CN101358178B - 一种培养光合细菌的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种培养光合细菌的方法，属于生物技术领域。本发明采用大型水泥池作为培养容器，用透明的塑料薄膜将水泥池内的光合细菌液体培养物表面覆盖密封，在平均温度大于20℃太阳光照射下进行光合细菌的培养。培养开始后每天取样测定光合细菌培养物的pH，通过添加5％到30％浓度的乙酸溶液并进行搅拌均匀后，使光合细菌培养物的pH降低至7.0。本发明既能够大规模培养光合细菌，又能使光合细菌快速持续生长，最终培养获得沼泽红假单胞菌细胞干重浓度为1.8g/L，对应细胞浓度达到了81.8×10⁸/ml，实现了快速、高效和大规模产业化培养高细胞浓度光合细菌的目的。

Description

一种培养光合细菌的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别是提供了一种大规模培养高细胞浓度光合细菌的方法。

背景技术

光合细菌(Photosynthetic Bacteria)是一大类能在厌氧光照条件下进行不产氧光合作用的原核生物的总称，属于革兰阴性菌，分为红螺菌科(Rhodospirillaceae)、着色菌科(Chromatiaceae)、绿菌科(Chlorobiaceae)和绿色丝状菌科(Chloroflexaceae)4个科，菌细胞主要分为杆状和球形2种不同形态，是地球生命起源的先锋物种之一。其中红假单胞菌(Rhodopseudomonas)和紫色无硫菌(Rhodospirillaceae)是产业化生产较多的光合细菌菌种。光合细菌的蛋白质含量高达60％以上，同时富含可以作为细胞代谢激活剂和天然抗氧化剂的辅酶Q10(泛醌)及具有抗癌作用的类胡萝卜素，具有重要的营养和药用价值。目前，光合细菌在畜禽饲料添加剂促进动物生长、处理高浓度有机废水、水产养殖水质的净化和农业高效活性菌肥等方面都发挥了越来越重要的作用。

国内外研究现状显示，目前光合细菌主要有动态和静置2种培养方式，培养装置有开放和密闭2种类型。国外有采用透光的密闭式光生物反应器动态连续培养光合细菌的报道，但在国内多采用玻璃缸和塑料桶在光照下静置密闭培养。动态密闭培养一般在透光的反应器内进行，为了保持培养物能够得到充分的光照，通过泵使光合细菌液体培养物流过螺旋透光的玻璃管。对于静置封闭培养光合细菌的规模生产工艺一般分为四级培养，分别是一级试管种的转接和纯化；二级锥形瓶培养，培养体积1～5升；三级扩大培养，培养体积25～50升；四级扩大培养，培养体积为100～500升。

虽然光合细菌的生产方法有很多种，但是到目前为止还多限于采用玻璃缸和塑料桶在光照下静置密闭的小规格培养方式，如何大规模培养光合细菌是制约光合细菌培养与应用的瓶颈问题。由于光合细菌生长过程中机体内发生的生物化学反应是酶促反应，而酶促反应都有一个最合适的pH值范围。溶液pH值的改变将直接影响酶的活性中心的存在形式，改变底物分子和酶分子的带电状态，从而影响酶与底物的结合。光合细菌培养的最适pH在7.0左右，过高或过低的pH值将会影响酶的稳定性，进而使酶遭到破坏，导致光合细菌生长速率降低。我国企业生产的光合细菌细胞浓度一般仅维持在30亿/毫升左右，pH过高是限制光合细菌达到快速可持续生长的一个重要原因。因此在大规模培养条件下，研究确定既可以使光合细菌能够快速生长，同时又能够维持培养物pH的稳定，是实现高水平光合细菌产业化生产的重要研究内容。

发明内容

本发明的目的在于提供一种大规模培养高细胞浓度光合细菌的方法，不仅提高光合细菌的培养规模，而且可以保持光合细菌的快速生长，以提高产业化生产光合细菌的产量和质量。

本发明采用水泥池作为光合细菌的培养容器，配制1200升到6000升液体培养基，按照15％的体积比接种180升到900升光合细菌菌种液后，用透光塑料薄膜将光合细菌液体培养物覆盖密封，使薄膜与液面紧贴保持无气体交换的厌氧状态，同时避免空气中的灰尘等洒落于培养物中。在平均温度大于20℃太阳光照射下进行培养。

接种培养光合细菌后，每天取样检测培养物的pH值，通过添加5％到30％浓度的乙酸溶液并迅速搅拌均匀，使光合细菌培养物pH降低到7.0。

所述水泥池的长为4～6米，宽为3～5米，高为0.1～0.3米。

本发明利用大型水泥池，借助自然的太阳光照射，在平均温度20℃以上条件下，采用单一培养容器对光合细菌进行1.0m³以上体积的大规模培养。当乙酸钠作为碳源培养光合细菌过程中，会导致培养物pH的快速升高，使光合细菌的生长受到明显抑制。通过在培养物中添加乙酸，一方面可以降低光合细菌培养物的pH值，使其维持在光合细菌生长的最适范围内，另一方面乙酸可以作为光合细菌生长的碳源，可以保证光合细菌的快速持续生长，实现了光合细菌的大规模产业化生产。

本发明的优点在于：单一培养容器每次培养光合细菌体积达到了1.0m³以上，采用每天添加乙酸回调pH至7.0的控制，实现了光合细菌持续快速的生长，是一种快速、高效培养生产高细胞浓度光合细菌的有效方式。

附图说明

图1是利用构建的水泥池培养沼泽红假单胞菌，每天添加或不添加乙酸降低沼泽红假单胞菌培养物pH至7.0条件下，沼泽红假单胞菌的生长曲线。其中，横坐标为时间，单位：天；纵坐标为沼泽红假单胞菌细胞干重浓度，单位：g/L。

图2是利用构建的水泥池培养沼泽红假单胞菌，每天添加或不添加乙酸回调pH至7.0条件下，沼泽红假单胞菌培养物中pH的变化。其中，横坐标为时间，单位：天；纵坐标为大池内沼泽红假单胞菌培养物的pH。

具体实施方式

首先在构建的长5米，宽4米，高0.3米的水泥池中，采用自来水配制液体培养基，其组成为(g/L)：NH₄Cl1.5，KH₂PO₄1.5，MgSO₄7H₂O0.8，NaCl4.0，NaHCO₃1.8，CaCl₂0.01，VB0.1，酵母粉1.0，乙酸钠4.0，微量元素液1.0ml/L。微量元素液包括(mg/L)：FeCl₃6H₂O5.0，CuSO₄5H₂O0.05，H₃BO₃1.0，MnCl₂4H₂O0.5，ZnSO₄7H₂O1.0，CoCl₂6H₂O0.5。按照配方在水泥池内配制光合细菌培养基3500升后，按照15％的比例接种525升培养好的沼泽红假单胞菌液，采用透明的塑料薄膜覆盖于沼泽红假单胞菌培养物表面，在太阳光照射下进行培养。培养过程中每天上午10点取样检测沼泽红假单胞菌培养物的pH，通过喷洒搅拌10％乙酸溶液使沼泽红假单胞菌培养物的pH降低至7.0。

经过5天的培养和添加乙酸进行pH控制，由图1显示：在初始细胞干重浓度都为0.15g/L，对应沼泽红假单胞菌细胞浓度都为6.0×10⁷/ml下，培养5天沼泽红假单胞菌的细胞干重浓度均一直呈现上升趋势。如果每天不添加乙酸回调培养物pH至7.0，虽然培养第2天进入生长指数期，但培养第3天后沼泽红假单胞菌的生长速度明显降低，培养第5天仅获得沼泽红假单胞菌细胞干重浓度1.4g/L，对应沼泽红假单胞菌细胞浓度63.6×10⁸/ml。如果每天添加乙酸回调培养物pH至7.0，培养第2天进入生长指数期，第4天后进入生长稳定期，第5天获得沼泽红假单胞菌细胞干重浓度1.8g/L，对应沼泽红假单胞菌细胞浓度达到了81.8×10⁸/ml。比不添加乙酸回调培养物pH至7.0条件下提高了沼泽红假单胞菌生物量达28.6％。从图2中可以看出，在不添加乙酸回调pH至7.0条件下，随着时间的延长培养物的pH在不断的升高，培养第3天pH上升到8.8，过高的pH已经明显抑制了沼泽红假单胞菌的生长(图1)，培养第5天pH更进一步提高到了9.3。而在每天添加乙酸回调pH至7.0条件下，虽然沼泽红假单胞菌培养物中pH也都在增加，但pH范围始终维持在8.5以下，没有对沼泽红假单胞菌的生长产生明显的抑制，培养第5天获得沼泽红假单胞菌细胞干重浓度1.8g/L(图1)，对应沼泽红假单胞菌细胞浓度达到了81.8×10⁸/ml。因此每天添加乙酸回调pH至7.0，可以培养出高细胞浓度的沼泽红假单胞菌，在产业化培养出高质量光合细菌方面具有重要的应用价值。

Claims (2)

1.一种培养光合细菌的方法，其特征在于：采用水泥池作为光合细菌的培养容器，配制1200升到6000升液体培养基，按照15％的体积比接种180升到900升光合细菌菌种液后，用透光塑料薄膜将光合细菌液体培养物覆盖密封，使薄膜与液面紧贴保持无气体交换的厌氧状态，在平均温度大于20℃太阳光照射下进行培养，接种培养光合细菌后，每天取样检测培养物的pH，通过添加5％到30％浓度的乙酸溶液并迅速搅拌均匀，使光合细菌培养物pH降低到7.0。

2.按照权利要求1所述的培养光合细菌的方法，其特征在于：所述水泥池的长为4～6米，宽为3～5米，高为0.1～0.3米。

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