MX2012009352A - "anticuerpos cd20 y su utilización". - Google Patents

"anticuerpos cd20 y su utilización".

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MX2012009352A
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cells
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Jutta Deckert
Lingyun Rui
Peter U Park
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Immunogen Inc
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Abstract

CD20 es una proteína de membrana de la familia tetraspanina expresada en la superficie de las células B y que se encuentra en las células B de la sangre periférica así como también los tejidos linfoides. La expresión CD20 persiste desde la etapa de célula pre-B temprana hasta la etapa de diferenciación de células plasmáticas. De manera inversa, no se ha encontrado en células madre hematopoyéticas, células pro-B, células plasmáticas diferenciadas o tejidos no linfoides. Además de la expresión en células B normales, CD20 se expresa en las enfermedades derivadas de la célula B tales como el linfoma de no Hodgkin (NHL) y la leucemia linfocítica crónica de células B (CLL). Las células de expresión CD20 se conocen por jugar un papel en otras enfermedades y trastornos, que incluye inflamación. La presente invención incluye anticuerpos, formas y fragmentos anti CD20 que tienen propiedades físicas y funcionales superiores, inmunoconjugados, composiciones, reactivos de diagnóstico, métodos para inhibir el crecimiento, métodos terapéuticos, anticuerpos mejorados y líneas celulares; y polinucleótidos, vectores y constructos genéticos que codifican los mismos.

Description

ANTICUERPOS CD20 Y SU UTILIZACIÓN ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las CD20 y las ¡soformas de las CD20 ("CD20") se consideran, por lo general, que son proteínas transmembrana de la familia de las tetraspaninas, las cuales se expresan en la superficie de las células B (Valentín y otros, J. Biol. Chem, 264 (19): 1 1282-11287 (1989); Einfeld y colaboradores, EMBO J., 7 (3): 71 1 -717 (1988)). La CD20 se expresa en la gran mayoría de las células B de la sangre periférica, así como también, en varios tejidos linfoides. La expresión de la CD20, en general, persiste desde la etapa temprana del desarrollo de las células pre-B, hasta la fase de diferenciación del desarrollo de las células plasmáticas (Tedder y colaboradores. J. Immunol., 135 (2): 973-979 (1985)). La CD20 no es expresada, por lo general, por las células madre hematopoyéticas, las células pro-B, las células diferenciadas de plasma, los tejidos no linfoides o similares. Además de ser expresada en las células B normales, la CD20 se expresa también en las neoplasias malignas derivadas de las células B, tales como en el linfoma no-Hodgkin (NHL) y en la leucemia linfocítica crónica (CLL) de células B (Anderson y colaboradores. Blood, 63 (6): 1424-1433 (1984)) y en las células B involucradas en los trastornos inmunes, las enfermedades autoinmunes y las enfermedades inflamatorias.
Aunque la función exacta de la CD20 no es clara, la CD20 está implicada en la movilización del calcio y puede funcionar como un canal de calcio (Tedder y colaboradores, J. Cell Biochem, 14D: 195 (1990)). Las CD20 podrían estar implicadas en la activación y diferenciación de las células B (Tedder y colaboradores. Eur. J. Immunol., 16 (8): 881 -887 (1986)).
El perfil de expresión de la CD20 y el conocimiento de los anticuerpos CD20 existentes han hecho de las CD20 un objetivo de interés para las terapias con anticuerpos. Es sabido en el arte que, en general, los anticuerpos para las CD20 se clasifican según sus propiedades funcionales. Por ejemplo, los anticuerpos de tipo I se caracterizan por su capacidad de distribución de la CD20 en compartimientos de balsas lipídicas y, cuando son quimerizadas, pueden mediar en la citotoxicidad dependiente del complemento ("CDC" (por sus siglas en Idioma Inglés) ) (JP Deans, J Biol Chem 1998; 273: 344-8; Cragg MS, Blood 2003; 101 :1045-52, y Cragg MS Blood 2004;. 103:2738-2743). Los anticuerpos Tipo I, por lo general, no tienen una actividad pro-apoptótica efectiva por sí mismos, a menos que los anticuerpos se encuentren reticulados. Ejemplos de anticuerpos de tipo I que requieren reticulación, son el rituximab y el 2F2 (Cragg y colaboradores, Blood, 101 (3): 1045-1052 (2003) y Teeling y colaboradores, Blood, 104 (6): 1793-1800 (2004)). En contraste, los anticuerpos de tipo II son capaces de distribuir las CD20 en las balsas lipídicas. Si son quimerizados, los anticuerpos de tipo II tienen una actividad CDC limitada. Los anticuerpos de tipo II se caracterizan por su fuerte actividad pro-apoptótica. Los B1 y GA101 son ejemplos de anticuerpos de tipo II (Cragg MS, Blood 2003; 101 :1045-52; Cragg MS, Blood 2004; 103: 2738-2743), y Umana y colaboradores, Blood, 108:72a, Resumen 229 (2006)). Los anticuerpos de Tipo I y de Tipo II, potencialmente, pueden mediar la citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCC, (por sus siglas en Idioma Inglés) ).
Dada la expresión de CD20 en las células no deseadas, tales como en los linfomas de células B, este antígeno es útil para atacar a las células CD20 positivas perjudiciales (por ejemplo, las células de linfoma). En esencia, tales objetivos se generalizan de la siguiente manera: se administran a un paciente los anticuerpos específicos para el antígeno CD20 en la superficie de las células B. Estos anticuerpos anti-CD20 se unen específicamente al antígeno CD20, tanto de las células B normales como de las células B no deseadas (por ejemplo, células B malignas e inmunorreactivas); el anticuerpo unido al antígeno de superficie CD20 puede conducir a la destrucción y depleción de las células B.
De manera adicional, los agentes químicos o los marcadores radiactivos que poseen el potencial para destruir las células tumorales que expresan CD20, pueden ser conjugados con el anticuerpo anti-CD20, de tal manera que el agente sea específicamente "administrado" a las células B neoplásicas. Independientemente del enfoque, el objetivo principal es destruir las células no deseadas; el enfoque específico puede ser determinado por el anticuerpo anti-CD20 particular que se utilice, y por lo tanto, los enfoques disponibles para apuntar a los antígenos CD20 pueden variar considerablemente. El anticuerpo rituximab (RITUXAN ®) es un anticuerpo monoclonal quimérico murino/humano, obtenido por ingeniería genética, dirigido contra la CD20. Rituximab es el anticuerpo llamado "C2B8" en la patente de los Estados Unidos de Norte América No. 5.736.137 (Anderson y colaboradores). El rituximab se encuentra aprobado, en la actualidad, para el tratamiento del linfoma folicular en recaída o refractario (Leget y colaboradores, Curr. Opin. Oncol., 10: 548-551 (1998)). Los informes indican que, mediante infusiones semanales, el rituximab dio como resultado tasas de respuestas globales del 48 %. No obstante, muchos pacientes no responden al tratamiento con rituximab y los pacientes que responden al rituximab eventualmente sufren recaídas y, a menudo, desarrollan resistencia al tratamiento con rituximab. Así, por ejemplo, las recidivas y la resistencia a las terapias corrientes disponibles, hacen necesarias el descubrimiento de nuevos agentes y nuevas terapias dirigidas al CD20.
Debido a las limitaciones de los anticuerpos disponibles, terapias de anticuerpos contra CD20 de siguiente generación se encuentran en desarrollo, destinadas a mejorar los aspectos funcionales específicos del rituximab. Por ejemplo, en el caso del ofatumumab, un anticuerpo monoclonal humano 2F2, se ha reportado una actividad CDC in vitro mejorada, en especial en células que tienen una densidad de antígeno CD20 mas baja (Teeling y colaboradores, J. Immunol., 177(1 ):362-371 (2006)). Se ha reportado que el Afutuzumab o el GA101 proveen una mejora marginal de la actividad pro-apoptótica respecto de la del rituximab in vitro, pero el GA101 no demuestra actividad CDC (Umana P, Blood 2006; 108:72a, Resumen 229 y solicitud de patente WO 2005/044859). Además, el GA101 es un anticuerpo humanizado por glico-ingeniería con mejor actividad ADCC (Umana y colaboradores, Blood :2006; 108:72a, Resumen 229 y WO 2005/044859). Otros compuestos, en varios estadios de desarrollo, han sido reportados para mejorar, de manera marginal, ciertas propiedades intrínsecas del rituximab u otros anticuerpos anti-CD20 conocidos. No obstante, hasta la fecha, no se encuentra disponible ninguna molécula novedosa que posea las características físicas y funcionales únicas como para solucionar los problemas conocidos en el arte.
El rituximab también ha sido aprobado en los Estados Unidos en combinación con MTX para reducir los signos y síntomas en pacientes adultos con RA, moderada, a severamente activa, que hayan tenido una respuesta inadecuada a, al menos, un antagonista TNF. Muchos estudios abordan el uso de rituximab en una variedad de trastornos autoinmunes o inflamatorios no malignos, incluyendo la RA, en los que las células B y los anticuerpos parecen jugar un papel en la fisiopatología de la enfermedad. Edwards y colaboradores, Soc. Biochem. Trans. 30:b824-828 (2002). Se ha informado acerca de la focalización de CD20 con anticuerpos anti-CD20 para aliviar los posibles signos y síntomas de, por ejemplo, RA (Leandro y colaboradores, Ann Rheum Dis. 61 : 883-888 (2002); Edwards y colaboradores, Arthritis Rheum, 46 (Suplemento 9): S46 (2002), Stahl y colaboradores, Ann Rheum Dis, 62 (Supl. 1 ): OP004 (2003); Emery y colaboradores, Arthritis Rheum 48 (9): S439 (2003)), lupus (Eisenberg, Arthritis Res Ther 5: 157-159 (2003), Leandro y colaboradores, Arthritis Rheum 46: 2673 a 2677 (2002); Gorman y colaboradores, Lupus. 13: 312-316 (2004)), púrpura trombocitopénica inmune (D'Arena y colaboradores, Leuk Lymfoma 44:561-562 (2003.), Stasi y colaboradores, Blood, 98: 952-957 (2001 ); Saleh y colaboradores, Semin Oncol, 27 (Supl 12): 99-103 (2000); Zaja y colaboradores, Haematologica, 87: 189-195 (2002); Ratanatharathorn y colaboradores, Ann Int Med,. 133:275-279 (2000)), aplasia pura de células rojas (Auner y colaboradores, Br. J. Haematol, 1 16: 725-728 (2002.)); anemia autoimmune (Zaja y colaboradores, supra (errata aparece en Haematologica 87: 336 (2002)), enfermedad por crioaglutininas (Layios y colaboradores, Leukemia, 15:187-8 (2001 ); Berentsen y colaboradores, Blood, 103: desde la página 2925 hasta la 2928 (2004); Berentsen y colaboradores, Br. J. Haematol, 115: 79-83 (2001 ); Bauduer, Br. J. Haematol, 1 12:1083-1090 (2001 ); Zaja y colaboradores, Br Haematol J., 1 15: 232 - 2330 (2001 )), síndrome de resistencia grave a la insulina tipo B (Coll y colaboradores, N. Engl. J. Med., 350: 310-31 1 (2004), crioglobulinemia mixta (DeVita y colaboradores. Arthritis Rheum. 46 Supl. 9:S206/S469 (2002)), miastenia gravis (Zaja y colaboradores, Neurology, 55: 1062-1063 (2000); Wylam y colaboradores, J. Pediatr, 143: 674-677 (2003)), granulomatosis de Wegener (Specks y colaboradores, Arthritis & Rheumatism 44: 2836-2840 (2001 )), pénfigo vulgar rebelde (Dupuy y colaboradores, Arch Dermatol., 140: 91 -96 (2004)), dermatomiositis (Levine, Arthritis Rheum., 46 (Suplemento 9): S1299 (2002)), síndrome de Sjogren (Somer y colaboradores, Arthritis & Rheumatism, 49: 394-398 (2003.)), crioglobulinemia tipo II mixta activa (Zaja y colaboradores, Blood, 101 : 3827-3834 (2003)), pénfigo vulgar (Dupay y colaboradores, Arch. Dermatol., 140: 91 -95 (2004)), neuropatía autoinmune (Pestronk y colaboradores, J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 74: 485-489 (2003)), síndrome paraneoplásico opsoclono-mioclono (Pranzatelli y colaboradores, Neurology 60 (Suplemento 1 ). P05.128: A395 (2003), y esclerosis múltiple recurrente-recidivante (RRMS) (por sus siglas en Idioma inglés). Croos y colaboradores (resumen) " Preliminary Results from a Phase II Trial of Rituximab in MS " Octava Reunión Anual de los Comités de las Américas para la Investigación y el Tratamiento de la Esclerosis Múltiple, 20-21 (2003).
Entre las patentes y las publicaciones de patentes que hacen referencia a anticuerpos CD20, moléculas que se unen a CD20 y vacunas auto-antígeno se incluyen: U.S. Pat. Nos. 5,776,456, 5,736, 137, 5,843,439, 6,399,061 y 6,682,734, como así también US 2002/0197255, US 2003/0021781 , US 2003/0082172, US 2003/0095963, US 2003/0147885, US 2005/0186205 y WO 1994/1 1026 (Anderson y col.); U.S. Pat. No. 6,455,043, US 2003/0026804, US 2003/0206903 y WO 2000/09160 (Grillo-Lopez, A.); WO 2000/27428 (Grillo-Lopez y White); US 2004/0213784 y WO 2000/27433 (Grillo-Lopez y Leonard); WO 2000/44788 (Braslawsky y col.); WO 2001/10462 (Rastetter, W.); WO 2001/10461 (Rastetter y White); WO 2001/10460 (White y Grillo-Lopez); US 2001/0018041 , US 2003/0180292, US 2002/0028178, WO 2001/34194 y WO 2002/22212 (Hanna y Hariharan); US 2002/0006404 y WO 2002/04021 (Hanna y Hariharan); US 2002/0012665, US 2005/0180975, WO 2001/74388 y U.S. Pat. No. 6,896,885B5 (Hanna, N.); US 2002/0058029 (Hanna, N.); US 2003/0103971 (Hariharan y Hanna); US 2005/0123540 (Hanna y col.); US 2002/0009444 y WO 2001/80884 (Grillo-Lopez, A.); WO 2001/97858; US 2005/01 12060, US 2002/0039557 y U.S. Pat. No. 6,846,476 (White, C); US 2002/0128448 y WO 2002/34790 (Reff, M.); WO 2002/060955 (Braslawsky y col.); WO 2002/096948 (Braslawsky y col.); WO 2002/079255 (Reff y Davies); U.S. Pat. Nos. 6,171 ,586 y 6,991 ,790 y WO 1998/56418 (Lam y col.); US 2004/0191256 y WO 1998/58964 (Raju, S.); WO 1999/22764 (Raju, S.); WO 1999/51642, U.S. Pat. No. 6,194,551 , U.S. Pat. No. 6,242,195, U.S. Pat. No. 6,528,624 y U.S. Pat. No. 6,538,124 (Idusogie y col.); U.S. Pat. No. 7,122,637, US 2005/01 18174, US 2005/0233382, US 2006/0194291 , US 2006/0194290, US 2006/0194957 y WO 2000/42072 (Presta, L); WO 2000/67796 (Curd y col.); WO 2001/03734 (Grillo-Lopez y col.); US 2002/0004587, US 2006/0025576 y WO 2001/77342 (Miller y Presta); US 2002/0197256 y WO 2002/078766 (Grewal, I.); US 2003/0157108 y WO 2003/035835 (Presta, L); U.S. Pat. Nos. 5,648,267, 5,733,779, 6,017,733 y 6,159,730, y WO 1994/1 1523 (Reff y col.); U.S. Pat. Nos. 6,565,827, 6,090,365, 6,287,537, 6,015,542, 5,843,398 y 5,595,721 (Kaminski y col.); U.S. Pat. Nos. 5,500,362, 5,677,180, 5,721 ,108, 6,120,767, 6,652,852 y 6,893,625 así como la WO 1988/04936 (Robinson y col.); U.S. Pat. No. 6,410,391 (Zelsacher); U.S. Pat. No. 6,224,866 y WO00/20864 (Barbera-Guillem, E.); WO 2001/13945 (Barbera-Guillem, E.); WO 2000/67795 (Goldenberg); U.S. Pat. No. 7,074,403 (Goldenberg y Hansen); U.S. Pat. No. 7,151 ,164 (Hansen y col.); US 2003/0133930; WO 2000/74718 y US 2005/0191300A1 (Goldenberg y Hansen); US 2003/0219433 y WO 2003/68821 (Hansen y col.); WO 2004/058298 (Goldenberg y Hansen); WO 2000/76542 (Golay y col.); WO 2001/72333 (Wolin y Rosenblatt); U.S. Pat. No. 6,368,596 (Ghetie y col.); U.S. Pat. No. 6,306,393 y US 2002/0041847 (Goldenberg, D.); US 2003/0026801 (Weiner y Hartmann); WO 2002/102312 (Engleman, E.); US 2003/0068664 (Albitar y col.); WO 2003/002607 (Leung, S.); WO 2003/049694, US 2002/0009427 y US 2003/0185796 (Wolin y col.); WO 2003/061694 (Sing y Siegall); US 2003/0219818 (Bohen y col.); US 2003/0219433 y WO 2003/068821 (Hansen y col.); US 2003/0219818 (Bohen y col.); US 2002/0136719 (Shenoy y col.); WO 2004/032828 y US 2005/0180972 (WahI y col.); y WO 2002/56910 (Hayden-Ledbetter). Ver además U.S. Pat. No. 5,849,898 y EP 330,191 (Seed y col.); EP332.865A2 (Meyer y Weiss); U.S. Pat. No. 4,861 ,579 (Meyer y col.); US 2001/0056066 (Bugelski y coll); WO 1995/03770 (Bhat y col.); US 2003/0219433 A1 (Hansen y col.); WO 2004/035607 y US 2004/167319 (Teeling y col.); WO 2005/103081 (Teeling y col.); US 2006/0034835, US 2006/0024300 y WO 2004/056312 (Lowman y col.); US 2004/0093621 (Shitara y col.); WO 2004/103404 (Watkins y col.); WO 2005/000901 (Tedder y col.); US 2005/0025764 (Watkins y col.); US 2006/0251652 (Watkins y col.); WO 2005/016969 (Carr y col.); US 2005/0069545 (Carr y col.); WO 2005/014618 (Chang y col.); US 2005/0079174 (Barbera-Guillem y Nelson); US 2005/0106108 (Leung y Hansen); US 2005/0123546 (Umana y col.); US 2004/0072290 (Umana y col.); US 2003/0175884 (Umana y col.); y WO 2005/044859 (Umana y col.); WO 2005/070963 (Alian y col.); US 2005/0186216 (Ledbetter y Hayden-Ledbetter); US 2005/0202534 (Hayden-Ledbetter y Ledbetter); US 2005/136049 (Ledbetter y col.); US 2003/1 18592 (Ledbetter y col.); US 2003/133939 (Ledbetter y Hayden-Ledbetter); US 2005/0202012 (Ledbetter y Hayden-Ledbetter); US 2005/0175614 (Ledbetter y Hayden-Ledbetter); US 2005/0180970 (Ledbetter y Hayden-Ledbetter); US 2005/0202028 (Hayden-Ledbetter y Ledbetter); US 2005/0202023 (Hayden-Ledbetter y Ledbetter); WO 2005/017148 (Ledbetter y col.); WO 2005/037989 (Ledbetter y col.); U.S. Pat. No. 6,183,744 (Goldenberg); U.S. Pat. No. 6,897,044 (Braslawski y col.); WO 2006/005477 (Krause y col.); US 2006/0029543 (Krause y col.); US 2006/0018900 ( cLCCormick y col.); US 2006/0051349 (Goldenberg y Hansen); WO 2006/042240 (lyer y Dunussi-Joannopoulos); US 2006/0121032 (Dahiyat y col.); WO 2006/064121 (Teillaud y col.); US 2006/0153838 (Watkins), CN 1718587 (Chen y col.); WO 2006/084264 (Adams y col.); US 2006/0188495 (Barran y col.); US 2004/0202658 y WO 2004/091657 (Benynes, K.); US 2005/0095243, US 2005/0163775, WO 2005/00351 y WO 2006/068867 (Chan, A.); US 2006/0135430 y WO 2005/005462 (Chan y col.); US 2005/0032130 y WO 2005/017529 (Beresini y col.); US 2005/0053602 y WO 2005/023302 (Brunetta, P.); US 2006/0179501 y WO 2004/060052 (Chan y col.); WO 2004/060053 (Chan y col.); US 2005/0186206 y WO 2005/060999 (Brunetta, P.); US 2005/0191297 y WO 2005/061542 (Brunetta, P.); US 2006/0002930 y WO 2005/1 15453 (Brunetta y col.); US 2006/0099662 y WO 2005/108989 (Chuntharapai y col.); CN 1420129A (Zhongxin Guojian Pharmaceutical); US 2005/0276803 y WO 2005/1 13003 (Chan y col.); US 2005/0271658 y WO 2005/1 17972 (Brunetta y col.); US 2005/0255527 y WO 2005/1 1428 (Yang, J.); US 2006/0024295 y WO 2005/120437 (Brunetta, P.); US 2006/0051345 y WO 2005/1 17978 (Frohna, P.); US 2006/0062787 y WO 2006/012508 (Hitraya, E.); US 2006/0067930 y WO 2006/31370 (Lowman y col.); WO 2006/29224 (Ashkenazi, A.); US 2006/01 10387 y WO 2006/41680 (Brunetta, P.); US 2006/01341 1 1 y WO 2006/066086 (Agarwal, S.); WO 2006/069403 (Ernst y Yansura); US 2006/0188495 y WO 2006/076651 (Dummer, W.); WO 2006/084264 (Lowman, H.); WO 2006/093923 (Quan y Sewell); WO 2006/106959 (Numazaki y col.); WO 2006/126069 (Morawala); WO 2006/130458 (Gazit-Bornstein y col.); US 2006/0275284 (Hanna, G.); US 2007/0014785 (Golay y col.); US 2007/0014720 (Gazit-Bornstein y col.); y US 2007/0020259 (Hansen y col.); US 2007/0020265 (Goldenberg y Hansen); US 2007/0014797 (Hitraya); US 2007/0224189 (Lazar y col.); y WO 2008/003319 (Parren y Baadsgaard).
Para nombrar algunas publicaciones científicas relacionadas con tratamientos con anticuerpos anti-CD20 se incluyen: Perotta y Abuel, "Response of chronic relapsing ITP of 10 years duration to rituximab" Abstract #3360 Blood, 10(1 )(part 1-2):88B (1998); Perotta y col., "Rituxan in the treatment of chronic idiopathic thrombocytopaenic purpura (ITP)", Blood, 94:49 (r) (1999); atthews, R., "Medical Heretics" New Scientist, (7 Abr., 2001 ); Leandro y col., "Clinical outcome in 22 patients with rheumatoid arthritis treated with B lymphocyte depletion" Ann Rheum Dis., supra; Leandro y col., "Lymphocyte depletion in rheumatoid arthritis: early evidence for safety, efficacy and dose response" Arthritis and Rheumatism, 44(9):S370 (2001 ); Leandro y col., "An open study of B lymphocyte depletion in systemic lupus erythematosus" Arthritis and Rheumatism, 46:2673-2677 (2002), en donde durante un período de 2 semanas, cada paciente recibió dos infusiones de 500 mg de anticuerpos de CD20, dos infusiones de 750 mg de ciclofosfamida, una dosis alta, por vía oral, de corticoesteroides, y en donde dos de los pacientes tratados tuvieron una recaída a los siete y ocho meses, respectivamente, y fueron tratados nuevamente, aunque con protocolos diferentes; "Successful long-term treatment of systemic lupus erythematosus with rituximab maintenance therapy" Weide y col., Lupus, 12:779-782 (2003), donde un paciente fue tratado con un anticuerpo anti-CD20 (375 mg/m2 x 4, repetido a intervalos semanales), se llevaron a cabo otras aplicaciones cada cinco a seis meses, y entonces recibió terapia de mantenimiento con anticuerpos 375 mg/m2 cada tres meses, y en donde un segundo paciente con SLE refractario fue tratado con el anticuerpo anti-CD20 rituximab y continuó recibiendo terapia de mantenimiento cada tres meses; Edwards y Cambridge, "Sustained improvement in rheumatoid arthritis following a protocol designed to deplete B lymphocytes" Rheumatology, 40:205-21 1 (2001 ); Cambridge y col., "B lymphocyte depletion in patients with rheumatoid arthritis: serial studies of immunological parameters" Arthritis Rheum., 46 (Suppl. 9): S1350 (2002); Cambridge y col., "Serologic changes following B lymphocyte depletion therapy for rheumatoid arthritis" Arthritis Rheum., 48:2146-2154 (2003); Edwards y col., " B-lymphocyte depletion therapy in rheumatoid arthritis and other autoimmune disorders" Biochem Soc. Trans., supra; Edwards y col., " Efficacy and safety of rituximab, a B-cell targeted chimeric monoclonal anticuerpo: A randomized, placebo controlled trial in patients with rheumatoid arthritis", Arthritis and Rheumatism, 46(9):S197 (2002); Edwards y col., "Efficacy of B-cell-targeted therapy with rituximab in patients with rheumatoid arthritis" N Engl. J. Med., 350:2572-2582 (2004); Pavelka y col., Ann. Rheum. Dis., 63:(S1 ):289-290 (2004); Emery y col., Arthritis Rheum. 50 (S9):S659 (2004); Levine y Pestronk, "IgM antibody-related polyneuropathies: B-cell depletion chemotherapy using Rituximab" Neurology, 52:1701 -1704 (1999); Uchida y col., " The innate mononuclear phagocyte network depletes B lymphocytes through Fc receptor-dependent mechanisms during anti-CD20 anticuerpo immunotherapy" J. Exp. Med., 199:1659-1669 (2004); Gong y col., "Importance of cellular microenvironment and circulatory dynamics in B cell immunotherapy' J. Immunol., 174:817-826 (2005); Hamaguchi y col., "The peritoneal cavity provides a protective niche for B1 and conventional B lymphocytes during anti-CD20 immunotherapy in mice" J. Immunol., 174:4389-4399 (2005); Cragg y col. " The biology of CD20 and its potential as a target for mAb therapy Curr. Dir. Autoimmun., 8:140-174 (2005); Eisenberg, "Mechanisms of autoimmunity" Immunol. Res., 27:203-218 (2003); DeVita y col., "Efficacy of selective B cell blockade in the treatment of rheumatoid arthritis" Arthritis & Rheum, 46:2029-2033 (2002); Higashida y col. " Treatment of DMARD-refractory rheumatoid arthritis with rituximab" Annual Scientific Meeting of the American College of Rheumatology (Abstract #LB1 1 ), New Orleans, La. (Octubre, 2002); Tuscano, "Successful treatment of infliximab-refractory rheumatoid arthritis with rituximab" Annual Scientific Meeting of the American College of Rheumatology, New Orleans, La. (Octubre, 2002), published as Tuscano, Arthritis Rheum. 46:3420 (2002); "Pathogenic roles of B cells in human autoimmunity; insights from the clinic" Martin y Chan, Immunity, 20:517-527 (2004); Silverman y Weisman, "Rituximab therapy and autoimmune disorders, prospects for anti-B cell therapy, Arthritis and Rheumatism, 48:1484-1492 (2003); Kazkaz y Isenberg, "Anti B cell therapy (rituximab) in the treatment of autoimmune diseases" Current Opinión in Pharmacology, 4:398-402 (2004); Virgolini y Vanda, "Rituximab in autoimmune diseases" Biomedicine & Pharmacotherapy, 58: 299-309 (2004); Klemmer y col., " Treatment of antibody mediated autoimmune disorders with an AntiCD20 monoclonal antibody Rituximab" Arthritis and Rheumatism, 48(9) (SEP):S624-S624 (2003); Kneitz y col., "Effective B cell depletion with rituximab in the treatment of autoimmune diseases" Immunobiology, 206:519-527 (2002); Arzoo y col., " Treatment of refractory antibody mediated autoimmune disorders with an anti-CD 20 monoclonal antibody (rítuximab)" Annals of the Rheumatic Diseases, 61 (10):922-924 (2002) Comment ¡n Ann. Rheum. Dis. 61 :863-866 (2002); "Future strategies in immunotherapy" por Lake y Dionne, en Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery (John Wiley & Sons, Inc., 2003) (Capítulo 2 " Antibody -Directed Immunotherapy'); Liang y Tedder, Wiley Encyclopedia of Molecular Medicine, Sección: CD20 as an Immunotherapy Target (2002); Apéndice 4A titulado "Monoclonal Antibodies to Human Cell Surface Antigens" por Stockinger y col., eds: Coligan y col., in Current Protocols in Immunology (John Wiley & Sons, Inc., 2003); Penichet y Morrison, "CD Antibodies/molecules: Definition; Antibody Engineering" en Wiley Encyclopedia of Molecular Medicine, Sección: Chimeric, Humanized and Human Antibodies (2002).
Además, ver Looney, "B cells as a therapeutic target in autoimmune diseases other than rheumatoid arthritis" Rheumatology, 44 Suppl 2:ii13-ii17 (2005); Chambers e Isenberg, "Anti-B cell therapy (rítuximab) in the treatment of autoimmune diseases" Lupus, 14(3):210-214 (2005); Looney y col., "B-cell depletion as a novel treatment for systemic lupus erythematosus: a phase l/ll dose-escalating trial of rítuximab" Arthritis Rheum., 50:2580-2589 (2004); Looney, " Treating human autoimmune disease by depleting B cells" Ann Rheum. Dis., 61 :863-866 (2002); Edelbauer y col., "Rítuximab in childhood systemic lupus erythematosus refractory to conventional immunosuppression Case report' Pediatr. Nephrol., 20(6): 81 1 -813 (2005); D'Cruz y Hughes, "The treatment of lupus nephritis" BMJ, 330(7488) :377-378 (2005); Looney, "B cell-targeted therapy in diseases other than rheumatoid arthritis" J. Rheumatol. Suppl., 73: 25-28-discusión 29-30 (2005); Sfikakis y col., "Remission of proliferative lupus nephritis following B cell depletion therapy is preceded by down-regulation of the T cell costimulatory molecule CD40 ligand: an open-label triat' Arthritis Rheum., 52(2):501 -513 (2005); Rastetter y col., "Rituximab: expanding role in therapy for lymphomas and autoimmune diseases" Annu. Rev. Med., 55:477-503 (2004); Silverman, "Anti-CD20 therapy in systemic lupus erythematosus: a step closer to the clinid' Arthritis Rheum., 52(2) .371-377 (2005), Errata en: Arthritis Rheum. 52(4): 1342 (2005); Ahn y col., "Long-term remission from Hfe-threatening hypercoaguiable state associated with lupus anticoagulant (LA) following rituximab therapy" Am. J. Hematol., 78(2): 127-129 (2005); Tahir y col., "Humanized anti-CD20 monoclonal antibody in the treatment of severe resistant systemic lupus erythematosus in a patient with antibodies against rituximab" Rheumatology, 44(4):561 -562 (2005), Epub 2005, Ene. 1 1 ; Looney y col., " Treatment of SLE with anti CD20 monoclonal antibody Curr. Dir. Autoimmun., 8:193-205 (2005); Cragg y col., " The biology of CD20 and its potential as a target for mAb therap Curr. Dir. Autoimmun., 8:140-174 (2005); Gottenberg y col., " Tolerance and short term efficacy of rituximab in 43 patients with systemic autoimmune diseases" Ann. Rheum. Dis., 64(6):913-920 (2005) Epub 2004 Nov. 18; Tokunaga y col., " Down-regulation of CD40 and CD80 on B cells in patients with Hfe-threatening systemic lupus erythematosus after successful treatment with rituximab" Rheumatology 44(2): 176-182 (2005), Epub 2004 Oct. 19. Ver también Leandro y col., "B cell repopulation occurs mainly from naive B cells in patient with rheumatoid arthritis and systemic lupus erythematosus" Arthritis Rheum., 48 (Suppl 9): S1 160 (2003).
Ver además, Specks y col. "Response of Wegener's granulomatosis to anti-CD20 chimeric monoclonal antibody therapy" Arthritis & Rheumatism, 44(12):2836-2840 (2001 ) donde se revela el uso de cuatro infusiones de un anticuerpo anti-CD20 (375 mg/m2) y dosis altas de glucocorticoides para tratar la granulomatosis de Wegener's. La terapia se repitió luego de 1 1 meses cuando la cANCA recurrió, pero la terapia se llevó a cabo sin glucocorticoides. Ocho meses después del segundo curso de anticuerpos anti- CD20, la enfermedad de los pacientes se mantuvo en remisión completa. En otro estudio, se reportó la remisión de la vasculitis severa asociada a ANCA, cuando se utilizó un anticuerpo antí-CD20 en una dosis de 375 mg/m2 x 4 junto con prednisona oral (1 mg/kg/día), la cual fue reducida a 40 mg/día en la semana cuatro y se la discontinuó totalmente durante las 16 semanas siguientes. Cuatro pacientes fueron tratados nuevamente solo con anticuerpos anti-CD20, para los títulos de ANCA recurrente/en aumento. Keogh y col., Kidney Blood Press. Res., 26:293 (2003) reportaron que once pacientes con vasculitis refractaria asociada con ANCA entraron en remisión tras el tratamiento con cuatro dosis semanales de anticuerpos anti-CD20 (375 mg/m2) y dosis altas de glucocorticoides.
A pacientes con vasculitis refractaria asociada a ANCA se les administró anticuerpos anti-CD20 junto con medicamentos inmunosupresores, tales como la ciclofosfamida intravenosa, el micofenolato de mofetilo, la azatioprina o la leflunomida. Eriksson, "Short-term outcome and safety ¡n 5 patients with ANCA-positive vasculitis treated with rítuximab" Kidney and Blood Pressure Research,, 26:294 (2003) (en donde cinco pacientes con vasculitis asociada a ANCA fueron tratados con 375 mg/m2 de anticuerpo anti-CD20, una vez por semana, durante cuatro semanas); Jayne y col., "B-cell depletion with rítuximab for refractory vasculitis Kidney and Blood Pressure Research, 26:294-295 (2003) (seis pacientes con vasculitis refractaria recibieron cuatro infusiones semanales de anticuerpos anti-CD20, a dosis de 375 mg/m2 y ciclofosfamida, junto con un fondo de inmunosupresión y prednisolona, experimentando cambios en la actividad vasculítica). Otro informe acerca de la utilización de anticuerpos anti-CD20 junto con ciclofosfamida intravenosa, a 375 mg/m2 por dosis, en cuatro dosis, para su administración a pacientes con vasculitis sistémica refractaria, se proporciona en el trabajo de Smith y Jayne "A prospective, open labe! tria! of B-cell depletion with rítuximab in refractory systemic vasculitis poster 998 (1 1 o Taller de la International Vasculitis y ANCA), American Society of Nephrology, J. Am. Soc. Nephrol., 14:755A (2003). Ver además Eriksson, J. Internal Med., 257:540-548 (2005). Véase también en Eriksson, J. Internal Med., 257: 540-548 (2005) con respecto a nueve pacientes con vasculitis ANCA-positivos que recibieron tratamiento con dos o cuatro dosis semanales de 500 mg de anticuerpo anti-CD20; y Keogh y col., Arthritis and R eumatism, 52:262-268 (2005), quien informó que en 1 1 pacientes con vasculitis refractaria asociada a ANCA, el tratamiento o re-tratamiento con cuatro dosis semanales de 375 mg/m2 de anticuerpos anti-CD20 presumiblemente indujeron a la remisión por la depleción de los linfocitos B.
En cuanto a la actividad de un anticuerpo humanizado anti-CD20, véase, por ejemplo, Vugmeyster y col., "Depletion of B cells by a humanized anti-CD20 antibody PRO70769 in Macaca fascicularté' J. ¡mmunotherapy, 28: 212-219 (2005). Para la discusión acerca de un anticuerpo monoclonal humano, véase en Baker y col., "Generation and characterization of LymphoStat-B, a human monoclonal antibody that antagonizes the bioactivities of B lymphocyte stimulatoi", Arthritis Rheum., 48: 3253-3265 (2003). El ensayo MINT con el anticuerpo anti-CD20 se llevó a cabo involucrando el tratamiento del linfoma no Hodgkin agresivo en pacientes más jóvenes. Pfreundschuh y col., Lancet Oncology, 7 (5): 379-391 (2006).
Los conjugados de agente citotóxico - anticuerpo (o "AAC", por sus siglas en Idioma Inglés), también llamados conjugados droga- anticuerpo (ADC, por sus siglas en Idioma Inglés), son conocidos por ser un tipo de inmunoconjugados que constan de un agente citotóxico unido covalentemente a un anticuerpo, a través de un enlazador químico especializado. El uso de ACCs para la administración local de los agentes citotóxicos o citostáticos, es decir, los medicamentos para matar o inhibir a las células tumorales en el tratamiento del cáncer (ver Syrigos y Epenetos (1999) Anticancer Research 19: 605-614; Niculescu-Duvaz y Springer (1997) Adv Drg Del. Rev. 26: 151 -172; la patente de los Estados Unidos de Norte América No. 4.975.278), permite la administración dirigida a los tumores de la porción de droga y la acumulación intracelular de la misma, donde la administración sistémica de estos agentes de droga sin estar conjugados puede dar lugar a niveles inaceptables de toxicidad, tanto para las células normales como para las células tumorales que se pretende eliminar (Baldwin y col., (1986) Lancet pp (15 de marzo 1986): 603-05; Thorpe, (1985) "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents ¡n Cáncer Therapy: A Review, " in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications", A. Pinchera y col. (ed. s), pp 475-506). Se requiere una eficacia máxima con una mínima toxicidad. Algunas veces, tanto los anticuerpos policlonales como los anticuerpos monoclonales, han sido reportados como que son útiles en este sentido. (Ver Rowland y col., (1986) Cáncer Immunol. Immunotherapy, 21 : 183-87). Entre las drogas conocidas así utilizadas se incluyen: la daunomicina, la doxorrubicina, el metotrexato y la vindesina (Rowland y col., Cáncer Immunol. Immunotherapy, 21 : 183-87 (1986)). Las toxinas utilizadas en los conjugados de anticuerpo - toxina, incluyen las toxinas bacterianas, tales como la toxina de la difteria, las toxinas de las plantas, tales como la ricina y las toxinas de moléculas pequeñas, tales como la geldanamicina. Kerr y col, (1997) Bioconjugate Chem. 8(6):781 -784; Mandier y col. (2000) Journal of the Nat. Cáncer Inst. 92(19):1573-1581 ; Mandier y col. (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10: 1025-1028; Mandier y col. (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791 ), maitansinoides (patente EP 1391213, Liu y col., (1996), Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU, 93: 8618-8623) y caliqueamicina (Lode y col., (1998) Cáncer Res. 58: 2928; Hinman y col., (1993), Cáncer Res., 53: 3336-3342. Las toxinas pueden ejercer efectos citotóxicos y/o citostáticos a través de diversos mecanismos, tales como la unión a tubulina, la unión al ADN o la inhibición de la topoisomerasa. Meyer D.L. y Senter, P.D. "Recent Advances in Antibody Drug Conjugates for Cáncer Therapy" en Annual Reports in Medicinal Chemistry, Vol 38 (2003) Capítulo 23, 229-237. Sin embargo, muchos fármacos citotóxicos tienden a ser inactivos o menos activos cuando se conjugan con anticuerpos grandes o ligandos del receptor de la proteína.
Los conjugados maitansinoide- anticuerpo, se componen de un anticuerpo monoclonal que se dirige a un antígeno expresado en la superficie de las células y un compuesto derivado de la maitansina (por ejemplo, fármacos anti-mitóticos potentes que inhiben la polimerización de los microtúbulos) unido covalentemente al anticuerpo. RV Chari, Acc. Chem. Res. 2008 Feb; 41 (1 ): 98-107. Con un enlazador apropiado, un conjugado maitansinoide-anticuerpo (AMC, por sus siglas en Idioma Inglés) puede ser estable in vivo y puede ser significativamente menos tóxico para las células que no expresan el antígeno objetivo, incrementando así el índice terapéutico del conjugado. Tras la unión con el antígeno objetivo en la superficie celular, un AMC se internaliza, se desglosa en el lisosoma, presumiblemente por las proteasas, generando metabolitos activos maitansinoides que luego se unen e inhiben a los microtúbulos, disparando la detención del ciclo celular y, por último, produciendo la muerte celular, probablemente por apoptosis. Erickson y col., Cáncer Res. 2006, 15 de abril; 66 (8): 4426-33. Mediante la conjugación con maitansinoides, los mAb pueden mejorar la actividad de la muerte selectiva in vitro e in vivo.
En la actualidad, numerosos ACCs se están estudiando en ensayos clínicos y en desarrollos pre-clínicos. Idealmente, los inmunoconjugados podrían ser fáciles de administrar a los pacientes, de manera similar a las terapias con anticuerpos. En particular, un ACC denominado trastuzumab-SMCC-DM1 (T-DM1 ), ha demostrado ser eficaz en pacientes con cáncer de mama metastásico con sobreexpresión de HER-2, en los cuales fracasó la administración de trastuzumab y quimioterapia, mostrando al mismo tiempo un perfil favorable de baja toxicidad. Véase CL Vogel, ASCO Resumen # 2009 La depuración plasmática de los conjugados anticuerpo-maitansinoide, tal como el trastuzumab- SMCC-DM1 , sintetizados con el enlazador no escindible SMCC, es muy lenta en relación con la depuración de los anticuerpos solos (Solicitud de Patente de los Estados Unidos 2005/ 0169933). Esto está en fuerte contraste con la depuración plasmática de los conjugados preparados con uniones de disulfuro relativamente lábiles, tal como el huC242-SPP-DM1. Por ejemplo, la vida media para la depuración del conjugado con SMCC es de aproximadamente 320 horas, mientras que la vida media para el conjugado SPP está en el rango de alrededor de 40 a 50 horas. Sin embargo, la depuración del componente de anticuerpo para cada tipo de conjugado es idéntico, lo cual sugiere que la diferencia en la tasa de depuración del conjugado medido podría deberse a la pérdida del maitansinoide del anticuerpo conjugado (es decir, en el caso del conjugado SPP-DM1 ). El enlace no escindible del SMCC tiene, quizás, mucho más resistencia a las actividades de división maitansinoide-enlazador in vivo que el conjugado SPP-DM1. Además, la tasa de disminución de la depuración de los conjugados con enlace SMCC, en comparación con los conjugados SPP-DM1 , conduce a un aumento de casi cinco veces en la exposición general de los animales al maitansinoide, medida mediante el área bajo la curva (AuC). Este aumento de la exposición podría tener un impacto sustancial en la eficacia del medicamento.
Se ha informado que los conjugados maitansinoides preparados con enlazadores no escindibles, tal como el SMCC, muestran un aumento inesperado de la tolerancia en ratones, en comparación con los conjugados preparados con enlazadores de disulfuro escindibles (US 2005/0169933). Por ejemplo, la tolerabilidad de los conjugados huC242-SMCC-DM1 y huC242-SPP-DM1 , fueron comparados mediante un ensayo de toxicidad aguda, en ratones CD-1 , empleando una dosis única por vía intravenosa. La dosis máxima tolerada (MTD, por sus siglas en Idioma Inglés) para el conjugado SMCC-DM1 , fue mayor que la dosis más alta ensayada (150 mg/kg), mientras que el MTD para el conjugado disulfuro-enlazador SPP-DM1 estuvo en el rango de los 45-90 mg/kg. A una dosis de 150 mg/kg, todos los ratones en el grupo tratado con SMCC-DM1 sobrevivieron, mientras que se observó una toxicidad letal para todos los ratones en el grupo tratado con SPP-DM1 luego de las 96 horas de tratamiento. Además, el conjugado anticuerpo-maitansinoide unido al tioéter no reducible trastuzumab-DM1 -SMCC, exhibió una tolerabilidad de 2 a 3 veces mejor en las ratas, que la del trastuzumab unido a disulfuro escindible, trastuzumab-SPP-DM1 (Lewis Phillips G.D., Li G., Dugger D.L y col. "Targeting HER2-positive breast cáncer with trastuzumab-DM1 , an antibody-cytotoxic drug conjugaté', Cáncer Res. 2008; 68: 9280-90). Por lo tanto, resulta posible que los conjugados de droga- anticuerpo, preparados con enlazadores no escindibles tales como el SMCC, puedan presentar, en modelos preclínicos, una toxicidad y unos parámetros farmacocinéticos favorables.
Aunque la CD20 es conocida en el arte, la CD20 no es un objetivo favorable para la conjugación droga- anticuerpo, ya que los anticuerpos anti-CD20 conocidos son internalizados de manera muy pobre. OW Press, Cáncer Res. 1989; 49: 4906-12 y N. Vangeepuram, Cáncer 1997; 80 (Supl.): 2425-30. Conjugados de anticuerpos CD20 han sido estudiados previamente, aunque no han demostrado, de manera significativa, una potencia fuerte, especialmente cuando se utilizan enlazadores no-disulfuro o estables a los ácidos.
Por ejemplo, se ha informado que los conjugados SMCC-DM1 no escindibles de un anticuerpo anti-CD20 han tenido la misma eficacia que los anticuerpos no conjugados, mientras que únicamente un conjugado SPP-DM1 escindible del mismo anticuerpo mostró una mejor eficacia marginal en un modelo de xenotransplante Granta- 519 en ratones SCID (Polson y col., Cáncer Res., 69 (6): 2358-2364 (2009)). De manera similar, se ha informado que los conjugados de anticuerpos anti-CD20 con caliqueamicina, hechos con un enlazador de amida estable a los ácidos, no mostraron una mejora en la eficacia de rituximab in vivo en un modelo de xenotrasplante de Ramos en ratones desnudos. En este estudio, sólo los conjugados de rituximab hechos con un enlazador Ac-But dimetil hidracida, lábil a los ácidos, mostraron una mejora en la eficacia in vivo (DiJoseph y col. Cáncer Immunol Immunotherapy, 56 (7): 1 107-1 1 17 (2007)) . En un estudio diferente, en un modelo de xenotransplante Daudi, se informó que los conjugados con adriamicina de anticuerpos anti-CD20, lábiles a los ácidos, eran sólo moderadamente efectivos. Los conjugados con adriamicina de los mismos anticuerpos, estables a los ácidos, mostraron ser totalmente ineficaces (Braslawsky y col., Cáncer Immunol Immunotherapy, 33:367-74 (1991 )). El conjugado de Rituximab con monometil auristatina E (MMAE, por sus siglas en idioma inglés) mediante un enlace peptídico escindible por enzimas, tal como el rituximab-vcMMAE, ha reportado ser eficaz in vitro e in vivo contra las células del linfoma de Ramos (Law y col., Clin. Cáncer Res, 10 (23): 7842-7851 (2004), Fe de erratas en: Clin. Cáncer Res., 1 1 (10): 3969 (2005)).
Otro enfoque reportado para mejorar la capacidad de los anticuerpos monoclonales para que sean más efectivos en el tratamiento de los trastornos de las células B, ha sido la de conjugar un marcador radiactivo al anticuerpo, de manera que el marcador se localice en el sitio del antígeno. Radio inmunoconjugados que tienen CD20 como diana u objetivo, tales como Bexxar ® (1311-tositumomab) y Zevalin (90Y ibritumomab tiuxetan), han sido aprobados en pacientes con linfomas de las células B, no-Hodgkin, recidivantes o rebeldes, incluyendo pacientes refractarios al rituximab. En un entorno clínico, algunos pacientes refractarios al rituximab respondieron al Bexxar ® (Horna, J. Clin. Oncol. 2005; 23: 712-9). Se ha reportado que, cuando se compararon el rituximab y el Zevalin, en NHL folicular o de grado bajo, en recaída o refractario, el tratamiento con Zevalin mostró tasas de respuesta, generales y completas, significativamente mejores que mediante el tratamiento con rituximab (Witzig, J Clin Oncol 2002; 20: 2453-2463). Si bien estos datos clínicos sugieren que los radio-inmunoconjugados anti-CD20 pueden ser más efectivos que el rituximab, estos no son ampliamente utilizados, debido a las toxicidades adicionales y a las dificultades en su administración que se encuentran asociadas con el uso de compuestos radiactivos. Por lo tanto, ha habido una necesidad de desarrollar anticuerpos efectivos contra CD20 y conjugados de los mismos, que sean fáciles de administrar y posean una más baja toxicidad.
Por lo tanto, sigue existiendo la necesidad de desarrollar agentes terapéuticos que tengan como blanco al CD20, que sean mejores y superiores a los conocidos, entre los que se incluyen a los anticuerpos o a los fragmentos de los mismos, que exhiban una especificidad, una toxicidad reducida, una estabilidad y propiedades físicas y funcionales mejoradas, respecto de los agentes terapéuticos conocidos. La presente invención se dirige a dichas necesidades.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Se hará referencia ahora, de manera detallada, a determinados aspectos de la invención, ejemplos de los cuales se ilustran en las estructuras y fórmulas que se acompañan. Mientras que la invención se describirá en relación con los aspectos enumerados, se entenderá que no se tiene la intención de limitar la invención a esos aspectos. Por el contrario, se pretende que la invención cubra todas las alternativas, modificaciones" y equivalentes que puedan ser incluidos dentro del alcance de la presente invención, tal como se define mediante las reivindicaciones. Una persona experta en la materia reconocerá muchos métodos y materiales, similares o equivalentes a los descriptos en el presente documento, que pueden ser utilizados en la práctica de la presente invención.
En un aspecto, la presente invención es un anticuerpo anti-CD20 y/o un fragmento del mismo. En un aspecto, la presente invención es un anticuerpo anti-CD20 citolítico y/o un fragmento del mismo. En un aspecto de la invención, el anticuerpo anti-CD20 citolítico y los fragmentos del mismo son útiles en el tratamiento de aquellas condiciones médicas en donde las células B que expresan CD20 influyen en el curso de la enfermedad. En un aspecto, las células B blanco son no deseadas. En un aspecto, la condición médica involucra la actividad de las células B no deseadas. En un aspecto, la condición médica es una enfermedad de las células B. Otro aspecto de la invención es un anticuerpo o un fragmento del mismo, que se une específicamente al antígeno CD20, en donde dicho anticuerpo o dicho fragmento es capaz de inducir la apoptosis, la citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCC) y la citotoxicidad dependiente de complemento (CDC). En un aspecto preferido, la condición médica es un linfoma no-Hodgkin.
Un aspecto de la invención es un anticuerpo, o un fragmento del mismo, que se une de manera específica a CD20, en donde dicho anticuerpo o dicho fragmento es capaz de inducir la apoptosis, la citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCC) y la citotoxicidad dependiente de complemento (CDC), en donde el anticuerpo o el fragmento, es murino, no humano, humanizado, quimérico, con su superficie acondicionada ("resurfaced") o humano. Otro aspecto de la invención es un anticuerpo, o un fragmento del mismo, que se une de manera específica a CD20, en donde el anticuerpo o el fragmento es capaz de inducir la apoptosis, la citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCC) y la citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) y en donde el anticuerpo o el fragmento es monoclonal o monocadena.
Un aspecto de la invención incluye un anticuerpo, o un fragmento del mismo, que se une específicamente a CD20, en donde dicho anticuerpo o dicho fragmento es capaz de inducir la apoptosis, la citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCC) y la citotoxicidad dependiente de complemento (CDC), en donde los anticuerpos se obtienen a partir de células CHO o NSO. En otro aspecto de la presente invención, el anticuerpo o sus fragmentos se unen de manera específica a, por lo menos, un aminoácido que comprende los residuos de aminoácidos situados entre el tercero y el cuarto dominio transmembrana de la CD20.
En otro aspecto de la invención, el anticuerpo o sus fragmentos, se une específicamente a, por lo menos, un aminoácido que comprende los aminoácidos de la SEC ID NO: 45, o una secuencia correspondiente a una cualquiera de las Gl 21330989, de la proteína del GenBank ID 231 10989 o similares. Otro aspecto de la presente invención es un anticuerpo o un fragmento del mismo, en donde el anticuerpo o el fragmento es capaz de inducir la muerte de una célula que expresa CD20. En todavía otro aspecto de la invención, el anticuerpo o el fragmento es un anticuerpo de Tipo III, que posee la capacidad de inducir la apoptosis, de manera sustancial y en ausencia de agentes reticulantes, de manera similar a la de los anticuerpos de Tipo II, y que posee la capacidad de redistribuir al CD20 en una balsa lipídica e inducir, de manera sustancial, la citoxicidad dependiente de complemento (CDC), de manera similar a la de los anticuerpos de Tipo I.
Un aspecto de la invención incluye un anticuerpo o un fragmento anti-CD20, en donde el anticuerpo o el fragmento, se une de manera específica a CD20, en ensayos Wéstern blot, ELISA o FACS.
En un aspecto de la invención, el anticuerpo o el fragmento anti-CD20 comprende una Fab, una Fab', una F (ab')2, una Fd, una mono cadena Fv o scFv, un Fv unido a disulfuros, un dominio V-NAR, una IgNar, un intracuerpo, un lgGDCH2, un minicuerpo, una F (ab')3, un tetracuerpo, un triacuerpo, un diacuerpo, una (scFv)2, un anticuerpo de dominio único, DVD-lg, Fcab, mAb2 o una scFv-Fc. Otro aspecto de la presente invención es un anticuerpo, un fragmento y/o conjugados de los mismos, que comprenden un dominio constante de la cadena pesada de una inmunoglobulina. En un aspecto de la invención, el anticuerpo o el fragmento del dominio constante de la cadena pesada de una inmunoglobulina, seleccionada del grupo que consiste en un dominio constante IgGi, un dominio constante lgG2, un dominio constante lgG3 y un dominio constante lgG4. En un aspecto de la invención, el anticuerpo anti-CD20 es un CD20-6. En otro aspecto de la invención, el anticuerpo anti-CD20 es un CD20-7.
En un aspecto de la invención, el anticuerpo, el fragmento o el conjugado de los mismos, induce la apoptosis de las células de linfoma. En un aspecto de la presente invención, el anticuerpo, el fragmento o el conjugado de los mismos incluye la apoptosis de las células del linfoma de Ramos y/o las células del linfoma de Raji y/o las células del linfoma de WSU-DLCL-2 y/o las células del linfoma de Jeko-1 y/o las células del linfoma de Granta-519. En otro aspecto de la presente invención, el anticuerpo, el fragmento o el conjugado de los mismos de la presente invención induce la apoptosis de las células del linfoma de Ramos y/o las células del linfoma de Raji y/o las células del linfoma de WSU-DLCL-2 y/o las células del linfoma de Jeko-1 y/o las células del linfoma de Granta-519, medida mediante la tinción con Anexina-V, en ausencia de agente reticulante. En un aspecto de la presente invención, el anticuerpo, el fragmento o el conjugado de los mismos induce la apoptosis en alrededor de, por lo menos, el 48 % de las células del linfoma de Ramos y/o por lo menos alrededor del 53 % de las células de linfoma de Raji y/o por lo menos alrededor del 34 % de las células del linfoma WSU- DLCL-2 y/o por lo menos alrededor del 12 % de las células del linfoma Jeko-1 y/o por lo i menos alrededor del 40 % de las células de linfoma de Granta-519, medida mediante la tinción con Anexina-V, en ausencia de agente reticulante.
En otro aspecto de la invención, el anticuerpo, el fragmento o el conjugado de los mismos, es capaz de inducir la apoptosis de las células de linfoma, con una EC50 de alrededor de 0.2 nM o menor, en ausencia de una agente reticulante. En otro aspecto de la invención, el anticuerpo, el fragmento o el conjugado de los mismos, es capaz de inducir la apoptosis de, por lo menos, el 48 % de las células del linfoma de Ramos con una EC50 de 0.2 nM o menor, en ausencia de un agente reticulante.
En otro aspecto de la invención, el anticuerpo, el fragmento y/o el conjugado de los mismos, es capaz de translocar, de manera eficiente, a la CD20, en un compartimiento de balsa lipídica de una membrana celular que expresa a CD20. En otro aspecto de la invención, el anticuerpo, el fragmento y/o el conjugado de los mismos, de la presente invención, es capaz de translocar de manera eficiente a la CD20, en un compartimiento de balsa lipídica de la membrana de una célula de linfoma que expresa CD20 y/o en una célula inmuno-reguladora que expresa CD20. En un aspecto de la presente invención, el anticuerpo, el fragmento y/o el conjugado de los mismos, es capaz de translocar de manera eficiente a la CD20 en un compartimiento de balsa lipídica de la membrana de las células del linfoma de Ramos.
En un aspecto de la invención, el anticuerpo, el fragmento y/o el conjugado de los mismos, mata a las células del linfoma de Ramos con una EC50 de aproximadamente 0.018 µ?/?t??. o menor y/o mata a las células del linfoma de Daudi con un EC50 de alrededor de 0.25 pg/mL o menor y/o mata a las células del linfoma WSU- DLCL-2 con un EC50 de alrededor de 0.58 µ?/???. o menor, mediante CDC, en presencia de aproximadamente 5% de suero humano que posee complemento.
En un aspecto de la invención, el anticuerpo, el fragmento y/o el conjugado de los mismos, se une a un epítope de CD20, el cual no comprende o no requiere al residuo aminoácido prolina en la posición 170 y/o 172. En un aspecto de la invención, el anticuerpo, el fragmento y/o el conjugado de los mismos se une a un epítope de CD20 que comprende o que tiene al residuo aminoácido asparagina en la posición 163 y/o 166. En un aspecto de la invención, el anticuerpo, el fragmento y/o el conjugado de los mismos, se une a un epítope de CD20, que no comprende ni requiere al residuo aminoácido prolina en la posición 170 y/o 172 y/o que comprende o que tiene al residuo aminoácido asparagina en la posición 163 y/o 166.
En un aspecto de la invención, el anticuerpo, el fragmento y/o el conjugado de los mismos se une a un epítope de CD20, en donde el epítope CD20 no posee prolina en la posición 170 y/o 172 y/o que posee al residuo aminoácido asparagina en la posición 163 y/o 166.
En un aspecto de la invención, el anticuerpo o el fragmento del mismo comprende, al menos, una región determinante de la complementariedad, que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo formado por las SEQ ID NOS: 25-30. En un aspecto de la invención, el anticuerpo o el fragmento del mismo comprende, al menos, una región determinante de la complementariedad que posee una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo formado por la SEQ ID NOS: 17-22. En un aspecto de la invención, el anticuerpo o el fragmento comprende, al menos, una región determinante de la complementariedad que posee una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID No.: 25-30 y 17-22, y en donde el anticuerpo o el fragmento se une a la CD20 . En un aspecto de la invención, el anticuerpo o el fragmento comprende, al menos, una cadena pesada y, por lo menos, una cadena liviana, en donde la cadena pesada comprende tres regiones determinantes de la complementariedad secuenciales, que poseen las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOS.: 20-22 o 28-30, y en donde dicha cadena liviana se compone de tres regiones determinantes de la complementariedad secuenciales, que poseen las secuencias de los aminoácidos de la SEC ID No.: 17-19 o 25-27. En un aspecto de la invención, el Ab o el fragmento de la cadena pesada tiene, al menos, un 90 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NOs.: 47, 34, 35 o 36. En un aspecto de la invención, el anticuerpo o el fragmento de cadena pesada tiene, por lo menos, un 96 % de identidad de secuencia con la de la secuencia de aminoácidos representada por las SEQ ID NOs.: 47, 34, 35 o 36. En un aspecto de la invención, el anticuerpo o el fragmento de cadena pesada tiene, por lo menos, un 98 % de identidad de secuencia con la de la secuencia de aminoácidos representada por las SEQ ID NOs: 47, 34, 35 o 36. En un aspecto de la invención, el anticuerpo o el fragmento, de cadena pesada tiene, por lo menos, un 99 % de identidad de secuencia con la de la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID No.: 47, 34, 35 o 36. En un aspecto de la invención, el anticuerpo o el fragmento de cadena pesada tiene, la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO.: 47, 34, 35 o 36.
Las secuencias que forman las secuencias señales de secreción no están presentes en el polipéptido maduro.
La invención provee un anticuerpo con su superficie acondicionada que se une al CD20 humano, o un fragmento de unión al antígeno del mismo y/o un conjugado del mismo, que agota a las células B in vivo. En todavía otro aspecto, las células B son de humanos o de monos cynomolgus. En otros aspectos, las regiones CDR comprenden sustituciones de aminoácidos en las que los residuos no son ni del anticuerpo del donante ni del anticuerpo del recipiente.
En un aspecto preferido, los anticuerpos de la invención son los anticuerpos de longitud entera, en donde la región VH se une a una región constante de cadena pesada de una IgG humana. En algunos aspectos preferidos, la IgG es la \gG<, o la lgG3 humana.
En un aspecto de la invención, la cadena liviana del anticuerpo o de un fragmento del mismo posee, por lo menos, un 90 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 46, 32 o 33. En un aspecto de la invención, la cadena liviana del anticuerpo o de un fragmento del mismo posee, al menos, el 95 % de identidad de secuencia con dicha secuencia de aminoácidos representada por las SEQ ID NOS: 46, 32 o 33. En un aspecto de la invención, la cadena liviana del anticuerpo o de un fragmento del mismo posee, por lo menos, un 96 % de identidad de secuencia con dicha secuencia de aminoácidos representada por las SEQ ID NO.: 46, 32 o 33. En un aspecto de la invención, la cadena liviana del anticuerpo o de un fragmento del mismo posee, al menos, el 97 % de identidad de secuencia con dicha secuencia de aminoácidos representada por las SEQ ID NO.: 46, 32 o 33. En un aspecto de la invención, la cadena liviana del anticuerpo o de un fragmento del mismo posee, al menos, el 98 % de identidad de secuencia con dicha secuencia de aminoácidos representada por las SEQ ID NO: 46, 32 o 33. En un aspecto de la invención, la cadena liviana del anticuerpo o de un fragmento del mismo posee, tiene al menos, el 99 % a la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID NO.: 46, 32 o 33. En un aspecto de la invención, la cadena liviana del anticuerpo o de un fragmento del mismo, posee una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO.: 46, 32 o 33. En un aspecto, el anticuerpo anti-CD20 con su superficie acondicionada y/o el conjugado del mismo es el CD20-7 o un fragmento del mismo.
En un aspecto de la invención, el anticuerpo o el fragmento del mismo, es un anticuerpo o un fragmento mejorado, que se une específicamente a la CD20, preparado mediante: (a) proporcionar un ADN que codifica a un anticuerpo o a un fragmento del mismo, que comprende, al menos, una secuencia seleccionada del grupo formado por las SEQ ID NOS.: 32-36,46, 47, 17-22, 25-30 y 1 -7, (b) introducir, al menos, una mutación, supresión o inserción de nucleótidos en dicho ADN, de tal manera tal que la secuencia de aminoácidos de dicho anticuerpo o de dicho fragmento de anticuerpo codificado por dicho ADN, sea cambiada, (c) expresar dicho anticuerpo o dicho fragmento de anticuerpo, (d) examinar, dicho anticuerpo o dicho fragmento de anticuerpo expresado para dicha mejora, por la que, dicho anticuerpo o dicho fragmento de anticuerpo mejorado se prepara. En un aspecto de la invención, la mejora es un aumento de la afinidad a la CD20. En otro aspecto de la invención, el aumento de la afinidad resulta de, al menos, una mutación, una supresión o una inserción de nucleótidos, llevada a cabo mediante un método conocido, tal como la mutagénesis de sitio dirigido mediada por oligonucleótidos, la mutagénesis de cásete, PCR con tendencia al error, desorden del ADN y. el uso de las cepas de mutación del E. coli. En otro aspecto de la invención, la mejora es una mayor avidez por la CD20. En otro aspecto de la invención, la mejora es un aumento de la actividad citotóxica por la célula que expresa a la CD20. En otro aspecto de la invención, la mejora es un nivel de expresión incrementado. En otro aspecto de la invención, la mejora es una mayor actividad idiotípica.
En otro aspecto de la invención, el anticuerpo o el fragmento del mismo, comprende una o más substituciones conservadoras de los residuos de aminoácidos, respecto de otro anticuerpo o fragmento del mismo, de acuerdo con la invención. En algunas realizaciones, tales sustituciones se producen en el marco y/o en la CDR y/o en las secciones hipervariables de las cadenas pesadas y/o livianas del anticuerpo o fragmento del mismo. En algunas realizaciones, tales sustituciones se producen sólo en las secuencias de las CDR. En algunas realizaciones, hay aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30 , 35, 40, 45, 50 O más de tales sustituciones. En otras realizaciones, hay 1 -20, 1 -15, 1 -10, 1 -5, 1 -3, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14,13, 12, 1 1 , 10, 9, 8,7,6, 5, 4, 3, 2 o 1 de dichas sustituciones en las cadenas pesadas y/o livianas de los anticuerpos o fragmentos de los mismos, de acuerdo con la invención.
Por lo tanto, la presente invención proporciona anticuerpos que se unen a CD20, fragmentos funcionales dé los mismos y/o conjugados de los mismos, y su uso en el tratamiento con células asociadas con enfermedades, que expresan CD20. En aspectos específicos, los anticuerpos que se unen a CD20 son, preferiblemente, con su superficie acondicionada, humanizados o quiméricos. Los anticuerpos humanizados incluyen a aquellos que poseen sustituciones de aminoácidos en las regiones de marco (FR por sus siglas en inglés) y anticuerpos de afinidad de maduración con cambios en las CDR. Los aminoácidos sustituidos en la CDR o en las FR no se limitan a aquellos presentes en los anticuerpos de los donantes o de los recipientes. En otros aspectos, los anticuerpos anti-CD20, los fragmentos funcionales de los mismos y/o los conjugados de los mismos, de acuerdo con la invención, además comprenden cambios en los residuos de aminoácidos en la región Fe, los cuales conducen a una función efectora mejorada, entre las que se incluyen, una mejor función CDC y/o ADCC y la muerte de las células B.
Otros anticuerpos anti-CD20, fragmentos funcionales de los mismos y/o conjugados de los mismos, de la invención, incluyen a aquellos que poseen cambios específicos para mejorar la estabilidad. En un aspecto específico, los anticuerpos CD20 humanizados o fragmentos funcionales de los mismos poseen una estabilidad aumentada.
También se proporcionan anticuerpos con una variación en la glicosilación, los cuales poseen una función ADCC in vivo mejorada.
En un aspecto de la invención, el anticuerpo o el fragmento del mismo es un medio para la unión específica al CD20, en donde dicho medio es capaz de inducir la apoptosis, la ADCC y la CDC. En un aspecto de la invención, el anticuerpo o el fragmento comprenden, al menos, un polipéptido que comprende, al menos, un miembro, seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID No.: 1 -7 y 17-36.
En otro aspecto, la presente invención es un anticuerpo o un fragmento del mismo, producido mediante el hibridoma correspondiente al número de Acceso ATCC: PTA-10486 o el hibridoma correspondiente al número de Acceso ATCC: PTA-10487.
Para las aplicaciones de diagnóstico, los anticuerpos o los fragmentos de los mismos de la presente invención, típicamente serán marcados con una porción detectable. La porción detectable puede ser cualquiera que sea capaz de producir, ya sea directa o indirectamente, una señal detectable. Por ejemplo, la fracción detectable puede ser un radioisótopo, tal como 3H, 14C, 32P, 35S o 131l, un compuesto fluorescente o quimioluminiscente, tal como el isotiocianato de fluoresceína, rodamina o luciferina, o una enzima, tal como la fosfatasa alcalina, la beta -galactosidasa o la peroxidasa de rábano picante.
En un aspecto, la presente invención es un anticuerpo citolítico anti-CD20 y/o un fragmento conjugado. En un aspecto de la invención, el conjugado anticuerpo citolítico específico para CD20 es útil en el tratamiento de las condiciones médicas en donde las células B que expresan CD20 influyen en el curso de la enfermedad. En un aspecto, las células B objetivo son no deseadas. En un aspecto, la condición médica es una enfermedad de las células B. En un aspecto, la condición médica involucra una actividad de las células B no deseadas. Otro aspecto de la invención es un conjugado de anticuerpo que se une de manera específica a la CD20, en donde dicho anticuerpo o fragmento es capaz de inducir la apoptosis, la citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCC) y la citotoxicidad dependiente de complemento (CDC), en una célula que expresa CD20. En un aspecto, la condición médica es el linfoma no-Hodgkin.
Un aspecto de la invención es un conjugado de un anticuerpo anti-CD20 o de un fragmento del mismo, que comprende al anticuerpo o al fragmento del mismo, ligado a un agente citotóxico. Los agentes citotóxicos utilizados en el conjugado pueden ser maitansinoides, análogos dé maitansinoides, benzodiazepinas, taxanos, CC-1065, análogos de CC- 1065, duocarmicina, análogos de duocarmicina, enodiínos tales como la caliqueamicina, la dolastatina, los análogos de dolastatina, incluyendo las auristatinas, los derivados de tomaimicina y los derivados de la leptomicina.
Los agentes citotóxicos más preferidos son los maitansinoides y los análogos de los maitansinoides, las benzodiazepinas, los taxanos, el CC-1065 y los análogos de CC-1065.
Los maitansinoides y los análogos maitansinoides se encuentran entre los agentes citotóxicos preferidos. Ejemplos de maitansinoides adecuados son conocidos por las personas expertas en la materia e incluyen a los ésteres de maitansinol y a los análogos de maitansinol. Maitansinoides adecuados se describen, por ejemplo, en las patentes de los Estados Unidos de Norte América No.: 4,424,219; 4,256,746; 4,294,757; 4,307,016; 4,313,946; 4,315,929; 4,331 ,598; 4,361 ,650; 4,362,663; 4,364,866; 4,450,254; 4,322,348; 4,371 ,533; 6,333,410; 5,475,092; 5,585,499; 5,846,545; 6,444,163; 6,716,821 ; 7,276,497, 7,473,796 y en la publicación de los Estados Unidos de Norte América No.: 20050169933.
Los taxanos también son agentes citotóxicos preferidos. Los taxanos adecuados para su uso en la presente invención se revelan, por ejemplo, en la patentes de los Estados Unidos de Norte América No.: 6,372,738; 6,340,701 ; 6,436,931 ; 6,596,757; 7,441 ,063; 7,495,1 14 y 7,598,290.
Uno de los candidatos para la preparación de los conjugados citotóxicos son los análogos de la CC-1065, la cual es un potente antibiótico anti-tumoral aislado del caldo de cultivo de la Streptomyces zelensis. El CC 1065 es, aproximadamente, 000 veces más potente in vitro que las drogas normalmente utilizadas contra el cáncer, tales como la doxorrubicina, el metotrexato y la vincristina (B.K. Bhuyan y col., Cáncer Res., 42, 3532 a 3537 (1982)). Los análogos de CC-1065 son también drogas citotóxicas preferidas para su utilización en la presente invención. El CC-1065 y sus análogos se describen en las patentes de los Estados Unidos de Norte América No.: 6.756.397, 7.049.316, 7.388.026, 6.372.738, 6.340.701 , 5.846.545 y 5.585.499.
Los derivados de las benzodiazepinas son también drogas citotóxicas adecuadas para su uso en la presente invención. Las pirrolobenzodiazepinas, tales como las descritas en la publicación de los Estados Unidos de Norte América No.: 20090036431 y en la solicitud de patente europea EP N ° 2019104, son drogas citotóxicas adecuadas.
También son adecuados los derivados de las benzodiazepinas, tales como las descritas en la patente provisional de los Estados Unidos de Norte América No.: 61/150.201.
Las drogas citotóxicas tales como el metotrexato, el cisplatino, el carboplatino, la daunorubicina, la vincristina, la vinblastina, el melfalan, la mitomicina C, el clorambucilo y la morfolino doxorrubicina, también son adecuadas para la preparación de los conjugados de la presente invención.
Con el fin de enlazar el agente citotóxico al anticuerpo, se utiliza un grupo de enlace. Los grupos de enlace adecuados, escindibles y no escindibles, se describen en el presente documento y son bien conocidos en la técnica, e incluyen a los grupos disulfuro, los grupos tioéter, los grupos lábiles a los ácidos, los grupos fotolábiles, los grupos lábiles a la peptidasa y los grupos lábiles a la ésterasa. Los grupos de enlace preferidos son los grupos de enlace disulfuro y los grupos tioéter, especialmente los que se describen en la patente de Estados Unidos de Norte América No.: 6.913.748, las publicaciones de las patentes de los Estados Unidos de Norte América No.: 20050169933, 20090274713 y la solicitud de patente PCT WO2009/0134976. Por ejemplo, los conjugados se pueden construir utilizando una reacción de intercambio de disulfuros o mediante la formación de un enlace tioéter entre el anticuerpo y el agente citotóxico. Los enlazadores preferidos para la modificación de anticuerpos para dar conjugados enlazados por disulfuros son el /V-succinimidil 4- (2-piridilditio) pentanoato (SPP), el /V-succinimidil 4-(2-piridilditio) butanoato (SPDB) o el /V-succinimidilo 4-(2-piridilditio)-2-sulfobutanoato (sulfó-SPDB).
La presente invención incluye aspectos en donde la conjugación de los maitansinoides al anticuerpo a través de enlazadores no escindibles aumenta su potencia, permitiendo al mismo tiempo, alcanzar dosis altas in vivo, de tal manera que la actividad funcional inherente de los anticuerpos anti-CD20 o de los fragmentos de los mismos, sea preservada. Los enlazadores no escindibles preferidos para modificar al anticuerpo o a un fragmento del mismo, para obtener un enlace tioéter con el maitansinoide, son el N-succinimidilo 4-(maleimidometil) ciclohexanocarboxilato (SMCC), el /V-sulfosuccinimidil 4-(maleimidometil) ciclohexanocarboxilato (sulfoSMCC) y el A/-succinimidil -4-(iodoacetil)-aminobenzoato (SIAB).
La presente invención también incluye aspectos en donde los enlazadores descritos en el presente documento son hidrofílicos (por ejemplo, por la incorporación de PEG) y contribuyen a aumentar la actividad del fármaco. Por lo tanto, otro aspecto de la invención incluye la mejora de ' la manera en que las drogas están enlazadas a un anticuerpo anti-CD20, de manera tal que el diseño del enlazador proporciona conjugados que son activos en un amplio espectro de tumores, particularmente en tumores con baja expresión de antígenos o en tumores resistentes a las drogas. Adicionalmente, la incorporación de estos enlazadores hidrofílicos permite la conjugación de hasta 15 moléculas de droga por molécula de anticuerpo, con un alto rendimiento y sin agregación ni precipitación. Estos conjugados de enlazadores hidrofílicos con hasta 15 moléculas de droga, enlazadas por cada anticuerpo, se unen con gran afinidad al antígeno CD20 diana (similar a la de los anticuerpos sin modificar). Un enlazador hidrofílico preferido para la modificación de los anticuerpos es el éster de A-succinimidilo-[(N-maleimidopropionamido)-tetraetilenglicol] (SNS-PEG4-maleimida).
La presente invención también incluye aspectos en donde los enlazadores descritos en el presente documento carecen de un átomo de azufre, tales como los enlazadores derivados de las porciones basadas en ácidos dicarboxílicos (ver la publicación de los Estados Unidos de Norte América No.: 2005016993).
La presente invención también incluye aspectos en donde los enlazadores descritos en el presente documento están cargados, en donde las cargas se mantienen, tanto luego de la modificación del anticuerpo anti-CD20 o del fragmento del mismo, como en el conjugado de droga resultante.
La presente invención también incluye aspectos en donde alrededor de 2-8 moléculas de droga están enlazadas a un anticuerpo anti-CD20 o a un fragmento del mismo. Un aspecto preferido es un conjugado en donde alrededor de 2-8 moléculas de droga están enlazadas a un anticuerpo anti-CD20 o a un fragmento del mismo, y en donde la muerte celular del conjugado es más eficaz respecto a la de un conjugado con una carga de droga de un número menor o mayor de drogas enlazadas al mismo anticuerpo anti-CD20.
Aún otro aspecto más de la presente invención es un método para el tratamiento del cáncer sensible al tratamiento con dicho método, que comprende la administración parenteral a un paciente que lo necesite de una dosis efectiva de una composición que comprende el conjugado de fórmula CB [-X,- (- CH2-CH2-0-)n-Yp-D]m (fórmula II) o D-Yp-(-CH2-CH2-0-)n-X1]m-CB (fórmula II') en donde, CB representa un anticuerpo anti-CD20; D representa una droga; X representa un unidad alifática, aromática o heterocíclica unida al agente de enlace a la célula mediante un enlace tioéter, un enlace amida, un enlace de carbamato o un enlace éter; Y representa una unidad alifática, aromática o heterocíclica unida a la droga mediante un enlace covalente seleccionado del grupo que consiste en un enlace tioéter, un enlace amida, un enlace carbamato, un enlace éter, un enlace amina, un enlace carbono-carbono y un enlace hidrazona; I es 0 o 1 ; p es 0 o 1 ; m es un entero de 2 a 15, y n es un entero de 1 a 2000.
Es importante destacar que los conjugados que se describen en esta invención son muy potentes y eficaces hacia las células que expresan CD20 resistentes a las multidrogas {mdr (por sus siglas en Idioma Inglés)), las cuales tienen poca sensibilidad al tratamiento con drogas citotóxicas. Por ejemplo, la terapia del cáncer representa un obstáculo en los mecanismos de superación de la resistencia a los medicamentos que, a menudo, se encuentran después de varias rondas de tratamiento con diferentes agentes quimioterápicos. Uno de tales mecanismos observados en las células cancerosas se denomina resistencia a múltiples drogas y es causado por una exportación de drogas incrementada por parte de los transportadores del cásete de unión al ATP (ABC, por sus siglas en idioma inglés) (C. Drumond, Sikic B. I., J. Clin. Oncology, 1999, 17, 1061 -1070, G, Szokacs y col., Nature Reviews, 5; 219 a 234, 2006). Las terapias que solucionan estos mecanismos de resistencia a los medicamentos, tal como interferir con o superar este flujo de salida de drogas por las células cancerosas, poseen un valor significativo.
Un aspecto de la invención es una composición que comprende un anticuerpo o un fragmento y/o un conjugado de los mismos. Todavía otro aspecto de la invención es una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o un fragmento y/o un conjugado de los mismos y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En un aspecto de la invención, el anticuerpo o el fragmento de la composición farmacéutica comprende un conjugado y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La presente invención incluye una composición (por ejemplo, una composición farmacéutica), que comprende conjugados de anticuerpos anti-CD20 o de un fragmento del mismo, y un vehículo (por ejemplo, un vehículo farmacéuticamente aceptable).
La presente invención también incluye una composición (por ejemplo, una composición farmacéutica), que comprende anticuerpos anti-CD20 o fragmentos de los mismos, conjugados y un vehículo (un vehículo farmacéuticamente aceptable), comprendiendo además un segundo agente terapéutico. Las presentes composiciones son útiles para inhibir el crecimiento de las células anormales o para tratar una enfermedad proliferativa en un mamífero (por ejemplo, en un humano). Las presentes composiciones también son útiles para tratar la depresión, la ansiedad, estrés, fobias, pánico, disforia, trastornos psiquiátricos', dolor y enfermedades inflamatorias en un mamífero (por ejemplo, un humano).
En un aspecto de la invención, un reactivo de diagnóstico comprende una composición que posee un anticuerpo o un fragmento del mismo y/o un conjugado de los mismos, tal y como se describe en el presente documento, en donde el anticuerpo o el fragmento se encuentra marcado. En un aspecto de la invención, la marcación del anticuerpo, del fragmento y/o del conjugado se selecciona del grupo que consiste de un radiomarcador, un fluoróforo, un cromóforo, un agente de imagen y un ión metálico.
En un aspecto de la invención, se provee un método para la unión específica a una célula que expresa CD20. En un aspecto de la invención, la CD20 es expresada por una célula B. En un aspecto de la invención, la célula que expresa a la CD20 es una célula cancerosa. En un aspecto de la invención, el anticuerpo o el fragmento se une a una célula cancerosa seleccionada del grupo que consiste en los linfomas de las células B, incluyendo la NHL (por sus siglas en Idioma Inglés) , el linfoma /leucemia linfoblástica del precursor de la célula B y los neoplasmas de las células B maduras, tal como la leucemia linfocítica crónica (CLL (por sus siglas en Idioma Inglés)), el linfoma linfocítico pequeño (SLL (por sus siglas en Idioma Inglés)) de las células B, la leucemia prolinfocítica de células B, el linfoma linfoplasmacítico, el linfoma de las células del manto (MCL (por sus siglas en Idioma Inglés) ), el linfoma folicular (FL (por sus siglas en Idioma Inglés)), incluidos FL de grado bajo, intermedio y alto, el linfoma cutáneo de centro folicular, el linfoma de las células B de la zona marginal (tipo MALT (por sus siglas en Idioma Inglés), tipo nodal y tipo esplénico), la leucemia de células pilosas, el linfoma difuso de las células B grandes, el linfoma de Burkitt, plasmocitoma, el mieloma de las células del plasma, el trastorno linfoproliferativo post-trasplante, la macroglobulinemia de Waldenstrom y el linfoma anaplásico de células grandes (ALCL (por sus siglas en Idioma Inglés)).
En otro aspecto de la invención, la célula que expresa CD20 influye en la respuesta inmune no deseada. En otro aspecto de la invención, la célula que expresa CD20 influencia a la inflamación.
Los anticuerpos anti-CD20, los conjugados de los mismos y las composiciones que los comprenden, son útiles para el tratamiento o para disminuir la gravedad de los trastornos, como por ejemplo, los caracterizados por un crecimiento anormal de las células (por ejemplo, el cáncer y las enfermedades inmunes y los trastornos). Otras aplicaciones de esta invención incluyen, pero no están limitadas por, los co-tratamientos de la osteoporosis, la depresión, la ansiedad, el estrés, las fobias, el pánico, la disforia, los trastornos psiquiátricos y el dolor o como antiepilépticos, antibacterianos, hipotensores y diuréticos, hipolipemiantes y anti-depresivos.
En un aspecto de la invención, se provee un método para inhibir el crecimiento de una célula cancerosa que comprende contactar la célula con un anticuerpo, fragmento del anticuerpo y/o un conjugado del mismo.
En un aspecto de la invención, se provee un método para el tratamiento de un paciente que tiene un cáncer, que comprende administrar al paciente una cantidad efectiva del anticuerpo, fragmento y/o conjugado de los mismos, que se describen en el presente documento. En un aspecto de la invención, el tratamiento además comprende administrar a dicho paciente un agente terapéutico. En un aspecto de la invención, el agente terapéutico es un agente citotóxico.
En otro aspecto, la invención es un anticuerpo o un fragmento citolítico específico para CD20 y/o un conjugado de los mismos, útiles en el tratamiento de enfermedades inflamatorias, tal como la artritis reumatoide y similares. En un aspecto adicional, la invención es un anticuerpo citolítico dirigido a CD20 y/o un conjugado del mismo, útil en el tratamiento de la artritis reumatoide en combinación con metotrexato. En un aspecto, la invención es un anticuerpo citolítico específico para CD20 y/o un conjugado del mismo, útil en el tratamiento de la artritis reumatoide en combinación con metotrexato, en pacientes con artritis reumatoide moderada a severa activa, que presentan una respuesta inadecuada a una o más terapias antagonistas del TNF.
En un aspecto de la invención, el anticuerpo, fragmento y/o conjugado de los mismos es un método para el tratamiento de un paciente que padece cáncer, que comprende administrar a dicho paciente una cantidad efectiva del conjugado que se describe en el presente documento. En un aspecto de la invención, el cáncer es un cáncer tratable seleccionado del grupo que consiste en los linfomas de las células B, incluyendo NHL, el linfoma /leucemia linfoblástica del precursor de las células B y a los neoplasmas de las células B maduras, tales como la leucemia linfocítica crónica (CLL), el linfoma linfocítico pequeño (SLL) de las células B, la leucemia prolinfocítica de las células B, el linfoma linfoplasmacítico, el linfoma de las células del manto (MCL), el linfoma folicular (FL), incluyendo FL de grado bajo, intermedio y alto, el linfoma cutáneo del centro folicular, el linfoma de las células B de la zona marginal (tipo MALT, tipo nodal y tipo esplénico), la leucemia de las células pilosas, el linfoma difuso de las células B grandes, el linfoma de Burkitt, el plasmocitoma, el mieloma de las células del plasma, el trastorno linfoproliferativo post-trasplante, la macroglobulinemia de Waldenstrom y el linfoma anaplásico de células grandes (ALCL) .
En un aspecto de la invención, se provee un método para diagnosticar a un sujeto que se sospecha padece cáncer, que comprende administrar al sujeto un reactivo de diagnóstico y detectar la distribución del reactivo en el sujeto. En un aspecto de la invención, el método de diagnóstico incluye el diagnóstico de un cáncer seleccionado del grupo que consiste en los linfomas de las células B, incluyendo NHL, el linfoma /leucemia linfoblástica del precursor de las células B y a los neoplasmas de las células B maduras, tal como la leucemia linfocítica crónica (CLL), el linfoma linfocítico pequeño (SLL) de las células B, la leucemia prolinfocítica de células B, el linfoma linfoplasmacítico, el linfoma de las células del manto (MCL), el linfoma folicular (FL), incluyendo FL de grado bajo, intermedio y alto, el linfoma cutáneo de centro folicular, el linfoma de las células B de la zona marginal (tipo MALT, tipo nodal y tipo esplénico), la leucemia de células pilosas, el linfoma difuso de las células B grandes, el linfoma de Burkitt, el plasmocitoma, el mieloma de las células del plasma, el trastorno linfoproliferativo post-trasplante, la macroglobulinemia de Waldenstrom y el linfoma anaplásico de células grandes (ALCL) En otro aspecto de la invención, se provee un método para el diagnóstico de un sujeto que se sospecha padece un trastorno inmunológlco, que comprende administrar a un sujeto el reactivo de diagnóstico y detectar la distribución del reactivo en el sujeto. En un aspecto de la invención, el método de diagnóstico incluye el diagnóstico de un trastorno inmunológico seleccionado del grupo que consiste en la artritis reumatoide, la artritis reumatoide juvenil, el lupus eritematoso sistémico (SLE {por sus siglas en Idioma Inglés)), la enfermedad de Wegener, la enfermedad inflamatoria intestinal, púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), púrpura trombocitopénica trombótica (TTP), la trombocitopenia autoinmune, la esclerosis múltiple, la psoriasis, la nefropatía IgA, las polineuropatías IgM, la miastenia gravis, la vasculitis, la diabetes mellitus, el síndrome de Raynaud, la enfermedad de Crohn, la colitis ulcerosa, la gastritis, la tiroiditis de Hashimoto, la espondilitis anquilosante y la vasculitis crioglobulinémica asociada a hepatitis C. Un aspecto preferido de la invención es un método para el diagnóstico en un sujeto que se sospecha padece de una enfermedad autoinmune o una enfermedad inflamatoria seleccionada del grupo que consiste en artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, lupus eritematoso sistémico (SLE), enfermedad de Wegener, la enfermedad inflamatoria intestinal, púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), púrpura trombocitopénica trombótica (TTP), trombocitopenia autoinmune, la esclerosis múltiple, la psoriasis, la nefropatía IgA, polineuropatías IgM, la miastenia gravis, la vasculitis, diabetes mellitus, síndrome de Raynaud, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, gastritis, tiroiditis de Hashimoto, la espondilitis anquilosante, vasculitis crioglobulinémica asociada con la hepatitis C, encefalitis focal crónica, pénfigo vesicular, la hemofilia A, la glomerulonefritis membranoproliferativa, la dermatomiositis adulta y juvenil, la polimiositis adulta, la urticaria crónica, la cirrosis biliar primaria, la neuromielitis óptica, la enfermedad distiroidea de Graves, penfigo vesicular, glonerulonefritis membranoproliferativa, síndrome de Churg-Strauss, el asma, la artritis psoriásica, la dermatitis, el síndrome de dificultad respiratoria, la meningitis, encefalitis, uveítis, el eczema, la aterosclerosis, la deficiencia de adhesión leucocitaria, la diabetes juvenil, la enfermedad de Reiter, la enfermedad de Behcet, la anemia hemolítica, la dermatitis atópica, el pénfigo vulgar, la granulomatosis de Wegener, el síndrome de Omenn, la falla renal crónica, la mononucleosis infecciosa aguda, las enfermedades asociadas con el VIH y el herpes, la esclerosis sistémica, la glomerulonefritis y el síndrome de Sjorgen. Cuando la enfermedad autoinmune es la artritis reumatoide, de manera opcional, los anticuerpos pueden ser administrados en combinación con un segundo agente terapéutico, el cual es, de preferencia, el metotrexato.
Otro aspecto de la invención es un método para inducir la apoptosis de las células B in vivo, que comprende poner en contacto las células B con un anticuerpo y/o un conjugado del mismo, de acuerdo con la presente invención, con el fin de matar a las células B.
La invención también proporciona métodos para el tratamiento de enfermedades mediante la administración de un anticuerpo que se una al CD20, un fragmento y/o un conjugado de los mismos, a un mamífero, tal como, por ejemplo, un paciente humano que padece una enfermedad. En cualquiera de los métodos para el tratamiento de una enfermedad autoinmune o de un cáncer que expresa CD20, en un aspecto, el anticuerpo es el CD20-7 o el CD20-6. Por lo tanto, uno de los aspectos es un método para tratar un cáncer CD20 positivo, que comprende administrar a un paciente que padece cáncer, una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo que se une a CD20 y/o de un conjugado de la invención. En un aspecto preferido, el cáncer que expresa CD20 es un linfoma o una leucemia de células B que expresan CD20, tal como el linfoma no Hodgkin (NHL) o la enfermedad de Hodgkin con predominio de linfocitos (LPHD ), leucemia linfocítica crónica (CLL) o SLL. En un aspecto del método de tratamiento de un linfoma o de una leucemia de las células B, el anticuerpo y/o el conjugado del mismo se administra en un rango de dosis de alrededor de 20 a 2000 mg/m2. En otros aspectos adicionales, el método de tratamiento comprende además administrar al paciente por lo menos un agente quimioterapéutico, en donde para el linfoma no-Hodgkin (NHL), el agente quimioterapéutico se selecciona del grupo que consiste en la doxorrubicina, la ciclofosfamida, la vincristina y la prednisolona.
También se proporciona un método para tratar una enfermedad autoinmune o un enfermedad inflamatoria, que comprende administrar a un paciente que padece de una enfermedad autoinmune o un enfermedad inflamatoria, una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo que une a CD20, un fragmento y/o un conjugado de los mismos, según lo discutido en el presente documento. La enfermedad autoinmune o inflamatoria se selecciona del grupo que consiste en la artritis reumatoide, la artritis reumatoide juvenil, el lupus eritematoso sistémico (SLE), la enfermedad de Wegener, la enfermedad inflamatoria intestinal, púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), púrpura trombocitopénica trombótica (TTP), trombocitopenia autoinmune, la esclerosis múltiple, la psoriasis, la nefropatía IgA, las polineuropatías IgM, la miastenia gravis, la vasculitis, la diabetes mellitus, el síndrome de Raynaud, la enfermedad de Crohn, la colitis ulcerosa, la gastritis, la tiroiditis de Hashimoto, la espondilitis anquilosante, la vasculitis crioglobulinémica asociada a hepatitis C, la encefalitis crónica focal, penfigo vesicular, la hemofilia A, la glomerulonefritis membranoproliferativa, la dermatomiositis adulta y juvenil, la polimiositis adulta, la urticaria, crónica, la cirrosis biliar primaria, la neuromielitis óptica, la enfermedad distiroide de Graves, penfigo vesicular, la glomerulonefritis membranoproliferativa, el síndrome de Churg-Strauss, el asma, la artritis psoriásica, la dermatitis, el síndrome de dificultad respiratoria , la meningitis, la encefalitis, la uveítis, el eczema, la aterosclerosis, la deficiencia en la adhesión de los leucocitos, la diabetes juvenil, la enfermedad de Reiter, la enfermedad de Behcet, la anemia hemolítica, la dermatitis atópica, el pénfigo vulgar, la granulomatosis de Wegener, el síndrome de Omenn, la insuficiencia renal crónica, la mononucleosis infecciosa aguda, las enfermedades asociadas con VIH y herpes, la esclerosis sistémica, el síndrome de Sjorgen y la glomerulonefritis. Cuando la enfermedad autoinmune es la artritis reumatoide, de manera opcional, los anticuerpos pueden ser administrados en combinación con un segundo agente terapéutico, el cual es, de preferencia, metotrexato.
En un aspecto, la invención proporciona un método para tratar una enfermedad autoinmune o una, enfermedad inflamatoria seleccionada del grupo que consiste en la dermatomiositis, la granulomatosis de Wegner, ANCA, la anemia aplásica, la anemia hemolítica autoinmune (AIH, por sus siglas en Idioma Inglés), la deficiencia de factor VIII, hemofilia A, la neutropenia autoinmune, el síndrome de Castleman, el síndrome de Goodpasture, el rechazo al trasplante de órganos sólidos, la enfermedad injerto contra huésped (GVHD, por sus siglas en Idioma Inglés)), IgM mediada, púrpura trombótica trombocitopénica (TPP, por sus siglas en Idioma Inglés), la tiroiditis de Hashimoto, la hepatitis autoinmuríie, la neumonitis intersticial linfoide (HIV), la bronquiolitis obliterante (no-trasplante ) vs NSIP, el síndrome de Guillain-Barré, la vasculitis de grandes vasos, la arteritis de células gigantes ( de Takayasu), la vasculitis de vasos medios, la enfermedad de Kawasaki y la poliarteritis nodosa, que comprende administrar a un paciente que padece de la enfermedad, una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo que se une a CD20 y/o un conjugado. En un aspecto de este método, el anticuerpo que se une a CD20 es CD20-7 o CD20-6.
En los métodos de tratamiento de los solicitantes de la presente, los anticuerpos que se unen a CD20 y/o los conjugados de los mismos, se pueden administrar solos o en combinación con un segundo agente terapéutico, tal como un segundo anticuerpo, un agente quimioterapéutico o un agente inmunosupresor. El segundo anticuerpo, el fragmento y/o el conjugado de los mismos puede ser uno tal que se una a CD20 o a antígenos diferentes de las células B o a antígenos de las células NK o de las células T. En un aspecto, el segundo anticuerpo, el fragmento y/o sus conjugados, es un anticuerpo anti-CD20 radiomarcado. En otros aspectos, el anticuerpo que se une a CD20 está conjugado con un agente citotóxico tal como una toxina o un isótopo radiactivo.
La presente invención incluye un método para inhibir las células B no deseadas y/o el crecimiento de células anormales o para tratar una enfermedad proliferativa en un mamífero (por ejemplo, en un humano) que comprende administrar a dicho mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de los anticuerpos ant¡-CD20 y/o sus conjugados (y/o los solvatos y sales de los mismos) o una composición de los mismos, ya sea solos como en combinación con un segundo agente terapéutico.
Un aspecto de la invención es una formulación líquida que comprende un anticuerpo CD20 y/o un conjugado del mismo, a aproximadamente 20 mg/mL de anticuerpo, aproximadamente 10 mM de sulfato de histidina a pH 5,8, aproximadamente 60 mg/ml de sacarosa (6 %) y aproximadamente 0,2 mg/ml de polisorbato 20 (0,02 %).
La invención también proporciona diversos ácidos nucleicos aislados que codifican a cualquiera de los anticuerpos revelados en el presente documento, incluyendo un vector de expresión para expresar el anticuerpo y/o a los fragmentos de . los anticuerpos. Un aspecto de la invención incluye uno o varios polinucleótido(s) que codifica(n) al anticuerpo o a un fragmento, tal como se describe en el presente documento.
En un aspecto de la invención, el polinucleótido codifica una cadena liviana o una cadena pesada del anticuerpo, del fragmento y/o de un conjugado de los mismos y el polinucleótido, es un ADN o un ARN. En un aspecto de la invención, el polinucleótido es en un vector. En otro aspecto de la invención, el vector es un vector de expresión capaz de expresar dicho anticuerpo o fragmento.
La invención proporciona un ácido nucleico aislado que comprende la secuencia de nucleotidos de las SEQ ID NOs: 8-16, o una variante degenerada de estas secuencias, o similares. Uno de los aspectos es un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia que codifica un polipéptido con la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 1 -7 y 17-36, que tiene, opcionalmente, sustituciones conservadoras de aminoácidos.
Otro aspecto es un vector que comprende un ácido nucleico que se describe en el presente documento, incluyendo un vector de expresión para la expresión en una célula huésped. Se incluye también una célula huésped que comprende al vector Otro aspecto de la invención incluye células huésped que comprenden ácidos nucleicos, y células huésped que producen los anticuerpos o los fragmentos. En un aspecto preferido de este último, la célula huésped es una célula CHO o una célula NSO.
Se proporciona un método para producir los anticuerpos y/o los conjugados de los mismos, que comprende el cultivo de la célula huésped que produce el anticuerpo y la recuperación de los anticuerpos de los cultivos celulares.
La presente invención incluye un método de síntesis y la utilización de los anticuerpos anti-CD20 y/o los conjugados, en el diagnóstico o en el tratamiento de células de mamíferos, organismos o condiciones patológicas asociados in vitro, in situ e in vivo.
Los aspectos de la presente invención se pueden proporcionar en un artículo de fabricación o en un kít.
Para su uso en el diagnóstico o en el tratamiento de un sujeto, el artículo de fabricación comprende, además, un prospecto que indica que la composición se utiliza para diagnosticar o para tratar la enfermedad o el trastorno apropiados.
En un aspecto preferido, de todos los anticuerpos, los fragmentos de anticuerpos, los conjugados, las composiciones y los métodos de uso de esta invención, el anticuerpo que se une a CD20, con su superficie acondicionada, es el CD20-7 y posee una secuencia de aminoácidos de cadenas liviana y pesada, tal como se describe en el presente documento.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra los histogramas de unión del anticuerpo a las células control 300-19 no transfectadas (paneles de la izquierda) y a las células 300-19 que expresan CD20 (paneles de la derecha). Los histogramas se muestran para la tinción con 10 nM muCD20-6 (arriba), muCD20-7 (centro) y la ausencia de anticuerpo primario (abajo).
Las Figuras 2A y. 2B muestran la unión de muCD20-7 (Figura 2A) y muCD20-6 (Figura 2B) a células BJAB según lo ensayado mediante citometría de flujo. La curva de unión fue utilizada para determinar la EC50 de unión del anticuerpo, la cual corresponde a la Kd aparente del anticuerpo.
Las Figuras 3A y 3B muestran los resultados de un ensayo con Anexina-V utilizando (Figura 3A) células del linfoma de Ramos incubadas con una concentración de 10 nM de rituximab, muCD20-2, muCD20-5, muCD20-6 o muCD20-7 y (Figura 3B) células del linfoma Raji incubadas con una concentración de 10 nM de rituximab, B1 , muCD20-2 o muCD20-7. Las muestras control se incluyen como comparación.
Las Figuras 4A y 4B muestran los resultados de un ensayo de balsa lipídica utilizando células de Ramos teñidas con anticuerpos anti-CD20 o anticuerpos de control de isotipos mulgGI a una concentración de 10 pg/mL. MFI para FL1 de las muestras en ausencia (barras negras) y en presencia (barras abiertas) de Triton-X 100 se gráfica para cada tratamiento con anticuerpo. Los anticuerpos ensayados fueron (Figura 4A) muCD20-2, muCD20-7, rituximab, anticuerpo control mulgG y (Figura 4B) muCD20-2, muCD20-5, muCD20-6, muCD20-7, anticuerpo control mulgG.
La Figura 5 muestra los resultados de un ensayo con Anexina-V utilizando células del linfoma de Ramos incubadas con una concentración de 10 nM de chCD20-2, chCD20-7, rituximab o control ((no Ab, sin anticuerpo) Las Figuras 6A y 6B muestran los resultados de ensayos CDC en células de Daudi (Figura 6A) y en células WSU-DLCL-2 (Figura 6B) incubadas con chCD20-2, chCD20-7, rituximab o un anticuerpo de control de isotipo hulgGI en presencia de suero humano que tiene complemento al 5%.
Las Figuras 7A y 7B muestran los residuos de superficie del CD20-7 y las sustituciones en las versiones con su superficie acondicionada para CD20-7 VL (Figura 7A) y CD20-7 VH (Figura 7B).
Las Figuras 8A y 8B muestran la alineación de las secuencias ejemplares de acondicionamiento de superficie para la región variable de CD20-7 vis-á-vis la secuencia contraparte murina. Ver, la Figura 8A para el dominio variable de la cadena liviana (VL); y la Figura 8B para el dominio variable de la cadena pesada (VH). Los guiones "-" denotan identidad con la secuencia murina.
La Figura 9 muestra la unión de muCD20-7, chCD20-7 y huCD20-7 pero no del anticuerpo de control de isotipos hulgd a las células BJAB, ensayadas mediante citometría de flujo. Las curvas de unión fueron utilizadas para determinar la EC50 de unión del anticuerpo, la cual corresponde a la Kd aparente para cada anticuerpo.
La Figura 10 muestra la unión de huCD20-7 a la preparación de membranas de las células de linfoma WSU-DLCL-2 mediante ELISA.
La Figura 1 muestra los resultados de un ensayo con Anexina-V en las células del linfoma de Ramos incubadas con muCD20-7, huCD20-7 o un anticuerpo de control de isotipos hulgGI a concentraciones de 10 nM, 1 n y 0.1 nM.
La Figura 12 muestra los resultados de un ensayo con Anexina-V en las células del linfoma de Ramos incubadas con huCD20-7, B1 , rituximab, GA101 -F y 2F2, a concentraciones en el rango de desde 3 x 10'8M a 1 .7 x 10"13M. Se compararon las muestras control. "B1 " corresponde a la forma de Bexxar® (Beckman Coulter) sin marcar; "GA 01 -F" corresponde a la versión fucosilada de afutuzumab oGA101 (Hoffman LaRoche) y "2F2" corresponde a ofatumumab (Genmab/GSK).
Las Figuras 13A a 13E muestran los resultados de ensayos con Anexina-V en células de linfoma incubadas con concentraciones de 10 nM de huCD20-7, B1 , o rituximab. Las muestras control con células sin tratar son utilizadas como comparación. Los Experimentos incluyeron (Figura 13A) células de Ramos, (Figura 13B) células de Raji, (Figura 13C) células WSU-DLCLr2, (Figura 13D) células Jeko-1 y (Figura 13E) células de linfoma Granta-519.
La Figura 14 muestra los resultados de un ensayo de balsa lipídica utilizando células de Ramos y anticuerpos huCD20-7, rituximab, 2F2 yGA101 -F a 10 pg/mL. MFI para FL1 de las muestras en ausencia (barras negras) y en presencia (barras blancas) de Triton-X 100 se gráfica para cada tratamiento con anticuerpo.
Las Figuras 15A a 15B muestran los resultados de ensayos CDC en (Figura 15A) células de linfoma de Daudi y (Figura 15B) células de linfoma de Ramos incubadas con huCD20-7, rituximab, GA101-F o un anticuerpo de control de isotipos hulgGI , en presencia de suero humano al 5%, que tiene complemento.
Las Figuras 16A y 16B muestran los resultados de ensayos CDC en (Figura 16A) células de linfoma WSU-DLCL-2 y (Figura 16B) células de linfoma RL incubadas con huCD20-7, rituximab o un anticuerpo de control de isotipos hulgGI en presencia de suero humano al 5%, que tiene complemento.
Las Figuras 17A y 17B muestran los resultados de un ensayo ADCC utilizando (Figura 1 A) células de linfoma de Ramos y (Figura 17B) células JVM-13 CLL, incubadas con huCD20-7, rituximab, 2F2 o un anticuerpo de control de isotipos hulgGI en presencia de células NK humanas purificadas, como células efectoras.
Las Figuras 8A y 18B muestran la unión de un panel de anticuerpos CD20 a células transfectadas con CD20 humano, ensayada mediante citometría de flujo, utilizando la Figura 18A huCD20-7, rituximab, 2F2, GA101 -F, B1 y Figura 18B muCD20-6 y muCD20-7.
Las Figuras 19A y 19B muestran la unión de un panel de anticuerpos CD20 a células transfectadas con CD20 A179S P172S humano, ensayada mediante citometría de flujo utilizando (Figura 19A) huCD20-7, rituximab, 2F2, GA101 -F, B1 y (Figura 19B) muCD20-6, muCD20-7, rituximab y 2F2.
Las Figuras 20A y 20B muestran la unión de un panel de anticuerpos CD20 a células transfectadas con CD20 N163D humano, ensayada mediante citometría de flujo utilizando (Figura 20A) huCD20-7, rituximab, 2F2, GA101 -F y (Figura 20B) muCD20-6, muCD20-7, rituximab y 2F2. , Las Figuras 21 A y 21 B muestran la unión de un panel de anticuerpos CD20 a células transfectadas con CD20 N163D N166D humano, ensayada mediante citometría de flujo utilizando (Figura 21 A) huCD20-7, rituximab, 2F2, GA101 -F y (Figura 21 B) muCD20-6, muCD20-7, rituximab y 2F2.
Las Figuras 22A y 22B muestran la unión de huCD20-7 en comparación con (Figura 22A) huCD20-7-SMCC-DM1 y -SPP-DM1 o (Figura 22B) conjugados huCD20-7-sulfomal-DM4 a una preparación de membrana de células de linfoma WSU-DLCL-2 mediante ELISA.
La Figura 23 muestra los resultados de un ensayo con Anexina-V en células del linfoma de Ramos incubadas con rituximab, huCD20-7, huCD20-7-SMCC-DM1 o huCD20-7-SPDB-DM4, a concentraciones en el rango de desde 3 x 10"8M a 1 x 10"1 M. Las células de Ramos fueron tratadas con las mismas concentraciones de conjugados de no-unión hulgG1 -SMCC-DM1 y hulgG1 -SPDB-DM4.
Las Figuras 24A y 24B muestra los resultados de ensayos CDC en (Figura 24A) células de linfoma de Daudi y (Figura 24B) células de linfoma WSU-DLCL-2 incubadas con huCD20-7, huCD20-7-SPDB-DM4, huCD20-7-PEG4-mal-DM4, rituximab O un anticuerpo de control de isotipos hulgGI en presencia de suero humano al 5% que tiene complemento.
Las Figuras 25A y 25B muestran los resultados de ensayos CDC en (Figura 25A) células del linfoma WSU-DLCL-2 y (Figura 25B) células del linfoma de Ramos incubadas con huCD20-7, huCD20-7-SMCC-DM1 , huCD20-7-sulfo-mal-DM4, rituximab o un anticuerpo de control de isotipos hulgGI , en presencia de suero humano al 5% que tiene complemento.
Las Figuras 26A y 26B muestran los resultados de ensayos ADCC en (Figura 26A) células del linfoma de Ramos y (Figura 26B) células del linfoma Granta-519 incubadas con huCD20-7, huCD20-7-SMCC-DM1 , rituximab, 2F2 o un anticuerpo de control de isotipos hulgGI , en presencia de células NK humanas purificadas como células efectoras.
Las Figuras 27A y 27B muestran los resultados de un ensayo de citotoxicidad WST-8 en (Figura 27A) células de Ramos y (Figura 27B) células de Daudi incubadas con huCD20-7, huCb20-7-SMCC-DM1 , rituximab o conjugado control hulgGI -SMCC-DM1 en concentraciones en el rango de entre 3 x 10'8M a 1 x 10"11M, durante 5 días.
Las Figuras 28A y 28B muestran los resultados de un ensayo de citotoxicidad WST-8 en (Figura 28A) células Granta-519 y (Figura 28B) células SC-1 incubadas conhuCD20-7, huCD20-7-SMCC-DM1 , rituximab o un conjugado control de no-unión hulgGI -S CC-DM1 en concentraciones en el rango de desde 3 x 10'8M hasta 1 x 10'11 , durante 5 días.
Las Figuras 29A y 29B muestran los resultados de un ensayo de citotoxicidad WST-8 en (Figura 29A) células de linfoma DOHH-2 de células B y (Figura 29B) células de leucemia Molt-4 de células T incubadas con huCD20-7, huCD20-7-SMCC-DM1 , rituximab o conjugado control hulgGI -S CC-DM1 a concentraciones en el rango de desde 3 x 10"8M hasta 1 x 10"11M, durante 5 días. Las células Molt-4 son negativas a CD20.
Las Figuras 30A y 30B muestran los resultados de un ensayo de citotoxicidad WST-8 en (Figura 30A) células de Ramos y (Figura 30B) células de Daudi incubadas con huCD20-7, huCD20-7-SMCC-DM1 , rituximab, rituximab-SMCC-DM1 o un anticuerpo de no-unión hulgGI y un conjugado control hulgGI -SMCC-DM1 a concentraciones en el rango de desde 3 x 10'8M hasta 1 x 10'1 1M, durante 5 días.
Las Figuras 31 A y 31 B muestran (Figura 31 A) la unión de huCD20-7, huCD20-7-SMCC-[3H]DM1 , rituximab o rituximab-SMCC-[3H]DM1 a las células SU-DHL-4, tal como se ensayó mediante citometría de flujo. La Figura 31 B representa los resultados de un ensayo de citotoxicidad de WST-8 en células de linfoma de célula B SU-DHL-4 positivas al antígeno y en células de cáncer de colon COLO205 negativas al antígeno, incubadas durante 5 días con huCD20-7, huCD20-7-S CC-[3H]DM1 , rituximab o rituximab-SMCC-[3H]DM1.
Las Figuras 32A y 32B muestran (Figura 32A) la cantidad de huCD20-7-SMCC-[3H]DM1 o de rituximab-SMCC-[3H]DM1 unido por célula SU-DHL-4 y (Figura 32B) la cantidad de metabolito de Lisina-SMCC-[3H]DM1 producido 22 h después de la exposición de las células SU-DHL-4 a huCD20-7-S CC-[3H]DM1 o a rituximab-SMCC-[3H]DM1.
Las Figuras 33A y 33B muestran los resultados de un estudio de toxicidad ejemplar WST-8 en células Granta-519 incubadas con (Figura 31 A) huCD20-7, huCD20-7-SMCC-DM1 , huCD20-7-PEG4-mal-DM4 y huCD20-7-SPDB-DM4 y (Figura 31 B) huCD20-7, huCD20-7-SMCC-DM1 , huCD20-7-SPP-DM1 , huCD20-7-sulfo-mal-DM4 y hulgG1 -SMCC-DM1 y conjugados control hulgG1 -SPP-DM1 a concentraciones en el rango de desde 3x10'8 M hasta 1 x10"11 M, durante 5 días.
La Figura 34 muestra resultados de experimentos utilizando un modelo de xenotransplante establecido, implantando de manera subcutánea células de linfoma de células B grandes difusas SU-DHL-4 en ratones SCID. Los ratones fueron tratados tres veces semanalmente en los días 14, 21 y 28 (flechas), luego de la inoculación de las células con 10 o 1 mg/kg de huCD20-7 o rituximab. El volumen tumoral medio de los diferentes grupos de tratamiento se gráfica respecto al tiempo luego de la inoculación de las células tumorales.
Las Figuras 35A y 35B muestran los resultados de un estudio de xenotransplante in vivo utilizando células del linfoma de Daudi implantadas de manera intravenosa en ratones SCID. Los ratones fueron tratados, una vez, el día 7 después de la inoculación con las células, con 10 mg/kg de huCD20-7, 10 mg/kg de huCD20-7-SMCC-DM1 o 5 mg/kg de huCD20-7-SPP-DM1 (Fig. 35A) y 10 mg/kg of huCD20-7, rituximab, huCD20-7-SMCC-DM1 o huCD20-7-BMPS-DM1 (Figura 35B). El número de ratones sobrevivientes en los diferentes grupos de tratamiento se gráfica respecto al tiempo, luego de la inoculación de las células tumorales.
La Figura 36 muestra los resultados de un estudio de xenotransplante ejemplar utilizando células de linfoma folicular DOHH-2 implantadas de manera subcutánea en ratones SCID. Los ratones fueron tratados una vez el día 3 luego de la inoculación con las células con 10 mg/kg de huCD20-7, 10 mg/kg de huCD20-7-SMCC-DM1 o 5 mg/kg de huCD20-7-SPP-DM1 . El volumen tumoral medio de los diferentes grupos de tratamiento se gráfica respecto del tiempo luego de la inoculación con las células tumorales.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona una nueva clase de anticuerpos anti-CD20 (es decir, Tipo III) que tienen una potencia alta en las siguientes tres actividades citotóxicas contra las células que expresan CD20 (por ejemplo, células positivas): inducción de la apoptosis, ADCC CDC. Asimismo, los conjugados de SMCC-DM1 con anticuerpos anti-CD20 con matan células que expresan CD20 inesperadamente bien, tal como se demuestra usando modelos tumorales in vivo.
Definiciones En todos los aspectos, un "grupo alifático" se define como un grupo alquilo, alquenilo o alquinilo. Un grupo alquilo es un grupo de hidrocarburos alifáticos, que puede ser de cadena recta o ramificada, de preferencia que tiene de 1 a 20 átomos de carbono en la cadena, o cíclicos, de preferencia que tienen de 3 a 10 átomos de carbono.
Los grupos alquilo preferidos tienen de 1 a 12 átomos de carbono en la cadena. "Ramificada" significa que uno o más grupos de alquilo inferior, tales como metilo, etilo o propilo, se encuentran unidos a una cadena de alquilo lineal. Ejemplos de grupos alquilo incluyen metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, n-butilo, t-butilo, n-pentilo, 3-pentilo, octilo, nonilo, decilo, ciclopentilo y ciclohexilo.
Un grupo alquenilo es un grupo de hidrocarburos alifáticos que contienen un enlace doble carbono-carbono y que puede ser recto o ramificado, de preferencia con 2 a 15 átomos de carbono en la cadena. Los grupos alquenilo más preferidos tienen de 2 a 12 átomos de carbono en la cadena y, más preferiblemente, de 2 a 4 átomos de carbono en la cadena. Ejemplos de grupos alquenilo incluyen etenilo, propenilo, n-butenilo, i-butenilo, 3-metilbut-2-enilo, n-pentenilo, heptenilo, octenilo, nonenilo y decenilo.
Un grupo alquinilo es un grupo de hidrocarburos alifáticos que contienen un enlace carbono-carbono triple y que puede ser recto o ramificado, de preferencia con 2 a 15 átomos de carbono en la cadena. Los grupos alquinilo más preferidos tienen de 2 a 12 átomos de carbono en la cadena y, más preferiblemente, de 2 a 4 átomos de carbono en la cadena. Ejemplos de grupos alquinilo incluyen etínilo, propinilo, n-butinilo, 2-butinilo, 3-metilbutinilo, n-pentinilo, octinilo, heptimilo y decinilo.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "grupo aromático", quiere decir un grupo arilo sustituido o no sustituido que consiste en un sistema de anillos de hidrocarburos aromáticos monocíclicos o multicíclicos de 6 a 14 átomos de carbono, preferentemente de 6 a 10 átomos de carbono. Entre los ejemplos de grupos arilo se incluyen fenilo y haftilo. Los sustituyentes incluyen, pero no están limitados por, los grupos alquilo, halógeno, nitro, amino, hidroxilo y grupos alcoxi C C3, tal como metoxi, etoxi y propoxi.
Los términos "heterociclo", "heterociclilo" y "grupo heterocíclico" se refieren a anillos mono, bi o multicíclicos, no- aromáticos y estables, saturados, parcialmente saturados o insaturados, de 3 a 14, preferiblemente de 5 a 10 miembros de anillos, en donde, por lo menos, un miembro del anillo es un heteroátomo o un anillo aromático, preferiblemente de 5 a 10 miembros, mono-, bi-o multicíclico, que tiene, al menos, un heteroátomo. Normalmente, entre los heteroátomos se incluyen, pero no están limitados por, los átomos de oxígeno, nitrógeno, azufre, selenio y fósforo. Los heteroátomos preferidos son oxígeno, nitrógeno y azufre. Los heterociclos se describen en Paquette Leo A., " The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A series of Monographs" (W.A. Benjamín, Nueva York, 1968), en particular los capítulos 1 , 3, 4, 6, 7 y 9, " The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A series of Monographs " (John Wiley & Sons, Nueva York, 1950 al presente), en particular, en los volúmenes 13, 14, 16, 19 y 28, y J. Chem. Soc. (1960) 82:5566. Los "heterociclilos" también incluyen radicales, en donde los radicales de heterociclo se funden con un anillo saturado, parcialmente insaturado, o con un anillo aromático carbocíclico o heterocíclico.
Las unidades alifáticas, aromáticas y heterocíclicas también puede poseer un sustituyeme cargado. El sustituyeme cargado puede ser un grupo con carga negativa, seleccionado entre, pero no limitado por, carboxilato, sulfonato y fosfato, o un grupo cargado positivamente, seleccionado de un grupo amino terciario o cuaternario.
El término "heteroarilo" se refiere a un radical aromático monovalente de anillos de 5 o 6 miembros, e incluye sistemas de anillos fusionados (en los que por lo menos uno de ellos es aromático) de 5-18 átomos, que contienen uno o más heteroátomos seleccionados independientemente de nitrógeno, oxígeno y azufre. Ejemplos de grupos heteroarilo son piridinilo (incluyendo, por ejemplo, 2-hidroxipiridinilo), imidazolilo, ¡midazopiridinilo, pirimidinilo (incluyendo, por ejemplo, 4-hidroxipirimidinilo), pirazolilo, triazolilo, pirazinilo, tetrazolilo, furilo, tienilo, tiazolilo, isoxazolilo, oxazolilo isotiazolilo, pirrolilo, quinolinilo, isoquinolinilo, indolil, benzimidazolilo, benzofuranilo, cinolinilo, indazolilo, indoliziniloi ftalazinilo, piridazinilo, triazinilo, isoindolilo, pteridinilo, purinilo, oxadiazolilo, triazolilo, tiadiazolilo, furazanilo, benzofurazanilo, benzotiofenilo, benzotiazolilo, quinazolinilo benzoxazolilo, quinoxalinilo, naftiridinilo y furopiridinilo.
Los grupos heterociclo o heteroarilo pueden ser de carbono (carbono-enlazados) o de nitrógeno (nitrógeno-enlazados) unidos cuando ello sea posible. A modo de ejemplo y sin limitación, los heterociclos unidos por carbonos y los heteroarilos están en la posición 2, 3, 4, 5 o 6 de una piridina, en la posición 3, 4, 5 o 6 de una piridazina, en la posición 2, 4, 5 o 6 de una pirimidina, en la posición 2, 3, 5 o 6 de una pirazina, en la posición 2, 3, 4 o 5 de un furano, tetrahidrofurano, tiofurano, tiofeno, pirrol o tetrahidropirrol, en la posición 2, 4 o 5 de un oxazol, imidazol o tiazol, en la posición 3, 4 o 5 de un isoxazol, pirazol, o isotiazol, en la posición 2 o 3 de una aziridina, en la posición 2, 3 o 4 de una azetidina, en la posición 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 de una quinoleína o en la posición 1 , 3, 4, 5, 6, 7 u 8 de una isoquinolina.
A modo de ejemplo y sin limitaciones, los heterociclos y heteroarilos unidos por nitrógeno están unidos en la posición 1 de una aziridina, azetidina, pirrolidina, pirrol, 2-pirrolina, 3-pirrolina, imidazol, imidazolidina, 2-imidazolina, 3-imidazolina, pirazol, pirazolina, 2-pirazolina, 3-pirazolina, piperidina, piperazina, indol, indolina, 1 H-indazol, en la posición 2 de un isoindol o un isoindolina, en la posición 4 de un morfolina y en la posición 9 de carbazol u O- carbplina.
Los heteroátomos presentes en los grupos heteroarilo y heterociclilo incluyen las formas oxidadas tales como el NO, SO y S02. Los sustituyentes de heteroarilos o de heterocíclicos incluyen, pero no están limitados por, los grupos alquilo, halógeno, nitro, amino, grupos hidroxilo y alcoxi C C3, tales como metoxi, etoxi y propoxi.
Los "halógenos" incluyen los átomos de flúor, cloro, bromo y yodo. Los átomos de flúor y cloro son los preferidos.
El término "conjugado" tal como se usa en el presente documento, se refiere a un compuesto o un derivado del mismo, que está unido a un agente de unión a la célula (es decir, un anticuerpo anti-CD20 o un fragmento del mismo) y se define mediante la fórmula genérica: C-L-CBA, en donde C = al compuesto, L = al enlazador, y CBA = al agente de unión a la célula, el anticuerpo anti-CD20 o un fragmento del mismo. En algunas realizaciones, también se puede usar de la misma manera la fórmula genérica: D-L-CBA, en donde D = a la droga , L = al enlazador y CBA = al agente de unión a la célula, el anticuerpo anti-CD20 o un fragmento del mismo.
Un enlazador es cualquier porción química que sea capaz de enlazar un compuesto, por lo general una droga, tal como un maitansinoide, a un agente de unión a la célula, tal como un anticuerpo anti CD20 o un fragmento del mismo, de una manera estable y covalente. Los enlazadores pueden ser susceptibles, o ser sustancialmente resistentes, a una escisión inducida por ácidos, a una escisión inducida por luz, a una escisión inducida por peptidasas, a una escisión inducida por ésterasas y a una escisión de enlaces disulfuro, bajo condiciones en las que el compuesto o el anticuerpo se mantienen activos. Los enlazadores adecuados son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, a los grupos disulfuro, los grupos tioéter, los grupos lábiles a los ácidos, los grupos fotolábiles, los grupos lábiles a la peptidasa y los grupos lábiles a la esterasa. Los enlazadores también incluyen enlazadores cargados y las formas hidrof ílicas de los mismos, tal como se describe en el presente documento y se conoce en la técnica.
"El crecimiento anormal de las células", tal como se usa en el presente documento, a menos que se indique lo contrario, se refiere a un crecimiento de la célula que es independiente de los mecanismos normales de regulación (por ejemplo, la pérdida de inhibición por contacto). Esto incluye, por ejemplo, el crecimiento anormal de: (1 ) las células tumorales (tumores) que proliferan por la expresión de tirosina quinasa mutada o de la sobreexpresión de un receptor de la tirosina quinasa, (2) las células benignas y malignas de otras enfermedades proliferativas en las que se produce la activación de la tirosina quinasa aberrante, (3) cualquier tumor que prolifere mediante los receptores de la tirosina quinasa, (4) cualquier tumor que prolifere mediante la activación de una treonina/serina quinasa aberrante, y (5) las células benignas y malignas de otras enfermedades proliferativas que en las que se produce la activación de la treonina/ serina quinasa aberrante.
La presente invención se puede utilizar para tratar y/o prevenir una variedad de enfermedades que afectan a las células que expresan CD20, incluidas las enfermedades tumorigénicas y las enfermedades autoinmunes, es decir, las enfermedades autoinmunes o inflamatorias.
Los términos "cáncer" y "cancerosas" se refieren a, o describen, un estado fisiológico en mamíferos caracterizado, típicamente, por un crecimiento celular descontrolado. Un "tumor" comprende una o más células cancerosas. Ejemplos de cáncer incluyen, pero no están limitados por, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y las neoplasias malignas linfoides o de la leucemia. Ejemplos de enfermedades "tumorigénicas" que pueden ser tratadas y/o prevenidas, incluyen los linfomas de las células B, incluyendo NHL, al linfoma /leucemia linfoblástica de los precursores de las células B y a los neoplasmas de las células B maduras, tal como la leucemia linfocítica crónica (CLL), el linfoma linfocítico pequeño (SLL) de las células B, la leucemia prolinfocítica de células B, el linfoma linfoplasmacítico, el linfoma de las células del manto (MCL), el linfoma folicular (FL), incluyendo FL de grado bajo, intermedio y grado, linfoma cutáneo de centro folicular, linfoma de las células B de la zona marginal (tipo MALT, tipo nodal y tipo esplénico), la leucemia de las células pilosas, el linfoma difuso de las células B grandes, el linfoma de Burkitt, plasmocitoma, mieloma de células plasmáticas, trastorno linfoproliferativo post-trasplante, la macroglobulinemia de Waldenstrom y el linfoma anaplásico de células grandes (ALCL).
Los ejemplos de "trastornos del sistema inmune" y de enfermedades en las que están involucradas células B que expresan CD20, que pueden ser tratadas y/o prevenidas, incluyen la psoriasis, la artritis psoriásica, la dermatitis, la esclerodermia sistémica y la esclerosis, la enfermedad inflamatoria intestinal (IBD (por sus siglas en Idioma Inglés)), la enfermedad de Crohn, la colitis ulcerosa, el síndrome de dificultad respiratoria, la meningitis, la encefalitis, la uveítis, la glomerulonefritis, eczema, asma, la aterosclerosis, la deficiencia de adhesión de los leucocitos, la esclerosis múltiple, el síndrome de Raynaud, el síndrome de Sjogren, la diabetes juvenil, la enfermedad de Reiter, la enfermedad de Behcet, la nefritis compleja inmune, la nefropatía IgA , las polineuropatías IgM, las trombocitopenias mediadas inmunes, tal como púrpura trombocitopénica idiopática aguda y púrpura trombocitopénica idiopática crónica, la anemia hemolítica, la miastenia gravis, la nefritis lúpica, el lupus eritematoso sistémico, la artritis reumatoide (RA), la dermatitis atópica, el pénfigo, la enfermedad de Graves, la tiroiditis de Hashimoto, la granulomatosis de Wegener, el síndrome de Omenn, la insuficiencia renal crónica, la mononucleosis infecciosa aguda, HN y las enfermedades asociadas con el virus del herpes. Otros ejemplos son el síndrome de distrés respiratorio agudo y la coreoretinitis. Todavía, otros ejemplos son las enfermedades y los trastornos causados por la infección de las células B por virus, tal como por el virus de Epstein-Barr (EBV [por sus siglas en Idioma Inglés)).
Un "agente terapéutico" abarca tanto un agente biológico, como un anticuerpo, un péptido, una proteína, una enzima o un agente quimioterapéutico.
Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer. Ejemplos de agentes quimioterápicos incluyen al Erlotinib (Tarceva®, Genentech / OSI Farm.), Bortezomib (Velcade®, Milenio Farm.), Fulvestrant (Faslodex®, de AstraZeneca), Sutent (SU1 1248, Pfizer), Letrozol (Femara ®, Novartis), mesilato de Imatinib (Gleevec ®, Novartis), PTK787/ZK 222584 (Novartis), Oxaliplatino (Eloxatin®, Sanofi), 5-FU (5-flúoruracilo), Leucovorina, Rapamicina (sirolimus, Rapamune®, Wyeth), Lapatinib , (Tykerb® , GSK572016, Glaxo Smith Kline), Lonafarnib (SCH 66336), Sorafenib (BAY43-9006, laboratorios Bayer) y Gefitinib (Iressa®, de AstraZeneca), AG1478, AG1571 (SU 5271 ; Sugen), agentes alquilantes tales como el tiotepa y el Cytoxan® ciclofosfamida, sulfonatos de alquilo tales como el busulfán, improsulfan y piposulfan; aziridinas tales como la benzodopa, carboquona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas incluyendo a la altretamina, trietilenemelamina, trietilenefosforamida, trietilenetiofosforamida y trimetilomelamina; acetogeninas (especialmente bulatacin y bulatacinona), un camptotecina; (incluido el análogo sintético topotecan); briostatina, calistatin, CC-1065 (incluido sus análogos sintéticos adocelesina, carzelesina y bizelesina); criptoficinas (en particular criptoficina 1 y criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluyendo los análogos sintéticos, KW-2189 y CB1 -TM1 ); eleuterobina; pancratistatina, una sarcodictina; spongistatina, mostazas nitrogenadas, tales como el clorambucilo, la clornafazina, la clorofosfamida, la ifosfamida, la estramustina, la mecloretamina, el clorhidrato del óxido de mecloretamina, melfalán, novembichin, trofosfamida, fenésterina, prednimustina, mostaza uracilo; nitrosureas tales como la carmustina , la clorozotocina, la fotemustina, la lomustina, la nimustina y la ranimnustina; antibióticos, tales como los antibióticos de enedina (por ejemplo, caliqueamicina, especialmente la caliqueamicina gammal y la caliqueamicina omegall (Angew Chem International Ed. Engl (1994) 33:183-186); dinemicina, incluyendo a la dinemicina A, bifosfonatos, tal como el clodronato, una esperamicina, así como también un cromóforo de neocarzinostatina y los cromóforos de antibióticos de enedina cromoproteína relacionados), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicin, caminomicina, carzinofilin, cromomicinais, dactinomicina, daunorubicina, detorubicin, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, Adriamicina® (doxorrubicina), morfolin-doxorrubicina, doxorrubicina cianomorfolino, 2-pirrolo-doxorrubicina y deoxidoxorubicin), epirubicina, esorubicin, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas como la mitomicina C, el ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, porfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicin, estreptonigrin, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatin, zorubicina; antimetabolitos tales como el metotrexato y 5-fluoruracilo (5-FU), análogos del ácido fólico tal como denopterin, metotrexato, pteropterina, trimetrexato, análogos de la purina tal como la fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamniprina, tiogüanina, análogos de la pirimidina tal como la ancitabina, la azacitidina, carmofur, 6-azauridina, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos, tales como epitiostanol calusterona, propionato de dromostanolona, testolactona mepitiostano; anti-suprarrenales tales como aminoglutetimida, el mitotano, trilostano; regenerador del ácido fólico tal como el ácido frolínico; aceglatona; aldofosfamida glucósida, aminoácidolevulínico; eniluracil; amsacrina; bestrabucil; bisantreno; edatraxato; defofamina, demecolcina; diaziquona; elformitina, acetato de eilpitnio, una epotilona; etoglucid, nitrato de galio; hidroxiurea; lentinan; lonidainina; maitansinoides tal como la maitansina y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina, pentostatina; fenamet; pirarubicin, ácido podofilínico; losoxantrona; 2-etilhidrazida, procarbazina, complejo de polisacáridos PSK® (JHS Natural Products, Eugene, Oreg.); razoxano; rizoxina; sizofuran; espirogermanio, ácido tenuazónico; triaziquona, 2,2', 2"-triclorotrietilamina; tricotecenos (en especial la toxina T-2, verracurin A, roridin A y anguidina); uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"), ciclofosfamida, tiotepa; taxoides, por ejemplo, Taxol® (paclitaxel; Bristol-Myers Squibb Oncología, Princeton, New Jersey), ABRAXANE® (libre de Cremofor), las formulaciones de paclitaxel diseñadas con nanopartículas de albúmina (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois), y Taxotere ® (docetaxel, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, Francia); cloranmbucilo; Gemzar ® (gemcitabina); 6-tioguanina, mercaptopurina; metotrexato; análogos del platino como el cisplatino y carboplatino, vinblastina, etopósido (VP-16), ifosfamida, mitoxantrona, vincristina, Navelbine ® (vinorelbina); Novantrona; tenipósido; edatrexato; daunomicina; aminopterina; capecitabina (Xeloda ®), ibandronato, CPT-1 1 , inhibidor de la topoisomerasa RFS 2000; difluormetilornitina (DMFO), retinoides, tales como el ácido retinoico y sus sales farmacéuticamente aceptables, ácidos y derivados de cualquiera de los anteriores.
También incluidos en la definición de "agente quimioterapéutico" se encuentran: (i) los agentes anti-hormonales que actúan para regular o inhibir la acción de las hormonas en los tumores tales como los anti-estrógenos y los moduladores selectivos del receptor de estrógeno (SERM (por sus siglas en Idioma Inglés) ), como por ejemplo, el tamoxifeno (Nolvadex ® incluyendo el citrato de tamoxifeno), el raloxifeno, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY1 17018, onapristona y FARESTON ® (citrato de toremifina), (ii) los inhibidores de aromatasa que inhiben la enzima aromatasa que regula la producción de estrógenos en las glándulas suprarrenales, tales como, por ejemplo, 4 (5)-imidazoles, aminoglutetimida, MEGASE® (acetato de megestrol), AROMASIN® (exemestano, Pfizer), formestanie, Fadrozol, RIVISOR ® (vorozola), FEMARA ® (letrozol; Novartis), y Arimidex® (anastrozol, AstraZeneca), (iii) anti-andrógenos tales como la flutamida, la nilutamida, la bicalutamida, el leuprolida, la goserelina y, así como también troxacitabina (un análogo del nucleósido de citosinal ,3-dioxolano), (iv) inhibidores de la proteína quinasa, (v) inhibidores de la quinasa lipídica, (vi) oligonucleótidos antisentido, particularmente aquellos que inhiben la expresión de genes en las vías de señalización implicadas en la proliferación aberrante de células, como, por ejemplo, la PKC-alfa, Ralf y H-Ras; (vii) ribozimas tales como los inhibidores de la expresión de VEGF (por ejemplo, Angiozyme®) y los inhibidores de la expresión de HER2, (viii) las vacunas tales como las vacunas de terapia génica, por ejemplo, ALLOVECTIN®, LEUVECTIN®, y VAXID®; PROLEUKIN ® rlL-2; un inhibidor de la topoisomerasa 1 tal como LURTOTECAN®; ABARÉLIX ® rmRH; (ix) los agentes anti-angiogénicos, tales como el bevacizumab (AVASTIN®, Genentech), y (x), las sales, ácidos y derivados, farmacéuticamente aceptables, de cualquiera de los anteriores. Otros agentes anti-angiogénicos incluyen a los inhibidores de MMP-2 (metaloproteinasa de matriz-2), inhibidores de MMP-9 (metaloproteinasa - matriz de 9), inhibidores de la COX-II (ciclooxigenasa II) e inhibidores de la tirosina quinasa del receptor VEGF. Ejemplos de tales inhibidores de las metaloproteinasas de la matriz útiles que se pueden utilizar en combinación con los presentes compuestos/composiciones se describen en WO 96/33172, WO 96/27583, EP 818442, EP 1004578, WO 98/07697, WO 98/03516, WO 98 / 34918, WO 98/34915, WO 98/33768, WO 98/30566, EP 606.046, EP 931 .788, WO 90/05719, WO 99/52910, WO 99/52889, WO 99/29667, WO 99/07675, EP 945.864, US Pat. No. 5.863.949, US Pat. No. 5.861 .510, y en la EP 780.386, todas las cuales se incorporan al presente documento, como referencia, en su totalidad. Ejemplos de inhibidores de la tirosina quinasa del receptor de VEGF incluyen al 4-(4-bromo-2-fluoranil¡no)-6-metoxi-7-(1 -metilpiperidin-4-ilmetoxi)quinazolina (ZD6474; Ejemplo 2 de la solicitud de patente PCT WÓ 01/32651 ), 4-(4-flúor-2-metilindol-5-iloxi)-6-metoxi-7-(3-pirrolidin-1 -ilpropoxi) -quinazolina (AZD2171 ; Ejemplo 240 de la solicitud de patente PCT WO 00/47212), vatalanib (PTK787; WO 98/35985) y SU1 1248 (sunitinib, WO 01/60814), y compuestos tales como los descriptos en las publicaciones del PCT No. WO 97/22596, WO 97/30035, WO 97/32856, y WO 98/13354.
Otros ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen a los inhibidores de PI3K (fosfoinosítidos-3-quinasa), tales como los reportados en Yaguchi y col. ,(2006) Jour. of the Nat. Cáncer Inst. 98(8):545-556; U.S. Pat. No. 7,173,029; U.S. Pat. No. 7,037,915; U.S. Pat. No. 6,608,056; U.S. Pat. No. 6,608,053; U.S. Pat. No. 6,838,457; U.S. Pat. No. 6,770,641 ; U.S. Pat. No. 6,653,320; U.S. Pat. No. 6,403,588; WO 2006/046031 ; WO 2006/046035; WO 2006/046040; WO 2007/042806; WO 2007/042810; WO 2004/017950; US 2004/092561 ; WO 2004/007491 ; WO 2004/006916; WO 2003/037886; US 2003/149074; WO 2003/035618; WO 2003/034997; US 2003/158212; EP 1417976; US 2004/053946; JP 2001247477; JP 08175990; JP 08176070; U.S. Pat. No. 6,703,41 y WO 97/15658, todos los cuales se incorporan a la presente, como referencia, en su totalidad. Ejemplos específicos de tales inhibidores de PI3K incluyen al SF-1 126 (inhibidor de PI3K, Semafore Pharmaceuticals), BEZ-235 (inhibidor de PI3K, Novartis) y XL-147 (inhibidor de PI3K, Exelixis, Inc.).
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "CD20" o "antígeno CD20" se refiere a polipéptidos y a cualquiera de sus variantes, ¡soformas y especies homologas de CD20 que son naturalmente expresadas o que son expresadas por las células transfectadas con el gen CD20 o similares. Los CD20 humanos son también conocidos como MS4A1 , miembro 1 de la subfamilia A con 4 dominios transmembranales. Sinónimos adicionales para CD20, tal como se reconoce en el arte, incluyen el antígeno CD20, el receptor CD20, antígeno B1 , B1 , Bp35, LEU-16, MGC3969, MS4A2 y S7 de superficie de los linfocitos B. Dos variantes de la transcripción han sido descritas para el CD20 humano. La variante 1 representa una variante de transcripción más larga y corresponde al GénBank ID (Gl) 68348720. La variante 3 carece de una porción de la 5 'UTR, en comparación con la variante 1 y corresponde al GenBank ID (Gl) 68348721 . Las variantes 1 y 3 codifican la misma proteína. La forma principal de CD20 humano comprende una proteína con 297 aminoácidos descrita mediante el GenBank Protein ID 231 10989.
El término "epítope" se refiere a una proteína determinante capaz de unirse de manera específica a un anticuerpo. Los epítopes usualmente consisten en grupos de moléculas de superficie químicamente activa tales como los aminoácidos o cadenas laterales de azúcares y, por lo general, tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas.
El término "balsa" se refiere a microdominios de membrana ricos en esfingolípidos y colesterol, situados en la zona exterior de la hojilla de la membrana plasmática de una célula. La capacidad de ciertas proteínas de asociarse dentro de los dominios puede afectar la función de la proteína. Por ejemplo, la traslocación de las moléculas CD20 en las balsas lipídicas, después de haber sido unidas mediante anticuerpos y/o los fragmentos de los mismos de la presente invención, crea una alta densidad de complejo antígeno-anticuerpo CD20 en las membranas plasmáticas. Esta alta densidad del complejo del antígeno-anticuerpo CD20 puede habilitar la activación eficaz del sistema de complementos durante la CDC.
Tal como se utiliza en la presente, un "anticuerpo" o fragmento y lo similar, incluye cualquier proteína o molécula que contenga péptidos que comprenda, al menos, una porción de una molécula de ¡nmunoglobulina, tal como, pero sin estar limitada por, al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de una cadena pesada, una cadena liviana o una porción de la unión del ligando de la misma, una región variable de la cadena pesada o de la cadena liviana, una región constante de la cadena pesada o de la cadena liviana, una región marco, o cualquier porción de la misma, o, por lo menos, una porción de un antígeno o receptor de antígenos o una proteína de unión, las cuales pueden ser incorporadas en el anticuerpo contra el CD20 de la presente invención. De manera opcional, tales anticuerpos además afectan a un ligando específico, tal como pero sin estar limitado por, donde cada uno de tales anticuerpos modula, disminuye, aumenta, antagoniza, agoniza, mitiga, alivia, bloquea, inhibe, deroga y/o interfiere con, por lo menos, una actividad o enlace del antígeno, o con la actividad o el enlace del receptor del antígeno, in vitro, in situ, in vivo y ex vivo. A modo de ejemplo no limitativo, varios anticuerpos específicos que se unen a CD20 se revelan, en donde porciones, variantes o dominios específicos de los mismos se puede unir a, al menos, una molécula de antígeno, o a porciones, variantes o dominios específicas del mismo. De manera opcional, un anticuerpo, porción o variante antígeno específicos, también pueden afectar a, al menos, una actividad o función, por ejemplo pero sin estar limitado por, el ARN, el ADN o a la síntesis de las proteínas, la liberación, la señalización del receptor, la asociación de las membranas, la actividad de unión y la producción y/o síntesis de proteínas.
Los anticuerpos son glicoproteínas heterotetraméricas, compuestas por dos cadenas livianas idénticas (LC (por sus siglas en idioma inglés)) y dos cadenas pesadas idénticas (HC (por sus siglas en idioma inglés)). Por lo general, cada cadena liviana está relacionada con una cadena pesada por un puente disulfuro covalente, mientras que el número de enlaces disulfuro varía entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulinas. Cada cadena pesada y liviana también tiene puentes disulfuro intra-cadena espaciados. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (VH), seguido por un número de dominios constantes. Cada cadena liviana tiene un dominio variable en un extremo (VL) y un dominio constante en su otro extremo, estando el dominio constante de la cadena liviana alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada y el dominio variable de cadena liviana alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Las cadenas livianas de los anticuerpos de cualquier especie de vertebrados pueden ser asignadas a uno de los dos tipos claramente diferenciados, a saber, kappa y lambda, basado en las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes. Las inmunoglobulinas pueden ser asignadas a cinco clases principales, a saber, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, en función de la secuencia de amino ácidos del dominio constante de la cadena pesada. Las IgA e IgG, además, son sub-clasificadas como los isotipos lgA1 , lgA2, lgG1 , lgG2, lgG3 e lgG4.
Entre los fragmentos de anticuerpos se incluyen a cualquier proteína o molécula que contenga péptidos, que comprenda, al menos, una porción de una molécula de ¡nmunoglobulina, tal como pero sin estar limitada por, al menos, una región determinante de la complementariedad (CDR) de una cadena pesada o liviana, o una porción de unión ligante de la misma, una cadena pesada o una región variable de la cadena liviana, una cadena pesada o de una región constante de la cadena liviana, una región marco, o cualquier porción de la misma, o por lo menos, una porción de un antígeno o receptor de antígenos o proteínas de unión, los cuales pueden ser incorporados en un anticuerpo al CD20 de la presente invención.
El término "variable" se refiere al hecho de que ciertas partes de los dominios variables difieren ampliamente en su secuencia entre los anticuerpos y se utilizan en la unión y la especificidad de cada anticuerpo en particular por su antígeno en particular. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye uniformemente a lo largo de los dominios variables de los anticuerpos. Se concentra en tres segmentos llamados regiones determinantes de la complementariedad (CDR) o regiones hipervariables, tanto en los dominios variables de las cadenas livianas como en los de las cadenas pesadas. Las porciones más altamente conservadas de los dominios variables se denominan marco (FR (por sus siglas en Idioma Inglés)). Cada uno de los dominios variables de las cadenas nativas pesadas y livianas, comprenden cuatro regiones FR, en gran medida adoptando una configuración de hoja-beta, conectadas por tres CDRs, que forman lazos de conexión y, en algunos casos, forman parte de la estructura hoja-beta. Los CDR en cada cadena se mantienen unidos en las proximidades de las regiones FR, con los CDRs de la otra cadena, contribuyendo a la formación del sitio de los anticuerpos de unión al antígeno (véase Kabat y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991 ). Los dominios constantes no se encuentran directamente involucrados en la unión de un anticuerpo a un antígeno, pero presentan diferentes funciones efectoras, tales como la participación de los anticuerpos en la toxicidad celular dependiente de anticuerpos.
El término "anticuerpo" también incluye a los fragmentos de digestión y las partes y variantes especificas de los mismos, incluyendo a los miméticos de anticuerpos o a los anticuerpos que comprenden porciones que imitan la estructura y/o función de un anticuerpo o un fragmento determinado o parte de los mismos, incluyendo los anticuerpos de cadena única y los fragmentos de los mismos. Los fragmentos funcionales incluyen a los fragmentos de unión al antígeno que se unen a antígenos de mamíferos, tales como CD20, solos o en combinación con otros antígenos, como, por ejemplo, el receptor del factor del crecimiento epidérmico humano (HER1 ), IgE, el factor de crecimiento vascular endotelial, inhibidores de la dimerización de HER, proteínas de la familia Bcl-2, MET, IL-13, IFN alfa, EGFL7, CD40, DR4 y DR5, PI3-quinasa, alfa linfotoxina, integrina 7 beta, la beta amiloide, CRIG, TNF, complemento (C5), CBL, CD147 , IL-8, gp120, VLA-4, CD1 1 a, CD18, VEGF, CD40L, Id, ICAM-1 , CD2, del EGFR, TGF-beta, TNF-alfa, E-selectina, Fact VII, TNF, Her2/neu, F gp, CD11/18, CD14, ICAM-3, CD80, CD40L, CD4, CD23, beta2-integrina, alfa4beta7, CD52, HLA-DR, CD22, CD64 (FcR), alfa beta TCR, CD2, CD3, Hep B, CA 125, EpCAM, gp120, CMV, gpllbllla, IgE, IL5, IL-4, CD25, CD3, CD33, CD19, CD22, CD28, CD36, CD37, CD44, CD55, CD59, CD70, CD79, CD80, CD103, CD134 , CD137, CD138, CD152, CD30, HLA, VNRintegrina, CD25, IL-23 e IL-12. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpos capaces de unirse al antígeno o las porciones de los mismos, incluyen, pero no están limitados por, Fab (por ejemplo, mediante digestión con papaína), Fab '(por ejemplo, mediante digestión por pepsina y reducción parcial) y F (ab') 2 (por ejemplo, mediante digestión con pepsina), facb (por ejemplo, mediante digestión con plasmina), PFC (por ejemplo, mediante digestión con pepsina o plasmina), Fd (por ejemplo, mediante digestión con pepsina, la reducción parcial y reagrupamiento), fragmentos de Fv o scFv (por ejemplo, mediante técnicas de biología molecular), están abarcados por la presente invención (véase, por ejemplo, Colligan, Immunology).
Estos fragmentos pueden ser producidos mediante escisión enzimática o por técnicas sintéticas o recombinantes, tal como se conoce en el arte y/o como se describe en el presente documento. Los anticuerpos también pueden producirse de una variedad de formas truncadas utilizando genes de los anticuerpos en los que uno o más codones de terminación se han introducido corriente arriba del sitio de parada natural. Por ejemplo, una combinación de genes que codifican una porción de la cadena pesada F(ab')2 puede ser diseñada para incluir secuencias de ADN que codifican el dominio CH1 y/o una región bisagra de la cadena pesada. Las distintas partes de los anticuerpos pueden unirse químicamente mediante técnicas convencionales, o pueden prepararse como una proteína contigua utilizando técnicas de ingeniería genética.
Un anticuerpo de "bloqueo" o un anticuerpo "antagonista" es aquel que inhibe o reduce la actividad biológica del antígeno al cual se une, tal como el CD20. De preferencia, los anticuerpos de bloqueo o los anticuerpos antagonistas inhiben sustancialmente o completamente la actividad biológica del antígeno. Es deseable, que la actividad biológica se reduzca en un 10 %, un 20 %, un 30 %, un 50 %, un 70 %, un 80 %, un 90 %, un 95 % o incluso un 100 %.
Un "anticuerpo agonista", tal como se usa en el presente documento, es un anticuerpo que imita, al menos, una de las actividades funcionales de un polipéptido de referencia de interés.
Un "anticuerpo anti-idiotípico (anti-ld)" es un anticuerpo que reconoce los determinantes únicos, generalmente asociados con el sitio de unión al antígeno de un anticuerpo. Un anticuerpo Id se puede preparar mediante la inmunización de un animal de la misma especie y tipo genético (por ejemplo, una cepa de ratón) como la fuente del mAb, con el mAb con el cual el anti-ld está siendo preparado. Los animales vacunados reconocerán y responderán a los determinantes idiotípicos del anticuerpo de inmunización mediante la producción de un anticuerpo a estos determinantes idiotípicas (el anticuerpo anti-ld). Véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos de Norte América No.: 4.699.880, la cual se incorpora al presente documento, como referencia, en su totalidad. El anticuerpo anti-ld también puede ser utilizado como un "inmunógeno" para inducir una respuesta inmune en otro animal, produciendo el así llamado anticuerpo anti-anti-ld. El anti-anti-ld puede ser, epitópicamente, idéntico al mAb original, el cual induce al anti-ld. Así, mediante el uso de anticuerpos a los determinantes idiotípicos de un anticuerpo monoclonal, es posible identificar otros clones que expresan anticuerpos de especificidad idéntica.
Un anticuerpo "aislado" es uno separado y/o recuperado de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son los materiales que puedan interferir con sus usos diagnósticos o terapéuticos y pueden incluir a las enzimas, las hormonas y otros solutos proteicos o no-proteicos. En aspectos preferidos, el anticuerpo se purifica (1 ) a más del 95 % en peso del anticuerpo, determinado, por ejemplo, mediante el método de Lowry y, preferiblemente, a más del 99 % en peso, (2) en un grado suficiente como para obtener al menos 15 residuos de la secuencia N-terminal, o la secuencia de aminoácidos internos mediante el uso de un secuenciador de taza giratorio, o (3) hasta homogeneidad mediante SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato sódico), bajo condiciones reductoras o no reductoras, con azul de Coomassie o, preferiblemente, con tintura de plata. Los anticuerpos aislados incluyen al anticuerpo CD20 in situ dentro de las células recombinantes donde, por lo menos, uno de los componentes del ambiente natural del anticuerpo no se encuentra presente. Por lo general, sin embargo, el anticuerpo aislado será preparado mediante, al menos, un paso de purificación.
El término "rituxirnab" o "RITUXAN ®" se refiere a los anticuerpos quiméricos anti-CD20 disponibles en el mercado, los cuales se describen como "C2B8" en la patente de los Estados Unidos de Norte América No. 5.736.137 (Anderson y colaboradores). El término "2F2" o "ofatumumab" se refiere a los anticuerpos ahti-CD20 totalmente humanos tal como se describen en la solicitud de patente PCT WO 2004/035607 (Teeling y colaboradores, (2004)). El término "GA101 " o "afutuzumab" se refiere a los anticuerpos anti-CD20 humanizados y de glico-ingeniería que consisten en una cadena pesada B-HH6 y una cadena liviana B-KV1 tal como se describen en la solicitud de patente PCT WO 2005/0448959 (Umana, patente de los Estados Unidos de Norte América Serie No.: 5.639.641 (2005)). El término "B1 " se refiere al anticuerpo anti-CD20 murino tositumomab, que corresponde al componente de los anticuerpos sin marcar de Bexxar ®.
Tal como se utiliza en la presente, el término anticuerpo de "Tipo III" incluye una anticuerpo intacto o un fragmento del mismo que se une al CD20, a epitopes del mismo y/o a las isoformas del mismo, que tienen la capacidad de inducir de manera sustancial la apoptosis en ausencia de agentes reticulantes, de manera similar a la de los anticuerpos de Tipo II, y que tienen la capacidad de causar la redistribución de CD20 en una balsa lipídica e inducir, de manera sustancial, la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), similar a los anticuerpos de Tipo I.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "ingeniería de anticuerpos" o "anticuerpo alterado" incluye un anticuerpo con marcos y regiones constantes humanos significativos (los dominios CL, CH (por ejemplo, CH1 , CH2, CH3), y la bisagra) y los CDRs derivados a partir de los anticuerpos de unión al antígeno, tales como los anticuerpos anti-CD20 o los fragmentos de los mismos. Los marcos totalmente humanos constituyen marcos de referencia que corresponden a las secuencias de la línea germinal humana, así como también a las secuencias con mutaciones somáticas. Los CDR pueden derivar de uno o más CDRs que se asocian con, o se unen a, los antígenos dentro o fuera del contexto de un marco de anticuerpos. Por ejemplo, los CDRs del anticuerpo de ingeniería dirigido a la CD20 de la presente invención pueden ser derivados de los CDRs que se unen al antígeno en el contexto de un marco de anticuerpos del ratón y luego por ingeniería genética se unen con los antígenos en el contexto de un marco humano. A menudo, la ingeniería de los anticuerpos humanos es sustancialmente no inmunogénica en los seres humanos.
Del mismo modo, los anticuerpos designan anticuerpos de primates (monos, babuinos, chimpancés, etc), roedores (ratones, ratas, conejos, hámsters, cobayos, y similares) y de otros mamíferos que designan a estas especies, sub-géneros, géneros, sub-familias y familias específicas. Además, los anticuerpos quiméricos pueden incluir cualquier combinación de los anteriores. Estos cambios o variaciones, opcionalmente y de preferencia, mantienen o reducen la inmunogenicidad en humanos o en otras especies, respecto de la de los anticuerpos no modificados. Un anticuerpo humano obtenido por ingeniería genética es distinto a un anticuerpo quimérico o humanizado.
Un anticuerpo humano obtenido por ingeniería genética puede ser producido mediante un animal no-humano o mediante células procarióticas o eucarióticas, que sean capaces de expresar funcionalmente los genes de la inmunoglobulina reorganizada humana u obtenida por ingeniería humana (por ejemplo, cadena pesada y/o cadena liviana). Además, cuando un anticuerpo obtenido por ingeniería es un anticuerpo de cadena simple, puede abarcar un péptido enlazador que no se encuentra en los anticuerpos humanos o no humanos nativos. Por ejemplo, una Fv puede comprender un péptido enlazador, tal como de dos a aproximadamente ocho glicinas u otros residuos de aminoácidos, los cuales conectan la región variable de la cadena pesada con la región variable de la cadena liviana. Estos péptidos enlazadores se consideran como de origen humano.
Anticuerpos bispecíficos, heteroespecíficos, heteroconjugados o similares, también pueden ser utilizados, los cuales son monoclonales, de preferencia, humanos, de ingeniería genética humana, con su superficie acondicionada o humanizados, anticuerpos que tienen especificidades de unión por, al menos, dos antígenos diferentes, tales como al CD20 y un antígeno no CD20. En el presente caso, una de las especificidades de unión es a, por lo menos, una proteína antigénica y la otra es a otra proteína antigénica. Los métodos para producir anticuerpos biespecíficos son conocidos en el arte. Tradicionalmente, la producción de los anticuerpos recombinantes biespecíficos se basa en la co-expresión de dos pares de cadenas pesadas /de cadenas livianas de ¡nmunoglobulinas, donde las dos cadenas pesadas poseen especificidades diferentes (Milstein y Cuello, Nature 305:537 (1983)). Debido a la mezcla aleatoria de las cadenas pesadas y livianas de las ¡nmunoglobulinas, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de aproximadamente 10 moléculas de anticuerpos diferentes, de las cuales sólo una posee la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta suele hacerse mediante cromatografía de afinidad o de alguna otra forma descrita en el presente documento. Procedimientos similares se dan a conocer, por ejemplo, en la solicitud de patente PCT WO 93/08829, en las patentes de los Estados Unidos de Norte América No.: 6.210.668, 6.193.967, 6.132.992, 6.106.833, 6.060.285, 6.037.453, 6.010.902, 5.989.530, 5.959.084, 5.959.083, 5.932.448, 5.833.985, 5.821 .333, 5.807.706, 5.643.759, 5.601.819, 5.582.996, 5.496.549, 4.676.980, en las solicitudes de patentes PCT WO 91/00360, WO 92/00373, en la EP 03089, Traunecker y col., EMBO J. 10:3655 (1991 ), Suresh y colaboradores, Methods in Enzymology 121 :210 (1986), US 20090258026, US 20060140946 y US 20070298040, todas las cuales se incorporan en la presente, como referencia, en su totalidad Las "funciones efectoras" del anticuerpo se refieren a las actividades biológicas atribuibles a la región Fe de un anticuerpo (una región Fe de secuencia nativa o una región Fe de secuencia variante de aminoácidos), y varían con el isotipo del anticuerpo. Ejemplos de las funciones efectoras de los anticuerpos son: la unión al C1q y la citotoxicídad dependiente del complemento (CDC), la unión al receptor Fe; la citotoxicidad mediada de por células dependiente de anticuerpos (ADCC), la fagocitosis, la regulación en baja de los receptores de la superficie de las células (por ejemplo, los receptores de las células B) y la activación de las células B. ' Las "células efectoras humanas" son leucocitos que expresan una o más FcRs y llevan a cabo funciones efectoras. En ciertos aspectos, las células expresan, por lo menos, a FcyRIII y llevan a cabo las función(es) efectora(s) ADCC. Ejemplos de leucocitos humanos que median ADCC incluyen a las células mononucleares de sangre periférica (PBMC (por sus siglas en Idioma Inglés)), las células asesinas naturales (NK {por sus siglas en Idioma Inglés)), los monocitos, las células T citotóxicas y los neutrófilos. Las células efectoras se pueden aislar de una fuente nativa, por ejemplo, de la sangre.
Anticuerpos anti-CD20 Basado en el descubrimiento de los solicitantes, entre otras cosas, los anticuerpos anti-CD20 y los fragmentos de los mismos, los conjugados, las composiciones y los métodos de la invención pueden ser anticuerpos mutantes y similares. El anticuerpo anti-CD20 puede ser un "anticuerpo obtenido mediante ingeniería" o un anticuerpo modificado tal como una variante de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo anti-CD20, en donde uno o más de los residuos de aminoácidos del anticuerpo anti-CD20 se han modificado. Salvo que se indique lo contrario o sea conocido, las modificaciones de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo anti-CD20 incluyen las modificaciones al polipéptido y/o a la secuencia de polinucleótidos, para mejorar la afinidad o avidez del anticuerpo o del fragmento al antígeno, y/o modificaciones a la porción Fe del anticuerpo para rnejorar la función efectora. Las modificaciones se pueden realizar sobre cualquier anticuerpo anti-CD20 conocido o a los anticuerpos anti-CD20 identificados que se describen en el presente documento. Tales anticuerpos alterados necesariamente tienen menos de un 100 % de identidad de secuencia o de similaridad con el anticuerpo anti-CD20 de referencia. En un aspecto preferido, el anticuerpo modificado tendrá una secuencia de aminoácidos que tienen al menos un 20 %, 25 %, 35 %, 45 %, 55 %, 65 % o 75 % de identidad o de similaridad de secuencia de amino ácidos con la secuencia de aminoácidos de, ya sea el dominio variable de la cadena pesada o de la cadena liviana del anticuerpo anti-CD20, preferiblemente por lo menos el 80 %, más preferiblemente al menos el 85 %, más preferiblemente al menos el 90 % y más preferiblemente al menos un 95 %. En un aspecto preferido, el anticuerpo modificado tendrá una secuencia de aminoácidos que tienen al menos un 25 %, un 35 %, un 45 %, un 55 %, un 65 % o un 75 % de identidad o de similitud de secuencia de amino ácidos con la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada CDR1 , CDR2, o CDR3, de los anticuerpos anti-CD20, preferiblemente por lo menos el 80 %, más preferiblemente al menos el 85 %, más preferiblemente al menos el 90 % y mas preferiblemente al menos el 95 %. En un aspecto preferido, el anticuerpo CD20 humano alterado mantendrá su capacidad de unión. En ciertos aspectos, el anticuerpo anti-CD20 de la invención comprende una cadena pesada que es alrededor del 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más, idéntica a las secuencias de los aminoácidos de las SEQ ID NOs.: 47, 34, 35 y 36. En ciertos aspectos, el anticuerpo anti-CD20 de la invención comprende una cadena liviana que es aproximadamente el 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idénticas a las secuencias de los aminoácidos de las SEQ ID NOs.: 46, 32 o 33. En un aspecto preferido, el anticuerpo modificado tendrá una secuencia de aminoácidos que tienen al menos un 25 %, 35 %, 45 %, 55 %, 65 % o 75 % de identidad o de similitud con la secuencia de amino ácidos de la cadena liviana CDR1 , CDR2 o CDR3 del anticuerpo anti-CD20, preferiblemente por lo menos el 80 %, más preferiblemente al menos el 85 %, más preferiblemente al menos el 90 %, y preferiblemente por lo menos el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 %.
En algunas realizaciones de la invención, el anticuerpo anti-CD20 puede ser un "anticuerpo obtenido mediante ingeniería" o un anticuerpo modificado como una variante de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo anti-CD20 en donde uno o más de los residuos de aminoácidos del anticuerpo anti-CD20 se han modificado. A menos que se indique lo contrario en el presente o que se conozca, las modificaciones de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo anti-CD20 incluyen las modificaciones al polipéptido y/o la secuencia de polinucleótidos para mejorar la afinidad o avidez del anticuerpo o de un fragmento del mismo, a su antígeno, y/o las modificaciones a la porción Fe del anticuerpo para mejorar la función efectora. Las modificaciones se pueden hacer a cualquier anticuerpo anti-CD20 conocido o a los anticuerpos anti-CD20 identificados que se describen en el presente documento. Tales anticuerpos alterados necesariamente tienen menos de un 100 % de identidad de secuencia o de similitud, con un anticuerpo anti-CD20 de referencia. En un aspecto preferido, el anticuerpo modificado tendrá una secuencia de aminoácidos que tienen, al menos 1 -5, 1 -3, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13 , 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45 o 50 substituciones conservadoras de aminoácidos, con respecto a la secuencia de aminoácidos del dominio variable de las cadenas pesadas o livianas del anticuerpo anti-CD20. En un aspecto preferido, el anticuerpo modificado tendrá una secuencia de aminoácidos que tienen, al menos 1 -20, 1 -15, 1 -10, 1 -5, 1 -3, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14 , 13, 12, 1 1 , 10, 9,8,7,6, 5, 4, 3, 2 o 1 de sustituciones de aminoácidos conservadoras respecto de la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada CDR1 , CDR2 o CDR3 del anticuerpo anti -CD20. En un aspecto preferido, el anticuerpo CD20 humano modificado mantendrá la capacidad de unión. En ciertos aspectos, el anticuerpo anti-CD20 de la invención comprende una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene alrededor de 1 -20, 1 -15, 1 -10, 1 -5, 1-3, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45 o 50 de sustituciones de aminoácidos conservadoras en comparación con la secuencia de aminoácidos de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs.: 47, 34, 35 y 36. En ciertos aspectos, el anticuerpo anti-CD20 de la invención comprende una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene alrededor de 1 -20, 1 -15, 1 -10, 1 -5, 1 -3, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45 o 50 sustituciones de aminoácidos conservadoras en comparación con la secuencia de aminoácidos de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOS.: 46, 32 o 33. En un aspecto preferido, el anticuerpo modificado tendrá una secuencia de aminoácidos que tiene, al menos 1 -20, 1 -15, 1 -10, 1 -5, 1 -3, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14 , 3, 12, 1 1 , 10, 9,8,7,6, 5, 4, 3, 2 o 1 de sustituciones de aminoácidos conservadoras en comparación con la secuencia de aminoácidos de la cadena liviana CDR1 , CDR2 o CDR3 del anticuerpo anti-CD20.
Los hibridomas que producen los anticuerpos anti-CD20, CD20-7 y CD20-6 se han depositado en la ATCC bajo los números de depósito PTA-10487 y PTA-10486.
El "% de identidad", tal como se conoce en el arte, es una medida de la relación entre dos polinucleótidos o dos polipéptidos, según lo determinado mediante la comparación de sus secuencias. La identidad o la similitud con respecto a una secuencia se define, en el presente documento, como el porcentaje de residuos de aminoácidos en la secuencia candidato que son idénticos (es decir, que son el mismo residuo), o son similares (es decir, residuos de aminoácidos del mismo grupo sobre la base de propiedades de las cadenas láterales comunes, ver más abajo) a los residuos de anticuerpo anti-CD20, después de alinear las secuencias y, si fuera necesario, introducir los espacios, para alcanzar el porcentaje máximo de identidad de secuencia. Ninguna de las extensiones, eliminaciones o inserciones N-terminal, C-terminal, o internas, en la secuencia del anticuerpo fuera del dominio variable se interpretará como que afecta la secuencia de identidad o de similitud. En general, las dos secuencias a comparar se alinean para dar una máxima correlación entre las secuencias. La alineación de las dos secuencias se examina y el número de posiciones que den una correspondencia exacta de aminoácidos o de nucleótidos entre las dos secuencias determinadas, dividido por la longitud total de la alineación y multiplicado por 100, brinda el % de identidad. Este % de identidad se puede determinar en toda la longitud de las secuencias a comparar, lo cual es particularmente adecuado para las secuencias de longitud igual o muy similar y que son altamente homologas, o en las longitudes definidas más cortas, lo cual es más adecuado para las secuencias de longitud desigual o que tienen un menor nivel de homología.
Por ejemplo, las secuencias pueden ser alineadas con el software ClustalW bajo Unix, el cual genera un archivo con una extensión ".aln", este archivo se puede importar con el programa Bioedit (Hall, TA 1999, BioEdit: a user-friendly biológica! sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucí. Acids. Symp. Ser. 41 :95-98) el cual permite leer el archivo .aln. En la ventana Bioedit, uno puede elegir secuencias individuales (dos a la vez) y alinearlas. Este método permite la comparación de la secuencia completa.
Los métodos para comparar las identidades de dos o más secuencias son bien conocidos en el arte. Así, por ejemplo, los programas están disponibles en el Paquete de Análisis de Secuencias Wisconsin, en la versión 9.1 (Devereux, J. y col., Nucleic Acids Res., 12:387-395, 1984, disponible de Genetics Computer Group, adison, Wis., USA). La determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias se puede lograr usando un algoritmo matemático. Por ejemplo, los programas BESTFIT y GAP, pueden ser utilizados para determinar el % de identidad entre dos polinucleótidos y el % de identidad entre dos secuencias de polipéptidos. BESTFIT utiliza el algoritmo de "homología local" de Smith y Waterman (Advances in Applied Mathematics, 2:482-489, 1981 ) y encuentra una única mejor región de similitud entre dos secuencias. BESTFIT es más adecuado para comparar dos polinucleótidos, o dos secuencias de polipéptidos que son diferentes en longitud, el programa asume que la secuencia más corta representa una porción de la más larga. En comparación, GAP alinea dos secuencias para descubrir una "similitud máxima", de acuerdo con el algoritmo de Neddleman y Wunsch (J. Mol. Biol., 48:443-354, 1970). GAP es más adecuado para comparar secuencias que son de, aproximadamente, una misma longitud y donde se espera una alineación en toda la longitud. Preferiblemente, los parámetros "Peso del Espacio" y "Peso de la Longitud" que se utilizan en cada programa son 50 y 3 para polinucleótidos y 12 y 4 para polipéptidos, respectivamente. Preferiblemente, los porcentajes para las identidades y las similitudes se determinan cuando las dos secuencias que se comparan están alineadas de forma óptima.
Otros programas para determinar la identidad y/o la similitud entre las secuencias también son conocidos en el arte, por ejemplo la familia de los programas BLAST (Altschul y Karlin, 1990, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 87:2264-2268, modificado por Karlin y Altschul, 1993, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90:5873-5877, disponible en el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NVB (por sus siglas en Idioma Inglés)), Bethesda, Maryland, USA, y accesible a través de la página de inicio del NCBI en www.ncbi.nlm.nih.gov). Estos programas ¡lustran un ejemplo preferido, aunque no limitativo, de un algoritmo matemático utilizable en la comparación de dos secuencias. Este algoritmo se ha incorporado en los programas NBLAST y XBLAST de Altschul y col., 1990, J. Mol. Bíol., 215:403-410. Las búsquedas de nucleótidos por medio de BLAST se pueden llevar a cabo mediante el programa NBLAST, puntuación = 100, longitud de palabra = 12, para obtener las secuencias de nucleótidos homologas a una molécula de ácido nucleico que codifica la totalidad, o una parte de cualquier anticuerpo anti-CD20 de la invención. Las búsquedas de proteínas por medio de BLAST, se pueden realizar con el programa XBLAST, puntuación = 50, longitud de palabra = 3, para obtener las secuencias de aminoácidos homologas a una molécula de proteína de la invención. Para obtener alineaciones espaciadas, a efectos comparativos, se puede utilizar el BLAST GAPPED tal como se describe en Altschul y col., 1997, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402. Por otra parte, el PSI-Blast se puede utilizar para llevar a cabo una búsqueda mediante iteraciones que detecte las relaciones a distancia entre las moléculas (Id.). Cuando se utilizan los programas BLAST, GAPPED BLAST y PSI-Blast, se pueden utilizar los parámetros por defecto de los respectivos programas (por ejemplo, XBLAST y NBLAST). Véase, http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Otro ejemplo preferido, no limitativos, de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de las secuencias es el algoritmo de Myers y Miller, 1988, CABIOS 4:11 -17. Dicho algoritmo se ha incorporado al programa ALIGN (versión 2.0) el cual es parte del paquete de software de alineación de secuencias GCG. Cuando se utiliza el programa ALIGN para comparar las secuencias de los aminoácidos, se puede utilizar una tabla de residuos de peso PAM120, una penalidad de longitud de espacio 12 y una penalidad de espacio de 4.
Otro ejemplo no limitante de un programa para determinar la identidad y/o la similitud entre las secuencias conocidas en el arte es FASTA (Pearson W.R. y D.J. Lipman, Proc. Nat.. Acad. Sci. USA, 85:2444-2448, 1988, disponible como parte del Paquete de Análisis de Secuencias Wisconsin). Preferiblemente, la matriz de sustitución de aminoácidos BLOSUM62 (Henikoff S. y J.G. Henikoff, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89:10915-10919, 1992) se utiliza en la comparación de las secuencias polipeptídicas, incluyendo las secuencias de nucleótidos que se traducen primero en secuencias de aminoácidos antes de la comparación.
Otro ejemplo no limitante de un programa conocido en la técnica para determinar la identidad y/o la similitud entre secuencias de aminoácidos es el Software SeqWeb (una interfaz basada en la web para el Paquete Wisconsin GCG: programa GAP), que se utiliza con el algoritmo por defecto y los parámetros de configuración del programa: BLOSUM62, peso de espacio 8, peso de longitud 2.
El porcentaje de identidad entre dos secuencias se puede determinar utilizando técnicas similares a las descriptas anteriormente, con o sin permitir espacios.
En el cálculo del porcentaje de identidad, típicamente se cuentan las similitudes exactas.
El programa BESTFIT puede ser utilizado para determinar el % de identidad de una búsqueda de polinucleótidos, o de una secuencia polipeptídica con respecto a un polinucleótido o a una secuencia del polipéptido de la invención, estando la búsqueda y la secuencia de referencia alineadas de forma óptima y los parámetros del programa fijados en el valor por defecto.
Para generar un anticuerpo alterado, se introducen alteraciones de uno o más aminoácidos (por ejemplo, sustituciones) en una o más de las regiones hipervariables de un anticuerpo. Alternativamente, o adicionalmente, una o más alteraciones (por ejemplo, sustituciones) de los residuos de la región marco pueden ser introducidas en un anticuerpo anti-CD20 que resulten en una mejora de la afinidad de unión del anticuerpo mutante con el antígeno. Ejemplos de residuos de regiones marco para modificar, incluyen a aquellos que, de forma no covalente, se unen directamente al antígeno (Amit y colaboradores, Science, 233:747-753 (1986)); Interactuar con/efectuar la conformación de un CDR (Chotia y col., J. Mol Biol., 196:901 -917 (1987)); y/o participar en la interfaz de VL VH. En ciertos aspectos, la modificación de uno o más de tales residuos o regiones marco da lugar a una mejora de la afinidad de unión del anticuerpo con el antígeno. Por ejemplo, alrededor de uno a, aproximadamente, cinco residuos de marcos (por ejemplo, 1 , 2, 3, 4 o 5) pueden ser modificados en este aspecto de la invención. A veces, esto puede ser suficiente como para producir un anticuerpo con un incremento de la afinidad de unión, aun cuando ninguno de los residuos de la región hipervariable haya sido alterado. Normalmente, sin embargo, un anticuerpo modificado comprenderá una alteración de la región hipervariable(s) adicional.
Los residuos de la región hipervariable que se alteran se pueden cambiar al azar, especialmente cuando la afinidad de la unión inicial de un anticuerpo anti-CD20 con el antígeno es tal que tales anticuerpos alterados producidos al azar puedan ser fácilmente seleccionados.
Un procedimiento útil para generar tal anticuerpo modificado es denominado "mutagénesis mediante escaneo de alanina" (Cunningham y Wells, Science, 244:1081 -1085 (1989)). Uno o más de los residuos de la región hipervariable(s) se sustituyen por residuo(s) de alanina o residuo(s) de polialanina para afectar la interacción de los aminoácidos con el antígeno. Aquellos residuos de la(s) región(es) hipervariable(s) que demuestran una sensibilidad funcional a las sustituciones luego son refinadas por la introducción de mutaciones adicionales, o de otro tipo a, o para, los sitios de sustitución. Así, mientras que el sitio para introducir una variación de una secuencia de aminoácidos se determina, la naturaleza de la mutación en sí misma no tiene que ser predeterminada. Los mutantes Ala- producidos de esta manera son evaluados por su actividad biológica tal como se describe en el presente documento y/o como se conoce en el arte.
Otro procedimiento para generar dicho anticuerpo alterado implica la maduración de la afinidad utilizando la visualización de fagos (Hawkins y col., J. Mol. Biol, 254:889-896 (1992) y Lowman y col., Biochemistry, 30 (45) :10832-10837 (1991 )). En pocas palabras, varios sitios de la región hipervariable (por ejemplo, 6-7 sitios) están mutados para generar todas las posibles sustituciones de aminoácidos en cada sitio. Los mutantes de los anticuerpos así generados se muestran en forma monovalente desde las partículas de fagos filamentosos como fusiones al producto gen III M13 empacados dentro de cada partícula. Los fagos mutantes qua aparecen son examinados por su actividad biológica (por ejemplo, por la afinidad de unión) tal como se revela en el presente documento y/o como se conoce en el arte.
Las mutaciones en las secuencias de anticuerpos pueden incluir sustituciones, eliminaciones, incluyendo eliminaciones internas, adiciones, incluyendo el aumento del rendimiento de las proteínas de fusión, o sustituciones conservadoras de los residuos de aminoácidos dentro y/o adyacentes a la secuencia de aminoácidos, pero que resultan en un cambio silencioso, por lo que el cambio produce un anticuerpo o fragmento anti-CD20 funcionalmente equivalente. Las sustituciones conservadoras de aminoácidos se pueden hacer sobre la base de la similitud en la polaridad, la carga, la solubilidad, la hidrotobicidad, la hidrofilia, y/o la naturaleza antipática de los residuos en cuestión. Por ejemplo, los aminoácidos no polares (hidrofóbicos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina, los aminoácidos polares neutros son: glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y la glutamina; los aminoácidos positivamente cargados (básicos) incluyen arginina, Usina e histidina, y los aminoácidos con carga negativa (ácido) son: el ácido aspártico y ácido glutámico. Además, la glicina y la prolina son residuos que pueden influir en la orientación de la cadena. Las sustituciones no conservativas implicarán el intercambio de un miembro de una de estas clases por un miembro de otra clase. Por otra parte, si se deseara, pueden introducirse aminoácidos no clásicos o análogos de aminoácidos químicos, mediante sustitución o adición en la secuencia de anticuerpos. Los aminoácidos no-clásicos incluyen, pero no están limitados por, los D-isómeros de los aminoácidos comunes, el ácido a-amino isobutírico, el ácido 4-aminobutírico, Abu, el ácido 2-amino butírico, ?-Abu, e-Ahx, el ácido 6-amino hexanoico, Aib, el ácido 2-amino butírico, el ácido 3-amino propiónico, ornitina, norleucina, norvalina, hidroxiprolina, sarcosina, citrulina, ácido cisteico, t-butilglicina, t-butilalanina, fenilglicina, ciclohexilalanina, ß-alanina, flúor-aminoácidos, aminoácidos de diseño tales como los ß-metil aminoácidos, C-a-metil aminoácidos, ?-a-metil aminoácidos y análogos de aminoácidos en general.
En otro aspecto, los sitios seleccionados para su modificación son de afinidad madura que utilizan la aparición de fagos (véase más arriba).
Cualquier técnicas para la mutagénesis conocida en la técnica se puede utilizar para modificar los nucleótidos individuales en una secuencia de ADN, a los efectos de hacer la sustitución del aminoácido(s) en la secuencia de los anticuerpos, o para la creación/ eliminación de sitios de restricción para facilitar la manipulación posterior. Estas técnicas incluyen, pero no se limitan a, la mutagénesis química, la mutagénesis de sitio-dirigido ¡n vitro (Kunkel, Proc Nati Acad Sci. USA, 82:488 (1985); Hutchinson, C. y col., J. Biol. Chem., 253:6551 (1978)), la mutagénesis dirigida de oligonucleótidos (Smith, Ann Rev. Genet, 19:423-463 (1985) Hill y col., Methods Enzymol., 155:558-568 (1987), extensión por superposición basada en la PCR (Ho y col., Gene, 77:51 -59 (1989)), mutagénesis del megacebador basado en la PCR (Sarkar y col., Biotechniques, 8:404-407 (1990)), etc. Las modificaciones se pueden confirmar mediante la secuenciación del dideoxi ADN de doble cadena.
Los ácidos nucleicos aislados de la presente invención pueden ser utilizados para la producción de, al menos, un anticuerpo o un fragmento específico de CD20 o una variante específica del mismo, que puede ser utilizado para medir o efectuar en una célula, tejido, órgano o animal (incluidos los mamíferos y los seres humanos), para diagnosticar, controlar, modular, tratar, aliviar, ayudar a prevenir la incidencia de, o reducir los síntomas de, al menos, una condición, seleccionada de, pero no limitada por, al menos uno de: un trastorno o una enfermedad inmunológica, un trastorno o una enfermedad cardiovascular, una patología infecciosa, maligna, cancerosa, y/o un trastorno o enfermedad neurológica, u otras condiciones relacionadas con el antígeno especificado o conocido.
Es significativo que los anticuerpos humanos obtenidos mediante ingeniería que son específicos para las proteínas humanas o sus fragmentos, tales como el CD20, pueden ser diseñados para otros antígenos inmunogénicos o isoformas, tal como una proteína CD20 y/o una porción de la misma (incluyendo las moléculas sintéticas, tales como los péptidos sintéticos) o cualquiera de, o una combinación' de antígenos, tales como el CD56, receptor del factor de crecimiento epidérmico humano (HER1 ), IgE, el factor de crecimiento endotelial vascular, los inhibidores de la dimerización de HER, las proteínas de la familia Bcl-2, el MET, IL-13, IFN alfa, EGFL7, CD40, DR4 y DR5, la quinasa PI3, linfotoxina alfa, la integrina beta 7, la beta amiloide, CRIG, TNF, complemento (C5), CBL, CD147, IL-8, gp120, VLA-4, CD1 1 a, CD18, VEGF, CD40L, Id, ICAM-1 , CD2, EGFR, TGF-beta, TNF-alfa, E-selectina, Fact VII, el TNF, Her2/neu, gp M, CD1 1/18, CD14, ICAM-3, CD80, CD40L, CD4, CD23, beta-2 integrina, alfa4beta7, CD52, HLA-DR, CD22, CD64 (Fe), beta TCR alfa, CD2, CD3, hepatitis B, CA 125, EpCAM, gp120, CMV, gpllbllla, IgE, IL-5, IL-4, CD25, CD3, CD33, CD30, CD19, CD22, CD28, CD36, CD37, CD44, CD55, CD59, CD70, CD79, CD80, CD103, CD134, CD137, CD138, CD152, HLA, VNRintegrina, CD25, IL-23 e IL-12, por ejemplo.
Producción de anticuerpos Por lo menos un anticuerpo específico del antígeno de la presente invención, tal como un anticuerpo anti-CD20, puede, opcionalmente, ser producido por una línea de células, una línea de células mixtas, una célula inmortalizada o una población clonal de células inmortalizadas, como es bien conocido en el arte. Véase, por ejemplo, Ausubel, y col., ed, Current Protocole in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, NY (1987-2001 ); Sambrook, y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 a edición, Cold Spring Harbor, Nueva York (1989); Harlow y Lañe, Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Nueva York (1989);. Colligan, y col., eds, Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons. Inc., Nueva York (1994-2001 ); Colligan y colaboradores, Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, New York, NY, (1997-2001 ).
En un método, un hibridoma se produce por la fusión de una línea celular inmortal adecuada (por ejemplo, una línea celular de mieloma, tal como, pero no limitado a, Sp2/0, SP2/0-Ag14, NS0, NS1 , NS2, Jurkat AE-1 , L.5, L243, P3X63Ag8.653, Sp2 SA3, Sp2 AMI, Sp2 SS1 , Sp2 SA5, U937, MLA 144, IV ACT, MOLT4, DA-1 , WEHI, K-562, COS, RAJI, NIH 3T3, HL-60, MLA 144, MAMALWA, NEURO 2A, o similares, o heteromielomas, productos de la fusión de los mismos, o en cualquier célula o célula de fusión derivadas de allí, o cualquier otra línea de célula adecuada tal como se conoce en el arte) ( véase, por ejemplo, www.atcc.org, www.lifetech.com y similares), con las células productoras de anticuerpos, tales como, pero no limitadas por, al bazo aislado o clonado, sangre periférica, linfa, las amígdalas, u otras células inmunes o que contienen células B, o cualesquiera otras células que expresen la cadena pesada o liviana, constante o variable, o de marco, o las secuencias de CDR, tanto en forma de ácido nucleico heterólogo como endógeno, como recombinante o endógeno, virus, bacterias, algas, procariotas, anfibios, insectos, reptiles , peces, mamíferos, roedores, equinos, ovinos, caprinos, ovejas, los primates, el ADN eucariota, genómico, cADN, ADNr, ADN o ARN mitocondrial, ADN o ARN del cloroplasto, ARNhn, ARNm, ARNt, de hebra simple, doble o triple, hibridizada, y similares, o cualquier combinación de los mismos. Véase, por ejemplo, Ausubel, supra, y Colligan, Immunology, supra, capítulo 2, totalmente incorporados en el presente documento como referencia.
Las células productoras de anticuerpos también se pueden obtener de la sangre periférica o, preferiblemente, del bazo o de los ganglios linfáticos, de los seres humanos o de otros animales adecuados que han sido inmunizados con el antígeno de interés. Cualquier otra célula huésped adecuada también puede ser utilizada para expresar el ácido nucleico heterólogo o endógeno que codifica un anticuerpo, un fragmento o una variante especifica del mismo de la presente invención. Las células fusionadas (hibridomas) o las células recombinantes pueden ser aisladas por medio de condiciones de cultivo selectivas o mediante otros métodos conocidos adecuados, y clonadas mediante una dilución limitada o clasificación de las células, o por otros métodos conocidos. Las células que producen anticuerpos con la especificidad deseada se pueden seleccionar mediante un ensayo adecuado (por ejemplo, mediante ELISA y, más específicamente, mediante un ELISA CD20).
Un anticuerpo específico a un antígeno humano, puede ser adicionalmente generado mediante la inmunización de un animal transgénico (por ejemplo, un ratón, una rata, un hámster, primates no humanos y similares) capaz de producir un repertorio de anticuerpos humanos, tal como se describe en el presente documento y/o como se conoce en el arte. Las células que producen un anticuerpo específico contra el antígeno se pueden aislar de dichos animales e inmortalizarlas mediante un tratamiento adecuado, tales como los métodos descriptos en el presente documento.
Los ratones transgénicos que pueden producir un repertorio de anticuerpos humanos que se unen a los antígenos humanos, tales como el CD20 humano, pueden ser producidos mediante métodos conocidos (por ejemplo, pero no limitados por, los descritos en las Patentes US. No. 5.770.428, 5.569.825, 5.545.806, 5.625.126, 5.625.825, 5.633.425, 5.661.016 y 5.789.650 publicada a Lonberg y col., Jakobovits y col.,WO 98/50433, Jakobovits y col.,WO 98/24893, Lonberg y col.,WO 98/24884, Lonberg y col.,WO 97/13852, Lonberg y col., WO 94/25585, Kucherlapate y col., WO 96/34096, Kucherlapate y col., patente europea EP 0463 151 B1 , Kucherlapate y col., EP 0710 719 A1 , Surani y col., US Pat. No. 5.545.807, Brüggemann y col., WO 90/04036, Brüggemann y col., patente europea EP 0 438 474 B1 , Lonberg y col., EP 0 814 259 A2, Lonberg y col., GB 2 272 440 A, Lonberg y col., Nature 368:856-859 (1994), Taylor y col., Int. Immunol. 6 (4) 579-591 (1994), Green y col., Nature Genetics 7:13-21 (1994), Méndez y col., Nature Genetics 15:146-156 (1997), Taylor y col., Nucleic Acids Research 20 (23): 6287-6295 (1992), Tuaillon y col., Proc Nati Acad Sci. USA, 90 (8) 3.720 -3724 (1993), Lonberg y col. Immunol Rev Int 13 (1 ): 65-93 (1995) Fishwald y col., Nat Biotechnol 14 (7) : 845-851 (1996), que están cada una de ellas incorporadas en el presente documento, como referencia, en su totalidad). Por lo general, estos ratones comprenden, al menos, un transgén que comprende el ADN de, al menos, un locus de inmunoglobulina humana que está funcionalmente reordenado, o que puede experimentar un reordenamiento funcional. El locus de la inmunoglobulina endógena en tales ratones puede ser interrumpido o suprimido, para eliminar la capacidad del animal de producir anticuerpos codificados por sus genes endógenos.
La detección de anticuerpos para la unión específica a proteínas, o a fragmentos similares, puede ser adecuadamente lograda utilizando bibliotecas de visualización de péptidos, exhibición de fagos y otros métodos conocidos. Los métodos de exhibición de péptidos implican la proyección de grandes colecciones de péptidos para los miembros individuales que tienen la función o estructura deseada. La detección de anticuerpos en las bibliotecas de exhibición de péptidos es muy conocida en el arte. Las secuencias de péptidos que aparecen pueden ser de 3 a 5000 o más aminoácidos de longitud, con frecuencia de 5 a 100 aminoácidos de longitud y, a menudo, de aproximadamente 8 a 25 aminoácidos de largo. Además de los métodos químicos de síntesis para la generación de las bibliotecas de péptidos, se han descrito varios métodos de ADN recombinante. Un tipo involucra la exhibición de una secuencia de un péptido en la superficie de un bacteriófago o de una célula. Cada bacteriófago o célula contiene la secuencia de nucleótidos, codificando la particular secuencia de péptidos que se exhibe. Estos métodos se describen en la publicación de las solicitudes de patentes PCT No. 91/17271 , 91/18980, 91/19818 y 93/08278.
Otros sistemas para la generación de bibliotecas de péptidos poseen aspectos tanto de la síntesis química in vitro como de los métodos recombinantes. Ejemplos de estos sistemas se describen, por ejemplo, en la publicación de las solicitudes de patente PCT N 0 92/05258, 92/14843 y 96/19256. Véase también, las patentes US No. 5.658.754 y US No. 5.643.768. Las bibliotecas de exhibición de péptidos, vectores y los equipos de detección se encuentran comercialmente disponibles en el mercado a través de proveedores tales como Invitrogen (Carlsbad, California) y Cambridge Antibody Technologies (Cambridgeshire, Reino Unido). Ejemplos de estos sistemas se describen, por ejemplo, en las patentes de los Estados Unidos de Norte América No. 4.704.692, 4.939.666, 4.946.778, 5.260.203, 5.455.030, 5.518.889, 5.534.621 , 5.656.730, 5.763.733, 5.767.260, 5.856.456 asignadas a Enzon, en las patentes de los Estados Unidos de Norte América No. 5.223.409, 5.403.484, 5.571 .698, 5.837.500 asignadas a Dyax; en la patente de los Estados Unidos de Norte América No. 5.427.908, 5.580.717 asignada a Affymax; en la patente de los Estados Unidos de Norte América No. 5.885.793 asignada a Cambridge Antibody Technologies; en la patente de los Estados Unidos de Norte América No. 5.750.373 asignada a Genentech, en las patentes de los Estados Unidos de Norte América No. 5.618.920, 5.595.898, 5.576.195, 5.698.435, 5.693.493, 5.698.417 asignadas a Xoma y col.; y Sambrook supra. Los anticuerpos CD20 de la presente invención también puede ser preparados mediante, al menos, un ácido nucleico que codifique un anticuerpo específico para el antígeno, para suministrar animales o mamíferos transgénicos, tales como cabras, vacas, caballos, ovejas, conejos y similares, que produzcan dichos anticuerpos en la leche. Cada animal puede ser provisto utilizando los métodos conocidos. Ejemplos de estos métodos se describen, por ejemplo, pero no se limitan a, las patentes de los Estados Unidos de Norte América No. 5.827.690, 5.849.992, 4.873.316, 5.849.992, 5.994.616, 5.565.362, 5.304.489 y similares. Cada referencia que se menciona en el presente documento está incorporada en la presente, en su totalidad.
Los anticuerpos anti-CD20 de la presente invención, pueden ser además preparados utilizando, al menos, un ácido nucleico que codifique un anticuerpo específico para un antígeno, para proporcionar plantas y células vegetales cultivadas transgénicas (por ejemplo, pero no limitadas a, el tabaco y el maíz) que produzcan a estos anticuerpos, porciones especificas o variantes, en partes de las plantas o en las mismas células cultivadas. A modo de ejemplo no limitativo, las hojas de tabaco transgénicas que expresan proteínas recombinantes se utilizan con éxito para proporcionar grandes cantidades de proteínas recombinantes, por ejemplo, utilizando un promotor inducible. Véase, por ejemplo, Cramer y col., Curr. Top. Microbol. Immunol. 240:95-1 18 (1999) y las referencias allí citadas. Además, el maíz transgénico se utiliza para expresar proteínas de mamíferos a niveles de producción comercial, con actividades biológicas equivalentes a las producidas en otros sistemas recombinantes o a los purificados a partir de fuentes naturales. Véase, por ejemplo, Hood y col, Adv. Exp. Med. Biol. 464:127-147 (1999) y las referencias allí citadas. Los Anticuerpos (incluyendo los fragmentos de anticuerpos, tales como los anticuerpos de cadena única (scFvs)) se producen en grandes cantidades a partir de semillas de plantas transgénicas, incluyendo las semillas del tabaco y los tubérculos de la papa. Véase, por ejemplo, Conrad y col., Plant Mol. Biol. 38:101 -109 (1998) y las referencias allí citadas. Por lo tanto, los anticuerpos CD20 de la presente invención pueden ser producidos utilizando plantas transgénicas, de acuerdo con los métodos conocidos. Véase también, por ejemplo, Fischer y col., Biotechnol. Appl. Biochem. 30:99-108 (octubre, 1999), Ma y col., Trends Biotechnol 13:522-7 (1995), Ma y col, Plant Physiol. 109:341 -6 (1995); Whitelam y col., Biochem. Soc. Trans. 22:940-944 (1994), y las referencias allí citadas.
Ingeniería, humanización y acondicionamiento de la superficie de los anticuerpos Los métodos de ; ingeniería, humanización o acondicionamiento de la superficie de anticuerpos no humanos o humanos, también pueden ser utilizados y son bien conocidos en el arte. Un anticuerpo humanizado, con acondicionamiento de superficie, o hecho por ingeniería de manera similar, puede poseer uno o más residuos de aminoácidos de una fuente que no es humana, por ejemplo, pero no limitada a, ratones, ratas, conejos, primates no humanos u otros mamíferos. Estos residuos amino ácidos no-humanos son remplazados por los residuos que se denominan, a menudo, como residuos de "importación", los cuales suelen ser tomados de una variable, constante o de otro tipo de dominio de "importación" de una secuencia humana conocida.
Secuencias de Ig humanas conocidas se revelan, por ejemplo en www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi; www.ncbi.nih.gov/igblast; www.atcc.org/phage/hdb.html; www.mrc-cpe.cam.ac.uk/ALIGNMENTS.php; www.kabatdatabase.com/top.html; ftp.ncbi.nih.gov/repository/kabat; www.sciquest.com; www.abcam.com; www.anticuerporesource.com/onlinecomp.html; www. public.iastate.edu/.alrededor.pedro/researchjools. html; www.whfreeman.com/immunology/CH05/kuby05.htm; www.hhmi.org/grants/lectures/1996/vlab; www.path.cam. ac.uk/.alrededor.mrc7/mikeimages.html; I mcb.harvard.edu/BioLinks/lmmuhology.html; www.immunologylink.com; pathbox.wustl.edu/.about.hcenter/index.html; www.app iedbiosystems.com; www.nal.usda.gov/awic/pubs/antlcuerpo; www.m.ehime-u.ac.jp/.alrededor.yasuhito/Elisa.html; www.biodesign.com; www.cancerresearchuk.org; www.biotech.ufl.edu; www.isac-net.org; baserv.uci.kun.nl/.about.jraats/linksl .html; www.recab.uni-hd.de/immuno.bme.nwu.edu; www.mrc-cpe.cam.ac.uk; www.ibt.unam.mx/vir/V_mice.html; http://www.bioinf.org.uk/abs; anticuerpo.bath.ac.uk; www.unizh.ch; www.cryst.bbk. ac.uk/.alrededor.ubcg07s; www.nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.html; www.path.cam.ac.uk/.alrededor.mrc7/humanisation/TAHHP.html; www.ibt.unam.mx/vir/structure/stat_aim.html; www.biosci.missouri.edu/smithgp/index.html; www.jerini.de; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept. Health (1983), cada una de los cuales se incorporan aquí, como referencia, en su totalidad.
Tales secuencias importadas, pueden ser utilizadas para reducir la inmunogenicidad o para reducir, mejorar o modificar la unión, afinidad, constante de afinidad, constante de disociación, la avidez, la especificidad, la vida media, o cualquier otra característica adecuada, tal como se conoce en el arte. En general, los residuos CDR están directa y sustancialmente más implicados en influenciar la unión de CD20. En consecuencia, parte o la totalidad de las secuencias de CDR no humanas o humanas se mantienen, mientras que las secuencias no-humanas de las regiones variables y constantes podrán ser sustituidas con aminoácidos humanos o de otro tipo.
Los anticuerpos también pueden opcionalmente ser humanizados, acondicionados en su superficie o realizados por ingeniería, o los anticuerpos humanos pueden ser realizados por ingeniería con retención de alta afinidad para el antígeno CD20 y otras propiedades biológicas favorables. Para lograr este objetivo, los anticuerpos anti-CD20 y los anticuerpos humanizados (o humanos) acondicionados en su superficie o realizados por ingeniería, anti- CD20 pueden ser, opcionalmente, preparados mediante un procedimiento de análisis de las secuencias parentales y por diversos productos humanizados y de ingeniería conceptual mediante el uso de modelos tridimensionales de las secuencias, parental, de ingeniería, y humanizadas. Los modelos tridimensionales de inmunoglobulina se encuentran normalmente disponibles y son familiares para los expertos en la materia. Los programas de computación disponibles ilustran y muestran las probables estructuras de conformación tridimensional de las secuencias de inmunoglobulina candidato seleccionada. La inspección de estas muestras permite el análisis de la función probable de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de la inmunoglobulina candidato, es decir, el análisis de los residuos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidato para unirse a antígenos, tales como CD20. De esta manera, los residuos de marco (FR) pueden ser seleccionados y combinados de las secuencias de consenso y de importación, de modo que la característica deseada del anticuerpo, tal como una mayor afinidad por el antígeno (s) objetivo, se logre.
La Humanización, acondicionamiento de superficie o ingeniería de los anticuerpos de la presente invención puede ser llevada a cabo utilizando métodos conocidos, tal como, pero sin estar limitados por, aquellos descritos en Winter (Jones y col., Nature 321 :522 (1986); Riechmann y col., Nature 332:323 (1988); Verhoeyen y col., Science 239:1534 (1988)), Sims y col., J. Immunol. 151 : 2296 (1993); Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196:901 (1987), Cárter y col., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 89:4285 (1992); Presta y col., J. Immunol. 151 :2623 (1993), U.S. Pat. Nos. 5,639,641 , 5,723,323; 5,976,862; 5,824,514; 5,817,483; 5,814,476; 5,763,192; 5,723,323; 5,766,886; 5,714,352; 6,204,023; 6,180,370; 5,693,762; 5,530,101 ; 5,585,089; 5,225,539; 4,816,567; PCT/: US98/16280; US96/18978; US91/09630; US91/05939; US94/01234; GB89/01334; GB91/01 134; GB92/01755; WO90/14443; WO90/14424; WO90/14430; EP 229246; 7,557,189; 7,538,195 y 7,342,1 10, cada uno de los cuales se incorpora a la presente, como referencia, en su totalidad.
Regiones Fe En algunos aspectos, el anticuerpo comprende una región Fe alterada (por ejemplo, mutada). Por ejemplo, en algunos aspectos, la región Fe fue modificada para reducir o mejorar las funciones efectoras de los anticuerpos. En algunos aspectos, la región Fe es un isotipo seleccionado de IgM, IgA, IgG, IgE u otros isotipos.
Como alternativa o de manera adicional, puede ser útil combinar las modificaciones de los aminoácidos con una o más otras modificaciones de aminoácidos que alteren la unión a C1 q y/o la función de la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) de la región Fe de una molécula de unión al antígeno. El polipéptido de partida de interés particular, puede ser uno que se una a C1q y muestre una citotoxicidad dependiente del complemento. Los polipéptidos con actividad de unión a C1 q preexistente que, además, opcionalmente, tengan capacidad de mediar en los CDC, pueden ser modificados de tal manera que una o ambas de estas actividades sean mejoradas. Las modificaciones de los aminoácidos que alteran a C1 q y/o modifican su función de citotoxicidad dependiente del complemento, se describen, por ejemplo, en la solicitud de patente PCT WO0042072, la cual se incorpora a la presente, como referencia, en su totalidad.
Se puede diseñar una región Fe de un anticuerpo de la invención con la función efectora alterada, por ejemplo, mediante la modificación de la unión a Clq y/o la unión a FcyR y, por lo tanto, cambiar la actividad CDC y/o la actividad ADCC. Las "Funciones efectoras" son responsables de la activación o de la disminución de la actividad biológica (por ejemplo, en un sujeto). Ejemplos de funciones efectoras incluyen, pero no se limitan a: la unión a C1 q; citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), la unión al receptor Fe, citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC), la fagocitosis, la regulación a la baja de los receptores de superficie de la célula (por ejemplo, receptor de las células B; BCR), etc. Tales funciones efectoras pueden requerir la región Fe para ser combinadas con un dominio de unión (por ejemplo, un dominio de anticuerpos variable) y se puede evaluar utilizando diversos análisis (por ejemplo, los ensayos de unión a Fe, los ensayos ADCC, los ensayos CDC, etc.).
Por ejemplo, se puede generar una región Fe variante del anticuerpo anti-CD20 de ingeniería con un mejora de la unión a C1q y un mejora de la unión a Fe RUI (por ejemplo, que tiene tanto una mejora en la actividad ADCC como una mejora de la actividad CDC). Por otra parte, si se deseara que la función efectora sea reducida o abolida, una región variante Fe puede ser diseñada por ingeniería con reducción de la actividad de CDC y/o con reducción de la actividad de ADCC. En otros aspectos, sólo una de estas actividades puede ser aumentada, y, opcionalmente, también la otra actividad puede ser reducida (por ejemplo, para generar una variante de la región Fe con un mejora de la actividad ADCC, pero con una actividad reducida CDC y viceversa). Un Fe ejemplar mutante es el cambio de residuos triple, S239D, A330L y I332D (sistema de numeración de la UE) en el que ADCC se ha mejorado y la actividad de CDC ha disminuido. Métodos no limitantes para el diseño de tales imitantes pueden encontrarse, por ejemplo, en Lazar y col. (2006, Proc Nati Acad Sci USA 103 (1 1 ): 4005 a 4010) y Okazaki y col., (2004, J. Mol. Biol. 336 (5): 1239-49). Véase también WO 03/074679, WO 2004/029207, WO 2004/099249, WO2006/047350, WO 2006/019447, WO 2006/105338 y WO 2007/041635.
Las mutaciones Fe también se pueden introducir en los anticuerpos diseñados para alterar su interacción con el receptor Fe neonatal (FcRn) y mejorar sus propiedades farmacocinéticas. Una colección de variantes Fe humanas con la mejora de la unión a la FcRn han sido descritos e incluyen, por ejemplo, Shields y col., 2001. El mapeo de alta resolución del sitio de unión de la lgG1 humana para FcyRI, FcyRIl, FCYRI I I, y FcRn y el diseño de las variantes lgG1 con una mejor unión a FcyRI, J. Biol. Chem. 276:6591 -6604), son incorporados en la presente, como referencia, en su totalidad.
Otro tipo de sustitución de aminoácidos sirve para alterar el patrón de glicosilación de la región Fe de un anticuerpo. La glicosilación de una región Fe suele ser N-enlazada u O-enlazada. Las N-enlazadas, por lo general, se refieren a la unión de la fracción de hidratos de carbono a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática de la porción de hidratos de carbono a las secuencias de péptidos de cadena lateral de asparagina son asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, donde X es cualquier aminoácido, excepto prolina. Por lo tanto, la presencia de cualquiera de estas secuencias de péptidos de un polipéptido crea un sitio de glicosilación potencial. La glicosilación O-enlazada, por lo general , se refiere a la conexión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa a un ácido hidroxiamino, más comúnmente serina o treonina, aunque la 5-hidroxiprolina y la 5-hidroxilisina también puede ser utilizadas.
El patrón de glicosilación de un anticuerpo o fragmento del mismo puede ser modificado, por ejemplo, mediante la supresión de uno o más de los sitios de glicosilación que se encuentren en el polipéptido, y/o por la adición de uno o más sitios de glicosilación que no están presentes en el polipéptido. La eliminación de sitios de glicosilación en la región Fe de iun anticuerpo o fragmento de anticuerpo es, de manera conveniente, lograda mediante la alteración de la secuencia de aminoácidos, de tal manera que se elimine una o más de las secuencias de tripéptido anteriormente descriptas (para los sitios de N-glicosilación). Un ejemplo de variante de glicosilación tiene una sustitución de los residuos de aminoácidos N297 a A297 (sistema de numeración de la UE) de la cadena pesada. La eliminación de un sitio de glicosilación de enlace-O también puede lograrse mediante la sustitución de uno o más residuos de serina o treonina glicosiladas o con cualquier aminoácido además de serina o treonina.
Cuando el anticuerpo comprende una región Fe, el hidrato de carbono unido al mismo puede ser alterado. Por ejemplo, los anticuerpos con una estructura de hidratos de carbono madura que carece de fucosa unida a una región Fe del anticuerpo se describen, por ejemplo, en la Solicitud de patente US No.: 2003/0157108: (Presta, L.) y en la Solicitud de patente US No.: 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Se hace referencia a los anticuerpos con una N-acetilglucosamina (GIcNAc) bisectante en el hidrato de carbono unido a una región Fe del anticuerpo, por ejemplo, en WO 2003/01 1878, Jean-Mairet y col. y Patente US No. 6.602.684, Umana y col. Se informa acerca de anticuerpos con, al menos, un residuo de galactosa en el oligosacárido unido a una región Fe de un anticuerpo, por ejemplo, en la solicitud de Patente PCT WO 1997/30087, Patel y col. Véase también, WO 1998/58964 y WO 1999/22764 (Raju, S.) relacionadas con anticuerpos con hidratos de carbono alterados unidos a la región Fe de los mismos. Véase también, por ejemplo, la solicitud de patente US No.: 2005/0123546 (Umana y col.) relacionada con moléculas de unión al antígeno con glicosilación modificada.
En ciertos aspectos, una variante de glicosilación comprende una región Fe, en donde una estructura de los hidratos de carbono unida a la región Fe carece de fucosa. Tales variantes han mejorado la función ADCC. Ejemplos de publicaciones relacionadas con los anticuerpos "defucosilados" o "deficientes en fucosa" incluyen: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/01 15614; US 2002/0164328; US 2004/0093621 ; US 2004/0132140; US 2004/01 10704; US 2004/01 10282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; W02005/053742; Yamane Ohnuki y col., Biotech. Bioeng, 87. 614 (2004). Ejemplos no limitantes de líneas celulares productoras de anticuerpos defucosilados incluyen a las células CHO Lecí3 deficientes en la fucosilación de las proteínas (Ripka y col., Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); solicitud de patente US No. 2003/0157108 A1 , Presta, L; y WO 2004/056312 A1 , Adams y col., especialmente en el ejemplo 1 1 ), líneas de células knockout, tales como el gen de la alfa-1 ,6-fucosiltransferasa, FUT8, las células CHO knockout (Yamane-Ohnuki y col., Biotech Bioeng, 87. 614 (2004)), y mediante el uso inhibidores de la ruta de fucosilación, tales como, por ejemplo, castanospermina en medios de cultivo de células (solicitud de patente US No.: 2009/0041765).
En algunos aspectos, el anticuerpo de la presente invención se expresa en células que expresan a la beta (1 ,4)-N-acetilglucosaminotransferasa III (GnT III), de tal manera que GnT III añade GIcNAc al anticuerpo humano de ingeniería antígeno específico. Métodos para la producción de anticuerpos de esta manera, se proporcionan en WO/9954342, WO/0301 1878, en la publicación de patente 20030003097A1 y en Umana y col., Nature Biotechnology, 17:176-180, febrero de 1999.
Afinidad del anticuerpo Los anticuerpos de la invención se unen a CD20 humano, con una amplio rango de afinidades (KD). En un aspecto preferido, de manera opcional, por lo menos un mAb de la presente invención, puede unirse con alta afinidad a antígenos humanos. Por ejemplo, un mAb humano, humanizado, con acondicionamiento de superficie o realizado por ingeniería, puede unirse a un antígeno humano con un KD igual o menor que, aproximadamente, 10'7 M, por ejemplo, pero no limitado a, 0,1 a 9,9 (o cualquier rango o valor de la misma) x10"7 , ? ?-8, 109, ? ?-10, 10"1\ 10"12, 10"13, 1014, ? ?-15 o cualquier rango, o valor de la misma, según lo determinado por el ensayo de inmunoabsorcion ligado a enzimas (ELISA), resonancia de plasmones superficiales (SPR, por sus siglas en Idioma Inglés) o el método KinExA ®, tal como es practicado por los expertos en la materia. Los anticuerpos anti-CD20 se unen con una Kd de aproximadamente 10"9 M o menos, más específicamente cerca de 10"9 a 10"10 M.
La afinidad o avidez de un anticuerpo por un antígeno se determina experimentalmente utilizando cualquier método adecuado bien conocido en el arte, por ejemplo, mediante el ensayo de inmunoabsorcion ligado a enzimas (ELISA), mediante el radioinmunoensayo (RIA) o mediante cinética (por ejemplo, análisis de BiacoreMR). Formatos de ensayo de unión directa, así como de ensayo de unión competitiva pueden ser fácilmente utilizados. (Véase, por ejemplo, Berzofsky y col., "Antibody-Antigen Interactions" en Fundamental Immunology, Paul, W.E., Ed, Raven Press: New York, NY (1984); Kuby Janis, Immunology, WH Freeman y Compañía: Nueva York, NY (1992), y los métodos descriptos en el presente documento. La medida de la afinidad de una interacción antígeno-anticuerpo en particular puede variar si se mide bajo condiciones diferentes (por ejemplo, concentración de la sal, pH y temperatura). Por lo tanto, las mediciones de afinidad y otros parámetros de enlace de antígeno (por ejemplo, KD o Kd, on y K0fi) se hacen, preferiblemente, con soluciones estandarizadas de anticuerpos y antígenos y un amortiguador estándar, tal como se conoce en el arte y con un amortiguador tal como el que se describe en el presente documento.
En un aspecto, los ensayos de unión pueden ser llevados a cabo utilizando un ensayo de inmunoabsorción ligado con enzimas (por ejemplo, ELISA) con antígenos CD20. Por ejemplo, los lisados de células crudas preparados a partir líneas de células B que expresan CD20 o una proteína recombinante, pueden ser utilizados como fuente del antígeno CD20 que se describe en la presente. Dichas preparaciones de antígeno CD20 fueron cubiertas sobre placas Immulon 2HB en carbonato de sodio 50 mM (pH 9.6) a 100 pL/pocillo durante aproximadamente 18 a 24 hrs, a 4 °C. Las placas se lavan con buffer de lavado (Tween-20 0.1 % en TBS, pH 7.4). Subsecuentemente, las placas se bloquean con caseína 1 % en TBS (pH 7.4), durantel hora, a temperatura ambiente. A las placas se le agregan diluciones seriales de los anticuerpos, se incuban durante aproximadamente 3 horas a temperatura ambiente y, entonces, se lavan como anteriormente. Para la detección, un conjugado HRP-anti- humano de cabra o un anticuerpo anti-murino de cabra se agrega como un segundo anticuerpo y se permite la incubación durante 1 hora, a temperatura ambiente. Las placas se lavan como anteriormente y se agrega para el desarrollo 100 pL/pocillo de sustrato TMB1 (BioFX). La reacción se apaga con 100 pL/pocillo de reactivo de parada 450 nm (BioFX) luego de aproximadamente 20 min. La absorbancia a 450 nm se lee y se gráfica respecto a la concentración de anticuerpos, para cada anticuerpo. Una curva dosis-respuesta sigmoidea se ajusta para las curvas de unión y se calculan los valores de EC50 utilizando programas tales como el GraphPad Prism v4 con parámetros por defecto (GraphPad software, San Diego, CA). Los valores de EC50 pueden ser usados como una medida de la constante de disociación aparente "Kd" o "KD" para cada anticuerpo.
El porcentaje (%) de identidad de una secuencia de aminoácidos con respecto a una secuencia de péptidos o polipéptido, también se define como el porcentaje de residuos de aminoácidos en una secuencia candidato que sean idénticos a los residuos de aminoácidos en la secuencia específica de péptidos o polipéptido, después de alinear las secuencias y, si fuese necesario, la introducción de los espacios, para alcanzar el porcentaje máximo de identidad de la secuencia y no considerar ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. La alineación a efectos de determinar el porcentaje de identidad de la secuencia de amino ácidos se puede lograr de varias maneras que están dentro de la habilidad en el arte, por ejemplo, las descriptos en el presente documento, como por ejemplo, mediante el uso de programas de software informáticos disponibles en forma pública, tales como los programas de computación BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Las personas expertas en la materia pueden determinar los parámetros adecuados para medir la alineación, incluyendo los algoritmos necesarios para lograr la alineación máxima sobre toda la longitud de las secuencias que se comparan. En situaciones en las que ALIGN-2 está disponible y puede ser empleado para las comparaciones con las secuencias de los aminoácidos, el % de identidad de una secuencia dada de aminoácidos A para, con o contra una secuencia dada de aminoácidos B (la que alternativamente puede expresarse como una secuencia dada de aminoácidos A que tiene o que comprende un cierto % de identidad con la secuencia de aminoácidos para, con o contra una secuencia dada de aminoácidos B) se calcula de la siguiente manera: 100 veces la fracción X/Y, donde X es el número de residuos de aminoácidos calificados como coincidencias idénticas mediante el programa de alineamiento de secuencias ALIGN-2, en la alineación de A y B de ese programa , y donde Y es el número total de residuos de aminoácidos en B. Podrá apreciarse que, cuando la longitud de la secuencia de aminoácidos A no sea igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de la secuencia de aminoácidos de A a B no será igual al % de identidad de secuencia de aminoácidos de B a A.
Resulta deseable que dos o más secuencias de aminoácidos sean, por lo menos, un 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o un 90 % idénticas. Es más deseable, que dos o más secuencias de aminoácidos sean, al menos, el 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o incluso el 100 % idénticas. A menos que se especifique lo contrario, todos los valores de los % de identidad de las secuencias de aminoácidos que aparecen en el presente documento son obtenidos tal como se describe en el párrafo inmediato anterior, utilizando, por ejemplo, los programas de computación ALIGN-2 o BLAST.
Uso del anticuerpo Por lo general, algunas formas de los anticuerpos antígeno específicos útiles para los métodos y las composiciones de la invención, opcionalmente, pueden ser caracterizados mediante una unión de alta afinidad al antígeno y, opcionalmente y de preferencia, que posean baja toxicidad y bajas consecuencias adversas para el receptor. De manera particular, resulta útil en la presente invención, un anticuerpo, o un fragmento específico o variante del mismo, donde los componentes individuales, tales como la región variable, la región constante y el marco, de manera individual y/o colectivamente, de manera opcional y preferentemente, poseen baja inmunogenicidad. Opcionalmente, los anticuerpos que pueden ser utilizados en la invención, se caracterizan por su capacidad para ser usados en e| tratamiento de pacientes durante períodos prolongados, con un alivio medible de los síntomas y/o con una baja y aceptable toxicidad. Una inmunogenicidad baja o aceptable y/o una alta afinidad, así como otras propiedades adecuadas, pueden contribuir al logro de los resultados terapéuticos. Una "Inmunogenicidad baja" se define en el presente documento como, por lo menos, la incidencia de niveles titulables de anticuerpos a un antígeno, en pacientes tratados con un anticuerpo, que ocurran en menos del 25 % de los pacientes tratados y, preferiblemente, en menos del 10 % de los pacientes, tratados con la dosis recomendada para el curso del tratamiento recomendado durante el período de tratamiento.
Los ácidos nucleicos aislados de la presente invención pueden ser utilizados para la producción de, al menos, un anticuerpo específico para CD20, un fragmento o una variante específica del mismo, que pueden ser utilizados para medir o alcanzar un efecto en una célula, tejido, órgano o animal (incluidos los mamíferos y los seres humanos), para diagnosticar, controlar, modular, tratar, aliviar, ayudar a prevenir la incidencia de, o para reducir los síntomas de, al menos, una condición, seleccionada, pero no limitada a, al menos, uno de, un trastorno o enfermedad inmunológico, un trastorno o enfermedad cardiovascular, una enfermedad o un trastorno infeccioso, canceroso o neurológico, u otras condiciones relacionadas con el antígeno conocidas o especificadas.
Dicho método puede comprender la administración de una cantidad efectiva de una composición o una composición farmacéutica que comprenda, al menos, un anticuerpo específico para el antígeno, tal como un anticuerpo anti-CD20 o un fragmento del mismo , a una célula, tejido, órgano, animal o paciente que necesite de dicha modulación, tratamiento, alivio, prevención o reducción, de los síntomas, efectos o mecanismos. La cantidad efectiva puede comprender una cantidad de aproximadamente 0,001 a 500 mg/kg por cada administración única (por ejemplo, en bolo), múltiple o continua, o para lograr una concentración sérica de alrededor de 0,01 a 5000 µg ml de concentración de suero, para cada administración única, múltiple o continua, o de cualquier rango efectivo o valor en el mismo, como se hace y se determina utilizando los métodos conocidos, tal como se describe en el presente documento o que sea conocidos en el arte pertinente.
Anticuerpos a modo de ejemplo Los anticuerpos específicos para CD20 preferidos de la invención, poseen las secuencias que se muestran. Por ejemplo, un anticuerpo específico para el antígeno de la invención incluye una de las secuencias CDR de las cadenas livianas de la Tabla 1 (es decir, CDRL1 , CDRL2 y CDRL3) y/o una de las secuencias CDR de la cadena pesada que se muestra en Tabla 1 (es decir, CDRH1 , CDRH2 y CDRH3). De manera mas específica, un anticuerpo anti-CD20-6 tiene la CDRL1 de SEQ ID NO:25, la CDRL2 de SEQ ID NO: 26, la CDRL3 de SEQ ID NO: 27, la CDRH1 de SEQ ID NO: 28, la CDRH2 de SEQ ID NO: 29, la CDRH3 de SEQ ID NO: 30. Y un anticuerpo anti-CD20-7 tiene la CDRL1 de SEQ ID NO: 17, la CDRL2 de SEQ ID NO: 18, la CDRL3 de SEQ ID NO: 19, la CDRH1 de SEQ ID NO: 20, la CDRH2 de SEQ ID NO: 21 , la CDRH3 de SEQ ID NO: 22.
Aspectos de la presente invención a modo de ejemplos, incluyen: Secuencias de aminoácidos murinas muCD20-7LC DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASGSVDSFGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLES GVPARFSGGGSRTDFTLTINPVEADDIATYFCQQSYEDPFTFGAGTKLEL RADAAPTVSI FPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMS STLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC [SEQ ID NO: 1 ]; Región Variable muCD20-7LC DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASGSVDSFGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLES GVPARFSGGGSRTDFTLTINPVEADDIATYFCQQSYEDPFTFGAGTKLELMR [SEQ ID NO:32] muCD20-7HC QLQLVQSGPELKKPGETVKISC ASGYSFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEP SYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQISNLKNEDTATYFCARGAYYRYDLGMDYWGQGTSV TVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPA VLESDLYTLSSSVTVPSSMRPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVS SVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCV VDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNST FRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMA KDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMNTNGSYFVYSKLNVQKSNWE AGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK [SEQ ID NO: 2]; Región variable muCD20-7HC QLQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYSFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEP SYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQISNLKNEDTATYFCARGAYYRYDLGMDYWGQGTSV TVSS [SEQ ID NO:34] muCD20-6LC DIVLTQSPASLAVSLGQRAIISCRASESVDNFGNSFMHWYQQKPGQPPTLLIYRASNLES GIPARFSGSGSRTDFTLTVNPVEADDIATYYCQQSYEDPFTFGAGTKLELKRADAAPTVSI FPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMS STLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC [SEQ ID NO: 3]; Región variable muCD20-6LC DIVLTQSPASLAVSLGQRAIISCRASESVDNFGNSF HWYQQKPGQPPTLLIYRASNLES GIPARFSGSGSRTDFTLTVNPVEADDIATYYCQQSYEDPFTFGAGTKLELKR [SEQ ID NO:46] muCD20-6HC QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYKFTNVGMNWVKQVPGKGLKWMGWINTYTGEP AYADDFKGRFVFSLETSASAAFLQINNLKNEDTATYFCARGAYYRYDLGMDYWGQGTSV TVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPA VLESDLYTLSSSVTVPSSMRPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVS SVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNST FRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMA KDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMNTNGSYFVYSKLNVQKSNWE AGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK [SEQ ID NO: 4]; Región variable muCD20-6HC QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYKFTNVGMNWVKQVPGKGLKWMGWINTYTGEP AYADDFKGRFVFSLETSASAAFLQINNLKNEDTATYFCARGAYYRYDLGMDYWGQGTSV TVSS [SEQ ID NO:47] Secuencias humanizadas de aminoácidos huCD20-7LCv1.0 DIVLTQSPASLAVSPGQRATISCRASGSVDSFGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLES GVPARFSGGGSRTDFTLTINPVEANDIATYFCQQSYEDPFTFGQGTKLELKRTVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS STLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC [SEQ ID NO: 5]; Región variable huCD20-7LCv1 .0 DIVLTQSPASLAVSPGQRATISCRASGSVDSFGNSFMHWYQQKPGQPPKLÜYRASNLES GVPARFSGGGSRTDFTLTINPVEANDIATYFCQQSYEDPFTFGQGTKLELKR [SEQ ID NO:33] huCD20-7HCv1.0 ELQLVQSGGELKKPGETVRISCAASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEP SYAAPFKGRFAFSLETSASTAYLQISSLKTEDTATYFCARGAYYRYDLGMDYWGQGTSV TVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAP ELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTL PPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLT VDKSRWQQGNVFSCSV HEALLHNHYTQKSLSLSPGK [SEQ ID NO: 6]; Región variable huCD20-7HCv1 .0 ELQLVQSGGELKKPGETVRISCAASGYTFTNYG NWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEP SYAAPFKGRFAFSLETSASTAYLQISSLKTEDTATYFCARGAYYRYDLGMDYWGQGTSV TVSS [SEQ ID NO:35] huCD20-7HCv1 .1 ELQLVQSGGELKKPGETVRISCAASGYSFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEP SYAAPFKGRFAFSLETSASTAYLQISSLKTEDTATYFCARGAYYRYDLGMDYWGQGTSV TVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAP ELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNA TKP REEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTL PPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLT VDKSRWQQGNVFSCSV HEALHNHYTQKSLSLSPGK [SEQ ID NO: 7]; Región variable huCD20-7HCv1 .1 ELQLVQSGGELKKPGETVRISCAASGYSFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEP SYAAPFKGRFAFSLETSASTAYLQISSLKTEDTATYFCARGAYYRYDLGMDYWGQGTSV TVSS [SEQ ID NO:36] Secuencias de ADN de la región variable murinas muCD20-7LC gatattgtgctgacccagtctccagcttctttggctgtgtctctagggcagagggccaccatatcctgcagagccagtggaagtg ttgatagttttggcaatagttttatgcactggtaccagcagaaaccaggacagcctcccaaactcctcatctatcgtgcatccaac ctagaatctggggtccctgccaggttcagtggcggtgggtctaggacagacttcaccctcaccattaatcctgtggaagctgat gatattgcaacctatttctgtcagcaaagttatgaggatccgttcacgttcggtgctgggaccaagctggagctgatgcgg [SEQ ID N0.8]; muCD20-7HC cagctccagttggtgcagtctggacctgagctgaagaagcctggagagacagtcaagatctcctgcaaggcttctgggtatag tttcacaaactatggaatgaactgggtgaagcaggctccaggaaagggtttaaagtggatgggctggataaacacctacact ggagagccatcttatgctgatgacttcaagggacggtttgccttctctttggaaacctctgccagcactgcctatttgcagatcagc aacctcaaaaatgaggacacggctacatatttctgtgcaaggggggcctactataggtacgacttaggtatggactactgggg tcaaggaacctcagtcaccgtctcctca [SEQ ID NO: 9]; muCD20-6LC gatattgtgctgacccagtctccagcttctttggctgtgtctttagggcagagggccattatatcctgcagagccagtgaaagtgtt gataattttggcaatagctttatgcactggtaccagcagaagccaggacagccacccacactcctcatctatcgtgcatccaac ctagaatctgggatccctgccaggttcagtggcagtgggtctaggacagacttcaccctcaccgttaatcctgtggaggctgat gatattgcaacttattactgtcaacaaagttatgaggatccgttcacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaacgg [SEQ ID NO:10]; muCD20-6HC cagatccagttggtgcagtctggacctgagctgaagaagcctggagagacagtcaagatctcctgcaaggcttctgggtataa attcacaaacgttggaatgaactgggtgaagcaggttccaggaaagggtttaaagtggatgggctggataaacacctacact ggagagccagcatatgctgatgacttcaagggacggtttgtcttttctttggaaacctctgccagcgctgcctttttgcagatcaac aacctcaaaaatgaggacacggctacatatttctgtgcaaggggggcctactataggtatgacttaggtatggactactggggt caaggaacctcagtcaccgtctcctca [SEQ ID NO: 1 1 ]; Secuencias de ADN de la región variable quiméricas y humanizadas huCD20-7LCv1.0 gaattcgccaccatgggctggagctgtattattctgttcctggtagcaaccgctacaggtgtacactccgatattgttcttacccaa agcccagcctccctcgctgtcagtccaggccagcgagccactatctcctgccgtgcaagtggatctgtcgacagctttggaaat agcttcatgcactggtaccagcagaagcctggtcagcccccaaaactcctgatttatcgggcttccaatctggagtcaggagtg cccgcaaggttctctggcgggggcagccggacagatttcacattgactataaatcccgtggaggctaacgatatcgcaacat acttctgtcagcagtcttatgaggaccccttcacattcggccagggcacaaagctggagctcaaacgtacg [SEQ ID NO: 12]; huCD20-7HCv1.0 aagcttgccaccatgggatggagttgcatcatcctgttcctcgtcgcaaccgcaacaggggtgcattccgaactgcagctggtc cagtctggtggtgagttgaagaaaccaggggaaacagttcgcattagctgtgctgcaagcggctatacattcacaaattatgg aatgaattgggtgaaacaggcccccggcaagggcctgaagtggatgggctggataaatacctatactggagagcctagtta cgccgctcccttcaaggggcggtttgccttctctcttgagacaagtgccagcaccgcctatttgcagatttctagtttgaaaaccg aagacacagctacatacttctgcgcccgcggcgcatattacagatatgatctggggatggactattggggccagggtacctcc gtgaccgtatcatccgcctccacaaagggccc [SEQ ID NO: 13]; huCD20-7HCv1.1 aagcttgccaccatgggttggtcttgcatcattctgtttctggtagcaactgcaactggagtgcacagcgagctgcaactcgtcca gagcggaggtgagcttaagaagccaggagagaccgtgcgaatctcttgcgccgcatccggctactctttcacaaattacgga atgaattgggtcaagcaggcaccaggtaagggactcaaatggatgggctggatcaatacctacaccggcgagcctagttat gccgcacccttcaagggtcgatttgcattcagcctggagaccagtgcttctacagcttatttgcagatcagctctctgaagaccg aggacacagctacatacttctgcgcccgtggtgcctactaccgatacgatctgggcatggactattggggccaaggcacctca gtgactgtgtcttcagcatcaaccaagggccc [SEQ ID NO: 14]; chCD20-7LC gaattcgccaccatggggtggtcatgtatcatcctcttccttgtggcaaccgcaacaggcgtacactccgacattgtactgaccc agtcacctgcctccctcgccgtatcccttgggcagagagccactattagttgcagggctagtggcagtgtcgattctttcggcaat tcatttatgcactggtatcagcagaaaccagggcagccacccaagttgctcatataccgcgcctcaaaccttgagtccggggt cccagcccggttttccggaggcgggtcccgcaccgacttcaccctgacaatcaacccagtagaagcagatgatatcgctactt atttctgtcagcagagctatgaagacccttttacatttggggccggaaccaagttggagctcaagcgtacg [SEQ ID NO: 15]; chCD20-7HC aagcttgccaccatgggatggagctgcatcattttgtttcttgtcgctaccgcaactggcgtccactcacagctgcagctggtgca gagtgggcctgagcttaagaaacccggtgagactgtgaagatctcatgtaaggctagcggctattcctttacaaattatggcat gaattgggtgaagcaggcccctgggaagggtctcaagtggatgggatggattaacacctatactggagagccttcatacgcc gatgatttcaaagggaggttcgccttctccttggaaacctctgcttctactgcctaccttcagatttctaacctcaagaacgaggac actgcaacctatttttgcgctcgtggcgcatactatcgatatgatctgggcatggattattggggtcaaggcacatccgtaaccgt gtcctcagctagcactaagggccc [SEQ ID NO: 16]; CDR's con la superficie acondicionada de CD20-7 murino y humano Cadena liviana CD20-7_LC_CDR1 RASGSVDSFGNSF H [SEQ ID NO: 17]; CD20-7_LC_CDR2 RASNLES [SEQ ID NO: 18]; CD20-7_LC_CDR3 QQSYEDPFT [SEQ ID NO: 19]; Cadena Pesada CD20-7_HC_CDR1 NYGMN [SEQ ID NO: 20]; CD20-7_HC_CDR2 WINTYTGEPS [SEQ ID NO: 21 ]; CD20-7_HC_CDR3 GAYYRYDLGMDY [SEQ ID NO: 22]; CD20-7 HC CDR2 murino y humanizado definido por Kabat Murino muCD20-7_HC_KabCDR2 WINTYTGEPSYADDFKG [SEQ ID NO: 23]; Humanizado huCD20-7_HC_KabCDR2 WINTYTGEPSYAAPFKG [SEQ ID NO: 24]; Secuencias CDR CD20-6 murinas Cadena Liviana CD20-6_LC_CDR1 RASESVDNFGNSFMH [SEQ ID NO: 25]; CD20-6_LC_CDR2 RASNLES [SEQ ID NO: 26]; CD20-6_LC_CDR3 QQSYEDPFT [SEQ ID NO: 27]; Cadena Pesada CD20-6_HC_CDR1 NVGMN [SEQ ID NO: 28]; CD20-6_HC_CDR2 WINTYTGEPA [SEQ ID NO: 29]; CD20-6„HC CDR3 GAYYRYDLGMDY [SEQ ID NO: 30]; and HC CDR2 definido por Kabat CD20-6_HC_KabCDR2 WINTYTGEPAYADDFKG [SEQ ID NO: 31 ].
El experto en la técnica sabrá comprender que las secuencias de la presente solicitud se incorporan como ejemplos no-limitantes.
Equivalentes Funcionales, Variantes y Derivados de los Anticuerpos Los equivalentes funcionales incluyen, además, a los fragmentos de anticuerpos que tienen las mismas, o comparables, características de unión que las de los anticuerpos intactos o las del conjunto de ellos. Dichos fragmentos pueden contener uno o ambos fragmentos Fab o el fragmento F (ab ')2. Preferiblemente, los fragmentos de anticuerpos contienen todas las seis regiones determinantes de complementariedad del anticuerpo completo, aunque los fragmentos que contienen menos regiones, tal como una, dos, tres, cuatro o cinco CDRs, también son funcionales. Además, los equivalentes funcionales pueden ser, o se pueden combinar, con los miembros de cualquiera de las siguientes clases de inmunoglobulinas: IgG, IgM, IgA, IgD o IgE, y las subclases de las mismas.
En algunos aspectos de la invención, los anticuerpos anti-CD20 pueden ser modificados para producir proteínas de fusión, es decir, el anticuerpo o un fragmento del mismos se puede fusionar a una proteína heteróloga, a un polipéptido o a un péptido. En ciertos aspectos, la proteína que se fusiona a la porción de un anticuerpo anti-CD20 es un componente enzimático de ADEPT. Ejemplos de otras proteínas o polipéptidos que pueden ser diseñados por ingeniería como una proteína de fusión con un anticuerpo anti-CD20 incluyen, pero no están limitadas por, las toxinas, tales como la ricina, la abrina, la ribonucleasa, la DNasa I, la enterotoxina estafilocócica-A, la proteína de la hierba carmín anti-viral, la gelonina, la toxina difterina, las exotoxinas de Pseudomonas y. las endotoxinas de Pseudomonas. Véase, por ejemplo, Pastan y col., Cell, 47:641 (1986); y Goldenberg y col., Cáncer Journal for Clinicians, 44:43 (1994). Las toxinas enzimáticamente activas y los fragmentos de las mismas que se pueden utilizar, incluyen a la cadena A de la difteria, los fragmentos de no unión activos de la toxina de la difteria, una cadena A de la exotoxina (de la pseudomona aeruginosá), una cadena A de la ricina, una cadena de abrina, una cadena A de la modeccina, la alfa-sarcina, las proteínas Aleurites fordii, las proteínas diantinas, las proteínas de la Fytolaca americana (PAPI, PAPII, y PAP-S), el inhibidor de la Momordica charantia, curcina, crotina, el inhibidor de la sapaonaria officinalis, gelonina, mitogellina, restrtctocina, fenomicina, enomicina y tricotecenos. Ejemplos no limitantes se incluyen, por ejemplo, en la WO 93/21232, publicada el 28 de octubre 1993 incorporada por completo, como referencia, en el presente documento.
Proteínas de fusión adicionales que pueden ser generadas mediante técnicas de transposición/barajado de genes, transposición/barajado de motivos, transposición/barajado de exones y/o transposición/barajado de codones (referidos colectivamente como "transposición/barajado de ADN"). La transposición/barajado de ADN se puede emplear para alterar las actividades de los anticuerpos o de los fragmentos de los mismos (por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento del mismo, con afinidades mayores y con tasas de disociación menores). Véase, en general, patentes US No. 5.605.793, 5.81 1.238, 5.830.721 , 5.834.252 y 5.837.458, y Patten y col., 1997, Curr. Biotechnol Opinión, 8:724-33;. Harayama, 1998, Trends Biotechnol, 16 (2): 76-82; Hansson y col., 1999, J. Mol.. Biol., 287:265-76; y Lorenzo y Blasco, 1998, Biotechniques, 24 (2): 308-313, cada una de las cuales se incorporan a la presente, como referencia, en su totalidad. El anticuerpo, además, puede ser una proteína de fusión de inmunoglobulina de unión de dominio, tal como se describe en la Publicación de los Estados Unidos de Norte América 200301 18592, en la Publicación de los Estados Unidos de Norte América 200330133939, y en la publicación del PCT WO 02/056910, todas para Ledbetter y col., las cuales se incorporan a la presente, como referencia, en su totalidad.
Anticuerpos de dominio. Los anticuerpos anti-CD20 de las composiciones y de los métodos de la invención, pueden ser anticuerpos de dominio, por ejemplo, anticuerpos que contienen unidades de unión de los anticuerpos funcionales pequeñas, que corresponden a las regiones variables de la cadena pesada (VH) o de la cadena liviana (VL) de los anticuerpos humanos. Entre los ejemplos de anticuerpos de dominio se incluyen, pero no están limitados por, los disponibles de Domantis Limited (Cambridge, Reino Unido) y Domantis Inc. (Cambridge, Massachusetts, Estados Unidos de Norte América), que son específicos para los objetivos terapéuticos (véase, por ejemplo, WO04/058821 , WO04/003019; las patentes US No.: 6.291.158; 6.582.915, 6.696.245 y 6.593.081 ). Bibliotecas de anticuerpos de dominio comercialmente disponibles, pueden ser usadas para identificar los anticuerpos de dominio anti-CD20. En ciertos aspectos, los anticuerpos anti-CD20 de la invención comprenden una unidad de unión funcional CD20 y una unidad de unión funcional de un receptor Fe gamma.
Diacuerpos. El término "diacuerpos" hace referencia a fragmentos pequeños de anticuerpos con dos sitios dé unión al antígeno, que incluyen fragmentos que comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena liviana (VL) :en la misma cadena polipeptídica (VH-VL). Mediante el uso de un enlazador que sea demasiado corto como para permitir el enlace entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios se ven forzados a formar pares con los dominios complementarios de la otra cadena y a crear dos sitios de unión al antígeno. Los diacuerpos se describen más detalladamente en, por ejemplo, EP 404.097, WO 93/1 1 161 y en Hollinger y col., Proc. Nati. Acad. Sci., USA No.: 90:6444-6448 (1993).
Vaccibodies (vacunas de moléculas recombinantes). En determinados aspectos de la invención, los anticuerpos anti-CD20 son vaccibodies. Los Vaccibodies son polipéptidos diméricos. Cada monómero de un vaccibody consiste en una scFv con especificidad para una molécula de superficie en un APC conectado a través de una región bisagra y a un dominio Cg3 a un segundo scFv. En otros aspectos de la invención, los vaccibodies que contienen como uno de los scFv a un fragmento de anticuerpo anti-CD20, pueden ser usados para yuxtaponer las células B a ser destruidas y a una célula efectora que media a ADCC. Por ejemplo, ver, Bogen y col., publicación la solicitud de patente US No.: 20040253238.
Anticuerpos lineales. En determinados aspectos de la invención, los anticuerpos anti-CD20 son anticuerpos lineales. Los anticuerpos lineales comprenden un par de segmentos en tándem Fd (VH-CH1 -VH-CH1 ) los cuales forman un par de regiones de unión al antígeno. Los anticuerpos lineales pueden ser biespecíficos o monoespecíficos. Ejemplos no limitantes de anticuerpos lineales se describen en, por ejemplo, Zapata y col., Protein Eng., 8(10): 1057-1062 (1995).
Anticuerpo Parental. En determinados aspectos de la invención, el anticuerpo anti-CD20 es un anticuerpo parental. Un "anticuerpo parental" es un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos que carece, o que es deficiente, de uno o más residuos de aminoácidos en, o adyacente a, una o más de sus regiones hipervariables respecto de las de un anticuerpo alterado/mutante, de acuerdo a lo que se revela en el presente documento. Por lo tanto, el anticuerpo parental tiene una región hipervariable más corta que la región hipervariable correspondiente de un anticuerpo mutante, de acuerdo a como se revela en el presente documento. El polipéptido parental puede comprender una secuencia nativa (es decir, una de origen natural) un anticuerpo (incluyendo las variante alélicas que ocurre en forma natural) o un anticuerpo con modificaciones pre-existentes en la secuencia de aminoácidos (tales como otras inserciones, supresiones y/o sustituciones) de una secuencia que ocurre de forma natural. Preferiblemente, el anticuerpo parenteral es un anticuerpo humanizado o un anticuerpo humano.
Fragmentos de anticuerpos. Los "fragmentos de anticuerpos" comprenden una porción de la longitud total de un anticuerpo, por lo general, una región de unión al antígeno o una región variable del mismo. Ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen, entre otros, a Fab, Fab', F (ab')2, y los fragmentos Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpos de cadena simple y anticuerpos multiespecíficos formado a partir de fragmentos de anticuerpos.
Tradicionalmente, los fragmentos se obtenían mediante la digestión proteolítica de los anticuerpos intactos (véase, por ejemplo, Morimoto y col., Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 24: 107-1 17 (1992) y Brennan y col., Science, 229:81 (1985)). Sin embargo, los fragmentos ahora pueden ser directamente producidos mediante células huésped recombinantes. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpos pueden ser aislados de las bibliotecas de fagos de anticuerpos, tal como se explica en el presente documento. De manera alternativa, los fragmentos Fab'-SH pueden ser recuperados directamente de la E. coli y ser acoplados químicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Cárter y col., Bio Technology, 10:163-167 (1992)). Según otro enfoque, los fragmentos F(ab')2 se pueden aislar directamente del cultivo células huésped recombinantes. Teniendo en cuenta las enseñanzas descritas en el presente documento, otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos resultarán evidentes para el experto en la técnica. En otros aspectos, el anticuerpo de elección es un fragmento Fv (scFv) de cadena única. Véase, por ejemplo, WO 93/16185. En ciertos aspectos, el anticuerpo no es un fragmento Fab.
Anticuerpos biespecíficos. Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos que tienen especificidades de unión para, por lo menos, dos epítopes diferentes. A modo de ejemplo, los anticuerpos biespecíficos pueden unirse a dos epítopes diferentes de CD20. Otros de dichos anticuerpos pueden unirse a CD20 y además unirse a un segundo antígeno. De manera alternativa, un brazo de unión a CD20 se puede combinar con un brazo que se une a una molécula de activación en un leucocito, tal como una molécula del receptor de las células T (por ejemplo, CD2 o CD3), o los receptores Fe para IgG (FcyR), de manera de enfocar mecanismos de defensa celulares al objetivo. Los anticuerpos biespecíficos también pueden ser utilizados para ubicar agentes citotóxicos en el objetivo. Estos anticuerpos poseen un brazo marcador de células de unión y un brazo que une al agente citotóxico (por ejemplo, saporina, anti-interferón a, alcaloides de la vinca, una cadena A de ricina, mentol-exato o haptenos de isótopos radiactivos). Los anticuerpos biespecíficos se pueden preparar como anticuerpos de longitud total o como fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, F(ab'): anticuerpos biespecíficos).
Los métodos para obtener anticuerpos biespecíficos son conocidos en el arte. Véase, por ejemplo, Millstein y col., Nature, 305:537-539 (1983); Traunecker y col., EMBO J. 10:3655-3659 (1991 ), Suresh y cola., ethods in Enzymology, 121. 210 (1986); Kostelny y col., J. Immunol, 148 (5):1547-1553 (1992); Hollinger y col., Proc. Nati. Acad.
Sci. USA, 90:6444-6448 (1993); Gruber y col., J. Immunol, 152:5368 (1994), patentes US No. 4.474.893, 4.714.681 , 4.925.648, 5.573.920; 5,601 ,81 ; 95731 168; 4.676.980 y 4.676.980, las solicitudes de patentes WO 94/04690, WO 91/00360, WO 92/200373, WO 93/17715 y WO 92/08802, la EP 03 089 y la US No. 2009/0048122.
En algunos aspectos de la invención, las composiciones y los métodos comprenden un anticuerpo murino biespecífico o un fragmento y/o los conjugados de los mismos, con especificidad para el CD20 humano y la cadena épsilon CD3 del receptor de las células T, tales como el anticuerpo biespecífico descrito por Daniel y col., Blood, 92:4750-4757 (1998). En aspectos preferidos, cuando el anticuerpo anti-CD20, los fragmentos y/o los conjugados de los mismos, de las composiciones y de los métodos de la invención, son biespecíficos, entonces el anticuerpo anti-CD20 es humano o humanizado y tiene especificidad para el CD20 humano y para un epítope en un célula T, o es capaz de unirse a un efector de células humanas tal como, por ejemplo, un monocito/macrófago y/o a una célula asesina natural, para efectuar la muerte de la célula.
Afinidad de Unión de los Anticuerpos En ciertos aspectos de la invención, los anticuerpos anti-CD20 pueden ser modificados para alterar su afinidad de unión por el CD20 y por los fragmentos antigénicos del mismo. Las propiedades de unión pueden ser determinadas mediante una variedad de métodos de ensayo in vitro conocidos en el arte, por ejemplo, ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), radioinmunoensayo (RIA)) o cinética (por ejemplo, análisis por BIACORE™). Por lo general, se entiende que resulta preferida una molécula de unión que posea un KD bajo.
En un aspecto de la presente invención, los anticuerpos o los fragmentos de anticuerpos se unen específicamente a CD20 y a los fragmentos antigénicos de los mismos, con una constante de disociación o KD o Kd (kotf/kon) menor que 10'5 M, o menor que 10'6 M, o menor que 0"7 MÍ o menor que 10'8 M, o menor que 10'9 M, o menor que 10'10 M, o menor que 10"11 M, o menor que 10"12 M, o menor que 10"13 M.
En otro aspecto, el anticuerpo o el fragmento de la invención se une a CD20 y/o a los fragmentos antigénicos del mismo con un Koff menor que 1x10'3 s' o menor que 3x10"3 s' . En otros aspectos, el anticuerpo se une a CD20 y a los fragmentos antigénicos del mismo con un Koff menor que 10"3 s"\ menor que 5x10'3 s"1 , menor que 10' s"1, menor que 5x10"4 s'\ menor que 10~5 s"1, menor que 5x10"5 s"\ menor que 10"6 s"1, menor que 5x10"6 s"\ menor que 10"7 s"1, menor que 5x10'7 s"1, menor que 10-8 s" , menor que 5x10'8 s-1 , menor que 10'9 s"1 , menor que 5x10'9 s"1 , o menor que 10'10 s'1.
En otro aspecto, el anticuerpo o el fragmento de la invención se une a CD20 y/o a los fragmentos antigénicos del mismo con un constante de tasa de asociación o tasa kon de al menos 105 M'1 s'1, al menos 5x10 5 M"1 s"1, al menos 106 M" s"1, al menos 5x106 M'1 s'\ al menos 107 M"1 s al menos 5x107 M"1 s "1, o al menos 108 M'1 s'1, o al menos 109 M 1 s"1.
El experto en la técnica entiende que los conjugados de la invención poseen las mismas propiedades que aquellas descritas en la presente. ,1 Anticuerpos pl y Tm En algunos aspectos de la invención, los anticuerpos anti-CD20 pueden ser modificados para alterar su punto isoeléctrico (pl). Los anticuerpos, como todos los polipéptidos, tienen un pl, el cual por lo general se define como el pH en el cual un polipéptido no lleva carga neta. Es conocido en el arte que la solubilidad de las proteínas es comúnmente más baja, cuando el pH de la solución es igual al punto isoeléctrico (pl) de la proteína. Tal como se utiliza en el presente documento, el valor de pl se define como el pl de la forma de la carga predominante. El pl de una proteína puede ser determinado mediante una variedad de métodos, incluyendo pero sin estar limitados por, enfoque isoeléctrico y varios algoritmos informáticos (véase, por ejemplo, Bjellqvist y col., 1993, Electrophoresis, 14:1023). Además, las temperaturas de fusión térmica (Tm (por sus siglas en Idioma Inglés)) del dominio Fab de un anticuerpo, puede ser un buen indicador de la estabilidad térmica de un anticuerpo y puede proporcionar, además, una indicación de su vida útil. Una Tm inferior indica más agregación / menos estabilidad, mientras que ' una Tm superior indica menos agregación/más estabilidad. Así, en determinados aspectos, se prefieren los anticuerpos que tienen mayor Tm. La Tm de un dominio de la proteína (por ejemplo, un dominio Fab) puede medirse mediante cualquier método estándar conocido en el arte, por ejemplo, mediante calorimetría diferencial de barrido (véase, por ejemplo, Vermeer y otros, 2000, Biophys. J. 78:394 -404, Vermeer y colaboradores, 2000, Biophys. J. 79: 2150-2154).
Por consiguiente, un aspecto adicional no exclusivo de la invención incluye anticuerpos modificados que tienen ciertas características bioquímicas preferidas, tales como un punto isoeléctrico (pl) particular o un temperatura de fusión (Tm) particular.
Más específicamente, en un aspecto, los anticuerpos modificados de la presente invención presentan un pl en el rango de entre 5.5 a 9.5. En todavía otro aspecto específico, los anticuerpos modificados de la presente invención tienen un pl en el rango de entre alrededor de 5.5 a alrededor de 6.0, o alrededor de 6.0 a alrededor de 6.5, o alrededor de 6.5 a alrededor de 7.0, o alrededor de 7.0 a alrededor de 7.5, o alrededor de 7.5 a alrededor 8.0, o alrededor de 8.0 a alrededor de 8.5, o alrededor de 8.5 a alrededor de 9.0, o alrededor de 9.0 a alrededor de 9.5. En otros aspectos específicos, los anticuerpos modificados de la presente invención tienen un a pl en el rango de 5.5-6.0, o 6.0 a 6.5, o 6.5 a 7.0, o 7.0-7.5 o 7.5-8.0, o 8.0-8.5, o 8.5-9.0, o 9.0-9.5. Aún de manera más específica, los anticuerpos modificados de la presente invención tienen un pl de al menos 5.5, o al menos 6.0, o al menos 6.3, o al menos 6.5, o al menos 6.7, o al menos 6.9, o al menos 7.1 , o al menos 7.3, o al menos 7.5, o al menos 7.7, o al menos 7.9, o al menos 8.1 , o al menos 8.3, o al menos 8.5, o al menos 8.7, o al menos 8.9, o al menos 9.1 , o al menos 9.3, o al menos 9.5. En otros aspectos específicos, los anticuerpos modificados de la presente invención tienen un pl de la menos alrededor de 5.5, o al menos alrededor de 6.0, o al menos alrededor de 6.3, o al menos alrededor de 6.5, o al menos alrededor de 6.7, o al menos alrededor de 6.9, o al menos alrededor de 7.1 , o al menos alrededor de 7.3, o al menos alrededor de 7.5, o al menos alrededor de 7.7, o al menos alrededor de 7.9, o al menos alrededor de 8.1 , o al menos alrededor de 8.3, o al menos alrededor de 8J.5, o al menos alrededor de 8.7, o al menos alrededor de 8.9, o al menos alrededor de 9.1 , o al menos alrededor de 9.3 o al menos alrededor de 9.5.
I Es posible optimizar la solubilidad mediante la alteración del número y la ubicación de los residuos ionizábles en el anticuerpo, para ajustar el pl. Por ejemplo, el pl de un polipéptido se puede manipular haciendo las sustituciones de aminoácidos adecuadas (por ejemplo, mediante la sustitución de un aminoácido cargado, tal como la lisina por un residuo sin carga como la alanina). Sin querer quedar atado a ninguna teoría en particular, las sustituciones dé aminoácidos de un anticuerpo que producen cambios del pl de dicho anticuerpo podrían mejorar la solubilidad y/o la estabilidad del anticuerpo. Los expertos en la materia podrán entender cuáles serían las sustituciones de aminoácidos más apropiadas de un anticuerpo particular, para lograr el pl deseado. En un aspecto, una sustitución se genera en un anticuerpo de la invención para alterar el pl. Se contempla en forma expresa, que la o las sustitución(es) de la región Fe que resultan de alterar la unión a FcyR (descrita más arriba) también pueden resultar en un cambio en el pl. En otro aspecto, la o las sustitución(es) de la región Fe se eligen específicamente para efectuar tanto la alteración deseada en la unión de FcyR como también algún cambio deseado en el pl.
En un aspecto, los anticuerpos modificados de la presente invención tienen un Tm en el rango de desde 65°C hasta 120°C. En aspectos específicos, los anticuerpos modificados de la presente invención tienen un Tm en el rango de entre 75°C hasta alrededor de 120°C, o alrededor de 75°C hasta alrededor de 85°C, o alrededor de 85°C hasta alrededor de 95°C, o alrededor de 95°C hasta alrededor de 105°C, o alrededor de 105°C hasta alrededor de 1 15°C, o alrededor de 1 15°C hasta alrededor de 120°C. En otros aspectos específicos, los anticuerpos modificados de la presente invención tiene un Tm en el rango de desde 75°C ¡hasta 120°C, o 75°C hasta 85°C, o 85°C hasta 95°C, o 95°C hasta 105°C, o 105°C hasta 1 15°C, o 1 15°C hasta 120°C. En todavía otros aspectos específicos, los anticuerpos modificados de la presente invención tienen un Tm de al menos alrededor de 65°C, o al menos alrededor de 70°C, o al menos alrededor de 75°C, o al menos alrededor de 80°C, o al menos alrededor de 85°C, o al menos alrededor de 90°C, o al menos alrededor de 95°C, o al menos alrededor de 100°C, o al menos alrededor de 105°C, o al menos alrededor de 1 10°C, o al menos alrededor de 1 15°C, o al menos alrededor de 120°C. En todavía otros aspectos específicos, los anticuerpos modificados de la presente invención tienen un Tm de al menos 65°C, o al menos 70°C, o al menos 75°C, o al menos 80°C, o al menos 85°C, o al menos 90°C, o al menos 95°C, o al menos 100°C, o al menos 105°C, o al menos 1 10°C, o al menos 1 15°C o al menos 120°C.
Función Efectora de Ingeniería Puede ser deseable modificar el anticuerpo anti-CD20 de la invención con respecto a la función efectora, de manera de aumentar la eficacia del mismo en el tratamiento de, por ejemplo, una enfermedad asociada con las células B, un cáncer, un GVHD o un rechazo. Por ejemplo, uno o mas residuos de cisteína pueden ser introducidos en la región Fe, permitiendo la formación de enlaces disulfuro entre cadenas en esta región. El anticuerpo homodimérico así generado puede tener un capacidad de internalización mejorada y/o una muerte celular mediada por complemento aumentada y/o una citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo aumentada (ADCC). Véase, Carón y col., J. ed Exp., 176:1 191 -1 195 (1992) y Shopes, B. J. Immunol., 148: 2918-2922 (1992). Anticuerpos homodiméñeos con actividad incrementada también se pueden preparar con reticulantes hetero-bifuncionales tal como se describe en Wolff y col., Cáncer Research, 53:2560-2565 (1993). De manera alternativa, un anticuerpo puede ser diseñado por ingeniería como para que tenga regiones Fe duales y que pueda, por lo tanto, tener la lisis del complemento y las capacidades de DAC, incrementadas. Véase, Stevenson y col., Anti-Cancer Droga Design, 3:219-230 (1989).
Otros métodos de ingeniería de las regiones Fe de los anticuerpos con el fin de alterar las funciones efectoras son conocidos en el arte (por ejemplo, en la publicación de la solicitud de patente US No.: 20040185045 y en la publicación de la solicitud PCT No. WO 2004/016750, ambas para Koenig y col., en las cuales se describe la alteración de la región Fe para mejorar la afinidad de unión por FCFtyllB en comparación con la afinidad de unión de Fcy RIIA, véase, también, la publicación PCT No. WO 99/58572 a Armour y col.; la WO 99/51642 a Idusogie y col.; y la patente US No.: 6.395.272 a Deo y col., las revelaciones de las cuales se incorporan al presente documento en sus totalidades); Los métodos de modificación de la región Fe para disminuir la afinidad de unión al FcyRIIB también son conocidos en el arte (por ejemplo, en la publicación de la solicitud de patente US No.: 20010036459 y en la publicación de la solicitud PCT No. WO 01/79299, para Ravetch y col., las revelaciones de las cuales se incorporan al presente documento en sus totalidades). Los anticuerpos modificados que tienen regiones Fe variantes con una afinidad de unión mejorada para FcyRIIIA y/o FcyRIIA, en comparación con una región Fe de tipo salvaje, son conocidos (por ejemplo, ver la publicación PCT No. WO 2004/063351 , a Stavenhagen y col.; la divulgación de las cuales se incorpora en el presente documento en su totalidad).
Se pueden utilizar ensayos in vitro conocidos en la técnica, para determinar si los anticuerpos anti-CD20, las composiciones, los conjugados y los métodos de la invención, por ejemplo, son capaces de mediar ADCC, tal como se describe en el presente documento.
Regiones Fe Variantes. La presente invención proporciona una formulación de proteínas que comprende una región Fe variante. Esto es, una región Fe que ocurre no-naturalmente, por ejemplo, una región Fe que comprende uno o más residuos de aminoácidos que no se encuentran en la naturaleza. También se encuentra abarcada por las regiones variantes Fe de la presente invención, las regiones Fe que comprenden supresiones, adiciones y/o modificaciones de aminoácidos.
Se entenderá que la región Fe, tal como se utiliza en el presente documento, incluye los polipéptidos que comprenden la región constante de un anticuerpo, excluyendo el dominio de la primera región constante de la inmunoglobulina. Por lo tanto, Fe se refiere a los dos últimos dominios de las regiones constantes de la inmunoglobulina IgA, IgD e IgG, y los últimos tres dominios de la región constante de la inmunoglobulina IgE e IgM y la bisagra flexible N-terminal para aquellos dominios. Para las IgA e IgM, el Fe puede incluir la cadena J. Para IgG, Fe comprende los dominios de inmunoglobulina C 2 y Cy3 (C 2 y Cy3) y la bisagra entre Cy1 (Cy1 ) y Cy2 (Cy2). Aunque los límites de la región Fe pueden variar, la región Fe de la cadena pesada de la IgG humana se define, por lo general, como para que comprenda los residuos C226 o P230 en su terminal carboxilo, en donde la numeración está de acuerdo con el índice de la UE, como en Kabat y col., NIH Publication 91 -3242, National Technical Information Service, Springfield, Va.). El "índice de ía UE como en Kabat" se refiere a la numeración de los residuos del anticuerpo UE IgGí humano tal como se describe en Kabat y col., supra. Fe puede hacer referencia a esta región en forma aislada, a la región en el contexto de un anticuerpo, a un fragmento de un anticuerpo o a una proteína de fusión Fe. Una proteína variante Fe puede ser un anticuerpo, una fusión de Fe, o cualquier proteína o dominio de una proteína que comprenda una región Fe. Particularmente preferidas son las proteínas que comprenden regiones Fe variantes, que son variantes de un Fe que no se encuentra en la naturaleza. Polimorfismos en un número de posiciones Fe han sido observados, incluyendo pero sin estar limitados por, Kabat 270, 272, 312, 315, 356 y 358, y por lo tanto, pequeñas diferencias entre la secuencia presentada y las secuencias del arte previo pueden existir y deberían ser conocidas, para un experto en la materia sobre la base de las enseñanzas de la presente.
La presente invención abarca proteínas variantes Fe que poseen propiedades de unión para un ligando Fe alteradas (por ejemplo, un receptor Fe, C1 q), en relación con una molécula comparable (por ejemplo, una proteína que tiene la misma secuencia de aminoácidos, excepto que tiene una región Fe de tipo salvaje). Ejemplos de propiedades de unión incluyen, pero no se limitan a, especificidad de unión, la constante de disociación de equilibrio (KD), las tasas de asociación y de disociación (Koff y Kon) y la afinidad de unión y/o avidez. En general, se entiende que es preferible una molécula de unión (por ejemplo, una proteína variante Fe, tal como un anticuerpo) con una KD baja, a una molécula de unión con una KD alta. Sin embargo, en algunos casos, el valor de la K0ff y Kon puede ser más relevante que el valor de la KD. Los expertos en la materia pueden determinar los parámetros cinéticos que son más importantes en los anticuerpos para una aplicación determinada.
Las afinidades y las propiedades de unión de un dominio Fe para su ligando, pueden ser determinadas mediante una variedad de métodos de ensayo in vitro conocidos en el arte (ensayos basados en parámetros bioquímicos o inmunológicos), para determinar las interacciones Fc-FcyR, es decir, la unión específica de una región Fe a una región FcyR, incluyendo pero no limitado a, métodos de equilibrio (por ejemplo, el ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), el radioinmunoensayo (RIA) o cinética (por ejemplo, el análisis BiacoreMR), y otros métodos indirectos, tales como los ensayos de unión indirecta, los ensayos de inhibición competitiva, la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET (por sus siglas en Idioma Inglés)), la electroforesis en gel y la cromatografía (por ejemplo, filtración en gel). Estos y otros métodos pueden utilizar una marcación en uno o más de los componentes a ser examinados y/o emplear una variedad de métodos de detección, incluyendo pero sin estar limitados por, los marcadores cromogénicos, fluorescentes, luminiscentes o isotópicos. Una descripción detallada de afinidades de unión y de la cinética se puede encontrar en, por ejemplo, Paul, W. E., ed., Fundamental Immunology, 4th Ed., Lippincott-Raven, Philadelphia (1999).
Por ejemplo, para mejorar la actividad DAC, una modificación que mejore la unión del Fe a uno o más reguladores positivos (por ejemplo, FCYRI IIA), mientras que deje sin cambios o incluso reduzca la unión del Fe al regulador negativo FcyRIIIB sería preferible. De manera alternativa, para reducir la actividad DAC, una modificación que reduzca la unión a uno o más reguladores positivos y/o mejore la unión a FcyRIIIB sería preferible. En consecuencia, la relación de afinidades de unión (por ejemplo, las constantes de equilibrio de disociación (KD)) pueden indicar si la actividad ADCC de una variante Fe ha aumentado o ha disminuido. Por ejemplo, una disminución en tasa de equilibrio FcyR 111 A FcyR 111 B de la constante de disociación (KD), se correlaciona con una mejora de la actividad ADCC, mientras que un aumento en la tasa se correlaciona con una disminución de la actividad ADCC. De manera adicional, las modificaciones que mejoren la unión a C1 q serían preferibles para mejorar la actividad de los CDC, mientras que una modificación que reduzca la unión a C1 q sería preferible para reducir o eliminar la actividad de los CDC.
En un aspecto, las variantes Fe de la invención se unen a FcyRIIIA con una mayor afinidad respecto de una molécula comparable. En otro aspecto, las variantes Fe de la invención se unen a FcyRIIA con una afinidad aumentada y se unen a FcyRIIIB con una afinidad de unión que se mantiene sin cambios respecto de una molécula comparable. En aún otro aspecto, las variantes Fe de la invención se unen a FcyRIIIA con una afinidad aumentada y se unen a FcyRIIB con una afinidad disminuida con relación a una molécula comparable. En todavía otro aspecto, las variantes Fe de la invención tienen una relación de constantes de disociación de equilibrio (KD), FcyRIIA/ FcyRIIB, que se encuentra reducida respecto a la de una molécula similar.
En un aspecto, la proteína variante Fe posee una unión mejorada a uno o más ligandos Fe en relación con una molécula comparable. En otro aspecto, la proteína variante Fe tiene una afinidad por un ligando Fe que es por lo menos dos veces, o por lo menos 3 veces, o por lo menos 5 veces, o por lo menos 7 veces, o por lo menos 10 veces, o por lo menos 20 veces, o por lo menos 30 veces, o por lo menos 40 veces, o por lo menos 50 veces, o por lo menos 60 veces, o por lo menos 70 veces, o por lo menos 80 veces, o por lo menos 90 veces, o por lo menos 100 veces, o por lo menos 200 veces, mayor que la de una molécula comparable. En un aspecto específico, la proteína variante Fe posee una unión a un receptor Fe mejorada. En otro aspecto específico, la proteína variante Fe posee una unión al receptor FcyRIIIA mejorada. En otro aspecto más específico, la proteína variante Fe posee una unión al receptor de Fe FcRn mejorada. En aún otro aspecto específico, la proteína variante Fe posee una unión al C1 q mejorada respecto de la de una molécula comparable.
En otro aspecto, una variante Fe de la invención tiene una constante de equilibrio de disociación (KD), que se reduce entre alrededor de 2 y alrededor de 10 veces, o entre alrededor de 5 y alrededor de 50 veces, o entre aproximadamente 25 y alrededor de 250 veces, o entre aproximadamente 100 veces y alrededor de 500 veces, o entre aproximadamente 250 veces y alrededor de 1000 veces, respecto de una molécula comparable. En otro aspecto, una variante Fe de la invención tiene una constante de equilibrio de disociación (KD), que se reduce entre 2 y 10 veces, o entre 5 y 50 veces, o entre 25 y 250 veces, o entre 100 y 500 veces, o entre 250 y 1000 veces en relación con una molécula comparable. En un aspecto específico, las variantes Fe tienen una constante de equilibrio de disociación (KD) para FcyRIIIA que se encuentra reducida en, al menos dos veces, o por lo menos 3 veces, o por lo menos 5 veces, o por lo menos 7 veces, o 10 veces, o por lo menos 20 veces, o por lo menos 30 veces, o por lo menos.40 veces, o por lo menos 50 veces, o por lo menos 60 veces, o por lo menos 70 veces, o por lo menos 80 veces, o por lo menos 90 veces , o por lo menos 100 veces, o por lo menos 200 veces, o por lo menos 400 veces, o por lo menos 600 veces, en relación con una molécula similar.
La vida media de las proteínas que comprenden las regiones Fe en el suero puede ser incrementada mediante el aumento de la afinidad de unión de la región Fe por el FcRn. En un aspecto, la proteína variante Fe ha mejorado su vida media en el suero con respecto a la de una molécula comparable.
La "citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpo " o "ADCC" se refiere a una forma dé citotoxicidad en las que las Ig secretadas se unen a los receptores Fe (FcRs) presentes en ciertas células citotóxicas (por ejemplo, células Natural Killer (NK), neutrófilos y macrófagos) que permite que estas células efectoras citotóxicas se unan de manera específica a una célula objetivo que tiene un antígeno y, posteriormente, maten con citotoxinas a la célula objetivo. Los anticuerpos IgG de alta afinidad, por ejemplo, dirigidos a la superficie de las células objetivo "arman" las células citotóxicas y permiten semejante matanza. La lisis de la célula objetivo es extracelular, requiere el contacto directo de célula a célula y no involucra al complemento. Se contempla que, además de los anticuerpos, otras proteínas que comprendan regiones Fe, específicamente proteínas de fusión Fe que tengan la capacidad de unirse específicamente a una célula objetivo que tenga un antígeno, tendrán la capacidad de efectuar la citotoxicidad mediada por células. Para simplificar, a la citotoxicidad mediada por células, resultante de la actividad de una proteína de fusión Fe, también se la refiere en el presente documento como actividad ADCC.
La capacidad de una proteína variante de Fe para, en particular, mediar la lisis de la célula objetivo por ADCC puede ser ensayada. Para evaluar la actividad ADCC se añade una variante de la proteína Fe de interés a las células objetivo, en combinación con las células efectoras inmunes, las cuales pueden ser activadas por los complejos antígeno-anticuerpo que resultan en la citólisis de la célula objetivo. La citólisis, por lo general, se detecta por la liberación de la marcación (por ejemplo, substratos radiactivos, colorantes fluorescentes o proteínas naturales intracelulares) de las células lisadas. Las células efectoras útiles para tales ensayos son las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y las células asesinas naturales (NK). Ejemplos específicos de ensayos in vitro ADCC se describen en Wisecarver y col., 1985, 79:277-282; Brüggemann y col., 1987, J Exp Med 166:1351 -1361 ; Wilkinson y col., 2001 , J Immunol Methods, 258:183-191 ; y Patel y col., 1995, J Immunol Methods, 184:29-38. Como alternativa, o adicionalmente, la actividad ADCC de la proteína variante Fe de interés puede ser confirmada in vivo, por ejemplo, en un modelo animal, tal como el que se describe en Clynes y col., 1998, PNAS USA, 95:652-656.
En un aspecto, una proteína variante Fe posee una mejora en la actividad ADCC con respecto a la de una molécula comparable. En un aspecto específico, una proteína variante Fe que tiene actividad ADCC es, por lo menos dos veces, o por lo menos 3 veces, o por lo menos 5 veces, o por lo menos 10 veces, o por lo menos 50 veces, o por lo menos 100 veces mayor que la de una molécula comparable. En otro aspecto específico, una proteína variante del Fe posee una unión mejorada al receptor FcyRIIIA y una actividad ADCC mejorada, respecto a las de una molécula comparable. En otros aspectos, la proteína variante Fe posee tanto una actividad ADCC mejorada, como una vida media sérica aumentada, respecto de las de una molécula comparable.
La "citotoxicidad dependiente del complemento" y "CDC" se refieren a la lisis de la célula diana en presencia del complemento. La vía de activación del complemento se inicia mediante la unión del primer componente del sistema de complementos (C1 q) a una molécula, por ejemplo a un anticuerpo, formando un complejo con un antígeno afín. Para evaluar la activación del complemento, se puede realizar un ensayo de CDC, por ejemplo, tal como se describe en Gazzano-Santoro y col., 1996, J. Immunol. Methods, 202:163. En un aspecto, una proteína variante Fe posee una actividad CDC mejorada respecto de la de una molécula comparable. En un aspecto específico, una proteína variante Fe tiene uña actividad CDC que es, por lo menos dos veces, o por lo menos 3 veces, o por lo menos 5 veces, o por lo menos 10 veces, o por lo menos 50 veces, o por lo menos 100 veces mayor que la de una molécula comparable. En otros aspectos, la proteína variante Fe tiene tanto una actividad CDC aumentada como una vida media sérica aumentada, respecto de las de una molécula comparable.
En un aspecto, la presente invención provee formulaciones, en donde la región Fe comprende residuos de aminoácidos que no se encuentran en la naturaleza, en una o más posiciones, seleccionadas del grupo que consiste en 234, 235, 236, 239, 240, 241 , 243, 244, 245, 247, 252, 254, 256, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 269, 296, 297, 298, 299, 313, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 332, 333 y 334 numeradas mediante el índice EU tal como se describe en Kabat. De manera opcional, la región Fe puede comprender un residuo aminoácido que no se encuentra en la naturaleza en posiciones adicionales o alternativas conocidas para el experto en la técnica (ver por ejemplo, Patentes U.S. Nos. 5,624,821 ; 6,277,375; 6,737,056; Publicaciones de solicitudes de Patentes PCT WO 01/58957; WO 02/06919; WO , 04/016750; WO 04/029207; WO 04/035752 y WO 05/040217) o como se revela en el presente documento.
En un aspecto específico, la presente invención provee una formulación de una proteína variante Fe, en donde la región Fe comprende por lo menos un residuo aminoácido que no se encuentra en la naturaleza, seleccionado del grupo que consiste en 234D, 234E, 234N, 234Q, 234T, 234H, 234Y, 234I, 234V, 234F, 235A, 235D, 235R, 235W, 235P, 235S, 235N, 235Q, 235T, 235H, 235Y, 235I, 235V, 235F, 236E, 239D, 239E, 239N, 239Q, 239F, 239T, 239H, 239Y, 240I, 240A, 240T, 240M, 241W, 241 L, 241 Y, 241 E, 241 R. 243W, 243L 243Y, 243R, 243Q, 244H, 245A, 247V, 247G, 252Y, 254T, 256E, 262I, 262A, 262T, 262E, 263I, 263A, 263T, 263 , 264L, 264I, 264W, 264T, 264R, 264F, 264M, 264Y, 264E, 265G, 265N, 265Q, 265Y, 265F, 265V, 265I, 265L, 265H, 265T, 266I, 266A, 266T, 266M, 267Q, 267L, 269H, 269Y, 269F, 269R, 296E, 296Q, 296D, 296N, 296S, 296T, 296L, 296I, 296H, 269G, 297S, 297D, 297E, 298H, 298I, 298T, 298F, 299I, 299L, 299A, 299S, 299V, 299H, 299F, 299E, 313F, 325Q, 325L, 325I, 325D, 325E, 325A, 325T, 325V, 325H, 327G, 327W, 327N, 327L, 328S, 328 , 328D, 328E, 328N, 328Q, 328F, 328I, 328V, 328T, 328H, 328A, 329F, 329H, 329Q, 330K, 330G, 330T, 330C, 330L, 330Y, 330V, 330I, 330F, 330R, 330H, 332D, 332S, 332W, 332F, 332É, 332N, 332Q, 332T, 332H, 332Y y 332A numerados tal como en el índice EU como se describe en Kabat. De manera opcional, la región Fe puede comprender aminoácidos adicionales y/o alternativos, que no se encuentran en la naturaleza, conocidos por el experto en la técnica (ver, por ejemplo Patentes U.S. Nos. 5,624,821 ; 6,277,375; 6,737,056; Solicitudes de Patentes PCT WO 01/58957; WO 02/06919; WO 04/016750; WO 04/029207; WO 04/035752 y WO 05/040217).
En otro aspecto, la presente invención proporciona una formulación de la proteína variante Fe, en donde la región Fe comprende, por lo menos, un aminoácido que no se encuentra en la naturaleza, en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste ene 239, 330 y 332, según la numeración usada por el índice EU según lo dispuesto en Kabat. En un aspecto específico, la presente invención proporciona una formulación de la proteína variante Fe, en donde la región Fe comprende, por lo menos, un aminoácido que no se encuentra en la naturaleza, seleccionado del grupo que consiste en 239d, 330L y 332E, numeradas por el índice EU según lo dispuesto en Kabat. Opcionalmente, la región Fe puede comprender además un aminoácido adicional que no se encuentre en la naturaleza en una o mas posiciones seleccionadas del grupo que consiste en 252, 254 y 256, numeradas según la numeración dada por el índice EU, según lo dispuesto en Kabat. En un aspecto específico, la presente invención proporciona una formulación de la proteína variante de Fe, en donde la región Fe comprende, al menos, un aminoácido que no se encuentra en la naturaleza seleccionado del grupo que consiste en 239D, 330L y 332E, numerados según la numeración dada por el índice EU según lo dispuesto en Kabat, y al menos un aminoácido no se encuentra en la naturaleza en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en 252Y, 254T y 256E, numerados según la numeración dada por el índice EU según lo dispuesto en Kabat. [280] En un aspecto, las variantes Fe de la presente invención pueden combinarse con otras variantes Fe conocidas, tales como las que describe Ghetie y col., 1997, Nat. Biotech. 15:637-40; Duncan y col., 1988, Nature 332:563-564; Lund y col., 1991 , J. Immunol, 147:2657-2662; Lund y col., 1992, Mol. Immunol, 29:53-59; Alegre y col., 1994, Transplantation 57:1537-1543; Hutchins y col., 1995, Nati Proc. Acad Sci USA, 92:1 1980-1 1984; Jefferis y col., 1995, Immunol Lett, 44:1 1 1-1 17; Lund y col., 1995, J. Faseb, 9:1 15-1 19; Jefferis y co., 1996, Immunol Lett, 54:101 -104; Lund y col., 1996, J. Immunol, 157:4963-4969; Armour y col., 1999, Eur J Immunol 29:2613-2624; Idusogie y col., 2000, J. Immunol, 164:4178-4184; Reddy y col., 2000, J. Immunol, 164:1925-1933; Xu y col., 2000, Cell Immunol, 200:16-26; Idusogie y col., 2001 , J . Immunol, 166:2571 -2575; Shields y col., 2001 , J Biol. Chem, 276:6591 -6604; Jefferis y col., 2002, Immunol Lett, 82:57-65; Presta y col., 2002, Biochem Soc Trans, 30:487-490; en las patentes U.S. No. 5.624.821 , 5.885.573, 5.677.425, 6.165.745, 6.277.375, 5.869.046, 6.121 .022, 5.624.821 , 5.648.260, 6.528.624, 6.194.551 , 6.737.056, 6.821 .505, 6.277.375, publicación de Solicitud de Patente U.S. No.: 2004/0002587 y las publicaciones de Solicitudes de Patentes PCT WO 94/29351 , WO 99/58572 ; WO 00/42072, WO 02/060919; WO 04/029207; WO 04/099249 y WO 04/063351 , las cuales revelan variantes Fe útiles a modo de ejemplo. La presente invención también abarca las regiones Fe que comprenden supresiones, adiciones y/o modificaciones. Sin embargo, otras modificaciones / sustituciones / adiciones / eliminaciones del dominio Fe resultaran evidentes para un experto en la materia.
Los métodos para la generación de regiones Fe que no se encuentran en la naturaleza se conocen en el arte. Por ejemplo, las sustituciones de aminoácidos y/o las eliminaciones pueden ser generadas mediante métodos de mutagénesis, incluyendo pero sin estar limitados por, mutagénesis de sitio dirigido (por ejemplo, Kunkel, Proc. Nati.
Acad. Sci. USA 82:488-492 (1985)), la mutagénesis mediante PCR (por ejemplo, Higuchi, en "PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications" , Academic Press, San Diego, pp. 177-183 (1990)), y la mutagénesis del cassette (por ejemplo, Wells y col., Gene, 34:315-323 (1985)). Preferiblemente, la mutagénesis de sitio dirigido se realiza por el método PCR de superposición-extensión (por ejemplo, Higuchi, en "PCR Technology: Principies and Applications for DNA Amplification" , Stockton Press, New York, pp. 61 -70 (1989)). De manera alternativa, la técnica PCR de superposición -extensión (por ejemplo, Higuchi, suprá) puede ser utilizada para introducir cualquier mutación deseada(s) en una secuencia objetivo (el ADN de inicio). Por ejemplo, la primera ronda de PCR en el método de superposición-extensión involucra amplificar la secuencia diana con un cebador externo (primer 1 ) y un cebador de mutagénesis interno (primer 3), y por separado, con un segundo cebador exterior (primer 4) y un cebador interno (primer 2), dando como resultado dos segmentos de PCR (segmentos A y B). El cebador de mutagénesis interno (primer 3) está diseñado para contener los desajustes de la secuencia objetivo, especificando la o las mutaciones deseada(s). En la segunda ronda de PCR, los productos de la primera ronda de PCR (segmentos A y B) son amplificados mediante PCR utilizando los dos cebadores extemos (primers 1 y 4). El segmento de PCR de longitud total resultante (segmento C) se digiere con enzimas de restricción y los fragmentos de restricción resultantes se clonan en un vector apropiado. Como primer paso de la mutagénesis, el ADN de inicio (por ejemplo, la codificación de una proteína de fusión Fe, un anticuerpo o simplemente una región Fe), es operativamente clonado en un vector de mutagénesis. Los cebadores están diseñados para reflejar la sustitución del aminoácido deseado. A modo de ejemplo, otros métodos para la generación de la variante de las regiones Fe se conocen en el arte (véase, por ejemplo, las Patentes U.S. No.: 5.624.821 ;. 5.885.573, 5.677.425, 6.165.745, 6.277.375, 5.869.046, 6.121 .022, 5.624.821 , 5.648.260, 6.528.624, 6.194.551 , 6.737.056; 6.821 .505, 6.277.375, publicación de la Solicitud de Patente U.S. No.: 2004/0002587 y las publicaciones de Solicitudes de Patentes PCT WO 94/29351 , WO 99/58572, WO 00/42072, WO 02/060919; WO 04/029207; WO 04/099249; WO 04/063351 , todo el contenido de las cuales se incorporan al presente a modo de referencia).
En algunos aspectos, una proteína variante de la Fe comprende uno o más glicoformas de ingeniería, es decir, una composición de carbohidratos que está covalentemente unida a la molécula que comprende una región Fe. Las glicoformas de ingeniería pueden ser útiles para una variedad de propósitos, incluyendo pero no limitados a, aumentar o reducir la función efectora. Las glicoformas de ingeniería pueden ser generadas por los métodos descriptos en el presente documento y mediante cualquier otro método conocido por el experto en el arte de la técnica, por ejemplo, mediante el uso de cepas de expresión variantes, mediante ingeniería, utilizando condiciones de crecimiento, medios que afectan a la glicosilación, mediante la co-expresión con una o más enzimas, por ejemplo, la DI N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTI1 1 ), expresando una molécula que comprende una región Fe en diversos organismos o líneas celulares de diversos organismos, o mediante la modificación de hidratos de carbono(s) después de haber expresado la molécula que comprende la región Fe. Los métodos para generar glicoformas por ingeniería son conocidos en el arte, e incluyen, pero no están limitados por, los descritos en Umana y col., 1999, Nat. Biotechnol., 17:176-180; Davies y col., 20017 Biotechnol Bioeng., 74:288-294; Shields y col., 2002, J Biol. Chem., 277:26733-26740; Shinkawa y col., 2003, J Biol. Chem., 278:3466-3473) U.S. Pat. No. 6,602,684; solicitud de Patente U.S. No. 10/277,370; solicitud de Patente U.S. Ser. No. 10/1 13,929; solicitud de Patente PCT WO 00/61739A1 ; solicitud de Patente PCT WO 01/292246A1 ; solicitud de Patente PCT WO 02/31 1 140A1 ; solicitud de Patente PCT WO 02/30954A1 ; tecnología Potillegent (Biowa, Inc., Princeton, N.J.); tecnología de ingeniería de glicosilación Glyco Ab™ (GLYCART™ biotechnology AG, Zurich, Switzerland). Ver también, por ejemplo, WO 00061739; EA01229125; US 200301 15614; Okazaki y col., 2004, JMB, 336: 1239-49.
Polinucleótidos, Vectores, Células Huésped y Métodos Recombinantes La presente invención además proporciona polinucleótidos que comprenden una secuencia de nucleotidos que codifican un anticuerpo de la invención o fragmentos de unión al epítope del mismo.
La presente invención también abarca a los polinucleótidos que codifican un polipéptido que puede enlazar CD20 y que híbrida en condiciones de hibridación estrictas a polinucleótidos que codifican un anticuerpo de la presente invención, en donde dichas condiciones estrictas de hibridación incluyen: la pre-hibridación durante 2 horas a 60° C en 6x/SSC, SDS 0,5 %, 5 x de solución de Denhardt y 100 µg/mL del ADN de esperma de salmón desnaturalizado por calor; hibridación durante 18 horas a 60° C, lavado dos veces en 4 x SSC, SDS 0,5 %, pirofosfato de sodio 0,1 %, durante 30 min a 60° C y dos veces en 2x SSC, SDS 0,1 % durante 30 min a 60° C.
Los polinucleótidos pueden ser obtenidos y la secuencia de nucleótidos de los polinucleótidos puede ser determinada, mediante métodos que son conocidos en el arte. Por ejemplo, si la secuéncia de nucleótidos del anticuerpo es conocida, un polinucleótido que codifique al anticuerpo puede ser ensamblado mediante síntesis química de oligonucleótidos (por ejemplo, como se describe en Kutmeier y col., 1994, BioTechniques 17:242) la cual, brevemente, involucra la síntesis de oligonucleótidos superpuestos que contengan porciones de la secuencia que codifica el anticuerpo, templado y ligado de dichos oligonucleótidos y, a continuación, la amplificación de los oligonucleótidos ligados mediante PCR.
Los métodos para la construcción de vectores recombinantes que contienen secuencias que codifican anticuerpos y las señales de control de la transcripción y la traducción apropiadas son bien conocidos en el arte. Estos métodos incluyen, por ejemplo, las técnicas de ADN recombinante in vitro, las técnicas sintéticas y la recombinación genética in vivo. La invención, por lo tanto, proporciona vectores replicables que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica a una molécula del anticuerpo de la invención, a una cadena pesada o liviana del mismo, a un dominio variable de la cadena pesada o liviana del mismo o a un fragmento de unión al epítope de cualquiera de estos, operativamente vinculados a un promotor.
El vector recombinante se transfiere a una célula huésped mediante técnicas convencionales y las células transfectadas son entonces cultivadas mediante técnicas convencionales para producir un anticuerpo de acuerdo con la invención. Así, la invención incluye las células huésped que contienen un polinucleótido que codifica a un anticuerpo de la invención o a un fragmento de unión al epítope del mismo, unido operativamente a un promotor heterologo. En aspectos preferidos, los vectores que codifican tanto las cadenas pesadas y livianas pueden ser co-expresados en la célula huésped para la expresión de una molécula de inmunoglobulina completa.
Una variedad de sistemas vectores de expresión-huésped pueden ser utilizados para expresar las moléculas de anticuerpos de la invención. Dichos sistemas de expresión-huésped representan vehículos mediante los cuales las secuencias codificantes de interés pueden ser producidas y posteriormente purificadas, pero también representan células que pueden, cuando son transformadas o transfectadas con las secuencias de codificación de nucleótidos adecuadas, expresar una molécula del anticuerpo de la invención in situ. Estos incluyen, pero no están limitados por, microorganismos tales como las bacterias (por ejemplo, la E. coli y el B. subtilis) transformadas con un ADN bacteriófago recombinante, un plásmido de ADN o con vectores de expresión de ADN cósmidos, que contienen secuencias codificadoras de anticuerpos, levaduras (por ejemplo, Saccharomyces y Pichiá) transformadas con vectores de expresión de levaduras recombinantes, que contienen secuencias de codificación de anticuerpos, sistemas de células de insectos infectadas con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, baculovirus) conteniendo secuencias de codificación de anticuerpos; sistemas de células de plantas infectadas con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, el virus mosaico de la coliflor (CaMV), el virus mosaico del tabaco (TMV) o transformadas con vectores de expresión con plásmidos recombinantes (por ejemplo, el plásmido Ti) conteniendo secuencias codificadoras de anticuerpos, o los sistemas de células de mamíferos (por ejemplo, las células COS, CHO, BHK, 293 y 3T3) que albergan constructos de expresión recombinante que contienen promotores derivados del genoma de células de mamíferos (por ejemplo, el promotor de la metalotioneína) o los virus de mamíferos (por ejemplo, el promotor tardío del adenovirus, el promotor del virus vaccinia 7.5K).
De preferencia, células de bacterias tales como la Escherichia coli y, más preferiblemente, las células eucarióticas, especialmente para la expresión de la molécula de anticuerpo recombinante completa, son utilizadas para la expresión de una molécula de anticuerpo recombinante. Por ejemplo, células de mamíferos, tales como las células de ovario de hámster chino (CHO), junto con un vector tal como el elemento mayor del promotor de genes temprano-intermedio del citomegalovirus humano, es un sistema de expresión efectivo para anticuerpos (por ejemplo, tal como se describe en Foecking y col., 1986, Gene 45:101 ; Cockett y col., 1990, Bio/Technology 8:02). i Para la producción de proteínas recombinantes durante largo plazo, con un alto rendimiento, se prefiere la expresión estable. Por ejemplo, las líneas celulares que expresan de forma estable la molécula de anticuerpo pueden ser realizadas por ingeniería. En lugar de usar vectores de expresión que contengan orígenes de replicación viral, las células huésped se pueden transformar con ADN controlado mediante elementos para el control de la expresión apropiados (por ejemplo, promotores, potenciadores, terminadores de transcripción, sitios de poliadenilación, etc.) y un marcador de selección. Tras la introducción del ADN extraño, a las células de ingeniería se les puede permitir crecer durante 1 -2 días en un medio enriquecido, para luego ser cambiadas a un medio selectivo. El marcador de selección en el plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permite a las células integrar el plásmido de manera estable en sus cromosomas y crecer para formar focos que a su vez se pueden clonar y se expanden a líneas celulares. Este método puede ser ventajosamente utilizado para diseñar las líneas celulares que expresen la molécula del anticuerpo. Dichas líneas celulares de ingeniería pueden ser particularmente útiles en la detección y evaluación de compuestos que interactúen, directa o indirectamente, con la molécula del anticuerpo.
Una vez que una molécula de anticuerpo de la invención ha sido expresada por medios recombinantes, puede ser purificada mediante cualquier método conocido en la técnica para la purificación de moléculas de inmunoglobulinas, por ejemplo, mediante cromatografía (por ejemplo, de intercambio iónico, de afinidad, en particular mediante afinidad por el antígeno específico después de la Proteína A y cromatografía por columna de exclusión), centrifugación, solubilidad diferencial o mediante cualquier otra técnica estándar para la purificación de proteínas. En este sentido, la patente U.S. No.: 7.538.195 ya ha sido mencionada en la presente descripción, las enseñanzas de las cuales se incorporan a la presente, como referencia, en su totalidad.
En otro aspecto, anticuerpos y fragmentos de anticuerpos diversos, así como los anticuerpos simulados, pueden ser fácilmente producidos mediante mutación, eliminación y/o inserción dentro de las secuencias de las regiones variables y constantes que flanquean un conjunto particular de CDR. Así, por ejemplo, ciertas clases diferentes de Ab son posibles para un conjunto dado de CDRs, mediante la sustitución de las diferentes cadenas pesadas, por lo cual, por ejemplo, los tipos de anticuerpos lgG1 -4, IgM, lgA1 -2, IgD e IgE y los isotipos, pueden ser producidos. Del mismo modo, los anticuerpos artificiales en el ámbito de la invención pueden ser producidos mediante la incorporación de un conjunto dado de CDRs en un marco totalmente sintético. La expresión "variable" se utiliza en el presente documento para describir ciertas partes de los dominios variables que difieren en secuencia entre anticuerpos y que se utilizan en la unión y especificidad por el antígeno de cada anticuerpo en particular. Sin embargo, la variabilidad no suele ser uniformemente distribuida a través de los dominios variables de los anticuerpos. Normalmente, se concentra en tres segmentos llamados regiones determinantes de complementariedad (CDR) o regiones hipervariables, tanto en los dominios variables de las cadenas livianas como en los de las cadenas pesadas. Las porciones más altamente conservadas de los dominios variables se denominan el marco (FR). Cada uno de los dominios variables de las cadenas pesadas y livianas comprende por cuatro regiones de marco, en gran medida adoptando una configuración de hoja beta, conectadas mediante tres CDRs, los cuales forman lazos de conexión y, en algunos casos, forman parte de la estructura de la hoja beta. Los CDR en cada cadena se mantienen juntos en las proximidades mediante las regiones FR y con los CDRs de la otra cadena, contribuye a la formación del sitio de unión al antígeno de los anticuerpos (véase, por ejemplo, E. A. Kabat y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, fifth edition, 1991 , NIH). Los dominios constantes no se encuentran directamente involucrados en la unión de un anticuerpo a un antígeno, pero presentan diferentes funciones efectoras, tales como la participación de los anticuerpos en la toxicidad celular dependiente de anticuerpos.
Los anticuerpos humanizados o los anticuerpos adaptados para no ser rechazados por otros mamíferos, se pueden producir utilizando varias tecnologías, tales como la de acondicionamiento de superficie y la de injerto CDR. En la tecnología de acondicionamiento de superficie, el modelado molecular, el análisis estadístico y la mutagénesis se combinan para ajustar las superficies no CDR de las regiones variables para que se asemejen a las superficies de anticuerpos conocidos del huésped objetivo. Estrategias y métodos para el acondicionamiento de la superficie de anticuerpos y otros métodos para reducir la inmunogenicidad de los anticuerpos dentro de un huésped diferente, se dan a conocer, por ejemplo, en la patente U.S. No.: 5.639.641 , la cual se incorpora a la presente, en su totalidad, como referencia. En la tecnología de injerto de CDR, los CDRs de las cadenas pesadas y livianas murinas se injertan en una secuencia de marco completamente humana.
La invención también incluye equivalentes funcionales de los anticuerpos que se describen en la presente memoria descriptiva. Los equivalentes funcionales tienen características de unión que son comparables a las de los anticuerpos, e incluyen, por ejemplo, los anticuerpos quiméricos, humanizados y monocadena, así como también a los fragmentos de los mismos. Ejemplos de los métodos de producción de tales equivalentes funcionales se describen en la solicitud de patente PCT WO 93/213 9, en la Solicitud de la Patente Europea número 239400, en la Solicitud de Patente PCT WO 89/09622; en la Solicitud de Patente europea 338.745, y en la Solicitud de Patente Europea No. EP 332424, las cuales se incorporan] a la presente, en su totalidad, como referencia.
Los equivalentes funcionales incluyen a los polipéptidos con secuencias de aminoácidos que son sustancialmente las mismas que las secuencias de aminoácidos de las regiones variables o hipervariables de los anticuerpos de la invención.
"Sustancialmente las mismas" en relación a una secuencia de aminoácidos se define en el presente documento como una secuencia de, al menos, un 90 %, y preferiblemente al menos un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % y un 99 % de identidad de secuencia respecto de otra secuencia de aminoácidos, según lo determinado por el método de búsqueda de FASTA, de acuerdo con Pearson y Lipman, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85, 2444-2448 (1988).
Los anticuerpos quimerizados preferentemente tienen regiones constantes derivadas, sustancialmente o exclusivamente, a partir de las regiones constantes de anticuerpos humanos y regiones variables derivadas, sustancialmente o exclusivamente, a partir de la secuencia de la región variable de un mamífero que no sea un ser humano. Las formas humanizadas de los anticuerpos se realizan mediante la sustitución de las regiones determinantes de complementariedad de, por ejemplo, un anticuerpo de ratón, en un dominio de marco humano, por ejemplo, en la publicación PCT N 0 W092/22653. Los anticuerpos humanizados preferentemente, tienen regiones constantes y regiones variables, distintas de las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) derivadas, sustancialmente o exclusivamente, de las regiones correspondientes a los anticuerpos humanos y los CDRs derivados sustancialmente o exclusivamente a partir de un mamífero que no sea un ser humano.
Los equivalentes funcionales incluyen también fragmentos de anticuerpos de una sola cadena, también conocidos como anticuerpos de cadena única o monocadena (scFvs). Estos fragmentos contienen, al menos, un fragmento de la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada variable de un anticuerpo (VH), atada a, al menos, un fragmento de la secuencia de aminoácidos de la cadena liviana variable de un anticuerpo (VL) con o sin enlazadores de interconexión. Dicho enlazador puede ser un péptido corto, flexible, seleccionado para asegurar que el correcto plegado tridimensional de los dominios (VL) y (VH) se produzca una vez que estén vinculados, de manera de mantener la especificidad de unión a la molécula objetivo del anticuerpo completo a partir del cual deriva el fragmento de anticuerpo de cadena única. En general, el carboxilo terminal de la secuencia (VL) o (VH) puede estar covalentemente unido mediante dicho péptido enlazador al aminoácido terminal de la secuencia complementaria (VL) y (VH). Los I fragmentos de anticuerpos de una cadena única pueden ser generados mediante clonación molecular, una biblioteca de exhibición de fagos de anticuerpos o mediante técnicas similares. Estas proteínas pueden ser producidas ya sea en células eucarióticas como en células procarióticas, incluidas las bacterias.
Los fragmentos de anticuerpos de cadena única o monocadena contienen secuencias de aminoácidos que tienen, por lo menos, una de las regiones variables o determinantes de la complementariedad (CDR) de los anticuerpos intactos descritos en esta memoria descriptiva, pero carecen de algunos o de todos los dominios constantes de dichos anticuerpos. Estos dominios constantes no son necesarios para la unión al antígeno, pero constituyen una parte importante de la estructura de los anticuerpos intactos. Los fragmentos de anticuerpos de una sola cadena pueden, por lo tanto, superar algunos de los problemas asociados con el uso de anticuerpos que contienen una parte o la totalidad del dominio constante. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpos de cadena única tienden a estar libres de las interacciones no deseadas entre las moléculas biológicas y la región constante de la cadena pesada, o de otro tipo de actividad biológica no deseada. Además, los fragmentos de anticuerpos de cadena única son considerablemente más pequeños que los anticuerpos intactos o completos y, por lo tanto, pueden tener una mayor permeabilidad capilar que los anticuerpos intactos, lo cual permite que los fragmentos de lós anticuerpos de cadena única localicen y se enlacen a los sitios de unión del antígeno objetivo de manera más eficiente. Además, los fragmentos de anticuerpos se pueden producir en una escala relativamente grande en células procarióticas, facilitando así su producción. Además, el tamaño relativamente pequeño de los fragmentos de anticuerpos de cadena única, los hace menos propensos que los anticuerpos intactos, a provocar una respuesta inmune en un recipiente.
El conocimiento de las secuencias de aminoácidos y de los ácidos nucleicos para el anticuerpo anti-CD20 y sus variantes con superficie acondicionada o humanizadas, que se describen en el presente documento, pueden ser utilizados para desarrollar muchos anticuerpos que también se unen al CD20 humano. Varios estudios han examinado los efectos de la introducción de uno o más cambios de aminoácidos en varias posiciones de la secuencia de un anticuerpo, basándose en el conocimiento de la secuencia del anticuerpo primario, sobre sus propiedades, tales como la unión y el nivel de expresión (por ejemplo, Yang, W.P. y col., 1995, J. Mol Biol., 254, 392-403; Rader, C. y col., 1998, Proc Nati Acad Sci, USA, 8910-8915; Vaughan, TJ. y col., 1998, Nature Biotechnology, 16, 535 a 539).
En estos estudios, variantes del anticuerpo primario fueron generadas mediante el cambio de las secuencias de los genes de las cadenas pesadas y livianas en el CDR1 , CDR2, CDR3 o en las regiones marco, utilizando métodos tales como la mutagénesis de sitio dirigido mediada por oligonucleótidos, la mutagénesis por cásete, PCR propenso a errores, la transposición/barajado del ADN, o las cepas mutantes de la E. coli (Vaughan, TJ y col., 1998, Nature Biotechnology, 16, 535-539; Adey, NB y col., 1996, capítulo 16, pp 277-291 , en " Phage Display of Péptidos and Proteins", Eds. Kay, BK y col., Academic Press). Estos métodos para cambiar la secuencia del anticuerpo primario han resultado en mejoras de las afinidades de los anticuerpos secundarios (por ejemplo, Gram H. y col., 1992, Proc Nati Acad Sci USA, 89, 3576-3580; Boder, E . y col., 2000, Proc. Nati. Acad .Sci. USA, 97, 10.701 - 10.705; J. Davies, y Riechmann L, 1996, Immunotechnology, 2, 169-179; Thompson, J. y col., 1996, J. Mol Biol., 256, 77-88; Short M. K. y col., 2002, J. Biol Chem, 277, 16365-16370; Furukawa, K. y col., 2001 , J. Biol. Chem. 276, 27622 - 27.628).
Mediante una estrategia similar dirigida a cambiar uno o más residuos de aminoácidos del anticuerpo, las secuencias del anticuerpo descritas en esta invención pueden ser utilizadas para desarrollar anticuerpos anti-CD20 con funciones mejoradas, tales como los métodos descriptos en la publicación de la solicitud de patente 20090246195 , cuyo contenido se incorpora a la presente, como referencia, en su totalidad.
Immunoconjugados La presente invención está también dirigida a conjugados (también referidos aquí como immunoconjugados), que comprenden a los anticuerpos anti-CD20, fragmentos de anticuerpos, equivalentes funcionales, anticuerpos mejorados y sus aspectos tal como se describen aquí, enlazados o conjugados a una droga o prodroga. Drogas o prodrogas adecuadas son conocidas en el arte. Las drogas o prodrogas preferidas son agentes citotóxicos. El agente citotóxico utilizado en el conjugado citotóxico de la presente invención puede ser cualquier compuesto que de como resultado la muerte de una célula o que induzca la muerte celular, o que, de alguna manera disminuya la viabilidad celular, e incluyen, por ejemplo, a los maitansinoides y los análogos de maitansinoides, las benzodiazepinas, los taxoides, los análogos de CC-1065 y CC-1065, las duocarmicinas y los análogos de las duocarmicinas, enediinas, tales como las caliqueamicinas, la dolastatina y los análogos de dolastatina incluyendo las auristatinas, los derivados de tomaimicinas, los derivados de leptomicina, metotrexato, cisplatino, carboplatino, daunorubicina, doxorubicina, vincristina, vinblastina, melfalan, mitomicina C, clorambucilo y doxorubicina morfolino. Con mayor preferencia, los agentes citotóxicos son los maitansinoides y los análogos de los maitansinoides, las benzodiazepinas, los taxanos, CC-1065 y los análogos de CC-1065. De manera especial, se prefieren los maitansinoides y los análogos de los maitansinoides, la mayoría de los cuales se describen en las Solicitudes de Patentes U.S. Nos. 20070048314, 20060233814, 20080003652, 200601551 10, 20060128970, 20090182038, 20090042837, 20080233618, 200801 19558, 20060099235, 20050272727, 20050203174, 200501 12726, 20060182750, 20090202536, 20090142361 , 20080249085, 20080226659, 20080171865, 20080171856, 20080171040, 20080145374, 200801 14153, 20070270585, 20070269447, 20070264266, 20070009541 , 20070009540, 20070009539, 20060167245, 20060127407, 20060084141 , 20050276812, 20050169933, 20050152913, 200501 13571 , 20050003513, 20040241 174, 20040235840, 20040120949, 20040014980, 20030157694, 20020156318, 20020156274 y 20020001587, cuyo contenido se incorpora a la presente, como referencia, en su totalidad.
Estos conjugados se pueden preparar mediante la utilización de un grupo enlazante con el objeto de vincular a la droga o a la prodroga, al anticuerpo o a su equivalente funcional. Los grupos enlazantes adecuados son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, a los grupos disulfuro, los grupos tioéter, los grupos lábiles a los ácidos, los grupos fotolábiles, los grupos lábiles a la peptidasa y los grupos lábiles a la ésterasa.
La droga o a la prodroga pueden, por ejemplo, estar unidas con el anticuerpo anti-CD20, o con un fragmento del mismo, a través de un puente disulfuro. La molécula enlazante o el agente reticulante comprende un grupo químico reactivo que puede reaccionar con el anticuerpo anti-CD20 o con un fragmento del mismo. Los grupos químicos reactivos preferidos para la reacción con el agente de unión a la célula son los ésteres de /V-succinimidilo y los ésteres de /V-sulfosuccinimidilo. De manera adicional, la molécula enlazante comprende un grupo de reactivos químicos, de preferencia un grupo ditiopiridilo, que pueden reaccionar con las drogas para formar un enlace disulfuro. En particular, las moléculas enlazantes preferidas incluyen, por ejemplo, al /V-succinimidil 3-(2-piridilditio) propionato (SPDP) (véase, por ejemplo, Carlsson y col., Biochem J., 173: 723-737 (1978)), A-succinimidil-4-(2-pir¡dilditio) butanoato (SPDB) (véase, por ejemplo, la patente U.S. No.: 4.563.304), /V-succinimidil 4-(2-piridilditio) 2-sulfobutanoato (sulfo-SPDB) (véase la publicación U.S. No.: 20090274713) , /V-succinimidil 4-(2-piridilditio) pentanoato (SPP) (véase, por ejemplo, el número de registro CAS 341498-08-6), 2-iminotiolano, o anhídrido acetilsuccínico y otros reactivos reticulantes, tales como los descriptos en la patente U.S.No.: 6.913.748, que se incorporan al presente documento, en su totalidad, como referencia, utilizando métodos conocidos. Véase, por ejemplo, la patente U.S. No.: 4.563.304; Carlsson y col., Biochem. J., 173:723-737 (1978); Blattler y col., Biochem, 24:1517-1524 (1985); Lambert y col., Biochem, 22:3913-3920 (1983); Klotz y col., Arch. Biochem. Biophys., 96:605 (1962); y Liu y col., Biochem., 18:690 (1979), Blakey y Thorpe, Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals, 1 :1 -16 (1988); Worrell y col., Anti-Cancer Droga Design, 1 :179-184 (1986), las revelaciones de las cuales se incorporan al presente documento, como referencia, en su totalidad. Por ejemplo, el anticuerpo o el agente de unión de células puede ser modificado con los reactivos de reticulación y el anticuerpo o el agente de unión a la célula conteniendo grupos tiol libres o protegidos, así derivados se hacen reaccionar con un maitansinoide que contiene disulfuros o tioles, para producir conjugados. Los conjugados se pueden purificar por cromatografía, incluyendo pero sin estar limitados por, la HPLC, la cromatografía de exclusión por tamaño, la cromatografía de adsorción, la cromatografía de intercambio iónico y la cromatografía de captura por afinidad, diálisis o por filtración de flujo tangencial.
En otro aspecto de la presente invención, el anticuerpo anti-CD20 se encuentra enlazado con drogas citotóxicas a través de enlaces disulfuro y un espaciador de polietilen glicol, para mejorar la potencia, la solubilidad o la eficacia del inmunoconjugado. Dichos enlazadores hidrofílicos escindibles se describen en WO2009/0134976. El beneficio adicional de este diseño enlazador es la alta proporción del monómero deseado y la baja agregación del conjugado anticuerpo-droga. Específicamente contemplados en este aspecto se encuentran los conjugados de los agentes de unión a las células y las drogas, enlazados a través de grupos disulfuro (-S-S- .), llevando espaciadores de polietilenglicol ((CH2CH20) n= - 4), con un margen estrecho de ¦i carga de droga de 2-8 , los qu muestran una actividad biológica potente relativamente alta hacia las células cancerosas y que poseen propiedades bioquímicas deseadas de alto rendimiento de conjugación y alta relación de monómero, con una mínima agregación de proteínas.
Específicamente contempladas en este aspecto están los conjugados de droga- anticuerpo anti-CD20 de la fórmula (I) o un conjugado de la fórmula (G): CB-[X,-(-CH2-CH20) n-Y-D]m (I) [D-Y-(-CH2-CH20) n-Xi]m-CB ( ) en donde:CB representa un anticuerpo anti-CD20 o un fragmento del mismo; D representa una droga; X representa una unidad alifática, aromática o heterocíclica unida de unión a la célula, a través de un enlace tioéter, un enlace amida, un enlace carbamato o un enlace éter; Y representa una unidad alifática, aromática o heterocíclica, unida a la droga a través de una unión de disulfuro; I es 0 o 1 ; m es un número entero de 2 a 8, y n es un entero desde 1 hasta 24.
Más preferiblemente, m es un número entero de 2 a 6.
Además, más preferiblemente aún, m es un número entero de 3 a 5.
También, más preferiblemente, n es un entero de 2 a 8. De manera alternativa, como se describe en, por ejemplo, las patentes U.S. No.: 6.441.163 y 7.368.565, la droga puede ser primero modificada para introducir un éster reactivo adecuado como para reaccionar con un agente de unión a la célula. La reacción de estas drogas conteniendo una porción enlazante activada, con un agente de unión a la célula, proporciona otro método para producir un conjugado de droga- agente de unión a la célula. Los maitansinoides también pueden estar enlazados con el anticuerpo anti CD20 o con un fragmento del mismo, utilizando grupos enlazantes de PEG, según lo dispuesto, por ejemplo, en la patente U.S. No.: 6.716.821. Estos grupos enlazantes, no escindibles, de PEG, son solubles tanto en agua como en disolventes no acuosos y pueden ser utilizados para unir uno o más agentes citotóxicos a un agente de unión a la célula. Ejemplos de enlazantes de PEG incluyen los enlazantes de PEG heterobifuncionales que reaccionan con los agentes citotóxicos y con los agentes de unión de la célula en los extremos opuestos de los enlazadores, a través de grupos funcionales sulfhidrilo o disulfuro en un extremo y a través de un éster activo en el otro extremo. Como un ejemplo general de la síntesis de un conjugado citotóxico que utiliza un grupo enlazante de PEG, se hace referencia otra vez a la patente U.S. No.: 6.716.821 , la cual se incorpora en su totalidad, al presente documento, como referencia. La síntesis se inicia con la reacción de uno o más agentes citotóxicos que soportan una porción de PEG reactiva con un agente de unión a la célula, lo que resulta en el desplazamiento del éster activo terminal de cada porción reactiva de PEG, por un residuo de aminoácido del agente de unión a la célula, para obtener un conjugado citotóxico que comprende uno o más agentes citotóxicos, unidos covalentemente a un agente de unión a las células, a través de un grupo enlazante de PEG. De manera alternativa, la unión a la célula se puede modificar con el reticulante bifuncional de PEG, para introducir una fracción de disulfuro reactiva (tal como un piridildisulfuro), el cual luego puede ser tratado con un maitansinoide que contenga tilo, para proporcionar un conjugado. En otro método, la unión a la célula se puede modificar con el reticulante bifuncional de PEG, para introducir una porción de tilo, la cual se puede tratar con un reactivo maitansinoide que contenga disulfuros (tal como un piridildisulfuro), para proporcionar un conjugado.
También se pueden preparar conjugados anticuerpo - droga con enlaces no escindibles. Dichos reticulantes se describen en el arte (véase, por ejemplo, ThermoScientific Pierce Crosslinking Technical Handbook y la Publicación US No. 20050169933, cada una de las cuales se incorpora a la presente, como referencia) e incluyen, pero no están limitados por, /V-succinimidil 4-(maleimidometil) ciclohexanocarboxilato (SMCC), /\/-succinimidil-4-(/V-maleimidometil)-ciclohexano-1 -carboxi-(6-amidocaproato), el cual es un análogo de "cadena larga" del SMCC (LC-SMCC), éster de V-succinimidilo del ácido -maleimidoundecanoico (KMUA), éster de N- succinimidilo del ácido ß-maleimidopropanoico (BMPS), éster de /V-succinimidilo del ácido ?-maleimidobutírico (GMBS), /V-hidroxisuccinimida éster del ácido e-maleimidocaproico (EMCS), éster de m-maleimidobenzoil-/V-hidroxisuccinimida (MBS), éster de N-{ a-maleimidoacetoxi)-succinimida (AMAS), succin¡midil-6-( ß-male¡midopropionamido)hexanoato (SMPH), /V-succinimidil 4-(p-maleimidofenil)-butirato (SMPB) y A/-(p-maleimidofenil)isocianato (PMPI), /V-succinimidil-4-(¡odoacetil)-aminobenzoato (SIAB), /V-succinimidil iodoacetato (SIA), /V-succinimidil bromoacetato (SBA) y /V-succinimidil 3-(bromoacetamido)propionato (SBAP). Preferiblemente, el anticuerpo se modifica con reactivos reticulantes tales como el succinimidil 4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1 -carboxilato (SMCC), sulfo-SMCC, éster de i maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida (MBS), sulfo-MBS o succinimidil-iodoacetato, tal como se describe en la literatura, para introducir 1 -10 grupos reactivos (Yoshitake y col, Eur. J. Biochem., 101 :395-399 (1979); Hashida y col., J. Applied Biochem., 56-63 (1984); y Liu y col, Biochem., 18:690-697 (1979)). El anticuerpo modificado se hace luego reaccionar con el derivado de maitansinoide que contiene tiol, para producir un conjugado. El conjugado puede ser purificado mediante filtración en gel a través de una columna de Sephadex G25, mediante diálisis o mediante filtración del flujo tangencial. Los anticuerpos modificados son tratados con el compuestos maitansinoide conteniendo tiol (1 a 2 equivalentes molares / grupo maleimido) y los conjugados anticuerpo -maitansinoide son purificados mediante filtración por gel a través de una columna Sephadex G-25, cromatografía en columna de hidroxiapatita cerámica, diálisis, filtración de flujo tangencial o mediante una combinación de dichos métodos. Por lo general, se enlazan un promedio de 1 -10 maitansinoides por cada anticuerpo. Un método preferido consiste en modificar los anticuerpos con succinimidil 4 - (N-maleimidometil)-ciclohexano-l -carboxilato (SMCC) para introducir grupos maleimido, seguido de la reacción del anticuerpo modificado con un maitansinoide conteniendo tioles, para obtener un conjugado enlazado por tioéter. Otra vez, se obtiene como resultado conjugados con 1 a 10 moléculas de droga por molécula de anticuerpo. Los conjugados de anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, hormonas proteicas y factores de crecimiento proteicos con maitansinoides, se realizan de la misma manera.
En otro aspecto de la invención, el anticuerpo CD20 esta enlazado a la droga a través de un enlace no escindible a través de la intermediación de un espaciador de PEG. Reactivos reticulantes adecuados que comprenden cadenas de PEG hidrof ílicas que forman enlaces entre una droga y el anticuerpo o el fragmento anti-CD20, son bien conocidos en el arte o se encuentran disponibles en el comercio (por ejemplo de Quanta Biodesign, Powell, Ohio). Enlazadores adecuados que contienen PEG pueden ser además sintetizados a partir de los mismos PEGs disponibles en el comercio, mediante técnicas de química sintética conocidas para el experto en la técnica. Las drogas pueden hacerse reaccionar con enlazadores que contienen PEG bifuncionales, para obtener compuesto de la fórmula Z -X|-(-CH2-CH2-0-)n-Yp-D, mediante los métodos descritos en detalle en las Solicitudes de Patentes US 20090274713 y WO2009/0134976, el cual puede entonces reaccionar con un agente de unión a la célula para proveer un conjugado. De manera alternativa, la unión a la célula puede ser modificada con un enlazador bifuncional de PEG para introducir un grupo reactivo de tiol (tal como un maleimido o un haloacetamido) el cual puede ser tratado con un maitansinoide conteniendo tiol, para proveer el conjugado. En otro método, la unión a la célula puede ser modificada con un enlazador de PEG bifuncional, para introducir la porción tiol, la cual puede ser tratada con un maitansinoide reactivo a tiol (tal como un maitansinoide llevando maleimida o haloacetamida), para proveer un conjugado.
Por consiguiente, otro aspecto de la presente invención es un conjugado de un anticuerpo anti-CD20 droga de la fórmula (II) o de la fórmula (?G): CB-[X,-(-CH2-CH2-0-)n-Yp-D]m (II) [D-Yp-(-CH2-CH2-0-)n-X,]m-CB (?G) en donde, CB representa un anticuerpo anti-CD20 o un fragmento; D representa una droga; X representa una unidad alifática, aromática o heterocíclica unida al agente de unión a la célula vía un enlace tioéter, un enlace amida, un enlace carbamato, o un enlace éter; Y representa una unidad alifática, aromática o heterocíclica unida a una droga vía un enlace covalente seleccionado del grupo que consiste en un enlace tioéter, un enlace amida, un enlace carbamato, un enlace éter, un enlace amina, un enlace carbono-carbono y un enlace hidrazona; I es 0 o 1 ; p es 0 o 1 ; m es un entero desde 2 ai 15; y n es un entero desde 1 a 2000.
Preferentemente, m es un entero desde 2 to 8; y Preferentemente n es un entero desde 1 a 24.
Más preferentemente, m es un entero desde 2 a 6.
Además, aún más preferentemente, m es un entero desde 3 a 5.
Asimismo, mas preferentemente, n es un entero desde 2 a 8. Ejemplos de enlazadores conteniendo PEG adecuados incluyen enlazadores que poseen porciones de ésteres de /V-succinimidilo o /V-sulfosuccinimidilo para la reacción con el anticuerpo anti-CD20 o con un fragmento del mismo, como así también una porción basada en maleimido o haloacetilo para la reacción con el compuesto. Un espaciador de PEG puede ser incorporado en cualquier enlazador conocido en el arte, mediante los métodos aquí descritos. Reactivos reticulantes que comprenden un porción basada en maleimido que pueden ser incorporadas con un espaciador de PEG incluyen, pero no están limitados por, /V-succinimidil 4-(maleimidometil) ciclohexanocarboxilato (SMCC), A/-succinimidil-4-(/V-maleimidometil)-ciclohexano-1 -carboxi-(6-amidocaproato), el cual es un análogo de "cadena larga" de SMCC (LC-SMCC), /V-succinimidil éster del ácido - maleimidoundecanoico (KMUA), /V-succinimidil éster del ácido ?-maleimidobutírico (GMBS), /V- idroxisuccinimida éster del ácido e-maleimidocaproico (EMCS), éster de m- maleimidobenzoil-/V-hidroxisuccinimida (MBS), éster de ?/-( a-maleimidoacetoxi)- succinimida (AMAS), succinimidil-6-( P-maleimidopropionamido)hexanoato (SMPH), N-succinimidil 4-(p-male¡midofen¡l)-butirato (SMPB) y /V-(p-maleimidofen¡l)isoc¡anato (PMPI). Reactivos reticulantes que comprenden una porción basada en haloacetilo incluyen /V-succinimidil-4-(iodoacetil)-aminobenzoato (SIAB), /V-succinimidil iodoacetato (SIA), /V-succinimidil bromoacetato (SBA) y /V-succinimidil 3-(bromoacetamido)propionato (SBAP).
Otros reactivos reticulantes que carecen de átomos de azufre pueden también ser utilizados. Tales enlazadores pueden ser derivados de porciones basadas en ácidos dicarboxílicos. Entre las porciones basadas en ácidos dicarboxílicos se incluyen, pero no están limitadas por, los ácidos a,?-dicarboxílicos de la fórmula general que se muestra abajo: HOOC-A'p-E,q-(CH2CH20)nG,r-COOH en donde A' es un grupo opcional alquilo, alquenilo, o alquinilo, lineal o ramificado, que posee 2 a 20 átomos de carbono, E' es un grupo cicloalquilo o cicloalquenilo opcional que posee 3 a 10 átomos de carbono, G' es un grupo aromático, sustituido o sin sustituir, opcional que tiene 6 a 10 átomos de carbono, o un grupo heterocíclico, sustituido o sin sustituir, en donde el heteroátomo se selecciona entre N, O o S, y en donde p, q y r son cada uno 0 o 1 , siempre que p, q y r no sean todos cero al mismo tiempo, n es un entero desde 1 a 2000.
Muchos de los enlazadores que aquí se revelan se describen en detalle en las Solicitudes de Patentes U.S. Nos. 20050169933 y 20090274713 y en WO2009/0134976; el contenido de las cuales se incorpora a la presente, como referencia, en su totalidad.
La presente invención provee además enlazadores cargados, en donde las cargas se mantienen después de la modificación del anticuerpo anti-CD20 o del fragmento del mismo y en el conjugado de droga resultante. Más específicamente, la presente invención se relaciona con el uso de enlazadores cargados para enlazar drogas a un anticuerpo anti-CD20. En un aspecto de la invención, los enlazadores cargados son usados para modificar agentes de unión a las células y enlazarlos a drogas. En otro aspecto de la invención, los enlazadores cargados son utilizados para modificar drogas y enlazarlas a un anticuerpo anti-CD20 o a un fragmento. En todavía otro aspecto de la invención, los enlazadores cargados son usados para, de manera simultánea, enlazar drogas y agentes de unión a las células. En todos los casos, el resultado final preferido es un conjugado de agente de unión a células- enlazador cargado-droga, el cual puede ser representado mediante la fórmula, CB-(-L°-D)q, en donde CB es un agente de unión a la célula que es un anticuerpo anti-CD20 o un fragmento del mismo, Lc es un enlazador cargado, D es una molécula de droga y q es un entero desde 1 a 20. La presencia de uno o varios grupos cargados en el enlazador en el conjugado agente de unión a la célula -droga provee varias ventajas, táles como i) una mayor solubilidad en agua del producto final , ii) una habilidad para operar en concentraciones mas altas en soluciones acuosas, iii) una habilidad para enlazar un mayor número de moléculas de droga por molécula de agente de unión a las células, lo que resulta en una mayor potencia, iv) un potencial para que las especies de conjugado cargado sea retenido dentro de la célula diana, lo que resulta en una mayor potencia, y v) una sensibilidad mejorada de las células resistentes a multidrogas, las cuales serían incapaces de exportar las especies de droga desde la célula. La invención también describe enlazadores, los cuales pueden ser acoplados a la droga y al agente de unión a las células para obtener un conjugado que puede ser metabolizado en una célula para producir un metabolito de droga que contiene una o mas porciones cargadas. A estos enlazadores se los conoce como enlazadores pro-cargados.
A las porciones del enlazador que quedarán cargadas después del procesamiento de las células, se las conoce como porciones pro-cargadas.
En un aspecto de la presente invención, el reticulante cargado o pro-cargado es representado mediante la fórmula (III) en donde Y' puede reaccionar con un agente de unión a las células y Q puede reaccionar con droga citotóxica: en donde: Y' representa un grupo funcional que permite la reacción con un anticuerpo anti-CD20 o con un fragmento del mismo; Q representa una grupo funcional que permite el enlace de una droga citotóxica vía un enlace disulfuro, tioéter, tioéster, péptido, hidrazona, éter, éster, carbamato o amida; Ri , R2, R3, 4, R5, R6> R?> e, 9 y R10 son los mismos o son diferentes y son H, alquilo lineal que tienen de 1 -6 átomos de carbono, alquilo ramificado o cíclico que tiene desde 3 a 6 átomos de carbono, alquenilo o alquinilo, lineal, ramificado o cíclico, que tiene desde 2 a 6 átomos de carbono, aniones, tales como, pero sin estar limitados por, S03', X-SO3", OPO32", X-OPO32', P032', X-PO32", C02" y cationes, tales como, pero sin estar limitados por, un heterociclo conteniendo nitrógeno, N+R1 1 R12R13 o X-N+R 1 R12Ri3, o un fenilo, en donde: R11 , R12 y 13 son los mismos o son diferentes y son H, alquilo lineal que tienen de 1 -6 átomos de carbono, o alquilo ramificado o cíclico que tiene desde 3 a 6 átomos carbono y X representa fenilo o un alquilo lineal que tiene desde 1 a 6 átomos de carbono, o un alquilo ramificado o cíclico que tiene desde 3 a 6 átomos carbono; I, m y n son 0 o un entero desde 1 a 4; y A es un fenilo o un fenilo sustituido, en donde el sustituyente es un alquilo lineal que tiene desde 1 a 6 átomos de carbono o un alquilo alquilo ramificado o cíclico que tiene desde 3 a 6 átomos de carbono, o un sustituyente cargado seleccionado de los aniones, tales como pero sin estar limitados por, S03", X-S03", OP032", X-OP032", P032', X-P032~, C02" y cationes, tales como, pero sin estar limitados por, un heterociclo que contiene nitrógeno, N+R R12Ri3 o X-N+R R12R13, en donde X tiene la misma definición que arriba, y en donde g es 0 o 1 ; Z es una unidad polietilenoxi opcional de la fórmula (OCH2CH2)p, en donde p es 0 o un entero desde 2 hasta alrededor de 1000, o una unidad F1 -E1 -P-E2-F2 en la cual E1 y E2 son los mismos o son diferentes y son C=0, O o NR14, en donde R 4 es H, un alquilo lineal que tiene desde 1 -6 átomos de carbono, un alquilo ramificado o cíclico que tiene desde 3 hasta 6 átomos de carbono, un a alquenilo o un alquinilo, lineal, ramificado o cíclico, que tiene desde 2 a 6 átomos de carbono; P es una unidad peptídica de éntre 2 y 20 aminoácidos de longitud, en donde E1 o E2 pueden ser enlazados al péptido a través de un nitrógeno terminal, un carbono terminal o a través de una cadena lateral de uno de los aminoácidos del péptido; y F1 y F2 son los mismos o son diferentes y son una unidad polietilenoxi opcional de la fórmula (OCH2CH2)p, en donde p es 0 o un entero desde 2 hasta alrededor de 1000, siempre que cuando Z no sea F1 -E1 -P-E2-F2, entonces al menos uno de R1 ( R2, R3, R4, R5; R6, R7, R8, R9, y R10 sea un sustituyente cargado o que cuando g sea 1 , entonces al menos uno de A, R^ R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9 y R10 sea un sustituyente cargado. Esta es una realización a modo de ejemplo de un conjugado que tiene un enlazador cargado. Otros ejemplos se describen en la Solicitud de Patente Nos. 12/433,604, publicada como 2009-0274713 (Ravi, y col.), el contenido de la cual se incorpora a la presente, como referencia, en su totalidad. Enlazadores cargados adecuados son bien conocidos en el arte e incluyen aquellos descritos en, por ejemplo, 20090274713, cuyo contenido se incorpora a la presente, como referencia, en su totalidad.
La presente invención incluye aspectos en donde alrededor de 2 hasta alrededor de 8 moléculas de droga ("carga de droga"), por ejemplo, maitansinoides, se unen a un anticuerpo anti-CD20 o fragmento del mismo, en donde el efecto anti-tumor del conjugado es mucho mas eficaz que el de un conjugado con una carga de droga con un número mayor o menor de moléculas de droga unidas al mismo agente de unión a las células. "Carga de droga", como se utiliza en la presente, hace referencia al número de moléculas de droga (por ejemplo; un maitansinoide) que pueden estar unidas al agente de unión a la célula (por ejemplo un anticuerpo anti-CD20 o un fragmento del mismo). En un aspecto el número de moléculas de droga que pueden ser enlazadas a un agente que se une a las células puede ser, en promedio, desde alrededor de 2 hasta alrededor de 8 (por ejemplo 1.9, 2.0, 2.1 , 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1 , 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1 , 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1 , 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1 , 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1 , 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1 ). En un aspecto preferido, el numero de moléculas de droga que pueden ser enlazadas a un agente que se une a las células puede ser, en promedio, desde alrededor de 2 hasta alrededor de 7 (por ejemplo 1.9, 2.0, 2.1 , 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1 , 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1 , 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1 , 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1 , 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1 ). En un aspecto todavía mas preferido, el numero de moléculas de droga que pueden ser enlazadas a un agente que se une a las células puede ser, en l promedio, desde alrededor de 2 hasta alrededor de 6 (por ejemplo 1 .9, 2.0, 2.1 , 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1 , 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1 , 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1 , 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1 ). En la realización mas preferida, el numero de moléculas de droga que pueden ser enlazadas a un agente que se une a las células puede ser, en promedio, desde alrededor de 2 hasta alrededor de 5 (por ejemplo 1 .9, 2.0, 2.1 , 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1 , 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1 , 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5, 5.1 ). El termino "promedio", tal como se usa en la presente, se determina mediante medidas espectrofotométricas de la absorbancia de un anticuerpo anti-CD20 o de un fragmento del mismo y de la droga enlazada a ellos. En otro aspecto, el conjugado de droga-anticuerpo anti-CD20 o fragmento del mismo, se representa mediante la fórmula (D)airededor 2- alrededor 8-L-Anti-CD20Ab, en donde D es una droga (por ejemplo un maitansinoide, una taxano o un análogo de CC1065), L es un enlazador, en donde el enlazador se selecciona entre un enlazador escindible (por ejemplo enlazadores escindibles a través de intercambio de disulfuros) o un enlazador sustancialmente resistente a la escisión (por ejemplo enlazadores que tienen una porción del éster de N-succinimidilo o de un éster de N-sulfosuccinimidilo para la reacción con el agente de unión a las células, como así también una porción basada en maleimido o haloacetilo) y Anti-CD20Ab es un anticuerpo o fragmento del mismo que se une a CD20 tal como se describe en la presente. En un elemento preferido, el conjugado de droga-agente de unión a las células (por ejemplo,' un inmunoconjugado) representado mediante la fórmula (May)airededor 2-airededor 8"L- Anti-CD20Ab, en donde May es un maitansinoide, L es un enlazador, en donde dicho enlazador es un enlazador escindible o un enlazador substancialmente resistente a la escisión; y Anti-CD20Ab es un anticuerpo o fragmento del mismo que se une a CD20 tal como se describe en la presente. Las drogas adecuadas para su uso en esta invención son drogas citotóxicas capaces de ser enlazadas a un agente de unión a las células tal como se describe en la presente. Un aspecto de la invención es un análogo de maitansinol adecuado que tiene un anillo aromático modificado, incluyendo: (1 ) C-19-decloro (Patente U.S. no. 4,256,746) (preparado mediante reducción LAH de ansamitocina P2); (2) C-20-hidroxi (o C-20-demetil) +/-C-19-decloro (Patentes U.S. nos. 4,361 ,650 y 4,307,016) (preparado mediante demetilación utilizando Streptomyces o Actinomyces o decloración usando LAH); y (3) C-20-demetoxi, C-20-aciloxi (-OCOR), +/-decloro (Patente U.S no. 4,294,757) (preparado mediante acilación utilizando cloruros de acilo). Ejemplos específicos de análogos adecuados de maitansinol que tienen modificaciones en otras posiciones incluyen: (1 ) C-9-SH (Patente U.S no. 4,424,219) (preparado mediante la reacción de maitansinol con H2S o P2S5); (2) C-14-alcoximetil (demetoxi/CH2OR) (Patente U.S no. 4,331 ,598); (3) C-14-hidroximetil o aciloximetil (CH2OH o CH2OAc) (Patentes U.S no. 4,450,254) (preparado a partir de Nocardia); (4) C-15-hidroxi/aciloxi (Patente U.S no. 4,364,866) (preparado mediante la conversión de maitansinol mediante Streptomyces); (5) C-15-metoxi (Patente U.S nos. 4,313,946 y 4,315,929) (aislado desde Trewia nudiflora); (6) C-18-A/-demetil (Patentes U.S nos. 4,362,663 y 4,322,348) (preparado mediante la demetilación de maitansinol mediante Streptomyces); y (7) 4,5-deoxi (Patente U.S. 4,371 ,533) (preparado mediante la reducción de maitansinol con tricloruro de titanio /LAH). La síntesis de los maitansinoides conteniendo tiol utilizables en la presente invención se revelan completamente en las Patentes U.S. Nos. 5,208,020, 5,416,064, y 7,276,497. Maitansinoides con una porción tiol en la posición C-3, en la posición C-14, en la posición C-15 o en la posición C-20 son convenientes. Se prefiere la posición C-3 y la posición C-3 de maitansinol es especialmente preferida. También preferidos son un maitansinoide con una porción de tiol C-3 conteniendo /V-metil-alanina y un maitansinoide con una porción de tiol C-3 conteniendo /V-metil-cisteína y análogos de los mismos. Maitansinoides preferidos son aquellos descritos en las Patentes US 5,208,020; 5,416,064; 6,333.410; 6,441 ,163; 6,716,821 ; RE39.151 y 7,276,497. De estos se prefieren /\^'-deacetil-/^'-(3-mercapto-1 -oxopropil)-maitansina (DM1 ) y /\^'-deacetil-N2-(4-mercapto-4-metil-1 -oxopentil) maitansina (DM4). Otras drogas pueden ser utilizadas en el presente aspecto de la invención, por ejemplo, aquellas descritas en la presente. Otros ejemplos se describen en la Solicitud Provisoria U.S. No. 61/049,296 y en la Solicitud de Patente U.S. No. 12/574,430; cuyo contenido se incorpora a la presente, como referencia, en su totalidad.
El anticuerpo anti-CD20 o fragmento del mismo puede ser modificado mediante la reacción de un reactivo reticulante bifuncional con un anticuerpo anti-CD20 o un fragmento del mismo, resultando así en la unión covalente de una molécula enlazadora al anticuerpo anti-CD20 o al fragmento del mismo. Tal como se usa en la presente, un "reactivo reticulante bifuncional" es cualquier porción química que una covalentemente a un agente de unión a células con una droga, tal como las drogas que se describen en la presente. En otro método, una parte de la porción enlazante es provista por la droga. En este sentido, la droga comprende una porción enlazante que es parte de una molécula de enlazador más grande, que es usada para unir el agente de unión a las células con la droga. Por ejemplo, para formar el maitansinoide DM1 , la cadena lateral en el grupo hidroxil C-3 idroxil de la maitansina se modifica para tener un grupo sulfhidrilo libre (SH). Esta forma tiolada de maitansiná puede reaccionar con un agente de unión a las células modificado, para formar un conjugado. Por lo tanto, el enlazador final es ensamblado de dos componentes, uno de los cuales es provisto por el reactivo reticulante, mientras que el otro es provisto por la cadena lateral del DM1.
Las moléculas de droga pueden ser también enlazadas a las moléculas de anticuerpo a través de una molécula vehículo intermediaria tal como la albúmina sérica.
Tal como se utiliza en la presente, la expresión "enlazado a un agente que se une a las células" o "enlazado a un anticuerpo o un fragmento anti-CD20" hace referencia a una molécula de conjugado que comprende al menos un derivado de droga ligado a un agente de unión a las células, un anticuerpo anti-CD20 o un fragmento del mismo, vía un grupo enlazante adecuado, o un precursor del mismo. Un grupo enlazante preferido es SMCC.
Agentes citotóxicos especialmente preferidos útiles en la presente invención son los maitansinoides y los análogos de maitansinoides. Ejemplos de maitansinoides adecuados incluyen los ésteres de maitansinol y los análogos de maitansinol. Se incluye cualquier droga que inhiba la formación de microtúbulos y que sea altamente tóxica para las células de mamíferos, como lo son el maitansinol y los análogos de maitansinol.
Ejemplos de ésteres de maitansinol adecuados incluyen aquellos que tienen un anillo aromático modificado y aquellos que tienen modificaciones en otras posiciones. Dichos maitansinoides adecuados se revelan en las Patentes U.S. Nos. 4,424,219; 4,256,746; 4,294,757; 4,307,016; 4,313,946; 4,315,929; 4,331 ,598; 4,361 ,650; 4,362,663; 4,364,866; 4,450,254; 4,322,348; 4,371 ,533; 5,208,020; 5,416,064; 5,475,092; 5,585,499; 5,846,545; 6,333,410; 7,276,497 y 7,473,796.
Ejemplos específicos de análogos de maitansinol adecuados que tienen anillos aromáticos modificados incluyen: (1 ) C-19-decloro (U.S. Pat. No. 4,256,746) (preparado mediante reducción LAH de ansamitocina P2); (2) C-20-hidroxi (o C-20-demetil) +/-C-19-decloro (U.S. Pat. Nos. 4,361 ,650 y 4,307,016) (preparado mediante desmetilación utilizando Streptomyces o Actinomyces o decloración usando LAH); y (3) C-20-demetoxi, C-20-aciloxi (-OCOR), +/-decloro (U.S. Pat. No. 4,294,757) (preparado mediante acilación utilizando cloruros de acilo).
Ejemplos de análogos adecuados de maitansinol que tienen modificaciones en otras posiciones incluyen: (1 ) C-9-SH (U.S. Pat. No. 4,424,219) (preparado mediante la reacción de maitansinol con H2S o P2S5); (2) C-14-alcoximetil (demetoxi/CH20R) (U.S. Pat. No. 4,331 ,598); (3) C-14-hidroximetil o aciloximetil (CH20H o CH20Ac) (U.S. ¦ Pat. No. 4,450,254) (preparado de Nocardia); (4) C-15-hidroxi/aciloxi (U.S. Pat. No. 4,364,866) (preparado por la conversión de maitansinol mediante Streptomyces); (5) C-15-metoxi (U.S. Pat. Nos. 4,313,946 y 4,315,929) (aislado de Trewia nudiflora); (6) C-18-N-demetil (U.S. Pat. Nos. 4,362,663 y 4,322,348) (preparado mediante la desmetilación de maitansinol mediante Streptomyces); y (7) 4,5-deoxi (U.S. Pat. No. 4,371 ,533) (preparado mediante la reducción de maitansinol con tricloruro de titanio /LAH).
En un aspecto preferido, los conjugados de la presente invención utilizan un maitansinoide conteniendo tiol (DM1 ), formalmente denominado /\^'-deacet¡l- \ '-(3-mercapto-1 - oxopropil)-maitansina, como el agente citotóxico. DM1 se representa mediante la siguiente fórmula estructural (IV): En un aspecto preferido, los conjugados de la presente invención utilizan al maitansinoide conteniendo tiol /V2-deacetil-/\^ (4-meti-4-mercapto-1 - oxopentil)-maitansina (por ejemplo, DM4) como el agente citotóxico. DM4 se representa mediante la siguiente fórmula estructural (V): Otros maitansinoides preferidos que comprenden una cadena lateral que contiene un enlace tiol esféricamente impedido es el A^ -deacetil-/V-2 (4-mercapto-1 -oxopentil)-maitansina (denominado DM3), representado mediante la siguiente fórmula estructural (VI): (Vll-L) (Vll-D) (VII-D.L) en donde: Y representa (CRyRe CRsRsUCRaR^CR^SZ, en donde: RT y R2 son cada uno, de manera independiente, alquilo o alquenilo lineales que tienen desde 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo, ramificados o cíclicos, que tienen desde 3 hasta 10 átomos de carbono, fenilo, fenilo sustituido o grupo heterocíclico y en adición uno de R, y R2 puede ser H; 3, 4. 5> R6, R7 y Re son cada uno, de manera independiente, H, alquilo o alquenilo lineales, que tienen desde 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo, ramificados o cíclicos, que tienen desde 3 a10 átomos de carbono, fenilo, fenilo sustituido, o radicales heterocíclico aromático o heterocicloalquilo; I, m y n son cada uno, de manera independiente, un entero de desde 1 a 5, y en adición n puede ser 0; Z es H, SR o -COR en donde R es alquilo o alquenilo, lineal o ramificado, que tiene desde 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo cíclico que tiene desde 3 a 10 átomos de carbono, o arilo sustituido o sin sustituir o grupo heterocíclico; y May representa un maitansinoide que soporta la cadena lateral en C-3, C-14 hidroximetil, C-15 hidroxi o C-20 desmetil.
Aspectos preferidos de la fórmulas (Vll-L), (Vll-D) y (VII-D,L) incluyen a los compuestos de la fórmulas (Vll-L), (Vll-D) y (VII-D,L) en donde: es H, R2 es metil, R5, R6, R7, y R8 son cada uno H, I y m es cada uno 1 , n es 0, y Z es H.
Ri y R2 son metil, R5, R6, R7, R8 son cada uno H, I y m son 1 , n es 0, y Z es H. RT es H, R2 es metil, R5, R6, R7, R8 son cada uno H, I y m son cada uno 1 , n es 0, y Z es -SCH3.
Ri y R2 son metil, R5, R6, R7, e son cada uno H, I y m son 1 , n es 0, y Z es— SCH3.
Maitansinoides adicionales también incluyen compuestos representados mediante la fórmula (VIII): en donde Y es como se define para la fórmula (VII).
Aspectos preferidos de la fórmula (VIII) incluyen compuestos de la fórmula (VIII) en donde: Ri es H, R2 es metilo, R5, R6, R7, y R8 son cada uno H; I y m son cada uno 1 ; n es 0; y Z es H.
Ri y R2 son metilo, R5, R6, R7, y Rs son cada uno H, I y m son 1 ; n es 0; y Z es H.
R es H, R2 es metilo, R5, R6, R7, y R8 son cada uno H, I y m son cada uno 1 , n es 0, y Z es— SCH3.
RÍ y R2 son metilo, R5, R6, R7, y Re son cada uno H, I y m son 1 , n es 0, y Z es— SCH3.
Maitansinas adicionales incluyen además compuestos representados por la fórmula (IX-L), (IX-D) o (IX-D.L): (IX-L) (IX-D) (IX-D.L) en donde: Y2 representa (CR7R8)i(CR9=CR1o)p(C=C)qA0(CR5R6)mDu(CR11=CR12)r(C=C)sBt(CR3R4)nCRiR2SZ2, en donde: Ri y R2 son cada uno, de manera independiente, alquilo o alquenilo lineal, que tienen desde 1 to 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo cíclicos o ramificados que tienen desde 3 a 10 átomos de carbono, fenilo, fenilo sustituido o grupo heterocíclico, y en adición, uno de Ri y R2 puede ser H; A, B, y D, cada uno de manera independiente, es cicloalquilo o cicloalquenilo que tiene 3 a 10 átomos de carbono, arilo simple o sustituido o aromático heterocíclico o radical heterocicloalquilo; R5. R6. 7, Rs. 9> R10, R11 y R12 son cada uno, de manera independiente, H, alquilo o alquenilo lineal, que tiene desde 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo cíclico o ramificado que tiene desde 3 a 10 átomos de carbono, fenilo, fenilo sustituido o grupo heterocíclico; I, m, n, o, p, q, r, s, y t son cada uno, de manera independiente, 0 o un entero de desde 1 a 5, siempre que, al menos, dos de I, m, n, o, p, q, r, s y t no sean cero al mismo tiempo; y Z2 es SR o -COR, en donde R es alquilo o alquenilo lineal que tiene desde 1 a 10 átomos de carbono, alquilo cíclico o ramificado o alquenilo que tiene desde 3 - 10 átomos de carbono, o arilo simple o sustituido o aromático heterocíclico o radical heterocicloalquilo y May es un maitansinoide.
Aspectos preferidos de los compuestos de la fórmula (IX) incluyen a los compuestos en donde R, es H y R2 es metilo, y es metilo y R2 es metilo.
Otros maitansinoides incluyen a los compuestos representados mediante la fórmula (X): en donde Y2' es tal como se define el mismo como Y2 para la fórmula (IX).
Cada uno de los maitansinoides que se enseñan en las Patentes US No. 5,208,020 y 7,276,497, pueden además ser utilizadas en el conjugado de la presente invención. En este sentido, la revelación completa de los documentos 5,208,020 y 7,276,697 se incorporan aquí como referencia.
Muchas posiciones de los maitansinoides pueden servir como la posición para conectar químicamente la porción enlazante. Por ejemplo, la posición C-3 que tiene un grupo hidroxilo, la posición C-14 modificada con hidroximetilo, la posición C-15 modificada con hidroxi y la posición C-20 que tiene un grupo hidroxi son todas esperables que sean útiles. No obstante, la posición C-3 es preferida y la posición C-3 de maitansinol es especialmente preferida.
Representaciones ! estructurales de conjugados preferidos se muestran abajo: (XI) Ab-PEG4-Mal-DM 1 (XII) (XIV) Varias descripciones para producir dichos conjugados anticuerpo- maitansinoide se proveen en las Patentes U.S. No. 6,333,410 y en las Solicitudes de Patentes U.S. Nos. 09/867,598, 10/161 ,651 y 10/024,290, cada una de las cuales se incorporan aquí en su totalidad.
En general, una solución de un anticuerpo en un buffer acuoso puede ser incubada con un exceso molar de maitansinoides que tienen una porción de disulfuro que soporta un grupo reactivo. · La mezcla de reacción puede ser templada mediante el agregado de amina en exceso (tal como etanolamina, taurina, etc.). El conjugado maitansinoide-anticuerpo puede ser entonces purificado mediante filtración en gel.
El número de moléculas de maitansinoide que se unen por molécula de anticuerpo puede ser determinado mediante medición espectrofotométrica de la relación de absorbancia a 252 nm y 280 nm. Se prefiere un promedio de 1-10 moléculas de maitansinoide /moléculas de anticuerpo y un promedio de of 2-5 es todavía mas preferido.
Los conjugados de anticuerpos con drogas maitansinoides pueden ser evaluados por su habilidad para suprimir in vitro la proliferación de varias líneas celulares no deseadas. Por ejemplo, líneas celulares tales como la línea celular de Daudi del linfoma humano y la línea celular de Ramos del linfoma humano, pueden ser fácilmente utilizadas para la evaluación de la toxicidad de estos compuestos. Las células a ser evaluadas pueden ser expuestas a los compuestos durante 4 a 5 días y las fracciones de células sobrevivientes ser medidas por ensayos directos mediante métodos conocidos. Los valores de IC50 pueden entonces ser calculados a partir de los resultados de los ensayos.
Los compuestos de benzodiazepinas descritos en la Solicitud Provisional US No. 61/150,201 (por ejemplo, indolinobenzodiazepinas o oxazolidinobenzodiazepinas), sus derivados e intermediarios, pueden también ser utilizados para preparar un fragmento de anticuerpo anti-CD20 o sus conjugados.
Entre las benzodiazepinas útiles se incluyen a los compuestos de la fórmula (XIX), (XX) y (XXI), en los cuales, de manera opcional, los compuestos diméricos soportan un grupo enlazador que permite el vínculo con agentes que se unen a las células. doble, siempre que cuando es un enlace doble, entonces X está ausente e Y es H, y cuando es un enlace simple, entonces X es H o una porción protectora de aminas que convierte al compuesto en una prodroga; Y se selecciona entre -ÚR, un éster representado por -OCOR', un carbonato representado por -OCOOR', un carbamato representado por -OCONR'R", un amino o un hidroxil amino representado por NR'R", una amida representada por -NRCOR', un péptido representado por NRCOP. en donde P es un aminoácido o un polipéptido que contiene entre 2 y 20 unidades de aminoácidos, un tioéter representado por SR', un sulfóxido representado por SOR', una sulfona representada por -S02R', un sulfito -S03l un bisulfito -OS03, un halógeno, un ciano, un azido o un tiol, en donde R, R' y R" son los mismos o diferentes y se seleccionan de H, alquilo, alquenilo o alquinilo, sustituidos o sin sustituir, lineales, ramificados o cíclicos, que tienen desde 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2)n, en donde n es un entero desde 1 hasta 2000, arilo que tiene desde 6 a 10 átomos de carbono, un anillo heterocíclico que tiene desde 3 hasta 10 átomos de carbono en donde el sustituyente se selecciona entre halógeno, OR7, NR8R9, N02, NRCOR', SRi0, un sulfóxido representado por SOR', una sulfona representada por -S02R\ un sulfito -S03, un bisulfito -OS03, una sulfonamida representada por S02N RR', ciano, un azido, -COR , OCORn oOCONR R 2, en donde las definiciones de R7, R8, Rg, Río, Rn y R12 son como se mencionan arriba, opcionalmente R" es OH; W es C=0, C=S, CH2, BH, SO o S02; Ri , R2, R3- R4, Ri', R2', R3' y R4' son cada uno, de manera independiente, seleccionados de H, alquilo, alquenilo o alquinilo, sustituidos o sin sustituir, lineales, ramificados o cíclicos que tienen desde 1 hasta 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2)n, en donde n es un entero desde 1 a 2000, o un sustituyente seleccionado de un halógeno, guanidinio [-NH(C=NH)NH2], OR7, NR8R9, N02l NRCOR', SR 0, un sulfóxido representado por SOR', una sulfona representada por -S02R', un sulfito -SO3, un bisulfito -OSO3, una sulfonamida representada por S02NRR\ ciano, un azido, -COR, , , OCORn o OCONRn R12 en donde R7, R8, R9, R10, Rn y R12 son cada uno, de manera independiente, seleccionados de H, alquilo, alquenilo o alquinilo, lineales, ramificados o cíclicos, que tienen de 1 a10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2)n, en donde n es un entero de 1 a 2000, arilo que tiene de 6 a 10 átomos de carbono, anillo heterocíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, opcionalmente R10 es SR13 o COR 3, en donde R 3 se selecciona entre alquilo, alquenilo o alquinilo, lineales, ramificados o cíclicos, que tienen de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2)n, en donde n es un entero de 1 a 2000, arilo que tiene de 6 a 10 átomos de carbono, un anillo heterocíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, opcionalmente R es OR14, en donde R 4 tiene la misma definición que R, opcionalmente, uno cualquiera de R1 f R2, R3, R4, Ri', R2', R3' o R4' es un grupo enlazante que permite el acoplamiento a un agente que se une a las células vía un enlace covalente o se selecciona entre una unidad polipirrolo, poli-indolil, poli-imidazolil, polipirollo-imidazolil, poli-pirrolo-indolil o poliimidazolo-indolil, que opcionalmente soporte un grupo enlazante que permita el acoplamiento a un agente que se une a las células; Z se selecciona entre (CH2)n, en donde n es 1 , 2 o 3, CRi5Ri6, NR 7, O o S, en donde R15, R16 y R-i son cada uno, de manera independiente, seleccionados de H, alquilo lineal, ramificado o cíclico que tiene desde 1 a 10 átomos de carbono, una unida polietilenglicol (-OCH2CH2)n, en donde n es un entero de 1 a 2000; R6 es OR, SR o NRR', en donde R y R' tienen la misma definición dada más arriba; X' se selecciona entre CH2) NR, CO, BH, SO o S02 en donde R tiene la misma definición dada más arriba; Y' es O, CH2l NR o S, en donde R tiene la misma definición dada más arriba; Z' es CH2 o (CH2)n, en donde n es 2, 3 o 4, siempre que X', Y' y Z' no sean todos CH2 al mismo tiempo; A y A' son los mismos o son diferentes y son seleccionados de O, -CRR'O, S, -CRR'S, -NR15 o CRR'NHR,5, en donde R y R' tienen la misma definición dada más arriba y en donde R15 tiene la misma definición dada más arriba para R; D y D' son los mismos o son diferentes y, de manera independiente, son seleccionados de alquilo, alquenilo o alquinilo, lineales, ramificados o cíclicos, que tienen de 1 a 10 átomos de carbono, opcionalmente sustituidos con uno cualquiera de halógeno, OR7, NR8R9, N02, NRCOR', SR10, un sulfóxido representado por SOR', una sulfona representada por -S02R', un sulfito -S03, un bisulfito -OS03, una sulfonamida representada por S02NRR', ciano, un azido, -CORn, OCORn o OCONR R12, en donde las definiciones de R7, R8l Rg, Río, Rn y R12 son como las dadas más arriba, una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2)n, en donde n es un entero de 1 a 2000; L es un grupo fenilo opcional o un anillo heterociclo que tiene de 3 a 10 átomos de carbono que está, opcionalmente, sustituido, en donde el sustituyeme es un grupo enlazador que permite el acoplamiento al agente que se une a las células vía un enlace covalente, o se selecciona entre un alquilo, alquenilo o alquinilo, lineal, ramificado o cíclico, que tiene desde 1 a 10 átomos de carbono, opcionalmente sustituidos con uno cualquiera de halógeno, OR7, NR8R9, N02, NRCOR', SR10, un sulfóxido representado por SOR', una sulfona representado por -S02R', un sulfito -S03, un bisulfito -OS03, una sulfonamida representada por S02NRR\ ciano, un azido, , -CORn, OCORn o OCONRnR12, en donde las definiciones de R7, R8, R9, R10, Rn y Ri2 son las dadas arriba, una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2)n, en donde n es un entero de 1 a 2000; opcionalmente, L en si mismo es un grupo enlazador que permite la conexión al agente que se une a las células vía un enlace covalente; o sus solvatos, sales, hidratos o sales hidratadas, farmacéuticamente aceptables, sus isómeros ópticos, sus racematos, sus diastereomeros, sus enantiómeros o las estructuras polimórficas cristalinas de dichos compuestos; siempre que el compuesto no tenga mas de un grupo enlazador que permita la conexión al agente que se une a las células vía un enlace covalente.
En un aspecto preferido, la línea doble — entre N y C representa un enlace simple o un enlace doble, siempre que cuando es un enlace doble, entonces X se encuentre ausente e Y sea H, y que cuando es un enlace simple, X es H o un grupo protector amino que convierte al compuesto en una prodroga; Y se selecciona entre -OR, NR'R", un sulfito -S03, o un bisulfito -OS03, en donde R se selecciona entre H, un alquilo, alquenilo o alquinilo, lineal, ramificado o cíclico, que tiene desde 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol {-OCH2CH2)n, en donde n es un entero desde 1 a 2000, un arilo que tiene de 6 a 10 átomos de carbono, un anillo heterocíclico que tiene de 3 a10 átomos de carbono; W es C=0, CH2 o S02; Ri , R2, R3> R4, Ri'. R2'- R3' y 4' son cada uno, de manera independiente, seleccionados de H, N02 o un grupo enlazador que permite la conexión al agente que se une a las células vía un enlace covalente; R6 es OR18, en donde R18 posee la misma definición que R; Z se selecciona entre (CH2)n, en donde n es 1 , 2 o 3, CR15R16, NR17, O o S, en donde R15, R16 y R17 son cada uno, de manera independiente, seleccionados de H, alquilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2)n, en donde n es un entero de 1 a 2000; X' se selecciona entre CH2 o C=0; Y' es O, NR o S, en donde R es definido como arriba; Z' es CH2 o (CH2)2; A y A' son cada uno O; D y D' son iguales o diferentes y seleccionadas de manera independiente de alquilo, alquenilo o alquinilo, lineal, cíclico o ramificado, que tiene desde 1 hasta 10 átomos de carbono; L es un grupo fenilo opcional o un anillo heterociclo que tiene de 3 a 10 átomos de carbono que se encuentra opcionalmente sustituido, en donde el sustituyente es un grupo enlazador que permite la conexión a un agente que se une a las células vía un enlace covalente, o se selecciona entre alquilo, alquenilo o alquinilo, lineal, cíclico o ramificado, que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, opcionalmente substituidos con uno cualquiera de halógeno, OR7, NR8R9, N02, NRCOR', SR10, un sulfóxido representado por SOR', una sulfona representada por -S02R', un sulfito -S03, un bisulfito -OS03, una sulfonamida representada por S02NRR', ciano, una azida, , -CORn, OCORn o OCONRnR12, una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2)n, en donde n es un entero desde 1 a 2000; opcionalmente, L en si mismo es un grupo enlazador que permite la conexión a un agente que se une a las células vía un enlace covalente; o sus solvatos, sales, hidratos o sales hidratadas, farmacéuticamente aceptables, sus isómeros ópticos, sus racetnatos, sus diastereómeros, enantiómeros y las estructuras polimórficas cristalinas de los compuesto En otro aspecto preferido, el compuesto está representado por la fórmula (XXII): en donde la doble línea — entre N y C representa un enlace simple o un enlace doble, siempre que cuando sea un doble enlace entonces X está ausente y Y es H y que cuando es un enlace simple, X es H o un grupo protector de amino que convierte al compuesto en una prodroga, e Y se selecciona entre OH, un éter representado por -OR, un sulfito -S03, o un bisulfito -OS03, en donde R se selecciona entre un alquilo, alquenilo o alquinilo, lineal, cíclico o ramificado, que tiene desde 1 hasta 10 átomos de carbono, uno de R2, R3 es un grupo enlazador que permite la conexión al agente que se une a las células vía un enlace covalente y el otro es H, uno de L', L" o L'" es un grupo enlazador que permite la conexión a un agente que se une a las células, mientras que los otros son H; preferentemente L' es el grupo enlazador y G es CH o N. Otros ejemplos se describen en la Solicitud de Patente No. 61/150,201 , el contenido de la misma se incorpora a la presente, como referencia, en su totalidad.
El agente citotóxico utilizado en los conjugados citotóxicos de acuerdo con la presente invención también puede ser un taxano o un derivado del mismo. Los taxanos son una familia de compuestos que incluyen al paclitaxel (Taxol), un producto citotóxico natural, y al docetaxel (Taxotere), un derivado semi-sintético, dos compuestos que son ampliamente utilizados en el tratamiento del cáncer. Los taxanos son venenos del huso mitótico que inhiben la despolimerización de la tubulina, lo que resulta en la muerte de la célula. Si bien el docetaxel y el paclitaxel son agentes útiles en el tratamiento del cáncer, su actividad antitumoral resulta limitada, debido a su toxicidad no específica hacia las células normales. Además, los , compuestos como el paclitaxel y el docetaxel en sí mismos, no son suficientemente potentes como para ser utilizados en los conjugados de los agentes de unión a las células, tales como los anticuerpos anti-CD20 y los fragmentos de éstos de la presente invención. Los taxanos adecuados para su uso en la presente invención se describen en las patentes US No.: 6.372.738 y 6.340.701. Los conjugados de los taxanos y un agente de unión a las célula de la invención se pueden obtener utilizando técnicas actualmente conocidas o que se desarrollen más adelante. Numerosos métodos de conjugación se enseñan en las Patentes US 5.416.064 y US 5.475.092. Los taxanos también se enseñan en los documentos 7.598.290, 20090099336, 20070031402, 20060233814, 2006023381 1 , 20050123549, 20050085513 y20040039176, todos los cuales se incorporan al presente documento, como referencia, en su totalidad.
También son drogas citotóxicas preferidas para su utilización en la presente invención el CC-1065 y sus análogos. El CC-1065 y sus análogos se describen en las Patentes U.S. No.: N° 6,372,738, 6,340,701 , 5,846,545 y 5,585,499. El CC-1065 es un potente antibiótico anti-tumoral aislado del caldo de cultivo de Streptomyces zelensis.
El CC-1065 es aproximadamente 1000 veces más potente in vitro, que las drogas anticáncer utilizadas comúnmente, tales como la doxorrubicina, el metotrexato y la vincristina (BK Bhuyan y col., Cáncer Res., 42, 3532 3.537 (1982)).
Las duocarmicinas son drogas citotoxicas bien adecuadas para su uso en la presente invención y se exponen a continuación y en el arte, por ejemplo, en las Patentes U.S. No.: Ser. N° 6.281.354, 6.066.742, 5.703.080, 4.994.578, 4.923.990. Todos estos documentos se incorporan al presente, en su totalidad, para referencia.
Las enedi'inas, tales como las caliqueamicinas, son drogas citotoxicas adecuadas para su uso en la presente invención y se exponen a continuación y en el arte, por ejemplo, en las Patentes U S No.: Ser. N 0 5.436.361 , 5.053.394, y 20090105461 . Cada referencia es incorporada al presente documento, como referencia, en su totalidad.
Las dolastinas y los análogos de dolastina, incluyendo las auristatinas, son drogas citotoxicas adecuadas para su uso en la presente invención y se exponen a continuación y en el arte, por ejemplo, en las Patentes US Ser. Nos. Nos. 7,084,1 10; 6,737,409; 6,686,445; 6,632,795; 6,458,765; 6,323,315; 6,248,865; 6,239,104; 6,143,721 ; 6,103,698; 6,034,065; 5,985,837; 5,965,537; 5,886,147; 5,554,725; 5,138,036; 5,076,973; 4,986,988; 4,978,744 y 4,879,278.. Cada referencia es incorporada al presente documento, como referencia, en su totalidad.
Los derivados de tomaimicina son drogas citotoxicas adecuadas para su uso en la presente invención y se exponen a continuación y en el arte, por ejemplo, en la Patente U.S. No.: Ser. N ° 4.427.588, Arima y col. "J. Antibiotics", vol. 25, N 0 8, pp 437-444, (1972); Kariyone y col., "Chem Pharm Bull.", Vol. 19, N 0 1 1 , pp 2289-2293, (1971 ); Leimgruber y col., "J. Am. Chem. Soc", vol. 90, pp. 5641 -5643, (1968). Cada referencia es incorporada al presente documento, como referencia, en su totalidad. [352] Los derivados de leptomicina son drogas citotoxicas adecuadas para su uso en la presente invención y se exponen a continuación y en el arte, por ejemplo, en la Patente U.S. No.: Ser. N ° 7.446.196; Kudo y col. Experimental Cell Research, 1998, 242 (2), 54-546;. Kuhnt y col., Applied Environmental Microbiology, 1998, 64(2), 714-720; Solicitud de Patente U.S. No. 10/856,703; Cari y col., J. Med. Chem. 1981 , 24 (3), 479-480, "A Novel Connector Linkage Applicable in Prodrug Design"; Chemical Abstráete No. 105:102629 (resumen de JP 61 -109717 A2 (1986)); Doherty y col., J. Nat. Cáncer Inst. 2003, 95(24), 1859-1868, "Cell Cycle Checkpoint Function in Bladder Cáncer"; Fukuda y col., Nature 1997, 390, 308-31 1 , "CHM1 is responsible for intracellular transpon mediated by the nuclear export signaf; Hamamoto y col., J. Antibiotics 1983, 36 (6), 639-645, " Leptomycins A and B, New Antifungal Antibiotics I. Taxonomy of the Producing Strain and Their Fermentation, Puril ¡catión and Characterization"; Hayakawa y col., J. Antibiotics 1987, 40 (9), 1349-1352, "New Antitumor Antibiotics, Anguinomycins A and B'; Inoue y col., J. Biol. Chem. 2002, 277 (17), 15053-15060, "Nuclear Import and Export Signáis in Control of the p53-related Protein p73'; Kobayashi y col., Ensho, Saisei 2004, 24(5), 578-583, "Role of matrix metalloproteinase-9 expression on cutaneous inflammation: possible treatment by leptomyein B application" (resumen); Komiyama y col., J. Antibiotics 1985, 38 (2), 220-223, "Structural Study of a New Antitumor Antibiotic, Kazusamycin"; Komiyama y col., J. Antibiotics 1985, 38 (2), 224-229, "Antitumor Activity of a New Antibiotic, Kazusamycin"; Komiyama y col., J. Antibiotics 1985, 38 (3), 427-429, "Antitumor activity of leptomyein 8"; Kudo y col., Exp. Cell Res. 1998, 242, 540-547, "Lepto-mycin B Inhibition of Signal Mediated Nuclear Export by Direct Binding to CRM1"; Kudo y col., Proc. Nat'l Acad. Sci. (USA) 1999, 96 (3), 91 12-91 17, "Leptomyein B inactivates CRM1/exportin 1 by covalent modification at a cysteine residue in the central conserved región"; Kuhnt y col., Applied Environ. icrobiol. 1998, 64 (2), 714-720, "Microbial Conversión Products of Leptomyein B"; Lañe y col., Proc. Nat'l Acad. Sci. (USA) 2000, 97, 8501 -8506, "Activation of p53 in cervical carcinoma cells by small molecules"; arabese y col., Nucleic Acids Res. 2003 31 (22), 6624-6632, "DNA damage induces transcriptional activation of p73 by removing C-EBPa repression on ,E2F1" Meissner y col., FEBS Letters 2004, 576(1 -2), 27-30, "Ratjadone and leptomycin B block CRM1-dependent nuclear export by idéntica! mechanisms" (resumen); Nishi y col., J. Biol. Chem. 1994, 269 (9), 6320-6324, "Leptomycin B Targets a Regulatory Cascade of crml, a Fission Yeast Nuclear Protein, Involved in Control of Higher Order Chromosome Structure and Gene Expression"; Peehl y col., Prostate 2003, 54, 258-267, "Leptomycin B Stabilizes and Activates p53 in Primary Prostatic Epithelial Cells and Induces Apoptosis in the LNCaP Cell Line"; y University of Dundee, Dept. Surgery & Molecular Oncology, Lain Group Website, http://www.dundee.ac.uk/surgery/Non-Genotoxic.htm, consultado Dic. 6, 2004, "Non-genotoxic activation of the p53 tumor suppressor function". Cada referencia se incorpora a la presente, como referencia, en su totalidad.
En otro aspecto de la invención, en lugar de drogas, moléculas de siRNA pueden estar conectadas con los anticuerpos de la invención. Los siRNAs pueden ser enlazados a los anticuerpos de la presente invención mediante los métodos comúnmente utilizados para la modificación de oligonucleótidos (véase, por ejemplo, las Publicaciones de Solicitudes de Patentes No.: 20050107325 y 20070213292). Así, el siRNA en su forma de 3? 5'-fosforomidita se puede hacer reaccionar con un extremo de un reticulante que i soporte una funcionalidad hidroxilo, para obtener un enlace éster entre el siRNA y el reticulante. Del mismo modo, la reacción de la fosforamidita siRNA con un reticulante que soporte un grupo amino terminal resulta en la conexión del reticulante al siRNA a través de una amina. Por otra parte, el siRNA puede ser derivatizado mediante métodos químicos para introducir a un grupo tiol estándar. Este SiRNA que contiene tiol se puede hacer reaccionar con un anticuerpo, el cual fue modificado para introducir un disulfuro activo o una porción maleimida, para producir un conjugado escindible o no escindióle. Mediante este método, entre 1 a 20 moléculas de siRNA pueden ser enlazadas.
Aplicaciones de diagnóstico e investigación Además de los usos terapéuticos de los anticuerpos discutidos en el presente documento, los anticuerpos y/o fragmentos de la presente invención pueden ser empleados en muchas aplicaciones de diagnóstico e investigación conocidas. Los anticuerpos y/o fragmentos de la presente invención pueden utilizarse, por ejemplo, en la purificación, detección y focalización del CD20, incluyendo tanto los métodos de diagnóstico in vitro como los in vivo. Por ejemplo, los anticuerpos y/o fragmentos se pueden utilizar en inmunoensayos para la medición cualitativa y cuantitativa de los niveles de CD20 expresados por células en muestras biológicas. Véase, por ejemplo, Harlow y col., Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988), incorporado al presente documento, para referencia, en su totalidad.
Los anticuerpos de la invención se puede utilizar en, por ejemplo, ensayos de unión competitiva, ensayos sándwich directos e indirectos y ensayos de inmunoprecipitación (Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.147-158 ' (CRC Press, Inc., 1987)).
Por ejemplo, la presente invención proporciona también los péptidos y los anticuerpos anti-CD20 arriba mencionados, marcados para su detección, tal como se describe a continuación, para su utilización en métodos de diagnóstico para la detección de CD20 en pacientes que se sabe o se sospecha que tengan una enfermedad mediada por CD20. Los péptidos y/o los anticuerpos anti-CD20 de la presente invención son útiles para inmunoensayos, para detectar o cuantificar al CD20 o los anticuerpos anti-CD20, en una muestra. Un inmunoensayo para CD20 abarca típicamente incubar una muestra biológica en presencia de un péptido y/o un anticuerpo anti-CD20 de alta afinidad de la presente invención marcado para su detección, capaz de unirse selectivamente a CD20, y detectar el péptido o anticuerpo marcado que se une a una muestra. Varios procedimientos de ensayos clínicos son bien conocidos en el arte, por ejemplo, como se describe en "Immunoassays for the 80's", A. Voller y col., eds., University Park, 1981 . Por lo tanto, un péptido anti-CD20 o un anticuerpo o un fragmento del mismo pueden ser agregados a nitrocelulosa, o a cualquier otro soporte sólido que sea capaz de inmovilizar las células, las partículas de células o las proteínas solubles. El soporte puede ser lavado con amortiguadores adecuados, seguido de un tratamiento con el péptido, anticuerpo o fragmento CD20, marcado para su detección. El soporte de la fase sólida puede ser lavado una segunda vez con el amortiguador para remover al péptido, al anticuerpo o al fragmento no unido. La cantidad de marcación unida puede ser entonces detectada en el soporte sólido mediante etapas de métodos conocidos.
Por "soporte de la fase sólida" o "vehículo" se entiende cualquier soporte capaz de unirse al péptido, antígeno, anticuerpo o fragmento del mismo. Entre los soportes o vehículos bien conocidos se incluyen al vidrio, al poliestireno, al polipropileno, al polietileno, al dextrano, al nylon, las amilasas, las celulosas naturales y modificadas, las poliacrilamidas, las agarosas y la magnetita. A los efectos de la presente invención, la naturaleza del vehículo puede ser, en cierta medida, soluble o insoluble. El soporte puede tener virtualmente cualquier configuración estructural posible, siempre y cuando la molécula unida sea capaz de unirse a CD20, a un anticuerpo anti-CD20 o a un fragmento del mismo. Así, la configuración del soporte puede ser esférica, tal como en una perla, o cilindrica, tal como en la superficie interior de un tubo de ensayo o la superficie externa de una varilla. De manera alternativa, la superficie puede ser plana, tal como una hoja, una placa de cultivo, una tira para ensayos, etc. Los soportes preferidos incluyen las perlas de poliestireno. Los expertos en la materia conocerán muchos otros vehículos adecuados para la unión al anticuerpo o fragmento del mismo, al péptido o al antígeno, o podrán determinarlos mediante experimentación de rutina.
Etapas de métodos conocidos pueden ser utilizadas para determinar la actividad de unión de un determinado lote del péptido y/o del anticuerpo ant CD20 o fragmento del mismo. Los expertos en la materia pueden determinar las condiciones óptimas operativas y de ensayo mediante experimentación de rutina.
La marcación para su detección de un péptido y/o un anticuerpo específicos de CD20 o un fragmento del mismo, se puede lograr mediante el enlace a una enzima, para utilizarlos en un inmunoensayo enzimático (EIA (por sus siglas en Idioma Inglés)), o un ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA). La enzima enlazada reacciona con el sustrato expuesto para generar una porción química que se pueda detectar, por ejemplo, mediante medios espectrofotométricos, fluorométricos o visuales. Las enzimas que pueden ser utilizadas para la marcación para su detección de los anticuerpos específicos CD20 o los fragmentos del mismo de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, la malato de deshidrogenasa, la nucleasa de estafilococos, la isomerasa delta-5-ésteroide, la alcohol deshidrogenasa de levadura, la alfa-glicerofosfato deshidrogenasa, la triosa fosfato isomerasa, la peroxidasa de rábano, la fosfatasa alcalina, la asparaginasa, la glucosa oxidasa, la beta-galactosidasa, la ribonucleasa, la ureasa, la catalasa, la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, la glucoamilasa y la acetilcolinesterása.
Mediante la marcación radiactiva de los anticuerpos específicos CD20 y/o los fragmentos del mismo, se puede detectar CD20 a través de la utilización de radio-inmunoensayo (RIA, [por sus siglas en Idioma Inglés) (véase, por ejemplo, Work", y col., Laboratory Techniques and Biochemistry ín Molecular Biology, North Holland Publishing Company, ?.?. (1978)). Los isótopos radiactivos se pueden detectar por medios tales como el uso de un contador gamma, un contador de centelleo o mediante autorradiografía. Los isótopos que son particularmente útiles para los fines de la presente invención son: 3H, 125l, 131l, 35S, 14C, y, preferentemente, 125l.
También es posible marcar a los anticuerpos específicos CD20 y/o a los fragmentos de los mismos, con un compuesto fluorescente. Cuando el anticuerpo marcado por fluorescencia está expuesto a luz de una longitud de onda adecuada, su presencia se puede detectar debido a su fluorescencia. Entre los compuestos para la marcación fluorescente mas utilizados se encuentran el isotiocianato de fluoresceína, la rodamina, la ficoeritrina, la ficocianina, la aloficocianina, el o-ftaldehído y la fluorescamina.
Los anticuerpos específicos CD20 o los fragmentos de los mismos, también pueden ser marcados para su detección utilizando metales que emiten fluorescencia, tales como 125Eu, u otros de la serie de los lantánidos. Estos metales pueden ser unidos al anticuerpo CD20 específico o al fragmento del mismo, utilizando grupos quelantes metálicos tales como el ácido dietilentriaminapentaacético (DTPA, (por sus siglas en Idioma Inglés)) o el ácido etilendiaminotetraacético (EDTA).
Los anticuerpos específicos CD20 o los fragmentos de los mismos también pueden ser marcados para su detección por medio del acoplamiento a un compuesto quimioluminiscente. La presencia del anticuerpo quimioluminiscente marcado se determina mediante la detección de la presencia de la luminiscencia que surge durante el curso de una reacción química. Ejemplos de compuestos para la marcación por quimioluminiscencia particularmente útiles son el luminol, el isoluminol, el éster de acridina teromática, el ¡midazol, la sal de acridinio y el éster de oxalato. Del mismo modo, un compuesto bioluminiscente se puede utilizar para etiquetar los anticuerpos CD20 específicos, fragmentos o derivados de la presente invención. La bioluminiscencia es un tipo de quimioluminiscencia que se encuentran en los sistemas biológicos en los que una proteína catalítica aumenta la eficiencia de la reacción de la quimioluminiscencia. La presencia de una proteína biqluminiscente se determina mediante la detección de la presencia de la luminiscencia. Los compuestos para la marcación bioluminiscente importantes son la luciferina, la luciferasa y el aecuorin.
La detección del anticuerpo específico CD20, fragmento o derivado del mismo se puede lograr mediante un contador de centelleo, por ejemplo, si la marcación detectable es un emisor radiactivo gamma, o mediante un fluorómetro, por ejemplo, si la marcación es un material fluorescente. En el caso de una marcación enzimática, la detección se puede obtener mediante métodos colorimétricos que empleen un sustrato para la enzima. La detección también se puede llevar a cabo mediante la comparación visual de la extensión de la reacción enzimática de un sustrato en comparación con estándares preparados de manera similar.
A los fines de la presente invención, el CD20 que es detectado mediante los ensayos anteriores, puede estar presente en una muestra biológica. Cualquier muestra que contenga CD20 puede ser utilizada. Preferiblemente, la muestra es un fluido biológico, como, por ejemplo, sangre, suero, linfa, orina, exudado inflamatorio, líquido cerebroespinal, fluido amniótico, extracto de tejido u homogenato, y los similares. Sin embargo, la invención no se limita a los ensayos utilizando sólo estas muestras, siendo posible que un experto en la materia determine las condiciones adecuadas que permitan el uso de otras muestras.
La detección in situ se puede lograr retirando una muestra histológica de un paciente y proporcionando la combinación de anticuerpos marcados de la presente invención a dicha muestra. El anticuerpo o fragmento del mismo se proporciona, preferiblemente, mediante la aplicación o mediante la superposición de los anticuerpos o fragmentos marcados del mismo, a una muestra biológica. A través del uso de dicho procedimiento, es posible determinar no sólo la presencia de CD20, sino también la distribución de CD20 en los tejidos examinados. Utilizando la presente invención, los expertos en la técnica percibirán fácilmente que cualquiera de una amplia variedad de métodos histológicos (tales como los procedimientos de tinción) pueden ser modificados con el fin de alcanzar dicha detección in situ.
El anticuerpo o fragmento del mismo de la presente invención puede ser adaptado para su utilización en un ensayo inmunométrico, también conocido como de "dos sitios" o ensayo de "sandwich". En un ensayo inmunométrico típico, una cantidad de anticuerpos o fragmentos del mismo sin marcar se unen a un soporte sólido ¡nsoluble en el líquido a ser ensayado y se le agrega una cantidad detectable de anticuerpos marcados solubles, de manera de permitir la detección y/o cuantificación del complejo ternario formado entre el anticuerpo - fase sólida, antígenos y anticuerpo marcado.
Típicamente, y de preferencia, los ensayos inmunométricos incluyen los ensayos "hacia adelante" en los cuales el anticuerpo, unido a la fase sólida, se contacta primero con la muestra a analizar, para extraer el CD20 de la muestra mediante la formación de un complejo de anticuerpo CD20 de fase sólida binario. Después de un período de incubación adecuado, el soporte sólido se lava para eliminar el residuo de la muestra de líquido, incluyendo el CD20 que no ha reaccionado, si hubiese alguno, y se pone luego en contacto con una solución que contiene una cantidad conocida de anticuerpo marcado (que funciona como una "molécula reportera") . Después de un segundo período de incubación para permitir que el anticuerpo marcado forme complejos con el CD20 unido al soporte sólido a través de los anticuerpos o fragmentos del mismo sin marcar, el soporte sólido se lava por segunda vez para eliminar el anticuerpo marcado, o fragmento del mismo, que no reaccionó. Este tipo de ensayo sándwich hacia adelante puede ser un ensayo simple "sí /no" para determinar si el CD20 se encuentra presente, o puede llevarse a cabo de manera cuantitativa mediante la comparación de la medida del anticuerpo o fragmento marcado, respecto de la medida obtenida para una muestra estándar conteniendo cantidades conocidas de CD20. Estos ensayos de "dos sitios" o "sándwich" se describen en Wide (Radioimmune Assay Method, Kirkham, ed., Livingstone, Edinburgh, 1970, pp. 199-206).
Otros tipos de ensayos "sandwich", que también pueden ser útiles con CD20, son los ensayos así llamados "simultáneos" y "reversos". Un ensayo simultáneo involucra una única etapa de incubación, en donde el anticuerpo unido al soporte sólido y el anticuerpo marcado son ambos agregados al mismo tiempo a la muestra bajo análisis. Una vez completada la incubación, el soporte sólido se lava, para eliminar el residuo y el anticuerpo marcado sin formar complejos de la muestra de fluido. La presencia del anticuerpo marcado asociado con el soporte sólido se determina como si estuviera en un ensayo convencional sandwich "hacia adelante".
En el ensayo "reverso", primero se le agrega a la muestra de fluido, de a poco, una solución de anticuerpo marcado, seguido de la adición de anticuerpos sin marcar, unidos a un soporte sólido, luego de un período de incubación adecuado. Luego de una segunda incubación, la fase sólida se lava en forma convencional, para liberarla de los residuos de la muestra a analizar y de la solución de los anticuerpos marcados sin reaccionar. La determinación de anticuerpos marcados asociados a un soporte sólido se determina entonces como en los ensayos "simultáneos" y "hacia adelante". En un aspecto, se puede utilizar una combinación de anticuerpos de la presente invención, específicos para epitopes separados, para construir un ensayo sensible inmunoradiométrico de tres sitios.
Los anticuerpos o fragmentos de los mismos de la invención son también útiles para imágenes in vivo, en donde un anticuerpo o un fragmento del mismo marcado con una porción detectable, tal como un agente radio-opaco o un radioisótopo, se administra a un sujeto, de preferencia en la circulación sanguínea y se analiza la presencia y la ubicación del anticuerpo marcado en el huésped. Esta técnica de imágenes es útil para la estadificación y el tratamiento de enfermedades malignas. El anticuerpo o el fragmento del mismo puede ser marcado con cualquier porción que sea detectable en un huésped, ya sea por resonancia magnética nuclear, radiología, o mediante otros métodos de detección conocidos en la materia.
La marcación puéde ser cualquier porción detectable que sea capaz de producir, ya sea directa o indirectamente, una señal detectable. Por ejemplo, la marcación puede ser una marcación con biotina, un marcación con enzima (por ejemplo, luciferasa, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa y peroxidasa de rábano picante), un marcador radiactivo (por ejemplo, 3H, 1 C, 32P, 35S y 125l), un fluoróforo tal como un compuesto fluorescente o quimioluminiscente (por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína, rodamina), un agente de imágenes (por ejemplo, Tc-M99 y el indio (11 1ln)) y un ion metálico (por ejemplo, el galio y el europio).
Se puede emplear cualquier método conocido en el arte para conjugar el anticuerpo o el fragmento del mismo a la marcación, incluyendo, a modo de ejemplo, los métodos descriptos por Hunter y col., 1962, Nature 144:945; David y col., 1974, Biochemistry 13:1014; Pain y col., 1981 , J. Immunol. Meth. 40:219; Nygren, J., 1982, Histochem. and Cytochem. 30:407.
Los anticuerpos o fragmentos de los mismos de la invención son también útiles como reactivos en la investigación biológica, sobre la base de su inhibición de la función de CD20 en las células.
Los anticuerpos o fragmentos de los mismos de la invención son útiles como agentes de purificación por afinidad. En este proceso, los anticuerpos, por ejemplo, se inmovilizan en un soporte adecuado, tal como una resina Sephadex o un filtro de papel, usando métodos bien conocidos en el arte. Así, el CD20 puede ser aislado y purificado de una muestra biológica.
La presente invención proporciona además polinucleotidos que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo o un fragmento del mismo de la invención o los fragmentos de unión al epítope del mismo.
La presente invención también abarca a los polinucleotidos que codifican a un polipéptido que puede unirse al CD20 y que hibridiza bajo condiciones, estrictas de hibridación de polinucleotidos que codifican un anticuerpo o un fragmento del mismo de la invención, en donde dichas condiciones estrictas de hibridación son: pre-hibridación durante 2 horas a 60 °C en 6x SSC, SDS 0,5 %, 5x de una solución de Denhardt y 100 µg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado por calor; hibridación durante 18 horas a 60° C, lavado dos veces en 4 x SSC, SDS 0,5 %, pirofosfato de sodio 0,1 %, durante 30 min a 60 ° C y dos veces en 2x SSC, 0,1 % de SDS durante 30 min a 60° C.
Los polinucleotidos se pueden obtener, y la secuencia de nucleótidos de los polinucleotidos se puede determinar, por cualquier método conocido en el arte. Por ejemplo, utilizando la secuencia de nucleótidos del anticuerpo o fragmento del mismo establecidos en el presente documento, un polinucleótido que codifica al anticuerpo puede ser ensamblado a partir de la síntesis química de oligonucleótidos (por ejemplo, como se describe en Kutmeier y col., 1994, BioTechniques 17:242), que, en pocas palabras , implica la síntesis por superposición de oligonucleótidos que contienen porciones de la secuencia que codifica el anticuerpo, el templado y la ligadura de aquellos oligonucleótidos y luego la amplificación de los oligonucleótidos ligados mediante PCR.
Los métodos para la construcción de vectores recombinantes que contienen anticuerpos anti-CD20 o las secuencias que codifican al fragmento y las señales de control de la transcripción y la traducción adecuadas son bien conocidos en el arte. Estos métodos incluyen, por ejemplo, las técnicas de ADN recombinante in vitro, las técnicas de síntesis, así como la recombinación genética in vivo. La invención, por lo tanto, proporciona los vectores replicables que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica una molécula de anticuerpo de la invención, o una cadena pesada o liviana del mismo, o un dominio variable de cadena pesada o liviana, o un fragmento de unión al epítope de cualquiera de estos, operativamente vinculados a un promotor.
Para producir un anticuerpo de la invención, el vector recombinante se transfiere a una célula huésped mediante técnicas convencionales y las células transfectadas son entonces cultivadas mediante técnicas convencionales. Así, la invención incluye las células huésped que contienen un polinucleótido que codifica a un anticuerpo de la invención o a un fragmento de unión al epítope del mismo, unido operativamente a un promotor heterólogo. En aspectos preferidos, los vectores que codifican tanto las cadenas pesadas como las cadenas livianas, pueden ser coexpresadas en la célula huésped, para la expresión de una molécula de inmunoglobulina completa.
Una variedad de sistemas de expresión huésped -vector pueden ser utilizados para expresar las moléculas de anticuerpo anti-CD20 o fragmento de la invención. Estos sistemas de expresión del huésped representan los vehículos mediante los cuales las secuencias codificantes de interés pueden ser producidas y posteriormente purificadas, y además representan las células que pueden, cuando se transforman o transfectan con las secuencias de nucleótidos codificantes adecuadas, expresar una molécula de anticuerpo de la invención in situ. Estos incluyen, pero no están limitados por, los microorganismos tales como las bacterias (por ejemplo, E. coli, B. subtilis) transformadas con un ADN recombinante de bacteriófago, los vectores de expresión de ADN cósmido o plásmido, que contienen secuencias que codifican al anticuerpo, las levaduras (por ejemplo, Saccharomyces, Pichia) transformadas con vectores de expresión de levaduras recombinante que contienen secuencias que codifican anticuerpos, sistemas de células de insectos infectadas con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, baculovirus) que contienen secuencias que codifican a los anticuerpos, sistemas celulares de las plantas infectadas con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, el virus mosaico de la coliflor, CaMV, el virus mosaico del tabaco, TMV) o transformadas con vectores de expresión de plásmidos recombinantes (por ejemplo, el plásmido Ti) que contengan secuencias que codifiquen a los anticuerpos o los sistemas de célula de mamíferos (por ejemplo, las células COS, CHO, BHK, 293, 3T3) que alberga los constructos de expresión recombinantes que contiene promotores derivados del genoma de células de mamíferos (por ejemplo, el promotor de la metalotioneína) o de los virus de mamíferos (por ejemplo, el promotor del adenovirus tardío, el promotor del virus vaccinia 7.5K).
Para la expresión de moléculas de anticuerpo recombinantes, de preferencia, se utilizan células: bacterianas tales como la Escherichia coli, y más preferiblemente, las células eucariotas, especialmente para la expresión de la molécula completa del anticuerpo recombinante. Por ejemplo, las células de mamíferos, tales como las células de ovario de hámster chino (CHO), junto con un vector tal como el elemento del promotor del gen intermedio- temprano mayor del citomegalovirus humano, es un sistema efectivo para la expresión de anticuerpos (Foecking y col., 1986, Gene 45.: 101 ; Cockett y col., 1990, Bio / Technology 8: 2).
Para la producción de proteínas recombinantes, durante largo plazo, con alto rendimiento, se prefiere una expresión estable. Por ejemplo, líneas celulares que expresan de manera estable la molécula del anticuerpo pueden ser obtenidas mediante ingeniería. En lugar de usar vectores de expresión que contienen orígenes virales de replicación, las células huésped se pueden transformar con ADN controlado por elementos para el control de la expresión apropiados (por ejemplo, el promotor, el potenciador, las secuencias, terminadores de transcripción, los sitios de poliadenilación, etc) y un marcador de selección. Tras la introducción del ADN foráneo, se puede permitir a las células realizadas por ingeniería crecer durante 1 -2 días en un medio enriquecido, para luego cambiarlas a un medio selectivo. El marcador de selección en el plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permite a las células integrar al plásmido de manera estable en sus cromosomas y crecer para formar focos, que a su vez pueden ser clonadas y expandidas a líneas celulares. Este método puede ser ventajosamente utilizado para diseñar líneas celulares que expresen a la molécula del anticuerpo. Estas líneas celulares de ingeniería pueden ser particularmente útiles en la detección y evaluación de compuestos que interactúen, directa o indirectamente, con la molécula del anticuerpo.
Una vez que una molécula del anticuerpo de la invención ha sido expresada en forma recombinante, puede ser purificada por cualquier método conocido en la técnica para la purificación de moléculas de inmunoglobulinas, por ejemplo, mediante cromatografía (por ejemplo), de intercambio iónico, de afinidad, particularmente por afinidad por el antígeno específico después de la proteína A y cromatografía de columna de exclusión por tamaño), la centrifugación, la solubilidad diferencial, o por cualquier otra técnica estándar para la purificación de proteínas. En este sentido, la Patente U.S No.: 7.538.195 ha sido mencionada en la presente descripción, las enseñanzas de la cual, se incorpora en su totalidad a la presente como referencia.
En otro aspecto, los anticuerpos y diversos fragmentos de anticuerpos, así como las mímicas de anticuerpos pueden ser fácilmente producidas mediante mutación, eliminación y/o inserción dentro de las secuencias de las regiones variables y constantes que flanquean un conjunto particular de CDRs, utilizando los métodos descritos en el presente documento o conocidos en el arte. Así, por ejemplo clases diferentes de anticuerpos son posibles para un conjunto dado de CDRs, mediante la sustitución de las diferentes cadenas pesadas, donde, por ejemplo, se pueden producir los anticuerpos y los isotipos tipo lgG1 -4, IgM, lgA1 -2, IgD e IgE. De manera similar, los anticuerpos artificiales en el ámbito de la invención pueden ser producidos mediante la incorporación de un conjunto de CDRs determinado en un marco totalmente sintético. La expresión "variable" se utiliza en el presente documento para describir ciertas partes de los dominios variables que difieren en la secuencia entre los anticuerpos, y que se utilizan en la especificidad y en la unión de cada anticuerpo en particular con su antígeno. Sin embargo, la variabilidad no suele estar uniformemente distribuida a través de los dominios variables de los anticuerpos. Normalmente se concentra en tres segmentos llamados regiones determinantes de la complementariedad (CDR) o regiones hipervariables, tanto en los dominios variables de la cadena liviana como en los dominios de la cadena pesada. Las porciones más altamente conservadas de los dominios variables se denominan el marco (FR). Cada uno de los dominios variables de las cadenas pesadas y livianas comprende cuatro regiones marco, las cuales adoptan, en gran medida, una configuración hoja-beta, conectadas por tres CDRs, que forman lazos de conexión y, en algunos casos, forman parte de la estructura hoja-beta. Los CDR en cada cadena se mantienen unidos en las proximidades de las regiones FR y, con los CDRs de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión al antígeno de los anticuerpos (E. A. Kabat et al. Sequences oí Proteins of Immunological Intérest, fifth edition, 1991 , NIH). Los dominios constantes no están involucrados directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno, pero presentan diferentes funciones éfectoras, tales como la participación de los anticuerpos en la toxicidad celular dependiente de anticuerpos.
Los anticuerpos humanizados o los anticuerpos adaptados para el no rechazo por otros mamíferos, se pueden producir utilizando varias tecnologías, tales como el acondicionamiento de superficie y el injerto de CDR. En la tecnología de acondicionamiento de superficie, el modelado molecular, el análisis estadístico y la mutagénesis, se combinan para ajustar las superficies no CDR de las regiones variables que se asemejan a las superficies de los anticuerpos conocidos del huésped diana. Las estrategias y los métodos para el acondicionamiento de superficie de los anticuerpos, y otros métodos para reducir la inmunogenicidad de los anticuerpos en un huésped diferente, se describen en la Patente U.S. No.: 5.639.641 , la cual se incorpora a la presente, en su totalidad, como referencia. En la tecnología de injerto de CDR, CDRs de la cadena pesada y liviana de ratones se injertan en una secuencia marco totalmente humana. * La invención también incluye equivalentes funcionales de los anticuerpos descriptos en esta memoria descriptiva. Los equivalentes funcionales tienen características de unión que son comparables a las de los anticuerpos, e incluyen, por ejemplo, los anticuerpos quimerizados, humanizados y monocadena, así como los fragmentos de los mismos. Los métodos de producción de tales equivalentes funcionales se describen en la solicitud PCT WO 93/21319, la Solicitud de Patente Europea 239400, la solicitud PCT WO 89/09622, la solicitud de Patente Europea 338.745 y la solicitud de Patente Europea EP 332.424, las cuales se incorporan a la presente, en su totalidad, como referencia.
Los equivalentes funcionales incluyen a los polipéptidos con secuencias de aminoácidos sustancialmente iguales a las de la secuencia de aminoácidos de las regiones variables o hipervariables de los anticuerpos de la invención. "Sustancialmente igual" en relación a una secuencia de aminoácidos se define en el presente documento como una secuencia de, al menos, un 90 %, y, preferiblemente, por lo menos el 95 % de identidad de secuencia a otra secuencia de aminoácidos, según lo determinado por el método de búsqueda de FASTA, de conformidad con Pearson y Lipman, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85, 2444-2448 (1988).
Los anticuerpos quimerizados preferentemente tienen regiones constantes derivadas sustancialmente o exclusivamente de las regiones constantes de los anticuerpos humanos y las regiones variables se derivan sustancial o exclusivamente de la secuencia de la región variable de un mamífero que no sea un ser humano. Las formas humanizadas de los anticuerpos se realizan mediante la sustitución de las regiones determinantes de complementariedad de, por ejemplo, un anticuerpo de ratón, en un dominio marco humano, por ejemplo, véase la Solicitud PCT Pub. N ° W092/22653. Los anticuerpos humanizados preferentemente tienen regiones constantes y regiones variables distintas de las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) derivadas sustancialmente o exclusivamente de las regiones correspondientes de los anticuerpos humanos y CDR derivados sustancialmente o exclusivamente a partir de un mamífero que no sea un ser humano.
Los equivalentes funcionales incluyen también a los fragmentos de anticuerpos monocadena, también conocidos como anticuerpos de cadena simple (scFvs). Estos fragmentos contienen al menos un fragmento de una secuencia de aminoácido de la cadena pesada variable de anticuerpo (VH), atada al menos a un fragmento de una secuencia de la cadena liviana variable de un anticuerpo (VL) con o sin uno o más enlazadores de interconexión. Tal enlazador puede ser un péptido corto, flexible seleccionado para asegurar el correcto plegado tridimensional de los dominios (VL) y (VH) que se produce una vez que están unidos de manera de mantener la especificidad de unión del anticuerpo completo a la molécula diana del cual el fragmento de anticuerpo de cadena simple deriva. En general, el carboxilo terminal de la secuencia (VL) o (VH) puede estar covalentemente unido mediante dicho enlazador peptídico a la terminal de aminoácidos de una secuencia complementaria (VL) y (VH). Los fragmentos de anticuerpos monocadena pueden ser generados mediante clonación molecular, biblioteca de visualización de fagos de anticuerpos o las técnicas similares. Estas proteínas pueden ser producidas tanto en células eucariotas como en células procariotas, incluyendo las bacterias.
Los fragmentos de anticuerpo de cadena simple contienen secuencias de aminoácidos que tienen, por lo menos, una de las regiones variables o determinantes de la complementariedad (CDR) de los anticuerpos completos descritos en esta memoria descriptiva, pero carecen de algunos o de todos los dominios constantes de aquellos anticuerpos. Estos dominios constantes no son necesarios para la unión al antígeno, pero constituyen una parte importante de la estructura de los anticuerpos completos. Los fragmentos de anticuerpos monocadena, por lo tanto, pueden superar algunos de los problemas asociados con el uso de anticuerpos que contienen una parte o la totalidad del dominio constante. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo monocadena tienden a estar libres de las interacciones no deseadas con las moléculas biológicas y la región constante de la cadena pesada, o de otro tipo de actividad biológica no deseada. Además, los fragmentos de anticuerpos monocadena son considerablemente más pequeños que los anticuerpos completos y, por lo tanto, pueden tener una mayor permeabilidad capilar que los anticuerpos completos, permitiendo que los fragmentos de anticuerpo monocadena se localicen y enlacen con distintos sitios de unión del antígeno diana de manera más eficiente. Además, los fragmentos de anticuerpos se pueden producir en escala relativamente grande en células procariotas, facilitando así su producción. Además, el tamaño relativamente pequeño de los fragmentos de anticuerpos de monocadena los hace menos propensos que los anticuerpos completos a provocar una respuesta inmune en un receptor.
El conocimiento de las secuencias de aminoácidos y de los ácidos nucleicos para el anticuerpo anti-CD20 y sus variantes humanizadas, que se describen en el presente documento, puede ser utilizado para desarrollar otros anticuerpos que también se unan al CD20 humano. Varios estudios han examinado los efectos de la introducción de uno o más cambios de aminoácidos en varias posiciones en la secuencia de un anticuerpo, basados en el conocimiento de la secuencia del anticuerpo primario, en sus propiedades tales como la unión y el nivel de expresión (Yang, W. P. y col., 1995, J. Mol. Biol., 254, 392-403; Rader, C. y col., 1998, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 95, 8910-8915; Vaughan, T. J. y col., 1998, Nature Biotechnology, 16, 535-539).
En estos estudios, las variantes del anticuerpo primario han sido generadas cambiando las secuencias de los genes de las cadenas pesadas y livianas en las regiones CDR1 , CDR2, CDR3 o en las regiones marco, utilizando métodos tales como la mutagénesis sitio- dirigida mediada por oligonucleótidos, mutagénesis de cassette, PCR propenso a errores, transposición de ADN, o cepas mutantes de E. coli (Vaughan, T. J. y col., 1998, Nature Biotechnology, 16, 535-539; Adey, N. B. y col., 1996, Capítulo 16, pp. 277-291 , en "Phage Display of Peptides and Proteins", Eds. Kay, B. K. y col., Academic Press). Estos métodos para cambiar la secuencia del anticuerpo primario han dado como resultado anticuerpos secundarios con afinidades mejoradas (Gram, H. y col., 992, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89, 3576-3580; Boder, E. T. y col. 2000, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 97, 10701 -10705; Davies, J. and Riechmann, L, 1996, Immunotechnolgy, 2, 169-179; Thompson, J. y col., 1996, J. Mol. Biol., 256, 77-88; Short, M. K. y col., 2002, J. Biol.
Chem., 277, 16365-16370; Furukawa, K. y col., 2001 , J Biol. Chem., 276, 27622-27628).
En una estrategia similar dirigida para cambiar uno o más residuos de los aminoácidos del anticuerpo, las secuencias del anticuerpo descritas en esta invención pueden ser utilizadas para desarrollar anticuerpos anti-CD20 con funciones mejoradas, tales como mediante los métodos descritos en la publicación de la Solicitud de Patente 20090246195, cuyo contenido se incorpora en su totalidad a la presente como referencia.
Cualquier método conocido en el arte para conjugar el anticuerpo a la porción detectable puede ser empleado, incluyendo los métodos descriptos por Hunter y col., Nature 144:945 (1962); David, y col., Biochemistry 13:1014 (1974); Pain, y col., J. Immunol. Meth. 40:219 (1981 ) y Ñygren, J. Histochem. and Cytochem. 30:407 (1982).
Los anticuerpos de la presente invención pueden ser empleados en cualquier método de ensayo conocidos, tal como en los ensayos de unión competitiva, los ensayos sándwich directos e indirectos y los ensayos de inmunoprecipitación (Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.147-158 (CRC Press, Inc., 1987)).
Los anticuerpos de la invención son también útiles para obtener imágenes in vivo, en donde un anticuerpo marcado con una porción detectable, tal como un agente radio-opaco o un radioisótopo, se administra a un sujeto, de preferencia en la circulación sanguínea y se estudia la presencia y la localización del anticuerpo marcado en el huésped. Esta técnica de imagen es útil en la estadificación y tratamiento de enfermedades malignas. El anticuerpo se puede marcar con cualquier porción que sea detectable en un huésped, ya sea por resonancia magnética nuclear, radiología o mediante la detección utilizando otros medios conocidos en la materia.
Los anticuerpos de la invención son útiles como agentes de purificación por afinidad. En este proceso, los anticuerpos se inmovilizan en un soporte adecuado, tal como una resina Sephadex o un filtro de papel, usando métodos bien conocidos en el arte.
Aplicaciones Terapéuticas También incluidos en la presente invención están los métodos para inhibir el crecimiento de las células que expresan CD20. Estos métodos hacen uso de los anticuerpos, de los fragmentos o de los conjugados de la presente invención, así como de los anticuerpos o fragmentos o inmunoconjugados de la presente invención junto con uno o más agentes terapéuticos adicionales. Los agentes terapéuticos adecuados son aquellos que, directa o indirectamente, inhiben el crecimiento de una célula que expresa CD20.
Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "inhibir" e "inhibiendo" debe ser entendida para incluir cualquier efecto inhibidor sobre el crecimiento celular, incluyendo la muerte celular. Los efectos inhibitorios son efectos temporales, efectos sostenidos y efectos permanentes.
Las aplicaciones terapéuticas de la presente invención incluyen los métodos para tratar a un sujeto que padece una enfermedad. Las enfermedades tratadas con los métodos de la presente invención son las que se caracterizan por la expresión de CD20. Estas enfermedades incluyen los tumores malignos derivados de las células B, tales como el linfoma no Hodgkin, la leucemia linfocítica crónica de las células B, la leucemia linfoblástica aguda, así como los trastornos autoinmunes o inflamatorias no malignos, incluyendo la artritis reumatoide, en las que las células B positivas a CD20 juegan un papel en la fisiopatología de la enfermedad. El experto en la materia va a entender que los métodos de la presente invención también pueden usarse para tratar otras enfermedades que aún no se han descrito, pero que se caractericen por la expresión de CD20.
Las aplicaciones terapéuticas de la presente invención también puede ser practicadas in vitro y ex vivo.
Algunos ejemplos de los usos in vitro incluyen la purificación de las poblaciones de células contaminadas con células positivas a CD20, tales como las células de linaje de células B. El método comprende el cultivo de las poblaciones de células en presencia de un conjugado cítotóxico huCD20-7 y la eliminación de células muertas positivas a CD20. Las condiciones para el uso in vitro no-clínico son bien conocidas, (ver, por ejemplo Uckun y col., 1986, J Exp. Med. 163,347-368; Uckun y col., 1985, J. Immunol. 134, 3504-3515; Ramakrishnan y col., 1985, J. Immunol. 135, 3616-3622).
Los anticuerpos, fragmentos y regiones, los fragmentos, o los derivados de la presente invención, unidos a un soporte sólido, también se pueden utilizar para eliminar CD20 de los fluidos, tejidos o extractos de células. En un aspecto preferido, se utilizan para eliminar CD20 de la sangre y de los productos del plasma de la sangre. En otro aspecto preferido, los anticuerpos murinos y quiméricos, los fragmentos y las regiones, se emplean ventajosamente en dispositivos inmunoadsorbentes extracorpóreos, los cuales son conocidos en la materia (véase, por ejemplo, Seminars in Hematology, 26 (2 Suppl. 1 ) (1989)). La sangre del paciente u otros fluidos corporales se exponen al anticuerpo unido, lo que resulta en la remoción parcial o completa del CD20 circulante (complejos libres o complejos inmunes), tras lo cual el líquido se devuelve al cuerpo. Esta inmunoadsorción puede ser implementada en un arreglo de flujo continuo, con o sin la interposición de una etapa de centrifugación de las células. Véase, por ejemplo, Terman y col., J. Immunol. 1 1 7:1971 -1975 (1976).
La presente invención también incluye aplicaciones terapéuticas de los anticuerpos o conjugados de la presente invención, en donde los anticuerpos conjugados se pueden administrar a un sujeto, en una forma de dosificación farmacéuticamente aceptable. Pueden administrarse por vía intravenosa, en bolo o en infusión continua durante un período de tiempo, por vía intramuscular, subcutánea, intra-articular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica o por inhalación. También se pueden administrar por vía intratumoral, peritumoral, intralesional o perilesional, para ejercer tanto efectos terapéuticos locales como sistémicos.
Formulaciones Farmacéuticas Para aplicaciones terapéuticas, los anticuerpos o los conjugados de la invención se administran a un sujeto, en una forma de dosificación farmacéuticamente aceptable. Pueden administrarse por vía intravenosa como un bolo o mediante infusión continua durante un período de tiempo, por vía intramuscular, subcutánea, intra-articular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica o por inhalación. Los anticuerpos o conjugados también se pueden administrar por vía intratumoral, peritumoral, intralesional o perilesional, para ejercer efectos terapéuticos locales o sistémicos. Los vehículos, diluyentes y excipientes farmacéuticamente aceptables son bien conocidos y pueden ser determinados por los expertos de acuerdo con la situación clínica. Ejemplos de vehículos, diluyentes y/o excipientes adecuados son: (1 ) una solución salina amortiguadora de fosfatos de Dulbecco, pH de alrededor de 7,4, conteniendo alrededor de 1 mg/ml a 25 mg/ml de albúmina de suero hurtjiano, (2) solución salina al 0,9 % (0,9 % p/v de NaCI), (3) dextrosa al 5 % (p/v) y (4) sulfato de histidina 10 mM pH 5.8, sacarosa 6 %, polisorbato 20 al 0,02 %.
Cuando se presenta en una forma de dosificación acuosa, en lugar de ser liofilizado, el anticuerpo o conjugado típicamente se formulará en una concentración de alrededor de 0,1 mg/ml a 100 mg/ml, aunque una amplia variación fuera de este rango está permitida. Para el tratamiento de una enfermedad, la dosis adecuada de anticuerpo, de fragmento o de conjugado, dependerá del tipo de enfermedad a tratar, según lo definido arriba, de la gravedad y el curso de la enfermedad, de si los anticuerpos o conjugados son administrados con fines preventivos o con fines terapéuticos, del curso de la terapia anterior, de la historia clínica del paciente, de la respuesta al tratamiento y de la discreción del médico tratante. El anticuerpo, fragmento o conjugado es adecuadamente administrado al paciente de una vez o en una serie de tratamientos.
Según el tipo y la gravedad de la enfermedad, aproximadamente de 0,015 a 25 mg del anticuerpo o del conjugado por kg de peso del paciente, es candidato para la dosis inicial de administración al paciente, ya sea, por ejemplo, por una o más administraciones separadas, o mediante infusión continua. Para la administración repetida durante varios días o más, dependiendo de la condición, el tratamiento se repite hasta que una supresión deseada de los síntomas de la enfermedad se produce. Sin embargo, otros regímenes de dosificación pueden ser útiles y no se excluyen.
Para la administración pulmonar, de preferencia, por lo menos un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo conjugado o composición anti-CD20 se administra en un tamaño de partícula eficaz como para llegar a las vías respiratorias inferiores de los pulmones o a los senos paranasales. De acuerdo con la invención, por lo menos un anticuerpo, un fragmento o un conjugado anti-CD20 puede ser administrado por cualquiera de una variedad de los dispositivos de inhalación nasal conocidos en la técnica para la administración por inhalación de agentes terapéuticos. Estos dispositivos capaces de depositar formulaciones en aerosol en la cavidad sinusal o en los alvéolos de un paciente incluyen los inhaladores dosificadores, los nebulizadores, los generadores de polvos secos, los pulverizadores, etc. Otros dispositivos adecuados para dirigir la administración pulmonar o nasal de anticuerpos también se conocen en el arte. Todos estos dispositivos pueden utilizar formulaciones adecuadas para la administración en materia de dispensación de anticuerpos en un aerosol. Estos aerosoles pueden estar compuestos ya sea por soluciones (tanto acuosas y no acuosas) como por partículas sólidas. Los inhaladores dosificadores como el inhalador dosificador Ventolín™, suelen i utilizar un gas propulsor y requieren de la actuación durante la inspiración (Véase, por ejemplo, WO 94/16970, WO 98/35888). Los inhaladores de polvo seco tal como el Turbuhaler™ (Astra), Rotahaler™ (Glaxo), Diskus™ (Glaxo), inhalador Spiros™ (Dura), y los dispositivos comercializados por Inhale Therapeutics y el inhalador de polvos Spinhaler™ (Fisons), usan de la actuación-respiración de una mezcla de polvos (Patentes U.S. No. 4,668,218 Astra, EP 237507 Astra, WO 97/25086 Glaxo, WO 94/08552 Dura, U.S. Pat. No. 5,458,135 Inhale, WO 94/06498 Fisons, incorporadas a la presente, como referencia, en su totalidad). Los nebulizadores como AERxT Aradigin, el nebulizador UltraventTM (Mallinckrodt) y el nebulizador Acom HTM (Marquest Medical Products) (U.S. Pat. No. 5,404,871 Aradigm, WO 97/22376), incorporadas a la presente, como referencia, en su totalidad, producen aerosoles a partir de soluciones, etc. mientras que los inhaladores dosificadores y los inhaladores de polvo seco, generan pequeñas partículas de aerosoles. Estos ejemplos específicos de dispositivos de inhalación comercialmente disponibles están destinados a ser representativos de los dispositivos específicos adecuados para la práctica de esta invención pero no se pretende que sean limitantes del alcance de la invención. De preferencia, una composición que comprende, al menos, un anticuerpo un fragmento o un conjugado anti-CD20 es administrado mediante un inhalador de polvo seco o un rociador. Hay varias características deseables para un dispositivo de inhalación para la administración de, por lo menos, un anticuerpo de la invención. Por ejemplo, la administración mediante el dispositivo de inhalación es ventajosamente confiable, reproducible y precisa. El dispositivo de inhalación, opcionalmente, puede administrar pequeñas partículas secas, por ejemplo, menores que alrededor de 10 µ?t?, de preferencia alrededor de 1 - 5 µ?t?, para una buena respiración.
Para la absorción a través de las superficies mucosas, las composiciones y los métodos de administración de, por lo menos, un anticuerpo, un fragmento o un conjugado anti-CD20 incluyen una emulsión que comprende una pluralidad de partículas submicrónicas, una macromolécula muco adhesiva, un péptido biológicamente activo y una fase acuosa continua, que promueve la absorción a través de las superficies mucosas, logrando la mucoadhesión de las partículas de la emulsión (Patente US 5,514,670). Las superficies mucosas aptas para la aplicación de las emulsiones de la presente invención pueden incluir rutas de administración corneal, conjuntival, bucal, sublingual, nasal, vaginal, pulmonar, estomacal, intestinal y rectal. Las formulaciones para la administración vaginal o rectal, por ejemplo, supositorios, pueden contener excipientes como, por ejemplo, polialquilenglicoles, vaselina, manteca de cacao y los similares. Las formulaciones para la administración intranasal pueden ser sólidas y contienen, como excipientes, por ejemplo lactosa, o pueden ser gotas nasales de soluciones acuosas o aceitosas. Entre los excipientes de administración bucal se incluyen los azúcares, el estearato de calcio, el estearato de magnesio, el almidón pregelatinizado y los similares (Patente U.S. No. 5,849,695).
Para la administración transdérmica del, al menos, un anticuerpo o un conjugado anti-CD20, se encapsula en un dispositivo de suministro, tal como un liposoma o una nanopartícula polimérica, micropartícula, microcápsula o microesferas (a las que se refiere colectivamente como micropartículas a menos que se indique lo contrario). Un número de dispositivos adecuados son conocidos, como las micropartículas de polímeros sintéticos, tales como los ácidos polihidroxilados, como el ácido poliláctico, ácido poliglicólico y los copolímeros de los mismos, los poliortoésteres, los polianhídridos, los polifosfazenos y los polímeros naturales tales como el colágeno, los poliaminoácidos, la albúmina y otras proteínas, el alginato y otros polisacáridos y las combinaciones de los mismos (Patente U.S. No. 5,814,599).
Todas las publicaciones o patentes citadas en el presente documento están enteramente incorporadas en el presente documento como referencia y son una evidencia del estado de la técnica. Las publicaciones se refieren a las publicaciones científicas o patentes, o cualquier otra información disponible en cualquier formato, incluyendo todos los formatos de grabado, impresó o electrónico. Las siguientes referencias se encuentran incorporadas a la presente, como referencia, en su totalidad: Ausubel, y col., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, N.Y. (1987-2001 ); Sambrook, y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2da Edición, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Harlow and Lañe, antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Colligan, y col., eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., N.Y. (1994-2001 ); Colligan y col., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y., (1997-2001 ), en particular los contenidos relacionados con la preparación de anticuerpos, fragmentos, conjugados, agentes, composiciones anti-CD20, etc, tal como se describen en la presente. Es evidente para un experto en la materia que las distintas referencias a los anticuerpos y sus fragmentos tienen por objeto hacer referencia a, por ejemplo, los conjugados, sin apartarse del espíritu y alcance de la misma, Habiendo descrito en forma general la invención, la misma será entendida como referencia a determinados ejemplos específicos, los cuales se incluyen en el presente documento solamente con fines ilustrativos y no se pretende que sean limitantes, a menos que se especifique lo contrario.
EJEMPLOS Línea celular Origen Fuente Ramos Linfoma de Burkitt DSMZ (ACC 603) Raji Linfoma de Burkitt DSMZ (ACC 319) Daudi Linfoma de Burkitt DSMZ (ACC 78) BJAB B-NHL Un obsequio de Elliot Kieff (Harvard) WSU-DLCL-2 B-NHL, linfoma difuso de células B grandes DSMZ (ACC 575) RL B-NHL, linfoma difuso de células B grandes DSMZ (ACC 613) SU-DHL-4 B-NHL, linfoma difuso histiocítico DSMZ (ACC 495) DOHH-2 Linfoma de células B inmunoblástico DSMZ (ACC 47) refractario, linfoma folicular SC-1 B-NHL, linfoma folicular DSMZ (ACC 558) Jeko-1 B-NHL, linfoma de células del manto DSMZ (ACC 553) Granta-519 B-NHL, linfoma de células del manto DSMZ (ACC 342) JVM-13 B-CLL, leucemia linfbcítica crónica B DSMZ (ACC 19) Molt-4 T-ALL, leucemia linfóblástica T aguda DSMZ (ACC 362) A menos que se indique lo contrario, las líneas celulares se cultivaron en el medio adecuado, por ejemplo medio RPMI-1640 suplementado con suero fetal bovino al 10 %, glutamina 2 mM y de penicilina-estreptomicina al 1 % (todos los reactivos de Invitrogen) a 37°C en una incubadora humidificada con C02 al 5 %. Las células fueron pasadas mediante dilución a un medio fresco, dos veces por semana, y se mantuvieron entre 0,2 a 1 x 106 células/ml.
Ejemplo 1 Producción de anticuerpos murinos CD20 Se construyó un plásmido de expresión pSRa-CD20 que contenía la secuencia completa de codificación (CDS) del CD20, flanqueada por los sitios de restricción Xbal y BamHI, lo que permitió la expresión de CD20 humano (Gl 231 10989). Células 300-19, una línea de células pre-B derivadas de ratones Balb le (Reth y col., Nature, 317:353-355 (1985)), se transfectaron con el plásmido de expresión para expresar, de forma estable, niveles altos de CD20 humano en la superficie celular y se utilizaron para la inmunización de los ratones Balb le VAF. Los ratones fueron inmunizados por vía subcutánea con aproximadamente 5x106 células 300-19 que expresen CD20 por cada ratón, cada 2-3 semanas, utilizando protocolos de inmunización estándar conocidos por los expertos, por ejemplo, los utilizados por ImmunoGen, Inc. Los ratones inmunizados fueron reforzados con antígenos tres días antes de ser sacrificados para la generación de hibridomaó. El bazo de los ratones fue recolectado de acuerdo con los protocolos estándar para animales, como, por ejemplo, moliendo el tejido entre dos láminas de microscopio estériles y congeladas, para obtener una suspensión de células individuales en un medio RPMI-1640. Las células del bazo fueron centrifugadas, peleteadas, lavadas y fusionadas con un mieloma murino, como, por ejemplo, células P3X63Ag8.653 (Keamey y col., J. Immunol., 123:1548-1550 (1979)) utilizando polietilenglicol-1500 (Roche 783 641 ). Las células fusionadas se resuspendieron en un medio de selección RPMI-1640 conteniendo hipoxantina-aminopterina-timidina (HAT) (Sigma, H-0262) y se seleccionaron para el crecimiento en placas de cultivo de fondo plano de 96 pocilios (Corning-Costar 3596, 200 µ? de suspensión de células por pocilio) a 37° C con C02 al 5 %. Después de 5 días de incubación, se retiró de cada fuente 100 µ? del sobrenadante de cultivo y se remplazó con 100 µL· de medio RPMI-1640 conteniendo suplemento de hipoxantina-timidina (HT) (Sigma, H-0137). La incubación a 37° C con C02 al 5% se continuó hasta que los clones de hidridoma estuvieron listos para la detección de anticuerpos. Otras técnicas de inmunización y producción de hibridomas también se pueden utilizar, incluyendo aquellas descritas en Langone y col., (Eds., "Immunochemical Techniques, Part I", Methods in Enzymology, Academic Press, volumen 121 , Florida) y Harlow y col. ("Antibodies: A Laboratory Manual"; Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1988)).
Los sobrenadantes de cultivo de los hibridomas fueron seleccionados mediante citometría de flujo para la secreción de anticuerpos monoclonales de ratón que se unan a las células que expresan CD20, tales como las células 300-19 que expresan CD20, pero no a las células 300-19 no transfectadas. 100 µ? de los sobrenadantes de hibridoma se incubaron durante 3 horas, ya sea con las células 300-19 que expresan CD20 como con las células 300-19 no transfectadas (1 x105 células por muestra) en 100 µ?_ de amortiguador FACS (medio RPMI-1640 suplementado con suero normal de cabra al 2 %). Luego, las células se centrifugaron, se peletizaron, se lavaron y se incubaron durante 1 hora con 100 µ? de anticuerpo IgG anti-ratón de cabra conjugado con PE (por ejemplo, como el que se obtiene de, Laboratorio Jackson, 6 µ?/??? en amortiguador FACS). Las células fueron centrifugadas, peletizadas nuevamente, lavadas con amortiguador FACS y resuspendidas en 200 µL· de PBS conteniendo formaldehído al 1 %. Las células fueron adquiridas mediante un citómetro de flujo FACSCalibur con un recogedor de muestras multipocillo HTS o mediante un citómetro de flujo FACSarray y se analizaron utilizando CelIQuest Pro (todos de BD Biosciences, San Diego, US).
Los clones de hibridomas positivos se subclonaron mediante diluciones limitantes. Un subclon de cada hibridoma, el cual mostró por citometría de flujo la misma reactividad frente a CD20 que las células parentales, fue elegido para su posterior análisis. Los subclones estables fueron cultivados y el isotipo de cada anticuerpo anti-CD20 secretado se identificó utilizando reactivos comerciales para la identificación de isotipos (Roche 1493027).
Purificación de anticuerpos Los anticuerpos fueron purificados a partir de los sobrenadantes de subclonación de hibridomas, utilizando métodos estándar, como, por ejemplo, cromatografía de proteínas A o G (HiTrap Protein A o G HP, 1 mL, Amersham Biosciences). En pocas palabras, el sobrenadante se preparó para la cromatografía mediante la adición de 1 /10 volúmenes de amortiguador Tris/HCI 1 M, pH 8,0. El sobrenadante de pH-ajustado se filtró a través de una membrana de 0,22 µ?? de membrana de filtrado y se cargó en la columna equilibrada con amortiguador de unión (PBS, pH 7,3). La columna se lavó con amortiguador de unión hasta que se obtuvo una línea de base estable sin absorbancia a 280 nm. Los anticuerpos se eluyeron con amortiguador de ácido acético 0,1 M conteniendo NaCI 0,15 , pH 2,8, utilizando una tasa de caudal de 0,5 mlJmin. Se recogieron fracciones de aproximadamente 0,25 mi recogidas y se neutralizaron por la adición de 1/10 volúmenes de Tris/HCI 1 M, pH 8,0. La fracción máxima(s) fue dializada durante la noche dos veces contra 1 x PBS y se esterilizó por filtración a través de una membrana de 0,2 µ?? de filtro. Los anticuerpos purificados se cuantificaron por absorbancia a A280.
A continuación, las fracciones de proteína A purificadas fueron pulidas usando cromatografía de intercambio iónico (IEX) con cromatografía de sales de amonio cuaternario (Q), para anticuerpos murinos. Brevemente, las muestras de la purificación de la proteína A se intercambiaron en un amortiguador a un buffer de unión (10 mM Tris, 10 mM de cloruro de sodio, pH 8,0) y se filtraron a través de un filtro de 0,22 µ??. A continuación, la muestra preparada se cargó en una resina de flujo Q rápido (GE Lifesciences) que se equilibró con el buffer de unión, con un caudal de flujo de 120 cm/hr. El tamaño de la columna fue elegido para tener capacidad suficiente para unir a todos los Mab en la muestra. Luego, la columna se lavó con buffer de unión hasta que se obtuvo una línea base estable sin absorbancia a 280 nm. Los anticuerpos se eluyeron mediante el inicio de un gradiente desde 10 mM hasta 500 mM de cloruro de sodio en 20 volúmenes de columna (CV). Las fracciones de los picos fueron recolectadas basadas en la medición de absorbancia a 280 nm (A280). El porcentaje de monómero se evaluó mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) en un gel TSK G3000SWXL, 7,8 x 300 mm, con una columna de seguridad SWXL, 6,0 x 40 mm (Tosoh Bioscience, Montgomeryville, PA), utilizando un sistema de HPLC Agilent 1 100 (Agilent, Santa Clara, CA). Las fracciones con contenido de monómero por encima del 95 % se agruparon, se sometieron a intercambio de buffer PBS (pH 7,4) utilizando un sistema TFF y se esterilizaron por filtración a través de una membrana de filtro de 0,2 µ??. La concentración de IgG de anticuerpo purificado se determinó mediante A280 utilizando un coeficiente de extinción de 1 ,47. Métodos alternativos, tales como la cerámica de hidroxiapatita (CHT) también fueron utilizados para pulir los anticuerpos con buena selectividad. Una resina tipo II CHT con 40 µ?t? de tamaño de partícula (Bio-Rad Laboratories) fue utilizada con un protocolo similar al descrito para la cromatografía de IEX. El buffer de unión para CHT corresponde a fosfato sódico 20 mM, pH 7,0 y el anticuerpo se eluyó con un gradiente de 20 a 160 mM de fosfato de sodio, durante 20 CV.
Ejemplo 2 Caracterización de Unión mediante Citometría de Flujo La especificidad de unión fue testeada mediante citometría utilizando anticuerpos purificados. Los histogramas FACS que demuestran la unión de muCD20-7 y muCD20-6 a las células 300-19 que expresan CD20 y la ausencia de unión a las células párenteles 300-19 se muestran en la Figura 1. Cualquiera de los anticuerpos muCD20-7 o muCD20-6 se incubaron durante 3 horas, ya sea con células 300-19 que expresan CD20 como con células 300-19 no transfectadas (1 x105 células por muestra) en 100 µ? de amortiguador FACS (medio RPMI-1640 suplementado con suero normal de cabra al 2%). Luego, las células se peletizaron, se lavaron y se incubaron durante 1 hora con 100 µ?_ de anticuerpo IgG anti-ratón de cabra conjugado con FITC (tal como puede ser obtenido por, por ejemplo, por el Laboratorio Jackson, 6 g mL en amortiguador FACS). Las células se peletizaron nuevamente, se lavaron con amortiguador FACS y resuspendieron en 200 µL· de PBS conteniendo formaldehído al 1 %. Las muestras fueron adquiridas utilizando un citómetro de flujo FACSCalibur con un recogedor de muestras multipocillo HTS o con un citómetro de flujo FACS y se analizaron mediante CelIQuest Pro (todos de BD Biosciences, San Diego, Estados Unidos de Norte América).
Los histogramas FACS de las células 300-19 que expresan CD20, incubadas con muCD20-7 o muCD20-6, mostraron un corrimiento de fluorescencia, mientras que las células 300-19 parentales no lo hicieron (Figura 1 ). Además, no se detectó ningún corrimiento de fluorescencia significativo cuando cualquiera de las líneas celulares fue incubada solamente con anticuerpo IgG anti-ratón de cabra conjugado con FITC (Figura 1 de más abajo).
Un corrimiento de fluorescencia también se observó cuando las células del linfoma BJAB se incubaron con muCD20-7 o muCD20-6 (Figuras 2A y 2B). Las células BJAB fueron incubadas con concentraciones variables del anticuerpo muCD20-7 o muCD20-6 y se procesaron tal como se describió anteriormente para el análisis mediante citometría de flujo. El análisis de datos se realizó mediante CelIQuest Pro (BD Biosciences, San Diego, Estados Unidos de Norte América) y para cada muestra la intensidad de fluorescencia media para FL1 (IMF) se exportó y se gráfico contra la concentración de anticuerpos en un gráfico semilog. Una curva de dosis-respuesta se generó mediante regresión no lineal y el valor de la constante de disociación aparente (Kd) de muCD20-7 o muCD20-6 para la unión a las células BJAB se calculó utilizando GraphPad Prism v4 (GraphPad software, San Diego, CA), la que corresponde a 0,3 nM y 0,4 nM, respectivamente.
Ejemplo 3 Actividad pro-apoptótica de anticuerpos anti-CD20 murinos Los anticuerpos anti-CD20 muCD20-2, muCD20-6 y muCD20-7 indujeron la apoptosis de las líneas celulares de linfoma. El grado de apoptosis fue medido mediante análisis de citometría de flujo luego de la tintura con conjugados de FITC con Anexina-V (Invitrogen) y con TO-PRO®-3 (Invitrogen). En células normales, saludables, la fosfatidilserina se encuentra en el interior de la membrana lipídica, y la transición de la fosfatidilserina desde la hoja interior a la hoja exterior de la membrana plasmática, es una de las señales más tempranas de la apoptosis. La Anexina V se une a la fosfatidilserina en el exterior pero no en el interior de la membrana celular de las células intactas. El grado de unión de Anexina V, es por lo tanto, un indicador de la inducción de apoptosis. TO-PRO®-3 es un colorante de ácidos nucleicos de cianina monomérico, que sólo puede penetrar la membrana plasmática cuando la integridad de dicha membrana se rompe, como ocurre en las últimas etapas de la apoptosis. Tres poblaciones de células son distinguibles en la citometría de flujo de dos colores: las células no-apoptóticas (negativas a Anexina-V y a TO-PRO®-3), células apoptóticas tempranas (positivas a Anexina-V y negativas a TO-PROO-3) y células necróticas o células apoptóticas tardías (positivas a Anexina-V y positivas a TO-PRO®-3).
Células en crecimiento exponencial fueron sembradas a, aproximadamente, 2 x 105 célula/ml en placas de 24-pocillos en medio RMPI-1640 suplementado con suero fetal bovino al 10% (FBS), L-glutamina 2mM y 50 pg/mL de gentamicina (designada mas abajo como medio RMPI-1640 completo). Por lo general, salvo que se indique lo contrario, las células se dejaron crecer en un medio completo RMPI-1640. Las células fueron incubadas con 10 nM de anticuerpos anti-CD20 durante 20-24 h, a 37°C, en una incubadora con humidificación y C02 al 5%. Las células fueron peleteadas, lavadas 2 veces con 500 µ? PBS, resuspendidas en 100 pL de buffer de unión (Hepes -NaOH 10 mM, pH 7.4, NaCI 140 mM y CaCI2 2.5 mM) y teñidas con 5 pL de Anexina V-FITC, durante 15 min, en hielo. Entonces, se le agregaron a la mezcla 400 pL de buffer de unión y 1 µ? de TO-PRO®-3 y la fluorescencia asociada a las células de FITC y TO-PRO®-3 fue inmediatamente medida mediante citometría de flujo. Cinco mil eventos fueron recolectados para cada muestra. Los gráficos de puntos de fluorescencia de TO-PRO®-3 (FL4-H; eje y) y fluorescencia de Anexina V-FITC (FL1-H; eje x) fueron generados utilizando el programa BD CelIQuest.
El porcentaje de células positivas a la Anexina-V (incluyendo tanto la células TO-PRO®-3 positivas y negativas) fueron determinadas para cada muestra a partir de los gráficos, los cuales se muestran en las Figuras 3A y 3B. Varios anticuerpos aislados a partir de nuestro muestreo de anticuerpos fueron ensayados para medir su actividad apoptótica en comparación con rituximab. De manera inesperada, muCD20-2, muCD20-6 y muCD20-7 mostraron una actividad pro-apoptótica muy fuerte. Mas del 70 % de las células Ramos expuestas ya sea a muCD20-6, muCD20-7 o muCD20-2, resultaron positivas a la Anexina-V, en comparación con sólo alrededor del 5 % de las células sin tratar. El tratamiento con el anticuerpo anti-CD20 rituximab resultó en sólo un 13 % de células positivas a Anexina-V. De manera similar, el tratamiento con el anticuerpo muCD20-5 dio como resultado un 12 % de células positivas a Anexina-V.
De igual manera, mas del 60% de las células de Raji tratadas con muCD20-7 o muCD20-2 resultaron positivas a la Anexina-V, en comparación con un 5% de las células sin tratar. Esta actividad inesperada es aún mayor que la de B1 , un anticuerpo tipo II previamente aislado, el cual dio como resultado un 42% de células positivas a Anexina-V. La incubación con rituximab dio como resultado un 14% de células positivas a Anexina-V. El anticuerpo muCD20-5 no indujo un mayor porcentaje de células positivas a Anexina-V, en comparación con las células sin tratar.
Ejemplo 4 Balsas Lipídicas La reorganización de CD20 en balsas lipídicas después de la unión del anticuerpo ha sido correlacionada con la capacidad de los anticuerpos de reclutar, de manera eficaz, los factores de complemento y provocar la actividad CDC. Como una medida de la re-distribución de CD20 inducida por anticuerpos a las balsas lipídicas, empleamos el método basado en citometría de flujo modificado de Cragg y col., (2003), supra. El principio de este ensayo se basa en la insolubilidad a bajas temperaturas, de los compartimentos de las balsas lipídicas en Tritón X-100.
Las células fueron cosechadas mediante centrifugación, se lavaron y se resuspendieron en RPMI-1640 con BSA al 1 %. 0,2 mi de células en 2,5 x 106 células fueron usadas para cada ensayo, por duplicado. Los anticuerpos anti-CD20 se añadieron de a 10 µg/m\ y las muestras fueron incubadas durante 15 min. a 37° C. Las muestras se centrifugaron, se lavaron dos veces y se volvieron a suspender en 0,2ml de amortiguador FACS (1 xPBS, BSA al 1 %, 20 mM de azida de Na). Las muestras fueron enfriadas en hielo y se mantuvieron en frío a partir de ese momento. Para detectar la fracción de antígeno asociada con las balsas lipídicas en respuesta al tratamiento del anticuerpo, las muestras fueron incubadas con Tritón X-100 al 0,5 % durante 15 minutos en hielo. Para detectar la cantidad total de anticuerpo unido, las muestras se dejaron en hielo durante 15 minutos sin ser molestadas. Las muestras se lavaron dos veces en amortiguador FACS y se tiñeron con AB anti-ratón de cabra acoplado con FITC, diluido hasta 1 :200, durante 1 hora en hielo. Las muestras se centrifugaron, se lavaron dos veces con amortiguador FACS y las células se resuspendieron en 200 µ? de PBS y formaldehído 1 % para la fijación. Las muestras fueron adquiridas mediante citometría de flujo para determinar la unión de los anticuerpos anti-CD20 como un promedio de FL-1. La intensidad media de fluorescencia (MFI, por sus siglas en idioma inglés) fue graficada para cada muestra, en ausencia (sin tratamiento) o en presencia (tratadas con Tritón) de incubación con Tritón X-100 en las Figuras 4A y 4B.
Usamos rituximab, un ejemplo de un anticuerpo de tipo I que ha demostrado previamente que trasloca de manera eficiente CD20 en balsas lipídicas insolubles en TritonX-100, como control. Como era de esperar, las células tratadas con rituximab muestran el mismo nivel de fluorescencia con y sin tratamiento con TritonX-100. Por el contrario, la MFI de células teñidas con muCD20-2 es mucho menor con el tratamiento de TritonX-100 que sin él. Esto es consistente con la incapacidad de muCD20-2 para redistribuir CD20 en balsas lipídicas, un rasgo característico de los anticuerpos CD20 tipo II previamente descritos. Sorprendentemente, el MFI de las células teñidas con muCD20-7 es similar con o sin tratamiento con TritonX-100. Adicionalmente, hemos ensayado anticuerpos muCD20-5 y muCD20-6 para la actividad de balsa lipídica. Como se observa para muCD20-7, la MFI de células teñidas con muCD20-5 o muCD20-6 es similar con o sin tratamiento con TritonX-100. Este dato muestra que muCD20-5, muCD20-6 y muCD20-7, tal como el rituximab, puede traslocar de manera eficiente CD20 en un compartimiento de balsa lipídica de la membrana celular de las células de linfoma. Tomados juntos con los resultados de los ensayos con Anexina-V, estos demuestran que muCD20-2 posee características de anticuerpo de tipo II. Puede inducir fuertemente la apoptosis, aunque no puede redistribuir CD20 en balsas lipídicas. Por el contrario, muCD20-5 tiene las características de anticuerpo de tipo I. Puede redistribuir CD20 en balsas lipídicas perno no posee actividad pro apoptótica.
Este sorprendente resultado demuestra que muCD20-6 y muCD20-7 tienen una combinación única e inesperada de propiedades funcionales: Tienen la actividad de balsa lipídica de los anticuerpos de tipo I y la actividad pro-apoptótica fuerte típicamente vista para los anticuerpos de tipo II.
Ejemplo 5 Clonación y secuenciación de las regiones VL v VH de los anticuerpos CD20-7 v CD20-6 El RNA (por sus siglas en Idioma Inglés) total celular se preparó a partir de 5 x 106 células de hibridoma CD20-7 y CD20-6 mediante un equipo de RNeasy (QIAGEN) según el protocolo del fabricante. El ADNc (por sus siglas en Idioma Inglés) fue posteriormente sintetizado partir de RNA total utilizando el kit de síntesis SuperScript II cDNA (Invitrogen).
El procedimiento para la primera ronda de la reacción de PCR degenerada en el ADNc derivado de las células de hibridoma estuvo basado en los métodos descritos en Wang y col., ((2000) J Immunol Methods. Ene 13;233(1 -2): 167-77) y Co y col. ( (1992) J Immunol. Feb 15;148(4):1 149-54). Las secuencias de VH fueron amplificadas mediante PCR utilizando los siguientes cebadores degenerados: EcoMW CTTCCGGAATTCSARGTNMAGCTGSAGSAGTC (SEQ ID NO:37), EcoMH2 CTTCCGGAATTCSARGTNMAGCTGSAGSAGTCWGG (SEQ ID NO:48) y BamlgGI GGAGGATCCATAGACAGATGGGGGTGTCGTTTTGGC (SEQ ID NO:38). Las secuencias VL fueron amplificadas mediante PCR utilizando los siguientes cebadores degenerados: SacIMK GGAGCTCGAYATTGTGMTSACMCARWCTMCA (SEQ ID NO:39) y HindKL TATAGAGCTCAAGCTTGGATGGTGGGAAGATGGATACAGTTGGTGC (SEQ ID NO:40) (Las bases mixtas se definen de la manera siguiente: N=G+A+T+C, S=G+C, Y=C+T, M=A+C, R=A+G, W=A+T).
A continuación, las mezclas de reacción de la PCR se corrieron en un gel de agarosa de bajo derretimiento al 1 %, bandas de 300-400 pb fueron removidas, purificadas utilizando mini columnas Zymo DNA, y enviadas a Agencourt Biosciences para la secuenciación. Se utilizaron los respectivos cebadores 5 'y 3' de la PCR, como cebadores para generar la secuencia de región variable de ADNc de ambas direcciones. Las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL se deducen de los resultados de secuenciación del ADN.
Las secuencias de ADNc preliminares se utilizan para buscar en el sitio NCBI IgBlast (www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/) para las secuencias de la línea germinal murina a partir de las cuales derivan las secuencias de anticuerpos. Los cebadores de la PCR fueron diseñados para templar la secuencia líder enlazada a la línea germinal del anticuerpo murino, para que esta nueva reacción de PCR produzca una secuencia completa de la región variable ADNc variable, inalterada por los cebadores de la PCR. Además, un método de PCR RACE fue llevado a cabo, tal como se describe en Co y col., supra, para secuenciar la secuencia de la región variable completa de la cadena pesada del CD20-7. Las reacciones de PCR, purificaciones de las bandas y el secuenciamiento, se realizó tal como se describid anteriormente.
Determinación de la Masa para la Confirmación de la Secuencia La información de la secuencia del ADNc de la región variable se combinó con la secuencia de región constante de la línea germinal, para obtener secuencias de ADNc de los anticuerpos de longitud completa. Los pesos moleculares de las cadenas pesadas y livianas se calcularon y se compararon con los pesos moleculares obtenidos mediante análisis LC/MS de los anticuerpos murinos CD20-7 y CD20-6. Las mediciones de peso molecular son consistentes con las secuencias de ADN, para las cadenas pesadas y livianas de CD20-7 y CD20-6.
Quimerización La secuencia variable de la región variable de la cadena liviana se clona en los sitios EcoRI y fís/WI en el plásmido pchCD20-7LCZ. La región variable de la cadena pesada es clonada en los sitios Hind\\\ y Apa\ en el plásmido pchCD20-7HCN. Plásmidos equivalentes fueron construidos para chCD20-2, chCD20-9. Estos plásmidos fueron utilizados para expresar anticuerpos quiméricos en células HEK-293T utilizando un procedimiento estándar con fosfato de calcio (BD Biosciences, CalPhos Mammalian Transfection Kit, Cat # 631312);. El sobrenadante se purificó usando los procedimientos cromatográficos de proteína A estándares, tal como los que se describieron anteriormente, pero las etapas de la cromatografía de pulido se realizaron utilizando resina de intercambio iónico (IEX) de flujo rápido de carboximetilo (CM) (GE Lifesciences) y fosfato de potasio 10 mM, buffer de unión en cloruro de sodio 10 mM (pH 7.5) o mediante los métodos alternativos CHT descritos anteriormente.
Ejemplo 6 Actividad pro-apoptótica de CD20-7 Quimérico La capacidad de los anticuerpos quiméricos para inducir la apoptosis en células de Ramos fue medida utilizando la tinción con Anexina-V-FITC y TO-PRO®-3, tal como se describió para los anticuerpos murinos de los ejemplos de mas arriba. 10 nM de cada anticuerpo quimérico fueron incubados con células de Ramos durante 20 hrs, seguido de la tinción con Anexina-V y análisis por citometría de flujo y los resultados se presentan en la Figura 5. El tratamiento con chCD20-7 dio como resultado un 59% de células positivas a Anexina-V, en comparación con sólo un 1 1 % para las muestras sin tratar. El tratamiento con chCD20-2 indujo un 43% de células positivas a Anexina-V, mientras que el tratamiento con rituximab dio como resultado niveles de tinción con Anexina-V similares a los de las células sin tratar. Así, CD20-7 retuvo su sorprendente capacidad de inducir una apoptosis fuerte de las células Ramos después de la quimerización.
Actividad CDC del CD20-7 Quimérico Para determinar las actividades de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) de los anticuerpos quiméricos anti-CD20, se llevaron a cabo ensayos basados en células de acuerdo a un método publicado (Gazzano-Santoro, J. Immunol. Methods, 202(2):163-171 , 1997). Los anticuerpos fueron tomados en alícuotas, por duplicado, a 50 µ?7?????? en una placa de cultivo de tejidos de 96 pocilios, de fondo plano, a varias concentraciones, típicamente en el rango de desde 5 pg/mL (= 3.3 x 10"8 M) a 2.3 ng/mL (= 1 .5 x 10"11 M) en un medio RHBP (RPMI-1640, 20 mM HEPES, 0.1 % BSA, 1 % penicilina-estreptomicina). Las células diana fueron agregadas a los anticuerpos a 5 x 104 células en 100 pL de medio RHBP por pocilio. El complementó humano liofilizado (Sigma-Aldrich, St. Louis, US) fue reconstituido con 1 mi de agua purificada estéril por vial y diluido 5 veces hasta un 20% del stock con medio RHBP, inmediatamente antes del uso. Se agregaron 50 µ?/pocillo de solución de complemento a cada pocilio hasta una concentración final de 5%. La placa fue incubada durante 2 h a 37°C en una incubadora con C02 5% humidificado para permitir la lisis mediada por complemento. Después de este tiempo de incubación se le agregó reactivo Alamar Blue (Invitrogen) a cada pocilio, hasta una concentración final del 10% para medir la viabilidad de las células remanentes. La placa fue incubada durante 16 a 20 horas a 37°C, antes de la medición de fluorescencia (en unidades de fluorescencia relativas, RFU) a EX540/EM590 nm. Los controles incluyeron pocilios triplicados con medio y complemento, pero sin células (medio solamente, 0% viabilidad) y pocilios con células y complementos pero sin anticuerpos (células solamente, 100% viabilidad). El porcentaje de viabilidad específico de las células para cada muestra fue determinado mediante la siguiente fórmula: Porcentaje de viabilidad = (control - medio solamente)/ (células solamente - medio solamente).
De manera sorprendente, el anticuerpo chCD20-7 presenta una actividad CDC similar a la del rituximab, tanto en las células del linfoma de Daudi como en las células del linfoma WSU-DLCL-2, tal como se muestra en las Figuras 6A y 6B. El chCD20-7 redujo completamente la viabilidad celular en ambas líneas celulares, con un EC50 de 1 .0 nM para las células de Daudi y de 2.2 nM para las células WSU-DLCL-2. El rituximab tuvo una actividad CDC con un EC50 de 1.1 nM para las células de Daudi y 2.8 nM para las células WSU-DLCL-2. Como era de esperarse para un anticuerpo de tipo II, el chCD20-2 no presentó actividad CDC ni con las células de Daudi ni con las células WSU-DLCL-2.
Ejemplo 7 Humanización de anticuerpos El anticuerpo CD20-7 se humanizó siguiendo los métodos de acondicionamiento de superficie descriptos anteriormente, tales como, por ejemplo, en Roguska y col., Proc. Nati. Acad. Sci., USA, 91 (3):969-973 (1994) y Roguska y col., Protein Eng. 9(10):895-904 (1996), los cuales se incorporan a la presente, en su totalidad como referencia. El acondicionamiento de superficie involucra, de manera general, la identificación de residuos de la superficie de la región variable de ambas cadenas livianas y pesadas y su sustitución por equivalentes humanos. Ejemplos de CDRs se definen como se indica en la Tabla 1.
Tabla 1 Ejemplos de CDRs de CD20-7 con acondicionamiento de la superficie Cadena liviana CDR1 : R A S G S V D S F G N S F M H (SEQ ID NO:17) CDR2: R A S N L E S (SEQ ID NO:18) CDR3: QQSYEDPFT (SEQ ID NO:19) Cadena pesada CDR1 : N Y G M N (SEQ ID NO:20) CDR2: Wl NTYTG E IP S (SEQ ID NO:21) CDR3: GAYYRYDLGMDY (SEQ ID NO:22) CD20-7 HC CDR2 definido por Kabat Murino HC CDR2: WINTYTG EPS Y A D D F KG (SEQ ID NO:23) Humano HC CDR2: WI NTYTG EPS YAAPFKG (SEQ ID NO:24) Los CDR's de las cadenas livianas y pesadas de los CD20-7, como se definen para el acondicionamiento de superficie, se muestran a manera de ejemplo en la Tabla 1. La definición de Kabat para la cadena pesada de CDR2 también se da para los CD20-7 murinos y humanos. La secuencia subrayada marca la porción de la cadena pesada de CDR2 no considerada por Kabat como un CDR para el acondicionamiento de superficie.
Las posiciones de los residuos de superficie se definen como cualquier posición con su accesibilidad relativa del 30 % o mayor (Pedersen y col., J. Mol. Biol., 235 (3) :959-973 (1994)). Los residuos de la superficie están alineados con las secuencias de la superficie de la línea germinal humana para identificar la secuencia de superficie más homologa a la humana. Para el CD20-7, las secuencias de las líneas germinales humanas utilizadas para el remplazo de superficies fueron IGKV7-3*01 y IGHV3-15*04 para VL y VH, respectivamente. Como puede observarse de las Figuras 7 A y 7B, un total de 4 residuos de superficie en la cadena liviana y 9 en la cadena pesada fueron remplazados por sus contrapartes humanas. El residuo S28 de la cadena pesada esta cercano a CDR-H1 y dado que su sustitución por el T28 humano puede dar como resultado una afinidad de unión disminuida, una segunda versión con su superficie acondicionada fue generada con el residuo murino S28 retenido. Las Figuras 8A y 8B muestran la alineación de las secuencias con superficie acondicionada para el dominio variable de CD20-4 de ambas cadenas livianas y pesadas, con sus contrapartes murinas.
Expresión recombinante del anticuerpo huCD20-7 Las secuencias de la región variable de huCD20-7 fueron optimizadas por codón y sintetizadas mediante Blue Heron Biotechnology. Las secuencias se encuentran flanqueadas por los sitios de la enzima de restricción, para la clonación en marco de las respectivas secuencias constantes, en los plásmidos de expresión de mamíferos de cadena simple. La región variable de cadena liviana es clonada en los sitios EcoRI y Ss/WI en el plásmido phCD20-7LCZ. La región variable de la cadena pesada es clonada en los sitios H/>7dlll y Apa\ en el plásmido phCD20-7HCN. Estos plásmidos pueden ser utilizados para expresar huCD20-7, en transfecciones transitorias o estables, en células de mamíferos. Las transfecciones transitorias para expresar huCD20-7 en células HEK-293T se realizaron mediante un procedimiento modificado PEI (por sus siglas en Idioma Inglés) (Durocher, Y. y col., Nucleic Acids Res. 30 (2):E-9 (2002)). Los sobrenadantes se purificaron mediante Proteína A y las etapas de cromatografía de pulido estándar utilizadas fueron las descritas anteriormente para los anticuerpos quimerizados.
Expresión de Anticuerpos de Referencia Con el fin de comparar la actividad de huCD20-7, anticuerpos anti-CD20 previamente identificados fueron clonados y expresados. Las secuencias de aminoácidos para la región variable HC y LC del anticuerpo 2F2 (oftumumab) fueron derivadas de WO 2004/035607 (Teeling y col. ,(2004), supra) utilizando la SEQ ID NO:2 de la WO 2004/035607 para la región variable HC y la SEQ ID NO:4 de la WO 2004/035607 para la región variable LC. De manera similar, las secuencias de aminoácidos para la las regiones variables HC y LC del anticuerpo GA101 (base para el afutuzumab) se derivaron de la WO 2005/0448959 (Umaria, Patente US Ser. No. 5,639,641 (2005)). La SEQ ID NO:40 de la WO 2005/0448959, correspondiente a la descrita en el constructo B-HH6, fue utilizada para la región variable HC y la SEQ ID 76 de la WO 2005/0448959, correspondiente al contructo descrito B-KV1 , fue utilizado por la región variable LC.
Las secuencias de la región variable de ambos anticuerpos fueron optimizadas por codón y sintetizadas mediante Blue Heron Biotechnology. Las secuencias se encuentran flanqueadas por los sitios de la enzima de restricción para el clonado de marco de las respectivas secuencias constantes en los plásmidos de expresión de cadena simple de mamíferos. La clonación, la expresión y la purificación se llevó a cabo tal como se describe arriba para el huCD20-7. El anticuerpo resultante GA101 -F muestra la fucosilación típica en la región constante y no es, por lo tanto, la versión defucosilada utilizada para afutuzumab.
Ejemplo 8 Afinidad de unión de huCD20-7 Ensayos de unión por citometría de flujo utilizando células BJAB y los anticuerpos muCD20-7, chCD20-7 o huCD20-7 se llevaron a cabo y se analizaron de la manera en que se describe en el Ejemplo 2. La Figura 9 representa las curvas de dosis- respuesta para cada anticuerpo, generadas mediante regresión no lineal. El valor de la constante de disociación aparente (Kd) de cada anticuerpo se calculó utilizando GraphPad Prism v4 (GraphPad software, San Diego, CA). La quimerización o la humanización no afectaron a la afinidad de unión del CD20-7, ya que las Kd para muCD20-7, chCD20-7 y huCD20-7 corresponden a 0.4 nM, 0.5 nM y 0.5 n , respectivamente.
Caracterización de la unión mediante ELISA Los lisados de células crudas se prepararon a partir de células WSU-DLCL-2 (es decir, una fuente de antígeno CD20) para medir la afinidad de unión mediante ELISA. Las células WSU-DLCL-2 fueron crecidas en botellas rotatorias en medio RPMI- 1640 suplementado con suero fetal bovino al 10%, 2 mM de glutamina y penicilina-estreptomicina al 1 % (todos los reactivos de Invitrogen) a 37°C en una incubadora de C02 al 5% humidificada. Las células fueron recolectadas mediante centrifugación y los pellets de células fueron lavados 2 veces con PBS 1 x frío y, de manera subsiguiente, fueron lisadas en buffer de lisis (Tris 50 mM, pH 8, NaCI 150 mM, EDTA 5 mM, NP-40 1 %, deoxicolato de sodio 0.25%, octilglucosido 25 mM ). Un volumen de 1 ml de buffer de lisis fue utilizado para la lisis de 1 x 107 células recolectadas. Los lisados celulares fueron homogeneizados mediantel O pasajes a través de una aguja de jeringa de calibre 22 y se permitió que el lisado fuera rotado durante 45 minutos a 4 °C. El lisado fue aclarado mediante centrifugación a 10,000 g durante 45 minutos a 4 °C. El sobrenadante fue filtrado a través de filtros de 0.22 micrones, separado en alícuotas, congelados de manera instantánea con nitrógeno líquido y almacenados a -80 °C. La concentración de proteína 1 total fue medida mediante un ensayo BCA (por ejemplo, Micro BCA Protein Assay Kit, PIERCE, US).
Para los experimentos de ELISA, las preparaciones lisadas fueron diluidas a 5 g/ml de proteínas totales en un buffer de cobertura (Na2C03 15 m , NaHC0335 mM, pH 9.6) y fueron plaqueadas en placas Immulon 2HB a 100 LJpocillo durante 18 a 24 hrs a 4 °C. Las placas fueron entonces lavadas tres veces con buffer de lavado (TBST: 0.1 % Tween-20/TBS, pH 7.4) a 200 µ?_/???????. Las placas fueron bloqueadas con 200 pL/pocillo de buffer de bloqueo (caseína 1 % TBS, pH 7.4) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas fueron lavadas como se mencionó anteriormente y se le agregó a las placas 100 µ?_/??a??? de diluciones seriadas de anticuerpos. Las placas fueron incubadas durante 3 horas, a temperatura ambiente, y se lavaron como anteriormente. Una dilución 1 :5,000 de peroxidasa de rábano de cabra-anti-humano en buffer de bloqueo se agregó como un segundo anticuerpo a 100 pL pocillo y se lo dejó incubar durante a 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron como anteriormente y luego se les agregaron 100 pL/pocillo de sustrato TMB1 (BioFX). La reacción se dejó proceder durante 20 minutos antes de detenerla con 100 pL/pocillo de 450 nm de reactivo de parada (BioFX). Se leyó la absorbancia a 450 nm y se gráfico respecto de la concentración de anticuerpo para cada muestra. Una curva dosis -respuesta sigmoideal se ajustó para las curvas de unión, utilizando GraphPad Prism v4 (GraphPad software, San Diego, CA). El valor de la constante de disociación aparente (Kd) calculado a partir de las curvas de unión para huCD20-7 se muestra en la Figura 10 y corresponde a 0.8 nM.
Ejemplo 9 Actividad pro- apoptótica de mu y huCD20-7 La actividad pro-apoptótica de huCD20-7 fue comparada con la actividad de muCD20-7. Las células de Ramos se incubaron con concentraciones de 10nM, 1 nM o 0.1 nM de muCD20-7, huCD20-7 o un anticuerpo de control de isotipos hulgG durante 20 hrs, seguido de la tinción con Anexina-V-FITC y TO-PRO®-3 y análisis por citometría de flujo. El porcentaje de células positivas a Anexina-V para cada condición se muestra en la Figura 1 1 . huCD20-7 retuvo la actividad pro-apoptótica fuerte del muCD20-7. Aproximadamente el 60% de las células de Ramos son positivas a Anexina-V después del tratamiento con 10 nM de cada anticuerpo, comparado con un 6% para las células tratadas con el control de isotipos.
Actividad Pro-apoptótica de huCD20-7 La actividad pro-apoptótica de huCD20-7 contra las células de Ramos se comparó con la de otros anticuerpos CD20. Rituximab y 2F2 son anticuerpos tipo I, con una actividad pro-apoptótica limitada, descrita previamente, mientras que GA101 y B1 son anticuerpos de tipo II con una fuerte actividad pro-apoptótica conocida. "B1 " corresponde a la forma sin marcar de BexxarTM (Coulter); mientras que "GA101 -P corresponde a la versión fucosilada de afutuzumáb o GA101 (Roche); y "2F2" corresponde a ofatumumab i (Genmab). Cantidades variables de cada anticuerpo se incubaron con células de Ramos durante 20 horas, seguidas de la tinción con Anexina-V-FITC y TO-PRO®-3 y análisis de citometría de flujo. El porcentaje de células positivas a Anexina-V se gráfico respecto de la concentración de anticuerpos en un gráfico semi-log en la Figura 12 y los valores de EC50 se calcularon a partir de ías curvas ajustadas utilizando un análisis de regresión no lineal. El huCD20-7 tiene el efecto pro-apoptótico mas fuerte con un porcentaje máximo de células positivas a Anexina-V de un 50% y un EC50 de 0.2 nM. Es aún mas potente que B1 , el cual da como resultado un 34% de células positivas a Anexina-V con un EC50 de 0.8 nM. GA101 -F es menos efectivo y da como resultado un 22% de células positivas a Anexina-V con un EC50 de 1.7 nM. El Rituximab presenta un efecto limitado en la apoptosis de las células de Ramos y da como resultado solo un 12% de células positivas a Anexina-V con un EC50 de 1.7 nM. Ambos 2F2 tratados y las muestras sin tratar contienen un 2% de células positivas a Anexina-V indicando que 2F2 no induce a la apoptosis de las células de Ramos. Luego de las sustracción del valor control, esto corresponde a un 48% de células de Ramos positivas a Anexina-V inducidas por huCD20-7, comparadas con un 32% por B1 , un 20% por GA101 -F y un 10% por rituximab.
Actividad pro-apoptótica contra un Panel de líneas celulares La actividad pro-apoptótica de huCD20-7 fue además comparada con el rituximab y el B1 contra un panel expandido de líneas celulares. Cada línea celular fue incubada con 10 nM o 1 .5 µg/ml de huCD20-7 o rituximab durante 20 horas, seguida de la tinción con Anexina-V-FITC y TO-PRO®-3 y citometría de flujo. El porcentaje de células positivas a Anexina-V se gráfico para cada anticuerpo y para las muestras no tratadas y se presenta las Figuras 13A-13E. El anticuerpo huCD20-7 fue mas potente que el rituximab y el B1 en las líneas celulares del linfoma de Ramos y de Raji. El huCD20-7 indujo un 60% de células positivas a Anexina-V en las células del linfoma de Ramos, comparadas con un 29% para B1 , 9% para rituximab y 6% para las células sin tratar. Luego de la sustracción de los valores control sin tratar, esto corresponde a un 54% de células de Ramos positivas a Anexina-V inducidas por huCD20-7, en comparación con un 23% mediante B1 y 3% mediante rituximab. huCD20-7 indujo un 58% de células de linfoma de Raji positivas a Anexina-V en comparación con un 42% para B1 , un 14% para rituximab y un 5% para las células sin tratar. Luego de la sustracción del valor de control sin tratar esto corresponde a un 53% de células de Raji positivas a Anexina-V inducidas mediante huCD20-7, en comparación con un 37% mediante B1 y un 9% mediante rituximab. De manera adicional, huCD20-7 indujo un 39% de células positivas a Anexina- V en células WSU-DLCL-2 DLBCL comparadas con un 26% para el rituximab y un 5% para las células sin tratar. Luego de la sustracción de los valores de control sin tratar esto corresponde a un 34% de células WSU-DLCL-2 positivas a Anexina-V inducidas por huCD20-7 y un 21 % mediante rituximab. huCD20-7 indujo un 20% de células positivas a Anexina-V en células Jeko-1 MOL en comparación con un 9% para el rituximab y un 8% para las células sin tratar. Luego de la sustracción de los valores de control sin tratar esto corresponde a un 12% de células Jeko-1 positivas a Anexina-V inducidas por huCD20-7 y solo un 1 % para el rituximab. Finalmente, huCD20-7 indujo un 58% de células Granta-519 MCL positivas a Anexina-V en comparación con un'23% para el rituximab y un 18% para las células sin tratar. Luego de la sustracción del valor de control sin esto corresponde a un 40% de células Granta-519 positivas a Anexina-V inducidas por el huCD20-7 y sólo de un 5% para el rituximab.
Ejemplo 10 Ensayo de Balsa lipídica utilizando anticuerpos humanos Los ensayos de balsas lipídicas contra células de Ramos se llevaron a cabo para huCD20-7, tal como se describe más arriba, en comparación con otros anticuerpos CD20. Rituximab y 2F2 son anticuerpos de tipo I que presentan una actividad de balsa de lípidos previamente descrita, mientras que GA101 -F y B1 son anticuerpos de tipo II, que carecen de balsa lipídica y, en consecuencia, de actividad CDC. De acuerdo a lo esperado, las células tratadas con rituximab y 2F2 muestran el mismo nivel de fluorescencia, con y sin tratamiento de TritonX-100 (Figura 14). En cambio, la fluorescencia media de las células teñidas con B1 o GA101-F es mucho menor con tratamiento de TritonX-100 que sin tratamiento, lo que es consistente con su incapacidad para redistribuir CD20 en las balsas lipídicas. De manera sorprendente, la fluorescencia media de las células teñidas con huCD20-7 es similar, con o sin tratamiento de TritonX-100. Así, el huCD20-7, tal como el rituximab y el 2F2, puede traslocar CD20, de manera eficiente, en el compartimiento de balsa lipídica de la membrana de las células B.
Actividad CDC de Anticuerpos quiméricos La actividad CDC de huCD20-7 en comparación con la del rituximab y GA101 -F fue medida tal como se describió para los anticuerpos quiméricos del ejemplo 6. Sorprendentemente, el anticuerpo huCD20-7 tuvo una actividad CDC similar a la del rituximab en las células del linfoma de Daudi, tal como se muestra en la Figura 15A. El tratamiento con Rituximab o con huCD20-7 redujo completamente la viabilidad de las células de Daudi con un EC50 de 0.23 y 0.25 pg/mL, respectivamente. Como era de esperarse, GA101 -F, un anticuerpo de tipo II típico, no mostró actividad CDC contra las células de Daudi. Resultados similares se observaron para las células del linfoma de Ramos, tal como se muestra en la Figura 15B. El tratamiento con rituximab o con huCD20-7 redujo completamente la viabilidad de las células de Ramos, con un EC50 de 0.09 y 0.014 pg/mL, respectivamente. Como era de esperarse GA101 -F, un anticuerpo de tipo II típico, tuvo una actividad CDC mínima contra las células de Ramos.
Adicionalmente, huCD20-7 tuvo una actividad CDC mas potente que la del rituximab contra las células del linfoma WSU-DLCL-2 y RL. El rituximab redujo la viabilidad de las células WSU-DLCL-2 a un 34% a la concentración mas alta con un EC50 de 1.9 pg/mL. En contraste, huCD20-7 redujo la viabilidad celular de las células f WSU-DLCL-2 a un 1 1 % a la concentración mas alta con un EC50 de 0.58 pg/mL (Figura 16A). Rituximab moderadamente la viabilidad de las células RL a un 56% a la concentración mas alta, con un EC50 de4.3 pg/mL. En comparación, huCD20-7 redujo la viabilidad celular de las células RL mas completamente a un 1 1 % a la concentración mas alta, con un EC50 mucho menor, de 0.67 pg/ml (Figura 16B).
Ejemplo 11 Actividad ADCC de huCD20-7 Un ensayo de liberación de lactato deshidrogenasa (LDH , por sus siglas en Idioma Inglés) se utilizó para medir la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) de líneas dé células tumorales, utilizando células asesinas (NK, por sus siglas en Idioma Inglés) ) naturales humanas recién aisladas como células efectoras (por ejemplo, Shields, J. Biol. Chem., 276 (9) :6591 -6604 (2001 )). Las células NK fueron aisladas por primera vez a partir de sangre humana procedente de un donante normal (Research Blood Components, Inc., Brighton, MA), utilizando un protocolo modificado para el NK Isolation Kit II (Miltenyi Biotech, 130-091 -152). La sangre se diluyó dos veces con PBS 1 x. 25 mi de sangre diluida fue cuidadosamente plaqueada sobre 25 mi de Ficoll Paque en un tubo cónico de 50 mi y se centrifugó a 400 g durante 45 min a temperatura ambiente. Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC, por sus siglas en Idioma Inglés) fueron recolectadas de la ¡nteríase, se transfirieron a un nuevo tubo cónico de 50 mi y se lavaron una vez Con PBS 1 x. Las células PBMC se resuspendieron en 2 mL buffer de aislamiento NK (1 x PBS, BSA 0,5 % , EDTA 2 mM), y luego se agregaron 500 µ\- de Cóctel de Biotina - Anticuerpo a la suspensión de la célula. El Cóctel de Biotina -Anticuerpo contiene anticuerpos biotinilados que se unen a los linfocitos, excepto para las células NK, lo que resulta en una selección negativa de las células NK. La mezcla se incubó a 4°C durante 10 minutos y, a continuación, se añadieron 1 ,5 mi de buffer de aislamiento NK y 1 mi de Micro Perlas de Anti Biotina. La mezcla de anticuerpos y células se incubaron durante otros 15 minutos a 4 °C. A continuación, las células se lavaron una vez con 50 mi de amortiguador de aislamiento de NK y se resuspendieron en 3 mi de amortiguador de aislamiento de NK. Luego, una columna MACS LS se montó en el separador de autoMACS (Miltenyi Biotech) y se pre-lavó con 3 mi de buffer de aislamiento NK. La suspensión celular se aplicó automáticamente en la columna, se lavó y la fracción de los efluentes sin marcar, con jas células NK, se recogieron en un nuevo tubo cónico de 50 mi. Las células NK resultantes se sembraron en 30 mi de medio RPMI completo (RPMI-1640 suplementado con suero fetal bovino al 5 %, 1 % de penicilina-estreptomicina, HEPES1 mM, piruvato de sodio 1 mM, solución de aminoácidos no esenciales al 1 % 100X MEM) durante la noche. El análisis posterior y todas las diluciones se realizaron en un medio RHBP (medio RPMI 1640 suplementado con HEPES 20 mM, pH 7,4, BSA 0,1 % y 1 % de penicilina estreptomicina).
Se separaron en alícuotas varias concentraciones de anticuerpos en un medio RHBP, por duplicado, a 50 L pocillo en una placa de fondo redondo de 96 pocilios. Las células diana se resuspendieron hasta 106 células/ml en un medio RHBP y se agregaron a 100 µ?/pocillo a cada pocilio conteniendo diluciones de anticuerpos. La placa conteniendo las células diana y las diluciones de anticuerpos se incubaron durante 30 min, a 37 ° C. Se agregaron entonces, a los pocilios, las células NK, s a 50 µ17???????. La relación típica fue de aproximadamente 1 célula diana a 3-4 células NK. Por lo menos, los siguientes controles se establecieron para cada experimento: las células NK solas, las células diana solas (liberación espontánea de LDH (por sus siglas en Idioma Inglés)), las células objetivo con las células NK (liberación de LDH), las células diana con TritonX -100 10 % (liberación máxima de LDH). Las mezclas fueron incubadas a 37 0 C durante 4 horas para permitir la lisis celular. Las placas fueron centrifugadas durante 10 min a 1200 rpm, y se transfirió, cuidadosamente, 100 µ\- del sobrenadante a una nueva placa de 96 pocilios de fondo chato. La mezcla de reacción de LDH (100 µ?_/??????) desde un Cytotoxicity Detection Kit (Roche 1 644 793) se añadió a cada pocilio y se incubo a temperatura ambiente durante 5 a 30 min. La densidad óptica de las muestras se midió a 490 nm (OD490). El porcentaje específico de lisis para cada muestra se determinó utilizando la siguiente fórmula: porcentaje de lisis específica = (valor de la muestra - liberación éspontánea)/(liberación máxima - liberación espontánea) * 100.
La incubación con huCD20-7 condujo a una buena actividad ADCC contra las células del linfoma de Ramos y contra las células de la leucemia linfocítica crónica JVM-13 (CLL) en presencia de células efectoras NK humanas. La actividad ADCC de las células del linfoma de Ramos fue comparada para huCD20-7, rituximab, GA101 -F y 2F2 (Figuras 17A y 17B). El tratamiento con huCD20-7 dio como resultado aproximadamente un 80% de lisis de las células de Ramos, actividad similar a las observadas con otros anticuerpos CD20. La actividad ADCC mediante huCD20-7 tuvo un EC50 de 1.1 ng/mL, rituximab tuvo un EC50 de 3.5 ng/mL, 2F2 de 1.2 ng/mL y GA101 -F de 0.59 ng/mL. La actividad ADCC de huCD20-7 en las células de JVM-13 CLL fue comparada con la del rituximab y la del 2F2. El tratamiento con huCD20-7 causó aproximadamente un 40% de lisis de las células JVM-13, similar al rituximab o 2F2. La actividad ADCC por huCD20-7 tuvo un EC50 de 0.23 ng/mL, rituximab tuvo un EC50 de 0.29 ng/mL y 2F2 de 0.17 ng/mL.
Ejemplo 12 Mapeo de Epítopes El dominio extracelular del CD20 contiene dos lazos extracelulares. El lazo más grande consiste de aproximadamente 44 aminoácidos entre el tercer y cuarto dominio transmembranal. La mayoría de los anticuerpos CD20 descritos requieren para una unión efectiva, por lo tanto, de residuos de aminoácidos en el lazo más grande. El análisis de mutagénesis ha identificado al menos a la alanina 170 (A170) y a la prolina 172 (P172) como los residuos críticos para la unión de los anticuerpos (Polyak, Blood, 99:3256-3262 (2002); y Polyak, J. Immunol., 161 :3242-3248 (1998)). Cambiando los residuos A170 y P172 por serinas, el aminoácido que se encuentra en estas posiciones en el CD20 murino, se impide la unión de los anticuerpos CD20, tal como el B1 . Del mismo modo, la introducción de residuos A170 y P172 en un CD20 conteniendo el lazo extracelular grande murino, permitió la unión de la mayoría de los anticuerpos CD20, incluyendo B1 y rituximab. En contraste, ha sido reportado que un conjunto inusual de anticuerpos, entre los que se incluye el 2F2, se unen a la de CD20 A170S P172S (Teeling y col. (2006), suprá). Además, cambiando el residuo de asparagina 163 (N163) o la asparagina 166 (N166) por ácido aspártico, se redujo la unión de 2F2, mientras que esto no afecta la unión de otros anticuerpos anti-CD20, tal como el B1 o el rituximab (Teeling y col. (2006) Blood. 177:363-371 ). Se ha sugerido que este epítope novedoso está relacionado con su actividad biológica, lo que supone una actividad CDC potente, pero una actividad limitada pro-apoptótica directa contra las células tumorales. Para caracterizar CD20-7 y CD20-6 analizamos su unión a las variantes del CD20.
Clonación y expresión de una Variante del CD20 La expresión del plásmido pSRA-CD20 contiene la secuencia completa del cADN del CD20 humano, con codones optimizados y sintetizado por Blue Heron Biotechnologies, flanqueado por los sitios de restricción Xba\ y SamHI para la clonación en el vector pSFta. La variante de CD20-A170S P172S (CD20-AP) fue creada mediante mutagénesis por PCR, utilizando el cebador 5' hCD20sacAP-SS (ATTAGAGCTCACACACCATATATTAACATATACAACTGTGAACCATCGAATTCCTCTG AGAAAAACT (SEQ ID NO: 41 )), junto con un cebador 3' reverso SRaMfeI R (AATGCAATTGTTGTTGTTAACT (SEQ ID NO: 42)) para amplificar un Sacl a un fragmento Mfe1 del plásmido PSRA-CD20, conteniendo la mutación A170S P172S. Este producto de PCR fue clonado en los sitios SacI y Mfe1 del plásmido PSRA-CD20. La mutagénesis introdujo un sitio EcoRI y el cambio de secuencia del CD20 en los clones resultantes fue verificado mediante la digestión con enzimas de restricción seguida de una secuenciación del ADN. El CD20 N163D N166D doble (CD20-NNDD) y los mutantes simples CD20 N163D (CD20-N163D) fueron generados mediante mutagénesis de PCR del mismo fragmento SacI a Mfe1 , mediante la modificación de los codones específicos en los extremos 5'de los cebadores. El fragmento muíante CD20 N163D N166D fue amplificado con el extremo 5' del cebador hCD20sacNN-DD 5' (ATTAGAGCTCACACACCATATATCGATATATACGATTGTGAACCA (SEQ ID NO: 43)) y el fragmento de CD20 N163D se amplificó con extremo 5' del cebador hCD20sacN163D (ATTAGAGCTCACACACCATATATTGATATCTACAACTGTGA (SEQ ID NO: 44)). Los fragmentos de la PCR SacI a N lfe1 PCR fueron clonados en los sitios SacI y Mfe1 del pSRA-CD20 y los constructos fueron examinados para los sitios introducidos Cla1 o EcoRV, respectivamente. Los clones positivos fueron confirmados por secuenciamiento del ADN.
Las líneas celulares estables fueron creadas por la transfección de los plásmidos de expresión de la variante CD20 en células 300-19 utilizando procedimientos conocidos de electroporación. En pocas palabras, 5 x 106 células 300-19 se electroporaron en un medio frío RPMI-1640 mediante el uso de un BioRad Gene Pulser fijado en 260V y 960 ?. Posteriormente, las células se diluyeron y se sembraron en placas de 96 pocilios en medios RPMI-1640 suplementados con FBS 10 % y 50 µ? de ß-mercaptoetanol. Después de 24 horas, el G418 (por ejemplo, tal como es obtenido de Invitrogen) se añadió hasta una concentración final de 2 mg/mL, para seleccionar las células transfectadas. Después de 2 semanas, las colonias únicas se aislaron y se expandieron.
Unión del anticuerpo a las variantes del CD20 La unión de varios anticuerpos CD20 a CD20 AP, expresando CD20 humano de tipo salvaje y variantes, se analizó mediante citometría de flujo. Como puede verse en la Figura 18A y en la Figura 18B, todos los anticuerpos incluyendo CD20-7 y CD20-6 se unieron a las células que expresan CD20 de tipo salvaje. Los datos obtenidos para las variantes CD20AP se muestran en las Figuras 19A y 19B. Como era de esperarse, el rituximab y GAI O^F no se unieron a la variante CD20AP, mientras que B1 mostró una unión mínima. En comparación, 2F2 puede unirse a la variante CD20AP, tal como se reportó previamente (Teeling y col. (2006), supra). Sorprendentemente, huCD20-7 se une a la variante CD20AP (ver Figura 19A). De manera similar, muCD20-6 y muCD20-7 también son capaces de unirse a la variante CD20AP (ver Figura 19B). Las mutaciones N163D y N166D han demostrado reducir la unión de 2F2, mientras que no afectan la unión de otros anticuerpos anti-CD20 como el B1 o el rituximab. De acuerdo a lo esperado, el rituximab y el GA101 -F se unieron a la variante CD20-N163D, mientras que el 2F2 mostró una unión reducida (Figura 20A). En comparación, huCD20-7, muCD20-7 y muCD20-6 mostraron una pérdida de unión a CD20 N163D. De manera similar, el rituximab y el GA101 -F se unieron a la variante CD20-N163D N166D, mientras que 2F2 mostró una unión mínima (Figuras 21 A y 21 B). Nuevamente, huCD20-7, muCD20-7 y muCD20-6 mostraron una pérdida de la unión al CD20 N163D N166D.
Este resultado inesperado indica que el huCD20-7 está funcionalmente relacionado con los anticuerpos de tipo II tal como el GA101 y el B1 , pero que claramente requiere de un epítope diferente al de aquellos anticuerpos. A diferencia de muchos otros anticuerpos, huCD20-7 no es dependiente de los residuos A170 y P172 del CD20. Por lo tanto, huCD20-7 es un nuevo anticuerpo CD20 con una, hasta ahora, no realizada combinación de características físicas y funcionales.
Ejemplo 3 Preparación de huCD20-7-SPP-DM1 El enlazador N-succinimidilo 4- (2-piridilditio) pentanoato (SPP, por sus siglas en Idioma Inglés) se disolvió en etanol. El anticuerpo huCD20-7 se incubó a 8 mg/mL con un exceso molar del enlazador SPP de 7 veces, durante aproximadamente 100 minutos, a temperatura ambiente, en amortiguador de fosfato de potasio de 50 mM (pH 6,5) conteniendo NaCI 50 mM, EDTA 2 mM y etanol al 5 %. La mezcla de reacción se purificó mediante una columna de Sephadex™ G25F equilibrada con el amortiguador de fosfato de potasio antes mencionado. Las fracciones que contenían anticuerpos se agruparon y se utilizaron en las etapas siguientes.
A modo de ejemplo, un maitansinoide DM1 se disolvió en dimetilacetamida (DMA, por sus siglas en Idioma Inglés, concentración final 3 %) y se añadió gota a gota al anticuerpo modificado SPP (1 ,7 veces de exceso molar relativo al enlazador). Después de la incubación durante la noche, a temperatura ambiente, el anticuerpo conjugado se purificó mediante cromatografía en Sephadex™ G25F equilibrada en amortiguador de fosfato salino (PBS), pH 6,5. El conjugado huCD20-7-SPP-DM1 fue entonces diaüzado en un amortiguador conteniendo histidina 10 mM, glicina 250 mM, sacarosa 1 %, pH 5,5. El número de moléculas de DM1 unidas por molécula de anticuerpo se determinó utilizando los coeficientes de extinción informados anteriormente para los anticuerpos y el DM1 (Liu y col., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 93, 8618-8623 (1996)). El porcentaje de maitansinoides libres presentes después de la reacción de conjugación se determinó mediante la inyección de 20 a 50 µg conjugado en una columna HiSep™, equilibrada en acetonitrilo 25 %, en amortiguador de acetato de amonio 100 mM, pH 7,0 y eluyendó en acetonitrilo. El área del pico de especies maitansinoides libres totales (eluido en el gradiente e identificado mediante comparación del tiempo de elución con estándares conocidos) se midió con un detector de absorbencia establecido, en una longitud de onda de 252 nm y comparando con el área de los picos relacionada con la unión de los maitansinoides (eluido en el pico conjugado en la columna de flujo a través de fracciones) para calcular el porcentaje del total de especies maitansinoides libres. Los conjugados con 3,5-4 moléculas de DM1 por anticuerpo huCD20- 7 fueron obtenidos estando menos del 1 % presentes como maitansinoides sin conjugar.
Preparación de huCD20-7-SMCC-DM1 El enlazador de (succinimidil 4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1 -carboxilato (SMCC, Pierce Biotechnology, Inc) fue disuelto en DMA. El anticuerpo huCD20-7 fue modificado con SMCC para introducir maleimidas en el anticuerpo, incubando el anticuerpo a 8 mg/mL en fosfato de potasio 50 mM, NaCI 50 mM, EDTA 2 mM, pH 6,5 con un exceso de 7,5 a 10 molar del SMCC. Después de agitar durante 2 a 4 horas en atmósfera de argón a temperatura ambiente, la mezcla de la reacción se purificó utilizando una columna de Sephadex™ G25 equilibrada con el mismo amortiguador de fosfato de potasio. Las fracciones que contenían anticuerpos se agruparon y se utilizaron en las etapas siguientes.
El anticuerpo modificado con SMCC se hizo reaccionar con una solución de DM1 10 mM en un exceso molar de 1 ,7 en relación con el enlazador maleimida. La reacción se agitó a temperatura ambiente, en atmósfera de argón, durante 4 horas hasta alrededor de 16 horas. La mezcla de reacción de conjugación se filtró a través de una columna de filtración por gel Sephadex™ G25 equilibrada con 1 x PBS a pH 6.5. El conjugado huCD20-7-SMCC-DM1 fue luego dializado en amortiguador conteniendo histidina 10 mM, glicina 250 mM, sacarosa 1 %, pH 5,5. El número de moléculas DM1 enlazadas por molécula del anticuerpo y el porcentaje de especies maitansinoides libres totales se determinaron como se describió anteriormente. Los conjugados con 3,5-4 moléculas de DM1 por anticuerpo huCD20-7 se obtuvieron con menos del < 1 % de maitansinoide no conjugado presente.
Preparación de huCD20-7-SPDB-DM4 A modo de ejemplo, el enlazador N-succinimidil 4- (2-piridilditio) butanoato (SPDB) se disolvió en etanol. El anticuerpo huCD20-7 se incubó a 8 mg/mL con un exceso molar de 5 veces del enlazador SPDB durante aproximadamente 100 minutos, a temperatura ambiente, en amortiguador de fosfato de potasio 50 mM (pH 6,5) conteniendo NaCI 50 mM, EDTA 2 mM y etanol al 3 %. La mezcla de la reacción se purificó mediante una columna de Sephadex™ G25F equilibrada con el amortiguador de fosfato de potasio antes mencionado. Las fracciones que contenían anticuerpos se agruparon y se utilizaron para las etapas siguientes.
El maitansinoide DM4 se disolvió en dimetilacetamida (DMA, concentración final al 3 %) y en un exceso de 1 ,7 veces molares en comparación con el enlazador se añadió gota a gota al anticuerpo SPDB modificado. Después de la incubación, durante una noche, a temperatura ambiente, el anticuerpo conjugado se purificó mediante cromatografía en Sephadex ™ G25F equilibrada con 1 xPBS a pH 6.5. El conjugado huCD20-7-SPDB-DM4 fue dializado luego en un amortiguador conteniendo histidina 10 mM, glicina 250 mM, sacarosa 1 %, pH, 5,5. El número de moléculas de DM4 enlazadas por molécula de anticuerpo se determinó utilizando los coeficientes de extinción informados anteriormente para los anticuerpos y para el maitansinoide (Widdison, WC, y col. J Med Chem, 49:4392-4408 (2006)). El porcentaje de especies maitansinoides libres totales se determinó como se describió anteriormente. Los conjugados con 3,5-4 moléculas de DM4 por anticuerpo huCD20-7 se obtuvieron con <1 % presente como maitansinoide no conjugado.
Preparación de huCD20-7-PEG4:-mal-DM4 El reactivo DM4-mal-PEG4-NHS fue disuelto DMA para obtener un solución madre 12 mM. El anticuerpo huCD20-7 fue modificado con 15 equivalentes de DM4-mal-PEG4-NHS a una concentración de anticuerpos de 4 mg/ml en fosfato de potasio 50 mM, NaCI 50 mM, EDTA 2 mM, pH 7.5 y DMA 10% en volumen. Luego de agitar durante 2 a 4 horas bajo argón a temperatura ambiente, se purificó la mezcla de reacción utilizando una columna SEPHADEX™ G25 equilibrada con el mismo buffer de fosfato de potasio.
El conjugado huCD20-7-PEG4-mal-DM4 fue luego dializado en un buffer conteniendo histidina 10 mM, glicina 250 mM, sacarosa 1 % y pH 5.5. El número de moléculas de DM4 unidas por molécula de anticuerpo y el porcentaje de especies maitansinoides libres totales se determinaron de la manera en que se describió mas arriba. Conjugados con 3.5-4 moléculas de DM4 por anticuerpo huCD20-7 fueron obtenidas con <1 % presentes como maitansinoides sin conjugar.
Preparación de huCD20-7-sulfOrmal-DM4 El DM4-mal-3-sulfo-NHS fue generado in situ mediante la reacción del enlazador 3-sulfo-mal-NHS con 1 .6 equivalentes de L-DM4-SH en DMA 60%/buffer succinato 200 mM pH 5, durante 2 horas a temperatura ambiente. 8 equivalentes de la mezcla de reacción (concentración del enlazador 4 mM) se agregó por antibiótico huCD20-7 (5 mg/ml) en fosfato de potasio 50 mM, NaCI 50 mM, EDTA 2 mM, pH 7.5 y DMA 10% en volumen. Luego de la agitación durante 2 a 4 horas bajo argón a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se purificó utilizando una columna SEPHADEX™ G25 equilibrada con el mismo buffer de fosfato de potasio.
El conjugado huCD20-7-sulfo-mal-DM4 fue entonces dializado en un buffer conteniendo histidina 10 mM, glicina 250 mM, sacarosa 1 %, pH 5.5. El número de moléculas de DM4 unidas por molécula de anticuerpo y el porcentaje de especies maitansinoides libres totales se determinaron como se describió mas arriba. Los conjugados con 3.5-4 DM4 moléculas por anticuerpo huCD20-7 fueron obtenidos con <1 % presentes como maitansinoides sin conjugar.
Ejemplo 14 Afinidad de unión de los conjugados La afinidad de enlace del huCD20-7 después de la conjugación con SMCC-DM1 o SPP-DM1 se analizó mediante ELISA, tal como se describe en el ejemplo anterior. El valor de las constantes de disociación aparentes (Kd) se calculó a partir de las curvas de unión mostradas en las Figurás 22A y 22B y corresponden a 0.7 nM para el huCD20-7, 0.9 nM para el conjugado SMCC-DM1 y 1.1 nM para el conjugado SPP-DM1 . Este resultado demuestra que, por ejemplo, la conjugación con SMCC-DM1 o SPP-DM1 no altera notablemente la afinidad del anticuerpo (por ejemplo, del CD20-7).
Además, la afinidad de unión de huCD20-7 luego de la conjugación a, por ejemplo, sulfo-mal-DM4 fue ensayada mediante ELISA, tal como se describe en el ejemplo anterior. El valor para las constantes de disociación aparentes (Kd) fueron calculadas a partir de las curvas de unión que se muestran en la Figura 22B y corresponden a 0.8 nM para huCD20-7, 1.3 nM para los conjugados sulfo-mal-DM4. Este resultado demuestra que la conjugación sulfo-mal-DM4 no altera de manera notable la afinidad del anticuerpo (por ejemplo, huCD20-7).
Actividades Pro-apoptóticas de los conjugados La actividad pfo-apoptótica de huCD20-7 después de la conjugación a SMCC-DM1 o SPDB-DM4 se ensayó en células de Ramos mediante, por ejemplo, el ensayo con Anexina-V que se describió anteriormente. Las células de Ramos fueron incubadas con diferentes concentraciones, de conjugados o anticuerpos huCD20-7, durante 20 horas, luego se tiñeron con Anexina V-FITC y TO-PRO®-3 y se analizaron por citometría de flujo. El porcentaje de células positivas a la Anexina- V fue graficado contra la concentración de anticuerpos, en la Figura 23, en una representación semi-log. El tratamiento con huCD20-7 dio como resultado un máximo del 51 % de células positivas a Anexina-V, en comparación con un 3% para las células sin tratar. El tratamiento con rituximab indujo sólo un 10% de células positivas a Anexina-V. El tratamiento con conjugados huCD20-7-SMCC-DM1 dio como resultado un incremento de células positivas a Anexina-V de un 73%, mientras que el tratamiento con huCD20-7-SPDB-DM4 dio como resultado otro incremento del 82%. En comparación, los conjugado S CC-DM1 o SPDB-DM4 de anticuerpo de control de isotipos de no unión dieron como resultado un 4% o un 8% de células positivas a Anexina-V, respectivamente. La actividad pro-apoptótica de, por ejemplo, huCD20-7 contra las células de Ramos se incrementa mediante la conjugación con maitansinoides.
Actividad CDC de los Conjugados La actividad CDG de, por ejemplo, huCD20-7 después de la conjugación i fue ensayada en células de linfoma en presencia de complemento humano, tal como se describe arriba. Como se observa en la Figura 24A para las células del linfoma de Daudi, los conjugados a modo de ejemplo SPDB-DM4 y PEG4-mal-DM4 del huCD20-7 tuvieron una actividad CDC similar a la del anticuerpo sin conjugar, con una EC50 de aproximadamente 0.4 pg/ml. En las células del linfoma de las células B grandes difusas WSU-DLCL-2 (Figura 24B), huCD20-7, huCD20-7-SPDB-DM4 y huCD20-7-PEG4-mal-DM4 tuvieron una actividad CDC similar con una EC50 de alrededor de 0.5 pg/ml. Como se observa en la Figura 25A para las células WSU-DLCL-2, huCD20-7, huCD20-7-SMCC-DM1 , -SPP-DM1 y sulfo-mal-DM4 tuvieron una actividad CDC similar con una EC50 de alrededor de 0.5 pg/mL. En las células del linfoma de Ramos (Figura 25B), huCD20-7, huCD20-7-SMCC-DM1 , -SPP-DM1 y sulfo-mal-DM4 tuvieron una actividad CDC similar con una EC50 de alrededor de 0.02 pg/mL. Así, la actividad CDC de, por ejemplo, huCD20-7 se mantiene después de la conjugación con maitansinoides.
Actividad ADCC de los conjugados La actividad ADCC de, por ejemplo, huCD20-7, después de la conjugación con SMCC-DM1 , se evaluó en células de Ramos y en células Granta-519, en presencia de células efectoras NK mediante el ensayo de liberación de LDH, tal como se describió anteriormente. Como se puede observar en las Figuras 26A y 26B, los conjugados huCD20-7-SMCC-DM1 tienen un actividad ADCC similar a la de los anticuerpos huCD20-7 no conjugados, en las células de Ramos, con una lisis celular máxima del 40 % cada uno y una EC50 de 1 ,8 ng/ml y 1 ,4 ng/ml, respectivamente. Se obtuvieron resultados similares utilizando otras células (por ejemplo, células Granta-519 MCL), como células diana. Los conjugados huCD20-7-SMCC-DM1 tienen, en las células Granta-519, una actividad ADCC comparable a la de los anticuerpos huCD20-7 no conjugados, con aproximadamente un 25 % de lisis celular máxima cada uno y una EC50 de 0,22 ng/ml y 0,14 ng/ml, respectivamente. Como se ve para CDC, la actividad ADCC de huCD20-7 se mantiene después de la conjugación con maitansinoides.
Ejemplo 15 Ensayos de citotoxicidad in vitro A modo de ejemplo, la capacidad de los conjugados huCD20-7 para inhibir el crecimiento celular se midió utilizando ensayos de citotoxicidad in vitro. En general, las células diana se sembraron a 5.000 células por pocilio en 100 µ?_ de medio RPMI completo (RPMI-1640, suero fetal bovino 10 %, glutamina 2 mM, 1 % de penicilina-estreptomicina, todos los reactivos de Invitrogen). Los anticuerpos y los conjugados se diluyeron en medio RPMI completo usando 3 series de dilución y se añadieron a 100 µ? por pocilio. La concentración final general estuvo en el rango de desde 3 x 10-8 M hasta 4,6 x 10 a '12 M. Las células se, incubaron a 37° C en una incubadora humidificada con C02 5 % durante 4 a 5 días. La viabilidad de las células restantes se determinó mediante ensayo de colorimetría WST-8 (Dojindo Molecular Technologies, Inc., Rockville, MD, US). WST-8 se reduce mediante las deshidrogenases en las células vivas, a un producto formazán naranja que es soluble en el medio de cultivo de tejidos. La cantidad de formazán producido es directamente proporcional al número de células vivas. WST-8 fue añadido al 10 % del volumen final y las placas se incubaron a 37° C en una incubadora humidificada con C02 al 5 % por un período adicional de 2-4 horas. Las placas fueron analizadas mediante la medición de la absorbancia a 450 nm (A450) en un lector de placas de multipocillo. La absorbancia de fondo A 50 de los pocilios con medio y únicamente WST-8, se restó de todos los valores. El porcentaje de viabilidad se calculó dividiendo cada valor de la muestra tratada por el valor promedio de los pocilios con células no tratadas. Porcentaje de viabilidad = 100 * (A450 de la muestra tratada - A450 del fondo)/( A 50 de la muestra no tratada - A450 del fondo). El valor del porcentaje de la viabilidad se gráfico contra la concentración del anticuerpo o la concentración del conjugado, en un gráfico semi-log, para cada tratamiento.
Citotoxicidad in vitro de huCD20-7 y huCD20-7-SMCC-DM1 en células de Ramos La citotoxicidad in vitro de uCD20-7 y huCD20-7-S CC-DM1 contra las células de Ramos se comparó con la actividad de rituximab y de un conjugado no específico hulgG-SMCC-DM1 . Como se observa en la Figura 27A, la incubación de huCD20-7 resultó en una reducción de la viabilidad de un 60%, mientras que el rituximab redujo la viabilidad a un 80%. El tratamiento con huCD20-7-S CC-DM1 redujo completamente la viabilidad con una EC50 de 0.68 nM, mientras que el conjugado no-específico hulgG-SMCC-DM1 tuvo un EC50 de 20 nM, resultando en una inesperada ventana especificidad 29 veces significativa para huCD20-7-SMCC-DM1.
Citotoxicidad in vitro de huCD20-7 v huCD20-7-SMCC-DM1 en células de Daudi La citotoxicidad in vitro para huCD20-7 y huCD20-7-SMCC-DM1 contra las células de Daudi fue comparada con la actividad del rituximab y con el conjugado no-específico hulgG-SMCC-DM1 . Como puede observarse en la Figura 27B, la incubación con huCD20-7 da como resultado una reducción de la viabilidad del 65% a la concentración mas alta, mientras que el rituximab redujo la viabilidad de manera mas moderada al 80%. El tratamiento con huCD20-7-SMCC-DM1 redujo completamente la viabilidad a la concentración mas alta ensayada, con un EC50 de 0.77 nM, mientras que el conjugado no específico hulgG-SMCC-DM1 tuvo un EC50 de 12 nM, dando como resultado una ventana de especificidad 16-veces significativa para el huCD20-7-SMCC-DM1 contra las células de Daudi.
Citotoxicidad In Vitro de huCD20-7 v huCD20-7-SMCC-DM1 en células Granta-519 La citotoxidad in vitro de huCD20-7 y huCD20-7-SMCC-DM1 contra células Granta-519 se comparó con la actividad del rituximab y del conjugado no específico hulgG-SMCC-DM1. Como se observa en la Figura 28A, la incubación con huCD20-7 dio como resultado una reducción el la viabilidad del 45% a la concentración mas alta, mientras que el rituximab redujo la viabilidad mas moderadamente al 60%. El tratamiento con huCD20-7-SMCC-DM1 redujo completamente la viabilidad a la concentración mas alta ensayada, con un EC50 de 0.03 nM, mientras que el conjugado no específico hulgG-SMCC-DM1 tuvo un EC50 de' 13 nM, resultando en una ventana de especificidad inesperadamente significativa de 419-veces para el huCD20-7-SMCC-DM1 contra células Granta-519.
Citotoxicidad in vitro de huCD20-47 v huCD20-7-SMCC-DM1 en Células SC-1 La citotoxicidad in vitro de huCD20-7 y huCD20-7-SMCC-DM1 ante las células SC-1 FL se comparó con la actividad de rituximab y un conjugado no específico hulgG-SMCC-DM1. Como se observa en la Figura 28B, la incubación con huCD20-7, resultó en una reducción de la viabilidad del 35 %, mientras que el rituximab redujo la viabilidad mas moderadamente al 75%. El tratamiento con huCD20-7-SMCC-DM1 redujo la viabilidad por completo a la mayor concentración ensayada con una EC50 de 0,39 nM, mientras que el conjugado no específico hulgG-SMCC-DM1 tuvo una EC50 de 31 nm, dando como resultado una ventana de especificidad inesperadamente significativa de 79 veces para huCD20-7-SMCC-DM1 contra las células SC-1 .
Citotoxicidad in vitro de huCD20-r7 y huCD20-7-SMCC-DM1 en células DOHH-2 La citotoxicidad in vitro de huCD20-7 y huCD20-7-SMCC-DM1 contra las células DOHH-2 FL se comparó con la actividad de rituximab y un conjugado no específico hulgG-SMCC-DM1 . Como se observa en la Figura 29A, la incubación de huCD20-7, en la concentración más alta, dio como resultado una reducción de la viabilidad a un 20 %, mientras que el rituximab redujo la viabilidad a un 25%. El tratamiento con huCD20-7-SMGC-DM1 redujo por completo la viabilidad a la mayor concentración probada con un EC50 de 0,12 nM, mientras que el conjugado no específico hulgG-SMCC-DM1 tuvo una EC50 de 35 nM, resultando en una ventana de especificidad inesperadamente significativa de 292 veces para el huCD20-7-SMCC-DM1 contra las células DOHH-2.
Citotoxicidad in vitro de huCD20-7-SMCC-DM1 en las células del antíqeno negativo Molt-4 A fin de verificar la especificidad de la citotoxicidad huCD20-7-SMCC-DM1 , su actividad se comparó con la de un conjugado no específico hulgG-SMCC-DM1 contra la línea celular de la leucemia linfoblástica aguda de las células T Molt-4, las cuales no expresan CD20. Una concentración aumentada de ambos conjugados se usó en este experimento para capturar la relativamente pobre citotoxicidad no específica. Como se observa en la Figura 29B, huCD20-7-SMCC-DM1 y el conjugado no específico mostraron la misma citotoxicidad con un EC550 de 33 nM.
Resumen de la citotoxicidad in vitro de huCD20-7-SMCC-DM1 huCD20-7, por ejemplo, es sorprendentemente mas activo que el rituximab contra las células de Ramos, Daudi, Grant-519, SC-1 y DOHH-2. La reducción de la viabilidad en las células diana es mayor después de la incubación con huCD20-7 que la que se observa para el tratamiento con rituximab. Además, por ejemplo, la conjugación de SMCC-DM1 con huCD20-7 le agrega una potente actividad citotóxica al anticuerpo. La viabilidad de las células tumoráles se redujo de manera mas completa en respuesta al tratamiento con el conjugado que con el tratamiento con únicamente el anticuerpo. Al comparar la potencia de huCD20-7-SMCC-DM1 contra la de los conjugados no-diana hulgG-SMCC-DM1 , una ventana de especificidad significativa se observa para cada línea de células que expresa CD20, lo que indica que la citotoxicidad es el resultado de la unión de los anticuerpos huCD20-7 a las células diana. Además, por ejemplo, huCD20-7- SMCC-DM1 y el conjugado no específico mostraron la misma citotoxicidad pobre contra las células Molt-4 antígeno negativas. Por lo tanto, la citotoxicidad observada para huCD20-7-SMCC-DM1 es dependiente de la expresión de CD20.
EC50 para los conjugados SMCC-DM1 Ejemplo 6 El huCD20-7-SMCC-DM1 es más activo que el Rituximab-SMCC-DM1 contra las Células de Ramos La citotoxicidad in vitro, por ejemplo, de huCD20-7 y huCD20-7-SMCC- DM1 contra las células de linfoma de Ramos se comparó con la actividad del rituximab, del rituximab-SMCC-DM1 y del conjugado no específico hulgG-S CC-DM1. Como se observa en la Figura 30A, la incubación con huCD20-7 dio como resultado una disminución en la viabilidad de un 55% a la concentración mas alta, mientras que el rituximab fracasó en la reducción significativa de la viabilidad. El tratamiento con huCD20-7-SMCC-DM1 redujo completamente la viabilidad con una EC50 de 0.72 nM, mientras que el conjugado no-específico hulgG-SMCC-DM1 tuvo una EC50 de 22 nM. El tratamiento con rituximab-SMCC-DM1 resultó en una citotoxicidad con una EC50 de 3,3 nM. De esta manera los conjugados huCD20-7-SMCC-DM1 presentan una actividad citotóxica in vitro más potente que la del rituximab-SMCC-DM1 .
El huCD20-7-SMCC-DM1 es más activo que Rituximab-SMCC-DM1 Contra las células de Daudi La citotoxicidad in vitro de huCD20-7 y huCD20-7-SMCC-DM1 contra, por ejemplo, las células del linfoma de Daudi se comparó con la actividad del rituximab, del rituximab-SMCC-DM1 y del conjugado no específico hulgG-SMCC-DM1 . Como se observa en la Figura 30B, la incubación con huCD20-7 dio como resultado una reducción de la viabilidad a un 50% a la concentración mas alta, mientras que el rituximab redujo la viabilidad a un 65%. El tratamiento con huCD20-7-SMCC-DM1 abolió la viabilidad con una EC50 del .O nM, mientras que el conjugado no específico hulgG-SMCC-DM1 tuvo un EC50 de 15 nM. El tratamiento con rituximab-SMCC-DM1 resultó en una citotoxicidad con una EC50 de2.6 nM. Por lo tanto, los conjugados huCD20-7-SMCC-DM1 tienen una actividad citotóxica más potente que el rituximab-SMCC-DM1 .
Ejemplo 17 Preparación de conjugados radio-marcados Conjugados radiomarcados de huCD20-7 y rituximab se prepararon utilizando esencialmente los mismos métodos descritos por Widdison y col. (Widdison y col. J Med Chem 2006;49:4392-408) para los conjugados sin marcar, con la excepción de que se utiliza DM1 marcado con tritio ([3H]DM1 ). Este método también se describe en detalle en Erickson y col. (Erickson y col. Bioconjug Chem 2010; 21 :84-92). [554] Brevemente, los anticuerpos son primero modificados en sus residuos lisina con N-succinimidil 4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1 carboxilato (SMCC) y purificados mediante filtración por gel antes de la conjugación al DM1 con tritio incorporado de manera estable en el grupo metoxi C-20. El DM1 marcado con tritio fue preparado a partir de Ansamitocin P-3. El grupo metoxi C-20 de Ansamitocinas P-3 fue retirado mediante incubación con la cepa bacteriana Streptomyces platensis para obtener ansamitocinas PDM-3 (Asai y col., Patente U.S. 4,307,016). La porción C-20-OH de las ansamitocinas PDM-3 fue entonces metilada utilizando yoduro de metilo marcado con tritio por medio del método descrito por Sawada (Sawada y col. Bioconj Chem 1993;4:284-289). La proporción de moléculas de maítansinoide unidas por molécula de anticuerpo (D/A) y las radioactividades específicas fueron como sigue: rituxumab-SMCC-[3H]DM1 (3,5 D/A, 1 ,9 Ci/mmol) y huCD20-7-SMCC-[3H]DM1 (3,4 D/A, 1 ,8 Ci/mmol).
Actividad del rituximab-SMCC-[3HlDM1 v del huCD20-7-SMCC-[3H1DM1 Se encontró que los dos conjugados y los anticuerpos sin modificar correspondientes tuvieron todos afinidades de unión similares a las células SU-DHL-4 CD20 positivas (Figura 31 A). La potencia citotoxica de los dos conjugados hacia células SU-DHL-4 CD20-positivas y células COLO205 CD20-negativas fueron evaluadas utilizando un ensayo de viabilidad basado en células, tal como el que se describe en el Ejemplo 15. Se encontró que ambos conjugados son potentes, con valores de IC50 de aproximadamente 0,1 nM y 0,24 nM para huCD20-7-SMCC-[3H]DM1 y conjugado rituximab-SMCC-[3H]DM1 , respectivamente (Figura 31 B). De acuerdo a lo esperado, ambos conjugados presentaron una potencia pobre contra la línea celular de cáncer de colon COLO205 antígeno-negativa con valores de EC50 de 34 nM y 1 1 nM para huCD20-7-SMCC-[3H]DM1 y conjugado rituximab-SMCC-[3H]DM1 , respectivamente. Esto muestra que la muerte celular por estos dos conjugados es CD20-dependiente. Como se observa en el Ejemplo 16 paras la células de Ramos y de Daudi, los conjugados huCD20-7- SMCC-[3H]DM1 tienen una actividad citotóxica más potente que el rituximab-SMCC-DM1 contra las células SU-DHL-4.
Metabolitos de células diana de rituximab-SMCC-í3HlDM1 y huCD20-7-SMCC-r3H1DM1 Para evaluar la cantidad y tipo de metabolito formado luego de la exposición de las células diana a los conjugados marcados por radioactividad, cultivos de células SU-DHL-4 (17 x 106 ) en 21 mL de medio RPMI-1640 suplementado con 10% FBS fueron expuestos a 40 nM del 3H-conjugado durante 30 min a 37°C, 6% C02. Las células fueron lavadas tres veces en medio RPMI-1640 para eliminar cualquier conjugado no unido y fueron re-suspendidas en medio de cultivo fresco (8 x 105 células/mL) e incubadas a 37°C, 6% C02 durante 22 h. Las células se recolectaron y se suspendieron en 0,3 mL de solución salina amortiguada conTris, pH 7,5. Se agregó acetona (4:3 v/v) y las muestras se mezclaron y se congelaron a -80°C durante 1 h para precipitar proteínas. Las muestras se descongelaron y sé centrifugaron a 2,000 x g durante 15 min y se separaron los sobrenadantes y sedimentos. Los sobrenadantes conteniendo los metabolitos maitansinoides libres de proteínas se evaporaron hasta sequedad utilizando una centrífuga evacuada. Los extractos se disolvieron en 0,12 mL de acetonitrilo acuoso al 20% conteniendo ácido trifluoroacético 0,025% y los metabolitos maitansinoides y los Maitansinoides se separaron en una columna analítica C-18 (Vydac, 0,46 x 25 cm) (Erickson y col. Cáncer Res 2006;66:4426-33). El efluente se recogió en fracciones de 1 mL y la radioactividad asociada con cada fracción se determinó por medio de la mezcla de cada vial con 4 mL de cóctel de líquido de centelleo Ultima Gold antes de contar durante 5 min en un contador de líquido de centelleo Tri-Carb 2900T.
El sedimento en acetona se resuspendió en 0,3 mL de agua y se disolvió mediante el agregado de 1 mL de reactivo Solvable (Perkin Elmer). Las muestras fueron entonces incubadas durante la noche, en un baño de agua a 50°C. Las muestras se retiraron de la incubación y, a cada una, se le agregó 0,1 ml_ de EDTA 0,1 M y 0,3 ml_ de peróxido de hidrógeno 30%, seguido de una incubación a temperatura ambiente durante 15 min. Luego las muestras se incubaron durante 1 h a 50°C. A cada muestra se le agregó 0,2 mL de HC1 1 N antes del agregado de 15 mi de fluido de centelleo Ultima Gold. Las muestras se agitaron vigorosamente y se mantuvieron en la oscuridad durante la noche, antes de contar mediante conteo de centelleo líquido (LSC).
Una corta exposición de las células SU-DHL-4 a ambos huCD20-7-SMCC-[3H]DM1 y rituximab-SMCC-[3H]DM1 resultó en un alto nivel similar de conjugados unidos por célula (Figura 32A). La cantidad de cada conjugado unido por célula se determinó a partir de la radioactividad total asociada con las células luego de una exposición inicial al conjugado y a las etapas de lavado. Los metabolitos maitansinoides se cuantificaron luego de 22 h de exposición mediante extracción con acetona y separación por HPLC mediante radio-detección. Se encontró que el único metabolito observado dentro de las células, luego de 22 h de exposición a ambos conjugados, fue lisina-S CC-[3H]DM1 . No se observó ningún otro metabolito. El metabolito lisina-SMCC-[3H]DM1 fue previamente identificado como el único metabolito de célula diana del huC242-SMCC-[3H]DM1 (Erickson y col. Cáncer Res 2006;66:4426-33). Se encontró que el nivel de metabolito de lisina-SMCC-[3H]DM1 luego de 22 h de exposición de las células al conjugado huCD20-7-SMCC-[3H]DM1 fue de aproximadamente 0,6 pmol/106 células. En contraste, se encontró que el nivel de metabolito de lisina-SMCC-[3H]DM1 , luego de 22 h de exposición de las células al conjugado rituximab-[3H]DM1 fue de aproximadamente 0,3 pmol/106 células. Por lo tanto, un nivel dos veces mayor de metabolito se forma luego de la exposición de las células al huCD20-7-SMCC-[3H]DM1 que el que se forma luego de la exposición a rituximab-SMCC-[3H]DM1 (Figura 32B). Este nivel aumentado de metabolito formado por medio del conjugado huCD20-7 puede dar lugar a una mayor actividad in vitro del conjugado huCD20-7. Por lo tanto, huCD20-7, por ejemplo, es un anticuerpo con propiedades físicas y funcionales únicas, que permiten que sea más eficaz in vitro como un conjugado no escindible.
Ejemplo 18 Citotoxicidad in vitro de los conjugados huCD20-7 con Diferentes Enlazadores La citotoxicidad de huCD20-7-SMCC-DM1 se comparó con la de los conjugados preparados con diferentes enlazadores. Tal como se puede observar en la Figura 33A, los conjugados de SPDB-DM4 y PEG4-mal-D 4 con huCD20-7, por ejemplo, tienen una actividad citotóxica Similar a la de los conjugados SMCC-DM1 contra las células Granta-519. Cualquiera de los conjugados resulta en una reducción completa de la viabilidad celular con un EC50 de 0.06 nM. Como se observa en la Figura 33B, los conjugados de SPP-DM1 y sulfp-mal-DM4 con huCD20-7, por ejemplo, también tienen una actividad citotóxica similar a la de los conjugados SMCC-DM1 contra las células Granta-519. Todos los conjugados resultan en una reducción completa de la viabilidad celular con un EC50 de 0.1 nM.
Ejemplo 19 La eficacia in vivo de los anticuerpos huCD20-7 en un modelo de Xenotransplante SU-DHL-4 A modo de ejemplo el anticuerpo huCD20-7 fue ensayado utilizando el modelo de xenotransplante establecido de células de linfoma de las células B largas difusas SU-DHL-4 implantadas por vía subcutánea en ratones SCID. Los ratones fueron tomados aleatoriamente por su peso corporal en grupos de tratamiento, y tratados tres veces por semana los días 14, 21 y 28, después de la inoculación con las células, ya sea con 10 o con 1 mg/kg de huCD20-7 o rituximab. El volumen tumoral medio de los diferentes tratamientos se gráfica en la Figura 34. El tratamiento con rituximab dio como resultado una disminución en el volumen tumoral medio en comparación con el control PBS para ambas dosis, siendo la dosis de 10 mg/kg más potente que la dosis de 1 mg/kg. El tratamiento con huCD20-7 a 1 mg/kg dio como resultado una disminución mas pronunciada en el volumen tumoral medio en comparación con el PBS que el rituximab a esa misma dosis. El tratamiento con huCD20-7 a 10 mg/kg dio como resultado una reducción más dramática del crecimiento tumoral vis-á-vis con el rituximab. En el día 66 del estudio, el tratamiento con huCD20-7 dio como resultado 7 de 10 sobrevivientes libres de tumores (TFS, por sus siglas en Idioma Inglés ), mientras que el tratamiento con rituximab dio como resultado en únicamente 1 de 10 TFS. Ningún TFS fue observado en el control PBS y en ambos grupos control con 1 mg/kg.
Ejemplo 20 Eficacia In Vivo del anticuerpo huCD20-7 y de los conjugados -SPP-DM1 , SMCC-DM1 y BMPS-DM1 en un modelo de Xenotransplante Daudi Anticuerpos huCD20-7 y conjugados de los mismos fueron ensayados para determinar su eficacia in vivo en un modelo de xenotransplante utilizando células del linfoma de Daudi implantadas por vía intravenosa en ratones SCID. Los ratones fueron tomados aleatoriamente por peso corporal en grupos de tratamiento y fueron tratados una vez el día 7 luego de la inoculación, ya sea con 10 mg/kg de huCD20-7, 10 mg/kg de huCD20-7-S CC-D 1 o 5 mg/kg de huCD20-7-SPP-DM1. El número de ratones sobrevivientes en los diferentes grupos de tratamiento se gráfica en la Figura 35A. La supervivencia media del grupo de ratones tratado con PBS fue de 27 días. El tratamiento con huCD20-7 dio como resultado un incremento en la supervivencia media de 45 días. Ambos conjugados dieron además como resultado un incremento en la supervivencia media en comparación con la del anticuerpo. huCD20-7-SMCC-DM1 y huCD20-7-SPP-DM1 dieron como resultado una supervivencia media de 64 días y 58 días, respectivamente.
En un modelo de xenotransplante similar utilizando células de linfoma de Daudi implantadas de manera intravenosa en ratones SCID, los ratones fueron tratados el día 7 luego de la inoculación con las células con 10 mg/kg of huCD20-7, rituximab, huCH20-7-SMCC-DM1 o huCH20-7-BMPS-DM1 . El número de ratones sobrevivientes en los diferentes grupos tratados se gráfico en la Figura 35B. La supervivencia media del grupo de ratones tratados con PBS fue de 31 días y el tratamiento con huCH20-7 dio como resultado un aumento en la supervivencia media de 49 días. En contraste, el tratamiento con rituximab dio como resultado un incremento en la supervivencia media de solo 40 días. Ambos conjugados basados en huCD20-7 dieron como resultado un aumento adicional en la supervivencia en comparación el anticuerpo, resultando el huCH20-7-SMCC-DM1 y el huCH20-7-BMPS-DM1 en una supervivencia del 90% del 100% en el día 5, respectivamente.
Eficacia In Vivo de un anticuerpo huCD20-7 y de los conjugados -SPP-DM1 v SMCC-DM1 en un Modelo de Xenotransplante DOHH-2.
A modo de ejemplo, anticuerpos huCD20-7 y conjugados de los mismos fueron ensayados en un modelo de xenotransplante utilizando células del linfoma folicular DOHH-2 implantadas de manera subcutánea en ratones SCID. Los ratones fueron asignados al azar, por el peso corporal, en grupos de tratamiento y se trataron una vez el día 3 después de la inoculación con las células, ya sea con 10 mg/kg de huCD20-7, 10 mg/kg de huCD20-7-SMCC-DM1 o 5 mg/kg de huCD20-7-SPP-DM1 . El volumen tumoral medio de los diferentes grupos de tratamiento se gráfica en la Figura 36. El tratamiento con el anticuerpo huCD20-7 resultó en una disminución en el volumen tumoral promedio en comparación con el control de PBS. Una eficacia mejorada se observó para los conjugados por huCD20-4 en comparación con el anticuerpo sin conjugar. Al final del estudio, en el día 90, el tratamiento con huCD20-7 resultó en 6 de 10 sobrevivientes libres de tumor (TFS), mientras que el tratamiento con huCD20-7-SMCC-DM1 resultó en 4 de 10 TFS y el tratamiento con huCD20-7-SPP-DM1 resultó en 10 de 10 de TFS. No se observó ningún TFS en el grupo de control con PBS.
Resumen de la eficacia in vivo de los conjugados basados en huCD20-7 Los conjugados de anticuerpos CD20 han sido descritos previamente. En un caso, los conjugados no-escindibles SMCC-DM1 de un anticuerpo anti-CD20 mostró la misma eficacia que el anticuerpo sin conjugar, mientras que un conjugado escindible SPP-DM1 del mismo anticuerpo mostró una mejora de la eficacia en un modelo de xenotransplante de Granta-519 en ratones SCID (Polson y col., supra). Del mismo modo, los conjugados de rituximab con caliqueamicina con un enlazador de amida estable a los ácidos no mostró un mejora en la eficacia in vivo en un modelo de xenotransplante de Ramos en ratones desnudos. Solamente los conjugados de rituximab con caliqueamicina con un enlazador Ac-But dimetil hidrazida lábil a los ácidos mostraron una mejora en la eficacia in vivo en este estudio (DiJoseph y col., Supra).
Sorprendentemente, los conjugados no escindibles de huCD20-7, como por ejemplo los conjugados SMCC-DM1 o BMPS-DM1 , muestran una eficacia in vivo dramáticamente mejorada en 2 modelos de xenotransplante diferentes en comparación con el anticuerpo sin conjugar. Además, los conjugados escindibles de huCD20-7, tal como por ejemplo, los conjugados SPP-DM1 , muestran una eficacia igualmente mejorada in vivo comparado con el anticuerpo sin conjugar. Por ejemplo el huCD20-7 es un anticuerpo con propiedades físicas y funcionales únicas, que permiten que sea más eficaz in vivo como un conjugado no escindible.
Mientras que la invención ha sido descrita en detalle y con referencia a los aspectos específicos de la misma, es evidente para un experto en la materia que varios cambios y modificaciones se pueden hacer, sin apartarse del espíritu y alcance de la misma.

Claims (93)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo o un fragmento del mismo que se une de manera específica a un CD20, en donde dicho anticuerpo o fragmento es capaz de inducir la apoptosis, la citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCC) y la citotoxicidad dependiente de complemento (CDC).
2. El anticuerpo o el fragmento de la reivindicación 1 , en donde dicho anticuerpo o dicho fragmento es murino, no-humano, humanizado, quimérico, con su superficie acondicionada {"resurfaced") o humano.
3. El anticuerpo o fragmento de la reivindicación 1 , en donde dicho anticuerpo o dicho fragmento es monoclonal o de monocadena.
4. Un anticuerpo o fragmento del mismo producido mediante el hibridoma (No. de Acceso ATCC PTA-10486) o el hibridoma (No. de Acceso ATCC PTA-10487).
5. El anticuerpo o el fragmento del mismo de la reivindicación 1 , obtenido de células huésped eucarióticas o procarióticas, seleccionadas del grupo que consiste en las células de mamíferos, de levaduras, de insectos, de plantas o de bacterias.
6. El anticuerpo o fragmento del mismo de la reivindicación 5, en donde dichas células de mamíferos son células CHO, NSO, SP2/0, PER.C6 o HEK-293.
7. El anticuerpo o fragmento del mismo de la reivindicación 5, en donde dichas células de levaduras son células de Pichia pastorís o de Saccharomyces cerevisiae.
8. El anticuerpo o fragmento del mismo de la reivindicación 5, en donde dichas células de insectos son células Sf-9.
9. El anticuerpo o el fragmento del mismo de la reivindicación 5, en donde dichas células de plantas son células de Lemna.
10. El anticuerpo o el fragmento del mismo de la reivindicación 5, en donde dichas células de bacterias son células de E. coli.
1 1 . El anticuerpo o el fragmento de la reivindicación 1 , en donde el anticuerpo o el fragmento se une de manera específica a, al menos, un aminoácido que comprende los residuos de aminoácidos ubicado entre el tercero y el cuarto dominio transmembranal del CD20.
12. Un conjugado que comprende al anticuerpo o al fragmento de la reivindicación 1 , unido a un agente citotóxico.
13. El conjugado de la reivindicación 12, en donde dicho agente citotóxico es seleccionado del grupo que consiste en un maitansinoide, un análogo de maitansinoides, una benzodiazepina, un taxoide, CC-1065, un análogo de CC-1065, duocarmicina, un análogo de duocarmicina, caliqueamicina, dolastatina, un análogo de dolastatina, aristatina, un derivado de tomaimicina y un derivado de leptomina, o una prodroga del conjugado.
14. Una composición farmacéutica que comprende al anticuerpo o al fragmento de la reivindicación 1 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
15. Una composición farmacéutica que comprende al conjugado de la reivindicación 12 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
16. Un reactivo de diagnóstico que comprende al conjugado de la reivindicación 12, en donde dicho anticuerpo o dicho fragmento se encuentra marcado.
17. El reactivo de diagnóstico de la reivindicación 16, en donde dicha marcación es seleccionada entré el grupo que consiste en un radiomarcador, un fluoróforo, un cromóforo, un agente para imágenes y un ion metálico.
18. El anticuerpo o fragmento de la reivindicación 1 , en donde el anticuerpo o el fragmento se une de manera específica a, al menos, un aminoácido que comprende a los aminoácidos de la SEQ ID NO:47, o una secuencia correspondiente a una cualquiera de Gl 21330989, GenBank Protein ID 231 10989.
19. El anticuerpo o el fragmento de la reivindicación 1 , en donde dicho anticuerpo o fragmento es capaz de inducir la muerte de una célula que expresa un CD20.
20. El anticuerpo o el fragmento de la reivindicación 1 , en donde dicho anticuerpo o dicho fragmento es un anticuerpo Tipo III, que tiene la capacidad de inducir de manera sustancial la apoptosis en ausencia de agentes de reticulación, que tiene la capacidad de causar la redistribución de CD20 en una balsa lipídica e inducir, de manera sustancial, la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC).
21. El anticuerpo o el fragmento de la reivindicación 1 , en donde el anticuerpo o el fragmento del mismo se une, de manera específica, a dicho CD20 en un Western blot.
22. El anticuerpo o el fragmento de la reivindicación 1 , en donde el anticuerpo o el fragmento del mismo se une, de manera específica, a dicho CD20 en un ELISA.
23. El anticuerpo o el fragmento del mismo de la reivindicación 1 , en donde el anticuerpo o el fragmento del mismo se une, de manera específica, a dicho CD20 en un ensayo de citometría de flujo.
24. El anticuerpo o el fragmento de la reivindicación 1 , en donde dicho anticuerpo o fragmento comprende un Fab, un Fab', un F(ab')2, un Fd, un Fv o un scFv monocadena, un Fv unido a disulfuros, un dominio V-NAR, un IgNar, un intracuerpo, un IgGí :CH2, un minicuerpo, un F(ab')3 un tetracuerpo, un fragmento trivalente ("triabod)/'), a un fragmento divalente ("diabod ), un anticuerpo de dominio único, DVD-lg, Fcab, mAb2, un (scFv)2 o un scFv-Fc.
25. El anticuerpo o el fragmento de la reivindicación 1 , que comprende un dominio constante de la cadena pesada de una inmunoglobulina.
26. El anticuerpo o el fragmento de la reivindicación 25, en donde dicho dominio constante de la cadena pesada de una inmunoglobulina es seleccionado del grupo que consiste en un dominio constante lgG1 , un dominio constante lgG2, un dominio constante lgG3 y un dominio constante lgG4.
27. El anticuerpo de la reivindicación 19, en donde dicha célula se deriva de una célula B.
28. El anticuerpo de la reivindicación 19, en donde dicha célula es una célula cancerosa.
29. El anticuerpo de la reivindicación 28, en donde dicha célula cancerosa es seleccionada del grupo que consiste en los linfomas de las células B, NHL, el linfoma/leucemia linfoblástica de los precursores de las células B y neoplasmas de células B maduras, leucemia linfocítica crónica (CLL)/linfoma linfocítico pequeño (SLL) de células B, leucemia prolinfocítica de células B, linfoma linfoplasmacítico, linfoma de células del manto (MCL), linfoma folicular (FL) de grado bajo, intermedio y alto, linfoma cutáneo del centro folicular, linfoma de la zona marginal de células B, linfoma de células B de la zona marginal tipo MALT , linfoma de células B de la zona marginal nodal, linfoma de células B de la zona marginal tipo esplénico, leucemia de células pilosas, linfoma difuso de células B grandes, linfoma de Burkitt, plasmacitoma, mieloma de células del plasma, trastorno linfoproliferativo post-transplante, macroglobulinemia de Waldenstrom y linfoma anaplásico de células grandes (ALCL).
30. El anticuerpo o el fragmento de la reivindicación 19, en donde dicha célula influencia una respuesta inmune no deseada.
31 . El anticuerpo o el fragmento de la reivindicación 19, en donde dicha célula influencia la inflamación.
32. El anticuerpo de la reivindicación 1 , en donde dicho anticuerpo o fragmento es capaz de matar, al menos, alrededor del 48% de las células del linfoma de Ramos, donde matar comprende la apoptosis en ausencia de un agente de reticulación.
33. El anticuerpo de la reivindicación 1 , en donde dicho anticuerpo o dicho fragmento es capaz de matar, al menos, alrededor del 48% de las células del linfoma de Ramos, donde matar comprende la apoptosis en ausencia de un agente de reticulación; y en donde dicho anticuerpo es capaz de matar las células del linfoma de Ramos con una EC50 de alrededor de 0,018 i jg/ml o menos, en donde matar comprende CDC.
34. El anticuerpo de la reivindicación 1 , en donde dicho anticuerpo o dicho fragmento es capaz de matar, al menos, alrededor del 48% de las células del linfoma de Ramos, donde matar comprende la apoptosis en ausencia de un agente de reticulación; y en donde dicho anticuerpo o dicho fragmento es capaz de matar las células del linfoma de con una EC50 de alrededor de 0,018 Gg/ml o menor, en donde matar comprende CDC; y en donde dicho anticuerpo o dicho fragmento es capaz de traslocar CD20 en un compartimiento de balsa lipídica de la membrana de dichas células.
35. El anticuerpo de la reivindicación 1 , en donde dicho anticuerpo o dicho fragmento es capaz de matar, al menos, alrededor de un 53% de las células del linfoma de Raji, en donde matar comprende la apoptosis en ausencia de agentes de reticulación.
36. El anticuerpo de la reivindicación 1 , en donde dicho anticuerpo o dicho fragmento es capaz de matar, al menos, alrededor de un 34% de las células de linfoma WSU-DLCL-2, en donde matar comprende la apoptosis en ausencia de agentes de reticulación.
37. El anticuerpo de la reivindicación 1 , en donde dicho anticuerpo o dicho fragmento es capaz de matar, al menos, alrededor de un 34 % de las células del linfoma WSU-DLCL-2, en donde matar comprende la apoptosis en ausencia de agentes de reticulación; y en donde dicho anticuerpo o dicho fragmento es capaz de mater células del linfoma WSU-DLCL-2 con un EC50 de alrededor de 0.58 Dg/ml o menos, en donde matar comprende CDC.
38. El anticuerpo de la reivindicación 1 , en donde dicho anticuerpo o dicho fragmento es capaz de matar, al menos, alrededor de un 12% de las células del linfoma Jeko-1 , en donde matar comprende la apoptosis en ausencia de agentes de reticulación.
39. El anticuerpo de la reivindicación 1 , en donde dicho anticuerpo o dicho fragmento es capaz de matar, al menos, alrededor de un 40% de las células del linfoma Granta-519, en donde matar comprende la apoptosis en ausencia de agentes de reticulación.
40. El anticuerpo de la reivindicación 1 , en donde dicho anticuerpo o dicho fragmento se une a un epítope del CD20, en donde dicho epítope no comprende o no requiere al residuo aminoácido prolina en la posición 170 y/o 172, y/o en donde dicho epítope comprende o requiere de residuos aminoácidos de asparagina en la posición 163 y/o 166.
41 . El anticuerpo de la reivindicación 1 , en donde dicho anticuerpo o dicho fragmento se une a un epítope del CD20, en donde dicho epítope no comprende o no requiere al residuo aminoácido prolina en la posición 170 y/o 172, y lo en donde dicho epítope comprende o requiere de residuos aminoácidos de asparagina en la posición 163 y/o 166; y en donde dicho antiquerpo o dicho fragmento es capaz de matar, al menos, alrededor del 48% de las células del linfoma de Ramos, en donde matar comprende la apoptosis en ausencia de agentes de reticulación.
42. El anticuerpo de la reivindicación 1 , en donde dicho anticuerpo o dicho fragmento se une a un epítope del CD20, en donde dicho epítope no comprende o no requiere al residuo aminoácido prolina en la posición 170 y/o 172, y/o en donde dicho epítope comprende o requiere de un epítope del CD20 que posea los residuos aminoácidos asparagina en la posición 163 y/o 166; y en donde dicho anticuerpo o dicho fragmento es capaz de matar, por lo menos, el 53% de las células del linfoma de Raji, en donde matar comprende la apoptosis en ausencia de agentes de reticulación.
43. El anticuerpo de la reivindicación 1 , en donde dicho anticuerpo o dicho fragmento se une a un epítope del CD20, en donde dicho epítope no comprende o no requiere al residuo aminoácido prolina en la posición 170 y/o 172, y/o en donde dicho epítope comprende o requiere de residuos aminoácidos asparagina en la posición 163 y/o 166; y en donde dicho anticuerpo o dicho fragmento es capaz de matar, por lo menos, un 34% de las células de linfoma, WSU-DLCL-2 en donde matar comprende la apoptosis en ausencia de agentes de reticulación.
44. El anticuerpo de la reivindicación 1 , en donde dicho anticuerpo o fragmento se une a un epítope del CD20, en donde dicho epítope no comprende o no requiere al residuo aminoácido prolina en la posición 170 y/o 172, y/o en donde dicho epítope comprende o requiere de residuos aminoácidos asparagina en la posición 163 y/o 166; en donde dicho anticuerpo o dicho fragmento es capaz de matar, por lo menos, un 12% de las células de linfoma Jeko-1 , en donde matar comprende la apoptosis en ausencia de agentes de reticulación.
45. El anticuerpo de la reivindicación 1 , en donde dicho anticuerpo o fragmento se une a un epítope del CD20, en donde dicho epítope no comprende o no requiere al residuo aminoácido prolina en la posición 170 y/o 172, y/o en donde dicho epítope comprende o requiere de residuos aminoácidos asparagina en la posición 163 y/o 166; y en donde dicho anticuerpo o dicho fragmento es capaz de matar, por lo menos, un 40 % de las células del linfoma Granta-519, en donde matar comprende la apoptosis en ausencia de agentes de reticulación.
46. Un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende al menos una región determinante de la complementariedad que posee una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOS:25-30 y 17-22.
47. El anticuerpo o el fragmento de la reivindicación 46, en donde dicho anticuerpo o dicho fragmento se une al CD20.
48. Un anticuerpo o un fragmento del mismo que comprende al menos un cadena pesada y al menos una cadena liviana, en donde dicha cadena pesada comprende tres regiones determinantes de la complementariedad secuenciales que poseen las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOS: 20-22 o 28-30 y en donde dicha cadena liviana comprende tres regiones determinantes de la complementariedad secuenciales que poseen las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOS: 17-19 o 25-27.
49. El anticuerpo o el fragmento de la reivindicación 48, en donde dicha cadena pesada posee una identidad de secuencia de, al menos, el 90% respecto de una secuencia de aminoácidos representada por las SEQ ID NO: 47, 34, 35 o 36.
50. El anticuerpo o el fragmento de la reivindicación 48, en donde dicha cadena pesada posee una identidad de secuencia de, al menos, el 95% respecto de una secuencia de aminoácidos representada por las SEQ ID NO: 47, 34, 35 o 36.
51 . El anticuerpo o el fragmento de la reivindicación 48, en donde dicha cadena pesada posee la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 47, 34, 35 o 36.
52. El anticuerpo o el fragmento de la reivindicación 48, en donde dicha cadena liviana posee una identidad de secuencia de, al menos, el 90% respecto de una secuencia de aminoácidos representada por las SEQ ID NO: 46, 32 o 33.
53. El anticuerpo o el fragmento de la reivindicación 48, en donde dicha cadena liviana posee una identidad de secuencia de, al menos, el 95% respecto de dicha secuencia de aminoácidos representada por las SEQ ID NO: 46, 32 o 33.
54. El anticuerpo o el fragmento de la reivindicación 48, en donde dicha cadena liviana posee una secuencia de aminoácidos de las NO: 46, 32 o 33.
55. El anticuerpo o el fragmento de la reivindicación 48, en donde la secuencia de aminoácidos de dicha cadena pesada comprende desde 1 -5 sustituciones conservativas en comparación con la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NOS: 47, 34, 35 o 36.
56. El anticuerpo o el fragmento de la reivindicación 48, en donde la secuencia de aminoácidos de dicha cadena pesada comprende de 1 -3 sustituciones conservativas en comparación con las secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ ID NOS: 47, 34, 35 o 36.
57. El anticuerpo o el fragmento de la reivindicación 48, en donde la secuencia de aminoácidos de dicha cadena pesada comprende desde 3 sustituciones conservativas en comparación con las secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ ID NOS: 47, 34, 35 o 36.
58. El anticuerpo o el fragmento de la reivindicación 48, en donde la secuencia de aminoácidos de dicha cadena pesada comprende desde 2 sustituciones conservativas en comparación con las secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ ID NOS: 47, 34, 35 36.
59. El anticuerpo o el fragmento de la reivindicación 48, en donde la secuencia de aminoácidos de dicha cadena pesada comprende desde 1 sustitución conservativa en comparación con las secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ ID NOS: 47, 34, 35 o 36.
60. El anticuerpo o el fragmento de la reivindicación 48, en donde la secuencia de aminoácidos de dicha cadena liviana comprende desde 1 -5 sustituciones conservativas en comparación con las secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ ID NOS: 46, 32 o 33.
61. El anticuerpo o el fragmento de la reivindicación 48, en donde la secuencia de aminoácidos de dicha cadena liviana comprende desde 1 -3 sustituciones conservativas en comparación con las secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ ID NOS: 46, 32 o 33.
62. El anticuerpo o el fragmento de la reivindicación 48, en donde la secuencia de aminoácidos de dicha cadena liviana comprende desde 3 sustituciones conservativas en comparación con las secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ ID NOS: 46, 32 o 33.
63. El anticuerpo o el fragmento de la reivindicación 48, en donde la secuencia de aminoácidos de dicha cadena liviana comprende desde 2 sustituciones conservativas en comparación con las secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ ID NOS: 46, 32 o 33.
64. El anticuerpo o el fragmento de la reivindicación 48, en donde la secuencia de aminoácidos de dicha cadena liviana comprende desde 1 sustitución conservativa en comparación con las secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ ID NOS: 46, 32 o 33.
65. Un anticuerpo o un fragmento mejorados que, de manera específica, se une al CD20, preparado mediante: (a) proveer un ADN que codifique un anticuerpo o un fragmento del mismo, que comprende al menos una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NOS: 132-36, 46, 47, 17-22, 25-30 y 1 -7; (b) introducir al menos una mutación, supresión o inserción de nucleótidos en dicho ADN, de manera tal que la secuencia de aminoácidos de dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo que codifica para dicho ADN cambie; (c) expresar dicho anticuerpo o dicho fragmento de anticuerpo; (d) cribar dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo expresado para dicha mejora, mediante la cual dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo es preparado.
66. El anticuerpo o el fragmento de la reivindicación 65, en donde dicha mejora es una afinidad aumentada por el CD20.
67. El anticuerpo o el fragmento de la reivindicación 65, en donde dicha, al menos, una mutación, supresión o inserción de nucleótidos, se lleva a cabo mediante un método seleccionado del grupo que consiste en la mutagénesis dirigida a sitios mediada ¦i por oligonucleótidos, mutagénésis de cassette, PCR con tendencia a errores {"error-prone PCR'), mezclado de ADN ("DNA shufflincf') y el uso de cepas mutantes de E.coli.
68. Un anticuerpo o un fragmento del mismo que comprende un polipéptido que comprende, por lo menos, un miembro seleccionado del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 1 -7 y 17-36.
69. El anticuerpo o el fragmento de la reivindicación 65, en donde dicha mejora es un aumento de la función efectora.
70. El anticuerpo o el fragmento de la reivindicación 65, en donde dicha mejora es un aumento de la actividad de CDC.
71. El anticuerpo o el fragmento de la reivindicación 65, en donde dicha mejora es un aumento de la actividad de ADCC.
72. El anticuerpo o el fragmento de la reivindicación 65, en donde dicha mejora es un aumento de la actividad de ADCC, un aumento de la actividad de CDC y un aumento de la función efectora.
73. El anticuerpo o un fragmento del mismo de la reivindicación 1 , en donde dicho anticuerpo o fragmento se obtiene a partir de la expresión de un huésped transgénico, en donde dicho huésped consiste en una cabra, un pollo, una vaca o un huevo, transgénicos.
74. Un método para inhibir el crecimiento de una célula cancerosa que comprende poner en contacto dicha célula con un anticuerpo o un fragmento de la reivindicación 1.
75. Un método para tratar un paciente que posea cáncer, que comprende la administración a dicho paciente de una cantidad efectiva del anticuerpo, fragmento o conjugado del mismo, que se une, de manera específica, al CD20, en donde dicho anticuerpo o fragmento es capaz de inducir la apoptosis, la citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCC) y la citotoxicidad dependiente de complemento (CDC).
76. El método de la reivindicación 75 que comprende, además, la administración de un agente terapéutico a dicho paciente.
77. El método de la reivindicación 76, en donde dicho agente terapéutico es un agente citotóxico.
78. Un método para tratar un paciente que padezca cáncer, que comprende la administración de una cantidad efectiva del conjugado de la reivindicación 19 a dicho paciente.
79. El método de tratamiento de la reivindicación 75, en donde dicho cáncer es un cáncer seleccionado del grupo que consiste en linfomas de las células B, NHL, linfoma/leucemia de precursores linfoblásticos de células B y neoplasmas de células B maduras, leucemia linfocítica crónica (CLL)/linfoma linfocítico pequeño (SLL) de células B, leucemia prolinfocítica de células B, linfoma linfoplasmacítico, linfoma de células del manto (MCL), linfoma folicular (FL) de grado bajo, intermedio y alto, linfoma cutáneo del centro folicular, linfoma de la zona marginal de células B, linfoma de células B de la zona marginal tipo MALT , linfoma de células B de la zona marginal nodal, linfoma de células B de la zona marginal tipo esplénico, leucemia de células pilosas, linfoma difuso de células B grandes, linfoma de Burkitt, plasmacitoma, mieloma de células del plasma, trastorno linfoproliferativo post-transplante, macroglobulinemia de Waldenstrom y linfoma anaplástico de células grandes (ALCL).
80. Un método para el diagnóstico de un sujeto que se sospeche posea cáncer, que comprende: administrar a dicho sujeto el reactivo de diagnóstico de la reivindicación 16; y detectar la distribución dé dicho reactivo dentro del sujeto.
81. El método para el diagnóstico de la reivindicación 80, en donde dicho cáncer es un cáncer seleccionado del grupo que consiste en linfomas de células B, NHL, linfoma/leucemia de precursores linfoblásticos de células B y neoplasmas de células B maduras, leucemia linfocítica crónica (CLL)/linfoma linfocítico pequeño (SLL) de células B, leucemia prolinfocítica de células B, linfoma linfoplasmacítico, linfoma de células del manto (MCL), linfoma folicular (FL) de grado bajo, intermedio y alto, linfoma cutáneo del centro folicular, linfoma de la zona marginal de células B, linfoma de células B de la zona marginal tipo MALT , linfoma de células B de la zona marginal nodal, linfoma de células B de la zona marginal tipo esplénico, leucemia de células pilosas, linfoma difuso de células B grandes, linfoma de Burkitt, plasmacitoma, mieloma de células del plasma, trastorno linfoproliferativo post-transplante, macroglobulinemia de Waldenstrom y linfoma anaplástico de células grandes (ALCL).
82. Un método para tratar un paciente que posea una enfermedad autoinmune o inflamatoria que comprende administrar a dicho paciente una cantidad efectiva del anticuerpo, fragmento o conjugado del mismo que, de manera específica, se une al CD20, en donde dicho anticuerpo o fragmento es capaz de inducir la apoptosis, la citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCC) y la citotoxicidad dependiente de complemento (CDC).
83. El método de tratamiento de la reivindicación 82, en donde dicha enfermedad autoinmune o inflamatoria es una enfermedad autoinmune o inflamatoria seleccionada del grupo que consiste en la artritis reumatoide, la artritis reumatoide juvenil, el lupus eritematoso sistémico (SLE), la enfermedad de Wegener, la enfermedad inflamatoria del intestino, púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), púrpura trombocitopénica trombótica (TTP), trombocitopenia autoinmune, la esclerosis múltiple, la psoriasis, la nefropatía IgA, polineuropatías IgM, miastenia gravis, vasculitis, la diabetes mellitus, el síndrome de Reynaud, la enfermedad de Crohn, la colitis ulcerativa, gastritis, tiroiditis de Hashimoto, espondilitis anquilosante, vasculitis crioglobulinémica asociada a hepatitis C , encefalitis focal crónica, pénfigo vesicular, hemofilia A, glomerulonefritis membranoproliferativa, dermatomiositis adulta y juvenil, polimiositis adulta, urticaria crónica, cirrosis biliar primaria, neuromielitis óptica, enfermedad distiroidea de Graves, pénfigo vesicular, glomérulonefritis membranoproliferativa , síndrome de Churg-Strauss, asma, artritis psoriásica, dermatitis, síndrome de distress respiratorio, meningitis, encefalitis, uveítis, eczema, ateroesclerosis, deficiencia en la adhesión de leucocitos, inicio de la diabetes juvenil, enfermedad de Reiter, enfermedad de Behcet, anemia hemolítica, dermatitis atópica, granulomatosis de Wegener, síndrome de Omenn, falla renal crónica, mononucleosis infecciosa aguda, enfermedades asociadas con HIV y herpes, esclerosis sistémica, glomerulonefritis y síndrome de Sjorgen, dermatomiositis, ANCA, anemia aplástica, anemia autoinmune hemolítica (AIHA), deficiencia del factor VIII, hemofilia A, neutropenia autoinmune, síndrome de Castleman, síndrome de Goodpasture, rechazo al trasplante de órganos, enfermedad de injerto contra huésped (GVHD), hepatitis autoinmune, neumonitis intersticial linfoidea (HIV), bronquiolitis obliterante (no- transplante), Síndrome de Guillain-Barre, vasculitis de grandes vasos, arteritis de células gigantes (de Takayasu) , vasculitis de vasos medianos, enfermedad de Kawasaki y la poliarteritis nodosa.
84. Un polinucleótido que codifica al anticuerpo o al fragmento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 , 4, 18 y 48.
85. Un polinucleótido que codifica a una cadena pesada o liviana del anticuerpo o fragmento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 , 4, 18 y 48.
86. Un vector que comprende al polinucleótido de la reivindicación 85.
87. El vector de la reivindicación 86, en donde dicho vector es un vector de expresión capaz de expresar a dicho anticuerpo o a dicho fragmento de anticuerpo.
88. Una célula huésped que comprende la expresión del vector de la reivindicación 87.
89. Medios que, de manera específica, se unen al CD20, en donde dichos medios son capaces de inducir la apoptosis, la ADCC y la CDC.
90. Un método para tratar un paciente que posea cáncer, que comprende administrar a dicho paciente una cantidad efectiva del anticuerpo o del fragmento de la reivindicación 1 , en donde dicho anticuerpo o dicho fragmento está unido a un compuesto radiomarcado.
91 . El conjugado de la reivindicación 12, en donde dicha unión del anticuerpo o del fragmento a dicho agente citotóxico es a través de un enlazador seleccionado del grupo que consiste en un grupo disulfuro, un grupo tioéter, un grupo lábil a los ácidos, un grupo fotolábil, un grupo lábil a las peptidasas y un grupo lábil a las esterasas.
92. El conjugado de la reivindicación 91 , en donde el enlazador se selecciona del grupo que consiste en A/-succinimidilo3-(2-piridilditio) propionato (SPDP), N-succinimidil 4-(2-piridilditio)butanoato (SPDB), /V-succinimidil 4-(2-piridilditio)2- sulfobutanoato (sulfo-SPDB), /V-succinimidil 4-(2-piridilditio) pentanoato (SPP), 2-iminotiolano y anhídrido acetilsuccinico.
93. El conjugado de la reivindicación 91 , en donde el enlazador se selecciona del grupo que consiste en /V-succinimidil 4-(maleimidometil) ciciohexanocarboxilato (SMCC), /V-succinimidil-4-(/V-maleimidometil)-ciclohexano-1 -carboxi-(6-amidocaproato) (LC-SMCC), /V-succinimidil éster del ácido ?-maleimidoundecanoico (KMUA), N- succinimidil éster del ácido ß-maleimidopropanoico (BMPS), /V-succinimidil éster del ácido y-maleimidobutírico (GMBS), éster de /V-hidroxisuccinimida del ácido e-maleimidocaproico (EMCS), éster de m-maleimidobenzo¡l-A/-hidroxisuccinim¡da (MBS), éster de N-( - maleimidoacetoxi)-succinimida (AMAS), succinimidil-6-( ß-maleimidopropionamido)hexanoato (SMPH), /V-succinimidil 4-(p-maleimidofenil)-butirato (SMPB), /V-(p-maleimidofenil)isocianato (PMPI), /V-succinimidil-4-(iodoacetil)-aminobenzoato (SIAB), /V-succinimidil iodoacetato (SIA), /V-succinimidil bromoacetato (SBA) y /V-succinimidil 3-(bromoacetamido)propionato (SBAP).
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Families Citing this family (70)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2002231736A1 (en) 2000-12-22 2002-07-08 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. Use of repulsive guidance molecule (rgm) and its modulators
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
EP1928905B1 (de) 2005-09-30 2015-04-15 AbbVie Deutschland GmbH & Co KG Bindungsdomänen von proteinen der repulsive guidance molecule (rgm) proteinfamilie und funktionale fragmente davon sowie deren verwendung
US8962803B2 (en) 2008-02-29 2015-02-24 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Antibodies against the RGM A protein and uses thereof
MX2012006560A (es) 2009-12-08 2012-10-05 Abbott Gmbh & Co Kg Anticuerpos monoclonales contra la proteina rgm a para utilizarse en el tratamiento de degeneracion de capa de fibra de nervio retinal.
US9175086B2 (en) * 2010-02-10 2015-11-03 Immunogen, Inc. CD20 antibodies and uses thereof
AR080513A1 (es) 2010-03-12 2012-04-11 Inmunogen Inc Moleculas de union cd37 y sus inmunoconjugados
CA2836927A1 (en) 2011-06-21 2012-12-27 Immunogen, Inc. Novel maytansinoid derivatives with peptide linker and conjugates thereof
CN107080847A (zh) * 2011-06-24 2017-08-22 森彻斯有限公司 细胞外靶向药物缀合物
CN103764665A (zh) 2011-06-28 2014-04-30 怀特黑德生物医学研究所 使用分选酶安装用于蛋白质连接的点击化学柄
CN102435728B (zh) * 2011-09-07 2014-06-25 福州大学 一种用于免疫组化过程质量检控的阳性参照物的制备方法
IL297229A (en) 2012-01-27 2022-12-01 Abbvie Inc The composition and method for the diagnosis and treatment of diseases related to the degeneration of nerve cells
WO2014039855A1 (en) * 2012-09-07 2014-03-13 Genentech, Inc. Combination therapy of a type ii anti-cd20 antibody with a selective bcl-2 inhibitor
PL2766048T3 (pl) 2012-10-12 2015-05-29 Medimmune Ltd Pirolobenzodiazepiny i ich koniugaty
US9353150B2 (en) 2012-12-04 2016-05-31 Massachusetts Institute Of Technology Substituted pyrazino[1′,2′:1 ,5]pyrrolo[2,3-b]-indole-1,4-diones for cancer treatment
CN103333245B (zh) * 2012-12-21 2015-03-18 百奥泰生物科技(广州)有限公司 一种针对细胞受体并抑制癌细胞生长的药物分子及其制备方法和用途
EP2948478B1 (en) * 2013-01-25 2019-04-03 Amgen Inc. Antibodies targeting cdh19 for melanoma
CN105142674B (zh) 2013-03-13 2018-11-13 麦迪穆有限责任公司 吡咯并苯并二氮杂卓和其结合物
AU2014244245C1 (en) 2013-03-13 2018-04-19 Genentech, Inc. Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
CN103254317B (zh) * 2013-05-08 2014-08-13 浙江大学 一种抗cd20单克隆抗体-海兔毒素偶联物及其制备方法和应用
WO2014183071A2 (en) 2013-05-10 2014-11-13 Whitehead Institute For Biomedical Research In vitro production of red blood cells with sortaggable proteins
EP4119662A1 (en) 2013-05-10 2023-01-18 Whitehead Institute For Biomedical Research Protein modification of living cells using sortase
JP6744212B2 (ja) * 2013-06-21 2020-08-19 イナート・ファルマ・ソシエテ・アノニムＩｎｎａｔｅ Ｐｈａｒｍａ Ｐｈａｒｍａ Ｓ．Ａ． ポリペプチドの酵素的結合
CN104341503A (zh) * 2013-07-29 2015-02-11 西藏海思科药业集团股份有限公司 对蒙古人种和高加索人种低免疫原性的、抗cd20的人抗体
US10556024B2 (en) 2013-11-13 2020-02-11 Whitehead Institute For Biomedical Research 18F labeling of proteins using sortases
WO2015118538A1 (en) * 2014-02-06 2015-08-13 Yeda Research And Development Co. Ltd. Anti cd84 antibodies, compositions comprising same and uses thereof
CN103880957B (zh) * 2014-03-27 2016-01-20 安徽大学 抗cd20抗原的抗体l1h1及其应用
CN103880958B (zh) * 2014-03-27 2016-01-20 安徽大学 抗cd20抗原的抗体l4h6及其应用
EP3560954B1 (en) 2014-04-03 2021-08-04 IGM Biosciences, Inc. Modified j-chain
CN113318239A (zh) * 2014-06-13 2021-08-31 梅约医药教育及研究基金会 治疗淋巴瘤
GB201416112D0 (en) 2014-09-12 2014-10-29 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
CN104391114B (zh) * 2014-11-13 2016-06-22 中国医学科学院肿瘤医院 Elisa方法定量测定人血清中重组人鼠嵌合抗cd20单克隆抗体浓度
BR112017018941B8 (pt) 2015-03-04 2023-01-10 Igm Biosciences Inc Molécula de ligação a cd20, seu uso, composição e método in vitro para direcionar a morte mediada por complemento de uma célula que expressa cd20
JP6979877B2 (ja) 2015-06-08 2021-12-15 デビオファーム インターナショナル， エス． アー． 抗ｃｄ３７イムノコンジュゲートおよび抗ｃｄ２０抗体の組み合わせ
WO2017040247A1 (en) 2015-08-28 2017-03-09 Immunogen, Inc. Antibodies and assays for detection of cd37
EP3356401B1 (en) 2015-09-30 2020-06-24 IGM Biosciences, Inc. Binding molecules with modified j-chain
CN108463245A (zh) 2015-09-30 2018-08-28 Igm生物科学有限公司 具有修饰的j链的结合分子
WO2017059397A1 (en) 2015-10-01 2017-04-06 Whitehead Institute For Biomedical Research Labeling of antibodies
AR106188A1 (es) 2015-10-01 2017-12-20 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-cd19 humano humanizados y métodos de utilización
CN105678109A (zh) * 2016-01-11 2016-06-15 天津师范大学 一种基于邻接蛋白的蛋白功能注释方法
TWI756199B (zh) 2016-01-15 2022-03-01 美商伯克利之光生命科技公司 製造患者專ㄧ性抗癌治療劑之方法及使用該治療劑之治療方法
GB201601431D0 (en) 2016-01-26 2016-03-09 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines
GB201602356D0 (en) 2016-02-10 2016-03-23 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
GB201602359D0 (en) 2016-02-10 2016-03-23 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
GB201607478D0 (en) 2016-04-29 2016-06-15 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
US10918627B2 (en) 2016-05-11 2021-02-16 Massachusetts Institute Of Technology Convergent and enantioselective total synthesis of Communesin analogs
CN105963711A (zh) * 2016-06-20 2016-09-28 杭州皓阳生物技术有限公司 一种抗人cd20单克隆抗体-dm1偶联物及其制备方法
GB201617466D0 (en) 2016-10-14 2016-11-30 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine conjugates
EP3535297B1 (en) 2016-11-02 2022-08-10 Debiopharm International, S.A. Methods for improving anti-cd37 immunoconjugate therapy
US20180206726A1 (en) 2016-12-07 2018-07-26 Progenity Inc. Gastrointestinal tract detection methods, devices and systems
PL3559034T3 (pl) * 2016-12-20 2021-04-19 F. Hoffmann-La Roche Ag Terapia skojarzona dwuswoistymi przeciwciałami anty-CD20/anty-CD3 i agonistami 4-1BB (CD137)
AU2018217926B2 (en) 2017-02-08 2019-10-03 Adc Therapeutics Sa Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
GB201702031D0 (en) 2017-02-08 2017-03-22 Medlmmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
US20210138213A1 (en) 2017-03-30 2021-05-13 Progenity, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an immune modulatory agent released using an ingestible device
EP3612537B1 (en) 2017-04-18 2022-07-13 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine conjugates
US11932650B2 (en) 2017-05-11 2024-03-19 Massachusetts Institute Of Technology Potent agelastatin derivatives as modulators for cancer invasion and metastasis
JP7220203B2 (ja) 2017-08-18 2023-02-09 メドイミューン・リミテッド ピロロベンゾジアゼピン複合体
SG11202002093TA (en) * 2017-09-13 2020-04-29 Teneobio Inc Heavy chain antibodies binding to ectoenzymes
US10640508B2 (en) 2017-10-13 2020-05-05 Massachusetts Institute Of Technology Diazene directed modular synthesis of compounds with quaternary carbon centers
RU2696096C2 (ru) * 2017-12-07 2019-07-31 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) Низкомолекулярные конъюгаты противоопухолевых агентов и высокоселективных лигандов асиалогликопротеинового рецептора для терапии онкологических патологий печени
GB201803342D0 (en) 2018-03-01 2018-04-18 Medimmune Ltd Methods
GB201806022D0 (en) 2018-04-12 2018-05-30 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
US20230041197A1 (en) 2018-06-20 2023-02-09 Progenity, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an immunomodulator
WO2019246317A1 (en) 2018-06-20 2019-12-26 Progenity, Inc. Treatment of a disease or condition in a tissue originating from the endoderm
WO2020106704A2 (en) 2018-11-19 2020-05-28 Progenity, Inc. Ingestible device for delivery of therapeutic agent to the gastrointestinal tract
WO2020247054A1 (en) 2019-06-05 2020-12-10 Massachusetts Institute Of Technology Compounds, conjugates, and compositions of epipolythiodiketopiperazines and polythiodiketopiperazines and uses thereof
EP4019544A4 (en) * 2019-08-19 2023-10-18 Shenyang Pharmaceutical University ANTIBODY MUTANT AND APPLICATION THEREOF
WO2021119482A1 (en) 2019-12-13 2021-06-17 Progenity, Inc. Ingestible device for delivery of therapeutic agent to the gastrointestinal tract
IL302412A (en) 2020-11-06 2023-06-01 Novartis Ag Anti-CD19 and B-cell targeting agent combination therapy for the treatment of B-cell malignancies
CN112924665B (zh) * 2021-02-19 2023-10-03 山东莱博生物科技有限公司 一种抗体辣根过氧化物酶标记物及其制备与应用

Family Cites Families (441)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2429001A (en) 1946-12-28 1947-10-14 Axel H Stone Artificial hand
FR2413974A1 (fr) 1978-01-06 1979-08-03 David Bernard Sechoir pour feuilles imprimees par serigraphie
US4307016A (en) 1978-03-24 1981-12-22 Takeda Chemical Industries, Ltd. Demethyl maytansinoids
US4256746A (en) 1978-11-14 1981-03-17 Takeda Chemical Industries Dechloromaytansinoids, their pharmaceutical compositions and method of use
JPS55102583A (en) 1979-01-31 1980-08-05 Takeda Chem Ind Ltd 20-acyloxy-20-demethylmaytansinoid compound
JPS55162791A (en) 1979-06-05 1980-12-18 Takeda Chem Ind Ltd Antibiotic c-15003pnd and its preparation
JPS5645483A (en) 1979-09-19 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd C-15003phm and its preparation
JPS5645485A (en) 1979-09-21 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd Production of c-15003pnd
EP0028683A1 (en) 1979-09-21 1981-05-20 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibiotic C-15003 PHO and production thereof
WO1982001188A1 (en) 1980-10-08 1982-04-15 Takeda Chemical Industries Ltd 4,5-deoxymaytansinoide compounds and process for preparing same
US4450254A (en) 1980-11-03 1984-05-22 Standard Oil Company Impact improvement of high nitrile resins
US4313946A (en) 1981-01-27 1982-02-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Chemotherapeutically active maytansinoids from Trewia nudiflora
US4315929A (en) 1981-01-27 1982-02-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Method of controlling the European corn borer with trewiasine
US4563304A (en) 1981-02-27 1986-01-07 Pharmacia Fine Chemicals Ab Pyridine compounds modifying proteins, polypeptides or polysaccharides
JPS57192389A (en) 1981-05-20 1982-11-26 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid
US4474893A (en) 1981-07-01 1984-10-02 The University of Texas System Cancer Center Recombinant monoclonal antibodies
US4714681A (en) 1981-07-01 1987-12-22 The Board Of Reagents, The University Of Texas System Cancer Center Quadroma cells and trioma cells and methods for the production of same
US4427588A (en) 1982-11-08 1984-01-24 Bristol-Myers Company Process for conversion of oxotomaymycin to tomaymycin
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4699880A (en) 1984-09-25 1987-10-13 Immunomedics, Inc. Method of producing monoclonal anti-idiotype antibody
JPS61109717A (ja) 1984-11-02 1986-05-28 Teruhiko Beppu 抗腫瘍剤
DE3587814T2 (de) 1985-03-30 1994-11-10 Marc Ballivet Verfahren zum erhalten von dns, rns, peptiden, polypeptiden oder proteinen durch dns-rekombinant-verfahren.
SE448277B (sv) 1985-04-12 1987-02-09 Draco Ab Indikeringsanordning vid en doseringsanordning for lekemedel
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US5618920A (en) 1985-11-01 1997-04-08 Xoma Corporation Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
US5576195A (en) 1985-11-01 1996-11-19 Xoma Corporation Vectors with pectate lyase signal sequence
DE3600905A1 (de) 1986-01-15 1987-07-16 Ant Nachrichtentech Verfahren zum dekodieren von binaersignalen sowie viterbi-dekoder und anwendungen
SE453566B (sv) 1986-03-07 1988-02-15 Draco Ab Anordning vid pulverinhalatorer
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
DE3783588T2 (de) 1986-04-17 1993-06-09 Kyowa Hakko Kogyo Kk Neue verbindungen dc-88a und dc-89a1 und deren herstellungsverfahren.
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US4704692A (en) 1986-09-02 1987-11-03 Ladner Robert C Computer based system and method for determining and displaying possible chemical structures for converting double- or multiple-chain polypeptides to single-chain polypeptides
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US6893625B1 (en) 1986-10-27 2005-05-17 Royalty Pharma Finance Trust Chimeric antibody with specificity to human B cell surface antigen
US5763192A (en) 1986-11-20 1998-06-09 Ixsys, Incorporated Process for obtaining DNA, RNA, peptides, polypeptides, or protein, by recombinant DNA technique
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
EP0832981A1 (en) 1987-02-17 1998-04-01 Pharming B.V. DNA sequences to target proteins to the mammary gland for efficient secretion
WO1988007089A1 (en) 1987-03-18 1988-09-22 Medical Research Council Altered antibodies
US4873316A (en) 1987-06-23 1989-10-10 Biogen, Inc. Isolation of exogenous recombinant proteins from the milk of transgenic mammals
US4975278A (en) 1988-02-26 1990-12-04 Bristol-Myers Company Antibody-enzyme conjugates in combination with prodrugs for the delivery of cytotoxic agents to tumor cells
US4939666A (en) 1987-09-02 1990-07-03 Genex Corporation Incremental macromolecule construction methods
US5677425A (en) 1987-09-04 1997-10-14 Celltech Therapeutics Limited Recombinant antibody
US5053394A (en) 1988-09-21 1991-10-01 American Cyanamid Company Targeted forms of methyltrithio antitumor agents
US4994578A (en) 1987-11-27 1991-02-19 Meiji Seika Kaisha, Ltd. Certain anti-tumor duocarmycin antibiotics from streptomyces
US5506126A (en) 1988-02-25 1996-04-09 The General Hospital Corporation Rapid immunoselection cloning method
WO1989008114A1 (en) 1988-02-25 1989-09-08 The General Hospital Corporation Rapid immunoselection cloning method
IL89489A0 (en) 1988-03-09 1989-09-10 Hybritech Inc Chimeric antibodies directed against human carcinoembryonic antigen
US4861579A (en) 1988-03-17 1989-08-29 American Cyanamid Company Suppression of B-lymphocytes in mammals by administration of anti-B-lymphocyte antibodies
US6010902A (en) 1988-04-04 2000-01-04 Bristol-Meyers Squibb Company Antibody heteroconjugates and bispecific antibodies for use in regulation of lymphocyte activity
AU631545B2 (en) 1988-04-15 1992-12-03 Protein Design Labs, Inc. Il-2 receptor-specific chimeric antibodies
ATE119198T1 (de) 1988-04-16 1995-03-15 Celltech Ltd Verfahren zur herstellung von proteinen mittels rekombinanter dna.
US4925648A (en) 1988-07-29 1990-05-15 Immunomedics, Inc. Detection and treatment of infectious and inflammatory lesions
US5601819A (en) 1988-08-11 1997-02-11 The General Hospital Corporation Bispecific antibodies for selective immune regulation and for selective immune cell binding
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5076973A (en) 1988-10-24 1991-12-31 Arizona Board Of Regents Synthesis of dolastatin 3
GB8827305D0 (en) 1988-11-23 1988-12-29 British Bio Technology Compounds
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US4978744A (en) 1989-01-27 1990-12-18 Arizona Board Of Regents Synthesis of dolastatin 10
DE3909708A1 (de) 1989-03-23 1990-09-27 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur herstellung bispezifischer antikoerper
CA2016841C (en) 1989-05-16 1999-09-21 William D. Huse A method for producing polymers having a preselected activity
US4879278A (en) 1989-05-16 1989-11-07 Arizona Board Of Regents Isolation and structural elucidation of the cytostatic linear depsipeptide dolastatin 15
WO1990014443A1 (en) 1989-05-16 1990-11-29 Huse William D Co-expression of heteromeric receptors
CA2016842A1 (en) 1989-05-16 1990-11-16 Richard A. Lerner Method for tapping the immunological repertoire
US6291158B1 (en) 1989-05-16 2001-09-18 Scripps Research Institute Method for tapping the immunological repertoire
US4986988A (en) 1989-05-18 1991-01-22 Arizona Board Of Regents Isolation and structural elucidation of the cytostatic linear depsipeptides dolastatin 13 and dehydrodolastatin 13
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
EP0739904A1 (en) 1989-06-29 1996-10-30 Medarex, Inc. Bispecific reagents for aids therapy
ES2118066T3 (es) 1989-10-05 1998-09-16 Optein Inc Sintesis y aislamiento, exentos de celulas, de nuevos genes y polipeptidos.
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5138036A (en) 1989-11-13 1992-08-11 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Isolation and structural elucidation of the cytostatic cyclodepsipeptide dolastatin 14
DE69133566T2 (de) 1990-01-12 2007-12-06 Amgen Fremont Inc. Bildung von xenogenen Antikörpern
TW212184B (es) 1990-04-02 1993-09-01 Takeda Pharm Industry Co Ltd
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
DE69128362T2 (de) 1990-06-01 1998-05-20 Chiron Corp Zusammensetzungen und verfahren zur identifizierung von molekülen mit biologischer wirksamkeit
US5723286A (en) 1990-06-20 1998-03-03 Affymax Technologies N.V. Peptide library and screening systems
WO1992000373A1 (en) 1990-06-29 1992-01-09 Biosource Genetics Corporation Melanin production by transformed microorganisms
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
KR100272077B1 (ko) 1990-08-29 2000-11-15 젠팜인터내셔날,인코포레이티드 이종 항체를 생산할 수 있는 전이유전자를 가진 인간이외의 동물
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
WO1992005258A1 (en) 1990-09-20 1992-04-02 La Trobe University Gene encoding barley enzyme
DE69128253T2 (de) 1990-10-29 1998-06-18 Chiron Corp Bispezifische antikörper, verfahren zu ihrer herstellung und deren verwendungen
CA2405246A1 (en) 1990-12-03 1992-06-11 Genentech, Inc. Enrichment method for variant proteins with alterred binding properties
US5582996A (en) 1990-12-04 1996-12-10 The Wistar Institute Of Anatomy & Biology Bifunctional antibodies and method of preparing same
IE920562A1 (en) 1991-02-21 1992-08-26 Gilead Sciences Aptamer specific for biomolecules and method of making
US5404871A (en) 1991-03-05 1995-04-11 Aradigm Delivery of aerosol medications for inspiration
US6284471B1 (en) 1991-03-18 2001-09-04 New York University Medical Center Anti-TNFa antibodies and assays employing anti-TNFa antibodies
US20070298040A1 (en) 1991-03-18 2007-12-27 Centocor, Inc. Methods of treating seronegative arthropathy with anti-TNF antibodies
JP3431140B2 (ja) 1991-04-26 2003-07-28 サーフィス・アクティブ・リミテッド 抗体およびその使用方法
EP0586505A1 (en) 1991-05-14 1994-03-16 Repligen Corporation Heteroconjugate antibodies for treatment of hiv infection
US6797492B2 (en) * 1991-05-17 2004-09-28 Merck & Co., Inc. Method for reducing the immunogenicity of antibody variable domains
DE4118120A1 (de) 1991-06-03 1992-12-10 Behringwerke Ag Tetravalente bispezifische rezeptoren, ihre herstellung und verwendung
CA2103059C (en) 1991-06-14 2005-03-22 Paul J. Carter Method for making humanized antibodies
US5637481A (en) 1993-02-01 1997-06-10 Bristol-Myers Squibb Company Expression vectors encoding bispecific fusion proteins and methods of producing biologically active bispecific fusion proteins in a mammalian cell
ATE189124T1 (de) 1991-07-02 2000-02-15 Inhale Inc Verfahren und vorrichtung zum abgeben von medikamenten in aerosolform
US5270170A (en) 1991-10-16 1993-12-14 Affymax Technologies N.V. Peptide library and screening method
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
DK1136556T3 (da) 1991-11-25 2005-10-03 Enzon Inc Fremgangsmåde til fremstilling af multivalente antigen-bindende proteiner
US5932448A (en) 1991-11-29 1999-08-03 Protein Design Labs., Inc. Bispecific antibody heterodimers
ES2341666T3 (es) 1991-12-02 2010-06-24 Medimmune Limited Produccion de autoanticuerpos de repertorios de segmentos de anticue rpos expresados en la superficie de fagos.
JP4157160B2 (ja) 1991-12-13 2008-09-24 ゾーマ テクノロジー リミテッド 改変抗体可変領域の調製のための方法
CA2129663C (en) 1992-02-06 2005-07-05 James S. Huston Biosynthetic binding protein for cancer marker
WO1993017715A1 (en) 1992-03-05 1993-09-16 Board Of Regents, The University Of Texas System Diagnostic and/or therapeutic agents, targeted to neovascular endothelial cells
DE4207475A1 (de) 1992-03-10 1993-09-16 Goldwell Ag Mittel zum blondieren von menschlichen haaren und verfahren zu dessen herstellung
EP0563475B1 (en) 1992-03-25 2000-05-31 Immunogen Inc Cell binding agent conjugates of derivatives of CC-1065
WO1993021319A1 (en) 1992-04-08 1993-10-28 Cetus Oncology Corporation HUMANIZED C-erbB-2 SPECIFIC ANTIBODIES
ZA932522B (en) 1992-04-10 1993-12-20 Res Dev Foundation Immunotoxins directed against c-erbB-2(HER/neu) related surface antigens
EP0640094A1 (en) 1992-04-24 1995-03-01 The Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant production of immunoglobulin-like domains in prokaryotic cells
ATE149570T1 (de) 1992-08-17 1997-03-15 Genentech Inc Bispezifische immunoadhesine
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
WO1994006498A1 (en) 1992-09-23 1994-03-31 Fisons Plc Inhalation device
WO1994008038A1 (en) 1992-10-02 1994-04-14 Trustees Of Dartmouth College Bispecific reagents for redirected targeting of low density lipoprotein
DK0665759T3 (da) 1992-10-19 1999-08-23 Dura Pharma Inc Tørpulverinhalator
NZ258392A (en) 1992-11-13 1997-09-22 Idec Pharma Corp Chimeric and radiolabelled antibodies to the b lymphocyte cellsurface antigen bp35 (cd-20) and their use in the treatment of b cell lymphona
DE669986T1 (de) 1992-11-13 1996-10-10 Idec Pharma Corp Völlig unfunktionelle konsensus-kozak-sequenzen zur säugetier-exprimierung.
US7744877B2 (en) 1992-11-13 2010-06-29 Biogen Idec Inc. Expression and use of anti-CD20 Antibodies
US5736137A (en) 1992-11-13 1998-04-07 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
US5648267A (en) 1992-11-13 1997-07-15 Idec Pharmaceuticals Corporation Impaired dominant selectable marker sequence and intronic insertion strategies for enhancement of expression of gene product and expression vector systems comprising same
AU5670194A (en) 1992-11-20 1994-06-22 Enzon, Inc. Linker for linked fusion polypeptides
US6034065A (en) 1992-12-03 2000-03-07 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of antineoplastic tetrapeptide phenethylamides of dolastatin 10
US5455258A (en) 1993-01-06 1995-10-03 Ciba-Geigy Corporation Arylsulfonamido-substituted hydroxamic acids
US5849695A (en) 1993-01-13 1998-12-15 The Regents Of The University Of California Parathyroid hormone analogues useful for treatment of osteoporosis and disorders of calcium meatabolism in mammals
WO1994016970A1 (en) 1993-01-19 1994-08-04 Glaxo Group Limited Device
US5770428A (en) 1993-02-17 1998-06-23 Wisconsin Alumni Research Foundation Chimeric retrovial expression vectors and particles containing a simple retroviral long terminal repeat, BLV or HIV coding regions and cis-acting regulatory sequences, and an RNA translational enhancer with internal ribsome entry site
EP0754225A4 (en) 1993-04-26 2001-01-31 Genpharm Int HETEROLOGIC ANTIBODY-PRODUCING TRANSGENIC NON-HUMAN ANIMALS
US5885573A (en) 1993-06-01 1999-03-23 Arch Development Corporation Methods and materials for modulation of the immunosuppressive activity and toxicity of monoclonal antibodies
AU691811B2 (en) 1993-06-16 1998-05-28 Celltech Therapeutics Limited Antibodies
US5417972A (en) 1993-08-02 1995-05-23 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Method of killing B-cells in a complement independent and an ADCC independent manner using antibodies which specifically bind CDIM
US5514670A (en) 1993-08-13 1996-05-07 Pharmos Corporation Submicron emulsions for delivery of peptides
US5595721A (en) 1993-09-16 1997-01-21 Coulter Pharmaceutical, Inc. Radioimmunotherapy of lymphoma using anti-CD20
US5432930A (en) 1993-09-30 1995-07-11 Eagle Crest Limited System for accessing cobol data files by generating a dictionary of NF.sup.2
US5625825A (en) 1993-10-21 1997-04-29 Lsi Logic Corporation Random number generating apparatus for an interface unit of a carrier sense with multiple access and collision detect (CSMA/CD) ethernet data network
DE4337197C1 (de) 1993-10-30 1994-08-25 Biotest Pharma Gmbh Verfahren zur selektiven Herstellung von Hybridomazellinien, die monoklonale Antikörper mit hoher Zytotoxizität gegen humanes CD16-Antigen produzieren, sowie Herstellung bispezifischer monoklonaler Antikörper unter Verwendung derartiger monoklonaler Antikörper und des CD30-HRS-3-Antikörpers zur Therapie menschlicher Tumore
US5814599A (en) 1995-08-04 1998-09-29 Massachusetts Insitiute Of Technology Transdermal delivery of encapsulated drugs
FR2713447B1 (fr) 1993-12-15 1996-02-09 Chenier Ste Civile Procédé et installation de torréfaction de fruits du genre noix de cajou ou analogues.
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
US5834252A (en) 1995-04-18 1998-11-10 Glaxo Group Limited End-complementary polymerase reaction
US5837458A (en) 1994-02-17 1998-11-17 Maxygen, Inc. Methods and compositions for cellular and metabolic engineering
US5605793A (en) 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
JPH09510201A (ja) 1994-03-07 1997-10-14 メダレツクス・インコーポレーテツド 臨床的効用を有する二重特異性分子
US5436361A (en) 1994-04-22 1995-07-25 Clemson University Process for synthesizing enediynes
DE4415998A1 (de) 1994-05-06 1995-11-09 Basf Ag Neue Tetrapeptide, ihre Herstellung Verwendung
JPH07309761A (ja) 1994-05-20 1995-11-28 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd デュオカルマイシン誘導体の安定化法
ATE306930T1 (de) 1994-08-12 2005-11-15 Immunomedics Inc Für b-zell-lymphom und leukämiezellen spezifische immunkonjugate und humane antikörper
US5554725A (en) 1994-09-14 1996-09-10 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Synthesis of dolastatin 15
US5763733A (en) 1994-10-13 1998-06-09 Enzon, Inc. Antigen-binding fusion proteins
JPH08175990A (ja) 1994-12-19 1996-07-09 Mitsubishi Chem Corp Ｐｉ３キナーゼ阻害剤とその製造法
JPH08176070A (ja) 1994-12-19 1996-07-09 Mitsubishi Chem Corp ジデプシド誘導体及びｐｉ３キナーゼ阻害剤
US5549551A (en) 1994-12-22 1996-08-27 Advanced Cardiovascular Systems, Inc. Adjustable length balloon catheter
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5863949A (en) 1995-03-08 1999-01-26 Pfizer Inc Arylsulfonylamino hydroxamic acid derivatives
US6037453A (en) 1995-03-15 2000-03-14 Genentech, Inc. Immunoglobulin variants
US5656730A (en) 1995-04-07 1997-08-12 Enzon, Inc. Stabilized monomeric protein compositions
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
DK0821671T3 (da) 1995-04-20 2001-04-23 Pfizer Arylsulfonylhydroxamsyrederivater som MMP- og TNF-inhibitorer
AU2466895A (en) 1995-04-28 1996-11-18 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6410690B1 (en) 1995-06-07 2002-06-25 Medarex, Inc. Therapeutic compounds comprised of anti-Fc receptor antibodies
DE19526926A1 (de) 1995-07-24 1997-01-30 Bayer Ag Verfahren zur Herstellung beladener nichtporöser Trägermaterialien
GB9521987D0 (en) 1995-10-26 1996-01-03 Ludwig Inst Cancer Res Phosphoinositide 3-kinase modulators
GB9624482D0 (en) 1995-12-18 1997-01-15 Zeneca Phaema S A Chemical compounds
DK0780386T3 (da) 1995-12-20 2003-02-03 Hoffmann La Roche Matrixmetalloproteaseinhibitorer
GB9526100D0 (en) 1995-12-20 1996-02-21 Intersurgical Ltd Nebulizer
WO1997025086A2 (en) 1996-01-03 1997-07-17 Glaxo Group Limited Inhalation device
SK285141B6 (sk) 1996-02-13 2006-07-07 Astrazeneca Uk Limited Použitie chinazolínového derivátu, chinazolínový derivát, spôsob jeho prípravy a farmaceutická kompozícia, ktorá ho obsahuje
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
EP0885198B1 (en) 1996-03-05 2001-12-19 AstraZeneca AB 4-anilinoquinazoline derivatives
US5714352A (en) 1996-03-20 1998-02-03 Xenotech Incorporated Directed switch-mediated DNA recombination
DE19624387C2 (de) 1996-06-19 1999-08-19 Hatz Motoren Kaltstartvorrichtung
EP0818442A3 (en) 1996-07-12 1998-12-30 Pfizer Inc. Cyclic sulphone derivatives as inhibitors of metalloproteinases and of the production of tumour necrosis factor
ES2175415T3 (es) 1996-07-18 2002-11-16 Pfizer Inhibidores de metaloproteasas matriciales basados en fosfinato.
US20010056066A1 (en) 1996-07-26 2001-12-27 Smithkline Beecham Corporation Method of treating immune cell mediated systemic diseases
EA199900139A1 (ru) 1996-08-23 1999-08-26 Пфайзер, Инк. Производные арилсульфониламиногидроксамовой кислоты
ES2169299T3 (es) 1996-09-03 2002-07-01 Gsf Forschungszentrum Umwelt Procedimiento para la destruccion de celulas tumorales contaminantes en transplantes de celulas madre utilizando anticuerpos especificos.
JPH1087666A (ja) 1996-09-18 1998-04-07 Kyorin Pharmaceut Co Ltd デュオカルマイシンｓａ及びその誘導体の製造中間体と製造方法
GB9718972D0 (en) 1996-09-25 1997-11-12 Zeneca Ltd Chemical compounds
EP2314625B1 (en) 1996-12-03 2014-05-07 Amgen Fremont Inc. Transgenic mammals having human Ig loci including plural VH and Vkappa regions and antibodies produced therefrom
PT950059E (pt) 1997-01-06 2004-10-29 Pfizer Derivados de sulfona ciclicos
EA002594B1 (ru) 1997-02-03 2002-06-27 Пфайзер Продактс Инк. Производные арилсульфониламиногидроксамовой кислоты
CA2279863A1 (en) 1997-02-07 1998-08-13 Pfizer Inc. N-hydroxy-beta-sulfonyl-propionamide derivatives and their use as inhibitors of matrix metalloproteinases
JP3710489B2 (ja) 1997-02-11 2005-10-26 ファイザー・インク アリールスルホニルヒドロキサム酸誘導体
JP4367866B2 (ja) 1997-02-12 2009-11-18 ザ リージェンツ オブ ジ ユニバーシティ オブ ミシガン 肺癌用のタンパク質マーカーおよびその使用
US5921447A (en) 1997-02-13 1999-07-13 Glaxo Wellcome Inc. Flow-through metered aerosol dispensing apparatus and method of use thereof
US6239104B1 (en) 1997-02-25 2001-05-29 Arizona Board Of Regents Isolation and structural elucidation of the cytostatic linear and cyclo-depsipeptides dolastatin 16, dolastatin 17, and dolastatin 18
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
US5965537A (en) 1997-03-10 1999-10-12 Basf Aktiengesellschaft Dolastatin 15 derivatives with carbonyl and heterocyclic functionalities at the C-terminus
US6103698A (en) 1997-03-13 2000-08-15 Basf Aktiengesellschaft Dolastatin-15 derivatives in combination with taxanes
US6306393B1 (en) 1997-03-24 2001-10-23 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of B-cell malignancies using anti-CD22 antibodies
US6183744B1 (en) 1997-03-24 2001-02-06 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of B-cell malignancies using anti-CD22 antibodies
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
AU754083B2 (en) 1997-05-22 2002-11-07 Scripps Research Institute, The Analogs of duocarmycin and CC-1065
EP0999853B1 (en) 1997-06-13 2003-01-02 Genentech, Inc. Stabilized antibody formulation
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
US6991790B1 (en) 1997-06-13 2006-01-31 Genentech, Inc. Antibody formulation
US20040191256A1 (en) 1997-06-24 2004-09-30 Genentech, Inc. Methods and compositions for galactosylated glycoproteins
DE69830315T2 (de) 1997-06-24 2006-02-02 Genentech Inc., San Francisco Galactosylierte glykoproteine enthaltende zusammensetzungen und verfahren zur deren herstellung
WO1999002567A2 (en) 1997-07-08 1999-01-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Compositions and methods for producing homoconjugates of antibodies which induce growth arrest or apoptosis of tumor cells
US6143721A (en) 1997-07-18 2000-11-07 Basf Aktiengesellschaft Dolastatin 15 derivatives
EP1003720B1 (en) 1997-08-08 2004-03-31 Pfizer Products Inc. Aryloxyarylsulfonylamino hydroxamic acid derivatives
US6686445B1 (en) 1997-09-24 2004-02-03 Arizona Board Of Regents, Acting For And On Behalf Of Arizona State University Synthetic antineoplastic agents derived from dolastatin 15 and methods of making same
GB9722131D0 (en) 1997-10-20 1997-12-17 Medical Res Council Method
WO1999022764A1 (en) 1997-10-31 1999-05-14 Genentech, Inc. Methods and compositions comprising glycoprotein glycoforms
GB9725782D0 (en) 1997-12-05 1998-02-04 Pfizer Ltd Therapeutic agents
GB9801690D0 (en) 1998-01-27 1998-03-25 Pfizer Ltd Therapeutic agents
JP4462654B2 (ja) 1998-03-26 2010-05-12 ソニー株式会社 映像素材選択装置及び映像素材選択方法
JP2002510481A (ja) 1998-04-02 2002-04-09 ジェネンテック・インコーポレーテッド 抗体変異体及びその断片
US6242195B1 (en) 1998-04-02 2001-06-05 Genentech, Inc. Methods for determining binding of an analyte to a receptor
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
US6528624B1 (en) 1998-04-02 2003-03-04 Genentech, Inc. Polypeptide variants
PA8469401A1 (es) 1998-04-10 2000-05-24 Pfizer Prod Inc Derivados biciclicos del acido hidroxamico
PA8469501A1 (es) 1998-04-10 2000-09-29 Pfizer Prod Inc Hidroxamidas del acido (4-arilsulfonilamino)-tetrahidropiran-4-carboxilico
ATE458007T1 (de) 1998-04-20 2010-03-15 Glycart Biotechnology Ag Glykosylierungs-engineering von antikörpern zur verbesserung der antikörperabhängigen zellvermittelten zytotoxizität
GB9809951D0 (en) 1998-05-08 1998-07-08 Univ Cambridge Tech Binding molecules
US5985837A (en) 1998-07-08 1999-11-16 Basf Aktiengesellschaft Dolastatin 15 derivatives
EA004107B1 (ru) 1998-08-11 2003-12-25 Айдек Фармацевтикалс Корпорэйшн Комбинированная терапия в-клеточных лимфом, предусматривающая введение антитела против cd20
US6224866B1 (en) 1998-10-07 2001-05-01 Biocrystal Ltd. Immunotherapy of B cell involvement in progression of solid, nonlymphoid tumors
ATE260255T1 (de) 1998-11-05 2004-03-15 Pfizer Prod Inc 5-oxo-pyrrolidine-2-carbonsäure- hydroxamidderivate
MY155913A (en) 1998-11-09 2015-12-15 Biogen Inc Chimeric anti-cd20 antibody treatment of patients receiving bmt or pbsc transpants
WO2000027428A1 (en) 1998-11-09 2000-05-18 Idec Pharmaceuticals Corporation Treatment of hematologic malignancies associated with circulating tumor cells using chimeric anti-cd20 antibody
ES2694002T3 (es) 1999-01-15 2018-12-17 Genentech, Inc. Polipéptido que comprende una región Fc de IgG1 humana variante
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US6897044B1 (en) 1999-01-28 2005-05-24 Biogen Idec, Inc. Production of tetravalent antibodies
EE05345B1 (et) 1999-02-10 2010-10-15 Astrazeneca Ab Kinasoliini derivaadid angiogeneesi inhibiitoritena
CA2704600C (en) 1999-04-09 2016-10-25 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. A method for producing antibodies with increased adcc activity
DK1176981T3 (da) 1999-05-07 2006-04-10 Genentech Inc Behandling af autoimmune sygdomme med antagonister som binder til B celleoverflademarkörer
EP1194167B1 (en) 1999-06-09 2009-08-19 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of autoimmune disorders using antibodies which target b-cells
ITMI991299A1 (it) 1999-06-11 2000-12-11 Consiglio Nazionale Ricerche Uso di anticorpi contro antigeni di superficie per il trattamento della malattia trapianto contro ospite
DE19930748C2 (de) 1999-07-02 2001-05-17 Infineon Technologies Ag Verfahren zur Herstellung von EEPROM- und DRAM-Grabenspeicherzellbereichen auf einem Chip
IL147547A0 (en) 1999-07-12 2002-08-14 Genentech Inc Blocking immune response to a foreign antigen using an antagonist which binds to cd20
US6451284B1 (en) 1999-08-11 2002-09-17 Idec Pharmaceuticals Corporation Clinical parameters for determining hematologic toxicity prior to radioimmunotheraphy
CN101259270A (zh) 1999-08-11 2008-09-10 拜奥根Idec公司 用抗cd20抗体治疗累及骨髓的非霍奇金淋巴瘤患者
US8557244B1 (en) 1999-08-11 2013-10-15 Biogen Idec Inc. Treatment of aggressive non-Hodgkins lymphoma with anti-CD20 antibody
WO2001013945A1 (en) 1999-08-23 2001-03-01 Biocrystal Ltd. Methods and compositions for immunotherapy of b cell involvement in promotion of a disease condition comprising multiple sclerosis
US6323315B1 (en) 1999-09-10 2001-11-27 Basf Aktiengesellschaft Dolastatin peptides
US20030039659A1 (en) 1999-09-24 2003-02-27 Mccormick Alison A. Self antigen vaccines for treating B cell lymphomas and other cancers
AU775373B2 (en) 1999-10-01 2004-07-29 Immunogen, Inc. Compositions and methods for treating cancer using immunoconjugates and chemotherapeutic agents
JP4668498B2 (ja) 1999-10-19 2011-04-13 協和発酵キリン株式会社 ポリペプチドの製造方法
ES2306306T3 (es) 1999-11-05 2008-11-01 Astrazeneca Ab Nuevos derivados de quinazolina.
WO2001034194A1 (en) 1999-11-08 2001-05-17 Idec Pharmaceuticals Corporation Treatment of b cell malignancies using anti-cd40l antibodies in combination with anti-cd20 antibodies and/or chemotherapeutics and radiotherapy
US20020028178A1 (en) 2000-07-12 2002-03-07 Nabil Hanna Treatment of B cell malignancies using combination of B cell depleting antibody and immune modulating antibody related applications
US20020006404A1 (en) 1999-11-08 2002-01-17 Idec Pharmaceuticals Corporation Treatment of cell malignancies using combination of B cell depleting antibody and immune modulating antibody related applications
ES2276708T3 (es) 1999-11-24 2007-07-01 Immunogen, Inc. Agentes citotoxicos que comprenden taxanos y su uso terapeutico.
ES2269366T3 (es) 2000-02-11 2007-04-01 Merck Patent Gmbh Mejoramiento de la vida media en circulacion de proteinas de fusion basadas en anticuerpos.
CZ303705B6 (cs) 2000-02-15 2013-03-27 Sugen, Inc. Pyrrolem substituovaná 2-indolinonová sloucenina pro pouzití jako inhibitor proteinkináz a farmaceutická kompozice s jejím obsahem
JP2001247477A (ja) 2000-03-03 2001-09-11 Teikoku Hormone Mfg Co Ltd 抗腫瘍剤
US7097840B2 (en) 2000-03-16 2006-08-29 Genentech, Inc. Methods of treatment using anti-ErbB antibody-maytansinoid conjugates
IL151906A0 (en) 2000-03-24 2003-04-10 Chiron Corp Methods of therapy for non-hodgkin's lymphoma using a combination of an antibody to cd20 and interleukin-2
US20030185796A1 (en) 2000-03-24 2003-10-02 Chiron Corporation Methods of therapy for non-hodgkin's lymphoma
CA2404365A1 (en) 2000-03-31 2001-10-11 Idec Pharmaceutical Corporation Combined use of anti-cytokine antibodies or antagonists and anti-cd20 for the treatment of b cell lymphoma
AU2001247616B2 (en) 2000-04-11 2007-06-14 Genentech, Inc. Multivalent antibodies and uses therefor
US7416726B2 (en) 2000-04-13 2008-08-26 The Rockefeller University Enhancement of antibody-mediated immune responses
KR20030016250A (ko) 2000-04-25 2003-02-26 아이덱 파마슈티칼즈 코포레이션 중추신경계 림프종 치료용 리툭시맵의 초내 투여
US6403588B1 (en) 2000-04-27 2002-06-11 Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd. Imidazopyridine derivatives
US6608053B2 (en) 2000-04-27 2003-08-19 Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd. Fused heteroaryl derivatives
JP2004512262A (ja) 2000-06-20 2004-04-22 アイデック　ファーマスーティカルズ　コーポレイション 非放射性抗ｃｄ２０抗体／放射標識抗ｃｄ２２抗体の組合せ
PT1296714E (pt) 2000-06-22 2009-10-15 Coley Pharm Gmbh Combinação de cpg e anticorpos dirigidos contra cd19, cd20, cd22 ou cd40 para o tratamento ou prevenção do cancro
SG136804A1 (en) 2000-07-12 2007-11-29 Idec Pharma Corp Treatment of b cell malignancies using combination of b cell depleting antibody and immune modulating antibody related applications
US6725230B2 (en) 2000-07-18 2004-04-20 Aegis Analytical Corporation System, method and computer program for assembling process data of multi-database origins using a hierarchical display
US6333410B1 (en) 2000-08-18 2001-12-25 Immunogen, Inc. Process for the preparation and purification of thiol-containing maytansinoids
AR030612A1 (es) 2000-09-12 2003-08-27 Smithkline Beecham Corp Procedimiento e intermedios
MXPA03002262A (es) 2000-09-18 2003-10-15 Idec Pharma Corp Terapia de combinacion para tratamiento de enfermedades autoinmunes usando una combinacion de anticuerpos inmunorreguladores/supresores de celulas b.
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
US7064191B2 (en) 2000-10-06 2006-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
HU231090B1 (hu) 2000-10-06 2020-07-28 Kyowa Kirin Co., Ltd. Antitest-kompozíciót termelő sejt
CA2424977C (en) 2000-10-06 2008-03-18 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
WO2002034790A1 (en) 2000-10-20 2002-05-02 Idec Pharmaceuticals Corporation Variant igg3 rituxan r and therapeutic use thereof
DK1355919T3 (da) 2000-12-12 2011-03-14 Medimmune Llc Molekyler med længere halveringstider, sammensætninger og anvendelser deraf
AU2002256971B2 (en) 2000-12-28 2008-04-03 Altus Pharmaceuticals Inc. Crystals of whole antibodies and fragments thereof and methods for making and using them
JP4458746B2 (ja) 2001-01-16 2010-04-28 グラクソ グループ リミテッド 癌の治療方法
US20030133939A1 (en) 2001-01-17 2003-07-17 Genecraft, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
CA2433877C (en) 2001-01-17 2014-11-18 Genecraft, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US7829084B2 (en) 2001-01-17 2010-11-09 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding constructs and methods for use thereof
US7754208B2 (en) 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
CA2436092A1 (en) 2001-01-29 2002-08-08 Idec Pharmaceutical Corporation Modified antibodies and methods of use
US7319139B2 (en) 2001-01-29 2008-01-15 Biogen Idec, Inc. TAG-72 specific CH2 domain deleted antibodies
US20030103971A1 (en) 2001-11-09 2003-06-05 Kandasamy Hariharan Immunoregulatory antibodies and uses thereof
US6444163B1 (en) 2001-03-06 2002-09-03 Kawasaki Steel Corporation Heat shielding apparatus for vertical continuous annealing furnace
US20020156274A1 (en) 2001-03-16 2002-10-24 Terfloth Gerald J. Process for preparing maytansinol
EP1383800A4 (en) 2001-04-02 2004-09-22 Idec Pharma Corp RECOMBINANT ANTIBODIES CO-EXPRESSED WITH GNTIII
IL157946A0 (en) 2001-04-02 2004-03-28 Genentech Inc Combination therapy
ITPD20010108A1 (it) 2001-05-08 2002-11-08 Fidia Advanced Biopolymers Srl Biomateriali polimerici elettricamente conduttori, loro processo di preparazione ed impiego nel settore biomedico sanitario.
WO2003061694A1 (en) 2001-05-10 2003-07-31 Seattle Genetics, Inc. Immunosuppression of the humoral immune response by anti-cd20 antibodies
US6441163B1 (en) 2001-05-31 2002-08-27 Immunogen, Inc. Methods for preparation of cytotoxic conjugates of maytansinoids and cell binding agents
EP1404366A4 (en) 2001-06-14 2006-06-07 Intermune Inc COMBINED THERAPY USING INTERFERON GAMMA AND SPECIFIC B-CELL ANTIBODIES
US7321026B2 (en) 2001-06-27 2008-01-22 Skytech Technology Limited Framework-patched immunoglobulins
US6737409B2 (en) 2001-07-19 2004-05-18 Hoffmann-La Roche Inc. Dolastatin 10 derivatives
EP1417976A4 (en) 2001-07-26 2004-09-15 Santen Pharmaceutical Co Ltd AGENT FOR TREATING GLAUKOM WITH A COMPOUND WITH PI3-KINASE INHIBITING EFFECT
CA2838062C (en) 2001-08-03 2015-12-22 Roche Glycart Ag Antibody glycosylation variants having increased antibody-dependent cellular cytotoxicity
US6703414B2 (en) 2001-09-14 2004-03-09 Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona Device and method for treating restenosis
EP2131198B1 (en) 2001-09-20 2013-03-27 Board of Regents, The University of Texas System Measuring circulating therapeutic antibody, antigen and antigen/antibody complexes using ELISA assays
US7151164B2 (en) 2002-02-14 2006-12-19 Immunomedics, Inc. Anti-CD20 antibodies and fusion proteins thereof and methods of use
AU2002349912A1 (en) 2001-10-24 2003-05-06 Iconix Pharmaceuticals, Inc. Modulators of phosphoinositide 3-kinase
WO2003034997A2 (en) 2001-10-24 2003-05-01 Iconix Pharmaceuticals, Inc. Modulators of phosphoinositide 3-kinase
HUP0600342A3 (en) 2001-10-25 2011-03-28 Genentech Inc Glycoprotein compositions
EP1444010A2 (en) 2001-10-30 2004-08-11 Pharmacia Corporation Heteroaromatic carboxamide derivatives for the treatment of inflammation
CN1210307C (zh) 2001-11-16 2005-07-13 上海中信国健药业有限公司 抗cd20人源化单克隆抗体
AU2002360413A1 (en) 2001-11-21 2003-06-10 University Of Washington Biosynthetic gene cluster for the maytansinoid antitumor agent ansamitocin
AU2002362098A1 (en) 2001-12-07 2003-06-23 Chiron Corporation Methods of therapy for non-hodgkin's lymphoma
US6716821B2 (en) 2001-12-21 2004-04-06 Immunogen Inc. Cytotoxic agents bearing a reactive polyethylene glycol moiety, cytotoxic conjugates comprising polyethylene glycol linking groups, and methods of making and using the same
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
US6790954B2 (en) 2002-01-29 2004-09-14 Immunogen, Inc. Mutant Actinosynnema pretiosum strain with increased maytansinoid production
US20040002587A1 (en) 2002-02-20 2004-01-01 Watkins Jeffry D. Fc region variants
WO2003074679A2 (en) 2002-03-01 2003-09-12 Xencor Antibody optimization
US7317091B2 (en) 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
US20030180292A1 (en) 2002-03-14 2003-09-25 Idec Pharmaceuticals Treatment of B cell malignancies using anti-CD40L antibodies in combination with anti-CD20 antibodies and/or chemotherapeutics and radiotherapy
US6756397B2 (en) 2002-04-05 2004-06-29 Immunogen, Inc. Prodrugs of CC-1065 analogs
US20040259150A1 (en) 2002-04-09 2004-12-23 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Method of enhancing of binding activity of antibody composition to Fcgamma receptor IIIa
WO2003084570A1 (fr) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Medicament contenant une composition d'anticorps appropriee au patient souffrant de polymorphisme fc$g(g)riiia
JPWO2003085118A1 (ja) 2002-04-09 2005-08-11 協和醗酵工業株式会社 抗体組成物の製造方法
BR0309145A (pt) 2002-04-09 2005-02-01 Kyowa Hakko Kogyo Kk Células das quais o genoma é modificado
AU2003236020B2 (en) 2002-04-09 2009-03-19 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Cell with depression or deletion of the activity of protein participating in GDP-fucose transport
JPWO2003084569A1 (ja) 2002-04-09 2005-08-11 協和醗酵工業株式会社 抗体組成物含有医薬
US20030219818A1 (en) 2002-05-10 2003-11-27 Bohen Sean P. Methods and compositions for determining neoplastic disease responsiveness to antibody therapy
JP2005525423A (ja) 2002-05-13 2005-08-25 スミスクライン・ビーチャム・コーポレイション メイタンシノールの調製方法
US6596757B1 (en) 2002-05-14 2003-07-22 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising polyethylene glycol-containing taxanes and their therapeutic use
US7538195B2 (en) 2002-06-14 2009-05-26 Immunogen Inc. Anti-IGF-I receptor antibody
DE60305919T2 (de) 2002-06-28 2007-01-18 Domantis Limited, Cambridge Dual-specifische liganden mit erhöhter halbwertszeit
MXPA05000453A (es) 2002-07-10 2005-03-23 Applied Research Systems Derivados de benceno fusionados a azolidinona-vinilo.
US20040092561A1 (en) 2002-11-07 2004-05-13 Thomas Ruckle Azolidinone-vinyl fused -benzene derivatives
CA2489779A1 (en) 2002-07-10 2004-01-22 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Use of compounds for increasing spermatozoa motility
CA2494104A1 (en) 2002-07-31 2004-04-22 Seattle Genetics, Inc. Anti-cd20 antibody-drug conjugates for the treatment of cancer and immune disorders
WO2004013093A2 (en) 2002-08-02 2004-02-12 Immunogen, Inc. Cytotoxic agents containing novel potent taxanes and their therapeutic use
ATE536188T1 (de) 2002-08-14 2011-12-15 Macrogenics Inc Fcgammariib-spezifische antikörper und verfahren zur verwendung davon
AU2003259163B2 (en) 2002-08-16 2008-07-03 Immunogen, Inc. Cross-linkers with high reactivity and solubility and their use in the preparation of conjugates for targeted delivery of small molecule drugs
EP1391213A1 (en) 2002-08-21 2004-02-25 Boehringer Ingelheim International GmbH Compositions and methods for treating cancer using maytansinoid CD44 antibody immunoconjugates and chemotherapeutic agents
AU2003255845A1 (en) 2002-08-22 2004-03-11 Piramed Limited Phosphadidylinositol 3,5-biphosphate inhibitors as anti-viral agents
DK2345671T3 (en) 2002-09-27 2016-02-15 Xencor Inc Optimized Fc variants and methods for their formation
AU2003286467B2 (en) 2002-10-15 2009-10-01 Abbvie Biotherapeutics Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
EP3284753B1 (en) * 2002-10-17 2019-06-05 Genmab A/S Human monoclonal antibodies against cd20 for use in the treatment of multiple sclerosis
US20040120949A1 (en) 2002-11-08 2004-06-24 Boehringer Ingelheim International Gmbh Compositions and methods for treating cancer using cytotoxic CD44 antibody immunoconjugates and radiotherapy
JP4480128B2 (ja) 2002-11-20 2010-06-16 独立行政法人科学技術振興機構 マトリックスメタロプロテアーゼ−９の産生を阻害するための薬剤
US7402728B2 (en) 2002-12-16 2008-07-22 Genentech, Inc. Transgenic mice expressing human CD20 and/or CD16
TWI335821B (en) 2002-12-16 2011-01-11 Genentech Inc Immunoglobulin variants and uses thereof
CA2511910A1 (en) 2002-12-27 2004-07-15 Domantis Limited Dual specific single domain antibodies specific for a ligand and for the receptor of the ligand
US7534427B2 (en) 2002-12-31 2009-05-19 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of B cell malignancies and autoimmune diseases using unconjugated antibodies and conjugated antibodies and antibody combinations and fusion proteins
WO2004063351A2 (en) 2003-01-09 2004-07-29 Macrogenics, Inc. IDENTIFICATION AND ENGINEERING OF ANTIBODIES WITH VARIANT Fc REGIONS AND METHODS OF USING SAME
EP2862878B1 (en) 2003-02-25 2022-11-02 Nykode Therapeutics ASA Modified antibody
US8084582B2 (en) 2003-03-03 2011-12-27 Xencor, Inc. Optimized anti-CD20 monoclonal antibodies having Fc variants
SI1613350T1 (sl) 2003-04-09 2009-08-31 Genentech Inc Zdravljenje avtoimunske bolezni pri bolniku z neustreznim odzivom na inhibitor TNF-alfa
EP2669377A3 (en) 2003-04-17 2015-10-14 Alnylam Pharmaceuticals Inc. Modified iRNA agents
US7755007B2 (en) 2003-04-17 2010-07-13 K&H Manufacturing, Inc Heated pet mat
JP5416338B2 (ja) 2003-05-09 2014-02-12 デューク ユニバーシティ Ｃｄ２０特異的抗体およびその使用方法
KR101424624B1 (ko) 2003-05-14 2014-07-31 이뮤노젠 아이엔씨 약물 콘쥬게이트 조성물
US8088387B2 (en) 2003-10-10 2012-01-03 Immunogen Inc. Method of targeting specific cell populations using cell-binding agent maytansinoid conjugates linked via a non-cleavable linker, said conjugates, and methods of making said conjugates
AR044388A1 (es) 2003-05-20 2005-09-07 Applied Molecular Evolution Moleculas de union a cd20
US7276497B2 (en) 2003-05-20 2007-10-02 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising new maytansinoids
EP1629001A2 (en) 2003-06-05 2006-03-01 Genentech, Inc. Blys antagonists and uses thereof
US20050163775A1 (en) 2003-06-05 2005-07-28 Genentech, Inc. Combination therapy for B cell disorders
US20050123549A1 (en) 2003-07-21 2005-06-09 Immunogen Inc. CA6 antigen-specific cytotoxic conjugate and methods of using the same
US7834155B2 (en) 2003-07-21 2010-11-16 Immunogen Inc. CA6 antigen-specific cytotoxic conjugate and methods of using the same
EP1667546B1 (en) 2003-07-25 2011-01-26 Bally Gaming International, Inc. A method to produce uniquely identifiable casino gaming chips
US20050032130A1 (en) 2003-07-29 2005-02-10 Genentech, Inc. Neutralizing antibody assay and uses therefor
AU2004263538B2 (en) 2003-08-08 2009-09-17 Immunomedics, Inc. Bispecific antibodies for inducing apoptosis of tumor and diseased cells
US8147832B2 (en) 2003-08-14 2012-04-03 Merck Patent Gmbh CD20-binding polypeptide compositions and methods
MXPA06002134A (es) 2003-08-29 2006-05-31 Genentech Inc Terapia de trastornos oculares.
US7288396B2 (en) 2003-09-11 2007-10-30 Kosan Biosciences Incorporated Biosynthetic gene cluster for leptomycins
US20080241884A1 (en) 2003-10-08 2008-10-02 Kenya Shitara Fused Protein Composition
EP1705251A4 (en) 2003-10-09 2009-10-28 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd PROCESS FOR PRODUCING ANTIBODY COMPOSITION BY RNA INHIBITION OF FUNCTION OF $ G (A) 1,6-FUCOSYLTRANSFERASE
GB0324368D0 (en) 2003-10-17 2003-11-19 Univ Cambridge Tech Polypeptides including modified constant regions
WO2005044859A2 (en) 2003-11-05 2005-05-19 Glycart Biotechnology Ag Cd20 antibodies with increased fc receptor binding affinity and effector function
GB0325952D0 (en) 2003-11-06 2003-12-10 Du Pont Method for producing enhanced solid state polymerization of polyethylene terephthalate
JPWO2005053742A1 (ja) 2003-12-04 2007-06-28 協和醗酵工業株式会社 抗体組成物を含有する医薬
JP2007514787A (ja) 2003-12-19 2007-06-07 ジェネンテック・インコーポレーテッド 自己免疫疾患の治療におけるｃｄ２０の検出
WO2005061542A2 (en) 2003-12-19 2005-07-07 Genentech, Inc. Detection of cd20 in transplant rejection
BRPI0506771A (pt) 2004-01-12 2007-05-22 Applied Molecular Evolution anticorpo, e, composição farmacêutica
US20060018911A1 (en) * 2004-01-12 2006-01-26 Dana Ault-Riche Design of therapeutics and therapeutics
US20050203174A1 (en) 2004-03-09 2005-09-15 Kosan Biosciences, Inc. Combination therapies using leptomycin B
WO2005099754A2 (en) 2004-04-14 2005-10-27 The Ohio State University Research Foundation Maytansinoid analogs as antitumor agents
BRPI0509419A (pt) 2004-04-16 2007-09-04 Genentech Inc método de ensaio imunossorvente ligado por enzimas, anticorpos, hibridoma e kit de imunoensaio
AR049021A1 (es) 2004-04-16 2006-06-21 Genentech Inc Tratamiento de trastornos con un anticuerpo que se une a cd20
US20050276803A1 (en) 2004-04-16 2005-12-15 Genentech, Inc. Method for augmenting B cell depletion
WO2005103081A2 (en) 2004-04-20 2005-11-03 Genmab A/S Human monoclonal antibodies against cd20
US20050271658A1 (en) 2004-05-05 2005-12-08 Genentech, Inc. Preventing autoimmune disease
WO2005114218A2 (en) 2004-05-15 2005-12-01 Genentech, Inc. Cross-screening system and methods for detecting a molecule having binding affinity for a target molecule
EP2286844A3 (en) 2004-06-01 2012-08-22 Genentech, Inc. Antibody-drug conjugates and methods
US7446196B2 (en) 2004-06-03 2008-11-04 Kosan Biosciences, Incorporated Leptomycin compounds
KR20070029733A (ko) 2004-06-04 2007-03-14 제넨테크, 인크. 다발성 경화증의 치료 방법
US20060024295A1 (en) 2004-06-04 2006-02-02 Genentech, Inc. Method for treating lupus
MX2007000327A (es) 2004-07-09 2007-03-12 Schering Ag Tratamiento del linfoma de celulas b.
CN101987870B (zh) 2004-07-15 2013-07-03 赞科股份有限公司 优化的Fc变体
US20060062787A1 (en) 2004-07-22 2006-03-23 Genentech, Inc. Method for treating Sjogren's syndrome
BRPI0515230A (pt) * 2004-08-19 2008-07-15 Genentech Inc polipeptìdeos, anticorpos e ácidos nucléicos isolados, composições, vetor de expressão, células hospedeiras isoladas, método para a produção de um anticorpo, artigos manufaturados, métodos de tratamento e para o alìvio de disfunções, métodos de produção e de seleção de um polipeptìdeo, anticorpo de ligação cd20 humanizado, anticorpo anti-her2 isolado e usos de um anticorpo
MX2007002855A (es) 2004-09-08 2007-04-27 Genentech Inc Metodos para usar ligandos de receptor de muerte y anticuerpos cd20.
BRPI0516297A (pt) 2004-10-05 2008-09-02 Genentech Inc métodos de tratamento de vasculite e artigos de fabricação
AR052774A1 (es) 2004-10-08 2007-04-04 Wyeth Corp Inmunoterapia para trastornos autoinmunes
WO2006047350A2 (en) 2004-10-21 2006-05-04 Xencor, Inc. IgG IMMUNOGLOBULIN VARIANTS WITH OPTIMIZED EFFECTOR FUNCTION
GB0423653D0 (en) 2004-10-25 2004-11-24 Piramed Ltd Pharmaceutical compounds
US20060099235A1 (en) 2004-11-11 2006-05-11 Medtronic Vascular, Inc. Medical devices and compositions useful for treating or inhibiting restenosis
EP1688415A1 (en) 2004-12-07 2006-08-09 Aventis Pharma S.A. Cytotoxic agents comprising new C-2 modified taxanes
NZ555601A (en) 2004-12-09 2009-07-31 Centocor Inc Anti-integrin immunoconjugates, methods and uses
KR20070086128A (ko) 2004-12-13 2007-08-27 에프. 호프만-라 로슈 아게 3-피롤리딘-2-일-프로피온산 유도체의 신규 제조 방법
FR2879204B1 (fr) 2004-12-15 2007-02-16 Lab Francais Du Fractionnement Anticorps cytotoxique dirige contre les proliferations hematopoietiques lymphoides de type b.
EP1824885A1 (en) 2004-12-17 2007-08-29 Genentech, Inc. Antiangiogenesis therapy of autoimmune disease in patients who have failed prior therapy
WO2006069403A2 (en) 2004-12-22 2006-06-29 Genentech, Inc. Methods for producing soluble multi-membrane-spanning proteins
CN101102993A (zh) 2005-01-13 2008-01-09 霍夫曼-拉罗奇有限公司 有用的双取代胺类的新型一步合成
MX2007008218A (es) 2005-01-13 2007-08-17 Genentech Inc Procedimiento de tratamiento.
US7301019B2 (en) 2005-01-21 2007-11-27 Immunogen, Inc. Method for the preparation of maytansinoid esters
DOP2006000029A (es) 2005-02-07 2006-08-15 Genentech Inc Antibody variants and uses thereof. (variantes de un anticuerpo y usos de las mismas)
EP1853322B1 (en) 2005-02-11 2014-06-25 ImmunoGen, Inc. Process for preparing maytansinoid antibody conjugates
TW200714289A (en) 2005-02-28 2007-04-16 Genentech Inc Treatment of bone disorders
ES2370941T3 (es) * 2005-03-31 2011-12-23 Biomedics Inc. Anticuerpo monoclonal anti-cd20.
EP1871808A2 (en) 2005-03-31 2008-01-02 Xencor, Inc. Fc VARIANTS WITH OPTIMIZED PROPERTIES
TWI381050B (zh) 2005-03-31 2013-01-01 Biomedics Inc Anti-CD20 monoclonal antibody
JP2008538365A (ja) 2005-04-15 2008-10-23 イミュノジェン・インコーポレーテッド 腫瘍内の不均一または混合細胞集団を排除する方法
MX2007014673A (es) 2005-05-24 2008-04-08 Avestha Gengraine Tech Pvt Ltd Metodo para la produccion de un anticuerpo monoclonal para cd20 para el tratamiento de linfoma de celular b.
AU2006252733A1 (en) 2005-06-02 2006-12-07 Astrazeneca Ab Antibodies directed to CD20 and uses thereof
WO2006133450A2 (en) 2005-06-08 2006-12-14 Duke University Anti-cd19 antibody therapy for the transplantation
CN1290864C (zh) 2005-07-11 2006-12-20 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 一种抗cd20嵌合抗体
KR101566393B1 (ko) 2005-08-03 2015-11-05 이뮤노젠 아이엔씨 면역접합체 제형
US20070213292A1 (en) 2005-08-10 2007-09-13 The Rockefeller University Chemically modified oligonucleotides for use in modulating micro RNA and uses thereof
AU2006283726C1 (en) 2005-08-24 2015-05-07 Immunogen, Inc. Process for preparing maytansinoid antibody conjugates
DK1931709T3 (en) 2005-10-03 2017-03-13 Xencor Inc FC VARIETIES WITH OPTIMIZED FC RECEPTOR BINDING PROPERTIES
GB0520657D0 (en) 2005-10-11 2005-11-16 Ludwig Inst Cancer Res Pharmaceutical compounds
GB0525214D0 (en) * 2005-12-12 2006-01-18 Bioinvent Int Ab Biological materials and uses thereof
US7441063B2 (en) 2005-12-14 2008-10-21 Aten International Co., Ltd. KVM system for controlling computers and method thereof
ATE527262T1 (de) 2006-01-25 2011-10-15 Sanofi Sa Neue tomaymycin derivate enhaltende zytotoxische mittel
NZ591252A (en) 2006-03-17 2012-06-29 Biogen Idec Inc Methods of designing antibody or antigen binding fragments thereof with substituted non-covarying amino acids
EP1864682A1 (en) 2006-06-09 2007-12-12 Sanofi-Aventis Leptomycin derivatives
US20080003652A1 (en) 2006-06-28 2008-01-03 Hans Iding Novel enzymatic process for the manufacture of Boc-Dap-Oh priority to related application(s)
JP5605895B2 (ja) 2006-07-04 2014-10-15 ゲンマブ エー／エス Ｃｏｐｄを処置するためのｃｄ２０結合分子
US7846434B2 (en) 2006-10-24 2010-12-07 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Materials and methods for improved immunoglycoproteins
PE20090321A1 (es) 2007-06-04 2009-04-20 Genentech Inc Anticuerpos anti-notch1 nrr, metodo de preparacion y composicion farmaceutica
BRPI0812562A2 (pt) * 2007-06-12 2019-09-24 Trubion Pharmaceuticals Inc composições terapêuticas anti-cd20 e métodos
ES2435779T3 (es) 2007-07-19 2013-12-23 Sanofi Agentes citotóxicos que comprenden nuevos derivados de tomaimicina y su uso terapéutico
GB0714602D0 (en) 2007-07-26 2007-09-05 Novathera Ltd Process
US20110243931A1 (en) * 2007-09-02 2011-10-06 Thomas Friess Combination therapy with type i and type ii anti-cd20 antibodies
JP5470817B2 (ja) 2008-03-10 2014-04-16 日産自動車株式会社 電池用電極およびこれを用いた電池、並びにその製造方法
KR20220035504A (ko) 2008-04-30 2022-03-22 이뮤노젠 아이엔씨 가교제 및 그 용도
US9175086B2 (en) * 2010-02-10 2015-11-03 Immunogen, Inc. CD20 antibodies and uses thereof
JP6136279B2 (ja) 2013-01-15 2017-05-31 株式会社ジェイテクト 転がり軸受装置
TWI503850B (zh) 2013-03-22 2015-10-11 Polytronics Technology Corp 過電流保護元件
TWI510996B (zh) 2013-10-03 2015-12-01 Acer Inc 控制觸控面板的方法以及使用該方法的可攜式電腦
US9816280B1 (en) 2016-11-02 2017-11-14 Matthew Reitnauer Portable floor
US11392902B2 (en) 2017-06-06 2022-07-19 United Parcel Service Of America, Inc. Systems, methods, apparatuses and computer program products for providing notification of items for pickup and delivery

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