PT1525313E - Proteína da espícula, polimerase e hemaglutinina/esterase de coronavírus respiratório canino (crcv) - Google Patents

Description

ΕΡ 1 525 313/ΡΤ DESCRIÇÃO "Proteína da espícula, polimerase e hemaglutinina/esterase de coronavírus respiratório canino (CRCV)" 0 presente invento refere-se a material biológico e em particular a um coronavírus respiratório canino que está presente em cães possuindo doença respiratória infecciosa canina. A doença respiratória infecciosa canina (CIRD) é uma doença altamente contagiosa comum em cães alojados em superlotação tais como em centros de realojamento e canis de alojamento ou de treino. Muitos cães sofrem apenas de uma tosse suave e recuperam após um curto período, no entanto, nalguns casos pode-se desenvolver uma grave broncopneumonia (Appel e Binn, 1987) . A patogénese de CIRD é considerada como sendo multifactorial, envolvendo vários vírus e bactérias. Os agentes infecciosos considerados como sendo os principais agentes causadores de CIRD são o vírus parainfluenza canino (CPIV) (Binn et al., 1967), o adenovírus canino de tipo 2 (CAV-2) (Ditchfield et al., 1962) e a bactéria Bordetella bronchiseptica (Bemis et al., 1977, Keil et al., 1998). Também, herpesvírus canino, reovírus humano e espécies de micoplasma foram isolados a partir de cães com sintomas de CIRD (Karpas et al., 1968, Lou e Wenner 1963, Randolph et al., 1993). Factores adicionais como o stress podem também ser importantes. CIRD é raramente fatal mas atrasa o realojamento de cães em centros de recuperação e causa a ruptura dos horários nos canis de treino bem como consideráveis custos de tratamento.

Estão disponíveis vacinas contra alguns dos agentes infecciosos associados a esta doença, nomeadamente Bordetella bronchiseptica bem como CPIV e CAV-2. No entanto, apesar da utilização destas vacinas, a CIRD é ainda prevalente em canis de todos o mundo, o que possivelmente se deve às vacinas não 2 ΕΡ 1 525 313/ΡΤ proporcionarem protecção contra todos os agentes infecciosos envolvidos em CIRD.

Descobrimos um novo coronavirus, que designámos coronavirus respiratório canino (CRCV), numa grande população de cães em canil com uma história de doença respiratória endémica, e mostrámos que este virus está associado a CIRD.

Sabe-se que alguns membros da família coronaviridae causam doença respiratória em humanos, gado, suínos e aves de capoeira (Mákelá et al., 1998, Pensaert et al., 1986, Ignjatovic e Sapats, 2000). Por exemplo, o coronavirus respiratório bovino está associado a febre do transporte em gado que é uma doença respiratória multifactorial (Storz et al., 2000) .

No entanto, os coronavirus não foram suspeitos de ter um papel na patogénese de CIRD. De facto, com apenas uma única excepção, foi relatado que os coronavirus caninos são vírus entéricos e causam diarreia aguda principalmente em cães jovens (por exemplo, Tennant et al., 1993). Num grande estudo de vírus envolvidos em doenças respiratórias caninas, Binn et al. (1979) relataram a detecção de um coronavirus canino no pulmão de um único cão que foi também infectado com SV5 e adenovírus canino 2, dois outros vírus que estão associados a doença respiratória canina.

Existem 30-40 cães vacinados comercialmente disponíveis no Reino Unido para utilizar contra vários patogénios que causam uma variedade de patogénios que podem causar uma variedade de doenças, tais como doenças neurológicas, entéricas, hepáticas e respiratórias. A maioria destas vacinas contém agentes microbianos tais como o vírus da cinomose, Adenovírus Canino-2, Parvovírus canino, vírus parainfluenza canino e Leptospira canicola e L. icterohaemorrhagiae. Nenhuma destas vacinas contém coronavirus caninos.

As vacinas de cães para utilizar contra doenças respiratórias caninas são comercializadas como vacinas para "tosse do canil" (ver abaixo). Todas as vacinas contêm Bordetella bronchisepticum, que é uma bactéria associada a "tosse do canil". 3 ΕΡ 1 525 313/ΡΤ

Coyne, M.J. & May, S.W., (1995) no seu artigo intitulado "Considerations in using a canine coronavirus vaccine" (publicado como um Boletim Técnico da Pfizer na Internet em http://www.pfizer.com/ah/vet/tref/trbull/ccv.html), lista mais de 20 vacinas comercialmente disponíveis contra apenas coronavirus caninos ou contra coronavirus caninos juntamente com outros organismos. Cada uma destas vacinas é para uma doença entérica canina, e não há sugestão de que um coronavirus canino possa estar associado a doença respiratória.

As Patentes U.S. Nos. 6057436 e 6372224, ambas para Miller et al., e atribuídas a Pfizer, inc., descrevem o gene da espícula do coronavirus canino entérico e utilizações para este, incluindo a sua utilização como vacina contra gastroenterite. Nenhuma destas duas patentes sugere que um coronavirus canino possa estar envolvido em CIRD.

Os membros da família coronaviridae são vírus envelopados, 80-160 nm de diâmetro, contendo um genoma de ARN linear de cadeia positiva. As proteínas estruturais dos coronavirus são a glicoproteína da espícula (Spike) (S), a glicoproteína membranar (M) e a proteína da nucleocápside (N). A glicoproteína hemaglutinina/esterase (HE) apenas se verifica à superfície de coronavirus de grupo II (p.ex. coronavirus bovino e vírus de hepatite de murídeo) (Spaan et al, 1988) . Mais detalhes da estrutura dos coronavirus podem ser encontrados no capítulo por Cavanagh et al. intitulado "Coronviridae" pág. 407-411, em "Virus Taxonomy, 6th Report of the International Committee on Taxonomy of Vírus", pub. Springer-Verlag Wein, New York, Eds. Murphy et al, que é aqui incorporado por referência. 0 coronavirus respiratório canino (CRCV) do invento pode ser caracterizado como um coronavirus presente nos tractos respiratórios de cães com doença respiratória infecciosa. Para melhor caracterizar CRCV, determinámos a sequência de 250 resíduos de nucleótidos do ADNc da polimerase (pol) de CRCV (Figura 1) que corresponde a uma sequência parcial de 83 aminoácidos da proteína pol (Figura 2) . Clonámos também e determinámos a sequência dos 4092 resíduos de nucleótidos do 4 ΕΡ 1 525 313/ΡΤ ADNc da espícula (Spike) (S) de CRCV (Figura 3), correspondendo a 1363 aminoácidos (Figura 4) . Determinámos também a sequência de 497 resíduos de nucleótidos do gene de hemaglutinina/esterase (HE) de CRCV (Figura 13), correspondendo a 165 aminoácidos (Figura 14) . Identificámos que CRCV tem uma homologia surpreendentemente baixa com o coronavírus canino entérico (CCV) ao mesmo tempo que tem um nível de homologia inesperadamente elevado com o coronavírus bovino (estirpe LY138 ou Quebec) e coronavírus humano (estirpe OC43).

Uma cultura de "Spike D-l CRCV", que é E. coli XLl-Blue (Stratagene) contendo um plasmídeo pT7Blue2 (Novagen) cuja inserção contém uma porção do ADNc da espícula de CRCV, foi depositada ao abrigo do Tratado de Budapeste em NCIMB Ltd sob o Número de entrada NCIMB 41146 a 25 de Julho de 2002. O depositante de NCIMB 41146 é o Royal Veterinary College, Royal College Street, London NWl OTU, UK. O endereço de NCIMB Ltd é 23 St. Machar Drive, Aberdeen, Scotland, AB24 3RY, UK. A relação filogenética de CRCV com onze coronavírus conhecidos foi determinada com base numa comparação da sequência de 250 nucleótidos do gene pol de CRCV com as regiões correspondentes dos outros vírus (Figura 5) . Verificou-se que o coronavírus bovino (BCV), o coronavírus humano (HCV) estirpe OC43 e o vírus da encefalomielite hemaglutinante (HEV) eram muito próximos de CRCV, ao mesmo tempo que se verificou que o CCV entérico era apenas distantemente aparentado com CRCV.

Ao longo dos 250 resíduos sequenciados do ADNc de pol, correspondendo a 83 aminoácidos, CRCV tem apenas 68,5% e 75,9% de identidade de sequência ao nível dos nucleótidos e aminoácidos, respectivamente, com a região equivalente do gene pol de CCV entérico (estirpe 1-71) (N°. de entrada em Genbank AF124986), tal como mostrado na Figura 6 e 7.

Ao longo dos 4092 resíduos de nucleótidos sequenciados do gene S de CRCV, correspondendo a 1363 aminoácidos, CRCV tem 45% e 21,2% de identidade de sequência ao nível dos nucleótidos (Figura 8) e aminoácidos, respectivamente, com a região equivalente do gene S do CCV entérico (estirpe 1-71) . 5 ΕΡ 1 525 313/ΡΤ Ο CCV entérico não é um coronavírus de grupo II e não possui um gene de HE, por isso não é possível determinar a extensão da identidade de sequência entre este gene em CRCV e em CCV entérico.

Excepto como descrito abaixo, a percentagem de identidade entre duas sequências nucleotídicas ou de aminoácidos foi determinada utilizando FASTA versão 34 (Pearson wr. (1990) "Rapid and sensitive sequence comparison with FASTP and FASTA". Methods Enzymol. 183: 63-98). As definições de FASTA foram Penalidade de intervalo aberto -16 e Penalidade de extensão do intervalo -4. A percentagem de identidade entre as sequências da espícula de CRCV e CCV entérico foi determinada utilizando GCG versão 10 (Genetics Computer Group, (1991), Program Manual for the GCG Package, Versão 7, Abril 1991, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711). Os parâmetros de GCG utilizados foram: Penalidade de criação de intervalo 50, Penalidade de extensão do intervalo 3 para ADN, e Penalidade de criação de intervalo 8 e Penalidade de extensão do intervalo 2 para Proteína. Os alinhamentos das sequências foram efectuados utilizando ClustalX (Thompson et al., 1997).

Em contraste, ao longo dos 250 resíduos sequenciados do ADNc de pol, CRCV tem 98,8% de identidade de sequência com a região equivalente do gene pol da estirpe Quebec de BCV (N°. de Entrada em Genbank AF220295), 98,4% de identidade de sequência com o gene pol da estirpe LY138 de BCV (N°. de Entrada em Genbank AF124985) e 98,4% de identidade de sequência com o gene pol de HCV OC43 (N°. de Entrada em Genbank AF124989).

Houve apenas uma única diferença de aminoácidos entre a proteína pol de CRCV ao longo dos 83 aminoácidos sequenciados e as proteínas pol de BCV, HCV e HEV que é o CRCV ter E (Glu) em oposição a D (Asp) na posição correspondendo à posição 4975 no genoma de BCV (N°. de Entrada em SWALL: Q91A29) . Assim a proteína pol de CRCV é 99% idêntica às proteínas pol de BCV, HCV e HEV ao longo desta região. 6 ΕΡ 1 525 313/ΡΤ São aqui utilizados os códigos de aminoácidos de uma e três letras da Comissão de Nomenclatura Bioquímica IUPAC-IUB.

Ao longo dos 497 resíduos de nucleótidos sequenciados, correspondendo a 165 aminoácidos, do gene de HE, CRCV tem 98,994% e 98,2% de identidade de sequência com a região equivalente do gene de HE da estirpe LY138 de BCV (N°. de Entrada em Genbank AF058942) ao nível dos nucleótidos e aminoácidos, respectivamente. CRCV tem 98,189% (nucleótidos) e 98,2% (aminoácidos) de identidade de sequência com o gene de HE do coronavírus entérico humano (HECV) (N°. de Entrada em Genbank L07747); 97,4% (nucleótidos) e 95,2% (aminoácidos) de identidade de sequência com o gene de HE de HCV OC43 (N°. de Entrada em Genbank M76373); e 92,0% (nucleótidos) e 93,9% (aminoácidos) de identidade com HEV (N°. de Entrada em Genbank AF481863), tal como mostrado nas Figuras 15 e 16.

Tal como mostrado na Figura 16 e na Tabela 3, os três aminoácidos que são diferentes entre a proteína HE de CRCV e cada uma das proteína S de BCV, HECV, HCV e HEV, dentro dos 165 aminoácidos da proteína HE de CRCV, são F (Phe) em oposição a L (Leu), N (Asn) em oposição a T (Thr), e L (Leu) em oposição a V (Vai) nas posições correspondendo às posições 235, 242 e 253, respectivamente, nos genes de HE de BCV, HECV, HCV OC43 e HEV (Figura 16) . Assim pode-se dizer que F na posição 235, N na posição 242 e L na posição 253 são aminoácidos específicos da proteína HE de CRCV.

Ao longo dos 4092 resíduos de nucleótidos sequenciados, correspondendo a 1363 aminoácidos, do gene S de CRCV, CRCV tem 97,3% e 96% de identidade com a região equivalente da estirpe LY138 de BCV (N°. de Entrada em Genbank AF058942) ao nível dos nucleótidos e aminoácidos, respectivamente. CRCV tem 96,9% (nucleótidos) e 95,2% (aminoácidos) de identidade com a estirpe OC43 de HCV (N°. de Entrada em Genbank Z32768), e 83,8% (nucleótidos) e 80,4% (aminoácidos) de identidade com HEV (Nos. de Entrada em Genbank AF481863 (ADNc) e aam 77000 (proteína)) tal como mostrado nas Figuras 9 e 10.

Os aminoácidos que são diferentes entre a proteína S de CRCV e cada uma das proteínas S de BCV, HCV e HEV, dentro dos 1363 aminoácidos da proteína S de CRCV, são listados na Tabela 7 ΕΡ 1 525 313/ΡΤ 1 abaixo. Assim pode-se dizer que os aminoácidos listados na Tabela 1 são aminoácidos específicos da proteína S de CRCV. Os aminoácidos são numerados desde o resíduo M inicial no início da proteína de CRCV, tal como mostrado na Figura 4.

Tabela 1: Lista de 39 aminoácidos específicos para a proteína S de CRCV que não estão presentes nas proteínas S de BCV, HCV e HEV.

Posição Aminoácido 103 V 118 V 166 D 171 M 179 K 192 P 210 S 235 H 267 F 388 F 407 M 436 S 440 I 447 I 501 F 525 Y 528 N 540 L 582 K 608 G

Posição Aminoácido 692 G 695 S 757 W 758 G 763 Q 769 T 786 P 792 H 818 R 827 P 828 V 887 F 933 D 977 F 1011 T 1018 S 1063 K 1256 L 1257 M

SOMÁRIO DO INVENTO 0 invento proporciona uma composição de vacina para vacinar cães. A composição compreende um coronavírus respiratório canino (CRCV) que compreende uma proteína da Espícula (Spike) (S) possuindo a sequência de aminoácidos listada na Figura 4, ou uma proteína S coronaviral possuindo pelo menos 97% de identidade de aminoácidos com a sequência de aminoácidos da Fig. 4, ou um fragmento imunogénico da Fig. 4 com pelo menos 200 aminoácidos de comprimento, ou um ácido 8 ΕΡ 1 525 313/ΡΤ nucleico codificando a referida proteína S coronaviral ou o referido fragmento imunogénico da Fig. 4. A proteína S coronaviral na composição de vacina pode ter pelo menos 98% de identidade ou pelo menos 99% de identidade com a sequência de aminoácidos da Fig. 4. A proteína S coronaviral na composição de vacina pode ser uma proteína isolada ou recombinante. A composição de vacina pode também compreender um adjuvante farmaceuticamente aceitável. A composição de vacina pode ainda compreender qualquer um ou mais de um agente capaz de aumentar uma resposta imunitária num cão contra vírus parainfluenza canino, um agente capaz de aumentar uma resposta imunitária num cão contra adenovírus canino de tipo 2, um agente capaz de aumentar uma resposta imunitária num cão contra herpesvírus canino, e um agente capaz de aumentar uma resposta imunitária num cão contra Bordetella bronchiseptica. 0 invento proporciona também uma proteína S de coronavírus possuindo pelo menos 97% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência listada na Figura 4 para utilizar em medicina. A proteína S de coronavírus pode ser uma proteína isolada ou recombinante. 0 invento proporciona ainda a utilização de um coronavírus possuindo uma proteína S com pelo menos 90% de identidade de aminoácidos com a sequência de aminoácidos da Fig. 4 ou uma proteína S coronaviral possuindo pelo menos 90% de identidade de aminoácidos com a sequência de aminoácidos da Fig. 4, ou um fragmento imunogénico desta, ou um ácido nucleico codificando a referida proteína S coronaviral ou fragmento imunogénico desta, na preparação de um medicamento para estimular uma resposta imunitária contra coronavírus respiratório canino num cão ou na preparação de um medicamento para profilaxia de doença respiratória num cão. O coronavírus pode compreender uma proteína S possuindo pelo menos 95% de identidade de aminoácidos com a sequência de aminoácidos da Fig. 4 ou pode compreender uma proteína S possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:4. A proteína S coronaviral pode ter pelo menos 95% ou pelo menos 97% de identidade de aminoácidos com a sequência de aminoácidos da Fig. 4. A proteína S coronaviral pode compreender pelo menos 9 ΕΡ 1 525 313/ΡΤ um dos aminoácidos específicos para a proteína S de CRCV nas posições listadas na Tabela 1. A proteína S coronaviral pode compreender a sequência de aminoácidos da Fig. 4. A proteína S coronaviral na composição de vacina pode ser uma proteína isolada ou recombinante. 0 invento proporciona uma composição de vacina para vacinar cães compreendendo um coronavírus respiratório canino possuindo uma proteína S com a sequência de aminoácidos da Figura 4, ou uma proteína S de coronavírus possuindo pelo menos 9 7% de identidade de aminoácidos com a proteína S de CRCV, ou um fragmento imunogénico de Fig. 4 com pelo menos 200 aminoácidos de comprimento, ou um ácido nucleico codificando a referida proteína coronaviral ou o referido fragmento imunogénico da Fig. 4.

De preferência, a vacina é empacotada e apresentada para utilização em cães.

Modificações proteicas típicas incluem substituições de aminoácidos para melhorar a antigenicidade da vacina. As proteínas de BCV, HCV e HEV podem ser modificadas para serem mais semelhantes à proteína de CRCV. Por exemplo, a proteína da espícula de BCV, HCV ou HEV pode ser modificada para incluir um aminoácido de CRCV em qualquer uma das diferenças mostradas na comparação na Figura 10, ou listadas na Tabela 1.

Proteínas nas quais um ou mais dos resíduos de aminoácidos são quimicamente modificados, podem ser utilizadas desde que a função da proteína, nomeadamente a produção de anticorpos específicos in vivo, permaneça substancialmente inalterada. Aprecia-se que as proteínas sintetizadas possam ser adequadamente modificadas antes ou após serem sintetizadas. Tais modificações incluem a formação de sais com ácidos ou bases, especialmente ácidos e bases orgânicos ou inorgânicos fisiologicamente aceitáveis, a formação de um éster ou amida de um grupo carboxilo terminal, e a ligação de grupos protectores de aminoácidos tais como N-t- butoxicarbonilo. Tais modificações podem proteger o péptido do metabolismo in vivo. 10 ΕΡ 1 525 313/ΡΤ A proteína pode estar presente como cópias únicas ou múltiplas, por exemplo repetições em cadeia. Tais repetições em cadeia ou múltiplas podem ser suficientemente antigénicas por si próprias para evitar a utilização de um transportador. Pode ser vantajoso que a proteína seja formada como uma volta, com as extremidades N-terminal e C-terminal unidas uma à outra, ou adicionar um ou mais resíduos Cys a uma extremidade para aumentar a antigenicidade e/ou permitir que se formem ligações dissulfureto. Se a proteína estiver covalentemente ligada a um transportador, de preferência um polipéptido, então o arranjo é de preferência de modo a que a proteína do invento forme uma volta.

De acordo com as actuais teorias imunológicas, uma função transportadora deverá estar presente em qualquer formulação imunogénica para estimular ou aumentar a estimulação do sistema imunitário. Pensa-se que os melhores transportadores incorporam (ou, junto com o antigénio, criam) um epitopo de células T. Os péptidos podem estar associados, por exemplo através de ligação cruzada, a um transportador separado, tal como albuminas do soro, mioglobinas, toxóides bacterianos e hemocianina da lapa. Transportadores mais recentemente desenvolvidos que induzem ajuda a células T na resposta imunitária incluem o antigénio central da hepatite B (também designado a proteína da nucleocápside), presumidos epitopos de células T tais como Thr-Ala-Ser-Gly-Val-Ala-Glu-Thr-Thr-Asn-Cys, beta-galactosidase e o péptido 163-171 da interleucina-1. 0 último composto pode ser variadamente considerado como transportador ou adjuvante ou ambos. Alternativamente, várias cópias da mesma proteína ou de proteínas diferentes do invento podem ser ligadas de forma cruzada umas às outras; nesta situação não existe um transportador separado como tal, mas pode ser proporcionada uma função transportadora através de tal ligação cruzada. Agentes de ligação cruzada adequados incluem os listados como tal nos catálogos de Sigma e Pierce, por exemplo glutaraldeído, carbodiimida e succinimidil-4-(N-maleimidometil)-ciclo-hexano-l-carboxilato, o último agente explorando o grupo -SH no resíduo de cisteína C-terminal (se presente).

Se a proteína for preparada através de expressão de uma sequência nucleotídica adequada num hospedeiro adequado, então 11 ΕΡ 1 525 313/ΡΤ pode ser vantajoso expressá-la como um produto de fusão com uma sequência peptídica que actua como transportador. 0 sistema "Ecosec" de Kabigen é um exemplo de um tal arranjo.

Aprecia-se que o componente coronavírus da vacina possa estar ligado a outros antigénios para proporcionar um efeito duplo. A proteína S de coronavírus na composição de vacina é uma proteína S de CRCV ou semelhante à de CRCV tal como aqui definido, ou um fragmento imunogénico da sequência listada na Figura 4, com pelo menos 200 aminoácidos de comprimento. A composição de vacina contém uma proteína S de CRCV que compreende ou consiste na sequência de aminoácidos listada na Figura 4, ou uma variante imunogénica desta possuindo pelo menos 97% de identidade com a sequência listada na Figura 4. De preferência, a variante tem pelo menos pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência listada na Figura 4. De maior preferência, a variante tem pelo menos 99,1 %, ou pelo menos 99,2%, ou pelo menos 99,3%, ou pelo menos 99,4%, ou pelo menos 99,5%, ou pelo menos 99,6%, ou pelo menos 99,7%, ou pelo menos 99,8%, ou pelo menos 99,9% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência listada na Figura 4.

Noutra concretização preferida, a composição de vacina compreende um CRCV.

Numa concretização preferida, o vírus é um vírus inactivado. Os métodos para inactivação de vírus para utilizar em vacinas são bem conhecidos na arte. Métodos adequados incluem métodos químicos, tais como a utilização de proprio-lactona beta (BPL). Vacinas de coronavírus bovino inactivado adequadas podem incluir BCV inactivado que é um componente de vacinas bovinas tais como "Rotovec Corona" de Schering-Plough (http://www.ukvet.co.uk/rotovec/scour.htm); "Lactovac" de Hoechst Roussel Vet. Ltd., (Veterinary Formulary 5a Edição de Veterinary Data Sheet Compendium); "First Defense" de

Immuncell Corp, USA; "Scour Bos 4" de Grand Laboraotries e "Scour Guard 3K" de Pfizer. 12 ΕΡ 1 525 313/ΡΤ

Numa concretização alternativa, o virus é um virus atenuado. Os métodos para atenuação de virus para utilizar em vacinas são bem conhecidos na arte.

De preferência, a composição de vacina compreende também um adjuvante farmaceuticamente aceitável.

De preferência, quando a vacina compreende um ácido nucleico, o ácido nucleico codificando a proteína coronaviral ou o referido fragmento imunogénico para utilizar como vacina é um polinucleótido S de CRCV ou semelhante ao de CRCV. De maior preferência, o ácido nucleico compreende ou consiste na sequência nucleotídica listada na Figura 3 ou Figura 13, ou fragmentos destes.

Para utilização como vacina, o ácido nucleico de S de CRCV ou semelhante ao de CRCV pode ser distribuído por vários vectores replicantes (p.ex., vacina de adenovírus recombinante) ou não replicantes (vacina de ADN).

Numa concretização preferida, a vacina pode conter proteína S recombinante de CRCV ou semelhante à de CRCV, bem como outras proteínas de coronavírus imunogénicas tais como a proteína HE.

Tal como discutido acima, sabe-se que vários agentes virais e bacterianos estão associados a doença respiratória em cães, incluindo vírus parainfluenza canino (CPIV), adenovírus de tipo 2 canino (CAV-2), herpesvírus canino (CHV), e

Bordetella bronchiseptica (B. bronchiseptica) .

Noutra concretização preferida, a vacina pode conter proteína S de CRCV ou semelhante à de CRCV recombinante, bem como outros organismos patogénicos envolvidos em doença respiratória de cães tais como vírus parainfluenza canino, adenovírus de tipo 2 canino, a bactéria Bordetella bronchiseptica, herpesvírus canino, reovírus humano e espécies de micoplasma, ou proteínas imunogénicas destes. Assim a vacina pode conter um agente capaz de aumentar uma resposta imunitária, tal como a produção de anticorpos contra CRCV, bem como contra outros organismos patogénicos envolvidos em doença 13 ΕΡ 1 525 313/ΡΤ respiratória de cães tais como CPIV, CAV-2, B bronchiseptica e CHV.

Numa concretização, para além de conter um agente capaz de estimular a produção de anticorpos contra a proteína S de CRCV, a composição de vacina compreende ainda qualquer um ou mais de: (a) um agente capaz de aumentar uma resposta imunitária num cão contra CPIV; (b) um agente capaz de aumentar uma resposta imunitária num cão contra CAV-2; (c) um agente capaz de aumentar uma resposta imunitária num cão contra CHV; e (d) um agente capaz de aumentar uma resposta imunitária num cão contra B. bronchiseptica.

Assim, a composição de vacina pode compreender também opcionalmente quaisquer dois ou quaisquer três ou todos os quatro destes agentes adicionais (a), (b), (c) e (d).

Tipicamente, um agente capaz de aumentar uma resposta imunitária num cão contra CPIV compreende CPIV inactivado ou atenuado, ou um fragmento imunogénico deste, ou um ácido nucleico codificando o referido fragmento imunogénico.

Tipicamente, um agente capaz de aumentar uma resposta imunitária num cão contra CAV-2 compreende CAV-2 inactivado ou atenuado, ou um fragmento imunogénico deste, ou um ácido nucleico codificando o referido fragmento imunogénico. 0 adenovírus de tipo 1 canino causa hepatite infecciosa; o adenovírus de tipo 2 canino causa doença respiratória. Foi mostrado que CAV-1 proporciona protecção cruzada contra CAV-2 e vice-versa. 0 agente que aumenta uma resposta imunitária num cão contra CAV-2 pode portanto conter CAV-1 ou CAV-2, ou um fragmento imunogénico deste. As vacinas listadas abaixo contêm CAV-2 excepto EURICAN DHPPi, que não especifica o tipo de vírus utilizado.

Agentes adequados que aumentam uma resposta imunitária num cão contra CPIV e CAV-2 são conhecidos de um perito na 14 ΕΡ 1 525 313/ΡΤ arte. Por exemplo, as seguintes vacinas de cães estão licenciadas no Reino Unido. KAVAK DA2PiP69 de Fort Dodge Animal Health é uma vacina viva liofilizada contendo estirpes atenuadas do virus de cinomose canina, adenovirus canino de tipo 2, parainfluenza canino de tipo 2 e parvovirus canino criado em cultura de tecidos. KAVAK Parainfluenza de Fort Dodge Animal Health contém vacina viva liofilizada derivada de uma estirpe atenuada de virus parainf luenza canino de tipo 2 cultivada numa linha celular homóloga estabelecida. NOBIVAC DHPPi de Intervet UK Limited é uma vacina de virus vivo atenuado liofilizada, contendo virus de cinomose canina, adenovirus canino de tipo 2, parvovirus canino e virus parainfluenza canino criado em cultura de tecidos de uma linha celular. NOBIVAC KC de Intervet UK Limited é uma vacina viva modificada liofilizada contendo a estirpe B-C2 de Bordetella bronchiseptica e a estirpe Cornell do virus parainfluenza canino (esta é uma vacina intranasal). Número de autorização da administração Vm 06376/4026. EURICAN DHPPi de Merial Animal Health Ltd. é uma vacina viva combinada liofilizada contra cinomose canina, hepatite infecciosa canina, parvovirus canino e virus parainfluenza canino de tipo 2. VANGUARD 7 de Pfizer Ltd. contém vírus vivo atenuado de cinomose canina (estirpe Snyder Hill), adenovirus (estirpe Manhattan de CAV-2), virus parainfluenza (estirpe NL-CPI-5), parvovirus canino (NL-35-D) propagado numa linha celular estabelecida, e uma cultura inactivada de Leptospira canicola e Leptospire icterohaemorrhagiae. QUANTUM DOG 7 de Schering-Plough Animal Health contém vacina (viva) de cinomse canina, adenovirus de tipo 2, parvovirus, virus parainfluenza de tipo 2 e vacina inactivada de Leptospira canicola e Leptospira icterohaemorrhagiae. 15 ΕΡ 1 525 313/ΡΤ CANIGEN DHPPi de Virbac Ltd. é uma vacina de vírus vivo atenuado, liofilizada, contendo vírus de cinomose canina, adenovírus canino (CAV2), parvovírus canino e vírus parainfluenza canino criados em cultura de tecidos de uma linha celular. CANIGEN Ppi de Virbac Ltd. é uma vacina de vírus vivo atenuado, liofilizada contendo parvovírus canino e vírus parainfluenza canino criado em cultura de tecidos numa linha celular. Tipicamente, um agente capaz de aumentar uma resposta imunitária num cão contra CHV compreende CHV inactivado ou atenuado, ou um fragmento imunogénico deste, ou um ácido nucleico codificando o referido fragmento imunogénico.

Agentes adequados que aumentam uma resposta imunitária num cão contra CHV são conhecidos de um perito na arte. Por exemplo, EURICAN Herpes 205 de Merial é uma vacina de subunidade purificada contra herpesvírus canino que está indicada para a imunização activa de cadelas grávidas para prevenir a mortalidade, os sinais clínicos e as lesões em cachorros resultantes de infecções por herpesvírus canino adquiridas nos primeiros dias de vida. Não está licenciada para a vacinação de cães adultos para a prevenção de doença respiratória.

Tipicamente, um agente capaz de aumentar uma resposta imunitária num cão contra B. bronchiseptica compreende B. bronchiseptica inactivada ou atenuada, ou um fragmento imunogénico desta, ou um ácido nucleico codificando o referido fragmento imunogénico.

Agentes adequados que aumentam uma resposta imunitária num cão contra B. bronchiseptica são conhecidos de um perito na arte. Por exemplo, as seguintes vacinas de cães estão licenciadas para utilização. COUG14GUARD-B® de Pfizer Animal Health (Lic. Vet. U.S. N°. : 189) contém uma cultura inactivada de B. bronchiseptica. É para a imunização de cães saudáveis contra doença causada por B. bronchiseptica, em particular tosse do canil. COUGHGUARD-B® é preparada a partir de uma estirpe altamente 16 ΕΡ 1 525 313/ΡΤ antigénica de Β. bronchiseptica que foi inactivada e processada para ser não tóxica quando administrada a cães. Está relatado que o método de produção deixa intactas as propriedades imunogénicas de B. bronchiseptica. VANGUARD® 5/B de Pfizer Animal Health (Lie. Vet. U.S. N°. : 189) contém estirpes atenuadas de virus de cinomose canina (CDV), CAV-2, CPIV, e parvovírus canino (CPV) propagadas numa linha celular canina estabelecida. 0 antigénio de CPV foi atenuado através de poucas passagens na linha celular canina e a esse nível de passagens tem propriedades imunogénicas capazes de neutralizar os anticorpos maternos. A vacina é empacotada na forma liofilizada com gás inerte em vez de vácuo. 0 componente bacterina contendo culturas inteiras inactivadas de B. bronchiseptica que é fornecido como diluente. 0 componente B. bronchiseptica em VANGUARDS® 5/B é preparado a partir de uma estirpe altamente antigénica que foi inactivada e processada para ser não tóxica quando administrada a cães.

TM NASAGUARD-B de Pfizer Animal Health (Lic. Vet. U.S. N°. : 112) é composta de uma cultura viva avirulenta de bactérias B. bronchiseptica. PROGARD®-KC de Intervet é uma vacina viva modificada intranasal contendo vírus parainfluenza canino atenuado e cultura viva avirulenta de Bordetella bronchiseptica. PROGARD®-KC é apresentada numa forma dissecada com diluente estéril proporcionado para reconstituição. PROGARD®-KC é para vacinação de cachorros e cães saudáveis, susceptíveis para prevenção de traqueobronquite infecciosa canina ("tosse do canil") devida a vírus parainfluenza canino e B. bronchiseptica. PROGARD®-KC PLUS de Intervet contém cultura viva de estirpes avirulentas de B. bronchiseptica, adenovírus canino atenuado de tipo 2 e vírus parainfluenza para administração intranasal. A vacinaçao com PROGARD -KC Plus estimula uma imunidade local rápida no tracto respiratório, inibindo deste modo a infecção na porta de entrada bem como prevenindo os sinais clínicos. Além da imunidade local, estimula também a imunidade sistémica dentro de três semanas de administração 17 ΕΡ 1 525 313/ΡΤ intranasal. Ο pequeno volume (0,4 ml) e uma aplicação na narina de PROGARD®-KC Plus proporcionam uma fácil vacinação, particularmente em raças pequenas e cachorros jovens. PROGARD®-KC Plus é apresentada numa forma dissecada com diluente estéril proporcionado para reconstituição. PROGARD®-KC PLUS é para vacinação de cães saudáveis e cachorros com três semanas de idade ou mais velhos para prevenção de traqueobronquite infecciosa canina ("tosse do canil") devida a adenovirus canino de tipo 2, vírus parainfluenza e B. bronchiseptica.

Intrac de Intervet é uma vacina viva modificada liofilizada, contendo a estirpe S 55 de B. bronchiseptica para administração intranasal. Número de licença do produto pl 0201/4011.

Nobivac KC, descrita acima, contém também B. bronchiseptica. A vacinação seria útil especialmente, mas não exclusivamente, para cães antes da entrada num canil de alojamento ou para a vacinação de cães em instalações de criação.

Uma dose típica de uma vacina constituída por proteína recombinante é de cerca de 5-10 pg. Uma dose típica de uma vacina constituída por vírus inactivado é de cerca de 1-10 mg. O invento proporciona a utilização de (i) um coronavírus possuindo uma proteína S com pelo menos 90% de identidade de aminoácidos com a proteína S de CRCV, ou uma proteína S de coronavírus possuindo pelo menos 90% de identidade de aminoácidos com a proteína S de CRCV ou um fragmento imunogénico desta, ou um ácido nucleico codificando a referida proteína S coronaviral ou um fragmento imunogénico desta, na preparação de um medicamento para estimulação de uma resposta imunitária contra CRCV num cão. O invento inclui a utilização de (i) um coronavírus possuindo uma proteína S com pelo menos 90% de identidade de aminoácidos com a proteína S de CRCV, ou uma proteína S de coronavírus possuindo pelo menos 90% de identidade de 18 ΕΡ 1 525 313/ΡΤ aminoácidos com a proteína S de CRCV ou um fragmento imunogénico desta, ou um ácido nucleico codificando a referida proteína coronaviral ou um fragmento imunogénico desta, na preparação de um medicamento para profilaxia de doença respiratória num cão, tipicamente CIRD.

Quando uma proteína de coronavírus, ou um fragmento imunogénico desta, é utilizada na preparação do medicamento, a proteína tem de preferência pelo menos 90%, ou pelo menos 95% de identidade de aminoácidos com a porção correspondente da proteína S de CRCV.

De preferência, a proteína coronaviral utilizada na preparação do medicamento é uma proteína de CRCV, ou uma modificação desta, tal como aqui descrito. A proteína coronaviral utilizada na preparação do medicamento compreende uma proteína S de CRCV ou semelhante à de CRCV tal como aqui definido ou um fragmento imunogénico desta.

De maior preferência, a proteína coronaviral utilizada na preparação do medicamento compreende ou consiste na sequência de aminoácidos listada na Figura 4, ou numa variante imunogénica desta possuindo pelo menos 97% de identidade com a sequência listada na Figura 4. De preferência, a variante tem pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de identidade da sequência de aminoácidos com a sequência listada na Figura 4. De maior preferência a variante tem pelo menos 99,1%, ou pelo menos 99,2%, ou pelo menos 99,3%, ou pelo menos 99,4%, ou pelo menos 99,5%, ou pelo menos 99,6%, ou pelo menos 99,7%, ou pelo menos 99,8%, ou pelo menos 99,9% de identidade da sequência de aminoácidos com a sequência listada na Figura 4.

Quando é utilizado um coronavírus na preparação do medicamento, o coronavírus compreende uma proteína S com pelo menos 90%, ou pelo menos 95% de identidade de aminoácidos com a proteína S de CRCV.

Adicionalmente o coronavírus pode compreender uma proteína HE com pelo menos 90%, ou pelo menos 95% de identidade de aminoácidos com a proteína HE de BCV. De 19 ΕΡ 1 525 313/ΡΤ preferência ο coronavírus compreende uma proteína HE com pelo menos 96%, ou pelo menos 97%, ou pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de identidade de aminoácidos com a proteína HE de CRCV. 0 invento proporciona também uma proteína S de CRCV ou semelhante à de CRCV possuindo pelo menos 97% de identidade de sequência com a sequência listada na Figura 4 para utilizar em medicina. Tipicamente, a proteína S será utilizada em medicina veterinária.

Tipicamente, a vacina será adequada para administração através das vias intramuscular, subcutânea ou intranasal. A proteína S de coronavírus, ou fragmento desta, no medicamento pode ter pelo menos 90% de identidade da sequência de aminoácidos com a proteína S de CRCV cuja sequência de aminoácidos está listada na Figura 4, e possuindo pelo menos um de V na posição 103; V na posição 118; D na posição 166; M na posição 171; K na posição 179; P na posição 192; S na posição 210; H na posição 235; F na posição 267; F na posição 388; M na posição 407; S na posição 436; I na posição 440; I na posição 447; F na posição 501; Y na posição 525; N na posição 528; L na posição 540; K na posição 582; G na posição 608; G na posição 692; S na posição 695; W na posição 757; G na posição 758; Q na posição 763; T na posição 769; P na posição 786; H na posição 792; R na posição 818; P na posição 827; V na posição 828; F na posição 887; D na posição 933; F na posição 977; T na posição 1011; S na posição 1018; K na posição 1063; L na posição 1256; e M na posição 1257. Os aminoácidos são numerados a partir do M inicial no início da proteína S de CRCV, tal como listado na Figura 4.

Aprecia-se que a sequência nucleotídica parcial de S de CRCV pode ser facilmente determinada por um vulgar perito na arte através de sequenciação da inserção do plasmídeo contido na estirpe D-l CRCV de E. coli, que foi depositada ao abrigo do Tratado de Budapeste em ncimb Ltd. com o Número de entrada NCIMB 41146 a 25 de Julho de 2002. Além disso, este ADN pode ser utilizado como uma sonda de hibridação ou como a base para o desenho de sondas, no isolamento de ácido nucleico de CRCV em caes. 20 ΕΡ 1 525 313/ΡΤ

Para evitar dúvidas, o medicamento pode incluir uma proteína S de coronavírus, ou um fragmento desta, possuindo pelo menos 90% de identidade da sequência de aminoácidos com a proteína S de CRCV da Fig. 4, e compreendendo pelo menos um dos aminoácidos específicos para a proteína S de CRCV na posição listada na Tabela 1.

Por "proteína" incluímos também o significado glicoproteína. A sequência de aminoácidos de uma glicoproteína refere-se à sequência de aminoácidos da estrutura polipeptídica da glicoproteína, independentemente do tipo, número, sequência e posição dos açúcares ligados a ela.

Tipicamente, o invento inclui uma proteína isolada ou recombinante, e não uma proteína de CRCV não modificada presente como componente de CRCV. O medicamento pode incluir uma proteína S de coronavírus, ou um fragmento desta, possuindo pelo menos 91% de identidade da sequência de aminoácidos com a proteína S de CRCV da Fig. 4, pelo menos 92%, ou pelo menos 93%, ou pelo menos 94%, ou pelo menos 95%, ou pelo menos 96%, ou pelo menos 97%, ou pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de identidade da sequência de aminoácidos com a proteína S de CRCV, e compreendendo pelo menos um dos aminoácidos específicos para a proteína S de CRCV na posição listada na Tabela 1. O medicamento pode também incluir uma proteína S de coronavírus, ou um fragmento desta, possuindo pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade da sequência de aminoácidos com a proteína S de CRCV da Fig. 4, e compreendendo pelo menos 2, ou pelo menos 3, ou pelo menos 4, ou pelo menos 5, ou pelo menos 6, ou pelo menos 7, ou pelo menos 8, ou pelo menos 9, ou pelo menos 10, ou pelo menos 11, ou pelo menos 12, ou pelo menos 13, ou pelo menos \—1 ou pelo menos 15, ou pelo menos 16, ou pelo menos 17, ou pelo menos 18, ou pelo menos 19, ou pelo menos 20, ou pelo menos 21, ou pelo menos 22, ou pelo menos 23, ou pelo menos 24, ou pelo menos 25, ou pelo menos 26, ou pelo menos 27, ou pelo menos 28, ou pelo menos 29, ou pelo menos 30, ou pelo menos 31, ou pelo menos 32, ou pelo menos 33, ou pelo menos 34, ou pelo menos 35, ou pelo menos 36, ou pelo 21 ΕΡ 1 525 313/ΡΤ menos 37, ou pelo menos 38 dos aminoácidos específicos para a proteína S de CRCV nas posições listadas na Tabela 1.

De preferência, a proteína S de coronavírus, ou fragmento desta, compreende todos os 39 resíduos de aminoácidos específicos para a proteína S de CRCV nas posições listadas na Tabela 1. 0 medicamento pode incluir uma proteína S de BCV, HCV ou HEV, ou fragmento desta, que tenha sido modificado pelo menos numa posição listada na Tabela 1 para se assemelhar à proteína S de CRCV.

De preferência, a proteína S de coronavírus utilizada no invento é uma proteína S de CRCV que compreende ou consiste na sequência listada na Figura 4, ou uma variante desta com pelo menos 97% de identidade com a sequência listada na Figura 4. De preferência, a variante tem pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de identidade da sequência de aminoácidos com a sequência listada na Figura 4. De maior preferência a variante tem pelo menos 99,1%, ou pelo menos 99,2%, ou pelo menos 99,3%, ou pelo menos 99,4%, ou pelo menos 99,5%, ou pelo menos 99,6%, ou pelo menos 99,7%, ou pelo menos 99, 8%, ou pelo menos 99,9 % de identidade da sequência de aminoácidos com a sequência listada na Figura 4.

Assim a variante da proteína S de coronavírus utilizada no invento inclui uma proteína que compreende ou consiste na sequência listada na Figura 4 mas tem entre 1 e 40 diferenças de aminoácidos da sequência listada na Figura 4. De preferência, a variante tem menos de 40 diferenças de aminoácidos da sequência listada na Figura 4. De maior preferência a variante tem menos de 35, menos de 30, ou menos de 25, ou menos de 20, ou menos de 15, ou 10 ou 9 ou 8 ou 7 ou 6 ou 5 ou 4 ou 3 ou 2 diferenças de aminoácidos, ou uma única diferença de aminoácidos da sequência listada na Figura 4. O fragmento da proteína S de CRCV pode compreender um fragmento da sequência listada na Figura 4 que compreende pelo menos um dos aminoácidos específicos para a proteína S de CRCV na posição listada na Tabela 1. 22 ΕΡ 1 525 313/ΡΤ

As proteínas S de coronavírus tal como definido acima podem ser aqui designadas proteínas de "CRCV" ou "semelhantes às de CRCV".

Uma "proteína S de CRCV" é uma proteína S ou um fragmento desta que tem a sequência de aminoácidos de S de CRCV nativa tal como listada na Figura 4, ou um fragmento desta que compreende pelo menos um dos aminoácidos específicos para uma proteína S de CRCV nas posições listadas na Tabela 1.

Uma "proteína S semelhante à de CRCV" é uma proteína S ou um fragmento desta que não possui uma sequência de aminoácidos idêntica à sequência de aminoácidos de S de CRCV nativa (Figura 4), mas tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a região correspondente da proteína S de CRCV, e de preferência tem pelo menos um dos aminoácidos específicos para uma proteína S de CRCV nas posições listadas na Tabela 1.

Uma "proteína S semelhante à de CRCV" inclui também uma proteína S que não tem uma sequência de aminoácidos idêntica à sequência de aminoácidos de S de CRCV nativa (Figura 4), mas que compreende ou consiste numa variante da sequência listada na Figura 4 com pelo menos 97% de identidade com a sequência listada na Figura 4. De preferência, a variante tem pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de identidade da sequência de aminoácidos com a sequência listada na Figura 4. De maior preferência a variante tem pelo menos 99,1%, ou pelo menos 99,2%, ou pelo menos 99,3%, ou pelo menos 99,4%, ou pelo menos 99,5%, ou pelo menos 99,6%, ou pelo menos 99,7%, ou pelo menos 99,8%, ou pelo menos 99,9% de identidade da sequência de aminoácidos com a sequência listada na Figura 4.

De preferência, a proteína de CRCV ou semelhante à de CRCV, ou um fragmento desta, tem pelo menos 200, ou pelo menos 300, ou pelo menos 400, ou pelo menos 500, ou pelo menos 600, ou pelo menos 700, ou pelo menos 800, ou pelo menos 900, ou pelo menos 1000, ou pelo menos 1100, ou pelo menos 1200 aminoácidos de comprimento.

De preferência, a proteína de CRCV ou semelhante à de CRCV, ou um fragmento desta, tem menos de cerca de 1300 aminoácidos de comprimento. De maior preferência, a proteína 23 ΕΡ 1 525 313/ΡΤ de CRCV ou semelhante à de CRCV, ou um fragmento desta, tem menos de cerca de 1200, ou menos de cerca de 1100, ou menos de cerca de 1000, ou menos de cerca de 900, ou menos de cerca de 800, ou menos de cerca de 700, ou menos de cerca de 600, ou menos de cerca de 500, ou menos de cerca de 400, ou menos de cerca de 300, aminoácidos de comprimento.

As proteínas de CRCV podem ser isoladas a partir de CRCV, ou podem ser produzidas utilizando técnicas de química proteica, por exemplo utilizando proteólise parcial de proteínas isoladas (exoliticamente ou endoliticamente), ou através da síntese de novo. Alternativamente, as proteínas de CRCV, bem como semelhantes às de CRCV, podem ser produzidas através de tecnologia de adn recombinante. As técnicas adequadas para clonagem, manipulação, modificação e expressão de ácidos nucleicos, e purificação de proteínas expressas, são bem conhecidas na arte e estão descritas por exemplo em Sambrook et al., (2001) "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", 3a edição, Sambrook et al.r (eds), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA.

Fragmentos mais curtos de proteínas de CRCV e semelhantes às de CRCV, i.e., péptidos, podem ser sintetizados utilizando técnicas padrão. Os péptidos podem ser sintetizados através do modo de Fmoc-poliamida de síntese peptídica de fase sólida tal como divulgado por Lu et al., (1981) J. Org. Chem. 46: 3433 e referências aí. A protecção temporária do grupo N-amino é conferida pelo grupo 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc). A clivagem repetitiva deste grupo protector altamente instável em bases é efectuada utilizando piperidina a 20% em N,N-dimetilformamida. As funcionalidades da cadeia lateral podem ser protegidas tais como os seus éteres butilicos (no caso de serina, treonina e tirosina), ésteres butilicos (no caso de ácido glutâmico e ácido aspártico), derivado butiloxicarbonilo (no caso de lisina e histidina), derivado tritilo (no caso de cisteína) e derivado 4-metoxi-2,3,6- trimetilbenzenossulfonilo (no caso de arginina).

Quando a glutamina ou asparagina são resíduos C-terminais, é utilizado o grupo 4,4'-dimetoxibenzidrilo para protecção das funcionalidades amido da cadeia lateral. O suporte da fase sólida baseia-se num polímero polidimetil- 24 ΕΡ 1 525 313/ΡΤ acrilamida constituído a partir dos três monómeros dimetilacrilamida (monómero estrutural), bisacriloiletileno-diamina (agente de reticulação) e éster metílico de acriloilsarcosina (agente funcionalizador). 0 agente ligado clivável péptido-para-resina utilizado é o derivado ácido 4-hidroximetil-fenoxiacético instável em ácido. Todos os derivados de aminoácidos são adicionados como os seus derivados anidrido simétricos pré-formados com excepção da asparagina e glutamina, que são adicionados utilizando um procedimento inverso de conjugação mediado por N,N-diciclo-hexil-carbodiimida/l-hidroxibenzotriazole. Todas as reacções de conjugação e desprotecção são monitorizadas utilizando ninidrina, ácido trinitrobenzeno-sulfónico ou procedimentos de teste de isotina. Após conclusão da síntese, os péptidos são clivados do suporte de resina com a concomitante remoção dos grupos protectores da cadeia lateral através de tratamento com ácido trifluoroacético a 95% contendo uma mistura de limpadores a 50%. Os limpadores vulgarmente utilizados são etanoditiol, fenol, anisole e água, dependendo a escolha exacta dos aminoácidos constituintes do péptido a sintetizar. O ácido trifluoroacético é removido através de evaporação em vácuo, com subsequente trituração com éter dietílico dando o péptido bruto. Quaisquer limpadores presentes são removidos através de um simples procedimento de extracção que em liofilização da fase aquosa dá o péptido bruto sem limpadores. Os reagentes para a síntese peptídica estão geralmente disponíveis em Calbiochem-Novabiochem (UK) Ltd, Nottingham NG7 2QJ, UK. A purificação pode ser efectuada através de qualquer uma, ou de uma combinação, de técnicas tais como cromatografia de exclusão de tamanho, cromatografia de permuta iónica e (principalmente) cromatografia líquida de elevada resolução de fase inversa. A análise dos péptidos pode ser realizada utilizando cromatografia de camada fina, cromatografia líquida de elevada resolução de fase inversa, análise de aminoácidos após hidrólise ácida e através de análise espectrométrica de massa de bombardeamento rápido de átomos (FAB).

Um polinucleótido que codifica uma proteína S de CRCV ou semelhante à de CRCV ou o complemento deste, pode ser utilizado para produzir a proteína S.

De preferência, o polinucleótido codifica uma S de CRCV. 25 ΕΡ 1 525 313/ΡΤ

De maior preferência, o polinucleótido codificando a proteína S de CRCV compreende ou consiste na sequência listada na Figura 3.

Aprecia-se que a sequência listada na Figura 3 contenha um Y na posição 3531, que se refere a C ou T. Em ambos os casos o aminoácido correspondente é Ile. Assim um polinucleótido codificando a proteína S de CRCV que compreende ou consiste na sequência listada na Figura 3, pode ter C na posição 3531. Também um polinucleótido codificando a proteína S de CRCV que compreende ou consiste na sequência listada na Figura 3, pode ter T na posição 3531. 0 polinucleótido de S de CRCV pode compreender um fragmento da sequência listada na Figura 3, que codifica uma proteína possuindo pelo menos um dos aminoácidos específicos para a proteína S de CRCV na posição listada na Tabela 1, ou o complemento deste.

Os polinucleótidos tal como definidos acima são aqui referidos como polinucleótidos de CRCV ou semelhantes aos de CRCV.

Um "polinucleótido semelhante ao de CRCV" é um polinucleótido que não possui uma sequência de bases idêntica a toda ou a um fragmento da sequência de ADNc nativa de CRCV tal como listada na Figura 3, mas que codifica uma proteína S de CRCV ou semelhante à de CRCV tal como definido acima, ou o complemento deste. 0 CRCV é um vírus de ARN de cadeia positiva. 0 polinucleótido pode ser ADN ou ARN. 0 ARN pode ser ARN de cadeia positiva ou negativa. 0 ADN pode ser ADN de cadeia simples ou cadeia dupla.

As técnicas adequadas para clonagem e sequenciação de um ADNc a partir de um vírus de ARN de cadeia positiva tal como CRCV são bem conhecidas na arte e estão descritas por exemplo em Sambrook et ai., 2001. 26 ΕΡ 1 525 313/ΡΤ

Os polinucleótidos de CRCV ou semelhantes aos de CRCV podem ser de qualquer tamanho adequado. No entanto, para certos fins, tais como sondagem ou amplificação, é preferível se o ácido nucleico tiver menos de 3000, de maior preferência menos de 1000, ainda de maior preferência de 10 a 100, e ainda de maior preferência de 15 a 30 pares de bases (se o ácido nucleico for de cadeia dupla) ou bases (se o ácido nucleico for de cadeia simples). Tal como é descrito mais completamente abaixo, os oligonucleótidos de ADN de cadeia simples, adequados para utilizar como sondas de hibridação ou como iniciadores numa reacção em cadeia da polimerase, são particularmente preferidos.

Oligonucleótidos que podem amplificar especificamente ou hibridar com polinucleótidos de S de CRCV, em oposição a polinucleótidos de S, pol ou HE de BCV, HCV, HEV ou CCV entérico, são particularmente preferidos. Os oligonucleótidos adequados podem ser determinados por um perito na arte através de referência às comparações das sequências nucleotídicas nas Figuras 6, 8, 9 e 15.

Aprecia-se que os oligonucleótidos de CRCV ou semelhantes aos de CRCV possam, mesmo sob condições de elevado rigor, hibridar com ácido nucleico, seja ARN ou ADN, de HCV, BCV, e HEV bem como de CRCV. No entanto, é preferido se os oligonucleótidos de CRCV ou semelhantes aos de CRCV hibridarem com ácido nucleico de CRCV sob condições mais rigorosas que com ácido nucleico de HCV, BCV ou HEV. Isto pode ser determinado experimentalmente ou através de uma comparação da sequência oligonucleotídica com as respectivas sequências de CRCV, HCV, BCV e HEV, tal como é bem conhecido de um perito na arte (Sambrook et al., 2001).

De preferência, os oligonucleótidos não hibridam de todo com ácido nucleico de CCV entérico sob condições rigorosas (ver abaixo).

Convenientemente, os polinucleótidos ou oligonucleótidos de CRCV ou semelhantes aos de CRCV compreendem ainda um marcador detectável. 27 ΕΡ 1 525 313/ΡΤ

Por "marcador detectável" é incluído qualquer marcador radioactivo conveniente tal como 32P, 33P ou 35S que pode ser facilmente incorporado numa molécula de ácido nucleico utilizando métodos bem conhecidos; qualquer marcador fluorescente ou quimioluminescente conveniente que possa ser facilmente incorporado num ácido nucleico está também incluído. Adicionalmente o termo "marcador detectável" inclui também uma porção que pode ser detectada em virtude da ligação a outra porção (tal como biotina que pode ser detectada através de ligação a estreptavidina); e uma porção, tal como uma enzima, que pode ser detectada em virtude da sua capacidade para converter um composto incolor num composto colorido, ou vice-versa (por exemplo, a fosfatase alcalina pode converter o-nitrofenilfosfato incolor em o-nitrofenol colorido). Convenientemente, a sonda de ácido nucleico pode ocupar uma certa posição num arranjo fixo e se um ácido nucleico hibridar com esta tal pode ser determinado através de referência à posição de hibridação no arranjo fixo. A marcaçao com [ P]dCTP pode ser realizada utilizando um estojo de marcação de iniciadores aleatórios Rediprime® fornecido por Amersham.

Iniciadores que são adequados para utilizar numa reacção em cadeia da polimerase (PCR; Saiki et al., (1988) Science 239: 487-491) são preferidos. Iniciadores de PCR adequados podem ter as seguintes propriedades: É bem conhecido que a sequência na extremidade 5' do oligonucleótido não necessita de corresponder à sequência alvo para ser amplificada. É habitual que os iniciadores de PCR não contenham quaisquer estruturas complementares umas às outras com mais de 2 bases, especialmente nas suas extremidades 3', uma vez que esta característica pode promover a formação de um produto artefacto designado "dímero de iniciadores". Quando as extremidades 3' dos dois iniciadores hibridam, formam um complexo "molde iniciado" e a extensão do iniciador resulta num curto produto duplex designado "dímero de iniciadores". 28 ΕΡ 1 525 313/ΡΤ A estrutura interna secundária deve ser evitada nos iniciadores. Para PCR simétrica, é frequentemente recomendado um teor de G+C de 40-60% para ambos os iniciadores, sem trechos longos de qualquer uma das bases. Os cálculos da temperatura de fusão clássicos utilizados em conjunto com estudos de hibridação de sondas de ADN prevêem frequentemente que um dado iniciador se deva ligar a uma temperatura especifica ou que a temperatura de extensão de 72°C dissociará prematuramente o híbrido iniciador/molde. Na prática, os híbridos são mais eficazes no processo de PCR que o geralmente previsto através de simples cálculos da Tf.

As temperaturas de ligação óptimas podem ser determinadas empiricamente e podem ser mais elevadas que o previsto. A adn-polimerase Taq tem actividade na região 37-55°C, assim a extensão dos iniciadores ocorrerá durante o passo de ligação e o híbrido será estabilizado. As concentrações dos iniciadores são iguais em PCR convencional (simétrica) e, tipicamente, dentro do intervalo de 0,1 a 1 μΜ.

Será ainda apreciado que se for para realizar uma reacção de amplificação de controlo, por exemplo, utilizando iniciadores complementares a um gene expresso ubiquamente, que pode ser benéfico que os produtos do controlo e os produtos de CRCV ou semelhantes aos de CRCV sejam de diferentes tamanhos, de modo a que os dois produtos possam ser distinguidos através dos meios de detecção empregues, por exemplo através da mobilidade em electroforese em gel de agarose. No entanto, pode ser desejável que os dois produtos sejam de tamanho semelhante, por exemplo ambos entre 100 e 1000, ou entre 100 e 600 nucleótidos de comprimento. Isto pode ajudar a análise simultânea dos produtos, por exemplo através de electroforese em gel, e pode também significar que as reacções de amplificação do controlo e de CRCV ou semelhante a CRCV podem ter características de desempenho semelhantes, em termos, por exemplo, de taxas relativas de acumulação do produto em diferentes estádios durante a reacção.

Pode ser utilizado qualquer um dos protocolos de amplificação de ácido nucleico incluindo a reacção em cadeia da polimerase, replicase QB e reacção em cadeia da ligase. Também, NASBA (amplificação baseada na sequência do ácido 29 ΕΡ 1 525 313/ΡΤ nucleico), também designada 3SR, pode ser utilizada tal como descrito em Compton (1991) Nature 350: 91-92 e AIDS (1993), Vol. 7 (Supl. 2). S108 ou SDA (amplificação de deslocamento da cadeia) pode ser utilizada tal como descrito em Walker et al., (1992) Nucl. Acids Res. 20: 1691-1696. A reacção em cadeia da polimerase é particularmente preferida devido à sua simplicidade.

Quando é utilizado um par de ácidos nucleicos adequados do invento numa PCR é conveniente detectar o produto através de electroforese em gel e coloração com brometo de etidio. Como alternativa, é conveniente utilizar um oligonucleótido marcado capaz de hibridar com o ADN amplificado como sonda. Quando a amplificação é por PCR a sonda oligonucleotidica híbrida com a sequência inter-iniciadores definida pelos dois iniciadores. A sonda oligonucleotidica tem de preferência entre 10 e 50 nucleótidos de comprimento, de maior preferência entre 15 e 30 nucleótidos de comprimento. Pode ser mais longa que o adn amplificado ou incluir um ou ambos os iniciadores, mas neste caso, as condições de hibridação deverão ser tais que a sonda não hibride apenas com os iniciadores, mas só com um produto amplificado que contenha também a sequência inter-iniciadores que é capaz de hibridar com a sonda.

A sonda pode ser marcada com um radionuclídeo tal como P, P e S utilizando técnicas padrão, ou pode ser marcada com um corante fluorescente. Quando a sonda oligonucleotidica é marcada com fluorescência, o produto de ADN amplificado pode ser detectado em solução (ver por exemplo Balaguer et al., (1991). "Quantification of DNA sequences obtained by polymerase chain reaction using a bioluminescence adsorbent" Anal. Bloclzem. 195: 105-110 e Dilesare et al., (1993) "A high-sensitivity electrochemiluminescence-based detection System for automated PCR product quantitation" BioTechniques 15: 152-157.

Os produtos de PCR podem também ser detectados utilizando uma sonda que pode ter um par fluoróforo-extintor ou pode ser ligada a um suporte sólido ou pode ter uma etiqueta de biotina ou pode ser detectada utilizando uma combinação de uma sonda de captura com uma sonda detectora. 30 ΕΡ 1 525 313/ΡΤ

Os pares fluoróforo-extintor são particularmente adequados para medições quantitativas de reacções de PCR (p.ex., RT-PCR). A polarização da fluorescência utilizando uma sonda adequada pode também ser utilizada para detectar produtos de PCR.

Um vector compreendendo o polinucleótido de CRCV ou semelhante ao de CRCV pode ser utilizado para expressar a proteína S de CRCV ou semelhante à de CRCV.

Plasmídeos vectores procarióticos típicos são: pUC18, pUC19, pBR322 e pBR329 disponíveis em Biorad Laboratories (Richmond, CA, USA); pTi-c99A, pKK223-3, pKK233-3, pDR540 e pRlT5 disponíveis em Pharmacia (Piscataway, nj, USA); vectores pBS, vectores Phagescript, vectores Bluescript, pNH8A, ρΝΗίβΑ, pNHl8A, pNH46A disponíveis em Stratagene Cloning Systems (La Jolla, CA 92037, USA).

Um plasmídeo vector de células de mamífero típico é pSVL disponível em Pharmacia (Piscataway, NJ, USA). Este vector utiliza o promotor tardio de SV40 para dirigir a expressão de genes clonados, sendo o nível de expressão mais elevado verificado em células produtoras do antigénio T, tais como células COS-1. Um exemplo de um vector de expressão de mamífero indutível é pMSG, também disponível em Pharmacia (Piscataway, NJ, USA). Este vector utiliza o promotor indutível por glucocorticóides da repetição terminal longa do vírus do tumor mamário de ratinho para dirigir a expressão do gene clonado.

Vectores plasmídicos de levedura úteis são pRS403-406 e pRS413-416 e estão geralmente disponíveis em Stratagene Cloning Systems (La Jolla, CA 92037, USA). Os plasmídeos pRS403, pRS404, pRS405 e pRS406 são plasmídeos Integrantes em Levedura (Ylps) e incorporam os marcadores seleccionáveis de levedura HIS3, TUPI, LEU2 e URA3. Os plasmídeos pRS413-416 são plasmídeos de Centrómero de Levedura (YCps).

Geralmente, o polinucleótido de CRCV ou semelhante ao de CRCV é inserido num vector de expressão, tal como um plasmídeo, na orientação apropriada e enquadramento de leitura aberto correcto para expressão. Pode ser ligado às sequências 31 ΕΡ 1 525 313/ΡΤ nucleotídicas de controlo reguladoras da transcrição e da tradução apropriadas reconhecidas pelo hospedeiro desejado antes da inserção no vector, embora tais controlos estejam geralmente disponíveis no vector de expressão. Assim, a inserção do polinucleótido do invento pode ser operativamente ligada a um promotor apropriado. Promotores eucarióticos incluem o promotor inicial imediato de CMV, o promotor da timidina-cinase de HSV, o promotor inicial e tardio de SV40 e os promotores das LTRs retrovirais. Outros promotores adequados serão conhecidos dos peritos. As construções de expressão contêm também desejavelmente locais para início e terminação da transcrição e, na região transcrita, um local de ligação ao ribossoma para tradução (WO 98/16643). Métodos bem conhecidos dos peritos na arte podem ser utilizados para construir vectores de expressão contendo a sequência de codificação e, por exemplo, controlos da transcrição ou tradução apropriados. Um tal método envolve ligação através de caudas homopoliméricas. Caudas de homopolímero polidA (ou polidC) são adicionadas a grupos OH 3' expostos no fragmento de ADN a clonar através de desoxinucleotidil-transferases terminais. O fragmento é então capaz de se ligar a caudas polidT (ou polidG) adicionadas às extremidades de um vector plasmídico linearizado. Os intervalos deixados após a ligação podem ser preenchidos pela ADN-polimerase e as extremidades livres unidas pela ADN-ligase.

Outro método envolve ligação através de extremidades coesivas. Extremidades coesivas compatíveis podem ser geradas no fragmento de ADN e vector através da acção de enzimas de restrição adequadas. Estas extremidades serão rapidamente ligadas através de emparelhamento de bases complementares e os cortes remanescentes podem ser fechados através da acção da ADN-ligase.

Outro método utiliza moléculas sintéticas designadas ligadores e adaptadores. Fragmentos de ADN com extremidades cegas são gerados pela ADN-polimerase do bacteriófago T4 ou a ADN-polimerase I de E. coli que remove os terminais 3' salientes e preenche extremidades 3' embutidas. Os ligadores sintéticos, pedaços de ADN de cadeia dupla de extremidades 32 ΕΡ 1 525 313/ΡΤ cegas que contém sequências de reconhecimento para enzimas de restrição definidas, podem ser ligados a fragmentos de ADN de extremidades cegas através da ADN-ligase T4. Estes são subsequentemente digeridos com enzimas de restrição de apropriadas para criar extremidades coesivas e ligados a um vector de expressão com terminais compatíveis. Os adaptadores são também fragmentos de ADN quimicamente sintetizados que contêm uma extremidade cega utilizada para ligação mas que possui também uma extremidade coesiva pré-formada.

Ligadores sintéticos contendo uma variedade de locais de endonucleases de restrição estão comercialmente disponíveis em várias fontes incluindo International Biotechnologies Inc, New Haven, CN, USA.

Um modo desejável de modificar o polinucleótido do invento é utilizar a reacção em cadeia da polimerase tal como divulgado por Saiki et al., (1988) Science 239: 487-491. Neste método o ADN a amplificar enzimaticamente é flanqueado por dois iniciadores oligonucleotídicos específicos que ficam incorporados eles próprios no ADN amplificado. Os iniciadores específicos podem conter locais de reconhecimento de endonucleases de restrição que podem ser utilizados para clonagem em vectores de expressão utilizando métodos conhecidos na arte.

Uma célula hospedeira transformada com o vector compreendendo o polinucleótido de CRCV ou semelhante ao de CRCV pode ser utilizada para expressar a proteína S. A célula hospedeira pode ser procariótica ou eucariótica. Se o polinucleótido de CRCV ou semelhante ao de CRCV, no vector, for para expressar como uma glicoproteína, a célula hospedeira é uma célula hospedeira eucariótica, e de preferência uma célula hospedeira de mamífero.

As células bacterianas são células hospedeiras procarióticas preferidas e são tipicamente uma estirpe de E. coli tal como, por exemplo, as estirpes DH5 de E. coli disponível em Bethesda Research Laboratories Inc., Bethesda, MD, USA, e RRl disponível em American Type Culture Collection (ATCC) de Rockville, MD, USA (ATCC No. 31343). Células hospedeiras eucarióticas preferidas incluem células de 33 ΕΡ 1 525 313/ΡΤ levedura e de mamífero, de preferência células de vertebrado tais como as de um ratinho, rato, macaco ou linha celular fibroblástica humana. Células hospedeiras de levedura incluem YPH499, YPH500 e YPH501 que estão geralmente disponíveis em Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, USA. Células hospedeiras de mamífero preferidas incluem células de Ovário de Hamster Chinês (CHO) disponíveis em ATCC como CCL61, células de embrião de ratinho NIH Swiss NIH/3T3 disponíveis na ATCC como CRL 1658, e células COS-1 derivadas de rim de macaco disponíveis na ATCC as CRL 1650. As células de insecto preferidas são células Sf9 que podem ser transfectadas com vectores de expressão de baculovírus. A transformação de células hospedeiras apropriadas com um vector é alcançada através de métodos bem conhecidos que dependem tipicamente do tipo de vector utilizado. Em relação à transformação de células hospedeiras procarióticas, ver, por exemplo, Cohen et al., (1972) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 69: 2110 e Sambrook et al., (2001) "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", 3a Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. A transformação de células de levedura está descrita em Sherman et al., (1986) "Methods In Yeast Genetics, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor, NY. O método de

Beggs (1978) Nature 275: 104-109 é também útil. Em relação às células de vertebrado, reagentes úteis na transfecção de tais células, por exemplo fosfato de cálcio e DEAE-dextrano ou formulações de lipossomas, estão disponíveis em Stratagene Cloning Systems, ou Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD 20877, USA. A electroporação é também útil para transformação de células e é bem conhecida na arte para transformação de células de levedura, células bacterianas e células de vertebrado.

Por exemplo, muitas espécies bacterianas podem ser transformadas através dos métodos descritos em Luchansky et al., (1988) Mol. Microbiol. 2: 637-646 aqui incorporado por referência. O maior número de transformantes é consistentemente recuperado após electroporação da mistura de ADN-células suspensa em PEB 2,5x utilizando 6250 V por cm a 25 pFD. 34 ΕΡ 1 525 313/ΡΤ Métodos para transformação de levedura através de electroporação são divulgados em Becker & Guarente (1990) Methods Enzymol. 194: 182.

Podem ser utilizados métodos fisicos para introdução de ADN em células animais e vegetais. Por exemplo, a microinjecção utiliza uma pipeta muito fina para injectar moléculas de adn directamente no núcleo das células a transformar. Outro exemplo envolve o bombardeamento das células com microprojécteis a elevada velocidade, habitualmente partículas de ouro ou tungsténio que foram revestidas com ADN.

As células transformadas com sucesso, i.e., as células que contêm uma construção de ADN de CRCV ou semelhante à de CRCV, podem ser identificadas através de técnicas bem conhecidas. Por exemplo, uma técnica de selecção envolve a incorporação no vector de expressão de uma sequência de ADN (marcador) que codifica para uma característica seleccionável na célula transformada. Estes marcadores incluem di-hidrofolato-redutase, resistência a G418 ou neomicina para cultura de células eucarióticas, e genes de resistência a tetraciclina, canamicina ou ampicilina para cultura em E. coli e outras bactérias. Alternativamente, o gene para a característica seleccionável pode estar noutro vector, que é utilizado para co-transformar a célula hospedeira desejada. O gene marcador pode ser utilizado para identificar transformantes mas é desejável determinar quais das células contêm moléculas de ADN recombinantes e quais contêm moléculas de vector auto-ligado. Isto pode ser alcançado através da utilização de um vector de clonagem onde a inserção de um fragmento de ADN destrói a integridade de um dos genes presentes na molécula. Os recombinantes podem por isso ser identificados devido a perda de função desse gene.

Outro método de identificação de células transformadas com sucesso envolve a criação das células resultantes da introdução de uma construção de expressão do presente invento para produzir a proteína S, pol ou HE de CRCV ou semelhante à de CRCV. As células podem ser colhidas e lisadas e o seu teor 35 ΕΡ 1 525 313/ΡΤ de ADN examinado quanto à presença do ADN utilizando um método tal como o descrito por Southern (1975) J. Mol. Biol. 98: 503 ou Berent et al., (1985) Biotech. 3: 208. Alternativamente, a presença da proteína no sobrenadante pode ser detectada utilizando anticorpos.

Para além do ensaio directo quanto à presença de ADN recombinante, a transformação com sucesso pode ser confirmada através de métodos imunológicos bem conhecidos quando o ADN recombinante é capaz de dirigir a expressão da proteína. Por exemplo, as células transformadas com sucesso com um vector de expressão produzem proteínas apresentando antigenicidade apropriada. Amostras de células suspeitas de estarem transformadas são colhidas e ensaiadas quanto à proteína utilizando anticorpos adequados.

As células hospedeiras que foram transformadas pelo polinucleótido recombinante de CRCV ou semelhante ao de CRCV, tipicamente num vector tal como descrito acima, são então cultivadas durante um período de tempo suficiente e sob condições apropriadas conhecidos dos peritos na arte tendo em vista os ensinamentos aqui divulgados para permitir a expressão da proteína de CRCV ou semelhante à de CRCV codificada pelo polinucleótido de CRCV ou semelhante ao de CRCV, que pode então ser recuperada. A proteína de CRCV ou semelhante à de CRCV pode ser recuperada e purificada a partir de culturas celulares recombinantes através de métodos bem conhecidos incluindo precipitação em sulfato de amónio ou etanol, extracção ácida, cromatografia de permuta aniónica ou catiónica, cromatografia de fosfocelulose, cromatografia de interacção hidrófoba, cromatografia de afinidade, cromatografia de hidroxilapatite e cromatografia de lectina. De maior preferência, é empregue para purificação cromatografia líquida de alta resolução ("HPLC") .

Por exemplo, para expressão num sistema de baculovírus, o ADN recombinante codificando o gene da espícula de CRCV pode ser clonado num vector de transferência adequado tal como pMelBac (Invitrogen). A co-transfecção com ADN de baculovírus (p.ex., Bac-N-Blue/lnvitrogen) resulta num baculovírus 36 ΕΡ 1 525 313/ΡΤ recombinante codificando ο gene da espícula. A infecção de uma linha celular de insecto adequada (p.ex., Sf9, Sf21, High Five/Invitrogen) a uma multiplicidade de infecção apropriada conduz à expressão da proteína da espícula recombinante. A expressão da proteína é confirmada através de western blotting ou ELISA utilizando reagentes apropriados (p.ex., soro canino convalescente ou outro anti-soro específico do vírus).

Uma proteína S glicosilada de CRCV ou semelhante à de CRCV, codificada pelo polinucleótido de CRCV ou semelhante ao de CRCV pode ser obtida através de cultura de uma célula hospedeira eucariótica, ou de maior preferência de mamífero, compreendendo a célula hospedeira o polinucleótido de CRCV ou semelhante ao de CRCV, tipicamente num vector; expressando a proteína na célula hospedeira; e purificação da proteína glicosilada. 0 invento será agora descrito em maior detalhe com a ajuda das seguintes Figuras e Exemplos.

Figura 1

Sequência nucleotídica parcial (250 resíduos) do ADNc da polimerase (pol) de CRCV.

Figura 2

Sequência de aminoácidos parcial (83 resíduos) da proteína pol de CRCV, derivada da sequência nucleotídica da Figura 1.

Figura 3

Sequência nucleotídica (4092 resíduos) do ADNc da Espícula (Spike) (S) de CRCV. O Y na posição 3531 refere-se a C ou T.

Figura 4

Sequência de aminoácidos (1363 resíduos) da proteína S de CRCV, derivada da sequência nucleotídica da Figura 3.

Figura 5 Árvore de consenso para as sequências de ADNc de uma região de 250 nucleótidos do gene da polimerase de 12 coronavírus. A sequência obtida a partir do coronavírus 37 ΕΡ 1 525 313/ΡΤ respiratório canino é designada T101. Os números indicam valores de arranque (bootstrap) obtidos através de análise de 100 conjuntos de dados. BCV: coronavirus bovino, CCV: coronavirus canino, FIPV: virus da peritonite infecciosa felina, HEV: virus da encefalomielite hemaglutinante, IBV: virus da bronquite infecciosa, MHV: virus da hepatite de ratinho, OC43: coronavirus humano estirpe OC43, SDAV: virus da sialodacrioadenite, TCV: coronavirus de peru, TGEV: virus da gastroenterite transmissível, 229E: coronavirus humano estirpe 229E, T101: coronavirus respiratório canino (produto de PCR da amostra de traqueia T101).

Figura 6

Alinhamento de múltiplas sequências CLUSTAL X (1.8) da sequência parcial de 250 nucleótidos do ADNc de pol de CRCV (amostra T101), BCV, HCV estirpe OC43, HEV e CCV (CCV entérico).

Figura 7

Alinhamento de múltiplas sequências CLUSTAL X (1.8) da sequência parcial de 83 aminoácidos da proteína pol de CRCV (protCRCVpol, SEQ ID NO: 2) com HCV (protHCVpoly), HEV (protHEVpoly), BCV (protBCVpoly) e CECV (CCV entérico, protCECVpol).

Figura 8

Alinhamento de sequências CLUSTAL X (1.8) da sequência nucleotídica do ADNc da espícula de CRCV (CRCVspike) e do ADNc da espícula de CCV entérico (CECVspike).

Figura 9

Alinhamento de múltiplas sequências CLUSTAL X (1.8) dos 4092 nucleótidos da sequência do ADNc da espícula de CRCV (CRCVspike) com ADNcs das espículas de BCV (BCVspike), HCV (HCVspike) e HEV (HEVspike). O Y na posição 3531 na sequência de CRCV refere-se a C ou T. 38 ΕΡ 1 525 313/ΡΤ

Figura 10

Alinhamento de múltiplas sequências CLUSTAL X (1.8) da sequência de 1363 aminoácidos da proteína da espícula de CRCV (CRCVspikepr) com as proteínas das espículas de BCV (BCVspikepro), HCV (HCVspikepro), HEV (HEVspikepro) e CCV entérico (CECVspikepr).

Figura 11 RT-PCR utilizando um conjunto aninhado de iniciadores (Spike 1 e 2 seguidos de Spike 3 e 4) . BCV: amostra de controlo positivo de coronavírus bovino; A72: células A72 negativas para coronavírus; H20: mistura de PCR sem ADN; T5-T21: Amostras da traqueia de cães do estudo. A electroforese em gel de agarose mostra produtos de PCR do tamanho esperado de 442 bp para o controlo positivo (BCV) e para as amostras T12 e T21.

Figura 12

Comparação da prevalência de doença respiratória em dois grupos de cães. Os cães no grupo 1 eram positivos para anticorpos séricos para coronavírus respiratório no dia de entrada no canil, os cães no grupo 2 eram negativos. O gráfico mostra a percentagem de cães que desenvolvem doença respiratória no grupo 1 em comparação com o grupo 2 (p<0,001. n é o número total de cães em cada grupo.

Figura 13

Sequência nucleotídica parcial (497 resíduos) do gene da hemaglutinina/esterase (HE) de CRCV. A sequência corresponde aos nucleótidos 418 a 914 dos genes de HE de BCV (GenBank M84486) e HCV OC43 (N°. de Entrada em GenBank M76373).

Figura 14

Sequência de aminoácidos parcial (165 resíduos) da proteína HE de CRCV, derivada da sequência nucleotídica da Figura 13. Esta sequência corresponde aos resíduos de aminoácidos 140 a 304 de BCV (GenBank M84486) e HCV OC43 (No. de Entrada em GenBank M76373). 39 ΕΡ 1 525 313/ΡΤ

Figura 15

Alinhamento de múltiplas sequências CLUSTAL X (1.8) de uma sequência parcial de 497 nucleótidos do gene da hemaglutinina/esterase (HE) de CRCV (coronavirus respiratório canino) com BCV (estirpe LY138 de coronavirus bovino, (SEQ ID NO: 23, tomada de N°. de Entrada em Genbank AF058942), OC43 (estirpe OC43 de coronavirus humano, tomada de N°. de Entrada em Genbank M76373), HECV (coronavirus entérico humano, tomada de N°. de Entrada em Genbank L07747), e HEV (virus da encefalomielite hemaglutinante, tomada de N°. de Entrada em Genbank AF481863).

Figura 16

Alinhamento de múltiplas sequências CLUSTAL X (1.8) de uma sequência parcial de 165 aminoácidos da proteína HE de CRCV (coronavirus respiratório canino) com BCV (estirpe LY138 de coronavirus bovino tomada de N°. de Entrada em Genbank AF058942), OC43 (estirpe OC43 de coronavirus humano, tomada de N° . de Entrada em Genbank M76373), HECV (coronavirus entérico

humano, tomada de N°. de Entrada em Genbank L07747), e HEV (virus da encefalomielite hemaglutinante, tomada de N°. de Entrada em Genbank AF481863). Os três aminoácidos específicos de CRCV, F, N e L, estão indicados a negrito e estão sublinhados.

Figura 17 RT-PCR utilizando os iniciadores de consenso HEI e HE2 dirigidos ao gene de HE de BCV e HCV (estirpe OC43) . A electroforese em gel de agarose mostra um produto de PCR do tamanho esperado de 497 pb para o controlo positivo de BCV e para quatro amostras de traqueia de cães do estudo (T90, T91, T101 e T105), e não para células A72 negativas para coronavirus ou a mistura de PCR sem ADN (H20) . 1 kb indica um padrão do tamanho molecular (Promega).

Figura 18

Estratégia de clonagem do gene da Espícula (Spike) de CRCV. 40 ΕΡ 1 525 313/ΡΤ

Exemplo 1: Detecção de um novo coronavírus associado a doença respiratória infecciosa canina

Sumário

Foi realizada uma investigação sobre as causas da doença respiratória infecciosa canina (CIRD) num grande canil de realojamento. Amostras de tecido tomadas do tracto respiratório de cães doentes foram testadas quanto à presença de coronavírus utilizando RT-PCR com iniciadores conservados para o gene da polimerase. A análise da sequência de quatro amostras positivas mostrou a presença de um novo coronavírus com elevada semelhança com ambos o coronavírus bovino e humano (estirpe OC43) nos seus genes da polimerase e da espícula enquanto havia uma baixa semelhança com genes comparáveis no coronavírus entérico canino. Este coronavírus respiratório canino (CRCV) foi detectado através de RT-PCR em 32/119 amostras da traqueia e 20/119 amostras de pulmão sendo a prevalência mais elevada detectada em cães com sintomas clínicos suaves. A análise serológica mostrou que a presença de anticorpos contra CRCV no dia de entrada no canil diminuiu o risco de desenvolvimento de doença respiratória.

Materiais e Métodos

População de estudo

Foram monitorizados para este estudo cães de um canil de realojamento bem estabelecido com uma história de doença respiratória endémica. À entrada no canil, todos os cães foram vacinados com KAVAK DA2 PiP69 (Fort Dodge), uma vacina viva atenuada para o vírus da cinomose, adenovírus canino de tipo 2, vírus parainfluenza canino e parvovírus canino. Foi também utilizada uma vacina morta de leptospirose (Fort Dodge). O estado de saúde de cada cão foi avaliado duas vezes ao dia por um clínico veterinário e os sintomas respiratórios foram classificados como se segue: 1: sem sinais respiratórios, 2: tosse suave, 3: tosse e corrimento nasal, 4: tosse, corrimento nasal e inapetência, 5: broncopneumonia. O estado de saúde global dos cães foi classificado como se segue: 1: boa saúde, 2: saúde fraca, 3: saúde muito fraca. A idade, raça e sexo dos cães foram registados. 41 ΕΡ 1 525 313/ΡΤ

Para 119 cães foi efectuado um exame post mortem completo. As amostras de tecido foram armazenadas a -70°C até posterior utilização.

Amostras de soro foram colhidas de 111 cães no dia de entrada no canil de realojamento. Para 81 cães esteve disponível um soro de seguimento no dia 7 e para 111 cães esteve disponível um soro no dia 21 após a entrada.

Dos 111 cães, 30 permaneceram saudáveis durante os 21 dias entre a primeira e a última amostra de soro enquanto 81 cães desenvolveram doença respiratória.

Soros de 35 cães alojados noutro local foram obtidos no serviço de diagnóstico do Royal Veterinary College. Estes soros foram submetidos a análise bioquímica por várias razões. Cinco destes soros foram de Beagles com 18 meses de idade sem história de doença respiratória. Os soros foram rotineiramente armazenados a -20°C.

Extracção de ARN e RT-PCR ARN foi extraído a partir de tecido da traqueia e pulmão de 119 cães utilizando TriReagent (Sigma). Foram utilizados aproximadamente 25-50 mg de tecido homogeneizado e o ARN foi extraído tal como recomendado pelo fabricante. A síntese de ADNc foi efectuada utilizando Random Hexamers (Roche) e transcritase reversa ImPromII (Promega).

Sabe-se que o gene da polimerase de coronavírus é altamente conservado, e foi previamente utilizado para análise filogenética desta família de vírus (Stephensen et al., 1999). Para a detecção de coronavírus foi utilizada uma modificação dos iniciadores 2Bp e 4Bm dirigidos contra o gene da polimerase tal como descrito por Stephensen et al., (1999) (Conscoro5: 5'-ACT-CAR-ATG-AAT-TTG-AAA-TAT-GC (SEQ ID NO: 31); e Conscoroô: 5'-TCA-CAC-TTA-GGA-TAR-TCC-CA (SEQ ID NO: 32)). A PCR foi efectuada utilizando polimerase Taq (Promega) no tampão de reacção proporcionado contendo uma concentração 42 ΕΡ 1 525 313/ΡΤ final de 2,5 mM de MgCl2 e 0,5 μΜ de iniciadores. Para PCR como os iniciadores Conscoro5 e Conscoro6 foi utilizado o seguinte perfil de temperatura: Após desnaturação a 95°C durante 5 min, foram realizados 10 ciclos a 95°C durante 1 min, ligação a 37°C durante 1 min e extensão a 72°C durante 1 min. Isto foi seguido de 10 ciclos utilizando uma temperatura de ligação de 45°C, 10 ciclos a uma temperatura de ligação de 50°C e 10 ciclos a uma temperatura de ligação de 53°C seguido de uma extensão final a 72°C durante 10 min.

Uma fracção de 20 μΐ do produto de PCR foi analisada num gel de agarose a 1,5% e transferida para uma membrana de nylon (Roche) após electroforese. A membrana de nylon foi hibridada com uma sonda oligonucleotidica especifica para o produto de PCR a 37°C de um dia para o outro (Sonda Conscoro: AAG-TTT-TAT-GGY-GGY-TGG-GA). À sonda foi adicionada uma cauda de A a 3' com Digoxigenina-dUTP e esta foi detectada utilizando conjugado anti-Digoxigenina e substrato quimioluminescente CSPD (Roche).

As sequências de iniciadores específicas para o gene da espícula foram derivadas de um alinhamento da região da espícula da estirpe LY-138 de coronavírus bovino (AF058942) e da estirpe OC43 de coronavírus humano (L14643).

Foi efectuada uma PCR com os iniciadores Spike 1 e Spike 2, seguida de uma PCR aninhada utilizando os iniciadores Spike 3 e Spike 4 e 2 μΐ do produto da primeira amplificação.

Os números dentro de parênteses referem-se à posição nucleotídica no genoma do coronavírus bovino.

Spike 1: 5'-CTT-ATA-AGT-GCC-CCC-AAA-CTA-AAT (25291-25314)

Spike 2: 5'-CCT-ACT-GTG-AGA-TCA-CAT-GTT-TG (25912-25890)

Spike 3: 5'-GTT-GGC-ATA-GGT-GAG-CAC-CTG (25320-25339)

Spike 4: 5'-GCA-ATG-CTG-GTT-CGG-AAG-AG (25762-25742)

O perfil de temperatura utilizado foi desnaturação a 95°C durante 5 min, seguido de 35 ciclos de desnaturação a 95°C durante 1 min, ligação a 55°C durante 40 seg e alongamento a 72°C durante 1 min. A extensão final foi efectuada a 72°C 43 ΕΡ 1 525 313/ΡΤ durante 10 min. A PCR aninhada produziu um fragmento de 442 pb.

Os produtos de PCR foram clonados no vector pGEM-T-easy (Promega) e seguenciados utilizando o estojo de sequenciação de ciclos com iniciadores marcados com fluorescência Thermo sequenase com 7-desaza-dGTP (Amersham Pharmacia) utilizando iniciadores marcados com Cy5.

Análise filogenética

Um alinhamento da sequência de ADNc de 250 pb do gene da polimerase com as sequências correspondentes de 11 coronavírus foi efectuado utilizando Clustaix (Thompson et al., 1997). A relação filogenética com coronavirus conhecidos foi analisada utilizando o pacote Phylip 3.6 (Felsenstein, 1989). Os alinhamentos foram seguidos de uma análise de bootstrap utilizando o programa Seqboot. Os conjuntos de dados obtidos foram utilizados para uma análise de máxima parcimónia utilizando o programa DNApars e foi calculada uma árvore de consenso utilizando Consense. As árvores resultantes foram desenhadas utilizando o programa Treeview (Página, 1996) .

ELISA O antigénio de ELISA para coronavírus bovino ou coronavírus entérico canino (CECV) (os antigénios são uma preparação de culturas celulares infectadas com o vírus obtidas em Churchill Applied Biosciences, Huntingdon, UK) foi ressuspenso em PBS à concentração recomendada pelo fabricante e incubado em placas de 96 poços (Falcon) de um dia para o outro a 37°C.

As placas foram lavadas com PBS e bloqueadas com PBS contendo leite em pó magro a 5% durante 30 min. Os soros foram diluídos 1:100 em tampão de bloqueio e incubados nas placas durante 1 h. Após lavagem com PBS/Tween 20 a 0,05% (Sigma), foi adicionado um conjugado de IgG de coelho anti-cão marcado com peroxidase (Sigma) (1:5000 em PBS/Tween 20 a 0,05%) durante 1 h. As placas foram incubadas com substrato de cor (OPD, Sigma) durante 10 min e a reacção foi parada através da 44 ΕΡ 1 525 313/ΡΤ adição de H2SO4 2 Μ. A adsorção foi determinada num fotómetro de ELISA a 492 nm.

Cultura virai 0 isolamento do virus é efectuado em fibroblastos de pulmão adulto canino (passagem 3 a 7), células MDCK e A72. (Aprecia-se, no entanto, que o isolamento do virus possa ser efectuado utilizando células primárias ou linhas celulares tais como MDCK ou A72 (caninas), MDBK (bovina), HRT-18 (linha celular de tumor rectal humano) e Vero (Macaco Verde Africano). Os fibroblastos pulmonares são mantidos em MEM com soro fetal de vitelo a 20% (FCS), as células MDCK e A72 são mantidas em mem com FCS a 5%. As amostras de tecido da traqueia (aprox. 25 mg) são homogeneizadas utilizando um bisturi e misturadas vigorosamente em 1 ml de MEM contendo Penicilina (100 U/ml), Estreptomicina (0,1 mg/ml),

Anfotericina B (2,5 pg/ml) e Tripsina (1 pg/ml). As amostras são centrifugadas a 13000 rpm durante 10 min. e 0 sobrenadante é utilizado para inocular culturas celulares. Após 30 min. a 37°C o sobrenadante é removido e é adicionado meio de manutenção às culturas. As culturas são passadas três vezes na ausência de um efeito citopático. Depois, o ARN é extraído das células e é efectuada RT-PCR para detectar a presença de CRCV.

Análise estatística

Os dados foram analisados utilizando o teste do qui-quadrado ou o teste exacto de Fisher e valores de p abaixo de 0,05 foram considerados estatisticamente significativos.

Resultados PCR utilizando iniciadores de consenso para o gene da ARN-polimerase de coronavírus

Utilizando os iniciadores Conscoro5 e Conscoroô, ADNc obtido a partir de 40 amostras de traqueia foi analisado através de RT-PCR.

Destas, verificou-se que sete eram positivas por PCR e subsequente hibridação (17,5%). 45 ΕΡ 1 525 313/ΡΤ

Os produtos de PCR foram clonados e sequenciados (Figuras 1 e 2) e os dados da sequência foram comparados com sequências virais disponíveis utilizando o programa de pesquisa FASTA (Pearson, 1990) . A comparação da sequência de ADNc da polimerase de coronavírus obtida em quatro das amostras de traqueia caninas com outras sequências de coronavírus revelou que são muito semelhantes com os dados das sequências das estirpes Quebec e LY138 de BCV (Nos. de Entrada em Genbank AF220295 e AF058942, respectivamente) e da estirpe OC43 de coronavírus humano (N°. de Entrada em Genbank AF124989). A semelhança na sequência de 250 pb analisada foi de 98,8% para BCV Quebec, e 98,4% para BCV LY138 e os genes de pol de HCV, enquanto foi de apenas 68,53% para o gene de pol da estirpe 1-71 de CCV (Figuras 6 e 7).

Um alinhamento da nova sequência com as sequências correspondentes de 11 coronavírus e a análise filogenética utilizando o método de máxima parcimónia resultou na árvore de consenso mostrada na Figura 5. A sequência de ADNc obtida a partir de uma amostra de traqueia (T101) foi verificada num ramo comum com o coronavírus bovino, coronavírus humano-OC43 e vírus da encefalomielite hemaglutinante. O vírus foi designado coronavírus respiratório canino (CRCV). PCR utilizando iniciadores para o gene da espícula

Para mais análise da sequência de ARN de CRCV, um alinhamento do ARN para o gene da espícula da estirpe LY138 de coronavírus bovino (AF058942) e da estirpe OC43 de coronavírus humano (L14643) foi efectuado utilizando Clustal X (Thompson et al., 1997). Regiões de consenso foram escolhidas para a selecção dos conjuntos de iniciadores aninhados Spike 1-2 e Spike 3-4 (Figura 11) . A análise de PCR foi efectuada com o ADNc obtidos a partir 119 amostras de traqueia e pulmão utilizando estes iniciadores aninhados. 46 ΕΡ 1 525 313/ΡΤ

No total 32 amostras de traqueia (26,9%) e 20 amostras de pulmão (16,8%) foram verificadas serem positivas através de PCR aninhada. Para oito cães um resultado de PCR positivo foi obtido para ambos traqueia e pulmão. A análise da sequência dos produtos de PCR obtidos a partir de tecidos de seis cães diferentes mostrou sequências de ADN idênticas para estes ADNcs (Figuras 3 e 4) . Uma comparação com sequências de espiculas de coronavírus conhecidas utilizando o programa FASTA revelou uma semelhança de 98,1% com o coronavírus bovino e uma semelhança de 97,8% com o coronavírus humano OC43 (Figuras 9 e 10).

PCR utilizando iniciadores para o gene de HE O coronavírus bovino e outros coronavírus de grupo II contêm uma proteína estrutural adicional, a hemaglutinina/esterase (HE). Devido à elevada semelhança de CRCV com BCV, analisámos a presença de um gene de HE em CRCV.

Foi utilizado um alinhamento das sequências dos genes de HE de BCV e HCV OC43 para desenhar os iniciadores HEl e HE2 (Tabela 2). Quatro amostras de traqueia que tinham sido anteriormente identificadas como positivas para ARN de coronavírus através de RT-PCR com iniciadores para o gene S foram testadas através de RT-PCR como o conjunto de iniciadores para o gene HE. Todas as quatro amostras mostraram uma banda de PCR do tamanho esperado após electroforese em gel de agarose (Figura 17).

Tabela 2: Iniciadores desenhados a partir de um alinhamento dos genes de hemaglutinina/esterase de BCV (Na. de Entrada em GenBank M84486) e HCV OC43 (Ns. de Entrada em GenBank M76373)

Nome Sequência Localização no gene de HE de BCV HE 1 5'-TAT-CGC-AGC-CTT-ACT-TTT-GT 418-437 HE 2 5'-ACC-GCC-GTC-ATG-TTA-TCA-G 914-896

A sequência do produto de PCR de CRCV obtida utilizando os iniciadores HE 1 e HE 2 é dada na Figura 13, e a sua sequência de aminoácidos prevista está listada na Figura 14. A 47 ΕΡ 1 525 313/ΡΤ comparação destas sequências nucleotídicas e de aminoácidos com os correspondentes fragmentos de outros coronavírus aparentados é mostrada nas Figuras 15 e 16. Mostrou-se que três aminoácidos eram únicos de CRCV, tal como mostrado nas Tabela 3.

Tabela 3: Aminoácidos únicos no gene de HE de CRCV

Aminoácido em CRCV Aminoácido em BCV/HECV/HCV/HEV Posição em BCV/HECV/HCV/HEV Posição no produto de PCR com HEI-HE2 F (Phe) L (Leu) 235 96 N (Asn) T (Thr) 242 103 L (Leu) V (Vai) 253 114

As posições de aminoácidos em BCV, HECV, HCV e hev são numeradas a partir do M inicial (que é o número 1) no inicio das proteínas HE de BCV e HCV OC43 (Nos. de Entrada em GenBank M84486 e M76373, respectivamente).

Associação das amostras positivas em PCR com sinais respiratórios

Utilizando iniciadores para o gene da espicula, amostras de traqueia e pulmão de 119 cães foram analisadas através de RT-PCR para CRCV. Destas 42 foram de cães sem sinais respiratórios (grau 1), 18 cães tinham sinais respiratórios suaves (grau 2), 46 tinham sinais respiratórios moderados (grau 3) e 13 graves (graus 4 e 5) . Os graus 4 e 5 foram agrupados devido ao reduzido número de casos nestes grupos. A Tabela 4 mostra os resultados de PCR para coronavírus em cães com diferentes graus de doença respiratória. Especificamente, a Tabela 4 mostra os resultados de RT-PCR de amostras de traqueia e pulmão de 119 cães com diferentes sinais respiratórios (nenhum grave) utilizando uma PCR aninhada dirigida contra o gene da espicula de coronavírus bem como o número de amostras positivas do número total de amostras e a percentagem de amostras positivas (dentro de parênteses). 48 ΕΡ 1 525 313/ΡΤ

Tabela 4: Resultados de rt-pcr para amostras de traqueia e pulmão

Sinais respiratórios Traqueia: Amostras positivas Pulmão: Amostras positivas Traqueia e pulmão: Amostras positivas Nenhum 11/42 (26,2%) 8/42 (19,1%) 2/42 Suave 10/18 (55,6%) 4/18 (22,2%) 4/18 Moderado 9/46 (19,6%) 8/46 (17,4%) 2/46 Grave 2/13 (15,4%) 0/13 0/13

Estabelecimento de um ensaio serológico para CRCV

Devido à homologia do ADNc da espícula de CRCV com a região da espícula do coronavírus bovino, foi utilizado um antigénio de ELISA para BCV para análise serológica de CRCV.

Foi testado o soro de cinco cães sem história de doença respiratória infecciosa que não tinham sido alojados no canil investigado. Os valores da DO variaram de -0,013 a 0,39 com um valor médio de DO de 0,154. Para além disso, o soro de 30 cães admitidos numa clínica veterinária por várias razões foi testado quanto a anticorpos para coronavírus. Destes, 20 amostras apresentaram uma DO de <0,4 (-0,46 a 0, 396) e 10 amostras apresentaram uma DO de >1,0 (1,012 a 1,949). Amostras com uma DO de 0,6 ou acima foram subsequentemente consideradas positivas.

Comparação da resposta imunitária a CRCV de cães com e sem doença respiratória O ELISA com antigénio de BCV foi efectuado utilizando soro aos pares de 111 cães do canil de estudo. Destes, 81 cães tinham mostrado sintomas de doença respiratória durante um período de 21 dias e 30 permaneceram saudáveis.

Do grupo de cães com doença respiratória, 17 eram positivos para anticorpos para CRCV no dia de entrada no canil e 64 eram negativos.

Dos 64 cães sem anticorpos detectáveis para BCV no dia um, 63 deram teste positivo no dia 21. Todos os 46 cães destes 49 ΕΡ 1 525 313/ΡΤ 63 para os quais uma amostra no dia 7 esteve disponível deram teste negativo no dia 7. Portanto, 63 cães mostraram uma seroconversão durante o periodo de estudo enquanto que apenas um cão permaneceu negativo.

Dos 31 cães que permaneceram saudáveis, 17 tinham anticorpos para CRCV no dia de entrada. Todos os 13 cães que eram negativos no dia 1 tiveram teste negativo no dia 7 mas apresentaram uma seroconversão pelo dia 21.

Assim, dos 34 cães que eram positivos para anticorpos para CRCV na chegada ao canil, 17 desenvolveram doença respiratória (50%) enquanto dos 77 cães que eram negativos à chegada, 64 desenvolveram sinais respiratórios durante o periodo de estudo (83,1%), (Figura 12).

Portanto, os cães que não tinham anticorpos para CRCV à entrada no canil tinham uma maior probabilidade de desenvolver doença respiratória (p<0,001).

Apenas um dos 77 cães que era negativo à chegada permaneceu negativo durante o periodo de estudo de 21 dias enquanto 76 cães mostraram uma seroconversão.

Serologia utilizando antigénio de coronavírus entérico canino (CECV)

Foi efectuado um ensaio ELISA utilizando um antigénio de coronavírus canino para investigar se CRCV apresentava uma reacção serológica cruzada com o coronavírus entérico canino. Foram seleccionados soros de 27 cães, anteriormente testados quanto a anticorpos para CRCV utilizando o antigénio de BCV.

Verificou-se que oito cães tinham anticorpos para CECV no dia de entrada no canil, destes, quatro também tinham anticorpos para CRCV. Verificou-se que dezanove cães eram negativos para CECV no dia 1, 17 destes eram também negativos para CRCV. Dos 19 cães negativos, cinco mostraram uma seroconversão para CECV durante o periodo de 21 dias da investigação e 17 mostraram uma seroconversão para CRCV. 50 ΕΡ 1 525 313/ΡΤ A análise da prevalência de doença respiratória neste grupo mostrou que seis dos oito cães (75%) que eram positivos para anticorpos para CECV no dia 1 desenvolveram doença respiratória. Do grupo de 19 cães que não tinham anticorpos detectáveis para CECV no dia 1, 15 mostraram sinais de doença respiratória (78,9%), (p=0,594).

Isolamento do vírus

Amostras de tecido da traqueia de cães que estão identificados como positivos para ARN de CRCV através de RT-PCR são inoculadas em culturas celulares de fibroblastos pulmonares caninos de adulto e células MDCK. Para algumas amostras, o isolamento do vírus é também efectuado em células A72. As culturas não mostram sinais de um efeito citopático durante três passagens. Após várias passagens, o ARN é extraído das culturas e testado quanto à presença de ARN de CRCV através de RT-PCR.

Discussão

Este estudo relata a detecção de um novo coronavírus, CRCV, em cães em canis com doença respiratória.

Foi relatado que os coronavírus causam doença respiratória do homem, gado, suínos e aves de capoeira, mas a sua presença no tracto respiratórios de cães e uma possível associação a doença respiratória infecciosa canina (CIRD) não foi determinada.

Foram investigados cães de um canil no qual CIRD era endémica e não podia ser controlada através da utilização de vacinas recomendadas contra CIRD. Amostras tomadas do tracto respiratório destes cães foram examinadas utilizando iniciadores de RT-PCR dirigidos ao gene conservado da polimerase de coronavírus (Stephensen et al., 1999).

Inicialmente, verificou-se que sete amostras de traqueia eram positivas; a sequência dos produtos de RT-PCR foi determinada e comparada com todas as sequências do gene da polimerase de coronavírus disponíveis. Esta análise revelou que a sequência de ADNc obtida a partir das amostras caninas 51 ΕΡ 1 525 313/ΡΤ tinha a maior semelhança com o gene da polimerase de coronavírus bovino (98,8%) e coronavírus humano OC43 (98,4%) mas apenas uma muito baixa semelhança com o gene da polimerase do coronavírus canino entérico (estirpe 1-71, 68,53% de semelhança).

Uma análise filogenética foi efectuada utilizando as sequências da polimerase de mais onze coronavírus. 0 coronavírus detectado no tracto respiratório de cães (CRCV) estava localizado num ramo comum com três vírus do grupo 2: BCV, estirpe OC43 de HCV e HEV. No entanto, mostrou-se que o coronavírus entérico canino, um coronavírus de grupo 1, está apenas distantemente aparentado. 0 coronavírus respiratório canino é portanto um novo coronavírus de cães que é muito intimamente aparentado com BCV e HCV-OC43, os quais se sabe serem ambos causadores de doença respiratória.

Para obter mais informação sobre a sequência e determinar melhor a relação com outros coronavírus utilizando um gene mais variável, foi analisada uma parte do gene da espícula. Uma vez que se mostrou que CRCV é muito semelhante a BCV e HCV-OC43, um alinhamento das sequências dos seus genes da espícula foi utilizado para desenhar um conjunto aninhado de iniciadores. Os iniciadores aninhados foram escolhidos para se alcançar um ensaio mais sensível. A sequenciação dos produtos desta RT-PCR confirmou a elevada semelhança de CRCV com BCV e HCV-OC43. A presença de anticorpos para CRCV foi analisada utilizando um ELISA baseado num antigénio de BCV devido à elevada semelhança das sequências dos dois vírus no ADNc da espícula. Os resultados de ELISA confirmaram a presença de um vírus semelhante a BCV na população de estudo. A prevalência de anticorpos foi de 30% no momento de entrada no canil e de 99% após 21 dias.

Interessantemente e inesperadamente, a análise serológica revelou que os cães com anticorpos para CRCV no dia de entrada 52 ΕΡ 1 525 313/ΡΤ no canil desenvolveram doença respiratória menos frequentemente que os cães sem anticorpos (p<0,001). Portanto, a presença de anticorpos para CRCV teve um efeito protector contra doença respiratória nesta população.

Quase todos os cães negativos no dia de entrada no canil mostraram uma seroconversão para CRCV dentro de três semanas, indicando que o virus é altamente contagioso. A serologia utilizando um antigénio para coronavírus entérico canino (CECV) mostrou uma prevalência muito inferior de anticorpos para CECV no dia 21. Portanto, os resultados de ELISA de BCV não reflectiram uma infecção com coronavírus entérico canino e a reactividade cruzada entre os dois antigénios parece ser baixa.

Anticorpos séricos para CRCV estavam presentes em cerca de 30% dos cães de várias origens incluindo cães que entraram num canil de realojamento bem como cães de estimação. A presença de CRCV não está, portanto, limitada ao canil investigado e o virus parece estar estabelecido na população canina.

Através de PCR, CRCV foi detectado em tecido de traqueia e tecido pulmonar e parece portanto infectar o tracto respiratório superior e inferior dos cães. Dentro da população em canil, ARN de CRCV foi detectado em 27,3% dos cães com todos os graus de doença respiratória bem como em 26,2% de cães que eram aparentemente saudáveis no momento da eutanásia. O ARN de CRCV foi muito verificado muito frequentemente na traqueia de cães com tosse suave (55%) . Estudos utilizando a estirpe 229E de coronavírus humano mostraram que os coronavírus podem causar ruptura do epitélio respiratório e discinesia ciliar (Chilvers et al.r 2001). Sem estarmos presos à teoria, cremos que uma infecção com CRCV tem um efeito semelhante, e que o vírus tem um papel importante nos estádios iniciais da patogénese de CIRD. Ao danificar o epitélio respiratório e perturbar a limpeza ciliar o CRCV facilita a entrada de outros patogénicos virais ou bacterianos. Portanto, ao mesmo tempo que a infecção de CRCV por si mesma pode causar apenas sintomas respiratórios suaves, em conjunto com outros agentes patogénicos pode conduzir a doença respiratória grave. 53 ΕΡ 1 525 313/ΡΤ A patogénese de CIRD não tinha sido cuidadosamente investigada desde a década de 1970 quando foi determinado que Bordetella bronchiseptica, adenovirus canino de tipo 2 e parainfluenza canino eram as principais causas da doença. No entanto a vacinação de todos os cães contra CPIV, CAV-2 e virus de cinomese não ajudaram a controlar a doença neste canil apesar de evidências de que a maioria dos cães respondeu à vacina em 21 dias (dados não mostrados).

Este estudo mostra uma associação de um novo coronavírus respiratório canino com CIRD. A etiologia de CIRD necessita portanto de ser reavaliada e o papel de novos microrganismos ou de microrganismos anteriormente não associados à doença tem de ser estabelecida.

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Exemplo 2: Clonagem e expressão da Espícula de CRCV O gene da Espícula (Spike) de CRCV foi clonado utilizando os iniciadores listados na Tabela 5 e utilizando a seguinte estratégia de clonagem, que é ilustrada na Figura 18. 1. O gene da espícula foi amplificado em quatro fragmentos sobreponíveis (A, B, c, D). 56 ΕΡ 1 525 313/ΡΤ 2. Ο produto de PCR Sp5-Sp2 (B) foi ligado ao produto Spl-Sp8 (C) utilizando o local PvuII na sobreposição. 3. Este fragmento foi clonado no vector pT7blue2 (Novagen) utilizando os locais de restrição Ncol e BstxI. 4. 0 fragmento de PCR SpFXho-Sp6 (A) foi unido a BC utilizando o local de restrição Bstxi na sobreposição e o local Xhol que tinha sido incorporado no iniciador SpF-Xho. 5. 0 fragmento ABC foi movido para o vector de transferência baculoviral pMelBacB (Invitrogen) utilizando os locais de restrição Xhol e Ncol. 6. 0 fragmento de PCR Sp7-SpR-HisTag-Eco (D) foi unido a ABC utilizando o local de restrição Ncol na sobreposição e o local EcoRI que tinha sido incorporado no iniciador SpR-Eco-HisTag resultando no gene completo da espícula em pMelBacB (Spike MelBac). Esta construção contém uma HisTag (6xHis) no terminal C da proteína expressa. 7. Para expressão em mamífero o gene completo foi movido para pSecTagA (Invitrogen) utilizando o local Bamhl em pMelBacB e o local EcoRI no fim do ABCD resultando no plasmídeo SpikeSecTag.

Construção de um baculovírus recombinante

Foi efectuada uma co-transfecção em células Sf9 utilizando o ADN de baculovírus Bac-N-Blue (Invitrogen) e Spike MelBac. Mostrou-se que o baculovírus resultante (AcSpCRCV 1-11) contém uma inserção inteira através de PCR utilizando iniciadores (invitrogen) localizados a montante e a jusante do local de recombinação.

Expressão em células de mamífero

0 plasmídeo Spike SecTag foi transfectado para células BHK-21 utilizando Lipofectamine (Invitrogen). A expressão da proteína da Espícula (Spike) foi analisada utilizando uma amostra de soro de um cão que se tinha mostrado ser positivo para anticorpos para CRCV utilizando ELISA (antigénio de BCV 57 ΕΡ 1 525 313/ΡΤ obtido em Churchill) e um soro de controlo positivo para BCV obtido em Churchill (galinha anti-BCV). As células transfectadas mostraram um sinal positivo num ensaio de imunofluorescência utilizando o soro canino ou de galinha e um conjugado marcado com FITC (anti-IgG de cão-FITC ou anti-IgG de galinha-FiTC).

Tabela 5: Iniciadores desenhados a partir de um alinhamento dos genes das espiculas de coronavírus bovino (Ns. de Entrada em GenBank AF058942) e coronavírus humano, OC43 (Ns. de Entrada em GenBank L14643)

Nome Sequência Localização no gene da espicula de BCV Spl 5'-CTT-ATA-AGT-GCC-CCC-AAA-CTA-AAT 1637-1660 Sp2 5'-CCT-ACT-GTG-AGA-TCA-CAT-GTT-TG 2258-2236 Sp3 5'-GTT-GGC-ATA-GGT-GAG-CAC-TG 1666-1686 Sp4 5'-GCA-ATG-CTG-GTT-CGG-AAG-AG 2107-2088 Sp5 5'-AAC-GGT-TAC-ACT-GTT-CAG-CC 931-950 Sp6 5'-CAA-GTA-AAT-GAG-TCT-GCC-TG 1121-1102 Sp7 5'-GGC-TGC-CAC-CTC-TGC-TAG-TC 2919-2938 Sp8 5' -ATT-GTT-AAA-TGC-ATT-AGC-AAT-AAG-C 3069-3045 SpF 5i-TTT-TTG-ATA-CTT-TTA-ATT-TCC-TTA-CC 4-29 SpR 5'-GTC-GTC-ATG-TGA-WGT-TTT-RAT-TAC 4089-4066 SpF- Xhol 5'-AGC-TCG-AGC-TTT-TTG-ATA-CTT-TTA-ATT-TCC-TTA-CC SpR His- EcoRI

SpF-XhoI contém um local XhoI (negrito). SpR-His-EcoRI contém uma 6xHisTag (duplo sublinhado), um codão de terminação (sublinhado) e um local EcoRI (negrito)

Lisboa, 2011-03-04

Claims (28)

1. ΕΡ 1 525 313/ΡΤ 1/5 REIVINDICAÇÕES 1. Composição de vacina para vacinar cães, compreendendo a composição um coronavirus respiratório canino (CRCV) que compreende uma proteína da Espícula (Spike) (S) possuindo a sequência de aminoácidos listada na Figura 4, ou a proteína S coronaviral possuindo pelo menos 97% de identidade de aminoácidos com a sequência de aminoácidos da Figura 4, ou um fragmento imunogénico da Figura 4 com pelo menos 200 aminoácidos de comprimento, ou um ácido nucleico codificando a referida proteína S coronaviral ou o referido fragmento imunogénico da Figura 4.
2. 2. Composição de vacina de acordo com a Reivindicação 1 em que a proteína S coronaviral tem pelo menos 98% de identidade com a sequência de aminoácidos da Figura 4.
3. 3. Composição de vacina de acordo com Reivindicação 2 em que a proteína S coronaviral tem pelo menos 99% de identidade com a sequência de aminoácidos da Figura 4.
4. 4. Composição de vacina de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1-3 em que a proteína S coronaviral é uma proteína isolada ou recombinante.
5. 5. Composição de vacina de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1-4 e compreendendo também um adjuvante farmaceuticamente aceitável.
6. 6. Composição de vacina de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1-5, compreendendo ainda qualquer um ou mais de: - um agente capaz de aumentar uma resposta imunitária num cão contra vírus parainfluenza canino; - um agente capaz de aumentar uma resposta imunitária num cão contra adenovírus canino de tipo 2; - um agente capaz de aumentar uma resposta imunitária num cão contra herpesvírus canino; e ΕΡ 1 525 313/ΡΤ 2/5 - um agente capaz de aumentar uma resposta imunitária num cão contra Bordetella bronchiseptica.
7. 7. Proteína S de coronavírus possuindo pelo menos 97% de identidade da sequência de aminoácidos com a sequência listada na Figura 4 para utilização em medicina.
8. 8. Proteína S de coronavírus para utilização de acordo com a Reivindicação 7 que é uma proteína isolada ou recombinante.
9. 9. Utilização de um coronavírus possuindo uma proteína S com pelo menos 90% de identidade de aminoácidos com a sequência de aminoácidos da Fig. 4 ou uma proteína S coronaviral possuindo pelo menos 90% de identidade de aminoácidos com a sequência de aminoácidos da Fig. 4 ou um fragmento imunogénico desta, ou um ácido nucleico codificando a referida proteína S coronaviral ou um fragmento imunogénico desta, na preparação de um medicamento para estimulação de uma resposta imunitária contra coronavírus respiratório canino num cão.
10. 10. Utilização de um coronavírus possuindo uma proteína S com pelo menos 90% de identidade de aminoácidos com a sequência de aminoácidos da Fig. 4 ou uma proteína S coronaviral possuindo pelo menos 90% de identidade de aminoácidos com a sequência de aminoácidos da Fig. 4, ou um fragmento imunogénico desta, ou um ácido nucleico codificando a referida proteína S coronaviral ou um fragmento imunogénico desta, na preparação de um medicamento para profilaxia da doença respiratória num cão.
11. 11. Utilização de acordo com a Reivindicação 9 ou 10 em que o coronavírus compreende uma proteína S possuindo pelo menos 95% de identidade de aminoácidos com a sequência de aminoácidos da Fig. 4.
12. 12. Utilização de acordo com Reivindicação 11 em que o coronavírus é CRCV que compreende uma proteína S possuindo a sequência de aminoácidos da Fig. 4. ΕΡ 1 525 313/ΡΤ 3/5
13. 13. Utilização de acordo com a Reivindicação 9 ou 10 em que a proteína S coronaviral tem pelo menos 95% de identidade de aminoácidos com a sequência de aminoácidos da Fig. 4.
14. 14. Utilização de acordo com a Reivindicação 13 em que a proteína S coronaviral tem pelo menos 97% de identidade de aminoácidos com a sequência de aminoácidos da Fig. 4.
15. 15. Utilização de acordo com qualquer uma das Reivindicações 9-10 e 13-14 em que a proteína S coronaviral compreende pelo menos um de V na posição 103; V na posição 118; D na posição 166; M na posição 171; K na posição 179; P na posição 192; S na posição 210; H na posição 235; F na posição 267; F na posição 388; M na posição 407; S na posição 436; I na posição 440; I na posição 447; F na posição 501; Y na posição 525; N na posição 528; L na posição 540; K na posição 582; G na posição 608; G na posição 692; S na posição 695; W na posição 757; G na posição 758; Q na posição 763; T na posição 769; P na posição 786; H na posição 792; R na posição 818; P na posição 827; V na posição 828; F na posição 887; D na posição 933; F na posição 977; T na posição 1011; S na posição 1018; K na posição 1063; L na posição 1256; e M na posição 1257.
16. 16. Utilização de acordo com qualquer uma das Reivindicações 9-10 e 13-15 em que a proteína S coronaviral compreende a sequência de aminoácidos da Figura 4.
17. 17. Utilização de acordo com qualquer uma das Reivindicações 9-10 e 13-16 em que a proteína S coronaviral é uma proteína isolada ou recombinante.
18. 18. Composição de vacina de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1, 5 ou 6, em que o coronavírus foi atenuado ou inactivado.
19. 19. Utilização de acordo com qualquer uma das Reivindicações 9-12, em que o coronavírus foi atenuado ou inactivado.
20. 20. Composição compreendendo um coronavírus possuindo uma proteína S com pelo menos 90% de identidade de aminoácidos ΕΡ 1 525 313/ΡΤ 4/5 com a sequência de aminoácidos da Figura 4, ou a proteína S coronaviral possuindo pelo menos 90% de identidade de aminoácidos com a sequência de aminoácidos da Figura 4, ou um fragmento imunogénico desta, ou um ácido nucleico codificando a referida proteína S coronaviral ou um fragmento imunogénico desta, para utilização na estimulação de uma resposta imunitária contra coronavírus respiratório canino num cão, ou para a utilização em profilaxia de doença respiratória num cão.
21. 21. Composição para utilização de acordo com a Reivindicação 20 em que o coronavírus compreende uma proteína S possuindo pelo menos 95% de identidade de aminoácidos com a sequência de aminoácidos da Figura 4.
22. 22. Composição para utilização de acordo com a Reivindicação 21 em que o coronavírus é CRCV que compreende uma proteína S possuindo a sequência de aminoácidos da Figura 4.
23. 23. Composição para utilização de acordo com qualquer uma das Reivindicações 20-22 em que o coronavírus foi atenuado ou inactivado.
24. 24. Composição para utilização de acordo com a Reivindicação 20 em que a proteína S coronaviral tem pelo menos 95% de identidade de aminoácidos com a sequência de aminoácidos da Figura 4.
25. 25. Composição para utilização de acordo com a Reivindicação 24 em que a proteína S coronaviral tem pelo menos 9 7% de identidade de aminoácidos com a sequência de aminoácidos da Figura 4.
26. 26. Composição para utilização de acordo com qualquer uma das Reivindicações 20, 24 e 25 em que a proteína S coronaviral compreende pelo menos um de V na posição 103; V na posição 118; D na posição 166; M na posição 171; K na posição 179; P na posição 192; S na posição 210; H na posição 235; F na posição 267; F na posição 388; M na posição 407; S na posição 436; I na posição 440; I na posição 447; F na posição 501; Y na posição 525; N na posição 528; L na posição 540; κ ΕΡ 1 525 313/ΡΤ 5/5 na posição 582; G na posição 608; G na posição 692; S na posição 695; W na posição 757; G na posição 758; Q na posição 763; T na posição 769; P na posição 786; H na posição 792; R na posição 818; P na posição 827; V na posição 828; F na posição 887; D na posição 933; F na posição 977; T na posição 1011; S na posição 1018; K na posição 1063; L na posição 1256; e M na posição 1257.
27. 27. Composição para utilização de acordo com qualquer uma das Reivindicações 20 e 24-26 em que a proteína S coronaviral compreende a sequência de aminoácidos da Figura 4.
28. 28. Composição para utilização de acordo com qualquer uma das Reivindicações 20 e 24-27 em que a proteína S coronaviral é uma proteína isolada ou recombinante. Lisboa, 2011-03-04 ΕΡ 1 525 313/ΡΤ 1/40 FIGURA 1 ctcagatgaa tttgaaat-at gctattagtg ctaagaafcag agccçgcacfc gttgctggfcg 60 tttccacact tagtactatg actggoagaa tgtttcatca aaaatgttfcg aaaagtatag 120 cagctaçacg tggtgtcoct gttgttatag gcaccactaa atttfcatggc ggctgggatg 180 atatgccscg tcgccttatt aaagatgtfcg acaatccagt acttatgggt tgggattstc 240 ctaagtgtga 250 FIGURA 2 QMNLKYAISA KNRARTVâGV SILSTMTGRM FHQKCLKS2A ATRGVPVVIG TTKFYGGWDD 60 mlrrlikdvb NPVLmmYP kce S4 ΕΡ 1 525 313/ΡΤ 2/40 FIGURA 3 (Página 1 de 2) atgttttfcga tacttttaat; ttccttacca atggcttttg ctgttatsgg agat.tt.aaag SO tgtactacgg tttccatcaa tgstgttgac accggngqtc cttctattag cactgatgtt 120 çÍ'cgatgtts ctaatggttt sggtaeitat tatgttttsg atcgtgtg^a tttaaatact 180 acattgttgc ttaafcggtta teaixetset tcaggttcta catatcgtaa tâtggcactg 240 aagggaactt tacfcattgsg cacaetatgg tttaaaccac cafcfctetttc tgattttatt 300 gatggtgfctt ttgctaaggt gaaaaatacc aaggttatta aagatggtgt agtgtatagc 360 gaqttteetg ctatãactat aggtagtact tttçtaaata catcctafcag tgtgatagta 420 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    ΕΡ 1 525 313/ΡΤ S=! <υ ο Ρη 35/40 FIGURA 12 ω ο3 t » e i ί >

    Grupo 1 Grupo 2 (Positivo à entrada) (Negativo à entrada) ΕΡ 1 525 313/ΡΤ 36/40 FIGURA 13 TATCGCAGCC mcmtGT TSATGTACCA ΪΑΤ6ΤΤΤΑΪΑ ATGGCJCTGC ACAATCIACA 60 GCTCTTTGTA AATCTGGTAS TTtSGTTCTT AATMCCCT6 CATATAÍAGC TCGTGMGCT 120 AATTTTGGGG ΑΤΤΑΪΪΑΤΤΑ TAÃGGTTGAA GGTGATTTCT ATTTGTCAGG TTGTGAC6&6 180 TATATCGTAC C&CTTTGXAT YTTTAACGGC MGTTXTIGT CGAATACMA GXftTTATGAT 240 GATAGTCAAT ΑΤΤΑΪΤΓΤΑΑ TAAAS&CACT GGTGTTATTT ATGGTTTCM TTCTACTGM 300 ACCATTAACA CTGGTTfISA TTTTAATT3T CATTAÍTIAC WXACCCTC TGGTAATTAT 360 TXAGCCATTT CAARTGAGCT ATTGTXAACT GTTCCIACGA AAGCAATCTG TCTTAATAAG 420 CGTMGGATT TTACfiCCTGT ACAG6TTSTT GACTCGCGGT GGAACMIGC CAGGCAGTCT 480 GATAACAtGA CGGCGG 497 FIGURA 14 YRSJjYFViíYP YVYHSSAQST ALCKSGSLVI N8PAY2AREA SFGOYYYKVE ADFYiSGCDfi 60 YimCXfVG KFLSKTKYYD DSQYYFMDT GVIYGFNSTE TINTGFDF19C HYU&PSSSY 120 XAISNBLLLT VPTKAICLNK RKDFTPVQVV DSRWHHAHQS DBMTA 165 ΕΡ 1 525 313/ΡΤ 37/40 FIGURA 15 (Página 1 de 2) CRCV BCV OC43 HECV HEV TATCGCAGCCTTÃCTTTTGTTAAIGTACCATATGTTTATAATGíJCIÇTGCACAftTCTACA TATCGCAGCCTTÃCmTGTÍfiA^mCCAT&TGTTTATMTGGCTCTGCACAATCTACÃ TATCGCAGCCTTACTTTTGTTAATGTACCATATGTmTAflTGGCTCTGCACAATCTACA TATCGCAGCCmCTTTTGTTAATGTACCATATCTTTACMTGGCTCTGCACARTCIACA TATCGCAGTCTTACTfTAGTTAAXGTGCCATACGTXTACAATGGGTCAGCTCAACCCACC * ΐ? 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    gene de Spike 3 1 3 /PT Spl Sp2

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