ES2356396T3

ES2356396T3 - Composición de vacuna para vacunbar a los perros contra la enfermedad respiratoria infecciosa canina (eric).

Info

Publication number: ES2356396T3
Application number: ES04743211T
Authority: ES
Inventors: John Brownlie; Victoria Jane Chalker; Kerstin Erles
Original assignee: Royal Veterinary College
Current assignee: Royal Veterinary College
Priority date: 2003-07-01
Filing date: 2004-07-01
Publication date: 2011-04-07
Anticipated expiration: 2024-07-01
Also published as: EP1638599A1; ZA200600918B; KR20060106809A; BRPI0412194A; AU2004253344B2; CA2530797C; JP2007526884A; US20070098739A1; GB0315323D0; WO2005002618A1; DK2050463T3; ES2432175T3; MXPA06000278A; US8329194B2; NO20056207L; AU2004253344A1; EP2050463A2; EP1638599B1; JP5698890B2; EP2050463A3

Abstract

Una composición de vacuna para la vacunación de perros que comprende: un agente capaz de elevar una respuesta inmune contra Streptococcus equi sub species zooepidemicus (S. zooepidemicus) en un perro, donde dicho agente se compone de S. zooepidemicus inactivado o atenuado o un fragmento inmunológico de S. zooepidemicus, o un ácido nucleico que codifica dicho fragmento; y un agente capaz de elevar una respuesta inmune contra Micoplasma cynos (M. cynos) en un perro, donde dicho agente se compone de M. cynos atenuado o inactivado, o un fragmeno inmunológico de M. cynos, o un ácido nucleico que codifica dicho fragmento.

Description

La presente invención trata de una composición de vacuna y en particular en una composición de vacuna para el uso contra enfermedades respiratorias infecciosas caninas.

La enfermedad respiratoria infecciosa canina (ERIC) es una enfermedad altamente contagiosa común en los perros de casa y en condiciones donde existe multitud de ellos como en centros de reacogida, de internamiento y 5 centros de entrenamiento. Muchos perros sufren sólo de una tos suave y se recuperan después de un corto tiempo, sin embargo en algunos casos puede desarrollarse una bronconeumonía (Appel y Binn, 1987). ERIC es raramente mortal pero puede retrasar la reacogida de perros en centros de rescate y puede causar el trastorno en perreras de entrenamiento con un coste de tratamiento considerable.

La patogénesis de ERIC se considera que puede ser multifactorial, involucrando muchos virus y bacterias. 10 Los agentes infecciosos que se consideran que son los mayores causantes patógenos de ERIC son los parainfluenzavirus caninos (CPIV)-(Binn et al, 1967), adenovirus canino tipo 2 (CAV-2) (Ditchfield et al, 1962), y herpesvirus canino (CHV) (Karpas et al, 1968 a y 1986b), coronavirus respiratorio canino (CRCV) (WO 2004/011651 (The Royal Veterinary Collage) y Erles et al, 2003) y la bacteria Bordetella Bronchiseptica (B. bronchiseptica) (Bemis et al, 1977a Keil et al, 1998). 15

Estos virus y bacterias han sido frecuentemente aislados durante los brotes y han sido mostrados para causar los síntomas respiratorios o lesiones de pulmón en infecciones experimentales (Appel y Percil 1970, Swango et al, 1970, Karpas et al, 1986b).

También, reovirus humanos y especies micoplasmáticas han sido aisladas de perros con síntomas de ERIC (Lou y Wenner 1963, Randolph et al, 1993). Además, factores como el estrés pueden ser importantes. 20

B. bronchiseptica fue descubierta como un agente primario etiologico en la enfermedad respiratoria “tos de las perreras” (Bemis et al, 1977b y Thompson et al, 1976). Ello predispone que los perros sean influenciados por otros agentes respiratorios y frecuentemente existe al mismo tiempo con ellos. La tos de las perreras puede reproducirse por un cambio virulento de B. bronchiseptica. Además, los factores medioambientales tales como frío, aire, y alta humedad, típicas condiciones en perreras, incrementan la susceptibilidad a la enfermedad (Ejlis et al, 25 2001). Los antibióticos son generalmente reconocidos como agentes pobres para tratar la enfermedad primaria (Ellis et al, 2001). En contraste, la inmunopropilaxis para B. bronchiseptica proporciona una eficacia relativa media para ayudar al control de esta enfermedad.

Los síntomas externos de la infección de B. bronchiseptica es una tos seca, violenta, la cual es agravada por la actividad o excitación. La tos ocurre en paroxismos, seguida de arcadas para intentar limpiar pequeñas 30 cantidades de mocos de la garganta. La temperatura corporal puede ser elevada a medida que tiene lugar una invasión secundaria bacteriana. Como la tos de las perreras es altamente contagiosa, la enfermedad puede ser rápidamente transmitida a perros susceptibles y produce una severa tos. Los más importantes signos salen al principio de dos a cinco días después de la infección, pero puede continuar en periodos ampliados. El stress, particularmente en condiciones medioambientales adversas, podría causar una recaída durante etapas posteriores 35 de la enfermedad.

La tos de las perreras es típicamente una condición de vías respiratorias superiores y caracterizadas por secreción nasal y tos. Mientras que la tos de las perreras implica cambios en las vías respiratorias superiores, la patología ERIC indica que está involucrada en los daños al pulmón y, el algunos casos, bronconeumonía. La tos de las perreras es un síndrome más suave que ERIC y no tiene el ancho rango de patología descrita en ERIC. ERIC es 40 también distinguido por un incremento en la severidad y mortalidad.

ERIC es un síndrome en perros que se presenta con signos respiratorios en un rango que va desde una enfermedad suave hasta la muerte. Se caracteriza por involucrar en la enfermedad las vías respiratorias superiores e inferiores con una progresión de patología desde inflamatoria hasta exudativa, edematosa y algunas veces hemorrágica que puede extenderse dentro del tejido pulmonar. ERIC puede también ocurrir en ausencia B. 45 bronchiseptica, y en efecto algunos perros contraen ERIC al tiempo que no tienenes B. bronchiseptica detectable, la cual indica que la tos de las perreras y ERIC son distintas infecciones.

Nosotros también hemos confirmado la asociación de B. bronchiseptica con las enfermedades respiratorias mientras que se concluye que otros agentes están involucrados en las enfermedades respiratorias (Chalker et al, 2003). 50

Nosotros ahora hemos demostrado que el Streptococcus equisug especies zooepidemicus (vea ejemplo 1), Micoplasma cynos (vea ejemplo 2), y un Chlamydophila (vea ejemplo 3), están asociados con ERIC. Como todos los perros en nuestro estudio de población fueron vacunados contra CPIV y CAV-2, no teníamos nuevos datos para apoyar la implicación de estos virus en el ERIC. Sin embargo hemos encontrado un incremento en la prevalencia del herpesvirus canino en peros con síntomas de respiración graves (vea ejemplo 4). 55

El Streptococcus equi sub especies zooepidemicus (S. zooepidemicus) es un patógeno oportunista el cual es aislado frecuentemente de una variedad de animales huéspedes, no solo de caballos. Es a menudo encontrado como un comensal de las vías respiratorias superiores en la extensión de las mucosas de mamíferos (Timoney el al, 1998; Quinn et al, 1999) y ha sido asociado con múltiples síndromes de enfermedades incluyendo la enfermedad de

las vías respiratorias inferiores, neumonía de potro y cervicitis en caballos (Chanter, 1997; Biberstein y Hirsh, 1999), neumonía en llamas (Biberstein y Hirsh, 1999), septicaemia y artritis en cerdos (Timoney, 1987), mastitis en vacas y cabras (Timoney et al, 1988), septicaemina en aves de corral, pericarditis y neumonía en ovejas (Timoney, 1987), limphadenitis en cobayas (Quinn el al, 1999), glomerulonefritis en humanos (Balter el al, 2000) y meningitis en humanos (Ural et al, 2003). En perros, la S. zooepidemicus ha sido asociada con infecciones cruzadas y septicaemia 5 (Quinn et al, 1999) y neumonía hemorrágica necrótica aguda (Garnett el al, 1982).

Aunque los perros en sus últimas etapas de neumonía hemorrágica estreptococica (NHE) comparte algunas características histológicas con perros con ERIC, este no es el caso en sus etapas iniciales (vea Chalker et al, 2003) y los trombos sépticos están presentes en NHE (Garnett el al, 1982). NHE tiene una rápida aparición que era mortal en la mayoría de los casos sin signos clínicos, donde el ERIC solo lo vimos como una aparición lenta con amplio 10 rango de signos clínicos desde mucosidad nasal, tos, estornudos, arcadas, inapetencia, neumonía y bronconeumonía.

Mycoplasma cynos (M. cynos) ha estado asociada con la infección del conducto urinario canino (Jang et al, 1984). Ello ha sido identificado en los pulmones de un perro con el moquillo (Rosendal, 1978), y la inoculación endobronquial de M. cynos fue encontrada para inducir neumonía en perros (Rosendal & Vinther, 1977). 15

El moquillo canino descrito por Rosendal (1978) es una compleja enfermedad seguida de una infección con el virus de moquillo canino, varias especies de mycoplasma y la bacteria Pseudomonas. Esto es una combinación poderosa de desafíos microbianos y, no sorprendentemente, resulta en neumonía. La proporción de la patología se debe al Mycoplasma spp, y no fue claro. Posteriormente al desafío con m. cynos fue caracterizado sin ninguna señal de enfermedad en los perros aunque algunas lesiones inflamatorias locales pequeñas fueron halladas en 4 de cada 20 5 perros inoculados. La significancia de M. cynos en este síndrome fue, como Rosendal lo planteó, “dificultad para evaluar”.

Las especies de Chlamydophila asociadas con ERIC están muy relacionadas con Chlamydophila abortus (C.abortus) por comparación de la secuencia de 218 nucleótidos en los 23 genes de ARNr. La secuencia de nucleótidos de esta región en estas especies de Chlamidophila (SEQ ID NO: 1) es idéntica en más del 99% para el 25 C.abortus, 98.6% idéntico para el Chlamydophila psittaci y 96.3% idéntico para el Chlamydophila felis.

La especie de Chlamydophila fue identificada en la tráquea y los pulmones de los perros con ERIC. En contraste, la infección con C. abortus está tipicamente asociado con desordenes reproductivos, a menudo liderando abortos no deseados, especialmente en ovejas. C. abortus no ha sido previamente descrito como una infección respiratoria en perros. 30

Hay pocas publicaciones que tratan de especies de Chlamydiae infecciosas en perros, y con lo cual muy pocas son conocidas de la diversidad de las especies Chlamydiae caninas. Recientemente, la Chlamydia pneumoniae (C. pneumoniae) ha estado asociado con la atroesclerosis en perros (Sako et al, 2002). Un no identificado Chlamydophila spp ha sido también identificada en un perro con poliartritis septico (Lambrechts et al, 1999). 35

C. psittaci ha sido previamente aislada en las heces, cerebro, hígado, bazo, riñón y tejido pulmonar de perros de casa (Asizmendi et al, 1992; Fraser et al, 1985 y Gresham et al, 1996). Estudios han demostrado que el 20% de la población de las mascotas caninas en Alemania y 10% en Japón han sido expuestos a anticuerpos elevados de Chlamydiaceae (Perth et al, 1987 y Fukushi el al, 1985). El predominio de C. psittaci en perros seropositivos en Gran Bretaña es desconocido (Gresham et al, 1996). Los perros infectados con C. psittaci podría 40 desarrollar infecciones crónicas sub-clinicas, atroesclerosis, artritis, conjuntivitis o incluso enfermedades respiratorias (Gresham et al, 1996, y Store 1988). Gresham et al, (1996) aislado C. psittaci de un perros con síntomas de enfermedad respiratoria aunque estos síntomas no eran tan severos como en ERIC. Ello sugiere que los perros podrían estar en reserva potencialmente y, con lo cual, importante en la epidemiología de infecciones humanas de Chlamydiae (Gresham et al, 1996; Perth 1989). Hay sólo un caso documentado de aislamiento en el cultivo celular 45 de C. psittaci de un perro naturalmente infectado (Arizmendi et al, 1992), y un caso de aislamiento de perros infectados experimentalmente (Young et al, 1972).

Las vacunas están disponibles contra algunos agentes infecciosos asociados con ERIC, nombrado B. bronchiséptica tan bien como CPIV y CAV-2. Sin embargo, a pesar del uso de estas vacunas, ERIC es todavía prevalente en el mundo de las perreras, lo cual es posible debido a que las vacunas no proporcionan protección 50 contra todos los agentes infecciosos involucrados en ERIC.

Un primer aspecto de la invención de este modo proporciona una composición de la vacuna para la vacunación de perros que comprende:

(a) un agente capaz de elevar la respuesta inmune en un perro contra S. zooepidemicus; y

(b) un agente capaz de elevar la respuesta inmune en un perro contra M. cynos; 55

como se define en la reivindicación 1.

Por un agente capaz de elevar la respuesta inmune en un perro contra un organismo particular, incluimos el significado de que cuando es administrado a un perro que no es inmunocomprometido o inmunosuprimido, el agente

induce a la inmunidad del sistema del perro produciendo anticuerpos los cuales se unen específicamente al organismo. De esta manera, el agente es capaz de inducir una respuesta inmune protectora contra un organismo en particular.

Es preferible, que el anticuerpo de esta manera producido específicamente, se una al organismo particular con una gran afinidad que por cualquier otra molécula en el individual. Preferentemente, el anticuerpo se une al 5 organismo en particular con al menos 2, o al menos 5, o al menos 10, o al menos 50 veces con una mayor afinidad que otra cualquier molécula individual. Es más preferible que el anticuerpo una el organismo particular con al menos 100, o al menos 1.000, o al menos 10.000 veces una mayor afinidad que para cualquier molécula en el individual.

Por un agente capaz de elevar una respuesta inmune en un perro contra un organismo particular, hemos incluido el significado que, cuando se le administró al perro el cual no es inmunocomprometido o inmunosupresivo, el 10 agente induce al sistema inmune del perro a producir anticuerpos los cuales se unen específicamente a macromoléculas como proteínas que son secretadas desde el organismo. Los anticuerpos podrían unir específicamente la macromolécula secretada como una toxina o hemolisina, e hincarla, además de reducir los cambios patogénicos en el huésped y la severidad de la enfermedad, de esta manera permitiendo que el huésped supere la infección en el huésped. De esta manera, a través de un agente capaz de elevar una respuesta inmune en 15 un perro contra un organismo particular, nosotros incluimos a los agentes los cuales son capaces de elevar una respuesta inmune que parta del organismo como una macromolécula secretada.

Típicamente, un agente capaz de elevar una respuesta inmune contra S. zooepidemicus en un perro comprende la inactividad o el atenuado S. zooepidemicus, o un fragmento inmunogénico de S. zooepidemicus, o un ácido nucleótido encodificando dicho fragmento. 20

Streptococcus eque sub species zooepidemicus ha sido depositado en NCTC (Depósito nº4676. S34), el ATCC (Depósito nº43079) y la Nacional Collection of Dairy Organims (NCDO) (Depósito nº1358), y es descrito por Farrow et al (1984).

Por un componente “inactivo” de una vacuna, nosotros incluimos el significado que la composición de la vacuna en particular, tal como una bacteria, micoplasma o virus, ha sido tratada de tal manera para eliminar su 25 capacidad para causar la enfermedad, pero todavía mantiene su habilidad para provocar la inmunidad protectiva. Por un componente de vacuna “inactivado” nosotros incluimos un organismo destructor.

Métodos para la inactivación y destrucción de organismos como bacterias, mycoplamas y virus para el uso en una vacuna son bien conocidos en la técnica, y han sido usados, por ejemplo, en la preparación de algunos de los componentes para vacunas de perro descritas abajo. 30

Hay muchos métodos para la desactivación de microorganismos por preparaciones de vacunas. El método más simple es la destrucción por calor (por ejemplo, calentando los virus a 58ºC durante 30 minutos, hirviendo la bacteria por 5 minutos o calentando a 65ºC durante una hora) o destruyendo por mezcla con formalina. Tu puedes también destruir microorganismos con una variedad de otros compuestos químicos, o tratándolos con luz ultravioleta.

Por un componente “atenuado” de una vacuna, nosotros incluimos el significado que un componente 35 particular de la vacuna, tal como la bacteria, micoplasma o virus, ha sido seleccionado o tratado de otra manera en tal forma que disminuya en gran medida su capacidad para causar la enfermedad pero todavía retenga su capacidad para provocar una inmunidad protectora.

Métodos para la atenuación de organismos como bacterias, mycoplasmas y virus para el uso en una vacuna son bien conocidos en la técnica, y han sido usados, por ejemplo, en la preparación de algunos 40 componentes para vacunas de perros descritas abajo.

Se pueden atenuar microorganismos a través de estancias prolongadas en una sedimentación diferente - por ejemplo en cultivos celulares para virus, y en un medio sólido o en un diferente huésped para bacterias, hasta que se nota una disminución en la virulencia. Alternativamente, se puede apuntar a la mutación o eliminar genes específicos en las bacterias las cuales están involucradas de esta manera a la limitación del potencial patogénico del 45 organismo, o mutar el organismo de modo que tenga un requerimiento especifico químico que no está presente en el animal huésped y así no puede multiplicarse y sobrevivir una vez en el huésped. La atenuación puede ser desarrollada en la bacteria con un tratamiento químico y un tratamiento de luz ultravioleta para causar las mutaciones indicadas en el genoma.

Un fragmento inmunogénico de S. zooepidemicus podría ser cualquier fragmento de S. zooepidemicus 50 capaz de elevar una respuesta protectora inmune en un perro, de esta manera cuando un fragmento inmunogenico de S. zooepidemicus es administrado al perro que no es inmunocomprometido o inmunosupresivo, induce al sistema inmune del perro a producir anticuerpos los cuales se unen a S. zooepidemicus.

Típicamente, el fragmento inmunogénico de un organismo en particular es un componente de la proteína de un organismo. A través de “un componente de proteína” de un organismo, nosotros incluimos el significado de una 55 proteína entera, o una porción de una proteína. Ello se aprecia en que el fragmento de proteína podría ser o no glicosilada. De esta manera, por “la proteína” incluimos también la glicoproteína. La secuencia de aminoácido de una glicoproteina se refiere a la secuencia del aminoácido del polipéptido DEL ESQUELETO / DEL EJE CENTRAL de la glicoproteina, independientemente del tipo, número, secuencia y posición de azúcares adjuntos a esto.

Las proteínas de S. zooepidemicus incluyen superficie celular de precursores proteínicas (Genbank Accesión Nos. AAA86832 y BAD00711), Cpn60 (Genbank Accesión nº AAM88472), M-like proteína (Genbank Accesión Nos. AAP33082, AAP33081, AAP33080, AAP33079, AAP22285, AAB92635, AAB92634, AAB92633, AAB92632, AAB92631, AAB92630, AAB92629, AAB92628, AAB92627, AAB92626, AAB92625, AAB92624, AAB92623, AAB92622, 2111310A y BAD00712), M-like proteína precursor (Genbank Accession No. AAD37432), M-5 like proteina Szp2 precursor (Genbank Accession No. AAF75674), M-like proteina Szp3 precursor (Genbank Accession No. AAF75675), M-like protein Szp4 precursor (Genbank Accession otros químicos, o por tratamiento con luz ultravioleta. No. AAF75676), la proteína similar a Streptococcus pneumoniae ORF5 (Genbank Accession No. BAB16041), la proteina putativa adhesina-ligando metálico (Genbank Accession No. CAB56710), factor inmunidad A zoocin (Genbank Accession No. AAC46073) y las proteínas Szp descritas por Walker et al (1998, 2003; incluyendo 10 Genbank Accession Nos. AAQ08488-AAQ08510).

Es preferible, que el fragmento inmunogénico de S. zooepidemicus, es una proteína estructural de S. zooepidemicus o una porción inmunogénica en sí. Más preferiblemente, el fragmento inmunogénico de S. zooepidemicus es una toxina secretada, o hemosilina, o una proteína adhesión/superficie, o una porción inmunogénica del mismo. 15

Las proteínas adicionales de superficie podrían ser aisladas de una bacteria como la S. zooepidemicus por métodos estándar conocidos de la piel de una persona en la técnica. Sambrook et al (2001) “Molecular Cloning a Laboratory Manual” 3ª edición, Sambrook et al (eds), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA, describe las técnicas de clonación bacterial que el mundo usa para este propósito.

Si el agente capaz de elevar una respuesta inmune en un perro es un componente de un organismo, como 20 una proteína, ella podría ser aislada de un cultivo del organismo. Es preferible, que las proteínas fabricadas por expresión de un adecuado ADN constructivo codifica la proteína usando la tecnología de ADN recombinante.

Técnicas adecuadas para la clonación, manipulación, modificación y expresión de ácidos nucleicos, y purificación de las proteínas expresadas, son bien conocidas en la técnica y son descritas por ejemplo en Sambrook et al (2001), incorporadas aquí en la referencia. 25

Alternativamente, las proteínas podrían fabricarse usando técnicas químicas proteínicas, por ejemplo usando una proteolisis parcial de proteínas aisladas (también exoliticamente o endoliticamente) o por sistemas de novo. Los péptidos podrían ser sintetizados por el Fmoc-poliamida hecha de la síntesis de una fase sólida como se describe en Lu et al (1981) J. Org, Chem. 46, 3433 y referencias del mismo.

Un agente capaz de elevar la respuesta inmune en un perro contra un organismo podría ser “un derivado” 30 de un fragmento inmunogénico de un organismo, por el cual nosotros incluimos el significado de proteína, o porción de proteína, la cual ha sido modificada desde la forma en la cual está naturalmente presente en el organismo, pero el cual retiene la habilidad de elevar una respuesta inmune en el perro, tal como la habilidad de inducir a la producción de anticuerpos que se unen específicamente al organismo.

Por ejemplo, una derivada podría incluir una variedad de secuencia de la proteína o porción de la misma la 35 cual podría ser usada para inducir a la producción de anticuerpos los cuales se unen específicamente a ese organismo. Típicamente, las substituciones de aminoácido son hechas para mejorar la antigenicidad de la vacuna. Preferiblemente, la variación de la secuencia es al menos 90% o al menos 91% o al menos 92%, o al menos 93%, o al menos 94% o al menos 95% idéntica a la secuencia original de la proteína o parte de la misma. Se prefiere más que la variación de la secuencia sea al menos 96%, o al menos 97%, o al menos 98% o al menos 99%, o al menos 40 99.5% idéntica a la secuencia original de la proteína o parte de la misma.

El porcentaje de la identidad de la secuencia entre dos polipéptidos podría determinarse usando adecuados programas de ordenador, por ejemplo GAP de la University of Wisconsin Genetic Computing Group. El porcentaje de identidad entre dos nucleótidos o dos secuencias de aminoácidos podrían determinarse usando GCG versión 10 (Genetics Computer Group, (1991)), Program Manual para el GCG Package, Versión 7, April 1991, 575 Science 45 Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711). Los parámetros de GCG usados pueden ser: penalización por creación de gap 50, penalización por extensión de gap 3 para el ADN, penalización por creación de gap 8 y penalización por extensión de gap 2 por la proteína. El porcentaje de identidad entre dos nucleótidos o dos secuencias de aminoácidos podrían determinarse usando FASTA versión 34 (Pearson WR. (1990) “"Rapid and sensitive sequence comparison with FASTP and FASTA". Método Enzymol,;183:63-98). La posición de FASTA podría estar en 50 penalización de apertura de gap -16 y en penalización por extensión de gap -4.

Se apreciará que el porcentaje de identidad es calculado en relación a polipéptidos cuya secuencia ha sido alineada óptimamente.

La alineación podría llevarse a cabo alternativamente usando el programa W Clustal (Thomson et al., (1994) Nucleic Acids Res 22, 4673-80). Los parámetros usados podrían ser los que siguen: 55

Los parámetros de alineamiento de emparejamiento rápido: k-tuple (palabra) tamaño; 1, tamaño de ventana; 5, penalización de gap; 3, número de diagonales superiores; 5. Resultado del método: x por ciento.

Parámetros de alineamientos múltiples: penalización por creación de gap; 10, penalización por extensión de gap; 0.05. Resultado de la matriz: BLOSUM.

Típicamente, la variación de la secuencia tiene menos de 100, o menos de 50, o menos de 40, o menos de 30, o menos de 20 residuos de aminoácidos diferentes de la secuencia original de la proteína o parte de la misma. Más preferiblemente, la secuencia tiene 15 o 14 o 13 o 12 o 11 o 10 o 9 o 8 o 7 o 6 o 5 o 4 o 3 o 2 o sólo un residuo de aminoácido diferente de la secuencia original de la proteína o parte de la misma.

La secuencia de la derivada podría haber sido alterada para aumentar la inmunogenecidad del agente o 5 podría no tener efecto en su inmunogenecidad. Por ejemplo, la derivada podría haber tenido una o más secuencias de aminoácidos que no son necesarios para eliminar la inmunogenecidad.

Por “derivativa” incluimos péptidos en los cuales uno o mas de un residuo de aminoácido son químicamente modificados, antes o después de que el péptido sea sintetizado, proporcionando la función del péptido, nombrado la producción de anticuerpos específicos en vivo, continuando substancialmente no cargados. Tales modificaciones 10 incluyen la formación de sales con ácidos o bases, orgánicos especialmente aceptables fisiológicamente o ácidos o bases inorgánicas, formando un ester o amida de una grupo carboxil terminal, y unido al aminoácido protector de grupos como N-t-butoxicarbonil. Tales modificaciones podrían proteger el péptido del metabolismo en vivo. Los péptidos podrían estar presentes como copias simples o múltiples, por ejemplo una repetición de tandem. Tal tandem o múltiples repeticiones podrían se suficientemente antigenicos ellos mismos para obviar el uso de un 15 portador. Ello podría ser ventajoso para el péptido que se forma en forma de un rizo, con unos extremos N-terminal y C-terminal que se unen juntos, o se añaden uno o más residuos Cys en el extremo para aumentar la antigenecidad y/o para permitir que las uniones de sulfuro sean posibles. Si el péptido es unido covalentemente a un portador, preferiblemente un polipéptido, entonces el encuentro es preferiblemente tal que el péptido de la invención forma un rizo. 20

En relación a las actuales teorías inmunológicas, la función del portador debería estar presente en cualquier formulación inmunogénica para estimular o aumentar la estimulación del sistema inmune. Ello se piensa que los mejores portadores que expresan (o, juntos con el antígeno, crea) un epítopo celular-T. Los péptidos podrían asociarse, por ejemplo por cross-linking, con un portador de separación, como suero de albúminas, mioglobinas, bacterias toxoides y hemocianina de lapa ojo de cerradura. Más recientemente los portadores desarrollados los 25 cuales inducen a ayudar a la célula-T en la respuesta inmune, incluye el núcleo del antígeno de la hepatitis-B (también llamada proteína nucleocapside), epítopos supuestos célular-T, beta-galactosidasa y el péptido 163-171 de interleukina-1. El último componente se puede considerar como un portador o como adyuvante o como ambos. Alternativamente, muchas copias de el mismo o diferentes péptidos de la invención podrían ser entrecruzados a otro; en esta situación no hay separación del portador, pero tal función del portador podría proporcionarse por cross-30 linking. Agentes adecuados de cross-linking se incluyen en esta lista como en los catálogos Sigma y Pierce, por ejemplo glutaraldehido, carbodiimida y succinimidil 4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato, el último agente aprovechando el grupo –SH en el residuo C-terminal de cisteína (si está presente).

Si el péptido es preparado por expresión de una secuencia de nucleótido adecuado en un huésped adecuado, entonces puede ser ventajoso expresar el péptido como un producto de fusión con una secuencia de 35 péptido la cual actúa como un portador. El sistema Kabigen´s “Ecosec” es un ejemplo de tal disposición.

Típicamente, la codificación del polinucleótido de la fracción inmunogénica de S. zooepidemicus codifica una proteína estructural, y más preferiblemente una superficie de proteína de S. zooepidemicus, o una porción inmunogénica de la misma. Las secuencias de polinucleótidos codificadoras de varias proteínas de S. zooepidemicus pueden ser establecidas en referencia al Genbank Accession Nos. mencionado anteriormente. Sin 40 embargo, la secuencia de polinucleótido codificadora de cualquier proteína inmunogénica de S. zooepidemicus puede ser determinada por técnicas estándar de biología molecular.

Típicamente, un agente capaz de elevar una respuesta inmune contra M. cynos en un perro se compone de M. cynos inactivada o atenuada, o un fragmento de M. cynos inmunogénico o un ácido nucleico codificador de dicho fragmento. 45

Mycoplasma cynos siendo depositado en NCTC (Deposit n. 10142H831) y en el ATCC (Deposit no. 27544) y es descrito por Rosendal (1972).

Preferiblemente, el fragmento inmunogénico de M. cynos es una proteína estructural de M. cynos o una porción inmunogénica de la misma, y más preferiblemente, una proteína de superficie de M. cynos o una porción inmunogénica de la misma. Las proteínas de superficie pueden ser aisladas de un micoplasma tal como M. cynos 50 por métodos estándar conocidos par una persona con conocimiento de la técnica.

Métodos para la identificación e aislamiento de las proteínas de micoplasma son generalmente los mismos para una bacteria experto que algunos genes requieren vectores especializados que reconocen el uso el único codón de mycoplamas (vea todos los capítulos en la Sección B, en Genome Characterisation and Genetics, In Molecular and Diagnostic Procedures in Mycoplasmology. Vol 1 Ed S. Razin & J. Tully. Academia Press Inc. 1995). 55

Las vacunas más eficaces de micoplasma tienden a contener una vacuna de célula entera inactivada por calor o formalina o viva atenuada, y en consecuencia conteniendo todas, o al menos la mayoría, de sus proteínas. Los componentes de micoplasma potenciales para el uso como vacunas incluyen proteínas como proteínas de membrana de estructura unida primaria, que se cree está entre 45kDA (equivalente a P1 citadhesina de M. pneumoniae y homólogas tal que MgPa de M. genitalium los cuales están en todas partes de el operón de tres 60

genes), superficie expuesta a las proteínas y otras proteínas unidas, membrana glicolípidas, fracción de membrana polisacarida, lipogliconas y todas las mencionadas en las revistas de vacunas de micoplama animal (Barlie 1985 y Barile et al, 1985).

Para el uso de la vacuna, los agentes polinucleótidos pueden desarrollarse en varias replicaciones (vacunas recombinantes adenovirus) o vectores no replicantes (vacuna ADN). 5

Una dosis típica de una vacuna, se compone de proteína recombinante de unos 5-10 μg. Una típica dosis de vacuna de bacteria es 108 unidades de colonia formadas por ml.

Tipicamente, la composición de la vacuna se compone además de un portador aceptable farmacéuticamente, diluyente o adyuvante.

Ciertos portadores y adyuvantes son descritos arriba. Otros adyuvantes adecuados incluyen el completo o 10 incompleto adyuvante de Freund, dipéptido muramyl, los “Iscoms” de EP 109 942, EP 180 546 y EP 231 039, hidróxido de aluminio, saponina, dextran-DEAE, aceites neutros (como el migliol), aceites vegetales (como aceites de cacahuete), liposomas, polioles Pluronic® o el sistema adyuvante Ribi (ver, por ejemplo GB-A-2189 141).

El portador(es) debe ser “aceptable” en el sentido de ser compatible con el agente(s) de la invención y no nocivo para el receptor del mismo. Típicamente, los portadores serán agua o suero fisiológico las cuales serán 15 estériles y libres de pirógenos.

Típicamente, la vacuna será administrada vía oral, intramuscular, subcutánea, intravenosa, intraperitoneal o por ruta intranasal.

La composición de la vacuna podría ser formulada por administración parenteral, y podría incluir inyecciones de soluciones acuosas o no acuosas las cuales podrían contener antioxidantes, buffers, bacteriostatos y 20 solutos los cuales se administran e la formulación isotónica con la sangre del recipiente previsto; y/o suspensiones estériles acuosas o no acuosas las cuales podrían incluir agentes de suspensión y agentes espesadores.

La composición de la vacuna podría estar presente en contenedores unidosis o multidosis, por ejemplo en ampollas y viales selladas, y podrían estar almacenadas en condición de hielo-seco (liofilizado) requiriendo sólo la adición de un líquido portador estéril, por ejemplo agua para inyecciones, inmediatamente anterior a su uso. 25 Inyecciones de solución improvisadas y suspensiones podrían prepararse a partir de polvo, granulado o comprimidos.

La composición de la vacuna podría ser formulada por administración intranasal y podría desarrollarse convenientemente en forma de spray de aerosol presentándose en un contenedor presurizado, bomba, spray o nebulizador con el uso de un adecuado propulsor, como diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoro-etano, un hidrofluoroalcano tal como 1, 1, 1, 2-tetrafluoroetano (HFA 134ATM, o 1, 1, 1, 2, 3, 3, 3-30 heptafluorpropano (HFA 227 EATM), dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado, la dosis podría determinarse a través de una válvula para desarrollar un medidor de cantidad. El contenedor presurizado, bomba, spray o nebulizador podría contener una solución o suspensión del agente(s), usando una mezcla de etanol y el propulsor como el solvente, el cual puede contener adicionalmente un lubricante, como el trioleato sorbitano. 35

Para el uso veterinario, la vacuna es preparada como una formulación aceptable en relación con una práctica normal veterinaria el cirujano veterinario determinará el régimen de dosis y la vía de administración la cual será más apropiada para un animal en particular.

Formulaciones para vacunas adecuadas para la administración a perros son bien conocidas en la técnica e incluye las formulaciones usadas en vacunas de perros descritas debajo. 40

Como se describió arriba, la mayoría de los agentes virales y bacterianos conocidos se asocian a enfermedades respiratorias en perros, incluyendo coronavirus respiratorio canino (CRCV), virus parainfluencia canino (CPIV); adenovirus canino tipo-2 (CAV-2), herpesvirus (CHV), y Bordetella bronchiseptica (B. bronchiseptica).

Así, en una fabricación, la composición de la vacuna contiene además de uno más de:

(d) un agente capaz de elevar una respuesta inmune en un perro contra CRCV; 45

(e) un agente capaz de elevar una respuesta inmune en un perro contra CPIV;

(f) un agente capaz de elevar una respuesta inmune en un perro contra CAV-2;

(g) un agente capaz de elevar una respuesta inmune en un perro contra CHV; y

(h) un agente capaz de elevar una respuesta inmune en un perro contra B. bronchiseptica,

como se define en las reivindicaciones 3-8. 50

De este modo, la composición de la vacuna puede opcionalmente componerse de dos, o tres, o cuatro, o todos los cinco de estos agentes adicionales.

El agente capaz de elevar una respuesta inmune en un perro contra CRCV se compone de CRCV atenuado o inactivo, o un fragmento de inmunogénico de CRCV, o un ácido nucleótido codificando dicho fragmento inmunogénico.

Fragmentos adecuados inmunogénicos de CRCV son descritos en WO 2004/011651 (The Royal Veterinary Collegue) y en Erles et al, 2003. Fragmentos adecuados inmunogénicos de CRCV incluyen las proteínas 5 superficiales Spike (S) y la hemoglutinina-estereasa (HE), la membrana glicoproteína (M), y la proteína nucleocápsida (N), o porciones inmunogénicas de la misma. Las proteínas Spike y HE tipo CRCV descritas en WO 2004/011651 podrían ser adecuadas como agentes que elevan una respuesta inmune contra CRCV. Relacionado con los coronavirus, como el coronovirus ovino y el coronavirus humano, y fragmentos inmunogénicos del mismo, podrían ser adecuados como agentes que elevan la respuesta inmune contra CRCV. 10

Típicamente, un agente capaz de elevar una respuesta inmune en un perro contra CPIV se compone de CHIV inactivo o atenuado, o un fragmento inmunogénico del mismo, o un ácido nucleico que codifica dicho fragmento inmunogénico.

Típicamente, un agente capaz de elevar una respuesta inmune en un perro contra CAV-2, se compone de CAV-2 atenuado o inactivo, o un fragmento inmunogénico del mismo, o un ácido nucleico que codifica dicho 15 fragmento inmunogénico.

El adenovirus canino tipo 1 causa hepatitis infecciosa; el adenovirus canino tipo 2 causa enfermedad respiratoria. Ello ha demostrado que CAV-1, proporciona una protección entrecruzada contra CAV-2 y viceversa. El agente que eleva una respuesta inmune en un perro contra CAV-2 podría contener o el CAV-1 o CAV-2, o un fragmento inmunogénico del mismo. Las vacunas descritas abajo contienen CAV-2 excepto EURICAN© DHPPi, el 20 cual no es específico al tipo de virus usado.

Agentes adecuados que elevan la respuesta inmune en un perro contra CPIV y CAV-2 son conocidos para la persona especializada en la técnica. Por ejemplo, las siguientes vacunas son legales en GB.

KAVAK® DA2PiP69 de Fort Dodge Animal Health es una vacuna viva seca fría que contiene cepas de virus de moquillo, adenovirus canino tipo 2, parainfluencia canina tipo 2 y parvovirus canino cultivados en tejido celular. 25

KAVAK® Parainfluenza de Fort Dodge Animal Health contiene una vacuna viva seca fría derivada de una cepa atenuada de virus parainfluenza canica tipo 2 cultivada en una línea celular homóloga establecida.

NOBIVAC® DHPPi de Intervet UK Limited es una viva atenuada seca-fría, vacuna de virus conteniendo el virus canino del moquillo, adenovirus canino tipo 2, parvovirus canino y vius parainfluenza cultivado en la línea de cultivo celular. 30

NOBIVAC® KC de Intervet UK Limited es una vacuna viva seca-fría que contiene Bordetella bronchiseptica cepa B-C2 y cepa de virus canino parainfluenza Cornell (esto es una vacuna intranasal). El número de autorización de gestión VM 06376/4026.

EURICAN® DHPPi de Merial Animal Health Ltd, es una vacuna combinada viva seca-fría contra el moquillo canino, hepatitis infecciosa canina, parvovirus canino y virus canino parainfluenza tipo 2. 35

VANGUARD® 7 de Pfizer Ltd, contiene el virus de moquillo canino vivo atenuado (cepa Snyder Hill), virus parainfluenza (cepa NL-CPI-5), parvovirus canino (NL-35-D) propagado en la línea celular establecida, y un cultivo inactivado de Leptospira canicola y Leptospira icterohaemorrhagiae.

QUANTUM® DOG 7 de Scherin-Plough Animal Health contiene el moquillo canino, adenovirus tipo 2, parvovirus, vacuna virus parainfluenza tipo 2(viviente) e Leptospira canicola inactivada y vacuna de Leptospira 40 icterohaemorrhagiae.

CANIGEN DHPPi de Virbac Ltd, es una viva atenuada, seca-fría, vacuna de virus conteniendo el virus canino del moquillo, adenovirus canino (CAV-2), parvovirus canino y virus parainfluenza canino crecido en la línea celular del cultivo celular.

CANIGEN Ppi de Virbac Ltd es una viva atenuada, vacuna viral fría-seca conteniendo virus parvovirus 45 canino y virus parainfluenza canino crecido en la línea celular del cultivo celular.

El agente capaz de elevar una respuesta inmune en el perro con el CHV se compone de CHV inactivado o atenuado, o un fragmento inmunológico del mismo, o ácido nucleico que codifica una respuesta inmune.

Los agentes adecuados que elevan una respuesta inmune en un perro contra CHV son conocidos para una persona con conocimientos en la técnica. Por ejemplo, EURICAN Herpes 205 de Merial es una sub-unidad de 50 vacuna purificada contra CHV la es indicada para la inmunización activa de perras preñadas para prevenir la mortalidad, signos clínicos y lesiones en cachorros resultante de infecciones CHV adquiridas en los primeros días de vida. Ello no está autorizado para una vacuna de perros adultos para la prevención de enfermedades respiratorias.

El agente capaz de elevar una respuesta inmune en un perro contra B. bronchiseptica se compone de B. bronchiseptica activado o atenuado, o un fragmento inmunológico del mismo, o un ácido nucleico que codifica dicho fragmento inmunológico.

Agentes adecuados que elevan la respuesta inmune en un perro contra B. bronchiseptica son conocidos por personas especializadas en la técnica. Por ejemplo, las vacunas siguientes en los perros son autorizadas para el 5 uso.

COUGHGUARD-B® de Pfizer Animal Health (U. S. Vet. Lic. No.:189) contiene un cultivo inactivo de B. bronchiseptica. Esto es para la inmunización de la salud de los perros contra la enfermedad causada por B. bronchiseptica, en particular la tos de las perreras. COUGHGUARD-B® es preparada de una cepa fuertemente antigénica de B. bronchiseptica la cual ha sido inactivada y procesada par ser no tóxica cuando se le administra a los 10 perros. En los métodos de producción se informa del abandono de propiedades inmunológicas de B. bronchiseptica se quedan intactas.

VANGUARD*5/B de Pfizer Animal Health (U. S. Vet. Lic. No.:189) contiene cepas atenuadas de virus del moquillo canino (CDV), CAV-2, CPIV, y parvovirus canino (CPV) propagado en una línea celular establecida. El antígeno (CPV) fue atenuado por paso bajo en la línea celular canina y a ese nivel de paso tiene propiedades 15 inmunológicas capaces de aumentar anticuerpos maternales. La vacuna es empaquetada en forma liofilizada con un gas inerte en lugar de vacío. El componente de la bacteria contiene cultivos enteros de B. bronchiseptica la cual se suministra como diluyente del componente de B. bronchiseptica en VANGUARD® 5/B y se prepara de una cepa altamente antigénica la cual ha sido inactivada y procesada para ser no tóxica cuando se administra en perros. `

NASAGUARD-BTM de Pfizer Animal Health (U. S. Vet. Lic. No.:112) está compuesto de un cultivo vivo de 20 avirulento de la bacteria B. bronchiseptica.

PROGARD®-KC de Intervet es una vacuna intranasal modificada que contiene virus atenuado parainfluenza canino y cultivo vivo avirulento de Bordetella bronchiseptica. PROGARD®-KC es presentado en forma disecada con un diluyente estéril proporcionado por reconstitución. PROGARD®-KC es para la vacunación de la salud, para cachorro y perros susceptibles para prevenir la traqueobronquitis infecciosa canina (“tos perruna”) debido 25 al virus parainfluenza canina y B. bionchiseptica.

PROGARD®-KC PLUS de Intervet contiene cultivo vivo de cepas avirulentas de B. bronchiseptica, adenovirus canino atenuado tipo 2 y virus parainfluenza para administración intranasal. La vacunación con PROGARD®-Kc Plus estimula rápido, inmunidad local en el tracto respiratorio, de ese modo, la inhibición de la infección en el puerto de entrada para prevenir síntomas clínicos. Además de la inmunidad local, esta también 30 estimula a la inmunidad sistemática dentro de tres semanas de la administración intranasal. El pequeño volumen (0.4 ml) y la aplicación por el agujero de la nariz de PROGARD®-KC Plus, proporciona para cada vacunación, particularmente en pequeñas razas y jóvenes cachorros. PROGARD®-KC Plus es presentado en una forma disecada con un diluyente estéril para proporcionar la reconstitución. PROGARD®-KC Plus es para la vacunación de la salud de perros y cachorros de tres semanas de edad o mayores para prevenir la traqueobronquitis canina 35 infecciosa (“tos perruna”) debido a adenovirus canino tipo 2, virus parainfluenza y B. bronchiseptica.

Intrac de Intervet es una vacuna viva modificada fría-seca, conteniendo la cepa B. bronchiseptica S 55, por administración intranasal. El número de licencia del producto PL 0201/4011.

Nobivac® KC, descrita arriba, también contiene B. bronchiseptica.

En una fabricación preferida, la composición de la vacuna consta de: 40

(a) un agente capaz de elevar una respuesta inmune contra S. zooepidemicus en un perro;

(b) un agente capaz de elevar una respuesta inmune contra M. cynos en un perro; y

(d) un agente capaz de elevar una respuesta inmune contra CRCV en un perro.

Donde cada uno de los agentes (a), (b), y (d) están definidos arriba.

En otra fabricación preferida, la composición de la vacuna consta de: 45

(a) un agente capaz de elevar una respuesta inmune contra S. zooepidemicus en un perro; y

(b) un agente capaz de elevar una respuesta inmune contra M. cynos en un perro;

(d) un agente capaz de elevar una respuesta inmune contra CRCV en un perro; y en cualquiera o más de:

(e) un agente capaz de elevar una respuesta inmune contra CPIV en un perro;

(f) un agente capaz de elevar una respuesta inmune contra CAV-2 en un perro; 50

(g) un agente capaz de elevar una respuesta inmune contra CHV en un perro; y

(h) un agente capaz de elevar una respuesta inmune contra B. bronchispetica en un perro,

donde cada uno de los agentes de (a) a (b) están definidos arriba.

De esta manera se aprecia que los agentes (a), (b) y (d), la composición puede contener cualquier de los dos agentes, €, (f), (g) y (h), o cualquier tres, o cuatro, o todos los cinco agentes, (e), (f), (g), y (h).

La invención proporciona el uso de una composición de la vacuna como se detalla en el primer aspecto de la invención en la preparación del medicamento para la vacunación de ERIC, o el tratamiento de ERIC en un perro. 5

La composición de la vacuna del primer aspecto de la invención podría ser útil para combatir el ERIC profilácticamente o terapéuticamente.

Un segundo aspecto de la invención proporciona el uso de:

(b) un agente capaz de elevar una respuesta inmune contra M. cynos en un perro; 10

en la preparación de un medicamento para la profilaxis o tratramiento de ERIC en un perro,

donde los agentes (a) y (b) están definidos arriba. En la fabricación, el medicamento además consta de uno o más de uno de:

(d) un agente capaz de elevar una respuesta inmune contra CRCV en un perro;

(e) un agente capaz de elevar una respuesta inmune contra CPIV en un perro; 15

(f) un agente capaz de elevar una respuesta inmune contra CAV-2 en un perro;

(g) un agente capaz de elevar una respuesta inmune contra CHV en un perro; y

(h) un agente capaz de elevar una respuesta inmune contra B. bronchiseptica en un perro;

donde cada uno de los agentes de (d) a (h) son como se definen arriba. En esto y en todos los aspectos subsecuentes de la invención, las preferencias de (a), (b), (d), €, (f), (g) y (h) están descritas respecto al primer 20 aspecto de la invención.

Un tercer aspecto de la invención proporciona el uso de

(b) un agente capaz de elevar una respuesta inmune contra M. cynos en un perro;

como se definió en el primer aspecto de la invención, en la preparación del medicamento para la estimulación de una 25 respuesta inmune contra dicho S. zooepidemicus y M. cynos en un perro.

En una fabricación, el medicamento además consta de uno o más de uno de:

(d) un agente capaz de elevar una respuesta inmune contra CRCV en un perro;

(e) un agente capaz de elevar una respuesta inmune contra CPIV en un perro;

(f) un agente capaz de elevar una respuesta inmune contra CAV-2 en un perro; 30

(g) un agente capaz de elevar una respuesta inmune contra CHV en un perro; y

(h) un agente capaz de elevar una respuesta inmune contra B. bronchiseptica en un perro,

como se definió arriba en el primer aspecto de la invención.

Un cuarto aspecto en la invención proporciona una composición que contiene:

(a) un agente capaz de elevar una respuesta inmune contra S. zooepidemicus en un perro; y 35

(b) un agente capaz de elevar una respuesta inmune contra M. cynos en un perro;

para usar como medicamento. Así, esta composición es empaquetada y presentada para su uso como un medicamento.

En una fabricación, la composición es para uso en medicina veterinaria. Así esta composición es empaquetada y presentada para uso como medicamento veterinario. 40

Típicamente, la composición para usarla en medicina veterinaria. Así la composición es empaquetada y presentada para el uso como un medicamento veterinario canino y es empaquetado y presentado para usarse en perros.

En una fabricación, la composición además consta de uno o más de:

(d) un agente capaz de elevar una respuesta inmune contra CRCV en un perro;

(e) un agente capaz de elevar una respuesta inmune contra CPIV en un perro;

(f) un agente capaz de elevar una respuesta inmune contra CAV-2 en un perro;

(g) un agente capaz de elevar una respuesta inmune contra CHV en un perro; y

(h) un agente capaz de elevar una respuesta inmune contra B. bronchiseptica en un perro, 5

como se definió arriba en el primer aspecto de la invención.

En una fabricación preferida de este aspecto, la composición consta de:

(d) un agente capaz de elevar una respuesta inmune contra CRCV en un perro, 10

como se define arriba en el primer aspecto de la invención.

En otra fabricación preferida de este aspecto, la composición consta de

(d) un agente capaz de elevar una respuesta inmune contra CRCV en un perro; y uno o más de: 15

(e) un agente capaz de elevar una respuesta inmune contra CPIV en un perro;

(f) un agente capaz de elevar una respuesta inmune contra CAV-2 en un perro;

(g) un agente capaz de elevar una respuesta inmune contra CHV en un perro; y

como se define arriba en el primer aspecto de la invención. 20

Así se aprecia que los agentes (a), (b) y (d), la composición puede contener cualquiera de dos de los agentes (e), (f), (g) y (h), o cualquier de tres, o cuatro, de todos los cinco agentes (e), (f), (g), y (h).

Un quinto aspecto de la invención proporciona un kit de partes para la composición de la vacuna de este primer aspecto de la invención, que comprende

(a) un agente capaz de elevar una respuesta inmune contra S. zooepidemicus en un perro; y 25

(b) un agente capaz de elevar una respuesta inmune contra M. cynos en un perro;

como se define arriba,

y opcionalmente un portador farmacéuticamente aceptable, diluyente o adyuvante.

En una fabricación, el kit contiene además uno o más de:

(d) un agente capaz de elevar una respuesta inmune contra CRCV en un perro; 30

(e) un agente capaz de elevar una respuesta inmune contra CPIV en un perro;

(f) un agente capaz de elevar una respuesta inmune contra CAV-2 en un perro;

(g) un agente capaz de elevar una respuesta inmune contra CHV en un perro; y

como se definió arriba en el primer aspecto de la invención. 35

En otra fabricación preferida de este aspecto, el kit contiene:

(d) un agente capaz de elevar una respuesta inmune contra CRCV en un perro; y uno o más de uno de:

(e) un agente capaz de elevar una respuesta inmune contra CPIV en un perro; 40

(f) un agente capaz de elevar una respuesta inmune contra CAV-2 en un perro;

(g) un agente capaz de elevar una respuesta inmune contra CHV en un perro; y

como se define arriba en el primer aspecto de la invención.

Ello se aprecia que estos agentes (a), (b) y (d), el kit podría contener cualquier de los dos agentes, (e), (f), (g) y (h), o cualquiera de los tres, o cuatro, o de todos los cinco de agentes, (e), (f), (g) y (h). 5

El listado o discusión de una primera publicación del documento en esta especificación no debería ser necesariamente tomado como un conocimiento en el que el documento es parte de la técnica o es de conocimiento general.

La invención ahora será descrita con más detalle con la ayuda de las siguientes figuras y ejemplos.

Figura 1: Aislamiento de S. canis y S. zooepidemicus de 229 perros de perrera con un resultado clínico 10 respiratorio (n = total de números de perros en cada grupo). Las barras de error representan intervalos de confianza (95%).

Figura 2: Porcentaje de perros con ERIC, S. canis o S. zooepidemicus con un tiempo en la perrera (n = total de números de perros en cada grupo de un total de 229 perros). Las barras de error representan intervalos de confianza (95%). 15

Figura 3: Porcentaje de perros con infección traqueal y pulmonar de M. cynos en niveles altos de severidad de ERIC.

Figura 4: Porcentaje de perros con infección traqueal y pulmonar de M. cynos después de aumentar la longitud del tiempo en las perreras.

Figura 5: secuencia parcial nucleótido 218 (SEQ ID NO:1) de gen 23S ARNr de Chlamydophila aislado de 20 un perro con ERIC (DHB10).

Figura 6: Porcentaje de perros con infección traqueal y pulmonar de Chlamydophila en niveles crecientes de severidad de ERIC.

Figura 7: secuencias de ARNr 23S parcial (DHB) alineada con ARNr 23S de todas las especies conocidas de Chlamydia y Chlamydophila (Cabor-C. Abortus, Cpsit-C.psittaci, Cfe.-C.felis, Ccavi-C. caviae, Cpne- 25 C.pneumoniae, Cpec-C.pecorum, Csuis-C. suis, Ctrac-C. trachomatis, Wad-Wad-dlia, Sim- Simkania).

Figura 8: secuencias parciales de nucleotido 218 (SEQ ID Nos:2-8) del gen ARNr 23S de además de siete especies aisladas de Chlamydophila aisladas de un perro con ERIC (DHB 2,4, 5, 6, 7, 8 y 9).

Figura 9: Porcentaje de perros con infección traqueal y pulmonar de herpervirus canino en niveles altos de la severidad de ERIC. 30

Ejemplo 1: La asociación de Streptococcus equi sub species zooepidemicus con enfermedad respiratoria infecciosa canina.

Resumen

La enfermedad respiratoria infecciosa canina (ERIC) es una infección multifactorial que afecta a la mayoría de los perros de perrera a pesar de el amplio uso de la vacunación. Las actuales vacunas apuntan a proteger contra 35 los agentes virales y un simple agente bacteriano, Bordetella bronchiseptica. Nosotros examinabamos el papel de las especies de estreptococos en ERIC. El aislamiento e identificación del estreptococo en el tracto respiratorio inferior de perros clínicamente sanos y aquéllos con ERIC eran usados para relacionar la presencia de especies específicas de estreptococos con la enfermedad respiratoria. Nosotros mostramos que la presencia de S. equi sub species zooepidemicus (S. zooepidemicus) está asociada al incremento de la severidad de la enfermedad en un 40 población de perros de perrera con ERIC endémica.

Introducción

ERIC es una infección que afecta a los perros de todas las edades y comúnmente ocurre cuando un gran número de perros son caseros junto un cercano confinamiento. La enfermedad tiene una alta morbosidad con la tos seca áspera característica de laringitis en sus etapas tempranas, secreciones nasales y/o oculares, y anorexia y 45 depresión variable, las cuales pueden evolucionar en traqueobronquitis, neumonía e incluso la muerte en la mayoría de los casos. La enfermedad ha sido historicamente considerada como una infección compleja en la que combinó un desafío secuencial con ambos virus (CPIV y CAV-2) y agentes bacterianos que producen un engrandecimiento sinergístico de los resultados clínicos (Appel y Binn, 1987). El agente bacteriano más común detectado durante la enfermedad es B. bronchiseptica (McCandlisn et al, 1978), pero otras especies como Pasteurella sp, Micoplasma sp, 50 y β-hemolitico estreptococo (βhS) han sido asociadas con esta enfermedad (McCandish et al, 1978; Rosendal, 1978; Thrusfield et al, 1991).

Muchos estudios involucrados en el aislamiento bacterial del tracto respiratorio superior (oral y cavidad nasal) e inferior (tráquea y pulmones) de ambos perros enfermos y sanos mencionan la presencia de βhS (Smith, 1967; McCandlish et al, 1978; McKiernan et al, 1982; Azetaka y Konishi, 1988). Sin embargo, a pesar de la variedad de especies de βhS encontradas en el tracto respiratorio superior de los perros, sólo unas pocas investigaciones están orientadas a las especies de βhS involucradas en las enfermedades de las vías respiratorias inferiores 5 (Garnett et al, 1982; Angus et al, 1997). Aunque especies de βhS en el tracto respiratorio canino fueron anotadas por Biberstein et al, (1980) este estudio descuidó la distinción entre el transporte en tracto respiratorio superior e inferior. Además, incluso aunque el aislamiento era de pacientes hospitalarios veterinarios, se omitió la razón para la derivación y por lo tanto un enlace a condiciones clínicas específicas. El más común βhS en perros, S. canis, un Grupo Lancefield G Streptococcus, es un normal comensal de la mucosa genital y respiratoria como en la piel 10 (Timoney, 1987; Quinn el al, 1999). Streptococcus canis (S. canis) ha sido previamente aislado de las amígdalas de 60 a 73% de los perros sanos (Smith, 1967; Sadatsune and Moreno, 1975; Biberstein y Hirsh, 1999). S. canis causa una variedad de infecciones esporádicas y oportunistas en perros, incluyendo la neumonía, septicema, flemas, otitis, mastitis, piometra, proctitis, síndrome de shock tóxico y fascitis necrotizante (Bibserstein y Hirsh, 1999, Quinn et al, 1999). 15

Además de S. canis βhS de otros Grupo Lancefield, tales como A, C, y E, han sido aislados de perros (Biberstein et al, 1980). S. zooepidemicus, Grupo Lancefield C, se encuentra como un comensal de las mucosas del tracto respiratorio superior de los mamíferos (Timoney et al, 1988; Quinn et al, 1999). Ello está asociado con diversos síntomas de enfermedades incluyendo enfermedades respiratorias inferiores, neumonía de potrillo y cervicitis en caballos (Chanter, 1997; Biberstein y Hirsh, 1999), neumonía en llamas (Biberstein y Hirsh, 1999), 20 septicemia y artritis en cerdos (Timoney, 1987), mastitis en vacas y cabras (Timoney et al, 1988), septicemia en aves de corral, pericarditis y neumonía en corderos (Timoney, 1987), linfadenitis en conejillos de indias (Quinn et al, 1999) y glomerulonefritis en humanos (Balter et al, 2000). En perros, S. zooepidemicus ha estado asociado con infecciones respiratorias, septicemia (Quinn et al, 1999) y neumonía hemorrágica necrósita aguda (Garnett et al, 1982). En este estudio, nosotros buscábamos establecer especies de βhS las cuales están presentes en el tracto 25 respiratorio de los perros sanos y en perro con ERIC.

Materiales y Métodos

Estudio de población y muestreo.

El principal estudio de población (n=209, lavado alveolar bronquial, LAB) se compone de animales de bien establecidos reacogidos de perreras (~600 perros) con una historia endémica de ERIC: en la entrada a la perrera, 30 todos los perros fueron vacunados con KAVAK DA2 PiP69 (Fort Dodge) una vacuna viva atenuada para el virus del moquillo, CAV-2, CPIV y parvovirus canino y KAVAK L contra Leptospirosis. La presencia de ambos coronavirus canino (CRCV) y B. Bronchiseptica ha sido demostrada en perros con ERIC en este centro (Chalker et al. 2003: Erles et al. 2003). Cada semana en esta perrera debía sacrificarse algunos perros por razones de bienestar y de esos perros 2-3 eran seleccionados arbitrariamente para el muestreo. Muestras de LAB fueron tomadas por el 35 siguiente método de un total de 209 individuos perrunos en un periodo de 2 años de 1999 a 2001. Dentro de las 2 horas de eutanasia, la tráquea fue sujetada justo por encima de la bifurcación para prevenir cualquier contaminación traqueal del pulmón durante el muestreo. Usando un catéter estéril y en un tubo de 50 ml, la solución de Sal Equlirada Hanks fue entonces emplazada en el lóbulo del pulmón izquierdo apical. Este lóbulo del pulmón fue masajeado manualmente durante 30 segundos y el LAB retirado. La eutanasia en perros era graduada por la 40 severidad de los resultados respiratorios clínicos en las siguientes características: (1) signos de no respiración, n=71 (2) Media tos, n=37 (3) Tos y segregación nasal, n=76 (4) Tos y segregación nasal con depresión y/o inapetencia n=9 (5) bronconeumonía supurativa, n=16.

Después del muestreo de LAB, una sección de tejido pulmonar del lóbulo derecho distal fue tomado por análisis histológico. Formalina fijaba (10% formalina salina) a los bloques de tejido que estaban incrustados en 45 parafina, y hemotoxilina estándar y secciones de eosina teñidas, que eran vistas bajo la luz del microscópio (X40, X100, X400). La presencia o ausencia de neutrófilos intra-alveolar era anotada.

El número total de días en el que cada perro permaneció en la perrera era grabado y el tiempo en la perrera era calculado en semanas. La edad y condición clínica a la entrada de la perrera de cada animal era anotada y el resultado de la composición de la condición clínica se basaba en el estatus nutricional, pelo, comportamiento, apetito 50 y examinación general clínica (temperatura, frecuencia cardiaca y pulmonar) era graduada como sigue: buena (1), pobre (2), muy pobre (3).

Una población adicional perruna fue incluida como un grupo de control que consistía en perros caseros con unos síntomas respiratorios clínicos referidos al diagnóstico bacteriológico de RVC por un periodo de 2 años (1998 a 2000) (n=71, LAB). Muestras del grupo de control fueron recogidas usando técnicas guías endoscópicamente como 55 descrbió Cocoran (1998). Todas la muestras en el estudio fueron guardadas a 4ºC hasta el test bacteriológico, y el testado fue desarrollado dende de 24 h del muestreo excepto el calculo de CFU por ml que fue desarrollado en LAB helado.

Aislamiento Bacteriano e Identificación.

Un volumen de 50 µl de LAB fue recubierto en duplicado en Columbia Blood Agar (Oxoid Ltd, Hampshire, 60 UK) con 5% de sangre de oveja e incubadas ambas aeróbicamente y anaeróbicamente durante 24 hrs a 37ºC. Las

colonias de β-hemoliticas fueron identificadas y purificadas en colonias individuales. Las bacterias gram-positiva catalasa-negativa fueron identificadas como streptococci por morfología celular y colonial, y entonces serogrupadas por aglutinación deslizante de cama de látex (Oxoid Ltd., Hampshire, UK) en Grupo Lancefields. Las aisladas fueron identificadas en especies de nivel de utilización biomédica y acción enzimática usando el kit de identificación manual API20STREP (bioMérieux UK Ltd, Basingtoke, UK). 5

Con el fin de detectar infecciones mixtas, 3 colonias de los primeros 12 perros en el estudio fueron examinados ambas por aglutinación deslizante de cama de látex y API20STREP. Las series de diluciones de LAB en sal buffer de fosfato (Sigma-Aldrich Co. Ltd, Dorset, UK) fueron emplacadas en triplicado, incubadas como se describe arriba y el UFC (unidad formadora de colonia) por ml de LAB calculado. Crecido el βhS era entonces graduado como sigue: ninguno (0), <100 UFC por ml (1), 100 a 1000 UFC por ml (2) y > 1000 UFC por ml (3). 10

Análisis Estadístico.

Un significativo nivel o probabilidad de un tipo de error 1 (α) de 0.05 fue asumido en todos los análisis. La presencia de S. zooepidemicus con edad, condición clínica a la entrada de la perrera, semanas en la perrera, la presencia de neutrofilos intra-alveolar y resultados respiratorios clínicos fueron analizados usando Prism (versión 3.0, GraphPad Software Inc, San Diego, USA) software de test estadístico de análisis X2. La correlación del crecimiento 15 de la bacteria y resultado respiratorio fue determinado por le uso de resultados principales combinados, analizados con Prism por una dirección ANOVA (no-paramétrico) test. La presencia de S. canis, Szooepidemicus y enfermedad respiratoria en las muestras de perros de perrera en tiempo de semanas también fue calculada.

Resultados.

Streptococci β-hemolítica fueron aisladas de ambas poblaciones de objeto de estudio, y el aislamiento de 20 LAB de mascotas caseras fue considerablemente diferente de los perros de perrera (1.4% perros casero, 23.9% perrera, X2 análisis ***p=0.000). Todas las hS aislados fueron encontrados de ser S. canis o S. zooepidemicus. Las infecciones mixtas con diferentes Grupos Lancefield o especies no fueron encontradas, además todas las placas individuales presentaron colonias de morfología uniforme. Ambas S. canis y S. zooepidemicus fueron aisladas de perros de perrera, mientras que una simple aislada de S. zooepidemicus y no S. canis fueron aisladas de mascotas 25 caseras. S. zooepidemicus fue encontrada para ser la especie predominante hS en los perros de perrera (92%). El transporte de ambas S. canis y S. zooepidemicus fue examinado en los perros de perrera dentro de cada grado de resultado respiratorio clínico (figura 1). S. canis fue presentado en ambos perros con y sin resultados clínicos, y el aislamiento no incrementó la severidad de la enfermedad. En contraste, los perros sanos eran menos propensos a tener S. zooepidemicus en el tracto respiratorio inferior que los animales enfermos (X2 análisis, **p=0.004) y el 30 aislamiento de S. zooepidemicus incrementó dramáticamente con el incremento del resultado clínico respiratorio, de 9.7 % en perros sin síntomas a 87.5% en perros con bronconeumonía supurativa (X2 análisis, ***p=0.000). Los perros con resultados respiratorios superiores eran más propensos a tener un mayor resultado de crecimiento de S. zooepidemicus que los perros clínicamente sanos (análisis ANOVA simple ***p=0.000. Rcuadrado= 0.194, F=22.265). La edad y condición clínica del animal a la entrada de la perrera no tuvo efecto en el aislamiento de S. 35 zooepidemicus (X2 análisis, edad p=0.341, condición clínica a la entrada p=0.295).

El porcentaje de perros con ERIC en la perrera se incrementó dramáticamente de 21.1% en la semana 1 a 70.1% en la semana 2, y ERIC no decreció en la población hasta después de la cuarta semana (Figura 2). Aunque la diferencia no significativa fue detectada, el número de perros con S. zooepidemicus en el pulmón incrementó de 20.6% en el tiempo de la perrera desde 16.7% en la semana 1 al 34.4% en la semana 3 (Figura 2), mientras tanto la 40 tendencia fue vista con S. canis.

Los análisis histológicos revelaron que los perros con S. zooepidemicus eran más probables a tener neutrofilia intra-alveolar que los que no tenían S. zooepidemicus (X2 análisis, **p=0.006). En perros con altos resultados bacterianos, supuraciones agudas o neumonías necróticas con moderado a marcado agregación macrófaga era a menudo anotada, similar a los encontrados de Garnett et al, (1982) en perros con S. zooepidemicus 45 que inducieron neumonía hemorrágica streptococcal (NHS). Las células no bacterianas eran aparentemente teñidas en seccioens H y E.

Discusión.

En este estudio nosotros lo orientamos a las especies de βhs presentes en el tracto respiratorio inferior de los perros caseros y los perros de perrera, con y sin enfermedad respiratoria. Aunque S. canis es la predominante 50 βhs del tracto respiratorio en perros (Biberstein et al, 1980) y fue aislado desde el tracto respiratorio inferior de algunos perros de perrera en este estudio, ello no fue asociado con ERIC en los perros de perrera. En contraste, un incremento del aislamiento de S. zooepidemicus fue asociado con el aumento de ERIC severo. Los perros con cualquier síntoma respiratorio eran más propensos a tener S. zooepidemicus en el tracto respiratorio inferior que los animales sanos en las perreras y S. epidemicus fue encontrado en una baja proporción de las mascotas de casa que 55 en los perros de perrera.

Streptococcus equi sub species zooepidemicus a sido previamente asociada con NHS en perros (Garnett et al, 1982). El síndrome de NHS era una severa infección en la colonia cercana de beagles, en las cuales de repente la muerte era seguida sin resultados clínicos primarios. En la necropsia se encontró abundantes exudaciones hemorrágicas dentro de la tráquea y las ramificaciones bronquiales, con pulmones enrojecidos oscuros difusivos. 60

Además, había hemorrágeas equimóticas de un rango de otros tejidos. La enfermedad era reproducida por inoculación intra-traqueal con S. zooepidemicus en un perro. Lo interesante de este estudio, perros con altos resultados de crecimiento de S. zooepidemicus eran más probables a neutrofilia intra.alveolar y comparten las características histológicas de los pulmones descritos en Garnett et al, (1982) en NHS que aquellos perros con bajos resultados en crecimiento. 5

ERIC ha sido históricamente considerada como una enfermedad compleja, involucrando ambos agentes bacterianos y virales. De hecho, muchos otros agentes han sido descritos en esta población de perro de perrera, incluyendo CRCV. (Erles et al, 2003) y B. bronchiseptica (Chalker et al, 2003). Aunque el potencial patogénico de CRCV no ha sido clarificado todavía, dato de Erles et al (2003) muestra que CRCV predomina en aquellos perros con enfermedad respiratoria media (resultado 2) y similarmente a Chalker et al (2003) encontrado en perros con B. 10 bronchiseptica predomina en aquellos perros con enfermedad moderada (resultado 3).

Nosotros encontramos que Streptococcus zooepidemicus está asociado más comúnmente con sólo los más severos casos de ERIC (resultado 4-5) indicand que podría actuar como un secundario invasor. De hecho, especies de βhs han sido previamente descritas como invasores secundarios en el complejo ERIC (McCandlish et al, 1978). Sin embargo, ello todavía no es conocido si S. zooepidemicus juega un papel importante en la enfermedad 15 respiratoria en estos animales o simplemente invade el tracto respiratorio provocando daño por otros patógenos. Las pruebas epidemiológicas sugieren que en los caballos, S. zooepidemicus podría ser un patógeno primario en la enfermedad respiratoria (Word et al, 1993; Cjanter, 1997) pero puede ser considerada para ser un agente oportunístico (Walker y Timoney 1998; Anzai et al, 2000). Incluso si S. zooepidemicus no es una causa primaria de ERIC en estos perros, el rango de gran aislamiento de perros con bronconeumonía supurativa (87.5%) apoya la 20 hipótesis que S. zooepidemicus es responsable de la mayoría de los signos clínicos que se ven en esta perrera. El bajo aislamiento de mascotas caseras (1.4%) con enfermedad respiratoria, indica que este agente podría estar en común con una infección respiratoria y podría ser un problema particular para esta perrera. Aunque y previamente la perrera no fue tomada en consideración es más probable que algunos perros domésticos en este estudio han estado en la perrera alguna vez. El papel jugado por S. zooepidemicus en otras casos de ERIC en perros de perrera, no ha 25 sido establecido.

El aislamiento de S. zooepìdemicus de estos perros se incrementa con el tiempo en la perrera, indicando que los pulmones de estos perros llegan a estar infectados con estas bacterias. Tal infección podría ocurrir de infecciones subclínicas del tracto respiratorio superior o de una cepa simple patogénica., Un sistema de tipificación PCR para el gen de la proteína SzP variable tipo M, permite la separación de 15 conocidos sero-tipos de 30 S.zooepidemicus en cinco grupos definidos, HV1-5 (Walter y Timoney, 1998). Análisis con estos sistemas de mecanografiado de Anzai et al, (2000) encontró que las variantes clonales simples de S. zooepidemicus fueron encontradas en el pulmón de neumonía de caballo mientras que los diferentes tipos se encuentran en amígdalas de los caballos sanos. Sería interesante para los sub-tipos de S. zooepidemicus aislar los iniciadores involucrados de ERIC para determinar si una variante simple clonal está presente en la población enferma, y también para examinar 35 la relación, si la hay, que los aislados de S. zooepidemicus canina tienen que causar la enfermedad respiratoria en caballos o en otros animales. La neumonía asociada de S. zooepidemicus se da en caballos de todas las edades y la neumonía acusada hemorrágica en caballos viejos, que son estresados por el transporte (Anzai et al, 2000). En este brote de ERIC en perros jóvenes y las condiciones clínicas pobres a la entrada de la perrera eran susceptibles a la infección con S. zooepidemicus como en los perros viejos y estos estaban sanos a la entrada. 40

En esta perrera, la terapia antibiótica es dada para un rango de infecciones, y el tratamiento no es rutinariamente dada a perros con ERIC excepto en casos de bronconeumonía severa. Es posible que el tratamiento pudiera estar influenciado por el espectro de la bacteria anotado en este estudio. Sin embargo la examinación de brotes naturales de enfermedades respiratorias puede proporcionar información valiosa que no es obtenida de otras maneras. 45

ERIC es conocida para ser una enfermedad multi-factorial que incluye a diversos agentes como CAV-2, CPIV, B. bronchiseptica y Micoplasma spp. En esta perrera en la cual un gran número de perros de diversas localidades son traídos juntos y domesticados, muchos patógenos están presentes y la severidad de esta enfermedad podría reflejar esto.

Ejemplo 2: La asociación de Micoplasma cynos con la enfermedad infecciosa respiratoria canina. 50

La presencia de M. cynos fue investigada por el cultivo del organismo e identificación por análisis PCR. En una encuesta de 184 perros de perrera, nosotros encontramos que el porcentaje de perros con M. cynos en la traquea o pulmón se incrementa con signos de enfermedad respiratoria de 10% en perros sanos a 31% en perros enfermos (figura 3).

Nosotros también anotamos que la enfermedad respiratoria se incrementa con el tiempo en la perrera y 55 durante la primera semana en los perros de perrera no se detectó M. cynos en la traquea, mientras que en la segunda semana 24% de 184 perros de la población estaba siendo infectada con esta bacteria. Un pequeño pero similar aumento fue también visto por la colonización del pulmón (de 15% a 23%) (vea figura 4).

Ejemplo 3: La asociación de Chlamydofilia con la enfermedad infecciosa canina respiratoria.

Nosotros reconocimos 210 perros por análisis PCR para la presencia de Chlamydofilia. 60

Un fragmento de par de bases (pb) 218 del gen 23S ARNr fue amplificado des la Chlamydofilia por el siguiente PCR. Las condiciones de reacción, 95ºC 5min (x 1 ciclo), 95ºC 30 segundos, 50ºC 30 segundos, 72ºC 1 minuto (x 40 ciclos) y 72ºC 5 min. La reacción de PCR mezcla 50 μl del total incluido 5.0 μl 10x buffer libre de magnesio (Promega), 1.5 mM MgCl2 (Promega), 0.5 μl (0.5 unidades) Taq ADN polimerasa (Promega), 0.2 mM nucleótido PCR mezcla (Promega), 0.025 μg seguido del iniciador C1 (5´- 5 GATGCCTTGGCATTGATAGGCGATGAAG GA-3’, SEC ID NO: 9) y el iniciador contrario C2 (5’-TGGCTCATCATGCAAAAGGCA- 3’, SEC ID NO: 10), 40 μl agua y 2 μl de tejido de muestra de ADN.

Un producto PCR obtenido de 8 perros fue confirmado como una Chalamydofila por análisis de secuencia y comparación del producto PCR para todas las posibles secuencias en Genbank por análisis Fasta. La secuencia parcial de gen 23S ARNr de tal secuencia (DHBC10) es mostrada en la figura 5 (SEC ID NO: 1). Esta secuencia pb 10 218 es 99.08% idéntica que la misma región en Chlamydophila abortus y 98.6% idéntica a Chlamydophila psittaci y 96.3% idéntica a Chlamydophila felis y en los análisis filogenéticos preeliminares (método clustal con Megalign) la mayoría de las secuencias del grupo en un clade distinto(figura 7). Las secuencias parciales 23S ARNr de otras siete aisladas Chlamidophila son mostradas en la figura 8 (SEC ID Nos: 2-8).

En esta estadística nosotros encontramos un incremento en la detección de Chlamydophila con un 15 incremento en la severidad de la enfermedad respiratoria en la traquea y pulmón. Un ligero incremento de la detección de 10% fue encontrado en las muestras de tráqueas (de 25% a 34%). Una diferencia más dramática fue encontrada en la detección de Chlamydophila en el pulmón, con un incremento de 0% en perros sanos a 37.5% en perros con ERIC (figura 6). Además, un incremento en el número total de perros examinados positivos por PCR para Chlamydophila desde 25% en perros sanos a 50% en perros con enfermedad severa fue anotada (Figura 6). 20

Ejemplo 4: La asociación de herpesvirus canino con enfermedad respiratoria infecciosa canina.

Nosotros encontramos un incremento en la prevalencia de herpesvirus canino en perros con síntomas severos respiratorios (figura 9). Cuando el anticuerpo monitorizado responde a CHV mas de un periodo de un año, los perros de las perreras con frecuentes brotes de enfermedad respiratoria mostraron seroconversiones de CHV más frecuentemente (58.3%) que los perros de perreras similares sin los brotes (8.3%). 25

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición de vacuna para la vacunación de perros que comprende:

un agente capaz de elevar una respuesta inmune contra Streptococcus equi sub species zooepidemicus (S. zooepidemicus) en un perro, donde dicho agente se compone de S. zooepidemicus inactivado o atenuado o un fragmento inmunológico de S. zooepidemicus, o un ácido nucleico que codifica dicho fragmento; y

un agente capaz de elevar una respuesta inmune contra Micoplasma cynos (M. cynos) en un perro, donde 5 dicho agente se compone de M. cynos atenuado o inactivado, o un fragmeno inmunológico de M. cynos, o un ácido nucleico que codifica dicho fragmento.
2. Una composición de vacuna según la reivindicación 1 y un portador farmacéuticamente aceptable, diluyente o adyuvante.
3. Una composición de vacuna según la reivindicación 1 o 2 que comprende además un agente capaz de 10 elevar la respuesta inmune en un perro contra coronavirus respiratoria canina (CRCV), donde dicho agente se compone de CRCV inactivado o atenuado, o un fragmento inmunológico del mismo, o un ácido nucleico que codifica dicho fragmento inmunológico.
4. Una composición de vacuna según la reivindicación 3, donde el fragmento inmunológico de CRCV se compone de la proteína Spike o la proteína hemoglutinina-estereasa (HE), o una porción inmunogénica 15 de la proteina Spike o HE.
5. Una composición de vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 1-4 que comprende además un agente capaz de elevar la respuesta inmune de un perro contra el virus de parainfluenza canino (CPIV), donde dicho agente se compone de CPIV inactivado o atenuado, o un fragmento inmunológico del mismo, o un ácido nucleico que codifica dicho fragmento inmunogénico. 20
6. Una composición de vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 1-4 que comprende además un agente capaz de elevar la respuesta inmune en un perro contra adenovirus tipo 2 canino (CAV-2), donde dicho agente se compone de CAV-2 atenuado o inactivado, o un fragmento inmunológico del mismo, o un ácido nucleico que codifica dicho fragmento inmunológico.
7. Una composición de vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 1-4 que comprende además un 25 agente capaz de elevar la respuesta inmune en un perro contra herpesvirus canino (CHV), donde dicho agente se compone de CHV atenuado o inactivado, o un fragmento inmunológico del mismo, o un ácido nucleico que codifica dicho fragmento inmunológico.
8. Una composición de vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que además comprende un agente capaz de elevar la respuesta inmune en un perro contra Bordetella bronchiseptica (B. 30 bronchiseptica), donde dicho agente se compone de B. bronchiseptica atenuada o inactivada, o un fragmento inmunogénico del mismo, o un ácido nucleico que codifica dicho fragmento inmunogénico.
9. El uso de un agente capaz de elevar la respuesta inmune contra S. zooepidemicus en un perro y un agente capaz de elevar una respuesta inmune contra M. cynos en un perro, como se definió en la reivindicación 1, en la preparación de un medicamento para la profilaxis o tratamiento de enfermedad 35 respiratoria infecciosa canina (ERIC) en un perro.
10. El uso de un agente capaz de elevar la respuesta inmune contra S. epidemicus en un perro y un agente capaz de elevar la respuesta inmune contra M. cynos en un perro, como se definió en la reivindicación 1, en la preparación de un medicamento para estimular una respuesta inmune contra S. zooepidemicus y dicho M. cynos en un perro. 40
11. El uso según a las reivindicaciones 9 o 10 donde el medicamento además comprende uno o más cualesquiera de:

un agente capaz de elevar la respuesta inmune en un perro contra CRCV;

un agente capaz de elevar la respuesta inmune en un perro contra CPIV;

un agente capaz de elevar la respuesta inmune en un perro contra CAV-2; 45

un agente capaz de elevar la respuesta inmune en un perro contra CHV;

un agente capaz de elevar la respuesta inmune en un perro contra B. bronchiseptica como se definió en la cualquiera de las reivindicaciones 3-8.
12. Una composición que contiene un agente capaz de elevar la respuesta inmune contra S. zooepidemicus en un perro y un agente capaz de elevar una respuesta inmune contra M. cynos en un perro, como se 50 definió en la reivindicación 1, para el uso como medicamento.
13. Una composición según la reivindicación 12 para su uso como un medicamento veterinario.
14. Una composición según la reivindicación 13 para su uso como un medicamento veterinario canino.
15. Una composición para uso según cualquiera de las reivindicaciones 12-14 que comprende además una cualquiera o más de:

un agente capaz de elevar la respuesta inmune en un perro contra CRCV;

un agente capaz de elevar la respuesta inmune en un perro contra CPIV; 5

un agente capaz de elevar la respuesta inmune en un perro contra CAV-2;

un agente capaz de elevar la respuesta inmune en un perro contra CHV;

un agente capaz de elevar la respuesta inmune en un perro contra B. bronchiseptica, como se definió en cualquiera de las reivindicaciones 3-8.
16. Un kit de partes para una composición de vacunas, comprendiendo: 10

un agente capaz de elevar la respuesta inmune en un perro contra S. zooepidemicus como se definió en la reivindicación 1; y

un agente capaz de elevar la respuesta inmune en un perro contra M. cynos como se definió e la reivindicación 1, y, opcionalmente, un portador farmacéuticamente aceptable, diluyente o adyuvante.
17. El kit según la reivindicación 16, que comprende además una cualquiera o más de: 15

un agente capaz de elevar la respuesta inmune en un perro contra CRCV;

un agente capaz de elevar la respuesta inmune en un perro contra CPIV;

un agente capaz de elevar la respuesta inmune en un perro contra CAV-2;

un agente capaz de elevar la respuesta inmune en un perro contra CHV; y

un agente capaz de elevar la respuesta inmune en un perro contra B. bronchiseptica, como se definió en cualquiera 20 de las reivindicaciones 3-8.