JPH11174A - 酵母を用いた抗体Ｆａｂ断片の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 抗体Fab断片を微生物を宿主として安価に大
量発現させる方法を提供する。 【解決手段】 酵母ピヒア・パストリスPichia pastori
sを用いることを特徴とする抗体Fab断片の製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、酵母を用いた新規
な抗体Fab断片の製造方法に関する。さらに具体的に
は、ヒト型化抗ヒトIgE高親和性受容体（FcεRI）抗体F
ab断片の製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】現在、医療分野における診断、治療に各
種の抗体が利用され、また、試薬として非常に多様な抗
体が販売されている。治療薬として抗体分子を用いる場
合、免疫原性が低いこと、投与後迅速に病変部へ集積す
ること、薬物の付加が容易であること等の利点から、抗
体分子そのままではなく、N末端側のH鎖の一部(V_HC_H1)
とL鎖から成る1つの抗原結合部位のみを切り出したも
の、すなわちFab断片を用いることが検討されている。F
ab断片製造には、従来、精製抗体をパパイン消化して、
Fab断片のみを再度精製するという方法が用いられてき
た。近年、遺伝子組換え技術の進歩に伴って、Fab断片
のみを直接発現させる方法が考案された。酵素消化とそ
の後の精製の手間を考えると、遺伝子組換えを用いた方
法が実用的であり、実際に、酵母S.cerevisiae、大腸
菌、哺乳類細胞を宿主として用いてFab断片の発現に成
功した例が報告されているが、その生産性の悪さから実
用には至っていない。例えば、大腸菌での活性を保持し
たFabの発現は、そのほとんどがペリプラズムへの蓄積
であり(N.N. Anand et al.: Gene, 100, 39-44, 1991,
S. Takeda et al.: Hybridoma, 14, 9-18, 1995)、培地
1mlあたり数百ng程度しか得ることができない。そのう
え、再フォールディングを要求される場合も多く、精製
過程が煩雑である。

【０００３】最近、チオレドキシンリダクターゼ欠損株
を用いて、活性を保持したFabを細胞質に蓄積させるこ
とに成功している(特開平8-289794)が、細胞の破砕が必
要であり、産生量も十分ではない。また、酵母S.cerevi
siaeを用いた場合の発現量は、培地1mlあたり最高100-2
00ngであり(A.H.Horwitz et al.: Proc. Natl. Acad.Sc
i., 85, 8678-8682, 1988)、実用用途にはほど遠いもの
である。一方、哺乳類細胞での発現は、産生量は得られ
る反面、培地等が高価であり、また培養時間が長いた
め、非常にコストがかかり、実用的ではない(M.J. Evan
s et al.: ,Journal of Immunological Methods, 184,
123-138, 1995, M.S. Co et al.: J. Immunol., 152, 2
968-2976, 1994)。

【０００４】一方、近年、アレルギー症状を持つヒトが
増加しており、社会的に問題になっている。その代表的
なものとして、花粉症、アトピー性皮膚炎およびアトピ
ー性喘息を挙げることができる。これらのアレルギー
は、IgEによって媒介させるI型アレルギーに分類され
る。肥満細胞、好塩基中の細胞膜上に発現するFcεRIは
I型アレルギー反応において、鍵を握る糖蛋白分子であ
る。 FcεRIに結合した抗原特異的IgEが、対応する多価
抗原すなわちアレルゲン（例えば杉花粉症の患者では杉
花粉抗原、ダニアレルギー患者ではダニ抗原）によって
架橋されると、FcεRIは凝集し、シグナル伝達機構が作
動し、肥満細胞は初めて活性化される。その結果、アレ
ルギ―性炎症を惹起する種々の化学伝達物質、すなわち
あらかじめ細胞内顆粒に貯えられていたヒスタミンの放
出をはじめとして、細胞内代謝産物であるロイコトリエ
ン、プロスタグランジンなどの新たな合成、放出が爆発
的に誘導され、I型アレルギー反応が惹起される。

【０００５】I型アレルギーの特異的治療を考えると
き、I型アレルギーを特異的に支配するFcεRIを標的に
して、その反応の根幹を遮断するために、IgE- FcεRI
の結合を特異的に阻害する戦略は有望である。ヒト型化
抗ヒトFcεRI抗体Fab断片はFcεRIに特異的に結合する
ことにより、前述したアレルゲン−IgEによるFcεRI発
現細胞の活性化を阻止する。従って、I型アレルギーの
予防、治療薬として開発が望まれている。ヒト型化抗ヒ
トFcεRI抗体および、その製造法は既に本出願人により
開示されているが（特願平8-24816）、そのFab断片の効
率的製造法に関しては検討した例はなかった。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】上記現状より、抗体Fa
b断片を微生物を宿主として安価に大量発現させる方法
の確立が望まれている。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決すべく、様々な宿主−ベクター系で検討を重ね、鋭
意研究した結果、酵母ピヒア・パストリスPichia pasto
ris（以下P.pastorisと略す）を用いることで、上記課
題が解決できることを見いだし本発明を完成するに至っ
た。従って、本発明は、酵母ピヒア・パストリス(Pichi
a pastoris)を宿主細胞として用いることを特徴とする
抗体Fab断片の製造方法である。

【０００８】酵母ピヒア・パストリスP.pastorisを宿主
として異種タンパク質を多量に発現させた例がいくつか
報告されている(K. Barr et al.: Pharm. Eng. 12(2),
48-51, 1992, J.J. Clare et al.: Gene, 105, 205-21
2, 1991, C.W. Despreaux etal.: Gene, 131, 35-41, 1
993)。P.pastorisで異種タンパク質を発現させるために
は、P.pastorisで効率よく働く転写プロモーターの支配
下に当該遺伝子を挿入する必要がある。この転写プロモ
ーターはP.pastorisで働く任意のものが使用できるが、
P.pastoris由来のアルコールオキシダーゼ遺伝子(AOX1)
の転写プロモーターが望ましい。この転写プロモーター
は、炭素源としてメタノールが存在する場合にのみ誘導
され、その転写されるmRNAの量は、全mRNAの5%にも昇る
強力なものである。AOX1転写プロモーターを用いてP.pa
storisで異種タンパク質を発現させるための発現カセッ
トベクターも既に開示されている(例えばpHIL-D2、pHIL
-S1(インビトロゲン社製))。さらに、発現量を増大させ
るために、同一遺伝子を複数個挿入するためのベクター
も市販されている（例えばpAO815(インビトロゲン社
製))。しかしながら、これまで、複数種の遺伝子を同時
に発現させた例はなかった。本発明者らは、抗体L鎖遺
伝子及びH鎖遺伝子をそれぞれAOX1転写プロモーター
（5'AOX1）と転写ターミネーター（3'AOX1）の間に挿入
した２種の発現カセットを作製し、両者をP.pastorisに
導入することにより、発現産物が会合して成るFab断片
の産生が可能であると考え本発明に着手した。その際、
L鎖遺伝子とH鎖V_H C_H1領域遺伝子は発現細胞からのクロ
ーニング、遺伝子合成などの任意の方法で調製できる。
また、同遺伝子は動物細胞中ではイントロン配列を保持
しているが、cDNAとしても発現させることができる。

【０００９】

【発明の実施の形態】以下に前述したヒト型化抗ヒトFc
εRI抗体Fab断片の産生方法に係わる操作手順を一例と
して説明する。既に開示されているヒト型化抗FcεRIα
鎖抗体を産生するCHO細胞より、mRNAを調製し、RT-PCR
法により、抗体L鎖及びH鎖のcDNAを得た。さらに、H鎖
については、L鎖とのジスルフィド結合に関与するCys
と、H鎖どうしのジスルフィド結合に関与する、ヒンジ
領域中のCysとの間の任意の位置に終止コドンを導入す
る必要がある。一例として、L鎖とのジスルフィド結合
に関与するCysのコドンの直後に終始コドンを導入した
場合について述べる。終始コドンを挿入するには合目的
的な任意の方法が適用できるが、終始コドンを含むよう
にデザインしたプライマーを用いてPCRを行い、目的断
片を調製する方法が簡便である。得られたL鎖及びH鎖の
L鎖とのジスルフィド結合に関与するCysまでをコードす
る領域のcDNAをそれぞれ5'AOX1と3'AOX1の間に挿入し
た。この発現カセットをP.pastorisに導入するためのベ
クターには、両遺伝子の挿入された株を選択できるよう
なマーカーを保持する任意のものが使用できるが、２つ
の遺伝子を同時に導入でき、目的遺伝子の挿入された株
を一度の選択で得ることのできる方法が望ましい。そこ
で、ヒスチジン合成遺伝子(HIS4)を選択マーカーとして
保持し、発現カセットを連結して挿入することができる
ようにデザインされたpAO 815を利用して、L鎖とH鎖の
発現カセットを連結したベクターを構築した。作製した
プラスミドから、5'AOX1-L鎖-3'AOX1-5'AOX1-H鎖-3'AOX
1(HIS4)を含む領域を線状DNAとして調製し、P.pastoris
ヒスチジン合成遺伝子欠損(his4)株GS115に導入し、栄
養要求性により、導入した線状DNAが染色体上で組換え
を起こした株を選択した。さらにその中で、染色体上AO
X1遺伝子座で相同組換えを起こした株を、メタノールを
唯一の炭素源とする培地で生育速度が著しく遅いことを
指標にして選択した。このように選択した組換え酵母
は、メタノール培地で培養することにより、培養上清中
にFab断片を分泌することが確認された。その量は、培
養上清1mlあたり0.5-1.5μgに及び酵母S.cerevisiaeを
用いた場合の発現量の２倍以上であった。

【００１０】さらに、本発明者らは、分泌発現に必要な
領域を改変することによる、発現量増大の可能性を探っ
た。分泌タンパク質の発現には、タンパク質のN末端に
存在する15-30残基のアミノ酸から成るシグナル配列が
必要であり、このペプチド領域が脂質二重膜を通過する
際に機能し、通過後切断される。先にクローニングした
cDNAはマウス抗体遺伝子由来のシグナル配列遺伝子を含
んでいるが、これを酵母由来のシグナル配列遺伝子に置
き換えることにより、発現効率が上がると考えた。この
配列は酵母由来の任意の物が使用できるが、P.pastoris
のフォスファターゼ由来のシグナル配列を用いることが
最も望ましい。シグナル配列の置換は、任意の遺伝子工
学的手法を用いて行うことができる。得られた発現用プ
ラスミドは同様の方法でP.pastorisに導入することがで
きる。かくして得られた組換え酵母は、培養上清中に1m
lあたり10-40μgという実生産に十分な量のFabを分泌す
ることが確認され、本発明を完成するに至った。還元下
及び非還元下のSDS-PAGEを比較した結果、ここで得られ
るFab断片は、ジスルフィド結合によりL鎖とH鎖が会合
していることが確認された。H鎖V_HC_H1領域遺伝子もしく
はL鎖遺伝子のみをP.pastorisに導入した場合には、培
養上清中に発現産物は分泌されず、菌体内にわずかに存
在するのみであった。このことは、２つの遺伝子を同時
に導入することによってはじめて、P.pastorisでFabを
分泌発現させることが可能であることを示している。ま
た、培養上清より精製したFab断片は、抗体をパパイン
消化して得られるFab断片と同等に、IgEとFcεRIα鎖の
結合を阻害することが、明らかとなった。

【００１１】

【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説
明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものでは
ない。実施例１ 抗体由来シグナル配列を用いた組換えヒト型
化抗FcεRIα鎖抗体Fab断片発現用プラスミドの構築 ヒト型化抗FcεRIα鎖抗体Hu.cRA2を産生するCHO細胞
(特願平8-24816記載のもの）よりQuick Prep mRNA Puri
fication Kit(ファーマシア社製）を用いてmRNAを調製
した。このmRNAを鋳型として、L鎖のC末端に相当する配
列にEcoRIサイトをつなげた5'-CGGAATTCCCTCTAACACTCTC
CCCTG-3'をプライマーとして用い、AMV逆転写酵素を添
加して、42℃30分、99℃5分、5℃5分の反応を行い、cDN
Aを合成した。その後、シグナルペプチド上流の配列にE
coRIサイトをつなげたプライマー5'-CGGAATTCCAGCACTTA
ACACAGACCAC-3'及びTaq ポリメラーゼを添加して、94℃
2分反応させた後、94℃30秒、60℃30秒、72℃1.5分の反
応を40サイクル行い、同断片を増幅した。H鎖に関して
も、H鎖C1領域のL鎖とのジスルフィド結合に関与するCy
sコドンの直後に終始コドンを導入した5'-CGGAATTCCTAA
CAAGATTTGGGCTCAAC-3'と5'-CGGAATTCCAGCACTTAACACAGAC
CAC-3'を用いて、同条件でRT-PCRを行った。得られた２
種のcDNAをpCR^TM3(インビトロゲン社)に挿入してクロー
ニングした(pCR^TM3::L、pCR^TM3::H)。確認した塩基配列
を配列表の配列番号：１および２に示す。これらをEcoR
Iで切断して得られる断片をそれぞれ、同酵素で処理し
た発現ベクターpAO815(インビトロゲン社）に挿入し、A
OX1プロモーターに対して正方向に挿入断片を含むもの
を選択した（pAO815::L、pAO815::Hとする）。pAO815::
HをBglIIとBamHIで切断して得られた断片を、BamHIで切
断した後にBAPを用いて脱リン酸化したpAO815::Lに挿入
した(pAO815::L,H)（図１）。

【００１２】実施例２ PHO1由来シグナル配列を用いた
組換えヒト型化抗FcεRIα鎖抗体Fab断片発現用プラス
ミドの構築 pCR^TM3::Lを鋳型として、5'-GACATCGTGATGACCCAGTCTCCA
-3'及び5'-CAGCCTGCAGGCTGCTGATGGT-3'を用いたPCR法に
より、L鎖の可変領域をコードする部分の最初からSse83
87I部位までの断片(fL)を得た。同様に、pCR^TM3::Hを鋳
型として、5'-GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCT-3'及び5'-GATGGG
CCCTTGGTGGAGGCTGA-3'を用いたPCR法により、H鎖の可変
領域をコードする部分の最初からApaI部位までの断片(f
H)を得た。また、pHIL-S1(インビトロゲン社）を鋳型と
して、5'-GACAAGCTTTTGATTTTAACGACT-3'及び5'-AGCGAAG
ACAGATTGCAAAGT-3'を用いたPCR法により、AOX1プロモー
ター中のHindIII部位からPHO1由来シグナルペプチドを
コードする領域の終わりまでの断片(fS)を得た。fL、f
H、fSの３断片を平滑末端化し、T4ポリヌクレオチドキ
ナーゼを用いてリン酸化した後、fSとfLを連結し、連結
された断片をPCR法により増幅した（fSL)。また、同様
に、fSとfHを連結した後、連結された断片をPCR法によ
り増幅した(fSH)。fSL及びfSHを各々pCRTM3に挿入し、
クローニングした(pCR^TM3::fSL、pCRT^TM::fSH)。確認し
た塩基配列を配列表の配列番号：３および４に示す。pC
R^TM3::fSLをSse8387I及びHindIIIで切断して得られた断
片を、同酵素群で処理した後にBAPを用いて脱リン酸化
したpAO815::Hに挿入した(pAO815::fSL)。同様に、pCR
^TM3::fSHをApaI及びHindIIIで切断して得られた断片
を、同酵素群で処理した後にBAPを用いて脱リン酸化し
たpAO815::Lに挿入した(pAO815::fSH)。pAO815::fSHをB
glII及びBamHIで切断して得られた断片を、BamHIで切断
した後にBAPを用いて脱リン酸化したpAO815::fSLに挿入
した(pAO815::PHO1-L,H)（図２）。

【００１３】実施例３ 組換えヒト型化抗FcεRIα鎖抗
体Fab断片発現株の樹立 マウス抗体由来シグナル配列あるいはPHO1由来シグナル
配列を利用した組換えヒト型化抗FcεRIα鎖抗体Fab断
片発現株をそれぞれ以下に示す方法で樹立した。150ml
のYPD培地(1% yeast extract、2% bact-pepton、2% glu
cose)で酵母ピヒア・パストリスPichia pastoris GS115
(インビトロゲン社)を30℃でOD₆₀₀=1.3-1.5まで培養
後、集菌(1500×g、5分、4℃)し、氷冷した150ml滅菌水
で洗浄した。続いて、同様に、75ml滅菌水、6ml１Ｍソ
ルビトール(いずれも氷冷したもの)で洗浄した。最終的
に0.3mlの1Mソルビトールに懸濁し、形質転換用細胞と
した。この懸濁液80μlとpAO815::L,HあるいはpAO815::
PHO1-L,Hをそれぞれ10μgをBglIIで切断したものを混合
し、エレクトロポレーション（Bio-Rad社製；200Ω、25
μFD、2.0kV/0.2cm) に供した後、1mlの1Mソルビトール
溶液と混合し、適当量をMD培地（1.34% yeast nitrogen
base w/o a.a.、1%グルコース、4×10^-5%ビオチン) に
塗布した。MD培地で正常な生育をし、MM培地（1.34% ye
ast nitrogen base w/o a.a.、0.5%メタノール、4×10
^-5%ビオチン) で生育速度が顕著に遅い株を選択し、組
換えヒト型化抗FcεRIα鎖抗体Fab断片発現株を取得し
た。

【００１４】実施例４ 組換えヒト型化抗FcεRIα鎖抗
体Fab断片の発現 組換えヒト型化抗FcεRIα鎖抗体Fab断片の発現は、以
下に示す方法で行った。組換えヒト型化抗FcεRIα鎖抗
体Fab断片発現株を100mlBMGY培地(100mMリン酸カリウム
pH6.0、1.34% yeast nitrogen base w/o a.a.、1%グリ
セロール、4×10-5^-5ビオチン)で30℃、36時間培養後、
集菌(1500×g)した。その後、15mlBMM(100mM リン酸カ
リウム pH6.0、1.34% yeast nitrogen base w/o a.a.、
0.5%メタノール、4×10^-5% ビオチン)培地に懸濁し、30
℃、60時間強振とうして組換えヒト型化抗FcεRIα鎖抗
体Fab断片の発現を誘導した。遠心分離(1500×g)によ
り、菌体と上清を分離し、培養上清及び菌体粗抽出液に
ついて、パーオキシダーゼ標識抗ヒトIgG抗体(カッペル
社）、パーオキシダーゼ標識抗κ鎖抗体(ビンディグ・
サイト社)、パーオキシダーゼ標識抗ヒトIgG Fab抗体
(カッペル社）を用いたウエスタンブロッティング法に
よる分析を行った（図3）。すなわち、SDS-PAGEに供し
た後、25mMトリス-192mMグリシン緩衝液を用いてPVDF膜
に電気的に転写した。得られた膜を1%ウシ血清アルブミ
ンを含むリン酸緩衝塩溶液（8g NaCl, 0.2g KCl, 0.2g
KH₂PO₄, 2.9g Na₂HPO₄.12H₂O/1LH₂O;以下PBSと略す）で
ブロッキングした後、0.05%Tween-20を含むPBS（以下PB
STと略す）で500-1000倍希釈した上記各抗体と反応させ
た。PBSTで洗浄後、4-クロロ-1-ナフトール及び過酸化
水素を加えて発色させた。その結果、抗体由来シグナル
配列を用いた場合も、PHO1由来シグナル配列を用いた場
合も、大部分のFabは培養上清中に存在し、菌体画分に
はおそらく輸送途中のものであると思われるFabがごく
わずか存在することが明らかになった。また、培養上清
中の発現量は、抗体由来シグナル配列を用いた場合よ
り、PHO1由来シグナル配列を用いた場合の方が、顕著に
多かった。

【００１５】実施例５ 組換えヒト型化抗FcεRIα鎖抗
体Fab断片の精製 実施例４の方法で得られた培養上清より、プロテインG
カラム(ファーマシア社)を用いてFabを精製し、セント
リコン10(アミコン社)を用いて限外濾過濃縮した。抗体
由来シグナル配列を用いた場合には、培養上清1mlあた
り、1.5μgの精製Fabが得られた。また、PHO1由来シグ
ナル配列を用いた場合には、培養上清1mlあたり、40μg
の精製Fabが得られた。

【００１６】実施例６ 組換えヒト型化抗FcεRIα鎖抗
体Fab断片のN末端アミノ酸配列の確認 実施例５の方法で精製したFabを2-メルカプトエタノー
ルを添加した還元条件下でSDS-PAGEに供した後、PVDF膜
にブロッティングし、473Aプロテインシーケンサ(アプ
ライド・バイオシステムズ社)を用いて、L鎖及びH鎖そ
れぞれのN末端アミノ酸配列の確認を行った。抗体由来
あるいはPHO1由来のどちらのシグナル配列を用いた場合
にも、L鎖、H鎖ともにそれぞれのN末の１残基目の配列
であった。したがって、どちらのシグナルペプチドも正
しい位置で切断されていることが確認された。

【００１７】実施例７ 組換えヒト型化抗FcεRIα鎖抗
体Fab断片のIgE-FcεRI結合阻害活性の測定 実施例５の方法で精製したFabを用いて、ELISA法によ
り、FcεRIα鎖とIgEの結合阻害活性を測定した。96穴
イムロン２プレートに、PBSに溶解した31.25ng/wellの
組換えFcεRIα鎖を添加し、室温で１時間静置した。PB
Sで２回洗浄後、ブロックエース（大日本製薬）を添加
し、37℃で１時間静置した。PBSTで洗浄後、適宜希釈し
た組換えFab断片と10ng/wellのヒトIgEを添加し、37℃
で１時間静置した。PBSTで3回洗浄後、50ng/wellのパー
オキシダーゼ標識抗ヒトIgE抗体を添加し、37℃で１時
間静置した。PBSTで３回洗浄後、6×10^-5%の過酸化水素
及び0.4mg/mlのo-フェニレンジアミンジヒドロクロリド
(シグマ社)を添加した0.1Mクエン酸緩衝液(pH5.0)を加
えた。2N硫酸を加えて反応を停止させた後、492nmの吸
光度を測定した。この方法により、組換え抗FcεRIα鎖
抗体Fab断片と、CHO細胞において発現させた同抗体をパ
パイン消化することにより得たFab断片のFcεRIα鎖-Ig
E結合阻害活性を比較した。抗体由来シグナル配列を用
いた場合にも、PHO1由来シグナル配列を用いた場合に
も、組換えFabは、パパイン消化により得られたFabと同
等の活性を示した（図４）。

【００１８】

【配列表】

【００１９】配列番号：１ 配列の長さ：758 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源：ヒト型化抗FcεRIα鎖抗体産生CHO細胞 配列の特徴 存在位置：3..8 その他の情報：制限酵素EcoRI切断部位 特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：34..90 特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：91..744 存在位置：751..756 その他の情報：制限酵素EcoRI切断部位 配列 CGGAATTCCA GCACTTAACA CAGACCACTC ACC ATG GAC TCC AGG CTC AAT 51 Met Asp Ser Arg Leu Asn -15 TTA GTT TTC CTT GTC CTT ATT TTA AAA GGT GTC CAG TGT GAC ATC GTG 99 Leu Val Phe Leu Val Leu Ile Leu Lys Gly Val Gln Cys Asp Ile Val -10 -5 1 ATG ACC CAG TCT CCA GAC TCC CTG GCT GTG TCT CTG GGC GAG AGG GCC 147 Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala 5 10 15 ACC ATC AAC TGC AGA GCC AGT GAA AGT GTT GAT AGT TAT GGC AAC AGT 195 Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr Gly Asn Ser 20 25 30 35 TTT ATG CAC TGG TAC CAG CAG AAA CCA GGA CAG CCT CCT AAG CTG CTC 243 Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu 40 45 50 ATT TAC CTT GCA TCC AAC CTA GAA TCT GGG GTC CCT GAC CGA TTC AGT 291 Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 55 60 65 GGC AGC GGG TCT GGG ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATC AGC AGC CTG CAG 339 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 70 75 80 GCT GAA GAT GTG GCA GTT TAT TAC TGT CAG CAG AAT AAT GAA GAT CCG 387 Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Glu Asp Pro 85 90 95 TAC ACG TTC GGC CAG GGG ACC AAG CTG GAA ATC AAA CGA ACT GTG GCT 435 Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 115 GCA CCA TCT GTC TTC ATC TTC CCG CCA TCT GAT GAG CAG TTG AAA TCT 483 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 120 125 130 GGA ACT GCC TCT GTT GTG TGC CTG CTG AAT AAC TTC TAT CCC AGA GAG 531 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 135 140 145 GCC AAA GTA CAG TGG AAG GTG GAT AAC GCC CTC CAA TCG GGT AAC TCC 579 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 150 155 160 CAG GAG AGT GTC ACA GAG CAG GAC AGC AAG GAC AGC ACC TAC AGC CTC 627 Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 165 170 175 AGC AGC ACC CTG ACG CTG AGC AAA GCA GAC TAC GAG AAA CAC AAA GTC 675 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 180 185 190 195 TAC GCC TGC GAA GTC ACC CAT CAG GGC CTG AGC TCG CCC GTC ACA AAG 723 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 200 205 210 AGC TTC AAC AGG GGA GAG TGT TAG AGGGAATTCC G 758 Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 215

【００２０】配列番号：２ 配列の長さ：761 配列の数：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源：ヒト型化抗FcεRIα鎖抗体産生CHO細胞 配列の特徴 存在位置：3..8 その他の情報：制限酵素EcoRI切断部位 特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：34..90 特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：91..750 存在位置：754..759 その他の情報：制限酵素EcoRI切断部位 CGGAATTCCA GCACTTAACA CAGACCACTC ACC ATG GAC TCC AGG CTC AAT 51 Met Asp Ser Arg Leu Asn -15 TTA GTT TTC CTT GTC CTT ATT TTA AAA GGT GTC CAG TGT GAG GTG CAG 99 Leu Val Phe Leu Val Leu Ile Leu Lys Gly Val Gln Cys Glu Val Gln -10 -5 1 CTG GTG GAG TCT GGG GGA GGC TTG GTC CAG CCT GGG GGG TCC CTG AGA 147 Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg 5 10 15 CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACC TTT AGT ACC TAT CCC ATG TCT 195 Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Pro Met Ser 20 25 30 35 TGG GTC CGC CAG GCT CCA GGG AAG GGG CTG GAG TGG GTG GCC TTC ATT 243 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Phe Ile 40 45 50 AGT AAT CGT GGT GGT AGC ACC TAC TAT CCA GAC ACT GTA AAG GGC CGA 291 Ser Asn Arg Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys Gly Arg 55 60 65 TTC ACC ATC TCC AGA GAC AAC GCC AAG AAC TCA CTG TAT CTG CAA ATG 339 Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met 70 75 80 AAC AGC CTG AGA GCC GAG GAC ACG GCT GTG TAT TAC TGT GCG AGA CAT 387 Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg His 85 90 95 AAT TAT GGA GGA ATG GAC TAC TGG GGG CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC 435 Asn Tyr Gly Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val 100 105 110 115 TCC TCA GCC TCC ACC AAG GGC CCA TCG GTC TTC CCC CTG GCA CCC TCC 483 Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser 120 125 130 TCC AAG AGC ACC TCT GGG GGC ACA GCG GCC CTG GGC TGC CTG GTC AAG 531 Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys 135 140 145 GAC TAC TTC CCC GAA CCG GTG ACG GTG TCG TGG AAC TCA GGC GCC CTG 579 Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu 150 155 160 ACC AGC GGC GTG CAC ACC TTC CCG GCT GTC CTA CAG TCC TCA GGA CTC 627 Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu 165 170 175 TAC TCC CTC AGC AGC GTG GTG ACA GTG CCC TCC AGC AGC TTG GGC ACC 675 Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr 180 185 190 195 CAG ACC TAC ATC TGC AAC GTG AAT CAC AAG CCC AGC AAC ACC AAG GTG 723 Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val 200 205 210 GAC AAG AGA GTT GAG CCC AAA TCT TGT TAG GAATTCCG 761 Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys 215 220

【００２１】配列番号：３ 配列の長さ：767 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源：ヒト型化抗FcεRIα鎖抗体産生CHO細胞 配列の特徴 特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：34..99 特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：100..753 存在位置：760..765 その他の情報：制限酵素EcoRI切断部位 配列 AGAAGATCAA AAAACAACTA ATTATTCGAA ACG ATG TTC TCT CCA ATT TTG 51 Met Phe Ser Pro Ile Leu -20 TCC TTG GAA ATT ATT TTA GCT TTG GCT ACT TTG CAA TCT GTC TTC GCT 99 Ser Leu Glu Ile Ile Leu Ala Leu Ala Thr Leu Gln Ser Val Phe Ala -15 -10 -5 GAC ATC GTG ATG ACC CAG TCT CCA GAC TCC CTG GCT GTG TCT CTG GGC 147 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 GAG AGG GCC ACC ATC AAC TGC AGA GCC AGT GAA AGT GTT GAT AGT TAT 195 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr 20 25 30 GGC AAC AGT TTT ATG CAC TGG TAC CAG CAG AAA CCA GGA CAG CCT CCT 243 Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 AAG CTG CTC ATT TAC CTT GCA TCC AAC CTA GAA TCT GGG GTC CCT GAC 291 Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp 50 55 60 CGA TTC AGT GGC AGC GGG TCT GGG ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATC AGC 339 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 AGC CTG CAG GCT GAA GAT GTG GCA GTT TAT TAC TGT CAG CAG AAT AAT 387 Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn 85 90 95 GAA GAT CCG TAC ACG TTC GGC CAG GGG ACC AAG CTG GAA ATC AAA CGA 435 Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 ACT GTG GCT GCA CCA TCT GTC TTC ATC TTC CCG CCA TCT GAT GAG CAG 483 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 115 120 125 TTG AAA TCT GGA ACT GCC TCT GTT GTG TGC CTG CTG AAT AAC TTC TAT 531 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 130 135 140 CCC AGA GAG GCC AAA GTA CAG TGG AAG GTG GAT AAC GCC CTC CAA TCG 579 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 145 150 155 160 GGT AAC TCC CAG GAG AGT GTC ACA GAG CAG GAC AGC AAG GAC AGC ACC 627 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 165 170 175 TAC AGC CTC AGC AGC ACC CTG ACG CTG AGC AAA GCA GAC TAC GAG AAA 675 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 180 185 190 CAC AAA GTC TAC GCC TGC GAA GTC ACC CAT CAG GGC CTG AGC TCG CCC 723 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 195 200 205 GTC ACA AAG AGC TTC AAC AGG GGA GAG TGT TAG AGGGAATTCC G 767 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215

【００２２】配列番号：４ 配列の長さ：770 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源：ヒト型化抗FcεRIα鎖抗体産生CHO細胞 配列の特徴 特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：34..99 特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：100..759 存在位置：763..768 その他の情報：制限酵素EcoRI切断部位 配列 AGAAGATCAA AAAACAACTA ATTATTCGAA ACG ATG TTC TCT CCA ATT TTG 51 Met Phe Ser Pro Ile Leu -20 TCC TTG GAA ATT ATT TTA GCT TTG GCT ACT TTG CAA TCT GTC TTC GCT 99 Ser Leu Glu Ile Ile Leu Ala Leu Ala Thr Leu Gln Ser Val Phe Ala -15 -10 -5 GAG GTG CAG CTG GTG GAG TCT GGG GGA GGC TTG GTC CAG CCT GGG GGG 147 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 TCC CTG AGA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACC TTT AGT ACC TAT 195 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 CCC ATG TCT TGG GTC CGC CAG GCT CCA GGG AAG GGG CTG GAG TGG GTG 243 Pro Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 GCC TTC ATT AGT AAT CGT GGT GGT AGC ACC TAC TAT CCA GAC ACT GTA 291 Ala Phe Ile Ser Asn Arg Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val 50 55 60 AAG GGC CGA TTC ACC ATC TCC AGA GAC AAC GCC AAG AAC TCA CTG TAT 339 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 CTG CAA ATG AAC AGC CTG AGA GCC GAG GAC ACG GCT GTG TAT TAC TGT 387 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 GCG AGA CAT AAT TAT GGA GGA ATG GAC TAC TGG GGG CAA GGG ACC ACG 435 Ala Arg His Asn Tyr Gly Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 GTC ACC GTC TCC TCA GCC TCC ACC AAG GGC CCA TCG GTC TTC CCC CTG 483 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 GCA CCC TCC TCC AAG AGC ACC TCT GGG GGC ACA GCG GCC CTG GGC TGC 531 Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 CTG GTC AAG GAC TAC TTC CCC GAA CCG GTG ACG GTG TCG TGG AAC TCA 579 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 GGC GCC CTG ACC AGC GGC GTG CAC ACC TTC CCG GCT GTC CTA CAG TCC 627 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 TCA GGA CTC TAC TCC CTC AGC AGC GTG GTG ACA GTG CCC TCC AGC AGC 675 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 TTG GGC ACC CAG ACC TAC ATC TGC AAC GTG AAT CAC AAG CCC AGC AAC 723 Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 ACC AAG GTG GAC AAG AGA GTT GAG CCC AAA TCT TGT TAG GAATTCCG 770 Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220

【図面の簡単な説明】

【図１】 実施例１において、pAO815::L,H の作製を示
す図。

【図２】 実施例２において、pAO815::PHO1-L,Hの作製
を示す図。

【図３】 実施例４において、電気泳動パターンとウェ
スタンブロッティングにおける発色パターンを示す図。

【図４】 実施例７において、IgE-FcεRI（α鎖）結合
阻害活性の測定結果を示すグラフ。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:84） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:84） (72)発明者 高橋 恭子 東京都大田区大森北２−13−１ アサヒビ ール株式会社基盤研究所内 (72)発明者 結城 敏文 東京都大田区大森北２−13−１ アサヒビ ール株式会社基盤研究所内 (72)発明者 高井 敏朗 東京都大田区大森北２−13−１ アサヒビ ール株式会社基盤研究所内 (72)発明者 羅 智靖 千葉県千葉市花見川区花園２丁目14番13号

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 酵母ピヒア・パストリス(Pichia pastor
   is)を宿主細胞として用いることを特徴とする抗体Fab断
   片の製造方法。
2. 【請求項２】 抗体Ｌ鎖遺伝子およびＨ鎖V_H及びC_H1領
   域遺伝子の２種の発現カセットをそれぞれ作製し、両者
   を連結したベクターを酵母ピヒア・パストリス(Pichia
   pastoris)に導入することにより、発現産物が会合して
   成る抗体Fab断片を培地中に分泌発現させることを特徴
   とする請求項１記載の抗体Fab断片の製造方法。
3. 【請求項３】 抗体Ｌ鎖遺伝子およびＨ鎖V_H及びC_H1領
   域遺伝子の分泌に関与する領域（シグナルペプチド）を
   コードする遺伝子を酵母由来のシグナルペプチド遺伝子
   に置き換えることを特徴とする請求項２記載の抗体Fab
   断片の製造方法。
4. 【請求項４】 置き換えるシグナルペプチド遺伝子が酵
   母ピヒア・パストリス(Pichia pastoris)由来のフォス
   ファターゼ(PHO1)遺伝子のシグナル配列であることを特
   徴とする請求項３記載の抗体Fab断片の製造方法。
5. 【請求項５】 発現させる抗体遺伝子がヒト型化抗ヒト
   高親和性IgE受容体（FcεRI）抗体遺伝子であることを
   特徴とする請求項２または４記載の抗体Fab断片の製造
   方法。
6. 【請求項６】 請求項５記載のヒト型化抗ヒトIgE受容
   体（FcεRI）抗体Fab断片の製造にあたり、その遺伝子
   が配列表１、２および３、４に示した配列であることを
   特徴とする製造方法。