TWI388665B - 雞傳染性鼻炎重組次單位疫苗 - Google Patents

Description

雞傳染性鼻炎重組次單位疫苗

本發明係關於編碼Avibacterium paragallinarum 之P6蛋白的經單離核酸分子。本發明亦關於該重組P6蛋白與/或其變體，以及其製造方法。本發明進一步揭示利用A. paragallinarum 之重組P6蛋白作為次單位疫苗，以及使用該次單位疫苗保護雞隻，對抗A. paragallinarum 所引起之雞傳染性鼻炎。

傳染性可利查(infectious coryza,IC)，亦稱雞傳染性鼻炎，係由Avibacterium paragallinarum (先前稱Haemophilus paragallinarum ；雞副嗜血桿菌)所引起之雞隻呼吸道傳染病。雞隻在感染後會導致生長遲緩及產蛋率下降等問題，並造成嚴重之經濟損失。傳染性可利查必須使用疫苗來加以控制，世界各地每年所使用之傳染性可利查疫苗數量亦極大，目前已商業化之A. paragallinarum 疫苗，皆是以液體培養基培養A. paragallinarum 全菌來製作。全菌不活化疫苗雖可提供雞隻保護力，但此保護力僅侷限於相同血清型之菌株，不同血清型間缺乏交叉保護力。另一方面，由於菌苗是由不活化之菌體所製成，因此需要較大之抗原量，加上培養A. paragallinarum 所需之培養基價格昂貴，使得其菌苗之製作成本居高不下。另一方面，雞隻在免疫全菌菌苗後，可能會產生局部之過敏反應及肉芽腫等問題，因此如何研發出一種價格低廉、低副作用，以及兼具不同血清型交叉保護力之新一代A. paragallinarum 疫苗，乃為目前世界各地許多IC疫苗研發人員追逐之目標。

近年來也有多篇報告，是以重組DNA技術，來研發新一代的A. paragallinarum 次單位疫苗，例如，Noro等人(Avian Dis 2007;51:84-9)曾報導，從A. paragallinarum 基因體中選殖到一段大小為5.1kb之片段，並稱其為hpa5.1，此片段中含一個大小約4.8kb之基因，且此基因的產物在免疫雞隻後，可提供雞隻充分之保護力，此為第一個發表A. paragallinarum 次單位疫苗之報導，但是Noro等人在文獻中並未提及此4.8kb基因所表現之蛋白序列為何，也未討論為何此蛋白具有保護能力。另一方面，Hsu等人(Vet Microbiol 2007;122:280-9)則以重組之血球凝集素蛋白(r-HagA)免疫雞隻，但攻毒實驗後發現，r-HagA之保護效力只有約71%。除了hpa5.1與HagA外，目前文獻中並無任何有關A. paragallinarum 次單位疫苗之報導，而hpa5.1與HagA因表現量過低或效力不佳，目前也無商業化生產之可能。

雞傳染性鼻炎疫苗目前在現場並無任何次單位疫苗可供使用，因此利用生物技術來生產可供利用之次單位疫苗，即為本發明之研發重點。A. paragallinarum 之次單位疫苗之研發，主要面對兩項困難，首先是發表文獻很少，很難找到適當的標的蛋白來進行研發次單位疫苗之工作。另一項困難是A. paragallinarum 之基因體全長序列尚未被發表，因此也無法以生物資訊之方法，搜尋可能成為次單位疫苗之基因，來進行重組蛋白之表現與測試。為了克服這兩項困難，本案發明人首先進行文獻搜尋之結果發現，在和A. paragallinarum 在分類上較接近之菌株中，以Haemophilus influenzae (H. influenzae )之次單位疫苗報告最多。H. influenzae 為造成幼童上呼吸道感染之主要病原之一，在疾病防治上有很高之重要性，而現有報告中H. influenza 次單位疫苗之主要成分，則是為P6及P4蛋白。

P6為分子量約15kDa之脂蛋白(lipoprotein)，此蛋白廣泛存在於各種血清型之H. influenzae 中，有多篇報導指出，以E. coli 系統表現之重組P6蛋白，可保護動物對抗H. influenzae 之攻擊(參見，例如，Green BA等人，Infect Immun 1987;55:2878-83；Kyd JM等人，Infect Immun 1995;63:2931-40；DeMaria TF等人，Infect Immun 1996;64:5187-92；及Yang YP等人，Vaccine 1997;15:976-87)。因此，對於H. influenzae 而言，P6確實為一極有潛力之次單位疫苗成分(Green BA等人，Infect Immun 1990;58:3272-8)。

另一方面，P4又稱e蛋白，為分子量約28-30kDa之脂蛋白(lipoprotein)，此蛋白與H. influenzae 利用NAD之能力密切相關。於2004及2005年各有一篇報告指出P4重組蛋白可作為H. influenzae 之有效次單位疫苗成份(Mason K等人，Vaccine 2004;22:3449-56；及Green BA等人，Infect Immun 2005;73:4454-7)。

由於A. paragallinarum 之基因體序列尚未被發表，因此沒有序列可供參考以設計PCR引子來進行其基因之增幅。為突破此一瓶頸，本發明遂利用與A. paragallinarum 在分類上較為接近菌株之P6與P4之基因序列，進行排列比對，並藉以設計退化性引子(degenerated primers)，增幅出A. paragallinarum 之P4與P6基，完成其選殖與定序工作，並登錄至NCBI-BenBank(登錄序號為FJ422953-FJ422958)。於是，本發明利用E. coli 宿主表現P6與P4重組蛋白，再進行雞隻免疫與攻毒試驗，結果發現P6能有效作為A. paragallinarum 之次單位疫苗，且其效果優於傳統疫苗，進而完成本發明。

於一方面，本發明係提供一種Avibacterium paragallinarum 之脂蛋白P6，或其同功能變異型(variant)，其具有包含由SEQ ID NO. 1所表示之胺基酸序列。

於另一方面，本發明揭示一種編碼Avibacterium paragallinarum 之脂蛋白P6之經單離核酸分子，其具有SEQ ID NO:2之核苷酸序列，或具有與SEQ ID NO:2之核苷酸序列相似性大於90%以上的核苷酸序列。

於又一方面，本發明提供一種表現質體，其包含編碼Avibacterium paragallinarum 之脂蛋白P6之核酸分子，及調控元件。於一項具體態樣，該表現質體包含具有SEQ ID NO:2之核苷酸序列，或具有與SEQ ID NO:2之核苷酸序列相似性大於90%以上的核苷酸序列。

於又另一方面，本發明提供一種大腸桿菌宿主細胞，其含有包含編碼Avibacterium paragallinarum 之脂蛋白P6之核酸分子的表現質體。

本發明進一步提供一種用於防治由A. paragallinarum 所造成之動物疾病的次單位疫苗組成物，其包含重組A. paragallinarum 脂蛋白P6(lipoprotein P6)做為抗原蛋白，及獸醫學上可接受之佐劑。於一項具體態樣，該由A. paragallinarum 所造成之動物疾病為雞隻傳染性鼻炎(infectious coryza,IC)。

本發明的其他特徵與優點，將從下列圖式及數項具體實施例之詳細描述，亦從附屬之申請專利範圍顯而易見。

本發明係採用以下策略來研發A. paragallinarum 之次單位疫苗：首先是搜尋文獻中所有和A. paragallinarum 在分類上較接近菌株之研究報告，再確定這些菌株是否有次單位疫苗之報導，如果有則再以此次單位成分為標的，尋找A. paragallinarum 中相對應之蛋白，以研發A. paragallinarum 之次單位疫苗。

經選定以P6或P4脂蛋白作為研發A. paragallinarum 次單位疫苗之標的蛋白後，接著進行P6與P4基因之選殖與表現，以大量製造可供次單位疫苗應用的重組蛋白質。

經由雞隻免疫與攻毒試驗，結果發現A. paragallinarum 脂蛋白P6能有效作為防治A. paragallinarum 感染之次單位疫苗，且其效果優於傳統疫苗。

實施例

以下，本發明將詳細描述特殊的具體實施例。這些具體實施例經由發明解釋提供，並非意欲用以限制本發明。在發明的範圍及精神內，本發明存在傾向於包括這些及其他變更及變動。

實施例1.雞傳染性鼻炎A. paragallinarum 脂蛋白P6與

P4之基因選殖

由於A. paragallinarum 之基因體序列尚未被發表，因此沒有序列可供參考以設計PCR引子來進行其基因之增幅。本發明首先利用與A. paragallinarum 在分類上較為接近菌株之P6與P4之基因序列，進行排列比對，並藉以設計退化性引子(degenerated primers)，增幅出A. paragallinarum 之P6與P4基因。

先前之研究已顯示P6基因存在於H. influenza PittEE(accession number=CP000671)、Pasteurella multocida Pm70(accession number=AE006136)及Actinobacillus pleuropneumoniae L30(accession number=CP000569)之基因組序列中。而且，P6基因係位於tolB基因之正下游。因此，為增幅出A. paragallinarum 之P6基因，遂以存在於tolB與P6基因之保守序列(conserved sequences)為基礎，設計得tolB-1183(+)及p6-462(-)引子。tolB-1183(+)與p6-462(-)引子之序列如下所示：5'-GTG CTA CAA TTG GTW TCY GC-3'(W=A/T)(SEQ ID NO. 13)及5'-TTA GTA TGC TAA CAC AGC AC-3'(SEQ ID NO. 14)。使用該二引子，經PCR反應從A. paragallinarum 基因體DNA增幅出一段580-bp產物(圖1b)，其涵蓋tol B與之3'-端及P6基因之完整編碼區域(圖1a)。

從分離自三株A. paragallinarum 不同分離株，即Strains 221(serovar A)、H18(serovar C)及台灣分離株TW07(serovar C)，之基因體DNA選殖出的全長P6基因，具有很高的序列同一性(參見SEQ ID NO. 1至6)。

關於A. paragallinarum 之P4基因的選殖，係以存在H. influenza PittEE(CP000671)、Pasteurella multocida Pm70(AE006136)與Actinobacillus pleuropneumoniae L30(CP000569)之P4基因中的保守序列為基礎，設計p4-223(+)與p4-749(-)引子來擴增P4基因之DNA序列，p4-223(+)與p4-749(-)引子之序列如下所示：5’-AAA GGT AAG AAA AAA GC-3’(SEQ ID NO. 15)及5’-TYA KCT AAA CCG CCT TCC CAG-3’(Y=C/T且K=G/T)(SEQ ID NO. 16)，經PCR反應後增幅得一段527-bp PCR產物(圖1d)，其涵蓋P4基因之核苷酸(nts)223-749(圖1c)。接著利用可黏合至該527-bp區域中特定位置之特異性引子SP(-)與SP(+)(其序列分別為5’-GAT CAA CCA CAA CCG CTT T-3’(SEQ ID NO. 17)，及5’-CAG GCA CAG GGT TTA ATG GTG AAG AT-3’(SEQ ID NO. 18))；以及可黏合至該527-bp區域之上游或下游未知位置的非特異性引子NSP(+)(5’-GCC GTG CTT TCG TTC AAC AA-3’(SEQ ID NO. 19))與NSP(-)(5’-ARA TTA TTT RCC RTC CCA-3’)(R=A/G)(SEQ ID NO. 20))，進行標靶基因步移PCR方法(targeted gene walking PCR)(參見，Parker JD等人，Nucleic Acids Res 1991;19:3055-60)，增幅出該527-bp區域之上游或下游的DNA序列。經由PCR反應，引子NSP(+)與SP(-)增幅出一段277-bp PCR產物，其涵蓋P4基因之5'-端；而引子SP(+)與NSP(-)則增幅出一段898-bp PCR產物，其涵蓋P4基因之3'-端(圖1c)。將彼等PCR產物片段定序，而得完整的P4基因核苷酸序列。從分離自三株A. paragallinarum 不同分離株，即Strains 221(serovar A)、H18(serovar C)及台灣分離株TW07(serovar C)，之基因體DNA選殖出的全長P4基因，具有很高的序列同一性(參見SEQ ID NO. 7至12)。

實施例2.重組脂蛋白r-P6與r-P4於大腸桿菌之表現與純化

依據本研究室所登錄之A. paragallinarum 之P6與P4序列(Genebank accession number=FJ422953-FJ422958)，設計PCR引子以增幅P6與P4基因。增幅之範圍包括全長之P6與P4(所表現之重組蛋白稱為r-P6與r-P4)。P6(+):5'-CCA TGG GCA AAA ACT TTA AAA AAT TAT TG-3'(SEQ ID NO. 21)，P6(-):5'-CTC GAG GTA TGC TAA CAC AGC ACG ACG-3'(SEQ ID NO. 22)，P4(+):5'-CCA TGG CCA AAC ACA CAA AAT CCA AAT TA-3'(SEQ ID NO. 23)，P4(-):5'-GGA TCC GAT TTT CCG CTC CAC ACT TTG AT-3'(SEQ ID NO. 24)。在引子序列的5'端設計Nco I,Xho I或Bam HI之限制酵素切位，以利選殖至表現載體之中。利用PCR反應增幅P6及P4基因，再將增幅產物以設計之限制酵素作用之後嵌入接合至表現載體pET28a(Novagen,Inc. Madison,WI)，最後以定序確認質體序列，正確無誤之後再進行重組r-P6與r-P4之蛋白表現。

將所構築得之表現載體轉形至E. coli BL21(DE3)宿主細胞中，於LB培養液中於37℃下培養至吸光值(OD₆₀₀ )達到0.6時，加入IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)終濃度為0.4mM，進行誘導基因的轉錄，以合成大量重組r-P6與r-P4表現蛋白。之後將表現重組蛋白r-P6與r-P4之大腸桿菌菌體懸浮於結合緩衝液(binding buffer)(20mM pH 7.9Tris，5mM咪唑，500mM NaCl)中，並以超音波擊碎。之後於4℃下以12000rpm之速度離心30分鐘，收集具有可溶性蛋白的上清液，以含有2.5mL“His-bind”樹脂(Novagen)親合性樹脂之管柱，進行重組蛋白的純化。簡言之，先以25mL之結合緩衝液與15mL之洗滌緩衝液(washing buffer)(20mM pH 7.9Tris，50mM咪唑，500mM NaCl)將未與親合性樹脂結合的蛋白移除，最後以15mL之溶析緩衝液(eluting buffer)(20mM pH 7.9Tris，250mM咪唑，500mM NaCl)將r-PlpE表現蛋白回收。將經純化的重組蛋白以"Protein Assay"套組(BIO-RAD,Hercules,CA)測定其濃度，並進行SDS-PAGE與西方轉漬Western blot分析，觀察重組蛋白的表現量與蛋白之純度。結果如圖2所示。

亦根據前述之法，分別利用引子組ΔP6(+):5'-CCA TGG GCT GTA GTT CAT CAA AAC ATA CCG AAA C-3'(SEQ ID NO. 25)與ΔP6(-):5'CTC GAG GTA TGC TAA CAC AGC ACG ACG-3'(SEQ ID NO. 26)，及ΔP4(+):5'-CCA TGG GCT GTA CCT CAA ATC AAC AAC ATG-3'(SEQ ID NO. 27)與ΔP4(-):5'GGA TCC GAT TTT CCG CTC CAC ACT TTG AT(SEQ ID NO. 28)增幅出編碼去除訊號肽(signal peptide)之經截短P6與P4脂蛋白片段的DNA序列，並將其用以表現及製造重組蛋白r-ΔP6與r-ΔP4。

由E. coli 所表現之r-P6、r-P4、r-ΔP6與r-ΔP4粗萃取與純化蛋白列示於圖2，上述重組蛋白之C'端加上六個組胺酸標誌蛋白(His-tag)。由圖2a之SDS-PAGE電泳圖顯示，相較於標準分子量蛋白，r-P6與r-P4全長重組蛋白分子量估計分別為17.5kDa與32.7kDa，而且當訊號胜肽斷裂之後，r-P6與r-P4均能產生一個分子量較小的成熟蛋白，估計約15.7kDa與30.7kDa。另一方面，r-ΔP6與r-ΔP4重組蛋白分子量估計分別為15.7kDa與30.7kDa(參見圖2a)。所有重組表現蛋白以抗-組胺酸(anti-His)之單源抗體進行免疫轉漬分析後，發現r r-P6、r-P4、r-ΔP6與r-ΔP4之全長及成熟蛋白均能夠與抗-組胺酸之單源抗體結合反應，而產生免疫複合物之條帶，圖中所對應之r-P6、r-P4、r-ΔP6與r-ΔP4之全長及已修飾之成熟蛋白產物，均以箭號標示，另外上述重組蛋白之雙體(dimmer)則以空心箭號標示(參見圖2b之免疫轉漬結果)。

實施例3.重組P6與P4脂蛋白次單位疫苗保護效力評估

取六週齡SPF雞隻，進行重組P6與P4蛋白之免疫，並於九週齡時補強免疫一次，再於十二週齡時進行攻毒測試，共進行兩次免疫與攻毒試驗，其結果分別如表1與表2所示。

^B d2-d5=攻毒後2-5日

^C 不同之字母代表統計上之差異顯著(P<0.05)b

^D 保護率之計算方式為攻毒後呈現受保護雞隻數目/測試雞隻數目

從表1所示之結果可得知：免疫r-P6之雞隻於攻毒後2-5日所呈現之每日病變描述與總平均病變指數皆為0，且其保護率為100%，兩項數值皆顯著優於對照組雞隻(P<0.05)。免疫r-ΔP6之雞隻於攻毒後2-5日所呈現之每日病變指數在0.33至0.83之間，而其總平均病變指數為0.54±0.13，保護率為33%，此總平均病變指數顯著低於對照組(P<0.05)，但保護率則與對照組無明顯差異。免疫r-P4之雞隻於攻毒後2-5日所呈現之每日病變指數在0.67至1.17之間，而其總平均病變指數為0.92±0.20，保護率為17%，此總平均病變指數與保護率皆與對照組無明顯差異。此外，免疫r-ΔP6加r-ΔP4之雞隻於攻毒後2-5日所呈現之每日病變指數在0.5至0.83之間，而其總平均病變指數為0.67±0.18，保護率為50%，此總平均病變指數低於對照組(P<0.05)，但保護率則無明顯差異。由實驗二(表2)所獲得之結論，與實驗一完全一致。

總結而言，雞隻以r-P6免疫後可顯著降低其病變指數，並提昇其保護率，而以r-Δ P6免疫後可顯著降低其病變指數，但是卻無法顯著提昇其保護率。另一方面，雞隻以r-P4免疫後，對於其病變指數與保護力，皆與對照組無顯著之差異。因此，A. paragallinarum 脂蛋白P6能有效作為防治A. paragallinarum 感染之次單位疫苗

其他具體態樣

本說明書中所揭示之全部特徵可以任何組合方式組合。於是，本說明書中所揭示之各別特徵可由依相同、相等或類似目的之替代特徵取代。因此，除非另行清楚地指示，所揭示之各特徵僅為一系列同等物或類似特徵之實例。

從前述之說明，習於該項技藝人士可容易地確定本發明之基本特徵，且在未偏離其範圍下，可進行本發明之各種改變與修飾，以使其適於各種不同用途與狀況。因此，於申請專利範圍內亦包含其他具體態樣。

<110> 國立中興大學

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<130> BHT-3139-11

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圖1列示用於增幅A. paragallinarum P6及P4基因之策略(1a與1c)；以及所增幅得之PCR產物(1b與1d)。Lanes 1-3係使用分離自strains 221、H18及TW07之基因體為模板所進行之增幅；且Lane 4為陰性對照組(negative control)。Lane M為size markers(100-bp ladder,PRO-tech,Taipei,Taiwan)。

圖2列示重組P6及P4蛋白(r-P6及r-P4)於E. coli 中之表現與純化結果。(a)為重組蛋白質粗萃取物(crude extracts)及經純化(purified)樣本之SDS-PAGE凝膠經考馬司藍(Coomassie blue)染色的結果。(b)為以小鼠抗-組胺酸單株抗體(mouse anti-hexahistidine monoclonal antibodies)為探針進行之免疫轉漬分析結果。相當於r-P6、r-P4、r-ΔP6與r-ΔP4所在位置之條帶係以實心箭號標示；而相當於彼等之雙體(dimmer)所在位置的條帶則以空心箭號標示。

Claims (9)

1. 一種雞副嗜血桿菌(Avibacterium paragallinarum )脂蛋白P6，其包含SEQ ID NO.2、4或6之胺基酸序列。
2. 根據申請專利範圍第1項之脂蛋白P6，其為經由大腸桿菌表現所製得之重組脂蛋白P6(r-P6)。
3. 一種編碼Avibacterium paragallinarum 之脂蛋白P6之經單離核酸分子，其包含選自由(i)SEQ ID NO：1、3或5之核苷酸序列；及(ii)具有與SEQ ID NO：1、3或5之核苷酸序列相似性大於90%以上的核苷酸序列所組成之組群的核苷酸序列。
4. 根據申請專利範圍第3項之經單離核酸分子，其中該脂蛋白P6包含SEQ ID No.2、4或6之胺基酸序列。
5. 一種表現質體，其包含根據申請專利範圍第3項之核酸分子，及調控元件。
6. 一種大腸桿菌宿主細胞，其含有根據申請專利範圍第5項之表現質體。
7. 一種用於防治由A.paragallinarum 所造成之動物疾病的次單位疫苗組成物，其包含根據申請專利範圍第1或2項之A.paragallinarum 脂蛋白P6(lipoprotein P6)做為抗原蛋白，及獸醫學上可接受之佐劑。
8. 根據申請專利範圍第7項之疫苗組成物，其中該A.paragallinarum 脂蛋白P6包含SEQ ID No.2、4或6之胺基酸序列。
9. 根據申請專利範圍第7項之疫苗組成物，其中該由A.paragallinarum 所造成之動物疾病為雞隻傳染性鼻炎(infectious coryza,IC)。