CN101376900A

CN101376900A - 一种恒化高密度培养趋磁细菌高产磁小体的方法

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Publication number: CN101376900A
Application number: CNA2008102234997A
Authority: CN
Inventors: 姜伟; 刘阳; 张扬; 李颖; 关国华; 田杰生; 李季伦
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2008-09-28
Filing date: 2008-09-28
Publication date: 2009-03-04
Anticipated expiration: 2028-09-28
Also published as: CN101376900B

Abstract

本发明提供了一种恒化高密度培养趋磁细菌高产磁小体的方法，它采用深层发酵培养法培养趋磁细菌，发酵培养基中含有碳源、氮源和铁源，在发酵过程中分阶段控制溶解氧，并通过调节pH值进行补料。该方法实现了趋磁细菌的恒化高密度培养和磁小体的大量生产，培养36～48小时的细胞密度为12OD_565nm，磁小体干重为80～100mg/L，并缩短了发酵周期。该方法为细菌磁小体的工业化生产奠定了坚实的基础。

Description

一种恒化高密度培养趋磁细菌高产磁小体的方法

技术领域

本发明涉及纳米生物技术研究领域，具体地涉及一种恒化高密度培养趋磁细菌，高产磁小体的方法。

背景技术

趋磁细菌是一类在胞内形成纳米磁小体的特殊细菌，其形成的磁小体具有晶型稳定、体积小、有外膜包被而不易团聚等特点，在免疫检测、固定化酶、核酸分离纯化等方面显示出优于其它材料的优势，特别是在肿瘤的靶向和基因治疗上具有重要的应用前景。

但由于趋磁细菌培养困难，难以通过大量培养趋磁细菌获得足够的磁小体用于基础及应用研究，磁小体至今仍未商业化应用。趋磁细菌大量培养的问题主要体现在如下三个方面：(1)培养周期长，根据文献报道的最短培养时间为50小时，最长的达10天之久；(2)由于所使用培养基中碳、氮源浓度的限制，致使培养密度不高，磁小体产量很低；(3)细胞密度和磁小体产量之间的关系有待于进一步协调，在某些条件下细胞密度得到了明显提高，但磁小体的产量并不随之增加。

本发明着眼于上述问题，深入研究了培养基组分、溶解氧等因素对趋磁细菌生长和磁小体合成的影响，摸索出最佳培养条件，实现了通过高密度培养趋磁细菌来大量生产磁小体的目的。

发明内容

本发明的目的是提供一种恒化高密度培养趋磁细菌、高产磁小体的方法，以实现趋磁细菌的高密度培养和磁小体的大量生产。

本发明提供了一种恒化高密度培养趋磁细菌、高产磁小体的方法，它采用深层发酵培养法培养趋磁细菌，发酵培养基中含有碳源、氮源和铁源，在发酵过程中分阶段控制溶解氧在0～2250ppb，并通过补料控制pH值在6.5～7.5。

其中，所述发酵培养基中的碳源是1～30mmol/L的乳酸钠，氮源是3～18mmol/L的铵盐或硝酸盐，铁源是20～500μmol/L的柠檬酸铁。实验证明，相对于硝酸盐，铵盐更有利于细胞生长，因此，所述氮源优选铵盐，如氯化铵。

发酵前期控制溶解氧为5～2250ppb，以促进细胞快速生长；然后随着细胞的生长，溶液内的溶解氧逐渐消耗至0，此后始终控制溶解氧为0，便于胞内磁小体的积累。

发酵过程中pH值的控制范围为6.5～7.5，通过补料调节pH可以实现恒化培养，使发酵培养基中的营养物质始终处于恒定水平，维持细胞的快速生长和磁小体的大量合成，实现磁细菌的高密度培养和高磁小体产量。

其中，所述补料使用的溶液含有铵盐、柠檬酸铁、乳酸钠和乳酸。铵盐优选氯化铵，优选地，补料溶液中各组分的浓度分别为：氯化铵20～100g/L，柠檬酸铁1～10g/L，乳酸钠50～200g/L，乳酸20～200g/L。更优选地，补料溶液中各组分的浓度分别为：氯化铵50～60g/L，柠檬酸铁4～6g/L，乳酸钠100～140g/L，乳酸40～60g/L。

实验证明，低浓度碳源有利于磁细菌细胞的快速生长和磁小体的合成，因此发酵过程中恒定的低浓度乳酸钠对于细胞的快速生长、缩短发酵周期是必要的，且磁小体的大量合成与细胞的强生长能力直接相关。本发明在发酵过程中乳酸钠的总浓度恒定控制在2～20mmol/L，柠檬酸铁的总浓度恒定控制在20～500μmol/L。优选地，发酵过程中乳酸钠的总浓度恒定控制在2～5mmol/L，柠檬酸铁的总浓度恒定控制在80～120μmol/L。

本发明的发酵过程参数控制为：培养温度25℃～35℃，pH值6.5～7.5，搅拌转速50～500转/分钟，通气量0.1～25L/min。

发酵培养前，先将菌种活化，制成种子液。采用的培养基为乳酸钠固体和液体培养基，其组分和配比如下：

乳酸钠液体培养基(以1L计)：

矿质元素混合液 5～10ml

柠檬酸铁(0.01mol/L) 2～10ml

80％乳酸钠 0.1～6.5g

NH₄Cl 0.2～1g

K₂HPO₄ 0.5～5g

酵母粉 0.1～5g

MgSO₄·7H₂O 0.1～0.5g

硫代乙醇酸钠 0.01～0.1g

蒸馏水加蒸馏水至1L。

pH 6.5～7.5

其中，矿质元素混合液(Mineral elixir)是根据Wolin E.A.，Wolin M.J.&Wolfe R.S.1963)，J.Biol.Chem.，238，2882-2886公开的方法制成。

乳酸钠固体培养基：按0.75～2％的比例在乳酸钠液体培养基中加入琼脂粉，制成乳酸钠固体培养基。

活化方法如下：

1)用原始菌株在乳酸钠固体培养基平板上划线，培养皿用石蜡膜(parafilm)密封，30℃培养4～7天；

2)挑单菌落，接种至含10ml乳酸钠液体培养基试管中，用硅胶塞封住试管口，30℃，摇床100转/分，培养24小时。

3)从乳酸钠液体培养基试管中取10ml菌液，接种至装有90ml乳酸钠液体培养基的250ml血清瓶中，用硅胶塞封住瓶口，30℃，摇床100转/分，培养24小时。同样条件下活化1～2次，制成种子液，使种子液最终细胞密度为0.8～1OD_565nm。

采用本发明所述的方法，实现了趋磁细菌的恒化高密度培养和磁小体的大量生产，培养36～48小时的细胞密度为12OD_565nm，磁小体干重为80～100mg/L，细胞密度和磁小体产量均超过已有文献报道的最高值，并缩短了发酵周期。不仅如此，恒化培养还有利于简化操作，便于实现操作的自动化，同时可避免培养过程中因碳源缺乏而引起的细胞自溶或生长停止，为细菌磁小体的工业化生产奠定了坚实的基础。

附图说明

图1是摇瓶中不同乳酸钠浓度对磁螺菌生长的影响；

图2是不同氮源对磁螺菌生长的影响；

图3是发酵罐中不同乳酸钠浓度对细胞生长的影响；

图4是42L发酵罐上细胞生长曲线(初始转速100rpm/分，通气量0.3L/分)，■表示细胞生长曲线，●表示溶解氧变化曲线；

图5是42L发酵罐上细胞生长曲线(初始转速200rpm/分，通气量2.0L/分)，■表示细胞生长曲线，●表示溶解氧变化曲线；

图6是42L发酵罐上细胞生长曲线(初始转速200rpm/分，通气量1.0L/分)，■表示细胞生长曲线，●表示溶解氧变化曲线；

图7是42L发酵罐上细胞生长曲线和碳源和铁源浓度变化曲线，▲表示乳酸浓度变化曲线，●表示细胞生长曲线，◆表示Fe³⁺浓度变化曲线；

图8是发酵培养的不同阶段磁螺菌的电镜观察照片，a表示溶解氧下降为0％时，b表示溶解氧下降为0％后的1-2小时，c表示溶解氧下降为0％后的3-4小时，d表示溶解氧下降为0％后的15-16小时，e表示溶解氧下降为0％后的24小时，f表示发酵结束时的磁小体整体照片。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的保护范围。

以下实施例中所使用的药品均为分析纯。

实施例1 趋磁细菌的活化

将原始菌株MSR-1(购自德国微生物菌种保藏中心(DSMZ))活化，使用的乳酸钠液体培养基的成分如下所示：

矿质元素混合液 5ml

柠檬酸铁(0.01mol/L) 6ml

K₂HPO₄ 0.5g

酵母粉(Oxoid) 0.1g

MgSO₄·7H₂O 0.1g

NH₄Cl 0.6g

硫代乙醇酸钠 0.05g

80％乳酸钠 2.25g

蒸馏水 1000ml

pH 7.0

乳酸钠固体培养基：按0.75％的比例在乳酸钠液体培养基中加入琼脂粉，制成乳酸钠固体培养基。

活化和培养方法如下：

用原始菌株在乳酸钠固体培养基平板上划线，培养皿用石蜡膜(parafilm)密封，30℃培养5天。

挑单菌落，接种至含10ml乳酸钠液体培养基试管中，用硅胶塞封住试管口，30℃，摇床100转/分，培养24小时。

从乳酸钠液体培养基试管中取10ml菌液，接种至装有90ml乳酸钠液体培养基的250ml血清瓶中，用硅胶塞封住瓶口，30℃，摇床100转/分，培养24小时。同样条件下活化2次，制成种子液。

实施例2 碳、氮源浓度对趋磁螺菌摇瓶及深层培养的影响

取种子液进行以下实验：

1)摇瓶碳源浓度试验

在250ml血清瓶中分别加入含10、20、30、40、50mmol/L的乳酸钠培养基90ml，接入活化好的种子液，于30℃摇床100转/分培养24小时，测定OD_565nm，结果如图1所示。显然，含有1～30mmol/L乳酸钠的培养基都有促进趋磁螺菌生长的作用，最适合的乳酸钠浓度为20mmol/L，当浓度超过30mmol/L时则明显抑制菌体生长。

2)摇瓶氮源试验

在两只250ml血清瓶中分别加入乳酸钠液体培养基90ml，一组的培养基成分如上所述，另一组是上述乳酸钠培养基中的铵盐被相同氮摩尔浓度的硝酸钠取代的乳酸钠液体培养基，接入活化好的种子液，于30℃摇床100转/分培养，不同时间取样测定OD_565nm，结果如图2所示。显然，在培养前期，铵盐和硝酸钠中的氮作为趋磁螺菌的氮源，具有相同的作用，但在细菌培养后期，硝酸盐对细菌的增长有一支作用。

3)发酵罐中碳源浓度对菌体生长的影响

将600ml种子液加入7.5升自动发酵罐中，进行碳源浓度试验，选用乳酸钠液体培养基，碳源乳酸钠浓度分别为2.3mmol/L、20mmol/L，其它成分不变，培养条件如下：温度30℃，通气量为0.6升/分，搅拌转速200转/分，通过补料液(氯化铵50g/L，柠檬酸铁10g/L，乳酸钠100g/L，乳酸200g/L。)调pH，pH控制在6.5～7.0之间，发酵过程中始终维持发酵罐中的乳酸钠浓度保持恒定，分别在接种后0、4、8、12、16、20、24、26小时取样，测定其浓度，比较趋磁螺菌在不同浓度碳源条件下的生长情况。结果如图3所示，说明在恒定碳源浓度的情况下，培养基中低浓度的乳酸钠(2.3mmol/L)比高浓度的乳酸钠(20mmol/L)生长快。

实施例3溶解氧(DO)与磁螺菌生长和磁小体合成之间的关系

在42L自动发酵罐中，装入27L发酵培养基，该培养基的成分如下：

矿质元素混合液 5ml

柠檬酸铁(0.01mol/L) 6ml

NH₄Cl 0.6g

80％乳酸钠 2.25g

K₂HPO4 0.5g

酵母粉 0.5g

MgSO₄·7H₂O 0.2g

硫代乙醇酸钠 0.05g

蒸馏水 1000ml

接种10％，通空气培养，设定起始0.3L/分的通气量和100转/分的转速以维持溶氧浓度在较低水平，并将此时的溶解氧(DO)设置为100％(500ppb)。在此培养条件下，溶氧在发酵4小时后下降为0％，此时的细胞密度为0.26OD_565nm，为促进细胞生长，在培养14小时、20小时、28小时和40小时时分别提高转速40转，以提高溶氧，但DO始终维持在0％；为了实现细胞的快速生长和磁小体的大量合成，利用将含有氯化铵25g/L，柠檬酸铁2g/L，乳酸钠50g/L，乳酸20g/L的酸性溶液调节pH，将其控制在6.5-7.5，并补充营养物质，实现恒化培养，乳酸钠的总浓度恒定控制在2～15mmol/L，柠檬酸铁的总浓度恒定控制在20～100μmol/L，经过54小时的发酵培养细胞密度可达6.5OD_565nm，整个培养过程中生长曲线及溶氧曲线如图4所示，最终磁小体的产量为40.0mg/L(干重)，生产强度为17.5mg·l^-1·day^-1。在该条件下，由于前期溶氧过低，细胞生长缓慢，延滞期较长(约20小时)。

为提高前期溶氧浓度以缩短生长延滞期，在上述条件基础上，将初始转速和通气提升为200转/分和2.0L/分，并将此时的溶解氧(DO)设置为100％(2250ppb)。在这一培养条件下，20小时后溶氧才下降为0％，此时的细胞密度达到2.4 OD_565nm，为使细胞获得足够的溶氧，在24小时，32小时和42小时分别将通气量提升为4L/分，8L/分和16L/分，但DO始终维持在0％；为了实现细胞的快速生长和磁小体的大量合成，利用将含有氯化铵80g/L，柠檬酸铁85g/L，乳酸钠200g/L，乳酸150g/L的酸性溶液调节pH，将其控制在6.5-7.5，并补充营养物质，实现恒化培养，当乳酸钠的总浓度恒定控制在10～20mmol/L，柠檬酸铁的总浓度恒定控制在400～500μmol/L，经过48小时的发酵培养，细胞密度可达12 OD_565nm，磁小体干重为60.0mg/L，产物的生产强度为30.0mg·l^-1·day^-1。如图5所示，细胞前期的生长速率明显加快，延滞期大大缩短。

由于磁骡菌为微好氧菌，前期溶氧过高，细胞生长同样会受到限制，在前面试验数据的基础上，将初始通气和转速设定为1L/分和200转/分，以适当降低初始的DO水平，并将此时的溶解氧(DO)设置为100％(1200ppb)。在这一培养条件下，12小时后溶氧才下降为0％，在发酵过程的20小时调整通气量为2L/min，28小时调整转速为300转/分，但DO始终维持在0％；为了实现细胞的快速生长和磁小体的大量合成，利用将含有氯化铵50g/L，柠檬酸铁6g/L，乳酸钠100g/L，乳酸50g/L的酸性溶液调节pH，将其控制在6.5-7.5，并补充营养物质，实现恒化培养，当乳酸钠的总浓度恒定控制在2～5mmol/L，柠檬酸铁的总浓度恒定控制在80～120μmol/L，经过36小时的发酵培养，细胞密度可达12 OD_565nm，磁小体干重为80.0mg/L，产物的生产强度为53.3mg·l^-1·day^-1。图6是生长过程中细胞密度与溶解氧含量之间的关系，图7是生长过程乳酸钠和柠檬酸铁总浓度的变化和细胞密度之间的关系，如图6和图7所示，通过溶解氧含量和营养物质总浓度控制，细胞在前期的生长速率进一步加快。磁小体产量和生产强度大幅度提高，分别是目前已知报道最高产量的1.92和3.17倍(Jian-Bo S.et al.2008，Appl.Microbiol.Biotl.，79(3)，389-397)。

为了解溶解氧和磁小体合成之间的关系，在透射电子显微镜下观察了不同DO条件下培养的趋磁螺菌细胞，结果显示，DO不同，磁螺菌合成磁小体的情况也有所差异，如图8所示，在DO下降为0％之前，含有磁小体的细胞很少或没有，极少数含有磁小体的细胞中所含磁小体的数目为5～10个；当DO下降为0％后1-2个小时，100％的细胞内含有磁小体，单个细胞内所含磁性颗粒的数目超20个；在随后的发酵阶段，DO始终控制在0％，细胞中磁小体的个数随发酵时间延长逐渐增多，至发酵结束，100％细胞内合成了磁小体，每个细胞内磁小体数目为30-50个。

实施例4

取MS-1(Magnetospirillum magnetotactic)(购自德国微生物菌种保藏中心(DSMZ))用实施例1的培养基，按实施例1的活化过程活化，制成种子液。

在42L自动发酵罐中，装入27L发酵培养基，接种3L种子液，通空气培养，设定初始转速为200转/分，通气速度2.0L/分，将此时的溶解氧(DO)设置为100％(2250ppb)。在这一培养条件下，20小时后溶氧下降为0％，此时的细胞密度达到2.4OD_565nm，为使细胞获得足够的溶氧，在24小时，32小时和42小时分别将通气量提升为4L/分，8L/分和16L/分，但DO始终维持在0％，补料维持恒化培养，经过48小时的发酵培养，细胞密度可达12OD_565nm，磁小体干重为60mg/L，产物的生产强度为30mg·l^-1·day^-1。

Claims

1、一种恒化高密度培养趋磁细菌的方法，它采用深层发酵培养法培养趋磁细菌，发酵培养基中含有碳源、氮源和铁源，在发酵过程中分阶段控制溶解氧在0～2250ppb，并通过补料控制pH值在6.5～7.5。

2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，利用深层发酵法培养前，先将菌种活化，活化使用的培养基为乳酸钠固体和液体培养基，其组分和配比如下:

乳酸钠液体培养基(以1L计):

矿质元素混合液 5～10ml

柠檬酸铁(0.01mol/L) 2～10ml

80％乳酸钠 0.1～6.5g

NH₄Cl 0.2～1g

K₂HPO₄ 0.5～5g

酵母粉 0.1～5g

MgSO₄·7H₂O 0.1～0.5g

硫代乙醇酸钠 0.01～0.1g

蒸馏水加蒸馏水至1L

pH 6.5～7.5；

乳酸钠固体培养基:按0.75～2％的比例在乳酸钠液体培养基中加入琼脂粉，制成乳酸钠固体培养基。

3、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述碳源是1～30mmol/L的乳酸钠，氮源是3～18mmol/L的铵盐或硝酸盐，铁源是20～500μmol/L的柠檬酸铁。

4、根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述氮源是3～18mmol/L的铵盐。

5、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵前期控制溶解氧为5～2250ppb，当溶解氧的浓度被消耗至0，则此后始终控制溶解氧为0。

6、根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述用于调节pH值的补料溶液含有:氯化铵20～100g/L，柠檬酸铁1～10g/L，乳酸钠50～200g/L，乳酸20～200g/L。

7、根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述补料溶液中各组分的浓度分别为:氯化铵50～60g/L，柠檬酸铁4～6g/L，乳酸钠100～140g/L，乳酸40～60g/L。

8、根据权利要求1任一所述的方法，其特征在于，发酵过程中参数控制为:培养温度25℃～35℃，搅拌转速50～500转/分钟，通气量0.1～25L/min。

9、根据权利要求1所述的方法，其特征在于发酵过程中乳酸钠的总浓度恒定控制在2～20mmol/L，柠檬酸铁的总浓度恒定控制在20～500μmol/L。

10、根据权利要求9所述的方法，其特征在于发酵过程中乳酸钠的总浓度恒定控制在2～5mmol/L，柠檬酸铁的总浓度恒定控制在80～120μmol/L。