TW202241455A - 使用akr1c3活化化合物與免疫檢查點抑制劑之組合療法 - Google Patents

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明添 賴
李婉芬
王俊中
陳律慈
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Abstract

本文提供一種醫藥組合物及其醫療用途。該醫藥組合物包括化合物1-(3-(3-N,N-二甲基胺基羰基)苯氧基-4-間苯基)-1-乙基-N,N′-雙(乙烯)胺基磷酸酯及至少一治療劑,該治療劑包括化學治療劑或生物試劑。

Description

使用AKR1C3活化化合物與免疫檢查點抑制劑之組合療法
本發明涉及一種組合物及其醫療用途,該組合物包括化合物1-(3-(3-N,N-二甲基胺基羰基)苯氧基-4-間苯基)-1-乙基-N,N'-雙(乙烯)胺基磷酸酯與至少一治療劑之組合,該治療劑包括化學治療劑或生物試劑。
癌症係人類罹病率及死亡率之主要原因之一。癌症治療具有挑戰性,此乃因難以在不損傷或殺死正常細胞之情形下殺死癌細胞。在癌症治療期間損傷或殺死正常細胞係在患者中產生不利副作用之原因,且其限制向癌症患者投與之抗癌藥物之量。
醛酮還原酶家族1成員C3(AKR1C3)係人類中由AKR1C3基因編碼之酶。此基因編碼醛/酮還原酶超家族之成員,該超家族由多於40種已知酶及蛋白質組成。該等酶藉由利用NADH及/或NADPH作為輔因子來催化醛及酮轉化為其相應醇。其亦被稱為第5型,17β-羥基類固醇去氫酶(17β-hydroxysteroid dehydrogenase,17β-HSD)以及前列腺素F合成酶。AKR1C3為醛糖酮還原酶(aldo-keto reductases,AKRs)的15個基因家族的成員之一。AKR1C3最初是從人類前列腺 (1)以及胎盤 (2)的cDNA文庫中選殖出來的。AKR1C3為一種單體、存在胞質液(cytosolic)中的NAD(P)(H)依賴性氧化還原酶,具有323個胺基酸,分子量為37 kDa (1)。AKR1C3與其相關的人類AKR1C家族,包括AKR1C1、AKR1C2,以及AKR1C4,具有高度的序列同源性。AKR1C3催化雄性荷爾蒙、雌性荷爾蒙、孕酮(progesterone),以及前列腺素(prostaglandin,PG)代謝,隨後參與核受體活性的調節 (3,4)。AKR1C3在包括類固醇荷爾蒙依賴性以及類固醇荷爾蒙非依賴性細胞在內的正常組織中表現,其平均表現量低,除了在肝臟、腎臟,以及小腸以外 (5)。許多研究顯示,AKR1C3在許多惡性實體及血液系統腫瘤中異常過度表現。數據顯示,以免疫組織化學評分(immunohistochemistry,IHC評分)0至6的評分範圍內,檢測到超過50%的肝癌、膀胱癌、腎癌,以及胃癌中AKR1C3的高度表現,其IHC評分≥ 4 (6)。AKR1C3在非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)中高度表現,但在小細胞肺癌中則否 (7)
據報導,癌症中的AKR1C3上調與去勢抗性前列腺癌(castrate-resistant prostate cancer,CRPC (8))以及直腸癌(colorectal cancer,CRC (9))的轉移有關,且還與預後不良以及低存活率有關 (10,11)。另外,許多類型的治療抗性歸因於AKR1C3的過度表現。據報導,對阿黴素(doxorubicin) (12,13)、恩雜魯胺(enzalutamide) (14)、阿比特龍(abiraterone) (15)及氨甲蝶呤(methotrexate) (16)的化學療法抗性與細胞中AKR1C3的高度表現直接相關。食道癌 (17)、前列腺癌 (18)以及NSCL癌細胞 (19)中的放射線療法抗性與AKR1C3過度表現有關。AKR1C3對抗電離輻射的主要作用機制為減少細胞中的活性含氧物(reactive oxygen species,ROS)、增加PGF2α,隨後導致MAP激酶活化以及PPARγ的抑制,進而顯著減少DNA損傷 (18)。免疫治療抗性也歸因於AKR1C3的高度表現。一項研究顯示,基於全基因組微陣列以及多重定量(q)RT-PCR基因表現分析 (20),AKR1C3的高度表現與PD-L1陽性晚期腎細胞癌(renal cell carcinoma,RCC)患者的PD-1標靶治療失敗有關。由於AKR1C3的腫瘤特異性過度表現,設計AKR1C3活化的前驅藥成為一種專門針對癌症的有吸引力的方法。其中一個例子為AKR1C3活化的前驅藥PR104,儘管其最初被設計為一種低氧活化的前驅藥 (22-24),但其在體外及體內均表現出良好的抗腫瘤活性 (6,21)
本發明之式I-1的抗癌前驅藥(在本文中以OBI-3424表示)為一種化學合成的強氮芥(nitrogen mustard),其在NADPH的存在下被AKR1C3選擇性裂解為細胞毒性氮丙啶(aziridine)(在本文中以OBI-2660表示)。由OBI-3424釋放的活性分子OBI-2660與標準化學治療藥物噻替哌(thiotepa)以及絲裂黴素C(mitomycin C)相似,後者導致DNA在鳥嘌呤(guanine)的N7(或O6)位置上的烷基化及交聯。目前在亞洲,前驅藥OBI-3424由深圳艾欣達偉醫藥科技有限公司(Ascentawits Pharmaceuticals, LTD.)開發,在亞洲以外的國家由OBI製藥公司(OBI Pharma, Inc.)開發(藥物代碼OBI-3424),以用於治療惡性腫瘤。前驅藥OBI-3424目前正在美國(NCT04315324以及NCT03592264)及中國(CXHL1900137以及CXHL2000263)進行多個臨床第一期試驗研究,以治療超過14種的人類癌症,包括實體瘤以及血液系統惡性腫瘤。由於AKR1C3在腫瘤中的高度表現,前驅藥OBI-3424被設計為在腫瘤中會被特異性活化,但在AKR1C3表現量低的正常細胞中不會被活化,以達到以腫瘤為特異性標靶的作用。此外,OBI-3424的腫瘤選擇性活化與非選擇性傳統烷基化劑,例如環磷醯胺(cyclophosphamide)以及異環磷醯胺(ifosfamide)不同,這表示OBI-3424有潛力成為範圍廣、高選擇性的抗腫瘤藥物。據報導,前驅藥OBI-3424在體外及體內對T-ALL的臨床前模型均顯示出強效功效 (25,26)
在NADPH存在的情況下,AKR1C3調節OBI-3424的還原作用,進而釋放出細胞毒性部分體OBI-2660,其為一種氮丙啶雙烷基化劑,可導致DNA在鳥嘌呤N7(或O6)位置的交聯,並隨後導致細胞死亡。
Figure 02_image001
OBI-3424還原活化途徑示意圖
近年來,設計以癌細胞為標靶的前驅藥已成為一種有吸引力的癌症治療策略;然而,由於缺乏有效的生物標記物來選擇患者,許多前驅藥在臨床第三期試驗中失敗了 (27)。鑑於可使用RT-PCR或免疫組織化學來評估AKR1C3的表現,可透過選擇具有較高AKR1C3表現且最可能對前驅藥產生反應的患者,以臨床有效的方式開發OBI-3424。AKR1C3被證明在獲得化學抗性 (13,14)、放射線抗性 (19)以及免疫抗性 (20)時過度表現。此外,已知具有同源重組缺陷(homologous recombination deficiency,HRD)的癌症,例如卵巢癌、乳癌,以及胰臟癌對DNA損傷劑敏感 (28)。作為DNA烷基化劑,OBI-3424也可能是治療具有AKR1C3表現的HRD癌症的良好候選藥物。
仍然需要適合於治療癌症患者的化合物,其為一種選擇性的AKR1C3還原酶活化的前驅藥,以及一種新穎、選擇性且廣泛的抗癌劑。本發明滿足了此一需求。
計畫性死亡1(PD-1)為表現在T細胞、B細胞、或單核球上之抑制性受體。PD-L1與PD-L2為PD-1之配體,其經確定在結合至PD-1時向下調節T細胞活化與細胞激素分泌。以PD-1配合PD-L1或PD-L2,導致免疫反應向下調節。因此,已知阻斷PD-1/PD-L1途徑可減弱對抗癌症時的中樞與週邊免疫反應。在包括黑色素瘤、非小細胞肺癌(NSCLC)、腎細胞癌(RCC)、膀胱癌、及何杰金氏淋巴瘤(Hodgkin’s lymphoma)等15種以上的癌症類型中,標靶PD-1與PD-L1途徑顯示臨床功效。然而,仍有許多病患沒有反應;一些病患出現最初的反應,但隨時間推移產生抗藥性。因此,迫切需要確定結合醫療的抗藥性機制。
基於如PCT專利申請號PCT/US2016/062114(WO2017087428A1)中公開的化合物或其醫藥上可接受的鹽類或其溶劑化物,本發明提供該化合物的醫療用途,並提供包括該化合物或其醫藥上可接受的鹽類、其同位素變體或其溶劑化物之組合物,及其抗癌醫療用途。
於一態樣,本發明提供由式I(於本文中以OBI-2870表示)表示之化合物1-(3-(3-N,N-二甲基胺基羰基)苯氧基-4-間苯基)-1-乙基-N,N'-雙(乙烯)胺基磷酸酯(1-(3-(3-N,N-dimethylaminocarbonyl)phenoxyl-4-mtrophenyl)-1-ethyl-N,N'-bis (ethylene)phosphoramidate),或其醫藥上可接受的鹽類、同位素變體或溶劑化物在製造用於治療一患者癌症的藥物之用途,其中該癌症的AKR1C3還原酶含量由AKR1C3蛋白含量或RNA含量來表示,且等於或大於一預定值。AKR1C3含量係根據所屬領域中具有通常知識者習知之常規方法測量。
Figure 02_image002
式I (OBI-2870)
根據本發明之特定實施例,該化合物為由式I-1(於本文中以OBI-3424表示)表示之(S)-1-(3-(3-N,N-二甲基胺基羰基)苯氧基-4-間苯基)-1-乙基-N,N'-雙(乙烯)胺基磷酸酯,或為由式I-2(於本文中以OBI-3423表示)表示之(R)-1-(3-(3-N,N-二甲基胺基羰基)苯氧基1-4-間苯基)-1-乙基-N,N'-雙(乙烯)胺基磷酸酯。
Figure 02_image004
Figure 02_image005
式I-1                                                    式I-2 (OBI-3424)                                     (OBI-3423)
式I、式I-1或式I-2之化合物的製備揭露於PCT專利申請號PCT/US2016/062114(WO2017087428A1)中,其公開內容透過引用整體併入本文。於本文中,化合物OBI-2870為一外消旋混合物,包含1:1比例的R-鏡像異構物3423以及S-鏡像異構物OBI-3424。
於本文中,該鹽類可為鹼性鹽,包括該化合物與一無機鹼(例如,鹼金屬氫氧化物以及鹼土金屬氫氧化物)或與一有機鹼(例如,單乙醇胺、二乙醇胺或三乙醇胺)形成的鹽類。或者,該鹽可為酸鹽,包括該化合物與一無機酸(例如,鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、硝酸、過氯酸、硫酸或磷酸)或與一有機酸(例如,甲磺酸、三氟甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、對甲苯磺酸、富馬酸(fumaric acid)、草酸(oxalic acid)、馬來酸以及檸檬酸)形成的鹽類。選擇並製備一化合物的可接受的鹽類、溶劑化物等為本領域習知之技術。
根據本發明之特定實施例,式I-1或式I-2之化合物的鏡像異構物超越量不小於80%。較佳地,該化合物的鏡像異構物超越量不小於90%,更佳不小於95%。
根據本發明之特定實施例,式I-1或式I-2之化合物為基本上純的。
根據本發明之特定實施例,該癌症為肝癌、肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)、肺癌、黑色素瘤、前列腺癌、乳癌、血癌、食道癌、腎癌、胃癌、結腸癌、腦癌、膀胱癌、子宮頸癌、卵巢癌、頭頸癌、子宮內膜癌、胰臟癌、肉瘤癌或直腸癌。
根據本發明之特定實施例,該癌症為肝癌。
用於治療癌症的藥物劑量,或該藥物中包含的化合物或其鹽類、同位素變體或溶劑化物或其他化學治療劑的劑量通常取決於所用之具體化合物、患者、具體疾病或狀況及其嚴重性、給藥途徑及頻率等,且需由主治醫生根據具體情況來確定。為了本發明之目的,典型的日劑量可在約0.1 μg/kg至1 μg/kg、至10 μg/kg、至100 μg/kg、至1 mg/kg、至10 mg/kg、至100 mg/kg或更高的任何範圍內,具體取決於上述因素。針對幾天或更長時間的重複給藥,取決於病情,治療持續到出現期望的症狀抑制或直到達到足以減輕癌症或其症狀的治療程度。示例性的給藥方案包括給予約0.1 mg/kg、0.2 mg/kg、0.3 mg/kg、0.4 mg/kg、0.5 mg/kg、0.6 mg/kg、0.7 mg/kg、0.8 mg/kg、0.9 mg/kg、1 mg/kg、2 mg/kg、3 mg/kg、4 mg/kg、5 mg/kg、6 mg/kg、7 mg/kg、8 mg/kg、9 mg/kg 、10 mg/kg或更高的初始劑量,然後每週一次維持劑量。然而,取決於該行醫者希望達到的藥物動力學衰減的模式,其他劑量方案可能是有用的。例如,可考慮每週服用一至四次。於某些實施例中,給藥頻率為每週、每2週、每4週、每5週、每6週、每7週、每8週、每9週或每10週一次;或每月、每2個月或每3個月或更長時間一次。透過常規技術及分析很容易監測該療法的進展。
藥物可為用於臨床給藥的任何劑型,例如片劑、栓劑、分散片、腸溶片、咀嚼片、口腔崩解片、膠囊劑、糖衣劑、顆粒劑、乾粉、口服溶液、注射用小針、注射用凍乾粉或輸注溶液。
根據本發明之特定實施例,該方法進一步包括以下步驟:使用AKR1C3抗體測量一患者體內癌細胞的AKR1C3還原酶的含量,其中AKR1C3還原酶的含量被測量為等於或大於預定值, 然後將該化合物施用於該患者。
於另一態樣,本發明提供一種抑制細胞生長之方法,包括使細胞與一有效量之由式I表示之化合物1-(3-(3-N,N-二甲基胺基羰基)苯氧基-4-間苯基)-1-乙基-N,N'-雙(乙烯)胺基磷酸酯,或其一醫藥上可接受的鹽類、同位素變體或溶劑化物接觸之步驟;其中該細胞的AKR1C3還原酶含量由AKR1C3蛋白含量或RNA含量表示並且等於或大於一預定值。
根據本發明之特定實施例,該方法進一步包括使用AKR1C3抗體測量細胞的AKR1C3還原酶含量之步驟,其中測得的AKR1C3還原酶的含量等於或大於該預定值,並使該化合物與該細胞接觸。
於另一態樣,本發明提供由式I表示之化合物1-(3-(3-N,N-二甲基胺基羰基)苯氧基-4-間苯基)-1-乙基-N,N'-雙(乙烯)胺基磷酸酯,或其一醫藥上可接受的鹽類、同位素變體或溶劑化物在製備用於抑制細胞生長的藥物之用途;其中該細胞的AKR1C3還原酶含量由該AKR1C3蛋白含量或RNA含量表示並且等於或大於一預定值。
根據本發明之特定實施例,該細胞為癌細胞。
於另一態樣,本發明提供一種組合物,包括: (1)由式I表示之化合物1-(3-(3-N,N-二甲基胺基羰基)苯氧基-4-間苯基)-1-乙基-N,N'-雙(乙烯)胺基磷酸酯,或其一醫藥上可接受的鹽類、同位素變體或溶劑化物;以及 (2)至少一治療劑,包括化學治療劑或生物試劑。
根據本發明之特定實施例,該化合物為由式I-1表示之(S)-1-(3-(3-N,N-二甲基胺基羰基)苯氧基-4-間苯基)-1-乙基-N,N'-雙(乙烯)胺基磷酸酯,或為由式I-2表示之(R)-1-(3-(3-N,N-二甲基胺基羰基)苯氧基1-4-間苯基)-1-乙基-N,N'-雙(乙烯)胺基磷酸酯。
根據本發明之特定實施例,該抗PD-1/PD-L1抗體為Bavencio ®(阿維魯單抗(avelumab))、Opdivo ®(納武利尤單抗(nivolumab))、Keytruda ®(帕博利珠單抗(pembrolizumab))、Imfinzi ®(度伐利尤單抗(durvalumab)),及/或Tecentriq ®(阿替利珠單抗(atezolizumab))。
根據本發明之特定實施例,在該癌症為肝癌的情況下,該抗PD-1抗體為Keytruda ®(帕博利珠單抗),且該抗PD-1抗體為Bavencio ®(阿維魯單抗)。
根據本發明之特定實施例,該組合物還包含醫藥上可接受之賦形劑。較佳地,該賦形劑選自惰性稀釋劑、分散劑及/或製粒劑、界面活性劑及/或乳化劑、崩解劑、黏合劑、防腐劑、緩衝劑、潤滑劑及油類。
於另一態樣,本發明提供一種於有需要的患者中治療癌症之方法,包括向該患者施用有效量的根據本發明之組合物的步驟。
根據本發明之特定實施例,該方法進一步包括使用AKR1C3抗體測量患者體內癌細胞的AKR1C3還原酶含量之步驟,當測得AKR1C3還原酶的含量等於或大於預定值時,將該組合物施用於該患者。
因此,本發明之實施例涉及包括式I(OBI-2870)、式I-1(OBI-3424)或式I-2(OBI-3423)之化合物以及至少一抑制性免疫檢查點抗原的抑制劑之組合。於某些特定的實施例中,該免疫檢查點抑制劑為抑制/阻斷該抑制性免疫檢查點抗原的抗免疫檢查點抗體。
於一實施例中,該抑制性免疫檢查點抗原係選自PD-1/PD-L1抗原、細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4(Cytotoxic T-lymphocyte-Associated Protein 4,CTLA-4)、淋巴細胞活化基因3(Lymphocyte Activation Gene 3,LAG-3)、基於T細胞免疫球蛋白與免疫受體酪胺酸的抑制性模體結構域(T-cell ImmunoGlobulin and Immunoreceptor Tyrosine-based inhibitory motif domain,TIGIT)、癌胚抗原相關細胞黏附分子1(Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1,Ceacam 1)、白血球相關類免疫球蛋白受體-1(leucocyte-associated immunoglobulin-like receptor-1,LAIR-1)、T細胞免疫球蛋白及黏蛋白結構域3(T cell Immunoglobulin and Mucin domain-3,TIM-3)、T細胞活化的V結構域Ig抑制劑(V-domain Ig suppressor of T cell activation,VISTA)、殺手細胞類免疫球蛋白受體(Killer-cell Immunoglobulin-like Receptor,KIR)、吲哚胺-吡咯2,3-二氧酶(Indoleamine-pyrrole 2,3-dioxygenase,IDO)、B7-H3(CD276)、A2AR(腺苷A2A受體)或CD47。
於一實施例中,該抗免疫檢查點抗體為抗PD-1/PD-L1抗體、抗CTLA-4(細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4)抗體、抗LAG-3(淋巴細胞活化基因3)抗體、抗TIGIT(基於T細胞免疫球蛋白與免疫受體酪胺酸的抑制性模體結構域)抗體、抗Ceacam 1(癌胚抗原相關細胞黏附分子1)抗體、抗LAIR-1(白血球相關類免疫球蛋白受體-1)抗體、抗TIM-3(T細胞免疫球蛋白及黏蛋白結構域3)抗體、抗VISTA(T細胞活化的V結構域Ig抑制劑)抗體、抗KIR(殺手細胞類免疫球蛋白受體)抗體、抗IDO(吲哚胺-吡咯2,3-二氧酶)抗體、抗B7-H3(抗CD276)抗體、抗A2AR(腺苷A2A受體)抗體或抗CD47抗體。
於一實施例中,該抗PD-1/PD-L1抗體為Bavencio ®(阿維魯單抗)、Opdivo ®(納武利尤單抗)、Keytruda ®(帕博利珠單抗)、Imfinzi ®(度伐利尤單抗),及/或Tecentriq ®(阿替利珠單抗)。
以下將參考實施例描述本發明。所屬領域中具有通常知識者可以理解,這些實施例僅用於描述本發明,並不以任何方式限制本發明之範圍。
定義
提供以下定義以幫助讀者。除非另有定義,否則本文中使用之所有技術術語、符號以及其他科學或醫學術語或詞彙目的在於具有化學及醫學領域技術人員通常理解之含義。於某些情況下,為了清楚及/或便於參考,本文定義了具有通常理解的含義之術語,且不應將本文中包括這樣的定義解釋為表示與本領域中通常理解的術語之定義實質性的差異。
所有數值標記,例如pH、溫度、時間、濃度,以及重量,包括其範圍,皆為近似值,通常可適當地以(+)或(-)為單位以0.1、1.0或10.0的增量變化。所有數字標記可理解為在術語「約」之後。本文所述之試劑為示例性的,其等同物在本領域中為已知的。
除非上下文另外明確指出,否則術語「一」、「一個/種」以及「該」包括複數指示物。因此,例如,提及一化合物係指一種或多種化合物或至少一種化合物。如此,術語「一」(或「一個/種」)、「一或多個/種」以及「至少一」在本文中可互換使用。
術語「大約」或「近似」係指由所屬領域中具有通常知識者確定之特定值的可接受誤差,其部分取決於如何測量或確定該數值。於某些實施例中,術語「約」或「大約」係指在1、2、3或4個標準偏差之內。於某些實施例中,術語「約」或「大約」係指在一給定值或範圍的50%、20%、15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%或0.05%之內。
如本文所用,術語「包含(comprising )」或「包括(including )」目的在於表示該組合物及方法包括所列舉的要素,但不排除其他要素。當用於定義組合物及方法時,「基本上由...組成(consisting essentially of)」應表示排除對該組合物或方法具有任何重要意義的其他要素。「由...組成(consisting of)」係指排除所請求保護之組合物以及實質性方法步驟中其他成分之多於極微量的元素。由這些連接詞中的每一個定義的實施例在本發明之範圍內。因此,目的在於該方法及組合物可包括另外的步驟及組成分(包含/包括),或者可替代地包括不重要的步驟及組合物(基本上由其組成),或者目的僅在於所述之方法步驟或組合物(由...組成)。
術語對一患者「施用(administering)」一藥物」或將一藥物「施用至(administration of」一患者(以及該短語的等同語法)係指直接施用,可由一醫療專業人員對一患者進行施用,或可為自我施用;以及/或間接施用,其可為開處方籤的行為。例如,指示患者自我施用藥物及/或對一患者提供藥物處方的醫師正在對該患者施用藥物。
術語「抗體」目的進一步涵蓋抗體、消化片段、其特定部分及其變體,包括抗體模擬物(antibody mimetics)或包括模擬一抗癌抗體或其特定片段或部分之結構及/或功能的抗體部分,包括單鏈抗體及其片段,每個都包含至少一個衍生自本發明抗癌抗體的CDR。
術語「生物試劑」包括胜肽、蛋白質、抗體、荷爾蒙、細胞激素、趨化激素(chemokine)及其任何組合。
術語「癌症」係指血癌、淋巴瘤、上皮癌,以及其他惡性腫瘤,包括實體瘤,其潛在無限生長,可透過侵襲而局部擴散,並透過轉移而全身擴散。癌症的實施例包括,但不限於,腎上腺癌、骨癌、腦癌、乳癌、支氣管癌、結腸及/或直腸癌、膽囊癌、頭頸癌、腎癌、喉癌、肝癌、肺癌、神經組織癌、胰臟癌、前列腺癌、副甲狀腺癌、皮膚癌、胃癌,以及甲狀腺癌。某些其他癌症實施例包括急性與慢性淋巴細胞與顆粒細胞性腫瘤、腺癌、腺瘤、基底細胞癌、子宮頸不典型增生及原位癌、Ewing氏肉瘤、表皮樣癌、巨細胞瘤、多形性膠質母細胞瘤(glioblastoma multiforma)、毛細胞瘤、腸神經節細胞瘤、增生性角膜神經瘤、胰島細胞癌、卡波西氏肉瘤(Kaposi’s sarcoma)、平滑肌瘤、血癌、淋巴瘤、惡性類癌、惡性黑色素瘤、惡性高鈣血症、馬凡氏體徵腫瘤、髓質癌、轉移性皮膚癌、黏膜神經瘤、骨髓瘤、蕈狀肉芽腫、神經胚細胞瘤、骨肉瘤、骨原性肉瘤以及其他肉瘤、卵巢腫瘤、嗜鉻細胞瘤、真性紅血球增多症(polycythermia vera)、原發性腦腫瘤、小細胞肺腫瘤、潰瘍及乳突型二者之鱗狀細胞癌(squamous cell carcinoma of both ulcerating and papillary type)、增生、精原細胞瘤、軟組織肉瘤、視網膜母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、腎細胞腫瘤、皮膚局部病變、網狀細胞肉瘤(veticulum cell sarcoma),以及威爾姆氏瘤(Wilm’s tumor)。
如本文所用,術語「化學治療劑」為一種可用於治療癌症的化合物。化學治療劑的實施例包括單甲基澳瑞他汀E(Monomethyl auristatin E,MMAE)、單甲基澳瑞他汀F(MMAF)、美登木素生物鹼(mertansine,DM1)、蒽環素(anthracycline)、吡咯並苯並二氮雜(pyrrolobenzodiazepine)、α-蠅蕈素(α-amanitin)、微管溶素(tubulysin)、苯二氮平(benzodiazepine)、厄洛替尼(erlotinib)、硼替佐米(bortezomib)、氟維司群(fulvestrant)、舒尼替尼(sunitinib)、來曲唑(letrozole)、甲磺酸伊馬替尼(imatinib mesylate)、PTK787/ZK 222584、奧沙利鉑(oxaliplatin)、菊白葉酸(leucovorin)、雷帕黴素(rapamycin)、拉帕替尼(lapatinib)、洛那法尼(lonafarnib)(SARASAR ®,SCH 66336)、索拉非尼(sorafenib)、吉非替尼(gefitinib)、AG1478、AG1571、烷基化試劑(alkylating agent)、烷基磺酸鹽(alkyl sulfonate)、氮丙啶類(aziridines)、伸乙亞胺(ethylenimine)、甲基三聚氰胺(methylamelamine)、內酯(acetogenins)、喜樹鹼(camptothecin)、苔蘚蟲素(bryostatin)、卡利斯他汀(callystatin)、CC-1065、念珠藻素(cryptophycins)、尾海兔素(dolastatin)、杜卡黴素(duocarmycin)、艾榴塞洛素(eleutherobin)、胰抑素(pancratistatin)、珊瑚素(sarcodictyin)、海綿素(spongistatin)、氯芥苯丁酸(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷醯胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、異環磷醯胺(ifosfamide)、甲氯乙胺(mechlorethamine)、氧化甲乙胺鹽酸鹽(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法侖(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥膽甾醇(phenesterine)、潑尼氮芥(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)、卡莫司汀(carmustine)、氯脲黴素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷諾氮芥(ranimustine)、卡奇黴素(calicheamicin)、達尼黴素(dynemicin)、氯磷酸鹽(clodronate)、埃司帕黴素(esperamicin)、新卡他汀發色團(neocarzinostatin chromophore)、阿克拉黴素(aclacinomysins)、放線菌黴素(actinomycin)、安麯黴素(authramycin)、茜素(azaserine)、博萊黴素(bleomycins)、放線菌素(cactinomycin)、卡拉黴素(carabicin)、洋紅黴素(caminomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、色黴素(chromomycinis)、放線菌素(dactinomycin)、道諾黴素(daunorubicin)、艾黴素(detorubicin)、6-重氮-5-氧代-L-正白胺酸(6-diazo-5-oxo-L-norleucine)、阿黴素(doxorubicin)、泛艾黴素(epirubicin)、表阿黴素(esorubicin)、艾達黴素(idarubicin)、麻西羅黴素(marcellomycin)、絲裂黴素(mitomycins)、黴酚酸(mycophenolic acid)、諾加黴素(nogalamycin)、橄欖黴素(olivomycins)、培洛黴素(peplomycin)、泊非黴素(potfiromycin)、嘌呤黴素(puromycin)、喹納黴素(quelamycin)、羅黴素(rodorubicin)、鏈黑菌素(streptonigrin)、鏈脲佐菌素(streptozocin)、結核菌素(tubercidin)、苯丁抑制素(ubenimex)、新制癌菌素(zinostatin)、紅柔黴素(zorubicin)、氨甲蝶呤(methotrexate)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)、二甲葉酸(denopterin)、蝶羅呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)、氟達拉濱(fludarabine)、6-巰基嘌呤(6-mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鳥嘌呤(thioguanine)、安西他濱(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-硫唑脲嘧啶(6-azauridine)、卡莫呋(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、雙去氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、伊諾他濱(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)、鈣雌酮(calusterone)、屈他雄酮丙酸酯(dromostanolone propionate)、環硫雄醇(epitiostanol)、美雄酮(mepitiostane)、睾內酯酮(testolactone)、胺魯米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、三矽烷(trilostane)、醛葉酸(folinic acid)、乙醯格雷酮(aceglatone)、醛磷醯胺糖苷(aldophosphamide glycoside)、胺乙醯丙酸(aminolevulinic acid)、恩尿嘧啶(eniluracil)、安吖啶(amsacrine)、阿莫司汀(bestrabucil)、比生群(bisantrene)、依達曲沙(edatraxate)、地磷醯胺(defofamine)、秋水仙胺(demecolcine)、地吖醌(diaziquone)、艾福米辛(elformithine)、依利醋銨(elliptinium acetate)、埃博黴素(epothilone)、依託格魯(etoglucid)、硝酸鎵(gallium nitrate)、羥基脲(hydroxyurea)、香菇多醣(lentinan)、氯尼達明(lonidainine)、美登素(maytansine)、安絲菌素(ansamitocins)、米托脲腙(mitoguazone)、米托蒽醌(mitoxantrone)、莫哌達醇(mopidanmol)、硝拉維林(nitraerine)、噴司他丁(pentostatin)、蛋胺氮芥(phenamet)、吡柔比星(pirarubicin)、洛索蒽醌(losoxantrone)、鬼臼酸(podophyllinic acid)、2-乙基醯肼(ethylhydrazide)、甲基芐肼(procarbazine)、雷佐生(razoxane)、根黴素(rhizoxin)、西佐喃(sizofiran)、鍺螺胺(spirogermanium)、細交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid)、三亞胺醌(Triaziquone)、2,2’,2’’-三氯三乙胺(trichlorotriethylamine)、新月毒素(trichothecene)、烏拉坦(urethan)、長春地辛(vindesine)、達卡巴仁(dacarbazine)、甘露醇氮芥(mannomustine)、二溴甘露醇(mitobronitol)、二溴衛矛醇(mitolactol)、溴丙哌嗪(pipobroman)、甲托辛(gacytosine)、阿拉伯醣苷(arabinoside)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、噻替哌(thiotepa)、類紫杉醇(taxoid)、紫杉醇(paclitaxel)、歐洲紫杉醇(docetaxel)、苯丁酸氮芥(chloranbucil)、吉西他濱(gemcitabine)、6-硫鳥嘌呤(6-thioguanine)、巰基嘌呤(mercaptopurine)、氨甲蝶呤(methotrexate)、順鉑(cisplatin)、卡鉑(carboplatin)、長春花鹼(vinblastine)、鉑(platinum)、依託泊苷(etoposide)、異環磷醯胺(ifosfamide)、米托蔥醌(mitoxantrone)、長春新鹼(vincristine)、溫諾平(vinorelbine)、米托蔥醌(novantrone)、替尼泊苷(teniposide)、依達曲沙(edatrexate)、道諾黴素(daunomycin)、胺基蝶呤(aminopterin;)、截瘤達(xeloda)、伊班膦酸(ibandronate)、拓撲異構酶抑制劑、二氟甲基鳥氨酸(difluoromethylornithine,DMFO)、維他命A酸(retinoid),以及卡培他濱(capecitabine)。
術語「組合」係指組合治療為OBI-3423/OBI-3424化合物的量及/或與其他生物或化學藥物的量,在治療週期期間的相同或不同日期依序地或同時地一起施用(共同施用及/或共同配製)時,具有在治療上是有效的且多於治療上的綜合作用之協同作用。
術語「接觸(contacting)」或「接觸(contact)」係指將治療劑與細胞或組織聚集在一起,使得由於這種接觸而發生生理及/或化學作用。接觸可在體外、離體或體內進行。於一實施例中,將治療劑與細胞培養物中的細胞接觸(體外)以確定該治療劑對該細胞的作用。於另一實施例中,將治療劑與細胞或組織的接觸包括對一具有要接觸的細胞或組織的受試者施用治療劑。
術語「光學活性的(optically active)」係指分子的集合,其鏡像異構物超越量(enantiomeric excess)不少於約10%、不少於約20%、不少於約30%、不少於約40%、不少於約50%、不少於約60%、不少於約70%、不少於約80%、不少於約90%、不少於約91%、不少於約92%、不少於約93%、不少於約94%、不少於約95%、不少於約96%、不少於約97%、不少於約98%、不少於約99%、不少於約99.5%、不少於約99.8%或不少於約99.9%。於某些實施例中,光學活性化合物的鏡像異構物超越量不少於約90%、不少於約95%、不少於約98%或不少於約99%。化合物的鏡像異構物超越量可透過所屬領域中具有通常知識者使用的任何標準方法來確定,包括但不限於,使用光學活性固定相的對掌性光學層析法(chiroptical chromatography)(氣相層析法、高效液相層析法,以及薄層層析法)、同位素稀釋、電泳、量熱法、旋光測定法(polarimetry)、具有對掌性衍生作用的NMR拆分方法(NMR resolution methods),以及具有對掌性溶劑化劑(chiral solvating agent)或對掌性轉移劑的NMR方法。
在描述一光學活性化合物時,前綴R及S用於表示分子圍繞其對掌性中心的絕對構型。
術語「基本上純的」係指足夠均勻,以顯示沒有容易檢測到的雜質,如透過所屬領域中具有通常知識者所使用的標準分析方法所確定的,包括但不限於,薄層層析法(TLC)、凝膠電泳、高效液相層析法(HPLC)、氣相層析法(GC)、核磁共振(NMR),以及質譜測定法(MS);或者足夠純淨,以至於進一步純化不會可檢測地改變其物理、化學、生物學及/或藥理特性,例如該物質的酶及生物活性。於某些實施例中,「基本上純的」係指分子的集合,其中按重量計,至少約50%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或至少約99.5%的分子為一化合物的單一立體異構體,如透過標準分析方法所測定。
「患者」及「受試者」可互換使用,係指需要治療癌症的哺乳動物。通常,該患者為人類。通常,該患者為被診斷出患有癌症的人類。於某些實施例中,「患者」或「受試者」可指用於篩選、描述特徵,以及評估藥物及療法的非人類哺乳動物,例如非人類靈長類動物、狗、貓、兔、豬、小鼠或大鼠。
術語「前驅藥」係指一化合物,其在給藥後就至少一種性質而言被代謝或以其他方式轉化為生物活性或更多活性的化合物(或藥物)。相對於藥物,前驅藥以使其相對於藥物較少活性或不活化的方式進行化學修飾,但是該化學修飾使得該相對應的藥物是在施用該前驅藥後,由代謝或其他生物學過程所產生。相對於活性藥物,前驅藥可能具有改變的代謝穩定性或轉運特性、較少的副作用或較低的毒性,或改善的味道(例如,參閱參考文獻Nogrady,1985年,Medicinal Chemistry A Biochemical Approach,牛津大學出版社,紐約,第388-392頁,其透過引用併入本文)。可使用除了該相應藥物以外的反應物來合成前驅藥。
術語「實體瘤」係指包括但不限於存在於骨、腦、肝、肺、淋巴結、胰腺、前列腺、皮膚,以及軟組織(肉瘤)中的轉移性腫瘤之實體瘤。
術語藥物的「治療有效量」係指當對一罹患癌症的患者施用時具有預期的治療作用,例如減輕、改善、緩和或消除在該患者身上的一種或多種癌症表現的藥物量。透過施用一劑量不一定產生治療效果,且可能僅在施用一系列劑量之後才出現治療效果。因此,治療有效量可施用一次或多次。
術語「治療」一病症或患者係指採取步驟以獲得有益或期望的結果,包括臨床結果。為了本發明之目的,有益的或期望的臨床結果包括,但不限於:減輕或改善一種或多種癌症症狀;疾病程度的減少;延緩或減緩疾病進展;減輕、緩和或穩定疾病狀態;或其他有益的結果。於某些情況下,癌症的治療可能會導致部分反應或疾病穩定。
術語「腫瘤細胞」係指任何適當種類的腫瘤細胞,例如哺乳動物,例如鼠、犬、貓、馬或人類。
術語「同位素變體」係指在構成這樣的化合物的一個或多個原子上含有非自然比例的同位素之化合物。於某些實施例中,化合物的「同位素變體」包含非自然比例的一種或多種同位素,包括但不限於,氫( 1H)、氘( 2H)、氚( 3H)、碳11( 11C)、碳12( 12C)、碳13( 13C)、碳14( 14C)、氮13( 13N)、氮14( 14N)、氮15( 15N)、氧14( 14O)、氧15( 15O)、氧16( 16O)、氧17( 17O)、氧18( 18O)、氟17( 17F)、氟18( 18F)、磷31( 31P)、磷32( 32P)、磷33( 33P)、硫32( 32S)、硫33( 33S)、硫34( 34S)、硫35( 35S)、硫36( 36S)、氯35( 35Cl)、氯36( 36Cl)、氯37( 37Cl)、溴79( 79Br)、溴81( 81Br)、碘123( 123I)、碘125( 125I)、碘127( 127I)、碘129( 129I),以及碘131( 131I)。於某些實施例中,化合物的「同位素變體」為穩定形式,即非放射性的。於某些實施例中,化合物的「同位素變體」包含非自然比例的一種或多種同位素,包括但不限於,氫( 1H)、氘( 2H)、碳12( 12C)、碳13( 13C)、氮14( 14N)、氮15( 15N)、氧16( 16O)、氧17( 17O)、氧18( 18O)、氟17( 17F)、磷31( 31P)、硫32( 32S)、硫33( 33S)、硫34( 34S)、硫36( 36S)、氯35( 35Cl)、氯37( 37Cl)、溴79( 79Br)、溴81( 81Br),以及碘127( 127I)。於某些實施例中,化合物的「同位素變體」呈不穩定形式,即具有放射性。於某些實施例中,化合物的「同位素變體」包含非自然比例的一種或多種同位素,包括但不限於,氚( 3H)、碳11( 11C)、碳14( 14C)、氮13( 13N)、氧14( 14O)、氧15( 15O)、氟18( 18F)、磷32( 32P)、磷33( 33P)、硫35( 35S)、氯36( 36Cl)、碘123( 123I)、碘125( 125I)、碘129( 129I),以及碘131( 131I)。應當理解的是,於可行的情況下,根據所屬領域具有通常知識者的判斷,在本文提供的化合物中,例如,任何氫可為 2H,或者任何碳可為例如 13C,或者任何氮可為例如 15N,且任何氧可為 18O。於某些實施例中,化合物的「同位素變體」包含非自然比例的氘。
術語「溶劑化物」係指由一個或多個溶質分子,例如本文提供之化合物,以及一個或多個溶劑分子形成的錯合物或聚集體(aggregate),其以化學計量或非化學計量的量存在。合適的溶劑包括但不限於水、甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇,以及醋酸。於某些實施例中,該溶劑為醫藥上可接受的。於一實施例中,該錯合物或聚集體為結晶形式。於另一實施例中,該錯合物或聚集體為非結晶形式。當該溶劑為水時,該溶劑化物為水合物。水合物之實施例包括,但不限於,半水合物、單水合物、二水合物、三水合物、四水合物,以及五水合物。
術語「醫藥上可接受的賦形劑」係指一醫藥上可接受的材料、組合物或載劑,例如液體或固體填充劑、稀釋劑、溶劑或包囊材料(encapsulating material)。於一實施例中,在與一藥物製劑的其他成分相容的意義上,每個成分都是「醫藥上可接受的」,且適合與人類及動物的組織或器官接觸而沒有過度的毒性、刺激性、過敏反應。
術語「免疫檢查點抑制劑」為抑制/阻斷抑制性免疫檢查點系統的分子,已經成為晚期贅瘤形成(neoplasia)的有效療法;其中包括阻斷細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4(cytotoxic T lymphocyte associated antigen 4,CTLA4)以及計畫性細胞死亡蛋白1(programmed cell death protein 1,PD-1)的治療性抗體,已用於多種腫瘤 (34)。PD-1(計畫性細胞死亡蛋白,CD279),為B7/CD28受體家族的成員,為一種在活化的白血球(包括T、B、NK,以及骨髓來源的抑制細胞)的細胞表面表現的單體分子,其表現受到基因以及表觀遺傳(epigenetic)機制之間相互作用的良好調節。PD-1的已知配體為PD-L1以及和PD-L2 (35)
PD-L1(計畫性細胞死亡蛋白配體1、B7H1、CD274)在包括T細胞、B細胞、骨髓細胞及樹突狀細胞之造血細胞,以及非造血細胞(如肺、心臟、內皮、胰島細胞、角質細胞(keratinocyte))且特別是癌細胞上表現量低,並在細胞活化後上調。PD-L2(計畫性細胞死亡蛋白配體2、B7-DC、CD273)在巨噬細胞、樹突狀細胞(dendritic cells,DCs)、活化的CD4 +及CD8 +淋巴細胞以及一些實體瘤(卵巢癌、小細胞肺癌、食道癌)上表現。在正常及與癌症相關的纖維母細胞上也檢測到PD-L1以及PD-L2的表現。PD-L1與PD-L2均與其他受體相互作用:PD-L1與CD28配體CD80,而PD-L2與排斥指導分子(Repulsive Guidance Molecule,RGM)b,在巨噬細胞以及其他細胞類型上表現。PD-1的胞質尾部包含基於免疫受體酪胺酸的抑制模體(Immunoreceptor Tyrosine-based Inhibition Motif,ITIM)以及基於免疫受體酪胺酸的開關模體(immunoreceptor tyrosine-based switch motif,ITSM)。在T淋巴細胞中,PD-1及其配體的相互作用導致PD-1細胞內尾部的兩個酪胺酸磷酸化;接著,將包含SH2結構域的蛋白酪胺酸磷酸酶(SHP-1及/或SHP-2)募集到PD-1的ITSM細胞質區域,然後抑制T細胞受體的下游訊號,進而抑制T細胞增殖及細胞激素的產生。PD-1對T細胞也有其他作用:例如,透過抑制Akt以及Ras途徑,PD-1觸發抑制了泛素連接酶組成分SKP2的轉錄:這導致SKP2調節的p27(kip1)的降解受損(p27為一種依賴細胞週期蛋白(cyclin-dependent)的激酶的抑制劑),進而阻斷細胞週期進程。此外,PD-1可透過多種機制促進細胞凋亡。除了直接抑制T細胞活化外,由PD-L1觸發的PD-1還可誘導T調節細胞(Treg)的發展,T調節細胞為周邊耐受的關鍵調節者,可以有效抑制效應T細胞。由PD-1觸發的Treg誘導是透過關鍵訊號分子(如磷酸化Akt(phospho-Akt))的調節所調節的,該關鍵訊號分子透過PD-1 -誘導的PTEN活性而保持較低含量。幾種類型的癌細胞確實表現PD-L1。此外,腫瘤微環境中的非腫瘤細胞(內皮細胞、白血球、纖維母細胞)亦可表現PD-L1。這表示它們可以耐受腫瘤浸潤的PD-1 +T淋巴細胞(TILs)及/或誘導Treg的發育;的確,有越來越多的證據顯示,使用抗PD-1/PD-L1單株抗體(monoclonal antibodies,mAbs)治療受某些癌症類型(黑色素瘤、腎癌、非小細胞肺癌等)影響的患者可減少腫瘤生長。
已知免疫檢查點抑制劑可在人體內提供某些抗腫瘤活性,且這種部分抗腫瘤活性僅在一部分接受治療的受試者中觀察到。檢查點抑制劑可包括或不包括蛋白質、多胜肽(包括胺基酸殘基)以及單株或多株抗體。本文所述之組合物可包括或與多於一種的檢查點抑制劑一起施用。於一些實施例中,檢查點抑制劑結合在任何T細胞調節劑家族中發現的配體或蛋白質,包括CD28/CTLA-4。檢查點抑制劑的標靶可包括或排除在免疫系統效應子或調節細胞(例如,T細胞)上表現的受體或共受體(例如CTLA-4;CD8);抗原呈現細胞表面表現的蛋白質(亦即,在活化的T細胞表面表現,可包括或不包括PD-1、PD-2、PD-L1,以及PD-L2);腫瘤及腫瘤浸潤細胞均表現的代謝酶(例如,吲哚胺-吡咯2,3-二氧酶(Indoleamine-pyrrole 2,3-dioxygenase,IDO),包括同功型(isoform),例如IDO1以及IDO2);屬於免疫球蛋白超級家族的蛋白質(例如,淋巴細胞活化基因3,亦稱為LAG3);屬於B7超級家族的蛋白質(例如,B7-H3/CD276或其同源物)。在活化的抗原呈現細胞以及T細胞上均可發現B7蛋白。於一些實施例中,可以將兩種或更多種檢查點抑制劑組合或配對。例如,可將在抗原呈現細胞上發現的B7家族檢查點抑制劑與在T細胞表面表現的CD28或CTLA-4抑制劑配對,以產生共同抑制訊號,進而降低這兩種細胞之間的活性。共同受體係指位於同一細胞上的兩個不同受體,它們與外部配體結合後可以調節內部細胞程序。共同受體可為刺激性的或抑制性的。共同受體有時被稱為輔助受體或共同訊號受體。如本文所用,術語「共同抑制」係指不止一個分子與細胞表面上的它們各自的受體結合進而減慢或防止細胞內程序發生的結果。
於某些實施例中,免疫檢查點抑制劑可包括抑制PD-1或CTLA-4途徑的抑制性受體的拮抗劑,例如抗PD-1、抗PD-L1或抗CTLA-4抗體或抑制劑。PD-1或PD-L1抑制劑的實施例可包括,但不限於,阻斷人類PD-1的人源化抗體,例如派姆單抗(lambrolizumab)(抗PD-1抗體,商品名Keytruda ®)或匹地珠單抗(pidilizumab)(抗PD-1抗體)、Bavencio ®(抗PD-L1抗體,阿維魯單抗(avelumab))、Imfinzi ®(抗PD-L1抗體,度伐利尤單抗(durvalumab)),以及Tecentriq ®(抗PD-L1抗體,阿替利珠單抗(atezolizumab)),以及完全人類抗體,例如納武利尤單抗(nivolumab)(抗PD-1抗體,商品名Opdivo ®)。其他PD-1抑制劑可包括可溶性PD-1配體的呈現,包括,但不限於亦稱為B7-DC-Ig或AMP-244的PD-L2 Fc融合蛋白以及目前正在研究及/或開發用於治療的其他PD-1抑制劑。此外,免疫檢查點抑制劑可包括,但不限於阻斷PD-L1的人源化或完全人源抗體,例如度伐利尤單抗(durvalumab)與MIH1以及目前正在研究的其他PD-L1抑制劑。於一些實施例中,免疫檢查點抑制劑為CTLA-4、PD-L1或PD-1抗體。於一些實施例中,PD-1或CTLA-4抑制劑包括,但不限於阻斷人類PD-1的人源化抗體,例如派姆單抗(lambrolizumab)(抗PD-1抗體,商品名Keytruda ®)或匹地珠單抗(pidilizumab)(抗PD-1抗體)、納武利尤單抗(nivolumab)(抗PD-1抗體,商品名Opdivo ®)、替利木單抗(ticilimumab)(抗CTLA-4抗體)、易普利姆單抗(ipilimumab)(抗CTLA-4抗體)、MPDL3280A、BMS-936559、AMP-224、IMP321(ImmuFact公司)、 MGA271、Indoximod,以及INCB024360。
實施例
實施例 1. OBI-3424 + PD-1 抗體(帕博利珠單抗( pembrolizumab ))或抗 PD-L1 抗體(阿維魯單抗( avelumab ))在 HepG2 腫瘤人源化小鼠模型中的功效性評估
研究之目的為在HepG2 瘤人源化小鼠模型中評估測試品項OBI-3424單一治療或在抗hPD-1抗體或抗hPD-L1抗體存在下組合治療的功效。
材料
1. OBI-3424-DP 批號:FLC-INJ-1711-01 測試品項數:2個小瓶/每個小瓶1 mL 成分:DNA烷基化劑 濃度:10 mg/mL 物理外觀:透明液體 儲存條件:-20℃
2. 抗人類PD-1抗體,帕博利珠單抗(pembrolizumab),默克公司(Merck & Co., Inc.)。 批號:7302614A13 測試品項數:1瓶/每瓶1.2 mL 成分:抗體 濃度:25 mg/mL 物理外觀:透明液體 儲存條件:2~8℃
3. 抗人類PD-L1抗體,阿維魯單抗(avelumab),默克公司。 批號:AU024788 測試品項數:1管/每管1.5 mL 成分:抗體 濃度:20 mg/mL 物理外觀:透明液體 儲存條件:2~8℃
4. 無菌生理食鹽水(信東生技股份有限公司) 批號:1PD2A054 測試品項數:6管20 mL試管 濃度:0.9%氯化鈉 物理外觀:透明液體 溶解度:未提供 儲存條件:室溫
5. 基質膠(Matrigel)(Corning公司,型號:354248,批號:8228001)
6. 人類PBMC(批號:PBMC102219D,Zenbio公司,美國)
7. 膠原酶(Sigma Aldrich公司,C5138)、DNA水解酶 I(Sigma Aldrich公司,D5025)、玻尿酸酶(Sigma Aldrich公司,H6254)
8. RBC紅血球裂解緩衝液(Biolegend公司,420302)
9. 細胞染色緩衝液(Biolegend公司,420201)
10. 人類TruStain FcX TM(Fc受體阻隔溶液)(Biolegend公司,422302)
11. 抗體: 抗人類CD45抗體(Beckman公司,IM0782U)、抗人類CD8抗體(Beckman公司,IM0452U以及Biolegend公司,300911)、抗人類CD4抗體(Beckman公司,B16491)、抗人類CD56抗體(Beckman公司,IM2474U)、抗人類CD16抗體(Beckman公司,IM1238U)、抗人類CD25抗體(Beckman公司,IM0479U)。
小鼠1. 物種:小鼠( Mus musculus) 品系:晚期免疫缺陷小鼠。 (NOD.Cg-Prkdc scidIl2rg) 來源:三華生物科技股份有限公司 性別:雌 研究開始時的年齡:6~8週 研究開始時的體重範圍:17~28克
2. 編號與識別:每隻小鼠以耳標編號。透過籠卡識別住籠,其中包括研究編號、籠編號、動物編號、性別、劑量含量等資訊。
動物分組:小鼠分為6組:G1(載劑)、G2(OBI-3424)、G3(抗hPD-1抗體)、G4(抗hPD-L1抗體)、G5(OBI-3424 + 抗hPD-1抗體),以及G6(OBI-3424 + 抗hPD-L1抗體)。每組包含五隻小鼠。將人類肝癌細胞株HepG2皮下接種至晚期免疫缺陷小鼠。本項研究含括共30隻小鼠。
3. 選擇動物的原因:根據衛生福利部食品藥物管理署公告之非臨床藥物安全性研究建議中的抗癌藥物非臨床研究指南,可將動物異種移植腫瘤模型用於評估新藥或新抗癌藥的療效。常用的小鼠品系包括BALB/c、C57BL/6,而通常選擇BALB/c Nude、Nu/Nu以及NOD/SCID小鼠來評估目標藥物的抗腫瘤作用。這些品系是在全球的基礎下進行管理的,具有眾所周知的遺傳及品種背景,可提供對人體適當反應的功能性意義。
4. 適應期:在隨機分組之前,使小鼠適應至少3天。在適應期間進行臨床觀察並測量體重。在此期間,這些動物沒有表現出任何疾病跡象或行為改變。
5. 動物的居住條件:將小鼠飼養在單獨的通風籠(individually ventilated cages,IVC)中,該籠中裝有無菌墊層(10054,Andersons公司,美國),在受控環境中,溫度為22±3℃,相對濕度為50±20%,光照/黑暗週期為12/12小時。在整個研究期間,小鼠可隨意取用食物(LabDiet 5010,PMI公司,美國)及水(無菌逆滲透水)。
6. 隨機化:將所有動物稱重,並在研究前觀察健康狀況。在實驗中選擇沒有異常臨床徵狀的動物。將健康的動物隨機分為不同的組別,各組之間的體重沒有顯著差異。動物的體重變化不應超過平均體重的±20%。該程序遵循實驗室動物操作標準。
7. IACUC核准號:IACUC-2020-SH-016
設備細胞培養培養箱(Shel Lab公司/3552) 生物安全櫃(BAKER公司/SG604) 電子天平(PRECISA公司/XS 225A-SCS) 吸量管(Thermo公司/Finnpipette F1) 隔離正/負壓驗證的籠式住房系統(Allentown公司/NEXGEN) 分析天平(PRECISA公司/XS3250C-SCS) 動物安樂死設備(聯臺國際科技有限公司) 流式細胞儀(Beckman Coulter公司/Navios EX) 游標尺(Mitutoyo公司/CD-6」ASX)
方法
實驗設計
1. 取樣:實驗設計、實驗組、注射劑量與體積、施用途徑以及動物數量列於 1
表1. 劑量方案及取樣
組別 測試品項的施用途徑 注射劑量 (mg/kg) 注射體積 (mg/kg) 動物 數量
G1: 載劑 IV及IP N/A 5+10 5
G2: OBI-3424 IV 1 5 5
G3: 抗hPD-1抗體 IP 10(自D15起為20*) 5 5
G4: 抗hPD-L1抗體 IP 10(自D15起為20*) 10 5
G5: OBI-3424+ 抗hPD-1抗體 IV及IP 10(自D15起為20*) 5+10 5
G6: OBI-3424+ 抗hPD-L1抗體 IV及IP 1+10(自D15起為20*) 5+10 5
靜脈注射(IV):注射量為5 mL/kg 腹膜內注射(IP):注射量為10 mL/kg
*從第15天開始,腹膜內注射劑量更改為20 mg/kg。
2. 異種移植小鼠模型之建立
2.1. 動物除毛:在注射人類肝癌細胞株HepG2之前,僅剪除右側腹部的毛髮。
2.2. 皮下接種腫瘤細胞:將1x10 7個HepG2細胞與0.25x10 7個 hPBMC(細胞數比為4:1)預混合,然後再與基質膠混合(體積比1:1)(Corning公司,型號:354248,批號:8228001)。皮下注射體積為200 μL/小鼠。
3. 測試物品的施用途徑:
3.1. 在接種腫瘤細胞後的第8天,將測試品項抗hPD-1抗體或參考品項以腹膜內注射施用於小鼠。使用胰島素注射器以10 mg/kg的劑量進行注射,注射量為10 mL/kg(從第15天起將注射劑量更改為20 mg/kg)。針對G3及G5,在第8、11、15、18、22、25、29及32天連續給予測試品項抗hPD-1抗體。G1組施用該參考品項。該程序遵循樣品施用的標準。
3.2. 在接種腫瘤細胞後第8天,將測試品項抗hPD-L1抗體或參考品項以腹膜內注射施用於小鼠。使用胰島素注射器以10 mg/kg的劑量進行注射,注射量為10 mL/kg(從第15天起將注射劑量更改為20 mg/kg)。針對G4及G6,在第8、11、15、18、22、25、29及32天連續給予測試品項抗hPD-L1抗體。G1組施用該參考品項。該程序遵循樣品施用的標準。
3.3. 在接種腫瘤細胞後第14天,將測試品項OBI-3424、參考品項以靜脈內注射施用於小鼠。使用胰島素注射器以1 mg/kg的劑量以及5 mL/kg的注射體積進行注射。針對G2、G5及G6,在第14、21、28及35天連續給予OBI-3424測試品項。G1組施用該參考品項。該程序遵循樣品施用的標準。
3.4. 測試品項或參考品項之準備: 施用前,將測試品項以參考品項稀釋。測試品項OBI-3424的溶液濃度為0.2 mg/mL,測試品項抗hPD-1抗體及測試品項抗hPD-L1抗體為1 mg/mL(從第15天起為2 mg/mL)。
4. 體重測量: 從接種的第二天開始進行測量。測量動物體重,每週記錄兩次。
5. 腫瘤直徑測量: 從接種的第二天開始進行測量。每週兩次測量並記錄腫瘤體積(週一、週四)。根據記錄,透過橢圓方程式算出腫瘤體積(長軸×短軸×短軸)×(π/6)。
6. 腫瘤生長抑制率之計算: 根據以下公式,將腫瘤體積用於計算腫瘤生長抑制(tumor growth inhibition,TGI)速率:TGI(%)= [1-(Ti-T0)/(Ci-C0)]×100,其中Ti及Ci表示實驗結束時(第35天)治療組以及載劑組的平均腫瘤體積。而T0及C0表示實驗開始(第1天)時治療組及載劑組的平均腫瘤體積。
7. 血液採樣: 在實驗終點收集頜下(Submandibular)血液樣本。犧牲動物時,可使用心臟穿刺收集血液樣本。將收集的血液樣本於4±2℃下以1500xg離心15分鐘以分離血清及沈澱物。收集上層血清,並保存在低於-70℃的溫度下。該程序遵循動物血液採樣的標準。
8. 確定研究的終點: 該研究在第36天結束。
9. 腫瘤切除: 在研究結束時,以二氧化碳安樂死方式將小鼠犧牲,並切除腫瘤周圍的結締組織。然後取出腫瘤樣品並稱重。將一半的組織固定在10%甲醛中,然後包埋在石蠟中;另一半準備用於分離腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor-infiltrating lymphocytes,TILs)。
10. 腫瘤浸潤淋巴細胞(TILs)之分離: 以手術刀將一半的小鼠腫瘤切成較小的碎片,然後以膠原酶、DNA水解酶I,以及玻尿酸酶(膠原酶,型號C5138,DNA水解酶I ,型號D5025,玻尿酸酶,型號H6254,Sigma Aldrich公司)的混合物消化至少2小時。然後使用注射器柱塞將腫瘤消化物通過70 µm篩孔細胞過濾器(Falcon公司,型號352350),並以PBS洗滌。以RBC紅血球裂解緩衝液(Biolegend公司,型號420302)處理細胞,並製備用於流式細胞儀的單細胞懸浮液。
11. TIL族群之流式細胞儀分析: 以染色緩衝液(Biolegend公司,型號420201)洗滌細胞,重新懸浮於含有Fc受體阻隔溶液(Biolegend公司,型號422302)的染色緩衝液中,並於4℃下作用15分鐘。以螢光共軛的表面抗體對細胞進行染色,並於4℃下作用30分鐘,然後將其重新懸浮於染色緩衝液中以進行流式細胞儀分析。使用Navios EX流式細胞儀(Beckman Coulter公司)進行流式細胞儀分析。使用Kaluza分析軟體(Beckman Coulter公司)分析數據。
12. 統計分析: 結果表示為平均值與平均值的標準誤差(Mean ± SEM)。使用司徒頓t檢定(Microsoft Excel,2007年)計算每個治療組收集的所有數據與同時出現的陰性對照數據之比較。P ≤ 0.05被認為具有顯著差異。
結果
2列出各組體重之總結。在研究開始時,各組之間的平均體重沒有統計學上的顯著差異。在研究結束時,相較於其他組別,G5(OBI-3424 + 抗hPD-1抗體)以及G6(OBI-3424 + 抗hPD-L1抗體)的體重略有增加( 1 及表 2)。從不同的測試品項檢查腫瘤反應,在第1、4、7、11、14、18、21、25、28、32以及35天記錄平均腫瘤反應( 3 及表 3)。
表2. 體重總結
組別 動物 編號 體重(g)
第 0天 第 1天 第 4天 第 7天 第 11天 第 14天 第 18天 第 21天 第 25天 第 28天 第 32天 第 35天
G1: 載劑 MI039 24.99 24.93 25.83 25.32 25.81 24.73 24.63 24.55 24.60 23.64 24.15 23.62
MI047 20.78 20.80 21.81 22.05 22.97 23.69 23.28 23.07 22.91 22.23 23.04 22.58
MI049 23.24 22.25 23.62 22.65 24.47 24.98 24.70 23.99 23.91 23.77 24.10 23.87
MI057 22.07 22.32 23.10 23.14 22.35 21.86 23.11 23.13 23.22 23.31 23.02 22.01
MI059 23.33 22.89 24.40 24.24 24.12 24.30 24.12 23.80 24.02 23.35 24.16 24.20
平均 22.88 22.64 23.75 23.48 23.94 23.91 23.97 23.71 23.73 23.26 23.69 23.26
SEM 0.70 0.67 0.67 0.58 0.60 0.56 0.33 0.28 0.30 0.27 0.27 0.41
G2: OBI-3424 MI035 24.96 22.46 22.37 22.47 23.94 24.07 24.35 24.16 24.25 23.76 24.05 24.05
MI036 24.90 25.09 24.64 24.34 25.49 25.93 25.50 25.46 26.12 24.92 24.28 23.62
MI040 22.27 22.27 23.03 23.05 23.21 23.33 22.61 22.60 22.64 20.15 22.28 21.87
MI051 22.28 22.08 22.64 23.08 25.15 25.28 24.90 24.19 24.16 24.19 25.24 24.53
MI053 22.68 22.05 23.02 23.25 23.92 23.25 23.80 23.77 24.18 24.28 24.80 24.42
平均 23.42 22.79 23.14 23.24 24.34 24.37 24.23 24.04 24.27 23.46 24.13 23.70
SEM 0.62 0.58 0.39 0.31 0.42 0.53 0.49 0.46 0.55 0.85 0.51 0.48
G3: 抗hPD-1抗體 MI031 24.48 23.77 24.37 24.33 25.23 25.73 25.52 25.31 25.35 24.05 23.93 24.51
MI041 22.83 22.64 23.22 23.26 23.13 23.05 24.00 23.64 23.30 21.35 21.55 21.67
MI055 22.77 22.39 23.69 23.03 22.86 22.58 23.68 23.07 23.44 22.97 23.13 23.02
MI058 22.35 22.37 23.44 23.66 24.79 24.78 24.66 24.39 24.30 23.07 23.22 23.30
MI060 21.75 21.18 22.64 23.10 23.48 23.54 23.64 21.55 20.71 21.15 20.92 21.34
平均 22.84 22.47 23.47 23.48 23.90 23.94 24.30 23.59 23.42 22.52 22.55 22.77
SEM 0.45 0.41 0.28 0.24 0.47 0.58 0.36 0.63 0.77 0.55 0.56 0.58
G4: 抗hPD-L1抗體 MI037 23.68 23.15 23.83 23.75 24.89 25.06 24.70 24.14 24.47 23.71 23.83 23.41
MI046 25.61 25.88 26.01 26.73 26.45 26.71 26.09 26.11 25.74 25.42 25.58 24.98
MI048 23.03 22.46 23.49 23.02 23.97 23.84 24.20 24.05 24.60 22.64 22.43 22.69
MI052 21.27 21.36 21.62 21.92 22.76 22.29 22.27 21.02 22.60 21.81 18.37 *
MI062 20.75 20.78 21.66 22.00 22.78 20.81 20.56 21.51 21.07 24.27 22.52 22.32
平均 22.87 22.73 23.32 23.48 24.17 23.74 23.56 23.37 23.70 23.57 22.55 23.35
SEM 0.87 0.89 0.81 0.88 0.70 1.03 0.97 0.94 0.83 0.63 1.19 0.59
G5: OBI-3424+ 抗hPD-1抗體 MI034 24.95 24.33 25.05 24.40 25.22 25.31 24.96 24.83 24.70 24.33 25.61 25.91
MI042 25.59 25.08 25.58 25.24 24.20 24.12 24.42 24.53 25.02 25.15 25.57 26.42
MI050 22.28 22.34 23.28 23.74 25.05 25.31 24.89 25.38 25.09 25.13 25.75 26.23
MI054 23.20 23.02 23.81 23.75 22.96 23.02 22.93 22.61 23.68 23.46 23.66 23.62
MI056 22.96 21.62 22.27 22.67 23.69 24.00 23.47 23.02 23.08 23.81 23.66 24.08
平均 23.80 23.28 24.00 23.96 24.22 24.35 24.13 24.07 24.31 24.38 24.85 25.25
SEM 0.63 0.63 0.60 0.42 0.42 0.44 0.40 0.54 0.40 0.34 0.49 0.58
G6: OBI-3424+ 抗hPD-L1抗體 MI033 24.49 24.60 25.89 25.25 25.37 24.64 24.78 24.95 25.59 25.71 25.99 26.47
MI038 22.81 22.96 24.01 24.22 24.80 24.30 24.40 24.38 24.70 24.18 24.12 24.45
MI043 21.17 21.04 22.06 21.83 21.70 22.36 22.13 22.13 22.31 23.00 22.71 23.24
MI044 24.26 23.76 25.16 24.35 25.05 25.46 24.03 24.15 24.37 24.80 25.51 25.78
MI045 23.88 23.67 24.74 24.22 24.62 25.02 25.30 25.75 25.26 25.12 26.14 26.98
平均 23.32 23.21 24.37 23.97 24.31 24.36 24.13 24.27 24.45 24.56 24.89 25.38
SEM 0.61 0.60 0.65 0.57 0.66 0.54 0.54 0.60 0.57 0.46 0.65 0.68
*:於第34天發現MI052死亡。
表3. 腫瘤體積及重量之總結
組別 動物 編號 腫瘤體積(mm 3 腫瘤 重量 ( mg) TGI(%)
D1 D4 D7 D11 D14 D18 D21 D25 D28 D32 D35 D35
G1: 載劑 MI039 273.66 265.50 334.42 388.44 462.39 600.99 954.55 1033.73 1246.21 1698.35 1833.05 1064.10 N/A
MI047 300.06 222.20 246.06 268.86 333.72 538.18 716.42 1405.89 1582.38 1771.38 2073.85 1704.60
MI049 322.78 280.12 289.67 292.95 321.52 372.96 523.55 557.61 670.58 796.22 940.35 638.90
MI057 482.26 362.35 332.03 382.50 404.25 465.56 639.62 955.72 991.31 1159.28 1357.04 995.80
MI059 576.81 357.00 292.38 349.42 380.15 405.82 464.71 544.77 906.23 1171.66 1488.24 933.90
平均 391.11 297.43 298.91 336.43 380.41 476.70 659.77 899.54 1079.34 1319.38 1538.51 1067.46
SEM 58.97 27.15 16.25 23.93 25.43 41.91 85.77 161.30 155.84 182.90 195.78 175.01
G2: OBI-3424 MI035 336.94 248.60 247.70 272.45 316.87 443.46 495.51 530.21 534.09 458.78 326.08 187.80 83.13
MI036 416.45 319.17 329.31 403.25 450.69 595.27 703.20 1087.59 929.53 802.95 875.83 442.00
MI040 374.19 317.11 337.59 346.18 410.20 558.01 847.55 1133.30 1088.12 1097.24 1092.67 575.30
MI051 431.65 274.75 282.91 337.46 361.93 491.94 487.42 479.83 505.34 313.47 325.92 74.00
MI053 426.18 316.40 293.88 361.50 385.75 588.12 603.56 635.01 537.45 543.00 332.59 93.10
平均 397.08 295.20 298.28 344.17 385.09 535.36 627.45 773.19 718.91 643.09 590.62 274.44
SEM 18.11 14.31 16.31 21.19 22.50 29.34 67.74 140.13 121.11 138.64 164.32 99.79
G3: 抗hPD-1抗體 MI031 317.46 236.70 257.47 308.80 397.01 693.99 881.79 1085.08 1583.17 1923.48 2446.76 2447.20 -9.69
MI041 272.82 209.94 296.62 308.98 339.27 629.12 1133.34 1200.68 1453.15 1801.67 2416.49 2501.20
MI055 354.07 270.30 282.75 291.53 334.80 515.62 545.25 648.40 782.93 970.79 1023.97 447.30
MI058 458.23 341.42 343.00 412.75 473.75 891.77 904.48 901.39 1044.52 1211.89 1248.89 655.20
MI060 371.40 288.50 328.21 375.46 423.96 944.97 935.49 904.19 991.40 923.05 930.75 281.50
平均 354.80 269.37 301.61 339.50 393.76 735.09 880.07 947.95 1171.03 1366.17 1613.37 1266.48
SEM 30.89 22.54 15.41 23.27 26.24 80.53 94.85 93.94 149.72 209.37 338.07 496.67
G4: 抗hPD-L1抗體 MI037 311.93 275.12 258.52 261.37 274.59 334.71 560.79 596.92 636.51 844.25 1122.20 960.10 35.60
MI046 470.43 344.51 365.09 379.77 444.66 599.46 759.83 849.43 918.32 1330.79 1513.23 1437.50
MI048 376.06 275.94 275.91 328.38 353.38 481.58 589.05 897.19 949.94 1161.94 1337.47 1190.20
MI052 413.00 384.63 326.38 445.55 490.86 624.77 1049.86 1294.64 1343.20 1884.53 * *963.00
MI062 477.14 300.15 296.62 299.06 293.86 415.39 417.12 426.57 486.86 557.69 621.65 455.10
平均 409.71 316.07 304.50 342.83 371.47 491.18 675.33 812.95 866.97 1155.84 1148.64 * 1010.73
SEM 30.77 21.27 18.90 32.15 42.04 54.72 108.32 147.72 147.29 225.44 193.00 209.29
G5: OBI-3424+ 抗hPD-1抗體 MI034 255.56 235.32 259.12 316.52 319.27 406.87 333.76 271.54 259.90 317.15 388.43 124.30 109.71
MI042 365.53 303.74 314.43 364.96 412.55 508.29 322.13 314.43 298.78 320.28 245.14 53.70
MI050 450.24 376.72 371.44 372.22 438.22 579.37 570.71 493.70 503.36 367.28 242.18 102.40
MI054 445.96 267.88 273.95 314.86 334.05 384.14 295.90 243.93 211.39 196.54 198.00 53.10
MI056 376.86 279.26 300.66 327.56 347.38 423.68 432.55 417.39 229.54 257.99 263.40 65.70
平均 378.83 292.58 303.92 339.23 370.30 460.47 391.01 348.20 300.59 291.85 267.43 79.84
SEM 35.34 23.74 19.47 12.24 23.28 36.38 50.54 46.82 52.81 29.47 32.10 14.29
G6: OBI-3424+ 抗hPD-L1抗體 MI033 383.35 290.41 302.58 412.69 451.18 568.41 452.77 375.48 426.92 519.39 396.47 147.70 97.11
MI038 286.46 235.58 260.09 326.89 435.04 570.91 615.63 595.06 735.67 793.12 773.46 429.20
MI043 516.08 320.84 267.89 306.21 340.88 695.17 687.48 641.22 565.46 512.11 366.43 132.80
MI044 418.50 332.14 388.79 389.37 484.13 672.17 688.96 406.06 259.81 281.58 341.67 86.90
MI045 493.81 349.65 306.13 389.67 478.67 548.76 623.49 413.49 504.75 501.25 385.72 145.60
平均 419.64 305.72 305.09 364.96 437.98 611.08 613.66 486.26 498.52 521.49 452.75 188.44
SEM 41.15 20.01 22.83 20.48 25.88 30.10 43.07 54.70 78.38 81.19 80.72 61.18
*於第34天發現MI052死亡,並記錄其腫瘤重量。平均腫瘤重量統計計算中不包括MI052。
首先,我們檢查來自G1(載劑)、G2(OBI-3424)、G3(抗hPD-1抗體),以及G4(抗hPD-L1抗體)的所有測試品項對腫瘤反應的效果。於第35天時,在存在OBI-3424的情況下,觀察到平均腫瘤體積顯著減少(G1載劑:1538.51±195.78 mm 3;G2 OBI-3424:590.62±164.32 mm 3,p = 0.003 < 0.05)。在第35天以抗hPD-1抗體及抗hPD-L1的治療未觀察到統計學上的顯著差異(G1載劑:1538.51±195.78 mm 3;G3抗hPD-1抗體:1613.37±338.07 mm 3;G4抗hPD-L1抗體:1148.64±193.00 mm 3)。
此外,組合治療G5(抗hPD-1抗體 + OBI-3424)及G6(抗hPD-L1抗體 + OBI-3424)的結果顯示第35天的平均腫瘤體積顯著減少(G1載劑:1538.51±195.78 mm 3;G5抗hPD-1抗體 + OBI-3424:267.43±32.10 mm 3,p = 0.0001 < 0.001;G6抗hPD-L1抗體 + OBI-3424:452.75±80.72 mm 3,p = 0.0005 < 0.001),同時,在第35天G3與G5之間的平均腫瘤體積顯著減少(G3抗-hPD-1抗體:1613.37±338.07 mm 3;G5抗-hPD-1抗體 + OBI-3424:267.43±32.10 mm 3,p = 0.002 <0.05)。此外,在第35天G4與G6之間的平均腫瘤體積顯著減少(G4抗hPD-L1抗體:1148.64±193.00 mm 3;G6抗hPD-L1抗體 + OBI-3424:452.75±80.72 mm 3,p = 0.004 < 0.05)(圖3以及表3)。在腫瘤重量上觀察到類似的趨勢(圖2及表3)。此外,在第34天發現一隻G4(抗-hPD-L1抗體)小鼠死亡,並在同一天記錄腫瘤重量。
從新鮮腫瘤組織中分離出腫瘤浸潤淋巴細胞(TILs),並透過流式細胞儀檢測各組之間表面標記物CD45、CD4、CD8、CD56、CD16、CD25、PD-1及PD-L1的表現量。 4~7提供了個別小鼠的數值數據。這表示相較於載劑,OBI-3424治療(G2)後腫瘤中的CD8 +細胞毒性T細胞(cytotoxic T cells,CTL)細胞數量顯著增加,但在抗PD-1抗體(G3)或抗PD-L1抗體(G4)治療後的腫瘤中未觀察到這種增加。然而,在OBI-3424 +抗PD-1抗體(G5)以及OBI-3424 +抗PD-L1抗體(G6)治療後的腫瘤中,這兩組中的CTL族群數量均顯著升高。這表示增加的CTL族群是由OBI-3424而非抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體治療所引起的。此外,在G5及G6的腫瘤中,CD4 +T輔助細胞的數量顯著增加。載劑以及每個治療組之間的NK細胞數量沒有顯著差異。
表4. TILs中CTL細胞百分比之總結
組別 動物 編號 細胞 濃度 細胞 總數 存活率 CTL細胞 (CD45 +CD8 +) CD25 +CTL細胞(CD45 +CD8 +CD25 +) PD-1 +CTL細胞 (CD45 +CD8 +PD-1 +)
× (10 5/ mL) × 10 6 % 總數% CD45 +圈選 % 細胞 計數 (x10 5) 總數% CTL 圈選 % 細胞 計數 (x10 5) 總數% CTL 圈選 % 細胞 計數 (x10 5)
G1: 載劑 MI039 5.87 10.50 55.90 9.21 53.75 9.67 0.40 4.35 0.42 13.93 95.18 14.63
MI047 8.63 13.10 65.88 10.71 41.07 14.03 0.35 3.27 0.46 10.06 90.88 13.18
MI049 5.16 12.30 41.95 6.62 51.92 8.14 0.85 12.84 1.05 5.85 80.80 7.20
MI057 5.53 9.62 57.48 7.90 37.24 7.60 0.07 0.89 0.07 20.46 95.45 19.68
MI059 12.30 19.00 64.74 14.06 37.94 26.71 0.19 1.35 0.36 13.78 90.03 26.18
G2: OBI-3424 MI035 2.85 4.36 65.37 20.93 49.08 9.13 0.27 1.27 0.12 21.41 92.13 9.33
MI036 2.81 7.37 38.13 12.12 66.81 8.93 0.30 2.48 0.22 12.30 91.25 9.07
MI040 5.72 8.18 69.93 21.14 72.14 17.29 0.77 3.64 0.63 20.63 99.25 16.88
MI051 1.91 2.44 78.28 45.53 74.09 11.11 0.52 1.13 0.13 41.26 91.79 10.07
MI053 3.22 4.06 79.31 36.08 57.70 14.65 0.28 0.78 0.11 28.90 85.06 11.73
G3: 抗hPD-1抗體 MI031 20.80 30.40 68.42 9.30 36.10 28.27 0.26 2.80 0.79 10.83 89.36 32.92
MI041 23.00 35.10 65.53 6.22 34.75 21.83 0.10 1.53 0.35 9.53 84.37 33.45
MI055 6.17 9.53 64.74 21.30 75.47 20.30 0.65 3.05 0.62 15.71 66.70 14.97
MI058 7.72 12.90 59.84 11.17 53.85 14.41 0.84 7.48 1.08 10.88 66.59 14.04
MI060 4.45 6.79 65.54 24.91 55.75 16.91 0.41 1.65 0.28 14.41 57.38 9.78
G4: 抗hPD-L1抗體 MI037 8.66 12.20 70.98 14.00 57.51 17.08 0.27 1.93 0.33 17.16 97.44 20.94
MI046 15.00 22.00 68.18 18.51 57.17 40.72 0.30 1.59 0.66 16.84 88.98 37.05
MI048 11.60 17.70 65.54 11.85 56.56 20.97 0.21 1.77 0.37 12.16 94.63 21.52
MI062 3.28 7.22 45.43 16.01 70.33 11.56 0.63 3.90 0.45 16.68 98.61 12.04
G5: OBI-3424+ 抗hPD-1抗體 MI034 2.00 2.90 68.97 30.12 56.19 8.73 0.64 2.13 0.19 15.92 52.86 4.62
MI042 0.24 0.49 48.28 25.43 46.84 1.25 0.20 0.77 0.01 11.13 35.95 0.55
MI050 1.71 2.91 58.76 20.78 59.78 6.05 0.44 2.09 0.13 11.90 52.33 3.46
MI054 0.89 1.21 73.88 31.55 63.27 3.82 0.58 1.84 0.07 16.88 48.79 2.04
MI056 2.06 3.13 65.81 30.09 55.23 9.42 0.37 1.23 0.12 12.41 39.23 3.88
G6: OBI-3424+ 抗hPD-L1抗體 MI033 2.16 3.20 67.50 27.93 65.90 8.94 0.30 1.07 0.10 25.02 87.30 8.01
MI038 4.46 5.69 78.38 31.74 49.21 18.06 0.39 1.23 0.22 30.71 97.65 17.47
MI043 3.20 4.50 71.11 40.03 69.67 18.01 0.28 0.69 0.13 25.12 66.20 11.30
MI044 1.06 1.81 58.56 22.68 53.32 4.11 0.33 1.43 0.06 20.46 89.05 3.70
MI045 3.28 4.20 78.10 32.10 61.60 13.48 0.27 0.83 0.11 29.07 93.11 12.21
CD45 +圈選(Gated)% = 圈選的CD45 +細胞 細胞計數(x10 4)=細胞總數 x 總數% x 10 CTL圈選% = 圈選的CD45 +CD8 +細胞
5. TILs中TH細胞的百分比之總結
組別 動物 編號 細胞 濃度 細胞 總數 存活率 TH細胞 (CD45 +CD4 +) CD25 +TH細胞(CD45 +CD4 +CD25 +) PD-1 +TH細胞 (CD45 +CD4 +PD-1 +)
× (10 5/ mL) × 10 6 % 總數% CD45 +圈選 % 細胞 計數 (x10 5) 總數% TH 圈選 % 細胞 計數 (x10 5) 總數% TH 圈選 % 細胞 計數 (x10 5)
G1: 載劑 MI039 5.87 10.50 55.90 6.86 40.03 7.20 0.59 8.61 0.62 7.13 99.30 7.49
MI047 8.63 13.10 65.88 15.84 60.74 20.75 0.77 4.86 1.01 14.43 98.23 18.90
MI049 5.16 12.30 41.95 5.60 43.88 6.89 0.58 10.28 0.71 5.47 98.20 6.73
MI057 5.53 9.62 57.48 11.34 53.43 10.91 0.39 3.40 0.38 15.83 99.94 15.23
MI059 12.30 19.00 64.74 17.72 47.82 33.67 0.77 4.35 1.46 18.40 99.00 34.96
G2: OBI-3424 MI035 2.85 4.36 65.37 18.53 43.45 8.08 1.06 5.70 0.46 19.45 99.46 8.48
MI036 2.81 7.37 38.13 9.14 50.36 6.74 0.68 7.39 0.50 9.29 98.15 6.85
MI040 5.72 8.18 69.93 14.30 48.78 11.70 0.82 5.74 0.67 13.77 99.75 11.26
MI051 1.91 2.44 78.28 14.34 23.33 3.50 0.52 3.63 0.13 15.00 97.06 3.66
MI053 3.22 4.06 79.31 16.81 26.88 6.82 0.53 3.15 0.22 16.75 97.78 6.80
G3: 抗hPD-1抗體 MI031 20.80 30.40 68.42 19.18 74.49 58.31 0.71 3.70 2.16 20.78 96.11 63.17
MI041 23.00 35.10 65.53 11.07 61.90 38.86 0.67 6.05 2.35 11.99 90.08 42.08
MI055 6.17 9.53 64.74 9.76 34.59 9.30 0.82 8.35 0.78 9.21 83.23 8.78
MI058 7.72 12.90 59.84 11.17 53.85 14.41 1.28 11.42 1.65 11.61 82.55 14.98
MI060 4.45 6.79 65.54 18.23 40.81 12.38 0.45 2.44 0.31 15.49 85.27 10.52
G4: 抗hPD-L1抗體 MI037 8.66 12.20 70.98 9.82 40.34 11.98 1.19 12.12 1.45 10.85 99.40 13.24
MI046 15.00 22.00 68.18 12.42 38.36 27.32 1.34 10.75 2.95 11.67 99.02 25.67
MI048 11.60 17.70 65.54 6.81 32.51 12.05 1.01 14.76 1.79 6.66 99.40 11.79
MI062 3.28 7.22 45.43 15.92 69.93 11.49 1.14 7.16 0.82 15.38 99.19 11.10
G5: OBI-3424+ 抗hPD-1抗體 MI034 2.00 2.90 68.97 31.40 58.59 9.11 1.49 4.73 0.43 29.96 89.25 8.69
MI042 0.24 0.49 48.28 29.46 54.25 1.45 0.60 2.02 0.03 28.73 86.08 1.42
MI050 1.71 2.91 58.76 14.65 42.15 4.26 0.94 6.42 0.27 13.65 87.05 3.97
MI054 0.89 1.21 73.88 22.65 45.42 2.74 1.62 7.13 0.20 20.44 83.31 2.47
MI056 2.06 3.13 65.81 24.15 44.32 7.56 0.85 3.50 0.27 22.53 87.16 7.05
G6: OBI-3424+ 抗hPD-L1抗體 MI033 2.16 3.20 67.50 14.36 33.88 4.60 0.56 3.90 0.18 15.43 98.75 4.94
MI038 4.46 5.69 78.38 43.37 67.24 24.68 3.95 9.11 2.25 41.44 99.72 23.58
MI043 3.20 4.50 71.11 19.38 33.73 8.72 0.53 2.71 0.24 20.71 99.00 9.32
MI044 1.06 1.81 58.56 19.02 44.72 3.44 0.94 4.94 0.17 21.16 99.18 3.83
MI045 3.28 4.20 78.10 20.28 38.91 8.52 0.59 2.91 0.25 21.10 99.67 8.86
CD45 +圈選% = 圈選的CD45 +細胞 細胞計數(x10 4)= 細胞總數 x 總數% x 10 TH圈選% = 圈選的CD45 +CD4 +細胞
表6. TILs中NK細胞百分比之總結
組別 動物 編號 細胞 濃度 細胞 總數 存活率 NK細胞 (CD45 +CD56 +) CD16 +NK細胞(CD45 +CD56 +CD16 +) PD-1 +NK細胞(CD45 +CD56 +PD-1 +)
× (10 5/ mL) × 10 6 % 總數% CD45 +圈選 % 細胞 計數 (x10 5) 總數% NK 圈選 % 細胞 計數 (x10 5) 總數% NK 圈選 % 細胞 計數 (x10 5)
G1: 載劑 MI039 5.87 10.50 55.90 1.26 9.08 1.32 0.16 12.30 0.17 1.89 99.74 1.98
MI047 8.63 13.10 65.88 2.62 9.86 3.43 1.01 38.43 1.32 1.68 94.10 2.20
MI049 5.16 12.30 41.95 2.78 23.40 3.42 0.69 24.82 0.85 1.04 66.77 1.28
MI057 5.53 9.62 57.48 0.74 3.67 0.71 0.26 34.46 0.25 1.91 100.00 1.84
MI059 12.30 19.00 64.74 0.72 1.96 1.37 0.18 24.48 0.34 3.36 94.12 6.38
G2: OBI-3424 MI035 2.85 4.36 65.37 2.47 6.06 1.08 0.39 15.62 0.17 3.26 88.81 1.42
MI036 2.81 7.37 38.13 1.62 9.96 1.19 0.21 12.65 0.15 1.51 88.82 1.11
MI040 5.72 8.18 69.93 1.15 4.16 0.94 0.24 20.43 0.20 1.63 97.60 1.33
MI051 1.91 2.44 78.28 2.73 5.20 0.67 0.21 7.71 0.05 2.76 90.05 0.67
MI053 3.22 4.06 79.31 1.39 2.33 0.56 0.17 11.87 0.07 2.38 83.33 0.97
G3: 抗hPD-1抗體 MI031 20.80 30.40 68.42 2.91 12.27 8.85 0.41 13.94 1.25 2.67 99.81 8.12
MI041 23.00 35.10 65.53 1.08 6.34 3.79 0.32 29.77 1.12 1.13 100.00 3.97
MI055 6.17 9.53 64.74 3.01 12.96 2.87 0.44 14.48 0.42 2.36 87.08 2.25
MI058 7.72 12.90 59.84 1.93 9.57 2.49 0.32 16.58 0.41 1.46 98.31 1.88
MI060 4.45 6.79 65.54 4.76 12.69 3.23 0.79 16.61 0.54 1.78 64.90 1.21
G4: 抗hPD-L1抗體 MI037 8.66 12.20 70.98 1.67 9.51 2.04 0.44 26.13 0.54 2.28 99.56 2.78
MI046 15.00 22.00 68.18 2.61 10.84 5.74 0.80 30.65 1.76 2.28 97.23 5.02
MI048 11.60 17.70 65.54 1.42 12.49 2.51 0.62 43.46 1.10 2.10 88.77 3.72
MI062 3.28 7.22 45.43 1.80 8.78 1.30 0.48 26.39 0.35 1.78 91.52 1.29
G5: OBI-3424+ 抗hPD-1抗體 MI034 2.00 2.90 68.97 3.12 6.58 0.90 0.40 12.82 0.12 2.46 65.29 0.71
MI042 0.24 0.49 48.28 5.87 10.28 0.29 0.80 13.54 0.04 2.83 63.38 0.14
MI050 1.71 2.91 58.76 3.98 12.46 1.16 0.82 20.50 0.24 2.11 68.62 0.61
MI054 0.89 1.21 73.88 4.04 8.60 0.49 0.59 14.60 0.07 1.99 70.82 0.24
MI056 2.06 3.13 65.81 3.66 7.72 1.15 0.43 11.76 0.13 1.99 62.09 0.62
G6: OBI-3424+ 抗hPD-L1 MI033 2.16 3.20 67.50 1.71 4.79 0.55 0.39 22.81 0.12 2.57 85.50 0.82
MI038 4.46 5.69 78.38 3.94 7.12 2.24 0.77 19.42 0.44 4.00 90.69 2.28
MI043 3.20 4.50 71.11 3.32 11.18 1.49 0.40 11.90 0.18 4.01 67.25 1.80
MI044 1.06 1.81 58.56 3.01 8.98 0.54 0.46 15.28 0.08 2.79 85.43 0.50
MI045 3.28 4.20 78.10 3.09 6.87 1.30 0.71 23.01 0.30 4.69 90.36 1.97
CD45 +圈選% = 圈選的CD45 +細胞 細胞計數(x10 4)= 細胞總數 x 總數% x 10 NK圈選% = 圈選的CD45 +CD56 +細胞
表7. TILs中PD-L1細胞百分比之總結
組別 動物 編號 細胞 濃度 細胞 總數 存活率 CD45 +細胞 細胞總數 總PD-L1 +細胞 (PD-L1 +)
× (10 5/ mL) × 10 6 % 總數% 圈選 % 細胞計數 (x10 6) 總數% 圈選 % 細胞計數 (x10 6) 總數% Total cells 圈選 % 細胞計數 (x10 5)
G1: 載劑 MI039 5.87 10.50 55.90 17.13 30.98 1.80 53.73 53.73 5.64 3.80 7.06 3.99
MI047 8.63 13.10 65.88 26.08 37.00 3.42 82.52 82.52 10.81 7.38 8.94 9.67
MI049 5.16 12.30 41.95 12.75 18.11 1.57 81.77 81.77 10.06 24.44 29.89 30.06
MI057 5.53 9.62 57.48 21.22 39.14 2.04 46.07 46.07 4.43 0.70 1.51 0.67
MI059 12.30 19.00 64.74 37.05 53.59 7.04 78.60 78.60 14.93 3.86 4.90 7.33
G2: OBI-3424 MI035 2.85 4.36 65.37 42.64 58.88 1.86 87.63 87.63 3.82 4.97 5.67 2.17
MI036 2.81 7.37 38.13 18.14 28.16 1.34 79.89 79.89 5.89 19.30 24.15 14.22
MI040 5.72 8.18 69.93 29.31 40.69 2.40 84.57 84.57 6.92 5.09 6.02 4.16
MI051 1.91 2.44 78.28 61.46 79.75 1.50 94.06 94.06 2.30 1.08 1.15 0.26
MI053 3.22 4.06 79.31 62.53 79.11 2.54 94.44 94.44 3.83 0.62 0.65 0.25
G3: 抗hPD-1抗體 MI031 20.80 30.40 68.42 25.75 41.15 7.83 53.84 53.84 16.37 3.47 6.45 10.55
MI041 23.00 35.10 65.53 17.89 30.42 6.28 51.71 51.71 18.15 3.89 7.52 13.65
MI055 6.17 9.53 64.74 28.22 47.95 2.69 67.88 67.88 6.47 2.50 3.68 2.38
MI058 7.72 12.90 59.84 20.74 36.87 2.68 77.26 77.26 9.97 6.05 7.83 7.80
MI060 4.45 6.79 65.54 44.68 63.31 3.03 89.23 89.23 6.06 6.21 6.95 4.22
G4: 抗hPD-L1抗體 MI037 8.66 12.20 70.98 24.35 34.93 2.97 77.18 77.18 9.42 1.11 1.43 1.35
MI046 15.00 22.00 68.18 32.38 47.08 7.12 75.98 75.98 16.72 1.81 2.38 3.98
MI048 11.60 17.70 65.54 20.95 31.41 3.71 74.62 74.62 13.21 8.80 11.79 15.58
MI062 3.28 7.22 45.43 22.77 28.59 1.64 88.63 88.63 6.40 16.86 19.02 12.17
G5: OBI-3424+ 抗hPD-1抗體 MI034 2.00 2.90 68.97 53.60 70.26 1.55 88.56 88.56 2.57 0.85 0.96 0.25
MI042 0.24 0.49 48.28 54.30 81.64 0.27 53.73 53.73 0.26 1.46 2.72 0.07
MI050 1.71 2.91 58.76 34.76 53.31 1.01 50.19 50.19 1.46 2.12 4.21 0.62
MI054 0.89 1.21 73.88 49.86 70.32 0.60 49.84 49.84 0.60 1.86 3.73 0.23
MI056 2.06 3.13 65.81 54.48 78.32 1.71 90.68 90.68 2.84 2.12 2.34 0.66
G6: OBI-3424+ 抗hPD-L1抗體 MI033 2.16 3.20 67.50 42.38 60.88 1.36 72.79 72.79 2.33 1.67 2.29 0.53
MI038 4.46 5.69 78.38 64.51 81.40 3.67 80.45 80.45 4.58 0.74 0.92 0.42
MI043 3.20 4.50 71.11 57.46 79.35 2.59 88.15 88.15 3.97 1.48 1.67 0.67
MI044 1.06 1.81 58.56 42.53 64.37 0.77 89.54 89.54 1.62 2.50 2.79 0.45
MI045 3.28 4.20 78.10 52.11 72.03 2.19 93.65 93.65 3.93 1.00 1.06 0.42
結果顯示施用抗-hPD-1抗體或抗-hPD-L1抗體對腫瘤生長沒有影響。相較之下,在HepG2人源化小鼠模型中,OBI-3424的施用、OBI-3424與抗hPD-1抗體的組合治療,或OBI-3424與抗hPD-L1抗體的組合治療證明對腫瘤生長具有有效的抗腫瘤作用。
實施例 2. OBI-3424 + PD-1 抗體(帕博利珠單抗( pembrolizumab ))在 HepG2 腫瘤人源化小鼠模型中的功效性評估
研究之目的為評估在HepG2人源化小鼠模型中存在抗PD-1抗體(帕博利珠單抗(pembrolizumab))的情況下,不同劑量的OBI-3424測試品項對腫瘤生長的功效,以及CD8 +T細胞耗竭對組合治療(OBI-3424/抗PD-1抗體)的抗腫瘤作用的影響。
材料
1. OBI-3424-DP 批號:FLC-INJ-1711-01 測試品項數:2小瓶/每小瓶1 mL 成分:DNA烷基化劑 濃度:10 mg/mL 物理外觀:透明液體 儲存條件:-20℃
2. 抗人類PD-1抗體,帕博利珠單抗(pembrolizumab),默克公司。 批號:7006846900 測試品項數:1瓶/每瓶100 mg 成分:抗體 濃度:25 mg/mL 物理外觀:透明液體 儲存條件:2~8℃
3. 等滲透壓氯化鈉溶液(信東生技股份有限公司) 批號:1OP2A092 濃度:0.9%氯化鈉 物理外觀:透明液體 溶解度:未提供 儲存條件:室溫
4. 基質膠(Corning公司,型號:354248,批號:0261002)
5. 人類PBMC(批號:PBMC102219D,Zenbio公司,美國)
6. 膠原酶(Sigma Aldrich公司,型號:C5138),DNA水解酶I(Sigma Aldrich公司,型號:D5025),玻尿酸酶(Sigma Aldrich公司,型號:H6254)
7. RBC紅血球裂解緩衝液(Biolegend公司,型號:420302)
8. 細胞染色緩衝液(Biolegend公司,型號:420201)
9. 人類TruStain FcX TM(Fc受體阻隔溶液)(Biolegend公司,型號:422302)
10. 抗體: 抗人類CD45抗體(Biolegend公司,型號:368508)、抗人類CD8抗體(Biolegend公司,型號:344710)、抗人類CD4抗體(Biolegend公司,型號:317429)、抗人類CD56抗體(Biolegend公司,型號:318332)、抗人類CD11c抗體(Biolegend公司,型號:301614)、抗人類CD25抗體(Biolegend公司,型號:302610)、抗人類CD69抗體(Biolegend公司,型號:310914)、抗人類CD86抗體(Biolegend公司,型號:305406)、抗人類CD91抗體(Invitrogen、46-0919-42)、抗人類 Foxp3抗體(Biolegend公司,型號:320108)、抗人類IFN-γ抗體(Biolegend公司,型號:506507)、抗人類顆粒酶B抗體(Biolegend公司,型號:372204)、抗人類鈣網伴護蛋白抗體(Abcam公司,型號:ab209577)、抗人類PD-1抗體(Biolegend公司,型號:329907)、抗人類PD-L1抗體(Biolegend公司,型號:329738)以及ViaKrome 405(Biolegend公司,型號:302610)。
小鼠
1. 物種:小鼠( Mus musculus) 品系:晚期免疫缺陷小鼠。 (NOD.Cg-Prkdc scidIl2rg) 來源:三華生物科技股份有限公司
性別:雌 研究開始時的年齡:6~8週 研究開始時的體重範圍:17~30克
2. 編號與識別:每隻小鼠以耳標編號。透過籠卡識別住籠,其中包括研究編號、籠編號、動物編號、性別、劑量含量等資訊。
動物分組:小鼠分為9組:G1(載劑)、G2(OBI-3424 0.3 mg/kg)、G3(OBI-3424 1 mg/kg)、G4(抗hPD-1抗體)、G5(OBI-3424 0.3 mg/kg +抗hPD-1抗體)、G6(OBI-3424 1 mg/kg +抗-hPD-1抗體),以及G7(OBI-3424 1 mg/kg +抗hPD-1抗體,不包括CD8 +PBMC組)。每組包含六隻小鼠。將人類肝癌細胞株HepG2皮下接種至晚期免疫缺陷小鼠。本項研究含括共42隻小鼠。
3. 選擇動物的原因:根據衛生福利部食品藥物管理署公告之非臨床藥物安全性研究建議中的抗癌藥物非臨床研究指南,可將動物異種移植腫瘤模型用於評估新藥或新抗癌藥的療效。常用的小鼠品系包括BALB/c、C57BL/6,而通常選擇BALB/c Nude、Nu/Nu以及NOD/SCID小鼠來評估目標藥物的抗腫瘤作用。這些品系是在全球的基礎下進行管理的,具有眾所周知的遺傳及品種背景,可提供對人體適當反應的功能性意義。
4. 適應期:在隨機分組之前,使小鼠適應至少3天。在適應期間進行臨床觀察並測量體重。在此期間,這些動物沒有表現出任何疾病跡象或行為改變。
5. 動物的居住條件:將小鼠飼養在單獨的通風籠(individually ventilated cages,IVC)中,該籠中裝有無菌墊層(10054,Andersons公司,美國),在受控環境中,溫度為22±3℃,相對濕度為50±20%,光照/黑暗週期為12/12小時。在整個研究期間,小鼠可隨意取用食物(LabDiet 5010,PMI公司,美國)及水(無菌逆滲透水)。
6. 隨機化:將所有動物稱重,並在研究前觀察健康狀況。在實驗中選擇沒有異常臨床徵狀的動物。將健康的動物隨機分為不同的組別,各組之間的體重沒有顯著差異。動物的體重變化不應超過平均體重的±20%。該程序遵循實驗室動物操作標準。
7. IACUC核准號:IACUC-2020-SH-024
設備細胞培養培養箱(Shel Lab公司/3552) 生物安全櫃(BAKER公司/SG604) 電子天平(PRECISA公司/XS 225A-SCS) 吸量管(Thermo公司/Finnpipette F1) 隔離正/負壓驗證的籠式住房系統(Allentown公司/NEXGEN) 分析天平(PRECISA公司/XS3250C-SCS) 動物安樂死設備(聯臺國際科技有限公司) 流式細胞儀(Beckman Coulter公司/Navios EX) 游標尺(Mitutoyo公司/CD-6”ASX)
方法
實驗設計
取樣:實驗設計、實驗組、注射劑量與體積、施用途徑以及動物數量列於 8
表8. 劑量方案及取樣
組別 測試品項的施用途徑 注射劑量 (mg/kg) 注射體積 (mg/kg) 動物 數量
G1: 載劑 IV N/A 5 6
G2: OBI-3424 IV 0.3 5 6
G3: OBI-3424 IV 1 5 6
G4: 抗hPD-1抗體 IP 20 10 6
G5: OBI-3424+PD-1抗體 IV及IP 0.3+20 5+10 6
G6: OBI-3424+PD-1抗體 IV及IP 1+20 5+10 6
G7: OBI-3424+PD-1抗體 (不包括CD8 +PBMC) IV及IP 1+20 5+10 6
靜脈注射(IV):注射量為5 mL/kg 腹膜內注射(IP):注射量為10 mL/kg
2. 異種移植小鼠模型之建立
2.1. 動物除毛:在注射人類肝癌細胞株HepG2之前,僅剪除右側腹部的毛髮。
2.2. 皮下接種腫瘤細胞:將1x10 7個HepG2細胞與0.25x10 7個 hPBMC(細胞數比為4:1)預混合,然後再與基質膠混合(體積比1:1)(Corning公司,型號:354248,批號:8228001)。皮下注射體積為200 μL/小鼠。
將腫瘤細胞注射的日期表示為潛伏期的第一天(L0)。
3. 測試物品的施用途徑:
3.1. 在第0天將測試品項OBI-3424或參考品項以靜脈內注射施用於小鼠。使用胰島素注射器以0.3 mg/kg或1 mg/kg的劑量進行注射,且注射體積為5mL/kg。針對G2、G3、G5、G6及G7,在第7、14、21及28天連續給予OBI-3424測試品項。G1組施用該參考品項。該程序遵循樣品施用的標準。給予試驗品項的開始日為第一個實驗日(D0)。
3.2. 於第2天將測試品項抗hPD-1抗體以腹膜內注射施用於小鼠。使用胰島素注射器以20 mg/kg的劑量以及10mL/kg的注射體積進行注射。針對G4、G5、G6及G7,在第5、9、12、16、19、23及26天連續給予測試品項抗hPD-1抗體。該程序遵循樣品施用的標準。
3.3. 測試品項或參考品項之準備: 施用前,將測試品項以參考品項稀釋。測試品項OBI-3424的溶液濃度為0.06 mg/mL及0.2 mg/mL,測試品項抗hPD-1抗體為2 mg/mL。
4. 體重測量: 從接種的第二天開始進行測量。測量動物體重,每週記錄兩次。
5. 腫瘤直徑測量: 從接種的第二天開始進行測量。每週兩次測量並記錄腫瘤體積(週一、週四)。根據記錄,透過橢圓方程式算出腫瘤體積(長軸×短軸×短軸)×(π/6)。
6. 腫瘤生長抑制率之計算: 根據以下公式,將腫瘤體積用於計算腫瘤生長抑制(TGI)速率:TGI(%)= [1-(Ti-T0)/(Ci-C0)]×100,其中Ti及Ci表示實驗結束時(第30天)治療組以及載劑組的平均腫瘤體積。而T0及C0表示實驗開始(第0天)時治療組及載劑組的平均腫瘤體積。
7. 血液採樣: 在實驗終點收集頜下血液樣本。犧牲動物時,可使用心臟穿刺收集血液樣本。將收集的血液樣本於4±2℃下以1500xg離心15分鐘以分離血清及沈澱物。收集上層血清,並保存在低於-70℃的溫度下。該程序遵循動物血液採樣的標準。
8. 確定研究的終點: 該研究在第30天結束。
9. 腫瘤切除: 在研究結束時,以二氧化碳安樂死方式將小鼠犧牲,並切除腫瘤周圍的結締組織。然後取出腫瘤樣品並稱重,如果腫瘤重量超過400 mg,則將其均等地切成三段。準備腫瘤組織以分離腫瘤浸潤淋巴細胞(TILs)。一段的其餘部分以10%甲醛固定並包埋在石蠟中;其他的則存放在低於-70℃的溫度下。
10. 腫瘤浸潤淋巴細胞(TILs)之分離: 以手術刀將腫瘤樣品切成較小的碎片,然後以膠原酶、DNA水解酶I,以及玻尿酸酶(膠原酶,型號C5138,DNA水解酶I ,型號D5025,玻尿酸酶,型號H6254,Sigma Aldrich公司)的混合物消化至少2小時。然後使用注射器柱塞將腫瘤消化物通過70 µm篩孔細胞過濾器(Falcon公司,型號352350),並以PBS洗滌。以RBC紅血球裂解緩衝液(Biolegend公司,型號420302)處理細胞,並製備用於流式細胞儀的單細胞懸浮液。
11. TIL族群之流式細胞儀分析: 以染色緩衝液(Biolegend公司,型號420201)洗滌細胞,重新懸浮於含有Fc受體阻隔溶液(Biolegend公司,型號422302)的染色緩衝液中,並於4℃下作用15分鐘。以螢光共軛的表面抗體對細胞進行染色,並於4℃下作用30分鐘,然後將其重新懸浮於染色緩衝液中以進行流式細胞儀分析。使用Navios EX流式細胞儀(Beckman Coulter公司)進行流式細胞儀分析。使用Kaluza分析軟體(Beckman Coulter公司)分析數據。
12. 統計分析: 結果表示為平均值與平均值的標準誤差(Mean ± SEM)。使用司徒頓t檢定(Microsoft Excel,2007年)計算每個治療組收集的所有數據與同時出現的陰性對照數據之比較。P ≤ 0.05被認為具有顯著差異。
結果
9列出各組體重之總結。在研究開始或犧牲時,G1~G7組之間的平均體重沒有統計學上的顯著差異( 4 及表 9)。
表9. 體重總結
組別 動物 編號 體重(g)
L0 L1 L3 L7 D2 D6 D9 D13 D16 D20 D23 D27 D30
G1: 載劑 MI031 22.05 21.73 22.89 22.36 23.62 25.05 24.09 24.58 24.59 24.56 24.44 24.68 22.93
MI033 20.51 19.87 20.11 19.94 19.10 20.14 20.06 22.19 21.81 22.02 21.24 21.69 20.11
MI054 23.71 23.62 23.44 22.98 23.28 24.10 23.93 24.23 24.65 23.87 23.06 22.54 21.47
MI058 24.10 24.35 24.34 24.45 24.28 24.34 24.03 24.98 25.02 25.30 25.31 25.50 24.29
MI070 20.37 19.72 20.50 20.71 20.18 23.10 20.59 23.14 23.13 23.53 21.78 20.73 20.37
MI079 19.28 20.19 21.02 21.52 21.78 22.78 22.54 23.33 24.20 24.51 23.71 24.04 22.57
平均 21.67 21.58 22.05 21.99 22.04 23.25 22.54 23.74 23.90 23.97 23.26 23.20 21.96
SEM 0.79 0.82 0.71 0.66 0.84 0.71 0.74 0.42 0.49 0.46 0.64 0.75 0.66
G2: OBI-3424 (0.3 mg/kg) MI036 20.66 20.85 21.84 21.82 21.10 21.72 20.84 21.95 21.66 22.00 21.53 21.32 20.17
MI042 21.24 21.28 21.89 23.06 22.12 23.84 23.67 23.82 23.93 24.14 23.32 23.24 22.36
MI048 23.04 22.53 23.06 23.01 22.75 23.46 22.94 23.20 23.72 23.44 23.35 23.18 21.65
MI061 22.63 23.02 23.57 23.62 23.28 24.10 24.14 23.96 24.02 24.21 23.91 23.92 22.81
MI090 25.00 25.12 24.12 23.73 23.23 23.68 23.38 23.82 24.56 23.98 23.98 23.80 22.44
MI093 23.36 23.18 23.45 23.44 23.55 24.82 24.58 24.87 24.17 23.75 23.72 23.94 22.94
平均 22.66 22.66 22.99 23.11 22.67 23.60 23.26 23.60 23.68 23.59 23.30 23.23 22.06
SEM 0.64 0.62 0.38 0.28 0.38 0.42 0.54 0.40 0.42 0.34 0.37 0.41 0.42
G3: OBI-3424 (1 mg/kg) MI038 21.11 20.59 20.70 22.50 21.69 21.91 22.01 22.55 22.68 22.87 23.02 22.66 22.31
MI039 21.33 21.16 22.24 22.44 22.40 23.15 23.65 24.14 23.51 23.39 24.10 24.41 23.72
MI056 23.07 22.18 22.28 22.31 22.55 23.56 22.70 23.60 23.20 24.21 23.75 23.42 23.08
MI060 24.07 23.34 24.21 24.22 23.34 24.29 24.85 25.97 25.06 25.53 25.37 24.68 23.90
MI077 19.46 20.56 20.80 21.42 20.20 21.84 21.52 22.22 22.25 21.98 22.89 22.84 22.02
MI089 22.68 23.40 24.01 25.55 24.22 24.90 23.72 24.68 23.35 24.69 25.12 24.66 23.87
平均 21.95 21.87 22.37 23.07 22.40 23.28 23.08 23.86 23.34 23.78 24.04 23.78 23.15
SEM 0.67 0.53 0.62 0.62 0.56 0.51 0.50 0.57 0.39 0.53 0.42 0.38 0.34
G4: PD-1抗體 (20 mg/kg) MI030 21.15 22.22 22.28 22.27 22.72 23.42 23.27 23.91 24.02 23.53 24.14 23.57 22.68
MI035 21.19 20.61 21.38 21.44 21.11 21.38 21.52 21.90 21.33 22.00 21.15 19.29 18.42
MI045 21.82 21.84 22.87 23.16 22.69 23.51 23.58 23.56 24.01 24.34 23.47 23.24 22.49
MI047 21.03 20.64 21.14 22.30 21.97 22.44 21.24 21.85 21.00 20.52 19.43 19.43 18.28
MI053 22.27 22.00 22.64 22.76 22.88 23.38 23.19 23.60 23.33 24.43 24.46 24.74 24.00
MI087 23.11 22.72 23.21 24.04 23.93 24.02 23.71 24.09 23.04 22.69 21.87 19.83 19.38
平均 21.76 21.67 22.25 22.66 22.55 23.03 22.75 23.15 22.79 22.92 22.42 21.68 20.88
SEM 0.33 0.35 0.34 0.36 0.39 0.39 0.44 0.41 0.54 0.61 0.80 0.99 1.01
G5: OBI-3424+ PD-1抗體 (0.3 mg/kg +20 mg/kg) MI029 20.81 21.05 21.58 21.21 21.99 22.57 22.26 22.94 23.38 23.34 22.84 22.12 21.45
MI032 20.96 21.45 22.27 22.62 23.34 23.63 23.65 23.46 24.27 24.53 24.34 24.51 23.89
MI049 23.40 22.90 23.13 23.49 23.00 24.07 24.30 24.48 24.34 24.57 24.17 25.20 25.43
MI062 22.36 21.91 22.25 23.49 23.07 23.28 23.39 23.33 23.16 23.38 23.24 23.21 22.79
MI064 21.01 20.89 21.73 21.74 21.87 22.91 23.70 23.88 24.66 23.54 24.37 23.81 22.50
MI076 18.35 18.83 19.93 20.92 20.68 21.15 20.75 21.24 21.70 21.41 21.08 21.23 20.31
平均 21.15 21.17 21.82 22.25 22.33 22.94 23.01 23.22 23.59 23.46 23.34 23.35 22.73
SEM 0.70 0.55 0.44 0.46 0.41 0.42 0.53 0.45 0.45 0.47 0.52 0.61 0.73
G6: OBI-3424+ PD-1抗體 (1 mg/kg +20 mg/kg) MI034 20.15 19.74 20.75 21.61 21.05 21.96 21.26 21.82 23.03 22.78 21.12 21.90 21.32
MI041 21.74 21.58 23.24 23.66 23.68 24.37 24.27 24.74 24.45 25.08 24.09 25.08 24.33
MI046 20.48 19.99 21.39 22.05 21.59 22.18 21.14 22.18 22.59 22.68 22.49 23.38 22.13
MI059 21.61 21.78 22.69 22.56 22.69 22.46 22.64 23.04 23.84 23.62 23.58 23.76 23.73
MI088 22.82 22.81 21.54 22.64 22.44 23.25 23.03 23.26 22.89 23.39 23.74 24.35 23.76
MI095 23.26 22.67 22.61 23.43 23.01 24.34 23.94 22.66 22.80 22.97 23.04 23.23 22.41
平均 21.68 21.43 22.04 22.66 22.41 23.09 22.71 22.95 23.27 23.42 23.01 23.62 22.95
SEM 0.50 0.53 0.39 0.32 0.39 0.44 0.54 0.42 0.29 0.36 0.44 0.44 0.48
G7: OBI-3424+ PD-1抗體 (1 mg/kg +20 mg/kg) (不包含CD8 +PBMC) MI066 23.91 23.62 24.10 24.30 24.26 25.08 24.84 25.43 24.90 25.28 25.31 25.50 24.54
MI067 21.49 21.56 22.25 22.47 22.97 23.44 23.23 24.16 24.11 24.43 24.52 25.14 23.89
MI068 20.43 19.82 20.13 20.79 20.59 21.24 21.40 21.21 21.20 22.13 22.40 22.23 22.02
MI069 21.89 21.28 22.28 23.53 22.75 23.31 22.84 23.04 22.84 23.65 23.51 23.80 23.61
MI078 19.10 18.53 19.45 19.76 19.41 20.48 20.25 20.27 20.13 20.12 19.83 20.15 19.32
MI091 25.33 25.36 24.88 24.91 23.78 23.98 23.71 24.11 24.00 24.24 23.75 25.17 23.88
平均 22.03 21.70 22.18 22.63 22.29 22.92 22.71 23.04 22.86 23.31 23.22 23.67 22.88
SEM 0.93 1.01 0.87 0.83 0.77 0.71 0.67 0.80 0.76 0.77 0.79 0.86 0.79
從不同的測試品項檢查腫瘤反應,在注射腫瘤細胞後的L1、L3及L7天記錄平均腫瘤反應,在施用測試品項後的D0、D2、D6、D9、D13、D16、D20、D23、D27及D30天記錄平均腫瘤反應( 6 及表 10)。
首先,我們檢查自G1(載劑)、G2(OBI-3424 0.3 mg/kg)、G3(OBI-3424 1 mg/kg)及G4(抗hPD-1抗體,20 mg/kg)測試品項對腫瘤反應的效果。在第30天,在存在OBI-3424(0.3 mg/kg及1 mg/kg)的情況下,觀察到與劑量相關的平均腫瘤體積減少(G1載體:882.92±158.14 mm 3;G2 OBI-3424 0.3 mg/kg:716.44±31.12 mm 3;G3 OBI-3424 1 mg/kg:216.90±22.20 mm 3,p = 0.00096 <0.001)。於第30天,抗hPD-1抗體的治療中未觀察到統計學上的顯著差異(G1載劑:882.92±158.14 mm 3;G4抗hPD-1抗體:983.84±266.44 mm 3)。
組合治療G5(OBI-3424 0.3 mg/kg +抗hPD-1抗體 20 mg/kg)、G6(OBI-3424 1 mg/kg +抗hPD-1抗體 20 mg/kg)及G7(OBI-3424 1 mg/kg +抗hPD-1抗體 20 mg/kg,不包括CD8 +PBMC)的結果顯示,於D30天相較於載劑組,所有這些組別的平均腫瘤體積均顯著減少(G1載劑:882.92±158.14 mm 3;G5 OBI-3424 0.3 mg/kg +抗hPD-1抗體:429.41±106.14 mm 3,p = 0.0193 <0.05;G6 OBI-3424 1 mg/kg +抗hPD-1抗體:197.74±19.62 mm 3,p = 0.00078 <0.001;G7 OBI-3424 1 mg/kg +抗-hPD-1抗體,不包括CD8 +PBMC:374.44±36.97 mm 3,p = 0.0053 <0.05)。
相較於單一治療,於D30天時,組合治療傾向於改善G2與G5之間以及G3與G6之間對平均腫瘤體積的抑制作用,但是這些減少並不顯著(G2 OBI-3424 0.3 mg/kg:716.44±31.12 mm 3;G5 OBI-3424 0.3 mg/kg +抗hPD-1抗體:429.41±106.14 mm 3;G3 OBI-3424 1 mg/kg:216.90±22.20 mm 3;G6 OBI-3424 1 mg/kg +抗hPD-1抗體:197.74±19.62 mm 3)。此外,計算腫瘤生長抑制(TGI)的百分比以量化治療效果。低劑量與高劑量OBI-3424的單一治療分別產生的TGI為27.82%及113.27%。抗-hPD-1抗體與低劑量及高劑量OBI-3424的組合治療分別產生的TGI為77.22%及117.66%( 6 及表 10)。
不過,針對G6(OBI-3424 1 mg/kg +抗hPD-1抗體)以及G7(OBI-3424 1 mg/kg +抗hPD-1抗體,不包括CD8 +PBMC)進行比較,CD8 +細胞的耗竭導致在D30天的平均腫瘤體積顯著增加(G6 OBI-3424 1 mg/kg +抗hPD-1抗體:197.74±19.62 mm 3,G7 OBI-3424 1 mg/kg +抗hPD-1抗體,不包括CD8 +PBMC:374.44±36.97 mm 3,p = 0.00088 <0.001 ),儘管採用相同劑量的組合治療,TGI的百分比仍從117.66%降至87.35%( 6 及表 10)。在腫瘤重量上也觀察到類似趨勢( 5 及表 10)。
表10. 腫瘤體積及重量之總結
組別 動物 編號 腫瘤體積(mm 3 腫瘤 重量 (mg) TGI(%)
L1 L3 L7 D0 D2 D6 D9 D13 D16 D20 D23 D27 D30 D30
G1: 載劑 MI031 537.1 527.4 303.8 314.2 317.2 328.7 417.9 528.2 724.3 804.6 830.3 868.4 1015. 615.80 N/A
MI033 398.9 395.5 278.0 285.4 286.1 287.5 320.9 335.6 424.2 529.0 543.8 563.1 673.3 486.20
MI054 352.0 347.2 276.2 277.9 279.7 281.1 390.3 520.1 569.8 641.1 817.8 841.5 867.3 805.90
MI058 485.4 463.9 368.9 373.9 375.1 378.1 403.4 418.1 421.6 422.0 422.4 422.4 423.7 91.20
MI070 251.6 251.4 215.7 217.0 222.1 292.5 317.2 407.6 632.0 789.9 916.4 1085. 1562. 942.50
MI079 354.0 297.0 302.9 311.8 312.9 316.9 338.8 353.9 442.6 500.7 535.2 659.7 755.3 544.80
平均 396.5 380.4 290.9 296.7 298.9 314.1 364.8 427.3 535.7 614.6 677.7 740.1 882.9 581.07
SEM 41.81 42.23 20.35 21.07 20.63 14.80 18.10 33.20 51.68 64.53 82.33 97.39 158.1 120.09
G2: OBI-3424 (0.3 mg/kg) MI036 501.6 474.1 278.0 280.0 283.9 289.0 375.6 569.5 714.1 808.4 889.2 926.9 1012. 445.50 27.82
MI042 529.3 501.4 273.7 279.4 281.1 293.9 367.0 452.6 528.0 658.4 661.3 527.6 468.2 223.90
MI048 346.7 337.6 216.4 226.0 230.6 241.0 395.2 528.9 714.4 854.0 890.1 909.1 882.8 327.90
MI061 442.3 401.2 336.7 353.6 354.0 356.0 367.9 388.3 405.8 419.5 297.5 205.1 181.5 63.40
MI090 597.1 491.4 313.3 317.7 321.0 330.5 388.9 590.7 749.1 751.9 842.6 848.5 850.4 449.00
MI093 493.5 461.1 301.9 303.0 334.4 336.3 437.7 524.2 591.5 721.3 884.2 886.5 903.5 317.00
平均 485.1 444.5 286.7 293.3 300.8 307.8 388.7 509.0 617.1 702.3 744.1 717.3 716.4 304.45
SEM 34.55 25.76 16.95 17.53 18.24 16.99 10.83 30.95 54.63 62.98 96.27 119.0 131.1 59.47
G3: OBI-3424 (1 mg/kg) MI038 448.8 395.2 273.6 290.8 295.5 297.0 337.5 341.3 359.9 345.0 260.7 246.4 185.2 62.40 113.27
MI039 449.7 447.9 315.2 318.0 322.4 328.4 468.5 492.3 556.8 552.1 544.3 426.0 295.5 101.90
MI056 394.4 373.2 278.1 286.8 292.9 304.4 334.0 362.5 465.2 465.2 419.2 295.9 215.0 105.20
MI060 244.8 244.1 219.0 233.0 238.8 240.6 301.7 342.7 343.3 343.7 343.7 327.7 197.1 90.30
MI077 508.7 446.7 300.7 306.6 310.3 312.8 337.3 352.9 354.8 355.2 355.2 252.6 145.5 69.80
MI089 410.4 379.8 332.7 332.7 334.6 338.1 416.4 422.6 429.4 425.6 360.3 341.1 262.8 76.80
平均 409.5 381.2 286.5 294.7 299.1 303.6 365.9 385.7 418.2 414.4 380.6 315.0 216.9 84.40
SEM 36.68 30.45 16.27 14.16 13.69 14.02 25.72 24.60 33.95 34.15 38.76 27.16 22.20 7.14
G4: PD-1抗體 (20 mg/kg) MI030 585.9 550.0 299.8 300.3 303.5 305.3 433.1 485.3 516.7 522.8 525.5 446.8 342.6 166.60 -15.29
MI035 508.2 411.4 273.3 277.4 280.5 284.0 469.1 934.7 982.0 1192. 1346. 1629. 1673. 1230.8
MI045 554.1 364.6 280.8 283.7 285.9 288.1 339.5 382.0 382.6 391.8 416.4 600.5 674.1 453.90
MI047 400.6 393.3 332.0 345.0 346.9 348.5 552.4 762.2 772.3 1032. 1076. 1076. 1093. 676.50
MI053 326.5 323.9 242.4 324.7 328.3 331.6 382.0 366.3 356.9 333.6 317.7 310.1 310.1 108.20
MI087 506.8 431.1 316.9 316.7 318.5 321.9 389.3 671.7 690.8 1015. 1089. 1730. 1808. 1541.7
平均 480.4 412.4 290.9 308.0 310.6 313.2 427.6 600.4 616.9 748.1 795.2 965.6 983.8 696.28
SEM 40.04 31.49 13.18 10.51 10.43 10.33 30.89 92.87 99.24 152.6 174.4 249.6 266.4 237.06
G5: OBI-3424+ PD-1抗體 (0.3 mg/kg +20 mg/kg) MI029 575.5 511.0 269.1 276.3 279.9 283.4 365.0 432.8 490.6 523.4 561.4 565.7 567.2 284.00 77.22
MI032 410.1 393.6 317.4 323.5 325.6 326.8 367.2 397.3 424.8 432.7 432.7 348.6 203.6 77.30
MI049 527.7 452.6 331.3 338.1 345.1 348.9 424.6 433.2 437.4 441.7 442.5 314.1 237.6 87.30
MI062 392.7 318.9 242.9 248.4 252.5 254.4 283.4 386.4 390.9 426.4 430.7 399.8 305.0 149.00
MI064 364.1 346.6 286.4 295.5 298.7 301.9 373.1 469.4 475.2 555.2 573.0 427.5 372.4 173.40
MI076 464.4 397.7 298.1 293.1 296.3 297.4 399.6 500.9 539.8 640.5 690.6 799.1 890.3 609.80
平均 455.8 403.4 290.9 295.8 299.7 302.1 368.8 436.7 459.8 503.3 521.8 475.8 429.4 230.13
SEM 33.69 28.57 13.15 13.15 13.37 13.48 19.49 17.60 21.65 34.93 42.90 73.72 106.1 81.77
G6: OBI-3424+ PD-1抗體 (1 mg/kg +20 mg/kg) MI034 403.6 365.0 245.5 271.9 277.1 280.2 322.4 410.6 417.8 395.8 357.2 317.5 267.7 76.20 117.66
MI041 431.2 427.1 293.8 298.0 301.8 303.3 346.5 368.4 373.1 359.4 306.5 197.8 185.5 59.30
MI046 484.8 472.0 326.2 328.4 330.0 241.5 254.9 260.8 377.3 389.9 403.1 331.0 238.4 73.60
MI059 315.5 314.3 268.4 274.3 276.5 279.3 319.6 335.2 335.8 330.2 303.5 193.0 162.1 69.20
MI088 440.6 413.0 288.4 297.3 302.9 305.1 344.2 362.6 371.1 370.8 297.0 278.3 138.0 45.20
MI095 586.6 568.9 331.0 337.3 342.7 345.8 365.3 465.9 471.9 333.2 314.2 241.2 194.5 66.20
平均 443.7 426.7 292.2 301.2 305.2 292.5 325.5 367.3 391.2 363.2 330.3 259.8 197.7 64.95
SEM 36.66 36.01 13.45 11.03 11.03 14.19 15.70 28.28 19.33 11.32 17.00 24.07 19.62 4.63
G7: OBI-3424+ PD-1抗體 (1 mg/kg +20 mg/kg) (不包含 CD8 +PBMC) MI066 373.0 371.9 295.3 298.1 304.0 307.0 422.4 466.3 472.2 473.1 475.1 475.6 356.3 85.30 87.35
MI067 350.1 347.3 247.0 262.5 268.3 274.2 369.0 377.4 386.5 387.4 387.4 333.1 268.0 93.60
MI068 338.4 336.6 323.7 354.0 356.0 358.0 412.1 428.2 437.2 445.7 468.4 471.5 390.8 124.20
MI069 364.3 356.6 249.3 256.3 262.9 264.5 301.9 359.9 360.6 382.0 386.1 379.4 325.8 50.60
MI078 387.0 382.9 293.1 304.8 309.2 311.4 363.6 457.0 458.0 524.0 534.9 535.4 537.7 255.60
MI091 343.3 342.5 324.5 325.6 328.8 330.7 380.8 447.2 451.4 488.5 497.6 501.2 367.8 133.40
平均 359.4 356.3 288.8 300.2 304.8 307.6 374.9 422.7 427.6 450.1 458.3 449.4 374.4 118.78
SEM 7.66 7.33 13.99 15.18 14.50 14.22 17.49 17.99 18.03 23.12 24.52 31.45 36.97 24.53
從新鮮腫瘤組織中分離出腫瘤浸潤淋巴細胞(TILs),並以流式細胞儀測量各組之間的表面標記物CD45、CD4、CD8、CD56、CD11c、CD69、CD25、CD86、CD91、顆粒酶B、IFN-γ、Foxp3、鈣網伴護蛋白(Calreticulin)、PD-1,以及PD-L1的表現量。 11~16中提供個別小鼠的數值數據。相較於載劑組,高劑量OBI-3424治療不論是單獨治療或與抗hPD-1抗體組合治療時,細胞毒性淋巴細胞(CTL)細胞(CD45 +CD8 +T細胞)以及T輔助細胞(T helper,TH)(CD45 +CD4 +T細胞)的數量顯著增加(CTL細胞:G1載劑:15.53±5.66%;G3 OBI-3424 1 mg/kg:33.50±3.38%, p= 0.0107 <0.05;G6 OBI-3424 1 mg/kg +抗hPD-1抗體:38.46±2.63%, p= 0.00215 <0.05。TH細胞:G1載體:14.59±2.00%,G3 OBI-3424 1 mg/kg:25.05±2.08%, p= 0.0023 <0.05;G6 OBI-3424 1 mg/kg +抗hPD-1抗體:30.62±2.07%, p= 0.00012 <0.001)( 13~14)。
表11. TILs中鈣網伴護蛋白細胞百分比之總結
組別 動物 編號 細胞 濃度 細胞 總數 存活率 CD45 -細胞總數 (CD45 -) CD45 -活細胞 (CD45 -ViaKrome405 ) 鈣網伴護蛋白細胞(CD45 -鈣網伴護蛋白 +)
× (10 6/ mL) × 10 6 % 總數% CD45 +圈選 % 細胞 計數 (x10 5) 總數% CTL 圈選 % 細胞 計數 (x10 5) 總數% CTL 圈選 % 細胞 計數 (x10 5)
G1: 載劑 MI031 2.33 23.30 52.58 34.52 51.85 80.43 15.84 45.89 36.91 0.67 4.24 1.56
MI033 2.60 25.95 62.24 34.54 45.88 89.63 13.47 39.00 34.95 0.87 6.44 2.26
MI054 2.56 25.60 64.65 30.47 41.12 78.00 15.06 49.43 38.55 0.91 6.06 2.33
MI058 0.73 7.30 67.53 18.76 21.62 13.69 8.71 46.41 6.36 0.45 5.19 0.33
MI070 2.43 24.30 74.90 40.29 48.60 97.90 19.59 48.62 47.60 1.11 5.68 2.70
MI079 4.42 44.20 72.29 28.66 36.41 126.68 16.05 56.01 70.94 1.50 9.32 6.63
平均 2.51 25.11 65.70 31.21 40.91 81.06 14.79 47.56 39.22 0.92 6.16 2.63
SEM 0.48 4.78 3.25 2.98 4.46 15.26 1.47 2.26 8.53 0.15 0.71 0.87
G2: OBI-3424 (0.3 mg/kg) MI036 1.95 19.45 64.78 36.29 50.59 70.58 20.24 55.78 39.37 2.85 14.09 5.54
MI042 2.05 20.45 62.35 22.44 29.66 45.89 12.36 55.07 25.28 0.62 5.02 1.27
MI048 5.40 54.00 80.46 24.15 28.87 130.41 15.52 64.29 83.81 1.90 12.21 10.26
MI061 0.21 2.14 72.34 10.20 12.41 2.18 6.30 61.79 1.35 0.28 4.51 0.06
MI090 2.47 24.65 80.93 26.47 31.01 65.25 12.13 45.83 29.90 0.45 3.69 1.11
MI093 0.73 7.25 71.03 14.28 21.40 10.35 8.10 56.69 5.87 0.26 3.21 0.19
平均 2.14 21.32 71.98 22.31 28.99 54.11 12.44 56.58 30.93 1.06 7.12 3.07
SEM 0.74 7.41 3.15 3.77 5.18 19.06 2.06 2.61 12.12 0.44 1.94 1.66
G3: OBI-3424 (1 mg/kg) MI038 0.29 2.90 68.97 8.45 9.67 2.45 5.94 70.28 1.72 0.17 2.90 0.05
MI039 1.26 12.62 80.03 12.06 13.99 15.22 7.66 63.52 9.67 0.20 2.61 0.25
MI056 0.71 7.06 65.44 16.62 19.95 11.73 11.16 67.13 7.88 1.25 11.18 0.88
MI060 0.99 9.88 73.48 11.79 13.15 11.65 9.18 77.84 9.07 0.25 2.75 0.25
MI077 0.74 7.44 64.52 11.27 12.84 8.38 7.02 62.30 5.22 0.26 3.65 0.19
MI089 0.81 8.10 84.69 11.04 12.22 8.94 8.30 75.12 6.72 0.15 1.83 0.12
平均 0.80 8.00 72.86 11.87 13.64 9.73 8.21 69.37 6.71 0.38 4.15 0.29
SEM 0.13 1.32 3.32 1.09 1.40 1.76 0.74 2.55 1.19 0.17 1.43 0.12
G4: PD-1抗體 (20 mg/kg) MI030 3.86 38.55 66.41 30.12 39.67 116.11 18.34 60.90 70.70 0.55 2.99 2.12
MI035 10.32 103.20 64.44 16.86 35.97 174.00 7.84 46.50 80.91 0.29 3.72 2.99
MI045 2.67 26.65 63.41 44.65 67.00 118.99 27.23 60.98 72.57 0.42 1.53 1.12
MI047 24.70 247.00 73.48 17.29 27.78 427.06 11.87 68.63 293.19 0.34 2.83 8.40
MI053 2.84 28.35 72.84 17.20 20.43 48.76 8.94 51.99 25.34 0.17 1.88 0.48
MI087 7.96 79.60 44.22 13.96 28.78 111.12 4.37 31.30 34.79 0.30 6.78 2.39
平均 8.73 87.23 64.13 23.35 36.61 166.01 13.10 53.38 96.25 0.35 3.29 2.92
SEM 3.43 34.33 4.34 4.85 6.67 54.67 3.41 5.43 40.43 0.05 0.77 1.16
G5: OBI-3424+ PD-1抗體 (0.3 mg/kg +20 mg/kg) MI029 6.00 60.00 65.75 18.72 22.49 112.32 12.14 64.85 72.84 0.56 4.58 3.36
MI032 0.69 6.86 61.81 11.22 12.86 7.70 8.70 77.57 5.97 0.27 3.13 0.19
MI049 0.94 9.44 59.96 10.46 11.76 9.87 7.77 74.33 7.33 0.58 7.51 0.55
MI062 2.40 24.00 47.08 42.80 50.53 102.72 8.18 19.12 19.63 0.24 2.93 0.58
MI064 2.52 25.20 62.22 24.16 28.02 60.88 10.99 45.49 27.69 0.80 7.31 2.02
MI076 3.17 31.65 47.71 35.75 52.15 113.15 18.92 52.91 59.88 0.99 5.22 3.13
平均 2.62 26.19 57.42 23.85 29.64 67.77 11.12 55.71 32.23 0.57 5.11 1.64
SEM 0.78 7.82 3.26 5.37 7.30 20.23 1.71 8.87 11.41 0.12 0.81 0.57
G6: OBI-3424+ PD-1抗體 (1 mg/kg +20  mg/kg) MI034 0.70 7.00 58.57 11.25 13.01 7.88 7.08 62.92 4.96 0.36 5.14 0.25
MI041 0.75 7.54 48.01 12.45 14.26 9.39 9.13 73.31 6.88 0.23 2.50 0.17
MI046 0.95 9.50 54.32 10.29 12.12 9.78 6.32 61.43 6.00 0.26 4.05 0.25
MI059 0.54 5.36 48.88 10.13 11.15 5.43 7.00 69.15 3.75 0.25 3.54 0.13
MI088 0.28 2.84 44.23 8.02 8.81 2.28 5.55 69.11 1.58 0.43 7.71 0.12
MI095 0.74 7.38 59.08 18.72 20.88 13.82 15.58 83.21 11.50 0.17 1.08 0.13
平均 0.66 6.60 52.18 11.81 13.37 8.09 8.44 69.86 5.78 0.28 4.00 0.18
SEM 0.09 0.93 2.48 1.51 1.68 1.61 1.51 3.22 1.37 0.04 0.93 0.02
G7: OBI-3424+ PD-1抗體 (1 mg/kg +20  mg/kg) (不包含CD8 +PBMC) MI066 1.40 14.02 51.93 24.34 27.12 34.12 19.92 81.85 27.93 1.13 5.68 1.58
MI067 1.22 12.16 59.05 8.22 9.18 10.00 6.57 79.95 7.99 0.06 0.85 0.07
MI068 2.64 26.40 60.15 6.81 7.56 17.98 5.17 75.97 13.65 0.20 3.94 0.53
MI069 0.47 4.72 38.31 6.71 7.57 3.17 4.82 71.75 2.28 0.15 3.16 0.07
MI078 2.54 25.40 71.65 16.11 18.71 40.92 11.09 68.84 28.17 0.87 7.86 2.21
MI091 1.20 11.96 75.92 17.00 19.44 20.33 14.21 83.62 17.00 0.26 1.83 0.31
平均 1.58 15.78 59.50 13.20 14.93 21.09 10.30 77.00 16.17 0.45 3.89 0.80
SEM 0.35 3.46 5.55 2.91 3.29 5.82 2.44 2.39 4.28 0.18 1.05 0.36
CD45 -圈選% = 圈選的CD45 -細胞 活細胞圈選% = 圈選的CD45 -ViaKrome405 細胞 細胞計數(x10 5)= 細胞總數 x 總數% x 10
表12. TILs中PD-L1 +細胞的百分比之總結
組別 動物 編號 細胞 濃度 細胞 總數 存活率 細胞總數 PD-L1 +細胞總數 (PD-L1 +) PD-L1 +細胞 (CD45 -PD-L1 +)
× (10 6/ mL) × 10 6 % 總數% 圈選 % 細胞 計數 (x10 5) 總數% 細胞 總數 圈選 % 細胞 計數 (x10 5) 總數% CD45 -圈選 % 細胞 計數 (x10 5)
G1: 載劑 MI031 2.33 23.30 52.58 48.90 48.90 113.94 3.28 6.70 7.64 1.97 7.65 4.59
MI033 2.60 25.95 62.24 67.54 67.54 175.27 3.61 5.35 9.37 1.88 6.67 4.88
MI054 2.56 25.60 64.65 62.60 62.60 160.26 4.06 6.49 10.39 1.96 8.58 5.02
MI058 0.73 7.30 67.53 88.24 88.24 64.42 2.07 2.35 1.51 0.56 3.81 0.41
MI070 2.43 24.30 74.90 78.33 78.33 190.34 3.32 4.24 8.07 1.75 5.20 4.25
MI079 4.42 44.20 72.29 74.74 74.74 330.35 1.67 2.23 7.38 0.58 2.34 2.56
平均 2.51 25.11 65.70 70.06 70.06 172.43 3.00 4.56 7.39 1.45 5.71 3.62
SEM 0.48 4.78 3.25 5.57 5.57 36.74 0.38 0.80 1.27 0.28 0.97 0.74
G2: OBI-3424 (0.3 mg/kg) MI036 1.95 19.45 64.78 62.65 62.65 121.85 7.42 11.84 14.43 4.84 15.51 9.41
MI042 2.05 20.45 62.35 74.17 74.17 151.68 2.94 3.97 6.01 1.01 5.86 2.07
MI048 5.40 54.00 80.46 82.83 82.83 447.28 4.56 5.50 24.62 1.98 9.64 10.69
MI061 0.21 2.14 72.34 93.16 93.16 19.94 1.34 1.44 0.29 0.35 4.13 0.07
MI090 2.47 24.65 80.93 83.93 83.93 206.89 4.33 5.16 10.67 2.69 12.53 6.63
MI093 0.73 7.25 71.03 68.08 68.08 49.36 2.15 3.16 1.56 0.84 7.23 0.61
平均 2.14 21.32 71.98 77.47 77.47 166.17 3.79 5.18 9.60 1.95 9.15 4.91
SEM 0.74 7.41 3.15 4.60 4.60 62.69 0.88 1.46 3.72 0.67 1.75 1.89
G3: OBI-3424 (1 mg/kg) MI038 0.29 2.90 68.97 94.96 94.96 27.54 1.58 1.66 0.46 0.27 4.18 0.08
MI039 1.26 12.62 80.03 94.48 94.48 119.23 1.19 1.26 1.50 0.24 2.31 0.30
MI056 0.71 7.06 65.44 86.71 86.71 61.22 2.88 3.32 2.03 0.58 3.76 0.41
MI060 0.99 9.88 73.48 95.07 95.07 93.93 1.71 1.80 1.69 0.52 4.37 0.51
MI077 0.74 7.44 64.52 93.62 93.62 69.65 2.24 2.39 1.67 0.66 7.16 0.49
MI089 0.81 8.10 84.69 94.29 94.29 76.37 2.86 3.03 2.32 0.58 4.63 0.47
平均 0.80 8.00 72.86 93.19 93.19 74.66 2.08 2.24 1.61 0.48 4.40 0.38
SEM 0.13 1.32 3.32 1.31 1.31 12.63 0.29 0.33 0.26 0.07 0.65 0.07
G4: PD-1抗體 (20 mg/kg) MI030 3.86 38.55 66.41 79.18 79.18 305.24 2.73 3.45 10.52 1.07 3.76 4.12
MI035 10.32 103.20 64.44 37.54 37.54 387.41 2.44 6.49 25.18 1.20 8.16 12.38
MI045 2.67 26.65 63.41 62.56 62.56 166.72 2.54 4.07 6.77 1.47 3.98 3.92
MI047 24.70 247.00 73.48 60.73 60.73 1500.03 3.53 5.82 87.19 1.46 10.27 36.06
MI053 2.84 28.35 72.84 89.83 89.83 254.67 2.21 2.46 6.27 1.10 7.27 3.12
MI087 7.96 79.60 44.22 17.89 17.89 142.40 1.74 9.73 13.85 0.89 13.27 7.08
平均 8.73 87.23 64.13 57.96 57.96 459.41 2.53 5.34 24.96 1.20 7.79 11.12
SEM 3.43 34.33 4.34 10.83 10.83 211.34 0.24 1.07 12.76 0.09 1.50 5.18
G5: OBI-3424+ PD-1抗體 (0.3 mg/kg +20 mg/kg) MI029 6.00 60.00 65.75 85.20 85.20 511.20 2.36 2.77 14.16 0.92 5.55 5.52
MI032 0.69 6.86 61.81 93.50 93.50 64.14 2.09 2.24 1.43 0.70 6.28 0.48
MI049 0.94 9.44 59.96 93.21 93.21 87.99 2.02 2.17 1.91 0.63 6.68 0.59
MI062 2.40 24.00 47.08 58.90 58.90 141.36 4.94 8.38 11.86 1.20 10.78 2.88
MI064 2.52 25.20 62.22 81.27 81.27 204.80 2.74 3.37 6.90 0.86 5.35 2.17
MI076 3.17 31.65 47.71 61.30 61.30 194.01 3.62 5.90 11.46 1.93 6.89 6.11
平均 2.62 26.19 57.42 78.90 78.90 200.58 2.96 4.14 7.95 1.04 6.92 2.96
SEM 0.78 7.82 3.26 6.25 6.25 66.17 0.46 1.02 2.21 0.20 0.81 0.98
G6: OBI-3424+ PD-1抗體 (1 mg/kg +20  mg/kg) MI034 0.70 7.00 58.57 91.38 91.38 63.97 2.62 2.87 1.83 0.71 7.78 0.50
MI041 0.75 7.54 48.01 93.44 93.44 70.45 1.96 2.09 1.48 0.33 2.81 0.25
MI046 0.95 9.50 54.32 94.93 94.93 90.18 1.88 1.98 1.79 0.50 7.52 0.48
MI059 0.54 5.36 48.88 94.81 94.81 50.82 2.83 2.99 1.52 0.81 7.96 0.43
MI088 0.28 2.84 44.23 95.18 95.18 27.03 2.02 2.12 0.57 0.56 10.01 0.16
MI095 0.74 7.38 59.08 95.84 95.84 70.73 1.35 1.41 1.00 0.42 2.43 0.31
平均 0.66 6.60 52.18 94.26 94.26 62.20 2.11 2.24 1.36 0.56 6.42 0.35
SEM 0.09 0.93 2.48 0.66 0.66 8.74 0.22 0.24 0.20 0.07 1.26 0.06
G7: OBI-3424+ PD-1抗體 (1 mg/kg +20  mg/kg) (不包含 CD8 +PBMC) MI066 1.40 14.02 51.93 93.45 93.45 131.02 3.06 3.27 4.29 0.81 3.39 1.14
MI067 1.22 12.16 59.05 95.47 95.47 116.09 1.10 1.15 1.34 0.13 1.56 0.16
MI068 2.64 26.40 60.15 95.72 95.72 252.70 1.79 1.87 4.73 0.40 5.38 1.06
MI069 0.47 4.72 38.31 95.30 95.30 44.98 1.41 1.48 0.67 0.28 4.39 0.13
MI078 2.54 25.40 71.65 91.26 91.26 231.80 2.42 2.65 6.15 0.77 5.35 1.96
MI091 1.20 11.96 75.92 93.52 93.52 111.85 1.17 1.25 1.40 0.10 0.61 0.12
平均 1.58 15.78 59.50 94.12 94.12 148.07 1.83 1.95 3.09 0.42 3.45 0.76
SEM 0.35 3.46 5.55 0.70 0.70 32.25 0.32 0.35 0.92 0.13 0.81 0.31
CD45 -圈選% = 圈選的CD45 -細胞 細胞計數(x10 5)= 細胞總數 x 總數% x 10
表13. TILs中CTL細胞百分比之總結
組別 動物 編號 CTL細胞 (CD45 +CD8 +) PD-1 +CTL細胞 (CD45 +CD8 +PD-1 +) CD69 +CTL細胞 (CD45 +CD8 +CD69 +) CD25 +CTL細胞 (CD45 +CD8 +CD25 +) 顆粒酶 B +CTL細胞 (CD45 +CD8 +GrB +) IFN-γ +CTL細胞 (CD45 +CD8 +IFN-γ +)
總數% CD45 +圈選 % 細胞計數 (x10 5) 總數% CTL 圈選 % 細胞計數 (x10 5) 總數% CTL 圈選 % 細胞計數 (x10 5) 總數% CTL 圈選 % 細胞計數 (x10 5) 總數% CTL 圈選 % 細胞 計數 (x10 5) 總數% CTL 圈選 % 細胞 計數 (x10 5)
G1: 載劑 MI031 5.09 33.26 11.86 4.99 97.96 11.63 3.94 60.23 9.18 1.33 20.28 3.10 6.11 91.66 14.24 0.13 1.98 0.30
MI033 12.58 43.90 32.65 11.28 89.64 29.27 7.98 59.50 20.71 0.73 5.43 1.89 12.87 99.84 33.40 0.28 2.17 0.73
MI054 11.35 39.92 29.06 10.31 90.87 26.39 8.02 64.46 20.53 0.66 5.31 1.69 13.11 98.26 33.56 0.30 2.28 0.77
MI058 42.94 75.72 31.35 26.06 60.69 19.02 29.48 78.49 21.52 0.98 2.60 0.72 34.50 88.28 25.19 0.24 0.62 0.18
MI070 6.94 21.57 16.86 6.12 88.19 14.87 2.35 41.51 5.71 0.30 5.30 0.73 6.01 94.83 14.60 0.14 2.27 0.34
MI079 14.27 40.45 63.07 11.14 78.05 49.24 7.84 53.18 34.65 0.51 3.45 2.25 16.20 99.14 71.60 0.06 0.37 0.27
平均 15.53 42.47 30.81 11.65 84.23 25.07 9.94 59.56 18.72 0.75 7.06 1.73 14.80 95.34 32.10 0.19 1.62 0.43
SEM 5.66 7.39 7.31 3.08 5.38 5.55 4.03 5.00 4.20 0.15 2.69 0.37 4.28 1.89 8.64 0.04 0.36 0.10
G2: OBI-3424 (0.3 mg/kg) MI036 8.21 43.92 15.97 7.87 95.86 15.31 5.21 62.46 10.13 0.98 11.79 1.91 5.97 66.16 11.61 0.18 2.04 0.35
MI042 26.79 72.25 54.79 18.38 68.60 37.59 23.86 73.01 48.79 1.90 5.81 3.89 33.78 97.44 69.08 0.23 0.66 0.47
MI048 31.80 73.64 171.72 23.04 72.47 124.42 22.84 61.79 123.34 1.43 3.87 7.72 36.33 95.50 196.18 0.20 0.54 1.08
MI061 45.54 66.97 9.75 22.62 49.67 4.84 35.19 85.14 7.53 1.62 3.93 0.35 30.78 85.88 6.59 0.13 0.36 0.03
MI090 26.88 60.34 66.26 25.86 96.18 63.74 17.92 68.69 44.17 1.27 4.86 3.13 28.03 99.84 69.09 0.31 1.10 0.76
MI093 17.47 46.12 12.67 12.75 73.00 9.24 16.34 67.19 11.85 0.80 3.31 0.58 22.98 99.74 16.66 0.15 0.64 0.11
平均 26.12 60.54 55.19 18.42 75.96 42.52 20.23 69.71 40.97 1.33 5.60 2.93 26.31 90.76 61.54 0.20 0.89 0.47
SEM 5.18 5.27 25.24 2.82 7.24 18.66 4.04 3.52 18.05 0.17 1.29 1.11 4.49 5.35 29.31 0.03 0.25 0.16
G3: OBI-3424 (1 mg/kg) MI038 43.72 66.02 12.68 25.64 58.64 7.44 35.67 80.80 10.34 1.49 3.38 0.43 40.55 90.46 11.76 0.39 0.87 0.11
MI039 31.93 53.39 40.30 20.11 62.98 25.38 25.23 70.50 31.84 1.02 2.85 1.29 31.10 99.18 39.25 0.20 0.63 0.25
MI056 30.92 62.97 21.83 25.04 80.96 17.68 25.96 83.69 18.33 1.26 4.07 0.89 28.95 89.16 20.44 0.28 0.85 0.20
MI060 22.88 38.03 22.61 19.75 86.30 19.51 12.76 59.32 12.61 1.57 7.29 1.55 21.85 96.01 21.59 0.14 0.63 0.1
MI077 43.04 65.33 32.02 31.41 72.97 23.37 32.38 76.33 24.09 2.57 6.05 1.91 42.67 95.94 31.75 0.09 0.20 0.07
MI089 28.52 49.11 23.10 26.74 93.75 21.66 18.14 60.89 14.69 2.34 7.84 1.90 17.29 58.25 14.00 0.18 0.61 0.15
平均 33.50 55.81 25.42 24.78 75.93 19.17 25.02 71.92 18.65 1.71 5.25 1.33 30.40 88.17 23.13 0.21 0.63 0.15
SEM 3.38 4.52 3.89 1.79 5.56 2.60 3.49 4.16 3.29 0.23 0.80 0.24 3.78 5.72 4.31 0.04 0.09 0.03
G4: PD-1抗體 (20 mg/kg) MI030 20.34 62.25 78.41 6.46 31.77 24.90 14.94 75.13 57.59 2.23 11.21 8.60 17.56 98.76 67.69 0.07 0.38 0.27
MI035 8.15 58.12 84.11 5.62 68.92 58.00 9.40 52.94 97.01 1.12 6.33 11.56 16.76 96.54 172.96 0.10 0.55 1.03
MI045 7.63 43.67 20.33 6.86 89.83 18.28 5.25 68.03 13.99 1.00 13.01 2.67 7.08 87.71 18.87 0.08 0.99 0.21
MI047 10.44 35.54 257.87 8.64 82.69 213.41 5.14 24.85 126.96 2.05 9.91 50.64 17.18 93.27 424.35 0.16 0.85 3.95
MI053 37.52 64.31 106.37 8.16 21.75 23.13 31.34 74.74 88.85 1.66 3.96 4.71 42.68 98.96 121.00 0.11 0.25 0.31
MI087 3.74 50.11 29.77 2.90 77.62 23.08 6.08 54.03 48.40 0.93 8.28 7.40 7.23 64.06 57.55 0.18 1.60 1.43
平均 14.64 52.33 96.14 6.44 62.10 60.13 12.03 58.29 72.13 1.50 8.78 14.26 18.08 89.88 143.74 0.12 0.77 1.20
SEM 5.11 4.61 35.06 0.84 11.59 31.22 4.15 7.78 16.39 0.23 1.35 7.38 5.31 5.44 60.25 0.02 0.20 0.59
G5: OBI-3424+ PD-1抗體 (0.3 mg/kg +20 mg/kg) MI029 16.57 34.68 99.42 10.62 64.12 63.72 8.26 50.84 49.56 0.88 5.42 5.28 13.91 96.69 83.46 0.05 0.36 0.30
MI032 39.77 63.46 27.28 15.81 39.76 10.85 29.46 73.79 20.21 1.32 3.32 0.91 32.47 99.23 22.27 0.06 0.18 0.04
MI049 41.68 62.07 39.35 12.52 30.05 11.82 29.44 75.60 27.79 3.58 9.20 3.38 33.30 89.55 31.44 0.08 0.23 0.08
MI062 18.13 50.51 43.51 7.14 39.41 17.14 11.02 69.86 26.45 1.98 12.55 4.75 16.71 99.78 40.10 0.10 0.60 0.24
MI064 16.60 36.40 41.83 7.24 43.61 18.24 9.53 55.76 24.02 1.48 8.68 3.73 15.12 99.92 38.10 0.05 0.32 0.13
MI076 10.51 51.48 33.26 7.30 69.47 23.10 7.28 60.72 23.04 0.98 8.20 3.10 9.90 90.63 31.33 0.08 0.73 0.25
平均 23.88 49.77 47.44 10.11 47.74 24.14 15.83 64.43 28.51 1.70 7.90 3.52 20.24 95.97 41.12 0.07 0.40 0.17
SEM 5.44 5.00 10.68 1.46 6.33 8.12 4.34 4.15 4.35 0.41 1.31 0.62 4.11 1.92 8.85 0.01 0.09 0.04
G6: OBI-3424+ PD-1抗體 (1 mg/kg +20  mg/kg) MI034 38.17 61.22 26.72 13.21 34.60 9.25 24.82 71.33 17.37 1.94 5.56 1.36 33.88 96.68 23.72 0.13 0.38 0.09
MI041 36.57 60.58 27.57 13.06 35.70 9.85 28.01 76.61 21.12 2.87 7.85 2.16 27.28 91.46 20.57 0.15 0.51 0.11
MI046 47.52 71.66 45.14 5.80 12.20 5.51 38.01 79.06 36.11 2.05 4.26 1.95 48.90 99.20 46.46 0.11 0.23 0.10
MI059 44.53 65.11 23.87 21.69 48.72 11.63 31.83 72.07 17.06 2.77 6.28 1.48 35.22 82.90 18.88 0.11 0.25 0.06
MI088 32.19 44.50 9.14 14.83 46.07 4.21 21.54 74.67 6.12 2.88 10.00 0.82 15.89 52.69 4.51 0.09 0.29 0.03
MI095 31.76 53.09 23.44 16.37 51.54 12.08 14.80 46.63 10.92 1.98 6.25 1.46 29.71 94.29 21.93 0.08 0.27 0.06
平均 38.46 59.36 25.98 14.16 38.14 8.75 26.50 70.06 18.12 2.42 6.70 1.54 31.81 86.20 22.68 0.11 0.32 0.08
SEM 2.63 3.87 4.71 2.11 5.90 1.32 3.30 4.83 4.20 0.19 0.81 0.19 4.42 7.08 5.53 0.01 0.04 0.01
G7: OBI-3424+ PD-1抗體 (1 mg/kg +20  mg/kg) (不包含 CD8 +PBMC) MI066 7.49 16.15 10.50 6.13 81.85 8.59 2.88 42.02 4.04 0.89 13.00 1.25 4.77 75.68 6.69 0.10 1.59 0.14
MI067 11.27 17.67 13.70 6.64 58.94 8.07 7.44 64.95 9.05 0.84 7.30 1.02 10.92 98.66 13.28 0.17 1.52 0.21
MI068 3.79 5.74 10.01 3.22 85.02 8.50 1.32 44.96 3.48 0.38 12.94 1.00 1.68 71.87 4.44 0.12 5.32 0.32
MI069 13.88 20.93 6.55 11.49 82.82 5.42 4.65 36.73 2.19 0.74 5.88 0.35 2.17 17.23 1.02 0.12 0.92 0.06
MI078 3.20 5.84 8.13 2.49 77.88 6.32 0.87 34.72 2.21 0.45 17.92 1.14 1.59 91.47 4.04 0.15 8.76 0.38
MI091 7.51 14.95 8.98 4.62 61.50 5.53 3.56 51.33 4.26 0.50 7.16 0.60 5.97 98.87 7.14 0.06 0.99 0.07
平均 7.86 13.55 9.65 5.77 74.67 7.07 3.45 45.79 4.21 0.63 10.70 0.89 4.52 75.63 6.10 0.12 3.18 0.20
SEM 1.70 2.59 0.99 1.32 4.68 0.61 0.98 4.54 1.03 0.09 1.91 0.14 1.48 12.58 1.69 0.02 1.30 0.05
CD45 -圈選% = 圈選的CD45 -細胞 CTL圈選% = 圈選的CD45 +CD8 +細胞 細胞計數(x10 5)= 細胞總數 x 總數% x 10
表14. TILs中TH細胞的百分比之總結
組別 動物 編號 TH細胞 (CD45 +CD4 +) PD-1 +TH細胞 (CD45 +CD4 +PD-1 +) CD69 +TH細胞 (CD45 +CD4 +CD69 +) CD25 +TH細胞 (CD45 +CD4 +CD25 +) Foxp3 +Treg細胞 (CD45 +CD4 +CD25 +Foxp3 +)
總數% CD45 +圈選 % 細胞計數 (x10 5) 總數% TH  圈選 % 細胞 計數 (x10 5) 總數% TH 圈選 % 細胞 計數 (x10 5) 總數% TH  圈選 % 細胞 計數 (x10 5) 總數% TH  圈選 % 細胞 計數 (x10 5)
G1: 載劑 MI031 9.47 61.88 22.07 9.32 98.44 21.72 8.27 59.31 19.27 3.46 24.81 8.06 0.05 1.50 0.12
MI033 11.45 39.95 29.71 11.40 99.51 29.58 6.84 46.34 17.75 1.41 9.53 3.66 0.10 7.10 0.26
MI054 15.68 55.17 40.14 15.58 99.34 39.88 9.07 48.48 23.22 1.88 10.07 4.81 0.13 6.79 0.3
MI058 13.00 22.91 9.49 12.26 94.31 8.95 7.88 64.02 5.75 1.42 11.50 1.04 0.08 5.37 0.06
MI070 23.53 73.10 57.18 23.16 98.45 56.28 11.02 54.44 26.78 1.32 6.54 3.21 0.07 5.14 0.17
MI079 14.43 40.91 63.78 14.23 98.61 62.90 5.57 35.29 24.62 1.22 7.71 5.39 0.04 3.62 0.18
平均 14.59 48.99 37.06 14.33 98.11 36.55 8.11 51.31 19.56 1.79 11.69 4.36 0.08 4.92 0.19
SEM 2.00 7.33 8.50 1.98 0.78 8.42 0.76 4.18 3.08 0.35 2.72 0.96 0.01 0.85 0.04
G2: OBI-3424 (0.3 mg/kg) MI036 11.03 59.01 21.45 10.86 98.48 21.12 7.64 63.07 14.86 2.23 18.38 4.34 0.11 5.03 0.21
MI042 9.70 26.17 19.84 7.88 81.16 16.11 6.79 71.55 13.89 1.66 17.49 3.39 0.13 7.95 0.27
MI048 7.52 17.42 40.61 7.14 94.89 38.56 5.20 57.32 28.08 1.65 18.21 8.91 0.08 5.08 0.43
MI061 22.11 32.52 4.73 20.09 90.86 4.30 15.65 75.09 3.35 2.12 10.15 0.45 0.13 6.05 0.03
MI090 13.12 29.44 32.34 13.06 99.60 32.19 6.87 49.45 16.93 4.23 30.45 10.43 0.16 3.69 0.39
MI093 13.82 36.50 10.02 13.65 98.76 9.90 8.60 44.32 6.24 2.84 14.61 2.06 0.11 3.81 0.08
平均 12.88 33.51 21.50 12.11 93.96 20.36 8.46 60.13 13.89 2.46 18.22 4.93 0.12 5.27 0.24
SEM 2.07 5.74 5.47 1.92 2.88 5.35 1.51 4.95 3.56 0.40 2.76 1.60 0.01 0.65 0.07
G3: OBI-3424 (1 mg/kg) MI038 25.00 37.76 7.25 24.22 96.86 7.02 16.35 61.50 4.74 1.46 5.51 0.42 0.07 4.64 0.02
MI039 24.72 41.33 31.20 23.33 94.38 29.44 15.22 60.62 19.21 2.88 11.47 3.63 0.06 2.22 0.08
MI056 17.44 35.50 12.31 16.66 95.57 11.76 13.01 67.91 9.19 2.69 14.05 1.90 0.10 3.57 0.07
MI060 24.40 40.55 24.11 24.05 98.57 23.76 11.04 45.46 10.91 5.06 20.81 5.00 0.12 2.45 0.12
MI077 25.26 38.34 18.79 24.52 97.07 18.24 16.92 68.87 12.59 4.55 18.53 3.39 0.06 1.41 0.04
MI089 33.47 57.62 27.11 33.34 99.62 27.01 20.76 63.43 16.82 3.26 9.97 2.64 0.13 3.92 0.11
平均 25.05 41.85 20.13 24.35 97.01 19.54 15.55 61.30 12.24 3.32 13.39 2.83 0.09 3.04 0.07
SEM 2.08 3.27 3.72 2.17 0.78 3.61 1.37 3.45 2.14 0.50 2.13 0.64 0.01 0.46 0.01
G4: PD-1抗體 (20 mg/kg) MI030 12.78 39.13 49.27 9.19 71.87 35.43 8.75 63.85 33.73 3.08 22.44 11.87 0.10 3.38 0.39
MI035 6.23 44.45 64.29 5.61 90.05 57.90 5.80 44.44 59.86 1.30 9.95 13.42 0.07 5.23 0.72
MI045 11.05 63.24 29.45 9.68 87.55 25.80 6.80 60.36 18.12 2.74 24.33 7.30 0.04 1.31 0.11
MI047 19.16 65.22 473.25 18.33 95.66 452.75 5.43 20.34 134.12 4.77 17.86 117.82 0.16 3.27 3.95
MI053 17.34 29.71 49.16 14.42 83.20 40.88 10.05 56.98 28.49 2.21 12.52 6.27 0.08 3.80 0.23
MI087 4.73 63.41 37.65 4.03 85.19 32.08 9.41 60.75 74.90 1.81 11.70 14.41 0.23 12.58 1.83
平均 11.88 50.86 117.18 10.21 85.59 107.47 7.71 51.12 58.20 2.65 16.47 28.51 0.11 4.93 1.20
SEM 2.36 6.17 71.38 2.19 3.26 69.20 0.80 6.75 17.45 0.50 2.45 17.91 0.03 1.61 0.61
G5: OBI-3424+ PD-1抗體 (0.3 mg/kg +20 mg/kg) MI029 26.12 54.68 156.72 23.73 90.86 142.38 9.50 37.70 57.00 1.93 7.67 11.58 0.06 3.31 0.36
MI032 24.04 38.35 16.49 19.71 81.99 13.52 15.02 65.21 10.30 2.29 9.94 1.57 0.08 3.32 0.05
MI049 24.72 36.82 23.34 19.89 80.46 18.78 15.43 67.23 14.57 4.06 17.69 3.83 0.11 2.76 0.10
MI062 16.62 46.31 39.89 11.64 70.04 27.94 7.18 59.46 17.23 3.31 27.44 7.94 0.08 2.29 0.19
MI064 21.51 47.16 54.21 19.37 90.05 48.81 8.30 39.40 20.92 2.68 12.74 6.75 0.04 1.34 0.10
MI076 12.90 63.18 40.83 9.65 74.81 30.54 12.65 73.71 40.04 3.52 20.51 11.14 0.10 2.84 0.32
平均 20.99 47.75 55.24 17.33 81.37 46.99 11.35 57.12 26.68 2.97 16.00 7.14 0.08 2.64 0.19
SEM 2.12 4.07 21.03 2.23 3.36 19.71 1.44 6.16 7.38 0.33 3.00 1.62 0.01 0.30 0.05
G6: OBI-3424+ PD-1抗體 (1 mg/kg +20  mg/kg) MI034 32.23 51.69 22.56 24.70 76.63 17.29 17.76 60.04 12.43 3.09 10.44 2.16 0.07 2.20 0.05
MI041 25.80 42.74 19.45 20.10 77.89 15.16 15.91 61.65 12.00 3.39 13.13 2.56 0.12 3.54 0.09
MI046 23.78 35.87 22.59 14.56 61.24 13.83 15.23 67.57 14.47 2.81 12.46 2.67 0.08 2.99 0.08
MI059 31.85 46.58 17.07 26.28 82.51 14.09 20.82 68.88 11.16 4.28 14.15 2.29 0.09 2.06 0.05
MI088 37.77 52.21 10.73 28.20 74.67 8.01 23.50 69.63 6.67 6.21 18.40 1.76 0.15 2.38 0.04
MI095 32.31 54.02 23.84 26.32 81.47 19.42 11.71 37.95 8.64 3.13 10.14 2.31 0.10 3.32 0.07
平均 30.62 47.19 19.37 23.36 75.74 14.63 17.49 60.95 10.90 3.82 13.12 2.29 0.10 2.75 0.06
SEM 2.07 2.83 2.00 2.09 3.14 1.58 1.72 4.87 1.14 0.52 1.23 0.13 0.01 0.25 0.01
G7: OBI-3424+ PD-1抗體 (1 mg/kg +20  mg/kg) (不包含 CD8 +PBMC) MI066 32.30 69.63 45.28 27.95 86.55 39.19 16.28 49.59 22.82 4.90 14.94 6.87 0.08 1.63 0.11
MI067 50.70 79.45 61.65 39.02 76.97 47.45 32.52 61.40 39.54 3.32 6.26 4.04 0.12 3.62 0.1
MI068 56.19 85.06 148.34 45.95 81.78 121.31 19.64 40.53 51.85 3.83 7.91 10.11 0.14 3.55 0.37
MI069 57.47 86.67 27.13 45.08 78.43 21.28 23.64 43.70 11.16 2.62 4.84 1.24 0.11 4.13 0.05
MI078 38.81 70.85 98.58 25.46 65.62 64.67 10.75 26.95 27.31 4.36 10.94 11.07 0.11 2.47 0.28
MI091 34.79 69.23 41.61 25.26 72.62 30.21 21.56 52.60 25.79 2.99 7.29 3.58 0.07 2.41 0.08
平均 45.04 76.82 70.43 34.79 77.00 54.02 20.73 45.80 29.74 3.67 8.70 6.15 0.11 2.97 0.17
SEM 4.54 3.25 18.51 3.97 2.97 14.77 2.99 4.80 5.77 0.35 1.50 1.59 0.01 0.39 0.05
CD45 -圈選% = 圈選的CD45 -細胞 TH圈選百分比 = 圈選的CD45 +CD4 +細胞 細胞計數(x10 5)= 細胞總數 x 總數% x 10
表15. TILs中NK細胞百分比之總結
組別 動物編號 細胞濃度 細胞總數 存活率 NK細胞 (CD45 +CD56 +) PD-1 +NK細胞 (CD45 +CD56 +PD-1 +)
× (10 6/mL) × 10 6 % 總數% CD45 +圈選 % 細胞 計數 (x10 5) 總數% NK 圈選 % 細胞 計數 (x10 5)
G1: 載劑 MI031 2.33 23.30 52.58 0.57 3.74 1.33 0.50 88.11 1.17
MI033 2.60 25.95 62.24 3.32 11.57 8.62 1.64 49.46 4.26
MI054 2.56 25.60 64.65 1.92 6.74 4.92 1.04 54.49 2.66
MI058 0.73 7.30 67.53 4.38 7.72 3.20 1.57 35.80 1.15
MI070 2.43 24.30 74.90 1.33 4.13 3.23 0.77 57.83 1.87
MI079 4.42 44.20 72.29 2.66 7.53 11.76 1.08 40.51 4.77
平均 2.51 25.11 65.70 2.36 6.91 5.51 1.10 54.37 2.65
SEM 0.48 4.78 3.25 0.56 1.16 1.60 0.18 7.55 0.64
G2: OBI-3424 (0.3 mg/kg) MI036 1.95 19.45 64.78 1.18 6.33 2.30 0.85 71.96 1.65
MI042 2.05 20.45 62.35 3.26 8.78 6.67 1.08 33.17 2.21
MI048 5.40 54.00 80.46 3.83 8.87 20.68 2.01 52.46 10.85
MI061 0.21 2.14 72.34 6.83 10.05 1.46 1.44 21.08 0.31
MI090 2.47 24.65 80.93 1.00 2.25 2.47 0.88 87.65 2.17
MI093 0.73 7.25 71.03 2.54 6.70 1.84 1.14 44.79 0.83
平均 2.14 21.32 71.98 3.11 7.16 5.90 1.23 51.85 3.00
SEM 0.74 7.41 3.15 0.87 1.14 3.06 0.18 10.05 1.60
G3: OBI-3424 (1 mg/kg) MI038 0.29 2.90 68.97 2.64 3.99 0.77 0.91 34.34 0.26
MI039 1.26 12.62 80.03 3.38 5.65 4.27 1.30 38.34 1.64
MI056 0.71 7.06 65.44 2.95 6.00 2.08 1.44 48.85 1.02
MI060 0.99 9.88 73.48 2.44 4.05 2.41 1.79 73.40 1.77
MI077 0.74 7.44 64.52 2.63 3.99 1.96 1.40 53.12 1.04
MI089 0.81 8.10 84.69 2.46 4.24 1.99 2.18 88.62 1.77
平均 0.80 8.00 72.86 2.75 4.65 2.25 1.50 56.11 1.25
SEM 0.13 1.32 3.32 0.14 0.35 0.46 0.16 7.94 0.24
G4: PD-1抗體 (20 mg/kg) MI030 3.86 38.55 66.41 5.98 18.31 23.05 0.53 8.83 2.04
MI035 10.32 103.20 64.44 0.66 4.68 6.81 0.40 60.98 4.13
MI045 2.67 26.65 63.41 0.82 4.67 2.19 0.26 32.35 0.69
MI047 24.70 247.00 73.48 1.41 4.81 34.83 0.97 68.84 23.96
MI053 2.84 28.35 72.84 3.60 6.18 10.21 0.70 19.53 1.98
MI087 7.96 79.60 44.22 0.57 7.62 4.54 0.20 34.51 1.59
平均 8.73 87.23 64.13 2.17 7.71 13.60 0.51 37.51 5.73
SEM 3.43 34.33 4.34 0.89 2.17 5.20 0.12 9.51 3.67
G5: OBI-3424+ PD-1抗體 (0.3 mg/kg +20 mg/kg) MI029 6.00 60.00 65.75 1.63 3.42 9.78 0.97 59.56 5.82
MI032 0.69 6.86 61.81 3.28 5.23 2.25 0.71 21.59 0.49
MI049 0.94 9.44 59.96 6.65 9.90 6.28 0.73 10.95 0.69
MI062 2.40 24.00 47.08 6.30 17.57 15.12 0.75 11.93 1.80
MI064 2.52 25.20 62.22 2.82 6.19 7.11 0.81 28.75 2.04
MI076 3.17 31.65 47.71 1.05 5.15 3.32 0.39 36.88 1.23
平均 2.62 26.19 57.42 3.62 7.91 7.31 0.73 28.28 2.01
SEM 0.78 7.82 3.26 0.96 2.12 1.91 0.08 7.45 0.80
G6: OBI-3424+ PD-1抗體 (1 mg/kg +20  mg/kg) MI034 0.70 7.00 58.57 5.74 9.20 4.02 0.63 10.95 0.44
MI041 0.75 7.54 48.01 2.06 3.41 1.55 0.48 23.54 0.36
MI046 0.95 9.50 54.32 4.30 6.49 4.09 0.30 7.06 0.29
MI059 0.54 5.36 48.88 3.70 5.40 1.98 1.11 30.09 0.59
MI088 0.28 2.84 44.23 3.52 4.86 1.00 0.86 24.57 0.24
MI095 0.74 7.38 59.08 2.35 3.93 1.73 0.43 18.37 0.32
平均 0.66 6.60 52.18 3.61 5.55 2.40 0.64 19.10 0.37
SEM 0.09 0.93 2.48 0.55 0.85 0.54 0.12 3.57 0.05
G7: OBI-3424+ PD-1抗體 (1 mg/kg +20  mg/kg) (不包含 CD8 +PBMC) MI066 1.40 14.02 51.93 3.44 7.42 4.82 0.60 17.56 0.84
MI067 1.22 12.16 59.05 5.44 8.53 6.62 0.75 13.74 0.91
MI068 2.64 26.40 60.15 3.62 5.47 9.56 0.96 26.66 2.53
MI069 0.47 4.72 38.31 10.72 16.16 5.06 2.25 20.98 1.06
MI078 2.54 25.40 71.65 4.04 7.38 10.26 0.60 14.74 1.52
MI091 1.20 11.96 75.92 8.08 16.08 9.66 0.76 9.41 0.91
平均 1.58 15.78 59.50 5.89 10.17 7.66 0.99 17.18 1.30
SEM 0.35 3.46 5.55 1.20 1.92 1.00 0.26 2.47 0.27
CD45 +圈選% = 圈選的CD45 +細胞 NK圈選% = 圈選的CD45 +CD56 +細胞 細胞計數(x10 5)= 細胞總數 x 總數% x 10
表16. TILs中樹突狀細胞百分比之總結
組別 動物 編號 細胞 濃度 細胞 總數 存活率 DC細胞 (CD45 +CD11c +) CD86 +DC細胞 (CD45 +CD11c +CD86 +) CD91 +DC細胞 (CD45 +CD11c +CD91 +)
× (10 6/mL) × 10 6 % 總數% CD45 +圈選 % 細胞 計數 (x10 5) 總數% CTL 圈選 % 細胞 計數 (x10 5) 總數% CTL 圈選 % 細胞 計數 (x10 5)
G1: 載劑 MI031 2.33 23.30 52.58 5.45 26.37 12.70 2.98 54.77 6.94 0.07 1.32 0.16
MI033 2.60 25.95 62.24 13.15 41.24 34.12 6.38 48.51 16.56 0.10 0.79 0.26
MI054 2.56 25.60 64.65 10.61 34.69 27.16 3.87 36.50 9.91 0.14 1.28 0.36
MI058 0.73 7.30 67.53 11.86 20.97 8.66 5.36 45.23 3.91 0.08 0.67 0.06
MI070 2.43 24.30 74.90 4.68 15.74 11.37 2.54 54.19 6.17 0.08 1.62 0.19
MI079 4.42 44.20 72.29 10.37 30.75 45.84 5.20 50.10 22.98 0.04 0.39 0.18
平均 2.51 25.11 65.70 9.35 28.29 23.31 4.39 48.22 11.08 0.09 1.01 0.20
SEM 0.48 4.78 3.25 1.42 3.78 6.08 0.61 2.76 2.98 0.01 0.19 0.04
G2: OBI-3424 (0.3 mg/kg) MI036 1.95 19.45 64.78 5.46 32.90 10.62 3.27 59.93 6.36 0.09 1.61 0.18
MI042 2.05 20.45 62.35 11.42 30.81 23.35 7.01 61.40 14.34 0.08 0.70 0.16
MI048 5.40 54.00 80.46 19.59 44.83 105.79 5.11 26.07 27.59 0.10 0.51 0.54
MI061 0.21 2.14 72.34 12.80 19.60 2.74 5.82 45.47 1.25 0.08 0.63 0.02
MI090 2.47 24.65 80.93 10.32 24.30 25.44 6.34 61.42 15.63 0.09 0.85 0.22
MI093 0.73 7.25 71.03 12.66 36.70 9.18 6.50 51.39 4.71 0.06 0.44 0.04
平均 2.14 21.32 71.98 12.04 31.52 29.52 5.68 50.95 11.65 0.08 0.79 0.19
SEM 0.74 7.41 3.15 1.87 3.65 15.66 0.55 5.62 3.92 0.01 0.17 0.08
G3: OBI-3424 (1 mg/kg) MI038 0.29 2.90 68.97 15.16 23.54 4.40 7.68 50.65 2.23 0.14 0.90 0.04
MI039 1.26 12.62 80.03 18.68 31.09 23.57 8.39 44.92 10.59 0.08 0.41 0.10
MI056 0.71 7.06 65.44 19.60 41.01 13.84 7.73 39.45 5.46 0.09 0.45 0.06
MI060 0.99 9.88 73.48 12.37 19.89 12.22 6.81 55.03 6.73 0.08 0.68 0.08
MI077 0.74 7.44 64.52 22.41 35.18 16.67 9.38 41.86 6.98 0.06 0.29 0.04
MI089 0.81 8.10 84.69 17.47 28.58 14.15 8.78 50.27 7.11 0.07 0.41 0.06
平均 0.80 8.00 72.86 17.62 29.88 14.14 8.13 47.03 6.52 0.09 0.52 0.06
SEM 0.13 1.32 3.32 1.33 2.90 2.54 0.34 2.24 1.11 0.01 0.08 0.01
G4: PD-1抗體 (20 mg/kg) MI030 3.86 38.55 66.41 9.61 32.74 37.05 3.50 36.43 13.49 0.04 0.37 0.15
MI035 10.32 103.20 64.44 3.99 34.88 41.18 1.25 31.29 12.90 0.04 1.00 0.41
MI045 2.67 26.65 63.41 4.92 38.28 13.11 1.99 40.37 5.30 0.02 0.49 0.05
MI047 24.70 247.00 73.48 5.24 25.68 129.43 2.40 45.76 59.28 0.13 2.52 3.21
MI053 2.84 28.35 72.84 9.27 16.68 26.28 3.84 41.48 10.89 0.04 0.39 0.11
MI087 7.96 79.60 44.22 0.78 13.45 6.21 0.44 56.41 3.50 0.04 5.64 0.32
平均 8.73 87.23 64.13 5.64 26.95 42.21 2.24 41.96 17.56 0.05 1.74 0.71
SEM 3.43 34.33 4.34 1.37 4.14 18.29 0.53 3.51 8.51 0.02 0.85 0.50
G5: OBI-3424+ PD-1抗體 (0.3 mg/kg +20 mg/kg) MI029 6.00 60.00 65.75 10.77 23.07 64.62 6.36 59.06 38.16 0.04 0.33 0.24
MI032 0.69 6.86 61.81 10.83 16.62 7.43 6.15 56.79 4.22 0.04 0.41 0.03
MI049 0.94 9.44 59.96 11.79 18.07 11.13 5.30 44.96 5.00 0.03 0.24 0.03
MI062 2.40 24.00 47.08 9.62 30.34 23.09 4.71 48.94 11.30 0.11 1.16 0.26
MI064 2.52 25.20 62.22 15.61 32.00 39.34 7.50 48.07 18.90 0.08 0.54 0.20
MI076 3.17 31.65 47.71 5.96 34.00 18.86 3.20 53.62 10.13 0.08 1.34 0.25
平均 2.62 26.19 57.42 10.76 25.68 27.41 5.54 51.91 14.62 0.06 0.67 0.17
SEM 0.78 7.82 3.26 1.28 3.04 8.72 0.61 2.23 5.18 0.01 0.19 0.05
G6: OBI-3424+ PD-1抗體 (1 mg/kg +20  mg/kg) MI034 0.70 7.00 58.57 10.74 18.16 7.52 5.54 51.56 3.88 0.10 0.97 0.07
MI041 0.75 7.54 48.01 8.66 15.07 6.53 4.54 52.35 3.42 0.11 1.29 0.08
MI046 0.95 9.50 54.32 16.79 26.86 15.95 7.56 45.00 7.18 0.08 0.45 0.08
MI059 0.54 5.36 48.88 13.35 19.71 7.16 5.70 42.69 3.06 0.07 0.54 0.04
MI088 0.28 2.84 44.23 15.24 21.31 4.33 8.17 53.62 2.32 0.04 0.29 0.01
MI095 0.74 7.38 59.08 9.55 16.02 7.05 5.83 61.08 4.30 0.03 0.34 0.02
平均 0.66 6.60 52.18 12.39 19.52 8.09 6.22 51.05 4.03 0.07 0.65 0.05
SEM 0.09 0.93 2.48 1.33 1.74 1.64 0.56 2.68 0.69 0.01 0.16 0.01
G7: OBI-3424+ PD-1抗體 (1 mg/kg +20  mg/kg) (不包含 CD8 +PBMC) MI066 1.40 14.02 51.93 12.46 26.87 17.47 7.73 62.04 10.84 0.09 0.74 0.13
MI067 1.22 12.16 59.05 15.61 24.15 18.98 10.54 67.54 12.82 0.08 0.49 0.10
MI068 2.64 26.40 60.15 10.93 16.58 28.86 8.14 74.42 21.49 0.10 0.91 0.26
MI069 0.47 4.72 38.31 13.43 19.06 6.34 10.18 75.82 4.80 0.09 0.66 0.04
MI078 2.54 25.40 71.65 10.68 19.89 27.13 6.91 64.72 17.55 0.10 0.97 0.25
MI091 1.20 11.96 75.92 18.70 36.18 22.37 13.58 72.58 16.24 0.08 0.43 0.10
平均 1.58 15.78 59.50 13.64 23.79 20.19 9.51 69.52 13.96 0.09 0.70 0.15
SEM 0.35 3.46 5.55 1.25 2.90 3.31 1.00 2.28 2.38 0.00 0.09 0.04
CD45 +圈選% = 圈選的CD45 +細胞 DC圈選% = 圈選的CD45 +CD11c +細胞 細胞計數(x10 5)= 細胞總數 x 總數% x 10
結果顯示,施用OBI-3424可顯著更大程度地抑制腫瘤生長,並顯示出具有抗腫瘤活性的劑量依賴性趨勢。此外,高劑量OBI-3424結合抗hPD-1抗體治療在HepG2人源化小鼠模型中顯示出對腫瘤生長最有效的抗腫瘤作用。但是,CD8 +細胞的耗竭導致組合治療的抗腫瘤功效大幅降低。
本發明實施例的以上描述並不限制本發明。所屬領域中具有通常知識者可根據本發明做出各種修改及改變,且在本發明之精神內的任何修改及改變都應包括在本發明所附申請專利範圍的範圍內。
本文引用之所有參考文獻均在法律允許的範圍內透過引用併入本文。這些參考文獻的討論目的僅在於總結其作者提出之主張。不承認任何參考文獻(或任何參考文獻的一部分)為相關的現有技術。申請人保留質疑任何引用文獻的準確性及相關性之權利。 參考文獻1.       Lin HK, Jez JM, Schlegel BP, Peehl DM, Pachter JA, Penning TM. Expression and characterization of recombinant type 2 3 alpha-hydroxysteroid dehydrogenase (HSD) from human prostate: demonstration of bifunctional 3 alpha/17 beta-HSD activity and cellular distribution. Mol Endocrinol 1997;11:1971-84 2.       Dufort I, Rheault P, Huang XF, Soucy P, Luu-The V. Characteristics of a highly labile human type 5 17beta-hydroxysteroid dehydrogenase. Endocrinology 1999;140:568-74 3.       Penning TM, Drury JE. Human aldo-keto reductases: Function, gene regulation, and single nucleotide polymorphisms. Arch Biochem Biophys 2007;464:241-50 4.       Rizner TL, Penning TM. Role of aldo-keto reductase family 1 (AKR1) enzymes in human steroid metabolism. Steroids 2014;79:49-63 5.       Chang TS, Lin HK, Rogers KA, Brame LS, Yeh MM, Yang Q, et al. 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1. 實施例1各組的平均體重。每週兩次記錄載劑組、單一治療組,以及組合治療組的體重,直到第35天為止。在攜帶人類肝細胞癌HepG2腫瘤的人源化小鼠的所有治療組中均未見體重減輕。數據顯示為平均值 ± SEM(每組N = 5)。透過司徒頓t檢定(Student's t test)進行統計分析。
2. 實施例1的每組中的平均腫瘤重量。在接種腫瘤細胞後第36天犧牲小鼠,並記錄載劑組、單一治療組,以及組合治療組中小鼠的腫瘤重量。相較於載劑組(G1),OBI-3424(G2)以及OBI-3424 + 抗-hPD-1/抗-hPD-L1(G5/G6)組合治療組的腫瘤重量得到顯著抑制(p < 0.001)。此外,相較於抗-hPD-1/抗-hPD-L1(G3/G4)治療組,OBI-3424 + 抗-hPD-1/抗-hPD-L1(G5/G6)組合治療組的腫瘤重量得到顯著抑制(p < 0.05)。數據顯示為平均值 ± SEM(每組N = 5)。透過司徒頓t檢定進行統計分析。P值 < 0.05被認為是顯著的。單星表示0.05 < P < 0.001,雙星表示P < 0.001。
3. 實施例1的各組中的平均腫瘤體積。每週兩次記錄載劑組、單一治療組,以及組合治療組的小鼠腫瘤體積,直到第35天為止。相較於載劑組(G1),OBI-3424(G2)以及OBI-3424 + 抗-hPD-1/抗-hPD-L1(G5/G6)組合治療組的腫瘤體積得到顯著抑制。數據顯示為平均值 ± SEM(每組N = 5)。透過司徒頓t檢定進行統計分析。
4. 實施例2的每組中的平均體重。每週兩次記錄載劑組、OBI-3424低劑量及高劑量治療組,以及OBI-3424加PD-1抗體組合治療組的體重,直到第30天為止。在攜帶人類肝細胞癌HepG2腫瘤的人源化小鼠的載劑組、OBI-3424單劑量組或OBI-3424加PD-1抗體組合治療組均未見體重減輕。數據顯示為平均值 ± SEM(每組N = 5)。透過司徒頓t檢定進行統計分析。
5. 的各組中的平均腫瘤重量。施用試驗品項後第30天犧牲小鼠,且相較於載劑組(G1),OBI-3424低劑量組(G2)、高劑量治療組(G3)以及OBI-3424加PD-1抗體組合治療組(G5~G7)中小鼠的腫瘤重量得到顯著抑制(p < 0.05)。此外,相較於高劑量OBI-3424單一治療組(G3),高劑量OBI-3424加上PD-1抗體組合治療組(G6)的腫瘤重量顯著降低(p <0.05)。數據顯示為平均值± SEM。透過司徒頓t檢定進行統計分析。P值<0.05被認為是顯著的。單星表示0.05 < P <0.001,雙星表示P < 0.001。
6. 實施例2的各組中的平均腫瘤體積。每週兩次記錄載劑組、OBI-3424低劑量及高劑量治療組,以及OBI-3424加PD-1抗體組合治療組的小鼠腫瘤體積,直到第30天為止。相較於載劑組(G1),OBI-3424高劑量治療組(G3)以及OBI-3424加抗hPD-1抗體(G5~G7)組合治療組的腫瘤體積被顯著抑制。數據顯示為平均值 ± SEM(每組N = 5)。透過司徒頓t檢定進行統計分析。
無。

Claims (20)

  1. 一種醫藥組合物,包含: (1)由式I表示之化合物1-(3-(3-N,N-二甲基胺基羰基)苯氧基-4-間苯基)-1-乙基-N,N'-雙(乙烯)胺基磷酸酯,
    Figure 03_image007
    式I 或其醫藥上可接受的鹽類、同位素變體或溶劑化物;以及 (2)至少一治療劑,包括化學治療劑或生物試劑。
  2. 如請求項1所述之醫藥組合物,其中該化合物為由式I-1表示之(S)-1-(3-(3-N,N-二甲基胺基羰基)苯氧基-4-間苯基)-1-乙基-N,N'-雙(乙烯)胺基磷酸酯,或
    Figure 03_image008
    式I-1 由式I-2表示之(R)-1-(3-(3-N,N-二甲基胺基羰基)苯氧基-4-間苯基)-1-乙基-N,N'-雙(乙烯)胺基磷酸酯
    Figure 03_image010
    式I-2。
  3. 如請求項1所述之醫藥組合物,其中該化學治療劑選自單甲基澳瑞他汀E(Monomethyl auristatin E,MMAE)、單甲基澳瑞他汀F(MMAF)、美登木素生物鹼(mertansine,DM1)、蒽環素(anthracycline)、吡咯並苯並二氮雜(pyrrolobenzodiazepine)、α-蠅蕈素(α-amanitin)、微管溶素(tubulysin)、苯二氮平(benzodiazepine)、厄洛替尼(erlotinib)、硼替佐米(bortezomib)、氟維司群(fulvestrant)、舒尼替尼(sunitinib)、來曲唑(letrozole)、甲磺酸伊馬替尼(imatinib mesylate)、PTK787/ZK 222584、奧沙利鉑(oxaliplatin)、菊白葉酸(leucovorin)、雷帕黴素(rapamycin)、拉帕替尼(lapatinib)、洛那法尼(lonafarnib)、索拉非尼(sorafenib)、吉非替尼(gefitinib)、AG1478、AG1571、烷基化試劑(alkylating agent)、烷基磺酸鹽(alkyl sulfonate)、氮丙啶類(aziridines)、伸乙亞胺(ethylenimine)、甲基三聚氰胺(methylamelamine)、內酯(acetogenins)、喜樹鹼(camptothecin)、苔蘚蟲素(bryostatin)、卡利斯他汀(callystatin)、CC-1065、念珠藻素(cryptophycins)、尾海兔素(dolastatin)、杜卡黴素(duocarmycin)、艾榴塞洛素(eleutherobin)、胰抑素(pancratistatin)、珊瑚素(sarcodictyin)、海綿素(spongistatin)、氯芥苯丁酸(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷醯胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、異環磷醯胺(ifosfamide)、甲氯乙胺(mechlorethamine)、氧化甲乙胺鹽酸鹽(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法侖(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥膽甾醇(phenesterine)、潑尼氮芥(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)、卡莫司汀(carmustine)、氯脲黴素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷諾氮芥(ranimustine)、卡奇黴素(calicheamicin)、達尼黴素(dynemicin)、氯磷酸鹽(clodronate)、埃司帕黴素(esperamicin)、新卡他汀發色團(neocarzinostatin chromophore)、阿克拉黴素(aclacinomysins)、放線菌黴素(actinomycin)、安麯黴素(authramycin)、茜素(azaserine)、博萊黴素(bleomycins)、放線菌素(cactinomycin)、卡拉黴素(carabicin)、洋紅黴素(caminomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、色黴素(chromomycinis)、放線菌素(dactinomycin)、道諾黴素(daunorubicin)、艾黴素(detorubicin)、6-重氮-5-氧代-L-正白胺酸(6-diazo-5-oxo-L-norleucine)、阿黴素(doxorubicin)、泛艾黴素(epirubicin)、表阿黴素(esorubicin)、艾達黴素(idarubicin)、麻西羅黴素(marcellomycin)、絲裂黴素(mitomycins)、黴酚酸(mycophenolic acid)、諾加黴素(nogalamycin)、橄欖黴素(olivomycins)、培洛黴素(peplomycin)、泊非黴素(potfiromycin)、嘌呤黴素(puromycin)、喹納黴素(quelamycin)、羅黴素(rodorubicin)、鏈黑菌素(streptonigrin)、鏈脲佐菌素(streptozocin)、結核菌素(tubercidin)、苯丁抑制素(ubenimex)、新制癌菌素(zinostatin)、紅柔黴素(zorubicin)、氨甲蝶呤(methotrexate)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)、二甲葉酸(denopterin)、蝶羅呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)、氟達拉濱(fludarabine)、6-巰基嘌呤(6-mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鳥嘌呤(thioguanine)、安西他濱(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-硫唑脲嘧啶(6-azauridine)、卡莫呋(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、雙去氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、伊諾他濱(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)、鈣雌酮(calusterone)、屈他雄酮丙酸酯(dromostanolone propionate)、環硫雄醇(epitiostanol)、美雄酮(mepitiostane)、睾內酯酮(testolactone)、胺魯米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、三矽烷(trilostane)、醛葉酸(folinic acid)、乙醯格雷酮(aceglatone)、醛磷醯胺糖苷(aldophosphamide glycoside)、胺乙醯丙酸(aminolevulinic acid)、恩尿嘧啶(eniluracil)、安吖啶(amsacrine)、阿莫司汀(bestrabucil)、比生群(bisantrene)、依達曲沙(edatraxate)、地磷醯胺(defofamine)、秋水仙胺(demecolcine)、地吖醌(diaziquone)、艾福米辛(elformithine)、依利醋銨(elliptinium acetate)、埃博黴素(epothilone)、依託格魯(etoglucid)、硝酸鎵(gallium nitrate)、羥基脲(hydroxyurea)、香菇多醣(lentinan)、氯尼達明(lonidainine)、美登素(maytansine)、安絲菌素(ansamitocins)、米托脲腙(mitoguazone)、米托蒽醌(mitoxantrone)、莫哌達醇(mopidanmol)、硝拉維林(nitraerine)、噴司他丁(pentostatin)、蛋胺氮芥(phenamet)、吡柔比星(pirarubicin)、洛索蒽醌(losoxantrone)、鬼臼酸(podophyllinic acid)、2-乙基醯肼(ethylhydrazide)、甲基芐肼(procarbazine)、雷佐生(razoxane)、根黴素(rhizoxin)、西佐喃(sizofiran)、鍺螺胺(spirogermanium)、細交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid)、三亞胺醌(Triaziquone)、2,2’,2’’-三氯三乙胺(trichlorotriethylamine)、新月毒素(trichothecene)、烏拉坦(urethan)、長春地辛(vindesine)、達卡巴仁(dacarbazine)、甘露醇氮芥(mannomustine)、二溴甘露醇(mitobronitol)、二溴衛矛醇(mitolactol)、溴丙哌嗪(pipobroman)、甲托辛(gacytosine)、阿拉伯醣苷(arabinoside)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、噻替哌(thiotepa)、類紫杉醇(taxoid)、紫杉醇(paclitaxel)、歐洲紫杉醇(docetaxel)、苯丁酸氮芥(chloranbucil)、吉西他濱(gemcitabine)、6-硫鳥嘌呤(6-thioguanine)、巰基嘌呤(mercaptopurine)、氨甲蝶呤(methotrexate)、順鉑(cisplatin)、卡鉑(carboplatin)、長春花鹼(vinblastine)、鉑(platinum)、依託泊苷(etoposide)、異環磷醯胺(ifosfamide)、米托蔥醌(mitoxantrone)、長春新鹼(vincristine)、溫諾平(vinorelbine)、米托蔥醌(novantrone)、替尼泊苷(teniposide)、依達曲沙(edatrexate)、道諾黴素(daunomycin)、胺基蝶呤(aminopterin)、截瘤達(xeloda)、伊班膦酸(ibandronate)、拓撲異構酶抑制劑(topoisomerase inhibitor)、二氟甲基鳥氨酸(difluoromethylornithine,DMFO)、維他命A酸(retinoid)及卡培他濱(capecitabine)。
  4. 如請求項1所述之醫藥組合物,其中該生物試劑選自胜肽、蛋白質、抗體、荷爾蒙、細胞激素或趨化激素。
  5. 如請求項4所述之醫藥組合物,其中該抗體為抑制/阻斷抑制性免疫檢查點抗原的抗免疫檢查點抗體。
  6. 如請求項5所述之醫藥組合物,其中該抗免疫檢查點抗體為抗PD-1/PD-L1抗體、抗CTLA-4抗體、抗LAG-3抗體、抗TIGIT抗體、抗Ceacam 1 抗體、抗LAIR-1抗體、抗TIM-3抗體、抗VISTA抗體、抗KIR抗體、抗IDO抗體、抗CD276抗體、抗A2AR抗體或抗CD47抗體。
  7. 如請求項6所述之醫藥組合物,其中該抗PD-1/PD-L1抗體為阿維魯單抗(avelumab)、納武利尤單抗(nivolumab)、帕博利珠單抗(pembrolizumab)、度伐利尤單抗(durvalumab)及/或阿替利珠單抗(atezolizumab)。
  8. 如請求項1所述之醫藥組合物,進一步包含醫藥上可接受之賦形劑。
  9. 一種如請求項1至8中任一項所述之醫藥組合物在製備用於治療一患者癌症的藥物之用途。
  10. 如請求項9所述之用途,其中該癌症為AKR1C3還原酶過度表現的癌症。
  11. 如請求項9所述之用途,其中該癌症為肝癌、肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)、肺癌、黑色素瘤、前列腺癌、乳癌、血癌、食道癌、腎癌、胃癌、結腸癌、腦癌、膀胱癌、子宮頸癌、卵巢癌、頭頸癌、子宮內膜癌、胰臟癌、肉瘤癌或直腸癌。
  12. 一種在一有其需要之患者中治療癌症之方法,包含對該患者施用治療有效量的如請求項1至8中任一項所述之醫藥組合物的步驟。
  13. 如請求項12所述之方法,其中該治療有效量為0.1 mg/kg至100 mg/kg。
  14. 如請求項12所述之方法,其中該癌症為AKR1C3還原酶過度表現的癌症。
  15. 如請求項12所述之方法,其中該癌症為肝癌、肝細胞癌(HCC)、肺癌、黑色素瘤、前列腺癌、乳癌、血癌、食道癌、腎癌、胃癌、結腸癌、腦癌、膀胱癌、子宮頸癌、卵巢癌、頭頸癌、子宮內膜癌、胰臟癌、肉瘤癌或直腸癌。
  16. 一種抑制癌細胞生長之方法,包含對一有此需要的患者施用治療有效量的醫藥組合物,該醫藥組合物包含由式I-1或式I-2表示之化合物與一免疫檢查點抑制劑之組合
    Figure 03_image012
    Figure 03_image014
    式I-1                                     式I-2。
  17. 如請求項16所述之方法,其中該化合物與該免疫檢查點抑制劑之組合共同或協同地進行阻斷作用以拯救T細胞不活化作用並改善治療功效。
  18. 如請求項16所述之方法,其中該免疫檢查點抑制劑為抗PD-1/PD-L1抗體。
  19. 如請求項16所述之方法,其中該癌症為AKR1C3還原酶過度表現的癌症。
  20. 如請求項16所述之方法,其中該癌症為肝癌、肝細胞癌(HCC)、肺癌、黑色素瘤、前列腺癌、乳癌、血癌、食道癌、腎癌、胃癌、結腸癌、腦癌、膀胱癌、子宮頸癌、卵巢癌、頭頸癌、子宮內膜癌、胰臟癌、肉瘤癌或直腸癌。
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TW110115224A TW202241455A (zh) 2021-04-28 2021-04-28 使用akr1c3活化化合物與免疫檢查點抑制劑之組合療法

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024051792A1 (zh) * 2022-09-09 2024-03-14 深圳艾欣达伟医药科技有限公司 Ast-3424联用治疗白血病及淋巴瘤

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WO2024051792A1 (zh) * 2022-09-09 2024-03-14 深圳艾欣达伟医药科技有限公司 Ast-3424联用治疗白血病及淋巴瘤

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