalmadas en los sitios del bucle modificado. Los títulos finales de los antisueros de ratón se determinaron con nuestro ensayo ELISA personalizado. Los ratones fueron inmunizados con: (i) el lóbulo C "sin bucles" con los cuatro bucles eliminados (SEQ.ID NO: 129), ii) el lóbulo C "sin bucles" con el bucle 10 de TbpA insertado en el bucle 21 del lóbulo C de TbpB (SEQ.ID n O: 154), iii) el lóbulo C "sin bucles" con el bucle 11 de TbpA insertado en el bucle 23 del lóbulo C de TbpB (SEQ.ID NO: 156), iv) el lóbulo C "sin bucles" con la hélice del bucle 3 de TbpA insertada en el bucle 27 del lóbulo C de TbpB (SEQ.ID NO: 158), o (v) el lóbulo C "sin bucles" con el bucle de tapón de TbpA insertado en el bucle 18 del lóbulo C de TbpB (SEQ.ID NO: 160). Los sueros se probaron contra el antígeno híbrido TbpA-TbpB en el que el lóbulo C "sin bucles" tiene insertados los cuatro bucles de TbpA (SEQ.ID NO: 131). Los resultados muestran que todos los antígenos híbridos eran inmunogénicos, al menos tan inmunogénicos como el lóbulo C "sin lazos".

La FIGURA 20 representa el diseño y la producción de proteínas híbridas que muestran regiones de LbpA (SEQ.ID NO: 162) en el andamio del lóbulo C de TbpB. El panel A es un modelo estructural de LbpA en el que se destacan las regiones seleccionadas para "trasplantar" al lóbulo C de TbpB. La hélice del bucle 3 de LbpA está coloreada en gris más oscuro y el bucle 2 en negro. El panel B muestra una alineación del lóbulo C nativo (lóbulo C, SEQ.ID NO: 125), el andamio del lóbulo C sin bucles (C sin bucles, SEQ.ID NO: 129) y la proteína híbrida con las regiones de LbpA mostradas. En la proteína híbrida el bucle 2 de LbpA sustituye al bucle 21 del lóbulo C de TbpB (SEQ.iD NO: 164) y la hélice del bucle 3 de LbpA sustituye al bucle 18 del lóbulo C de TbpB (SEQ.ID NO: 166). Los estándares de peso molecular de las proteínas (MWS) observados en estos geles son 100, 75, 63 y 48.

La FIGURA 21 representa el diseño de un "bucle de conjugación" en el lóbulo C de la TbpB del patógeno humano Haemophilus influenzae. El panel A muestra la secuencia de ADN y proteína para el gen que codifica el gen híbrido con la región de ADN que codifica el bucle de conjugación mostrada en letra más grande (SEQ.ID NO: 167). Los aminoácidos se muestran en un código de una sola letra en el que la lisina se indica con la letra K, de la cual hay 42 en el bucle de conjugación en comparación con 24 en todo el lóbulo C (SEQ.ID NO: 168). El panel B ilustra un modelo estructural del lóbulo C de la TbpB de H. influenzae que indica la posición para la inserción del bucle de conjugación. Como se ilustra, el bucle de conjugación se inserta en el dominio del asa del lóbulo C sustituyendo al bucle L23 del lóbulo C (utilizando la nomenclatura de bucle utilizada a lo largo de esta divulgación) (FIG. 2). Cabe señalar que, a efectos ilustrativos, el modelo se creó con un bucle de conjugación de 11 aminoácidos en lugar de los 91 de la proteína real.

La FIGURA 22 representa las propiedades de unión a la transferrina de las proteínas TbpB mutantes dirigidas al sitio, derivadas de las proteínas TbpB truncadas recombinantes de A. pleuropneumoniae, A. suis y H. parasuis. Las proteínas TbpB truncadas recombinantes se expresaron como proteínas de fusión y se comprobó su actividad de unión. Las proteínas de fusión recombinantes fueron examinadas inicialmente para la unión de la transferrina mediante un ensayo de unión en fase sólida y un ensayo de captura por afinidad. A continuación, se evaluó la unión de las proteínas mutantes purificadas a la pTf mediante calorimetría isotérmica, resonancia de plasmón de superficie o interferometría de bicapa(23-25). Varias de las mutaciones dieron lugar a un aumento de > 100 veces en la constante de afinidad (Kd), como la mutación F171A en la TbpB de la cepa H49 de A. pleuropneumoniae , la mutación Y174A en la TbpB de la cepa H49 de A. pleuropneumoniae o las mutaciones Y167A o W176A en la TbpB de la cepa HP5 de H. parasuis . Es interesante observar que todos estos mutantes se asignan al bucle 8.

La FIGURA 23 representa la capacidad mejorada de una proteína mutante dirigida al sitio para inducir una respuesta inmunitaria protectora en el huésped nativo. En esta figura se muestra la capacidad de la TbpB dirigida al sitio Y167A de la cepa HP5 de H. parasuis (SEQ.ID NO: 174) se compara con la TbpB de tipo salvaje (SEQ.ID NO: 115), y controles que incluían una vacuna comercial (Porcillis Glasser) y el adyuvante solo. Los cerdos fueron expuestos por inoculación intratraqueal con 108 unidades formadoras de colonias (cfus) de la cepa Hp5 (Nagasaki) y fueron monitorizados para detectar signos y síntomas clínicos durante todo el experimento. Los animales con sintomatología grave fueron sometidos a eutanasaia antes de finalizar el experimento. El gráfico muestra la curva de supervivencia de 24 a 108 horas en incrementos de 12 horas, y luego conecta con el punto de tiempo final a los 14 días.

La FIGURA 24 representa la respuesta inmunitaria celular inducida por los antígenos TbpB nativos y mutantes. Los paneles A y B ilustran la respuesta de las células B el día de la exposición (después de dos inmunizaciones IM) y 4 días (96 horas) después de la exposición, respectivamente. Los paneles C y D ilustran la respuesta de las células T auxiliares el día de la exposición y 4 días después de la exposición. Los rombos, triángulos y cuadrados representan cerdos inmunizados con TbpB nativa, la TbpB mutante Y167A y la vacuna Porcilis Glasser (PG), respectivamente. Hay un número reducido de muestras para los cerdos nativos de TbpB y los tratados con la vacuna PG en el cuarto día después de la exposición. El análisis se realizó por medio de un análisis FACS con células mononucleares de sangre periférica. Diferencias significativas entre los grupos: *p<0.05, *** p<0.001.

La FIGURA 25 representa que la inmunización con la TbpB truncada recombinante, el lóbulo N de la TbpB truncada recombinante o el lóbulo C de la TbpB recombinante de N. meningitidis proporciona protección contra la colonización en un modelo de ratón transgénico humanizado. En el experimento ilustrado en el panel A, los ratones negros C57 transgénicos que expresan el receptor humano CEACAM1 fueron inmunizados con TbpB truncada recombinante de la cepa M982 de N. meningitidis o con adyuvante solo el día 1 y el día 21. Los ratones fueron sometidos a una inoculación intranasal con aproximadamente 1 * 107 UFC de la cepa M982 de N. meningitidis el día 35. Los cuadrados y los círculos representan las UFC recuperadas de ratones individuales 3 días después de la exposición (día 38). El panel B ilustra un experimento de seguimiento en el que los ratones fueron inmunizados con TbpB truncada recombinante, lóbulo N de TbpB truncada recombinante, lóbulo C de TbpB recombinante, proteína de unión al factor H recombinante o adyuvante solo el día 1 y el día 21. Al igual que en el panel A, el número de UFC de la cepa M982 de N. meningitidis recuperada 3 días después de la exposición en ratones individuales se representa en el gráfico.

La FIGURA 26 representa la diversidad de secuencias de los lóbulos TbpB y TbpB C del patógeno humano Neisseria gonorrhoeae. Panel A (FIG. 26A) ilustra la diversidad de secuencias de las TbpB intactas y el panel B (FIG. 26B) representa la diversidad de secuencias para los lóbulos C de TbpB. Secuencias de TbpBs y lóbulos C de TbpB representativos de N. meningitidis (FIG. 10, flechas y flechas dobles) se incluyeron en este análisis para determinar hasta qué punto las secuencias de los lóbulos TbpB y TbpB C de N. gonorrhoeae son un subconjunto de la diversidad de secuencias presentes en N. meningitidis. En cuanto a la FIG.10, secuencias TbpB representativas de N. gonorrhoeae (SEQ ID NO: 207 a SEQ ID NO: 212) y las secuencias del lóbulo C de TbpB (SEQ ID NO: 213 a SEQ ID NO: 218) indicados con flechas se incluyen en el apéndice para proporcionar una representación de la diversidad global de secuencias. Como se ilustra en el panel A , hay dos grupos de TbpB de N. gonorrhoeae que son sub-ramas de TbpB de isotipo 2 de meningococo. Hay un grupo más grande relacionado con la TbpB de la cepa meningocócica H44/76 y un grupo más pequeño relacionado con la TbpB de la cepa P3306. El árbol de lóbulos C del panel B revela que los lóbulos C de la TbpB de N. gonorrhoeae forman un grupo distinto de los lóbulos C de la TbpB meningocócica que están más estrechamente relacionados con la TbpB del isotipo 2 meningocócica.

La FIGURA 27 representa la diversidad de secuencias de TbpBs y lóbulos C de TbpB del patógeno humano Haemophilus influenzae. Panel A (FIG. 27A) ilustra la diversidad de secuencias de las TbpB intactas y el panel B (FIG. 27B) representa la diversidad de secuencias para los lóbulos C de TbpB. Secuencias representativas de H. influenzae TbpB (SEQ ID NO: 196-204) indicados con flechas se incluyen en el apéndice para proporcionar una representación de la diversidad global de la secuencia. Como se ilustra en el panel A , hay tres agrupaciones (grupos) principales de TbpB de H. influenzae que incluyen cepas de H. influenzae de tipo b y no tipificables entremezcladas, lo que indica que la diversidad de TbpB no está vinculada a ningún otro atributo como la presencia de cápsula. También hay tres grupos principales de diversidad de lóbulos C.

La FIGURA 28 representa la diversidad de secuencias de TbpBs entre los patógenos de rumiantes Mannheimia haemolytica, Mannheimia glucosida y Bibersteinia trehalosi (también conocidos en el arte como Pasteurella haemolytica y P. trehalosi, respectivamente). Las flechas indican secuencias representativas incluidas en el listado Se Q.ID NO:.

La FIGURA 29 representa la diversidad de secuencias de las TbpB de Moraxella catarrhalis. Las flechas indican las secuencias representativas de TbpBs de los tres grupos principales que se incluyen en el listado SEQ.ID NO:.

La FIGURA 30 representa un árbol filogenético ilustrativo.

Las TABLAS 1-3 representan combinaciones de 1, 2 o 3 dominios de bucle, respectivamente, seleccionados de los dominios de bucle L1-L32 de los polipéptidos HIBP, que pueden ser modificados de acuerdo con la presente divulgación.

significa un dominio de bucle o una combinación de dominios de bucle que pueden ser modificados de acuerdo con ciertos aspectos de la presente divulgación.

significa una combinación no permitida de dominios de bucle de acuerdo con ciertos aspectos de la presente divulgación.

□

significa una combinación de dominios de bucle permitidos, mostrados sin embargo por un

0

en otra parte de la misma tabla, de acuerdo con ciertos aspectos de la presente divulgación.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA DIVULGACIÓN

A continuación se describen varias composiciones y procedimientos. Ninguna de las divulgaciones que aparecen a continuación limita la materia reivindicada y cualquier materia reivindicada puede abarcar procedimientos, procesos, composiciones o sistemas que difieren de los descritos a continuación. La materia reivindicada no se limita a las composiciones o procedimientos que tienen todas las características de cualquier composición, procedimiento, sistema o proceso descrito a continuación o a las características comunes a múltiples o todas las composiciones, sistemas o procedimientos descritos a continuación. Es posible que una composición, un sistema, un procedimiento o un proceso descrito a continuación no sea una realización de ninguna materia reivindicada. Cualquier materia divulgada en una composición, sistema, procedimiento o proceso descrito a continuación que no se reivindique en este documento puede ser objeto de otro instrumento de protección, por ejemplo, una solicitud de patente continuada, y los solicitantes, inventores o propietarios no pretenden abandonar, renunciar o dedicar al público ninguna de esas materias mediante su divulgación en este documento.

Cabe señalar que los términos de grado como "sustancialmente", "esencialmente" "alrededor de" y "aproximadamente", tal y como se utilizan en el presente documento, significan una cantidad razonable de desviación del término modificado, de manera que el resultado final no cambie significativamente. Estos términos de grado deben interpretarse como una desviación del término modificado si esta desviación no niega el significado del término que modifica.

Tal y como se utiliza en este documento, la expresión "y/o" pretende representar un inclusivo-o. Es decir, "X y/o Y" quiere decir X o Y o ambos, por ejemplo. Como ejemplo adicional, "X, Y, y/o Z" se refiere a X o Y o Z o cualquier combinación de los mismos.

Como se ha mencionado anteriormente, la presente divulgación proporciona novedosas composiciones inmunogénicas, y en particular composiciones inmunogénicas basadas en las proteínas receptoras de superficie de HIBP de especies bacterianas patógenas Gram-negativas, como Neisseria meningitidis. Las composiciones inmunogénicas de la presente divulgación son útiles porque pueden emplearse para preparar novedosas formulaciones de vacunas para proteger a los seres humanos y a los animales contra especies bacterianas patógenas infecciosas. De acuerdo con la presente divulgación, las proteínas receptoras de superficie de HIBP de la presente divulgación se modifican de tal manera que son incapaces de unirse sustancialmente a las proteínas de unión al hierro del huésped. Estas proteínas receptoras de superficie de HIBP modificadas presentan propiedades inmunogénicas inesperadamente fuertes. Además, las composiciones inmunogénicas de la presente divulgación son polipéptidos sustancialmente estables y, por tanto, pueden fabricarse fácilmente. Además, y de manera importante, las composiciones inmunogénicas de la presente divulgación son inesperadamente eficaces, por ejemplo, al inducir una respuesta inmunitaria cruzada, permitiendo así la protección contra múltiples organismos microbianos patógenos mediante la administración de un único compuesto de vacuna eficaz. Las vacunas preparadas de acuerdo con la presente divulgación no contienen organismos vivos ni extractos crudos, por lo que representan un riesgo muy limitado para la salud.

En consecuencia, la presente divulgación proporciona, en al menos un aspecto, una composición inmunogénica que comprende una proteína receptora de superficie de HIBP de una especie bacteriana patógena Gram-negativa, en la que la proteína receptora de superficie de HIBP ha sido modificada de tal manera que es incapaz de unirse sustancialmente a la proteína de unión al hierro del huésped.

La presente divulgación proporciona además una composición inmunogénica que comprende un polipéptido que comprende un dominio del lóbulo C o un dominio del lóbulo N de una proteína receptora de superficie de HiBp que se puede obtener de una especie bacteriana patógena Gram-negativa, en la que el polipéptido es incapaz de unirse sustancialmente a la proteína de unión al hierro del huésped. En ciertos aspectos, el dominio del lóbulo N o el dominio del lóbulo C de la proteína receptora de superficie de HIBP comprende una pluralidad de hebras p conectadas por una pluralidad de dominios de bucle, y uno o más dominios de bucle de la pluralidad de dominios de bucle ha sido modificado.

Términos y definiciones

A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que se entiende comúnmente por una persona con conocimientos normales en la técnica a la que pertenece la divulgación. Se señala además que, tal como se utiliza en esta especificación y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "uno, una" y "el, la" incluyen referentes plurales a menos que el contenido dicte claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a "un inmunógeno" incluye una mezcla de dos o más agentes de este tipo, la referencia a "un polipéptido" incluye la referencia a mezclas de dos o más polipéptidos, la referencia a "una célula" incluye dos o más células de este tipo, y similares.

Los términos "inmunógeno" y "composición inmunogénica", utilizados indistintamente en el presente documento, se emplean en su sentido más amplio para referirse a una molécula que contiene uno o más epítopos que estimularán la respuesta inmunitaria en un organismo huésped para generar una respuesta inmunitaria celular específica del inmunógeno, y/o una respuesta humoral de anticuerpos. Los inmunógenos incluyen ácidos nucleicos, proteínas, polipéptidos, péptidos y fragmentos de proteínas inmunogénicas.

Los términos "vacuna" y "composición de vacuna", utilizados indistintamente en el presente documento, se refieren a cualquier composición farmacéutica que contenga un inmunógeno, cuya composición puede utilizarse para prevenir o tratar una enfermedad o afección en un sujeto. Los términos abarcan, por tanto, las vacunas de subunidades, es decir, las composiciones de vacunas que contienen inmunógenos que están separados y discretos de un organismo completo con el que el inmunógeno está asociado en la naturaleza.

El término "sujeto vertebrado" se refiere a cualquier miembro del subfilo Chordata, particularmente los mamíferos, incluyendo, sin limitación, los humanos y otros primates. El término no denota una edad concreta. Por lo tanto, se pretende cubrir tanto a los recién nacidos, como a los lactantes, niños y adultos.

Los términos utilizados indistintamente en el presente documento "proteína receptora de superficie de HIBP", "polipéptido receptor de superficie de HIBP", "proteína receptora de superficie de la proteína de unión al hierro del huésped" o "polipéptido de superficie de la proteína de unión al hierro del huésped" se refieren a cualquier proteína o polipéptido anclado en la membrana que se pueda obtener de una especie bacteriana Gram-negativa capaz de interactuar con las proteínas de unión al hierro del huésped. El término incluye, cualquier proteína TbpB y LbpB. Las proteínas receptoras de superficie de HIBP, cuando se pliegan en su estructura tridimensional nativa, están compuestas por una estructura bimodal que comprende un dominio del lóbulo N y un dominio del lóbulo C, comprendiendo el dominio del lóbulo N y el dominio del lóbulo C una pluralidad de hebras p ensambladas en un barril p, y una pluralidad de hebras p ensambladas en una estructura de lámina p adyacente al barril p, denominada dominio de asa, en el que las hebras p están conectadas por una pluralidad de dominios de bucle (como se ilustra además en la FIG. 1). Los términos se refieren además a todas y cada una de las secuencias de polipéptidos receptores de superficie de HIBP, incluyendo todos los polipéptidos receptores de superficie de HIBP bacterianos, incluyendo, sin limitación, los establecidos en SEQ.ID NO: 2; SEQ.ID NO: 12; SEQ.ID NO: 28; SEQ.ID NO: 107 a SEQ.ID NO: 115; SEQ ID NO: 117; SEQ.ID NO: 123; SEQ.ID NO: 131 a SEQ.ID NO: 147; SEQ.ID NO: 177; SEQ.ID NO: 178; SEQ.ID NO: 196 a SEQ.ID NO: 204; SEQ.ID NO: 206 a SEQ.ID NO: 212; y SEQ.ID NO: 219 a SEQ.ID NO: 228, y los que comprenden una secuencia de residuos de aminoácidos que (i) son sustancialmente idénticos a las secuencias de aminoácidos que constituyen cualquier proteína receptora de superficie de HIBP establecida en el presente documento; (ii) están codificados por una secuencia de ácido nucleico capaz de hibridar en condiciones al menos moderadamente estrictas con cualquier secuencia de ácido nucleico que codifique cualquier proteína receptora de superficie de HIBP establecida en el presente documento o capaz de hibridar en condiciones al menos moderadamente estrictas con cualquier secuencia de ácido nucleico que codifique cualquier proteína receptora de superficie de HIBP establecida en el presente documento, pero para el uso de codones sinónimos. Los términos incluyen además cualquier polipéptido precursor de la proteína receptora de superficie de HIBP; o (iii) utilizarán las proteínas de unión a la transferrina, las proteínas de unión a la lactoferrina o sus subdominios como plantillas cuando se sometan a un servidor de modelado estructural como Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/) o Swiss-Model (http://swissmodel.expasv.org/). en este último seleccionando el modo automatizado. Los términos incluyen además polipéptidos TbpB maduros, así como cualquier precursor de polipéptido receptor de superficie de HIBP, incluyendo cualquier precursor de polipéptido receptor de superficie pre-HIBP, o precursor de polipéptido receptor de superficie de HIBP que comprenda una secuencia N-terminal u otra secuencia señal.

Los términos utilizados indistintamente en el presente documento "proteína integral de membrana externa" y "proteína IOM" se refieren a cualquier proteína integral de membrana externa de especies bacterianas Gram-negativas, incluyendo cualquier proteína perteneciente a la subclase de proteínas dependientes de TonB, que cuando se pliegan en su estructura tridimensional nativa comprenden un dominio beta-barril C-terminal de 22 hebras y un dominio de tapón o corcho N-terminal capaz de llenar un canal en el dominio beta-barril C-terminal. El término incluye, sin limitación, la proteína TbpA y LbpA. Los términos se refieren además a todas y cada una de las secuencias polipeptídicas de la OIM, incluidas las expuestas en la SEQ.ID NO: 152; y SEQ.ID NO: 162 y los que comprenden una secuencia de residuos de aminoácidos que (i) son sustancialmente idénticos a las secuencias de aminoácidos que constituyen cualquier proteína IOM establecida en el presente documento; (ii) están codificados por una secuencia de ácido nucleico capaz de hibridar en condiciones al menos moderadamente estrictas con cualquier secuencia de ácido nucleico que codifique cualquier proteína IOM establecida en el presente documento o capaz de hibridar en condiciones al menos moderadamente estrictas con cualquier secuencia de ácido nucleico que codifique cualquier proteína IOM establecida en el presente documento, pero para el uso de codones sinónimos. Los términos incluyen además cualquier polipéptido precursor de la proteína IOM; o (iii) utilizarán 3V8X o sus subdominios como plantillas cuando se sometan a un servidor de modelado estructural como Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/) o Swiss-Model(http://swissmodel.expasy.orq/). en este último seleccionando el modo automatizado.

El término "dominio de lóbulo N", tal como se utiliza en el presente documento. se refiere a la porción N-terminal de una proteína receptora de superficie de HIBP que comprende una pluralidad de hebras p conectadas por una pluralidad de dominios de bucle. en la que algunas de las hebras p están configuradas para formar un barril p y una estructura de hoja p adyacente. denominada dominio de asa (véase: FIG 1; residuo de aminoácido 46 a residuo de aminoácido 342). El término dominio del lóbulo N incluye además. sin limitación. todos los polipéptidos que tienen la secuencia establecida en la SEQ.ID NO: 8; SEQ.ID NO: 10; SEQ.ID NO: 24; SEQ.ID NO: 26; SEQ.ID NO: 36; SEQ.ID NO: 38; SEQ.ID NO: 121; SEQ.ID NO: 127; SEQ.ID NO: 229; SEQ.ID NO: 231; y SEQ.ID NO: 233.

El término "dominio de lóbulo C". tal como se utiliza en el presente documento. se refiere a la porción C-terminal de una proteína receptora de superficie de HIBP que comprende una pluralidad de hebras p conectadas por una pluralidad de dominios de bucle. en la que algunas de las hebras p están configuradas para formar un barril p y una estructura de hoja p adyacente denominada dominio de asa. Refiriéndose a la FIG. 1 y FIG. 2, el dominio de asa del lóbulo C es el dominio polipeptídico contiguo desde la hebra p 16 en adelante y hasta la hebra p 23 inclusive que. en el caso de la en la FIG. 2 representó los polipéptidos ApH49. ApH57 y ApH87 TbpB. consta de los residuos de aminoácidos 344 a 431. y en la SEQ.ID. NO: 2 desde el residuo de aminoácido 314 hasta el residuo de aminoácido 401 (ApH 49). en la SEQ.ID. NO: 27 desde el residuo de aminoácido 363 hasta el residuo de aminoácido 450 (ApH 57). y en la SEQ.ID. NO: 12 del residuo de aminoácido 315 al residuo de aminoácido 401 (ApH 87). El dominio del lóbulo C p-barril es el dominio polipeptídico contiguo desde la hebra p 23 en adelante hasta el extremo C del polipéptido. que. en el caso del en la FIG. 2 representado los polipéptidos ApH49. ApH57 y ApH87 TbpB. es la cadena polipeptídica desde el aminoácido 443 en adelante y hasta el C-terminal. y en la SEQ.ID. NO: 2 a partir del residuo de aminoácido 413 (ApH 49). en la SEQ.ID. NO: 27 a partir del residuo de aminoácido 462 (ApH 57). y en la SEQ.ID. NO: 12 a partir del residuo de aminoácido 413. Se observa que el dominio asa del lóbulo C y el dominio p-barril del lóbulo C pueden estar conectados por un bucle corto (denotado como "L24" en la FIG. 1 y FIG. 2). Se observa además que el término dominio del lóbulo C. tal como se utiliza en el presente documento. pretende incluir específicamente. no sólo el dominio del lóbulo C p-barril. sino también el dominio del asa que forma una estructura de lámina p. compuesta típicamente por aproximadamente 90 o más residuos de aminoácidos. y situada N-terminalmente en relación con la estructura del lóbulo C p-barril. El término dominio del lóbulo C. tal y como se utiliza en el presente documento. incluye además. sin limitación. todos los polipéptidos expuestos en la ^{s E q . I D} NO: 5; SEQ.ID NO: 6; SEQ.ID NO: 22; SEQ.ID NO: 33; SEQ.ID NO: 34; SEQ.ID NO: 119; SEQ.ID NO: 125; SEQ.ID NO: 179 a SEQ.ID NO: 195; SEQ.ID NO: 213 a SEQ.ID NO: 218; SEQ.ID NO: 230; SEQ.ID NO: 232; SEQ.ID NO: 234 a SEQ.ID NO: 278; y SEQ.ID NO: 288 a SEQ.ID NO: 292.

El término "dominio de bucle" se refiere a las secuencias polipeptídicas en una proteína receptora de superficie de HIBP que conectan dos hebras p. Estas secuencias polipeptídicas pueden variar considerablemente en longitud. desde varios residuos de aminoácidos hasta 150 o más residuos de aminoácidos.

Los términos "TbpB". "proteína TbpB". "polipéptido TbpB". utilizados indistintamente en el presente documento. se refieren a todas y cada una de las secuencias de la proteína B de unión a la transferrina. incluidos todos los polipéptidos TbpB bacterianos y los polipéptidos que comprenden una secuencia de residuos de aminoácidos que es (i) sustancialmente idéntica a las secuencias de aminoácidos que constituyen cualquier polipéptido TbpB establecido en el presente documento. incluyendo. sin limitación. SEQ.ID NO: 2; SEQ.ID NO: 12; ^{S E Q . i D N o :} 28; SEQ.ID NO: 107 a SEQ.ID NO: 115; SEQ ID NO: 117; SEQ.ID NO: 123; SEQ.ID NO: 131 a SEQ.ID NO: 147; SEQ.ID NO: 177; SEQ.ID NO: 178; SEQ.ID NO: 196 a SEQ.ID NO: 204; SEQ.ID NO: 206 a SEQ.ID NO: 212; y SEQ.ID NO: 219 a SEQ.ID NO: 228. o (ii) codificada por una secuencia de ácido nucleico capaz de hibridar en condiciones al menos moderadamente estrictas con cualquier secuencia de ácido nucleico que codifique cualquier polipéptido TbpB establecido en el presente documento o capaz de hibridar en condiciones al menos moderadamente estrictas con cualquier secuencia de ácido nucleico que codifique cualquier polipéptido TbpB establecido en el presente documento. pero para el uso de codones sinónimos. Los términos incluyen además polipéptidos TbpB maduros. así como cualquier precursor de TbpB. incluyendo cualquier pre-TbpB. o TbpB que comprenda una secuencia N-terminal u otra secuencia de señal.

Los términos "LbpB". "proteína LbpB". "polipéptido LbpB". utilizados indistintamente en el presente documento. se refieren a todas y cada una de las secuencias de la proteína B de unión a la lactoferrina. incluidos todos los polipéptidos LbpB bacterianos y un polipéptido que comprende una secuencia de residuos de aminoácidos que es (i) sustancialmente idéntica a las secuencias de aminoácidos que constituyen cualquier polipéptido LbpB establecido en el presente documento. incluyendo. sin limitación. SEQ.ID NO: 285 o (ii) codificada por una secuencia de ácido nucleico capaz de hibridar en condiciones al menos moderadamente estrictas con cualquier secuencia de ácido nucleico que codifique cualquier polipéptido LbpB establecido en el presente documento o capaz de hibridar en condiciones al menos moderadamente estrictas con cualquier secuencia de ácido nucleico que codifique cualquier polipéptido LbpB establecido en el presente documento. pero para el uso de codones sinónimos. Los términos incluyen además cualquier precursor de LbpB. incluido el pre-LbpB.

Los términos "TbpA". "proteína TbpA". "polipéptido TbpA". utilizados indistintamente en el presente documento. se refieren a todas y cada una de las secuencias de la proteína A de unión a la transferrina. incluidos todos los polipéptidos TbpA bacterianos y los polipéptidos que comprenden una secuencia de residuos de aminoácidos que es (i) sustancialmente idéntica a las secuencias de aminoácidos que constituyen cualquiera de los polipéptidos TbpA expuestos en el presente documento, incluyendo, sin limitación, SEQ.ID NO: 152 o (ii) codificada por una secuencia de ácido nucleico capaz de hibridar en condiciones al menos moderadamente estrictas con cualquier secuencia de ácido nucleico que codifique cualquier polipéptido TbpA establecido en el presente documento o capaz de hibridar en condiciones al menos moderadamente estrictas con cualquier secuencia de ácido nucleico que codifique cualquier polipéptido TbpA establecido en el presente documento, pero para el uso de codones sinónimos. Los términos incluyen además cualquier precursor de la TbpA, incluyendo la pre-TbpA.

Los términos "LbpA", "proteína LbpA", "polipéptido LbpA", utilizados indistintamente en el presente documento, se refieren a todas y cada una de las secuencias de la proteína A de unión a la lactoferrina, incluidos todos los polipéptidos LbpA bacterianos y un polipéptido que comprende una secuencia de residuos de aminoácidos que es (i) sustancialmente idéntica a las secuencias de aminoácidos que constituyen cualquier polipéptido LbpA establecido en el presente documento, incluyendo, sin limitación, SEQ.ID NO: 162, o (ii) codificada por una secuencia de ácido nucleico capaz de hibridar en condiciones al menos moderadamente estrictas con cualquier secuencia de ácido nucleico que codifique cualquier polipéptido LbpA establecido en el presente documento o capaz de hibridar en condiciones al menos moderadamente estrictas con cualquier secuencia de ácido nucleico que codifique cualquier polipéptido LbpA establecido en el presente documento, pero para el uso de codones sinónimos. Los términos incluyen además cualquier precursor de la LbpA, incluyendo la pre-LbpA.

El término "secuencia de ácido nucleico", tal como se utiliza aquí, se refiere a una secuencia de monómeros de nucleósidos o nucleótidos que consiste en bases, azúcares y enlaces interazúcares (backbone) naturales. El término también incluye secuencias modificadas o sustituidas que comprenden monómeros no naturales o porciones de los mismos. Las secuencias de ácido nucleico de la presente divulgación pueden ser secuencias de ácido desoxirribonucleico (ADN) o secuencias de ácido ribonucleico (ARN) y pueden incluir bases naturales como adenina, guanina, citosina, timidina y uracilo. Las secuencias también pueden contener bases modificadas. Ejemplos de estas bases modificadas son la adenina aza y deaza, la guanina, la citosina, la timidina y el uracilo, y la xantina y la hipoxantina.

Los términos aquí utilizados indistintamente "secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína receptora de superficie de HIBP" y "secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido receptor de superficie de HIBP", se refieren a todas y cada una de las secuencias de ácido nucleico que codifican una proteína receptora de superficie de HIBP, incluyendo cualquier proteína receptora de superficie de HIBP y cualquier secuencia de ácido nucleico que codifica precursores de la proteína receptora de superficie de HIBP, incluyendo, sin limitación, las establecidas en la SEQ.ID NO: 1; SEQ.ID NO: 11; SEQ.ID NO: 27; SEQ.ID NO: 116; SEQ.ID NO: 122; y SEQ.ID NO: 173. Tal como se utiliza en el presente documento, "precursor de proteína receptora de superficie de HIBP" se refiere a una molécula de proteína receptora de superficie de HIBP que comprende además una secuencia de señal N-terminal que facilita la exportación de la cadena polipeptídica a través de la membrana citoplasmática. Las secuencias de ácido nucleico que codifican una proteína receptora de superficie de HIBP incluyen además todas y cada una de las secuencias de ácido nucleico que (i) codifican polipéptidos que son sustancialmente idénticos a las secuencias de proteínas receptoras de superficie de HIBP establecidas en el presente documento; o (ii) hibridan con cualquier secuencia de ácido nucleico de proteína receptora de superficie de HIBP establecida en el presente documento en condiciones de hibridación al menos moderadamente estrictas o que hibridarían con ella en condiciones al menos moderadamente estrictas de no ser por el uso de codones sinónimos.

Los términos aquí utilizados indistintamente "secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína IOM" y "secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido IOM", se refieren a todas y cada una de las secuencias de ácido nucleico que codifican una proteína IOM, incluyendo cualquier proteína IOM y cualquier secuencia de ácido nucleico que codifica precursores de la proteína IOM, incluyendo, sin limitación, los establecidos en SEQ.ID NO: 151 y SEQ.ID NO: 161. Tal como se utiliza en el presente documento, "precursor de la proteína IOM" se refiere a una molécula de proteína IOM que comprende además una secuencia de señal N-terminal que facilita la exportación de la cadena polipeptídica a través de la membrana citoplasmática. Las secuencias de ácido nucleico que codifican una proteína IOM incluyen además todas y cada una de las secuencias de ácido nucleico que (i) codifican polipéptidos que son sustancialmente idénticos a las secuencias de proteínas IOM establecidas en el presente documento; o (ii) hibridan con cualquier secuencia de ácido nucleico de proteína IOM establecida en el presente documento en condiciones de hibridación al menos moderadamente estrictas o que hibridarían con ellas en condiciones al menos moderadamente estrictas de no ser por el uso de codones sinónimos.

Los términos aquí utilizados indistintamente "secuencia de ácido nucleico que codifica TbpB"; "secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido TbpB", se refieren a todas y cada una de las secuencias de ácido nucleico que codifican un polipéptido TbpB, incluyendo cualquier polipéptido TbpB, incluyendo, sin limitación, las secuencias establecidas en SEQ.ID NO: 1; SEQ.ID NO: 11; SEQ.ID NO: 27; SEQ.ID NO: 116; SEQ.ID NO: 122; y SEQ.ID NO: 173, e incluyendo además cualquier secuencia de ácido nucleico que codifique precursores de TbpB. Tal como se utiliza aquí, "precursor de TbpB" se refiere a una molécula de TbpB que comprende además una secuencia señal N-terminal que facilita la exportación de la cadena polipeptídica a través de la membrana citoplasmática. Las secuencias de ácido nucleico que codifican un polipéptido TbpB incluyen además todas y cada una de las secuencias de ácido nucleico que (i) codifican polipéptidos que son sustancialmente idénticos a las secuencias de polipéptidos TbpB establecidas en el presente documento; o (ii) hibridan con cualquier secuencia de ácido nucleico TbpB establecida en el presente documento en condiciones de hibridación al menos moderadamente estrictas o que hibridarían con ellas en condiciones al menos moderadamente estrictas de no ser por el uso de codones sinónimos.

Los términos aquí utilizados indistintamente "secuencia de ácido nucleico que codifica LbpB"; "secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido LbpB", se refieren a todas y cada una de las secuencias de ácido nucleico que codifican un polipéptido LbpB, incluyendo cualquier polipéptido LbpB, incluyendo, sin limitación, la secuencia establecida en SEQ.ID NO: 284 y cualquier secuencia de ácido nucleico que codifique precursores de LbpB. Tal como se utiliza aquí, "precursor de LbpB" se refiere a una molécula de LbpB que comprende además una secuencia señal N-terminal que facilita la exportación de la cadena polipeptídica a través de la membrana citoplasmática. Las secuencias de ácido nucleico que codifican un polipéptido LbpB incluyen además todas y cada una de las secuencias de ácido nucleico que (i) codifican polipéptidos que son sustancialmente idénticos a las secuencias de polipéptidos LbpB establecidas en el presente documento; o (ii) hibridan con cualquier secuencia de ácido nucleico LbpB establecida en el presente documento en condiciones de hibridación al menos moderadamente estrictas o que hibridarían con ellas en condiciones al menos moderadamente estrictas de no ser por el uso de codones sinónimos.

Los términos aquí utilizados indistintamente "secuencia de ácido nucleico que codifica TbpA"; "secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido TbpA", se refieren a todas y cada una de las secuencias de ácido nucleico que codifican un polipéptido TbpA, incluyendo cualquier polipéptido TbpA, incluyendo, sin limitación, la secuencia de ácido nucleico establecida en SEQ.ID NO: 151, y cualquier secuencia de ácido nucleico que codifique precursores de TbpA. Tal como se utiliza aquí, "precursor de TbpA" se refiere a una molécula de TbpA que comprende además una secuencia señal N-terminal que facilita la exportación de la cadena polipeptídica a través de la membrana citoplasmática. Las secuencias de ácido nucleico que codifican un polipéptido TbpA incluyen además todas y cada una de las secuencias de ácido nucleico que (i) codifican polipéptidos que son sustancialmente idénticos a las secuencias de polipéptidos TbpA establecidas en el presente documento; o (ii) hibridan con cualquier secuencia de ácido nucleico TbpA establecida en el presente documento en condiciones de hibridación al menos moderadamente estrictas o que hibridarían con ellas en condiciones al menos moderadamente estrictas de no ser por el uso de codones sinónimos.

Los términos aquí utilizados indistintamente "secuencia de ácido nucleico que codifica LbpA"; "secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido LbpA", se refieren a todas y cada una de las secuencias de ácido nucleico que codifican un polipéptido LbpA, incluyendo cualquier polipéptido LbpA, incluyendo, sin limitación, la secuencia de ácido nucleico establecida en SEQ.ID NO: 161 y cualquier secuencia de ácido nucleico que codifique precursores de LbpA. Tal como se utiliza aquí, "precursor de LbpA" se refiere a una molécula de LbpA que comprende además una secuencia señal N-terminal que facilita la exportación de la cadena polipeptídica a través de la membrana citoplasmática. Las secuencias de ácido nucleico que codifican un polipéptido LbpA incluyen además todas y cada una de las secuencias de ácido nucleico que (i) codifican polipéptidos que son sustancialmente idénticos a las secuencias de polipéptidos LbpA establecidas en el presente documento; o (ii) hibridan con cualquier secuencia de ácido nucleico LbpA establecida en el presente documento en condiciones de hibridación al menos moderadamente estrictas o que hibridarían con ellas en condiciones al menos moderadamente estrictas de no ser por el uso de codones sinónimos.

Por el término "sustancialmente idéntico" se entiende que dos secuencias polipeptídicas son preferentemente al menos 50% idénticas, y más preferentemente son al menos 85% idénticas y más preferentemente al menos 95% idénticas, por ejemplo 96%, 97%, 98% o 99% idénticas. Para determinar el porcentaje de identidad entre dos secuencias polipeptídicas se alinean las secuencias de aminoácidos de dichas dos secuencias, utilizando, por ejemplo, el procedimiento de alineación de Needleman y Wunsch (26), revisado por Smith y Waterman (27), de forma que se obtenga la mayor coincidencia de orden entre las dos secuencias y se determine el número de aminoácidos idénticos entre las dos secuencias. Un procedimiento preferido, ampliamente aplicable, para alinear con precisión dos polipéptidos implica el algoritmo Clustal W (28) empleado con la matriz de puntuación BLOSUM 62 (29) utilizando una penalización de apertura de brechas de 10 y una penalización de extensión de brechas de 0,1. Esto permite identificar alineaciones de alta puntuación entre dos secuencias, en las que al menos el 50% de la longitud total de una de las dos secuencias está implicada en la alineación. Los procedimientos para calcular el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos alineadas son generalmente reconocidos en el arte e incluyen, por ejemplo, los descritos por Carillo y Lipton (30) y los descritos en Computational Molecular Biology, Lesk Oxford University Press, Nueva York, 1988biocomputing: Proyectos de informática y genómica. Por lo general, se emplean programas informáticos para estos cálculos. Los programas informáticos que pueden utilizarse a este respecto incluyen, pero no se limitan a, GCG (31) BLASTP, BLASTN y FASTA (32).

Por "condiciones de hibridación al menos moderadamente estrictas" se entiende que se seleccionan condiciones que promueven la hibridación selectiva entre dos moléculas de ácido nucleico complementarias en solución. La hibridación puede producirse en la totalidad o en una parte de una molécula de secuencia de ácido nucleico. La porción de hibridación suele tener al menos 15 (por ejemplo, 20, 25, 30, 40 o 50) nucleótidos de longitud. Los expertos en la materia reconocerán que la estabilidad de un dúplex de ácido nucleico, o de los híbridos, está determinada por la Tm, que en los tampones que contienen sodio es una función de la concentración de iones sodio y de la temperatura (Tm=81,5° C.-16,6 (Log10 [Na+])+0,41(% (G+C)-600/l), o una ecuación similar). En consecuencia, los parámetros de las condiciones de lavado que determinan la estabilidad del híbrido son la concentración de iones de sodio y la temperatura. Para identificar moléculas que son similares, pero no idénticas, a una molécula de ácido nucleico conocida, se puede suponer que un desajuste del 1% da lugar a una disminución de aproximadamente 1° C en la Tm, por ejemplo, si se buscan moléculas de ácido nucleico que tengan una identidad >95%, la temperatura de lavado final se reducirá en aproximadamente 5° C. Basándose en estas consideraciones, los expertos en la materia podrán seleccionar fácilmente las condiciones de hibridación adecuadas. En aspectos preferidos de la divulgación, se seleccionan condiciones de hibridación estrictas. A modo de ejemplo, pueden emplearse las siguientes condiciones para lograr una hibridación estricta: hibridación en 5* cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC)/5*solución de Denhardt/1,0% SDS a Tm (según la ecuación anterior) -5° C, seguida de un lavado de 0*SSC/0,1% SDS a 60° C. Las condiciones de hibridación moderadamente estrictas incluyen una etapa de lavado en 3*SSC a 42° C. Se entiende, sin embargo, que pueden lograrse hibridaciones equivalentes utilizando tampones alternativos.2*SSC/0,1% SDS a 60° C. Las condiciones de hibridación moderadamente estrictas incluyen un paso de lavado en 3*SSC a 42° C. Se entiende, sin embargo, que pueden conseguirse condiciones equivalentes utilizando tampones, sales y temperaturas alternativas. Se pueden encontrar orientaciones adicionales sobre las condiciones de hibridación en: Green y Sambrook, Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2012 (33).

El término "quimérico", tal como se utiliza aquí en el contexto de las secuencias de ácido nucleico, se refiere a por lo menos dos secuencias de ácido nucleico vinculadas que no están naturalmente vinculadas. Las secuencias de ácido nucleico quimérico incluyen secuencias de ácido nucleico enlazadas de diferentes orígenes naturales. Por ejemplo, se considera quimérica una secuencia de ácido nucleico que constituye un promotor bacteriano unido a una secuencia de ácido nucleico de un polipéptido TbpB o de una proteína receptora de superficie de HIBP, y se considera quimérica una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido TbpB del que se han eliminado ciertas porciones y se han sustituido por porciones de un polipéptido TbpA. Las secuencias de ácido nucleico quiméricas también pueden comprender secuencias de ácido nucleico del mismo origen natural, siempre que no estén vinculadas naturalmente. Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que constituye un promotor obtenido a partir de un tipo de célula particular puede estar vinculada a una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido obtenido a partir de ese mismo tipo de célula, pero no está normalmente vinculada a la secuencia de ácido nucleico que constituye el promotor. Las secuencias de ácido nucleico quimérico también incluyen secuencias de ácido nucleico que comprenden cualquier secuencia de ácido nucleico de origen natural unida a cualquier secuencia de ácido nucleico de origen no natural.

Por el término "sustancialmente incapaz de unirse a la proteína de unión al hierro del huésped" se entiende que la capacidad de la proteína de unión al hierro del huésped de unirse a la proteína receptora de superficie de HIBP está disminuida de tal manera que el valor de la constante de unión (Kd) o la constante de disociación de la interacción de unión entre la proteína de unión al hierro del huésped nativo (es decir, la proteína de unión al hierro del huésped presente en el organismo huésped) y la proteína receptora de superficie de HIBP modificada es al menos 10 veces mayor que el valor de la constante de unión de la interacción de unión entre la proteína de unión al hierro del huésped nativo y su proteína receptora de superficie de HIBP nativa complementaria. En otras palabras, las proteínas modificadas tienen una afinidad 10 veces menor para unirse a la proteína de unión al hierro del huésped nativo que la proteína nativa del receptor. En aspectos preferidos de la divulgación, la afinidad relativa para la unión de la proteína de unión al hierro del huésped nativo por la proteína modificada es 30X menor que la de la proteína receptora de superficie de HIBP nativa, y, en aspectos más preferidos, la afinidad relativa para la unión de la proteína de unión al hierro del huésped nativo por la proteína modificada es 100X menor que la de la proteína receptora de superficie de HIBP nativa. En otros aspectos preferidos, la constante de unión entre la proteína receptora de superficie de HIBP modificada y la proteína de unión al hierro del huésped nativo es de al menos 300 nM. Preferentemente la constante de unión es de al menos 500 nM, y más preferentemente de al menos 1 |jM.

El término "sustancialmente libre", tal como se utiliza aquí, es un término de grado que significa que una composición no contiene cantidades significativas de un compuesto del que se dice que la composición está sustancialmente libre. Cuando una composición está sustancialmente libre de un compuesto, por ejemplo, sustancialmente libre del dominio del lóbulo N, dicha composición comprende preferentemente menos del 5,0% de dicho compuesto, más preferentemente menos del 1,0% de dicho compuesto, y más preferentemente menos del 0,1% de dicho compuesto.

Composiciones inmunogénicas

Como se ha mencionado anteriormente, la presente divulgación proporciona, en al menos un aspecto, una composición inmunogénica que comprende una proteína receptora de superficie de HIBP de una especie bacteriana patógena Gram-negativa, en la que la proteína receptora de superficie de HIBP se ha modificado de tal manera que es incapaz de unirse sustancialmente a una proteína de unión al hierro del huésped. El término "modificado" junto con una proteína receptora de superficie de HIBP pretende referirse a una proteína receptora de superficie de HIBP no nativa a la que se le ha eliminado al menos un residuo de aminoácido o en la que se ha sustituido al menos un residuo de aminoácido por otro, o una proteína receptora de superficie de HIBP que se ha fragmentado en dos o más polipéptidos separados. Así, las proteínas receptoras de superficie de HIBP modificadas incluyen, sin limitación, proteínas receptoras de superficie de HIBP truncadas (por ejemplo, un dominio del lóbulo N o un dominio del lóbulo C de una proteína receptora de superficie de HIBP); proteínas receptoras de superficie de HIBP de las que se han eliminado uno o más residuos de aminoácidos (por ejemplo, una proteína receptora de superficie de HIBP de la que se han eliminado uno o más aminoácidos de los dominios de bucle dentro del dominio del lóbulo N o del dominio del lóbulo C); proteínas receptoras de superficie de HIBP en las que se han insertado aminoácidos adicionales (por ejemplo Proteínas receptoras de superficie de HIBP en las que se han añadido uno o más aminoácidos a los dominios de bucle dentro del dominio del lóbulo N o del dominio del lóbulo C); polipéptidos HIBP multiméricos o extendidos (por ejemplo dímeros y trímeros y dímeros del dominio del lóbulo N o del dominio del lóbulo C); proteínas receptoras de superficie de HIBP que han sido modificadas por mutagénesis dirigida al sitio para alterar uno o más aminoácidos; y mezclas de dos o más polipéptidos de proteínas receptoras de superficie de HIBP (por ejemplo, una mezcla que comprende un dominio del lóbulo N y un dominio del lóbulo C separados de una proteína receptora de superficie de HIBP). Las proteínas receptoras de superficie de HIBP modificadas de la presente divulgación son incapaces de unirse sustancialmente a la proteína de unión al hierro del huésped nativo.

Como se ha mencionado anteriormente, la presente divulgación proporciona, en un aspecto, una composición inmunogénica que comprende o consiste en un polipéptido que comprende un dominio del lóbulo C o un dominio del lóbulo N de una proteína receptora de superficie de HIBP que se puede obtener a partir de u obtenida a partir de una especie bacteriana Gram-negativa o que se ha obtenido de ella, en la que el polipéptido es incapaz de unirse sustancialmente a la proteína de unión al hierro del huésped. En otros aspectos, la presente divulgación proporciona un polipéptido que comprende un dominio del lóbulo C o un dominio del lóbulo N de una proteína receptora de superficie de HIBp , en el que el dominio del lóbulo C o el dominio del lóbulo N comprende una pluralidad de hebras p conectadas por una pluralidad de dominios de bucle, y en el que al menos un dominio de bucle de la pluralidad de dominios de bucle ha sido modificado, y en el que el polipéptido es incapaz de unirse sustancialmente a la proteína de unión al hierro del huésped.

De acuerdo con la presente divulgación, puede utilizarse cualquier polipéptido o secuencia de ácido nucleico que codifique dicho polipéptido, que comprenda o consista en un dominio del lóbulo C o un dominio del lóbulo N de una proteína receptora de superficie de HIBP que se puede obtener de una especie bacteriana patógena Gram-negativa.

En aspectos de la divulgación en los que se utiliza el dominio nativo del lóbulo C, el polipéptido que comprende el dominio nativo del lóbulo C no comprende ni está químicamente unido mediante un enlace peptídico al dominio nativo del lóbulo N de la proteína receptora de superficie de HIBP, y es por tanto un dominio nativo aislado del lóbulo C, es decir, un dominio nativo del lóbulo C separado del dominio nativo del lóbulo N. Así, en ciertos aspectos, se proporcionan preparaciones que comprenden un dominio del lóbulo C de un polipéptido receptor de superficie de HIBP libre o sustancialmente libre del dominio del lóbulo N de un polipéptido receptor de superficie de HIBP, o porciones del mismo. En los aspectos de la divulgación en los que se utiliza el dominio nativo del lóbulo N, el polipéptido que comprende el dominio nativo del lóbulo N utilizado en el presente documento no comprende ni está unido químicamente a través de un enlace peptídico al dominio nativo del lóbulo C de la proteína receptora de superficie de HIBP, y es por tanto un dominio nativo aislado del lóbulo N, es decir, un dominio del lóbulo N separado del dominio nativo del lóbulo C. Así, en ciertos aspectos, se proporcionan preparaciones que comprenden un dominio del lóbulo N de un polipéptido receptor de superficie de HIBP libre o sustancialmente libre del dominio del lóbulo C de un polipéptido receptor de superficie de HIBP, o porciones del mismo. Sin embargo, en ciertos aspectos, puede utilizarse una mezcla de un dominio nativo del lóbulo C, o porciones del mismo, y el dominio nativo del lóbulo N, o porciones del mismo, siempre que el dominio del lóbulo N y el dominio del lóbulo C no estén unidos químicamente, es decir, que no estén unidos químicamente por un enlace peptídico. Así, la presente divulgación incluye una composición inmunogénica que comprende una mezcla de polipéptidos que comprenden un dominio del lóbulo N y un polipéptido que comprende un dominio del lóbulo C, en el que el dominio del lóbulo N y el dominio del lóbulo C no están unidos físicamente.

Para obtener los polipéptidos de la presente divulgación puede utilizarse cualquier proteína receptora de superficie de HIBP, o polipéptido TbpB que se puede obtener a partir de u obtenido a partir de cualquier especie bacteriana Gramnegativa, incluyendo, pero sin limitarse a, cualquier especie o cepa bacteriana patógena, e incluyendo, pero sin limitarse a ello, cualquier especie bacteriana perteneciente a las familias bacterianas de Pasteurellaceae, Moxarellaceae o Neisseriaceae, y especies bacterianas pertenecientes a los géneros bacterianos Actinobacillus, Neisseria, Haemophilus, Mannheimia, Histophilus, Pasteurella o Moraxella. Los polipéptidos incluyen además cualquier polipéptido que se puede obtener a partir de u obtenido a partir de cualquier proteína receptora de superficie de HIBP, o cualquier polipéptido que se puede obtener a partir de u obtenido a partir de cualquier polipéptido TbpB que se puede obtener u obtenido de las siguientes especies bacterianas: Actinobacillus pleuropneumoniae (12, 34), Actinobacillus suis, Haemophilus influenzae (35, 36), Haemophilus parasuis (37), Haemophilus somnus (también conocido en el arte como Histophilus somnus) (38), Mannheimia haemolytica (también conocido en el arte como Pasteurella haemolytica) (39), Moraxella catarrhalis (40), Moraxella bovis, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis (41, 42), Mannheimia glucosida (también conocida como Pasteurella haemolytica) y Bibersteinia trehalosi (también conocida como Pasteurella trehalosi).

Los polipéptidos ejemplares del dominio del lóbulo C y del dominio del lóbulo N que pueden utilizarse de acuerdo con el presente documento incluyen, además, cualquier dominio del lóbulo C establecido en SEQ.ID NO: 5; SEQ.ID NO: 6; SEQ.ID NO: 22; SEQ.ID NO: 33; SEQ.ID NO: 34; SEQ.ID NO: 119; SEQ.ID NO: 125; SEQ.ID NO: 179 a SEQ.ID NO: 195; SEQ.ID NO: 213 a SEQ.ID NO: 218; SEQ.ID NO: 230; SEQ.ID NO: 232; SEQ.ID NO: 234 a SEQ.ID NO: 278, y SEQ.ID NO: 288 a SEQ.ID NO: 292, y cualquier dominio del lóbulo N establecido en la SEQ.ID NO: 8; SEQ.ID NO: 10; SEQ.ID NO: 24; SEQ.ID NO: 26; SEQ.ID NO: 36; SEQ.ID NO: 38; SEQ.ID NO: 121; SEQ.ID NO: 127; SEQ.ID NO: 229; SEQ.ID NO: 231; y SEQ.ID NO: 233, e incluyen además cualquier dominio del lóbulo C o del lóbulo N que pueda prepararse a partir de un polipéptido HIBP o de un polipéptido TbpB, incluyendo, sin limitación, los polipéptidos establecidos en la SEQ.ID NO: 2; SEQ.ID NO: 12; SEQ.ID NO: 28; SEQ.ID NO: 107 a SEQ.ID NO: 115; SEQ ID NO: 117; SEQ.ID NO: 123; SEQ.ID NO: 131 a SEQ.ID NO: 147; SEQ.ID NO: 177; SEQ.ID NO: 178; SEQ.ID NO: 196 a SEQ.ID NO: 204; SEQ.ID NO: 206 a SEQ.ID NO: 212; y SEQ.ID NO: 219 a SEQ.ID NO: 228 o utilizando las secuencias de ácido nucleico codificadas por SEQ.ID NO: 1; SEQ.ID NO: 11; SEQ.ID NO: 27; SEQ.ID NO: 116; SEQ.ID NO: 122; y SEQ.ID NO: 173. Utilizando estas secuencias de ácidos nucleicos y secuencias polipeptídicas, los expertos en la materia pueden identificar fácilmente novedosas proteínas receptoras de superficie de HIBP y secuencias TbpB, así como dominios del lóbulo C o del lóbulo N. Por ejemplo, se pueden examinar las bibliotecas de expresión, las bibliotecas de ADNc y las bibliotecas genómicas, y se pueden buscar secuencias similares en las bases de datos que contienen información sobre la secuencia.

Las preparaciones inmunogénicas de la presente divulgación provocan, tras su administración a un sujeto vertebrado, una respuesta inmunitaria en dicho sujeto vertebrado, en forma de estimulación de la producción de anticuerpos por parte del sujeto vertebrado. De acuerdo con esto, dichos anticuerpos son reactivos contra al menos una cepa bacteriana Gram-negativa. Sin embargo, es preferible que los anticuerpos tengan reactividad cruzada y/o protección cruzada contra una pluralidad de cepas o especies bacterianas, y preferentemente dicha reactividad cruzada y/o protección cruzada se logra en un huésped que expresa una o más proteínas de unión al hierro del huésped, como la transferrina o la lactoferrina. El término "reactividad cruzada", tal como se utiliza aquí, se refiere a la capacidad de la respuesta inmunitaria inducida por una composición inmunógena obtenida a partir de una cepa bacteriana para estimular la producción de anticuerpos capaces de reaccionar adicionalmente con una cepa bacteriana diferente o una especie diferente. El término "protección cruzada", tal como se utiliza aquí, se refiere a la capacidad de la respuesta inmunitaria, inducida por una composición inmunógena obtenida a partir de una cepa bacteriana, para prevenir o atenuar la infección o la enfermedad por al menos una cepa bacteriana o especie bacteriana adicional. En aspectos preferidos de la presente divulgación, las composiciones inmunogénicas de la presente divulgación son reactivas y/o protectoras cruzadas contra una pluralidad de cepas bacterianas o especies bacterianas, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 especies bacterianas o cepas bacterianas. La reactividad cruzada se considera un indicador de protección cruzada. Los expertos en la materia apreciarán fácilmente que el aspecto anterior de la presente divulgación facilita la fabricación de vacunas al permitir la producción de un compuesto inmunogénico, es decir, un compuesto inmunogénico que se puede obtener a partir de una proteína receptora de superficie de HIBP, que ofrece protección contra múltiples cepas bacterianas infecciosas o especies bacterianas.

Las preparaciones inmunogénicas de la presente divulgación generan una respuesta inmunitaria inesperadamente eficaz en sujetos vertebrados, y en particular en sujetos vertebrados que expresan proteínas de unión al hierro del huésped, como la transferrina y la lactoferrina, superando la eficacia de la respuesta inmunitaria generada cuando se utilizan preparaciones inmunizantes que utilizan la proteína HIBP nativa. Un aspecto de la respuesta inmunitaria eficaz es la magnitud de la respuesta inmunitaria. Preferentemente, el título de anticuerpos obtenido utilizando las composiciones inmunogénicas de la presente divulgación supera el título de anticuerpos de una proteína HIBP nativa por un factor de al menos 2X, más preferentemente por un factor de al menos 5X, más preferentemente por un factor de al menos 10X.

En aspectos preferidos de la divulgación, se utilizan mezclas que comprenden al menos dos polipéptidos, cada uno de los cuales comprende o consiste en un dominio del lóbulo C; o se utilizan mezclas que comprenden al menos dos polipéptidos, cada uno de los cuales comprende o consiste en un dominio del lóbulo N o se utilizan mezclas que comprenden al menos tres polipéptidos que comprenden o consisten en al menos dos dominios del lóbulo C y al menos un dominio del lóbulo N; o se utilizan mezclas que comprenden al menos tres polipéptidos que comprenden o consisten en al menos dos dominios del lóbulo N y al menos un dominio del lóbulo C. En aspectos preferidos, los al menos dos polipéptidos se pueden obtener o se obtienen de un género o especie bacteriana Gram-negativa capaz de infectar a la misma especie vertebrada. Así, los al menos dos polipéptidos se seleccionarían entre, por ejemplo, dos dominios del lóbulo C de un polipéptido TbpB, en el que ambos dominios del lóbulo C se pueden obtener u obtener de un polipéptido TbpB obtenido u obtenido de una cepa de Actinobacillus capaz de infectar a los cerdos, o, por ejemplo dos dominios del lóbulo C de un polipéptido TbpB, en el que ambos dominios del lóbulo C pueden obtenerse u obtenidos de un polipéptido TbpB obtenido u se puede obtener de una cepa de Haemophilus capaz de infectar a las vacas. En los aspectos en los que se utilizan al menos dos dominios del lóbulo C, las mezclas están preferentemente libres, o sustancialmente libres, de dominios del lóbulo N o porciones de los mismos. En los aspectos en los que se utilizan al menos dos dominios del lóbulo N, las mezclas están preferentemente libres o sustancialmente libres de dominios del lóbulo C o de porciones de los mismos

En aspectos particularmente preferidos, de acuerdo con la presente divulgación, se utilizan mezclas de al menos dos polipéptidos, cada uno de los cuales comprende o consiste en un dominio del lóbulo C de una proteína receptora de superficie de HIBP que se puede obtener u obtenida de una especie bacteriana Gram-negativa. En tales aspectos, las mezclas están preferentemente libres de dominios de lóbulos N o porciones de los mismos. En aspectos particularmente preferidos, cualesquiera dos dominios del lóbulo C que se puede obteners u obtenidos a partir de los polipéptidos receptores de superficie de HIBP expuestos en la SEQ.iD NO: 2; SEQ.ID NO: 12; SEQ.ID NO: 28; SEQ.ID NO: 107 a SEQ.ID NO: 115; SEQ ID NO: 117; SEQ.ID NO: 123; SEQ.ID NO: 131 a SEQ.ID NO: 147; SEQ.ID NO: 177; SEQ.ID NO: 178; SEQ.ID NO: 196 a SEQ.ID NO: 204; SEQ.ID NO: 206 a SEQ.ID NO: 212; y SEQ.ID NO: 219 a SEQ.ID NO: 228; o cualesquiera dos dominios del lóbulo C que se puede obteners u obtenidos a partir de las secuencias de ácido nucleico expuestas en la SEQ.ID NO: 1; SEQ.ID NO: 11; SEQ.ID NO: 27; SEQ.ID NO: 116; SEQ.ID NO: 122; y SEQ.ID NO: 173 se utilizan. En otros aspectos preferidos, se utilizan dos dominios de lóbulo C cualesquiera seleccionados entre los dominios de lóbulo C expuestos en la SEQ.ID NO: 5; SEQ.ID NO: 6; SEQ.ID NO: 22; SEQ.ID NO: 33; SEQ.ID NO: 34; SEQ.ID NO: 119; SEQ.ID NO: 125; SEQ.ID NO: 179 a SEQ.ID NO: 195; y SEQ.ID NO: 213 a SEQ.ID NO: 218; SEQ.ID NO: 230: SEQ.ID NO: 232; SEQ.ID NO: 234 a SEQ.ID NO: 278; y SEQ.ID NO: 288 a SEQ.ID NO: 292.

En otros aspectos particularmente preferidos, se utilizan al menos dos dominios del lóbulo C que se puede obteners u obtenidos de una proteína receptora de superficie de HIBP, en la que al menos un dominio del lóbulo C se puede obtener u obtiene de una especie bacteriana perteneciente al género bacteriano de Actinobacillus, Haemophilus, Histophilus, Mannheimia, Moraxella, Neisseria, Pasteurella y Bibersteinia.

En otros aspectos particularmente preferidos, se utilizan al menos dos dominios del lóbulo C, en los que al menos un dominio del lóbulo C se puede obtener o se obtiene de una proteína receptora de superficie de HIBP que se puede obtener o se obtiene de Actinobacillus pleuropneumoniae, preferentemente el dominio del lóbulo C establecido en SEQ.ID. NO: 6 o SEQ.ID NO: 22, o en el que al menos un dominio del lóbulo C puede obtenerse o se obtiene de una proteína receptora de superficie de HIBP que puede obtenerse o se obtiene de Actinobacillus suis , preferentemente el dominio del lóbulo C establecido en ^{S e Q . I D} NO: 34.

En otros aspectos particularmente preferidos, se utilizan al menos dos dominios del lóbulo C, en los que al menos un dominio del lóbulo C se puede obtener o se obtiene de una proteína receptora de superficie de HIBP que se puede obtener o se obtiene de Mannheimia haemolytica , preferentemente el dominio del lóbulo C establecido en SEQ.ID NO: 232; o SEQ.ID NO: 234, o en el que al menos un dominio del lóbulo C puede obtenerse o se obtiene de una proteína receptora de superficie de HIBP que puede obtenerse o se obtiene de Mannheimia glucosida.

En otros aspectos particularmente preferidos, se utilizan al menos dos dominios del lóbulo C, en los que al menos un dominio del lóbulo C se puede obtener o se obtiene de una proteína receptora de superficie de HIBP que se puede obtener o se obtiene de Neisseria gonorrhoeae , preferentemente uno de los dominios del lóbulo C establecidos en SEQ.ID NO: 213 a SEQ.ID NO: 218, o en el que al menos un dominio del lóbulo C puede obtenerse o se obtiene de una proteína receptora de superficie de HIBP que puede obtenerse o se obtiene de Neisseria meningitidis , preferentemente uno de los dominios del lóbulo C establecidos en la SEQ.ID. NO: 119; SEQ.ID NO: 125; SEQ.ID NO: 128; SEQ.ID NO: 129; SEQ.ID NO: 130; SEQ.ID NO: 131; SEQ.ID NO: 152; SEQ.ID NO: 154; SEQ.ID NO: 156; SEQ.ID NO: 158; SEQ.ID NO: 160; SEQ.ID NO: 164; SEQ.ID NO: 166; SEQ.ID NO: 168; SEQ.ID NO: 179 a SEQ.ID NO: 195; y SEQ.ID NO: 235 a SEQ.ID NO: 278.

En otros aspectos particularmente preferidos de la divulgación, se utilizan al menos dos dominios del lóbulo C, en los que al menos un dominio del lóbulo C se puede obtener o se obtiene de una proteína receptora de superficie de HIBP que se puede obtener o se obtiene de Bibersteinia trehalosi, preferentemente el dominio del lóbulo C establecido en SEQ.ID.NO: 292.

En otros aspectos preferidos de la divulgación, se utilizan al menos dos dominios del lóbulo C que se puede obteners u obtenidos de un polipéptido receptor de superficie de HIBP, en el que ambos dominios del lóbulo C son que se puede obteners u obtenidos de dos especies bacterianas seleccionadas de Actinobacillus pleuropneumoniae, preferentemente, el dominio del lóbulo C establecido en SEQ.ID NO: 6 o SEQ.ID NO: 22, Actinobacillus suis, preferentemente el dominio del lóbulo C establecido en SEQ.ID NO: 34 y Haemophilus parasuis, preferentemente el dominio del lóbulo C establecido en la SEQ.ID NO: 294.

En otros aspectos preferidos de la divulgación, se utilizan al menos dos dominios del lóbulo C que se puede obteners u obtenidos a partir de un polipéptido receptor de superficie HIPB, en el que uno de los dos dominios del lóbulo C es que se puede obtener u obtenido a partir de Neisseria gonorrhoeae, preferentemente, uno de los dominios del lóbulo C establecidos en SEQ.ID. NO: 213 a SEQ.ID. NO: 218 y el otro dominio del lóbulo C se puede obtener de Neisseria meningitidis preferentemente uno de los dominios del lóbulo C expuestos en. SEQ.ID. NO: 119; SEQ.ID NO: 125; SEQ.ID NO: 128; SEQ.ID NO: 129; SEQ.ID NO: 130; SEQ.ID NO: 131; SEQ.ID NO: 152; SEQ.ID NO: 154; SEQ.ID NO: 156; SEQ.ID NO: 158; SEQ.ID NO: 160; SEQ.ID NO: 164; SEQ.ID NO: 166; SEQ.ID NO: 168; SEQ.ID NO: 179 a SEQ.ID NO: 195; y SEQ.ID NO: 235 a SEQ.ID NO: 278.

En otros aspectos preferidos de la divulgación, se utilizan al menos dos dominios del lóbulo C que se puede obteners u obtenidos de un polipéptido receptor de superficie HIPB, en el que uno de los dos dominios del lóbulo C es que se puede obtener u obtenido de Mannheimia haemolytica, preferentemente un dominio del lóbulo C establecido en SEQ.ID NO: 232; o SEQ.ID NO: 234, y el otro lóbulo C es que se puede obtener u obtenido de Bibersteinia trehalosi preferentemente un dominio de lóbulo C establecido en SEQ.ID ^{n O :} 292.

En otros aspectos preferidos de la divulgación, se utilizan al menos dos dominios del lóbulo C que se puede obteners u obtenidos a partir de un polipéptido TbpB, en el que ambos dominios del lóbulo C son que se puede obteners u obtenidos a partir de una o de dos especies bacterianas, y en el que los polipéptidos TbpB o los dominios del lóbulo C obtenidos a partir de ellos son antigénicamente divergentes. Los dominios TbpB o del lóbulo C se obtienen preferentemente de especies bacterianas o de cepas bacterianas capaces de intercambiar variantes de TbpB. El término "antigénicamente divergente", tal como se utiliza aquí en relación con dos polipéptidos TbpB o dominios del lóbulo C de polipéptidos TbpB, significa que los dos polipéptidos TbpB o dominios del lóbulo C de polipéptidos TbpB, cuando se utilizan para construir un árbol filogenético utilizando un número representativo de polipéptidos TbpB o dominios del lóbulo C, pertenecen a ramas o grupos divergentes de un árbol filogenético. De acuerdo con esto, puede construirse un árbol filogenético con cualquier cantidad de polipéptidos de TbpB o de dominio de lóbulo C, sin embargo, preferentemente un árbol filogenético se construye utilizando al menos 25 polipéptidos de TbpB o de dominio de lóbulo C, más preferentemente al menos 30, al menos 40, o al menos 50 polipéptidos de TbpB o de dominio de lóbulo C, y preferentemente un árbol filogenético se construye de tal manera que comprende al menos 2 órdenes de nodos por encima del nivel de raíz, más preferentemente un árbol filogenético comprende al menos 3, 4, o 5 órdenes de nodos por encima del nivel de raíz, más preferentemente, al menos 6, 7, 8, 9, o 10 órdenes de nodos por encima del nivel de raíz (como se explica más adelante y en la FIG. 30). Los polipéptidos TbpB antigénicamente divergentes o los polipéptidos del dominio del lóbulo C pertenecen preferentemente a ramas distintas que (i) divergen en un nodo de al menos 2 órdenes de nodos por debajo del nodo de mayor orden del árbol filogenético (por ejemplo si el nodo de mayor orden de un árbol filogenético es el nodo de 9° orden, los polipéptidos antigénicamente divergentes son aquellos que divergen en el nodo de 7° orden, o en un nodo de menor orden, es decir, el nodo de 6°, 5°, 4°, 3°, 2° o 1° orden; y/o (ii) divergen en un nodo de 1°, 2° o 3° orden de un árbol filogenético. Se pueden utilizar varios programas informáticos para facilitar la construcción de árboles filogenéticos utilizando polipéptidos TbpB o polipéptidos del dominio C, incluyendo: (i) programas informáticos que realizan alineaciones de secuencias, como un programa que utiliza el algoritmo de alineación M-Coffee, tal como se implementa en el sitio del servidor T-Coffee (http://www.tcoffee.org/) (43); (ii) programas informáticos que editan alineaciones, como Geneious Pro (44); (iii) programas informáticos que limpian automáticamente las alineaciones, como GBlocks (45); (iv) programas informáticos que seleccionan un modelo evolutivo compatible con la alineación, como ProtTest v3.2 (Darriba et al, 2011) y (iv) programas informáticos que generan árboles filogenéticos, como los programas que utilizan el procedimiento de máxima verosimilitud, PhyML (46), que funcionan con el modelo general reversible en el tiempo (GTR) (47) (48, 49), u otro modelo como el modelo JTT+I+G+F, o el modelo WAG+G=F, o programas como PHYLlP y pA u P (Universidad de Washington). Cada uno de estos programas se configura preferentemente para que las ramas del árbol se consideren estadísticamente significativas. No obstante, se observa que las ramas situadas más distalmente pueden ser menos significativas desde el punto de vista estadístico, por lo que se prefiere la selección de cepas pertenecientes a grupos basados en los nodos de menor orden.

Ahora refiriéndose a la FIG. 30, se muestra, con fines ilustrativos, un árbol filogenético 100 que tiene una raíz 120, ramas intermedias (como las ilustradas por 130, 131, 140, 141, 142 y 143), y un total de 38 ramas distales (como las ilustradas por las ramas distales 150, 151, 152, 153, 154 y 155), representando cada rama distal un polipéptido relacionado obtenido de 1 de las 38 cepas bacterianas (cepa 1-38 (110)). Cada rama mostrada se origina en un nodo (como ilustran los nodos 161, 171, 172, 181, 182, 183 y 184). Así, por ejemplo, la rama 130 se origina en el nodo 161 y la rama 143 se origina en el nodo 172. El nodo (161 ) más próximo a la raíz del árbol (120 ) se denomina más específicamente nodo de primer orden 161; los nodos 171 y 172 se denominan más específicamente nodos de 2do orden 171 y 172; los nodos 181, 182, 183 y 184 se denominan más específicamente nodos de 3er orden 181, 182, 183 y 184 , y otros nodos, mutatis mutandis, pueden denominarse nodos de 4°, 5°, 6°, 7°, , etc. Se muestra en la FIG.

30 son otros cuatro Grupos (Grupo 1 (105 ), polipéptidos de cepas bacterianas ( 110 ) 1-17; Grupo 2 (106) , polipéptidos de cepas bacterianas (110) 18-24; Grupo 3 (107), polipéptidos de cepas bacterianas (110) 25-30; y Grupo 4 (108), polipéptidos de cepas bacterianas (110) 26-38). Los polipéptidos de las cepas bacterianas pertenecientes al Grupo 1 (105) o al Grupo 2 (106) pertenecen a una rama (131 ) que diverge en el nodo de primer orden (161) del árbol filogenético (100). Del mismo modo, los polipéptidos de las cepas bacterianas pertenecientes al Grupo 3 (105) o al Grupo 4 (106) pertenecen a una rama (131 ) que diverge en el nodo de primer orden (161) del árbol filogenético (100).

Así, los polipéptidos de todas las cepas bacterianas pertenecientes al Grupo 1 (105) o al Grupo 2 (106) son antigénicamente divergentes de los polipéptidos de todas las cepas bacterianas pertenecientes al Grupo 3 (107) o al Grupo 4 (108). Los polipéptidos de las cepas bacterianas pertenecientes al Grupo 1 (105) o al Grupo 2 (106) pertenecen a grupos que divergen en el nodo de 2° orden (172 ) del árbol filogenético (100). Los polipéptidos de las cepas bacterianas pertenecientes al Grupo 1 (105) son, de acuerdo con esto, también antigénicamente divergentes de las cepas bacterianas pertenecientes al Grupo 2 (106). Cabe señalar que los árboles filogenéticos pueden representarse en diferentes formatos, por ejemplo, en un formato rectangular, como en la FIG.30 , por ejemplo, o en formato circular como en la FIG. 10. En la FIG. 4 se proporcionan árboles filogenéticos ejemplares construidos con polipéptidos TbpB o lóbulos C o polipéptidos TbpB. (que comprende cepas de Actinobacillus pleuropneumoniae, Actinobacillus suis y Haemophilus parasuis), FIG. 10 (que comprende cepas de Neisseria meningitidis), FIG. 26 (que comprende cepas de Neisseria meningitidis y Neisseria gonorrhoeae), FIG. 27 (que comprende cepas de Haemophilus influenza), FIG. 28 (con cepas de Mannheimia haemolytica y Bibersteinia trehalosi) y FIG. 29 (que comprende cepas de Moraxella catharrhalis).

En otros aspectos preferidos de la divulgación, se utilizan al menos dos dominios del lóbulo C que se puede obteners u obtenidos de un polipéptido TbpB, en el que ambos dominios del lóbulo C son que se puede obteners u obtenidos de Actinobacillus pleuropneumoniae, Actinobacillus suis y Haemophilus parasuis. Refiriéndose al árbol filogenético expuesto en la FIG. 4, en aspectos preferidos, se utilizan al menos dos dominios de lóbulo C, en los que un primer dominio de lóbulo C se obtiene de cualquiera de los dominios de lóbulo C seleccionados de una cepa bacteriana de Actinobacillus pleuropneumoniae, Actinobacillus suis o Haemophilus parasuis perteneciente al Grupo filogenético 1, al Grupo filogenético 2 o al Grupo filogenético 3, expuestos en la FIG.4, y en el que el segundo dominio del lóbulo C se obtiene de uno cualquiera de los dominios del lóbulo C seleccionados de una cepa de Actinobacillus pleuropneumoniae, Actinobacillus suis o Haemophilus parasuis perteneciente a un grupo filogenético expuesto en la FIG.4, aparte del grupo filogenético del que se selecciona el primer dominio del lóbulo C. En otros aspectos preferidos, se utilizan al menos tres dominios de lóbulo C, en los que un primer dominio de lóbulo C perteneciente a una cepa bacteriana de Actinobacillus pleuropneumoniae, Actinobacillus suis o Haemophilus parasuis perteneciente al Grupo filogenético 1 expuesto en la FIG.4 , un segundo dominio del lóbulo C perteneciente a la cepa bacteriana Actinobacillus pleuropneumoniae, Actinobacillus suis o Haemophilus parasuis , perteneciente al Grupo filogenético 2 expuesto en la FIG. 4 , y un tercer dominio del lóbulo C perteneciente a una cepa bacteriana de Actinobacillus pleuropneumoniae, Actinobacillus suis o Haemophilus parasuis perteneciente al grupo filogenético 3 expuesto en la FIG. 4 se utiliza. Así, a modo de ejemplo específico, un dominio del lóbulo C de Actinobacillus suis H57 (Grupo filogenético 1; FIG.4 flecha negra)) puede combinarse con un dominio del lóbulo C de Actinobacillus pleuropneumonaie H87 (Grupo filogenético 2; FIG. 4 flecha negra) y un dominio del lóbulo C de Actinobacillus pleuropneumonaie H49 (Grupo filogenético 3; FIG.

4 flecha negra).

En otros aspectos preferidos de la divulgación, se utilizan al menos dos dominios del lóbulo C que se puede obteners u obtenidos de una proteína TbpB, en la que ambos dominios del lóbulo C son que se puede obteners u obtenidos de Neisseria meningitidis. Refiriéndose al árbol filogenético expuesto en la FIG. 10A, en aspectos preferidos, se utilizan al menos dos dominios de lóbulo C, en los que un primer dominio de lóbulo C se obtiene de cualquiera de los dominios de lóbulo C seleccionados de una cepa bacteriana de Neisseria meningitidis perteneciente al Grupo filogenético 1, al Grupo filogenético 2, al Grupo filogenético 3 o al Grupo filogenético 4 expuestos en la FIG. 10A, y en el que el segundo dominio del lóbulo C se obtiene de cualquiera de las cepas de Neisseria meningitidis pertenecientes a un grupo filogenético expuesto en la FIG. 10A que el grupo filogenético del que se selecciona el primer dominio del lóbulo C. Así, a modo de ejemplo únicamente, un dominio del lóbulo C de TbpB obtenido de la cepa B16B6 de Neisseria meningitidis (Grupo filogenético 1; FIG 10A, flecha negra) puede combinarse con un dominio del lóbulo C de TbpB de la cepa M982 (Grupo filogenético 4; FIG 10A, flecha negra). En otros aspectos preferidos, se utilizan al menos tres dominios del lóbulo C, en los que los dominios del lóbulo C se seleccionan de entre las cepas que pertenecen a tres grupos diferentes establecidos en la FIG. 10A (por ejemplo, un dominio de lóbulo C seleccionado de cada grupo filogenético 1, grupo filogenético 2 y grupo filogenético 3). En otros aspectos preferidos, se utilizan al menos cuatro dominios de lóbulo C, en los que un primer dominio de lóbulo C perteneciente a una cepa bacteriana de Neisseria meningitidis perteneciente al Grupo 1 expuesto en la FIG. 10A , un segundo dominio del lóbulo C perteneciente a la cepa bacteriana de Neisseria meningitidis perteneciente al Grupo 2 expuesto en la FIG. 10A , y un tercer dominio del lóbulo C perteneciente a una cepa bacteriana de Neisseria meningitidis perteneciente al grupo filogenético 3 expuesto en la FIG. 10A y un cuarto dominio del lóbulo C perteneciente a una cepa bacteriana de Neisseria meningitidis perteneciente al grupo filogenético 4 expuesto en la FIG. se utilizal 0A . Así, a modo de ejemplo específico solamente, puede seleccionarse un dominio del lóbulo C de TbpB de las cepas B16B6 (Grupo filogenético 1; FIG 10A , flecha negra), BZ169 (Grupo filogenético 2; FIG 10A , flecha negra), S3131 (Grupo filogenético 3; FIG 10A, flecha negra) y M982 (Grupo filogenético 4; FIG 10A, flecha negra) de Neisseria meningitidis .

En otros aspectos preferidos de la divulgación, se utilizan al menos dos dominios del lóbulo C que se puede obteners u obtenidos de un polipéptido TbpB, en el que uno de los dos dominios del lóbulo C es que se puede obtener u obtenido de Neisseria meningitidis y el otro de los lóbulos C es que se puede obtener u obtenido de Neisseria gonorrhoeae. Refiriéndose al árbol filogenético expuesto en la FIG. 26B, en aspectos preferidos, se utilizan al menos dos dominios de lóbulo C, en los que un primer dominio de lóbulo C se obtiene de cualquiera de los dominios de lóbulo C seleccionados de una cepa bacteriana de Neisseria gonorrhoeae perteneciente al Grupo filogenético 3, expuesto en la FIG. 26B, y en el que el segundo dominio del lóbulo C se obtiene de uno cualquiera de los dominios del lóbulo C seleccionados de una cepa de Neisseria meningitidis perteneciente al Grupo filogenético 1 o al Grupo 2, expuestos en la FIG. 26B. Más preferentemente, se utilizan al menos tres dominios del lóbulo C que se puede obteners u obtenidos de un polipéptido TbpB, en el que dos dominios del lóbulo C se obtienen u obtienen de Neisseria meningitidis y el otro lóbulo C se obtiene u obtiene de Neisseria gonorrhoeae. Preferentemente, el dominio del lóbulo C se selecciona de una cepa bacteriana de Neisseria gonorrhoeae perteneciente al Grupo filogenético 3, expuesto en la FIG. 26B, a el segundo dominio del lóbulo C se obtiene de uno cualquiera de los dominios del lóbulo C seleccionados de una cepa de Neisseria meningitidis perteneciente a un grupo filogenético 2, expuesto en la FIG. 26B, y el tercer dominio del lóbulo C se obtiene de uno cualquiera de los dominios del lóbulo C seleccionados de una cepa de Neisseria meningitidis perteneciente a un grupo filogenético 1, expuesto en la FIG.26B. En otros aspectos preferidos, se utilizan al menos cuatro dominios del lóbulo C que se puede obteners u obtenidos de un polipéptido TbpB, en el que tres dominios del lóbulo C se obtienen u obtienen de Neisseria meningitidis y el otro dominio del lóbulo C se obtiene u obtiene de Neisseria gonorrhoeae. Preferentemente, el dominio del lóbulo C se selecciona de una cepa bacteriana de Neisseria gonorrhoeae perteneciente al Grupo filogenético 3, expuesto en la FIG. 26B, el segundo y el tercer dominio del lóbulo C se obtienen a partir de cualquiera de los dominios del lóbulo C seleccionados de una cepa de Neisseria meningitidis perteneciente a dos subgrupos diferentes del grupo filogenético 2 (por ejemplo, el subgrupo filogenético 2.1 y el subgrupo filogenético 2.2) expuestos en la FIG. 26B, y el cuarto dominio del lóbulo C se obtiene de cualquiera de los dominios del lóbulo C seleccionados de una cepa de Neisseria meningitidis perteneciente a un grupo filogenético 1, expuesto en la FIG. 26B. En otros aspectos preferidos, se utilizan al menos cuatro dominios del lóbulo C que se puede obteners u obtenidos de un polipéptido TbpB, en el que dos dominios del lóbulo C son que se puede obteners u obtenidos de Neisseria meningitidis y los otros dos lóbulos C son que se puede obteners u obtenidos de Neisseria gonorrhoeae. Preferentemente, los dos dominios del lóbulo C seleccionados de una cepa bacteriana de Neisseria gonorrhoeae pertenecen a dos subgrupos filogenéticos diferentes del grupo filogenético 3 (por ejemplo, el subgrupo 3.1 y el subgrupo 3.2), expuestos en la FIG. 26B, el tercer y cuarto dominio del lóbulo C se obtienen de una cepa de Neisseria meningitidis perteneciente al Grupo filogenético 1 y al Grupo filogenético 2, respectivamente. En otro aspecto, se utilizan al menos cinco dominios del lóbulo C que se puede obteners u obtenidos de un polipéptido TbpB, en el que tres dominios del lóbulo C se pueden obtener u obtener de Neisseria meningitidis y los otros dos lóbulos C se pueden obtener u obtener de Neisseria gonorrhoeae. Preferentemente, los dos dominios del lóbulo C seleccionados de una cepa bacteriana de Neisseria gonorrhoeae pertenecen a dos subgrupos filogenéticos diferentes del grupo filogenético 3 (por ejemplo, el subgrupo 3.1 y el subgrupo 3.2), expuestos en la FIG. 26B, el tercer y el cuarto dominio del lóbulo C se obtienen de una cepa de Neisseria meningitidis perteneciente a dos subgrupos filogenéticos diferentes del Grupo filogenético 2 (por ejemplo, el subgrupo 2.1 y el subgrupo 2.2), expuestos en la f Ig .26B, y el quinto dominio del lóbulo C pertenece a una cepa de Neisseria meningitidis perteneciente al Grupo filogenético 1 expuesto en la FIG.

26B. En otro aspecto preferido, se utilizan al menos seis dominios del lóbulo C que se puede obteners u obtenidos de un polipéptido TbpB. En este aspecto, al menos un dominio del lóbulo C se obtiene o se puede obtener de Neisseria meningitidis y al menos un dominio del lóbulo C se obtiene o se puede obtener de Neisseria gonorrhoeae, los otros lóbulos C se obtienen o se pueden obtener de cepas que son antigénicamente divergentes de acuerdo con la FIG.

26B. En aspectos preferidos, tres dominios del lóbulo C se pueden obtener o se obtienen de Neisseria meningitidis y los otros tres lóbulos C se pueden obtener o se obtienen de Neisseria gonorrhoeae. Refiriéndose a la FIG. 26B preferentemente los tres dominios del lóbulo C obtenidos de las cepas de Neisseria gonorrhoeae pertenecen a tres grupos antigénicamente divergentes, y los tres dominios del lóbulo C obtenidos de Neisseria meningitidis pertenecen a tres cepas antigénicamente divergentes.

En otros aspectos preferidos de la divulgación, se utilizan al menos dos dominios del lóbulo C que se puede obteners u obtenidos de un polipéptido TbpB, en el que uno de los dos dominios del lóbulo C es que se puede obtener u obtenido de Neisseria meningitidis y el otro de los lóbulos C es que se puede obtener u obtenido de Neisseria gonorrhoeae. Refiriéndose al árbol filogenético expuesto en la FIG. 26A, en aspectos preferidos, se utilizan al menos dos dominios de lóbulo C, en los que un primer dominio de lóbulo C se obtiene de cualquiera de los dominios de lóbulo C seleccionados de una cepa bacteriana de Neisseria gonorrhoeae perteneciente al Grupo filogenético 3 o al Grupo filogenético 1, expuestos en la FIG. 26A, y en el que el segundo dominio del lóbulo C se obtiene a partir de uno cualquiera de los dominios del lóbulo C seleccionados de una cepa de Neisseria meningitidis perteneciente a un grupo filogenético 2, un grupo 4 o un grupo 5, expuestos en la FIG. 26A.

En otros aspectos preferidos de la divulgación, se utilizan al menos dos dominios del lóbulo C que se puede obteners u obtenidos de una proteína TbpB, en la que ambos dominios del lóbulo C son que se puede obteners u obtenidos de Haemophilus influenzae. Refiriéndose al árbol filogenético expuesto en la FIG. 27A y FIG.27B, en aspectos preferidos, se utilizan al menos dos dominios de lóbulo C, en los que un primer dominio de lóbulo C se obtiene de cualquiera de los dominios de lóbulo C seleccionados de una cepa bacteriana de Haemophilus influenzae perteneciente al Grupo filogenético 1, al Grupo filogenético 2 o al Grupo filogenético 3 expuestos en la FIG. 27A o FIG. 27B, y en el que el segundo dominio del lóbulo C se obtiene de cualquiera de las cepas de Haemophilus influenzae pertenecientes a un grupo filogenético expuesto en la FIG. 27A o FIG. 27B distinto del grupo filogenético del que se selecciona el primer dominio del lóbulo C. Así, a modo de ejemplo solamente, un dominio del lóbulo C de TbpB obtenido de la cepa H216 de Haemophilus influenzae (Grupo filogenético 3; FIG. 27B, flecha negra) puede combinarse con un dominio del lóbulo C de TbpB de la cepa H214 (Grupo filogenético 1; FIG. 27B, flecha negra). En otros aspectos preferidos, se utilizan al menos tres dominios del lóbulo C, en los que los dominios del lóbulo C se seleccionan de entre las cepas que pertenecen a tres grupos diferentes establecidos en la FIG. 27A y FIG. 27B (es decir, un dominio de lóbulo C seleccionado de cada grupo filogenético 1, grupo filogenético 2 y grupo filogenético 3). Así, a modo de ejemplo específico, un dominio del lóbulo C de TbpB de la cepa H216 de Haemophilus influenzae (Grupo filogenético 3; f Ig .

27B, flecha negra), H214 (Grupo filogenético 1; FIG. 27B, flecha negra), y H011 (Grupo filogenético 2; FIG. 27B, flecha negra) puede ser seleccionada.

En otros aspectos preferidos de la divulgación, se utilizan al menos dos dominios del lóbulo C que se puede obteners u obtenidos de una proteína TbpB, en la que ambos dominios del lóbulo C son que se puede obteners u obtenidos de Mannheimia haemolytica. Refiriéndose al árbol filogenético expuesto en la FIG. 28, en aspectos preferidos, se utilizan al menos dos dominios de lóbulo C, en los que un primer dominio de lóbulo C se obtiene de cualquiera de los dominios de lóbulo C seleccionados de una cepa bacteriana Mannheimia haemolytica perteneciente al Grupo filogenético 1, expuesto en la FIG. 28, y en el que el segundo dominio del lóbulo C se obtiene de cualquiera de las cepas de Mannheimia haemolytica pertenecientes a un grupo filogenético 3.

En otros aspectos preferidos, se utilizan al menos dos dominios del lóbulo C que se puede obteners u obtenidos de un polipéptido TbpB, en el que uno de los dos dominios del lóbulo C es que se puede obtener u obtenido de Bibersteinia trehalosiy el otro de los lóbulos C es que se puede obtener u obtenido de Mannheimia haemolytica. Refiriéndose a la FIG. 28, en aspectos preferidos, se utilizan al menos dos dominios de lóbulo C, en los que un primer dominio de lóbulo C se obtiene de cualquiera de los dominios de lóbulo C seleccionados de una cepa bacteriana Bibersteinia trehalosi perteneciente al Grupo filogenético 2, expuesto en la FIG. 28, y en el que el segundo dominio del lóbulo C se obtiene de uno cualquiera de los dominios del lóbulo C seleccionados de una cepa de Mannheimia haemolytica perteneciente a un Grupo filogenético 1, o al Grupo 3, expuestos en la FIG. 28.

En otros aspectos preferidos de la divulgación, se utilizan al menos dos dominios del lóbulo C que se puede obteners u obtenidos de una proteína TbpB, en la que ambos dominios del lóbulo C son que se puede obteners u obtenidos de Moraxella catharrhalis. Refiriéndose al árbol filogenético expuesto en la FIG. 29, en aspectos preferidos, se utilizan al menos dos dominios de lóbulo C, en los que un primer dominio de lóbulo C se obtiene de cualquiera de los dominios de lóbulo C seleccionados de una cepa bacteriana de Moraxella catharrhalis perteneciente al Grupo filogenético 1, al Grupo filogenético 2 o al Grupo filogenético 3 expuestos en la FIG. 29, y en el que el segundo dominio del lóbulo C se

obtiene de cualquiera de las cepas de Moraxella catharrhalis pertenecientes a un grupo filogenético expuesto en la

FIG. 29 distinto del Grupo filogenético del que se selecciona el primer dominio del lóbulo C. Así, a modo de ejemplo

únicamente, un dominio del lóbulo C de TbpB obtenido de la cepa AAC34279.1 de Moraxella catharrhalis (Grupo

filogenético 3; FIG 29, flecha negra) puede combinarse con un dominio del lóbulo C de TbpB de la cepa AAD12263.1

(Grupo filogenético 1; FIG 29, flecha negra). En otros aspectos preferidos, se utilizan al menos tres dominios del lóbulo

C, en los que los dominios del lóbulo C se seleccionan de entre las cepas que pertenecen a tres grupos diferentes

establecidos en la FIG. 29 (es decir, un dominio de lóbulo C seleccionado de cada grupo filogenético 1, grupo

filogenético 2 y grupo filogenético 3). Así, a modo de ejemplo específico, un dominio del lóbulo C de TbpB de una cepa

de Moraxella catharrhalis AAC34279.1 (Grupo filogenético 3; Fig .29, flecha negra), AAD12263.1 (Grupo filogenético

1; FIG. 29, flecha negra), y 003664398.1 (Grupo filogenético 2; FIG. 29, flecha negra) puede ser seleccionado.

En aspectos particularmente preferidos de la divulgación, las mencionadas mezclas de polipéptidos que comprenden

o consisten en dominios del lóbulo C son dominios del lóbulo C que se puede obteners u obtenidos a partir de

polipéptidos TbpB, incluyendo, sin limitación, los dominios del lóbulo C establecidos en SEQ.ID NO: 5; SEQ.ID NO: 6;

SEQ.ID NO: 22; SEQ.ID NO: 33; SEQ.ID NO: 34; SEQ.ID NO: 119; SEQ.ID NO: 125; SEQ.ID NO: 179 a SEQ.ID NO:

195; y SEQ.ID NO: 213 a SEQ.ID NO: 218; SEQ.ID NO: 230; SEQ.ID NO: 232; y SEQ.ID NO: 234 a SEQ.ID NO: 278.

Las mezclas anteriores de dominios de lóbulo C pueden prepararse mezclando preparaciones que comprenden los

dominios de lóbulo C individuales o produciendo recombinantemente polipéptidos de fusión que comprenden dos o

más dominios de lóbulo C.

Como se ha mencionado anteriormente, las preparaciones inmunogénicas de la presente divulgación son

preferentemente de reacción cruzada y/o de protección cruzada. Si bien, como se ha mencionado anteriormente, las

formulaciones que comprenden dominios de lóbulos C individuales pueden ser de reactividad y/o protección cruzada,

se prefieren particularmente las mezclas de dominios de lóbulos C, ya que pueden utilizarse para preparar

formulaciones inmunogénicas que amplían sustancialmente la reactividad y/o la protección cruzada contra una gama

más amplia de cepas y/o especies bacterianas, y permiten la preparación de formulaciones de vacunas que

proporcionan protección contra la infección o la enfermedad transmitida por una pluralidad de especies bacterianas o

cepas bacterianas.

De acuerdo con otros aspectos de la divulgación, un polipéptido que comprende un dominio del lóbulo C y/o un dominio

del lóbulo N de un polipéptido receptor de superficie de HIBP se prepara de tal manera que un dominio de bucle que

conecta dos hebras p dentro del dominio del lóbulo C o del dominio del lóbulo N se modifica y el polipéptido es incapaz

de unirse sustancialmente a la proteína de unión al hierro del huésped. El término "modificado", tal y como se utiliza

aquí junto con un dominio de bucle, se refiere a un bucle del que se ha eliminado o sustituido al menos un residuo de

aminoácido. Así, el bucle resultante dentro del dominio del lóbulo C o del dominio del lóbulo N puede ser truncado o,

en otros aspectos, el residuo de aminoácido, los residuos pueden ser sustituidos por uno o más residuos de amino

alternativos. La FIG. 1 y FIG. 2 muestran los dominios de bucle de proteínas receptoras de superficie de HIBP

ejemplares. La FIG. 8 y FIG. 14 proporcionan ejemplos de reducciones de bucles en el dominio del lóbulo N y del

lóbulo C, respectivamente. De acuerdo con esto, al menos uno de los dominios de bucle que conectan dos hebras p

dentro del dominio del lóbulo C o del dominio del lóbulo N de la proteína receptora de membrana de unión a HIBP se

modifica para eliminar al menos un residuo de aminoácido de los dominios de bucle, comprendiendo el polipéptido

resultante un dominio del lóbulo N o del lóbulo C modificado e incapaz de unirse sustancialmente a la proteína de

unión al hierro del huésped. En otros aspectos se eliminan más residuos de aminoácidos, por ejemplo, al menos 5,

10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 8o, 90, 100 residuos de aminoácidos del dominio de bucle. En otros aspectos,

el dominio del bucle se elimina en su totalidad. Cualquiera de los dominios de bucle puede seleccionarse para ser

modificado de acuerdo con la presente divulgación, siempre que dicha modificación dé lugar a un polipéptido que no

pueda unirse sustancialmente a la proteína de unión al hierro del huésped. Así, refiriéndose al polipéptido TbpB porcino

ejemplar de la FIG. 1, en aspectos de la presente divulgación en los que se modifica un dominio de bucle, dicho

dominio de bucle puede seleccionarse para ser cualquiera de los dominios de bucle L1-L32 (como se ejemplifica en

las secuencias de polipéptidos de bucles L1 -L32 de Actinobacillus pleuropneumoniae : SEQ.ID: NO 42; SEQ.ID: NO

44; SEQ.ID: NO 46; SEQ.ID: NO 48; SEQ.ID: NO 50; SEQ.ID: NO 52; SEQ.ID: NO 54; SEQ.ID: NO 56; SEQ.ID: NO

58; SEQ.ID: NO 60; SEQ.ID: NO 62; SEQ.ID: NO 64; SEQ.ID: NO 66; SEQ.ID: NO 68; SEQ.ID: NO 70; SEQ.ID: NO

72; SEQ.ID: NO 74; SEQ.ID: NO 76; SEQ.ID: NO 78; SEQ.ID: NO 80; SEQ.ID: NO 82; SEQ.ID: NO 84; SEQ.ID: NO

86; SEQ.ID: NO 88; SEQ.ID: NO 90; SEQ.ID: NO 92; SEQ.ID: NO 94; SEQ.ID: NO 96; SEQ.ID: NO 98; SEQ.ID: NO

100; SEQ.ID: NO 102; SEQ.ID: NO 104; y SEQ.ID: NO 106, respectivamente, y codificados por las secuencias de

Q.ID: NO Q.ID: NO

Q.ID: NO

respectivamente), como se indica en la Tabla 1. En aspectos de la divulgación en los que se modifican dos dominios

de bucle, dichos dos dominios de bucle pueden ser cualesquiera dos dominios de bucle seleccionados entre los

dominios de bucle L1-L32 (refiriéndose de nuevo al polipéptido TbpB ejemplar de la FIG. 1), como se indica en la

Tabla 2. En aspectos de la divulgación en los que se modifican tres dominios de bucle, dichos tres dominios de bucle

pueden ser cualesquiera tres dominios de bucle seleccionados entre los dominios de bucle L1-L32 (refiriéndose de nuevo al polipéptido TbpB ejemplar de la FIG. 1), como se indica en la Tabla 3. En aspectos de la divulgación en los que se modifican cuatro dominios de bucle, dichos cuatro dominios de bucle pueden ser cualesquiera tres dominios de bucle seleccionados de la combinación de bucles establecida en la Tabla 3 más un dominio de bucle adicional seleccionado de los dominios de bucle L1-L32 (de nuevo refiriéndose al polipéptido TbpB ejemplar de la FIG. 1). En otros aspectos se puede modificar un total de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 o 32 dominios de bucle. Estará claro para los expertos en la materia que el número exacto de dominios de bucle modificados puede variar y puede seleccionarse para ser cualquier 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 o 32 dominios de bucle seleccionados de los bucles L1-L32, en cada uno de estos aspectos de la presente divulgación, de manera similar a la selección de dominios de bucle descrita con respecto a los aspectos en los que se han modificado 2 o 3 dominios de bucle. En aspectos particularmente preferidos, uno o todos los bucles L18, L21, L23 y L27 (como se ejemplifica en el Actinobacillus pleuropneumoniae SEQ.ID NO: 76; SEQ.ID NO: 82; SEQ.ID NO: 86; y SEQ.ID NO: 96, respectivamente) del dominio del lóbulo C se modifican. En otros aspectos particularmente preferidos, uno o todos los bucles L1, L5, L8 y L12 (como se ejemplifica en el Actinobacillus pleuropneumoniae SEQ.iD NO: 42; SEQ.ID NO: 50; SEQ.ID NO: 56; Se Q.iD NO: 64, respectivamente) del dominio del lóbulo N se modifican. Los dominios de bucle que pueden modificarse son dominios de bucle que conectan dos hebras p ensambladas dentro de un p-barril o dominio de asa p-hoja del dominio del lóbulo C o del dominio del lóbulo N-terminal, o dominios de bucle que conectan dos hebras p ensambladas, o una combinación de los anteriores. Para truncar un dominio de bucle dentro del dominio del lóbulo C o del dominio del lóbulo N-terminal, el polipéptido puede prepararse de manera que el dominio de bucle se elimine en su totalidad, y opcionalmente se sustituya por uno o más aminoácidos de enlace, dando así lugar a una conexión más o menos directa entre dos hebras p, o de manera que se elimine una porción o porciones de un dominio de bucle. De acuerdo con esto, preferentemente se elimina al menos la mitad de los residuos de aminoácidos de al menos uno de los dominios de bucle del dominio del lóbulo C o del dominio del lóbulo N. En otros aspectos preferidos, se elimina al menos la mitad del total de residuos de aminoácidos del dominio de bucle. Así, en los aspectos en los que un dominio de bucle comprende, por ejemplo, 40 residuos de aminoácidos, se eliminarán al menos 20 residuos de aminoácidos del dominio de bucle. En otros aspectos, el dominio de bucle se modifica de tal manera que se elimina al menos el 60%, 70%, 80% o 90% de los residuos de aminoácidos del dominio de bucle. En otros aspectos se conservan hasta 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos de los dominios de bucle, tras el truncamiento, y en otros aspectos se conservan hasta el 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90% de los dominios de bucle tras el truncamiento. En los aspectos en los que el dominio de bucle se modifica de tal manera que sólo se elimina una parte del dominio de bucle, los residuos de aminoácidos eliminados pueden estar situados en el extremo N-terminal del dominio de bucle, en el extremo C-terminal del dominio de bucle o entre los N- y C-terminales. En los aspectos en los que se modifican una pluralidad de dominios de bucle del dominio del lóbulo C o del dominio del lóbulo N, tales reducciones de bucle pueden implicar la eliminación de un número idéntico de residuos de aminoácidos de cada bucle, por ejemplo, se pueden eliminar 10 residuos de aminoácidos de cada bucle dentro del dominio del lóbulo C o del dominio del lóbulo N, o la reducción de bucle puede implicar la eliminación de diferentes cantidades de residuos de aminoácidos de cada bucle, por ejemplo, 10 residuos en un bucle y 20 residuos en otro bucle.

En otros aspectos preferidos de la divulgación, los residuos de aminoácidos dentro de los dominios de bucle del dominio del lóbulo C y/o del dominio del lóbulo N se sustituyen por otros, por ejemplo, mediante mutagénesis dirigida al sitio, comprendiendo el polipéptido resultante un dominio del lóbulo C o un dominio del lóbulo N modificado e incapaz de unirse sustancialmente a la proteína de unión al hierro del huésped. La FIG. 22 proporciona ejemplos de sustituciones de residuos en las regiones de bucle del dominio del lóbulo N de varios polipéptidos TbpB y la FIG. 23 ilustra la reducción de la unión de Tf debido a estas sustituciones de residuos. Así, por ejemplo, uno o más residuos de aminoácidos pueden ser sustituidos en cualquiera de los bucles L1 - L32. En ciertos aspectos preferidos, se sustituyen uno o más residuos de aminoácidos en el dominio de bucle L1, L3, L5 o L8 del dominio del lóbulo N (como se ejemplifica en el Actinobacillus pleuropneumoniae SEQ.ID NO: 42; SEQ.ID NO: 46; SEQ.ID NO: 50; y SEQ.ID NO: 56, respectivamente). En aspectos preferidos, un aminoácido aromático (fenilalanina, tirosina y triptófano) dentro del dominio de bucle L8 se sustituye por un aminoácido alifático (glicina, valina, leucina, isoleucina). Se trata de residuos de aminoácidos aromáticos accesibles en superficie en una región de superficie generalmente catiónica. En aspectos particularmente preferidos, se selecciona un polipéptido TbpB de Haemophilus parasuis y se realiza una o más de las siguientes mutaciones en el polipéptido TbpB para obtener un polipéptido TbpB modificado: Y93A (SEQ.ID NO: 170; SEQ.ID NO: 171); Y117A (SEQ.ID NO: 172; SEQ.ID NO: 173) o W176A (SEQ.ID NO: 176; SEQ.ID NO: 177). Según la invención, se selecciona un polipéptido TbpB de Haemophilus parasuis y se realiza la siguiente mutación en el polipéptido TbpB para obtener un polipéptido TbpB modificado: Y167A (SEQ.ID.NO: 174; SEQ.ID NO: 175;). En otros aspectos preferidos, se selecciona un polipéptido TbpB de Actinobacillus pleuropneumoniae y se realiza una o más de las siguientes mutaciones en el polipéptido para obtener un polipéptido TbpB modificado: F171A (SEQ.ID NO: 3; SEQ.ID NO: 4); Y95A (SEQ.ID NO: 13; SEQ.ID NO: 14); Y121A (SEQ.ID NO: 15; SEQ.ID NO: 16); Y174A (SEQ.ID NO: 17; SEQ.ID NO: 18); o R179E (SEQ.ID NO: 19; Se Q.ID NO: 20), y en otros aspectos preferidos se selecciona un polipéptido TbpB de Actinobacillus suis y se realiza una o más de las siguientes mutaciones en el polipéptido para obtener un polipéptido TbpB modificado: F63A (SEQ.ID NO: 29; SEQ.ID NO: 30) o F152A (SEQ.ID NO: 31; SEQ.ID NO: 32). La presente divulgación incluye cada uno de los polipéptidos modificados antes mencionados y las secuencias de ácido nucleico que codifican estos polipéptidos, así como composiciones inmunogénicas y composiciones de vacunas que comprenden estos polipéptidos.

Las reducciones de tamaño de uno o más dominios de bucle, o la modificación de aminoácidos en el dominio de bucle de los polipéptidos HIBP de acuerdo con la presente divulgación se realizan preferentemente de manera que el polipéptido resultante sea conformacionalmente estable. Por el término "conformacionalmente estable" se entiende que el estado conformacional o la conformación del polipéptido permanece sustancialmente igual tras la modificación del tamaño del bucle o la sustitución del residuo de aminoácido. El estado conformacional del dominio del bucle que se modifica puede estar más o menos alterado. Los determinantes del estado conformacional o de la confirmación de un polipéptido incluyen: la estructura primaria del polipéptido reflejada en su secuencia de aminoácidos, la estructura secundaria del polipéptido (por ejemplo, a-hélice, p-hoja y similares), la estructura terciaria del polipéptido (es decir, el plegado tridimensional de la cadena polipeptídica) y la estructura cuaternaria (es decir, la interacción del polipéptido con otras subunidades proteicas). La conformación de las proteínas puede verse influida además por factores ambientales, como el pH, la osmolaridad, la fuerza iónica y la concentración de sal. El diseño de la reducción del bucle puede basarse en la alineación y comparación de múltiples secuencias heterólogas, la comparación de estructuras conformacionales tridimensionales de múltiples polipéptidos heterólogos conocidos en la técnica, y el uso de sustituciones de aminoácidos conservadoras (por ejemplo, combinaciones como gly, ala; val, ile; leu, met; asp, glu; asn, gln; ser, thr; lys, arg; cys, met; y phe, trp, tyr). Además, el estado conformacional de una proteína puede analizarse mediante un ensayo funcional (por ejemplo, la unión de una proteína de unión al hierro del huésped), o mediante procedimientos físicos como la cristalografía de rayos X o la resonancia magnética nuclear (RMN).

En otros aspectos de la divulgación, al menos un dominio de bucle del dominio del lóbulo C o del dominio del lóbulo N de una proteína receptora de superficie de HIBP que comprende el bucle más largo, se selecciona para ser modificado. En los aspectos en los que dicho bucle se modifica en su totalidad, esto generalmente implicará la eliminación de al menos 25 residuos de aminoácidos y puede resultar en la eliminación de 150 residuos de aminoácidos o más.

En aspectos preferidos de la divulgación, se modifica al menos un dominio de bucle del dominio del lóbulo C o del dominio del lóbulo N de una proteína receptora de superficie de HIBP que comprende el bucle más largo (es decir, que comprende la mayor cantidad de residuos de aminoácidos) del dominio del lóbulo C o del dominio del lóbulo N. En otro aspecto preferido, se modifica al menos un dominio de bucle del dominio del lóbulo C o del dominio del lóbulo N de una proteína receptora de superficie de HIBP que comprende el bucle más largo del dominio del lóbulo C o del dominio del lóbulo N, y se selecciona un segundo dominio de bucle del dominio del lóbulo C o del dominio del lóbulo N de una proteína receptora de superficie de HIBP que comprende el segundo bucle más largo para ser modificado. En otros aspectos preferidos, al menos un dominio de bucle del dominio del lóbulo C o del dominio del lóbulo N de una proteína receptora de superficie de HIBP que comprende el bucle más largo, y un segundo dominio de bucle del dominio del lóbulo C o del dominio del lóbulo N de una proteína receptora de superficie de HIBP que comprende el segundo bucle más largo se seleccionan para ser modificados y un tercer dominio de bucle del dominio del lóbulo C o del dominio del lóbulo N de una proteína receptora de superficie de HIBP que comprende el tercer bucle más largo se selecciona para ser modificado. En otros aspectos preferidos, al menos un dominio de bucle del dominio del lóbulo C o del dominio del lóbulo N de una proteína receptora de superficie de HIBP que comprende el bucle más largo, y un segundo dominio de bucle del dominio del lóbulo C o del dominio del lóbulo N de una proteína receptora de superficie de HIBP que comprende el segundo bucle más largo se seleccionan para ser modificados y un tercer dominio de bucle del dominio del lóbulo C o del dominio del lóbulo N de una proteína receptora de superficie de HIBP que comprende el tercer bucle más largo se seleccionan para ser modificados, y un cuarto dominio de bucle del dominio del lóbulo C o del dominio del lóbulo N de una proteína receptora de superficie de HIBP que comprende el cuarto bucle más largo se seleccionan para ser modificados. Los aspectos mencionados anteriormente se detallan más en los Ejemplos 3 y 4 del presente documento.

Sorprendentemente, de acuerdo con esto, se ha encontrado que un polipéptido que consiste sustancialmente en un dominio de lóbulo C o un dominio de lóbulo N de una proteína receptora de superficie de HIBP puede producirse fácilmente, por ejemplo en un sistema de producción microbiana, cuando uno o más dominios de bucle se modifican, y el polipéptido modificado es sustancialmente conformacionalmente estable.

De acuerdo con esto, el dominio del lóbulo C modificado o el polipéptido del dominio del lóbulo N pueden utilizarse per se como inmunógeno, o el polipéptido puede ser modulado para comprender otras modificaciones. Las modificaciones del dominio del lóbulo C modificado o del dominio del lóbulo N del polipéptido que pueden realizarse de acuerdo con el presente documento incluyen la preparación de extensiones polipeptídicas N-terminales o C-terminales del polipéptido nativo o del dominio del lóbulo C modificado o del dominio del lóbulo N. Dichas extensiones polipeptídicas N-terminal y C-terminal incluyen la adición de un segundo polipéptido de longitud completa del dominio del lóbulo C al dominio del lóbulo C, proporcionando así un dímero del dominio del lóbulo C, la adición de un segundo polipéptido de longitud completa del dominio del lóbulo N al dominio del lóbulo N, proporcionando así un dímero del dominio del lóbulo N, o una adición que comprende una porción de un polipéptido del dominio del lóbulo C o una porción de un polipéptido del dominio del lóbulo N. Los multímeros pueden ensamblarse utilizando el mismo polipéptido monomérico (es decir, homodímeros, homotrímeros, etc.), o pueden ensamblarse utilizando diferentes polipéptidos, por ejemplo, un dominio del lóbulo C o un dominio del lóbulo N obtenido de diferentes variantes (es decir, hetrodímeros, heterotrímeros, etc.). En aspectos preferidos, se ensamblan proteínas heteromultiméricas que representan diferentes patógenos o cepas patógenas. Así, en un aspecto preferido, se prepara un polipéptido heteromultimérico que comprende dominios del lóbulo C o dominios del lóbulo N seleccionados del grupo que consiste en dominios del lóbulo C o dominios del lóbulo N de Actinobacillus pleuropneumoniae, Actinobacillus suis y Haemophilus parasuis . En aspectos particularmente preferidos, los dominios del lóbulo C o los dominios del lóbulo N se seleccionan del grupo que consiste en los dominios del lóbulo C o los dominios del lóbulo N de A. pleuropneumoniae H49, A. suis H57 y A. pleuropneumoniae H87. En otro aspecto preferido, se prepara un polipéptido heteromultimérico que comprende dominios del lóbulo C seleccionados de al menos dos dominios del lóbulo C de TbpB o dominios del lóbulo N seleccionados de cepas de Neisseria meningitidis . En aspectos particularmente preferidos, las cepas se seleccionan entre N. meningitidis M982 o N. meningitidis B16B6. Las proteínas heteromultiméricas pueden transmitir inmunogenicidad a diferentes patógenos. En otros aspectos preferidos, la presente divulgación proporciona, (i) un primer polipéptido, que comprende un dominio del lóbulo N o un dominio del lóbulo C de una proteína receptora de superficie de HIBP que se puede obtener a partir de u obtenida a partir de una especie bacteriana patógena Gramnegativa u obtenida de la misma, en el que el dominio del lóbulo N o el dominio del lóbulo C comprenden una pluralidad de hebras p conectadas por una pluralidad de dominios de bucle, y en el que al menos un dominio de bucle de la pluralidad de dominios de bucle del dominio del lóbulo N o del dominio del lóbulo C ha sido modificado, unido a (ii) un segundo polipéptido que comprende una proteína receptora de superficie de HIBP, o una porción de la misma, que se puede obtener de una especie bacteriana Gram-negativa. En aspectos preferidos, la porción de la proteína receptora de superficie de HIBP es un dominio del lóbulo N o un dominio del lóbulo C. En otros aspectos preferidos, la porción de la proteína de superficie de HIBP es un dominio del lóbulo N o un dominio del lóbulo C de una proteína receptora de superficie de HIBP que se puede obtener a partir de u obtenida a partir una especie bacteriana patógena Gramnegativa, en la que el dominio del lóbulo N o el dominio del lóbulo C comprenden una pluralidad de hebras p conectadas por una pluralidad de dominios de bucle, y en la que al menos un dominio de bucle de la pluralidad de dominios de bucle del dominio del lóbulo N o del dominio del lóbulo C ha sido modificado.

En otros aspectos de la divulgación, se prepara un polipéptido multimérico, comprendiendo dicha proteína multimérica una pluralidad de extensiones N- y C-terminales, incluyendo la adición de un segundo, tercero, cuarto, quinto, sexto o séptimo polipéptido de dominio de lóbulo C de longitud completa al dominio de lóbulo C, proporcionando así un multímero del dominio del lóbulo C, o la adición de un segundo, tercero, cuarto, quinto, sexto o séptimo polipéptido del dominio del lóbulo N de longitud completa al dominio del lóbulo N, proporcionando así un dímero del dominio del lóbulo N, o una adición que comprenda una porción de un polipéptido del dominio del lóbulo C o una porción de un polipéptido del dominio del lóbulo N. Así, por ejemplo, en un aspecto, los dominios del lóbulo C son al menos dos, o al menos tres, dominios del lóbulo C que se puede obteners de un polipéptido TbpB que se puede obtener de A. pleuropneumoniae, A. suis y Haemophilus parasuis. De acuerdo con dicho aspecto, las secuencias de ácido nucleico que codifican los dominios del lóbulo C de TbpB de A. pleuropneumoniae H49 (SEQ.ID NO: 5), A. suis H57 (SEQ.ID NO: 33) y A. pleuropneumoniae H87 (SEQ.ID NO: 21) pueden unirse para formar una secuencia de ácido nucleico quimérico (SEQ.ID NO: 39) que codifica un único polipéptido (SEQ.ID NO: 40) que abarca los tres lóbulos C (SEQ.ID NO: 6; SEQ.ID NO: 34; SEQ.ID NO: 22). Por consiguiente, en otros aspectos más, la presente divulgación proporciona (i) un primer polipéptido, que comprende un dominio del lóbulo N o un dominio del lóbulo C de una proteína receptora de superficie de HIBP que se puede obtener a partir de u obtenida a partir de una especie bacteriana patógena Gramnegativa, en el que el dominio del lóbulo N o el dominio del lóbulo C comprenden una pluralidad de hebras p conectadas por una pluralidad de dominios de bucle, y en el que al menos un dominio de bucle de la pluralidad de dominios de bucle del dominio del lóbulo N o del dominio del lóbulo C ha sido modificado, unido a (ii) una pluralidad de polipéptidos, cada uno de los cuales comprende una proteína receptora de superficie de HIBP, o una porción de la misma, que se puede obtener de una especie bacteriana Gram-negativa. En aspectos preferidos, la porción de la proteína receptora de superficie de HIBP es un dominio del lóbulo N o un dominio del lóbulo C. En otros aspectos preferidos, la porción de la proteína de superficie de HIBP es un dominio del lóbulo N o un dominio del lóbulo C de una proteína receptora de superficie de HIBP que se puede obtener a partir de u obtenida a partir una especie bacteriana patógena Gram-negativa, en la que el dominio del lóbulo N o el dominio del lóbulo C comprenden una pluralidad de hebras p conectadas por una pluralidad de dominios de bucle, y en la que al menos un dominio de bucle de la pluralidad de dominios de bucle del dominio del lóbulo N o del dominio del lóbulo C ha sido modificado.

En otros aspectos de la divulgación, al eliminar uno o más aminoácidos de uno o más dominios de bucle del lóbulo C o del lóbulo N de una proteína receptora de superficie de HIBP, estos residuos se sustituyen por uno o más residuos de aminoácidos alternativos. En un aspecto, los residuos aminoácidos alternativos comprenden un determinante antigénico polipeptídico heterólogo capaz de provocar una respuesta inmunitaria en un organismo huésped vertebrado. En otros aspectos, los residuos aminoácidos alternativos comprenden dos o más determinantes antigénicos polipeptídicos heterólogos capaces de provocar una respuesta inmunitaria en un organismo huésped vertebrado. Los determinantes antigénicos heterólogos pueden ser inmunorreactivos frente al mismo o a otro organismo patógeno. Por lo tanto, está claro que el dominio del lóbulo C modificado o el dominio del lóbulo N de una proteína receptora de superficie de HIBP de acuerdo con el presente documento puede utilizarse como andamio para producir y presentar uno o más determinantes antigénicos. En un aspecto preferido, una o más regiones de bucle del dominio del lóbulo C o del dominio del lóbulo N de TbpB se sustituye por una o más porciones polipeptídicas que se puede obteners a partir de u obtenidas a partir de una proteína IOM, incluyendo una proteína de unión a transferrina ("TbpA") o una proteína A de unión a lactoferrina ("LbpA"). Los polipéptidos LbpA y TbpA que pueden utilizarse de acuerdo con el presente documento incluyen los establecidos en SEQ.ID NO: 162 y SEQ.ID NO: 152. Las porciones de los polipéptidos LbpA y TbpA que pueden utilizarse de acuerdo con el presente documento incluyen las establecidas en SEQ.ID NO: 286 y SEQ.ID NO: 287. Estos fragmentos pueden utilizarse para construir secuencias de ácido nucleico y polipéptidos quiméricos, incluidos los expuestos en la ^{s E q . I D .} NO: 163; SEQ.ID. NO: 164; SEQ.ID. NO: 165; SEQ.ID. NO: 166, SEQ.ID. NO: 167; y SEQ.ID. ^{n O :} 168. Este aspecto de la divulgación se detalla aún más en los Ejemplos 7 y 8. del presente documento. En otro aspecto preferido, uno o más dominios de bucle del lóbulo C o del lóbulo N de TbpB se sustituye por una secuencia polipeptídica rica en lisina, como se describe en el ejemplo 9.

En todos los aspectos de la divulgación descritos anteriormente que comprenden un polipéptido receptor de superficie de HIBP que comprende un dominio de lóbulo N, es preferible que el dominio de lóbulo N se modifique de tal manera que el polipéptido de anclaje N-terminal, o una porción sustancial del mismo, se elimine del dominio de lóbulo N. La longitud del polipéptido de anclaje puede variar en función del polipéptido receptor de superficie de HIBP, pero normalmente oscila entre 40 y 75 aminoácidos de longitud, y se sitúa en el extremo N-terminal del polipéptido HIPB maduro. Así, en referencia a la FIG. 1, el polipéptido de anclaje del polipéptido TbpB maduro allí representado tiene 43 aminoácidos de longitud. Por consiguiente, en aspectos preferidos del presente documento que comprenden un polipéptido HIBP que comprende un dominio del lóbulo N, el polipéptido de anclaje se reduce en longitud en al menos 10 residuos de aminoácidos, preferentemente en al menos 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 o 75 residuos. En los aspectos en los que se selecciona una porción del polipéptido de anclaje para reducir su longitud, preferentemente se elimina una porción contigua del N-terminal del polipéptido de anclaje, por ejemplo, los 10 residuos de aminoácidos terminales del péptido de anclaje, aunque también pueden eliminarse otras porciones del polipéptido de anclaje. En otros aspectos preferidos, el polipéptido TbpB del que se ha truncado el péptido de anclaje incluye la SEQ.ID NO: 279 a SEQ.ID NO: 283. Los inventores han encontrado que los aspectos anteriores de la presente divulgación son particularmente deseables, ya que la eliminación del polipéptido de anclaje reduce la agregación del polipéptido receptor de superficie de HIBP modificado, haciendo que el polipéptido sea más fácil de producir, sin embargo, impacta sustancialmente las propiedades inmunogénicas del polipéptido. Por lo tanto, esta modificación de un polipéptido HIBP puede utilizarse junto con cualquiera de los péptidos modificados que son sustancialmente incapaces de unirse a la proteína de unión al hierro del huésped establecida en el presente documento, incluidos los polipéptidos HIBP descritos en el presente documento que comprenden un dominio del lóbulo N o un dominio del lóbulo C que comprende un dominio de bucle modificado, y los polipéptidos HIBP que comprenden un dominio del lóbulo N o del lóbulo C en el que se ha sustituido un solo aminoácido de tal manera que el polipéptido HIBP es sustancialmente incapaz de unirse a la proteína de unión al hierro del huésped.

Como se ha mencionado anteriormente, de acuerdo con la presente divulgación, la proteína receptora de superficie de HIBP se modifica de tal manera que es incapaz de unirse sustancialmente a la proteína de unión al hierro del huésped. La unión de la proteína de unión al hierro del huésped a la proteína receptora de superficie de HIBP modificada puede evaluarse mediante cualquier ensayo químico o bioquímico capaz de evaluar dicha unión, incluyendo, por ejemplo, un ensayo de unión en fase sólida, un ensayo de captura de afinidad o un ensayo biofísico. Las metodologías generales para realizar estos ensayos son conocidas por los expertos en la materia y se describen, por ejemplo, en (12, 23-25, 50, 51). Al realizar estos ensayos se puede determinar fácilmente la diferencia en las características de unión entre la proteína receptora de superficie de HIBP nativa y la proteína de unión al hierro del huésped nativo, y la proteína receptora de superficie de HIBP modificada y la proteína de unión al hierro del huésped nativo, y se puede evaluar una serie de proteínas receptoras de superficie de HIBP modificadas para determinar si son capaces de unirse a la proteína de unión al hierro del huésped. Se pueden determinar diferentes características de unión, incluida la constante de unión (Kd). Como se ha mencionado anteriormente, la Kd que caracteriza la unión entre la proteína de unión al hierro del huésped y las proteínas receptoras de superficie de HIBP modificadas de la presente divulgación es al menos 2 veces mayor que la Kd que caracteriza la unión entre la proteína de unión al hierro del huésped y la proteína receptora de superficie de HIBP nativa. Un procedimiento de ensayo ejemplar para determinar la constante de unión utilizando la transferrina del huésped se describe además en el Ejemplo 11 del presente documento.

La presente divulgación incluye además un procedimiento de identificación de una proteína receptora de superficie de HIBP modificada, comprendiendo el procedimiento:

(i) proporcionar una proteína receptora de superficie de HIBP modificada y una proteína receptora de superficie de HiBp nativa;

(ii) determinar las características de unión entre la proteína receptora de superficie de HIBP modificada y una proteína de unión al hierro del huésped para obtener las características de unión de las proteínas receptoras de superficie de HIBP modificadas;

(iii) determinar las características de unión entre la proteína receptora de superficie de HIBP nativa y una proteína de unión al hierro del huésped para obtener las características de unión de la proteína receptora de superficie de HIBP nativa;

(iv) comparar las características de unión de las características de la proteína receptora de superficie de HIBP modificada con las características de la proteína receptora de superficie de HIBP nativa; y

(v) identificar una proteína receptora de superficie de la HIBP que presente características de unión sustancialmente moduladas en relación con las características de unión de la proteína receptora de superficie de la HIBP nativa.

"Sustancialmente modulado", tal como se utiliza en el presente documento, significa que las fuerzas de interacción de unión entre las proteínas receptoras de superficie de HIBP modificadas y la proteína de unión al hierro del huésped son sustancialmente más débiles que las fuerzas de interacción de unión entre las proteínas receptoras de superficie de HIBP nativas y la proteína de unión al hierro del huésped. En aspectos preferidos de la divulgación, la característica de unión que se utiliza es la Kd relativa a la interacción de unión de la proteína receptora de superficie de HIBP y la proteína de unión al hierro del huésped, en la que el valor de la Kd de la interacción de unión entre las proteínas receptoras de superficie de HIBP modificadas y la proteína de unión al hierro del huésped es al menos 2 veces mayor en valor que la Kd de la interacción de unión entre las proteínas receptoras de superficie de HIBP nativas y la proteína de unión al hierro del huésped. Se observa además que el procedimiento anterior puede utilizarse para examinar una pluralidad de diferentes proteínas receptoras de superficie de HIBP candidatas, simultánea o secuencialmente, e identificar entre las proteínas receptoras de superficie de HIBP candidatas examinadas, aquellas que presentan una modulación más o menos pronunciada en las características de unión en relación con las proteínas receptoras de superficie de HIBP nativas.

La presente divulgación incluye además un procedimiento para preparar una proteína receptora de superficie de HIBP modificada para su uso como vacuna, comprendiendo el procedimiento:

(i) proporcionar una proteína receptora de superficie de HIBP modificada y una proteína receptora de superficie de HiBp nativa;

(ii) determinar las características de unión entre la proteína receptora de superficie de HIBP modificada y una proteína de unión al hierro del huésped para obtener las características de unión de las proteínas receptoras de superficie de HIBP modificadas;

(iii) determinar las características de unión entre la proteína receptora de superficie de HIBP nativa y una proteína de unión al hierro del huésped para obtener las características de unión de la proteína receptora de superficie de HIBP nativa;

(iv) comparar las características de unión de la proteína receptora de superficie de HIBP modificada con las características de unión de la proteína receptora de superficie de HIBP nativa;

(v) identificar una proteína receptora de superficie de la HIBP que presente características de unión sustancialmente moduladas en relación con las características de unión de la proteína receptora de superficie de la HIBP nativa; y

(vi) preparar la proteína receptora de superficie de HIBP modificada que presente características de unión sustancialmente moduladas en relación con las características de unión de la proteína receptora de superficie de HIBP nativa para su uso como vacuna.

De acuerdo con lo anterior, la proteína receptora de superficie de HIBP identificada que presenta características de unión sustancialmente moduladas en relación con las características de unión de las proteínas receptoras de superficie de HIBP nativas puede utilizarse para preparar formulaciones inmunogénicas, por ejemplo, produciendo recombinantemente la proteína receptora de superficie de HIBP, aislando la proteína de superficie de HIBP y preparando una formulación de vacuna que comprende la proteína receptora de superficie de HIBP.

En otros aspectos, la presente divulgación comprende procedimientos para evaluar la reactividad cruzada de antisueros contra variantes de proteínas receptoras de superficie. Por consiguiente, la presente divulgación comprende además un procedimiento de evaluación de la reactividad cruzada de los antisueros contra las variantes de proteínas receptoras de superficie, comprendiendo el procedimiento:

(i) proporcionar una pluralidad de secuencias de ácido nucleico que codifican proteínas receptoras de superficie;

(ii) determinar la variación de la secuencia de ácido nucleico entre la pluralidad de proteínas receptoras de superficie;

(iii) seleccionar una porción variante de una proteína receptora de superficie;

(iv) vincular una secuencia de ácido nucleico que codifica una porción N-terminal o C-terminal de la variante de la proteína receptora de superficie a una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido susceptible de biotinilación enzimática y una secuencia de ácido nucleico capaz de controlar la expresión en una célula huésped para formar una secuencia de ácido nucleico quimérica;

(v) introducir la secuencia de ácido nucleico quimérico en la célula huésped y expresar la secuencia de ácido nucleico quimérico para producir un polipéptido de fusión que comprenda la porción N-terminal o C-terminal de la variante de la proteína receptora de superficie fusionada con el péptido susceptible de biotinilación;

(vi) preparar lisados celulares de las células huésped;

(vii) aplicar los extractos celulares a un material de sustrato de inmunoensayo recubierto de estreptavidina; y (viii) aplicar un antisuero al material de sustrato de inmunoensayo, lavar el material de sustrato de inmunoensayo y aplicar segundos conjugados marcados para evaluar la reactividad cruzada entre el antisuero y la porción variante de la proteína receptora de superficie.

La secuencia de ácido nucleico que codifica el péptido susceptible de biotinilación puede comprender además una secuencia de ácido nucleico de longitud suficiente para permitir, tras la expresión, una extensión polipeptídica para el polipéptido de fusión, de manera que la proteína receptora de superficie esté distante del material de sustrato del inmunoensayo y, por tanto, sea totalmente accesible a la unión de un anticuerpo. El material de sustrato de inmunoensayo recubierto de estreptavidina puede ser cualquier material de sustrato, incluyendo, por ejemplo, una placa de ELISA.

En otros aspectos, la presente divulgación comprende procedimientos para evaluar las propiedades de reacción cruzada o de protección de variantes de proteínas receptoras de superficie de antisuero, comprendiendo el procedimiento:

(i) proporcionar una pluralidad de secuencias de ácido nucleico que codifican proteínas receptoras de superficie;

(ii) determinar la variación de la secuencia de ácido nucleico entre la pluralidad de proteínas receptoras de superficie;

(iii) proporcionar una célula huésped que comprenda un marcador selecconable por contador capaz de sustituir una secuencia de ácido nucleico que codifique una proteína receptora de superficie;

(iv) amplificación por PCR de una pluralidad de porciones variantes de una o más secuencias de ácido nucleico que codifican una proteína receptora de superficie para obtener una pluralidad de productos de PCR que codifican variantes de receptores de superficie, en los que la amplificación por PCR se realiza de manera que permita la integración de los productos de PCR en la célula huésped que comprende un marcador selecconable por contador, y en los que los productos de PCR comprenden una secuencia única de ácido nucleico extraña para permitir la identificación de cada producto de PCR;

(v) introducir y expresar la pluralidad de productos de PCR en la célula huésped que comprende el marcador selecconable por contador para proporcionar una biblioteca de variantes antigénicas de HIBP; y

(vi) utilizar toda la biblioteca o una parte de ella en un ensayo inmunológico in vivo o in vitro para evaluar las propiedades de reacción cruzada o de protección cruzada de la biblioteca o de una parte de ella.

El ensayo inmunológico in vivo o in vitro puede ser cualquier ensayo, incluyendo cualquier ensayo ELISA, ensayo inmunológico funcional o modelo de infección animal.

En otros aspectos más, la presente divulgación comprende un procedimiento para evaluar la eficacia de una vacuna para la prevención de la colonización del tracto respiratorio superior de los mamíferos por una cepa bacteriana Gramnegativa que expresa una variante de proteína receptora de superficie, comprendiendo el procedimiento:

(i) proporcionar a) una línea de ratón transgénico que exprese un receptor CEACAM de mamífero de la especie huésped del patógeno al que se dirige la vacuna y b) una línea de ratón genéticamente idéntica a la línea de ratón transgénico pero que no exprese el receptor CEACAM;

(ii) demostrar que la cepa bacteriana Gram-negativa que expresa la variante de la proteína receptora de superficie es capaz de colonizar el tracto respiratorio superior de la línea de ratones transgénicos, y no es capaz de colonizar el tracto respiratorio superior de la línea de ratones que no expresan el receptor CEACAM;

(iii) determinar si la inmunización con antígenos derivados de la proteína receptora de superficie da lugar a la ausencia de colonización del tracto respiratorio superior en ratones transgénicos infectados con la cepa bacteriana Gram-negativa que expresa la variante de la proteína receptora de superficie;

(iv) determinar si el suministro de antisueros de animales inmunizados con antígenos derivados de la proteína receptora de superficie da lugar a la ausencia de colonización del tracto respiratorio superior en ratones inmunizados no transgénicos infectados con la cepa bacteriana Gram negativa que expresa la variante de la proteína receptora de superficie

(v) preparar una biblioteca que comprenda porciones de la proteína del receptor de superficie de la cepa bacteriana Gram-negativa y utilizar la biblioteca en un modelo de colonización del tracto respiratorio superior de animales para evaluar la colonización del tracto respiratorio superior de animales expuestos con las variantes del receptor de superficie; y

(vi) opcionalmente, extraer y preparar el ADN obtenido de la biblioteca utilizada para exponer al animal y/o de las muestras obtenidas de los animales expuestos en períodos de tiempo apropiados después de la exposición, y determinar la proporción de cepas que expresan diferentes variantes del receptor.

En general, se entenderá por una persona con conocimientos normales en la materia, después de haber leído la presente divulgación, que de acuerdo con la divulgación se puede preparar y obtener una serie de diferentes polipéptidos modulados, todos los cuales, son proteínas receptoras de superficie de HIBP modificadas, en las que la modificación se realiza de tal manera que la proteína receptora de superficie de HIBP modificada es incapaz de unirse sustancialmente a la proteína de unión al hierro del huésped. Estos polipéptidos modulados y los procedimientos de fabricación de dichos polipéptidos modulados están todos destinados a ser incluidos en el ámbito de las composiciones y procedimientos aquí proporcionados.

Los polipéptidos del dominio del lóbulo C o del dominio del lóbulo N modificados se preparan convenientemente proporcionando una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína receptora de superficie de HIBP, y modulando la secuencia de ácido nucleico nativa de tal manera que los polipéptidos que comprenden el dominio del lóbulo C o el dominio del lóbulo N modificados se expresan en un organismo huésped recombinante, por ejemplo una célula microbiana. Las modificaciones de la secuencia del ácido nucleico pueden realizarse utilizando una variedad de técnicas de modificación del ácido nucleico que serán generalmente conocidas por los expertos en la materia, incluyendo, por ejemplo, la mutagénesis dirigida al sitio, la mutagénesis direccionada, la mutagénesis aleatoria, la adición de disolventes orgánicos, el barajado de genes o una combinación de estas y otras técnicas conocidas por los expertos en la materia, cada una de las cuales está diseñada para direccionar los dominios de bucle del dominio del lóbulo C o del dominio del lóbulo N de manera que se modifique un dominio de bucle del mismo. Alternativamente, las secuencias de ácido nucleico moduladas que codifican los polipéptidos modificados del dominio lóbulo C o del dominio lóbulo N pueden prepararse ab initio utilizando técnicas de síntesis genética. Las técnicas generales para preparar y modificar las secuencias de ácidos nucleicos están fácilmente disponibles para el artesano experto, por ejemplo en Green y Sambrook, Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2012, (33).

En otros aspectos de la presente divulgación, se proporcionan procedimientos para preparar una composición inmunogénica. En consecuencia, la presente divulgación proporciona un procedimiento para preparar una composición inmunogénica que comprende:

(a) proporcionar una secuencia de ácido nucleico quimérico que comprenda como componentes unidos operativamente

(i) una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende un dominio del lóbulo C o un dominio del lóbulo N de una proteína receptora de superficie de HIBP obtenida de una especie bacteriana Gram-negativa, en la que el polipéptido ha sido modificado de tal manera que es incapaz de unirse sustancialmente a la proteína de unión al hierro del huésped; y

(ii) una secuencia de ácido nucleico capaz de controlar la expresión en una célula huésped recombinante;

(b) introducir la secuencia de ácido nucleico quimérico en una célula huésped y cultivar la célula huésped para producir el polipéptido que comprende el dominio del lóbulo C o el dominio del lóbulo N;

(c) recuperar el polipéptido que comprende el dominio del lóbulo C o el dominio del lóbulo N de la célula huésped;

y

(d) preparar una composición inmunógena

En ciertos aspectos de la divulgación, el dominio del lóbulo C o el dominio del lóbulo N comprende una pluralidad de hebras p conectadas por una pluralidad de dominios de bucle, y en donde al menos un dominio de bucle de la pluralidad de dominios de bucle ha sido modificado, y en donde el polipéptido ha sido modificado de tal manera que es incapaz de unirse sustancialmente a la proteína de unión al hierro del huésped.

En otros aspectos preferidos, la presente divulgación proporciona un procedimiento para preparar una composición inmunogénica que comprende:

(a) proporcionar una secuencia de ácido nucleico quimérico que comprenda como componentes unidos operativamente

(i) una primera secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende un primer dominio del lóbulo C o un primer dominio del lóbulo N de una proteína receptora de superficie de HIBP obtenida de una especie bacteriana Gram-negativa;

(ii) una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende un segundo dominio del lóbulo C o un segundo dominio del lóbulo N de una proteína receptora de superficie de HIBP obtenida de una especie bacteriana Gram-negativa; y

(iii) una secuencia de ácido nucleico capaz de controlar la expresión en una célula huésped recombinante;

(b) introducir la secuencia de ácido nucleico quimérico en una célula huésped y cultivar la célula huésped para producir el polipéptido que comprende el primer y segundo dominio del lóbulo C o el primer y segundo dominio del lóbulo N;

(c) recuperar el polipéptido que comprende el primer y segundo dominio del lóbulo C o el primer y segundo dominio del lóbulo N de la célula huésped; y

(d) preparar una composición inmunogénica.

En aspectos preferidos de la divulgación, el primer y el segundo ácidos nucleicos están unidos operativamente de tal manera que se produce un polipéptido de fusión heteromultimérico que comprende un primer y un segundo dominio del lóbulo C o un primer y un segundo dominio del lóbulo N, y en el que el polipéptido de fusión heteromultimérico es incapaz de unirse sustancialmente a la proteína de unión al hierro del huésped.

La invención proporciona un procedimiento para preparar una composición inmunogénica que comprende:

(a) proporcionar una secuencia de ácido nucleico quimérico que comprenda como componentes unidos operativamente

(i) una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido TbpB que se puede obtener de una especie bacteriana patógena Gram-negativa, donde el polipéptido TbpB comprende la secuencia de la SEQ.ID NO: 174; y

(ii) una secuencia de ácido nucleico capaz de controlar la expresión en una célula huésped recombinante;

(b) introducir la secuencia de ácido nucleico quimérico en una célula huésped y cultivar la célula huésped para producir el polipéptido TbpB;

(c) recuperar el polipéptido TbpB de la célula huésped; y

(d) preparar una composición inmunogénica.

De acuerdo con esto, la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína receptora de superficie de HIBP está unida a una secuencia de ácido nucleico capaz de controlar la expresión de la proteína receptora de superficie de HIBP en una célula huésped. En consecuencia, la presente divulgación también proporciona una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína receptora de superficie de HIBP unida a un promotor capaz de controlar la expresión en una célula huésped. Las secuencias de ácido nucleico capaces de controlar la expresión en las células huésped que pueden utilizarse en el presente documento incluyen cualquier promotor transcripcional capaz de controlar la expresión de polipéptidos en las células huésped. Generalmente, los promotores obtenidos a partir de células bacterianas se utilizan cuando se selecciona un huésped bacteriano de acuerdo con el presente documento, mientras que un promotor fúngico se utilizará cuando se seleccione un huésped fúngico, un promotor vegetal se utilizará cuando se seleccione una célula vegetal, etc. Otros elementos de ácido nucleico capaces de controlar la expresión en una célula huésped incluyen terminadores transcripcionales, potenciadores y similares, todos los cuales pueden incluirse en las secuencias de ácido nucleico quimérico de la presente divulgación.

De acuerdo con la presente divulgación, las secuencias de ácido nucleico quimérico que comprenden un promotor capaz de controlar la expresión en una célula huésped vinculado a una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende un dominio del lóbulo C o un dominio del lóbulo N de una proteína receptora de superficie de HIBP que se puede obtener de una especie bacteriana Gram-negativa, en el que el dominio del lóbulo C o el dominio del lóbulo N comprende una pluralidad de hebras p conectadas por una pluralidad de dominios de bucle, y en el que al menos un dominio de bucle de la pluralidad de dominios de bucle ha sido modificado, puede integrarse en un vector de expresión recombinante que garantiza una buena expresión en la célula huésped. En consecuencia, la presente divulgación incluye un vector de expresión recombinante que comprende como componentes unidos operativamente:

(i) una secuencia de ácido nucleico capaz de controlar la expresión en una célula huésped; y

(ii) una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende un dominio del lóbulo C o un dominio del lóbulo N de una proteína receptora de superficie de HIBP que se puede obtener a partir de u obtenida a partir de una especie bacteriana Gram-negativa, en la que el polipéptido ha sido modificado de tal manera que es incapaz de unirse sustancialmente a la proteína de unión al hierro del huésped,

donde el vector de expresión es adecuado para la expresión en una célula huésped. El término "adecuado para la expresión en una célula huésped" significa que el vector de expresión recombinante comprende la secuencia de ácido nucleico quimérico de la presente divulgación unida a elementos genéticos necesarios para lograr la expresión en una célula huésped.

La invención proporciona un vector de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido TbpB que se puede obtener de una especie bacteriana patógena Gram-negativa, donde el polipéptido TbpB comprende la secuencia de la SEQ.ID NO: 174. Los elementos genéticos que pueden incluirse en el vector de expresión a este respecto incluyen una región de terminación transcripcional, una o más secuencias de ácido nucleico que codifican genes marcadores, uno o más orígenes de replicación y similares. Los elementos genéticos están vinculados de forma operativa, típicamente como sabrán los expertos en la materia, mediante la vinculación, por ejemplo, de un promotor en la dirección 5' a 3' de la transcripción a una secuencia codificante. En realizaciones preferidas, el vector de expresión comprende además elementos genéticos necesarios para la integración del vector o de una parte del mismo en el genoma de la célula huésped. En otros aspectos de la divulgación, el dominio del lóbulo C o el dominio del lóbulo N comprende una pluralidad de hebras p conectadas por una pluralidad de dominios de bucle, y en el que al menos un dominio de bucle de la pluralidad de dominios de bucle ha sido modificado.

De acuerdo con la presente divulgación, el vector de expresión puede contener además un gen marcador. Los genes marcadores que pueden utilizarse de acuerdo con la presente divulgación incluyen todos los genes que permiten distinguir las células transformadas de las no transformadas, incluidos todos los genes marcadores seleccionables y seleccionables. Un gen marcador puede ser un marcador de resistencia, como un marcador de resistencia a los antibióticos contra, por ejemplo, la kanamicina o la ampicilina. Los marcadores seleccionables que pueden emplearse para identificar a los transformantes mediante inspección visual incluyen la p-galactosidasa, la p-glucuronidasa (GUS) (Pat. de EE.UU. Números 5.268.463 y 5,599,670) y la proteína verde fluorescente (GFP) (52).

Una célula huésped que puede utilizarse de forma particularmente conveniente es Escherichia coli. La preparación de los vectores de E. coli puede llevarse a cabo mediante técnicas comúnmente conocidas, como la digestión por restricción, la ligadura, la clonación independiente de la ligadura, la electroforesis en gel, la secuenciación del ADN, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y otras metodologías. Existe una gran variedad de vectores de clonación para realizar los pasos necesarios para preparar un vector de expresión recombinante, incluyendo vectores personalizados que los inventores han desarrollado. Entre los vectores con un sistema de replicación funcional en E. coli, se encuentran vectores como la serie de vectores pUC o pET, etc. Normalmente, estos vectores de clonación contienen un marcador que permite la selección de las células transformadas. Las secuencias de ácido nucleico pueden introducirse en estos vectores, y los vectores pueden introducirse en E. coli mediante la preparación de células competentes, la electroporación o el uso de otras metodologías bien conocidas por un experto en la materia. E. coli puede cultivarse en un medio apropiado, como el medio Luria-Broth, y cosecharse. Los vectores de expresión recombinantes pueden recuperarse fácilmente de las células al cosecharlas y lisarlas. Además, se pueden encontrar orientaciones generales con respecto a la preparación de vectores recombinantes y al crecimiento de organismos recombinantes en, por ejemplo: Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2O0I, Third Ed (33).

La producción de las proteínas recombinantes puede ocurrir a lo largo del crecimiento de la cepa de E. coli , preferentemente por inducción de la expresión después de un período de crecimiento para lograr una biomasa significativa. Esto dará lugar a la producción del polipéptido que comprende el dominio del lóbulo C o el dominio del lóbulo N o el dominio del lóbulo C o el dominio del lóbulo N con bucles modificados. Posteriormente, el polipéptido puede recuperarse, aislarse y separarse de otros componentes de la célula huésped mediante diversas técnicas de purificación de proteínas, como por ejemplo la cromatografía de quelatos metálicos, la cromatografía de intercambio iónico, la cromatografía de exclusión por tamaño, la cromatografía de afinidad, la cromatografía de interacción hidrófoba, la cromatografía de fase inversa, la filtración en gel, etc. Se puede encontrar más orientación general con respecto a la purificación de proteínas, por ejemplo, en: Protein Purification: Principles, High Resolution Methods, and Applications (53). El término "recuperado", tal y como se utiliza aquí, significa que los polipéptidos se obtienen en forma más o menos pura. En aspectos preferidos, un polipéptido sustancialmente inmunogénico que comprende un dominio del lóbulo C de una proteína receptora de superficie de HIBP que se puede obtener a partir de una especie bacteriana Gram-negativa, en el que el dominio del lóbulo C o el dominio del lóbulo N comprende una pluralidad de hebras p conectadas por una pluralidad de dominios de bucle, y en el que al menos un dominio de bucle de la pluralidad de dominios de bucle ha sido modificado, puede obtenerse de acuerdo con esto. Así, los polipéptidos HIBP obtenidos de acuerdo con el presente documento pueden prepararse en forma sustancialmente pura. Por "sustancialmente pura" se entiende que la proteína inmunogénica está separada de otros componentes de la célula huésped. De acuerdo con esto, la proteína inmunogénica tiene una pureza de al menos el 95%, y más preferentemente una pureza de al menos el 96%, 97%, 98% o 99%. Alternativamente, pueden obtenerse fracciones relativamente crudas que comprendan el polipéptido HIBP, por ejemplo, células que contengan los polipéptidos, lisados celulares que contengan los polipéptidos o fracciones celulares que contengan el polipéptido.

En otros aspectos, la presente divulgación proporciona procedimientos para provocar una respuesta inmunitaria en un sujeto vertebrado. La respuesta inmune puede ser provocada por el suministro de la proteína inmunogénica o por el suministro de un vector de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína inmunogénica. En consecuencia, la presente divulgación proporciona además un procedimiento para provocar una respuesta inmunitaria en un sujeto vertebrado, comprendiendo dicho procedimiento administrar al sujeto:

(a) un inmunógeno que comprenda un polipéptido que comprenda un dominio del lóbulo C o un dominio del lóbulo N de una proteína receptora de superficie de HIBP obtenida de una especie bacteriana Gram-negativa, en la que el polipéptido sea incapaz de unirse sustancialmente a la proteína de unión al hierro del huésped; o

(b) un vector de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un inmunógeno que comprende un polipéptido con un dominio del lóbulo C o un dominio del lóbulo N de una proteína receptora de superficie de HIBP obtenida de una especie bacteriana Gram-negativa, en la que el polipéptido es incapaz de unirse sustancialmente a la proteína de unión al hierro del huésped; y

en el que el inmunógeno se administra o se expresa en una cantidad suficiente para provocar una respuesta inmunitaria en el sujeto vertebrado.

La presente divulgación también proporciona un uso de:

(a) un inmunógeno que comprenda un polipéptido que comprenda un dominio del lóbulo C o un dominio del lóbulo N de una proteína receptora de superficie de HIBP obtenida de una especie bacteriana Gram-negativa, en la que el polipéptido sea incapaz de unirse sustancialmente a la proteína de unión al hierro del huésped; o

(b) un vector de expresión que comprenda una secuencia de ácido nucleico que codifique un inmunógeno que comprenda un polipéptido que comprenda un dominio del lóbulo C o un dominio del lóbulo N de una proteína receptora de superficie de HIBP obtenida de una especie bacteriana Gram-negativa, en la que el polipéptido sea incapaz de unirse sustancialmente a la proteína de unión al hierro del huésped;

para provocar una respuesta inmunitaria en un sujeto vertebrado.

La presente divulgación proporciona además un uso de:

(a) un inmunógeno que comprenda un polipéptido que comprenda un dominio del lóbulo C o un dominio del lóbulo N de una proteína receptora de superficie de HIBP obtenida de una especie bacteriana Gram-negativa, en la que el polipéptido sea incapaz de unirse sustancialmente a la proteína de unión al hierro del huésped; o

(b) un vector de expresión que comprenda una secuencia de ácido nucleico que codifique un inmunógeno que comprenda un polipéptido que comprenda un dominio del lóbulo C o un dominio del lóbulo N de una proteína receptora de superficie de HIBP obtenida de una especie bacteriana Gram-negativa, en la que el polipéptido sea incapaz de unirse sustancialmente a la proteína de unión al hierro del huésped;

en la fabricación de un medicamento para provocar una respuesta inmunitaria en un sujeto vertebrado.

La presente divulgación también prevé:

(a) un inmunógeno que comprenda un polipéptido que comprenda un dominio del lóbulo C o un dominio del lóbulo N de una proteína receptora de superficie de HIBP obtenida de una especie bacteriana Gram-negativa, en la que el polipéptido sea incapaz de unirse sustancialmente a la proteína de unión al hierro del huésped; o

(b) un vector de expresión que comprenda una secuencia de ácido nucleico que codifique un inmunógeno que comprenda un polipéptido que comprenda un dominio del lóbulo C o un dominio del lóbulo N de una proteína receptora de superficie de HIBP obtenida de una especie bacteriana Gram-negativa, en la que el polipéptido sea incapaz de unirse sustancialmente a la proteína de unión al hierro del huésped;

para provocar una respuesta inmunitaria en un sujeto vertebrado.

En aspectos preferidos de la divulgación, el polipéptido comprende al menos dos dominios del lóbulo C, o al menos dos dominios del lóbulo N. En otros aspectos preferidos, el polipéptido comprende al menos tres dominios del lóbulo C, o al menos tres dominios del lóbulo N.

En ciertos aspectos de la divulgación, el dominio del lóbulo C o el dominio del lóbulo N comprende una pluralidad de hebras p conectadas por una pluralidad de dominios de bucle, y en el que al menos un dominio de bucle de la pluralidad de dominios de bucle se ha modificado de tal manera que el dominio del lóbulo C o el dominio del lóbulo N es incapaz de unirse sustancialmente a la proteína de unión al hierro del huésped.

La presente divulgación incluye además un inmunógeno que comprende un dominio del lóbulo C o un dominio del lóbulo N de un polipéptido receptor de superficie de HIBP en el que el dominio del lóbulo C o el dominio del lóbulo N comprende una pluralidad de hebras p conectadas por una pluralidad de dominios de bucle, y en el que al menos un dominio de bucle ha sido modificado para su uso como medicamento.

La presente divulgación incluye además un inmunógeno que comprende un dominio del lóbulo C o un dominio del lóbulo N de un polipéptido receptor de superficie de HIBP, en el que el dominio del lóbulo C o el dominio del lóbulo N comprende una pluralidad de hebras p conectadas por una pluralidad de dominios de bucle, y en el que al menos un dominio de bucle ha sido modificado para su uso en la prevención de infecciones o enfermedades por bacterias infecciosas Gram-negativas, incluyendo bacterias pertenecientes al género Actinobacillus, Neisseria, Haemophilus, Mannheimia, Histophilus, Pasteurella o Moraxella.

La presente divulgación incluye además un inmunógeno que comprende un dominio del lóbulo C o un dominio del lóbulo N de un polipéptido receptor de superficie de HIBP, en el que el dominio del lóbulo C o el dominio del lóbulo N comprende una pluralidad de hebras p conectadas por una pluralidad de dominios de bucle, y en el que al menos un dominio de bucle ha sido modificado para su uso en la fabricación de un medicamento para la prevención de infecciones o enfermedades por bacterias infecciosas Gram-negativas, incluyendo bacterias pertenecientes al género Actinobacillus, Neisseria, Haemophilus, Mannheimia, Histophilus, Pasteurella o Moraxella.

Preparaciones de vacunas

La presente divulgación proporciona además preparaciones de vacunas. Así, la presente divulgación proporciona además una composición de vacuna que comprende un antígeno derivado de una proteína receptora de superficie de HIBP de una especie bacteriana patógena Gram-negativa, en la que la proteína derivada de la proteína receptora de superficie de HIBP ha sido modificada de tal manera que es incapaz de unirse sustancialmente a la proteína de unión al hierro del huésped. Las composiciones de vacuna de la presente divulgación comprenden preferentemente una vacuna que comprende un polipéptido que comprende, una proteína receptora de superficie HlPB, un dominio del lóbulo C o un dominio del lóbulo N de una proteína receptora de superficie de HIBP que se puede obtener de una especie bacteriana patógena Gram-negativa en la que el polipéptido está modificado de tal manera que es incapaz de unirse sustancialmente a la proteína de unión al hierro del huésped. En aspectos preferidos, la preparación de la vacuna comprende una mezcla de dominios del lóbulo C pertenecientes a dos especies bacterianas diferentes o a dos cepas bacterianas diferentes. En otros aspectos preferidos, el polipéptido comprende al menos dos o al menos tres dominios del lóbulo N o del lóbulo C. En otros aspectos preferidos, dichos al menos dos o al menos tres dominios del lóbulo N o del lóbulo C forman un heteromultimero. En otros aspectos, el dominio del lóbulo C o el dominio del lóbulo N comprende una pluralidad de hebras p conectadas por una pluralidad de dominios de bucle, y en el que al menos un dominio de bucle de la pluralidad de dominios de bucle ha sido modificado.

La invención proporciona una composición de vacuna que comprende una composición inmunogénica según la reivindicación 1.

Las preparaciones de vacunas de la presente divulgación comprenden los polipéptidos HIBP inmunogénicos en forma más o menos pura. Así, de acuerdo con lo anterior, se pueden obtener polipéptidos HIBP sustancialmente puros y utilizarlos para preparar formulaciones de vacunas. En otras realizaciones, pueden obtenerse más preparaciones crudas de polipéptidos HIPB y utilizarse para preparar formulaciones de vacunas. Así, por ejemplo, en dichas realizaciones pueden utilizarse células, lisados celulares o fracciones celulares que comprendan los polipéptidos HIBP para preparar las formulaciones de vacuna.

Para aumentar la respuesta inmunitaria en un sujeto, las composiciones aquí proporcionadas incluyen preferentemente adyuvantes, como agentes farmacológicos, citoquinas o similares. Los adyuvantes adecuados incluyen cualquier sustancia que mejore la respuesta inmunitaria del sujeto a los polipéptidos inmunogénicos de la divulgación. Ejemplos no limitantes de adyuvantes incluyen citoquinas, por ejemplo, IL-1, IL-2, IL-12, IL-6, y además incluyen sales inorgánicas, por ejemplo, hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio y fosfato de calcio; emulsiones de aceite, por ejemplo, aceite mineral, MF59, QS-21, Montamide ISA51 e ISA-720; Isocoms, por ejemplo. ISCOMATRIX; derivados microbianos, por ejemplo MPLA, proteína activadora de macrófagos-2, virosomas, Lt /CT, CpG; polímeros naturales, por ejemplo polisacáridos; y polímeros sintéticos, por ejemplo polianhídridos y poliésteres, tal y como se revisa en Wilson-Welder et al.(54). Los adyuvantes pueden administrarse, por ejemplo, como proteínas u otras macromoléculas al mismo tiempo, antes o después de la administración de los antígenos polipeptídicos.

Las dosis para las proteínas inmunogénicas, generalmente van desde aproximadamente 0,1 |jg a aproximadamente 20 mg, preferentemente 10 jg a aproximadamente 3 mg para sujetos humanos. No obstante, la cantidad exacta necesaria variará en función de la edad y el estado general del sujeto receptor que se vaya a tratar, la gravedad de la afección que se trate, el preparado concreto que se suministre, el lugar de administración, así como otros factores. Un experto en la materia puede determinar fácilmente la cantidad terapéutica adecuada. Por lo tanto, una "cantidad terapéuticamente eficaz" de las presentes composiciones será una cantidad suficiente para provocar el tratamiento o la prevención de los síntomas de la enfermedad o afección, o para evitar la colonización por parte de las bacterias patógenas, y se situará en un rango relativamente amplio que puede determinarse mediante ensayos de rutina.

Las preparaciones de vacunas que comprenden la composición inmunogénica de la presente divulgación comprenden además, preferentemente, vehículos, excipientes y sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias amortiguadoras del pH y similares, pueden estar presentes en el excipiente o vehículo. Estos vehículos, excipientes y sustancias auxiliares son, por lo general, agentes farmacéuticos que no inducen una respuesta inmunitaria en el sujeto receptor y pueden administrarse sin una toxicidad indebida. Los excipientes farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, líquidos como agua, solución salina, polietilenglicol, ácido hialurónico, glicerol y etanol. También pueden incluirse sales farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, sales de ácidos minerales como clorhidratos, fosfatos, sulfatos y similares; y las sales de ácidos orgánicos como acetatos, propionatos, benzoatos y similares. También se prefiere, aunque no es obligatorio, que el preparado contenga un excipiente farmacéuticamente aceptable que sirva de estabilizador, en particular para estabilizar los polipéptidos de la presente divulgación. Los ejemplos de portadores adecuados que también actúan como estabilizadores para los péptidos incluyen, sin limitación, grados farmacéuticos de dextrosa, sacarosa, lactosa, sorbitol, inositol, dextrano y similares. Otros portadores adecuados son, de nuevo sin limitación, el almidón, la celulosa, los fosfatos de sodio o de calcio, el ácido cítrico, la glicina, los polietilenglicoles (PEG) y sus combinaciones.

Las preparaciones de vacunas de la presente divulgación pueden utilizarse para prevenir infecciones o enfermedades causadas por bacterias infecciosas Gram-negativas, incluyendo, sin limitación, bacterias pertenecientes al género Actinobacillus, Neisseria, Haemophilus, Mannheimia, Histophilus, Pasteurella o Moraxella , incluyendo sin limitación Actinobacillus pleuropneumoniae, Actinobacillus suis, Haemophilus parasuis, Neisseria meningitidis. Las preparaciones de la vacuna pueden utilizarse para inmunizar a cualquier sujeto vertebrado, incluyendo cualquier sujeto vertebrado que exprese proteínas de unión al hierro del huésped e incluyendo, sin limitación, cualquier sujeto mamífero, incluyendo cualquier sujeto humano, sujeto porcino, sujeto bovino, sujeto equino, sujeto ovino, sujeto hircino, sujeto canino, sujeto felino, sujeto leporino y, además, cualquier sujeto rumiante, y sujeto murino. Otros sujetos vertebrados que pueden ser inmunizados incluyen cualquier sujeto aviar y piscino. Las preparaciones de vacunas de la presente divulgación pueden presentar una respuesta inmunológica de reacción cruzada y/o de protección cruzada mejorada en el organismo receptor. Se observa además que las preparaciones de vacunas de la presente divulgación pueden prevenir la infección y/o la colonización por las bacterias infecciosas Gram-negativas, incluyendo la colonización bacteriana del tracto respiratorio o del tracto genital de un sujeto vertebrado.

La presente divulgación incluye además una vacuna que comprende una proteína receptora de superficie HIPB, un dominio del lóbulo C o un dominio del lóbulo N de un polipéptido receptor de superficie de HIBP en el que el dominio del lóbulo C o el dominio del lóbulo N comprende una pluralidad de hebras p conectadas por una pluralidad de dominios de bucle, y en el que al menos un dominio de bucle ha sido modificado para su uso en la prevención de infecciones o enfermedades por bacterias infecciosas Gram-negativas, incluyendo bacterias pertenecientes al género Actinobacillus, Neisseria, Haemophilus, Mannheimia, Histophilus, Pasteurella o Moraxella.

Prueba de los preparados de vacunas

De acuerdo con esto, la eficacia de las preparaciones de vacunas de la presente divulgación puede evaluarse, por ejemplo, determinando el título de anticuerpos presente en el suero sanguíneo de los sujetos inmunizados con una preparación de vacunas, por ejemplo, mediante la realización de un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA). Por consiguiente, la presente divulgación comprende además un procedimiento para evaluar la eficacia de una preparación de vacuna que comprende un dominio del lóbulo C o un dominio del lóbulo N de una proteína receptora de superficie de HIBP que se puede obtener de una especie bacteriana patógena Gram-negativa en la que el polipéptido está modificado de tal manera que es incapaz de unirse sustancialmente a la proteína de unión al hierro del huésped, comprendiendo el procedimiento:

(a) administrar a un sujeto vertebrado un preparado de vacuna que comprenda una proteína receptora de superficie HIPB, o un dominio del lóbulo C o un dominio del lóbulo N de un polipéptido receptor de superficie de HIBP que se puede obtener de una especie bacteriana patógena Gram-negativa, en el que el polipéptido esté modificado de tal manera que sea incapaz de unirse sustancialmente a la proteína de unión al hierro del huésped;

(b) obtener suero sanguíneo del sujeto vertebrado; y

(c) analizar el suero sanguíneo para detectar la presencia de anticuerpos contra los polipéptidos del receptor de superficie de la HIBP.

El suero sanguíneo de los vertebrados puede ensayarse tras la administración de una dosis única o múltiple (por ejemplo, 2, 3 o 4) de un preparado de vacuna. Los ensayos, como los de ELISA, pueden realizarse utilizando aislados de la proteína receptora de superficie de HIBP de una o varias cepas o especies microbianas diferentes. Los ensayos ELISA pueden implicar la unión del polipéptido receptor de superficie de la HIBP a una proteína portadora, como una proteína de unión a la maltosa. Cuando se ensaya la reactividad de los anticuerpos contra múltiples aislados de la proteína del receptor de superficie de la HIBP, es posible evaluar la preparación de la vacuna para la reactividad cruzada.

Regímenes de vacunación

Como es evidente para los expertos en la materia a la vista de las enseñanzas de esta especificación, la vacunación con los polipéptidos descritos anteriormente o con secuencias de ácido nucleico que codifican dichos polipéptidos (vacunas de ADN) puede efectuarse en una dosis, de forma continua o intermitente a lo largo del curso del tratamiento. Los procedimientos para determinar los medios y las dosis de administración más eficaces son bien conocidos por los expertos en la materia y variarán en función del vector de administración, la naturaleza de la composición, la profilaxis o la terapia específica que se busque, las células objetivo y el sujeto que se trate. Se pueden llevar a cabo administraciones únicas y múltiples, siendo el personal médico adecuado el que seleccione el nivel y la pauta de la dosis.

La administración de las preparaciones farmacéuticas descritas anteriormente puede realizarse en una dosis, de forma continua o intermitente a lo largo del tratamiento. La administración más típica será a través de una aguja y jeringa convencionales para las composiciones líquidas y para las suspensiones líquidas que contienen composiciones en partículas. Además, se conocen en la técnica varios inyectores de chorro de líquido que pueden emplearse para administrar las presentes composiciones. La vía de administración de la vacuna puede variar. Así, las vacunas de la presente divulgación pueden administrarse por vía intravenosa, subcutánea, intramuscular, intravaginal, intraperitoneal, intranasal, oral o por otras vías mucosas. Los procedimientos para determinar los medios y las dosis de administración más eficaces son bien conocidos por los expertos en la materia y variarán en función del vehículo de administración, la composición de la terapia, las células diana y el sujeto tratado. Se pueden llevar a cabo administraciones únicas o múltiples, siendo el médico o veterinario encargado de seleccionar el nivel y la pauta de la dosis.

EJEMPLOS

Los ejemplos que se presentan a continuación se ofrecen únicamente con fines ilustrativos y no pretenden limitar en modo alguno el alcance de la presente divulgación.

Ejemplo 1 - Respuesta inmunitaria con un dominio del lóbulo C de TbpB, un dominio del lóbulo N de TbpB y una mezcla de los mismos.

Este Ejemplo proporciona una ilustración del valor de utilizar subdominios de las proteínas del receptor TbpB para obtener una respuesta inmune más deseable. En cuanto a lo que se entiende por una respuesta inmune más deseable, se consideró tanto la magnitud de la respuesta de los anticuerpos como la reactividad cruzada de los mismos con las proteínas TbpB variantes.

La FIG. 3A ilustra los resultados del primer experimento para este Ejemplo en el que se inmunizaron diferentes especies de huéspedes (ratones, conejos y cerdos) con TbpBs intactas del patógeno humano Neisseria meningitidis (cepa B16B6 - s Eq .ID NO: 117) o del patógeno porcino Actinobacillus pleuropneumoniae (cepa H49 - SEQ.ID NO: 2). Los sueros de los animales inmunizados se analizaron frente al antígeno inmunizante en nuestro ensayo ELISA personalizado (véase más adelante). Los resultados ilustran que la magnitud (título) de la respuesta de anticuerpos en el cerdo con la TbpB del patógeno porcino A. pleuropneumoniae (barra gris) fue sustancialmente menor que en las otras especies de huéspedes en comparación con la TbpB del patógeno humano N. meningitidis (barra negra), lo que sugiere que la unión de la transferrina del huésped estaba influyendo en el desarrollo de la respuesta de anticuerpos contra la TbpB.

El segundo experimento (FIG. 3B) implica la inmunización de cerdos con TbpB intacta del patógeno bovino Mannheimia haemolytica (cepa H196 - SEQ.ID NO: 206) o la TbpB intacta (SEQ.ID No : 2), lóbulo N de TbpB (SEQ.ID NO: 8) o el lóbulo C de TbpB (SEQ.ID NO: 6) del patógeno porcino Actinobacillus pleuropneumoniae (cepa H49). La FIG. 3B ilustra la respuesta inmunitaria en cerdos individuales (grupo de barras) antes de la inmunización (barra blanca), después de la primera inmunización (barra gris claro), después de la segunda inmunización (barra gris oscuro) y después de la tercera inmunización (barra negra). Obsérvese que los títulos se expresan en forma de logaritmo binario para reflejar las diluciones dobles utilizadas en la evaluación del título. La mayoría de los cerdos mostraron títulos elevados de anticuerpos (entre 26.000 y 256.000) después de la tercera inmunización, pero varios de los cerdos inmunizados con TbpB intacta o con el lóbulo N de TbpB de A. pleuropneumoniae mostraron títulos sustancialmente reducidos (entre 5.300 y 8.000). La observación de que dos de los cuatro cerdos inmunizados con la TbpB intacta y tres de los cerdos inmunizados con el lóbulo N de la TbpB mostraron títulos sustancialmente reducidos sugiere que la unión de la transferrina del huésped influye en el desarrollo de la respuesta de anticuerpos sólo en un subconjunto de los animales.

El tercer experimento ilustrado en este ejemplo (FIG. 3C) se diseñó para evaluar la capacidad de los sueros contra la TbpB intacta y sus subdominios para reaccionar con diferentes TbpB representativas de patógenos porcinos con el fin de evaluar la reactividad cruzada de los antisueros. Los cerdos fueron inmunizados con la TbpB intacta (SEQ.ID NO: 2), el dominio del lóbulo C de TbpB (SEQ.ID NO: 6), el dominio del lóbulo N de TbpB (SEQ.ID NO: 8) o una mezcla del lóbulo N de TbpB y del lóbulo C de TbpB. Los sueros se probaron contra (i) la TbpB intacta de Actinobacillus pleuropneumoniae cepa H49 (SEQ.ID NO: 2), (ii) la TbpB intacta de la cepa HP5 de Haemophilus parasuis , (SEQ.ID NO: 115) o (iii) el TbpB intacto de Actinobacillus pleuropneumoniae cepa H87 (SEQ.ID NO: 12),

Los resultados de la FIG. 3C ilustran que el dominio del lóbulo C de la TbpB de la cepa H49 de A. pleuropneumoniae induce una respuesta inmunitaria más reactiva que la TbpB intacta (título más alto contra la TbpB heteróloga de la cepa H87) o el lóbulo N de la TbpB (títulos más altos contra la cepa H87 y HP5). Los TbpBs utilizados en este ensayo fueron diseñados para representar la secuencia global y la diversidad estructural presente en los aislados de enfermedades clínicas de A. pleuropneumoniae, A. suis y Haemophilus parasuis de cerdos de todo el mundo (SEQ.ID NO: 2; SEQ.ID NO:12; SEQ.ID NO: 28; y SEQ.ID NO: 107 a SEQ.ID NO: 115) (FIG. 4). Por lo tanto, en este ejemplo no se está limitando este análisis a un único patógeno porcino, sino que se está centrando en tres patógenos porcinos distintos que son problemáticos para la industria porcina mundial. El hecho de que estos patógenos compartan un mecanismo común para adquirir hierro del huésped ofrece una oportunidad única para desarrollar una vacuna dirigida a los tres patógenos a partir de un antígeno común, la TbpB. Estos resultados indican que utilizando uno o más dominios del lóbulo C como antígeno es factible producir una respuesta ampliamente reactiva contra los patógenos del cerdo en todo el mundo y, por lo tanto, se podría considerar la vacunación para eliminar la presencia de estos patógenos a nivel mundial.

Sorprendentemente, la mayor reactividad cruzada inducida por el dominio del lóbulo C se mantuvo incluso cuando el lóbulo C se mezcló con el lóbulo N en la mezcla inmunizante (FIG. 3C, "lóbulo N C"). Estos resultados nos enseñan que los antígenos con regiones de bucle variable más pequeñas (el "lóbulo C" comparado con el "lóbulo N", FIG. 1) son capaces de inducir una mayor respuesta de anticuerpos de reacción cruzada, y que esta mayor capacidad de inducir una respuesta inmunitaria de reacción cruzada se mantiene incluso cuando el lóbulo C se combina con otros antígenos en la mezcla inmunizante. Más concretamente, estos resultados indican que la tendencia del lóbulo N a generar una respuesta inmunitaria más específica de la cepa sólo es capaz de inhibir eficazmente la inducción de una respuesta inmunitaria de reacción cruzada por parte del lóbulo C cuando está físicamente unido al lóbulo N. En otras palabras, sorprendentemente, la propensión del lóbulo N a generar una respuesta inmune más específica se reduce sustancialmente cuando el lóbulo N se mezcla con el lóbulo C. Por lo que sabemos, este fenómeno no se ha descrito anteriormente.

Los resultados también sugieren que hay una respuesta reducida contra la TbpB intacta y el lóbulo N de la TbpB en relación con el lóbulo C(FIG. 3B, 3C), lo que podría indicar que la unión de la transferrina del huésped, una característica sólo presente en la TbpB intacta y en el lóbulo N de la TbpB, podría estar modulando la respuesta inmunitaria en los cerdos.

Es importante mencionar que, en contraste con los estudios publicados anteriormente, no se utilizó el procedimiento ELISA estándar para medir los niveles de anticuerpos, ya que se identificó una deficiencia importante en el procedimiento ELISA estándar. Se observa que, a diferencia de lo que se suele suponer, las proteínas purificadas no se unen necesariamente de forma aleatoria a las placas de ELISA, lo que supone un sesgo o una deficiencia potencialmente importantes a la hora de evaluar la unión de los anticuerpos a los epítopos de la superficie de la proteína. En particular, se observa que la TbpB, y en particular el lóbulo N de la TbpB, se une esencialmente a la superficie sólida de las placas de ELISA en una orientación, enmascarando la región de la tapa del lóbulo N, de modo que no se puede detectar la unión de la transferrina (FIG. 5). Por el contrario, la proteína de fusión recombinante con un compañero N-terminal de la proteína de unión a la maltosa (Mbp) que era el precursor del lóbulo N de la TbpB purificada era competente en la unión a la transferrina (FIG. 5). Este fenómeno se observó con los lóbulos N de TbpB de patógenos humanos, porcinos y bovinos y, en menor medida, con los TbpB intactos. Dado que estas proteínas son bastante diferentes en cuanto a su secuencia (<30% de identidad de secuencia global), esto indica que no se trata de una propiedad única de una proteína específica, sino que puede haber diversos grados en los que la unión no aleatoria afecta a los ensayos de unión en fase sólida.

Para superar esta deficiencia, se ideó un procedimiento para unir proteínas recombinantes a placas ELISA recubiertas de estreptavidina en virtud de un residuo de biotina que se añadió enzimáticamente al N-terminal durante la expresión de la proteína en el citoplasma. Como se muestra en la FIG. 5, la adición de un péptido N-terminal biotinilado enzimáticamente restauró la capacidad del lóbulo N de la TbpB para unirse a la transferrina. Este enfoque puede ser más eficiente a la hora de exponer la región de unión a la transferrina, como indica la comparación de los resultados con el lóbulo N de Tbp fusionado a Mbp en la parte izquierda y derecha de la figura. Este nuevo y novedoso formato de ensayo ELISA se utilizó en todos nuestros ensayos ELISA para monitorizar la reactividad de los anticuerpos, ya que garantizaba un acceso completo e igual a todos los epítopos de la proteína diana, proporcionando así una verdadera comparación en la evaluación del grado de reactividad cruzada.

Los antígenos recombinantes para los experimentos de inmunización se produjeron en el citoplasma de E. coli utilizando un vector de expresión T7 personalizado que codifica una etiqueta de polihistidina N-terminal, una proteína de unión a la maltosa y un sitio de escisión de la proteasa del virus del grabado del tabaco (TEV). Las proteínas de fusión recombinantes fueron aisladas por cromatografía Ni-NTA, los antígenos liberados por escisión (TEV) y purificados por una combinación de cromatografía Ni-NTA y Q-Sepharose.

Para el experimento de inmunización de la FIG3A se utilizaron ratones FVB ( haplotipo H2q del MHC albino de Charles River), conejos blancos de Nueva Zelanda de 3 meses de edad y cerdos cruzados de Large White Landrace Fl de 51 días de edad. Las proteínas recombinantes purificadas se mezclaron con solución salina tamponada con fosfato y con un 33% (FIG. 3A) o el 20% (FIG. 3B, FIG. 3c ) Emulsigen D (MVP Technologies) a una concentración final de 25 |jg en 0,1ml para ratones, 50 jg en 0,5ml para conejos y 100 jg en 2 ml para cerdos. Se administraron tres inyecciones por vía subcutánea en el caso de los ratones y los conejos y por vía subcutánea (FIG. 3A) o por vía intramuscular (FIG. 3B, FIG. 3C) para los cerdos. Los animales fueron inmunizados el día 0, 21, 42 y la sangre final se recogió el día 56.

Los sueros tomados en la semana 8 se analizaron frente a proteínas representativas en nuestro ensayo ELISA en fase sólida personalizado. Las proteínas de fusión recombinantes utilizadas en el ensayo ELISA se produjeron en el citoplasma de E. coli utilizando un vector de expresión T7 personalizado que codifica una secuencia de biotinilación optimizada en su extremo N, una etiqueta de polihistidina, una proteína de unión a maltosa y un sitio de escisión de la proteasa del virus del grabado del tabaco (TEV). Estas proteínas se biotinilaron in vivo en la secuencia de biotinilación N-terminal para que pudieran aplicarse a placas ELISA recubiertas de estreptavidina.

Los extractos crudos de los experimentos de expresión de proteínas a pequeña escala de una noche con el vector de expresión para las proteínas de fusión biotiniladas fueron suficientes para saturar las placas de ELISA según los experimentos de optimización previos. Se prepararon diluciones de los antisueros de interés en leche desnatada al 2,5% en tampón fosfato salino (PBST) y se aplicaron a las placas durante 1 hora a temperatura ambiente. Tras la eliminación y el lavado, el anticuerpo primario se detectó con IgG antiratón, anti-conejo o anti-suero de cabra conjugado con HRP a una dilución de 1:100.000 (1:25.000 para el anti-suero) durante una hora a temperatura ambiente. El título se expresa como el recíproco de la última dilución con un A450 > 0,3 (mayor que la media más tres desviaciones estándar de la lectura de fondo de los pozos sin sueros añadidos).

El cálculo del error SEM se realizó mediante ANOVA con la prueba HSD (diferencia significativa honesta) de Tukeys realizada como post hoc. Las estadísticas mostraron que para todos los sueros, H49 es significativamente diferente de H87 y que el lóbulo N es significativamente diferente del lóbulo C o del lóbulo N+C. Las estrellas mostradas en la FIG. 3C denotan pares específicos de inmunización/proteínas que difieren significativamente del lóbulo C o del lóbulo N+C probado contra H49.

Ejemplo 2 - Producción de un trímero de lóbulos C del patógeno porcino TbpB

En este Ejemplo se demostró que tres lóbulos C recombinantes de ingeniería que representan una amplia diversidad de TbpBs presentes en los tres patógenos porcinos, pueden unirse entre sí y retener la antigenicidad. Los lóbulos C de ingeniería utilizados aquí son los obtenidos de A. pleuropneumoniae, A. suis y Haemophilus parasuis (FIG. 4). Así, los genes que codifican los lóbulos C de la TbpB de las cepas A. pleuropneumoniae H49 (SEQ.ID NO: 6), A. suis H57 (SEQ.ID NO: 35) y A. pleuropneumoniae H87 (SEQ.ID NO: 22) se unieron para formar un gen que codifica un único polipéptido que abarca los tres lóbulos C (SEQ.ID NO: 40) Panel A de la FIG 6. Hay péptidos relativamente cortos que conectan los elementos estructurales secundarios de los lóbulos C (indicados con subrayado) en este trímero de lóbulos C. Los péptidos de enlace consisten en una secuencia interlóbica auténtica de los dominios individuales del lóbulo C. El panel B de la FIG. 6 ilustra la producción del trímero del lóbulo C y se compara con las preparaciones del lóbulo N y el lóbulo C de la TbpB recombinante de ingeniería del patógeno humano N. meningitidis cepa M982. Los resultados indican que el trímero del lóbulo C se produce en buena cantidad y es estable. Sin embargo, la preparación ilustrada en la FIG. 6 requiere una purificación adicional antes de su uso en experimentos de inmunización.

Dado que no había ninguna barrera importante para la producción de un trímero estable del lóbulo C, el trímero del lóbulo C se produjo y purificó para un experimento de inmunización para determinar si conservaba la inmunogenicidad. Como se ilustra en la FIG. 7 , el trímero del lóbulo C fue capaz de inducir una respuesta inmunitaria contra los tres TbpB representativos, lo que indica que la unión de los tres lóbulos C individuales no alteró sustancialmente sus propiedades inmunológicas. Los resultados también sugieren que un único antígeno proteico puede ser capaz de inducir una respuesta inmunitaria capaz de reaccionar con la mayoría, si no con todas, las cepas de los patógenos porcinos pleuropneumoniae, A. suis y Haemophilus parasuis , lo que resulta prometedor para el desarrollo de una vacuna porcina de amplia protección cruzada.

Ejemplo 3 - Reducción de las regiones de bucle en el lóbulo N de A p le u ro p n e u m o n ia e TbpB

En este Ejemplo, se modificaron las regiones de bucle del dominio del lóbulo N de tres TbpBs representativos de patógenos porcinos para determinar su impacto en la inducción de una respuesta inmune de reacción cruzada. Los tres TbpBs representativos eran de la cepa H57 de A. suis (SEQ.ID NO: 28), A. pleuropneumoniae cepa H87 (SEQ.ID NO: 12) y A. pleuropneumoniae cepa H49 (SEQ.ID NO: 2). Se seleccionaron estos TbpB concretos porque, además de representar la diversidad de secuencias, se disponía de datos estructurales de alta resolución; la cepa H57 de A, suis (3PQU.pdb), la cepa H87 de A. pleuropneumoniae (3PQS.pdb) y la cepa H49 de A. pleuropneumoniae (3HOL.pdb). El proceso de reducción del bucle resultó en una pérdida global de 74 aminoácidos (297-224) para el lóbulo N de TbpB de la cepa H57 de A. suis (SEQ.ID NO: 36,38], 45 aminoácidos (248-203) para el lóbulo N de TbpB de la cepa H87 de A. pleuropneumoniae (s Eq .ID NO: 24,26) y 27 aminoácidos (274-247) para el lóbulo N de TbpB de la cepa H49 de A. pleuropneumoniae (SEQ.ID NO: 8,10). El diseño de la reducción del bucle para la cepa H49 de A. pleuropneumoniae se describe con más detalle a continuación con fines ilustrativos.

Para diseñar las reducciones de bucle, se superpuso la estructura de la TbpB de la cepa H49 (3HOL.pdb) con la estructura de la TbpB de la cepa H87 (3PQS.pdb) mientras se visualizaba simultáneamente una alineación de secuencias múltiples de un conjunto de TbpBs representativas de patógenos porcinos. Al examinar la estructura y las regiones de variación, se identificaron varias áreas para la reducción potencial de los bucles que se predijo que no perturbarían la estructura general del lóbulo N, Estos incluyen los bucles 1, 5, 8a, 8c y 12 según la nomenclatura estándar (FIG. 2) y se ilustran en la FIG. 8 en modelos estructurales de una vista lateral (Panel A) y superior (Panel B) del lóbulo N de TbpB. Las reducciones de los bucles se diseñaron para minimizar la posible perturbación del plegado y la estructura general del lóbulo N, seleccionando las sustituciones de aminoácidos apropiadas según las necesidades, además de la eliminación de aminoácidos. La secuencia de aminoácidos del lóbulo N original (secuencia superior) y del lóbulo N modificado (secuencia inferior) se ilustran en la alineación de la secuencia en la FIG. 8, Panel C , donde las regiones de los bucles están resaltadas en gris y etiquetadas en letra gris. La secuencia de ADN que codifica la secuencia de aminoácidos ilustrada en el panel C fue optimizada para su expresión en la cepa E. coli y luego sintetizada.

Se adoptó una estrategia similar para generar reducciones de bucles para los lóbulos N de la TbpB de la cepa H87 de A. pleuropneumoniae y de la cepa H57 de A. suis , ya que representan una considerable diversidad de secuencias y estructuras de las TbpB de patógenos porcinos (FIG. 4) y las estructuras correspondientes están disponibles (3PQS.pdb y 3PQU.pdb) (12). La posibilidad de producir antígenos de ingeniería que colectivamente puedan inducir una respuesta cruzada contra las regiones del lóbulo N de la mayoría, si no de todos, los aislados clínicos, tendría un potencial considerable para mejorar la eficacia de una vacuna dirigida a los tres patógenos porcinos.

Los genes resultantes se clonaron en un vector de expresión personalizado que codifica una región de polihistidina N-terminal, una proteína de unión a la maltosa y un sitio de escisión del TEV (virus del grabado del tabaco) que precede a la secuencia de codificación del lóbulo N clonado. El plásmido de expresión de la versión de ingeniería del lóbulo N de la TbpB de la cepa H49 de A pleuropneumoniae se transformó en la cepa de expresión ER256 de E. coli que lleva una copia cromosómica del gen de la ARN polimerasa T7 insertada a continuación del promotor lacZ . Se realizó un análisis de expresión a pequeña escala utilizando un medio de autoinducción (55) que aprovecha la represión por glucosa y la inducción por lactosa del promotor lac . Así, utilizando una proporción específica de glucosa y lactosa en el medio, la expresión de la ARN polimerasa T7 se inicia de forma óptima en la fase media de crecimiento. Las células se lisaron tras una noche de crecimiento con un batidor de cuentas para lisarlas, las proteínas recombinantes se capturaron con una resina Ni-NTA o una resina Tf-Sepharose porcina, se lavaron y las proteínas unidas se eluyeron en tampón SDS-PAGE.

Como se ilustra en la FIG. 9 las reducciones de bucle en el lóbulo N de TbpB de la cepa H49 de A. pleuropneumoniae , de la cepa H57 de A. suis o de la cepa H87 de A. pleuropneumoniae dieron lugar a la producción de proteínas estables, por lo que no interfirieron en el plegamiento general del lóbulo N, y proporcionaron material adecuado para la inmunización. El panel superior muestra las proteínas recombinantes producidas en un experimento de expresión a pequeña escala capturadas en una resina Ni-NTA con la TbpB intacta de tipo salvaje y el lóbulo N de la TbpB como controles. Los resultados también muestran que, a diferencia de la proteína de tipo salvaje, las proteínas mutantes ya no eran capaces de unirse sustancialmente a la transferrina (Tf) porcina. Así, en el panel central, los lóbulos N de ingeniería no fueron capturados por la Tf-Sepharose porcina. En el panel inferior, el material ilustrado en el panel superior se utilizó en un ensayo de unión en fase sólida utilizando transferrina porcina conjugada con HRP y, a diferencia de los controles, los lóbulos N de ingeniería no mostraron ninguna actividad de unión. Se anticipó que habrá una mayor inmunogenicidad de estas proteínas en el huésped nativo, el cerdo. Así, este ejemplo muestra que las estrategias para la eliminación de las regiones antigénicamente variables en el lóbulo N de las proteínas TbpB son factibles y que dicha eliminación puede dar lugar a una mayor inmunogenicidad.

Ejemplo 4- Reactividad cruzada de los lóbulos C de N . m e n in g it id is TbpB

Este ejemplo ilustra el uso de derivados de ingeniería de TbpBs del patógeno humano Neisseria meningitidis de acuerdo con la presente divulgación. Como primer paso, se examinó la diversidad de TbpBs de N. meningitidis y nos aseguramos de tener un conjunto representativo de TbpBs para nuestra evaluación de la reactividad cruzada. La FIG.

10 ilustra la diversidad general de TbpBs en cepas de N. meningitidis recogidas en todo el mundo durante un largo periodo de tiempo, más las secuencias adicionales de la base de datos de secuencias del genoma de aislados de Neisseria (BIGSDB http://pubmlst.org/neisseria/)(56) (41). Las secuencias de un conjunto representativo de TbpBs (SEQ ID NO: 117; SEQ.ID NO: 123; SEQ.ID NO: 132 a SEQ.ID NO: 147; SEQ,ID NO: 177; y SEQ.ID NO: 178) de las cepas indicadas con flechas, flechas dobles o líneas en la FIG. 10A se incluyen en esta aplicación para definir la diversidad de secuencias en cada grupo. Hubo cuatro agrupaciones filogenéticas principales de los TbpB de N. meningitidis . El grupo 1 incluye las cepas que poseen TbpB de isotipo I. Los TbpB de isotipo I tienen característicamente TbpB más pequeños (aproximadamente 65-70 kDa) en comparación con los TbpB de isotipo II (80 -85kDa). La comparación de las secuencias por medio de alineaciones de secuencias múltiples reveló que la diferencia de tamaño se atribuye en gran medida a que el lóbulo C es mayor en las TbpB del isotipo II. Los TbpB de isotipo II se agruparon en tres grandes grupos filogenéticos (Grupos 2 -4, FIG.10A).

Un árbol filogenético que ilustra la diversidad de secuencias de los lóbulos C de TbpB (FIG. 10B) apoya la conclusión de que las secuencias del lóbulo C son las principales responsables de la identificación de los dos isotipos de TbpB. Los miembros del Grupo 2 de la FIG. 10A no se agrupan en el árbol filogenético del lóbulo C, sino que se distribuyen por el árbol de la FIG. 10B, lo que indica que el Grupo 2 estaba definido en gran medida por las secuencias del lóbulo N. Esto indica que si la reactividad cruzada inmunológica se va a determinar por la reactividad contra el lóbulo C, no se necesitarían representantes específicos del grupo 2. Por el contrario, las flechas y las líneas que se utilizaron para identificar un conjunto de secuencias TbpB que representaran la diversidad global de TbpB no representaban adecuadamente la diversidad global del lóbulo C, por lo que se seleccionaron dos cepas adicionales para proporcionar una representación más completa de la diversidad del lóbulo C. Las secuencias del lóbulo C de las cepas identificadas por las flechas, las flechas dobles o las líneas se incluyen en esta solicitud para proporcionar una muestra representativa de la diversidad de secuencias (SEQ ID NO: 87; SEQ.ID NO: 93; y SEQ.ID NO: 147 a SEQ.ID NO: 163).

Para abordar la cuestión de si una vacuna dirigida a la TbpB de N. meningitidis podría inducir una respuesta inmunitaria dirigida contra N. gonorrhoeae , se realizó un análisis de la diversidad de secuencias de los lóbulos TbpB y TbpB C de N. gonorrhoeae. Las secuencias de los TbpBs y lóbulos C de TbpB representativos del estudio de N. meningitidis (FIG. 10; SEQ .D NO: 119; SEQ.ID NO: 125; SEQ.ID NO: 179 a SEQ.ID NO: 195; SEQ.ID NO: 117; SEQ.ID NO: 123; SEQ.ID NO: 132 a SEQ.ID NO: 147; SEQ.ID NO: 177; y SEQ.ID NO: 178) se incluyeron en el análisis. Como se ilustra en la FIG. 26A, las TbpB de N. gonorrhoeae están más estrechamente relacionadas con las TbpB del isotipo 2 y forman dos subgrupos dentro del grupo del isotipo 2 de N. meningitidis . Esto sugiere que con las estrategias que utilizan mutantes dirigidos al sitio de la TbpB recombinante como antígenos de vacuna preferidos, podría ser posible lograr una amplia protección cruzada principalmente con antígenos derivados de la TbpB meningocócica. La FIG. 26B ilustra que, en contraste con la situación de los TbpB intactos, los lóbulos C de los TbpB de N. gonorrhoeae son un subgrupo distinto de los lóbulos C de N. meningitidis . Por lo tanto, con las estrategias que utilizan lóbulos C para proporcionar una amplia protección cruzada, se necesitarían lóbulos C de cepas de N. gonorrhoease .

Para comparar la capacidad de la TbpB truncada y del lóbulo C de la TbpB para inducir una respuesta de anticuerpos de reacción cruzada, una TbpB truncada recombinante y un lóbulo C de la TbpB derivado de la cepa de N. meningitidis , B16B6 (marcado con una flecha negra en la FIG. 10), fueron seleccionados para el análisis inmunológico. Se utilizó una TbpB truncada recombinante y un lóbulo C de TbpB de la cepa B16B6 para inmunizar a los conejos y se comprobó la reactividad cruzada del suero mediante nuestro novedoso ensayo ELISA (FIG. 5). Es importante reconocer que muchas de las secuencias de los lóbulos C incluidas en esta solicitud comienzan justo después del final de la última hebra beta del dominio de barril en el lóbulo N, por lo que incluyen la región de enlace entre el lóbulo N y el lóbulo C (L15, FIG. 2). Así, sería posible preparar lóbulos C estables y funcionales con truncamientos N-terminales que eliminen la región L15 (14 aminoácidos en el lóbulo C de B16B6) para experimentos de inmunización.

Un conjunto representativo de TbpBs derivado de cepas distribuidas a lo largo del árbol filogenético (flechas negras y grises , FIG. 10) fueron seleccionados para evaluar la reactividad cruzada de los sueros. Dos TbpB adicionales indicados por las dos flechas de doble cabeza se habrían incluido en el análisis para proporcionar una cobertura más completa, pero no estaban disponibles en el momento del análisis.

Las proteínas se expresaron en nuestro vector de expresión personalizado con una secuencia de biotinilación N-terminal, y se aplicaron a placas ELISA recubiertas de estreptavidina. Se comprobó la capacidad de los sueros de conejos inmunizados con el lóbulo C de ingeniería y la TbpB truncada derivada de la cepa B16B6 para reconocer el panel de variantes de TbpB. El antisuero contra la TbpB truncada presentaba títulos más altos contra la TbpB homóloga (B16B6) que el antisuero contra el lóbulo C, y títulos ligeramente superiores o equivalentes contra la TbpB de una de las cepas heterólogas (H44/76). Sin embargo, el antisuero anti-lóbulo C tenía títulos más altos de anticuerpos contra las TbpB de todas las demás cepas heterólogas que el antisuero anti-TbpB. Así, el lóbulo C es superior en su capacidad de inducir anticuerpos de reacción cruzada que la TbpB intacta.

En este experimento de inmunización, los antígenos recombinantes se produjeron como se ha descrito anteriormente y se utilizaron para inmunizar a conejos (New Zealand White, 3 meses de edad, hembra) por vía subcutánea en la región posterior utilizando 50 |jg de antígeno purificado en un adyuvante de 20% de Emulsigen D (VSA). Los conejos fueron inmunizados a las 0, 3 y 6 semanas.

Los sueros tomados en la semana 8 fueron analizados contra proteínas representativas en nuestro ensayo ELISA en fase sólida personalizado. Las proteínas de fusión recombinantes utilizadas en el ensayo ELISA se produjeron como se ha descrito anteriormente. Las proteínas recombinantes probadas en el ensayo ELISA personalizado eran versiones truncadas de las TbpB intactas (faltaban los primeros 19-36 aminoácidos) de las cepas de N. meningitidis ; (i) B16B6 (SEQ.ID NO: 117), (ii) H44/76 (SEQ.ID NO: 133), (iii) S3131 (SEQ.ID NO:132), (iv) M990 (SEQ.ID NO:134), (v) M978 (SEQ.ID NO:135), (vi) M992 (SEQ.ID NO:138), (vii) P3006 (SEQ.ID NO:139), (viii) 120M (SEQ.ID NO:137), (ix) MC58 (SEQ.ID NO:136) y (x) M982 (SEQ.ID NO: 123).

Los extractos crudos de los experimentos de expresión de proteínas a pequeña escala de una noche con el vector de expresión para las proteínas de fusión biotiniladas fueron suficientes para saturar las placas de ELISA según los experimentos de optimización previos. Se prepararon diluciones de los antisueros de interés en leche desnatada al 2,5% en tampón fosfato salino (PBST) y se aplicaron a las placas durante 1 hora a temperatura ambiente. El anticuerpo primario se detectó con IgG anti-conejo de cabra conjugado con HRP a una dilución de 1:100.000 durante una hora a temperatura ambiente y el título se expresa como el recíproco de la última dilución con un A450 > 0,3.

Ejemplo 5 - Producción de un dímero d e lóbulos C de N . m e n in g it id is TbpB

El resultado en la FIG. 11 ilustra que el dominio del lóbulo C de la TbpB del patógeno humano N. meningitidis es capaz de inducir una mayor respuesta de reacción cruzada en relación con la TbpB intacta. En este ejemplo se demostró que es posible generar un único polipéptido que abarque los dos lóbulos C que sea estable e inmunogénico. Los dos lóbulos C proceden de cepas con TbpB antigénicamente divergentes, la cepa B16B6 y M982, que representan los dos isotipos de TbpB(FIG. 10). El panel A de la FIG. 12 ilustra un único gen que fue construido para codificar los dos lóbulos C representativos de TbpB (SEQ.ID NO: 150) utilizado en los experimentos de inmunización descritos en el Ejemplo 4. El panel B de la FIG .12 ilustra la producción del dímero del lóbulo C en comparación con las preparaciones de los lóbulos C individuales de TbpB. Hay niveles razonables de producción del dímero del lóbulo C que parece ser relativamente estable, pero se requeriría una purificación adicional antes de su uso en experimentos de inmunización.

La FIG. 13 ilustra que el dímero formado por los lóbulos C de la TbpB de las cepas M982 y B16B6 de N. meningitidis es capaz de inducir una respuesta inmunitaria eficaz contra las TbpB intactas de ambas especies.

Ejemplo 6 - Reducción de las regiones de bucle del lóbulo C de N . m e n in g it id is .

En este Ejemplo se demostró que es posible reducir sustancialmente las regiones de bucle del lóbulo C de N. meningitidis. Dicha reducción es útil porque proporciona un derivado que carece de las grandes regiones de bucle que puede utilizarse como un "andamio" conveniente para mostrar epítopos de otros antígenos u otros patógenos, y además puede mostrar propiedades inmunológicas deseables.

En este ejemplo, las regiones de bucle del dominio del lóbulo C de la cepa M982 de N. meningitidis se modificaron para eliminar un total de 82 aminoácidos de las regiones de bucle grandes y flexibles. Los modelos estructurales del lóbulo C nativo y del lóbulo C de ingeniería con una reducción sustancial de cuatro de los grandes bucles flexibles se ilustran en el panel A de la FIG. 14. Los cuatro bucles a los que se pretende reducir no se resolvieron en la estructura basada en la cristalografía de la proteína (3VE2.pdb), lo que indica que hubo variación en la conformación de los bucles, razón por la cual los bucles están representados por líneas punteadas en el modelo de la izquierda en el panel A .

La estrategia para la eliminación del bucle se desarrolló mediante el examen de la estructura detallada (3VE2.pdb) mientras se evaluaba la variabilidad de la secuencia en las alineaciones de la secuencia de los lóbulos C seleccionados. Sin embargo, proporcionar el puente más eficaz entre los bucles sin interrumpir potencialmente la estructura fue un criterio dominante para la selección de los aminoácidos puente. El alineamiento de las secuencias del lóbulo C nativo (SEQ.ID NO: 125), derivados de ingeniería que carecen de cada uno de los bucles objetivo y un lóbulo C "sin bucles" con los cuatro bucles eliminados [SEQ.ID NO: 129) se ilustra en el panel B de la FIG. 14.

Utilizando el enfoque de empalme por extensión de solapamiento (SOEing) (57) se prepararon los genes que codifican las supresiones de bucles individuales y el lóbulo C "sin bucles" con los cuatro bucles eliminados. El enfoque de SOEing se llevó a cabo en el plásmido de expresión utilizado para la producción del lóbulo C recombinante de N. meningitidis M982, de modo que la estabilidad de las proteínas de ingeniería resultantes pudiera evaluarse fácilmente. El vector codifica una etiqueta de polihistidina N-terminal, el gen que codifica la proteína de unión a la maltosa y un sitio de escisión del TEV (virus del grabado del tabaco) que precede al gen insertado que codifica el lóbulo C de la TbpB. El plásmido de expresión se transformó en la cepa de expresión de E. coli ER2566 que lleva una copia cromosómica del gen de la ARN polimerasa T7 insertada en el gen lacZ , y que por tanto está bajo el control del promotor lac. Se realizó un análisis de expresión a pequeña escala utilizando medios de autoinducción (55). Tras una noche de crecimiento, las células se recogieron y lisaron y la fracción sobrenadante tras la centrifugación se aplicó a una resina Ni-NTA, se lavó y las proteínas unidas se eluyeron en tampón SDS-PAGE.

Como se ilustra en la FIG. 15, los rendimientos de los lóbulos C recombinantes con reducciones sustanciales del bucle 18, el bucle 21, el bucle 23 o el bucle 27 eran comparables a los de la proteína nativa del lóbulo C (WT), lo que indica que la eliminación de los bucles individuales no afectaba negativamente a la estabilidad de la proteína. FIG. l5 también muestra que la eliminación de 81 aminoácidos en los cuatro bucles no tuvo impacto en el nivel de proteína producida, lo que indica que la eliminación de los cuatro bucles no interfirió con el plegado general del lóbulo C. Es importante mencionar que el lóbulo C "sin bucles" se produjo y purificó fácilmente en buena cantidad, y que la estructura cristalina se ha obtenido a partir del lóbulo C "sin bucles" purificado. Esto indica que los antígenos de ingeniería pueden producirse fácilmente en una forma sustancialmente estable a niveles de producción que son adecuados para aplicaciones comerciales. Por lo tanto, este ejemplo no sólo muestra que las estrategias para la eliminación de las regiones antigénicamente variables son factibles, sino que la proteína resultante puede ser adecuada como andamio de visualización de epítopos, ya que el plegado de la estructura central no está influenciado por las variaciones en el tamaño y la naturaleza de los bucles.

Finalmente, como se ilustra en la FIG. 16, el lóbulo C "sin bucles" (SEQ.ID NO: 129, últimas dos barras) es inmunogénico y capaz de inducir una fuerte respuesta de anticuerpos contra el antígeno TbpB intacto (nativo) (SEQ.ID NO: 123). Esta figura ilustra que el lóbulo C sin bucles indujo realmente títulos más altos de anticuerpos contra la TbpB de la cepa M982 de N. meningitidis en ratones que el lóbulo C original de TbpB (SEQ ID NO: 125) (comparar las barras 3 y 1 de la figura). Igual de sorprendente es la observación de que el lóbulo C "sin bucles" indujo niveles similares de anticuerpos contra la TbpB heteróloga de la cepa B16B6 que el lóbulo C de la TbpB nativa de B16B6, a pesar de que su secuencia es bastante divergente (FIG. 10). Comparación de las barras 2‘ y 4‘ de la FIG. 16 ilustran que estas dos proteínas inducen un nivel similar de anticuerpos contra la TbpB intacta de la cepa B16B6.

En estos experimentos, los ratones hembra FvB fueron inmunizados con 25ug de antígeno proteico purificado con 20% de emulisgeno D en el día 0, 21 y 42 y los sueros tomados en el día 56 fueron evaluados para el título de punto final utilizando nuestro ensayo ELISA personalizado. Se utilizó el lóbulo C de la TbpB B16B6, el lóbulo C de la TbpB M982 o la TbpB M982 modificada ("sin lbucles") para inmunizar a cuatro ratones cada uno. Los títulos de los puntos finales se evaluaron contra la proteína M982 intacta biotinilada o la proteína TbpB de B16B6. Los títulos se determinaron con 1:100.000 de anticuerpo conjugado con peroxidasa anti-IgG de cabra H+L. Los títulos finales se determinaron como la inversa de la última dilución en la que se pudo detectar con seguridad una señal positiva. Cada suero se analizó por triplicado y los resultados se muestran como la media de todos los ratones con ese tratamiento /- SEM.

Ejemplo 7 - Inserción de porciones de TbpA en un lóbulo C de ingeniería de una TbpB.

En este ejemplo, el ADN que codifica los segmentos de los bucles de la superficie extracelular de la proteína integral de la membrana externa que se une a la transferrina A, TbpA, se empalmó en el gen que codifica el lóbulo C de la TbpB modificada o "sin bucles" de la cepa M982 de N. meningitidis , lo que dio lugar a genes que codifican varias proteínas híbridas TbpA-TbpB. La razón para empalmar regiones seleccionadas de TbpA en el andamiaje del lóbulo C de TbpB es que proporciona un medio de producción más eficiente que la proteína TbpA intacta, y proporciona la capacidad de dirigir específicamente las regiones superficiales de TbpA para la inducción de anticuerpos.

El gen que codifica el lóbulo C modificado del polipéptido TbpB (SEQ ID NO: 129) preparado en el ejemplo 6 se utilizó como punto de partida (véase más adelante: El panel A de la FIG. 14 (modelo medio)). El ADN que codifica segmentos de diferentes bucles de superficie de TbpA(FIG. 17, panel A) se empalmaron en los sitios donde se habían eliminado los bucles más grandes del polipéptido del lóbulo C de TbpB(FIG. 17, panel B). Porciones de los bucles extracelulares beta-barrel 3, 10 y 11 de TbpA (58) (regiones rellenas y etiquetadas en el panel A) se insertaron en las regiones de bucle modificadas 18, 21 y 23 del lóbulo C de TbpB de ingeniería (panel B). Del mismo modo, un segmento de la región plug N-terminal que se inserta entre los dominios C1 y C2 de la transferrina humana en la estructura de la TbpA-transferrina (plug loop, Panel A) se insertó en el bucle modificado 27 del lóbulo C de la TbpB modificada.

El ensamblaje de los bucles de TbpA en el lóbulo C de TbpB se realizó utilizando el enfoque de empalme por extensión de solapamiento (SOEing) (57). El enfoque de SOEing se llevó a cabo en el plásmido de expresión utilizado para la producción del lóbulo C recombinante de N. meningitidis M982, de modo que la estabilidad de las proteínas de ingeniería resultantes pudiera evaluarse fácilmente. El vector codifica una etiqueta de polihistidina N-terminal, el gen que codifica la proteína de unión a la maltosa y un sitio de escisión del TEV (virus del grabado del tabaco) que precede al gen insertado que codifica el lóbulo C de la TbpB. Los plásmidos de expresión se transformaron en la cepa de expresión de E. coli ER2566 que lleva una copia cromosómica del gen de la ARN polimerasa T7 insertada en el gen lacZ , y que por tanto está bajo el control del promotor lac. Se realizó un análisis de expresión a pequeña escala utilizando medios de autoinducción (55). Tras una noche de crecimiento, las células se recogieron y lisaron y la fracción sobrenadante tras la centrifugación se aplicó a una resina Ni-NTA, se lavó y las proteínas unidas se eluyeron en tampón SDS-PAGE.

Como se ilustra en el panel A de la FIG. 18, la inserción de los segmentos extraños de TbpA en los bucles del lóbulo C de TbpB modificado dio lugar a la producción de una proteína recombinante estable. Las proteínas recombinantes ilustradas en el panel A de la FIG. 18 contenía una etiqueta de polihistidina N-terminal, un socio de fusión de la proteína de unión a la maltosa y un sitio de escisión de la proteasa TEV (virus del grabado del tabaco). El panel B de la FIG. 18 ilustra la liberación de los lóbulos C de tipo salvaje y mutante del compañero de fusión de la proteína recombinante mediante la escisión con la proteasa TEV. Los resultados demuestran que la inserción de los segmentos proteicos extraños no afectó sustancialmente a la estabilidad del lóbulo C de ingeniería, lo que sugiere que los segmentos extraños no interfirieron en el plegado normal de los elementos estructurales centrales del lóbulo C. La implicación de estos resultados es que el lóbulo C parece ser un andamiaje proteico estable y versátil para la visualización de epítopos extraños que, en última instancia, podría utilizarse para la visualización de epítopos de una variedad de antígenos y variantes antigénicas, proporcionando una estrategia adicional para generar antígenos de ingeniería con la capacidad de generar una amplia respuesta inmune de protección cruzada.

Finalmente, como se ilustra en la FIG. 19, los lóbulos C de TbpB modificados que contienen regiones de TbpA empalmadas en las regiones donde se redujeron o eliminaron los bucles grandes son inmunogénicos. Esta figura ilustra que las proteínas del lóbulo C híbrido TbpA-TbpB indujeron títulos de anticuerpos iguales o superiores a los del lóbulo C modificado ("sin bucles"). En particular, las proteínas que muestran regiones del bucle 10 y del bucle 11 de TbpA tuvieron los títulos más altos (2' y3' barras en la FIG. 19).

En este experimento, los ratones hembra FvB fueron inmunizados con 25 |jg de antígeno proteico purificado con 20% de emulisgeno D en el día 0, 21 y 42 y el suero tomado en el día 56 fue evaluado para el título de punto final usando nuestro ensayo ELISA personalizado. Tres ratones fueron inmunizados con el lóbulo C "sin bucles" con los cuatro bucles eliminados (SEQ.ID NO: 97). Se utilizaron cinco ratones para la inmunización con cada uno de los otros cuatro antígenos híbridos; (i) el lóbulo C "sin bucles" con el bucle 10 de TbpA insertado en el bucle 21 del lóbulo C de TbpB (SEQ.ID NO: 154), ii) el lóbulo C "sin bucles" con el bucle 11 de TbpA insertado en el bucle 23 del lóbulo C de TbpB (SEQ.ID NO: 156), iii) el lóbulo C "sin bucles" con la hélice del bucle 3 de TbpA insertada en el bucle 27 del lóbulo C de TbpB (SEQ.ID NO: 158), o iv) el lóbulo C "sin bucles" con el bucle de tapón de TbpA insertado en el bucle 18 del lóbulo C de TbpB (SEQ.ID NO: 160). Los sueros se probaron contra la forma recombinante biotinilada del lóbulo C de M982 modificado que muestra los cuatro bucles TbpA insertados (SEQ.ID NO: 131). Los títulos se determinaron con 1:100.000 de anticuerpo conjugado con peroxidasa anti-IgG de cabra H+L. Los títulos finales se determinaron como la inversa de la última dilución en la que se pudo detectar con seguridad una señal positiva. Cada suero se analizó por triplicado y los resultados se muestran como la media de todos los ratones con ese tratamiento /- SEM.

Ejemplo 8- Inserción de porciones de LbpA en un lóbulo C modificado de una TbpB.

En este ejemplo, los segmentos de los bucles de la superficie extracelular proteína A de unión a la lactoferrina de la proteína de membrana externa integral, LbpA, de la cepa MC58 (SEQ.ID NO: 162), se empalmaron en el lóbulo C de TbpB modificado de la cepa M982 de N. meningitidis (SEQ. ID NO: 129) que se describió en el ejemplo 6. La razón para empalmar regiones seleccionadas de LbpA en el andamiaje del lóbulo C de TbpB es que proporciona un medio de producción más eficiente que la proteína LbpA intacta, y proporciona la capacidad de dirigirse específicamente a regiones superficiales de LbpA para la inducción de anticuerpos. Junto con el ejemplo 7 , se puede ilustrar cómo la generación de proteínas híbridas podría proporcionar la oportunidad de inducir una respuesta inmunitaria contra tres proteínas diferentes presentes en la superficie de N. meningitidis, proporcionando una mayor barrera para el potencial "escape de la vacuna", en el que una variante antigénica de una proteína diana crítica es capaz de escapar al impacto de la respuesta inmunitaria generada contra los antígenos de la vacuna.

Como no había estructuras disponibles para LbpA, se realizó un modelado estructural de LbpA utilizando 3 servidores de predicción de proteínas basados en la web: SWISS MODEL, I-TASSER, y PHYRE2 en un intento de conseguir el modelo más apropiado. Inicialmente se realizaron búsquedas BLAST para encontrar el LbpA más apropiado para el modelado con la estructura conocida de TbpA (58), y revelaron que el LbpA de la cepa MC58 (SEQ.ID NO: 130) era la más adecuada. Se generó un alineamiento de MC58 LbpA con K454 TbpA mediante ClustalW y sirvió como entrada para el modo de alineamiento en SWISS MODEL. En PHYRE2, el ID de PDB para la estructura de K454 TbpA y la secuencia FASTA de MC58 LbpA se presentaron como plantilla y objetivo, respectivamente. Sólo se envió a I-TASSER la secuencia FASTA de MC58 LbpA. La desviación media cuadrática (RMSD) se utilizó para evaluar la similitud de los diferentes modelos generados con la estructura de la plantilla tras superponerlos en Pymol (http://www.pymol.org/). El modelo de LbpA generado por PHYRE2 fue seleccionado como el más apropiado y se utilizó para seleccionar las regiones de bucle para generar la proteína híbrida o quimérica (FIG. 20, panel A).

El lóbulo C "sin bucles" del polipéptido TbpB preparado en el Ejemplo 6 (SEQ.ID NO: 129) se utilizó como punto de partida. El ADN que codifica las regiones del bucle extracelular 3 y del bucle 2 de LbpA se insertó entre el ADN que codifica las hebras beta que flanquean los bucles 18 y 21 del lóbulo C de TbpB de ingeniería (FIG. 20, panel B). Las regiones de bucles en el lóbulo C de TbpB y los bucles correspondientes en LbpA para la inserción se analizaron en cuanto a distancias utilizando Pymol para asegurar que los bucles de sustitución de LbpA estuvieran estructurados para ajustarse a los parámetros de distancia predichos por el bucle. El ensamblaje de los bucles de LbpA en el lóbulo C de TbpB se realizó mediante PCR SOE como en los ejemplos 6 y 7, y el análisis de la secuencia confirmó la inserción de la hélice 3 y el bucle 2 de LbpA MC58 en el lóbulo C de TbpB M982 sin bucles. El diseño de la proteína híbrida implicó la inserción de 15 aminoácidos de la región de la hélice 3 de LbpA (secuencia de la proteína: 383-YGTDEAEKFRDKSGV) en la región del bucle 18 del lóbulo C de M982 (SEQ.ID NO:166), y la inserción de 11 aminoácidos de la región del bucle 2 de LbpA (secuencia de la proteína: LNRWVKERIEQL) en la región del bucle 21 del lóbulo C de M982 (SEQ.ID NO:164)(FIG 20>, Panel B).

Los procedimientos para la transformación del plásmido recombinante y la realización de ensayos de expresión preliminares son los descritos para el Ejemplo 7. El cribado preliminar demostró que los rendimientos de la proteína recombinante eran elevados (abajo a la izquierda, panel B, FIG. 20), comparables o mejores que los resultados obtenidos con el lóbulo C nativo o el lóbulo C sin bucles utilizado como andamio (datos no mostrados). Claramente, los resultados demuestran además que la inserción de los segmentos de proteínas extrañas no afectó sustancialmente a la estabilidad del lóbulo C de ingeniería, lo que sugiere que los segmentos extraños no interfirieron en el plegado normal de los elementos estructurales centrales del lóbulo C.

Ejemplo 9 - Ingeniería de un bucle para aplicaciones de vacunas capsulares conjugadas utilizando el lóbulo C TbpB d e H . in f lu e n z a e

La mayoría de las vacunas capsulares conjugadas que se han desarrollado hasta la fecha han utilizado uno de los componentes de la vacuna basados en toxinas como portador para conjugar el material capsular de polisacáridos. La estrategia de conjugar el polisacárido capsular con la toxina o toxoide del tétanos o la difteria presenta varios inconvenientes. Una de ellas es la posibilidad de influir negativamente en la inducción de una respuesta inmunitaria eficaz debido a la exposición continuada a las proteínas portadoras que también están presentes en las vacunas utilizadas en las inmunizaciones rutinarias; el desarrollo de tolerancia inmunitaria. La segunda es que el portador no es relevante para la exposición natural al patógeno, por lo que no aprovechará plenamente la invocación de la ayuda de las células T más relevantes cuando se encuentre el patógeno.

Las vacunas capsulares conjugadas han tenido mucho éxito en la prevención de la infección, y de hecho en la prevención de la colonización, por los patógenos bacterianos que expresan el polisacárido capsular específico, normalmente denominado serotipo o serogrupo. Sin embargo, no hay protección cruzada para las bacterias que expresan otros tipos de polisacáridos capsulares, lo que puede llevar a que la enfermedad sea causada por cepas que expresan polisacáridos no cubiertos por la vacuna. La necesidad resultante de ampliar el espectro de tipos capsulares de polisacáridos cubiertos por las vacunas capsulares conjugadas ha llevado a la perspectiva de un desarrollo continuo de vacunas de espectro ampliado y a la opinión de que la solución definitiva reside en las vacunas basadas en proteínas que son capaces de proporcionar una protección cruzada sustancial. Sin embargo, si se desarrollara una vacuna basada en proteínas capaz de inducir una amplia protección cruzada, es poco probable que fuera aceptada para sustituir a las actuales vacunas capsulares conjugadas. La adición de otra vacuna al ya abarrotado calendario de inmunización rutinaria podría considerarse como un posible obstáculo para la introducción de las vacunas basadas en proteínas.

En este ejemplo se ha sometido a ingeniería un bucle de conjugación en un lóbulo C de TbpB de H. influenzae que contiene 42 residuos de lisina, superando sustancialmente el número total de lisinas en el resto del lóbulo C de TbpB, residuos de lisina, lo que se prevería para minimizar la modificación de las lisinas en los epítopos críticos, ya que sólo se modificarían las lisinas que reaccionan con los restos de carbohidratos activados y la proporción de carbohidratos con respecto a las proteínas puede controlarse durante el proceso de conjugación.

La secuencia del gen que codifica el lóbulo C de la TbpB de H. influenzae de ingeniería de la cepa H36 se ilustra en el panel A de la FIG. 21 con la región de ADN que codifica el bucle de conjugación indicada por un mayor tamaño de letra (14 frente a 12) (SEQ.ID NO: 167). El sitio de inserción y la secuencia del bucle de conjugación se diseñó utilizando como modelo el gran bucle cargado negativamente de LbpB de la cepa MC58 de N. meningitidis (59). Básicamente, se utilizó la secuencia del bucle LbpB como plantilla y se utilizaron lisinas para sustituir los residuos de ácido aspártico o glutámico del bucle. El bucle de conjugación se sometió a ingeniería en el dominio del asa del lóbulo C de TbpB, entre las hebras beta 22 y 23, en la posición del bucle 23(FIG. 2). La ubicación del bucle se ilustra en el panel B de la FIG. 21 utilizando un modelo estructural para el lóbulo C de H. influenzae generado con un bucle mucho más pequeño (compuesto por 11 aminoácidos) que sustituye al bucle 23. Los residuos insertados se ilustran como esferas llenas de espacio. El bucle de ingeniería se compone en realidad de 91 aminoácidos que constituyen más de % del tamaño del lóbulo C global (352 residuos de aminoácidos) y el bucle se establece como residuos resaltados en todo el lóbulo C con el bucle de ingeniería se establece en SEQ.ID NO: 205. Esto demuestra que el dominio del bucle puede albergar un gran número de aminoácidos adicionales.

La inclusión de una región de conjugación no se limitaría a la inserción en las regiones de bucle del lóbulo N o del lóbulo C, sino que, por ejemplo, podría proporcionarse mediante la inclusión de un grupo de residuos de lisina en el N-terminal de los lóbulos TbpB o TbpB intactos.

Ejemplo 10 - Producción de sustituciones de aminoácidos en los bucles de unión superficial de TbpB y evaluación de sus propiedades de unión a Tf

Se construyó una serie de mutantes dirigidos al sitio en los bucles de superficie de la proteína TbpB para explorar su impacto en las propiedades funcionales e inmunológicas. Con el fin de modificar los aminoácidos expuestos en la superficie, se realizaron mutaciones dirigidas al sitio en los TbpB para los que se tenían las estructuras derivadas de la cristalografía de rayos X (12, 13). Se utilizó un enfoque de empalme por reacción en cadena de la polimerasa de extensión solapada (SOE PCR) para introducir mutaciones en los genes que codifican las proteínas TbpB truncadas derivadas de los patógenos porcinos A pleuropneumoniae, A suis y H. parasuis. Incluyeron A. pleuropneumoniae TbpB20-528 (aminoácido 20-528) derivado de la cepa H49 (ApH49 TbpB, SEQ.ID NO: 2), y un mutante F171A de ApH49 TbpB2o-528 (SEQ ID.NO: 4). También se incluyeron A. pleuropneumoniae TbpB26-528 (aminoácido 26-528) derivado de la cepa H87 (ApH87 TbpB, SEQ.ID NO:12) y un mutante Y95A (SEQ.ID NO: 14), un mutante Y121A (SEQ.ID NO: 16), un mutante Y174A (SEQ.ID NO: 18) y un mutante R179E (SEQ.ID NO: 20). También se produjeron A. suis TbpB27-577 (aminoácido 27-577) derivado de la cepa H57 (AsH57 TbpB, SEQ.ID NO: 28), un mutante F63A (SEQ.ID NO: 30) y un mutante F152A (Se Q ID NO:32). Por último, también se prepararon H.parasuis TbpB27-177 (aminoácido 27-577) derivado de la cepa Hp5 de Nagasaki (Hp5 TbpB, SEQ.ID NO: 115), un mutante Y93A (SEQ.ID NO: 170), un mutante Y117A (SEQ.ID NO: 172), un mutante Y167A (SEQ.ID NO: 174), y un mutante W176A (SEQ.ID NO: 176) .

Las proteínas recombinantes se produjeron inicialmente con una pareja de fusión N-terminal que contenía una etiqueta de poli-histidina, una proteína de unión a maltosa y un sitio de escisión de la proteasa TEV. Esto permitió aislar la proteína recombinante adecuada para un ensayo de unión en fase sólida utilizando una membrana de nitrocelulosa y transferrina porcina marcada enzimáticamente o capturando la proteína de fusión recombinante a partir de extractos crudos con una resina de afinidad porcina-Sepharose (13). Mediante estos ensayos, se observó fácilmente una fuerte unión con los TbpB nativos, mientras que se redujo la unión con muchos de los mutantes dirigidos al sitio.

Aunque es posible derivar constantes de unión semicuantitativas para la unión de Tf porcina a partir de estos experimentos, se optó por utilizar una variedad de enfoques biofísicos y bioquímicos diferentes para obtener medidas más precisas y cuantitativas de la afinidad de unión. Como se muestra en la FIG. 22, utilizando calorimetría isotérmica , resonancia de plasmón de superficie o interferometría de biocapa (23-25) la constante de afinidad (Kd) para los TbpBs nativos estaba generalmente en el rango de 20 a 60 nM, con la excepción del TbpB de Actinobacillus suis para el que la cinética de unión era algo única y tenía un Kd estimado de 120 nM (12).

Varias de las mutaciones dieron lugar a un aumento de > 100 veces en la constante de afinidad (Kd), como la mutación F171A en la TbpB de la cepa H49 de A. pleuropneumoniae , la mutación Y174A en la TbpB de la cepa H49 de A. pleuropneumoniae o las mutaciones Y167a o W176A en la TbpB de la cepa HP5 de H. parasuis . Es interesante observar que todos estos mutantes se asignan al bucle 8.

Ejemplo 11 - Evaluación de las propiedades inmunológicas de derivados de TbpB con sustituciones de aminoácidos en los bucles de unión de superficie

Para probar las propiedades inmunológicas de las proteínas mutantes derivadas de TbpB que eran defectuosas en la unión de Tf era importante probarlas en el huésped nativo, y preferentemente probar directamente su capacidad para proteger al huésped de la infección por el patógeno objetivo. Así pues, se iniciaron los experimentos en un modelo de infección bien establecido para Haemophilus parasuis en el que los lechones privados de calostro fueron inmunizados a partir de los 28 días después del nacimiento y expuestos con Haemophilus parasuis al día 63 (37, 60). En este modelo de infección, una vacuna comercial derivada de la cepa de desafío (PorciNis Glasser) proporcionó una protección completa contra la muerte y las formas recombinantes de los receptores de transferrina habían proporcionado previamente un 20-30% de supervivencia 15 días después del desafío.

Grupos de cinco o seis cerdos fueron inmunizados con TbpB recombinante intacta de la cepa de exposición Hp5, la proteína TbpB Y167A dirigida al sitio, la vacuna Porcillis Glasser o el adyuvante solo. Los cerdos fueron expuestoscon la dosis de exposición estándar de 108 de la cepa H . parasuis Hp5 (Nagasaki) y fueron monitorizados durante un período de 15 días. Como se ilustra en la FIG. 23, sólo 1 de cada 5 cerdos inmunizados con la vacuna Porcilis Glasser de control sobrevivió a la exposición, lo que sugiere que en este experimento se utilizó una variante más virulenta de la cepa Hp5. Los experimentos de seguimiento con aislamientos de la cepa procedentes de cerdos infectados tuvieron tasas de supervivencia más bajas, lo que apoya esta conclusión. A pesar de la mayor virulencia de la cepa de exposición, los seis cerdos inmunizados con la TbpB Y167A sobrevivieron 15 días, y 5 de los 6 cerdos tuvieron pocos o ningún síntoma y se observó poca o ninguna patología en la necropsia. Este nivel de protección contrastó con el de los seis cerdos inmunizados con la proteína de tipo salvaje, en los que sólo 3 cerdos sobrevivieron a la exposición. Los 3 cerdos supervivientes presentaron síntomas clínicos significativos tras la exposición y mostraron una marcada patología en la necropsia. En resumen, este experimento ilustró que la proteína mutante Y167A TbpB indujo una respuesta inmunológica protectora superior en comparación con la proteína de tipo salvaje, y dado que las dos proteínas son prácticamente idénticas excepto por las propiedades de unión a la transferrina(FIG. 22), la respuesta inmunitaria subóptima de la proteína nativa puede atribuirse a la unión de la transferrina del huésped.

Para proporcionar más pruebas del impacto que la mutación tenía en la respuesta inmune, se evaluaron las respuestas de las células B y de las células T. Se analizaron muestras de sangre tomadas inmediatamente antes de la exposición (después de dos inmunizaciones) y a las 96 horas después de la exposición para determinar la respuesta inmunitaria adaptativa. Las muestras se evaluaron mediante análisis FACS para detectar subconjuntos de células B maduras (aIgM+CD21+) y células T auxiliares (CD4+CD8a-). Los resultados de la FIG 24 demuestran que, antes de la exposición, el antígeno TbpB mutante Y167A había inducido una respuesta más fuerte de las células B (panel A) y de las células T auxiliares (panel B) que el antígeno TbpB nativo o la vacuna comercial Porcilis Glasser. A las 96 horas de la exposición, la respuesta a la TbpB mutante (51,48% ± 1,18%) fue significativamente mayor que la respuesta a la TbpB nativa (45,65% ± 1,20%) o a la vacuna PG (44,83% ± 1,59%)(FIG. 24, panel C). Se observó una tendencia similar en la respuesta de las células T auxiliares, sin embargo, la diferencia en el porcentaje entre los tres grupos fue menos evidente (FIG. 24, panel D). Sin embargo, sólo quedaban 3/6 y 2/5 cerdos supervivientes en los grupos inmunizados con TbpB nativa o con la vacuna Porcilis Glasser después de 96 horas, y como los que respondían poco eran los que tendían a morir antes, las diferencias observadas entre los grupos en el punto de tiempo de 96 horas son en realidad una subestimación.

Ejemplo 12 - Una respuesta inmune dirigida contra derivados de TbpB es capaz de prevenir la colonización

Aunque los modelos de infección ofrecen la oportunidad de evaluar la eficacia potencial de las vacunas, rara vez emulan el proceso infeccioso natural, en el que la transmisión del patógeno normalmente conduce a la colonización del tracto respiratorio superior del huésped antes del establecimiento de la infección. Se ha demostrado que las vacunas capsulares conjugadas diseñadas para prevenir la meningitis, la neumonía y la infección invasiva eliminan las bacterias objetivo del tracto respiratorio superior (17), proporcionando la ventaja adicional de la inmunidad de grupo que protege a los individuos no inmunizados. La capacidad de prevenir la colonización se ha convertido desde entonces en una característica importante para tomar decisiones sobre la aplicación de la vacuna (18). Por lo tanto, puede ser prudente diseñar vacunas que impidan la colonización para que, junto con la prevención de la infección, puedan eliminar el reservorio de los patógenos causantes de la enfermedad.

Aprovechando estudios anteriores que caracterizaban la interacción de N. meningitidis y los receptores CEACAM humanos (61), se desarrolló un modelo de ratón transgénico humanizado capaz de soportar la colonización por Neisseria meningitidis (62). Este modelo se basa en una interacción específica de las proteínas Opa de Neisseria meningitidis con el receptor CEACAM1 humano, y podría extenderse potencialmente a otros patógenos que explotan esta interacción de forma natural o artificial. La inmunización de los ratones transgénicos con una vacuna capsular conjugada contra el meningococo del grupo C dio lugar a una inmunidad esterilizante de la mucosa en el modelo de colonización, o en otras palabras, impidió la colonización por Neisseria meningitidis del grupo C pero no por cepas con otros tipos capsulares.

Este modelo se utilizó para probar la capacidad de la TbpB y sus derivados para prevenir la colonización por N. meningitidis. Dado que no hay transferrina humana presente en estos ratones durante la etapa de inmunización, no fue necesario utilizar una TbpB no vinculante de ingeniería como se describió en el Ejemplo 11. Como se ilustra en la FIG. 25A, 8 de 9 ratones inmunizados con TbpB truncada recombinante no tenían niveles detectables de N. meningitidis tres días después de una exposición intranasal con 1 * 107 UFC de la cepa M982 de N. meningitidis . En los ratones de control tratados sólo con adyuvante, 6 de los 8 ratones tenían niveles detectables de N. meningitidis presentes. Es importante mencionar que este es el primer antígeno proteico que ha demostrado ser capaz de prevenir la colonización y no se puede asumir que esta característica sea común a los antígenos proteicos de superficie debido a nuestra limitada comprensión de los mecanismos implicados.

En un experimento de seguimiento, se comparó la TbpB con otra lipoproteína de superficie, la proteína de unión al factor H, que es un componente clave en dos vacunas, y con los subdominios individuales de la TbpB. Como se ilustra en la FIG. 25B el lóbulo C fue capaz de prevenir la colonización tan bien o mejor que el lóbulo TbpB intacto o el lóbulo N de TbpB, que a su vez fueron tan eficaces o más eficaces que la proteína de unión al factor H para inducir la inmunidad esterilizante en este experimento. La capacidad del lóbulo C de la TbpB para inducir una inmunidad mucosa esterilizante con la inmunización sistémica es un hallazgo especialmente alentador, ya que su falta de unión a la Tf significa que será igualmente eficaz en el huésped nativo, y su mayor capacidad para inducir una respuesta inmunitaria de reacción cruzada (FIG. 3, FIG. 11) facilitará el desarrollo de vacunas de amplia protección cruzada.

Los estudios de colonización se realizaron como se ha descrito anteriormente (62). Grupos de 8 o más C57/BI6 que expresan el transgén humano CEACAM-1 (criados internamente) recibieron 100 ul de inmunizaciones designadas por vía subcutánea en los días 0 y 21. Los grupos recibieron la proteína designada (25 ug) o ningún control proteico adyuvado con 20% de Emulsigen D (MVP Laboratories) diluido en solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) (Gibco) a un volumen de 100 ul por inyección.

En el día 35, se anestesió a los ratones con isoflurano (Baxter) y se les inoculó por instilación intranasal la cepa M982 de N. meningitidis pasada dos veces por los animales. Para preparar los inóculos, las cepas bacterianas para la infección se cultivaron durante la noche en agar GC (Beckton Dickinson); el césped de la noche se cosechó en 1 ml de PBS que contenía 1 mM de MgCl2 (PBS/Mg) y se midió la DO600 para ajustar el número de bacterias. Los cultivos se ajustaron de forma que cada inóculo final de 10 |jl contuviera aproximadamente 1 * w unidades formadoras de colonias. La densidad de la dosis de colonización se confirmó mediante la siembra por dilución en serie en agar GC.

Tres días después de la infección (día 38), los ratones fueron sometidos a eutanasaia por asfixia con dióxido de carbono. La carga de colonización se evaluó mediante un lavado traqueal con 250 ul de PBS/Mg seguido de un hisopado directo de las fosas nasales con un aplicador con punta de poliéster (Puritan Medical Products) resuspendido en 500 ul de PBS/Mg. Las muestras se enumeraron después de crecer durante una noche en agar GC complementado con un inhibidor de VCNT (Becton Dickinson) para evitar el crecimiento de la flora nasal. Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con el Comité de Revisión Ética de Animales de la Universidad de Toronto.

Ejemplo 13 - Formulación de vacuna que comprende mezclas de TbpBs o porciones de las mismas

Dado que los patógenos que poseen TbpB residen exclusivamente en su huésped específico (humanos, cerdos, ganado y/o rumiantes relacionados) y dado que TbpB es capaz de prevenir la colonización (FIG. 25), una vacuna de amplia protección cruzada basada en antígenos de ingeniería dirigidos a la TbpB tiene el potencial de eliminar el patógeno.

Para ampliar la eficacia de una formulación de vacuna contra un espectro de patógenos Gram-negativos, se pueden combinar TbpBs, o porciones de los mismos, por ejemplo un dominio del lóbulo C, obtenidos de diferentes especies o cepas bacterianas. En este Ejemplo se proporcionan combinaciones preferidas de polipéptidos TbpB o combinaciones de los mismos para su uso en la preparación de formulaciones de vacuna.

Una consideración importante en la identificación de combinaciones eficaces de polipéptidos TbpB es el grado en que diferentes cepas, especies y géneros son capaces de intercambiar fácilmente los genes tbpB , actuando así como un reservorio potencial de variantes de TbpB no cubiertas por la vacuna. Uno de los factores importantes que influyen en el intercambio horizontal de los genes tbpB es la naturaleza de la secuencia señal de captación (USS) que está inherentemente presente en estas especies naturalmente transformables (63, 64). Estas bacterias toman preferentemente el ADN que contiene el USS específico y lo incorporan a su genoma, proporcionando un mecanismo muy eficiente para incorporar variantes antigénicas de sus antígenos de superficie.

En el caso de Neisseria meningitidis se tiene una amplia colección de cepas que representan adecuadamente la diversidad escqucncc general (FIG. 10A). Existe una colección especialmente amplia de secuencias de todo el mundo disponibles en bases de datos públicas para este patógeno que representa una apreciación muy completa de la diversidad de secuencias. Dado que los otros patógenos humanos que poseen TbpB y que normalmente residen en el tracto respiratorio superior humano (Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis) no contienen el USS específico de Neisseria en su ADN genómico, no constituyen un reservorio listo para las variantes de antígenos. Así, el presente ejemplo incluye una formulación de vacuna que comprende una combinación de antígenos TbpB de ingeniería, que comprenden al menos dos polipéptidos TbpB, o una parte de los mismos (por ejemplo, el dominio del lóbulo C) obtenidos de cepas de Neisseria meningitidis seleccionadas de dos grupos filogenéticos diferentes establecidos en la FIG. 10A. Dicha formulación de la vacuna es potencialmente capaz de inducir una reacción cruzada (FIG. 11) y la respuesta de anticuerpos de protección cruzada, podrían utilizarse potencialmente para eliminar N. meningitidis de la población humana.

El patógeno relacionado, N. gonorrhoeae, que normalmente reside en el tracto genitourinario humano, comparte el mismo USS, por lo que podría servir como reserva de variación antigénica debido a la presencia ocasional de estas dos especies en la misma superficie de la mucosa. Sin embargo, el análisis de la diversidad de secuencias de las TbpB gonocócicas en relación con la diversidad en N. meningitidis (FIG. 26A) indica que son en gran medida un subconjunto de la diversidad de secuencias presentes en N. meningitidis , lo que lleva a la perspectiva de que, mediante una ligera extensión de nuestro enfoque, se podría utilizar un conjunto de antígenos de ingeniería para una vacuna potencialmente capaz de eliminar la colonización por cualquiera de los dos patógenos. En el caso de los lóbulos C de ingeniería (FIG. 26B) implicaría la inclusión de lóbulos C dirigidos específicamente a las variantes TbpB de N. g o n o rrh o e a e . La presencia de TbpB en algunos de los aislados de N e isse ria comensal representa otro reservorio potencial de variantes antigénicas, por lo que podría ser necesario ampliar nuestro enfoque para incluir variantes representativas de N e isse ria comensal para eliminar eficazmente la N e isse ria que exprese TbpB y sea capaz de causar enfermedades. Así, el presente ejemplo incluye una formulación de vacuna que comprende una combinación de antígenos TbpB de ingeniería, que comprende un polipéptido TbpB de N e isse ria m e n in g itid is , o una parte del mismo (por ejemplo, un dominio del lóbulo C), y un polipéptido TbpB de N e isse ria g o n o rrh o e a e o una parte del mismo (por ejemplo, un dominio del lóbulo C).

Los patógenos porcinos A. p le u ro p n e u m o n ia e , A. su is y H. p a ra s u is comparten el mismo USS y, en consecuencia, la diversidad de la secuencia TbpB se distribuye entre las tres especies (FIG. 4) de manera que los principales grupos filogenéticos tengan representantes de al menos dos especies. Por lo tanto, es importante tener en cuenta la variación global de la secuencia TbpB en las tres especies cuando se desarrollen vacunas basadas en TbpB contra estos patógenos. Esta es la base de nuestro enfoque poco convencional de desarrollar antígenos de ingeniería capaces de inducir una respuesta inmunitaria contra antígenos de más de una especie (FIG. 6, FIG. 7), y puesto que TbpB es capaz de impedir la colonización, están utilizando un enfoque que podría utilizarse para eliminar los tres patógenos de su huésped porcino. Así, el presente ejemplo incluye una formulación de vacuna que comprende una combinación de antígenos TbpB de ingeniería, que comprende al menos dos polipéptidos TbpB, o una parte de los mismos (por ejemplo, un dominio del lóbulo C) obtenidos de A c tin o b a c illu s p le u ro p n e u m o n ia e , A c tin o b a c illu s su is y H a e m o p h ilu s p a rasu is .

En lo que respecta a H a e m o p h ilu s in flue nzae , el espectro claramente diferente de la enfermedad causada por las cepas que poseen la cápsula de polisacáridos tipo b y las cepas no tipificables que carecen de una cápsula de polisacáridos han hecho que se centre la atención en las vacunas dirigidas a cada grupo por separado. El reciente aumento de la enfermedad invasiva debida a las cepas que expresan la cápsula de polisacáridos del grupo A ha hecho que se considere el desarrollo de vacunas dirigidas a las cepas del grupo A (65). Una evaluación de la diversidad de la TbpB en las cepas de H. in flu e n z a e indica que hay tres grupos filogenéticos principales (FIG. 27A) con las cepas no tipificables distribuidas entre los tres grupos. Dado que todas las cepas de H. in flu e n z a e comparten el mismo USS, es probable que la distribución de la diversidad de TbpB no se vea afectada por el tipo capsular, y el desarrollo de una vacuna de protección cruzada derivada de antígenos de ingeniería basados en TbpB se dirigirá eficazmente a las cepas de tipo b, a las cepas no tipificables y a las cepas que expresan otros tipos capsulares. Por lo tanto, este enfoque debería facilitar el desarrollo de una vacuna ampliamente protectora basada en TbpB para H. in flu e n z a e como vacuna independiente, o como portadora de una vacuna capsular conjugada (FIG. 21). Así, el presente ejemplo incluye una formulación de vacuna que comprende una combinación de antígenos TbpB diseñados, que comprenden al menos dos polipéptidos TbpB, obtenidos de cepas de H. in flu e n za e seleccionadas de dos grupos filogenéticos diferentes establecidos en la f Ig .27A.

A diferencia de N e isse ria m e n in g itid is y H a e m o p h ilu s in flue nzae , no hay USSs obvios presentes en los genomas de las cepas de M o ra xe lla ca ta rrh a lis , pero son naturalmente transformables con una fuerte preferencia por el ADN de M. c a ta rrh a lis . Por lo tanto, el desarrollo de una vacuna de amplia protección cruzada contra M. c a ta rrh a lis con antígenos de ingeniería dirigidos a la TbpB sólo debe tener en cuenta la diversidad de TbpB de M. c a ta rrh a lis (FIG.

29). Los antígenos derivados de las cepas que constituyen los tres grupos principales deberían ser suficientes para inducir una vacuna de amplia protección cruzada capaz de prevenir la colonización por M. ca ta rrh a lis . Así, el presente ejemplo incluye una formulación de vacuna que comprende una combinación de antígenos TbpB diseñados, que comprenden al menos dos polipéptidos TbpB, obtenidos a partir de cepas de M. c a th a rrh a lis seleccionadas de dos grupos filogenéticos diferentes establecidos en la FIG. 29.

El patógeno bovino M a n n h e im ia h a em o ly tica , antes conocido como P a s te u re lla h a em o ly tica , es la principal causa de la enfermedad respiratoria bovina (fiebre de embarque) en el ganado vacuno y de las infecciones respiratorias en las ovejas. El patógeno de las ovejas, P a s te u re lla tre h a lo s i , que ha sido reclasificado en dos especies M a n n h e im ia g lu c o s id a y B ib e rs te in ia treha los i, comparte las USS con M a n n h e im ia ha e m o ly tica . Esto puede ser en gran parte responsable de la constatación de que estas especies comparten un acervo genético común (66). En cambio, el patógeno bovino H is to p h ilu s som n i, antes conocido como H a e m o p h ilu s som nus, tiene un USS distinto, por lo que no es un reservorio de variantes antigénicas para M. ha em o ly tica . Hay tres linajes filogenéticos principales de TbpBs de M. h a e m o ly tica , M. g lu co s id a y B. tre h a lo s i que, obviamente, engloban a los patógenos del ganado ovino y bovino (66) (FIG. 28) con grupos de variantes que se limitan principalmente al ganado vacuno o al ovino. Así, será posible considerar el desarrollo de antígenos de ingeniería derivados de TbpB dirigidos a la enfermedad en el ganado vacuno, en el ovino o en ambas especies de rumiantes. Por lo tanto, el presente ejemplo incluye una formulación de vacuna que comprende una combinación de antígenos TbpB de ingeniería, o una porción de los mismos, por ejemplo, el dominio del lóbulo C, que comprende al menos dos polipéptidos TbpB, obtenidos a partir de cepas de M a n n h e im ia h a e m o ly tica , M a n n h e im ia g lu c o s id a y B ib e rs te in ia tre h a lo s i seleccionadas de dos grupos filogenéticos diferentes establecidos en la FIG. 28.

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Claims (4)

REIVINDICACIONES

1. Una composición inmunogénica que comprende un polipéptido de la proteína B de unión a la transferrina (TbpB) que se puede obtener de una especie bacteriana patógena Gram-negativa, en la que el polipéptido TbpB comprende la secuencia de la SEQ.ID NO: 174.

2. Una composición de vacuna que comprende una composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 1.

3. Un procedimiento para preparar una composición inmunogénica que comprende:

(a) proporcionar una secuencia de ácido nucleico quimérico que comprenda como componentes unidos operativamente

(i) una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido TbpB que se puede obtener de una especie bacteriana patógena Gram-negativa, donde el polipéptido TbpB comprende la secuencia de la SEQ.ID NO: 174; y

(ii) una secuencia de ácido nucleico capaz de controlar la expresión en una célula huésped recombinante; (b) introducir la secuencia de ácido nucleico quimérico en una célula huésped y cultivar la célula huésped para producir el polipéptido TbpB;

(c) recuperar el polipéptido TbpB de la célula huésped; y

(d) preparar una composición inmunogénica.

4. Un vector de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido TbpB que se puede obtener de una especie bacteriana patógena Gram-negativa, en el que el polipéptido TbpB comprende la secuencia de la SEQ.ID NO: 174.