CN1290864C - 一种抗cd20嵌合抗体 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗CD20嵌合抗体，包括人IgG1、К恒定区和鼠源可变区，轻链的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.1所示，重链的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。该嵌合抗体用于制备治疗B淋巴细胞癌的药物的应用。表达所述抗CD20嵌合抗体的CHO细胞株，其保藏号为CGMCC1400。本发明提供了一种全新的抗CD20的嵌合抗体，纯化后具有较好的与抗原结合能力和较强的杀伤作用；与鼠抗相比，嵌合抗体既保留了鼠源可变区的高亲和性，又具有人Fc段的多种免疫杀伤功能，从而大大降低了人抗鼠抗体反应的发生率，改善了临床治疗效果。与其它小分子基因工程抗体相比，嵌合抗体作为完整抗体分子，在体内半寿期更长，并具有人Fc段的多种免疫杀伤功能。

Description

一种抗CD20嵌合抗体

技术领域

本发明涉及一种抗CD20嵌合抗体、其编码基因及表达该抗体的CHO细胞株，属于医学生物工程领域。

背景技术

非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin′s lymphoma，NHL)是一组组织形态和生物学特性各异的淋巴系统恶性肿瘤，是最常见的血液系统恶性肿瘤，也是发病率增长最快的恶性肿瘤之一，我国每年约有3-4万人死于该病。按照预后分类，NHLs分为两组，惰性淋巴瘤(indolentlymphoma)和侵袭性淋巴瘤(aggressive lymphoma)。惰性淋巴瘤占NHLs的25％-40％，在组织学上多数是结节状或滤泡状的，预后较好，中位存活期可达10年，放、化疗对之有效，但临床多不能完全治愈。侵袭性淋巴瘤占NHLs的60％-75％，主要包括套细胞淋巴瘤、弥漫型大细胞性淋巴瘤等。自然病程较短，但采用大剂量化疗药物联用，30％-60％的患者可获痊愈。但是，化疗在杀灭肿瘤细胞的同时，也损伤人体正常细胞与组织，造成病人免疫力降低，生存质量恶化甚至生存期缩短。因此研制更加高效低毒的药物很有意义。

采用针对肿瘤细胞表面抗原的抗体治疗NHL，取得了显著的成绩，其中最有成效的是针对CD20抗原的抗体。CD20抗原属疏水跨膜蛋白，分子量大约35KD。CD20分子的作用尚未完全阐明，它有可能是一种钙通道，抗体和CD20结合以后，引起跨膜信号转导，导致多种后果，阻断细胞周期，阻止细胞分化成熟。

有报道采用抗CD20鼠源单抗治疗B细胞淋巴瘤，虽然采用了极大剂量持续静脉输注，但只是取得了暂时的疗效。产生这种现象的原因是因为鼠抗缺乏人抗体具有的免疫效应功能，如Fc上的补体受体介导的CDC、Fc段和Fc受体结合引起的吞噬作用。另外，鼠源抗体作为外源蛋白，反复刺激人体，可引起超敏反应，被称为人抗鼠抗体反应(HAMA)。因此很有可能鼠源抗体在与靶细胞结合前即被中和，进而被清除。然而，通过基因重组，采用人源恒定区取代鼠源恒定区，即嵌合抗体，即可将整个抗体分子的免疫原性降低95％，同时又具有了人抗体所有的CDC、ADCC、促进吞噬等生物学功能。

美国Genentech和IDEC公司开发的基因工程人鼠嵌合单克隆抗体anti-CD20 C2B8(化学名Rituximab，商品名美罗华)于1997年获得FDA批准上市，是第一个用于肿瘤治疗的治疗性抗体，包含人IgG1、κ恒定区和鼠源可变区。单独使用Rituximab^治疗复发以及难治的NHL有效率即达50％左右，若与化疗药物联用，则有效率可达90％-100％。同时，Rituximab不会带来诸如脱发、恶心、呕吐、血细胞减少等副作用，而只有轻微的发热、寒战等。由于其在非霍奇金淋巴瘤治疗中表现出的良好疗效和极低的毒副作用，已经成为美国销售额最大的抗肿瘤药物，2004年的年销售额几近30亿美元，位列全部生物技术药物第二。

美罗华取得的巨大成功激发了人们对于anti-CD20抗体的研究热情，业内人士通过对其结构进行改造来寻找人源化程度更高、治疗效果更优异的治疗性抗体。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人源化程度更高的抗CD20嵌合抗体。

本发明的第二个目的是提供该抗CD20嵌合抗体的编码基因序列。

本发明的第三个目的是提供高效表达该新型抗CD20嵌合抗体的CHO细胞株。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种抗CD20嵌合抗体，包括人IgG1、κ恒定区和鼠源可变区，轻链的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.1所示，重链的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。其中下划线部分为引导肽，位点创新的设计用方框表示。

该抗体与美罗华相比，差异在于：

1.轻链的第113位氨基酸为丝氨酸Ser(S)，美罗华为苏氨酸Thr(T)；第114位氨基酸为苯丙氨酸Phe(F)，美罗华为丝氨酸Ser(S)；第125位氨基酸为缬氨酸Vla(V)，美罗华为亮氨酸Leu(L)；

2.重链的第122位氨基酸为丝氨酸Ser(S)，美罗华为甘氨酸Gly(G)；第123位氨基酸为天冬酰胺Asn(N)，美罗华为甘氨酸Gly(G)；第124位氨基酸为丝氨酸Ser(S)，美罗华为天冬氨酸Asp(D)；第125位氨基酸为酪氨酸Tyr(Y)，此处增加一个氨基酸；第133位氨基酸为谷氨酰胺Gln(Q)，美罗华为丙氨酸Ala(A)；第141位氨基酸比美罗华缺失一个丙氨酸Ala(A)。

编码抗CD20嵌合抗体的基因序列，编码轻链的碱基序列如序列表SEQ ID No.3所示，编码重链的碱基序列如序列表SEQ ID No.4所示，其中下划线部分为引导肽。

发明人根据文献报道及计算机模拟设计轻、重链可变区序列，有目的地改变了其中某些影响蛋白质折叠的关键位点的编码碱基，用化学合成方法获得了编码重链可变区和轻链可变区的完整基因。轻链恒定区采用κ型，重链恒定区采用IgG1型，均来源于健康人B淋巴细胞。通过重叠延伸PCR，连接可变区与恒定区，得到完整抗体基因。将轻、重链基因分别用相应限制性内切酶切下，构建完成pIRES哺乳动物细胞双顺反子表达载体。

将构建完成的含有抗体基因的pIRES双顺反子表达载体转染至CHO-K1细胞中进行表达并挑取单克隆，以直接ELISA筛选出7株表达水平较高的阳性克隆。扩大培养阳性克隆，选择表达水平最高的一株进行保藏，保藏号为CGMCC1400，建议的分类名为抗CD20抗体CHO工程细胞株。以蛋白A亲和层析柱纯化得到目的蛋白，说明其含有人Fc段；紫外分光光度计测定纯化后蛋白浓度，根据纯化浓缩倍数，计算该细胞株表达水平约为2mg/L。该细胞株可用于制备治疗淋巴细胞瘤的药物的应用。

SDS-PAGE检测显示，纯化蛋白的相对分子量大小约为150KD，与标准抗体分子大小一致；纯度达到95％。以表达CD20抗原的Burkitt淋巴瘤细胞株Raji、Daudi、Ramous为抗原细胞，不表达CD20抗原的jurkat、PBMC、HL60细胞为阴性对照进行细胞ELISA检测研制抗体与CD20抗原特异性结合的能力，结果证明，该抗体能够与CD20抗原特异性结合。充分说明该抗体为抗CD20嵌合抗体。

采用竞争免疫荧光结合试验检测抗体与抗原的结合能力，结果证明抗体能够有效与Ritμximab竞争结合CD20抗原。将抗体与Ramous细胞混合反应，证明抗体能够在体外有效杀伤CD20⁺B淋巴瘤细胞，可用于制备治疗B淋巴细胞癌的药物。

本发明的有益效果在于：本发明提供了一种全新的抗CD20嵌合抗体，纯化后具有较好的与抗原结合能力和较强的杀伤作用；与鼠抗相比，嵌合抗体既保留了鼠源可变区的高亲和性，又具有人Fc段的多种免疫杀伤功能，从而大大降低了人抗鼠抗体反应的发生率，改善了临床治疗效果。与其它小分子基因工程抗体相比，嵌合抗体作为完整抗体分子，在体内半寿期更长，并具有人Fc段的多种免疫杀伤功能。与现有的anti-CD20嵌合抗体如Rituximab相比，本发明的抗体轻重链可变区采用人源的框架区4(Ftame region 4，FR4)替代鼠源的FR4，人源化程度从65％提高至70％，从而可进一步降低抗体分子的免疫原性。提高完整抗体分子的表达量必须同时提高轻链和重链的表达。本发明采用双表达载体表达抗体分子，使轻重链基因处于同一表达单元之中，从而有利于轻重链基因表达水平相当，且同一细胞同时表达轻重链，有利于完整抗体分子的正确折叠。CHO细胞是生物制药领域应用最广泛的哺乳动物细胞表达系统，大分子蛋白如抗体分子能够由CHO细胞分泌表达，并且可以正确折叠，无需复性。此外，由CHO表达的蛋白具有蛋白质翻译后的修饰作用，尤其是抗体分子，糖基化影响其生物活性，用大肠杆菌或酵母表达系统表达的蛋白无糖基化或糖基化结构与天然蛋白相差甚远，严重影响了蛋白质的生物学活性，而用CHO等哺乳动物细胞表达系统表达的蛋白，其结构和功能都与人体内产生的蛋白非常接近，在FDA2004年批准的生物技术药物中，90％左右的哺乳动物细胞表达的产品是由CHO细胞表达的。

下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明，凡是依照本发明公开内容所做出的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。

说明书附图

图1为重叠延伸PCR方法组装合成的轻、重链可变区寡核苷酸片断示意图

图2为连上轻、重链基因的pIRES双表达载体图。

图3为抗体基因片段验证图谱，1.轻链728bp；2.重链(不含Fc)734bp；3.重链可变区420bp；4.重链恒定区993bp；5.轻链恒定区324bp；6.轻链可变区384bp。

图4为表达anti-CD20嵌合抗体的细胞克隆图。

图5为ELISA挑选阳性克隆结果。

图6为SDS-PAGE检测蛋白图谱，其中1：还原型SDS-PAGE；2：标准蛋白1，蛋白标准自上向下为97.4，66.2，43，31，20，14.4kD；3：标准蛋白2，蛋白标准自上向下为22，17，11.6，76，53kD；4：非还原型SDS-PAGE。

图7a为蛋白浓度依次为0μg/ml引起的细胞凋亡荧光显微照片。

图7b为蛋白浓度依次为0.5μg/ml引起的细胞凋亡荧光显微照片。

图7c为蛋白浓度依次为5μg/ml引起的细胞凋亡荧光显微照片。

图7d为为蛋白浓度依次为50μg/ml引起的细胞凋亡荧光显微照片。

图7e为细胞凋亡死亡百分数图，显示随抗体浓度的增加而增加。

具体实施方式

以下实施例使用的载体、菌种、试剂及来源：pUC19质粒(TaKaRa)，pGEM-TEasy质粒(Promega)，pcDNA3.1(+)质粒(Invitrogen)，双表达载体pIRES(Clontech)；pIg质粒(R&D Systems)。DH5α感受态大肠杆菌(Doupson)；Taq酶、Pyrobest酶、DNA连接酶、T4多聚核苷酸激酶(T4PNK)、限制性内切酶Sac I、SacII、HindIII、Xba I均为TaKaRa产品，限制性内切酶BamH I、EcoR I、Nhe I、Not I为NEB公司产品；质粒提取、PCR产物回收、酶切产物回收分别采用Promega公司Wizard Plus SVMinipreps DNA purification System、Wizard PCR preps DNA purification system、Wizard DNAclean-up试剂盒；RNA提取试剂Trizol(Invitrogen)。

实施例1.抗体轻、重链可变区的合成

设计合成轻、重链可变区序列如下，该序列不仅在CDR3区与Rituximab不同，其FR4区采用人基因序列，因此人源化程度较Rituximab更高。异于Rituximab的部分用下划线标出。

轻链可变区编码序列：

ATGGATTTTCAGGTGCAGATTATCAGCTTCCTGCTAATCAGTGCTTCAGTCATAATGTCCAGAGGAC

AAATTGTTCTCTCCCAGTCTCCAGCAATCCTGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACAATGACTTG

CAGGGCCAGCTCAAGTGTAAGTTACATCCACTGGTTCCAGCAGAAGCCAGGATCCTCCCCCAAACC

CTGGATTTATGCCACATCCAACCTGGCTCTGGAGTCCCTGTTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGG

ACTTCTTACTCTCTCACCATCAGCAGAGTGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGT

GG AGTTTTAACCCACCCACGTTCGGAGGGGGGACCAAG GTGGAAATCAAA

重链可变区编码序列：

ATGGGTTGGAGCCTCATCTTGCTCTTCCTTGTCGCTGTTGCTACGCGTGTCCTGTCCCAGGTACAACT

GCAGCAGCCTGGGGCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGG

CTACACATTTACCAGTTACAATATGCACTGGGTAAAACAGACACCTGGTCGGGGCCTGGAATGGATTG

GAGCTATTTATCCCGGAAATGGTGATACTTCCTACAATCAGAAGTTCAAAGGCAAGGCCACATTGACT

GCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCT

ATTACTGTGCAAGATCGACTTACTAC AGTAACTCTTACTGGTACTTCAATGGTCTGGGGC CAAGGGAC

CACGGTCACCGTCTCT

因现有碱基合成水平只能精确合成80个碱基以下的基因序列，过长则误差较大，为便于化学合成，根据以下原则设计合成基因的寡核苷酸片段：相邻的两条寡核苷酸片段间约有20碱基互补，寡核苷酸片段长度一般长约75个碱基，尽量保证各互补寡核苷酸片段互补序列的的退火温度一致。用重叠延伸PCR方法组装合成的轻、重链可变区寡核苷酸片断。委托上海博亚公司合成。

表1：人工合成的轻链寡核苷酸片断的序列

VL1
	5-ATGGATTTTCAGGTGCAGATTATCAGCTTCCTGCTAATCAGTGCTTCAGTCATAATGTCCAGAGGACAAATTG-3VL25-CTTCTCCCCTGGAGATGCAGACAGGATTGCTGGAGACTGGGAGAGAACAATTTGTCCTCTGGACATTATG-3VL35-CTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACMTGACTGCAGGGCCAGCTGAAGTGTAAGTTACATCCACTGG-3

VL45-GGCATAAATCCAGGGTTTGGGGGAGGATCCTGGCTTCTGCTGGAACCAGTGGATGTAACTTACACTTC-3VL55-CCCAAACCCTGGATTTATGCCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTGTTCGCTTCAGTGG-3VL65-CCACTCTGCTGATGGTGAGAGAGTAAGAAGTCCCAGACCCACTGCCACTGAAGCGAACAGGGAC-3VL75-CTCTCACCATCAGCAGAGTGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGACTAGTAACC-3VL85-TTTGATTTCCACCTTGGTCCCCCCTCCGAACGTGGGTGGGTTAAAACTCCACTGCTGGC-3

表2：人工合成的重链寡核苷酸片断的序列

VH1

5-ATGGGTTGGAGCCTCATCTTGCTCTTCCTTGTCGCTGTTGCTACGCGTGTCCTGTCCCAGGTACAACTGCAG-3VH25-CTTGCAGGACATCTTCACTGAGGCCCCAGGCTTCACCAGCTCAGCCCCAGGCTGCTGCAGTTGTACCTGGGACAGG-3VH35-CTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACATTTACCAGTTACAATATGCACTGGGTAAAACAGAC-3VH45-GTATCACCATTTCCGGGATAAATAGCTCCAATCCATTCCAGGCCCCGACCAGGTGTCTGTTTTACCCAGTGCATATTG-3VH55-CTATTTATCCCGGAAATGGTGATACTTCCTACAATCAGAAGTTCAAAGGCAAGGCCACATTGACTGCAGACAAATCC-3VH65-GACCGCAGAGTCCTCAGATGTCAGGCTGCTGAGCTGCATGTAGGCTGTGCTGGAGGATTTGTCTGCAGTCAATGTGG-3VH75-GACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGATCGACTTACTACAGTAACTCTTACTGG-3VH85-AGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCCAGACATTGAAGTACCAGTAAGAGTTACTGTAGTAAGTC-3

总体顺序：

1)将片段1(VL1或VH1、下同)和2，3和4，5和6，7和8分别混合，进行重叠延伸PCR，得到1-2，3-4，5-6，7-8。

PCR反应体系：dNTP 8μl；pyrobest酶0.5μl；10×Bμffer 10μl；DNA片段2×20μl；水41.5μl，共100μl。

循环参数：94℃ 2min→(94℃ 30s→60℃ 30s→72℃ 30s)×20→72℃ 5min

2)将1-2和34，5-6和7-8分别混合进行重叠延伸PCR，得到1-4和5-8。

取反应1)相应产物各40μl补加0.5μl pyrobest酶，20μl水，循环参数不变。

3)混合1-4和5-8，重叠延伸PCR得到基因全长。

取反应2)相应产物各40μl补加0.5μl pyrobest酶，20μl水，循环参数不变。

4)得到可变区基因全序列，见图1；用各自上下游引物(重链引物为PHU、PHD轻链引物为PLU、PLD)对组装的基因进行扩增。

反应体系：dNTP 8μl；pyrobest 0.5μl；10×buffer 10μl；VL(VH)10μl；5’引物2μl；3’引物2μl；水67.5ul，共100μl。

循环参数：94℃ 2min→(94℃ 30s→60℃ 30s→72℃ 60s)×30→72℃ 5min→4℃

扩增引物序列：PLU：5-ATATCTAGAATGGATTTTCAGGTGCAGATTATC-3

              PLD：5-ATAAAGCTTTTTGATTTCCAGCTTGGTCCCC-3

              PHU：5-ATATCTAGAATGGGTTGG AGCCTCATCTTGC-3

              PHD：5-ATAAAGCTTAGAGACGGTGACCGTCCCTTG-3

实施例2.轻、重链恒定区基因的调取及可变区、恒定区基因的连接

根据在GENEBANK检索得到的抗体κ和IgG1型基因序列，设计调取的引物L上、L下、H上、H下。按常规方法分离健康人淋巴细胞，提取RNA，通过RT-PCR扩增得到轻、重链恒定区序列。上述序列均测序正确后，通过重叠延伸PCR，连接可变区与恒定区，得到完整抗体基因。

调取引物：L上：5’-TTCGGAGGGGGGACCAAGGTG-3’

          L下：5’-TCAACACTCTCCCCTGTTGAAG-3’

          H上：5’GGCCAAGGGACCACGGTCAC-3’

          H下：5’-TCATTTAGCCGGAGACAGGGAG-3’

RT-PCR反应体系：2×reaction mix 25μl；RNA 1μl；5’引物2μl；3’引物1μl；RT/Taq酶1μl；Mg²⁺(50mM)1.8μl；加水至50μl。

循环参数：50℃ 30min→94℃ 2min→(94℃ 30s→55℃ 30s→72℃ 60s)×40→72℃5min→4℃

实施例3.连接基因至克隆载体

1)双酶切轻、重链可变区及PUC19载体，反应体系：HindIII Xba I各2μl；10×Buffer5μl；0.1％BSA 5μl；DNA 5μl；水加至50μl。37℃水浴2h。

按试剂盒说明书操作，采用Promega Wizard DNA clean-μp试剂盒回收酶切产物。

2)连接可变区基因与pUC19载体：T4 ligase 1μl；10×Bμffer 2.5μl；基因5μl；pUC19 2μl；水加至25μl。16℃水浴，过夜。

3)连接恒定区基因与pGEM-T Easy载体：2×Rapid ligation Buffer 5μl；T Easy vector1μl；基因片段3μl；T4DNA ligase 1μl；4℃过夜。

4)转化：将连接产物转化至大肠杆菌，进行蓝白斑筛选，鉴定重组体。

实施例4.质粒提取与测序

采用Promega公司Wizard Plus SV Minipreps DNA purification System试剂盒提取质粒，将选出的质粒送交上海博亚公司测序。

测序结果证明，最终得到完全正确的基因片段。所调取抗体恒定区重链为IgGl型，轻链为κ型，见图3。

实施例5.连接完整轻、重链基因至pcDNA3.1载体

1)双酶切轻、重链及pcDNA3.1载体：轻链用Nhe I和EcoR I双酶切，重链用Xba I和BamH I双酶切。

反应体系：酶各2μl；10×Buffer 2 10μl；10×BSA 10μl；DNA 15μl；加水至100μl，37℃水浴2h。

2)回收酶切产物，采用Promega Wizard DNA clean-up试剂盒，按试剂盒操作进行。

3)连接目的基因与载体：T4 ligase 1μl；10×Buffer 2.5μl；基因6μl；pcDNA3.12μl；加水至25μl；16℃水浴，过夜。

4)将连接产物转化至大肠杆菌。从各菌板上挑取2个克隆，置10mlLB培养基中，至37℃C200r/min摇床扩大培养，次日提取质粒。

5)酶切鉴定质粒中是否含有目的基因：轻链用Sac I单酶切验证；重链用Xba I和BamHI双酶切验证。选出切下目的条带的质粒送交博亚公司测序。

实施例6.构建表达载体

测序正确后，将轻、重链以及含有内含子的Fc段基因(取自商业化pIg质粒)连接至双顺反子表达载体pIRES：先将轻链基因用Nhe I、EcoR I从pcDNA3.1载体切下，同时双酶切pIRES载体，然后连接基因与载体；之后将重链用Xba I和BamH I从pcDNA3.1载体切下，将Fc段用BamH I和Not I从pcDNA3.1载体切下，用Xba I和Not I双酶切pIRES载体，然后连接三片段，即构建完成表达载体。抗体的轻重链基因共用同一个启动子，通过IRES序列连接，见图2。

实施例7.转染CHO细胞及筛选阳性克隆

细胞系及培养条件：CHO-K1细胞为本室保存，培养条件为DMEM/F12培养基(GIBCO)，含5％加强型小牛血清(Hyclone)，培养于5％CO₂、37℃温箱。Raji、Daudi、Ramous、Jurkat细胞均购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心，HL60购自中国药品生物制品检定所，PBMC由健康人血液分离，培养条件均为RPMI1640培养基(GIBCO)，含5％胎牛血清(Hyclone)，培养于5％CO₂、37℃温箱。

转染采用Invitrogen公司生产的Lipofectamine^TM2000阳离子脂质体转染试剂盒，按照试剂盒说明书操作。对照采用空pIRES载体及鲑精DNA转染CHO细胞。采用G418(SIGMA)500μg/ml加压筛选，加压约10天后，挑出单克隆孔，以直接竞争ELISA挑选阳性克隆，用无血清培养上清直接包被NUNC^TM酶联板4℃过夜，3％BSA封闭后加入HRP标记山羊抗人IgG(H+L)，孵育后加入TMB试剂显色，450nm测OD值。以无血清RPMI1640培养基为阴性对照。

以直接竞争ELISA挑选阳性克隆，共筛选72孔单克隆，其中有20余株有表达，1B3、1B4、1D3、2A2、2D4、3A2、4F10等7株表达水平较高。细胞单克隆形态见图4。因各单克隆生长速度不同，因此只能分批进行筛选。图5是第一批ELISA筛选阳性克隆照片，阳性克隆率约25％。选用羊抗人IgG(H+L)作为二抗，检测无血清培养上清呈阳性结果，说明我们研制的抗体中含有人轻重链恒定区，是人源化的基因工程抗体。

选择表达水平最高的基因重组CHO工程细胞系anti-CD20-1B4进行保藏，保藏号为CGMCC1400，细胞呈梭形，贴壁生长。

实施例8.单克隆的扩大培养及蛋白收获

选择表达水平最高的基因重组CHO工程细胞系anti-CD20-1B4于1000ml转瓶中用含2％小牛血清的DMEM/F12培养基培养，待细胞长满瓶壁时，换为无血清培养基，隔天收液，可连续收液3-5次。

利用蛋白A对IgG的特异性吸附作用，采用nProtein A Sepharose 4 Fast Flow分离介质(Amersham Biosciences)进行亲和层析，纯化表达蛋白。操作方法参见产品说明。纯化后，以紫外分光光度计测定A₂₆₀和A₂₈₀值，按1.45A₂₈₀-0.74A₂₆₀推算蛋白浓度。以SDS-PAGE测定蛋白的纯度、分子量。

将3次收获上清约1.5L纯化后，得到蛋白溶液约25ml。根据紫外检测法测得蛋白浓度推算该单克隆表达水平约为2mg/L。由于能够与Protein A亲和柱结合，可以进一步判定该蛋白为抗体类物质。

图6为在非还原和还原条件下的SDS-PAGE结果，非还原条件下蛋白质的分子量约150kD，和人体内的IgGl的分子量一致。在还原条件下，有两条电泳带，分子量分别为23kD和51kD，与设计轻重链分子量吻合。表明我们得到的蛋白质是IgG1型的完整抗体分子。

实施例9.细胞ELISA检测产物的特异性

以CD20⁺细胞Raji、Daudi、Ramous(均为Burkitt淋巴瘤细胞)检测表达抗体对CD20的结合能力；以T淋巴瘤细胞株Jurkat、人白血病细胞株HL60以及PBMC检测表达抗体与CD20-细胞的结合情况，均以Protein A洗脱缓冲液Gly-HCl为阴性对照。操作时以细胞直接包被NUNC^TM酶联板(经多聚赖氨酸处理)，待细胞附于底部后，以戊二醛固定，3％BSA封闭后加入表达抗体，孵育后充分洗涤，再加入HRP标记山羊抗人IgG(H+L)，孵育后加入TMB试剂显色，450nm测OD值。

ELISA检测结果见表3。以Raji、Daudi、Ramous三种细胞为抗原，其各检测孔与阴性对照孔相比，OD450值均有明显差别，说明，该抗体可与CD20⁺细胞发生结合。检测表达抗体与CD20-细胞结合情况的实验表明该抗体与Jurkat基本不结合、与HL60以及PBMC部分结合(资料未显示)，与文献报道相符。说明该抗体能够与CD20抗原发生特异性结合。

             表3各检测孔吸光度

	1#	2#	control
				RajiDaudiRamous	1.0171.4970.688	0.7811.3790.813	0.1340.8880.078

实施例10.检测产物对CD20⁺细胞的杀伤作用

根据文献报道，抗体与CD20结合以后，能够引起细胞凋亡，从而达到消除肿瘤细胞的作用，因此，我们将该抗体直接加入CD20⁺细胞Ramous的培养体系中，观测抗体的杀伤细胞作用。在96孔板中培养细胞，保持各孔细胞数目相等，将抗体稀释至0.5、5、50μg/ml三个浓度加入至相应细胞孔，37℃作用24h后，以Annexin V、PI双染(Annexin V使凋亡细胞绿染；PI使死亡细胞红染)，荧光显微镜下观测染色情况。

如图7所示，实验结果发现，在抗体浓度为0、0.5、5、50μg/ml的条件下，引发了不同程度的细胞凋亡与死亡，并且随着抗体浓度的增加，杀伤效应也随之增强。

                           序列表

<110>中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所

<120>一种抗CD20嵌合抗体、其编码基因及表达该抗体的CHO细胞株

<130>

<160>4

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>235

<212>PRT

<213>人工合成

<400>1

Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Ile Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser

1                 5                         10                    15

Val Ile Met Ser Arg Gly Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile

                20                      25                     30

Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser

         35                      40                      45

Ser Ser Val Ser Tyr Ile His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser

     50                       55                     60

Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

65                       70                      75                80

Val Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile

                   85                      90                   95

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp

               100                    105                     110

Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys

Glu Ile Lys

            115                     120                       125

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

    130                     135                      140

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

145                     150                    155               160

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

                   165                     170                  175

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

               180                     185                   190

thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

         195                     200                     205

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

    210                     215                     220

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225                     230                     235

<210>2

<211>470

<212>PRT

<213>人工合成

<400>2

Met Gly Trp Ser Leu Ile Leu Leu Phe Leu Val Ala Val Ala Thr Arg

1                  5                       10                  15

Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys

               20                    25                      30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

         35                      40                      45

Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leμ

     50                     55                      60

Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn

65                       70                      75               80

Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser

                  85                      90                    95

Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser GLu Asp Ser Ala Val

             100                     105                     110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr

Trp Tyr Phe

          115                    120                          125

Asn Val Trp Gly Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Thr Lys

    130                    135                           140

Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly

145                     150                     155                160

Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro

                  165                     170                    175

Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr

              180                     185                      190

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val

         195                     200                      205

Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn

     210                     215                      220

Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Ala Glu Pro

225                     230                     235                240

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

                  245                     250                   255

Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

             260                     265                     270

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

        275                      280                      285

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

    290                     295                      300

Val GlμVal His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arh Glu Glu Gln Tyr Asn

305                     310                     315              320

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

                   325                      330                335

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro

             340                     345                     350

Ala Pro Ile Glu Lye Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

          355                     360                     365

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn

    370                      375                    380

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

385                     390                     395               400

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

                    405                   410                  415

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

              420                    425                     430

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

         435                     440                    445

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Ash His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

    450                     455                     460

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

465                    470

<210>3

<211>708

<212>DNA

<213>人工合成

<400>3

atggattttc aggtgcatat tatcagcttc cttctaatca gtgcttcagt cataatgtcc    60

agaggacaaa ttgttctctc ccagtctcca gcaatcctgt ctgcatctcc aggggagaag    120

gtcacaatga cttgcagggc cagctcaagt gtaagttaca tccactggtt ccagcagaag    180

ccaggatcct cccccaaacc ctggatttat gccacatcca acctggcttc tggagtccct    240

gttcgcttca gtggcagtgg gtctgggact tcttactctc tcaccatcag cagagtggag    300

gctgaagatg ctgccactta ttactgccag cagtggagtt ttaacccacc cacgttcgga    360

ggggggacca aggtggaaat caaacgtacg gtggctgcac catctgtctt catcttcccg    420

ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc    480

tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc    540

caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg    600

acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag    660

ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgttga                 708

<210>4

<211>1413

<212>DNA

<213>人工合成

<400>4

atgggttgga gcctcatctt gctcttcctt gtcgctgttg ctacgcgtgt cctgtcccag    60

gtacaactgc agcagcctgg ggctgagctg gtgaagcctg gggcctcagt gaagatgtcc    120

tgcaaggctt ctggctacac atttaccagt tacaatatgc actgggtaaa acagacacct    180

ggtcggggcc tggaatggat tggagctatt tatcccggaa atggtgatac ttcctacaat    240

cagaagttca aaggcaaggc cacattgact gcagacaaat cctccagcac agcctacatg    300

cagctcagca gcctgacatc tgaggactct gcggtctatt actgtgcaag atcgacttac  360

tacagtaact cttactggta cttcaatgtc tggggccaag ggaccacggt caccgtctct  420

gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg  480

ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg  540

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca  600

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc  660

tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agcagagccc  720

aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga  780

ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct  840

gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg  900

tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac  960

agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag  1020

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaa gccctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc  1080

aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag  1140

ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc  1200

gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg    1260

ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg    1320

cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atcattagg  ctctgcacaa ccactacacg    1380

cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga                                 1413

Claims (5)

1.一种抗CD20嵌合抗体，包括重链的人IgG1型恒定区、轻链的K型恒定区和鼠源可变区，轻链的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.1所示，重链的氨基酸序列如序列表SEQ IDNo.2所示。

2.权利要求1所述的嵌合抗体用于制备治疗B淋巴细胞癌的药物的应用。

3.编码权利要求1所述的CD20嵌合抗体的基因序列，编码轻链的碱基序列如序列表SEQ ID No.3所示，编码重链的碱基序列如序列表SEQ ID No.4所示。

4.表达权利要求1所述抗CD20嵌合抗体的CHO细胞株，其保藏号为CGMCC1400。

5.权利要求4所述的CHO细胞株用于制备治疗B淋巴细胞癌的药物的应用。

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