CN1798765A - 多价淋巴毒素β受体激动剂及其治疗用途 - Google Patents
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Abstract
公开了人淋巴毒素β受体特异性的多价抗体构建体，以及它们在受试者中治疗癌症和抑制肿瘤体积中的用途。
Description
相关申请
本申请要求2002年12月20日申请的美国临时申请60/435154的优先权。本申请也与2002年12月20日申请的美国临时申请60/435185相关。因此这些专利和专利申请的全部内容并入这里作为参考。
发明领域
本发明属于免疫学和癌症诊断与治疗领域。更特别地，它涉及多价淋巴毒素β受体(LT-β-R)激动剂抗体构建体的制备以及在治疗方法中与化疗剂相组合的用途。
背景
淋巴毒素β受体(LT-β-R)是肿瘤坏死因子家族的成员，它在免疫系统的发展以及免疫系统内很多细胞(包括滤泡树突细胞和很多基质细胞类型)的功能性维持中都具有公认的作用(Matsumoto等，1996Immunol.Rev.156：137)。LT-β-R的已知配体包括LTα1/β2和被称作LIGHT的第二配体(Mauri等，1998 Immunity 8：21)。已经发现可溶配体或激动性抗受体单克隆抗体对LT-β-R的活化会诱导某些癌的死亡(Browning，J.L.等(1996)J.Exp.Med.183：867-878和美国专利6,312,691)。
本发明提供了多价LT-β-R激动剂及其治疗用途。
发明概述
在一个方面，本发明提供了作为人淋巴毒素β受体(LT-β-R)激动剂的多价抗体构建体。在一个实施方案中，多价抗体构建体包含LT-β-R表位特异性的至少一个抗原识别位点。在某些实施方案中，至少一个抗原识别位点位于scFv结构域，而在其它实施方案中，所有抗原识别位点都位于scFv结构域。
本发明提供了包含淋巴毒素β受体(LT-β-R)表位特异性的至少一个抗原识别位点的多价抗体。在一个实施方案中，至少一个抗原识别位点位于scFv结构域内。在另一个实施方案中，所有抗原识别位点都位于scFv结构域内。在又一个实施方案中，该抗体构建体是单特异性的，包括例如CBE11结合的表位。在又一个实施方案中，本发明的多价抗体是四价的。仍在另一个实施方案中，该抗体构建体是BHA10表位特异性的。仍在另一个实施方案中，该抗体构建体是双特异性的。在一个实施方案中，该抗体构建体具有两个CBE11特异性抗原识别位点和两个BHA10特异性识别位点。
抗体构建体可以是二价的、三价的、四价的或五价的。在某些实施方案中，该抗体构建体是单特异性的。在一个实施方案中，该抗体构建体是CBE11结合的表位特异性的，并且在一些实施方案中，它是四价的。在另一个实施方案中，该抗体构建体是BHA10结合的表位特异性的，并且在一些实施方案中，它是四价的。在某些实施方案中，至少一个抗原识别位点位于scFv结构域内。在某些实施方案中，所有抗原识别位点都位于scFv结构域内。其它抗体构建体可以是人LT-β受体上不同表位多特异性的。在某些实施方案中，该抗体构建体是双特异性的。在其它实施方案中，该抗体构建体对BKA11、CDH10、BCG6、AGH1、BDA8、CBE11和BHA10组成的淋巴毒素β受体(LT-β-R)表位组中的至少两个成员是特异性的。在一个实施方案中，该抗体构建体是CBE11和BHA10结合的表位特异性的，并且在某些实施方案中，它是四价的。在一个实施方案中，该抗体构建体具有两个CBE11特异性抗原识别位点和两个BHA10特异性识别位点。在任何多特异性抗体构建体中，至少一个抗原识别位点可以位于scFv结构域，并且在某些实施方案中，所有抗原识别位点都位于scFv结构域。
本发明进一步提供了包含SEQ ID NOs：1-10的抗体构建体，以及编码它们的核酸和载体，包含该核酸和载体的宿主细胞。
在另一个方面，本发明提供了包含该主题抗体构建体和药物可接受载体的药物组合物。在某些实施方案中，该药物组合物可以进一步包含有效量的化疗剂，其中所述组合物给受试者的施用导致肿瘤的超累加抑制。在另一个方面，本发明提供了含有或能够装载有效量的主题多价抗体构建体和药物可接受载体的药物递送装置。在某些实施方案中，该药物递送装置进一步含有或能够装载有效量的化疗剂，其中用所述装置施用该构建体和该试剂会导致肿瘤的超累加抑制。
在另一个方面，本发明提供了治疗受试者癌症的方法，包括给该受试者施用有效量的主题抗体构建体。在某些实施方案中，该受试者是人。本发明还提供了抑制受试者的肿瘤体积的方法，包括给该受试者施用有效量的主题抗体构建体的步骤。在某些实施方案中，抑制肿瘤体积的方法包括给该受试者施用有效量的主题抗体构建体和化疗剂，其中所述构建体和所述试剂的施用会导致肿瘤的超累加抑制。
本发明进一步提供了包括主题药物组合物或药物递送装置，和任选它们的使用说明书的试剂盒。这种试剂盒的用途包括例如治疗应用。在某些实施方案中，任何试剂盒中含有的主题组合物已经被冻干并且使用前需要再水化。
在一个实施方案中，包含本发明多价抗体的药物组合物进一步包含有效量的化疗剂，其中所述组合物的施用导致肿瘤的超累加抑制。本发明还描述了包含有效量的本发明多价抗体构建体和药物可接受载体的药物组合物。在一个实施方案中，该药物组合物进一步包含有效量的化疗剂，其中所述组合物的施用导致肿瘤的超累加抑制。
本发明包括含有或能够装载有效量的本发明多价抗体构建体以及药物可接受载体的药物递送装置。在一个实施方案中，该药物递送装置进一步含有或能够装载有效量的化疗剂，其中用所述装置施用所述构建体和所述试剂会导致肿瘤的超累加抑制。
本发明还包括治疗受试者癌症的试剂盒，其中含有包含本发明多价抗体的组合物。在一个实施方案中，该试剂盒还包括说明书。在另一个实施方案中，该试剂盒包含化疗剂。
本发明还描述了抑制受试者的肿瘤体积的方法，包括给所述受试者施用有效量的本发明多价抗体构建体的步骤。
由下列详细说明书和权利要求，本发明的其它特征和优点将很明显。
附图简述
图1A和1B分别显示了huCBE11/huBHA10双特异性-1抗体构建体的成熟重链的多核苷酸(SEQ ID NO：1)和推导的多肽序列(SEQ IDNO：2)。
图2显示了huCBE11/huBHA10双特异性-1抗体构建体的成熟轻链的多核苷酸(SEQ ID NO：3)和推导的多肽序列(SEQ ID NO：4)。
图3A和3B分别显示了成熟huCBE11/huBHA10双特异性-2抗体构建体的多核苷酸(SEQ ID NO：5)和推导的多肽序列(SEQ ID NO：6)。
图4A和4B分别显示了huCBE11单特异性-1抗体构建体的成熟重链的多核苷酸(SEQ ID NO：7)和推导的多肽序列(SEQ ID NO：8)。
图5A和5B分别显示了成熟huCBE11单特异性-2抗体构建体的多核苷酸(SEQ ID NO：9)和推导的多肽序列(SEQ ID NO：10)。
图6A和6B显示了双特异性抗体构建体的三级结构示意图，可变区用适当阴影区表示。图6A显示了双特异性-1和双特异性-2抗体的结构，其包含CBE11和BHA10抗原识别位点。图6B显示了包含CBE11抗原识别位点的单特异性-1和单特异性-2四价抗体的结构。
图7描绘了可以使用本发明方法制备的其它抗体构建体的三级结构示意图。
图8描绘了图，该图显示了HT29细胞的增殖作用对八种激动剂抗LT-β-R抗体的抗体浓度的函数，所述抗体包括huCBE11/huBHA10双特异性-1和双特异性-2抗体构建体(分别为实心圆形和实心正方形)、单特异性-1和单特异性-2抗体构建体(分别为实心三角形和实心菱形)、人源化抗体huCBE11(开放三角形)、人源化抗体huBHA10(开放正方形)、联合施用的人源化抗体huCBE11和huBHA10(开放菱形)和五聚化chuCBE11抗体(开放圆形)。
图9描绘了图，该图显示了WiDr人结肠腺癌肿瘤对双特异性-1的反应，通过测定在双特异性-1(三角形、开放正方形、开放和闭合的圆形)、载体(PBS对照、十字形)和紫杉酚(闭合正方形)以所示剂量植入后不同天数观察的肿瘤重量进行评估。箭头示出了每种剂量的第一次和最后一次给药。
图10用来自多个肿瘤抑制实验的数据描述了huCBE11和双特异性-1活性的回顾性比较。数据是基于肿瘤生长的抑制百分比而计算的，该百分比是在每一实验的第34或35天，使用下式(100-(100x(测试组平均数/安慰剂对照组平均数)))计算的。图上的每一数据点代表来自研究的一个实验测试组。
图11A和11B显示了包含五聚形式CBE11抗体的序列。图11A描述了成熟五聚嵌合CBE11重链的多核苷酸(SEQ ID NO：17)和推导的多肽序列(SEQ ID NO：18)。图11B描述了成熟嵌合CBE11轻链的多核苷酸(SEQ ID NO：19)和推导的多肽序列(SEQ ID NO：20)。
发明详述
1.定义
为了方便，在进一步描述本发明之前，在这里定义说明书、实施例和所附权利要求书中使用的某些术语。
单数形式包括所指项目的复数形式，上下文清楚地指出者除外。
术语“施用”包括将本发明化合物，包括但不限于药物组合物或治疗剂递送给受试者的系统或者受试者内或受试者上的特定部位的任何方法。这里使用的短语“全身施用”、“外周施用”意思是化合物、药物或其它物质不是直接施用到中枢神经系统，这样使得它进入患者的系统，从而经受新陈代谢及其它类似过程，例如皮下施用。“肠胃外施用”是指除了肠内和局部施用的施用方式，通常通过注射，包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、被膜下、蛛网腹下、脊柱内和胸骨内注射和输注。
这里使用的术语“抗体”意思是指完全的、完整的抗体，和Fab、Fab’、F(ab)2、Fv及其其它片段。完全的、完整的抗体包括例如单克隆抗体，如鼠单克隆抗体、嵌合抗体、抗个体基因型抗体、抗抗个体基因型抗体、和人源化抗体，以及其多价形式。术语“免疫球蛋白”或“抗体”(这里可互换使用)是指具有由两条重链和两条轻链组成的四条多肽链基础结构的抗原结合蛋白，所述链例如通过链间二硫键稳定，该抗原结合蛋白具有特异性结合抗原的能力。重链和轻链都折叠成结构域。术语“结构域”是指包含例如通过β-折叠片和/或链内二硫键稳定的肽环(如包含3至4个肽环)的重链或轻链多肽的球形区。基于在“恒定区”结构域的情况下各种类型成员结构域内相对缺少序列变异，或在“可变区”结构域的情况下各种类型成员结构域内的显著变异，结构域这里进一步称作“恒定区”或“可变区”。轻链上的“恒定区”结构域可互换地称作“轻链恒定区”、“轻链恒定结构域”，“CL”区或“CL”结构域。重链上的“可变区”结构域可互换地称作“重链恒定区”、“重链恒定结构域”，“CH”区或“CH”结构域。轻链上的“可变区”结构域可互换地称作“轻链可变区”、“轻链可变结构域”，“VL”区或“VL”结构域。重链上的“可变区”结构域可互换地称作“重链恒定区”、“重链恒定结构域”，“CH”区或“CH”结构域。
术语“区”是指抗体链的一部分，包括如这里定义的恒定或可变区，以及所述结构域的更离散部分。例如，轻链可变结构域或区包括散布于“构架区”或“FRs”之间的“互补决定区”或“CDRs”，如这里定义。
免疫球蛋白或抗体可以以单体或多聚形式存在。术语“抗原结合片段”是指免疫球蛋白或抗体的多肽片段结合抗原或与完整抗体(即与它们所来源的完整抗体)竞争抗原结合(即特异性结合)。术语“构象”是指蛋白或多肽(如抗体、抗体链、或其结构域或区)的三级结构。例如，短语“轻(或重)链构象”是指轻(或重)链可变区的三级结构，短语“抗体构象”或“抗体片段构象”是指抗体或其片段的三级结构。
结合片段通过重组DNA技术，或通过酶促或化学切割完整免疫球蛋白而产生。结合片段包括Fab、Fab′、F(ab′)2、Fabc、Fv、单链，和单链抗体。不同于“双特异性”或“双功能”免疫球蛋白或抗体，免疫球蛋白或抗体被理解为它们的每个结合位点是相同的。“双特异性”或“双功能抗体”是具有两条不同重/轻链对和两个不同结合位点的人工杂合抗体。可以用各种方法制备双特异性抗体，包括杂交瘤的融合或Fab′片段的连接。参见如Songsivilai & Lachmann，Clin.Exp.Immunol.79：315-321(1990)；Kostelny等J.Immunol.148，1547-1553(1992)。
术语“抗体构建体”是指一种重组分子，其中包含来自抗体的重链和轻链可变结构域的两个或更多抗原结合片段，并可以包含来自五类Ig(例如IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)中任何一种抗体的恒定区的全部或部分。例如，抗体构建体可以由重链C末端包含单链可变片段的抗体制成。在另一个实例中，抗体构建体可以由抗体两条重链的恒定区的全部或部分组成，该重链的羧基和氨基末端包含单链可变片段。图6用示意图描述了这些构建体中每一个的实例。在又一个实例中，抗体构建体可以包含具有两个或更多可变区的两条重链和具有一个或多个可变区的两条轻链，其中两条重链通过二硫键或其它共价键连接。在另一个实例中，抗体构建体可以包含含有两个或更多可变区的两条重链，其中两条重链通过二硫键或其它共价键连接。图7用示意图描述了这些构建体中每一个的实例。本发明的详细说明书和实施例中描述了本发明抗体构建体的其它实例。
这里使用的术语“抗原”意思是与特异性抗体有反应性的分子。
术语“抗原结合位点”或“抗原识别位点”是指特异性结合抗原上表位的抗体区域。
术语“癌症”或“瘤”通常是指任何恶性瘤或者自发的细胞生长或增生。本文中该术语包括充分发育的恶性瘤，以及恶变前损害。具有“癌症”的受试者例如可以具有肿瘤或白细胞增生如白血病。在某些实施方案中，具有癌症的受试者是具有肿瘤如实体瘤的受试者。癌症包括实体瘤，包括但不限于非小细胞肺癌(NSCLC)、睾丸癌、肺癌、卵巢癌、子宫癌、子宫颈癌、胰腺癌、结肠直肠癌(CRC)、乳腺癌，以及前列腺、胃、皮肤、胃、食管和膀胱癌。
术语“化疗剂”是指用于治疗由外来细胞或恶性细胞(如肿瘤细胞)引起的疾病的任何小分子或组合物。化疗剂的非限制性实例包括破坏DNA合成的药剂、作为拓扑异构酶I抑制剂的药剂、烷化剂或植物碱。术语“破坏DNA合成的药剂”是指能够减少或抑制DNA合成过程的任何分子或化合物。破坏DNA合成的药剂实例包括但不限于核苷类似物如嘧啶或嘌呤类似物，包括例如但不限于吉西他滨或蒽环霉素化合物，包括例如但不限于阿霉素、daunombicin、羟基柔红霉素和idambicin和表鬼臼毒素如依托泊苷和替尼泊苷。术语“拓扑异构酶I抑制剂”是指抑制或降低拓扑异构酶I的生物活性的分子或化合物。包括例如但不限于camptosar。术语“烷化剂”是指能够与(例如胺、醇类、酚、有机和无机酸类)的亲核基团反应并由此给另一分子如蛋白或核酸添加烷基(例如乙基或甲基)的任何分子或化合物。用作化疗剂的烷化剂实例包括白消安(bisulfan)、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、氮芥、苯丙氨酸氮芥、噻替派、各种亚硝基脲化合物和铂化合物如顺铂和卡铂。术语“植物碱”是指属于生物学上有活性和细胞毒性的、来源于植物的碱性含氮分子家族的化合物。植物碱的实例包括但不限于紫杉烷类(taxanes)如紫杉酚、多西他赛(docetaxel)和紫杉醇以及长春药类如长春碱、长春新碱和长春瑞宾。
术语“嵌合抗体”是指这样一种抗体，其轻链和重链基因典型地通过遗传工程由属于不同种类的免疫球蛋白基因片段构建而成。例如，来自小鼠单克隆抗体的基因的可变(V)区片段可以与人恒定(C)区片段连接，如IgG1和IgG4。优选人同种型IgG1。因此典型的嵌合抗体是由来自小鼠抗体的V或抗原结合结构域和来自人抗体的C或效应结构域组成的杂合蛋白。
术语“有效量”是指足以引起期望结果(包括但不限于例如在体外或体内减小肿瘤体积)的化合物、物质或包含本发明化合物的组合物的量。本发明药物组合物的有效量是足以引起期望临床结果(包括但不限于改善、稳定、预防或延迟患者的癌症发展)的药物组合物的量。在两种情况下，本发明化合物的有效量都可以以一次或多次给药而施用。这些上述指标的检测和测定是本领域技术人员已知的，包括但不限于例如肿瘤负荷的减少、肿瘤大小的抑制、继发性肿瘤增生减少、基因在肿瘤组织中表达、生物标记的存在、淋巴结的参与、组织学分级和核分级。
术语“表位”是指抗体或抗体构建体优先和特异性结合的抗原区域。单克隆抗体优先结合分子中的单一特异性表位，所述表位可以在分子学上确定。在本发明中，多特异性抗体可以识别多个表位。
术语“肿瘤体积的抑制”是指肿瘤体积的任何减小或降低。
术语“人源化免疫球蛋白”或“人源化抗体”是指包括至少一条人源化免疫球蛋白或抗体链(即至少一条人源化轻或重链)的免疫球蛋白或抗体。术语“人源化免疫球蛋白链”或“人源化抗体链”(即“人源化免疫球蛋白轻链”或“人源化免疫球蛋白重链”)是指具有可变区的免疫球蛋白或抗体链(即分别指轻或重链)，其中包括基本上来自人免疫球蛋白或抗体的可变构架区和基本上来自非人免疫球蛋白或抗体的互补决定区(CDRs)(如至少一个CDR，优选两个CDRs，更优选三个CDRs)，并进一步包括恒定区(例如在轻链的情况下，包括至少一个恒定区或其部分，在重链的情况下，优选包括三个恒定区)。术语“人源化可变区”(如“人源化轻链可变区”或“人源化重链可变区”)是指包括基本上来自人免疫球蛋白抗体的可变构架区和基本上来自非人免疫球蛋白或抗体的互补决定区(CDRs)的可变区。
术语“淋巴毒素β受体(LT-β-R)激动剂”是指可以加强配体与LT-β-R结合、细胞表面LT-β-R聚集和/或LT-β-R信号传导的任何试剂。
短语“多价抗体”或“多价抗体构建体”是指包含一个以上抗原识别位点的抗体或抗体构建体。例如，“二价”抗体构建体具有两个抗原识别位点，“四价”抗体构建体具有四个抗原识别位点。术语“单特异性”、“双特异性”、“三特异性”、“四特异性”等是指本发明的多价抗体构建体中存在的不同抗原识别位点特异性的数目(与抗原识别位点数不同)。例如，“单特异性”抗体构建体的抗原识别位点全部结合同一表位。“双特异性”抗体构建体具有至少一个结合第一表位的抗原识别位点和至少一个结合不同于第一表位的第二表位的抗原识别位点。“多价单特异性”抗体构建体具有全部结合同一表位的多个抗原识别位点。“多价双特异性”抗体构建体具有多个抗原识别位点，其中一些结合第一表位，另一些结合不同于第一表位的第二表位。术语“双特异性-1”(也称为“BS-1”)、″双特异性-2″(也称为“BS-2”)、“单特异性-1”(也称为“MS-1”)和“单特异性-2”(也称为“MS-2”)是指这里进一步描述的特定抗体构建体。在本发明的一个实施方案中，抗体是单特异性四价抗体，其中该抗体包含四个CBE11抗原识别位点，如图6B所示。
“患者”或“受试者”或“宿主”是指人或非人动物。
术语“药物递送装置”是指可以用来给受试者施用治疗剂或试剂的任何装置。药物递送装置的非限制性实例包括皮下注射器、多室注射器、支架、导管、经皮贴片、显微针、微型研磨器和可植入型控释装置。在一个实施方案中，术语“药物递送装置”是指能够在注射前混合两种化合物的双室注射器。
这里使用短语“药物可接受的”指在合理医学判断范围内适合用于接触人和动物组织，而无过多毒性、刺激、变态反应或者其它问题或并发症，与合理的益处/风险比率相称的那些化合物、物质、组合物，和/或剂型。
这里使用的短语“药物可接受载体”意思是参与将主题化合物从一个器官或身体部分运载或输送至另一个器官或身体部分的药物可接受的物质、组合物或载体，如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂或溶剂包封材料。每种载体在与该制剂的其它成分相容和对患者无害的意义上必须是“可接受的”。可以用作药物可接受载体的物质的一些实例包括：(1)糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；(4)粉化黄芪胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石粉；(8)赋形剂，如可可油和栓剂蜡；(9)油类，如花生油、棉子油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和豆油；(10)二醇，如丙二醇；(11)多元醇，如甘油、山梨糖醇、甘露醇和聚乙二醇；(12)酯，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)无热原水；(17)等渗盐水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)pH缓冲液；(21)聚酯、聚碳酸酯和/或聚酐；和(22)药物制剂中使用的其它无毒相容物质。
“药物可接受盐”是指化合物的相对无毒的无机和有机酸加成盐。
术语“Fv片段”是指包含重链和轻链可变结构域的抗体片段。术语“Fc片段”是指包含重链恒定结构域的抗体片段。
术语“单链可变片段或scFv”是指重链结构域和轻链结构域相连接的Fv片段。一个或多个scFv片段可以与其它抗体片段(如重链或轻链的恒定结构域)连接形成具有一个或多个抗原识别位点的抗体构建体。
术语“肿瘤的超累加抑制”是指肿瘤体积总的减小大于由于每一单独试剂造成的试剂组合的作用总和。在一个实施方案中，超累加抑制包括施用LT-β-R激动剂和不是LT-β-R激动剂的化疗剂组合所产生的平均肿瘤抑制，该抑制在统计学上显著高于单独施用LT-β-R激动剂或单独施用化疗剂产生的肿瘤抑制的总和。可以用如本发明详述部分所述的各种统计方法确定LT-β-R激动剂和化疗剂组合施用产生的肿瘤抑制是否“在统计学上显著高于”各化合物预期的累加值。
术语“协同的”是指比任何两个或更多单一试剂的累加效应更有效的组合。在本发明的一个实施方案中，术语“协同的”包括超累加抑制的组合类型，其中LT-β-R激动剂和化疗剂二者单独都具有抑制肿瘤体积的能力。术语“增强”是指两种或更多试剂的同时作用大于各试剂单独作用的总和的情况。在某一实施方案中，增强是指超累加抑制类型，其中LT-β-R激动剂或化疗剂中仅有一种单独具有抑制肿瘤体积的能力。
“治疗”受试者的癌症或“治疗”具有癌症的受试者是指使受试者接受药物治疗，如施用药物，从而降低或预防癌症程度。治疗包括(但不限于)施用组合物，如药物组合物，且可以预防性或在病理事件开始之后实施。
术语“肿瘤体积”是指肿瘤总的大小，它包括肿瘤本身加上所波及的淋巴结(如果适用时)。可以用本领域已知的各种方法测定肿瘤体积，例如通过使用测径器、记算机断层(CT)或磁共振成象(MRI)扫描测量肿瘤尺寸，并使用基于例如Z轴直径或者基于标准形状如球体、椭圆球体或立方体的方程式计算体积。
2.多价LT-β-R激动剂抗体构建体和制备它的方法
在一个实施方案中，本发明的多价抗体构建体是淋巴毒素β受体激动剂，并包含至少两个能够结合该受体和诱导LT-β-R信号传导的结构域。这些构建体可以包括含有两个或更多可变区的重链，所述可变区包含结合LT-β受体特异性的抗原识别位点，并且可以包括含有一个或多个可变区的轻链，或可以构建为仅包含含有两个或更多可变区的重链或轻链，该可变区包含结合LT-β受体特异性的CDRs。
在一个方面，本发明提供了作为人淋巴毒素β受体(LT-β-R)激动剂的多价抗体构建体。在一个实施方案中，多价抗体构建体包含LT-β-R表位特异性的至少一个抗原识别位点。在某些实施方案中，抗原识别位点中的至少一个位于scFv结构域内，而在其它实施方案中，所有抗原识别位点都位于scFv结构域内。
抗体构建体可以是二价的、三价的、四价的或五价的。在某些实施方案中，该抗体构建体是单特异性的。在一个实施方案中，该抗体构建体是CBE11结合的表位特异性的。在其它实施方案中，本发明的抗体是包含四个CBE11抗原识别位点的单特异性四价LT-β-R激动剂抗体。在另一个实施方案中，该抗体构建体是BHA10表位特异性的，在一些实施方案中，它是四价的。在这些实施方案中的任何一个中，至少一个抗原识别位点可以位于scFv结构域上，在这些实施方案中的某些中，所有抗原识别位点都位于scFv结构域上。抗体可以是多特异性的，其中本发明的抗体结合人LT-β受体上的不同表位。
在某些实施方案中，该抗体构建体是双特异性的。在其它实施方案中，该抗体构建体对下列抗体：BKA11、CDH10、BCG6、AGH1、BDA8、CBE11和BHA10之一结合的表位组成的淋巴毒素β受体(LT-β-R)表位组中的至少两个成员是特异性的。在一个实施方案中，该抗体构建体是CBE11和BHA10抗体所结合的表位特异性的，在某些实施方案中，它是四价的。在一个实施方案中，该抗体构建体具有两个CBE11特异性抗原识别位点和两个BHA10特异性识别位点，其中该抗体是双特异性四价LT-β-R激动剂抗体。在任何多特异性抗体构建体中，至少一个抗原识别位点可以位于scFv结构域上，在某些实施方案中，所有抗原识别位点都位于scFv结构域上。
在另一些实施方案中，本发明的抗体构建体包含下列多核苷酸序列及其所编码的多肽序列：
| 序列 | 图 | 说明 |
| SEQ ID NO：1 | 1A | huCBE11/huBHA10双特异性-1抗体构建体的成熟重链的多核苷酸序列 |
| SEQ ID NO：2 | 1B | huCBE11/huBHA10双特异性-1抗体构建体的成熟重链的多肽序列 |
| SEQ ID NO：3 | 2 | huCBE11/huBHA10双特异性-1抗体构建体的成熟轻链的多核苷酸序列 |
| SEQ ID NO：4 | 2 | huCBE11/huBHA10双特异性-1抗体构建体的成熟轻链的多肽序列 |
| SEQ ID NO：5 | 3A | 成熟huCBE11/huBHA10双特异性-2抗体构建体的多核苷酸序列 |
| SEQ ID NO：6 | 3B | 成熟huCBE11/huBHA10双特异性-2抗体构建体的多肽序列 |
| SEQ ID NO：7 | 4A | huCBE11单特异性-1抗体构建体的成熟重链的多核苷酸序列 |
| SEQ ID NO：8 | 4B | huCBE11单特异性-1抗体构建体的成熟重链的多肽序列 |
| SEQ ID NO：9 | 5A | 成熟huCBE11单特异性-2抗体构建体的多核苷酸序列 |
| SEQ ID NO：10 | 5B | 成熟huCBE11单特异性-2抗体构建体的多肽序列 |
| SEQ ID NO：17 | 11A | 成熟CBE11五聚重链抗体构建体的多核苷酸序列 |
| SEQ ID NO：18 | 11A | 成熟CBE11五聚重链抗体构建体的多肽序列 |
| SEQ ID NO：19 | 11B | 成熟CBE11嵌合轻链抗体构建体的多核苷酸序列 |
| SEQ ID NO：20 | 11B | 成熟CBE11嵌合轻链抗体构建体的多肽序列 |
实施例1-9提供了获得上表列出的双特异性、单特异性和五聚LT-β-R激动剂抗体构建体的详细说明。图6A和6B描绘了这些构建体中某些构建体的示意图。然而可以使用本领域已知方法构建本发明的其它LT-β-R激动剂抗体构建体，如下简略描述。图7描绘了这些构建体的几个实例。
抗原识别位点或完整可变区可以来源于一个或多个亲本抗体。亲本抗体可以包括天然存在的抗体或抗体片段、由天然存在的抗体改变而来的抗体或抗体片段、使用已知特异于LT-β受体的抗体或抗体片段的序列从头构建的抗体。可以来源于亲本抗体的序列包括重和/或轻链可变区和/或CDRs、构架区或其其它部分。
多价、多特异性抗体可以含有包含两个或更多可变区的重链和/或包含一个或多个可变区的轻链，其中至少两个可变区识别LT-β受体上的不同表位。
可以使用来源于亲本抗LT-β-R抗体的各种不同序列以各种不同方法构建多价抗LT-β-R抗体，包括小鼠或人源化BHA10(Browning等J.Immunol.154：33(1995)；Browning等J.Exp.Med.183：867(1996))和/或小鼠或人源化CBE11(美国专利6,312,691)。
下列产生单克隆抗LT-β-R抗体的杂交瘤细胞系可以用来制备从中得到抗体构建体序列的抗LT-β-R抗体，所述杂交瘤细胞系以前已经根据布达佩斯条约规定保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，其ATCC保藏号如下：
| 细胞系 | mAb名称 | 保藏号 |
| a)AG.H1.5.1b)BD.A8.AB9c)BC.G6.AF5d)BH.A10e)BK.A11.AC10f)CB.E11.1g)CD.H10.1 | AGH1BDA8BCG6BHA10BKA11CBE11CDH10 | HB 11796HB 11798B 11794B 11795B 11799B 11793B 11797 |
然而，本领域技术人员使用常规重组DNA技术可以开发各种其它多价抗体构建体，例如如PCT国际申请PCT/US86/02269；欧洲专利申请184,187；欧洲专利申请171,496；欧洲专利申请173,494；PCT国际公开号WO 86/01533；U.S.Pat.No.4,816,567；欧洲专利申请125,023；Better等(1988)Science 240：1041-1043；Liu等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：3439-3443；Liu等(1987)J.Immunol.139：3521-3526；Sun等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84：214-218；Nishimura等(1987)Cancer Res.47：999-1005；Wood等(1985)Nature 314：446-449；Shaw等(1988)J.Natl.Cancer Inst.80：1553-1559)；Morrison(1985)Science 229：1202-1207；Oi等(1986)BioTechniques 4：214；U.S.Pat.No.5,225,539；Jones等(1986)Nature 321：552-525；Verhoeyan等(1988)Science 239：1534；Beidler等(1988)J.Immunol.141：4053-4060和Winter and Milstein，Nature，349，pp.293-99(1991))所述。优选通过将非人抗原结合结构域与人恒定结构域连接而将非人抗体“人源化”(例如Cabilly等美国专利4,816,567；Morrison等Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，81，pp.6851-55(1984))所述。
在下列出版物中描述了可以用于制备主题抗LT-β-R抗体构建体的其它方法：Ghetie，Maria-Ana等(2001)Blood 97：1392-1398；Wolff，Edith A.等(1993)Cancer Research 53：2560-2565；Ghetie，Maria-Ana等(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.94：7509-7514；Kim，J.C.等(2002)Int.J.Cancer 97(4)：542-547；Todorovska，Aneta等(2001)Journal of Immunological Methods 248：47-66；Coloma M.J.等(1997)Nature Biotechnology 15：159-163；Zuo，Zhuang等(2000)Protein Engineering(Suppl.)13(5)：361-367；Santos A.D.，等(1999)Clinical Cancer Research 5：3118s-3123s；Presta，LeonardG.(2002)Current Pharmaceutical Biotechnology 3：237-256；vanSpriel，Annemiek等(2000)Review Immuunology Today 21(8)391-397。
可以使用各种已知试验筛选候选抗体构建体的活性。例如，测定结合特异性的筛选试验是本领域熟知并常规进行的。对于这种试验的综合讨论，参见Harlow等(Eds.)，ANTIBODIEs：A LABORATORY MANUAL；Cold Spring Harbor Laboratory；Cold Spring Harbor，N.Y.，1988，Chapter 6。下列实施例提供了确定候选LT-β-R激动剂抗体构建体活化LT-β-R的效力的试验。
如上所述产生的LT-β-R激动剂抗体构建体可以纯化至用作药物组合物的适当纯度。通常，纯化的组合物将有一种组分占该组合物中存在的所有组分的大约85％以上，大约85％、90％、95％、99％以上或更多。可以将目标成分纯化至基本均一(用常规检测方法不能在组合物中检测到污染物)，其中该组合物基本上由单一成分组成。根据这里的教导，熟练技术人员可以使用蛋白纯化的标准技术纯化本发明的多肽，例如免疫亲和层析、大小排阻层析等等。可以用本领域技术人员已知的很多方法测定多肽的纯度，包括例如氨基末端氨基酸顺序分析、凝胶电泳和质谱分析。
在一些实施方案中，可以化学修饰本发明的多价抗体和抗体片段以提供预期效果。例如，可以通过本领域已知的任何聚乙二醇化反应进行本发明抗体和抗体片段的聚乙二醇化，例如下列参考文献：Focuson Growth Factors 3：4-10(1992)；EP 0 154 316；和EP 0 401 384(每一篇的全部内容并入这里作为参考)所述。优选，经由与反应性聚乙二醇分子(或类似的反应性水溶性聚合物)的酰化反应或烷化反应进行聚乙二醇化。用于本发明抗体和抗体片段聚乙二醇化的优选水溶性聚合物是聚乙二醇(PEG)。如这里使用，“聚乙二醇”意指包括已用于对其它蛋白进行衍生化的任何形式的PEG，如单(C1-C10)烷氧基或芳氧基聚乙二醇。
制备本发明的聚乙二醇化抗体和抗体片段的方法通常将包括以下步骤：(a)在抗体或抗体片段变得与一或多个PEG基团连接的条件下，使抗体或抗体片段与聚乙二醇、如PEG的反应性酯或醛衍生物反应，和(b)获得反应产物。基于已知参数和期望结果来选择最佳反应条件或酰化反应对本领域普通技术人员将是显而易见的。
聚乙二醇化的抗体和抗体片段通常可以用于治疗通过施用这里描述的抗体和抗体片段可以减轻或受到调节的病情。与非聚乙二醇化抗体和抗体片段相比，聚乙二醇化抗体和抗体片段通常具有增加的半衰期。聚乙二醇化抗体和抗体片段可以单独、共同、或与其它药物组合物组合使用。
在本发明的其它实施方案中，使用本领域公认技术将抗体或其抗原结合片段与白蛋白相缀合。
在本发明的另一个实施方案中，修饰多价抗体或其片段以减少或消除潜在糖基化位点。这种修饰的抗体常常被称为“非糖基化”抗体。为了提高抗体或其抗原结合片段的结合亲合力，可以例如通过诱变而改变抗体的糖基化位点(例如定点诱变)。“糖基化位点”是指被真核细胞识别为糖残基附着位置的氨基酸残基。碳水化合物如寡糖附着的氨基酸通常是天冬酰胺(N-连接)、丝氨酸(O-连接)和苏氨酸(O-连接)残基。为了鉴定抗体或抗原结合片段内的潜在糖基化位点，通过例如使用公众可利用的数据库如生物序列分析中心提供的网址(有关预测N-连接糖基化位点参见
http：//www.cbs.dtu.dk/services/ NetNGlyc/，预测O-连接糖基化位点参见
http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/)检查抗体的序列。美国专利6,350,861和5,714,350中描述了改变抗体糖基化位点的另外方法。
在本发明的又一个实施方案中，可以改变多价抗体或其片段，其中抗体的恒定区被修饰，以便相对于未修饰的抗体，被修饰抗体降低了至少一个恒定区介导的生物效应器功能。为了修饰本发明的抗体，使得它显示出与Fc受体(FcR)结合降低，可以在FcR相互作用所需的特殊区域突变抗体的免疫球蛋白恒定区片段(参见例如，Canfieldet al(1991)J.Exp.Med.
173：1483；和Lund，J.等(1991)J.ofImmunol.
147：2657)。抗体的FcR结合能力降低也可以降低依赖于FcR相互作用的其它效应器功能，如调理和吞噬作用以及抗原依赖性细胞毒性。
在本发明的特殊实施方案中，进一步涉及具有改变的效应器功能、如结合效应分子(例如补体或效应细胞上的受体)的能力改变的多价抗体。尤其是，本发明人源化抗体具有改变的恒定区，例如Fc区，其中Fc区中至少一个氨基酸残基已经被不同的残基或侧链取代，从而降低抗体结合FcR的能力。抗体的FcR结合能力降低也可以降低依赖于FcR相互作用的其它效应器功能，如调理和吞噬作用以及抗原依赖性细胞毒性。在一个实施方案中，该修饰的人源化抗体是IgG类，在Fc区包含至少一个氨基酸残基取代，以致该人源化抗体具有改变的效应器功能(例如与未人源化抗体相比)。在特殊实施方案中，本发明的人源化抗体具有改变的效应器功能，以致它具有较少的免疫原性(例如不激起不想要的效应细胞活性、溶解或补体结合)，和/或具有更理想的半衰期，同时保持对LTβR的特异性。
或者，本发明涉及具有改变的恒定区以提高FcR结合(例如FcγR3结合)的多价人源化抗体。这种抗体可用于调节效应细胞功能，例如增加ADCC活性，例如特别可用于本发明的肿瘤学应用中。
如这里使用的，“依赖于抗体的细胞介导的细胞毒性”和“ADCC”是指细胞介导的反应，其中表达FcRs的非特异性细胞毒性细胞(例如自然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上的结合抗体并随后引起靶细胞溶解。介导ADCC、NK细胞的主要细胞仅仅表达抗体的FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRI1I，例如抗体与另一药剂或抗体的缀合物。
在又一个实施方案中，本发明的多价抗LT-β-R抗体可以与化疗剂缀合，从而以超累加方式抑制肿瘤体积。可以与本发明抗体缀合的示范性化疗剂包括但不限于放射缀合物(90Y、131I、99mTc、111In、186Rh等)、肿瘤活化的前体药物(maytansinoids、CC-1065类似物、clicheamicin衍生物、蒽环霉素、长春花生物碱等)、蓖麻毒蛋白、白喉毒素、假单胞菌外毒素。
3.包括使用多价LT-β-R激动剂抗体构建体的组合治疗
本发明进一步提供了多价LT-β-R激动剂抗体与化疗剂组合使用来治疗癌症和/或抑制肿瘤生长的用途。同样地，可以使用或测试任何各种化疗剂供本发明方法之用，只要激动剂和试剂的组合对肿瘤的抑制大于该激动剂和试剂单独作用的简单累加所预期的抑制即可。这种化疗剂可以包括抗代谢剂、烷化剂、基于铂的试剂、蒽环霉素、抗生素、拓扑异构酶抑制剂及其它。可以使用各种形式的化疗剂和/或其它生物活性剂。这些包括但不限于诸如不带电的分子、分子复合物、盐、醚、酯、酰胺等等这类分子，当它们被植入、注射或插入肿瘤时，在生物学上是活化的。
可以与本发明多价抗体组合使用的化疗药物可以基于它们如何影响癌细胞内的具体化学物质，该药物干扰的细胞活动或过程以及该药物影响的细胞周期的具体时期而被分成几类。
在某些实施方案中，化疗剂是破坏DNA合成的试剂。在一个实施方案中，破坏DNA合成的试剂是核苷类似化合物。在某些实施方案中，该核苷类似化合物是吉西他滨。在另一个实施方案中，破坏DNA合成的试剂是蒽环霉素化合物，在某些实施方案中，蒽环霉素化合物是阿霉素。
在其它实施方案中，化疗剂是拓扑异构酶I抑制剂。在某些实施方案中，拓扑异构酶I抑制剂是Camptosar。
在其它实施方案中，化疗剂可以是烷化剂。烷化剂直接对DNA作用，以防止癌细胞复制。作为一类药物，这些试剂不是时期特异性的(换言之，它们对细胞周期的所有时期起作用)。烷化剂通常积极对抗慢性白血病、非何杰金氏淋巴瘤、何杰金氏病、多发性骨髓瘤和某些肺癌、乳腺癌和卵巢癌。烷化剂实例包括白消安、顺铂、卡铂、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、达卡巴嗪(DTIC)、氮芥(氮芥子气)和苯丙氨酸氮芥。在一个实施方案中，烷化剂是铂化合物，在某些实施方案中可以选自卡铂和顺铂组成的组。在某些实施方案中，该铂化合物是顺铂。
在又一些实施方案中，化疗剂可以是植物碱。在一个实施方案中，植物碱是紫杉烷(taxane)，在某些实施方案中，可以是紫杉酚。
本发明的多价抗体可以与化疗剂组合使用以治疗癌症，其中化疗剂和多价抗体的组合具有超累加作用。如这里使用，“肿瘤的超累加抑制”是指施用LT-β-R激动剂和化疗剂的组合所产生的平均肿瘤抑制作用在统计学上显著高于单独施用LT-β-R激动剂或化疗剂产生的肿瘤抑制的总和。可以如下确定LT-β-R激动剂和化疗剂的组合施用产生的肿瘤抑制是否“在统计学上显著高于”单独化合物预期的累加值。这种超累加抑制可以如上定义进行增强或协同。
通常，可以通过确定组合治疗是否引起治疗组平均肿瘤体积减小来估计超累加抑制，这种肿瘤体积减小与分别单独治疗它们的治疗组所产生的平均肿瘤体积减小的总和相比在统计学上是显著超累加的。由对照组和治疗组平均肿瘤体积之间的差异可以计算平均肿瘤体积减小。肿瘤体积的抑制分数-“影响分数”(Fa)，可以用治疗组平均肿瘤体积减小除以对照组平均肿瘤体积来计算。1.000的Fa表示肿瘤的完全抑制。统计学上显著增强的测试需要计算每个治疗组的Fa。组合治疗的预期累加Fa取自接受组合中任一元素处理的组中平均Fa的总和。例如，可以使用Two-Tailed One-Sample T-Test评价实验中获得的结果有多少可能是仅仅由于随机引起的，这可通过p值来确定。p值小于.05被认为是统计学上显著的，包括但不限于约0.05至约0.04之间；约0.04至约0.03之间；约0.03至约0.02之间；约0.02至约0.01之间，即不可能是仅仅由于随机本身引起。在某些情况下，p值可以小于0.01。因此，组合治疗组的Fa必须在统计学上显著高于单一元素治疗组的预期累积Fa，才能认为该组合引起增强的超累加作用。
可以用平均效应/组合指数等效线图解法(Chou等(1984)Ad.Enzyme Reg.22：27)估计协同作用是否由组合治疗引起。在这个方法中，基于由单独LT-β-R激动剂、单独化疗剂以及二者以固定摩尔比组合的中值效应图得到的参数计算不同剂量效应水平的组合指数(CI)值。CI＜1表示协同作用，包括但不限于约0.85至约0.90之间；约0.70至约0.85之间；约0.30至约0.70之间；约0.10至约0.30之间。在又一个实施方案中，组合指数小于0.10。优选使用用于剂量效应分析的CalcuSyn，Windows软件(Biosoft，Cambridge UK)进行这个分析。
本领域已知或以后开发的用于分析组合治疗是否存在超累加作用的任何方法预计均可用于筛选合适的化疗剂。
在发明名称为“癌症的新型组合疗法”的申请人的共同待审PCT申请(在同一天提出申请，其全部内容因此并入作为参考)和在2002年12月20日申请的临时申请60/435185中，教导了检测候选LT-β-R激动剂与化疗剂的组合以确定是否发生肿瘤的超累加抑制的方法。
4.药物组合物
本发明提供了包含上述LT-β-R激动剂抗体构建体的药物组合物。在某些实施方案中，该药物组合物可以进一步包含化疗剂。在一个方面，本发明提供了药物可接受的组合物，它包含与一种或多种药物可接受载体(添加剂)和/或稀释剂一起配制的治疗有效量的一种或多种上述化合物。在另一个方面，某些实施方案中，本发明的化合物本身可以施用或与药物可接受载体混合施用，并且还可以与其它化疗剂一起施用。因此结合(组合)治疗包括依次、同时并分开或共同施用活性化合物，使得首先施用的药物的治疗作用在施用后一药物时，尚未完全消失。
不管选择的给药途径如何，都可以用本领域技术人员已知的常规方法将本发明的化合物(其可以以合适的水合形式使用)和/或本发明的药物组合物配制成药物可接受剂型。尽管本发明的化合物可能单独施用，但是优选作为药物制剂(组合物)施用该化合物。根据本发明的化合物可以配制为以供人或兽医疗用途的任何方便方式施用，与其它药剂类似。
如下详细描述，本发明的药物组合物可以特别配制成固体或液体形式施用，包括适合于下列的那些：(1)口服施用，例如顿服药(水或非水溶液或悬浮液)、片剂，例如靶向颊、舌下和全身吸收的片剂、应用于舌的糊剂、丸剂、粉剂、粒剂；(2)肠胃外施用，例如作为如无菌溶液或悬浮液或持续释放制剂通过皮下、肌内、静脉内或硬膜外注射施用；(3)局部施用，例如作为应用于皮肤的乳剂、膏剂或控制释放贴片或喷雾剂；(4)阴道内或直肠内，例如作为阴道栓剂、乳剂或起泡剂；(5)经舌下；(6)经眼；(7)经皮；或(8)经鼻。在一个实施方案中，药物组合物被配制成用于肠胃外施用。在一个实施方案中，药物组合物被配制成用于动脉内注射。在另一个实施方案中，药物组合物被配制成用于全身施用。
在其它情况下，本发明的化合物可以含有一个或多个酸性官能团，因此能够与药物可接受碱形成药物可接受盐。
组合物中也可以存在润湿剂、乳化剂和润滑剂，如十二烷基硫酸钠和硬脂酸镁、以及着色剂、释放剂、包被剂、甜味剂、调味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂。
本发明的制剂包括适于口服、鼻内、局部(包括经颊和舌下)、直肠、阴道和/或肠胃外施用的制剂。该制剂可以方便地以单位剂量形式提供并可以用制药领域熟知的任何方法制备。可以与载体物质组合以制备单一剂型的活性成分的量将根据所治疗的宿主、特定给药方式而改变。可以与载体物质组合以制备单一剂型的活性成分的量通常将是产生治疗作用的化合物的量。
用于口服施用本发明化合物的液体剂型包括药物可接受乳剂、微乳剂、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂。除了活性成分外，液体剂型可以含有本领域通常使用的惰性稀释剂，例如水或其它溶剂、增容剂和乳化剂，如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇、油类(尤其是棉籽、落花生、玉米、胚芽、橄榄、蓖麻和芝麻油类)、甘油、四氢呋喃醇、聚乙二醇和脱水山梨醇的脂肪酸酯，及其混合物。除了惰性稀释剂外，口服组合物中还可以包含佐剂如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、调味剂、着色剂、芳香剂和防腐剂。悬浮液中除了活性物质外，还可以含有悬浮剂，例如乙氧基化异硬脂酰醇、聚氧乙烯山梨糖醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、aluminum metahydroxide、皂土、琼脂和黄芪胶，及其混合物。
适于口服施用的本发明的制剂可以是胶囊、扁囊剂、丸剂、片剂、锭剂(使用调味基质，通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄芪胶)、粉剂、粒剂形式或者作为水或非水液体中的溶液或悬浮液，或者作为水包油或油包水液体乳剂，或者作为酏剂或糖浆，或者作为软锭剂(使用惰性基质，如明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯胶)和/或作为漱口剂等等，每种中都含有预定量的本发明化合物作为活性成分。本发明的化合物也可以作为丸剂、药糖剂或糊剂施用。
在口服施用的本发明的固体剂型(胶囊、片剂、丸剂、糖衣丸、粉剂、粒剂等等)中，活性成分与一种或多种药物可接受载体(如柠檬酸钠或磷酸氢钙)和/或下列中任何成分相混合：(1)填充剂或膨胀剂，如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和/或硅酸；(2)粘合剂，例如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯胶；(3)润湿剂，如甘油；(4)崩解剂，如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；(5)溶液阻滞剂，如石蜡；(6)吸收加速剂，如季铵化合物；(7)润湿剂，例如鲸蜡醇、单硬脂酸甘油酯和非离子表面活性剂；(8)吸附剂，如高岭土和皂土粘土；(9)润滑剂，如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠、及其混合物；和(10)着色剂。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，药物组合物中也可以包含缓冲剂。类似类型的固体组合物也可以用作软和硬壳明胶胶囊中的填充物，其中使用如乳糖或乳中糖类以及高分子量聚乙二醇等等作为赋形剂。
可以通过压制或铸模来制备片剂，其中任选与一种或多种助剂一起制备。使用粘合剂(例如明胶或羟丙基甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如淀粉羟乙酸钠或交联羧甲基纤维素钠)、表面活性剂或分散剂制备压制片。可以通过将用惰性液体稀释剂湿润的粉末化合物混合物在合适机器中铸模来制备模制片。可以非必要地对片剂和本发明药物组合物的其它固体剂型(如糖衣丸、胶囊、丸剂和粒剂)进行评分或与包衣和壳制备，如肠溶衣和制药领域熟知的其它包衣。也可以配制它们以提供缓慢或控制释放的活性成分，其中使用例如不同比例的羟丙基甲基纤维素以提供期望的释放模式、其它聚合基质、脂质体和/或微球体。它们可以被配制成快速释放，例如冻干。可以对它们进行灭菌，通过例如在保持细菌的过滤器过滤或通过并入无菌固体组合物形式的杀菌剂来实现，所述组合物可以在使用前立即溶于无菌水或一些其它无菌可注射介质中。这些组合物也可以任选含有不透明剂，并可以是仅仅或优先在胃肠道的某一部分释放活性成分的组合物，任选以延迟方式释放。可以使用的包埋组合物的实例包括聚合物和蜡。如果合适，活性成分也可以是微囊密封形式，其中含有一种或多种上述赋形剂。
本发明化合物的局部或经皮施用剂型包括粉剂、喷雾剂、膏剂、糊剂、霜剂、洗液、凝胶剂、溶液、贴片和吸入剂。活性化合物可以在无菌条件下与药物可接受载体和任何防腐剂、缓冲剂或可能需要的推进剂混合。除了本发明的活性化合物外，膏剂、糊剂、霜剂和凝胶剂可以含有赋形剂，如动物和植物脂肪、油类、蜡、石蜡、淀粉、黄芪胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、皂土、硅酸、滑石粉和氧化锌，或其混合物。除了本发明的化合物外，粉剂和喷雾剂中还可以含有赋形剂如乳糖、滑石粉、硅酸、氢氧化铝、硅酸钙和聚酰胺粉末，或这些物质的混合物。喷雾剂另外含有惯用的推进剂，如氯氟碳氢化合物和挥发性的未取代碳氢化合物，如丁烷和丙烷。
适于肠胃外施用的本发明药物组合物包含一种或多种本发明化合物与一种或多种药物可接受的无菌等渗水或非水溶液、分散体、悬浮液或乳剂、或无菌粉剂相组合，无菌粉剂可以在临用前重溶成无菌注射液或分散体，该组合物可以含有糖、醇类、抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、致使制剂与预定受体的血液等渗的溶质、或者悬浮剂或增稠剂。这些组合物也可以含有佐剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。通过包含各种抗细菌和抗真菌剂，例如帕拉贝(paraben)、氯代丁醇、苯酚山梨酸等等，可以确保防止微生物对主题化合物的作用。在组合物中包括等渗试剂，如糖、氯化钠等等也可能令人期望。此外，通过包含延迟吸收的试剂如单硬脂酸铝和明胶，可以造成可注射药物形式的延长吸收。
有些情况下，为了延长药物的作用，延缓药物从皮下或肌内注射处的吸收是令人期望的。通过使用水溶性差的晶体或无定形物质的液体悬浮液可以完成此目的。药物的吸收速率取决于它的溶解速度，后者继而可能取决于晶体大小和结晶形态。或者，可以通过使药物溶解或悬浮在油类载体中来完成肠胃外施用的药物形式的延迟吸收。
通过使主题化合物在可生物降解的聚合物如聚交酯-聚乙醇酸交酯中形成微胶囊基质，可以制备可注射储库形式。根据药物与聚合物的比率，和使用的特定聚合物的性质，可以控制药物释放的速率。其它可生物降解的聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。通过将药物捕留在与身体组织相容的脂质体或微乳剂中可以制备可注射储库制剂。
5.递送方法和装置
也可以使用各种药物递送装置来施用本发明的药物组合物，这样的装置可以包括皮下注射器、多室注射器、支架、导管、经皮贴片、显微针、微型研磨器和可植入型控制释放装置。在一个实施方案中，药物递送装置含有或能够装载至少有效量的LT-β-R激动剂抗体构建体。这种装置可以具有在递送之前在装置中重溶冻干形式的抗体构建体的能力。在一些实施方案中，药物递送装置含有或能够装载至少有效量的LT-β-R激动剂和有效量的化疗剂。在一些实施方案中，该装置可能能够同时递送或施用LT-β-R激动剂抗体构建体和化疗剂。该装置可以具有在用该装置施用前混合抗体构建体和化疗剂的能力。在又一些实施方案中，该装置可能能够连续施用激动剂抗体构建体和化疗剂。
一种药物递送装置是能够在注射前混合两种化合物或者依次递送它们的多室注射器。Neue Verpackung，No.3，1988，p.50-52；Drugs Made in Germany，Vol.30，Pag.136-140(1987)；Pharm.Ind.46，Nr.10(1984)p.1045-1048 and Pharm.Ind.46，Nr.3(1984)p.317-318中公开了典型的双室注射器和自动制备这种预装填注射器的方法。注射型安瓿是双室装置，在前室具有用于连接针的前瓶型开口、两个活塞和用于混合冻干粉剂的外部型旁通管，在后室具有重溶液体。所述方法包括以下主要步骤：洗涤和硅化处理注射器圆筒，将多个圆筒插入载体托盘中，灭菌，通过圆筒后部末端引入中间活塞，转动托盘使其倒置，通过前开口引入粉剂溶液，冷冻干燥为干粉，在冻干室中时关闭前开口，转动托盘，通过圆筒后部末端引入重溶液体，插入后部活塞，从托盘中取出产物以及最后的控制和包装。可以制备预先充满各种组分的安瓿以便与注射器一起使用。
在另一个实施方案中，多室注射器是Lyo-ject系统(VetterPharma Turm，Yardley，PA)。Lyo-Ject允许用户直接在注射器中冻干药物，其与用于快速重构和注射的稀释剂包装在一起。它在专利4,874,381和5,080,649中有描述。
在其它实施方案中，使用能够完成注射的两个分开的注射器、导管、显微针或其它装置施用化合物。
也可以使用置于所影响组织或血流中、附近或与它们相联系的微球体、脂质体、其它微粒递送系统或持续释放制剂来施用本发明的药物组合物。持续释放载体的合适实例包括成形产品如栓剂或微胶囊形式的可半渗透聚合基质。可植入或微胶囊持续释放基质包括聚交酯(美国专利3,773,319；EP 58,481)、L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酸酯的共聚物(Sidman等Biopolymers，22，pp 547-56(1985))；聚(2-羟乙基-异丁烯酸(酯))或乙烯-乙酸乙烯酯共聚物(Langer等J.Biomed.Mater.Res.，15，pp.167-277(1981)；Langer，Chem.Tech.，12，pp.98-105(1982))。
本发明的组合物将以有效剂量施用以治疗所针对的特定临床病情。对于一个给定应用，其优选药物制剂和治疗有效剂量方案的确定是本领域内技术人员熟知的，其中可考虑到例如患者的病情和体重、期望治疗的程度和患者对治疗的耐受度。
经皮贴片具有向身体提供受控式递送本发明化合物的额外优点。可以通过在适当的介质中溶解或分散该化合物而制成这种剂型。吸收增强剂也可用于增加化合物穿过皮肤的流量。可以通过提供速度控制膜或在聚合物基质或凝胶中分散该化合物来控制这种流量的速率。
6.治疗方法
如实施例9所述以及如图9和10所示，本发明的多价抗体构建体在显著降低体内肿瘤重量方面是有效的。
因此，本发明进一步提供了治疗癌症的新治疗方法，其中包括给受试者施用有效量的药物组合物，任选使用上述递送装置。本发明的方法可以用来治疗癌症，包括但不限于治疗实体瘤。可以用本发明化合物治疗的实体瘤的实例，包括不限于乳腺、睾丸、肺、卵巢、子宫、子宫颈、胰腺、非小细胞肺(NSCLC)、结肠以及前列腺、胃、皮肤、胃、食管和膀胱癌。在某些实施方案中，该方法包括给受试者肠胃外施用有效量的主题药物组合物。在一个实施方案中，该方法包括给受试者动脉内施用主题组合物。在其它实施方案中，该方法包括将有效量的主题组合物直接施用于受试者肿瘤的动脉血供给内。在一个实施方案中，该方法包括使用导管将有效量的主题组合物直接施用于癌性肿瘤的动脉血供给内。在使用导管施用主题组合物的实施方案中，可以通过荧光镜检查或可以观察和/或指导导管插入的本领域已知的其它方法指导或观察导管的插入。在另一个实施方案中，该方法包括化疗栓塞术(chemoembolization)。例如，化疗栓塞方法可以包括用包括与油基质(例如乙碘油制剂中的聚乙烯醇)和一种或多种化疗剂混合的树脂样物质的组合物阻断向癌性肿瘤提供供应的血管。在又一些实施方案中，该方法包括给受试者全身施用主题组合物。
通常，不管部位如何，通常以类似方式实施利用本发明药物组合物的化疗栓塞术或者直接动脉内或静脉注射治疗。简言之，当进行X线时，通过插入到动脉或静脉(取决于待栓塞或注射的部位)的导管注射不透射线的对照物，可以首先实施待栓塞部位的血管造影术(血管的路径图)，或更具体地说在某些实施方案中是待栓塞部位的动脉造影术。该导管可以经皮或通过手术插入。然后通过导管回流本发明的药物组合物以栓塞血管，直到观察到流动停止。可以重复血管造影片来证实闭塞。在使用直接注射的实施方案中，接着以期望剂量给血管灌输本发明的药物组合物。
栓塞治疗通常导致含有抑制剂的组合物分布待治疗肿瘤或血管团的整个空隙。堵塞动脉腔的栓子颗粒的物质大块导致血液供应受阻。除这个作用之外，抗血管生成因子的存在防止了形成新血管以供应肿瘤或血管团，增强了切断血液供应的早衰作用。动脉内或静脉内直接注射通常也导致含有抑制剂的组合物分布到待治疗肿瘤或血管团的整个空隙。然而，用这个方法预期通常不能使血液供应阻断。
在本发明的一个方面内，利用栓塞或者动脉内或静脉内直接注射治疗可以治疗原发和继发肝脏或其它组织的肿瘤。简言之，通过股或肱动脉插入导管，并在荧光检查引导下引导它通过动脉系统向前进入肝动脉。使导管向前进入肝动脉树，远至完全阻断供应肿瘤的血管所需的程度，同时避开尽可能多的供应正常结构的动脉分支。理想地，这将是肝动脉的部分分支，但是根据肿瘤的程度及其单独的血液供应，可能将需要阻断远离胃十二指肠动脉起点的全部肝动脉，或甚至多个分开的动脉。一旦到达期望导管位置，则通过动脉导管注射组合物(如上所述)以栓塞动脉，直到待阻断的动脉中的血流停止，优选甚至到观察5分钟后。通过导管注射不透射线的对照物并通过荧光镜检查或X线光片证明预先充满对照物的脉管不再如此，由此可以证实动脉的闭塞。在使用直接注射的实施方案中，通过动脉导管以期望剂量注射组合物(如上所述)来灌输动脉。可以对待阻塞的每条供应动脉重复相同操作。
在大多数实施方案中，主题药物组合物将以一定的量掺入待递送的物质，该量足以给患者递送治疗有效量的掺入治疗剂或作为一部分预防或治疗处理的其它物质。颗粒中活性化合物的期望浓度将取决于药物的吸收、失活和排泄速率以及化合物的递送速度。应当注意，剂量值也可以随待减轻的病情的严重性而改变。应该进一步理解，对于任何特定受试者，应当随时间的推移根据个人需要和施用或监督组合物施用的人的专业判断调整具体的剂量方案。典型地，将使用本领域技术人员已知的技术确定剂量。所选择的剂量水平将取决于多种因素，包括所使用的本发明特定化合物或者其酯、盐或酰胺的活性、给药途径、施用时间、所使用的特定化合物的排泄或新陈代谢速率、治疗的持续时间、与所使用的特定化合物组合使用的其它药物、化合物和/或材料、所治疗患者的年龄、性别、体重、病情、一般的健康状况和既往病史，以及医学领域熟知的类似因素。
剂量可以以患者每公斤体重的组合物量为基础。本领域技术人员将知晓其它量并可容易确定。可供选择地，可以参考组合物的血浆浓度确定本发明的剂量。例如，可以使用最大血浆浓度(Cmax)和从0时间至无限大(AUC(0-4))的血浆浓度-时间曲线下的面积。本发明的剂量包括产生Cmax和AUC(0-4)这些值的剂量和导致那些参数的值更大或更小的其它剂量。
具有本领域普通技术的医生或兽医可以容易地确定和指定所需要的药物组合物的有效量。例如，为了医生或兽医可以使药物组合物中所用本发明化合物的剂量以低于获得期望治疗效果所需剂量的水平开始，逐步增加剂量直到达到期望效果。
通常，本发明化合物的合适日剂量将是有效产生治疗作用的最低剂量的化合物量。这种有效剂量通常将取决于上述因素。
将在给定患者中产生最有效治疗的任何特定化合物的精确给药时间和量将取决于特定化合物的活性、药代动力学和生物利用率、患者的生理情况(包括年龄、性别、疾病类型和阶段、一般身体情况、对药物治疗的给定剂量和类型的反应性)、给药途径等等。这里提出的方针可以用来优化治疗，如确定施用的最佳时间和/或量，其中只需要常规实验，包括监测受试者和调整剂量和/或给药时间。
当正在治疗受试者时，可以在24小时期间的预定时间测定一个或多个相关指数，由此监测患者的健康。根据这种监测结果可以优化治疗，包括补充，量、施用时间和制剂。通过测定相同参数，可以周期性地重新评价患者以确定改善程度，这种重新评价的第一次典型地在治疗开始后的四周末进行，随后的重新评价在治疗期间每四至八周进行，接着其后每三个月进行。治疗可以持续数月或甚至数年，对于人，最少一个月是典型的治疗时间。基于这些重新评价可以调整施用试剂的量，也可能调整施用时间。
可以以低于化合物的最佳剂量的较小剂量开始治疗。其后，可以以细微增量提高该剂量，直到获得最佳的治疗效果。
本发明几种化合物或可供选择的其它化疗剂的组合使用可以减少任何单一组分的所需剂量，因为不同组分作用的开始和持续时间有可能互补。在这种组合治疗中，不同活性剂可以共同或分开、并且可以同时或在一天内的不同时间递送。通过细胞培养或实验动物中的标准药学程序，例如测定LD50和ED50的程序，可以测定主题化合物的毒性和治疗效能。优选显示治疗指数高的组合物。尽管可以使用显示出毒性副作用的化合物，但是为了减少副作用，应该仔细设计将化合物靶向期望部位的递送系统。
细胞培养试验和动物研究获得的数据可以用于配制用于人的剂量范围。任何补充物或者其中的任何组分的剂量优选位于包括ED50、但很少或没有毒性的循环浓度范围内。根据使用的剂型和利用的给药途径，该剂量可以在这个范围内变化。对于本发明的试剂，最初可以由细胞培养试验估计治疗有效剂量。可以在动物模型中配制剂量，以获得细胞培养中测定的包括IC50(即达到最大症状抑制的一半的测试化合物浓度)的循环血浆浓度范围。这种信息可以用来更精确测定在人中的有效剂量。例如可以通过高压液相色谱测定血浆中的水平。
7.试剂盒
本发明提供了治疗各种癌症的试剂盒。例如，试剂盒可以包括一种或多种如上所述的药物组合物和任选它们的使用说明书。在又一些实施方案中，本发明提供了包含一种或多种药物组合物和完成施用这种组合物的一个或多个装置的试剂盒。例如，主题试剂盒可以包含药物组合物和完成将该组合物直接动脉内注射到癌性肿瘤的导管。在其它实施方案中，主题试剂盒可以包含预先充满LT-β-R激动剂抗体构建体的安瓿，以便与递送装置一起使用，该构建体任选被配制成药物，或处于冻干形式。
实施例
刚才一般地描述了本发明，参考下列实施例将更容易理解它，包括这些实施例仅仅为了阐明本发明的某些方面和实施方案，并不意欲以任何方式限制本发明。
除非另有陈述，本发明的实施将使用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规方法，它们在本领域技术范围内。在文献中描述了这种技术。参见例如Molecular Cloning A Laboratory Manual，2nd Ed.，ed.by Sambrook，Fritsch and Maniatis(Cold Spring Harbor Laboratory Press：1989)；DNA Cloninng，Volumes I and II(D.N.Glover ed.，1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gaited.，1984)；Mullis等美国专利：4,683,195；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames &S.J.Higgins eds.1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames & S.J.Higgins eds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，Alan R.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cells AndEnzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，A Practical Guide ToMolecular Cloning(1984)；the treatise，Methods In Enzymology(Academic Press，Inc.，N.Y.)；Gene Transfer Vectors ForMammalian Cells(J.H.Miller and M.P.Calos eds.，1987，ColdSpring Harbor Laboratory)；Methods In Enzymology，Vols.154 and155(Wu等eds.)，Immunochemical Methods In Cell And MolecularBiology(Mayer and Walker，eds.，Academic Press，London，1987)；Handbook Of Experimental Immunology，Volumes I-IV(D.M.Weirand C.C.Blackwell，eds.，1986)；Manipulating the Mouse Embryo，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。
在申请人的共同待审申请PCT公开号WO 96/22788、PCT公开号WO 02/30986，和PCT申请号PCT/US03/20762中已经预先描述了muBHA10和muCBE11可变区、鼠-人BHA10和CBE11嵌合抗体、重新整形的BHA10和CBE11可变结构域、编码huBHA10和huCBE11的表达载体、五聚chCBE11抗体的制备，以及它们的纯化和检测方法，这些申请中每一篇的全部内容并入作为参考。
实施例1 huCBE11/huBHA10双特异性-1抗体的构建和表达
将来自pXW018的含有1087bp BsrGI-NotI scFv的片段和来自pEAG1325的1170bp NotI-BsrG1 huCBE11重链片段亚克隆进入由Invitrogen pCEP4衍生的EBV表达载体pCH274的NotI位点，产生质粒pXW020，从而构建出huCBE11/huBHA10双特异性-1重链。进一步证实了pXW020中2.26kb NotI插入物的DNA序列。图1A显示了成熟双特异性-1重链的cDNA序列，图1B显示了其编码的氨基酸序列；它含有huCBE11重链，其C末端通过2X Gly4Ser柔性接头连接huBHA10scFv。通过pXW020和huCBE11轻链的表达载体-pAND076共转染，在293-EBNA细胞中瞬时表达huCBE11/huBHA10双特异性-1抗体。图2A和2B显示了pAND076编码的成熟双特异性-1轻链的eDNA及其编码的氨基酸序列。图6A用示意图描绘了双特异性-1构建体。从瞬时转染的细胞收获的条件培养液，对其进行Western印迹分析，证实huCBE11/huBHA10双特异性-1抗体构建体的表达。当用抗人IgG(重链加轻链)特异性抗体(亲本huBHA10，通过EBV表达载体pKJS046和pKJS049共转染产生亲本huCBE11，通过EBV表达载体pAND076和pAND090与的共转染产生，用作阳性对照；空载体pCH274用作阴性对照)探测Western印迹时，检测到异源四聚抗体。通过流式细胞计数法测定其对HT29和COS7细胞的表面LT-β-Ron染色的能力证实了huCBE11/huBHA10双特异性-1抗体构建体的特异性。准备用pXW020和pAND076大规模共转染293-EBNA细胞，以产生抗体进行纯化。
实施例2 scFv.huCBE11的构建
huCBE11的单链Fv(scFv.huCBE11)构建中的第一步是将来自EBV表达pAND090的携带huCBE11重链可变结构域的437bp NotI-HindIII片段亚克隆进入pBluescriptIISK+克隆载体的2.91kb NotI-HindIII载体主链片段，产生称作pXW022的诱变模板。使用StratageneQuikChange诱变试剂盒，遵循制造商推荐的方案，用引物(a)：5’CAA TCT CAA AGC TAC CAT GGA GGT CAC CGT CTC CTC TGG GGG CGG GGGGTC CGG GGG AGG CGG GTC GGG AGG TGG CGG AAG TGA TAT CCA GAT GACCCA G 3’(SEQ ID NO：11)及其反向互补物，向成熟huCBE11轻链的N末端添加符合读框的BstEII位点，5个重链FR4残基，和3X柔性Gly4Ser接头，用引物(b)：5’GCA CCA AGC TGG AGA TCA AAG GGGGTG GTG GTT CAG GAG GTG GAG GAT CCT TCC CAC CAT CCA GTG AC 3’(SEQ ID NO：12)及其反向互补物，向huCBE11链可变结构域的C末端添加符合读框的2X Gly4Ser接头，在接头的第二个Gly4Ser的3’末端有BamHI位点，由此对携带huCBE11轻链可变结构域的基于pUC的质粒pAND074进行定点诱变。通过筛选导入的BstEII和BamHI位点以及BglII限制性位点的丧失而鉴定既含5’接头又含3’接头的突变轻链质粒。证实了所得质粒pXW024中405bp BstEII-BamHI通过接头连接huCBE11轻链插入物的DNA序列。来自pXW022的412bpNotI-BstEII huCBE11重链可变结构域片段和来自pXW024的405bpBstEII-BamHI通过接头连接的huCBE11轻链片段亚克隆进入pBluescriptIISK+克隆载体的2.94kb NotI-BamHI载体主链片段，产生pXW025。证实了pXW025中817bp NotI-BamHI scFv.huCBE11插入物的DNA序列：它含有通过3X Gly4Ser柔性接头与轻链可变结构域连接的重链可变结构域(具有它的信号序列)，并有2X Gly4Ser接头与轻链可变结构域的C末端融合。
实施例3 scFv.huCBE11-Fc融合体的构建和表达
为证实scFv.huCBE11保持了亲本huCBE11 mAb的LTβR结合活性，构建了可溶性融合蛋白，其中2X Gly4Ser接头连接的scFv.huCBE11附着于可溶性IgG1Fc的N末端(scFv.huCBE11-Fc)。于是也表达这个构建体。对含有类似于Lo等1998，Protein Engineering 11：495-500描述的重组可溶性人IgG1Fc cDNA的质粒pEAG1397进行Quikchange定点诱变，其中使用引物5’GTT CTG GAT TCC GGC GTC GGG ATC CGA GCC CAA ATC TAG TGA CAAG 3’(SEQ ID NO：13)及其反向互补物在接点的5’末端添加符合读框的BamHI位点。通过筛选导入的BamHI位点而鉴定突变质粒。证实了所得质粒pXW023的711bp BamHI-NotI Fc片段的DNA序列。将来自pXW025的817bp NotI-BamHI scFv.huCBE11片段和来自pXW023的711bp BamHI-NotI Fc片段亚克隆进入由Invitrogen pCEP4衍生得到的EBV表达载体pCH274的NotI位点，产生质粒pXW026。证实了表达载体pXW026中1.53kb NotI scFv.huCBE11-Fc cDNA插入物的DNA序列。将质粒pXW026瞬时转染入293-EBNA细胞。对从瞬时转染的细胞收获的条件培养液进行Western印迹分析，证实了scFv.huCBE11-Fc融合蛋白的表达。当用抗人Fc特异性抗体(由EBV表达载体pAND076和pAND090的共转染产生的亲本huCBE11用作阳性对照，空载体pCH274用作阴性对照)探测Western印迹时，检测到预期大小的均二聚融合蛋白。经流式细胞计数法测定其对HT29细胞上表面LTbR的染色能力证实scFv.huCBE11-Fc的特异性。准备用pXW026大规模转染293-EBNA细胞，以产生抗体进行纯化。
实施例4 huCBE11/huBHA10双特异性-2抗体的构建和表达
证明Fc-scFv.huBHA10和scFv.huCBE11-Fc融合蛋白表达和LTβR结合后，构建含有两个单scFv实体的组合单融合蛋白，称作huCBE11/huBHA10特异性-2。将来自pXW018的含有1087bpBsrGI-NotI Fc-scFv.huBHA10的片段和来自pXW026的1220bpNotI-BsrG1 scFv.huCBE11-Fc片段亚克隆进入由Invitrogen pCEP4衍生得到的EBV表达载体pCH274的NotI位点，产生质粒pXW027，从而构建huCBE11/huBHA10双特异性-2抗体表达载体。证实pXW027中2.31kb NotI插入物的DNA序列。图3A和3B显示了pXW027编码的成熟huCBE11/huBHA10双特异性-2抗体构建体的cDNA和氨基酸序列：它含有在其C末端连接2X Gly4Ser柔性接头的scFv.huCBE11，并与在其Fc C末端连接与scFv.huBHA10融合的2X Gly4Ser柔性接头的人IgG1 Fc融合。图6A显示了双特异性-2抗体的示意图。通过用pXW027转染在293-EBNA细胞中瞬时表达huCBE11/huBHA10双特异性-2抗体构建体。对从瞬时转染的细胞收获的条件培养液进行Western印迹分析，证实了huCBE11/huBHA10双特异性-2抗体构建体的表达。当用抗人Fc特异性抗体(Fc-scFv.huBHA10-通过EBV表达载体pXW018转染产生，scFv.huCBE11-Fc通过EBV表达载体pXW026的转染性，用作阳性对照，空载体pCH274用作阴性对照)探测Western印迹时，检测到均二聚抗体。通过流式细胞计数法测定其对HT29和COS7细胞上表面LTbR的染色能力证实了huCBE11/huBHA10双特异性-2抗体构建体的特异性。准备用pXW027大规模转染293-EBNA细胞，以产生抗体进行纯化。
实施例5 单特异性-1四价CBE11抗体的构建和表达
类似于huCBE11/huBHA10双特异性-1和2抗体的设计，单特异性抗体构建体中设计有四个由huCBE11衍生的抗原结合位点。图6B显示了CBE11四价单特异性抗体的示意图。四价CBE11抗体的构建需要重建用于与Fc的C末端融合的scFv.huCBE11。模板pXW025编码的scFv.huCBE11重加工中的第一步是Stratagene Quikchange定点诱变，其中使用诱变引物(a)：5’GGA CTG GAC CTG GAG GGT CCC CGGGGG GGG AGG TGG ATC AGG AGG TGG CGG CTC CGA GGT ACA ACT GGT GG3’(SEQ ID NO：14)及其反向互补物，向huCBE11 scFv的5’末端添加符合读框的XmaI位点及随后的柔性2X Gly4Ser接头，利用引物(b)：5’CAT GTA TTG GTT TCG CCA GGC ACC GGG AAA GGG GCT GGAG 3’(SEQ ID NO：15)及其反向互补物除去huCBE11重链可变结构域的FR2中的内部XmaI位点。筛选出内部XmaI位点丧失并在合适位置具有新XmaI位点的突变质粒。证实了所得质粒pXW032中786bpBamHI-XmaI huCBE11 scFv插入物的DNA序列。对模板pXW032进行Stratagene Quikchange定点诱变，其中使用诱变引物：5’GCA CCA AGCTGG AGA TCA AAT GAG GCG GCC GCT CAG GAG GTG GAG GAT CC 3’(SEQID NO：16)及其反向互补物在scFv的轻链可变结构域FR4的末端添加终止密码子，并添加3’NotI克隆位点。筛选获得了NotI位点的突变质粒。证实了所得质粒pXW035中767bp XmaI-NotI连接scFv.huCBE11插入物的DNA序列。将来自pEAG1397的752bpNotI-XmaI可溶性huIgG1 Fc片段和来自pXW035的767bp XmaI-NotI连接scFv.huCBE11片段亚克隆进入由pCEP4衍生得到的EBV表达载体pCH274的NotI位点，产生pXW038。证实了pXW038中1.52kb NotIFc-scFv.huCBE11插入物的DNA序列。通过用pXW038瞬时转染293-EBNA细胞可以表达可溶性Fc-scFv.huCBE11。
将来自pEAG1325的1170bp NotI-BsrGI huCBE11重链片段和来自pXW038的1057bp BsrGI-NotI Fc-scFv.huCBE11片段亚克隆进入由pCEP4衍生的EBV表达载体pCH274的NotI位点，产生pXW039。证实了pXW039中2.23kb NotI插入物的DNA序列：它含有huCBE11重链，其C末端通过2X Gly4Ser柔性接头与huCBE11 scFv连接。用pXW039和huCBE11轻链的EBV表达载体-pAND076瞬时共转染293-EBNA细胞，可以表达单特异性-1huCBE11。图4A和4B以及图6B描绘了huCBE11单特异性-1抗体构建体的成熟重链的DNA和氨基酸序列。
实施例6 单特异性-2价huCBE11抗体的构建和表达
构建具有类似于huCBE11/huBHA10双特异性-2抗体结构的单特异性四价huCBE11抗体。图6B显示了CBE11四价单特异性抗体的示意图。根据下列克隆程序进行构建。将来自pXW026的1220bp NotI-BsrGIFc-scFv.huCBE11片段和来自pXW038的1057bp BsrGI-NotIFc-scFv.huCBE11片段亚克隆进入由pCEP4衍生的EBV表达载体pCH274的NotI位点，产生pXW040。证实了pXW040中2.28kb NotI插入物的DNA序列：它含有在其C末端连接了2X Gly4Ser柔性接头的scFv.huCBE11与在Fc的C末端连接了2X Gly4Ser柔性接头的人IgG1Fc融合，并融合了scFv.huCBE11。图5A和5B以及图6B用示意图显示了pXW040编码的成熟单特异性-2huCBE11构建体的DNA和氨基酸序列。用pXW040转染可以在293-EBNA细胞中瞬时表达单特异性-2抗体构建体。
实施例7 五聚嵌合CBE11的构建和表达
在申请人的共同待审申请PCT公开号WO 02/30986中预先描述了CBE11可变结构域的克隆和分别用于嵌合CBE11(chCBE11)kappa轻链和IgG1重链的EBV表达载体pEAG982和pEAG983的构建，该申请并入这里作为参考。
Smith等(1995)J.Immunol.
154：2226报道了向IgG恒定区添加C末端IgM尾段后可以产生聚合的重组IgM样抗体，大大增加它们的亲和性。通过定点诱变将来自IgM的18个氨基酸C末端尾段添加至嵌合CBE11-huIgG1重链的C末端，使Smith等描述的C末端尾段加倍，其中野生型IgG1 C末端PGK序列被人IgM C末端序列TGKPTLYNVSLVM SDTAGTCY(SEQ ID NO：21)置换。对在pUC衍生的克隆载体中以SalI-NotI片段形式含有人IgG1 Fc cDNA的模板pEAG409进行独特位点的消除(USE)诱变，其中使用Amersham PharmaciaBiotech USE诱变试剂盒，遵循制造商推荐的方案，利用诱变引物5’GAA GAG CCT CTC CCT GTC TAC CGG GAA ACC CAC CCT GTA CAA CGT GTCCCT GTG AGT GCG GCG GCC GCC 3’(SEQ ID NO：22)进行，该诱变引物将脯氨酸445(Kabat EU编号)突变为苏氨酸，并添加IgM尾段的前8个氨基酸。通过筛选导入的RsaI和AflIII位点而鉴定突变质粒。证实了所得质粒pEAG423中含有IgG cDNA C末端的Nsi-NotI插入物的DNA序列。
对模板质粒pEAG423进行另一轮USE诱变，其中使用诱变引物5’CCC TGT ACA ACG TGT CCC TGG TCA TGT CCG ACA CAG CTG GCA CCT GCTACT GAG TGC GGC GGC CGC C 3’(SEQ ID NO：23)，添加IgM尾段的最后10个氨基酸。通过筛选导入的DdeI和PvuII位点而鉴定突变质粒。证实所得质粒pEAG427中的Fc cDNA序列。为了向嵌合CBE11-IgG1重链的C末端添加IgM附属物，将来自pEAG983的1.57kbNotI-NsiI片段和来自pEAG427的0.12kb NsiI-NotI片段亚克隆进入由pCEP4(Invitrogen)衍生的EBV表达载体pCH269中的NotI位点，产生质粒pEAG995。
通过重链载体pEAG995和轻链载体pEAG982瞬时共转染293-EBNA细胞产生五聚嵌合CBE11抗体。图11显示了pEAG995和pEAG982编码的预测的成熟cDNA序列。转染细胞分泌单体和五聚chCBE11，亲和性大大增强。Western印迹分析表明pEAG995共转染中产生的重链比野生型chCBE11-IgG1重链载体pEAG983共转染产生的重链大。扩大pEAG982和pEAG995瞬时共转染规模，以产生五聚抗体进行纯化。
实施例8 多价抗LTBR抗体的体外分析
为了确定本发明多价抗体，例如双特异性-1、双特异性-2、单特异性1和单特异性2抗体抑制肿瘤细胞生长的体外功效，平行测试多价抗体以及各种形式的CBE11和BHA10抗体。
根据下列程序制备抗体。从稳定的表达CHO细胞系产生人源化CBE11和人源化BHA10抗体。从EBNA293细胞瞬时表达产生双特异性1、双特异性2、单特异性1、单特异性2和嵌合CBE11五聚抗体。首先在蛋白A Spharose(Amersham-Pharmacia)上层析纯化全部七种抗体。在Fractogel Hicap TMAE(EM Industries)和PhenylSepharose(Amersham-Pharmacia)上层析进一步纯化人源化CBE11。在Fractogel Hicap SE(EM Industries)上层析进一步纯化人源化BHA10和双特异性-1抗体。在Sepharose 6B上大小排阻层析纯化嵌合CBE11五聚体。
在G3000SW(TosoHaas)上大小排阻层析进一步纯化少量的每一种抗体(除了嵌合CBE11五聚体)，以除去任何聚集体(二聚物和更大的聚集体)。人源化CBE11、人源化BHA10和CBE11五聚体的消光系数为1.4。双特异性-1和单特异性1的消光系数为1.6。双特异性2和单特异性2的消光系数为1.7。SDS-PAGE和质谱分析表明纯化抗体至少95％是完整的。
为确定本发明多价抗体的抗肿瘤活性，使用HT29腺癌细胞系测定每一种抗体体外抑制肿瘤细胞生长的能力。结肠腺癌细胞系HT-29(ATCC)在补充10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、1％ NEAA的MEM Earle’s中，37℃，5％CO2中生长。将HT29细胞接种在96孔板的孔(5,000个细胞/孔)中，使用含有人γ干扰素(80U/ml)和各种浓度的抗体药剂的培养基。培养4天后，活细胞用MTT[3，4，5-二甲基噻唑-2-基)2，5二苯基四唑鎓溴化物]染色，其中MTT在线粒体中被还原成在570nm下吸收的有色甲产物。
在各种抗LTBR激动剂抗体(和γ干扰素)存在下，HT29腺癌细胞系的生长降至各种程度，如图8所示。每一种抗LTBR试剂到达不同的平台期，相当于最大活性(450nm下的最小吸光度值)。这个平台期是LTBR活化剂效力的量度。人源化BHA10是效力最低的试剂(最小A450＝0.9)，随后是人源化CBE11(最小A450＝0.8)。成对人源化CBE11和人源化BHA10显著增加功效(最小A450＝0.6)，但是huBHA10抗原结合区与huCBE11在单个四价分子中的组合(双特异性1)进一步提高了功效(最小A450＝0.5)。具有十个抗原结合位点的CBE11五聚体是最有效的试剂(最小A450＝0.3)。总之，双特异性(BHA10/CBE11)和单特异性(CBE11)四价抗体显示抑制肿瘤细胞生长的能力与huCBE11和huBHA10相比增加。
实施例9 在无胸腺裸鼠中，WiDr人结肠直肠腺癌对huBHA10和双特异
性1和2的比较性反应
WiDr人结肠直肠腺癌体外细胞系从美国典型培养物保藏中心获得。将此细胞系在含2mM L-谷氨酰胺和调至含有1.5g/L碳酸氢钠、0.1mM非必需氨基酸和1.0mM丙酮酸钠90％的Earle′s BSS；胎牛血清10％(无抗生素)的极限必需培养基Eagle中经过体外传代4次。
220只雌性无胸腺裸鼠从Harlan Sprague Dawley(Madison，WI)获得。随机化之前通过耳朵穿孔逐一标记动物。在随机化分成测试和对照组的当天，给动物植入BioMedic动物ID芯片。在右侧区域经皮下给动物植入2×10E6个细胞/小鼠的细胞接种物(RPMI-1640w/o血清)。在植入后5天，记录肿瘤大小测量值，并每天或隔天继续测量，直到植入后第7天确定阶段时为止。
选择具有使用游标卡尺测定测量最小尺寸为5mm(长度)×5mm(宽度)的肿瘤的小鼠。使用LabCat软件将小鼠随机分成测试和对照组。记录初始体重和给予治疗组的治疗如下：
表1
| 组 | 治疗方案 | 动物数 |
| PBS(无热源对照)， | 200uL/小鼠，i.p.，3x/周x4周.(M，W，F) | 20 |
| 紫杉酚 | 25.0mg/kg/腹膜内注射，Q4DX3 | 8 |
| huBHA10 | 200ug/200uL/腹膜内注射，2x/周x4周(M，Th) | 8 |
| huBHA10 | 100ug/200uL/腹膜内注射，2x/周x4周(M，Th) | 8 |
| huBHA10 | 50ug/200uL/腹膜内注射，2x/周x4周(M，Th) | 8 |
| huBHA10 | 25ug/200uL/腹膜内注射，2x/周x4周(M，Th) | 8 |
| 双特异性1 | 200ug/200uL/腹膜内注射，3x/周x4周(M，W，F) | 8 |
| 双特异性1 | 100ug/200uL/腹膜内注射，3x/周x4周(M，W，F) | 8 |
| 双特异性1 | 50ug/200uL/腹膜内注射，3x/周x4周(M，W，F) | 8 |
| 双特异性1 | 25ug/200uL/腹膜内注射，3x/周x4周(M，W，F) | 8 |
用下列指标估计治疗效果：初始体重、每周两次测量的肿瘤大小和体重、在第14、24、35天(治疗第7、17、28天)huBHA10组的血清样品(眼眶后出血)、和在第13、23、34天(治疗第7、18、28天)BS1组和10只载体对照组小鼠的血清样品(眼眶后出血)。
图9描述了WiDr人结肠腺癌肿瘤对双特异性-1的反应。图10描述了双特异性-1和huCBE11在抑制WiDr人结肠腺癌肿瘤生长中的效力比较。
等同物
本发明提供了新的抗体构建体等等。虽然已经论述了本发明的具体实施方案，但是上述说明书是说明性的而非限制性的。在回顾本说明书时，本发明的许多变化对本领域技术人员将变得显而易见。所附权利要求并非意在要求所有这些实施方案和变化，应该参考权利要求连同它们的等同物的全部范围、说明书连同这样的变化一起确定本发明的全部范围。
因此这里提及的所有出版物和专利的全部内容并入作为参考，如同每一单独出版物或专利被具体和逐一地指出并入作为参考。在冲突的情况下，将以本申请、包括其中的任何定义为准。
序列表
<110>Biogen Idec MA Inc.
<120>多价淋巴毒素β受体激动剂及其治疗用途
<130>BINA168PC
<150>60/435154
<151>2002-12-20
<160>20
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>2094
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>huCBE11/huBHAIO双特异性-1抗体重链
<400>1
gaggtacaac tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaggctc 60
tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt gactattaca tgtattggtt tcgccaggcc 120
ccgggaaagg ggctggagtg ggtcgcaacc attagtgatg gtggtagtta cacctactat 180
ccagacagtg tgaaggggcg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa cagcctctac 240
ctgcagatga gcagcctgag ggctgaggac acagctgtgt attactgcgc aagagaggag 300
aatggtaact tttactactt tgactactgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca 360
gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 420
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 480
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 600
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 660
aaatcttgtg acaagactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 720
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 780
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 840
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 900
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 960
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1020
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgcgatgag 1080
ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1140
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1200
ttggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1260
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1320
cagaagagcc tctccctgtc tcccggggga gggggtggat caggaggtgg cggctcccag 1380
gtccaactgg tgcagtctgg agctgaggtg aagaagcctg ggtcctcagt gaaggtgtcc 1440
tgcaaggctt ctggctacac tttcacaacc tactatttgc actgggtgag gcaggcccct 1500
ggacagggac ttgagtggat gggatggatt tatcctggaa atgttcatgc tcagtacaat 1560
gagaagttca agggcagggt cacaatcact gcagacaaat ccaccagcac agcctacatg 1620
gagctcagca gcctgaggtc tgaagatact gcggtctatt actgtgcaag atcctgggaa 1680
ggttttcctt actggggcca agggaccacg gtcaccgtct cctcaggtgg gggcggatct 1740
gggggcggcg gatccggtgg tggtggtagt gacattcaga tgacccagtc tcctagctcc 1800
ctgtccgcct cagtaggaga cagggtcacc atcacctgca aggccagtca gaatgtgggt 1860
attaatgtag cctggtatca acagaaacca gggaaggctc ctaaatcact gatttcctcg 1920
gcctcctacc ggtacagtgg agtcccttcc agattcagcg gcagtggatc tgggacagat 1980
ttcactctca ccatcagcag cctccagcct gaagacttcg caacctattt ctgtcagcaa 2040
tatgacacct atccattcac gttcggccag ggtaccaagg tggagatcaa atga 2094
<210>2
<211>697
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>huCBE11/huBHAIO重链
<400>2
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Asp Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Glu Asn Gly Asn Phe Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val
450 455 460
Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser
465 470 475 480
Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr Tyr Leu His Trp Val
485 490 495
Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Tyr Pro
500 505 510
Gly Asn Val His Ala Gln Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr
515 520 525
Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser
530 535 540
Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Trp Glu
545 550 555 560
Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly
565 570 575
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile
580 585 590
Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg
595 600 605
Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Ile Asn Val Ala
610 615 620
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile Ser Ser
625 630 635 640
Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly
645 650 655
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp
660 665 670
Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asp Thr Tyr Pro Phe Thr Phe
675 680 685
Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
690 695
<210>3
<211>645
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>huCBE11/huBHAIO双特异性-1抗体轻链
<400>3
gatatccaga tgacccagtc tccatcatcc ttgtctgcat cggtgggaga cagggtcact 60
atcacttgca aggcgggtca ggacattaaa agctatttaa gctggtacca gcagaaacca 120
gggaaagcgc ctaagcttct gatctattat gcaacaaggt tggcagatgg ggtcccatca 180
agattcagtg gcagtggatc tggtacagat tatactctaa ccatcagcag cctgcagcct 240
gaggatttcg caacttatta ctgtctacag catggtgaga gcccgtggac gttcggtgga 300
ggcaccaagc tggagatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600
ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag 645
<210>4
<211>194
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>huCBE11/huBHAIO双特异性-1抗体轻链
<400>4
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Gly Gln Asp Ile Lys Ser Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Thr Arg Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Gly Glu Ser Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly
180 185 190
Glu Cys
<210>5
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>成熟huCBE11/huBHAIO双特异性-2抗体
<400>5
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ccgggaaagg ggctggagtg ggtcgcaacc attagtgatg gtggtagtta cacctactat 180
ccagacagtg tgaaggggcg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa cagcctctac 240
ctgcagatga gcagcctgag ggctgaggac acagctgtgt attactgcgc aagagaggag 300
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gggggcgggg ggtccggggg aggcgggtcg ggaggtggcg gaagtgatat ccagatgacc 420
cagtctccat catccttgtc tgcatcggtg ggagacaggg tcactatcac ttgcaaggcg 480
ggtcaggaca ttaaaagcta tttaagctgg taccagcaga aaccagggaa agcgcctaag 540
cttctgatct attatgcaac aaggttggca gatggggtcc catcaagatt cagtggcagt 600
ggatctggta cagattatac tctaaccatc agcagcctgc agcctgagga tttcgcaact 660
tattactgtc tacagcatgg tgagagcccg tggacgttcg gtggaggcac caagctggag 720
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cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc 840
cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg 900
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agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc 1080
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acgttcggcc agggtaccaa ggtggagatc aaatga 2196
<210>6
<211>731
<212>PRT
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<220>
<223>成熟huCBE11/huBHAIO双特异性-2抗体
<400>6
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
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Tyr Met Tyr Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Asp Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Glu Asn Gly Asn Phe Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser
130 135 140
Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala
145 150 155 160
Gly Gln Asp Ile Lys Ser Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
165 170 175
Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Thr Arg Leu Ala Asp Gly
180 185 190
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu
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Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser
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Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
260 265 270
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
275 280 285
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
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His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
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Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
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Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
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Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
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Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
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Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln
485 490 495
Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys
500 505 510
Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr Tyr Leu His
515 520 525
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile
530 535 540
Tyr Pro Gly Asn Val His Ala Gln Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Arg
545 550 555 560
Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu
565 570 575
Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser
580 585 590
Trp Glu Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
595 600 605
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
610 615 620
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
625 630 635 640
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Ile Asr
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Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
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Ser Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
675 680 685
Ser Glv Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
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Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asp Thr Tyr Pro Phe
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<212>DNA
<213>人工序列
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<223>huCBE11单特异性-1抗体
<400>7
gaggtacaac tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaggctc 60
tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt gactattaca tgtattggtt tcgccaggcc 120
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ctgcagatga gcagcctgag ggctgaggac acagctgtgt attactgcgc aagagaggag 300
aatggtaact tttactactt tgactactgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca 360
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<223>huCBE11单特异性-1抗体
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
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Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Glu Glu Asn Gly Asn Phe Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
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Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
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Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
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Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
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Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
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Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Prc
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Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val
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Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
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Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
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Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser
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Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Glu Asn
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Gly Asn Phe Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
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Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
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Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
595 600 605
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tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 1140
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Ala Arg Glu Glu Asn Gly Asn Phe Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser
130 135 140
Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala
145 150 155 160
Gly Gln Asp Ile Lys Ser Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
165 170 175
Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Thr Arg Leu Ala Asp Gly
180 185 190
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu
195 200 205
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu
210 215 220
Gln His Gly Glu Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu
225 230 235 240
Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser
245 250 255
Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
260 265 270
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
275 280 285
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
290 295 300
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
305 310 315 320
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
325 330 335
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
340 345 350
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
355 360 365
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
370 375 380
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
385 390 395 400
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
405 410 415
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
420 425 430
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
435 440 445
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
450 455 460
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
465 470 475 480
Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln
485 490 495
Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Arg
500 505 510
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr Met Tyr
515 520 525
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Thr Ile
530 535 540
Ser Asp Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg
545 550 555 560
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met
565 570 575
Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu
580 585 590
Glu Asr Gly Asn Phe Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
595 600 605
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
610 615 620
Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
625 630 635 640
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Gly Gln Asp
645 650 655
Ile Lys Ser Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
660 665 670
Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Thr Arg Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser
675 680 685
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser
690 695 700
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Gly
705 710 715 720
Glu Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
725 730 735
<210>11
<211>100
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>11
caatctcaaa gctaccatgg aggtcaccgt ctcctctggg ggcggggggt ccgggggagg 60
cgggtcggga ggtggcggaa gtgatatcca gatgacccag 100
<210>12
<211>68
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>12
gcaccaagct ggagatcaaa gggggtggtg gttcaggagg tggaggatcc ttcccaccat 60
ccagtgac 68
<210>13
<211>46
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>13
gttctggatt ccggcgtcgg gatccgagcc caaatctagt gacaag 46
<210>14
<211>71
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>14
ggactggacc tggagggtcc ccgggggggg aggtggatca ggaggtggcg gctccgaggt 60
acaactggtg g 71
<210>15
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>15
catgtattgg tttcgccagg caccgggaaa ggggctggag 40
<210>16
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>16
gcaccaagct ggagatcaaa tgaggcggcc gctcaggagg tggaggatcc 50
<210>17
<211>1407
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>成熟五聚CBE11重链
<400>17
gaggtacaac tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt gactattaca tgtattggtt tcgccagact 120
ccggaaaaga ggctggagtg ggtcgcaacc attagtgatg gtggtagtta cacctactat 180
ccagacagtg tgaaggggcg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caacctgtac 240
ctgcaaatga gcagtctgaa gtctgaggac acagccatgt attactgtgt aagagaggag 300
aatggtaact tttactactt tgactactgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca 360
gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 420
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 480
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 600
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 660
aaatcttgtg acaagactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 720
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 780
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 840
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 900
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 960
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1020
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 1080
ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1140
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1200
ttggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1260
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1320
cagaagagcc tctccctgtc taccgggaaa cccaccctgt acaacgtgtc cctggtcatg 1380
tccgacacag ctggcacctg ctactga 1407
<210>18
<211>468
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>成熟五聚CBE11重链
<400>18
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Phe Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Asp Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Asn Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Glu Glu Asn Gly Asn Phe Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Thr
435 440 445
Gly Lys Pro Thr Leu Tyr Asn Val Ser Leu Val Met Ser Asp Thr Ala
450 455 460
Gly Thr Cys Tyr
465
<210>19
<211>645
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>成熟嵌合CBE11轻链
<400>19
gatattaaga tgacccagtc tccatcctcc atgtatgcat cgctgggaga gagagtcact 60
atcacttgca aggcgggtca ggacattaaa agctatttaa gctggtacca gcagaaacca 120
tggaaatctc ctaagatcct gatctattat gcaacaaggt tggcagatgg ggtcccatca 180
agattcagtg gcagtggatc tgggcaagat tattctctaa ccatcagcag cctggagtct 240
gacgatacag caacttatta ctgtctacag catggtgaga gcccgtggac gttcggtgga 300
ggcaccaagc tggagatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccct9acg 540
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600
ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag 645
<210>20
<211>214
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>成熟嵌合CBE11轻链
<400>20
Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Gly Gln Asp Ile Lys Ser Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Trp Lys Ser Pro Lys Ile Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Thr Arg Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser
65 70 75 80
Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Gly Glu Ser Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
Claims (33)
1.包含淋巴毒素β受体(LT-β-R)表位特异性的至少一个抗原识别位点的多价抗体。
2.权利要求1的多价抗体，其中至少一个抗原识别位点位于scFv结构域上。
3.权利要求1的多价抗体，其中所有的抗原识别位点位于scFv结构域上。
4.权利要求1的多价抗体，其中抗体构建体是单特异性的。
5.权利要求4的多价抗体，其中抗体构建体是CBE11所结合的表位特异性的。
6.权利要求5的多价抗体，其中抗体构建体是四价的。
7.权利要求4的多价抗体，其中抗体构建体是BHA10表位特异性的。
8.权利要求7的多价抗体，其中抗体构建体是四价的。
9.权利要求4-8任一项的多价抗体，其中至少一个抗原识别位点位于scFv结构域上。
10.权利要求4-8任一项的多价抗体，其中所有的抗原识别位点位于scFv结构域上。
11.权利要求1的多价抗体，其中抗体构建体是双特异性的。
12.权利要求11的多价抗体，其中抗体构建体对由BKA11、CDH10、BCG6、AGH1、BDA8、CBE11和BHA10组成的淋巴毒素β受体(LT-β-R)表位的组中至少两个成员是特异性的。
13.权利要求12的多价抗体，其中抗体构建体是CBE11和BHA10表位特异性的。
14.权利要求13的多价抗体，其中抗体构建体是四价的。
15.权利要求14的多价抗体，其中抗体构建体具有两个CBE11特异性抗原识别位点和两个BHA10特异性识别位点。
16.权利要求11-15任一项的多价抗体，其中至少一个抗原识别位点位于scFv结构域上。
17.权利要求11-15任一项的多价抗体，其中所有的抗原识别位点位于scFv结构域上。
18.在前权利要求中任一项的抗体用于制备治疗癌症的药物的用途。
19.包含有效量的权利要求1-18中任一项的多价抗体构建体和药物可接受载体的药物组合物。
20.一种治疗受试者的癌症的方法，包括给所述受试者施用有效量的权利要求19的组合物。
21.权利要求20的方法，其中所述受试者是人。
22.包含SEQ ID No.：1的核酸。
23.包含SEQ ID No.：3的核酸。
24.包含SEQ ID No.：5的核酸。
25.包含SEQ ID No.：7的核酸。
26.包含SEQ ID No.：9的核酸。
27.包含SEQ ID No.：2的多肽。
28.包含SEQ ID No.：4的多肽。
29.包含SEQ ID No.：6的多肽。
30.包含SEQ ID No.：8的多肽。
31.包含SEQ ID No.：10的多肽。
32.包含权利要求22-31任一项的核酸的表达载体。
33.包含权利要求32的表达载体的细胞。
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