KR102085101B1 - L-아스코르브산에 특이적으로 결합하는 압타머 및 그 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 L-아스코르브산에 결합하여 산화를 억제하는 단일 가닥 DNA 압타머에 있어서, 상기 단일가닥 DNA 압타머는 하나 이상의 스템-루프(stem-loop) 구조를 가지며, 상기 스템-루프 구조 중 스템 구조 끝에 CG 결합을 가지며 루프 구조의 양쪽 시작부분이 G 나 C로 서로 마주 보고 있는 것을 특징으로 하는 단일 가닥 DNA 압타머에 관한 것이다. 본 발명의 압타머는 비타민C의 산화방지 효과를 가지며, Vitamin C에 선택적으로 결합하는 압타머를 이용해 Vitamin C의 환원 상태를 유지해서 그 항산화 기능을 장기간 유지하게 하여 다양한 제형의 기능성 화장품과 경구용 영양보조제 및 식품 등에 이용할 수 있으며, Vitamin C에 선택적으로 결합하는 압타머를 이용해 미세량의 Vitamin C로도 지속적이고 극대화된 항산화 효과를 기대할 수 있다.

Description

L-아스코르브산에 특이적으로 결합하는 압타머 및 그 용도{An aptamer specifically binding to L-Ascorbic acid and use of the same}
본 발명은 L-아스코르브산에 특이적으로 결합하는 압타머 및 그 용도에 관한 것이다.
항산화 물질들 중 대표적인 성분의 하나인 L-Ascorbic acid (Vitamin C, 이하 'AA'라고 함)는 그것의 자유기의 중성화를 통한 항산화활성으로 인하여 의약, 화장품 및 식품과 음료 산업에서 널리 사용되고 있다. 식품 보조제 및/또는 의약적 활성 성분으로 사용될 때 AA의 이점은 산업 재해(타이어 및 고무 공장 화장품 제조 공장)에서 발생할 수 있는 ZnONPs 흡입으로 인해 생기는 급성 폐 세포 산화과정에 AA를 첨가한 식수를 공급하여 억제한다고 보고되었다. 수십 조원 규모에 이르는 이들 산업에서는 주요 해결책으로 비타민 C가 공통적으로 사용되는 것으로 알려졌다.
AA는 그 항산화 능력으로 인해 본질적으로 산화에 의하여 쉽게 분해될 수 있다. AA의 산화에 영향을 미치는 주요 인자는 온도, pH, 산소, 금속 이온, 빛 및 효소 등이다. AA를 주성분으로 사용하는 산업에서는 이러한 산화 분해되는 특성으로 인해 생산품의 저장 기간 및 효과에 모두 영향을 미치기 때문에 당면한 문제로 오랫동안 인식되어 왔다. 따라서 이들 산업에서 AA의 산화적 분해에 대한 이해뿐만 아니라 새롭고 더 우수한 방법을 개발하고 발견하는 것에 많은 연구와 비용이 투자되고 있다.
한편 노화를 촉진하는 원인들은 여러 가지가 있으나 그 중에서도 활성 산소계(Reactive Oxygen [0004] species: ROS)가 상당히 주요한 원인 중 하나인 것으로 받아들여지고 있다. 이러한 활성 산소는 에너지 대사과정, 면역 반응 등에서 필수 불가결하게 생성되며, 외부의 유해 환경에 의해서도 유발되는 피할 수 없는 자극이다. 활성 산소는 반응성이 매우 커서 체내에서 DNA 변성, 과도한 신호전달 유발 및 단백질 변성 등을 초래하여 건강에 해로운 영향을 누적하는 일련의 반응을 일으키게 된다. 그러나 이러한 유해한 반응들은 생체 내에 존재하는 항산화 물질(uric acid, vit.C, vit.E 등) 또는 항산화 효소(Glutathione peroxidase, superoxide dismutase, catalse 등)에 의해 정교하게 그 항상성을 유지하도록 되어 있다. 그러나 내인성 노화에 따른 항산화 시스템의 노쇠와 지속적인 유해 자극에 의한 활성 산소의 축적은 이러한 균형을 깨뜨려 건강을 해치게 되며 노화를 촉진시키고, 피부질환, 피부암, 동맥경화 및 혈전과 같은 각종 질병을 유발하기도 한다(Laure Rittie et al., Ageing Research Reviews, 1, 705-720, 2002; Cutler RG, Annals of the New York Academy of Sciences, 1055, 93-135, 2005).
따라서, 활성 산소계의 형성을 억제하거나, 형성된 활성 산소계를 제거하는 항산화 물질에 대한 관심이 날로 증가하고 있다. 항산화 물질은 인체 내에 자연적으로 존재하는 것과 외부에서 투여해 주는 것으로 나눌 수 있는데 인체 내에 자연적으로 존재하는 항산화 물질로는 과산화 억제효소(superoxide dismutase, SOD), 글루타치온(glutathione), 퍼옥시다아제(peroxidase) 및 카탈라아제(catalase) 등의 효소가 있으며, 외부에서 투여해 주는 것으로는 캠프페롤(kaempferol), 카테킨(catechin) 및 제니스테인(genistein) 등의 피토케미컬(phytochemical); 비타민 E, 비타민 C 및 베타카로틴; 및 셀레니움 등의 미네랄이 있다.
햇빛으로부터 조사되는 자외선A (UVA)와 자외선B (UVB), 공해물질, 스트레스, 흡연, 음주, 지방성 음식물 등으로 인해 발생되는 유리기 (free radical)와 활성산소 (oxygen free radical) 등에 의해 세포는 공격을 받으며, 이런 물질들로 부터 적절한 보호가 이루어 지지 않을 경우 세포는 노화하거나 사멸하게 된다. 피부의 경우 이런 물질들로 인해 콜라겐이나 엘라스틴 등의 물질의 생산이 줄어들거나 변성되어서 피부가 탄력을 잃고 주름이 생기게 된다. 이를 방지하기 위해 Vitamin A, C, E 등의 항산화 물질들을 포함한 제제를 피부에 도포, 피부 내로 흡수시킴으로써 이러한 유해 활성물질에 의한 산화를 막는 것이 피부의 노화를 막는 데에 중요한 것으로 공지되어 있다. 하지만 합성 Vitamin C는 공기 중에서 쉽게 산화되어 그 항산화 작용이 사라지게 되는 문제점으로 인해 보관기간이 긴 다양한 제형을 제조하는데 문제가 있다.
또한 환원력이 매우 높은 비타민C는 산화전위가 높은 물질에 매우 민감하게 반응하여 비타민C가 급속히 산화된다. 비타민C는 산화됨으로써 그 효능이 훼손됨은 이미 잘 알려진 사실이다 물은 산화전위가 높아서 비타민C가 매우 민감하게 반응하여 급속히 산화된다.
따라서 비타민 C를 포함하는 항산화 물질의 산화를 억제하는 새로운 방법 내지는 물질에 대한 필요성은 오랫동안 존재하여 오고 있다.
또한 압타머를 이용하여 항산화 물질의 산화를 방지하는 것은 기존의 방법에 비교하여,　안전하고 혁신적인 새로운 개념의 접근으로서, 이를 각종 산업에 적용하여 효과를 극대화할 수 있도록 제조가 가능하다. 특히, 기존의 Chemical 기반의 화장품, 영양보조제, 식품 시장을　획기적으로 　DNA(BIO) 기반의 　시장으로 변화시키는 기폭제가 될 것이다. 또한 각종 산업 부분에서 다양하게 이용될 수 있다 향후, DNA 시장의 폭발적인 증가와 혁신적인 솔루션을 제공할 것으로 예상된다.
[선행 특허 문헌]
대한민국 공개특허 제10-2018-0054508호
본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 비타민 C에 특이적으로 결합하여 산화를 방지하는 신규한 압타머를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 신규 압타머의 용도를 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 L-아스코르브산에 결합하여 산화를 억제하는 단일 가닥 DNA 압타머에 있어서, 상기 단일가닥 DNA 압타머는 하나 이상의 스템-루프(stem-loop) 구조를 가지며, 상기 스템-루프 구조 중 스템 구조 끝에 CG 결합을 가지며 루프 구조의 양쪽 시작부분이 G 나 C로 동일 염기가 서로 마주 보고 있는 것을 특징으로 하는 단일 가닥 DNA 압타머를 제공한다.
본 발명의 압타머는 상기 스템 루프 구조 중 스템 구조 끝에 CG결합을 가지고 루프 구조의 시작 부분 중 한 방향의 G 또는 C 염기가 T로 치환된 2차 구조를 가진 단일가닥 DNA 압타머를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서 상기 압타머는 서열번호 1 내지 29에 기재된 염기서열 중 하나로 이루어진 것이 바람직하고, 상기 압타머는 서열번호 1, 서열번호 4, 서열번호 5, 및 서열번호 17 내지 29에 기재된 염기서열 중 하나로 이루어진 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또 본 발명은 상기 본 발명의 압타머를 유효성분으로 포함하는 항산화용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 비타민 C에 상기 본 발명의 압타머를 처리하여 상기 비타민 C의 산화를 억제하는 방법을 제공한다.
본 발명을 통하여 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 압타머는 비타민C의 산화방지 효과를 가지며, Vitamin C (ascorbic acid)에 선택적으로 결합하는 압타머를 이용해 Vitamin C의 환원 상태를 유지해서 그 항산화 기능을 장기간 유지하게 하여 다양한 제형의 기능성 화장품과 경구용 영양보조제 (dietary supplements) 등에 이용할 수 있으며, Vitamin C 에 선택적으로 결합하는 압타머를 이용해 작은 양의 Vitamin C 로도 지속적이고 극대화된 항산화 효과를 기대할 수 있으며, Vitamin C (ascorbic acid)에 선택적으로 결합하는 압타머를 이용해 Vitamin C 등 생리활성 성분의 환원 상태를 유지해서 그 항산화 기능을 장기간 유지하게 하여 다양한 건강 음료, 항산화 음료 및 항산화 식품 등에 이용할 수 있다.
또한 압타머를 이용하여 항산화 물질의 산화를 방지하는 것은 기존의 방법에 비교하여,　안전하고 혁신적인 새로운 개념의 접근으로서, 이를 각종 산업에 적용하여 효과를 볼 수　있도록 제조가 가능하다. 특히, 기존의 Chemical 기반의 화장품, 영양보조제, 식품 시장을　획기적으로 DNA(BIO) 기반의　시장으로 변화시키는 기폭제가 될 것이다. 향후, DNA 시장의 폭발적인 증가와 혁신적인 솔루션을 제공할 것으로 예상된다.
도 1은 단일가닥 DNA 라이브러리 분리에 이용한 12 % native gel 전기영동 사진이다. 파란색 사각형으로 표시된 밴드를 절단하여 크러쉬 앤 소크 방법으로 정제하였다.
도 2는 단일가닥 DNA의 ascorbic acid 산화 방지 효과 확인을 위한 OPDA 측정 그래프이다. 서열번호 1과 서열번호 4, 서열번호 5의 단일가닥 DNA에서 산화 방지 효과가 관찰되었다.
도 3은 선별된 단일가닥 DNA의 MST(Microscale Thermophoresis)측정 결과 그래프이다. Kd(결합 해리상수) 측정결과 서열번호 1과 서열번호 4, 서열번호 5의 단일가닥 DNA에서 나노몰(Nano molarity, nM)수준으로 결합력이 확인되었다.
도 4는 M-fold 프로그램을 이용한 압타머의 2차 접힘 구조이다. 서열번호 1과 서열번호 4, 서열번호 5의 stem-loop 구조로 stem 구조 끝에 CG결합을 가지며 loop 구조의 양쪽 시작부분이 G 나 C로 서로 마주 보고 있는 공통적인 특징을 지닌다. (붉은색 사각형)
도 5는 stem-loop 구조를 포함한 임의 서열 13개의 OPDA 측정 그래프이다. 특정 stem-loop 구조를 포함한 13개의 서열에서 ascorbic acid의 산화 방지 효과가 관찰되었다.
도 6은 산화 방지 효과가 확인된 서열번호 1번과 4, 17, 18의 OPDA 측정 비교 그래프이다. 임의의 서열로 합성한 서열번호 17번의 압타머 서열이 산화 방지 효과가 가장 큰 것으로 관찰되었다.
도 7은 산화 방지 효과가 확인된 서열번호 17과 18의 MST 측정 결과 그래프이다.
이하 본 발명을 비한정적인 실시예를 통하여 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.
실시예 1: 단일가닥 DNA 라이브러리 제작
SELEX 방법을 이용하여 L-Ascorbic acid에 특이적으로 결합하는 단일가닥 DNA 압타머를 선별하기 위해 단일가닥 DNA 라이브러리를 제작하였다. 단일가닥 DNA 라이브러리 서열은 5'과 3'에 각각 15개의 특정 프라이머 서열을 포함시키고 30개의 무작위 서열을 가지도록 설계하여 총 60개의 염기로 구성하였다.
설계된 상기 단일가닥 DNA 라이브러리는 아래와 같다.
5'-ATGCGGATCCCGCGC-N30-GCGCGAAGCTTGCGC-3'(단일가닥 DNA 라이브러리 서열;서열번호 30)
합성된 상기 서열번호 30 염기서열의 단일 올리고 뉴클레오티드 단편을 주형으로 이용하여 비대칭 PCR 과정으로 단일가닥 DNA 라이브러리를 증폭하였다. 비대칭 PCR을 실시하기 위해 Primer 1과 2를 제작하였다.
상기번호 Primer 1과 2의 염기 서열은 아래와 같다.
5'-ATGCGGATCCCGCGC-3'(Primer 1;서열번호 31)
5'-GCGCAAGCTTCGCGC-3'(Primer 2;서열번호 32)
단일가닥 DNA를 대량 증폭하기 위해 10:1의 비율로 Primer 1과 Primer 2를 혼합하여 비대칭 PCR을 실시하였다. 비대칭 PCR 반응은 94 ℃에서 5분간 반응한 후 94 ℃,40초, 55 ℃,40 초, 72 ℃, 30초의 조건으로 45 사이클을 반복하여 실행한 뒤 72℃에서 10분 동안 반응시켜 증폭하였다. 증폭된 PCR 산물은 2.5%의 아가로스 젤에 전기영동하여 육안으로 밴드를 먼저 확인한 후 크러쉬 앤 소크(Crush and Soak)방법으로 분리하였다. PCR 산물은 12% native gel에 전기영동하여 단일가닥 DNA 밴드를 절단한 뒤 크러쉬 앤 소크 버퍼(Crush and Soak buffer)(500 mM NH4OAc, 0.1% SDS, 0.1 mM EDTA)에 용해시켜 에탄올 침전법으로 DNA를 정제하였다. (도 1) 정제된 단일가닥 DNA 라이브러리는 95 ℃에서 5분간 가열한 뒤 상온에서 10분간 접힘 구조를 형성시킨 후 SELEX에 사용하였다.
실시예 2: L-Ascorbic acid에 특이적으로 결합하는 압타머 선별을 위한 SELEX
L-Ascorbic acid에 특이적으로 결합하여 산화를 억제하는 단일가닥 DNA 압타머를 선별하기 위하여 그래핀을 이용한 SELEX(rGO-SELEX) 기술을 활용하였다.(Lee, A. Y., Ha, N. R., Jung, I. P., Kim, S. H., Kim, A. R., & Yoon, M. Y. (2017). Development of a ssDNA aptamer for detection of residual benzylpenicillin. Analytical biochemistry, 531, 1-7.)
이하 그래핀을 활용한 SELEX 방법은 아래와 같다.
먼저 그래핀과 1.5 ml 튜브에 비특이적으로 결합하는 단일가닥 DNA를 제거하기 위하여 200 pmol의 단일가닥 DNA 라이브러리와 4 mg/mL의 그래핀을 Binding buffer(20 mM Tris, pH 8.0)에 혼합하여 30분간 반응시킨 후 두 번의 원심분리로 상층액을 제거하였다. 남아있는 단일가닥 DNA와 그래핀 혼합물에 ascorbic acid를 처리하여 30분 동안 반응시키고 ascorbic acid에 결합한 단일가닥 DNA를 비대칭 PCR 과정으로 증폭하였다. 증폭된 단일가닥 DNA는 12%의 native gel에서 크러쉬 앤 소크(Crush and Soak)방법으로 분리하여 첫번째 SELEX 산물로 얻었다. 위의 과정을 5번 반복하고 5번째 반복한 SELEX 산물을 주형으로 사용하여 대칭적 PCR을 실시하였다. 증폭된 이중가닥 DNA 단편은 NGS(Next Generation Sequencing)기술로 서열을 분석하여 많은 빈도수로 분석되는 서열번호 1 내지 16의 16개 서열을 확인하였다.
실시예 3: Ascorbic acid의 산화 억제효과 분석
압타머에 의한 L-ascorbic acid의 산화 방지 효과를 분석하기 위해 OPDA(O-phenylenediamine) 분석법을 실시하였다. L-ascorbic acid의 산화된 구조인 DHA가 OPDA에 결합하여 형광 발색이 나타나는 원리를 이용하여 압타머에 의한 ascorbic acid의 산화방지 효과를 분석하였다.(Vislisel, J. M., Schafer, F. Q., & Buettner, G. R. (2007). A simple and sensitive assay for ascorbate using a plate reader. Analytical biochemistry, 365(1), 31-39.)
OPDA 분석 과정은 아래와 같다.
SELEX 산물에서 NGS 기술로 분석된 서열의 빈도수와 접힘 구조에 따라 16개의 서열을 합성하였다. 합성된 단일가닥 DNA는 95 ℃에서 5분간 가열하고 상온에서 10분간 반응시켜 접힘구조를 형성시킨 후 1 uM의 단일가닥 DNA와 5 mM ascorbic acid를 혼합하여 30분간 반응시켰다. 이 후 과산화수소수(H2O2)를 첨가하여 산화를 촉진시킨 뒤 OPDA 형광염료를 첨가하여 형광의 세기를 측정하였다. (비특허문헌 3) Control은 합성된 단일가닥 DNA를 첨가하지 않고 Vitamin C만 첨가한 시료로 16개 서열(서열번호 1 내지 16)의 단일가닥 DNA를 각각 처리한 시료보다 빠르게 산화되었다. 16개의 서열 중 서열번호 1과 서열번호 4, 및 서열번호 5의 3가지 단일가닥 DNA에서 L-ascorbic acid의 산화가 방지되는 것을 관찰하였다. (도 2)
.
실시예 4: L-Ascorbic acid와 압타머 서열의 결합력 측정
L-Ascorbic acid에 결합하는 압타머의 결합력을 확인하기 위해 MST(Microscale Thermophoresis) 방법을 이용하여 결합 해리 상수(Kd)를 측정하였다. 단일가닥 DNA의 5'에 Cy5의 형광을 부착시키고 열 구배 조건에서 결합력에 따라 나타나는 신호 차이를 분석하여 결합의 세기를 측정하였다.(Entzian, C., & Schubert, T. (2016). Studying small molecule-aptamer interactions using MicroScale Thermophoresis (MST). Methods, 97, 27-34.)
단일가닥 DNA 압타머의 농도는 5 nM에서 고정하고 ascorbic acid의 농도를 50 uM에서 1.53 nM의 범위로 농도구배를 이루도록 16개의 튜브에 삽입한 후 15분 동안 반응시켰다. 반응한 단일가닥 DNA와 L-ascorbic acid를 스캐닝 모세관 튜브(4 ul/튜브)에 흡입시켜준 후 Mnolith NT.11 기기를 이용하여 측정하였다. 상기 OPDA 방법으로 확인된 서열번호1과 서열번호 4, 서열번호 5의 압타머는 각각 280 nM과 149 nM, 685 nM의 Kd값으로 측정되어 나노몰(Nano molarity, nM) 수준의 결합력을 지니는 것으로 확인하였다. (도 3)
실시예 5: Vitamin C에 특이적으로 결합하는 단일가닥 DNA 압타머의 구조 유사성 분석
결합력이 확인된 서열번호 1과 서열번호 4, 서열번호 5의 단일가닥 DNA 압타머의 2차 구조(Scondary structure)를 확인하기 위하여 M-fold 프로그램을 이용하였다. 서열번호 1의 경우 2가지 형태로 2차 구조 형성할 수 있으며, 서열번호 4와 서열번호 5는 각각 3, 2가지의 형태로 스템-루프(Stem-loop) 구조를 형성할 수 있는 것으로 확인하였다.
이 3가지(서열번호 1과 서열번호 4, 서열번호 5)의 단일가닥 DNA 압타머는 스템-루프 구조 중 스템 구조 끝에 CG결합을 가지며 루프 구조의 양쪽 시작부분이 G 나 C로 서로 마주 보고 있는 공통적인 특징이 있다. (도 4, 붉은색 사각형) 확인된 3가지의 압타머의 구조는 -3.65와 -1.64, -0.86(kcal/mol)의 깁스 자유에너지 값을 가진 안정한 구조를 이루고 있다.
실시예 6:13가지 변형 서열의 산화 방지 효과 측정
압타머의 접힘 구조 분석을 통하여 확인된 특정 구조 서열을 기반으로 32개의 염기서열을 가진 임의의 서열을 설계하여 단일가닥 DNA를 합성하였다. 스템-루프 구조로 10 개의 염기 서열을 단위체로 구성하여 5'과 3' 양 끝에 1개 내지 2개씩 포함하도록 임의의 단일가닥 DNA를 제작하였다. 총 13가지로 제작한 서열번호 17 내지 29의 단일가닥 DNA의 산화방지 효과를 OPDA 측정법을 통해 확인하였다. (도 5)
13개의 임의 서열은 모두 L-ascorbic acid에 대하여 산화 방지 효과가 있었으며, 5'과 3'의 양 끝에 스템-루프 구조를 가진 서열번호 17의 단일가닥 DNA 압타머가 총 29 가지 서열 (임의에 합성하여 확인한 13개의 서열과 SELEX 과정으로 선별한 16가지 서열) 중 산화 방지 효과가 가장 큰 것으로 나타났다. (도 6)
실시예 7: 변형된 2가지 서열의 Kd 측정 및 비교
임의 서열(서열번호 17 내지 29) 중 산화방지 효과가 크게 확인된 2가지의 서열에 대하여 MST(Microscale Thermophoresis)분석으로 압타머의 결합력을 확인하였다.
OPDA 방법으로 확인된 서열번호 17번과 18번의 서열은 각각 729 nM과 289 nM의 Kd값으로 측정값을 얻었다. (도 7) OPDA 측정법으로 확인된 바와 달리 서열번호 17의 Kd 값이 높게 측정되는 것은 서열번호 17의 압타머가 결합력 자체는 낮으나 -OH작용기에는 더 특이적으로 결합하는 것으로 보인다.
서열번호 5' to 3' 염기 수
(mer)		 비고
서열번호 1 GCACCGACAGGGGAGCGCCTCGCACTGACT 30 ABA1
서열번호 2 GGTGCAAACCAGCGCGCCTCTCTGACGTCG 30 ABA2
서열번호 3 ACGCATGCCGGGCGCGCTCCCTGTCGTCCG 30 ABA3
서열번호 4 CGAGTCAGTGCGAGGCGCTCCCCTGTCGGT 30 ABA4
서열번호 5 GGGTCTGAGGAGTGCGCGGTGCCAGTGAGT 30 AA-001
서열번호 6 GAACCAACGGAAGCGCGGCACCACAACGGT 30 AA-002
서열번호 7 CGCAACCTGTTCGGCAGTGGGCCTCCGGGT 30 AA-003
서열번호 8 GAACTTGCGCACTAGGTGATGCGGATCCCG 30 AA-005
서열번호 9 GAAGCTTGCGCACTAGGTGGTGCGGATCCC 30 AA-006
서열번호 10 GATCAACGGAAGCGCGGCACCACAACGGTA 30 AA-014
서열번호 11 CGAGTCAGGTGGGATGATGTTCGGGGAAGG 30 AA-035
서열번호 12 GGCACAACGGGCGCGCCTCCATGCTGTTCG 30 AAL-001
서열번호 13 TGAACGACGAGGCGCGTCACACTGCGTGCC 30 AAL-002
서열번호 14 CGCAGTGTGACGCGCCTCGTCGTTCACTCG 30 AAL-003
서열번호 15 CACAATCGGGGCGCGCTCGTCCTCTGGCCG 30 AAL-004
서열번호 16 GGAACAACGGGCGCGCCTCCATGCTGTTCG 30 AAL-005
서열번호 17 GTGGAGGCGGTGGCCAGTCTCGCGGTGGCGGC 32 332-2
서열번호 18 GTGGAGGCGGTGGCCGTGGAGGCGGAGGCCGC 32 332-4
서열번호 19 GTGGAGGCGGTGGCCAGTCTGCGGCGCGGCAG 32 332-8
서열번호 20 GGCGGTGGCCCTGCAAGTCTCGCGGTGGCGGC 32 332-11
서열번호 21 GGCGGTGGCCCTGGAAGTCTCGCGGTGGCGGC 32 332-12
서열번호 22 GCGGCGGTGGCCAGAAGTCTCGCGGTGGCGGC 32 332-13
서열번호 23 CGGGCGGTGGCCAGAAGTCTCGCGGTGGCGGC 32 332-14
서열번호 24 GCGGCGGTGGCCTGAAGTCTGGCGGTGGCCCG 32 332-15
서열번호 25 GCGGCGGTGGCCTGAAGTCTGGCGGTGGCCCC 32 332-16
서열번호 26 GCGGCGGTGGCCTGAAGTCTGGCGGTGGCCCA 32 332-17
서열번호 27 GGCGGTGGCCTGGAAGTCTCATGGCGGTGGCC 32 332-18
서열번호 28 GTGGCGGTGGCCAGCATACGGGCGGTGGCCAG 32 332-19
서열번호 29 GTGGCGGTGGCCAGCATAGTGGCGGTGGCCAG 32 332-20
표 1은 본 발명의 압타머 서열을 나타낸 표이다.
<110> Nexmos,Inc. <120> An aptamer specifically binding to Ascorbic acid and use of the same <130> P18-0111HS <160> 32 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer <400> 1 gcaccgacag gggagcgcct cgcactgact 30 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer <400> 2 ggtgcaaacc agcgcgcctc tctgacgtcg 30 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer <400> 3 acgcatgccg ggcgcgctcc ctgtcgtccg 30 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer <400> 4 cgagtcagtg cgaggcgctc ccctgtcggt 30 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer <400> 5 gggtctgagg agtgcgcggt gccagtgagt 30 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer <400> 6 gaaccaacgg aagcgcggca ccacaacggt 30 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer <400> 7 cgcaacctgt tcggcagtgg gcctccgggt 30 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer <400> 8 gaacttgcgc actaggtgat gcggatcccg 30 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer <400> 9 gaagcttgcg cactaggtgg tgcggatccc 30 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer <400> 10 gatcaacgga agcgcggcac cacaacggta 30 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer <400> 11 cgagtcaggt gggatgatgt tcggggaagg 30 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer <400> 12 ggcacaacgg gcgcgcctcc atgctgttcg 30 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer <400> 13 tgaacgacga ggcgcgtcac actgcgtgcc 30 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer <400> 14 cgcagtgtga cgcgcctcgt cgttcactcg 30 <210> 15 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer <400> 15 cacaatcggg gcgcgctcgt cctctggccg 30 <210> 16 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer <400> 16 ggaacaacgg gcgcgcctcc atgctgttcg 30 <210> 17 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer <400> 17 gtggaggcgg tggccagtct cgcggtggcg gc 32 <210> 18 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer <400> 18 gtggaggcgg tggccgtgga ggcggaggcc gc 32 <210> 19 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer <400> 19 gtggaggcgg tggccagtct gcggcgcggc ag 32 <210> 20 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer <400> 20 ggcggtggcc ctgcaagtct cgcggtggcg gc 32 <210> 21 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer <400> 21 ggcggtggcc ctggaagtct cgcggtggcg gc 32 <210> 22 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer <400> 22 gcggcggtgg ccagaagtct cgcggtggcg gc 32 <210> 23 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer <400> 23 cgggcggtgg ccagaagtct cgcggtggcg gc 32 <210> 24 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer <400> 24 gcggcggtgg cctgaagtct ggcggtggcc cg 32 <210> 25 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer <400> 25 gcggcggtgg cctgaagtct ggcggtggcc cc 32 <210> 26 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer <400> 26 gcggcggtgg cctgaagtct ggcggtggcc ca 32 <210> 27 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer <400> 27 ggcggtggcc tggaagtctc atggcggtgg cc 32 <210> 28 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer <400> 28 gtggcggtgg ccagcatacg ggcggtggcc ag 32 <210> 29 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer <400> 29 gtggcggtgg ccagcatagt ggcggtggcc ag 32 <210> 30 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SS DNA library <400> 30 atgcggatcc cgcgcnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnngcgcg aagcttgcgc 60 60 <210> 31 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 31 atgcggatcc cgcgc 15 <210> 32 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 32 gcgcaagctt cgcgc 15

Claims (5)

  1. L-아스코르브산에 결합하여 산화를 억제하는 단일 가닥 DNA 압타머에 있어서, 상기 단일가닥 DNA 압타머는 하나 이상의 GCG(N)nGGC 모티프 패턴의 스템-루프(stem-loop) 구조를 가지며, 상기 스템-루프 구조 중 스템 구조 끝에 CG 결합을 가지며 루프 구조의 양쪽 시작부분이 G 나 C로 동일 염기가 서로 마주 보고 있는 것을 특징으로 하는 단일 가닥 DNA 압타머에 있어서, 여기서 상기 모티프의 N은 G,A,T 또는 C이며, n은 정수로 1 내지 3의 값을 가지며, 서열번호 17, 23 또는 26에 기재된 염기서열 중 하나인 것을 특징으로 하는 단일 가닥 DNA 압타머.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항의 압타머를 유효성분으로 포함하는 항산화용 조성물.
  5. 비타민 C에 제1항의 압타머를 처리하여 상기 비타민 C의 산화를 억제하는 방법.
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