CN1703243A - 针对erb－b1受体的药物组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及药物组合物，其包含不同的分子，优选单克隆抗体，其中各分子分别包含可以与相同ErbB1受体结构域中不同位点同时结合的表位。根据本发明优选的抗体是各自为鼠、嵌合或人源化形式的MAb 425和MAb 225。本发明涉及所述组合物在改善治疗，优选肿瘤治疗中的用途和方法。

Description

针对ERB-B1受体的药物组合物
发明领域
本发明涉及药物组合物，其包含不同分子，优选单克隆抗体，所述分子各包含可以同时与相同ErbB受体结构域，特别是ErbB1受体结构域中不同表位结合的位点。根据本发明优选的抗体是各自为鼠、嵌合或人源化形式的MAb 425和MAb 225。本发明涉及所述组合物在改善治疗，优选肿瘤治疗中的用途和方法。
发明背景
在超过20年的时间里，已知针对肿瘤细胞表面上的多种受体和其它抗原的生物分子，诸如单克隆抗体(MAb)或其它蛋白质/多肽，以及小化学化合物适用于肿瘤治疗。关于抗体方法，这些MAb大多数是被嵌合化的或人源化的以改善人类免疫系统的耐受性。MAb或上述化学体与其在肿瘤细胞上和大多数情况下也存在于正常组织上的靶结构特异性结合，并可导致依赖于其表位特异性和/或特定抗原的功能特性的不同效应。针对孤儿受体(orphan receptor)或其它无功能的细胞表面分子的MAb以及针对功能活性受体(例如具有激酶活性的生长因子受体)的配体-结合位点外部结构的MAb被预期可诱导主要针对靶细胞的免疫效应子作用(抗体依赖细胞介导的细胞毒性(ADCC)，补体依赖细胞毒性(CDC))。此外，根据抗原和Mab的特性，抗体的结合可导致受体的交联。由此引起的受体-抗体复合物内在化可导致细胞表面上受体密度的长时期下调。
与配体-结合位点内的或其直接邻域中的表位结合的MAb或小化学化合物竞争天然配体与其受体的结合，由此降低或完全抑制配体结合，并可置换已与其受体结合的配体。该受体的阻断抑制了配体依赖性受体活化和下游信号传导。例如，ErbB受体，诸如表皮生长因子受体(EGFR)被单克隆抗体阻断会导致多种细胞效应，包括抑制DNA合成和增殖，诱导细胞周期停滞和凋亡以及抗转移和抗血管生成作用。
在二十世纪八十年代，ErbB受体是癌症所涉及的典型受体酪氨酸激酶。酪氨酸激酶是一类酶，其催化腺苷三磷酸的末端磷酸向蛋白质底物中的酪氨酸残基转移。据信酪氨酸激酶通过底物磷酸化在许多细胞功能的信号传导中起关键作用。虽然信号传导的确切机理仍不清楚，但是酪氨酸激酶在细胞增殖，癌发生和细胞分化中显示出是重要的起作用因子。
酪氨酸激酶可分为受体型和非受体型。受体型和非受体型两种酪氨酸激酶都参与细胞信号途径，这些途径可导致许多病理状况，包括癌症，牛皮癣和超免疫反应。许多酪氨酸激酶参与细胞生长及血管生成。
非受体型酪氨酸激酶也由许多亚家族组成，包括Src，Frk，Btk，Csk，Abl，Zap70，Fes/Fps，Fak，Jak，Ack和LIMK。这些亚家族的每一个还可再分成不同的受体。例如，Src亚家族是最大的亚家族之一，其包括Src，Yes，Fyn，Lyn，Lck，Blk，Hck，Fgr和Yrk。Src亚家族中的酶与肿瘤形成有关。对非受体型酪氨酸激酶的更详细的讨论，参见BolenOncogene，8：2025-2031(1993)。
受体型酪氨酸激酶具有细胞外，跨膜和细胞内部分，而非受体型酪氨酸激酶完全是细胞内的。受体连接的酪氨酸激酶是跨膜蛋白，其包含细胞外配体结合域，跨膜序列，以及胞质酪氨酸激酶域。受体型酪氨酸激酶由大量具有不同生物活性的跨膜受体组成。
已经鉴定出了不同亚家族的受体型酪氨酸激酶。涉及的酪氨酸激酶包括成纤维细胞生长因子(FGF)受体，ErbB主要家族类型中的表皮生长因子(EGF)受体和血小板衍生生长因子(PDGF)受体。还涉及神经生长因子(NGF)受体，脑衍生的神经营养因子(BDNF)受体，以及神经营养蛋白-3(NT-3)受体和神经营养蛋白-4(NT-4)受体。
一个受体型酪氨酸激酶亚家族，被命名为HER或ErbB亚家族，由EGFR(ErbB1)，HER2(ErbB2或p185neu)，HER3(ErbB3)和HER4(ErbB4)组成。此受体亚家族的配体包括表皮生长因子(EGF)，TGF-a，双调蛋白(amphiregulin)，HB-EGF，β-细胞调节素(betacellulin)、heregulin及神经调节蛋白。PDGF亚家族包括由激酶插入域受体(KDR)组成的FLK家族。
EGFR，由ErbB1基因编码，其与人类恶性肿瘤因果相关。特别是，在乳腺，膀胱，肺，头，颈和胃部癌症以及成胶质细胞瘤中已经观察到EGFR的表达增强。EGFR受体表达的增强常常伴随有同一肿瘤细胞中EGFR配体，即转化生长因子α(TGF-α)的产生增加，从而经自分泌刺激途径引起受体激活(Baselga and Mendelsohn，Pharmac.Ther.64：127-154(1994))。
EGF是一种分子量为170,000的跨膜糖蛋白，并发现其存在于许多上皮细胞类型上。其可以被至少三种配体--EGF，TGF-α(转化生长因子α)和双调蛋白激活。经证明表皮生长因子(EGF)和转化生长因子α(TGF-α)都能与EGF受体结合进而引起细胞增殖和肿瘤生长。这些生长因子不能与HER2结合(Ulrich and Schlesinger，1990，Cell 61，203)。与借助自身二聚化性质诱导受体二聚化的几个生长因子家族(如PDGF)不同，单体生长因子如EGF具有2个受体结合位点，因此，其原则上可以交联两个邻近的EGF受体(Lemmon等，1997，EMBO J.16，281)。
近期研究(J.Schlessinger，2002，Cell 110，669)显示出受体二聚化由受体-受体相互作用介导，其中从邻近受体突出的环介导受体二聚化和活化。
受体二聚化对激活生长因子受体的内在催化活性以及对生长因子受体在酪氨酸残基上的自磷酸化是必需的。后者可作为多种衔接蛋白质或酶的停泊位点，这些蛋白质或酶可同时启动许多信号级联。在高等真核细胞中，简单的线性通路演化为充分交互作用的多层网络，其中组分的组合表达和活化使得可以在发育的自始至终形成背景特异性的生物反应。ErbB网络不仅能整合其自身的输入信号，还能整合异源信号，包括激素，淋巴因子，神经递质和应激诱导物。
应当指出的是受体蛋白酪氨酸激酶(PTK)既能进行同二聚化，也能进行异二聚化，其中同二聚体受体组合的促有丝分裂和转化作用(不启动或弱启动信号发生)低于相应的异二聚体组合。包含ErbB2的异二聚体是最有效的复合物(参见如下综述：Yarden and Sliwkowski，2001，NatureReviews，Molecular cell Biology，volume 2，127-137；Tzahar and Yarden，1998，BBA 1377，M25-M37)。
已经证明抗EGF受体的抗体在阻断EGF和TGF-α与受体结合的时候，显示出对肿瘤细胞增殖的抑制作用。考虑到这些发现，已经研制出很多小鼠和大鼠单克隆抗EGF受体抗体，并在体内和体外检测了它们对肿瘤细胞生长进行抑制的能力(Modjtahedi and Dean，1994，J.Oncology 4，277)。人源化单克隆抗体425(hMAb 425，US 5,558,864；EP 0531 472)和嵌合型单克隆抗体225(cMAb 225)都是针对EGF受体的，而且在临床试验中均显示有效。已经证明C225抗体(Cetuximab)可在体外抑制由EGF介导的肿瘤细胞生长，以及在裸鼠体内抑制人肿瘤的形成。而且，最重要的是，该抗体以及一般地所有抗EGFR抗体在异种移植小鼠模型中还显示出可与某些化疗剂(即阿霉素(doxorubicin，adriamycin)，紫杉醇和顺铂)协同作用体内根除人肿瘤(见例如，EP0667165)。Ye等(1999，Oncogene 18，731)报道通过联合应用嵌合MAb225和针对HER2受体的人源化MAb 4D5可以对人卵巢癌细胞进行成功地治疗。
ErbB家族的第二个成员-HER2(ErbB2或p185neu)，其最初被鉴定为来自经化学处理的大鼠的成神经细胞瘤的转化基因产物。neu原癌基因的激活形式由该编码蛋白的跨膜区中的点突变(缬氨酸变成谷氨酸)引起。可在乳腺和卵巢癌症中观察到neu人同系物的扩增，其与预后不良有关(Slamon等，Science，235：177-182(1987)；Slamon等，Science，244：707-712(1989)；US4,968,603)。ErbB2(HER2)的分子量为大约185,000，虽然至今对HER2的特异性配体尚未明确确定，但ErbB2(HER2)与EGF受体(HER1)有相当高的同源性。
进一步发现针对HER2受体的抗体4D5使过表达ErbB2的乳腺肿瘤细胞系对TNFα的细胞毒性效应敏感(US 5,677,171)。鼠抗-ErbB2抗体4D5的人源化重组体(huMAb4D5-8，rhuMAb HER2或HERCEPTIN；US 5,821,337)在已接受过大量抗癌前期治疗的患有ErbB2-过表达转移性乳腺癌的患者中具有临床活性(Baselga等，J.Clin.Oncol.14：737-744(1996))。HERCEPTIN在1988年被正式批准上市用于治疗患有转移性乳腺癌(其肿瘤过表达ErbB2蛋白)的患者。
除抗ErbB抗体外，还已知多种小化学分子为ErbB受体分子的有效抑制剂，其能阻断天然配体的结合位点(参见详细的描述)，或阻断受体激酶的结合位点的酪氨酸残基，由此阻止磷酸化和进一步的级联信号传导。
在临床试验中显示出高效能的一个代表物是IressaTM(ZD-1839)，其可以被用于NSCLC适应症(非小细胞肺癌)。
虽然已有一些处于开发中和已经上市用于治疗肿瘤的有希望的药物和方法，但仍需要具有改进的特性和增高的功效的其它药剂和药物组合物和组合。
发明概述
本发明基于本发明人的如下发现：某些受体酪氨酸激酶诸如ErbB受体抗体分子，优选ErbB1受体(EGFR)抗体分子(其在患病细胞例如肿瘤细胞表面上过表达)在天然配体结合域内具有特异性表位位点，不同抗体分子可与这些位点同时结合，而不会出现或仅存在可忽略的相互阻碍。显然，这些抗体分子具有在三维构型方面与受体分子的结合域的完整大小相比相对较小的结合表位。这些抗体分子可诱导对信号通路活性的增加调节，优选增加对ErbB受体的阻断，并由此增加对整个信号级联的阻断。本发明首次描述了该肿瘤治疗的新概念，即对个体施用可以阻断或抑制ErbB受体，优选EGF受体(EGFR)(ErbB1)的一种或多种生物学上和治疗上有效的药剂，通过所述药剂与至少第一和第二不同表位(优选位于相同受体的天然配体域内)结合来实施治疗。可以发现，例如，两种或多种，优选两种，不同受体-拮抗性分子可同时与相同受体结构域(优选相同受体分子的)结合，而不会出现相互阻碍或竞争，由此使得较高密度的拮抗剂可与受体结合并导致(通过降低的与天然(激动性)配体诸如EGF或TGFa结合的能力)对单体或二聚体单位形式的相应受体分子的信号级联产生更强的抑制作用。这应导致对肿瘤生长更强的抑制和/或导致实体瘤或肿瘤转移的凋亡增加。所述分子可以是小化学和合成化合物或蛋白质、多肽或肽、免疫球蛋白，诸如抗体或其片段、或免疫缀合物。
优选分子是抗-ErbB抗体，尤其是如上面和下面描述的抗-EGFR和抗-Her2抗体，及其片段，优选F(ab′)2。在本发明的优选实施方案中，对个体施用两种不同的抗EGFR抗体，优选人源化、嵌合或鼠型MAb 425或其片段，诸如F(ab′)2，和人源化、嵌合或鼠型MAb 225或其片段，诸如F(ab′)2。最优选的是人源化MAb 425和嵌合MAb 225以完整抗体或F(ab′)2片段形式联合施用。
但是也可以使用衍生自所述抗体结构的相对短的合成(多)肽，所述肽包含相应抗体的一、二或三个CDR的氨基酸序列，其中，任选地，为了增加对受体的亲和性和/或亲合力，可通过(优选)置换对抗原结合位点内或与其紧邻的某些氨基酸(1-5个氨基酸)进行修饰。以与相应抗体相当的方式和受体结合的这种合成肽具有制备简单且较价廉的优势。还可以合成单一肽，其包含源于第一分子以及第二分子的CDR的氨基酸序列，例如包含来源于MAb 425的1-3个CDR和MAb 225的1-3个CDR的氨基酸序列的(多)肽。
已发现，与仅包含所述结合位点之一的单一分子相比，根据本发明的药物组合物能够增强不同或相同ErbB受体的交联/二聚化，增强对ErbB受体的阻断/抑制，增强对ErbB受体-特异性信号通路调节的诱导。换言之：例如，MAb 425和MAb 225的混合物与将MAb 425或225作为单独药剂以相同浓度进行施用相比，前者能引发增强的对EGFR的抑制和下调。
虽然上述发现是仅对将ErbB受体作为靶受体分子而做出的，应当指出的是由本发明人所揭示的如上述和下述的科学原则也适用于ErbB之外的其它生物受体。
任选地，本发明的组合物还包含可以支持和增强上述分子的功效的其它治疗活性化合物。
所述药剂可以是细胞毒性剂，优选是拮抗性分子，诸如酪氨酸激酶拮抗剂、其它ErbB拮抗剂、生长激素受体拮抗剂、蛋白激酶拮抗剂、抗血管生成剂、或细胞因子。下面将更详细地具体描述可用于本发明的此类分子。
本发明所述的治疗活性剂也可以以包含如下包装的药物试剂盒的形式提供，此包装中包含置于各单独容器内的或在单一容器内的一种或多种所述拮抗剂。利用该联合的治疗方法可以任选地包括放射性治疗。大抵上，此药物施用可与放射治疗伴随进行，其中放射治疗可与药物施用基本上同时或在之前或在之后进行。根据本发明的联合疗法中的不同药剂的施用也可以基本上同时进行或相继进行。细胞表面上有参与肿瘤血管形成的受体的肿瘤可用本发明联合疗法成功地治疗。
已知肿瘤的发育和生长有多条可替换的路线。如果一条路线被阻断，则它们常能通过表达和使用其他受体和信号途径而转换到另一条路线上。因此，由于本发明的药物联合可以阻断几种这样的可能肿瘤发育策略，因而具有多种优点。本发明的联合可用于治疗和预防那些通过激活存在于肿瘤细胞表面上的相关激素受体而发育和生长的肿瘤、肿瘤样疾病和瘤形成性疾病以及肿瘤转移。
本发明联合中的不同药剂优选以低剂量联合应用，即，低于临床条件下常规使用的剂量。在给个体施用本发明的化合物、组合物、药剂和治疗的时候，降低剂量的优点包括降低了高剂量相关副反应的发生率。例如，通过降低如上文和下文所述药剂的剂量，与高剂量条件下观察到的效果相比，恶心和呕吐的频率和严重程度都得到降低。预期降低副反应发生率将能改善癌症患者的生活质量。降低副反应发生率的优点还包括改善患者的依顺性，降低因治疗副反应产生的需要住院的次数，减少在医治副反应带来的疼痛时所需止痛剂的使用。另外，本发明的方法和联合还能使较高剂量时的治疗效果最大化。
根据本发明的组合显示出令人惊异的协同作用。临床研究显示使用该药物联合可使肿瘤出现真实的缩小和解体，同时没有检测到明显的药物不良反应。
具体地，本发明涉及：
.药物组合物，其包含能够与ErbB受体分子的结合域中不同表位结合的一种或多种生物学上和/或治疗上有效的抗体分子(或其片段)，其中所述一种或多种抗体分子包含至少一个与所述受体结合域的第一特异性表位结合的结合位点及至少另一个与相同ErbB受体结合域的第二特异性表位结合的结合位点。
.相应的药物组合物，其包含两种或多种抗体分子，其中一种抗体分子至少包含与所述受体域的第一特异性表位结合的结合位点，而至少另一种抗体分子至少包含与相同受体结合域的第二特异性表位结合的另一结合位点。
.相应的药物组合物，其中至少一种所述抗体分子与受体的天然配体所结合的受体结合域内的表位相结合。
.相应的药物组合物，其与仅包含所述结合位点之一的单一分子相比，能增强对ErbB受体的阻断和/或抑制，并增强对ErbB受体-特异性信号通路调节的诱导。
.相应的药物组合物，其能增强对具有相同或不同特异性的不同受体分子的交联和/或二聚化的诱导。
.相应的药物组合物，其中所述ErbB受体是EGF受体(EGFR)。
.相应的药物组合物，其包含各自针对EGF受体的不同表位的第一和第二单克隆抗体或其生物活性片段。
.相应的药物组合物，其中第一抗体是鼠的、嵌合的或人源化的MAb425。
.相应的药物组合物，其中第二抗体是鼠的、嵌合的或人源化的MAb225。
.相应的药物组合物，其中所述第一抗体是人源化MAb 425(h425)和所述第二抗体是嵌合MAb 225(c225，Cetuximab)。
.相应的药物组合物，其还包含细胞毒性药。
.药物试剂盒，其包含
(i)第一包装，其至少包含与ErbB受体分子的结合域中第一特异性表位结合的第一生物学活性抗体分子，或其片段，和(ii)第二包装，其至少包含与相同ErbB受体分子的结合域中不同的第二特异性表位结合的第二抗体分子，或其片段。
.相应的药物试剂盒，其中至少一种所述抗体分子与受体的天然配体所结合的受体结合域内的表位相结合。
.相应的药物试剂盒，其中所述第一抗体分子是鼠的、嵌合的或人源化的单克隆抗体425或其生物活性片段，而所述第二抗体分子是鼠的、嵌合的或人源化的单克隆抗体225或其生物活性片段。
.相应的药物试剂盒，其包含第一包装和第二包装，第一包装包含人源化MAb 425(h425)，第二包装包含嵌合MAb 225(c225)。
.相应的药物试剂盒，其还包含第三包装，该包装包含能够增加第一和第二包装所提供的药物的功效的其它药物。
.相应的药物试剂盒，其中所述其它药物是细胞毒性药。
.一种治疗患者中肿瘤相关疾病的方法，包括对所述患者施用治疗上有效量的(i)至少第一抗体分子(或其片段)——该分子与ErbB受体分子的结合域中的第一特异性表位结合，和(ii)至少第二抗体分子——该分子与相同ErbB受体分子的结合域中的不同第二特异性表位结合。
.相应的方法，其中至少一种所述抗体分子与受体的天然配体所结合的受体结合域内的表位相结合。
.相应的方法，其中与所述表位结合的所述抗体分子阻断和/或抑制该受体，由此诱导对受体-特异性信号通路的调节。
.相应的方法，其中所述抗体分子的结合诱导具有相同或不同特异性的不同受体分子交联和/或二聚化。
.相应的方法，其中所述第一抗体分子是人源化单克隆抗体425(h425)或其生物活性片段，而所述第二分子是嵌合或单克隆抗体225(c225)或其生物活性片段。
在本发明的优选实施方案中，ErbB受体是EGF受体(EGFR)，而针对该受体上不同表位的抗体是抗EGFR抗体。
因此，本发明具体涉及：
.药物组合物，其包含能够与位于相同或不同ErbB受体分子类型上的不同表位结合的第一和第二抗体分子或其部分，其中所述第一抗体分子或其部分包含与ErbB1受体分子类型上的第一特异性表位结合的结合位点，而所述第二抗体分子包含与相同ErbB1受体分子类型上的第二特异性表位结合的结合位点。
.药物组合物，其中至少ErbB1受体分子类型上的所述第一或所述第二表位位于ErbB1受体结合域内。
.药物组合物，其中ErbB1受体分子类型上的所述第一和所述第二表位位于ErbB1受体结合域内。
.药物组合物，其中所述受体结合域是所述ErbB1受体分子类型的天然配体的结合域。
.药物组合物，其中第一和第二抗体或其片段与所述ErbB1受体分子类型的天然配体的结合域内的不同表位结合。
.药物组合物，其中与包含仅和所述ErbB1受体分子类型上所述第一或所述第二表位结合的单一抗体分子的组合物相比，所述药物组合物增强对ErbB受体的阻断和/或抑制和对ErbB受体-特异性信号通路下调的诱导。
.药物组合物，其中与包含仅和所述ErbB1受体分子类型上所述第一或所述第二表位结合的单一抗体分子的组合物相比，所述药物组合物增强对具有相同或不同特异性的ErbB受体分子的交联和/或二聚化的诱导。
.药物组合物，其中所述ErbB受体分子参与交联和/或二聚化，且选自ErbB1和ErbB2(Her-2)。
.药物组合物，其中所述第一和/或所述第二抗体是单特异性抗体。
.药物组合物，其中第一抗体是鼠的、嵌合的或人源化的MAb 425。
.药物组合物，其中第二抗体是鼠的、嵌合的或人源化的MAb 225。
.药物组合物，其中所述第一抗体是人源化MAb 425(h425)而所述第二抗体是嵌合MAb 225(c225)。
.根据权利要求1-12任一项的药物组合物，其还包含细胞毒性剂。
.药物组合物，其中所述细胞毒性剂是化疗剂。
.药物组合物，其中所述化疗剂选自：顺铂、阿霉素、吉西他滨、多西他赛(docetaxel)、紫杉醇、博来霉素。
.药物组合物，其中所述细胞毒性剂是ErbB受体抑制剂、VEGF受体抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、蛋白激酶A抑制剂、抗血管生成剂，或细胞因子。
.药物组合物，其中所述第一和/或所述第二抗体分子是免疫缀合物，其中抗体部分经其C末端，任选地借助接头肽与生物学上有效的肽、多肽或蛋白质融合
.药物组合物，其中蛋白质是细胞因子。
.药物试剂盒，其包含(i)第一包装，该包装包含含有与ErbB1受体分子上存在的第一特异性表位结合的结合位点的第一抗体分子或其部分，和(ii)第二包装，该包装包含含有与相同ErbB1受体分子类型上的第二不同特异性表位结合的结合位点的第二抗体分子。
.药物试剂盒，其中至少ErbB1受体上的所述第一或所述第二表位位于ErbB1受体结合域内。
.药物试剂盒，其中ErbB1受体上的所述第一和所述第二表位位于ErbB1受体结合域内。
.药物试剂盒，其中至少一种所述分子与ErbB1受体的天然配体所结合的受体结合域内的表位相结合。
.药物试剂盒，其中所述第一抗体分子是鼠的、嵌合的或人源化的单克隆抗体425，而所述第二分子是鼠的、嵌合的或人源化的单克隆抗体225。
.药物试剂盒，其包含第一包装和第二包装，第一包装包含人源化MAb 425(h425)，第二包装包含嵌合MAb 225(c225)。
.根据权利要求19-24任一项的药物试剂盒，其还包含第三包装，该包装包含细胞毒性剂。
.药物试剂盒，其中所述细胞毒性剂是化疗剂。
.药物试剂盒，其中所述化疗剂选自：顺铂、阿霉素、吉西他滨、多西他赛、紫杉醇、博来霉素。
.药物试剂盒，其中所述细胞毒性药是ErbB受体抑制剂、VEGF受体抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、蛋白激酶A抑制剂、抗血管生成剂，或细胞因子。
.如上述和权利要求任一项所述的药物组合物或药物试剂盒在制备用于治疗与ErbB，尤其是ErbB1受体过表达相关的肿瘤、肿瘤转移或肿瘤相关疾病的药物中的用途。
发明详述
本发明基于如下认识，具有针对不同免疫原性结构的特异性的两种或多种不同的分子，优选单克隆抗体(MAb)，可与其表位同时且无阻碍地结合，所述表位可位于相同ErbB(优选ErbB1)受体域上，例如位于ErbB(ErbB1)配体-结合域内。与仅用一种单特异性抗体的治疗效果相比，施用具有所述特性的两种或多种化学或生物分子，诸如单特异性MAb或针对相同或不同受体的抗体联合，可极大改进治疗效果：
.两种或多种Mabs独立地结合其靶受体(例如EGFR)上的不同表位。
.由于独立地结合不同受体表位，故使用相同抗体剂量或浓度可以增加每一受体和由此每一细胞所结合的抗体量。在每一抗体具有饱和浓度或剂量的最适条件下，当使用针对不同表位的两种抗体时，每一受体和每一细胞所结合的抗体分子的数量在理论上加倍。随着每增加应用一种抗体，每一受体和每一细胞所结合的抗体蛋白可以线性增加。
.对于具有的抗原密度低于抗体依赖性免疫效应子功能所需的密度阈值的细胞(其在正常条件下对抗体治疗不敏感)，在用两种或多种针对同一受体的不同表位的抗体处理后，其表面上的抗体量将增加，并由此可能易受ADCC和CDC的影响。
.与仅用一种单一抗体所得到的受体阻断功效相比，使用具有不同表位特异性的两种或多种单特异性抗体——所述不同表位位于配体结合域内或邻近配体-结合域——明显地增加了受体阻断功效。
.因为由针对相同受体域的不同抗体的联合引起的受体阻断比仅由一种单一抗体引起的受体阻断更有效，故可得到对配体-结合更有效的抑制作用，从而导致更有效的受体失活。
.该更有效的受体失活导致对下游受体信号转导更有效的抑制，并由此导致对配体-依赖性细胞功能的影响增强。
.由于该更有效的受体阻断，故可降低所使用的各抗体的剂量(或浓度)而不会损失功效。当使用的治疗性抗体低于最适治疗剂量仍显示出剂量限制性毒性或副作用时，这可能是非常有意义的。
.与受体的单一一种表位相互作用的单特异性抗体仅允许形成由两个受体分子组成的聚集物。与之相反，由针对不同表位的两种或多种抗体所诱导的受体交联可导致包含明显更多数量受体的受体-抗体复合物。
.通过使用两种或多种抗体诱导较大受体-抗体复合物形成，可以改善受体的内在化，并由此可以更有效地从细胞表面除去受体和随后下调受体-依赖性细胞功能。
.两种或多种针对相同或不同受体的抗体的联合可用于治疗带有适宜受体的肿瘤。EGFR阳性肿瘤是一个典型的实例，但是本发明所述的治疗原则的应用并不限于该适应症。由此，采用相同的原则可以治疗带有其它受体、受体家族或其它抗原性结构的种类繁多的肿瘤。
.应用两种或多种针对相同或不同受体上不同抗原的抗体的联合疗法还可以与化疗药和/或放射联合应用。
.应用针对相同或不同受体上不同抗原的两种或多种抗体的联合疗法还可以与其它治疗原则联合使用，所述其它治疗原则包括但不限于应用激素拮抗剂或激素激动剂、血管生成抑制剂的治疗和其它治疗。
本文中以对EGFR阳性肿瘤的治疗为例，描述了应用具有对相同或不同受体上抗原结构的不同特异性的适宜分子，优选抗体进行的联合治疗原则。但是，该原则并不限于EGFR，其可适用于任何其它靶抗原。
若没有另外的说明，本发明使用的术语和词语具有下面给出的含义和定义。而且，这些定义和含义更详细地描述了本发明，包括优选实施方案。
“受体”或“受体分子”是指可溶的或膜结合/相关的蛋白或糖蛋白，其含有一个或多个可与配体结合以形成受体-配体复合物的域。通过与可能是激动剂或拮抗剂的配体结合，受体可以被激活或者失活，由此可以启动或阻断信号通路。
术语“受体分子类型”或“ErbB(ErbB1)受体分子类型”是指具体的受体类型诸如ErbB1，ErbB2等，但不指该受体类型的具体的单分子。如果本文提及在本发明联合中根据本发明的抗体与特定ErbB受体分子类型结合，则这的确包括抗体与同一所述ErbB受体类型的相同或不同分子结合。由此，可能是，第一抗体与ErbB1受体分子个体上的特异性表位结合，而第二抗体与相同ErbB1受体分子个体上的另一不同表位结合。然而，也可能是第二抗体与相同受体类型的另一受体分子个体的相同不同表位结合。
“配体”或“受体配体”是指这样的天然或者合成的化合物，它可以和受体分子结合形成受体-配体复合物。术语配体包括激动剂、拮抗剂以及具有部分激动剂/拮抗剂活性的化合物。
“激动剂”或“受体激动剂”是指这样的天然或者合成的化合物，它和受体结合形成受体-激动剂复合物，激活所述受体或受体-激动剂复合物而启动信号通路及进一步的生物学过程。
“拮抗剂”或“受体拮抗剂”是指具有与激动剂相反的生物学效应的天然或者合成的化合物。拮抗剂和受体结合，通过和激动剂竞争受体而阻断受体激动剂的作用。拮抗剂是根据它阻断激动剂的作用的能力来定义的。受体拮抗剂也可以是抗体或是其具有免疫治疗活性的片段。下面将举出并论述本发明优选的拮抗剂。
“ErbB受体”是指属于(如上述)ErbB受体家族的受体蛋白酪氨酸激酶，包括EGFR(ErbB1)，ErbB2，ErbB3和ErbB4受体以及此家族中有待于在将来进行鉴别的其他成员。ErbB受体一般含有一个可与ErbB配体结合的细胞外域；一个亲脂性的跨膜域；一个保守的细胞内酪氨酸激酶域；以及一个含有若干可被磷酸化的酪氨酸残基的羧基端信号域。ErbB受体可以是“天然序列的”ErbB受体，或其“氨基酸序列变异体”。优选的ErbB受体是天然序列的人ErbB受体。ErbB1是指编码EGFR蛋白产物的基因。最优选的是EGF受体(EGFR，Her1)。“ErbB1”和“HER1”和“EGFR”在本文可互换使用且均指人HER1蛋白。“ErbB2”和“HER2”在本文可互换使用且均指人HER2蛋白。本发明优选ErbB1受体(EGFR)。
“ErbB配体”是结合并且/或者激活ErbB受体的多肽。与EGFR结合的ErbB配体包括例如EGF，TGF-α，双调蛋白，β细胞调节素(betacellulin)，HB-EGF和表皮调节素(epiregulin)，优选EGF和TGF-α。
在本发明的上下文中，“ErbB受体结合域”是ErbB受体的局部区域(结合序列/环/袋)，该区域与天然配体或拮抗剂或激动剂结合。该区域不仅可以包含一种特异性结合位点或表位，还可包含两种或多种表位或结合位点。该域内的一种特异性结合表位与一类拮抗剂或激动剂或配体结合。然而，不同药剂与相同受体类型结合域内的或邻近结合域的不同表位结合，被认为通常会通过抑制或活化作用导致该受体所典型的独特唯一信号通路。此外，应当指出本说明书和权利要求书中所使用的术语“结合域内”也包括紧邻相应天然配体的真实结合域的位置。
“ErbB结合表位或结合位点”是指ErbB受体的结合域内的或与结合域紧邻的氨基酸的构象和/或构型，所述结合域与配体或受体拮抗剂/激动剂结合。
“相同的ErbB/ErbB1受体分子”不一定意指同一个受体分子，而是也包括相同类型的其它受体分子。优选，意指同一个受体分子。
术语“ErbB受体拮抗剂/抑制剂”是指能结合并阻断或抑制ErbB受体的生物学上有效的分子。因此，通过阻断受体，拮抗剂阻止ErbB配体(激动剂)的结合以及激动剂/配体受体复合物的活化。ErbB拮抗剂可针对HER1(ErbB1，EGFR)，HER2(ErbB2)和ErbB3和ErbB4。本发明优选的拮抗剂针对EGF受体(EGFR，HER1)。ErbB受体拮抗剂可以是抗体或抗体的免疫治疗活性片段或非免疫生物学分子，诸如肽、多肽蛋白。化学分子也包括在内，但是本发明优选的拮抗剂为抗EGFR抗体和抗HER2抗体。
本发明优选的抗体为抗HER1和抗Her2抗体，更优选抗HER1抗体。优选的抗HER1抗体为Mab 425，优选人源化的Mab 425(hMAb 425，US 5,558,864；EP 0531 472)和嵌合MAb 225(CETUXIMAB)。最优选的是单克隆抗体h425，在单药物治疗中它已显示出高疗效和降低的不良反应和副反应。最优选的抗Her2抗体是Genentech/Roche上市的HERCEPTIN。
本发明的有效EGF受体拮抗剂还可以是天然或合成的化学化合物。此类优选分子的一些实例包括有机化合物、有机金属化合物、有机化合物和有机金属化合物的盐。HER2受体化学拮抗剂的实例有：苯乙烯基取代的杂芳基化合物(US 5,656,655)；双单环和/或双环芳基杂芳基、碳环和杂碳环化合物(US 5,646,153)；三环的嘧啶化合物(US 5,679,683)；具有受体酪氨酸激酶抑制活性的喹唑啉衍生物(US 5,616,582)；杂芳基乙烯二基或杂芳基乙烯二基芳基化合物(US 5,196,446)；名称为6-(2，6-二氯代苯基)-2-(4-(2-二乙基-氨基乙氧基)苯基氨基)-8-甲基-8H-吡啶并(2，3)-5-嘧啶-7-酮的化合物(Panek，等，1997，J.Pharmacol.Exp.Therap.283，1433)，其可以抑制EGFR、PDGFR和FGFR受体家族。
根据本发明，术语“酪氨酸激酶拮抗剂/抑制剂”是指天然或者合成的能够抑制或阻断酪氨酸激酶(包括受体酪氨酸激酶)的试剂。因此，该术语本身包括上述ErbB受体拮抗剂/抑制剂。除了上文和下文所提及的抗ErbB受体抗体以外，此定义下更优选的酪氨酸激酶拮抗剂是在单药物治疗中表现出对乳腺癌和前列腺癌有效的化学化合物。适宜的吲哚并咔唑型酪氨酸激酶抑制剂可利用如美国专利5,516,771；5,654,427；5,461,146；5,650,407等文献的信息获得。美国专利5,475,110；5,591,855；5,594,009和WO 96/11933公开了吡咯并咔唑型酪氨酸激酶抑制剂和前列腺癌。文中最有希望的一种抗癌剂是gefitinib(IRESSA，Astra Zeneca)，其已被报道对患有非小细胞肺癌(NSCLC)以及晚期头颈癌的患者具有显著的治疗效果和良好的耐受性。
上面定义的化学性酪氨酸激酶抑制剂的优选剂量为每天1pg/kg体重到1g/kg体重。更优选地，酪氨酸激酶抑制剂的剂量为每天0.01mg/kg体重到100mg/kg体重。
根据本发明的生物分子优选是抗体或其片段或抗体的任何变体诸如免疫缀合物。
在本文中，术语“抗体”或“免疫球蛋白”有最广义的含义，特别包括完整的单克隆抗体、多克隆抗体、由至少2个完整抗体构成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)以及抗体片段，只要其显示出具有所需的生物学活性即可。此术语一般包括由2个或多个具有不同结合特异性的抗体或抗体片段连接在一起构成的杂合抗体。
根据抗体恒定区的氨基酸序列，完整的抗体可被划分成不同的“抗体(免疫球蛋白)类型”。完整抗体有5个主要类型：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，其中有些可以被进一步划分成“亚类”(同种型)，如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA和IgA2。相应于不同抗体类型的重链恒定区分别称为α，δ，ε，γ和μ。本发明优选的抗体主要类型是IgG，更具体的说是IgG1和IgG2。
抗体常常是分子量约150,000的糖蛋白，由2条同样的轻(L)链和2条同样的重(H)链组成。每条轻链都通过一个共价二硫键和重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间二硫键数目不同。每条重链和轻链还有规则间隔的链内二硫键。每条重链都在一端有一个可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链都在一端上有一个可变区(VL)，在另一端上有一个恒定区。轻链的恒定区和重链的第一个恒定区并列，轻链的可变区和重链的可变区并列。据信特定氨基酸残基构成轻链和重链可变区之间的介面。可将脊椎动物物种的抗体“轻链”划分为2种明确不同的类型，称为卡帕(κ)和拉姆达(λ)，这取决于它们恒定区的氨基酸序列。
本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上均质的抗体群中获得的抗体，即，除了可能的天然发生的突变——此突变可能小量存在——以外，抗体群内的每一株抗体都是相同的。单克隆抗体具有高度的特异性，它针对单一的抗原位点。而且，和多克隆抗体制品不同，多克隆抗体含有针对不同决定簇(表位)的不同抗体，而每个单克隆抗体都仅针对抗原上的一个决定簇。除了其特异性以外，单克隆抗体的优越之处还在于可以合成无其他抗体污染的单克隆抗体。单克隆抗体的制备方法包括Kohler和Milstein(1975，Nature 256，495)和“单克隆抗体技术，啮齿类和人类杂交瘤的制备和表征”(1985，Burdon等，Eds，Laboratory Techniquesin Biochemistry and Molecular Biology，Volume 13，Elsevier SciencePublishers，Amsterdam)中描述的杂交瘤法，或者可以用众所周知的重组DNA方法进行制备(实例可参见US 4,816,567)。也可采用例如Clackson等，Nature，352：624-628(1991)和Marks等，J.Mol.Biol.，222：58，1-597(1991)中描述的技术从噬菌体抗体文库中分离单克隆抗体。
术语“嵌合抗体”是指这样的抗体，其重链和/或轻链的一部分与来自特定物种的抗体或属于特定抗体类型或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，然而链的其余部分则与来自另一物种的抗体或属于另一抗体类型或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，该术语还指此种抗体的片段，只要其具有所需的生物学活性即可(例如：US 4,816,567；Morrison等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，81：6851-6855(1984))。生产嵌合型和人源化抗体的方法是本领域技术人员所熟知的。例如，制备嵌合抗体的方法包括Boss(Celltech)和Cabilly(Genentech)(US 4,816,397；US 4,816,567)的专利中描述的方法。
“人源化抗体”是非人(如啮齿类)嵌合抗体形式的抗体，其含有最低量的源于非人免疫球蛋白的序列。就大部分而言，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中受体的高变区(CDR)的残基被替换成非人物种(如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类)(供体抗体)的、具有所需的特异性、亲和性和性能的高变区残基。有时，人免疫球蛋白构架区(FR)残基被相应的非人残基替换。此外，人源化抗体还可以含有受体抗体和供体抗体上均没有的残基。这些修饰可以进一步精细化抗体的性能。通常，人源化抗体含有基本上所有的可变区(至少一个，一般两个可变区)，其中所有或基本上所有的高变环都对应于非人免疫球蛋白的相应部分，而所有或基本上所有的FR都具有人免疫球蛋白序列。人源化抗体也可任选地含有至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，典型的是人免疫球蛋白的恒定区。人源化抗体的制备方法描述在例如Winter，US 5,225,539和Boss(Celltech，US 4,816,397)中。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选包含抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab，Fab′，F(ab′)2，Fv和Fc片段，双抗体(diabody)，线性抗体，单链抗体分子；以及由抗体片段构成的多特异性抗体。”完整”抗体是指包含结合抗原的可变区以及轻链恒定区(CL)和重链恒定区(CH1，CH2和CH3)的抗体。
优选地，完整抗体具有一个或多个效应子功能。木瓜蛋白酶消化抗体产生2个相同抗原结合片段(称之为“Fab”片段，每个片段含有一个抗原结合位点和一个CL区和一个CH1区)以及一个残余的“Fc”片段(其名称反映了其易于结晶的能力)。
抗体的“Fc”区一般含有CH2，CH3和IgG1或IgG2抗体主要类型的铰链区。铰链区是具有约15个氨基酸残基的基团，它把CH1区和CH2-CH3区结合起来。
胃蛋白酶处理产生一个“F(ab′)2”片段，其含有2个抗原结合位点并仍具有交联抗原的能力。
“Fv”是最小的抗体片段，其含有一个完整的抗原识别和抗原结合位点。此区域由一个重链可变区和一个轻链可变区通过紧密的非共价连接形成的二聚体组成。在此构型中每个可变区的3个高变区(CDR)相互作用在VH-VL二聚体表面上确定出一个抗原结合位点。总的说来，6个高变区赋予了抗体的抗原结合特异性。但是，甚至仅一个可变区(或仅含有3个抗原特异性高变区的一半Fv)也有识别并结合抗原的能力，虽然它比完整的结合位点的亲合力低。
“Fab”片段还包括轻链的恒定区和重链的第一恒定区(CH1)并仅具有一个抗原结合位点。“Fab′”片段和Fab片段的不同之处在于在重链CH1区的羧基端多了几个残基，包括一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸。
F(ab′)2抗体片段最初以Fab′片段对的形式产生，这两个Fab′片段之间有半胱氨酸铰链。抗体片段的其它化学偶联也是已知的(例如参见Hermanson，Bioconjugate Techniques，Academic Press，1996；US4,342,566)。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的V，和V，区，其中这些结构域存在于一条多肽链上。优选地，Fv多肽还包含在VH和VL结构域之间的多肽接头，其可使scFv形成抗原结合所需的结构。单链FV抗体也可从例如Plückthun(The Pharmacology Of Monoconal Antibodies，Vol.113，Rosenburg和Moore编，Springer-Verlag，NewYork，pp.269-315(1994))，WO 93/16185；US 5,571,894；US 5,587,458；Huston等(1988，Proc.Natl.Acad.Sci.85，5879)或Skerra和Plueckthun(1988，Science 240，1038)获知。
术语“可变”或“FR”是指如下事实，即抗体与抗体之间在可变区的某些部分具有十分不同的序列，这些部分用于各特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，此可变性并非均匀地分布在抗体的整个可变区。它集中在轻链和重链可变区的三个称为高变区的区段中。可变区的较高保守部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区每一个都包含四个FR(FR1-FR4)，其主要采用β-折叠构型，由三个高变区连接，高变区形成环连接这些β-折叠结构，且有时形成β-折叠结构的一部分。每条链的高变区通过FR紧邻地保持在一起，并与另一条链的高变区一起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等，Sequences Of Proteins OfImmunological Interest，5th Ed.Public Health Service，National InstitutesOf Health，Bethesda，MD.(1991)。虽然恒定区不直接参与抗体和抗原的结合，但其显示出多种效应子功能，如参与抗体的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。本文所用的术语“高变区”或“CDR”是指负责与抗原结合的抗体的氨基酸残基。高变区一般包含“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如，轻链可变区的24-34位(L1)，50-56位(L2)和89-97位(L3)残基，重链可变区的31-35位(H1)，50-65位(H2)和95-102位(H3)残基)；和/或“高变环”的氨基酸残基(例如，轻链可变区的26-32位(L1)，50-52位(L2)和91-96位(L3)残基，重链可变区的26-32位(H1)，53-55位(H2)和96-101位(H3)残基；Chothia and LeskJ.Mol.Biol.196：901-917(1987))。“构架区”或“FR”残基是指除本处定义的高变区残基以外的那些可变区残基。
术语“单特异性”是指根据本发明的抗体，其中抗体的两个结合位点具有相同的特异性，由此，能够结合受体上的相同表位。优选地，根据本发明，药物组合物包含单特异性抗体。
“双特异性抗体(BAbs)”是单个、双价的抗体(或其免疫治疗活性片段)，其含有2个不同特异性的抗原结合位点。根据本发明，BAbs的特征在于BAb<MAb1，MAb2>，其中<MAb1>和<MAb2>命名源自MAb1和MAb2的抗原结合位点。例如，第一个抗原结合位点针对血管生成受体(例如整联蛋白或VEGF受体)，而第二个抗原结合位点针对ErbB受体(例如EGFR或Her2)。双特异性抗体可用化学方法(例如参见Kranz等(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78,5807)或“polydoma”技术(参见US 4,474,893)或重组DNA技术制备，所有这些技术均为实质上已知的技术。其他方法在WO 91/00360，WO 92/05793和WO 96/04305中有描述。双特异性抗体还可用单链抗体来制备(例如参见Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85，5879；Skerra和Plueckthun(1988)Science 240，1038)。这些是以单条多肽链形式产生的抗体可变区类似物。为了构成双特异性结合剂，单链抗体可以通过本领域内技术人员熟知的化学方法或遗传工程方法偶联在一起。本发明的双特异性抗体也可以用亮氨酸拉链序列来制备。此序列可来自于转录因子Fos和Jun的亮氨酸拉链区(Landschulz等，1988，Science 240，1759；综述见，Maniatis和Abel，1989，Nature 341，24)。亮氨酸拉链是约20-40个残基长的特殊氨基酸序列，典型地每7个残基就有一个亮氨酸。此拉链序列形成两亲性α-螺旋，亮氨酸残基在疏水侧上排成一线以便形成二聚体。与Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链相应的肽优先形成异二聚体(O′Shea等，1989，Science 245，646)。含有拉链的双特异性抗体及其制备方法在WO 92/10209和WO 93/11162中有公开。
术语“融合蛋白”是指由上述一种或多种分子组成的天然或合成分子，其中具有不同特异性的两种或多种基于肽或蛋白质(包括糖蛋白)的分子任选的通过化学的或基于氨基酸的接头分子融合在一起。该连接可通过C-N融合或N-C融合(以5′→3′方向)，优选C-N融合而实现。
然而，根据本发明优选的融合蛋白质是如下述的免疫缀合物。
术语“免疫缀合物”指融合蛋白，且意指通过共价键与非免疫学效应分子融合在一起的抗体或免疫球蛋白或其免疫学活性片段。此融合伙伴(partner)优选为可被糖基化的肽或蛋白质。所述非抗体分子能连接到抗体重链恒定区的C末端或连接到轻链和/或重链可变区的N末端。此融合伙伴可以通过接头分子连接，一般这种接头分子是含3-15个氨基酸残基的肽。本发明的免疫缀合物是由针对ErbB受体的免疫球蛋白或其有免疫治疗效果的片段与优选地细胞因子，诸如TNFα、IFNγ或IL-2，或其它毒性剂组成的融合蛋白。优选地，这些基于肽或蛋白质的分子通过其N末端与所述免疫球蛋白的C末端(，即其Fc部分)相连。
“杂合抗体”是基本上由常规地通过化学交联剂而被融合在一起的两个或多个抗体或抗体结合片段组成的融合蛋白，这些抗体中每个都具有不同的结合特异性。杂合抗体可以通过将两个或多个抗体或抗体片段缀合在一起而制备。
优选的杂合抗体由交联的Fab/Fab′片段组成。很多偶联或交联试剂可用于抗体的缀合。例如蛋白A，碳二亚胺，N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基-硫代乙酸酯(SATA)和N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基联硫基)丙酸酯(SPDP)(例如参见Karpovsky等(1984)J.EXP.Med.160，1686；Liu等(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82，8648)。其他的方法还有Paulus，BehringInst.Mitt.，No.78，118(1985)；Brennan等(1985)Science 30，81或Glennie等(1987)J.Immunol.139，2367描述的方法。另一种方法使用邻亚苯基二马来酰亚胺(oPDM)将三个Fab′片段偶联在一起(WO 91/03493)。
本发明中多特异性抗体也是适用的，并可例如按照WO 94/13804和WO 98/50431的教导进行制备。本发明优选的杂合抗体是包含如所述连接在一起的两种抗EGFR抗体(各抗体均针对相同受体的不同表位)的融合蛋白(例如MAB 425-MAB 225)。
术语“细胞因子”是对由一个细胞群释放的作为细胞间介质作用于另一细胞的蛋白质的通称。这类细胞因子的实例有淋巴因子、单核因子以及传统的多肽激素。细胞因子包括生长激素如人生长激素，N-甲硫氨酰基人生长激素以及牛生长激素；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素如促卵泡激素(FSH)，促甲状腺激素(TSH)和黄体生成素(LH)；肝生长因子；成纤维细胞生长因子；催乳素；胎盘催乳素；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；活化素；血管内皮生长因子(VEGF)；整联蛋白；血小板生成素(TPO)；神经生长因子如NGFβ；血小板生长因子；转化生长因子(TGF)如TGFα和TGFβ；红细胞生成素(EPO)；干扰素如IFNα，IFNβ和IFNγ；集落刺激因子如M-CSF，GM-CSF和G-CSF；白细胞介素如IL-1，IL-1a，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12；和TNFα或TNFβ。本发明优选的细胞因子为干扰素和TNFα和IL-2。
抗体“效应子功能”是指由抗体Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)引起的那些生物活性。抗体效应子功能的实例包括补体依赖的细胞毒性，Fc受体结合，抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)，吞噬作用，细胞表面受体(如B细胞受体)的下调等。
术语“ADCC”(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用)是指这样一种细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(如天然杀伤(NK)细胞，嗜中性粒细胞，和巨噬细胞)识别靶细胞上的结合抗体并随后引起靶细胞的裂解。介导ADCC的主要细胞-NK细胞只表达FcγRIII，而单核细胞可表达FcγRI，FcγRII和FcγRIII。为估计目的分子的ADCC活性，可利用例如现有技术(US 5,500,362；US 5,821,337)中描述的体外ADCC实验来进行。此实验中有用的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。
术语“Fc受体”或“FcR”用于描述与抗体Fc区结合的受体。优选的FcR是天然序列人FcR。而且，优选的FcR是结合IgG抗体的受体(γ受体)并包括FcγRI，FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括这些受体的等位基因变体和可变剪接形式。对FcR的综述可参见例如，Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol 9：457-92(1991)。
作为一个具体的实施方案，本发明的治疗方法包括其它治疗上有效的药剂的施用，该其它药剂能辅助期望的效应，例如肿瘤毒性或细胞抑制功效，或减少或防止不需要的副作用。因此，本发明包括此类药剂与上文和下文所述的药物组合物的联合，其中所述药剂通常可以是其它ErbB受体拮抗剂、VEGF受体拮抗剂、细胞因子、细胞因子免疫缀合物、抗血管生成剂、抗激素剂、或细胞毒性剂。本发明的一个目的还在于根据已知方法将本文所述的组合物与放射治疗联合。
本文中所使用的术语“细胞毒性剂”具有非常广泛的定义，其是指这样的物质，该物质能抑制或防止细胞功能和/或导致细胞破坏(细胞死亡)，和/或产生抗肿瘤的/抗增殖的作用，例如，直接或间接防止瘤性肿瘤细胞的进展、成熟或扩散。该术语表达性地还包括这样的药剂，其仅导致细胞抑制作用而无纯粹的细胞毒性作用。该术语包括下面详细描述的化疗剂，以及其它ErbB拮抗剂(诸如抗ErbB抗体)，抗血管生成剂，酪氨酸激酶抑制剂，蛋白激酶A抑制剂，细胞因子家族成员，放射性同位素，和毒素诸如细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素。
术语“化疗剂”是术语“细胞毒性剂”的子集，其具体指具有抗肿瘤效果，优选直接作用于肿瘤细胞上，和较少地间接经过诸如生物反应修饰等机制起作用的化学药剂。本发明适宜的化疗剂优选为天然或合成的化学化合物。大量的现有处于商业使用、临床评价和临床前研发阶段的抗瘤形成化疗剂都可包括在本发明内，用于通过与本发明提到的受体拮抗剂相联合来治疗肿瘤/赘生物。应当指出化疗剂可任选地与本发明的所述ErbB受体拮抗剂，优选所述抗EGFR抗体一起施用。
化疗剂的实例包括烷化剂，如氮芥，吖丙啶化合物，烷基磺酸酯以及其他具有烷基化作用的化合物如亚硝基脲，顺铂和达卡巴嗪；抗代谢物如叶酸、嘌呤或嘧啶拮抗剂；有丝分裂抑制剂如长春花生物碱和鬼臼毒素衍生物；细胞毒性抗生素和喜树碱衍生物。
优选的化疗剂包括氨磷汀(ethyol)，顺铂，达卡巴嗪(DTIC)，放线菌素D，氮芥，链脲霉素，环磷酰胺，carrnustine(BCNU)，环己亚硝脲(CCNU)，阿霉素，阿霉素微脂体(doxil)，吉西他滨(gemzar)，柔红霉素，柔红霉素微脂体(daunoxome)，甲基苄肼，丝裂霉素，阿糖胞苷，足叶乙甙，氨甲蝶呤，5-氟尿嘧啶(5-FU)，长春花碱，长春新碱，博来霉素，紫杉醇(taxol)，泰索帝(taxotere)，阿地白介素(aldesleukin)，天冬酰胺酶，白消安，卡铂，克拉立平，喜树碱，CPT-11，10-羟基-7-乙基-喜树碱(SN38)，gefitinib(Iressa)，达卡巴嗪，氟尿苷，氟达拉滨，羟基脲，异环磷酰胺，伊达比星，巯乙磺酸钠，干扰素α，干扰素β，伊立替康(irinotecan)，米托蒽醌，托泊替堪，亮丙瑞林，甲地孕酮，抗瘤氨酸，巯嘌呤，普卡霉素(plicamycin)，氯苯二氯乙烷，天冬酰胺酶(pegaspargase)，喷司他丁(pentostatin)，哌酰溴烷，普卡霉素，链脲霉素，他莫西芬，替尼泊甙，睾内酯，硫鸟嘌呤，塞替派，尿嘧啶氮芥，维诺利宾，苯丁酸氮芥及其组合。
本发明最优选的化疗剂是顺铂，吉西他滨，阿霉素，紫杉醇(taxol)和博来霉素。
“抗血管生成剂”是指天然或合成的化合物，其可在一定程度上阻断或干扰血管的发育。例如，抗血管生成分子可以是与生血管生长因子或生长因子受体结合并将其阻断的生物分子。此处优选的抗血管生成分子可以与受体结合，优选与整联蛋白受体或与VEGF受体结合。本发明中此术语还包括所述血管生成剂的前体药物。该术语还包括具有所述活性并也可被分类为细胞毒性剂，优选化疗剂的药剂。
有很多结构和来源不同的分子都可以引起抗血管生成性质。本发明中适宜的血管生成抑制剂或阻断剂的大多数相关类型是，例如：
(i)抗有丝分裂剂，例如氟尿嘧啶，丝裂霉素C，紫杉醇；
(ii)雌激素代谢物如2-甲氧基雌二醇；
(iii)抑制锌金属蛋白酶的基质金属蛋白酶(MMP)抑制剂(例如，betimastat，BBl6，TIMPs，二甲胺四环素，GM6001，或在“基质金属蛋白酶的抑制：治疗应用”中论及的那些(物质)(Golub，Annals of the NewYork Academy Of Science，Vol.878a；Greenwald，Zucker(编)，1999)；
(iv)抗血管生成的多功能药剂和因子，如IFNα(US 4,530,901；US4,503,035；5,231,176)；血管他丁和纤溶酶原片段(例如kringle 1-4，kringle5，kringle 1-3(O′Reilly，M.S.等，Cell(Cambridge，Mass.)79(2)：315-328，1994；Cao等，J.Biol.Chem.271：29461-29467，1996；Cao等，J.Biol Chem 272：22924-22928，1997)；内皮生长抑素(endostatin)(O′Reilly，M.S.等，Cell 88(2)，277，1997和WO 97/15666)，血小板反应蛋白(TSP-1；Frazier，1991，Curr Opin Cell Biol 3(5)：792)；血小板因子4(PF4)；
(v)纤溶酶原激活物/尿激酶抑制剂；
(vi)尿激酶受体拮抗剂；
(vii)肝素酶；
(viii)烟曲霉素类似物如TNP-470；
(ix)酪氨酸激酶抑制剂如SU 10(上面和下面提到的很多ErbB受体拮抗剂(EGFR/Her 2拮抗剂)也是酪氨酸激酶抑制剂，因此其分别可以显示出抗EGF受体阻断活性从而导致肿瘤生长受抑制，及显示出抗血管生成的活性从而导致血管发育和内皮细胞发育受抑制)；
(x)苏拉明和苏拉明类似物；
(xi)制管张性(angiostatic)类固醇；
(xii)VEGF和bFGF拮抗剂；
(xiii)VEGF受体拮抗剂如抗VEGF受体抗体(DC-101)；
(xiv)flk-1和flt-1拮抗剂；
(xv)环加氧酶-II抑制剂如COX-II；
(xvi)整联蛋白拮抗剂和整联蛋白受体拮抗剂如αv拮抗剂和αv受体拮抗剂，例如，抗αv受体抗体和RGD肽。本发明优选整联蛋白(受体)拮抗剂。
术语“整联蛋白拮抗剂/抑制剂”或“整联蛋白受体拮抗剂/抑制剂”是指天然或者合成的分子，其阻断并抑制整联蛋白受体。有时，此术语包括针对所述整联蛋白受体的配体(例如对于αvβ3：玻连蛋白，纤维蛋白，纤维蛋白原，冯·维勒布兰德因子，血小板反应蛋白，层粘连蛋白；对于αvβ5：玻连蛋白；对于αvβ1：纤连蛋白和玻连蛋白；对于αvβ6：纤连蛋白)的拮抗剂。
本发明优选针对整联蛋白受体的拮抗剂。整联蛋白(受体)拮抗剂可以是天然或合成的肽，非肽，肽模拟物(pepetidomimetica)，免疫球蛋白例如抗体或抗体的功能性片段，或免疫缀合物(融合蛋白)。
本发明优选的整联蛋白抑制剂为针对αv整联蛋白受体(例如，αvβ3，αvβ5，αvβ6和亚类)的抑制剂。优选的整联蛋白抑制剂为αv拮抗剂，尤其是αvβ3拮抗剂。本发明优选的αv拮抗剂是RGD肽、肽模拟物(非肽)拮抗剂和抗整联蛋白受体抗体如阻断αv受体的抗体。示例性非免疫性的αvβ3拮抗剂在US 5,753,230和US 5,766,591中有教导。优选的拮抗剂为含RGD的线性和环型肽。环肽通常更稳定且在血清中的半衰期更长。然而，本发明最优选的整联蛋白拮抗剂是环(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)(EMD121974，Cilengitide，Merck KgaA，德国；EP 0770 622)，其可有效地阻断整联蛋白受体αvβ3、αvβ1、αvβ6、αvβ8、αnbβ3。
科技文献和专利文献中均描述过αvβ3/αvβ5/αvβ6整联蛋白受体的适宜肽类拮抗剂及肽模拟(非肽)拮抗剂。例如，可参见Hoekstra和Poulter，1998，Curr.Med.Chem.5，195；WO 95/32710；WO 95/37655；WO97/01540；WO 97/37655；WO 97/45137；WO 97/41844；WO 98/08840；WO 98/18460；WO 98/18461；WO 98/25892；WO 98/31359；WO 98/30542；WO 99/15506；WO 99/15507；WO 99/31061；WO 00/06169；EP 0853 084；EP 0854140；EP 0854145；US 5,780,426；和US 6,048,861。公开了也适用于本发明的苯并氮杂唑及相关的苯并二氮杂唑和苯并环庚烯αvβ3整联蛋白受体拮抗剂的专利包括WO 96/00574，WO 96/00730，WO 96/06087，WO96/26190，WO 97/241 19，WO 97/24122，WO 97/24124，WO 98/15278，WO 99/05107，WO 99/06049，WO 99/15170，WO 99/15178，WO 97/34865，WO 97/01540，WO 98/30542，WO 99/11626和WO 99/15508。在WO98/08840；WO 99/30709；WO 99/30713；WO 99/31099；WO 00/09503；US 5,919,792；US 5,925,655；US 5,981,546；和US 6,017,926中描述了具有主链构象环约束特征的其他整联蛋白受体拮抗剂。在US 6,048，861和WO00/72801中公开了一系列的壬酸衍生物，它们是有效的αvβ3整联蛋白受体拮抗剂。WO 00/38665中公开了其他化学小分子整联蛋白拮抗剂(多数为玻连蛋白拮抗剂)。其它αvβ3受体拮抗剂已被证实可有效地抑制血管生成。例如，合成的受体拮抗剂如(S)-10，11-二氢-3-[3-(吡啶-2-基氨基)-1-丙氧基]-5H-二苯并[a，d1环庚烯-10-乙酸(命名为SB-265123)已经在很多哺乳动物模型系统中实验过。(Keenan等，1998，Bioorg.Med.Chem.Lett.8(22)，3171；Ward等，1999，Drug Metab.Dispos.27(11)，1232)。适用作拮抗剂的整联蛋白拮抗剂的甄选实验在如Smith等，1990，J.Biol.Chem.265，12267中以及参考专利文献中有描述。
抗整联蛋白受体的抗体也是众所周知的。可对适宜的抗整联蛋白(如αvβ3，αvβ5，αvβ6)的单克隆抗体进行修饰，以包括其抗原结合片段(包括F(ab)2，Fab和工程化的Fv或单链抗体)。针对整联蛋白受体αvβ3的一个合适的且优选使用的单克隆抗体被鉴定为LM609(Brooks等，1994，Cell 79，1157；ATCC HB 9537)。在WO 97/45447中公开了一个强特异性抗αvβ5抗体，P1 F6，其也优选用于本发明。另一合适的αvβ6选择性抗体是选择性针对整联蛋白受体的αv链的MAb 14D9.F8(WO 99/37683，DSM ACC2331，Merck KGaA，德国)以及MAb 17.E6(EP 0719 859，DSM ACC2160，Merck KGaA)。另一个适宜的抗整联蛋白抗体是已上市的Vitraxin。
如此处所用的，术语“抗激素剂”包括天然或合成的有机或肽化合物，其作用是调节或抑制激素对肿瘤的作用。更具体地来说，“抗激素剂”(1)抑制血清雄激素的产生，(2)阻断血清雄激素与雄激素受体的结合，或者(3)抑制睾酮转化为DHT，或两种或多种所述化合物的联合。本发明的抗激素剂一般包括类固醇受体拮抗剂，更具体来说抗雌激素剂，如包括他莫昔芬，雷洛昔芬，芳香酶抑制4(5)-咪唑，4-羟基他莫昔芬，氢萘吡苯酮，keoxifene，LY117018，奥那斯酮和托瑞米芬(toremifene)(Fareston)；以及抗雄激素剂，如氟他胺(flutamide)，尼鲁他胺(nilutamide)，比卡鲁胺，亮丙瑞林(leuprolide)和性瑞林(goserelin)；以及上述任一种的药学可接受的盐、酸或衍生物。该术语还包括糖蛋白激素-如促卵泡成熟激素(FSH)，促甲状腺素(TSH)和黄体生成素(LH)和LHRH(黄体生成激素释放激素)的激动剂和/或拮抗剂。可用于本发明的LHRH激动剂是醋酸性瑞林，其商品名称为ZOLADEX(Zeneca)。适用的LHRH拮抗剂的另一实例是GANIRELIX(Roche/Akzo Nobel)。类固醇抗雄激素剂的实例是醋酸环丙孕酮(CPA)和醋酸甲地孕酮，其商品为MEGACE(Bristol-Myers，Oneology)。类固醇抗雄激素剂可阻断前列腺雄激素受体。它们还可抑制LH的释放。优选给人类患者施用的CPA剂量为100mg/天-250mg/天。非类固醇抗雄激素阻断雄激素受体。它们也可引起血清LH水平和血清睾酮水平的增加。优选的非类固醇抗雄激素剂是氟他胺(2-甲基-N-[4-20硝基-3-(三氟甲基)苯基丙酰胺]，其商品名为EULEXIN(Schering Corp.)。氟他胺发挥的是抗雄激素作用，其抑制雄激素摄取，抑制靶组织中雄激素的核结合或两者兼而有之。另一个非类固醇抗雄激素剂是尼鲁他胺，其化学名称为5，5-二甲基-3-[4-硝基-3-(三氟甲基-4’-硝基苯基)-4，4-二甲基-咪唑烷-二酮。在本发明的一些实施方案中，抗激素剂是LHRH激动剂如醋酸亮丙瑞林和抗雄激素剂如氟他胺或尼鲁他胺的联合。如，可通过皮下注射、肌肉注射或静脉注射施用醋酸亮丙瑞林，并同时可以口服氟他胺。本发明的抗激素剂包括，如上述，类固醇/甲状腺激素受体的拮抗剂，其中包括了其它非许可(non-permissive)的受体-如RAR，TR，VDR等的拮抗剂。本领域技术人员可很容易地理解，多种合成的和天然的视黄酸受体(RAR)拮抗剂可根据本发明而进行使用。
概括而言，根据本发明的药物组合物和试剂盒可以优选包括以下药物组合：
(i)针对EGF受体的不同表位的两种不同的单克隆抗体(MAb)，其片段或免疫缀合物(优选免疫细胞因子)。
(ii)各自针对EGF受体的不同表位的MAb 425和MAb 225或其片段或免疫缀合物(优选免疫细胞因子)。
(iii)各自针对EGF受体的不同表位的人源化MAb 425和嵌合225或其片段或免疫缀合物(优选免疫细胞因子)。
(iv)(i)-(iii)联合一种或多种细胞毒性剂。
(v)(i)-(iii)，尤其是鼠、嵌合或鼠型MAb 425和MAb 225或其片段或免疫缀合物(优选免疫细胞因子)，联合一种或多种化疗剂，优选顺铂、吉西他滨或紫杉醇。
(vi)(i)-(iii)，尤其是鼠、嵌合或鼠型MAb 425和MAb 225或其片段或免疫缀合物(优选免疫细胞因子)，联合其它ErbB拮抗剂。
(vii)(i)-(iii)，尤其是鼠、嵌合或鼠型MAb 425和MAb 225或其片段或免疫缀合物(优选免疫细胞因子)，联合针对ErbB-2(优选Herceptin)或ErbB-3、ErbB-4的抗体。
(viii)(i)-(iii)，尤其是鼠、嵌合或鼠型MAb 425和MAb 225或其片段或免疫缀合物(优选免疫细胞因子)，联合选自以下的药物：
.酪氨酸激酶抑制剂，诸如Iressa；
.抗血管生成剂，优选整联蛋白抑制剂，更优选RGD肽，包括环肽，诸如环-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)(Cilengitide，MerckKGaA)；
.抗VEGF受体抗体，诸如DC-101，或VEGF拮抗剂；
.COX-II抑制剂；
.细胞因子，诸如TNF-α，IFN-α，IFN-β，IFN-γ，IL-2；
.I型蛋白激酶A(PKAI)抑制剂，诸如混合的主链反义寡核苷酸，如HYB 165(参见，例如，Tortora等，1999，Clin.Cancer Res.，875-881)；
.抗激素剂，诸如性瑞林，boserelin，亮丙瑞林，他莫昔芬。
术语“癌”和“肿瘤”是指或描述的是典型特征为无调控细胞生长的哺乳动物生理疾病。通过施用本发明的药物组合物可以治疗肿瘤，诸如乳腺，心脏，肺，小肠，结肠，脾，肾，膀胱，头颈，卵巢，前列腺，脑，胰腺，皮肤，骨，骨髓，血液，胸腺，子宫，睾丸，子宫颈和肝的肿瘤。更具体地，肿瘤选自：腺瘤，血管肉瘤，星形细胞瘤，上皮癌，生殖细胞瘤，成胶质细胞瘤，神经胶质瘤，错构瘤，血管内皮瘤，血管肉瘤，血肿，肝胚细胞瘤，白血病，淋巴瘤，成神经管细胞瘤，黑素瘤，成神经细胞瘤，骨肉瘤，成视网膜细胞瘤，横纹肌肉瘤，肉瘤和畸胎瘤。具体而言，肿瘤选自：肢端色斑样黑素瘤，光化性角化病，腺癌，囊腺癌，腺瘤，腺肉瘤，腺鳞癌，星形细胞瘤，前庭大腺癌，基底细胞癌，支气管腺癌，毛细血管瘤、癌、癌肉瘤，海绵状胆管癌，软骨肉瘤，脉络丝乳头状瘤/癌，透明细胞癌，囊腺瘤，内胚窦瘤，子宫内膜增生，子宫内膜间质肉瘤，子宫内膜腺癌，室管膜肉瘤，上皮样肉瘤，尤因肉瘤，纤维板层样癌，局灶性结节性增生，胃泌素瘤，生殖细胞瘤，成神经胶质细胞瘤，胰升糖素瘤，成血管细胞瘤，血管内皮瘤，血管瘤，肝腺瘤，肝腺瘤病，肝细胞癌，胰岛素瘤，上皮内瘤形成，上皮间鳞状细胞癌，侵袭性鳞状细胞癌，大细胞癌，平滑肌肉瘤，恶性着色斑型黑素瘤，恶性黑素瘤，恶性间皮瘤，成神经管细胞瘤，髓上皮瘤，黑素瘤，脑膜肿瘤，间皮肿瘤，转移性肿瘤，粘液上皮癌，成神经细胞瘤，神经上皮腺癌，结节性黑色素瘤，燕麦细胞癌，少突神经胶质瘤，骨肉瘤，胰腺多肽，乳头状浆液性腺癌，松果体细胞瘤，垂体瘤，浆细胞瘤，假肉瘤，肺母细胞瘤，肾细胞瘤，成视网膜细胞癌，横纹肌肉瘤，肉瘤，浆液性癌，小细胞癌，软组织癌，抑生长素分泌细胞肿瘤，鳞癌，鳞状细胞癌，间皮下、表浅蔓延型黑素瘤，未分化的癌，眼色素层黑色素瘤，疣状癌，血管活性肠多肽瘤，充分分化的癌，和肾母细胞瘤。
优选可用根据本发明的抗体分子治疗的肿瘤是大量表达ErbB受体，尤其是ErbB1受体的实体肿瘤或肿瘤转移，诸如乳癌，前列腺癌，头颈癌，SCLC，胰腺癌。
术语“生物学上/功能上有效的”或“治疗上有效的(量)”是指这样的药物/分子，其能导致体内或体外的生物学功能或生物学功能的改变，以及在哺乳动物，优选在人类中能以特定量有效治疗疾病或病症。对癌症而言，药物的治疗有效量可减少癌细胞的数量；降低肿瘤的大小；抑制(即，一定程度地减缓并优选终止)癌细胞浸润到周围器官中；抑制(即，一定程度地减缓并优选终止)肿瘤的转移；在一定程度上抑制肿瘤的生长；和/或一定程度地减轻癌症相关的一种或多种症状。如果药物可以阻止已存在癌细胞的生长且/或杀死已存在的癌细胞，则该药物可能具有细胞抑制性和/或细胞毒性。对于癌症的治疗，疗效可以例如通过估计疾病进展时间(TTP)和/或测定反应率(RR)来确定。
术语“免疫治疗上有效的”是指引起哺乳动物免疫反应的生物分子。更具体地，此术语是指可以识别和结合抗原的分子。典型地，抗体、含有其抗原结合位点(互补决定区，CDR)的抗体片断和抗体融合蛋白是免疫治疗上有效的。
“放射性疗法”：根据本发明，肿瘤还可以利用放射线或放射药物进行治疗。放射源既可以位于要治疗的患者体外也可以位于体内。如果放射源位于患者体外，该治疗方法称作体外照射放疗(EBRT)。如果放射源位于患者体内，此治疗称为近距放射疗法(BT)。已经使用的一些典型的放射性原子包括镭，铯-137，和铱-192，镅-241和金-198，钴-57；铜-67；锝-99；碘-123；碘-131；以及铟-111。也可以用放射性同位素标记本发明药剂。当前放射性疗法是控制不能切除的或不宜手术的肿瘤和/或肿瘤转移的标准治疗方法。已经发现联合放射性疗法和化疗可提高疗效。放射性疗法依据的原理是投射到靶区的高剂量辐射将导致肿瘤和正常组织中的增殖细胞的死亡。辐射剂量方案一般根据辐射吸收剂量(rad)，时间和分段进行确定，并且必须由肿瘤专家进行仔细确定。患者接受的辐射量将取决于各种因素，但两个最重要的因素是肿瘤相对身体其它重要结构或器官的位置，以及肿瘤扩散的程度。对患者实施放射性疗法的一个优选疗程是治疗期持续5-6个星期，将50-60Gy总剂量按照每星期5天每天1次1.8-2.0Gy的剂量给患者分段施用。Gy是戈瑞的缩写，是指100rad剂量。如果用本发明所述的抗ErbB抗体在放射方案背景下治疗肿瘤，通常可观察到积极的甚至是协同的作用。换句话说，所述化合物如果与放射和/或化疗剂组合，则对肿瘤生长的抑制作用将增强。根据本发明可任选地使用放射治疗。其在不能对患者施用有效量的根据本发明的药剂的情况下是推荐和优选的。
“药物治疗”：就步骤而言，本发明的方法包括多种实施形式。例如，本发明的药剂可以同时地、相继地或独立地使用。另外，药剂可分开施用，两次施用之间为约3周的时间间隔，即第二种药剂在第一种活性剂施用后基本上立即开始施用到第一种药剂施用后不超过约3周的时间开始施用。本方法可在手术之后进行。或者，手术可在施用第一种活性药剂和第二种活性药剂之间的间隔期内进行。此方法的实例是将本发明方法和外科肿瘤摘除手术联合应用。
根据本发明方法的治疗典型地包括以一个或多个施用周期施用本治疗组合物。例如，当进行同时施用的时候，含有2种药剂的治疗组合物在单个周期内施用大约2天到约3周。此后，治疗周期可根据执业医生的判断按需要进行重复。类似地，如果进行相继施用，则每种治疗剂施用的时间可调整到典型地覆盖同样的时间。两周期之间的间隔可从约0到2个月不等。
本发明的药剂可通过注射或随时间逐渐输注经肠胃外施用。体内待治疗的组织用全身施用的方法一般就可进行治疗，因此最经常使用的方法是静脉内给予治疗组合物，但是当目标组织可能含有靶分子的时候，其他组织和施用方法也是可考虑的。因此，本发明的药剂可经眼内，静脉内，腹膜内，肌内，皮下，腔内，经皮，通过常位注射和输注施用，而且还可以通过蠕动泵方式施用。例如，包括例如整联蛋白拮抗剂的本发明治疗组合物通常通过静脉方式，例如以单位剂量注射施用。
本发明的治疗组合物包含生理学可耐受的载体和溶解或分散于其中的作为活性成分的此处描述的相关药剂。
如此处所使用的，术语“药学上可接受的”指代表如下物质的组合物、载体、稀释剂和试剂，所述物质能施用于哺乳动物上而不会产生不期望的生理效应如恶心，眩晕，反胃等。其中溶解或分散了活性成分的药物组合物的制备是本领域技术人员所熟知的，故无须在制剂的基础上进行限定。典型地，这种组合物可制成注射剂如液体溶液或悬液，但是，也可制成适于在使用前在液体中形成溶液或混悬液的固体形式。制剂也可进行乳化。可将活性成分和其量适用于此处描述的治疗方法的药学上可接受的并与活性成分兼容的赋形剂混合。
适当的赋形剂是，例如，水，盐水，葡萄糖，甘油，乙醇等以及这些的组合。另外，如果需要的话，组合物还可以包括小量的可增加活性成分效用的辅助物质如润湿剂或乳化剂，pH缓冲剂等。本发明治疗组合物可包括其中的成分的药学上可接受的盐。药学上可接受的盐包括酸加成盐(和多肽的游离氨基基团成盐)，所述酸是无机酸，例如，盐酸或磷酸，或如乙酸，酒石酸，苦杏仁酸等有机酸。也可从无机碱，例如，钠，钾，铵，钙或铁的氢氧化物，以及有机碱如异丙胺，三甲基胺，2-乙氨基乙醇，组氨酸，普鲁卡因等，得到与游离羧基基团形成的盐。在环肽αv拮抗剂制剂中特别优选使用HCl盐。生理学上可耐受的载体是本领域的技术人员所熟知的。液相载体的例子为无菌水性溶液，其可以仅含有活性组分和水或可以还含有缓冲剂例如在生理pH值的磷酸钠、生理盐水或两者，如磷酸缓冲盐水。
此外，含水载体可以含有一种以上的缓冲盐以及诸如氯化钠和氯化钾等盐，葡萄糖，聚乙二醇和其他溶质。液体组合物也可含有有水或无水的液相。这类其他液相的例子有甘油，植物油如棉籽油和水油乳液。
典型地，例如，对于形式为ErbB(ErbB1)受体阻断抗体、整联蛋白受体阻断抗体或抗体片段或抗体缀合物或抗VEGF受体阻断抗体、片断或缀合物的免疫治疗剂，治疗有效量是在生理可耐受的组合物中施用时，足以使血浆浓度达到约0.01微克(μg)每毫升(ml)至约100μg/ml，优选约1μg/ml至约5μg/ml，通常约5μg/ml的量。换言之，在一日或多日的每日一次或多次的施用中，剂量可在约0.1mg/kg至约300mg/kg，优选约0.2mg/kg至约200mg/kg，最优选约0.5mg/kg至约20mg/kg之间变化。当免疫治疗剂是单克隆抗体的片段或缀合物形式时，其用量可很容易地根据片段/缀合物的质量相对于整个抗体的质量的比例进行调整。优选的血浆摩尔浓度为约2微摩尔(μM)至约5毫摩尔(mM)，优选约100μM至1mM抗体拮抗剂。
对于属于非免疫治疗性肽或蛋白质多肽或其他类似大小的生物分子的本发明药剂，其治疗有效的量典型地为这样的多肽量，即在生理可耐受的组合物中施用时足以使血浆浓度达到约0.1微克(μg)每毫升(ml)至约200μg/ml，优选约1μg/ml至约150μg/ml的量。根据每摩尔有约500克质量的多肽来计算，优选的血浆摩尔浓度为约2微摩尔(μM)到约5毫摩尔(mM)，优选约100μM至1mM多肽拮抗剂。
对于优选为本发明的化学细胞毒性剂或化疗剂(既不是免疫治疗剂，也不是非免疫治疗性肽/蛋白)的活性剂，其典型剂量为每公斤体重每天10mg至1000mg，优选约20至200mg，更优选的是50至100mg。
本发明的“药物组合物”可包含能降低或避免伴随本发明联合疗法出现的副反应的药剂(“辅助疗法”)，其包括但不限于，如降低抗癌药物毒性作用的药剂，例如骨重吸收抑制剂，心脏保护药物。所述的辅助药剂可以防止或降低化疗，放射治疗或手术带来的恶心和呕吐的发生率，或降低施用骨髓抑制性抗癌药物带来的感染机率。辅助药剂是本领域内的技术人员所熟知的。此外，本发明的免疫治疗剂还可以和佐剂如BCG和免疫系统刺激剂一起使用。而且，组合物可包括含有具有细胞毒性作用的放射性标记同位素或其他细胞毒性剂如细胞毒性肽(例如细胞因子)或细胞毒性药物等的免疫治疗剂或化疗剂。
术语用于治疗肿瘤或肿瘤转移的“药物试剂盒”，是指一种包装以及通常地，药剂在肿瘤和肿瘤转移治疗方法中的使用说明书。本发明试剂盒中的药剂一般被配制成本处所描述的治疗组合物，因此可以采用任何适于试剂盒内放置的形式。这些形式可以包括液体，粉末，片剂，混悬液等，以便提供本发明的药物分子，优选抗ErbB1抗体。这些药剂可以在适合于根据本发明方法单独施用的各单独容器中提供，或可以在此包装中的单一容器内结合在组合物中提供。包装中可含有足以按照此处描述的治疗方法施用一次或多次的药剂量。本发明试剂盒还包括包装中所含材料的“使用说明”。
附图简述
图1显示利用流式细胞仪检测到的MAb 425(EMD 72000)和c225(Cetuximab)单独和联合时与不同癌细胞(A431，SK-OV3，HCT 116，MiaPaca-2，KYSE-30，KYSE-70)的结合。
图2显示依赖于抗体(MAb 425、MAb 225，或二者的混合物)浓度的效应子-靶细胞聚集。
图3显示MAb 425、MAb 225，或二者的混合物对EGF与A431肿瘤细胞结合的抑制。
图4显示MAb 425、MAb 225，或二者的混合物对A431癌细胞上结合的EGF的置换。
图5显示人源化MAb 425(EMD 72000)和嵌合MAb 225的混合物对A431细胞上EGF受体的下调。
实施例
实施例1：
通过联合两种具有不同表位特异性的EGFR阻断性抗体(Cetuximab，EMD 72 000)增加了结合在每细胞上的抗体。
将源自阴门表皮样癌(A431)，卵巢腺癌(SK-OV-3)，结肠癌(HCT116)，胰腺癌(MiaPaca-2)和食管癌(KYSE-30，KYSE-70)的、表达不同EGFR水平的六种EGFR阳性人类肿瘤细胞系在冰上分别与10μg/mlCetuximab或EMD 72 000，或与最终含有2.5μg/ml Cetuximab和2.5μg/mlEMD 72 000(总Mab浓度：5μg/ml)的混合物孵育15分钟。然后洗涤细胞，将其在冰上与作为第二步骤试剂的20μg/ml FITC标记的山羊抗人IgG+IgM(H+L)-F(ab′)2再孵育15分钟。洗涤后，用流式细胞仪(FACScan，Becton Dickinson)分析细胞的荧光强度，该强度大致相当于每一细胞所结合的抗体的量。
如显示出的，与用于抗体混合物的减少的染色浓度无关，用该混合物染色的细胞的荧光强度在所有情况下均高于仅用较高浓度的两种抗体之一染色的细胞的荧光强度(图1)。
实施例2：
效应子-靶细胞聚集是抗体依赖性细胞介导的细胞毒性反应的先决条件以及通过联合具有针对人EGFR的不同表位的特异性的两种抗体(Cetuximab和EMD 72 000)对其进行改进。
在该模型试验中，将EGFR阳性A431细胞用作靶细胞。将EGFR阴性的，Fc-γ受体(CD64(FcγRI)和CD32(FcγRII))阳性的U937组织细胞性淋巴瘤细胞用于模拟效应细胞。用绿色PKH2对A431细胞进行荧光标记，用红色PKH26对U937细胞进行荧光标记。然后按照效应子-靶细胞比率3∶1将两种细胞系混合，将其在冰上分别与Cetuximab和EMD72 000的系列稀释液(终浓度：4.74-0.0015μg/ml＝3.16×10-8-1×10-11M，对全部抗体均以MW为150kDa计)，或与具有半数总免疫球蛋白浓度(2.37-0.00075μg/ml＝1.58×10-8-5×10-12M；该混合物中的各Mabs的浓度为该浓度的1/2)的两种抗体的混合物的系列稀释液孵育15分钟。在50×g，4℃离心5分钟后，在不破坏沉淀物的情况下，将细胞在冰上再孵育60分钟。最后将沉淀物小心地再悬浮，采用FACScan仪器，通过流式细胞计测定聚集物的比例。
如图2所示，与仅与一种单一抗体进行孵育的细胞的所得结果相比，在与较低总蛋白质浓度的二种Mabs的混合物孵育的样品中聚集物的最大百分比增加。尽管与仅和一种Mabs孵育的样品相比，这些样品中的蛋白质浓度降低，但抗体混合物的滴定曲线的增加部分并未出现显著的移位。
实施例3：
针对EGFR配体-结合域的不同表位的两种抗体的混合物增强了对EGF与A431肿瘤细胞的结合的抑制。
将A431细胞与0.5μg/ml EMD72 000、Cetuximab或相同浓度的二种抗体的混合物在冰上预孵育15分钟。洗掉未结合的抗体后，将细胞与0.01、0.1、1或10μg/ml FITC标记的来自小鼠颌下腺的EGF(Molecular ProbesEurope，Leiden，The NetHERlands)在冰上再孵育15分钟，洗涤，并用流式细胞仪进行分析。
两种抗体均强烈地抑制EGF-FITC在所有浓度下的结合。但在所有情况下，二种抗体的混合物比单独任一种抗体均更为有效(图3)。
实施例4：
结合的EGF从A431细胞的EGFR上的置换。
将A431细胞与10μg/ml FITC标记的来自小鼠颌下腺的EGF(Molecular Probes Europe，Leiden，The NetHERlands)在冰上预孵育15分钟。
然后洗涤细胞，分别与10、1或0.1μg/ml EMD 72 000或Cetuximab或与二种抗体的2.5、0.25或0.025μg/ml混合物(总免疫球蛋白浓度：5、0.5或0.05μg/ml)孵育15分钟。然后洗涤细胞，用流式细胞仪分析结合的EGF-FITC。
作为单一药剂时两种抗体以浓度依赖性的方式从A431细胞的EGFR上置换EGF。两种抗体的混合物，其仅包含四分之一抗体浓度(总免疫球蛋白的1/2)的各Mab，在有效置换FITC标记的配体方面与较高浓度的每种抗体相似。
实施例5：
A431细胞与Mabs孵育24小时后，具有至少两种针对不同受体表位的抗体的混合物导致EGFR下调，但一种单一抗体不能或仅少量地降低细胞表面EGFR水平。
将包含10％FCS(胎牛血清)的2.5ml培养基中的2×106 A431细胞接种在6-孔微量培养板的孔中。在培养物中加入终浓度为10μg/ml的抗体(Cetuximab，EMD 72 000)。使用两种抗体的混合物，每种抗体的终浓度为10μg/ml(混合物1)或5μg/ml(混合物2)，分别导致总抗体浓度为20和10μg/ml。然后在存在抗体的情况下，于37℃和10％CO2孵育细胞24小时。
然后通过胰蛋白酶/EDTA(0.05/0.02％)处理收集细胞，洗涤，与20μg/ml FITC标记的山羊抗人IgG+IgM(H+L)-F(ab′)2(作为用于检测表面结合的抗EGFR抗体的第二步骤试剂)，或者与用于检测游离、未占据的EMD 72 000结合位点的10μg/ml FTTC标记的MAb425(EMD72 000的鼠前期物质)在冰上孵育15分钟。最后，用流式细胞仪分析细胞。图5显示了EMD 72 000和其鼠前期物质MAb425竞争与其在EGFR上的表位结合，而预结合的EMD 72 000几乎完全抑制了MAb425-FITC的结合。与之相反，与未处理的对照细胞相比，预结合的Cetuximab仅最小程度地抑制MAb425-FITC的结合。这清楚地显示了两种抗体与EGFR的不同表位结合。此外，该图显示出在细胞孵育24小时后，在抗体混合物的两种浓度下，用于检测表面结合的抗体的FITC标记的第二步骤试剂的荧光强度明显降低。
这表明，与仅用抗体之一进行培养的细胞相比，用抗体混合物处理的细胞的表面EGFR水平明显降低。
因此，由MAb的混合物形成的较大受体-抗体复合物似乎与仅由借助一个抗体分子交联后的两个受体组成的小受体-抗体复合物采用不同的机制被内在化和/或加工。

Claims (29)

1.药物组合物，其包含能够与位于相同或不同ErbB受体分子类型上的不同表位结合的第一和第二抗体分子或其部分，其中所述第一抗体分子或其部分包含与ErbB1受体分子类型上的第一特异性表位结合的结合位点，而所述第二抗体分子包含与相同ErbB1受体分子类型上的第二特异性表位结合的结合位点。
2.根据权利要求1或2的药物组合物，其中至少ErbB1受体分子类型上的所述第一或所述第二表位位于ErbB1受体结合域内。
3.根据权利要求1的药物组合物，其中ErbB1受体分子类型上的所述第一和所述第二表位位于ErbB1受体结合域内。
4.根据权利要求2或3的药物组合物，其中所述受体结合域是所述ErbB1受体分子类型的天然配体的结合域。
5.根据权利要求2或3的药物组合物，其中第一和第二抗体，或其片段，与所述ErbB1受体分子类型的天然配体的结合域内的不同表位结合。
6.根据权利要求5的药物组合物，其中与包含仅和所述ErbB1受体分子类型上所述第一或所述第二表位结合的单一抗体分子的组合物相比，所述药物组合物增强对ErbB受体的阻断和/或抑制以及对ErbB受体-特异性信号通路下调的诱导。
7.根据权利要求1-6任一项的药物组合物，其中与包含仅和所述ErbB1受体分子类型上所述第一或所述第二表位结合的单一抗体分子的组合物相比，所述药物组合物增强了对具有相同或不同特异性的ErbB受体分子的交联和/或二聚化的诱导。
8.根据权利要求7的药物组合物，其中所述ErbB受体分子参与交联和/或二聚化，且选自ErbB1和ErbB2(Her-2)。
9.根据权利要求1-8任一项的药物组合物，其中所述第一和/或所述第二抗体是单特异性抗体。
10.根据权利要求1-9任一项的药物组合物，其中第一抗体是鼠的、嵌合的或人源化的MAb 425。
11.根据权利要求1-9任一项的药物组合物，其中第二抗体是鼠的、嵌合的或人源化的MAb 225。
12.根据权利要求10或11的药物组合物，其中所述第一抗体是人源化MAb 425(h425)而所述第二抗体是嵌合MAb 225(c225)。
13.根据权利要求1-12任一项的药物组合物，其还包含细胞毒性剂。
14.根据权利要求13的药物组合物，其中所述细胞毒性剂是化疗剂。
15.根据权利要求14的药物组合物，其中所述化疗剂选自：顺铂、阿霉素、吉西他滨、多西他赛、紫杉醇、博来霉素。
16.根据权利要求15的药物组合物，其中所述细胞毒性剂是ErbB受体抑制剂、VEGF受体抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、蛋白激酶A抑制剂、抗血管生成剂，或细胞因子。
17.根据权利要求1-12任一项的药物组合物，其中所述第一和/或所述第二抗体分子是免疫缀合物，其中抗体部分经其C末端，任选地借助接头肽与生物学上有效的肽、多肽或蛋白质融合。
18.根据权利要求17的药物组合物，其中蛋白质是细胞因子。
19.一种药物试剂盒，其包含
(i)第一包装，其包含含有与ErbB1受体分子上存在的第一特异性表位结合的结合位点的第一抗体分子或其部分，和
(ii)第二包装，其包含含有与相同ErbB1受体分子类型上的第二不同特异性表位结合的结合位点的第二抗体分子。
20.根据权利要求19的药物试剂盒，其中至少ErbB1受体上的所述第一或所述第二表位位于ErbB1受体结合域内。
21.根据权利要求19的药物试剂盒，其中ErbB1受体上的所述第一和所述第二表位位于ErbB1受体结合域内。
22.根据权利要求19-21任一项的药物试剂盒，其中至少一种所述分子与ErbB1受体的天然配体所结合的受体结合域内的表位相结合。
23.根据权利要求19-22任一项的药物试剂盒，其中所述第一抗体分子是鼠的、嵌合的或人源化的单克隆抗体425，而所述第二分子是鼠的、嵌合的或人源化的单克隆抗体225。
24.根据权利要求23的药物试剂盒，其包含第一包装和第二包装，第一包装包含人源化MAb 425(h425)，第二包装包含嵌合MAb 225(c225)。
25.根据权利要求19-24任一项的药物试剂盒，其还包含第三包装，该包装包含细胞毒性剂。
26.根据权利要求25的药物试剂盒，其中所述细胞毒性剂是化疗剂。
27.根据权利要求26的药物试剂盒，其中所述化疗剂选自：顺铂、阿霉素、吉西他滨、多西他赛、紫杉醇、博来霉素。
28.根据权利要求26的药物试剂盒，其中所述细胞毒性剂是ErbB受体抑制剂、VEGF受体抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、蛋白激酶A抑制剂、抗血管生成剂，或细胞因子。
29.如权利要求1-28任一项所述的药物组合物或药物试剂盒在制备用于治疗肿瘤或肿瘤相关疾病的药物中的用途。
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