MXPA05001098A - Proteina dentada, polimerasa y hemaglutinina/esterasa del coronavirus respiratorio canino. - Google Patents

Proteina dentada, polimerasa y hemaglutinina/esterasa del coronavirus respiratorio canino.

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MXPA05001098A
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Abstract

Un coronavirus respiratorio canino (CRCV) que esta presente en el tracto respiratorio de los perros con una enfermedad respiratoria infecciosa canina y que tiene un bajo nivel de homologia con el coronavirus canino enterico, pero que tiene un alto nivel de homologia con todas las cepas de coronavirus bovino (por ejemplo, Quebec, y LY138), y la cepa OC43 del coronavirus humano, el CRCV dentado, el ADNc de al polimerasa y la hemaglutinina/esterasa y las secuencias parciales de la proteina se listan en las Figuras (1) a (4), (13) y (14).

Description

PROTEINA DENTADA. POLIMERASA Y HE AGLUTININA/ESTERASA DEL CORONAVIRUS RESPIRATORIO CANINO MEMORIA DESCRIPTIVA La presente invención se relaciona con material biológico, y en particular con un coronavirus respiratorio canino que está presente en perros que tienen enfermedad respiratoria infecciosa canina. La enfermedad respiratoria infecciosa canina (CIRD) es una enfermedad altamente contagiosa común en perros alojados en condiciones de hacinamiento, tales como centros para buscarles un nuevo hogar y perreras de pensión y de entrenamiento. Muchos perros sufren sólo de una tos leve y se recuperan después de un corto tiempo, sin embargo, en algunos casos, puede desarrollarse una severa bronconeumonía (Appel y Binn, 1987). La patogénesis de la CIRD se considera multifactorial, involucrando varios virus y bacterias. Los agentes infecciosos considerados como los principales patógenos causales de la CIRD son los virus de la parainfluenza canina (CPIV) (Binn et al., 1967), los adenovirus caninos del tipo 2 (CAV-2) (Ditchfield eí al., 1962) y las bacterias Bordetella bronchiseptica (Bemis et al., 1977, Keil et al., 1998). También se han aislado especies de herpesvirus caninos, reovirus humanos y micoplasma de perros con síntomas de CIRD (Karpas et al., 1968, Lou y Wenner 963, Randolph eí al., 993). Los factores adicionales tales como el estrés también pueden ser importantes.
La CIRD es raramente fatal pero retarda la búsqueda de un nuevo hogar de los perros en los centros de rescate y causa la interrupción de los programas en las perreras de entrenamiento, así como considerables costos de tratamiento. Están disponibles vacunas contra algunos agentes infecciosos asociados con esta enfermedad, a saber, Bordetella bronchiseptica así como CPIV y CAV-2. Sin embargo, a pesar del uso de estas vacunas, la CIRD todavía prevalece en las perreras en todo el mundo, lo cual se debe posiblemente a que las vacunas no proporcionan protección contra todos los agentes infecciosos involucrados con la CIRD. Hemos descubierto un coronavirus novedoso, el cual llamamos el coronavirus respiratorio canino (CRCV), en una gran población de perros en perreras, con un historial de enfermedad respiratoria endémica, y hemos demostrado que este virus está asociado con la CIRD. Se sabe que algunos miembros de la familia de los coronavirus causan enfermedad respiratoria en humanos, ganado, cerdos y aves de corral (Mákelá et al., 1998, Pensaert et al., 1986, Ignjatovic y Sapats 2000). Por ejemplo, los coronavirus respiratorios bovinos están asociados con la septicemia hemorrágica en el ganado, la cual es una enfermedad respiratoria multifactorial (Storz et al., 2000). Sin embargo, no se sospechaba que los coronavirus tuvieran un papel en la patogénesis de la CIRD. En realidad, con una sola excepción se ha reportado que los coronavirus caninos son virus entéricos y que causan diarrea aguda principalmente en perros jóvenes (por ejemplo, Tennant et al., 1993). En un gran estudio de los virus involucrados en las enfermedades respiratorias caninas, Binn et al. (1979) reportaron la detección de un coronavirus canino en el pulmón de un solo perro que también estaba infectado con SV5 y con el adenovirus canino 2, otros dos virus que estaban asociados con la enfermedad canina respiratoria. Hay 30-40 vacunas para perro comercial mente disponibles en el RU para utilizarse contra varios patógenos que pueden causar una gama de enfermedades, tales como enfermedades neurologicas, entéricas, hepáticas y respiratorias. La mayoría de estas vacunas contienen agentes microbianos tales como el virus del Moquillo, el Adenovirus-2 Canino, el parvovirus Canino, el virus de la parainfluenza canina y Leptospira canteóla y L. ¡cterohaemorrhagiae. Ninguna de estas vacunas contiene coronavirus caninos. Las vacunas para perro para utilizarse contra las enfermedades respiratorias caninas son comercializadas como vacunas para la "tos de las perreras" (véase a continuación). Todas las vacunas contienen Bordetella bronchisepticum, que es una bacteria asociada con la "tos de las perreras". Coyne M. J. y May S. W., (1995) en su artículo titulado "Considerations in using a canine coronavirus vaccine" (publicado como un Boletín Técnico de Pfizer en la Internet en http://www.pfizer.com/ah/vet/tref/trbull/ccv.html), lista más de 20 vacunas comercialmente disponibles contra los coronavirus caninos solos o contra los coronavirus caninos junto con otros organismos. Cada una de estas vacunas es para la enfermedad entérica canina, y no hay sugerencia de que un coronavirus canino pueda estar asociado con la enfermedad respiratoria. Las Patentes de E.U.A. Nos. 6,057,436 y 6,372, 224, ambas de Miller et al y cedidas a Pfizer, Inc., describen el gen dentado del coronavirus canino entérico y usos del mismo, incluyendo su uso como una vacuna contra la gastroenteritis. Ninguna de estas dos patentes sugiere que un coronavirus canino pueda estar involucrado en la CIRD. Los miembros de la familia de coronavirus son virus recubiertos, de 80-160nm de diámetro, que contienen un genoma del ARN de hebra positiva lineal. Las proteínas estructurales de los coronavirus son la glucoproteína dentada (S), la glucoproteína de la membrana (M) y la proteína de la nucleocápside (N). La glucoproteína de hemaglutinina/esterasa (HE) se encuentra solamente en la superficie del grupo II de los coronavirus (por ejemplo, coronavirus bovinos y virus de la hepatitis murinos) (Spaan eí al, 1988). Los detalles adicionales de la estructura de los coronavirus pueden encontrarse en el capítulo por Cavanagh et al titulado "Coronviridae", p407-411 , en "Virus Taxonomy, 6o Reporte del Comité Internacional sobre la Taxonomía de los Virus", pub. Springer-Verlag Wein, New York, Eds. Murphy eí al, que se incorpora aquí como referencia. El coronavirus respiratorio canino (CRCV) de la invención puede caracterizarse como un coronavirus presente en los tractos respiratorios de perros con enfermedad respiratoria infecciosa. Para caracterizar adicionalmente el CRCV, hemos determinado la secuencia de 250 residuos nucleotídicos del ADNc de la polimerasa del CRCV (pol) (Figura 1 y SEQ ID NO: 1 ), que corresponden a una secuencia parcial de 83 aminoácidos de la proteína pol (Figura 2 y SEQ ID NO: 2). También hemos clonado y determinado la secuencia de los 4092 residuos nucleotídicos del ADNc dentado del CRCV (S) (Figura 3 y SEQ ID NO: 3), que corresponde a 1363 aminoácidos (Figura 4 y SEQ ID NO: 4). También hemos determinado la secuencia de 497 residuos nucleotídicos del gen de la hemaglutinina/esterasa (HE) del CRCV (Figura 13 y SEQ ID NO: 21 ), que corresponde a 165 aminoácidos (Figura 14 y SEQ ID NO: 22). Hemos identificado que el CRCV tiene una homología sorprendentemente baja con el coronavirus canino entérico (CCV), mientras que tiene un nivel inesperadamente alto de homología con el coronavirus bovino (cepa LY138 o Québec) y con el coronavirus humano (cepa OC43). Un cultivo de "CRCV D-1 Dentado", que es XL1-Blue de E. coü (Stratagene) que contiene un plásmido pT7Blue2 (Novagen), cuyo inserto contiene una porción del ADNc dentado del CRCV, se ha depositado bajo el Tratado de Budapest en NCIMB Ltd bajo el número de Acceso NCIMB 41 146 en Julio 25 del 2002. El depositante de NCIMB 41 146 es el Real Colegio Veterinario, Royal College Street, Londres NW1 OTU, RU. La dirección de NCIMB Ltd es 23 St. Machar Drive, Aberdeen, Escocia, AB24 3RY, RU. La relación filogenética del CRCV con once coronavirus conocidos se determinó basándose en una comparación de la secuencia de 250 nucieótidos del gen poi del CRCV y las regiones correspondientes de los otros virus (Figura 5). Se encontró que el coronavirus bovino (BCV), el coronavirus humano (HCV) cepa OC43 y el virus de la encefalomielitis hemaglutinante (HEV), son los más estrechamente relacionados con el CRCV, mientras que se encontró que el CCV entérico está sólo lejanamente relacionado con el CRCV. Sobre los 250 residuos secuenciados del ADNc pol, que corresponden a 83 aminoácidos, el CRCV tuvo sólo un 68.5% y un 75.9% de identidad de la secuencia en los niveles de nucieótidos y aminoácidos, respectivamente, con la región equivalente del gen pol del CCV entérico (cepa 1-71 ) (No. de Acceso de Genbank AF124986), como se muestra en la Figura Figure 6 y 7. Sobre los 4092 residuos nucleotídicos secuenciados del gen S del CRCV, que corresponden a 1363 aminoácidos, el CRCV tuvo un 45% y un 21.2% de identidad de la secuencia en los niveles de nucieótidos (Figura 8) y de aminoácidos, respectivamente, con la región equivalente del gen S del CCV entérico (cepa 1-71 ). El CCV entérico no es un coronavirus del grupo II y no posee un gen HE, por lo tanto, no es posible determinar el grado de identidad de la secuencia entre este gen en el CRCV y el CCV entérico. Excepto como se describe a continuación, el porcentaje de identidad entre dos secuencias nucleotídicas o dos secuencias de aminoácidos se determinó utilizando FASTA versión 34 (Pearson WR. (1990) "Rapid and sensitive sequence comparison with FASTP and FASTA". Methods Enzymol,; 183: 63-98). Los ajustes de FASTA fueron una penalización 16 de la abertura del Hueco y una penalización 14 de la extensión del Hueco. El porcentaje de identidad entre las secuencias dentadas del CRCV y el CCV entérico se determinó utilizando GCG versión 10 (Genetics Computer Group, (1991 ), Manual del Programa para el Paquete GCG, Versión 7, Abril 1991 , 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, E.U.A. 53711 ). Los parámetros de GCG utilizados fueron: penalización 50 para la creación del Hueco, penalización 3 para la extensión del hueco para el ADN, y penalización 8 para la creación del Hueco y penalización 2 para la extensión del Hueco para la Proteína. Las alineaciones de la secuencia se realizaron utilizando ClustalX (Thompson et al., 1997). En contraste, sobre los 250 residuos secuenciados del ADNc pol, el CRCV tuvo un 98.8% de identidad de la secuencia con la región equivalente del gen pol de la cepa Québec del BCV (No. de Acceso de Genbank AF220295), 98.4% de identidad de la secuencia con el gen pol de la cepa LY138 del BCV (No. de Acceso de Genbank AF124985) y 98.4% de identidad de la secuencia con el gen pol OC43 del HCV (No. de Acceso de Genbank AF124989). Hubo solo una sola diferencia de aminoácidos entre la proteína pol del CRCV sobre los 83 aminoácidos secuenciados y las proteínas pol de BCV, HCV y HEV, lo cual es que el CRCV tuvo una E (Glu) en oposición a una D (Asp) en la posición correspondiente a la posición 4975 en el genoma del BCV (No. de Acceso SWALL: Q91A29). Así, la proteína pol del CRCV es 99% idéntica a las proteínas pol de BCV, HCV y HEV sobre esta región. Se utilizan aquí los códigos de una y tres letras para los aminoácidos, de la Comisión de Nomenclatura Bioquímica de la IUPAC-IUB. Sobre los 497 residuos nucleotídicos secuenciados, que corresponden a 165 aminoácidos, del gen HE, el CRCV tuvo 98.994% y 98.2% de identidad de la secuencia con la región equivalente del gen HE de la cepa LY138 del BCV (No. de Acceso de Genbank AF058942) en los niveles de nucleótidos y aminoácidos, respectivamente. El CRCV tuvo 98.189% (nucleótido) y 98.2% (aminoácido) de identidad de la secuencia con el gen HE del coronavirus entérico humano (HECV) (No. de Acceso de Genbank No. L07747); 97.4% (nucleótido) y 95.2% (aminoácido) de identidad de la secuencia con el gen HE OC43 del HCV (No. de Acceso de Genbank M76373); y 92.0% (nucleótido) y 93.9% (aminoácido) de identidad con HEV (Nos. de Acceso de Genbank AF481863), como se muestra en las Figuras 15 y 16. Como se muestra en la Figura 16 y el Cuadro 3, los tres aminoácidos que son diferentes entre la proteína HE del CRCV y cada una de las proteínas S de BCV, HECV, HCV y HEV, dentro de los 165 aminoácidos de la proteína HE del CRCV, son F (Phe) en oposición a L (Leu), N (Asn) en oposición a T (Thr), y L (Leu) en oposición a V (Val) en las posiciones que corresponden a la posición 235, 242 y 253, respectivamente, en los genes HE de HEV, OC43 de HCV, HECV y BCV (Figura 16). Así, puede decirse que F en la posición 235, N en la posición 242 y L en la posición 253 son los aminoácidos específicos de la proteína HE del CRCV. Sobre los 4092 residuos nucleotídicos secuenciados, que corresponden a 1363 aminoácidos, del gen S del CRCV, el CRCV tiene 97.3% y 96% de identidad con la región equivalente de la cepa LY138 de BCV (No. de Acceso de Genbank AF058942) en los niveles de nucleótidos y aminoácidos respectivamente. El CRCV tiene 96.9% (nucleótido) y 95.2% (aminoácido) de identidad con la cepa OC43 del HCV (No. de Acceso de Genbank Z32768), y 83.8% (nucleótido) y 80.4% (aminoácido) de identidad con HEV (Nos. de Acceso de Genbank AF481863 (ADNc) y AAM 77000 (proteína)), como se muestra en las Figuras 9 y 10. Los aminoácidos que son diferentes entre la proteína S de CRCV y cada una de las proteínas S de BCV, HCV y HEV, dentro de los 1363 aminoácidos de la proteína S de CRCV, se listan en el Cuadro 1 siguiente. Así, podría decirse que los aminoácidos listados en el Cuadro 1 son aminoácidos específicos de la proteína S de CRCV. Los aminoácidos están numerados desde el residuo M inicial al inicio de la proteína del CRCV, como se muestra en la Figura 4.
CUADRO 1 Lista de 39 aminoácidos específicos para la proteína S de CRCV que no se presentan en las proteínas S de BCV, HCV y HEV Un primer aspecto de la invención proporciona una proteína S de coronavirus, o un fragmento de la misma, que tiene al menos 75% de identidad de la secuencia de aminoácidos con la proteína S de CRCV cuya secuencia de aminoácidos se lista en la Figura 4, y que tiene al menos una de V en la posición 103; V en la posición 118; D en la posición 166; M en la posición 171 ; K en la posición 79; P en la posición 192; S en la posición 2 0; H en la posición 235; F en la posición 267; F en la posición 388; M en la posición 407; S en la posición 436; I en la posición 440; I en la posición 447; F en la posición 501 ; Y en la posición 525; N en la posición 528; L en la posición 540; K en la posición 582; G en la posición 608; G en la posición 692; S en la posición 695; W en la posición 757; G en la posición 758; Q en la posición 763; T en la posición 769; P en la posición 786; H en la posición 792; R en la posición 818; P en la posición 827; V en la posición 828; F en la posición 887; D en la posición 933; F en la posición 977; T en la posición 101 1 ; S en la posición 1018; K en la posición 1063; L en la posición 1256; y M en la posición 1257. Los aminoácidos se enumeran desde la M inicial al inicio de la proteína S de CRCV, como se lista en la Figura 4 (SEQ ID NO: 4). Se aprecia que la secuencia nucleotídica parcial de S de CRCV puede determinarse fácilmente por una persona con experiencia ordinaria en la técnica, secuenciando el inserto del plásmido contenido en la cepa D-1 de E. col¡ de CRCV, como se ha depositado bajo el Tratado dé Budapest en NCIMB Ltd., bajo el número de Acceso NCIMB 41 146, en el 25 Julio de 2002. Además, este ADN puede utilizarse como una sonda de hibridación, o como la base para el diseño de sondas, en el aislamiento del ácido nucleico de CRCV en perro. Para evitar la duda, la invención incluye una proteína S de coronavirus, o un fragmento de la misma, que tiene al menos 75% de identidad de la secuencia de aminoácidos con la proteína S de CRCV (SEQ ID NO: 4), y que comprende al menos uno de los aminoácidos específicos para la proteína S de CRCV en la posición listada en el Cuadro 1.
Por "proteína", también incluimos el significado de glucoproteína. La secuencia de aminoácidos de una glucoproteína se refiere a la secuencia de aminoácidos de la cadena polipeptídica de la glucoproteína, sin importar el tipo, número, secuencia y posición de los azúcares unidos a la misma. De manera típica, la invención incluye una proteína aislada o recombinante, y no una proteína de CRCV no modificada presente como un componente de CRCV. La invención incluye una proteína S de coronavirus, o un fragmento de la misma, que tiene al menos 76% de identidad de la secuencia de aminoácidos con la proteína S de CRCV (SEQ ID NO: 4), o al menos 77%, o al menos 78%, o al menos 79%, o al menos 80%, o al menos 81 %, o al menos 82%, o al menos 83%, o al menos 84%, o al menos 85%, o al menos 86%, o al menos 87%, o al menos 88%, o al menos 89%, o al menos 90%, o al menos 91 %, o al menos 92%, o al menos 93%, o al menos 94%, o al menos 95%, o al menos 96%, o al menos 97%, o al menos 98%, o al menos 99% de identidad de la secuencia de aminoácidos con la proteína S de CRCV, y que comprende al menos uno de los aminoácidos específicos para la proteína S de CRCV en la posición listada en el Cuadro 1. La invención también incluye una proteína S de coronavirus, o un fragmento de la misma, que tiene al menos 75%, o al menos 80%, o al menos 85% o al menos 90% o al menos 95% de identidad de la secuencia de aminoácidos con la proteína S de CRCV (SEQ ID NO: 4), y que comprende al menos 2, o al menos 3, o al menos 4, o al menos 5, o al menos 6, o al menos 7, o al menos 8, o al menos 9, o al menos 10, o al menos 1 , o al menos 12, o al menos 13, o al menos 14, o al menos 15, o al menos 16, o al menos 17, o al menos 18, o al menos 19, o al menos 20, o al menos 21 , o al menos 22, o al menos 23, o al menos 24, o al menos 25, o al menos 26, o al menos 27, o al menos 28, o al menos 29, o al menos 30, o al menos 31 , o al menos 32, o al menos 33, o al menos 34, o al menos 35, o al menos 36, o al menos 37, o al menos 38 de los aminoácidos específicos para la proteína S de CRCV en las posiciones listadas en el Cuadro 1. De manera preferida, la proteína S de coronavirus, o fragmento de la misma, comprende todos los 39 residuos de aminoácidos específicos para la proteína S de CRCV en las posiciones listadas en el Cuadro 1. Así, la invención incluye una proteína S de BCV, HCV o HEV o fragmento de la misma, que se ha modificado en al menos una posición listada en el Cuadro 1 para parecerse a la proteína S de CRCV. De manera preferida, la proteína S de coronavirus de la invención es una proteína S de CRCV que comprende o consiste de la secuencia listada en la Figura 4 (SEQ ID NO: 4), o una variante de la misma, con al menos 97% de identidad con la secuencia listada en la Figura 4. De manera preferida, la variante tiene al menos 98%, o al menos 99% de identidad de la secuencia de aminoácidos con la secuencia listada en la Figura 4. De manera más preferida, la variante tiene al menos 99.1 %, o al menos 99.2%, o al menos 99.3%, o al menos 99.4%, o al menos 99.5%, o al menos 99.6%, o al menos 99.7%, o al menos 99.8%, o al menos 99.9% de identidad de la secuencia de aminoácidos con la secuencia listada en la Figura 4. Así, la variante de la proteína S de coronavirus de la invención incluye una proteína que comprende o consiste de la secuencia listada en la Figura 4 (SEQ ID NO: 4), pero que tiene entre 1 y 40 diferencias de aminoácidos de la secuencia listada en la Figura 4. De manera preferida, la variante tiene menos que 40 diferencias de aminoácidos de la secuencia listada en la Figura 4. De manera más preferida, la variante tiene menos que 35, menos que 30, o menos que 25, o menos que 20, o menos que 15 ó 10 ó 9 ó 8 ó 7 ó 6 ó 5 ó 4 ó 3 ó 2 de diferencias de aminoácidos, o una sola diferencia de aminoácidos, de la secuencia listada en la Figura 4. La invención también incluye un fragmento de proteína S de CRCV que comprende un fragmento de la secuencia listada en la Figura 4 (SEQ ID NO: 4), que comprende al menos uno de los aminoácidos específicos para la proteína S de CRCV en la posición listada en el Cuadro 1. La invención incluye una proteína S de coronavirus, o un fragmento de la misma, que tiene al menos 75% de identidad de la secuencia de aminoácidos con la proteína S de la cepa LY138 de BCV (SEQ ID NO: 14, No. de Acceso de Genbank AF058942), y que comprende al menos una de V en la posición 103; V en la posición 118; D en la posición 166; M en la posición 171 ; K en la posición 179; P en la posición 192; S en la posición 210; H en la posición 235; F en la posición 267; F en la posición 388; M en la posición 407; S en la posición 436; I en la posición 440; I en la posición 447; F en la posición 501 ; Y en la posición 525; N en la posición 528; L en la posición 540; K en la posición 582; G en la posición 608; G en la posición 692; S en la posición 695; W en la posición 757; G en la posición 758; Q en la posición 763; T en la posición 769 en la posición 786; H en la posición 792; R en la posición 818; P en la posición 827; V en la posición 828; F en la posición 887; D en la posición 933; F en la posición 977; T en la posición 101 1 ; S en la posición 1018; K en la posición 1063; L en la posición 1256 y M en la posición 1257. Para evitar la duda, la invención incluye una proteína S de coronavirus, o un fragmento de la misma, que tiene al menos 75% de identidad de la secuencia de aminoácidos con la proteína S de la cepa LY138 de BCV (SEQ ID NO: 14), y que comprende al menos uno de los aminoácidos específicos para la proteína S de CRCV en la posición listada en el Cuadro 1. La invención incluye una proteína S de coronavirus, o un fragmento de la misma, que tiene al menos 76% de identidad de la secuencia de aminoácidos con la proteína S de la cepa LY138 de BCV, o al menos 77%, o al menos 78%, o al menos 79%, o al menos 80%, o al menos 81 %, o al menos 82%, o al menos 83%, o al menos 84%, o al menos 85%, o al menos 86%, o al menos 87%, o al menos 88%, o al menos 89%, o al menos 90%, o al menos 91 %, o al menos 92%, o al menos 93%, o al menos 94%, o al menos 95%, o al menos 96%, o al menos 97%, o al menos 98%, o al menos 99% de identidad de la secuencia de aminoácidos con la proteína S de la cepa LY138 de BCV, y que tiene al menos uno de los aminoácidos específicos para la proteína S de CRCV en la posición listada en el Cuadro 1. La invención también incluye una proteína S de coronavirus, o un fragmento de la misma, que tiene al menos 75%, o al menos 80%, o al menos 85%, o al menos 90%, o al menos 95% de identidad de la secuencia de aminoácidos con la proteína S de la cepa LY138 de BCV (SEQ ID NO: 14), y que comprende al menos 2, o al menos 3, o al menos 4, o al menos 5, o al menos 6, o al menos 7, o al menos 8, o al menos 9, o al menos 10, o al menos 11 , o al menos 12, o al menos 13, o al menos 14, o al menos 15, o al menos 16, o al menos 17, o al menos 18, o al menos 19, o al menos 20, o al menos 21 , o al menos 22, o al menos 23, o al menos 24, o al menos 25, o al menos 26, o ai menos 27, o al menos 28, o al menos 29, o al menos 30, o al menos 31 , o al menos 32, o al menos 33, o al menos 34, o al menos 35, o al menos 36, o al menos 37, o al menos 38 de los aminoácidos específicos para la proteína S de CRCV en las posiciones listadas en el Cuadro 1. De manera preferida, la proteína S de coronavirus, o fragmento de la misma comprende todos los 39 residuos de aminoácidos específicos para la proteína S de CRCV en las posiciones listadas en el Cuadro 1 . Un segundo aspecto de la invención proporciona una proteína pol de coronavirus, o un fragmento de la misma, que tiene al menos 90% de identidad de la secuencia de aminoácidos con la proteína pol de BCV (SEQ ID NO: 5), y que comprende el aminoácido E en la posición correspondiente a la posición 4975 en el genoma de BCV (No. de Acceso SWALL: Q91A29).
La invención incluye una proteína pol de coronavirus, o fragmento de la misma, que tiene al menos 91 % de identidad de la secuencia de aminoácidos con la proteína pol de la cepa LY138 de BCV, o al menos 92%, o al menos 93%, o al menos 94%, o al menos 95%, o al menos 96%, o al menos 97%, o al menos 98%, o al menos 99% de identidad de la secuencia de aminoácidos con la proteína pol de la cepa LY138 de BCV, y que tiene el aminoácido E en la posición correspondiente a la posición 4975 en el genoma de BCV (No. de Acceso SWALL: Q91A29). De manera preferida, la proteína pol de coronavirus, o fragmento de la misma, es una proteína pol de CRCV o fragmento de la misma, que comprende o consiste de las secuencias de aminoácidos listada en la Figura 2. Así, la invención incluye una proteína pol de BCV, HCV o HEV o fragmento de la misma, que se ha modificado en el aminoácido correspondiente a la posición 4975 en el genoma de BCV, para parecerse a la proteína pol de CRCV. La invención también incluye un fragmento de proteína pol de CRCV, que comprende un fragmento de la secuencia listada en la Figura 2 (SEQ ID NO: 2), y que tiene el aminoácido E en la posición correspondiente a la posición 4975 en el genoma de BCV. Un tercer aspecto de la invención proporciona una proteína HE de coronavirus, o fragmento de la misma, que tiene al menos 90% de identidad de la secuencia de aminoácidos con la proteína HE LY138 de BCV (No. de Acceso de Genbank AF058942), y que tiene al menos una de F en la posición 235; N en la posición 242; y L en la posición 253. Las posiciones de los aminoácidos están numeradas desde la M inicial (que es el número 1 ), al inicio de la proteína HE de BCV. La invención incluye una proteína HE de coronavirus, o fragmento de la misma, que tiene al menos 91 % de identidad de la secuencia de aminoácidos con la proteína HE de la cepa LY138 de BCV, o al menos 92%, o al menos 93%, o al menos 94%, o al menos 95%, o al menos 96%, o al menos 97%, o al menos 98%, o al menos 99% de identidad de la secuencia de aminoácidos con la proteína HE de la cepa LY138 de BCV, y que tiene al menos una de F en la posición 235; N en la posición 242; y L en la posición 253. Las posiciones de los aminoácidos están numeradas desde la M inicial (que es el número 1 ), al inicio de la proteína HE de BCV. La invención también incluye una proteína HE de coronavirus, o fragmento de la misma, que tiene al menos 90%, o al menos 91 %, o al menos 92%, o al menos 93%, o al menos 94%, o al menos 95%, o al menos 96%, o al menos 97%, o al menos 98%, o al menos 99% de identidad de la secuencia de aminoácidos con la proteína HE de la cepa LY138 de BCV, y que tiene dos de F en la posición 235; N en la posición 242; y L en la posición 253. Las posiciones de los aminoácidos están numeradas desde la M inicial (que es el número 1 ), al inicio de la proteína HE de BCV. La invención incluye además una proteína HE de coronavirus, o fragmento de la misma, que tiene al menos 90%, o al menos 91 %, o al menos 92%, o al menos 93%, o al menos 94%, o al menos 95%, o al menos 96%, o al menos 97%, o al menos 98%, o al menos 99% de identidad de la secuencia de aminoácidos con la proteína HE de la cepa LY138 de BCV, y que tiene las tres de F en la posición 235; N en la posición 242; y L en la posición 253. Las posiciones de los aminoácidos están numeradas desde la inicial (que es el número 1 ), al inicio de la proteína HE de BCV. De manera preferida, la proteína HE de coronavirus, o fragmento de la misma es una proteína HE de CRCV o un fragmento de la misma, que comprende o consiste de las secuencias de aminoácidos listada en la Figura 14 (SEQ ID NO: 22). Así, la invención incluye una proteína HE de BCV, HCV, HECV o HEV o fragmento de la misma, que se ha modificado en uno o más de los aminoácidos correspondientes a las posiciones 235, 242 y 253, para parecerse a la proteína HE de CRCV. La invención también incluye un fragmento de proteína HE de CRCV que comprende un fragmento de la secuencia listada en la Figura 14 (SEQ ID NO: 22), y que tiene uno o más del aminoácido F en la posición 235, N en la posición 242, y L en la posición 253. La numeración de estas posiciones de los aminoácidos corresponde a aquella de la proteína HE LY138 de BCV (No. de Acceso de Genbank AF058942), en la cual el residuo número 1 es la M inicial al inicio de la proteína HE LY138 de BCV.
Las proteínas S, pol y H del coronavirus, como se definió anteriormente en el primer, segundo y tercer aspectos de la invención, pueden denominarse aquí proteínas "CRCV" o "similares a CRCV". Una "proteína S de CRCV", es una proteína S o un fragmento de la misma que tiene la secuencia de aminoácidos de S de CRCV nativa como se lista en la Figura 4 (SEQ ID NO: 4), o un fragmento de la misma, que comprende al menos uno de los aminoácidos específicos para una proteína S de CRCV en las posiciones listadas en el Cuadro 1. Una "proteína pol de CRCV", es una proteína pol o un fragmento de la misma que tiene la secuencia de aminoácidos de pol de CRCV nativa, como se lista en la Figura 2 (SEQ ID NO: 2), o un fragmento de la misma, que comprende el aminoácido E en la posición correspondiente a la posición 4975 en el genoma de BCV. Una "proteína HE de CRCV", es una proteína HE o fragmento de la misma que tiene la secuencia de aminoácidos de HE de CRCV nativa como se lista en la Figura 14 (SEQ ID NO: 22), o un fragmento de la misma, que comprende uno o más del aminoácido F en la posición 235, N en la posición 242, y L en la posición 253. La numeración de estas posiciones de los aminoácidos corresponde a aquélla de la proteína HE LY138 de BCV (No. de Acceso de Genbank AF058942), en la cual el residuo número 1 es la M inicial al inicio de la proteína HE LY138 de BCV. Una "proteína S similar a CRCV", es una proteína S o fragmento de la misma, que no tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a la secuencia de aminoácidos de S de CRCV nativa (Figura 4 y SEQ ID NO: 4), pero que tiene al menos 75% de identidad de la secuencia con la región correspondiente de la proteína S cepa LY138 de CRCV o de BCV, y tiene al menos uno de los aminoácidos específicos para una proteína S de CRCV en las posiciones listadas en el Cuadro 1. Una "proteína S similar a CRCV", también incluye una proteína S que no tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a la secuencia de aminoácidos de S de CRCV nativa (Figura 4 y SEQ ID NO: 4), pero que comprende o consiste de una variante de la secuencia listada en la Figura 4 con al menos 97% de identidad con la secuencia listada en la Figura 4. De manera preferida, la variante tiene al menos 98%, o al menos 99% de identidad de la secuencia de aminoácidos con la secuencia listada en la Figura 4. De manera más preferida, la variante tiene al menos 99.1 %, o al menos 99.2%, o al menos 99.3%, o al menos 99.4%, o al menos 99.5%, o al menos 99.6%, o al menos 99.7%, o al menos 99.8%, o al menos 99.9% de identidad de la secuencia de aminoácidos con la secuencia listada en la Figura 4. Una "proteína pol similar a CRCV", es una proteína pol o un fragmento de la misma, que no tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a la secuencia de aminoácidos de pol de CRCV nativa, pero que tiene al menos 90% de identidad de la secuencia con la proteína pol de la cepa LY138 de BCV, y que tiene una E en la posición correspondiente a la posición 4975 en el genoma de BCV.
Una "proteína HE similar a CRCV", es una proteína HE o un fragmento de la misma que no tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a la secuencia de aminoácidos de HE de CRCV nativa, pero que tiene al menos 90% de identidad de la secuencia con la proteína HE cepa LY138 de BCV correspondiente, y que tiene uno o más del aminoácido F en la posición 235, N en la posición 242, y L en la posición 253. La numeración de estas tres posiciones de aminoácidos corresponde a aquélla de la proteína HE LY138 de BCV (No. de Acceso de Genbank AF058942), en la cual el número de residuo 1 es la M inicial al inicio de la proteína HE LY138 de BCV. De manera preferida, la proteína de CRCV o similar a CRCV, o fragmento de la misma, es al menos de 10 aminoácidos de longitud. De manera más preferida, la proteína de CRCV o similar a CRCV, o fragmento de la misma, es al menos 20, o al menos 30, o al menos 40, o al menos 50, o al menos 100, o al menos 200, o al menos 300, o al menos 400, o al menos 500, o al menos 600, o al menos 700, o al menos 800, o al menos 900, o al menos 1 ,000, o al menos 1 ,100, o al menos 1 ,200 aminoácidos de longitud. De manera preferida, la proteína de CRCV o similar a CRCV, o fragmento de la misma, es de menos que aproximadamente 1 ,300 aminoácidos de longitud. De manera más preferida, la proteína de CRCV o similar a CRCV, o fragmento de la misma, es de menos que aproximadamente 1 ,200, o menos que aproximadamente 1 ,100, o menos que aproximadamente 1 ,000, o menos que aproximadamente 900, o menos que aproximadamente 800, o menos que aproximadamente 700, o menos que aproximadamente 600, o menos que aproximadamente 500, o menos que aproximadamente 400, o menos que aproximadamente 300, o menos que aproximadamente 200, o menos que aproximadamente 100, o menos que aproximadamente 50 aminoácidos de longitud. Las proteínas de CRCV pueden aislarse de CRCV, o pueden hacerse utilizando técnicas de química de proteínas, por ejemplo, utilizando la proteólisis parcial de proteínas aisladas (ya sea exolítica o endolíticamente), o mediante síntesis de novo. De manera alterna, las proteínas de CRCV, así como las proteínas similares a CRCV, pueden hacerse mediante tecnología de ADN recombinante. Las técnicas adecuadas para clonar, manipular, modificar y expresar los ácidos nucleicos, y la purificación de las proteínas expresadas, son bien conocidas en la técnica, y se describen, por ejemplo, en Sambrook et al (2001 ) "Molecular Cloning, a Laboratory Manuaí', 3a edición, Sambrook et al (eds), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, E.U.A., incorporado aquí como referencia. Los fragmentos más cortos de las proteínas de CRCV y similares a CRCV, es decir, péptidos, pueden sintetizarse utilizando técnicas estándar. Los péptidos pueden sintetizarse mediante el modo de Fmoc-poliamida de la síntesis peptídica en fase sólida, como se describe por Lu et al (1981 ) J. Org. Chem. 46, 3433 y las referencias en la misma. La protección temporal del grupo N-amino, se proporciona por el grupo 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc). La escisión repetitiva de este grupo protector altamente lábil y básico, se efectúa utilizando piperidina al 20% en ?,?-dimetilformamida. Las funcionalidades de la cadena lateral pueden protegerse como sus éteres butílicos (en el caso de serina treonina y tirosina), ésteres butílicos (en el caso del ácido glutámico y el ácido aspártico), derivados de butiloxicarbonilo (en el caso de lisina e histidina), derivado de tritilo (en el caso de cisteína) y derivado de 4-metoxi-2,3,6-trimetilbencensulfonilo (en el caso de arginina). En donde la glutamina o la asparagina son residuos C terminales, se hace uso del grupo 4,4 -dimetoxibenzhidrilo para la protección de las funcionalidades amino de la cadena lateral. El soporte en fase sólida está basado en un polímero de polidimetil-acrilamida constituido de tres monómeros de dimetilacrilamida (cadena-monómero), bisacriloiletilen diamina (reticulante), y éster metílico de acriloilsarcosina (agente funcionalizante). El agente enlazado escindible péptido a resina utilizado, es el derivado del ácido 4-hidroximetil-fenoxiacético lábil y ácido. Todos los derivados de aminoácido se agregan como sus derivados de anhídrido simétrico preformados, con la excepción de la asparagina y glutamina, que se agregan utilizando un procedimiento de acoplamiento inverso mediado por N,N-diciclohexil-carbodiimida/1-hidroxibenzotriazol. Todas las reacciones de acoplamiento y desprotección se verifican utilizando procedimientos de prueba con ninhidrina, ácido trinitrobencen sulfónico o isotina. Tras la consumación de la síntesis, los péptidos se escinden del soporte de resina con la eliminación concomitante de los grupos protectores de la cadena lateral, mediante el tratamiento con ácido trifluoroacético al 95% que contiene una mezcla depuradora al 50%. Los depuradores utilizados comúnmente son etanditiol, fenol, anisol y agua, la elección exacta depende de los aminoácidos constituyentes del péptido que está siendo sintetizado. El ácido trifluoroacético se elimina mediante evaporación in vacuo, con la trituración posterior con éter dietílico que proporciona el péptido crudo. Cualesquier depuradores presentes se eliminan mediante un simple procedimiento de extracción, el cual, tras la liofilización de la fase acuosa proporciona el péptido crudo libre de depuradores. Los reactivos para la síntesis peptídica están disponibles generalmente de Calbiochem-Novabiochem (RU) Ltd, Nottingham NG7 2QJ, RU. La purificación puede efectuarse por cualquiera, o una combinación de técnicas tales como cromatografía por exclusión de tamaño, cromatografía por intercambio iónico (principalmente), cromatografía líquida de alto rendimiento en fase inversa. Los análisis de los péptidos pueden llevarse a cabo utilizando cromatografía en capa fina, cromatografía líquida de alto . rendimiento en fase inversa, análisis de aminoácidos después de hidrólisis ácida y mediante análisis espectrométricos de masa por bombardeo rápido con átomos (FAB). Un cuarto aspecto de la invención proporciona un polinucleótido que codifica una proteína S, pol o HE de CRCV o similar a CRCV, de acuerdo con el primer, segundo y tercer aspectos de la invención, o el complemento de la misma. De manera preferida, el polinucleótido codifica una proteína S de CRCV de acuerdo con el primer aspecto de la invención, o el complemento de la misma.
De manera más preferida, el polinucleótido que codifica la proteína S de CRCV, comprende o consiste de la secuencia listada en la Figura 3 (SEQ ID NO: 3). Se aprecia que la secuencia listada en la Figura 3 (SEQ ID NO: 3), contiene una Y en la posición 3531 , que se refiere ya sea a C o T. En ambos casos, el aminoácido correspondiente es lie. Así, la invención incluye un polinucleótido que codifica una proteína S de CRCV que comprende o consiste de la secuencia listada en la Figura 3, y que tiene una C en la posición 3531. La invención también incluye un polinucleótido que codifica una proteína S de CRCV que comprende o consiste de la secuencia listada en la Figura 3, y que tiene una T en la posición 3531 . La invención también incluye un polinucleótido S de CRCV que comprende un fragmento de la secuencia listada en la Figura 3 (SEQ ID NO: 3), que codifica una proteína que tiene al menos uno de los aminoácidos específicos para la proteína S de CRCV en la posición listada en el Cuadro 1 , o el complemento de la misma. De manera preferida, el polinucleótido que codifica la proteína pol comprende o consiste de la secuencia listada en la Figura 1 (SEQ ID NO: 1 ), o el complemento de la misma. La invención también incluye un polinucleótido pol de CRCV, que comprende un fragmento de la secuencia listada en la Figura 1 (SEQ ID NO: ), que codifica una proteína que tiene una E en la posición correspondiente a la posición 4975 en el genoma de BCV, o el complemento del mismo.
De manera preferida, el polinucleótido que codifica la proteína HE comprende o consiste de la secuencia listada en la Figura 13 (SEQ ID NO: 21 ), o el complemento del mismo. Xa invención también incluye un polinucleótido HE de CRCV que comprende un fragmento de la secuencia listada en la Figura 3 (SEQ ID NO: 21 ) que codifica una proteína que tiene uno o más del aminoácido F en la posición 235, N en la posición 242, y L en la posición 253. La numeración de estas tres posiciones de los aminoácidos corresponde a aquella de la proteína HE LY138 de BCV (No. de Acceso de Genbank AF058942), en la cual el número de residuo 1 es la M inicial al inicio de la proteína HE LY138 de BCV. Los polinucleótidos como se definieron anteriormente, se refieren aquí como polinucleótidos de CRCV o similares a CRCV de la invención. Un "polinucleótido similar a CRCV", es un polinucleótido que no tiene una secuencia base idéntica a toda o un fragmento de la secuencia del ADNc de CRCV nativa, como se lista en las Figuras 1 , 3 y 13 (SEQ ID NOS: 1 , 3 y 21 ), sino que codifica una proteína S, pol o HE de CRCV o similar a CRCV como se definió anteriormente, o el complemento de la misma. El CRCV es un virus con ARN de hebra positiva. El polinucleótido de la invención puede ser ADN o ARN. El ARN puede ser un ARN de hebra positiva o negativa. El ADN puede ser un ADN con hebra sencilla o doble. Las técnicas adecuadas para clonar y secuenciar un ADNc de un virus con ARN de hebra positiva, tal como un CRCV, son bien conocidas en la técnica y se describen, por ejemplo, en Sambrook eí al 2001 , incorporada aquí como referencia. Los polinucleótidos de CRCV o similares a CRCV de la invención, pueden ser de cualquiera tamaño adecuado. Sin embargo, para estos propósitos, tales como sondeo o amplificación, se prefiere que el ácido nucleico tenga menos que 3,000, de manera más preferida menos que 1000, de manera aún más preferida de 10 a 100, y con preferencia adicional de 15 a 30 pares de bases (si el ácido nucleico es de hebra doble), o bases (si el ácido nucleico es de hebra sencilla). Como se describe más completamente a continuación, los oligonucleótidos de ADN con hebra sencilla adecuados para utilizarse como sondas de hibridación o como cebadores en una reacción de cadena de polimerasa, son particularmente preferidos. Los oligonucleótidos que pueden amplificar o hibridar específicamente los polinucleótidos S, pol o HE de CRCV, en oposición a los polinucleótidos S, pol o HE de BCV, HCV, HEV o CCV entérico, son particularmente preferidos. Los oligonucleótidos adecuados pueden determinarse por una persona con experiencia en la técnica, mediante referencia a las comparaciones de la secuencia nucleotídica de las Figuras 6, 8, 9 y 15. Se aprecia que los oligonucleótidos de CRCV o similares a CRCV puede, incluso bajo condiciones altamente rigurosas, hibridarse al ácido nucleico, ya sea ARN o ADN, de HCV, BCV y HEV, así como de CRCV. Sin embargo, se prefiere que los oligonucleótidos de CRCV o similares a CRCV se hibriden al ácido nucleico de CRCV bajo condiciones más rigurosas que al ácido nucleico de HCV, BCV o HEV. Esto puede determinarse experimentalmente o mediante comparación de la secuencia oligonucleotídica con las secuencias de CRCV, HCV, BCV y HEV respectivas, como es bien conocido por alguien con experiencia en la técnica (Sambrook ef al 2001 ). También se aprecia que los oligonucleótidos de CRCV o similares a CRCV pueden hibridarse al ácido nucleico, ya sea ARN o ADN, del CCV entérico, así como del CRCV. Sin embargo, se prefiere que los oligonucleótidos de CRCV o similares a CRCV se hibriden al ácido nucleico del CRCV bajo condiciones más rigurosas que al ácido nucleico del CCV entérico. Esto puede determinarse experimentalmente o mediante una comparación de la secuencia oligonucleotídica con las secuencias respectivas, como es bien conocido por alguien con experiencia en la técnica (Sambrook et al 2001 ). De manera preferida, los oligonucleótidos no se hibridan al ácido nucleico del CCV entérico bajo condiciones rigurosas (véase a continuación). De manera conveniente, los polinucleótidos u oligonucleótidos de CRCV o similares a CRCV comprenden además una marca detectable. Por "marca detectable", se incluye cualquier marca radioactiva conveniente, tal como 32P, 33P o 35S, que pueda incorporarse fácilmente en una molécula de ácido nucleico, utilizando métodos bien conocidos; también se incluye cualquier marca fluorescente o quimioluminiscente conveniente, que pueda incorporarse fácilmente en un ácido nucleico. Además, el término "marca detectable", incluye una porción que puede detectarse en virtud de unirse a otra porción (tal como biotina, que puede detectarse por unirse a la estreptavidina); y una porción, tal como una enzima, que puede detectarse en virtud de su capacidad para convertir un compuesto incoloro en un compuesto coloreado o viceversa (por ejemplo, la fosfatasa alcalina puede convertir el o-nitrofenilfosfato incoloro en el o-nitrofenol coloreado). De manera conveniente, la sonda del ácido nucleico puede ocupar una cierta posición en un arreglo fijo y si un ácido nucleico se híbrida a ésta, puede determinarse con referencia a la posición de la hibridación en el arreglo fijo. El marcado con [32P]dCTP, puede llevarse a cabo utilizando un equipo para marcado con cebador aleatorio Rediprime®, suministrado por Amersham. Se prefieren los cebadores que son adecuados para utilizarse en una reacción de cadena de polimerasa (PCR; Saiki et al (1988) Science 239, 487-491 ). Los cebadores adecuados para la PCR, pueden tener las siguientes propiedades: Es bien conocido que la secuencia en el extremo 5' del oligonucleótido no necesita coincidir con la secuencia objetivo a ser amplificada. Es usual que los cebadores para la PCR no contengan ninguna estructura complementaria una con otra mayor de 2 bases, especialmente en sus extremos 3', puesto que esta característica puede promover la formación de un producto aberrante llamado "dímero cebador". Cuando los extremos 3' de los dos cebadores de hibridan, forman un complejo "plantilla cebada", y la extensión del cebador resulta en un producto doble corto llamado "dímero cebador". La estructura secundaria interna debe evitarse en los cebadores. Para la PCR simétrica, se recomienda con frecuencia, un contenido de G+C de 40-60% para ambos cebadores, sin tramos largos de cualquier base. Los cálculos clásicos de la temperatura de fusión utilizados en conjunto con los estudios de hibridación de la sonda de ADN con frecuencia predicen que un cebador dado debe recocerse a una temperatura específica o que la temperatura de extensión de 72°C disociará prematuramente el híbrido de cebador/plantilla. En la práctica, los híbridos son más efectivos en el procedimiento de PCR que los predichos generalmente mediante simples cálculos de Tm. Las temperaturas de recocido óptimas pueden determinarse empíricamente, y pueden ser más altas que las predichas. La polimerasa Taq de ADN tiene actividad en la región de 37-55°C, de manera que la extensión del cebador ocurrirá durante el paso de recocido y el híbrido se estabilizará. Las concentraciones de los cebadores son iguales en la PCR convencional (simétrica) y, típicamente, dentro del intervalo de 0.1 a 1µ . Se apreciará además que si se va a llevar a cabo una reacción de amplificación de control, por ejemplo, utilizando cebadores complementarios a un gen expresado ubicuamente, puede ser benéfico para los productos del control y los productos de CRCV o similares a CRCV que sean de diferentes tamaños, de manera que los dos productos pueden distinguirse mediante los medios de detección empleados, por ejemplo, mediante movilidad en electroforesis con gel de azarosa. Sin embargo, puede ser deseable que los dos productos sean de tamaño similar, por ejemplo, ambos de entre 100 y 1000, o entre 100 y 600 nucleótidos de largo. Esto puede ayudar a los análisis simultáneos de los productos, por ejemplo, mediante electroforesis en gel, y también puede significar que las reacciones de amplificación del control y del CRCV o similar a CRCV pueden tener características de desempeño similares, en términos, por ejemplo, de las velocidades relativas de acumulación del producto a diferentes etapas durante la reacción. Cualquiera de los protocolos de amplificación para ácidos nucleicos puede utilizarse en el método de la invención, incluyendo la reacción de cadena de polimerasa, replicasa QB y reacción en cadena de la ligasa. También, puede utilizarse NASBA (amplificación basada en la secuencia del ácido nucleico), también llamada 3SR, como se describe en Compton (1991 ) Nature 350, 91 -92 y AIDS (1993), Vol 7 (Supl 2), puede utilizarse la S108 o SDA (amplificación por desplazamiento de la hebra), como se describe en Walker et al (1992) Nucí. Acids Res. 20, 1691-1696. La reacción en cadena de la polimerasa es particularmente preferida debido a su simplicidad. Cuando se utilizan un par de ácidos nucleicos adecuados de la invención en una PCR, es conveniente detectar el producto mediante electroforesis en gel y tinción con bromuro de etidio. Como una alternativa, es conveniente utilizar un oligonucleótido marcado capaz de hibridarse al ADN amplificado como una sonda. Cuando la amplificación es mediante PCR, la sonda de oligonucleótido se híbrida a la secuencia intercebador, como se define por los dos cebadores. La sonda oligonucleotidica es, de manera preferida, de entre 10 y 50 nucleótidos de largo, de manera más preferida, de entre 15 y 30 nucleótidos de largo. Puede ser más larga que el ADN amplificado, o incluir uno o ambos de los cebadores, pero en este caso, las condiciones de hibridación deben ser tales que la sonda se hibride a los cebadores solos, sino que únicamente a un producto amplificado que también contiene la secuencia intercebador que es capaz de hibridarse a la sonda. La sonda puede marcarse con un radionúclido tal como 32P, 33P y 35S, utilizando técnicas estándar, o pueden marcarse con un tinte fluorescente. Cuando la sonda oligonucleotidica está marcada fluorescentemente, el producto de ADN puede detectarse en solución (véase, por ejemplo Balaguer eí al (1991 ). "Quantification of DNA sequences obtained by polymerase chain reaction using a bioluminescence adsorbent" Anal. Biochem. 195, 105-110 y Dilesare et al (1993) "A high-sensitivity electrochemiluminescence-based detection system for automated PCR product quantitation" BioTechniques 15, 152-157. Los productos de la PCR también pueden detectarse utilizando una sonda que puede tener un par fluoróforo-extinguidor, o puede unirse a un soporte sólido o puede tener una etiqueta de biotina o pueden detectarse utilizando una combinación de una sonda de captura y una sonda del detector.
Los pares fluoróforo-extinguidor son particularmente adecuados para las mediciones cuantitativas de las reacciones de PCR (por ejemplo, RT-PCR). La polarización de la fluorescencia que utiliza una sonda adecuada, también puede utilizarse para detectar los productos de la PCR. La invención también incluye un vector que comprende el polinucleótido de CRCV o similar a CRCV del cuarto aspecto de la invención. Los plásmidos del vector procariótico típicos son: pUC18, pUC19, pBR322 y pBR329, disponibles de Biorad Laboratories (Richmond, CA, E.U.A.); p77c99A, pKK223-3, pKK233-3, pDR540 y pRIT5, disponibles de Pharmacia (Piscataway, NJ, E.U.A.); vectores pBS, vectores Phagescript, vectores Bluescript, pNH8A, pNH16A, pNH18A, pNH46A, disponibles de Stratagene Cloning Systems (La Jolla, CA 92037, E.U.A.). Un plásmido de un vector de una célula de mamífero típico es pSVL disponible de Pharmacia (Piscataway, NJ, E.U.A.). Este vector utiliza el promotor tardío SV40 para accionar la expresión de los genes clonados, el nivel más alto de expresión se encuentra en las células que producen el antígeno T, tales como las células COS-1. Un ejemplo de un vector de expresión de un mamífero inducible es pMSG, también disponible de Pharmacia (Piscataway, NJ, E.U.A). Este vector utiliza el promotor inducible por glucocorticoide de la repetición de la terminal larga del virus del tumor mamario de ratón, para accionar la expresión del gen clonado. Los vectores de plásmido de levadura útiles son pRS403-406 y pRS413-416, y están generalmente disponibles de Stratagene Cloning Systems (La Jolla, CA 92037, E.U.A). Los plásmidos pRS403, pRS404, pRS405 y pRS406 se integran a la Levadura (Ylp), e incorpora los marcadores seleccionables de la levadura HIS3, TUPI, LEU2 y URA3. Los plásmidos pRS413-416, son plásmidos del Centrómero de la Levadura (YCp). Generalmente, el polinucleótido de CRCV o similar a CRCV de la invención se inserta en un vector de expresión, tal como un plásmido, en una orientación apropiada y en un marco de lectura correcto para la expresión. Puede enlazarse a las secuencias nucleotídicas de control que regulan la transcripción y la traducción apropiadas, reconocidas por el hospedero adecuado antes de la inserción en el vector, aunque tales controles están generalmente disponibles en el vector de expresión. Así, el polinucleótido del inserto de la invención, puede enlazarse de manera operativa a un promotor apropiado. Los promotores eucarióticos incluyen e! promotor temprano inmediato CMV, el promotor de la timidina cinasa HSV, los promotores tempranos y tardíos SV40 y los promotores de LTR retroviral. Otros promotores adecuados serán conocidos por el experto en la técnica. Los constructor de la expresión, de manera deseada, también contienen sitios para el inicio y la terminación de la transcripción, y en la región transcrita, un sitio de unión al ribosoma para la traducción (Hastings et al, Patente Internacional No. WO 98/16643). Pueden utilizarse métodos bien conocidos por aquellos con experiencia en la técnica para construir los vectores de expresión que contienen la secuencia codificante, y, por ejemplo, los controles transcripcionales o de traducción apropiados. Un método tal involucra el ligado vía colas de homopolímero. Las colas polidA (o polidC) de homopolímero, se agregan a los grupos OH 3' expuestos en el fragmento de ADN a ser clonado mediante desoxinucleotidil transferasas terminales. El fragmento es capaz a continuación, de recocerse a las colas polidT (o polidG) agregadas a los extremos de un vector plasmídico linealizado. Los huecos dejados después del recocido pueden llenarse mediante el ADN polimerasa y los extremos libres unirse mediante ADN ligasa. Otro método involucra el ligado vía extremos cohesivos. Los extremos cohesivos compatibles pueden generarse en el fragmento de ADN y el vector mediante la acción de enzimas de restricción adecuadas. Estos extremos se recocerán rápidamente a través del apareamiento complementario de las bases y las muescas restantes pueden cerrarse por la acción de la ADN ligasa. Un método adicional utiliza moléculas sintéticas llamadas enlazantes y adaptadores. Los fragmentos de ADN con extremos romos se generan mediante el ADN polimerasa del bacteriófago T4 o el ADN polimerasa I de E. coli que eliminan los términos 3' sobresalientes, y llenan los extremos 3' rebajados. Los enlazantes sintéticos, piezas de ADN de doble hebra con extremos romos, que contienen secuencias de reconocimiento para enzimas de restricción definidas, pueden ligarse a fragmentos de ADN con extremos romos mediante ADN ligasa de T4. Son digeridos posteriormente con enzimas de restricción apropiadas para crear extremos cohesivos y se ligan a un vector de expresión con términos compatibles. Los adaptadores también son fragmentos de ADN sintetizados químicamente, que contienen un extremo romo utilizado para el ligado, pero que también poseen un extremo cohesivo preformado. Los enlazantes sintéticos que contienen una variedad de sitios de endonucleasa de restricción, están comercial mente disponibles de varias fuentes, incluyendo International Biotechnologies inc, New Haven, CN, E.U.A. Una manera deseable de modificar el polinucleótido de la invención, es utilizar la reacción en cadena de la polimerasa como se describe por Saiki et al (1988) Science 239, 487-491. En este método, el ADN a ser amplificado enzimáticamente está flanqueado por dos cebadores oloigonucleotídicos específicos, que se incorporan ellos mismos en el ADN amplificado. Los cebadores específicos pueden contener sitios de reconocimiento de la endonucleasa de restricción que pueden utilizarse para clonarse en los vectores de expresión utilizando métodos conocidos en la técnica. La invención también incluye una célula hospedera transformada con el vector que comprende el polinucleótido de CRCV o similar a CRCV. La célula hospedera puede ser procariótica o eucariótica. Si el polinucleótido de CRCV o similar a CRCV, en el vector, se va a expresar como una glucoproteína, la célula hospedera es una célula hospedera eucariótica, y de manera preferida, es una célula hospedera de mamífero.
Las células bacterianas son células hospederas procarióticas, y típicamente son de una cepa de E. coli, tal como, por ejemplo, la cepa DH5 de E. coli disponible de Bethesda Research Laboratories Inc., Bethesda, D, E.U.A, y RR1 , disponibles de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) de Rockville, MD, E.U.A (No ATCC 31343). Las células hospederas eucarióticas preferidas, incluyen células de levadura y de mamífero, de manera preferida, células de vertebrado tales como aquéllas de una línea celular fibroblástica de ratón, rata, mono o humano. Las células hospederas de levadura incluyen YPH499, YPH500 y YPH501 , que están generalmente disponibles de Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, E.U.A. Las células hospederas de mamífero preferidas, incluyen las células de ovario de hámster Chino (CHO), disponibles de la ATCC como CCL61 , células de embrión de ratón NIH Swiss NIH/3T3, disponibles de la ATCC como CRL 1658, y células COS-1 derivadas de riñon de mono disponibles de la ATCC como CRL 1650. Las células de insecto preferidas son células Sf9 que pueden transfectarse con vectores de expresión de baculovirus. La transformación de las células hospederas apropiadas con un vector, se logra mediante métodos bien conocidos, que dependen típicamente del tipo de vector utilizado. Con respecto a la transformación de las células hospederas procarióticas, véase, por ejemplo, Cohén eí al (1972) Proc. Nati. Acad. Sc¡. E.U.A 69, 2110 y Sambrook eí al (2001 ) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3a Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. La transformación de las células de levadura se describe en Sherman et al (1986) Methods In Yeast Genetics, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY. El método de Beggs (1978) Nature 275, 104-109, también es útil. Con respecto a las células de vertebrado, los reactivos útiles en la transfección de tales células, por ejemplo, fosfato de calcio y DEAE-dextrano o formulaciones de liposoma, están disponibles de Stratagene Cloning Systems, o de Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD 20877, E.U.A. La electroporacion también es útil para transformar células, y es bien conocida en la técnica para transformar células de levadura, células bacterianas y células de vertebrado. Por ejemplo, muchas especies bacterianas pueden transformarse por los métodos descritos en Luchansky et al (1988) Mol. Microbiol. 2, 637-646, incorporado aquí como referencia. El número más grande de transformantes se recupera de manera consistente después de la electroporacion de la mezcla de ADN-células, suspendida en PEB 2.5x utilizando 6250V por cm a 25 µFD. Los métodos para la transformación de la levadura mediante electroporacion, se describen en Becker & Guarente (1990) Methods Enzymoi. 194, 182. Los métodos físicos pueden utilizarse para introducir ADN en células de animales y plantas. Por ejemplo, la microinyección utiliza una pipeta muy fina para inyectar moléculas de ADN directamente en el núcleo de las células a ser transformadas. Otro ejemplo involucra el bombardeo de las células con microproyectiles a alta velocidad, usualmente partículas de oro o tungsteno que se han recubierto con ADN. Las células transformadas de manera exitosa, es decir, las células que contienen un constructo de ADN de CRCV o similar a CRCV, pueden identificarse mediante técnicas bien conocidas. Por ejemplo, una técnica de selección involucra incorporar en el vector de expresión, una secuencia de ADN (marcador), que codifica una característica seleccionable en la célula transformada. Estos marcadores incluyen dihidrofolato reductasa, resistencia a G418 o neomicina para un cultivo celular eucariótico, y genes de resistencia a la tetraciclina, kanamicina o ampicilina para cultivar en E. coli y otras bacterias. De manera alterna, el gen para la característica seleccionable puede ser otro vector, que se utiliza para transformar la célula hospedera deseada. El gen marcador pueden utilizarse para identificar los transformantes, pero es deseable determinar cuales células contienen las moléculas de ADN recombinante, y cuales contienen las moléculas del vector autoligado. Esto puede lograrse utilizando un vector de clonación, en donde la inserción de un fragmento de ADN destruye la integridad de uno de los genes presentes en la molécula. Los recombinantes pueden identificarse por lo tanto, debido a la pérdida de función de ese gen. Otro método para identificar de manera exitosa las células transformadas involucra hacer crecer las células que resultan de la introducción de un constructo de expresión de la presente invención, para producir la proteína S, pol o HE de CRCV o similar a CRCV. Las células pueden cosecharse y lisarse, y su contenido de ADN examinarse para la presencia de ADN, utilizando un método tal como aquél descrito por Southern ( 975) J. Mol. Biol. 98, 503 o Berent et al (1985) Biotech. 3, 208. De manera alterna, la presencia de la proteína en el sobrenadante puede detectarse utilizando anticuerpos como se describe a continuación. Además de ensayar directamente para la presencia de ADN recombinante, la transformación exitosa puede confirmarse por métodos inmunológicos bien conocidos, cuando el ADN recombinante es capaz de dirigir la expresión de la proteína. Por ejemplo, las células transformadas exitosamente con un vector de expresión, producen proteínas que muestran una antigenicidad apropiada. Las muestras de células que se sospecha están transformadas, se cosechan y ensayan para la proteína utilizando anticuerpos adecuados. Así, además de las mismas células hospederas transformadas, la presente invención también contempla un cultivo de esas células, de manera preferida, un cultivo monoclonal (clonalmente homogéneo), o un cultivo derivado de un cultivo monoclonal, en un medio nutriente. Las células hospederas que se han transformado por el polinucleótido de CRCV o similar a CRCV, típicamente en un vector como se describió anteriormente, se cultivan a continuación durante un tiempo suficiente bajo condiciones apropiadas conocidas por aquellos con experiencia en la técnica, en vista de las enseñanzas descritas aquí, para permitir la expresión de la proteína de CRCV o similar a CRCV, codificada por el polinucleótido de CRCV o similar a CRCV, el cual puede recuperarse a continuación. La proteína de CRCV o similar a CRCV, puede recuperarse y purificarse de los cultivos celulares recombinantes mediante métodos bien conocidos, incluyendo con precipitación con sulfato de amonio o etanol, extracción ácida, cromatografía de intercambio de aniones o cationes, cromatografía con fosfocelulosa, cromatografía por interacción hidrofóbica, cromatografía por afinidad, cromatografía con hidroxilapatita y cromatografía con lectina. De manera más preferida, se emplea la cromatográfica líquida de alto rendimiento ("HPLC") para la purificación. Por ejemplo, para la expresión en un sistema de baculovirus, el ADN recombinante que codifica el gen dentado de CRCV puede clonarse en un vector de transferencia adecuado, tal como pMelBac (Invitrogen). La cotransfección con el ADN del baculovirus (por ejemplo, Bac-N-Blue/lnvitrogen), resulta en un baculovirus recombinante que codifica el gen dentado. La infección de una línea celular de insecto adecuada (por ejemplo, Sf9, Sf21 , High Five/lnvitrogen), a una multiplicidad apropiada de infección, conduce a la expresión de la proteína dentada recombinante. La expresión de la proteína se conforma por transferencia western o ELISA utilizando reactivos apropiados (por ejemplo, suero de canino convaleciente u otro antisuero específico del virus).
La invención incluye así, un método para obtener una proteína de CRCV o similar a CRCV codifica por un polinucleótido de CRCV o similar a CRCV de la presente invención. El método comprende cultivar la célula hospedera que comprende el polinucleótido de CRCV o similar a CRCV, típicamente en un vector; que expresa la proteína en la célula hospedera, y purifica la proteína. La invención incluye además, la proteína que se obtiene mediante este método. La invención incluye también por lo tanto, un método para obtener una proteína glucosilada de CRCV o similar a CRCV, típicamente una proteína S, codificada por el polinucleótido de CRCV o similar a CRCV de la presente invención. El método comprende cultivar una célula hospedera eucariótica, o de manera más preferida de mamífero, que comprende el polinucleótido de CRCV o similar a CRCV, típicamente en un vector; que expresa la proteína en la célula hospedera; y purificar la proteína glucosilada. La invención incluye además la proteína glucosilada que se obtiene mediante este método. En un quinto aspecto, la invención proporciona un método para hacer un anticuerpo anti-CRCV que comprende provocar una respuesta inmune a una proteína S de CRCV o similar a CRCV de la invención, como se describió anteriormente en el primer aspecto de la invención, en un animal, y preparar un anticuerpo del animal o de una célula inmortal derivada del mismo. De manera alterna, el método puede comprender seleccionar un anticuerpo de una biblioteca que muestra anticuerpos utilizando una proteína S de CRCV o similar a CRCV de la invención, como se describió anteriormente en el primer aspecto de la invención. Los métodos y técnicas para producir un anticuerpo monoclonal son bien conocidos por una persona con experiencia en la técnica, por ejemplo, aquéllos descritos en "Monoclonal Antibodies: A manual oí techniques", H Zola (CRC Press, 1988) y en "Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications", J G R Hurrell (CRC Press, 1982), incorporado aquí como referencia. Opcionalmente, el método comprende además determinar si el anticuerpo así obtenido tiene mayor afinidad por la proteína S de CRCV que por la proteína S de BCV, y de manera preferida, también si el anticuerpo tiene una mayor afinidad por la proteína S de CRCV que por las proteínas S de HCV y HEV. Los métodos para determinar la afinidad relativa de los anticuerpos para los antígenos, son conocidos en la técnica. La invención también incluye un anticuerpo anti-CRCV que se obtiene por el método del quinto aspecto de la invención, que tiene una afinidad mayor por la proteína S de CRCV que por la proteína S de BCV. De manera preferida, el anticuerpo también tiene una afinidad mayor por la proteína S de CRCV que por las proteínas S de HCV y HEV. La invención también incluye un método para hacer un anticuerpo anti-CRCV, que comprende provocar una respuesta inmune a una proteína HE de CRCV o similar a CRCV de la invención, como se describió anteriormente en el tercer aspecto de la invención, en un animal, y preparar un anticuerpo del animal o de una célula inmortal derivada del mismo. De manera alterna, el método puede comprender seleccionar un anticuerpo de una biblioteca que muestra anticuerpos utilizando una proteína HE de CRCV o similar a CRCV de la invención, como se describió anteriormente en el tercer aspecto de la invención. Opcionalmente, el método comprende además determinar si el anticuerpo así obtenido tiene una mayor afinidad por la proteína HE de CRCV que por la proteína HE de BCV, y de manera preferida, también si el anticuerpo tiene una afinidad mayor por la proteína HE de CRCV que por las proteínas HE de HCV y HEV. Los métodos para determinar la afinidad relativa de los anticuerpos para los antígenos se conocen en la técnica. La invención también incluye un anticuerpo anti-CRCV que se obtiene por el método del quinto aspecto de la invención, que tiene una afinidad mayor por la proteína HE de CRCV que por la proteína HE de BCV. De manera preferida, el anticuerpo también tiene una mayor afinidad por la proteína HE de CRCV que por las proteínas HE de HCV y HEV. De manera preferida, en anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. Sin embargo, la invención incluye un anticuerpo anti-CRCV monoespecífico. El anticuerpo puede ser un fragmento de anticuerpo, como se describe a continuación. El anticuerpo monoclonal o monoespecífico puede ser un anticuerpo quimérico, tal como el discutido por Neuberger et al (1988, 8th International Biotechnology Symposium Parte 2, 792-799). El anticuerpo monoclonal o monoespecífico puede también ser un anticuerpo "caninizado", por ejemplo, insertando las regiones CDR de anticuerpos de ratón en la estructura de los anticuerpos caninos. La invención también incluye fragmentos de anticuerpo anti-CRCV. Los dominios de la variable pesada (VH) y la variable ligera (VL) de los anticuerpos, están involucrados en el reconocimiento del antígeno, un hecho reconocido primero por los experimentos de digestión de proteasa iniciales. La confirmación adicional se encontró por la "humanización" de los anticuerpos de roedor, en los cuales los dominios variables de origen roedor pueden fusionarse en los dominios constantes de origen humano, de manera que el anticuerpo resultante retiene la especificidad antigénica del anticuerpo de origen roedor (Morrison et al (1984) Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A 81 , 6851-6855). Esta especificidad antigénica se confiere por los dominios variables y es independiente de los dominios constantes, es conocida de los experimentos que involucran la expresión bacteriana de los fragmentos de anticuerpos, todos que contienen uno o más dominios variables. Estas moléculas incluyen moléculas similares a Fab (Better et al (1988) Science 240, 1041 ); moléculas Fv (Skerra et al (1988) Science 240, 1038); moléculas Fv de una cadena sencilla (ScFv), en donde los dominios complementarios VH y VL están enlazados vía un oligopéptido flexible (Bird et al (1988) Science 242, 423; Huston et al (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A 85, 5879), y anticuerpos de dominio sencillo (dAbs), que comprende dominios V aislados (Ward et al (1989) Nature 341 , 544). Una revisión general de las técnicas involucradas en la síntesis de fragmentos de anticuerpos que retienen sus sitios de unión específicos, se encuentra en Winter & Milstein (1991 ) Nature 349, 293-299. Por "moléculas de ScFv", podemos decir moléculas en donde los dominios complementarios VH y VL están enlazados vía un oligopéptido flexible. Las ventajas de los fragmentos de anticuerpo, más que los anticuerpos completos, son bastantes. El tamaño más pequeño de los fragmentos puede conducir a propiedades farmacológicas mejoradas, tales como mejor penetración de un tejido sólido. Las funciones efectoras de los anticuerpos completos, tales como la unión al complemento, se eliminan. Los fragmentos de anticuerpos de Fab, Fv, ScFv y dAb pueden expresarse todos en, y secretarse de E. coli, permitiendo así la producción fácil de grandes cantidades de los fragmentos. Los anticuerpos completos, y los fragmentos F(ab')2 son "bivalentes". Por "bivalentes", queremos decir que los anticuerpos y los fragmentos F(ab')2 tienen dos sitios que se combinan con el antígeno. En contraste, los fragmentos Fab, Fv, ScFv y dAb son monovalentes, tienen sólo un sitio que se combina con el antígeno. En un sexto aspecto, la invención proporciona un método para determinar si un perro se ha expuesto al CRCV. El método comprende obtener una muestra adecuada del perro, e identificar el CRCV o un anticuerpo anti-CRCV en la muestra. El método puede utilizarse como una ayuda en el diagnóstico de si el perro tiene CIRD. La invención incluye un método para detectar, en una muestra obtenida de un perro, después de la exposición del perro al CRCV, el método comprende obtener una muestra adecuada del perro, identificar los anticuerpos anti-CRCV en la muestra. En una modalidad preferida, la muestra adecuada puede ser cualquier muestra que contiene el anticuerpo, tal como suero, saliva, lavado traqueal o lavado bronquiolar. De manera preferida, el anticuerpo anti-CRCV puede detectarse utilizando un antígeno de BCV, HCV, HEV o CRCV, de manera más preferida, utilizando un antígeno de BCV o CRCV. De manera más preferida, la identificación de un anticuerpo anti-CRCV en la muestra, comprende identificar un anticuerpo que se une selectivamente a una proteína S cuya secuencia de aminoácidos es al menos 75% idéntica con la secuencia de aminoácidos de la proteína S de CRCV (Figura 4 y SEQ ID NO: 4); una proteína S cuya secuencia de aminoácidos es al menos 75% idéntica con al secuencia de aminoácidos de la proteína S de BCV (No. de Acceso de Genbank AF058942); proteína S de HCV (No. de Acceso de Genbank L1 643); a un coronavirus que tiene una proteína S al menos 75% idéntica con la proteína S de BCV (No. de Acceso de Genbank AF058942), o un fragmento de la misma, o a un coronavirus que tiene una proteína S al menos 75% idéntica con la proteína S de CRCV, o un fragmento de la misma. De manera más preferida, la identificación del anticuerpo que se une selectivamente a una proteína S, cuya secuencia de aminoácidos es al menos 75% idéntica con la secuencia de aminoácidos de la proteína S de BCV, comprende identificar un anticuerpo que se une selectivamente a una proteína S cuya secuencia de aminoácidos es al menos 80% idéntica, o al menos 85% idéntica, o al menos 90% idéntica, o al menos 95% idéntica con la secuencia de aminoácidos de la proteína S de BCV (No. de Acceso de Genbank AF058942) o un fragmento de la misma. De manera más preferida, la identificación de un anticuerpo anti-CRCV en la muestra, comprende identificar un anticuerpo que se une selectivamente a la proteína S de BCV (No. de Acceso de Genbank AF058942). Aún de manera más preferida, la identificación de un anticuerpo que se une selectivamente a una proteína S cuya secuencia de aminoácidos es al menos 75% idéntica con la secuencia de aminoácidos de la proteína S de CRCV, comprende identificar un anticuerpo que se une selectivamente a una proteína S cuya secuencia de aminoácidos es al menos 80% idéntica, o al menos 85% idéntica, o al menos 90% idéntica, o al menos 95% idéntica con la secuencia de aminoácidos de la proteína S de CRCV (Figura 4 y SEQ ID NO: 4), o un fragmento de la misma.
Aún de manera más preferida, la identificación de un anticuerpo anti-CRCV en la muestra, comprende identificar un anticuerpo que se une selectivamente a una proteína S de CRCV o similar a CRCV, como se definió en el primer aspecto de la invención. De manera más preferida, la identificación de un anticuerpo anti- CRCV en la muestra, comprende identificar un anticuerpo que se une selectivamente a la proteína S de CRCV como se lista en la Figura 4 (SEQ ID NO: 4), o un fragmento de la misma. De manera similar, la identificación de un anticuerpo anti-CRCV en la muestra, puede comprender identificar un anticuerpo que se une selectivamente a una proteína HE cuya secuencia de aminoácidos es al menos 90% idéntica con la secuencia de aminoácidos parcial de la proteína HE de CRCV (Figura 14 y SEQ ID NO: 22); a una proteína HE cuya secuencia de aminoácidos es al menos 90% idéntica con la secuencia de aminoácidos de la proteína HE de BCV (No. de Acceso de Genbank AF058942), o la proteína HE de HECV (No. de Acceso de Genbank L07747); a un coronavirus que tiene una proteína S al menos 90% idéntica con la proteína HE de BCV (No. de Acceso de Genbank AF058942), o un fragmento de la misma; o a un coronavirus que tiene una proteína HE al menos 90% idéntica con la proteína HE de CRCV, o un fragmento de la misma. De manera más preferida, la identificación de un anticuerpo que se une selectivamente a una HE cuya secuencia de aminoácidos es al menos 90% idéntica con la secuencia de aminoácidos de la proteína HE de BCV, comprende identificar un anticuerpo que se une selectivamente a una proteína HE cuya secuencia de aminoácidos es al menos 91 % idéntica, o al menos 92% idéntica, o al menos 93% idéntica, o al menos 94% idéntica, o al menos 95% idéntica, o al menos 96% idéntica, o al menos 97% idéntica, o al menos 98% idéntica, o al menos 99% idéntica con la secuencia de aminoácidos de la proteína HE de BCV (No. de Acceso de Genbank AF058942), o un fragmento de la misma. De manera más preferida, la identificación de un anticuerpo anti-CRCV en la muestra, comprende identificar un anticuerpo que se une selectivamente a la proteína HE de BCV (No. de Acceso de Genbank AF058942). Aún de manera más preferida, la identificación de un anticuerpo que se une selectivamente a una proteína He cuya secuencia de aminoácidos es al menos 90% idéntica con la secuencia de aminoácidos parcial de la proteína HE de CRCV, comprende identificar un anticuerpo que se une selectivamente a una proteína HE cuya secuencia de aminoácidos parcial es al menos 91 % idéntica, o al menos 92% idéntica, o al menos 93% idéntica, o al menos 94% idéntica, o al menos 95% idéntica, o al menos 96% idéntica, o al menos 97% idéntica, o al menos 98% idéntica, o al menos 99% idéntica con la secuencia de aminoácidos parcial de la proteína HE de CRCV (Figura 13), o un fragmento de la misma. Aún de manera más preferida, la identificación de un anticuerpo anti-CRCV en la muestra, comprende identificar un anticuerpo que se une selectivamente a una proteína HE de CRCV o similar a CRCV, como se definió en el tercer aspecto de la invención. De manera más preferida, la identificación de un anticuerpo anti-CRCV en la muestra, comprende identificar un anticuerpo que se une selectivamente a la proteína HE de CRCV cuya secuencia de aminoácidos parcial se lista en la Figura 14 (SEQ ID NO: 22), o un fragmento de la misma. La invención incluye un método para detectar el CRCV en una muestra obtenida de un perro, el método comprende obtener una muestra adecuada del perro, e identificar el CRCV en la muestra. Se aprecia que puede haber una variación en la secuencia que ocurra naturalmente entre diferentes aislados de CRCV. La invención incluye así, identificar aislados de CRCV cuyos genes y proteínas S, pol y HE tengan alguna variación en la secuencia de las secuencias proporcionadas en las Figuras 1 a 4 y 13 y 14. Se aprecia, sin embargo, que los mismos métodos se utilizarán para detectar los aislados variantes de CRCV, así como el aislado caracterizado por las secuencias listadas en las Figuras 1 a 4 y 13 y 14. En una modalidad preferida, la muestra adecuada puede ser un lavado del pulmón, un lavado traqueal, un frotis amigdalino o una biopsia o muestra postmortem del tracto respiratorio del perro. De manera preferida, en esta modalidad, la identificación del CRCV comprende identificar un componente de ácido nucleico del CRCV. De manera típica, esto se realizará extrayendo el ARN de la muestra, y obteniendo el ADNc del mismo, por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 1. Posteriormente, un componente de ácido nucleico de CRCV se identifica en el ADNc, por ejemplo, utilizando técnicas que involucran hibridación con alto rigor, amplificación específica, y secuenciamiento nucleotídico, como es bien conocido por una persona con experiencia en la técnica (Sambrook et ai (2001 ) supra). De manera preferida, la identificación del CRCV comprende identificar un polinucleótido que se híbrida con alto rigor al genoma de BCV, tal como el genoma de la cepa LY138 (No. de Acceso de Genbank AF058942), o una porción del mismo. Además, de manera preferida, la identificación del CRCV comprende identificar un polinucleótido que se híbrida con alto rigor a los polinucleótidos S, pol o HE de CRCV (Figuras 1 , 3 y 13), o una porción de los mismos. Por "se híbrida con alto rigor", se quiere decir que el polinucleótido y el ácido nucleico al cual se híbrida, tienen suficiente similitud de la secuencia nucleotídica para que puedan hibridarse bajo condiciones altamente rigurosas. Como es bien conocido en la técnica, el rigor de la hibridación del ácido nucleico depende de factores tales como la longitud del ácido nucleico sobre el cual ocurre la hibridación, el grado de identidad de las secuencias que se hibridan y de factores tales como la temperatura, fuerza iónica y contenido de CG o AT de la secuencia. Los ácidos nucleicos que pueden hibridarse con alto rigor a la molécula de ADNc de CRCV, incluyen ácidos nucleicos que tienen >90% de identidad de la secuencia, de manera preferida aquéllos con >95% o >96% o >97% o >98, de manera más preferida aquéllos con >99% de identidad de la secuencia, sobre al menos una porción del ADNc de CRCV. Las condiciones de hibridación altamente rigurosas típicas que conducen a una hibridación selectiva, se conocen en la técnica, por ejemplo, aquéllas descritas en Sambrook et al 2001 (supra), incorporada aquí como referencia. Un ejemplo de una solución de hibridación típica cuando un ácido nucleico se inmoviliza en una membrana de nylon y la sonda del ácido nucleico es > 500 bases es: 6 x SSC (citrato de sodio salino) Sulfato de dodecilo sódico (SDS) al 0.5% 100 µ9/??? de ADN de esperma de salmón fragmentado, desnaturalizado La hibridación se realiza a 68°C. La membrana de nylon, con la cual se inmoviliza el ácido nucleico, puede lavarse a 68°C en 0.1 x SSC. Pueden prepararse 20 x SSC de la siguiente manera. Disolver 175.3 g de NaCI y 88.2 g de citrato sódico en 800 mi de H20. Ajustar el pH a 7.0 con unas pocas gotas de una solución 10 N de NaOH. Ajustar el volumen a 1 litro con H20. Distribuir en alícuotas. Esterilizar con autoclave. Un ejemplo de una solución de hibridación típica cuando un ácido nucleico se inmoviliza en una membrana de nylon y la sonda es un oligonudeótido de entre 15 y 50 bases es: Cloruro de trimetilamonio (TMACI) 3.0 M Fosfato de sodio 0.01 M (pH 6.8) EDTA 1 mm (pH 7.6) SDS al 0.5% 100 µ?/??? de ADN de esperma de salmón fragmentado, desnaturalizado Leche seca desgrasada al 0.1 % La temperatura óptima para la hibridación se elige usualmente para que sea 5°C por debajo de la T¡ para la longitud de cadena dada. T¡ es la temperatura de fusión irreversible del híbrido formado entre la sonda y su secuencia objetivo. Jacobs et al (1988) Nucí. Acids Res. 16, 4637, discute la determinación de las T¡. La temperatura de hibridación recomendada para los 17 meros en TMACI 3M es de 48-50°C; para los 19 meros, es de 55-57°C; y para los 20 meros, es de 58- 66°C. De manera preferida, la identificación del CRCV comprende utilizar un polinucleótido que tiene al menos 80%, o al menos 85%, o al menos 90%, o al menos 95% de identidad con una porción del genoma de BCV (No. de Acceso de Genbank AF058942). De manera más preferida, la identificación del CRCV comprende utilizar un polinucleótido que tiene al menos 80%, o al menos 85%, o al menos 90%, o al menos 95% de identidad con una porción de polinucleótido S de CRCV (Figura 3), o que tiene al menos 90%, o al menos 95% de identidad con una porción del polinucleótido pol de CRCV (Figura 1 ), o que tiene al menos 90%, o al menos 95% de identidad con una porción del polinucleótido HE de CRCV (Figura 13). De manera más preferida, la identificación del CRCV comprende identificar un polinucleótido de CRCV . como se definió anteriormente con respecto al cuarto aspecto de la invención. De manera más preferida, la identificación del CRCV comprende identificar un polinucleótido de CRCV que comprende o consiste de una secuencia listada en la Figura 1 o la Figura 3 o la Figura 13, o un fragmento de la misma. En otra modalidad preferida, la identificación del CRCV comprende identificar un componente de proteína de CRCV. De manera preferida, la identificación de un componente de proteína de CRCV comprende identificar una proteína de CRCV como se definió anteriormente en el primer o segundo o tercer aspectos de la invención. De manera más preferida, la identificación de un componente de proteína de CRCV comprende identificar una proteína de CRCV que comprende o consiste de una secuencia de aminoácidos listada en la Figura 2 o la Figura 4 o la Figura 14, o un fragmento de la misma. El ensayo de un componente de proteína de CRCV en una muestra biológica puede ocurrir utilizando cualquier método conocido en la técnica. Las técnicas basadas en un anticuerpo, son preferidas para ensayar niveles de proteína de CRCV en una muestra biológica.
De manera preferida, la identificación de un componente de proteína de CRCV, comprende utilizar un reactivo de anticuerpo con CRCV. De manera más preferida, el reactivo de anticuerpo con CRCV es un anticuerpo anti-BCV, un anticuerpo anti-HCV, un anticuerpo anti-HEV, o un anticuerpo anti-CRCV que se puede obtener o que se obtiene por los métodos del quinto aspecto de la invención. Por ejemplo, la expresión de una proteína de CRCV puede estudiarse con métodos inmunohistológicos clásicos. En éstos, el reconocimiento específico se proporciona por el anticuerpo primario (policlonal o monoclonal), pero el sistema de detección secundario puede utilizar anticuerpos fluorescentes, enzimas u otros anticuerpos secundarios conjugados. Como resultado, se obtiene una tinción inmunohistológica de la sección del tejido para el examen patológico. Los tejidos también pueden extraerse, por ejemplo, con urea o detergente neutro, para la liberación de la proteína de CRCV para el ensayo de transferencia Western o punto/ranura (Jalkanen, M., et al, J. Cell. Biol. 101 :976-985 (1985); Jalkanen, M., et al, J. Cell. Biol. 105:3087-3096 (1987)). En esta técnica, que se basa en el uso de fases sólidas catiónicas, la cuantificación de la proteína de CRCV puede lograrse utilizando una proteína CRCV aislada como un estándar. Esta técnica también puede aplicarse a muestras de fluido corporal. Otros métodos basados en anticuerpos útiles para detectar una expresión de la proteína de CRCV incluyen inmunoensayos, tales como el ensayo inmunosorbente enlazado a enzima (ELISA) y el radioinmunoensayo (RIA). Por ejemplo, un anticuerpo monoclonal reactivo de CRCV puede utilizarse tanto como un inmunosorbente como una sonda marcada con enzima para detectar y cuantificar la proteína CRCV. La cantidad de proteína CRCV presente en la muestra puede calcularse con referencia a la cantidad presente en una preparación estándar utilizando un algoritmo para computadora de regresión lineal. Tal ELISA para detectar un antígeno de tumor, se describe en lacobelli et al, Breast Cáncer Research and Treatment 11 :19-30 (1988). En otro ensayo ELISA, pueden utilizarse dos anticuerpos monodonales específicos distintos, para detectar la proteína CRCV en un fluido corporal. En este ensayo, uno de los anticuerpos se utiliza como el ¡nmunoadbsorbente, y el otro como la sonda marcada con la enzima. Las técnicas anteriores pueden realizarse esencialmente como un ensayo de "un paso" o de "dos pasos". El ensayo de "un paso", involucra poner en contacto la proteína CRCV con un anticuerpo inmovilizado y, sin lavado, poner en contacto la mezcla con el anticuerpo marcado. El ensayo de "dos pasos", involucra lavar antes de poner en contacto la mezcla con el anticuerpo marcado. Otros métodos convencionales también pueden emplearse conforme sea adecuado. Es usualmente deseable inmovilizar un componente del sistema de ensayo en un soporte, permitiendo por lo tanto, que otros componentes del sistema se pongan en contacto con el componente, y se eliminen fácilmente de la muestra. Las marcas de enzima adecuadas incluyen, por ejemplo, aquéllas del grupo oxidasa, que catalizan la producción de peróxido de hidrógeno reaccionando con un sustrato. La glucosa oxidasa es particularmente preferida, puesto que tiene buena estabilidad y su sustrato (glucosa), está fácilmente disponible. La actividad de una marca de oxidasa puede ensayarse midiendo la concentración de peróxido de hidrógeno formado por la reacción del anticuerpo marcado con enzima/sustrato. Además de las enzimas, otras marcas adecuadas incluyen radioisótopos, tales como yodo (125l, 121l), carbono (14C), azufre (35S), tritio (3H), indio ( ln), y tecnecio ("mTc), y marcas fluorescentes, tales como fluoresceína y rodamina y biotina. En un séptimo aspecto, la invención proporciona un ensayo ¡nmunosorbente para detectar los anticuerpos S o HE de anti-CRCV. El ensayo comprende una fase sólida recubierta con una proteína S o HE de CRCV o similar a CRCV, o recubierta con proteínas S y HE de CRCV o similar a CRCV, como se definió en el primer y tercer aspectos de la invención, o que se obtiene utilizando los métodos del cuarto aspecto de la invención, o un fragmento antigénico del mismo, en donde los anticuerpos S o HE de anti-CRCV en una muestra expuesta a la fase sólida, se unirán a la proteína; y un conjugado con una marca detectable que se unirá a los anticuerpos anti-CRCV unidos a la fase sólida. Se aprecia que un fragmento antigénico de la proteína S de CRCV o similar a CRCV que recubre la fase sólida, es de suficiente tamaño para unirse por un anticuerpo S anti-CRCV, y que comprende al menos uno de los aminoácidos específicos para la proteína S de CRCV como se lista en el Cuadro 1. También se aprecia que un fragmento antigénico de la proteína HE de CRCV o similar a CRCV que recubre la fase sólida, es de suficiente tamaño para unirse por un anticuerpo HE de anti-CRCV, y que comprende al menos uno de los tres aminoácidos específicos para la proteína HE de CRCV como se definió anteriormente. De manera preferida, la proteína S o HE de CRCV o similar a CRCV, o un fragmento antigénico de la misma, que recubre la fase sólida, es de al menos 10 aminoácidos de longitud. De manera más preferida, la proteína S de CRCV o similar a CRCV, o el fragmento antigénico de la misma, es de al menos 20, o al menos 30, o al menos 40, o al menos 50, o al menos 100, o al menos 200, o al menos 300, o al menos 400 aminoácidos de longitud. La proteína S de CRCV o similar a CRCV, puede ser de al menos 500, o al menos 600, o al menos 700, o al menos 800, o al menos 900, o al menos 1 ,000 aminoácidos de longitud. De manera preferida, la proteína S de CRCV o similar a CRCV, o el fragmento antigénico de la misma, que recubre la fase sólida es menor que aproximadamente 1200 aminoácidos de longitud. De manera más preferida, la proteína S de CRCV o similar a CRCV, o un fragmento antigénico de la misma, es menor que aproximadamente 1 ,100, o menor que aproximadamente 1 ,000, o menor que aproximadamente 900, o menor que aproximadamente 800, o menor que aproximadamente 700, o menor que aproximadamente 600, o menor que aproximadamente 500 aminoácidos de longitud. La proteína S o HE de CRCV o similar a CRCV, puede ser menor que aproximadamente 400, o menor que aproximadamente 300, o menor que aproximadamente 200, o menor que aproximadamente 100, o menor que aproximadamente 50 aminoácidos de longitud. De manera preferida, la fase sólida es un pozo de microtitulación. De manera más preferida, el conjugado comprende un anticuerpo anti-perro. De manera preferida, el conjugado comprende una enzima, por ejemplo, peroxidasa de rábano. De manera más preferida, el ensayo inmunosorbente también comprende un sustrato para la enzima. Los detalles adicionales de los ensayos inmunosorbentes adecuados y de ELISA, se proporcionan anteriormente. La invención incluye un equipo o partes que incluyen los componentes del ensayo inmunosorbente. El equipo de partes puede incluir así, una fase sólida, tal como una placa de microtitulación, una proteína S o HE de CRCV o similar a CRCV o ambas para recubrir la fase sólida, un conjugado con una marca detectable, tal como un anticuerpo anti-perro, que se unirá a los anticuerpos anti-CRCV unidos a la fase sólida. Si el conjugado con la marca detectable es una enzima, el equipo de partes puede también incluir un sustrato para la enzima. El equipo también puede incluir una muestra de control positivo que contiene un anticuerpo de proteína S o HE anti-CRCV, tal como aquellos descritos con referencia al quinto aspecto de la invención, y una muestra de control negativo. La invención incluye así, un sustrato sólido, con una proteína S o HE de CRCV o similar a CRCV, como se definió en el primer y tercer aspectos de la invención, o que se obtiene utilizando los métodos del cuarto aspecto de la invención, o un fragmento antigénico de la misma, unido a la misma, para capturar los anticuerpos S o HE anti-CRCV o ambos de una muestra líquida, en donde los anticuerpos S o HE anti-CRCV en una muestra expuesta al sustrato sólido, se unirán a la proteína S o HE. Típicamente, la proteína está recubierta en placas de microtitulación durante la noche de 4°C a 37°C, dependiendo de la estabilidad del antígeno. La proteína no unida se lava con un amortiguador de lavado, tal como suero fisiológico amortiguado con fosfato o suero fisiológico amortiguado con Tris. El suero u otras muestras se incuban en la placa, típicamente a 37°C durante entre 1 y varias horas. El material no unido se lava, las placas se incuban con un anticuerpo marcado con enzima (por ejemplo, peroxidasa de rábano), tal como IgG o IgM anti-canina para muestras de suero, o IgA anti-canina para lavados pulmonares, durante 1 a varias horas a 37°C. El anticuerpo no unido se lava, y las placas se incuban con un sustrato tal como OPD durante aproximadamente 10 minutos, y la densidad óptica se mide en un fotómetro. De manera preferida, el sustrato sólido es un pozo de microtitulación.
En un octavo aspecto, la invención proporciona una composición de vacuna para vacunar perros que comprende (i) un coronavirus que tiene una proteína S con al menos 75% de identidad de aminoácidos con la proteína S de CRCV, o (ii) un coronavirus que tiene una proteína S con al menos 75% de identidad de aminoácidos con la proteína S de BCV, o (iii) un coronavirus que tiene una proteína HE con al menos 90% de identidad de aminoácidos con la proteína HE de CRCV, o (iv) un coronavirus que tiene una proteína HE con al menos 90% de identidad de aminoácidos con la proteína HE de BCV, o (v) una proteína de coronavirus que tiene al menos 75% de identidad de aminoácidos con una proteína de CRCV o un fragmento inmunogénico de la misma, o (vi) una proteína de coronavirus que tiene al menos 75% de identidad de aminoácidos con una proteína de BCV o un fragmento inmunogénico de la misma, o (vii) un ácido nucleico que codifica la proteína coronaviral o una fracción inmunogénica de la misma. De manera preferida, la vacuna está empacada y preparada para utilizarse en perros. Cuando la vacuna comprende una proteína de coronavirus, o un fragmento inmunogénico de la misma, la proteína, de manera preferida tiene al menos 80%, o al menos 85%, o al menos 90%, o al menos 95% de identidad de aminoácidos con la porción correspondiente de una proteína de BCV o CRCV. De manera preferida, la proteína coronavirus es una proteína de BCV, HCV, HEV o CRCV, o una modificación de la misma.
Las modificaciones típicas de la proteína incluyen sustituciones de aminoácidos para mejorar la antigenicidad de la vacuna. Las proteínas de BCV, HCV y HEV pueden modificarse para ser más similares a una proteína de CRCV. Por ejemplo, la proteína dentada de BCV, HCV o HEV, puede modificarse para incluir un aminoácido de CRCV en cualquiera de las diferencias mostradas en la comparación en la Figura 10, o listada en el Cuadro 1. De manera adicional o alterna, la proteína HE de BCV, HCV o HEV, puede modificarse para incluir un aminoácido de CRCV en cualquiera de los tres residuos específicos de CRCV como se definió anteriormente. Las proteínas en las cuales uno o más de los residuos de aminoácidos están modificadas químicamente, pueden utilizarse con la condición de que la función de la proteína, a saber la producción de anticuerpos específicos in vivo, permanezca sustancialmente sin cambio. Se apreciará que las proteínas sintetizadas pueden modificarse de manera adecuada antes o después de ser sintetizadas. Tales modificaciones incluyen formar sales con ácidos o bases, especialmente ácido y bases orgánicos o inorgánicos fisiológicamente aceptables, formar un éster o amida de un grupo carboxilo terminal, y unir los grupos protectores de aminoácidos, tales como N-t-butoxicarbonilo. Tales modificaciones pueden proteger el péptido del metabolismo in vivo. La proteína puede estar presente como una sola copia o como múltiples copias, por ejemplo, repeticiones en cascada. Tales repeticiones en cascada o múltiples, pueden ser suficientemente antigénicas por si mismas, para obviar el uso de un portador. Puede ser ventajoso que la proteína se forme como un ciclo, con los extremos N terminales y C terminales unidos o agregar uno o más residuos Cys a un extremo para incrementar la antigenicidad y/o para permitir que se formen enlaces disulfuro. Si la proteína está enlazada covalentemente a un portador, de manera preferida un polipéptido, entonces el arreglo es de manera preferida tal que la proteína de la invención forme un ciclo. De acuerdo con las teorías inmunológicas actuales, debe estar presente una función portadora en cualquier formulación inmunogénica, con el fin de estimular, o aumentar la estimulación de la respuesta inmune. Se piensa que los mejores portadores involucran (o, junto con el antígeno, crean) un epitopo de un linfocito T. Los péptidos pueden asociarse, por ejemplo, mediante reticulación, con un portador separado, tal como seroalbúminas, mioglobinas, toxoides bacterianos y hemocianina de lapa ranurada. Los portadores desarrollados más recientemente que inducen la ayuda de los linfocitos T en la respuesta inmune, incluyen el antígeno del núcleo de la hepatitis B (también llamado la proteína de la nucleocápside), los epitopos supuestos de los linfocitos T, tales como Thr-Ala-Ser-Gly-Val-Ala-Glu-Thr-Thr-Asn-Cys (SEQ ID NO: 52), beta-galactosidasa y el péptido 163-171 de la interleucina-1. El último compuesto puede considerarse de manera vanada como un portador o como un adyuvante o como ambos. De manera alterna, varias copias de las mismas o diferentes proteínas de la invención pueden reticularse unas con otras; en esta situación, no hay un portador separado como tal, pero una función portadora puede proporcionarse por tal reticulación. Los agentes de reticulación adecuados incluyen aquéllos listados como tales en los catálogos de Sigma y Pierce, por ejemplo glutaraldehído, carbodiimida y 4-(N-maleim¡dometil)ciclohexan-1-carboxilato de succinimidilo, el último agente explota el grupo -SH en el residuo de cisteína C terminal (si está presente). Si la proteína se prepara por la expresión de una secuencia nucleotídica adecuada en un hospedero adecuado, entonces puede ser ventajoso expresarla como un producto de fusión con una secuencia peptídico que actúa como un portador. El sistema "Ecosec" de Kabigen es un ejemplo de tal arreglo. Se apreciará que el componente del coronavirus de la vacuna puede enlazarse a otros antígenos para proporcionar un efecto doble. De manera preferida, la proteína de coronavirus en la composición de vacuna es una proteína S. De manera más preferida, la proteína S es una proteína S de CRCV o similar a CRCV como se definió anteriormente en el primer aspecto de la invención o que se puede obtener mediante los métodos del cuarto aspecto de la invención, una proteína S de BCV, una proteína S de HCV, una proteína S de HEV, o un fragmento inmunogénico de la misma. De manera más preferida, la composición de vacuna contiene una proteína S de CRCV que comprende o consiste de la secuencia de aminoácidos listada en la Figura 4, o un fragmento inmunogénico de la misma que tiene al menos 97% de identidad con la secuencia listada en la Figura 4. De manera preferida, la variante tiene al menos 98%, o al menos 99% de identidad de la secuencia de aminoácidos con la secuencia listada en la Figura 4. De manera más preferida, la variante tiene al menos 99. 1 %, o al menos 99.2%, o al menos 99.3%, o al menos 99.4%, o al menos 99.5%, o al menos 99.6%, o al menos 99.7%, o al menos 99.8%, o al menos 99.9% de identidad de la secuencia de aminoácidos con la secuencia listada en la Figura 4. De manera adicional o alterna, la composición de vacuna puede comprender proteínas de coronavirus tales como una proteína de hemaglutinina-esterasa (HE) o una proteína de membrana integral (M), o la proteína de membrana pequeña (E) (Lai MMC y Cavanagh D, (1997) "The molecular biology of coronavirus" Adv. Vir. Res, 48: 1 - 00). En una modalidad, las proteínas HE, E o M son proteínas de BCV, HCV o HEV. En otra modalidad, las proteínas HE, E o M son proteínas de CRCV. De manera preferida, la proteína HE es una proteína HE de CRCV o similar a CRCV como se definió anteriormente en el tercer aspecto de la invención o que se puede obtener mediante los métodos del cuarto aspecto de la invención, o un fragmento inmunogénico de la misma. De manera más preferida, la composición de vacuna contiene una proteína HE de CRCV que comprende o consiste de la secuencia de aminoácidos parcial listada en la Figura 14, o un fragmento inmunogénico de la misma, que tiene al menos 97% de identidad con la secuencia listada en la Figura 14. De manera preferida, la variante tiene al menos al menos 98%, o al menos 99% de identidad de la secuencia de aminoácidos con la secuencia listada en la Figura 14. De manera más preferida, la variante tiene al menos 99. 1 %, o al menos 99.2%, o al menos 99.3%, o al menos 99.4%, o al menos 99.5%, o al menos 99.6%, o al menos 99.7%, o al menos 99.8%, o al menos 99.9% de identidad de la secuencia de aminoácidos con la secuencia listada en la Figura 14. Cuando la vacuna comprende un coronavirus, de manera preferida, el coronavirus comprende una proteína S con al menos 80%, o al menos 85%, o al menos 90%, o al menos 95% de identidad del aminoácido con la proteína S de BCV. De manera más preferida, el coronavirus comprende una proteína S con al menos 80%, o al menos 85%, o al menos 90%, o al menos 95% de identidad del aminoácido con la proteína S de CRCV. De manera adicional o alterna, cuando la vacuna comprende un coronavirus, de manera preferida el coronavirus comprende una proteína HE con al menos 90% o al menos 95% de identidad del aminoácido con la proteína HE de BCV. De manera más preferida, el coronavirus comprende una proteína HE con al menos 96%, o al menos 97%, o al menos 98%, o al menos 99% de identidad del aminoácido con la proteína HE de CRCV.
En otra modalidad preferida, la composición de vacuna comprende un virus seleccionado de BCV, HCV, HEV y CRCV, o una modificación del mismo. Se aprecia que las vacunas para perro efectivas contra un virus canino pueden derivarse de un virus no canino. Por ejemplo, la Patente de E.U.A. No. 5,750,112 de Gilí, y cedida a Solvay Animal Health Inc, describe una vacuna contra el coronavirus canino entérico que contiene el coronavirus felino entérico inactivado. La descripción de la US 5,750, 2 se incorpora aquí como referencia. En una modalidad preferida, el virus es un virus inactivado. Los métodos para inactivar los virus para utilizarse en vacunas son bien conocidos en la técnica. Los métodos adecuados incluyen métodos químicos, tales como el uso de la beta proprio-lactona (BPL). Las vacunas adecuadas de coronavirus bovino inactivado pueden incluir BCV inactivado, que es un componente de las vacunas bovinas tales como "Rotovec Corona" de Schering-Plough (http.7/www. u kvet. co. u k/rotovec/scou r. htm); "Lactovac" por Hoechst Roussel Vet Ltd, (Veterinary Formulary 5a Edición del Compendio de la Hoja de Datos Veterinarios); "First Defense" por Immuncell Corp, E.U.A.; "Scour Bos 4" por Grand Laboratories y "Scour Guard 3K" por Pfizer. En una modalidad alterna, el virus es un virus atenuado. Los métodos para atenuar virus para utilizarse en vacunas son bien conocidos en la técnica.
De manera preferida, la composición de vacuna también comprende un adyuvante farmacéuticamente aceptable. De manera preferida, cuando la vacuna comprende un ácido nucleico, el ácido nucleico que codifica la proteína coronaviral o la fracción ¡nmunogénica de la misma, para utilizarse como una vacuna, es un polinucleótido S de CRCV o similar a CRCV, o un polinucleótido HE de CRCV o similar a CRCV o ambos de un polinucleótido S y HE de CRCV o similar a CRCV. De manera más preferida, el ácido nucleico comprende o consiste de la secuencia nucleotídica listada en la Figura 3 o la Figura 13, o fracciones de la misma. Para utilizarse como vacuna, el ácido nucleico S o HE de CRCV o similar a CRCV puede suministrarse en varios vectores replicantes (por ejemplo, vacuna de adenovirus recombinante) o no replicantes (vacuna de ADN). En una modalidad preferida, la vacuna puede contener una proteína S recombinante de CRCV o similar a CRCV, así como otras proteínas inmunogénicas de coronavirus, tales como la proteína HE. Como se discutió anteriormente, se sabe que varios agentes virales y bacterianos están asociados con la enfermedad respiratoria en perros, incluyendo el virus de la parainfluenza canina (CPIV), adenovirus canino tipo 2 (CAV-2), herpesvirus canino (CHV), y Bordetella bronchiseptíca (B. bronchiseptíca).
En otra modalidad preferida, la vacuna puede contener una proteína S o HE recombinante de CRCV o similar a CRCV, así como otros organismos patógenos involucrados en la enfermedad respiratoria de perros, tales como el virus de la parainfluenza canina, adenovirus canino tipo 2, la bacteria Bordetella bronchiseptica, herpesvirus canino, reovirus humano y especies de micoplasma, o proteínas inmunogénicas de los mismos. Así, la vacuna puede contener un agente capaz de producir una respuesta inmune, tal como la producción de anticuerpos contra el CRCV, así como contra otros organismos patogénicos involucrados en la enfermedad respiratoria de perros, tales como CPIV, CAV-2, B. bronchiseptica y CHV. En una modalidad, así como contener un agente capaz de estimular la producción de anticuerpos contra el CRCV, tal como una proteína S o HE de CRCV o similar a CRCV, la composición de vacuna comprende además uno o más de: (a) un agente capaz de producir una respuesta inmune en un perro contra CPIV; (b) un agente capaz de producir una respuesta inmune en un perro contra CAV-2; (c) un agente capaz de producir una respuesta inmune en un perro contra CHV; y (d) un agente capaz de producir una respuesta inmune en un perro contra B. bronchiseptica.
Así, la composición de vacuna puede comprende también opcionalmente cualquiera de dos o cualquiera de tres o todos los cuatro de estos agentes adicionales (a), (b), (c) y (d). De manera típica, un agente capaz de producir una respuesta inmune en un perro contra CPIV comprende un CPIV inactivado o atenuado, o un fragmento inmunogénico del mismo, o un ácido nucleico que codifica la fracción inmunogénica. De manera típica, un agente capaz de producir una respuesta inmune en un perro contra CAV-2 comprende un CAV-2 inactivado o atenuado, o un fragmento inmunogénico del mismo, o un ácido nucleico que codifica la fracción inmunogénica. El adenovirus canino tipo 1 causa la hepatitis infecciosa; el adenovirus canino tipo 2 causa la enfermedad respiratoria. Se ha demostrado que el CAV-1 proporciona protección cruzada contra el CAV-2 y vice versa. El agente que produce una respuesta inmune en un perro contra CAV-2 puede contener, por lo tanto, CAV-1 o CAV-2, o un fragmento inmunogénico del mismo. Las vacunas listadas a continuación contienen CAV-2, excepto por EURICAN DHPPi, que no especifica el tipo de virus utilizado. Los agentes adecuados que producen una respuesta inmune en un perro contra CPIV y CAV-2 son conocidos por una persona con experiencia ordinaria en la técnica. Por ejemplo, las siguientes vacunas para perro tienen licencia en el RU.
KAVAK DA2P¡P69 por Fort Dodge Animal Health es una vacuna viva secada por congelación que contiene cepas atenuadas del virus del moquillo canino, adenovirus canino tipo 2, parainfluenza canina tipo 2 y parvovirus canino que crecieron en cultivo de tejido. KAVAK Parainfluenza por Fort Dodge Animal Health contiene una vacuna viva secada por congelación derivada de una cepa atenuada del virus de la parainfluenza canina tipo 2 cultivado en una línea celular homologa establecida. NOBIVAC DHPPi por Intervet UK Limited es una vacuna de virus viva atenuada, secada por congelación que contiene el virus del moquillo canino, adenovirus canino tipo 2, parvovirus canino y el virus de la parainfluenza canina que crecieron en un cultivo de tejido de una línea celular. NOBIVAC KC por Intervet UK Limited es una vacuna viva modificada, secada por congelación que contiene la cepa B-C2 de Bordetella bronchiseptica y la cepa Cornell del virus de la parainfluenza canina (esta es una vacuna intranasal). Número de autorización del manejo Vm 06376/4026. EURICAN DHPPi por Merial Animal Health Ltd. es una vacuna viva combinada, secada por congelación contra el moquillo canino, hepatitis infecciosa canina, parvovirus canino y virus de la parainfluenza canina tipo 2. VANGUARD 7 por Pfizer Ltd. contiene un virus vivo atenuado del moquillo canino (cepa Snyder Hill), adenovirus (CAV-2 cepa Manhattan), virus de la parainfluenza (cepa NL-CPI-5), parvovirus canino (NL-35-D) propagados en una línea celular establecida, y un cultivo inactivado de Leptospira canicola y Leptospira icterohaemorrhagiae. QUANTUM DOG 7 por Schering-Plough Animal Health contiene una vacuna (viviente) de moquillo canino, adenovirus tipo 2, parvovirus, virus de la parainfiuenza tipo 2 y una vacuna inactivada de Leptospira canicola y Leptospira icterohaemorrhagiae. CANIGEN DHPPi por Virbac Ltd. es una vacuna de virus, viva atenuada, secada por congelación, que contiene el virus del moquillo canino, adenovirus canino (CAV2), parvovirus canino y el virus de la parainfiuenza canina que crecieron en un cultivo de tejido de una línea celular. CANIGEN Ppi por Virbac Ltd. es una vacuna de virus, viva atenuada, secada por congelación que contiene parvovirus canino y virus de la parainfiuenza canina que crecieron en un cultivo de tejido de una línea celular. De manera típica, un agente capaz de producir una respuesta inmune en un perro contra CHV comprende CHV inactivado o atenuado, o un fragmento inmunogénico del mismo, o un ácido nucleico que codifica la fracción inmunogénica. Los agentes adecuados que producen una respuesta inmune en un perro contra CHV son conocidos por una persona con experiencia ordinaria en la técnica. Por ejemplo, EURICAN Herpes 205 por Merial es una vacuna de subunidad purificada contra el herpesvirus canino, que está indicada para la inmunización activa de perras preñadas para evitar la mortalidad, signos clínicos y lesiones en cachorros, que resultan de las infecciones con el herpesvirus canino adquiridas en los primeros días de vida. No tiene licencia para la vacunación de perros adultos para la prevención de la enfermedad respiratoria. De manera típica, un agente capaz de producir una respuesta inmune en un perro contra B. bronchiseptica comprende B. bronchiseptica inactivada o atenuada, o un fragmento inmunogénico de la misma, o un ácido nucleico que codifica la fracción inmunogénica. Los agentes adecuados que provocan una respuesta inmune en un perro contra B. bronchiseptica son conocidos por una persona con experiencia ordinaria en la técnica. Por ejemplo, las siguientes vacunas para perro tienen licencia de uso. COUGHGUARD-B® por Pfizer Animal Health (Lic. Vet. E.U.A. No.: 189) contiene un cultivo inactivado de B. bronchiseptica. Es para la inmunización de perros sanos contra la enfermedad causada por B. bronchiseptica, en particular la tos de las perreras. COUGHGUARD-B® es preparada de una cepa altamente antigénica de B. bronchiseptica que ha sido inactivada y procesada para que no sea tóxica cuando se administra a perros. Se reporta que el método de producción deja intactas las propiedades inmunogénicas de la B. bronchiseptica. VANGUARD® 5/B por Pfizer Animal Health (Lic. Vet. E.U.A. No.: 189) contiene cepas atenuadas del virus del moquillo canino (CDV), CAV-2, CPIV, y del parvovirus canino (CPV) propagadas en una línea celular canina establecida. El antígeno del CPV se atenuó por un pasaje bajo de la línea celular canina y ese nivel de pasaje tiene propiedades inmunogénicas capaces de anular los anticuerpos maternales. La vacuna está empacada en forma liofilizada con gas inerte en lugar de vacío. El componente bacteriano contiene cultivos completos inactivados de ß. bronchiseptica que se suministran como diluyente. El componente de B. bronchiseptica en la VANGUARD® 5/B se prepara de una cepa altamente antigénica que se ha inactivado y procesado para que no sea tóxica cuando de administra a los perros. NASAGUARD-B™ por Pfizer Anima! Health (Lic. Vet. E.U.A. No.: 112) está compuesta de un cultivo vivo no virulento de bacterias B. bronchiseptica. PROGARD®-KC por Intervet es una vacuna viva intranasal modificada que contiene virus atenuados de la parainfluenza canina y un cultivo vivo no virulento de Bordetella bronchiseptica. PROGARD®-KC está presentada en forma desecada con un diluyente estéril proporcionado para la reconstitución. PROGARD®-KC es para la vacunación de cachorros y perros sanos susceptibles, para la prevención de la traqueobronquitis infecciosa canina ("tos de las perreras") debida al virus de la parainfluenza canina y a B. bron ch ¡séptica . PROGARD@-KC PLUS por Intervet contiene un cultivo vivo de cepas no virulentas de B. bronchiseptica, adenovirus canino tipo 2 atenuado y virus de la parainfluenza para la administración intranasal. La vacunación con PROGARD@-KC Plus estimula la inmunidad local rápida en el tracto respiratorio, inhibiendo por lo tanto la infección en el puerto de entrada, así como evitando los signos clínicos. Además de la inmunidad local, también estimula la inmunidad sistémica a las tres semanas de la administración ¡ntranasal. El volumen pequeño (0.4 mi) y una aplicación en una narina de PROGARD®-KC Plus proporciona facilidad para la vacunación, particularmente en razas pequeñas y en cachorros. PROGARD®-KC Plus se presenta en forma desecada con un diluyente estéril proporcionado para la reconstitución. PROGARD®-KC Plus es para la vacunación de perros y cachorros de tres semanas de edad o más, sanos, para la prevención de la traqueobronquitis infecciosa canina ("tos de las perreras") debido al adenovirus canino tipo 2, el virus de la parainfluenza y B. bronchiseptica. Intrac por Intervet es una vacuna viva modificada, secada por congelación, que contiene la cepa S 55 de B. bronchiseptica, para la administración intranasal. Número de licencia del producto PL 0201/401 1 Nobivac KC, descrita anteriormente, contiene también B. bronchiseptica. La vacunación sería útil especialmente, pero no exclusivamente para perros antes de entrar en una perrera de pensión o para la vacunación de perros en instalaciones de crianza. Una dosis típica de una vacuna comprendida de una proteína recombinante es de aproximadamente 5-10 µg. Una dosis típica de una vacuna comprendida de un virus inactivado es de aproximadamente 1- 0 mg.
En un noveno aspecto, la invención proporciona el uso de (i) un coronavirus que tiene una proteína S con al menos 75% de identidad del aminoácido con la proteína S de CRCV, o (ii) un coronavirus que tiene una proteína S con al menos 75% de identidad del aminoácido con la proteína S de BCV, o (¡ii) un coronavirus que tiene una proteína HE con al menos 90% de identidad del aminoácido con la proteína HE de CRCV, o (¡v) un coronavirus que tiene una proteína HE con al menos 90% de identidad del aminoácido con la proteína HE de BCV, o (v) una proteína de coronavirus que tiene al menos 75% de identidad del aminoácido con una proteína de CRCV o un fragmento inmunogénico de la misma, o (vi) una proteína coronaviral que tiene al menos 75%o de identidad del aminoácido con una proteína de BCV, o un fragmento inmunogénico de la misma, o (vii) un ácido nucleico que codifica la proteína coronaviral o una fracción inmunogénica de la misma, en la preparación de un medicamento para estimular una respuesta inmune contra el CRCV en un perro. La invención incluye el uso de (i) un coronavirus que tiene una proteína S con al menos 75% de identidad del aminoácido con la proteína S de CRCV, o (¡i) un coronavirus que tiene una proteína S con al menos 75% de identidad del aminoácido con la proteína S de BCV, o (iii) un coronavirus que tiene una proteína HE con al menos 90% de identidad del aminoácido con la proteína HE de CRCV, o (iv) un coronavirus que tiene una proteína HE con al menos 90% de identidad del aminoácido con la proteína HE de BCV, o (v) una proteína de coronavirus que tiene al menos 75% de identidad del aminoácido con una proteína de CRCV o un fragmento ¡nmunogénico de la misma, o (vi) una proteína coronaviral que tiene al menos 75% de identidad del aminoácido con una proteína de BCV, o un fragmento ¡nmunogénico de la misma, o (vii) un ácido nucleico que codifica la proteína coronaviral o una fracción inmunogénica de la misma, en la preparación de un medicamento para la profilaxis de una enfermedad respiratoria en un perro, típicamente, CIRD. Cuando una proteína de coronavirus, o un fragmento ¡nmunogénico de la misma se utiliza para la preparación del medicamento, la proteína de manera preferida tiene al menos 80%, o al menos 85%, o al menos 90%, o al menos 95% de identidad del aminoácido con la porción correspondiente de una proteína de BCV. De manera preferida, la proteína tiene al menos 80%, o al menos 85%, o al menos 90%, o al menos 95% de identidad del aminoácido con la porción correspondiente de una proteína de CRCV. De manera preferida, la proteína coronaviral utilizada en la preparación del medicamento es una proteína de BCV, HCV, HEV o CRCV, o una modificación de la misma, como se describió anteriormente con referencia al octavo aspecto de la invención. De manera más preferida, la proteína coronaviral utilizada en la preparación del medicamento es una proteína S. Aún de manera más preferida, la proteína S comprende una proteína S de CRCV o similar a CRCV como se definió anteriormente en el primer aspecto de la invención o que se puede obtener mediante los métodos del cuarto aspecto de la invención, una proteína S de BCV, una proteína S de HCV, o un fragmento inmunogénico de la misma. De manera más preferida, la proteína coronaviral utilizada en la preparación del medicamento comprende o consiste de la secuencia de aminoácidos listada en la Figura 4, o un fragmento inmunogénico de la misma, que tiene al menos 97% de identidad con la secuencia listada en la Figura 4. De manera preferida, la variante tiene al menos 98%, o al menos 99% de identidad de la secuencia de aminoácidos con la secuencia listada en la Figura 4. De manera más preferida, la variante tiene al menos 99. 1 %, o al menos 99.2%, o al menos 99.3%, o al menos 99.4%, o al menos 99.5%, o al menos 99.6%, o al menos 99.7%, o al menos 99.8%, o al menos 99.9% de identidad de la secuencia de aminoácidos con la secuencia listada en la Figura 4. De manera adicional o alterna, la proteína coronaviral utilizada en la preparación del medicamento puede comprender las proteínas HE, E, M o N de coronavirus. En una modalidad, las proteínas HE, E, M o N son proteínas de BCV, HCV o HEV. En otra modalidad, las proteínas HE, E, M o N son proteínas de CRCV. De manera típica, la proteína HE comprende una proteína HE de CRCV o similar a CRCV como se definió anteriormente en el tercer aspecto de la invención o que se puede obtener mediante los métodos del cuarto aspecto de la invención, una proteína HE de BCV, una proteína HE de HCV, o un fragmento inmunogénico de la misma.
De manera preferida, la proteína HE coronaviral utilizada en la preparación del medicamento comprende o consiste de la secuencia de aminoácidos parcial listada en la Figura 14, o un fragmento inmunogénico de la misma, que tiene al menos 97% de identidad con la secuencia listada en la Figura 14. De manera preferida, la variante tiene al menos 98%, o al menos 99% de identidad de la secuencia de aminoácidos con la secuencia listada en la Figura 14. De manera más preferida, la variante tiene al menos 99.1 %, o al menos 99.2%, o al menos 99.3%, o al menos 99.4%, o al menos 99.5%, o al menos 99.6%, o al menos 99.7%, o al menos 99.8%, o al menos 99.9% de identidad de la secuencia de aminoácidos con la secuencia parcial listada en la Figura 14. Cuando un coronavirus se utiliza en la preparación del medicamento, el coronavirus de manera preferida comprende una proteína S con al menos 80%, o al menos 85%, o al menos 90%, o al menos 95% de identidad del aminoácido con la proteína S de BCV. De manera más preferida, el coronavirus comprende una proteína S con al menos 80%, o al menos 85%, o al menos 90%, o al menos 95% de identidad del aminoácido con la proteína S de CRCV. De manera adicional o alterna, el coronavirus puede comprender una proteína HE con al menos 90%, o al menos 95% de identidad del aminoácido con la proteína HE de BCV. De manera más preferida el coronavirus comprende una proteína HE con al menos 96%, o al menos 97%, o al menos 98%, o al menos 99% de identidad del aminoácido con la proteína HE de CRCV. En un décimo aspecto, la invención proporciona una proteína S de CRCV o similar a CRCV como se definió anteriormente en el primer aspecto de la invención o que se puede obtener mediante los métodos del cuarto aspecto de la invención, para utilizarse en medicina. De manera típica, la proteína S se utilizará en medicina veterinaria. La invención incluye una proteína HE de CRCV o similar a CRCV como se definió anteriormente en el tercer aspecto de la invención o que se puede obtener mediante los métodos del cuarto aspecto de la invención, para utilizarse en medicina. De manera típica, la proteína HE se utilizará en medicina veterinaria. En un onceavo aspecto, la invención proporciona un método para vacunar un perro contra el CRCV, el método comprende administrar al perro una composición de vacuna como se describió anteriormente en el noveno aspecto de la invención. De manera típica, la vacuna se administrará vía las rutas intramuscular, subcutánea o intranasal. En otra modalidad, un perro puede adquirir pasivamente inmunidad contra el CRCV, al administrársele un anticuerpo que reacciona con el CRCV. El anticuerpo que reacciona con el CRCV puede ser un anticuerpo anti-BCV, anti-HCV, pero es de manera preferida, un anticuerpo anti-CRCV. De manera preferida, el anticuerpo que reacciona con el CRCV es un anticuerpo de anti-proteína S, un anticuerpo anti-proteína HE. De manera más preferida, el anticuerpo que reacciona con el CRCV es un anticuerpo de proteína S o HE anti-CRCV, como se describe en el quinto aspecto de la invención. En un doceavo aspecto, la invención proporciona un método para combatir la propagación del CRCV entre los perros, que comprende determinar si un perro está infectado con CRCV de acuerdo con los métodos descritos anteriormente en el sexto aspecto de la invención, o utilizando el ensayo inmunosorbente o el sustrato sólido como se describió anteriormente en el séptimo aspecto de la invención, y, si el perro está infectado con CRCV, poner en cuarentena al perro. Por "poner en cuarentena" a un perro, incluimos el significado de mantener al perro separado de todos los otros perros. También incluimos el significado de mantener el perro separado de los perros que no han sido vacunados contra el CRCV, que puede realizarse como se describió anteriormente. También incluimos el significado de mantener el perro separado de los perros que no han sido infectado con CRCV, lo cual puede determinarse como se describió anteriormente. En un treceavo aspecto, la invención proporciona un método para combatir la propagación del CRCV entre los perros, que comprende determinar si un perro está infectado con CRCV de acuerdo con los métodos descritos anteriormente en el sexto aspecto de la invención, o utilizar el ensayo inmunosorbente o el sustrato sólido, como se describió anteriormente en el séptimo aspecto de la invención, y si el perro está infectado con CRCV, vacunar los otros perros que han estado, están o es probable que estén en contacto con el perro. Un catorceavo aspecto de la invención proporciona un método para identificar una vacuna de prueba capaz de prevenir o reducir la incidencia de la enfermedad respiratoria infecciosa canina (CIRD) en perros. El método comprende (a) determinar si un perro ha estado expuesto al CRCV, típicamente de acuerdo con los métodos descritos anteriormente en el sexto aspecto de la invención o utilizando el ensayo inmunosorbente o el sustrato sólido como se describió anteriormente, en el séptimo aspecto de la invención, (b) si el perro no ha estado expuesto al CRCV, administrar la vacuna de prueba al perro, (c) inocular al perro con el CRCV, y (d) determinar si el perro desarrolla CIRD. La ausencia de CIRD en el paso (d) indica que la vacuna de prueba es capaz de evitar la CIRD. De manera típica, este método se realiza en un conjunto de perros. De manera preferida, el método involucra el uso de un conjunto de perros de control a los cuales no se les ha administrado la vacuna de prueba en el paso (b). La incidencia significativamente más baja de la CIRD en el conjunto de perros a los que se les ha administrado la vacuna de prueba que en el conjunto de control, indica que la vacuna de prueba es capaz de prevenir o reducir la incidencia de la CIRD.
La invención también incluye una vacuna identificada mediante este método. Todos los documentos referidos aquí se incorporan en la presente, en su totalidad, como referencia. La invención será descrita ahora con más detalle con la ayuda de las siguientes Figuras y Ejemplos.
Figura 1 Secuencia nucleotídica parcial (250 residuos) del ADNc de polimerasa (pol) de CRCV (SEQ ID NO: 1 ).
Figura 2 Secuencia de aminoácidos parcial (83 residuos) de la proteína pol de CRCV (SEQ ID NO: 2), derivada de la secuencia nucleotídica de la Figura 1.
Figura 3 Secuencia nucleotídica (4092 residuos) del ADNc Dentado (S) de CRCV (SEQ ID NO: 3). La Y en la posición 3531 se refiere ya sea a C o T.
Figura 4 Secuencia de aminoácidos (1363 residuos) de la proteína S de CRCV (SEQ ID NO: 4), derivada de la secuencia nucleotídica de la Figura 3.
Figura 5 Derivación de consenso para las secuencias de ADNc de una región de 250 nucleótidos del gen de la polimerasa de 12 coronavirus. La secuencia obtenida del coronavirus respiratorio canino está designada como T101. Los números indican los valores de las secuencias iniciales obtenidos por el análisis de 100 conjuntos de datos. BCV: coronavirus bovino, CCV: coronavirus canino, FIPV: virus de la peritonitis infecciosa felina, HEV: virus de la encefalomielitis hemaglutinante, IBV: virus de la bronquitis infecciosa, MHV: virus de la hepatitis del ratón, OC43: cepa OC43 del coronavirus humano, SDAV: virus de sialodacrioadenitis, TCV: coronavirus de pavo, TGEV: virus de la gastroenteritis transmisible, 229E: cepa 229E del coronavirus humano, T101 : coronavirus respiratorio canino (producto de la PCR para la muestra traqueal T101 ) Figura 6 Alineación múltiple de la secuencia con CLUSTAL X (1.8) de la secuencia parcial de 250 nucleótidos del ADNc de pol de CRCV (muestra T101 , SEQ ID NO: 1 ), BCV (SEQ ID NO: 5), cepa OC43 de HCV (SEQ ID NO: 6), HEV (SEQ ID NO: 7) y CCV (CCV entérico, SEQ ID NO: 8).
Figura 7 Alineación múltiple de la secuencia con CLUSTAL X (1.8) de la secuencia parcial de 83 aminoácidos de la proteína pol de CRCV (protCRCVpol, SEQ ID NO: 2) con HCV (protHCVpoli, SEQ ID NO: 9), HEV (protHEVpoli, SEQ ID NO: 10), BCV (protBCVpoli, SEQ ID NO: 11 ) y CECV (CCV entérico, protCECVpol, SEQ ID NO: 12).
Figura 8 Alineación de la secuencia con CLUSTAL X (1.8) de la secuencia nucleotídica del ADNc dentado de CRCV (CRCVdentado, SEQ ID NO: 3) y ADNc dentado de CCV entérico (CECVdentado, SEQ ID NO: 13).
Figura 9 Alineación múltiple de la secuencia con CLUSTAL X (1.8) de 4092 nucleótidos de la secuencia del ADNc dentado de CRCV (CRCVdentado, SEQ ID NO: 3) con ADNc dentados de BCV (BCVdentado, SEQ ID NO: 14), HCV (HCVdentado, SEQ ID NO: 15) y HEV (HEVdentado, SEQ ID NO: 16). La Y en la posición 3531 en la secuencia del CRCV se refiere a C o T.
Figura 10 Alineación múltiple de la secuencia con CLUSTAL X (1.8) de la secuencia de 1363 aminoácidos de la proteína dentada de CRCV (CRCVprodentada, SEQ ID NO: 4) con proteínas dentadas de BCV (BCVprodentada, SEQ ID NO: 17), HCV (HCVprodentada, SEQ ID NO: 18), HEV (HEVprodentada, SEQ ID NO: 19) y CCV entérico (CECVprodentada, SEQ ID NO: 20).
Figura 1 1 RT-PCR que utiliza un conjunto anidado de cebadores (Dentado 1 y 2 (SEQ ID NOS: 34 y 35) seguido por Dentado 3 y 4 (SEQ ID NOS: 36 y 37)). BCV: muestra de control positiva al coronavirus bovino; A72: células A72 negativas al coronavirus; H20: mezcla de la PCR sin ADN; T5-T21 : Muestras de la tráquea de los perros del estudio. La electroforesis en gel de agarosa muestra los productos de la PCR del tamaño esperado de 442pb para el control positivo (BCV) y las muestras T12 y T21.
Figura 2 Comparación de la prevalescencia de la enfermedad respiratoria en dos grupos de perros. Los perros en el grupo 1 fueron positivos para los anticuerpos del suero para el coronavirus respiratorio en el día de la entrada a la perrera, los perros en el grupo 2 fueron negativos. La gráfica muestra el porcentaje de perros que desarrollan la enfermedad respiratoria en el grupo 1 en comparación con el grupo 2 (p < 0.001 ). n es el número total de perros en cada grupo.
Figura 13 Secuencia nucleotídica parcial (497 residuos) del gen de la hemaglutinina/esterasa (HE) del CRCV (SEQ ID NO: 21 ). La secuencia corresponde a los nucleótidos 418 a 914 de los genes HE de BCV (GenBank 84486) y OC43 de HCV (No. de Acceso de GenBank M76373).
Figura 14 Secuencia de aminoácidos parcial (165 residuos) de la proteína HE de CRCV (SEQ ID NO: 22), derivada de la secuencia nucleotídica de la Figura 13. Esto corresponde a los residuos 140 a 304 de la secuencia de aminoácidos de BCV (GenBank M84486) y OC43 de HCV (No. de Acceso de GenBank M76373).
Figura 15 Alineación múltiple de la secuencia con CLUSTAL X (1.8) de una secuencia parcial de 497 nucleótidos del gen de hemaglutinina/esterasa (HE) del CRCV (coronavirus respiratorio canino, SEQ ID NO: 21 ) con BCV (cepa LY138 de coronavirus bovino, (SEQ ID NO: 23, tomada del No. de Acceso de Genbank AF058942), OC43 (cepa OC43 del coronavirus humano, SEQ ID NO: 24 tomada del No. de Acceso de Genbank M76373), HECV (coronavirus entérico humano, SEQ ID NO: 25, tomado del No. de Acceso de Genbank L07747), y HEV (virus de la encefalomielitis hemaglutinante, SEQ ID NO: 26, tomado del No. de Acceso de Genbank AF481863).
Figura 16 Alineación múltiple de la secuencia con CLUSTAL X (1.8) de una secuencia parcial de 165 aminoácidos de la proteína HE de CRCV (coronavirus respiratorio canino, (SEQ ID NO: 22) con BCV (cepa LY138 del coronavirus bovino, SEQ ID NO: 27, tomada del No. de Acceso de Genbank AF058942), OC43 (cepa OC43 del coronavirus humano, SEQ ID NO: 28, tomada del No. de Acceso de Genbank M76373), HECV (coronavirus entérico humano, SEQ ID NO: 29, tomado del No. de Acceso de Genbank L07747), y HEV (virus de la encefalomielitis hemaglutinante, SEQ ID NO: 30, tomado del No. de Acceso de Genbank AF481863). Los tres aminoácidos específicos del CRCV, F, N y L se indican en negrillas y están subrayados.
Figura 17 RT-PCR que utiliza los cebadores de consenso HE1 (SEQ ID NO: 38) y HE2 (SEQ ID NO: 39) dirigidos al gen HE de BCV y HCV (cepa OC43). La electroforesis en gel de agarosa muestra un producto de la PCR del tamaño esperado de 497pb para el control positivo al BCV y para cuatro muestras de la tráquea de los perros del estudio (T9Q, T91 , T101 y T105), y no para las células A72 negativas al coronavirus o la mezcla de la PCR sin ADN (H20). 1 kb indica un tamaño molecular estándar (Promega).
Figura 18 Estrategia de clonación del gen Dentado de CRCV.
EJEMPLO 1 Detección de un nuevo coronavirus asociado con la enfermedad respiratoria infecciosa canina Resumen Se llevó a cabo una investigación sobre las causas de la enfermedad respiratoria infecciosa canina (CIRD) en una perrera grande en donde les buscan un nuevo hogar. Las muestras de tejido tomadas del tracto respiratorio de los perros enfermos se probaron para la presencia de coronavirus utilizando RT-PCR con los cebadores conservados para el gen de la polimerasa. Los análisis de la secuencia de cuatro muestras positivas, mostraron la presencia de un nuevo coronavirus con alta similitud con el coronavirus bovino y el humano (cepa OC43) en sus genes dentados y de polimerasa, mientras que hubo una baja similitud con los genes comparables en el coronavirus canino entérico. Este coronavirus respiratorio canino (CRCV) se detectó mediante RT-PCR en 32/1 9 muestras de la tráquea y 20/ 19 de pulmón, con la prevalescencia más alta detectada en perros con síntomas clínicos leves. Los análisis serológicos mostraron que la presencia de los anticuerpos contra el CRCV en el día de la entrada a la perrera, disminuyó el riesgo de desarrollar la enfermedad respiratoria.
Materiales y Métodos Población del estudio Los perros de una perrera bien establecida, en donde les buscan un nuevo hogar, con un historial de enfermedad respiratoria endémica, se vigilaron para este estudio. Con la entrada a la perrera, todos los perros se vacunaron con KAVAK DA2 PÍP69 (Fort Dodge), una vacuna viva atenuada para el virus de moquillo, adenovirus canino tipo 2, virus de la parainfluenza canina y parvovirus canino. También se utilizó una vacuna muerta de leptospirosis (Fort Dodge). El estado de salud de cada perro se valoró dos veces al día por un clínico veterinario y los síntomas respiratorios se graduaron como sigue: 1 : sin signos respiratorios, 2: tos leve, 3: tos y descarga nasal, 4: tos, descarga nasal e inapetencia, 5: bronconeumonía. El estado general de salud de los perros se graduó como sigue: 1 : buena salud, 2: salud deficiente, 3: salud muy deficiente. Se registró la edad, raza y sexo de los perros. Para 1 19 perros, se realizó un examen postmortem. Las muestras de tejido se almacenaron a -70°C hasta el uso posterior. Las muestras de suero se recolectaron de 1 1 1 perros en el día de la entrada en la perrera en donde les buscan un nuevo hogar. Para 81 perros un suero de seguimiento estuvo disponible en el día 7 y para 1 11 perros, un suero estuvo disponible en el día 21 después de la entrada.
De los 111 perros, 30 permanecieron saludables durante los 21 días entre la primera y última muestras de suero, mientras que 81 perros desarrollaron enfermedad respiratoria. El suero de 35 perros alojados en otro lugar, se obtuvo del servicio de diagnóstico del Real Colegio Veterinario. Estos sueros se presentaron para análisis bioquímicos por varias razones. Cinco de estos sueros fueron de sabuesos de 18 meses de edad sin historial de enfermedad respiratoria. Los sueros de almacenaron de manera rutinaria a -20°C.
Extracción del ARN y RT-PCR El ARN se extrajo del tejido de la tráquea y del pulmón de 119 perros, utilizando TriReagent (Sigma). Se utilizaron aproximadamente 25-50 mg de tejido homogeneizado y el ARN se extrajo como se recomienda por el fabricante. La síntesis del ADNc se realizó utilizando Hexámeros Aleatorios (Roche) y transcriptasa inversa ImPromll (Promega). Se sabe que el gen de la polimerasa de los coronavirus es altamente conservado, y se ha utilizado previamente para los análisis filogenéticos de esta familia de virus (Stephensen et al., 1999). Para la detección de los coronavirus, se utilizó una modificación de los cebadores 2Bp y 4Bm dirigidos contra el gen de la polimerasa, como se describe por Stephensen et al. (1999) (Conscoro5: 5'-ACT- CAR-ATG-AAT-TTG-AAA-TAT- GC (SEQ ID NO: 31 ); y Conscoro6: 5 -TCA-CAC-TTA-GGA-TAR-TCC-CA (SEQ ID NO: 32) ). La PCR se realizó utilizando polimerasa Taq (Promega) en el amortiguador de reacción proporcionado, que contiene una concentración final de MgCI2 2.5 mM y 0.5µ? de cebadores. Para la PCR con los cebadores Conscoro5 y Conscoro6, se utilizó el siguiente perfil de temperatura: Después de la desnaturalización a 95°C durante 5 minutos, se llevaron a cabo 10 ciclos a 95°C durante 1 minuto, recocido a 37°C durante 1 minuto y extensión a 72°C durante 1 minuto. Esto se siguió por 10 ciclos utilizando una temperatura de recocido de 45°C, 0 ciclos a una temperatura de recocido de 50°C y 10 ciclos a una temperatura de recocido de 53°C, seguido por una extensión final a 72°C durante 10 minutos. Una fracción de 20µ1 del producto de la PCR se analizó en un gel de agarosa al 1.5% y se transfirió a una membrana de nylon (Roche) después de la electroforesis. La membrana de nylon se hibridó con una sonda oligonucleotídica específica para el producto de la PCR a 37°C durante la noche (Sonda Conscoro: AAG-TTT-TAT-GGY-GGY-TGG-GA (SEQ ID NO: 33)). Se le puso una cola en 3? a la sonda con Digoxigenina-dUTP y se detectó utilizando un conjugado de anti-Digoxigenina y sustrato quimioluminiscente de CSPD (Roche). Las secuencias del cebador específicas para el gen dentado se derivaron de una alineación de la región dentada de la cepa LY-138 del coronavirus bovino (AF058942) y la cepa OC43 del coronavirus humano (L14643). Se realizó una PCR con los cebadores Dentado 1 y Dentado 2, seguido por una PCR anidada utilizando los cebadores Dentado 3 y Dentado 4 y 2µ? del producto de la primera amplificación. Los números en paréntesis se refieren a la posición de los nucleótidos en el genoma del coronavirus bovino. Dentado 1 : 5 -CTT-ATA-AGT-GCC-CCC-AAA-CTA-AAT (25291- 25314) Dentado 2: 5'-CCT-ACT-GTG-AGA-TCA-CAT-GTT-TG (25912- 25890) Dentado 3: 5 -GTT-GGC-ATA-GGT-GAG-CAC-CTG (25320- 25339) Dentado 4: 5 -GCA-ATG-CTG-GTT-CGG-AAG-AG (25762-25742) El oligonucleótido Dentado 1 tiene la SEQ ID NO: 34, Dentado 2 tiene la SEQ ID NO: 35, Dentado 3 tiene la SEQ ID NO: 36, Dentado 4 tiene la SEQ ID NO: 37. El perfil de temperatura utilizado fue desnaturalización a 95°C durante 5 minutos, seguido por 35 ciclos de desnaturalización a 95°C durante 1 minuto, recocido a 55°C durante 40 segundos y alargamiento a 72°C durante 1 minuto. La extensión final se realizó a 72°C durante 10 minutos. La PCR anidada produjo un fragmento de 442pb.
Los productos de la PCR se clonaron en el vector pGEM-T-easy (Promega) y se secuenciaron utilizando el equipo de secuenciamiento del ciclo del cebador marcado con fluorescencia con termosecuenasa, con 7-deaza-dGTP (Amersham Pharmacia) utilizando cebadores marcados con Cy5.
Análisis filoqenéticos Se realizó una alineación de la secuencia del ADNc de 250 pb del gen de poiimerasa a las secuencias correspondientes de 11 coronavirus, utilizando ClustalX (Thompson et al., 1997). La relación filogenética con los coronavirus conocidos se analizó utilizando el paquete Phylip 3.6 (Felsenstein, 1989). Las alineaciones fueron seguidas por un análisis de las secuencias iniciales utilizando el programa Seqboot. Los conjuntos de datos obtenidos se utilizaron para un análisis máximo de la frugalidad utilizando el programa DNApars y se calculó un árbol de consenso utilizando Consense. Las derivaciones resultantes se dibujaron utilizando un el programa Treeview (Page, 1996).
ELISA Los antígenos de ELISA para el coronavirus bovino o el coronavirus canino entérico (CECV) (los antígenos son una preparación de los cultivos celulares infectados con virus obtenidos de Churchill Applied Biosciences, Huntingdon, RU) se resuspendieron en PBS a la concentración recomendada por el fabricante y se incubaron en placas de 96 pozos (Falcon) durante la noche a 37°C. Las placas se lavaron con PBS y se bloquearon con PBS que contiene polvo de leche descremada al 5% durante 30 minutos. Los sueros se diluyeron 1 :100 en amortiguador de bloqueo y se incubaron en las placas durante 1 hora. Después de lavar con PBS/ Tween 20al 0.05% (Sigma), se agregó un conjugado de IgG anti-perro de conejo marcado con peroxidasa (Sigma) (1 :5000 en PBS/ Tween 20 a! 0.05%) durante 1 hora. Las placas se incubaron con el sustrato de color (OPD, Sigma) durante 10 minutos y la reacción se detuvo agregando H2SO4 2M. La adsorción se determinó en un fotómetro para ELISA a 492nm.
Cultivo del virus El aislamiento del virus se realizó en fibroblastos de pulmón adulto canino (pasaje 3 a 7), células MDCK y A72. (Se aprecia, sin embargo, que el aislamiento del virus puede realizarse utilizando las células primarias o las líneas celulares tales como MDCK o A72 (canino), MDBK (bovino), HRT-18 (línea celular de tumor rectal humano) y Vero (Mono Verde Africano). Los fibroblastos del pulmón se mantienen en MEM con suero de becerro fetal al 20% (FCS), las células MDCK y A72 se mantienen en MEM con FCS al 5%. Las muestras de tejido de la tráquea (aproximadamente 25mg), se homogeneízan utilizando un escalpelo y se mezclan vigorosamente en 1 ml de MEM que contiene Penicilina (100U/mi), Estreptomicina (0.1 mg/ml), Anfotericina B (2^g/ml) y Tripsina (^ µg/m\). Las muestras se centrifugan a 13000 rpm durante 10 minutos y el sobrenadante se utiliza para inocular los cultivos celulares. Después de 30 minutos a 37°C, el sobrenadante se elimina y se agrega medio de mantenimiento a los cultivos. Los cultivos se pasan tres veces en ausencia de un efecto citopático. A continuación, el ARN se extrae de las células y se realiza la RT-PCR para detectar la presencia del CRCV.
Análisis Estadísticos Los datos se analizaron utilizando la prueba de chi cuadrada o la prueba exacta de Fisher y los valores de p por debajo de 0.05 se consideraron estadísticamente significativos.
Resultados PCR utilizando los cebadores de consenso para el gen de la polimerasa del ARN del coronavirus Utilizando los cebadores Conscoro5 y Conscoro6, se analizó mediante TR-PCR el ADNc obtenido de 40 muestras de la tráquea. De éstos, se encontró que siete eran positivos mediante PCR y la hibridación posterior (17.5%). Los productos de la PCR se clonaron y secuenciaron (Figuras 1 y 2) y los datos de la secuencia se compararon con las secuencias virales disponibles utilizando el programa de búsqueda FASTA (Pearson, 1990).
La comparación de la secuencia de la ADNc polimerasa del coronavirus, obtenida de cuatro de las muestras de tráquea canina con otras secuencias de coronavirus, reveló que eran, más similares a los datos de la secuencia de la cepa Québec y LY138 de BCV (Nos. de Acceso de GenBank AF220295 y AF058942, respectivamente) y la cepa OC43 del coronavirus humano (No. de Acceso de Genbank AF124989). La similitud en la secuencia analizada de 250 pb fue del 98.8% para la cepa Québec de BCV, y del 98.4% para la cepa LY138 de BCV y los genes pol del HCV, mientras que fue de sólo 68.53% para el gen pol de la cepa 1-71 del CCV (Figuras 6 y 7). Una alineación de la secuencia novedosa con las secuencias correspondientes de 11 coronavirus y los análisis filogenéticos utilizando el método de la máxima frugalidad, resultó en el árbol de consenso mostrado en la Figura 5. Se encontró la secuencia de ADNc obtenida de la muestra de tráquea (T101 ) en una rama común con el coronavirus bovino, coronavirus-OC43 humano y el virus de la encefalomielitis hemaglutinante. El virus se llamó el coronavirus respiratorio canino (CRCV).
PCR utilizando los cebadores para el gen dentado Para los análisis adicionales de la secuencia del ARN del CRCV, se realizó una alineación del ARN para el gen dentado de la cepa LY 138 del coronavirus bovino (AF058942) y la cepa OC43 del coronavirus humano (L14643), utilizando Clustal X (Thompson et al., 1997). Las regiones de consenso se eligieron para la selección de los conjuntos de cebadores anidados Dentado 1-2 y Dentado 3-4 (Figura 1 1 ). Los análisis de la PCR se realizaron con el ADNc obtenido de 1 19 muestras de tráquea y pulmón, utilizando estos cebadores anidados. En total, se encontró que 32 muestras de la tráquea (26.9%) y 20 muestras del pulmón (16.8%) fueron positivas mediante la PCR anidada. Para ocho perros, se obtuvo un resultado con PCR positivo, para la tráquea y el pulmón. Los análisis de la secuencia de los productos de la PCR obtenidos de los tejidos de seis diferentes perros, mostraron algunas secuencias de ADN idénticas para estos ADNc (Figuras 3 y 4). Una comparación con las secuencias dentadas de los coronavirus conocidos utilizando el programa FASTA reveló una similitud del 98.1 % con el coronavirus bovino y una similitud del 97.8% con el coronavirus OC43 humano (Figuras 9 y 10).
PCR utilizando los cebadores para el gen HE Los coronavirus bovinos y otros coronavirus del grupo II contienen una proteína estructural adicional, la hemaglutinina/esterasa (HE). Debido a la alta similitud del CRCV con el BCV, analizamos la presencia de un gen HE en el CRCV. Una alineación de las secuencias de los genes HE de BCV y de OC43 de HCV se utilizó para diseñar los cebadores HE1 y HE2 (Cuadro 2).
Se probaron cuatro muestras de tráquea que se habían identificado previamente como positivas para el ARN de coronavirus mediante RT-PCR con los cebadores para el gen S, mediante RT-PCR, con el conjunto de cebadores para el gen HE. Las cuatro muestras mostraron una banda de la PCR del tamaño esperado después de la electroforesis en gel de agarosa (Figura 17).
CUADRO 2 Cebadores diseñados de una alineación de los genes de hemaglutinina/esterasa de BCV (No. de Acceso de GenBank M84486) y OC43 de HCV (No. de Acceso de GenBank 76373) El cebador HE1 tiene la SEQ ID No: 38 y HE2 tiene la SEQ ID No: 39. La secuencia del producto de la PCR del CRCV obtenido utilizando los cebadores HE 1 y HE 2 se da en la Figura 13 (SEQ ID No: 21 ), y su secuencia predicha de aminoácidos se lista en la Figura 14 (SEQ ID No: 22). Una comparación de estas secuencias nucleotídicas y de aminoácidos con los fragmentos correspondientes de otros coronavirus relacionados se muestra en las Figuras 15 y 16. Se demostró que tres aminoácidos son únicos del CRCV, como se muestra en Cuadro 3.
CUADRO 3 Aminoácidos únicos en el gen HE del CRCV Las posiciones de los aminoácidos en BCV, HECV, HCV y HEV están numeradas desde la M inicial (que es el número 1 ), al inicio de las proteínas HE de BCV y OC43 de HCV (Nos. de Acceso de GenBank M84486 y M76373, respectivamente).
Asociación de las muestras positivas de la PCR con los signos respiratorios Utilizando los cebadores para el gen dentado, se analizaron las muestras de 119 perros mediante RT-PCR para el CRCV. De éstas, 42 fueron de perros sin signos respiratorios (grado 1 ), 18 perros habían mostrado signos respiratorios leves (grado 2), 46 habían mostrado signos respiratorios moderados (grado 3) y 13 severos (grados 4 y 5). Los grados 4 y 5 se fusionaron debido al bajo número de casos en estos grupos. El Cuadro 4 muestra los resultados de la PCR para el coronavirus en perros con diferentes grados de enfermedad respiratoria. Específicamente, el Cuadro 4 muestra los resultados de la RT-PCR para las muestras de tráquea y pulmón de 119 perros con diferentes signos respiratorios (ninguno a severo), utilizando la PCR anidada dirigida contra el gen dentado del coronavirus, así como el número de muestras positivas del número total de muestras y el porcentaje de muestras positivas (en paréntesis).
CUADRO 4 Resultados de la RT-PCR para las muestras de tráquea y de pulmón Establecimiento de un ensayo serolóqico para el CRCV Debido a la homología del ADNc dentado del CRCV con la región dentada del coronavirus bovino, se utilizó un antígeno por ELISA para el BCV, para el análisis serológico del CRCV. Se probó el suero de cinco perros sin historial de enfermedad respiratoria infecciosa que no se habían alojado en la perrera investigada.
Los valores de OD variaron de -0.013 a 0.39 con un valor promedio de OD de 0.154. Además, se probaron los sueros de 30 perros admitidos en una clínica veterinaria por varias razones, para los anticuerpos del coronavirus. De éstos, 20 muestras mostraron un OD de < 0.4 (-0.46 a 0.396) y 10 muestras mostraron un OD de > 1.0 (1.012 a 1.949). Las muestras con un OD de 0.6 o superior se consideraron positivas posteriormente.
Comparación de la respuesta inmune al CRCV de perros con y sin enfermedad respiratoria La ELISA del antígeno de BCV se realizó utilizando sueros apareados de 1 1 1 perros de la perrera del estudio. De éstos, 81 perros habían mostrado síntomas de enfermedad respiratoria durante un periodo de 21 días y 30 habían permanecido sanos. Del grupo de perros con enfermedad respiratoria, 17 fueron positivos para los anticuerpos para el CRCV en el día de entrada en la perrera y 64 fueron negativos. Del grupo de 64 perros sin anticuerpos detectables para el BCV en el día uno, 63 tuvieron una prueba positiva en el día 21. Todos los 46 perros de éstos 63 para los cuales estuvo disponible una muestra en el día 7, tuvieron una prueba negativa en el día 7. Por lo tanto, 63 perros mostraron una seroconversión durante el periodo de estudio, mientras que sólo un perro permaneció negativo. De los 31 perros que permanecieron sanos, 17 tuvieron anticuerpo para el CRCV en el día de entrada. Todos los 13 perros que fueron negativos en el día 1 , tuvieron una prueba negativa en el día 7, pero mostraron una seroconversión en el día 21.
Así, de 34 perros que fueron positivos para los anticuerpos para el CRCV cuando llegaron a la perrera, 17 desarrollaron enfermedad respiratoria (50%), mientras que 77 perros que fueron negativos cuando llegaron, 64 desarrollaron signos respiratorios durante el periodo de estudio (83. 1 %), (Figura 12). Por lo tanto, los perros que no tuvieron anticuerpos para el CRCV cuando entraron a la perrera, tuvieron una probabilidad incrementada de desarrollar enfermedad respiratoria (p < 0.001 ). Sólo uno de los 77 perros que fueron negativos cuando llegaron, permaneció negativo durante el periodo de estudio de 21 días, mientras que 76 perros mostraron una seroconversión.
Seroloqía utilizando un antígeno del coronavirus canino entérico (CECV) Se realizó un ensayo de ELISA utilizando un antígeno de coronavirus canino, para investigar si el CRCV mostró una reacción cruzada serológica al coronavirus canino entérico. Se seleccionó el suero de 27 perros, probado previamente para los anticuerpos para el CRCV, utilizando el antígeno de BCV. Se encontró que ocho perros tuvieron anticuerpos para CECV el día de la entrada en la perrera, de éstos, cuatro tuvieron anticuerpos para el CRCV. Se encontró que diecinueve perros eran negativos para el CECV en el día 1 , 17 de éstos también fueron negativos para el CRCV. De los 19 perros negativos, cinco mostraron una seroconversión a CECV durante ei periodo de 21 días de la investigación y 17 mostraron una seroconversión a CRCV. Los análisis de la prevalencia de la enfermedad respiratoria en este grupo, mostraron que seis de ocho perros (75%) que fueron positivos para los anticuerpos para CECV en el día 1 desarrollaron enfermedad respiratoria. Del grupo de 19 perros que no tuvieron anticuerpos detectables para el CECV en el día 1 ,15 mostraron signos de enfermedad respiratoria (78.9%), (p=0.594).
Aislamiento del Virus Las muestras de tejido de la tráquea de perros que son identificados como positivos para el ARN de CRCV mediante RT-PCR, se inocularon en cultivos celulares de fibroblastos de pulmón adulto canino y células MDCK. Para algunas muestras, el aislamiento del virus se realiza también en las células A72. Los cultivos no muestran signos de un efecto citopático durantes los tres pasajes. Después de varios pasajes, el ARN es extruido de los cultivos y es probado para la presencia del ARN del CRCV mediante RT-PCR.
Discusión Este estudio reporta la detección de un nuevo coronavirus, el CRCV, en perros con enfermedad respiratoria que están en perreras.
Se ha reportado que los coronavirus causan la enfermedad respiratoria del hombre, ganado, credos y aves de corral, pero su presencia en el tracto respiratorio de perros y una posible asociación con la enfermedad respiratoria infecciosa canina (CIRD) no se ha determinado. Se investigaron los perros de una perrera en la cual la CIRD era endémica y no podía controlarse con el uso de vacunas recomendadas contra la CIRD. Las muestras tomadas del tracto respiratoria de estos perros se examinaron utilizando cebadores de RT-PCR dirigidos contra el gen conservado de la polimerasa de los coronavirus (Stephensen et al., 1999). Inicialmente, se encontraron que siete muestras de la tráquea eran positivas; se determinó la secuencia de los productos de la RT-PCR y se comparó con todas las secuencias disponibles del gen de la polimerasa del coronavirus. Este análisis reveló que la secuencia del ADNc obtenida de las muestras caninas tuvo una similitud más alta a la del gen de la polimerasa del coronavirus bovino (98.8%) y el coronavirus OC43 humano (98.4%), pero sólo una similitud muy baja con el gen de la polimerasa del coronavirus canino entérico (cepa 1 -71 ,68.53% de similitud). Se realizó un análisis filogenético utilizando las secuencias de la polimerasa de once coronavirus adicionales. El coronavirus detectado en el tracto respiratorio de perros (CRCV) se localizó en una rama común con tres virus del grupo 2: BCV, cepa OC43 del HCV y HEV. Sin embargo, el coronavirus canino entérico, un coronavirus del grupo 1 , demostró estar sólo relacionado de manera lejana.
Por lo tanto, el coronavirus respiratorio canino es un nuevo coronavirus de los perros que está más estrechamente relacionado con el BCV y el HCV-OC43, ambos de los cuales son conocidos por causar enfermedad respiratoria. Para obtener más información de la secuencia y determinar adicionalmente la relación con otros coronavirus utilizando un gen más variable, se analizó una parte del gen dentado. Puesto que el CRCV ha demostrado ser más similar al BCV y al HCV-OC43, se utilizó una alineación de las secuencias de sus genes dentados, para diseñar un conjunto anidado de cebadores. Los cebadores anidados se eligieron para lograr un ensayo más sensible. El secuenciamiento de los productos de esta RT-PCR confirmó la alta similitud del CRCV con el BCV y el HCV-OC43. La presencia de los anticuerpos para el CRCV se analizó utilizando un ELISA basado en un antígeno de BCV, debido a la alta similitud de la secuencia de los dos virus en el ADNc dentado. Los resultados de ELISA confirmaron la presencia de un virus similar a BCV en la población del estudio. La prevalescencia de los anticuerpos fué del 30% al momento de entrar en la perrera y del 99% después de 21 días. De manera interesante e inesperada, los análisis serológicos revelaron que los perros con anticuerpos para el CRCV en el día de la entrada a la perrera, desarrollaron la enfermedad respiratoria menos frecuentemente que los perros sin anticuerpos (p < 0.001 ). Por lo tanto, la presencia de los anticuerpos para el CRCV tuvo un efecto protector contra la enfermedad respiratoria en esta población. Casi todos los perros negativos en el día de la entrada en la perrera, mostraron una seroconversión al CRCV en tres semanas, indicando que el virus es altamente contagioso. La serología utilizando un antígeno para el coronavirus canino entérico (CECV), mostró una prevalescencia mucho menor de anticuerpos para CECV en el día 21. Por lo tanto, los resultados de BCV-ELISA no reflejan una infección con el coronavirus canino entérico y la reactividad cruzada entre los dos antígenos parece ser baja. Los anticuerpos para el CRCV en el suero, estaban presentes en aproximadamente 30% de los perros de varios orígenes, incluyendo perros que entraban a una perrera en donde les buscan un nuevo hogar, así como perros que son mascotas. La presencia del CRCV por lo tanto, no está limitada a la perrera investigada y el virus parece estar establecido en la población de perros. Mediante PCR, se detectó el CRCV en el tejido de la tráquea y de pulmón, y por lo tanto, parece infectar el tracto respiratorio superior e inferior de los perros. Dentro de la población en las perreras, se detectó el ARN de CRCV en 27.3% de los perros con todos los grados de enfermedad respiratoria, así como en 26.2% de los perros que estaban aparentemente sanos al momento de la eutanasia.
El ARN de CRCV se encontró más frecuentemente en la tráquea de los perros con tos leve (55%). Los estudios que utilizan la 229E del coronavirus humano han mostrado que los coronavirus pueden causar la ruptura del epitelio respiratorio y discinesia ciliar (Chilvers et al., 2001 ). Sin estar apegados a una teoría, creemos que una infección con CRCV tiene un efecto similar, y que el virus juega un papel importante en las etapas tempranas de la patogénesis de la CIRD. Al dañar el epitelio respiratorio e interrumpir la eliminación ciliar, el CRCV facilita la entrada de otros patógenos virales o bacterianos. Por lo tanto, mientras que la infección por CRCV por sí misma puede causar sólo síntomas respiratorios leves, en conjunto con otros agentes patogénicos, puede conducir a una enfermedad respiratoria severa. La patogénesis de la CIRD no se ha investigado completamente desde la década de 1970, cuando se determinó que la Bordetella bronchiseptica, el adenovirus canino tipo 2 y la parainfluenza canina eran las causas principales de la enfermedad. Sin embargo, la vacunación de todos los perros contra CPIV, CAV-2 y el virus del moquillo, no ayudó a controlar la enfermedad en esta perrera, a pesar de la evidencia de que la mayoría de los perros responden a la vacuna en 21 días (datos no mostrados). Este estudio muestra una asociación de un nuevo coronavirus respiratorio canino con la CIRD. La etiología de la CIRD, necesita, por lo tanto, ser reevaluada y tiene que establecerse el papel de los microorganismos novedosos o los microorganismos no asociados previamente con la enfermedad.
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EJEMPLO 2 Clonación y expresión del CRCV Dentado El gen Dentado de CRCV se clonó utilizando los cebadores listados en el Cuadro 5 y utilizando la siguiente estrategia de clonación, que se ilustra en la Figura 18. 1. El gen dentado se amplificó en cuatro fragmentos que se traslapan (A, B, C, D). 2. El producto de la PCR Sp5-Sp2 (B) se unió al producto Spl-Sp8 (C) utilizando el sitio Pvtvll en el traslape. 3. Este fragmento se clonó en el vector pT7blue2 (Novagen) utilizando los sitios de restricción Nco\ y BstX\. 4. El fragmento de la PCR SpFXho-Sp6 (A) se unió a BC utilizando el sitio de restricción BstXl en el traslape y el sitio Xho\ que se había incorporado en el cebador SpF-Xho. 5. El fragmento ABC se movió en el vector de transferencia del baculovirus pMelBacB (Invitrogen), utilizando los sitios de restricción Xho\ y Ncol. 6. El fragmento de la PCR Sp7-SpR-HisTag-Eco (D) se unió a ABC utilizando el sitio de restricción Ncol en el traslape y el sitio EcoRI que se había incorporado en el cebador SpR-Eco-HisTag, resultando en el gen dentado completo en pMelBacB (MelBac Dentado). Este producto contiene un HisTag (6xHis) en el término C de la proteína expresada. 7. Para la expresión en mamíferos, el gen completo se movió a pSecTagA (Invitrogen) utilizando el sitio SamHl en pMelBacB y el sitio EcoRI en el extremo de ABCD, resultando en el plásmido SecTagDentado.
Construcción de un baculovirus recombinante Se realizó una cotransfección en las células Sf9 utilizando el ADN del baculovirus Bac-N-Blue (Invitrogen) y MelBac Dentado. El baculovirus resultante (AcSpCRCV 1 -11 ) mostró contener un inserto de longitud completa mediante PCR, utilizando los cebadores (Invitrogen) localizados corriente arriba y corriente debajo del sitio recombinante.
Expresión en células de mamífero El plásmido SecTag Dentado se transfectó en las células BHK-21 utilizando Lipofectamina (Invitrogen). La expresión de la proteína Dentada se analizó utilizando una muestra de suero de un perro que había mostrad ser positive para los anticuerpos para el CRCV, utilizando ELISA (antígeno de BCV obtenido de Churchill), y un suero de control positivo para el BCV, obtenido de (BCV anti-pollo). Las células transfectadas mostraron una señal positive en un ensayo de Inmunofluorescencia, utilizando el suero canino o de pollo y un conjugado marcado con FITC (IgG anti-perro FITC o IgG anti-pollo FITC).
CUADRO 5 Cebadores diseñados de una alineación de los genes dentados del coronavirus bovino (No. de Acceso de GenBank AF058942) y el coronavirus humano, OC43 (No. de Acceso de GenBank L14643) SpF-Xhol contiene un sitio Xho I (negrilla). SpR-His-EcoR I contiene un 6xHisTag (doble subrayado), un codón de paro, (subrayado) y un sitio EcoR I (negrilla) LISTADO DE SECUENCIAS <110> Real Colegio Veten' onario <120> Material Biológico <130> RVCW/P28428PC <140> PCT/GB03/02832 <141> 2003-07-01 <150> GB 0217434.0 <151> 2002-07-27 <160> 52 <170> Patentln versión 3.1 <210> 1 <211> 250 <212> ADN <213> coronavi rus respiratorio < <400> 1 ctcagatgaa tttgaaatat gctattagtg ctaagaatag agcccgcact gttgctggtg 60 tttccatact tagtactatg actggcagaa tgtttcatca aaaatgtttg aaaagtatag 120 cagctacacg tggtgttcct gttgttatag gcaccactaa attttatggc ggctgggatg 180 atatgttacg tcgccttatt aaagatgttg acaatcctgt acttatgggt tgggattatc 240 ctaagtgtga 250 <210> 2 <211> 83 <212> P T <213> coronavi rus respiratorio canino <400> 2 Gln Met Asn Leu Lys Tyr Ala lie Ser Ala Lys Asn Arg Ala Arg Thr 1 5 10 15 val Ala Gly val ser lie Leu ser Thr Met Thr Gly Arg Met Phe His 20 25 30 Gln Lys Cys Leu Lys ser lie Ala Ala Thr Arg Gly val Pro val val 35 40 45 lie Gly Thr Thr Lys Phe Tyr Gly Gly Trp Asp Asp Met Leu Arg Arg 50 55 60 Leu lie Lys Asp Val Glu Asn Pro Val Leu Met Gly Trp Asp Tyr Pro 65 70 75 80 Lys Cys Glu <210> 3 <211> 4092 <212> DNA <213> coronav rus respiratorio canino <400> 3 atgtttttga tacttttaat ttccttacca atggcttttg ctgttatagg agatttaaag 60 tgtactacgg tttccatcaa tgatgttgac accggtgctc cttctattag cactgatgtt 120 gtcgatgtta ctaatggttt aggtacttat tatgttttag atcgtgtgta tttaaatact 180 acattgttgc ttaatggtta ttatcctact tcaggttcta catatcgtaa tatggcactg 240 aagggaactt tactattgag cacactatgg tttaaaccac catttctttc tgattttatt 300 gatggtgttt ttgctaaggt aaaaaatacc aaggttatta aagatggtgt agtgtatagt 360 gagtttcctg ctataactat aggtagtact tttgtaaata catcctatag tgtggtagta 420 caaccacata ctactaattt agataataaa ttacaaggtc tcttagagat ctctgtttgc 480 cagtatacta tgtgcgatta cccacatacg atgtgtcatc ctaatctggg taataaacgc 540 atagaactat ggcattggga tacaggtgtt gttccctgtt tatataagcg taatttcaca 600 tatgatgtga atgctgatta tttgtattcc catttttatc aagaaggtgg tactttttat 660 gcatatttta 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aagtgcttct ttacaagaaa ttctatctag acttgatgct 3240 cttgaagcgc aagctcagat agacagactt atcaatgggc gtcttaccgc tcttaatgct 3300 tatgtttctc aacagcttag tgattctaca ctagtaaaat ttagtgcagc acaagctatg 3360 gagaaggtta atgaatgtgt caaaagccaa tcatctagga taaatttttg tggtaatggt 3420 aatcatatta tatcattagt gcagaatgct ccatatggtt tgtattttat ccactttagc 3480 tatgtcccta ctaagtatgt cactgcgaag gttagtcccg gtctgtgcat ygcaggtgat 3540 agaggtatag ctcctaagag tggttatttt gttaatgtaa ataacacttg gatgttcact 3600 ggtagtggtt attactaccc tgaacctata actggaaata atgtggttgt tatgagtacc 3660 tgtgctgtta actatactaa agcaccggat gtaatgctga acatttcaac acccaacctc 3720 cctgatttta aggaagagtt ggatcaatgg tttaaaaacc aaacattaat ggcaccagat 3780 ttgtcacttg attatataaa tgttacattc ttggacctac aagatgaaat gaataggtta 3840 caggaggcaa taaaagtttt aaatcatagc tacatcaatc tcaaggacat tggtacatat 3900 gaatattatg taaaatggcc ttggtatgta tggcttttaa ttggccttgc tggcgtagct 3960 atgcttgttt tactattctt catatgctgt tgtacaggat gtgggactag ttgttttaag 4020 aaatgcggtg gttgttgtga tgattatact ggacatcagg agttagtaat caaaacgtca 4080 catgacgact aa 4092 <210> 4 <211> 1363 <212> PRT <213> coronavirus resp ratorio canino <400> 4 Met Phe Leu lie Leu Leu lie Ser Leu Pro Met Ala Phe Ala val lie 1 5 10 15 Gly Asp Leu Lys Cys Thr Thr val Ser lie Asn Asp val Asp Thr Gly 20 25 30 Ala Pro Ser lie Ser Thr Asp val Val Asp Val Thr Asn Gly Leu Gly 35 40 45 Thr Tyr Tyr Val Leu Asp Arg Val Tyr Leu Asn Thr Thr Leu Leu Leu 50 55 60 Asn Gly Tyr Tyr Pro Thr Ser Gly Ser Thr Tyr Arg Asn Met Ala Leu 65 70 75 80 Lys Gly Thr Leu Leu Leu Ser Thr Leu Trp Phe Lys Pro Pro Phe Leu 85 90 95 Ser Asp Phe lie Asp Gly Val Phe Ala Lys Val Lys Asn Thr Lys Val 100 105 110 lie Lys Asp Gly Val Val Tyr Ser Glu Phe Pro Ala lie Thr lie Gly 115 120 125 Ser Thr Phe val Asn Thr Ser Tyr Ser Val val Val Gln Pro His Thr 130 135 140 Thr Asn Leu Asp Asn Lys Leu Gln Gly Leu Leu Glu lie Ser Val Cys 145 150 155 160 Gln Tyr Thr Met Cys Asp Tyr Pro His Thr Met Cys His Pro Asn Leu 165 170 175 Gly Asn Lys Arg lie Glu Leu Trp His Trp Asp Thr Gly Val Val Pro 180 185 190 Cys Leu Tyr Lys Arg Asn Phe Thr Tyr Asp val Asn Ala Asp Tyr Leu 195 200 205 Tyr Ser His Phe Tyr Gln Glu Gly Gly Thr Phe Tyr Ala Tyr Phe Thr 210 215 220 Asp Thr Gly Val Val Thr Lys Phe Leu Phe His Val Tyr Leu Gly Thr 225 230 235 240 Val Leu ser His Tyr Tyr Val Met Pro Leu Thr Cys Asn Ser Ala Met 245 250 255 Thr Leu Glu Tyr Trp Val Thr Pro Leu Thr Phe Lys Gln Tyr Leu Leu 260 265 270 Ala Phe Asn Gln Asp Gly val lie Phe Asn Ala Val Asp Cys Lys Ser 275 280 285 Asp Phe Met Ser Glu lie Lys Cys Lys Thr Leu Ser lie Ala Pro Ser 290 295 300 Thr Gly val Tyr Glu Leu Asn Gly Tyr Thr Val Gln Pro lie Ala Asp 305 310 315 320 Val Tyr Arg Arg lie Pro Asn Leu Pro Asp Cys Asn lie Glu Ala Trp 325 330 335 Leu Asn Asp Lys Ser Val Pro Ser Pro Leu Asn Trp Glu Arg Lys Thr 340 345 350 Phe Ser Asn Cys Asn Phe Asn Met Ser Ser Leu Met Ser Phe lie Gln 355 360 365 Ala Asp Ser Phe Thr Cys Asn Asn lie Asp Ala Ala Lys lie Tyr Gly 370 375 380 Met Cys Phe Phe Ser lie Thr lie Asp 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Ala Asn Phe lie Leu His Gly 595 600 605 Val Asn Ser Gly Thr Thr Cys Ser Thr Asp Leu Gln Lys Ser Asn Thr 610 615 620 Asp lie lie Leu Gly val Cys val Asn Tyr Asp Leu Tyr Gly lie Thr 625 630 635 640 Gly Gln Gly lie Phe val Glu val Asn Ala Thr Tyr Tyr Asn Ser Trp 645 650 655 Gln Asn Leu Leu Tyr Asp Ser Asn Gly Asn Leu Tyr Gly Phe Arg Asp 660 665 670 Tyr Leu Thr Asn Arg Thr Phe Met lie Arg Ser Cys Tyr Ser Gly Arg 675 680 685 val Ser Ala Gly Phe His Ser Asn Ser Ser Glu Pro Ala Leu Leu Phe 690 695 700 Arg Asn lie Lys Cys Asn Tyr Val Phe Asn Asn Thr Leu Ser Arg Gln 705 710 715 720 Leu Gln Pro lie Asn Tyr Phe Asp Ser Tyr Leu Gly Cys Val Val Asn 725 730 735 Ala Asp Asn Ser Thr Ser Ser Ser val Gln Thr Cys Asp Leu Thr Val 740 745 750 Gly Ser Gly Tyr Trp Gly Asp Tyr Ser Thr Gln Arg Arg Ser Arg Arg 755 760 765 Thr lie Thr Thr Gly Tyr Arg Phe Thr Asn Phe Glu Pro Phe Thr Val 770 775 780 Asn Pro val Asn Asp Ser Leu His Pro Val Gly Gly Leu Tyr Glu lie 785 790 795 800 Gln lie Pro ser Glu Phe Thr lie Gly Asn Met Glu Glu Phe lie Gln 805 810 815 Thr Arg Ser Pro Lys Val Thr lie Asp Cys Pro Val Phe Val cys Gly 820 825 830 Asp Tyr Ala Ala Cys Lys Ser Gln Leu Val Glu Tyr Gly Ser Phe Cys 835 840 845 Asp Asn lie Asn Ala lie Leu Thr Glu Val Asn Glu Leu Leu Asp Thr 850 855 860 Thr Gln Leu Gln val Ala Asn ser Leu Met Asn Gly val Thr Leu ser 865 870 875 880 Thr Lys Leu Lys Asp Gly Phe Asn Phe Asn Val Asp Asp lie Asn Phe 885 890 895 Ser Pro Val Leu Gly cys Leu Gly ser Glu cys Asn Lys val Ser ser 900 905 910 Arg ser Ala lie Glu Asp Leu Leu Phe Ser Lys Val Lys Leu Ser Asp 915 920 925 Val Gly Phe Val Asp Ala Tyr Asn Asn Cys Thr Gly Gly Ala Glu lie 930 935 940 Arg Asp Leu lie Cys Val Gln Ser Tyr Asn Gly lie Lys Val Leu Pro 945 950 955 960 Pro Leu Leu Ser Glu Asn Gln lie Ser Gly Tyr Thr Leu Ala Ala Thr 965 970 975 Phe Ala Ser Leu Phe Pro Pro Trp Ser Ala Ala Ala Gly Val Pro Phe 980 985 990 Tyr Leu Asn Val Gln Tyr Arg lie Asn Gly lie Gly Val Thr Met Asp 995 1000 1005 Val Leu Thr Gln Asn Gln Lys Leu lie 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bovino <400> 17 Met Phe Leu lie Leu Leu lie Ser Leu Pro Met Ala Leu Ala Val lie 1 5 10 15 Gly Asp Leu Lys Cys Thr Thr Val Ser lie Asn Asp Val Asp Thr Gly 20 25 30 val Pro Ser val Ser Thr Asp Thr Val Asp Val Thr Asn Gly Leu Gly 35 40 45 Thr Tyr Tyr Val Leu Asp Arg Val Tyr Leu Asn Thr Thr Leu Leu Leu 50 55 60 Asn Gly Tyr Tyr Pro Thr Ser Gly Ser Thr Tyr Arg Asn Met Ala Leu 65 70 75 80 Lys Gly Thr Leu Leu Leu Ser Thr Leu Trp Phe Lys Pro Pro Phe Leu 85 90 95 Ser Asp Phe lie Asn Gly lie Phe Ala Lys Val Lys Asn Thr Lys Val 100 105 110 lie Lys Asn Gly val Met Tyr Ser Glu Phe Pro Ala lie Thr lie Gly 115 120 125 Ser Thr Phe Val Asn Thr Ser Tyr ser Val Val val Gln Pro His Thr 130 135 140 Thr Asn Leu Asp Asn Lys Leu Gln Gly Leu Leu Glu lie Ser Val Cys 145 150 155 160 Gln Tyr Thr Met Cys Glu Tyr Pro His Thr lie Cys His Pro Asn Leu 165 170 175 Gly Asn Arg Arg lie Glu Leu Trp His Trp Asp Thr Gly Val val ser 180 185 190 Cys Leu Tyr Lys Arg Asn Phe Thr Tyr Asp Val Asn Ala Asp Tyr Leu 195 200 205 Tyr 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respiratorio canino <400> 21 tatcgcagcc ttacttttgt taatgtacca tatgtttata atggctctgc acaatctaca 60 gctctttgta aatctggtag tttagttctt aataaccctg catatatagc tcgtgaagct 120 aattttgggg attattatta taaggttgaa gctgatttct atttgtcagg ttgtgacgag 180 tatatcgtac cactttgtat ttttaacggc aagtttttgt cgaatacaaa gtattatgat 240 gatagtcaat attattttaa taaagacact ggtgttattt atggtttcaa ttctactgaa 300 accattaaca ctggttttga ttttaattgt cattatttac ttttaccctc tggtaattat 360 ttagccattt caaatgagct attgttaact gttcctacga aagcaatctg tcttaataag 420 cgtaaggatt ttacgcctgt acaggttgtt gactcgcggt ggaacaatgc caggcagtct 480 gataacatga cggcgg 496 <210> 22 <211> 165 <212> PRT <213> coronavirus respiratorio canino <400> 22 Tyr Arg Ser Leu Thr Phe val Asn al Pro Tyr val Tyr Asn Gly Ser 1 5 10 15 Ala Gln Ser Thr Ala Leu cys Lys Ser Gly Ser Leu val Leu Asn Asn 20 25 30 Pro Ala Tyr lie Ala Arg Glu Ala Asn Phe Gly Asp Tyr Tyr Tyr Lys 35 40 45 Val Glu Ala Asp Phe Tyr Leu Ser Gly Cys Asp Glu Tyr lie Val Pro 50 55 60 Leu Cys lie Phe Asn Gly Lys Phe Leu ser Asn Thr Lys Tyr Tyr Asp 65 70 75 80 Asp Ser Gln Tyr Tyr Phe Asn Lys Asp Thr Gly Val lie Tyr Gly Phe 85 90 95 Asn Ser Thr Glu Thr lie Asn Thr Gly Phe Asp Phe Asn cys His Tyr 100 105 110 Leu Leu Leu Pro Ser Gly Asn Tyr Leu Ala lie Ser Asn Glu Leu Leu 115 120 125 Leu Thr Val Pro Thr Lys Ala lie Cys Leu Asn Lys Arg Lys Asp Phe 130 135 140 Thr Pro val Gln Val Val Asp Ser Arg Trp Asn Asn Ala Arg Gln ser 145 150 155 160 Asp Asn Met Thr Ala 165 <210> 23 <211> 497 <212> ADN <213> cepa LY138 de coronavirus bovino <400> 23 tatcgcagcc ttacttttgt taatgtacca tatgtttata atggctctgc acaatctaca 60 gctctttgta aatctggtag tttagttctt aataaccctg catatatagc tcgtgaagct 120 aattttgggg attattatta taaggttgaa gctgattttt atttgtcagg ttgtgacgag 180 tatatcgtac cactttgtat ttttaacggc aagtttttgt cgaatacaaa gtattatgat 240 gatagtcaat attattttaa taaagacact ggtgttattt atggtctcaa ttctactgaa 300 accattacca ctggttttga ttttaattgt cattatttag ttttaccctc tggtaattat 360 ttagccattt caaatgagct attgttaact gttcctacga aagcaatctg tcttaataag 420 cgtaaggatt ttacgcctgt acaggttgtt gactctcggt ggaacaatgc caggcagtct 480 gataacatga cggcggt 497 <210> 24 <211> 497 <212> ADN <213> cepa OC43 coronavi rus humano <400> 24 tatcgcagcc ttacttttgt taatgtacca tatgtttata atggctctgc acaatctaca 60 gctctttgta aatctggtag tttagtcctt aataaccctg catatatagc tcctcaagct 120 aactctgggg attattatta taaggttgaa gctgattttt atttgtcagg ttgtgacgag 180 tatatcgtac cactttgtat ttttaacggc aagtttttgt cgaatacaaa gtattatgat 240 gatagtcaat attattttaa taaagacact ggtgttattt atggtctcaa ttctacagaa 300 accattacca ctggttttga tcttaattgt tattatttag ttttaccctc tggtaattat 360 ttagccattt caaatgagct attgttaact gttcctacga aagcaatctg tcttaataag 420 cgtaaggatt ttacgcctgt acaggttgtt gattcgcggt ggaacaatgc caggcagtct 480 gataacatga cggcggt 497 <210> 25 <211> 497 <212> ADN <213> coronavirus entérico humano <400> 25 tatcgcagcc ttacttttgt taatgtacca tatgtttaca atggctctgc acaatctaca 60 gctctttgta aatctggtag tttagttctt aataaccctg catatatagc tcgtgaagct 120 aattttgggg attattatta taaggttgaa gctgattttt atttgtcagg ttgtgacgag 180 tatatcgtac cactttgtat ttttaacggc aagtttttgt cgaatacaaa gtattatgat 240 gatagtcaat attattttaa taaagacact ggtgttattt atggtctcaa ttctactgaa 300 accattacca ctggttttga ttttaattgt cattatttag ttctaccctc tggcaattat 360 ttagccattt caaatgagct attgttaact gttcctacta aagcaatctg tcttaataag 420 cgtaaggatt ttacgcctgt acaggttgtt gactcgcggt ggaacaatgc caggcagtct 480 gataacatga cggcagt 497 <210> 26 <211> 497 <212> ADN <213> virus de la encefalomielit s hemaglut nante <400> 26 tatcgcagtc ttactttagt taatgtgcca tacgtttaca atgggtcagc tcaacccacc 60 gcactttgta agtctggcag tttaattctt aacaatcctg catatatagc ccgtgaggct 120 aatgtgggtg attattatta taagtctgaa gcagattttt ctctctcagg ttgtgacgag 180 tatatcgtac cactttgtat ttttaatggc aagtttttgt cgaatacaaa gtattatgat 240 gatagtcaat attattttaa taaagacact ggtgttattt atggtctcaa ttctactgaa 300 accattacca ctggttttga ttttaattgt cattatttag ttctaccctc tggtaattat 60 ctagccattt caaatgagct attgttaact gttcctacta aagcaatctg tcttaataag 420 cgtaaggttt ttacgcctgt acaggttgtt gattcgcggt ggaacaatgc caggcaatct 480 gataacatga cggcagt 497 <210> 27 <211> 165 <212> PRT <213> cepa LY138 de coronavirus bovino <400> 27 Tyr Arg ser Leu Thr Phe Val Asn val Pro Tyr Val Tyr Asn Gly Ser 1 5 10 15 5 Ala Gln Ser Thr Ala Leu Cys Lys Ser Gly Ser Leu Val Leu Asn Asn 20 25 30 Pro Ala Tyr lie Ala Arg Glu Ala Asn Phe Gly Asp Tyr Tyr Tyr Lys 35 40 45 val Glu Ala Asp Phe Tyr Leu Ser Gly Cys Asp Glu Tyr lie Val Pro 50 55 60 Leu Cys lie Phe Asn Gly Lys Phe Leu Ser Asn Thr Lys Tyr Tyr Asp 65 70 75 80 0 Asp Ser Gln Tyr Tyr Phe Asn Lys Asp Thr Gly Val lie Tyr Gly Leu 85 90 95 Asn ser Thr Glu Thr lie Thr Thr Gly Phe Asp Phe Asn Cys His Tyr 100 105 110 Leu Val Leu Pro Ser Gly Asn Tyr Leu Ala lie ser Asn Glu Leu Leu 115 120 125 , J Leu Thr val Pro Thr Lys Ala lie Cys Leu Asn Lys Arg Lys Asp Phe 130 135 140 Thr Pro Val Gln Val val Asp Ser Arg Trp Asn Asn Ala Arg Gln Ser 145 150 155 160 Asp Asn et Thr Ala 165 <210> 28 <211> 165 <212> PRT <213> cepa OC43 de coronavirus humano <400> 28 Tyr Arg Ser Leu Thr Phe Val Asn Val Pro Tyr val Tyr Asn Gly Ser 1 5 10 15 Ala Gln Ser Thr Ala Leu Cys Lys Ser Gly ser Leu Val Leu Asn Asn 20 25 30 Pro Ala Tyr lie Ala Pro Gln Ala Asn Ser Gly Asp Tyr Tyr Tyr Lys 35 40 45 val Glu Ala Asp Phe Tyr Leu Ser Gly Cys Asp Glu Tyr lie val Pro 50 55 60 Leu Cys lie Phe Asn Gly Lys Phe Leu Ser Asn Thr Lys Tyr Tyr Asp 65 70 75 80 Asp Ser Gln Tyr Tyr Phe Asn Lys Asp Thr Gly val lie Tyr Gly Leu 85 90 95 Asn Ser Thr Glu Thr lie Thr Thr Gly Phe Asp Leu Asn Cys Tyr Tyr 100 105 110 Leu Val Leu Pro Ser Gly Asn Tyr Leu Ala lie Ser Asn Glu Leu Leu 115 120 125 Leu Thr val Pro Thr Lys Ala lie cys Leu Asn Lys Arg Lys Asp Phe 130 135 140 Thr Pro Val Gln Val Val Asp Ser Arg Trp Asn Asn Ala Arg Gln Ser 145 150 155 160 Asp Asn et Thr Ala 165 <210> 29 <211> 165 <212> PRT <213> coronavi rus entérico humano <400> 29 Tyr Arg Ser Leu Thr Phe Val Asn val Pro Tyr Val Tyr Asn Gly Ser 1 5 10 15 Ala Gln Ser Thr Ala Leu Cys Lys Ser Gly Ser Leu Val Leu Asn Asn 20 25 30 Pro Ala Tyr lie Ala Arg Glu Ala Asn Phe Gly Asp Tyr Tyr Tyr Lys 35 40 45 Val Glu Ala Asp Phe Tyr Leu Ser Gly Cys Asp Glu Tyr lie Val Pro 50 55 60 Leu cys lie Phe Asn Gly Lys Phe Leu ser Asn Thr Lys Tyr Tyr Asp 65 70 75 80 Asp ser Gln Tyr Tyr Phe Asn Lys Asp Thr Gly Val lie Tyr Gly Leu 85 90 95 Asn Ser Thr Glu Thr lie Thr Thr Gly Phe Asp Phe Asn Cys His Tyr 100 105 110 Leu val Leu Pro Ser Gly Asn Tyr Leu Ala lie Ser Asn Glu Leu Leu 115 120 125 Leu Thr Val Pro Thr Lys Ala lie Cys Leu Asn Lys Arg Lys Asp Phe 130 135 140 Thr Pro Val Gln Val Val Asp Ser Arg Trp Asn Asn Ala Arg Gln Ser 145 150 155 160 Asp Asn Met Thr Ala 165 <210> 30 <211> 165 <212> PRT <213> virus de la encefalomielitis hemaglutinante <400> 30 Tyr Arg Ser Leu Thr Leu Val Asn Val Pro Tyr val Tyr Asn Gly Ser 1 5 10 15 Ala Gln Pro Thr Ala Leu Cys Lys Ser Gly Ser Leu lie Leu Asn Asn 20 25 30 Pro Ala Tyr lie Ala Arg Glu Ala Asn Val Gly Asp Tyr Tyr Tyr Lys 35 40 45 Ser Glu Ala Asp Phe Ser Leu Ser Gly Cys Asp Glu Tyr lie Val Pro 50 55 60 Leu Cys lie Phe Asn Gly Lys Phe Leu Ser Asn Thr Lys Tyr Tyr Asp 65 70 75 80 Asp Ser Gln Tyr Tyr phe Asn Lys Asp Thr Gly val lie Tyr Gly Leu 85 90 95 Asn Ser Thr Glu Thr lie Thr Thr Gly Phe Asp Phe Asn cys His Tyr 100 105 110 Leu val Leu Pro Ser Gly Asn Tyr Leu Ala lie ser Asn Glu Leu Leu 115 120 125 Leu Thr Val Pro Thr Lys Ala lie Cys Leu Asn Lys Arg Lys Val Phe 130 135 140 Thr Pro Val Gln Val Val Asp Ser Arg Trp Asn Asn Ala Arg Gln Ser 145 150 155 160 Asp Asn Met Thr Ala 165 <210> 31 <211> 23 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Cebador oligonucleotidico de consenso para el gen de la polimerasa del coronav rus <400> 31 actcaratga atttgaaata tgc 23 <210> 32 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Cebador ol gonucleotidico de consenso para el gen de la polimerasa del coronavirus <400> 32 tcacacttag gatartccca 20 <210> 33 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Sonda oligonucleotidica de consenso para el gen de la polimerasa del coronavirus <400> 33 aagttttatg gyggytggga 20 <210> 34 <211> 24 <212> ADN <213> cepa LY138 del coronavirus bovino <400> 34 cttataagtg cccccaaact aaat <210> 35 <211> 23 <212> ADN <213> cepa LY138 del coronavirus bovino <400> 35 cctactgtga gatcacatgt ttg <210> 36 <211> 21 <212> ADN <213> cepa LY138 del coronavi rus <400> 36 gttggcatag gtgagcacct g <210> 37 <211> 20 <212> ADN <213> cepa LY138 del coronavi rus <400> 37 gcaatgctgg ttcggaagag <210> 38 <211> 20 <212 ADN <213> cepa LY138 del coronavirus bovino <400> 38 tatcgcagcc ttacttttgt <210> 39 <211> 19 <212> ADN <213> cepa LY138 del coronav rus bovino <400> 39 accgccgtca tgttatcag <210> 40 <211> 24 <212> ADN <213> cepa LY138 del coronavirus bovino <400> 40 cttataagtg cccccaaact aaat <210> 41 <211> 23 <212> ADN <213> cepa LY138 del coronavirus bovino <400> 41 cctactgtga gatcacatgt ttg <210> 42 <211> 20 <212> ADN <213> cepa LY138 del coronavirus bovino <400> 42 gttggcatag gtgagcactg <210> 43 <211> 20 <212> ADN <213> cepa LY138 del coronavirus bovino <400> 43 gcaatgctgg ttcggaagag <210> 44 <211> 20 <212> ADN <213> cepa LY138 del coronavirus <400> 44 aacggttaca ctgttcagcc <210> 45 <211> 20 <212> ADN <213> cepa LY138 del coronav rus bovino <400> 45 caagtaaatg agtctgcctg <210> 46 <211> 20 <212> ADN <213> cepa LY138 del coronavirus bovino <400> 46 ggctgccacc tctgctagtc <210> 47 <211> 25 <212> ADN <213> cepa LY138 del coronav rus bovino <400> 47 attgttaaat gcattagcaa taagc <210> 48 <211> 26 <212> ADN <213> cepa LY138 del coronavirus bovino <400> 48 tttttgatac ttttaatttc cttacc 26 <210> 49 <211> 24 <212> ADN <213> cepa LY138 del coronavirus bovino <400> 49 gtcgtcatgt gawgttttra ttac 24 <210> 50 <211> 35 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Cebador oligonucleotidico para clonar el gen dentado coronavirus respiratorio canino <400> 50 agctcgagct ttttgatact tttaatttcc ttacc 35 <210> 51 <211> 53 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Cebador oligonucleotidico para clonar el gen dentado del coronavirus resp ratorio canino <400> 51 ttgaattctt aatgatgatg atgatgatgg tcgtcatgtg awgttttrat tac 53 <210> 52 <211> 11 <212> PRT <213> Desconocido <220> <223> Epitopo supuesto del linfocito T <400> 52 Thr Ala ser Gly val Ala Glu Thr Thr Asn Cys 1 5 10

Claims (1)

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES
1 - Una proteína (S) Dentada de coronavirus, o un fragmento de la misma, que tiene al menos 75% de identidad de la secuencia de aminoácido con la proteína S de CRCV, cuya secuencia de aminoácidos se lista en la Figura 4, y que comprende al menos uno de los aminoácidos específicos del coronavirus respiratorio canino (CRCV) listados en el Cuadro 1. 2. - Una proteína S de coronavirus, que comprende la secuencia de aminoácidos listada en la Figura 4, o una variante de la misma, con al menos 97% de identidad de la secuencia de aminoácido con la secuencia listada en la Figura 4. 3. - Una proteína polimerasa (pol) de coronavirus, o un fragmento de la misma, que tiene al menos 90% de identidad de la secuencia de aminoácido con la proteína pol de BCV y que comprende el aminoácido E en la posición correspondiente a la posición 4975 en el genoma de BCV (No. de Acceso SWALL: Q91A29). 4. - Una proteína pol de coronavirus que comprende la secuencia de aminoácidos listada en la Figura 2. 5. - Una proteína hemaglutinina/esterasa (HE) de coronavirus, o un fragmento de la misma, que tiene al menos 90% de identidad de la secuencia de aminoácido con la proteína HE de BCV, y que comprende uno o más de F en la posición 235, N en la posición 242 y L en la posición 253 de la proteína HE de BCV (No. de Acceso de Genbank AF058942). 6. - Una proteína HE de coronavirus, que comprende la secuencia de aminoácidos listada en la Figura 14. 7. - Un polinucleótido que codifica una proteína de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o el complemento de la misma. 8. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque comprende la secuencia nucleotídica listada en la Figura 3. 9. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque comprende la secuencia nucleotídica listada en Figura 1. 10. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque comprende la secuencia nucleotídica listada en Figura 13. 11. - Un vector que comprende un polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10. 12. - Una célula hospedera que comprende el vector de conformidad con la reivindicación 1 1. 13. - Un método para obtener una proteína codificada por el vector de la reivindicación 11 , el método comprende cultivar la célula hospedera de la reivindicación 12, que expresa la proteína en la célula hospedera, y purificar la proteína. 14.- Una proteína que se puede obtener por el método de conformidad con la reivindicación 13. 15.- La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada además porque el vector es un vector de expresión que comprende un promotor eucariótico enlazado de manera operativa a los polinucleótidos, y en donde la célula hospedera es una célula hospedera eucariótica. 16.- Un método para obtener una proteína S glucosilada codificada por los polinucleótidos de la reivindicación 7 u 8, el método comprende cultivar la célula hospedera de la reivindicación 15, que expresa la proteína en la célula hospedera, y purificar la proteína. 17. - Una proteína S glucosilada que se puede obtener por el método de la reivindicación 16. 18. - Un método para hacer un anticuerpo anti-CRCV, que comprende (i) producir una respuesta inmune a una proteína S de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 , 2, 14 ó 17, en un animal, y preparar un anticuerpo del animal o de una célula inmortal derivada del mismo, o (ii) seleccionar un anticuerpo de una biblioteca que muestra los anticuerpos, utilizando una proteína S de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 , 2, 14 ó 17. 19. - El método de conformidad con la reivindicación 18, cauterizado además porque comprende determinar si el anticuerpo tiene una afinidad mayor para la proteína S de CRCV que por la proteína S de BCV. 20. - Un anticuerpo anti-CRCV que se puede obtener mediante el método de la reivindicación 18 ó 19, que tiene una mayor afinidad por la proteína S de CRCV que por la proteína S de BCV. 21. - Un método para hacer un anticuerpo anti-CRCV que comprende (i) producir una respuesta inmune a una proteína HE de conformidad con la reivindicación 5 ó 6, en un animal, y preparar un anticuerpo del animal o de una célula inmortal derivada del mismo, o (¡i) seleccionar un anticuerpo de una biblioteca que muestra anticuerpos, utilizando una proteína HE de conformidad con la reivindicación 5 ó 6. 22. - El método de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado además porque comprende adicionalmente determinar si el anticuerpo tiene una afinidad mayor por la proteína HE de CRCV que por la proteína HE de BCV. 23. - Un anticuerpo anti-CRCV que se puede obtener por el método de la reivindicación 21 ó 22, que tiene una afinidad mayor por la proteína HE de CRCV que por la proteína HE de BCV. 24.- Un método para determinar si un perro ha sido expuesto al CRCV, el método comprende identificar el CRCV o un anticuerpo anti-CRCV en una muestra adecuada de un perro. 25.- El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque el anticuerpo anti-CRCV se detecta utilizando un antígeno de CRCV, BCV, coronavirus humano (HCV) o virus de la encefalomielitis hemaglutinante (HEV). 26.- El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado además porque la muestra adecuada es una muestra que contiene el anticuerpo, tal como suero, saliva, lavado traqueal y lavado bronquiolar, y en donde la identificación del anticuerpo anti-CRCV comprende identificar un anticuerpo que se une selectivamente a la proteína S de BCV (AF058942), la proteína S de HCV (L14643), o a un coronavirus que tiene una proteína S con al menos 75% de identidad del aminoácido con la proteína S de CRCV (Figura 4) o un fragmento de la misma. 27. - El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado además porque la identificación de un anticuerpo anti-CRCV, comprende identificar un anticuerpo que se une selectivamente a una proteína HE de BCV (AF058942) proteína HE de HCV (M76373), o a un coronavirus que tiene una proteína HE con al menos 90% de identidad del aminoácido con la proteína HE de CRCV (Figura 14) o un fragmento de la misma. 28. - El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque la muestra adecuada es una muestra que contiene un anticuerpo, y en donde la identificación de un anticuerpo anti-CRCV comprende identificar un anticuerpo que se une selectivamente a una proteína S de acuerdo conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 , 2, 1 1 ó 14 o a una proteína HE de conformidad con la reivindicación 5 ó 6. 29. - El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque la muestra adecuada es un lavado de pulmón, lavado traqueal, frotis amigdalino o una biopsia o muestra postmortem del tracto respiratorio del perro. 30. - El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado además porque la identificación de un CRCV comprende identificar un componente de ácido nucleico de CRCV. 31.- El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado además porque la identificación de un ácido nucleico del CRCV comprende identificar un polinucleótido que se híbrida con alto rigor al genoma del BCV (AF058942). 32. - El método de conformidad con la reivindicación 30 ó 31 , caracterizado además porque la identificación del CRCV comprende identificar un polinucleótido como se definió en cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10. 33. - El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado además porque la identificación del CRCV comprende identificar un componente de proteína del CRCV. 34.- El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado además porque la identificación de un componente de proteína del CRCV comprende identificar una proteína de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 , 2, 5, 6, 1 1 ó 14. 35. - El método de conformidad con la reivindicación 33 ó 34, caracterizado además porque la identificación de un componente de proteína del CRCV comprende utilizar un reactivo de anticuerpo con el CRCV. 36. - El método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado además porque el reactivo de anticuerpo con el CRCV, es un anticuerpo anti-BCV, un anticuerpo anti-HCV, o un anticuerpo anti-CRCV de conformidad con la reivindicación 20 ó 23. 37. - Un ensayo inmunosorbente para detector anticuerpos S anti-CRCV que comprende: una fase sólida recubierta con una proteína S de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 , 2, 14 ó 17, o un fragmento antigénico de la misma, en donde los anticuerpos S anti-CRCV en una muestra expuesta a la fase sólida se unirán a la proteína; y un conjugado con una marca detectable que se unirá a los anticuerpos anti-CRCV unidos a la fase sólida. 38.- Un ensayo inmunosorbente para detector anticuerpos HE anti-CRCV que comprende: una fase sólida recubierta con una proteína HE de conformidad con la reivindicación 5 ó 6, o un fragmento antigénico de la misma, en donde los anticuerpos HE anti-CRCV en una muestra expuesta a la fase sólida se unirá a la proteína; y un conjugado con una marca detectable que se unirá a los anticuerpos anti-CRCV unidos a la fase sólida. 39 - El ensayo inmunosorbente de conformidad con la reivindicación 37 ó 38, caracterizado además porque la fase sólida es un pozo de microtitulación. 40. - El ensayo inmunosorbente de conformidad con la reivindicación 37 ó 38, caracterizado además porque el conjugado comprende un anticuerpo de anti-perro. 41. - El ensayo inmunosorbente de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 37 a 40, caracterizado además porque el conjugado comprende una enzima. 42. - El ensayo inmunosorbente de conformidad con la reivindicación 41 , caracterizado además porque la enzima es peroxidasa de rábano. 43.- El ensayo inmunosorbente de conformidad con la reivindicación 41 ó 42, caracterizado además porque comprende adicionalmente un sustrato para la enzima. 44. - Un sustrato sólido con una proteína S de cualquiera de las reivindicaciones 1 , 2, 14 ó 17, o un fragmento antigénico del mismo, unido a él, para capturar anticuerpos S anti-CRCV de una muestra líquida, en donde los anticuerpos S anti-CRCV en una muestra expuesta al sustrato sólido se unirán a la proteína S. 45. - Un sustrato sólido con una proteína HE de la reivindicación 5 ó 6, o un fragmento antigénico del mismo, unido al él, para capturar anticuerpos HE anti-CRCV de una muestra líquida, en donde los anticuerpos HE anti-CRCV en una muestra expuesta al sustrato sólido se unirán a la proteína HE. 46. - El sustrato sólido de conformidad con la reivindicación 44 ó 45, caracterizado además porque el sustrato sólido es un pozo de microtitulación. 47. - Una composición de vacuna para vacunar perros, que comprende un coronavims que tiene una proteína S con al menos 75% de identidad del aminoácido con la proteína S de BCV, o una proteína coronaviral que tiene al menos 75% de identidad del aminoácido con una proteína de BCV o un fragmento inmunogénico del mismo, o un ácido nucleico que codifica la proteína coronaviral o la fracción inmunogénica de la misma. 48.- La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 47, caracterizada además porque la proteína coronaviral es una proteína BCV, HCV, HEV o CRCV, o una modificación de la misma. 49.- La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 47 ó 48, en donde la proteína coronaviral es una proteína S. 50.- La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 49, caracterizada además porque comprende una proteína S de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 , 2, 14 ó 17, una proteína S de BCV, una proteína S de HCV, una proteína S de HEV, o un fragmento inmunogénico de la misma. 51.- La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 47 ó 48, caracterizada además porque la proteína coronaviral es una proteína de hemaglutinina-esterasa (HE) o una proteína de membrana integral (M). 52. - La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 51 , caracterizada además porque la proteína HE comprende una proteína HE como se definió de conformidad con la reivindicación 5 ó 6, una proteína HE de BCV, una proteína HE de HCV, o un fragmento inmunogénico de la misma. 53. - La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 47, caracterizada además porque el virus se selecciona de BCV, HCV, HEV y CRCV, o una modificación del mismo. 54. - La composición de vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 47 a 53, caracterizada además porque comprende también un adyuvante farmacéuticamente aceptable. 55. - La composición de vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 47 a 55, caracterizada además porque comprende uno o más de: (a) un agente capaz de producir una respuesta inmune en un perro contra el virus de la parainfluenza canina (CPIV); (b) un agente capaz de producir una respuesta inmune en un perro contra el adenovirus canino tipo 2 (CAV-2); (c) un agente capaz de producir una respuesta inmune en un perro contra el herpesvirus canino (CHV); y (d) un agente capaz de producir una respuesta inmune en un perro contra Bordetella bronchiseptica (B. bronchiseptica). 56. - El uso de (i) un coronavirus que tiene una proteína S con al menos 75% de identidad del aminoácido con la proteína S de CRCV, o (ii) un coronavirus que tiene una proteína S con al menos 75% de identidad del aminoácido con una proteína S de BCV, o (iii) un coronavirus que tiene una proteína HE con al menos 90% de identidad del aminoácido con una proteína HE de CRCV, o (iv) un coronavirus que tiene una proteína HE con al menos 90% de identidad del aminoácido con una proteína HE de BCV, o (v) una proteína de coronavirus que tiene al menos 75% de identidad del aminoácido con una proteína de CRCV o un fragmento inmunogénico de la misma, o (vi) una proteína coronaviral que tiene al menos 75% de identidad del aminoácido con una proteína de BCV, o un fragmento inmunogénico de la misma, o (vii) un ácido nucleico que codifica la proteína coronaviral o una fracción inmunogénica de la misma, en la preparación de un medicamento para estimular una respuesta inmune contra el CRCV en un perro. 57.- El uso de (i) un coronavirus que tiene una proteína S con al menos 75% de identidad del aminoácido con la proteína S de CRCV, o (ii) un coronavirus que tiene una proteína S con al menos 75% de identidad del aminoácido con una proteína S de BCV, o (iii) un coronavirus que tiene una proteína HE con al menos 90% de identidad del aminoácido con una proteína HE de CRCV, o (iv) un coronavirus que tiene una proteína HE con al menos 90% de identidad del aminoácido con una proteína HE de BCV, o (v) una proteína de coronavirus que tiene al menos 75% de identidad del aminoácido con una proteína de CRCV o un fragmento inmunogénico de la misma, o (vi) una proteína coronaviral que tiene al menos 75% de identidad del aminoácido con una proteína de BCV, o un fragmento inmunogénico de la misma, o (vii) un ácido nucleico que codifica la proteína coronaviral o la fracción inmunogénica de la misma, en la preparación de un medicamento para la profilaxis de una enfermedad respiratoria en un perro. 58. - El uso como se reclama en la reivindicación 56 ó 57, en donde la proteína coronaviral es una proteína BCV, HCV, HEV o CRCV, o una modificación de la misma. 59. - El uso como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 56 a 58, en donde la proteína coronaviral es una proteína S. 60. - El uso como se reclama en la reivindicación 59, en donde la proteína S comprende una proteína S de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 , 2, 14 ó 17, una proteína S de BCV, una proteína S de HCV, o un fragmento inmunogénico de la misma. 61 - El uso como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 56 a 58, en donde la proteína coronaviral es HE o M. 62. - El uso de como se reclama en la reivindicación 61 , en donde la proteína HE comprende una proteína HE de acuerdo con la reivindicación 5 ó 6, una proteína HE de BCV, una proteína HE de HCV, o un fragmento inmunogénico de la misma. 63. - El uso como se reclama en la reivindicación 56, en donde el virus se selecciona de BCV, HCV, HEV y CRCV, o una modificación de la misma. 64. - La proteína S de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 , 2, 14 ó 17, caracterizada además porque es para utilizarse en medicina. 65. - La proteína HE de conformidad con la reivindicación 5 ó 6 caracterizada además porque es para utilizarse en medicina. 66. - Un método para combatir la propagación del CRCV entre perros que comprende determinar si un perro está infectado con CRCV de acuerdo con el método de cualquiera de las reivindicaciones 24 a 36 y, si el perro está infectado con CRCV, poner en cuarentena al perro. 67 - Un método para combatir la propagación del CRCV entre perros que comprende determinar si un perro está infectado con CRCV de acuerdo al método de cualquiera de las reivindicaciones 24 a 36 y, si el perro está infectado con CRCV, vacunar otros perros que han estado, están o es probable que estén en contacto con el perro. 68.- Un método para identificar una vacuna de prueba capaz de prevenir la enfermedad respiratoria infecciosa canina (CIRD) en perros que comprende (a) determinar si un perro ha estado expuesto al CRCV de acuerdo al método de cualquiera de las reivindicaciones 24 a 36, (b) si el perro no ha estado expuesto al CRCV, administrar una vacuna de prueba al perro, (c) inocular al perro con CRCV, y (d) determinar si el perro desarrolla CIRD, en donde la ausencia de CIRD en el paso (d), indica que la vacuna de prueba es capaz de prevenir el CIRD. 69.- Una vacuna identificada por el método de la reivindicación 68. 70.- La cepa Dentada D-1 de E. coli de CRCV, que contiene un plásmido cuyo inserto contiene una porción del ADNc S de CRCV, como está depositado por el Real Colegio Veterinario en el NCIMB bajo el número de Acceso NCIMB 41 146, el 25 de Julio del 2002. 71 . - El plásmido contenido en la cepa Dentada D-1 de E. coli de CRCV, depositada por el Real Colegio Veterinario en el NCIMB bajo el número de Acceso NCIMB 41 146, el 25 de Julio del 2002. 72. - Un equipo de partes para el ensayo inmunosorbente de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 37-43, el equipo comprende una fase sólida, una proteína S de CRCV o similar a CRCV y/o una proteína HE de CRCV o similar a CRCV para recubrir la fase sólida, y un conjugado con una marca detectable. 73 - Ei equipo de partes de conformidad con la reivindicación 72, caracterizado además porque la fase sólida comprende una placa de microtitulación. 74. - El equipo de partes de conformidad con la reivindicación 72 ó 73, caracterizado además porque el conjugado con una marca detectable comprende una anticuerpo de anti-perro. 75. - El equipo de partes de conformidad con la reivindicación 72 ó 73, caracterizado además porque el conjugado con una marca detectable comprende una enzima. 76.- El equipo de partes de conformidad con la reivindicación 75, caracterizado además porque comprende un sustrato para la enzima. 77.- El equipo de partes de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 72 a 76, caracterizado además porque comprende una muestra de control positivo que contiene una anticuerpo de proteina S de anti-CRCV y/o un anticuerpo de proteína HE de anti-CRCV. 78.- El uso de un anticuerpo que reacciona con CRCV en la preparación de un medicamento para inmunizar de manera pasiva a un perro contra CRCV. 79 - El uso como se reclama en la reivindicación 78, en donde el anticuerpo que reacciona con CRCV es un anticuerpo anti-BCV, un anticuerpo anti-HCV, o un anticuerpo anti-CRCV. 80. - El uso como se reclama en la reivindicación 78 o 79, en donde el anticuerpo que reacciona con CRCV es un anticuerpo de anti-proteína S o un anticuerpo de anti-proteína HE. 81. - El uso como se reclama en las reivindicaciones 78 a 80, en donde el anticuerpo que reacciona con CRCV comprende el anticuerpo anti-CRCV de acuerdo con la reivindicación 20 o 23. 82.- Un método para diagnosticar CIRD, el método comprende determinar si un perro ha sido expuesto a CRCV de acuerdo con el método definido en cualquiera de las reivindicaciones 24 a 36.
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