JPH10218897A

JPH10218897A - 組換えダニアレルゲンＤｅｒｆ１およびその製造方法

Info

Publication number: JPH10218897A
Application number: JP9038628A
Authority: JP
Inventors: Takaomi Yasuhara; 貴臣安原; Toshifumi Yuki; 敏文結城; Yasushi Okumura; 康奥村
Original assignee: NIKKA UISUKII KK; Asahi Breweries Ltd; Nikka Whisky Distilling Co Ltd; Torii Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: NIKKA UISUKII KK; Asahi Breweries Ltd; Nikka Whisky Distilling Co Ltd; Torii Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1997-02-07
Filing date: 1997-02-07
Publication date: 1998-08-18
Anticipated expiration: 2017-02-07
Also published as: JP3805466B2

Abstract

(57)【要約】【課題】コナヒョウヒダニ由来の物質であって組換え
Der f 1アレルゲンの糖鎖欠損型及び高分子量糖鎖の結
合した組換えDer f 1アレルゲン及びこれらの産生方法
を提供する。【解決手段】ダニ主要アレルゲンDer f 1をコードす
る遺伝子中の糖鎖結合部位であるアスパラギン残基をコ
ードするコドンを他のアミノ酸をコードするコドンに変
更した遺伝子を用いて得る組換え糖鎖欠損型ダニアレル
ゲンDer f 1。ダニ主要アレルゲンDer f 1をコードする
遺伝子を用いて製造する組換え高分子量糖鎖結合型ダニ
アレルゲンDer f 1。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規なアレルゲン
物質及びその産生方法に係わり、さらに詳細には、コナ
ヒョウヒダニ由来の物質であって組換えDer f 1アレル
ゲンの糖鎖欠損型及び高分子量糖鎖の結合した組換えDe
r f 1アレルゲン及びこれらの産生方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年アレルギー性疾患が増加しており、
これらアレルギー疾患の代表的なものとして、花粉症、
アトピー性皮膚炎及びアトピー性喘息を挙げることがで
きる。特に、アトピー性喘息は室内塵によって発症する
ことが多い。室内塵の中にはダニの虫体及び排泄物、カ
ビの菌糸や胞子、飼育しているペットの体毛などが含ま
れていることが知られている。

【０００３】ここで、アレルギーを引き起こす原因物質
をアレルゲンと称するが、上記室内塵の成分中では、ダ
ニ由来の蛋白質が最も重要なアレルゲンであることが知
られている。そして、家庭内にアレルゲンをばらまくダ
ニの種類としては、コナヒョウヒダニ（Dermatophagoid
es farinae（以下、「Der f」と略す））と、ヤケヒョ
ウヒダニ（Dermatophagoides pteronyssinuss（以下、
「Der p」と略す））とがあり、日本には主としてDer f
が多く生息していることが知られている。

【０００４】上記ダニが産生するアレルゲンの中で特に
問題となるものは、その排泄物中に多く含まれる分子量
約25キロダルトン（以下、「kDa」と略す）のグループ
１と虫体内に多く含まれる分子量約14kDaのグループ２
と称されるアレルゲンであり、これらは由来するダニの
種類によってそれぞれDer f 1、Der f 2及びDer p 1、D
er p 2とに分類されている。この二つのグループのアレ
ルゲンに対し、アトピー性喘息患者及びアトピー性皮膚
炎患者の過半数が反応することが知られている（Heyman
n, P. W., et al.: J. Allergy Clin. Immunol., 83,
1055-1067, 1989）。

【０００５】既に、上記アレルゲンは、それぞれ天然か
らその純品が精製され（Yasueda, H. et al.: Int. Arc
h. Allergy Appl. Immunol., 88, 402-407, 1989）、ま
たこれらアレルゲンをコードする遺伝子もcDNAとしてク
ローニングされており（Dilworth, R. J., et al.: Cli
nical and Experimental Allergy, 21, 25-32, 1991、C
hua, K. Y., et al.: The Rockfeller University Pres
s, 167, 175-182,1988、Yuuki, T., et al.: Jpn. J. A
llergol., 39, 557-561, 1990、Chua, K. Y.,et al.:In
t. Arch. Allergy Appl. Immunol., 91, 118-123, 199
0）、これらの結果から、Der f 1とDer p 1及びDer f 2
とDer p 2とはそれぞれ高い相同性を有することも確認
されている。

【０００６】一般にアレルギーの発症機作には、４つの
タイプがあるとされており、アレルゲンにより引き起こ
されるものはＩ型アレルギーに属する。このタイプのア
レルギーでは、先ずアレルゲンが様々な形で人に取り込
まれ感作される。次いで、このアレルゲンに特異的なIg
E抗体が産生され、産生されたIgE抗体は気管、消化管、
鼻粘膜及び皮膚等に存在している肥満細胞や好塩基球上
のIgE抗体に特異的な受容体に結合する。その後、先の
アレルゲンが再び体内に取り込まれると、このアレルゲ
ンとこれに特異的なIgE抗体が抗原抗体反応し肥満細
胞、好塩基球の受容体の架橋を引き起こす。その結果、
肥満細胞あるいは好塩基球からヒスタミンに代表される
化学伝達物質が放出されアレルギーが引き起こされる。

【０００７】このような発症機作のアレルギーは、即時
型アレルギーと称され、アトピー性喘息も通常このＩ型
アレルギーに属する。現在、アレルギーに対して種々の
治療が行われているが、そのほとんどが対症療法であ
り、完治は困難な状況である。一方、原因アレルゲンを
少量づつ体内に投与し原因アレルゲンに対するアレルギ
ー反応を抑止するいわゆる減感作療法が知られている。
近年ではホヤ抗原に対して実施され著しい治療効果が得
られている。

【０００８】従って、ダニアレルゲンに起因するアトピ
ー性喘息を、ダニ由来の２種類のアレルゲンを用いた減
感作療法により効果的に治療できる可能性がある。しか
し、かかる減感作療法を実施するにあたっては、該アレ
ルゲンが大量に必要となるが、かかるアレルゲンは室内
塵及びダニ虫体中に含まれる割合が極めて少なく、これ
を大量に得ることは実質的に不可能であったことから、
該アレルゲンを大量にかつ安価に製造する方法の確立が
望まれていた。

【０００９】最近になって、遺伝子組換え技術の手法を
用いグループ２のアレルゲンについては、大腸菌を用い
て製造する方法が確立されている（Iwamoto, N., et a
l.: Int. Arch. Allergy Immunol., 109, 356-361, 199
6）。また、グループ１アレルゲンについては大腸菌で
の発現に成功していないが、昆虫細胞を用いた製造法が
確立されている（Shouji, H., et al.: Biosci. Biotec
h. Biochem., 60, 621-625, 1996）。しかし、グループ
１アレルゲンは糖鎖を保有することが明らかとなってお
り、ダニ由来のグループ１アレルゲンと遺伝子組換えで
作製した該アレルゲンとでこの糖鎖まで同じにすること
は不可能であった。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】減感作療法を考えた場
合、糖鎖が異なれば新たな抗原となりうる可能性があり
糖鎖を同じにするかあるいは糖鎖を持たないグループ１
アレルゲン並びにその製造法の確立が望まれている。一
方、極めて大きな分子量の糖鎖が結合したグループ１ア
レルゲンは診断薬あるいは抗原特異的なIgE抗体、IgG抗
体の精製に使用できることから、高分子量糖鎖の結合し
たグループ１アレルゲン及びその製造法の確立が望まれ
ている。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決すべく鋭意研究した結果、酵母ピヒア・パストリス
(Pichia pastoris)を用い該アレルゲンをコードする遺
伝子を改変することにより上記課題が解決できることを
見いだし本発明を完成するに至った。従って、本発明の
組換えDer f 1アレルゲン物質は配列表の配列番号：３
（糖鎖欠損型）及び配列番号：４および５（高分子量糖
鎖結合型）で表されるアミノ酸配列を有することを特徴
とする。ここで「糖鎖欠損型」とは糖鎖を結合していな
いタイプのものを意味し、「高分子量糖鎖結合型」とは
分子量１万以上の糖鎖が結合したタイプのものを意味す
る。

【００１２】また、本発明のアレルゲン物質の産生方法
は、遺伝子組換えによりDer f 1遺伝子を改変し酵母で
発現させ得られた組換えDer f 1アレルゲンプロ体から
プロ配列を除去することにより活性化することを特徴と
する。以下、本発明の組換えDer f 1アレルゲンについ
て説明する。本アレルゲンは、配列表の配列番号：６
（糖鎖欠損型、プロ配列付加）及び配列番号：７（高分
子量糖鎖結合型、プロ配列付加）に示すアミノ酸配列を
有する蛋白質として培地中に分泌される。従って、従来
のように可溶化剤による可溶化、透析等による脱塩を行
って精製する必要がなく、リフォールディングを考慮し
なくとも良い。本発明のプロ体を含有する溶液を濃縮し
種々の分離精製で容易に高純度の該アレルゲンを調製す
ることができる。精製したプロ配列を有する該アレルゲ
ン溶液のpHを酸性側、好ましくはpH=3-5、さらに好まし
くはpH=4に調整し適当な温度、好ましくは0ー30℃、さら
に好ましくは4ー10℃にて適当な期間維持することにより
プロ配列が除去された成熟型該アレルゲンを得ることが
できる。

【００１３】上述のごとく、本発明においては、天然の
Der f 1アレルゲンと同等のアレルゲン活性を有する組
換えDer f 1を大量に得ることができるので、該アレル
ゲンに感作されることによって発症しているアトピー性
喘息等の治療に有効な減感作療法剤を提供できる。特
に、本発明の糖鎖を有しない組換えDer f 1は、糖鎖の
違いによる新たな抗原となる可能性がなく減感作療法剤
として優れている。また、本発明における高分子量糖鎖
の結合した組換えDer f 1は、その糖鎖に修飾を加え適
当な担体、例えばセファロース（Pharmacia社製）等に
適当な間隔で結合させることができる。かくして作製し
た担体を用いて効率的にDer f 1特異的な種々の抗体を
精製することができる。

【００１４】

【発明の実施の形態】次に上述した本発明のプロ体の産
生方法に係わる操作手順の一例を説明する。酵母Pichia
pastorisで異種蛋白質を発現させるためには、酵母Pic
hia pastorisで効率よく働く転写プロモーターの支配下
で当該遺伝子を挿入し、RNAを転写させる必要がある。
この転写プロモーターは酵母で働く任意のものが使用で
きるが、 Pichia pastoris 由来のアルコールオキシダ
ーゼ遺伝子（AOX1）の転写プロモーターが望ましい。こ
の転写プロモーターは炭素源としてメタノールが存在す
る場合のみ誘導され、その転写されるmRNAの量は全mRNA
の5%にも昇る強力なものである。この転写プロモーター
を用いPichia pastoris で異種蛋白を発現させるための
発現カセットベクターは既に知られている（例えば発現
ベクターpHIL-D2（Invitrogen社製））。発現ベクターp
HIL-D2は制限酵素EcoRI切断部位をはさんでAOX1の転写
プロモーター（5'AOX1）と転写ターミネーター（3'AOX
1）を保持し、EcoRI部位に異種遺伝子を挿入できるよう
にデザインされている。また、 pHIL-D2は3'AOX1領域に
ヒスチジン合成遺伝子（HIS4）が選択マーカーとして挿
入されており、ヒスチジン合成遺伝子欠損株（his4株）
を用い、栄養要求性で遺伝子の導入された株を選択する
ことができる。そこでEcoRI部位に既にサブクローニン
グされているDer f 1の全遺伝子を挿入し、高分子糖鎖
結合型Der f 1の発現プラスミドpHIL-D2::Der f 1を構
築した。異種遺伝子の挿入方法は既知の遺伝子工学的手
法を用いて任意に行うことができる。作製したプラスミ
ドから、5'AOX1-Der f 1-3'AOX1（HIS4）を含む領域を
線状DNAとして調製し、Pichia pastoris GS115（his4）
に電気パルス法を用い導入した。 Pichia pastoris GS1
15（his4）は最小合成培地では生育できないが、導入し
た線状DNAが染色体上で組換えを起こした株はHIS4遺伝
子が発現するため生育できる。さらにその中で、染色体
上AOX1遺伝子座で相同組換えを起こした株はメタノール
を唯一炭素源とする最小培地では、AOX1構造遺伝子の欠
失に伴いメタノールを資化能を失うため生育できない。
このように二段階で選択した組み換え酵母はメタノール
培地で、AOX1遺伝子が誘導される代わりに、高分子の糖
鎖が結合したプロDer f １蛋白質を培地中に大量に発現
することが確認できた。

【００１５】糖鎖欠損型プロDer f 1蛋白質を発現させ
るためにDer f 1遺伝子の改変を行った。Der f 1の糖鎖
は５３番目（配列表の配列番号：３に従う）のアスパラ
ギン残基に結合している。このアミノ酸残基を遺伝子工
学的手法を用い、他のアミノ酸残基に置換すればもはや
糖鎖は付加しないと考えられる。このアスパラギン残基
を同じ酸アミド基を持つグルタミン残基に置換する方法
を一例として述べる。この置換体は合目的的な任意の方
法で作製できるが部位特異的変異の方法が望ましい。先
のアスパラギン残基に対応するコドンはAACである。こ
れをグルタミン残基に対応するコドン、例えばCAAに部
位特異的変異で置き換えた。部位特異的変異を行う手法
は既に確立されており、キットとして販売されているも
のを用いると簡便に行うことができる（例えばPharmaci
a社のU. S.E. Mutagenesis Kit）。このようにして作製
された変異Der f 1遺伝子は高分子糖鎖結合プロDer f 1
と同様な操作で酵母中に導入でき、培地中に大量に分泌
することができた。

【００１６】糖鎖欠損型Der f 1を産生する酵母Pichia
pastoris NQ-124株および高分子量糖鎖の結合したDer f
1を産生する酵母Pichia pastoris HM-2218 株をそれぞ
れ工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託した。前者
の受託番号はＦＥＲＭＰ−１５７１０であり、後者の
受託番号はＦＥＲＭＰ−１５７０９である。

【００１７】

【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説
明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものでは
ない。実施例１組換え糖鎖欠損型Der f 1発現用プラスミド
の構築発現ベクターpHIL-S1（Invitrogen社）のXho I-Bam HI
間隙にプロDer f 1 DNA断片をフレームが合うように挿
入するために、Der f 1プロ配列5'側に部位特異的変異
法によりXho Iサイトを導入した。鋳型DNAには完全長De
r f 1 cDNAを含むpUC118::Der f 1 を、変異導入プライ
マーには5'-ACTGTTTATGCTCGAGCAGCTTCAATCAAA-3'を用
い、U.S.E. Mutagenesis Kit（Pharmacia社）を用いて
改変体を得た（pUC118::Der f 1(x)）。さらに同様の手
法で、Der f 1タンパク内のAsn型糖鎖添加シグナルの破
壊を行った。pUC118::Der f 1（X）を鋳型にし、糖鎖付
加シグナル破壊用プライマー5'-TTGGCCTACCGTCAAACGTCT
TTGGAT-3'を用いて、U.S.E.Mutagenesis Kitに従い糖鎖
欠損型Der f 1 DNAカセットベクター（pUC118::Der f 1
(N/Q)）を構築した。pUC118::Der f 1(N/Q)をXhoIとBam
HIで切断して得られる約1kb長のAsn型糖鎖添加シグナル
が破壊されたプロDer f 1 DNA断片（配列表の配列番
号：１）を同制限酵素群で処理したpHIL-S1に連結し、
組換え糖鎖欠損型Derf１発現ベクターpHIL-S1::Der f 1
（N/Q）を構築した。(図１）pHIL-S1::Der f1（N/Q）の
2つのBgl IIサイト内にはAOX1プロモーターとそれに支
配されるPichia pastoris由来のPHO1シグナル配列とプ
ロ体Der f 1の融合タンパク構造遺伝子が存在してい
る。

【００１８】実施例２組換え野生型Der f 1発現ベク
ターの構築プレ及びプロ配列を保持したDer f 1断片をpHIL-D2（In
vitrogen社製）内のAOX1プロモーター下流に連結するた
めにpHIL-D2 のEcoRIサイトを破壊し、BamHIサイトの導
入を行った。すなわち、pHIL-D2をEcoRIで切断し、DNA
Blunting Kit（宝酒造社製）を用いて平滑化した後、8b
pのBamHIリンカー（宝酒造社製）との連結反応、BamHI
消化、自己閉環反応を行い、目的とする改変型ベクター
（pHIL-D2(E/B)）を構築した。挿入するプレプロDer f
1 DNA断片はpUC118::Der f 1を鋳型として5'-ATGAAATTC
GTTTTGGCCATTGCC-3'と5'-AATACTCGCAAGAGTAGTTG-3'を用
いたPCR法により増幅し、上述のように平滑化後、EcoRI
-NotI-BamHIアダプター（宝酒造社製）を両末端に連結
し、pBluescript II KS⁺（Stratagene社製）のEcoRIサ
イトにサブクローニングすることにより調製した（pBlu
escript II KS⁺::Derf 1）。このプラスミドをBamHI消
化して得られる約1.1kbp長のプレプロDer f 1断片（配
列表の配列番号：２）をpHIL-D2（E/B）のBamHIサイト
に挿入し、野生型 Der f 1発現ベクターpHIL-D2::Der f
1を構築した。(図２）。

【００１９】実施例３組換えDer f 1発現株の樹立糖鎖欠損型及び高分子量糖鎖が結合した組換えDer f 1
タンパク発現株は以下に示す同様の手法で樹立した。50
0mlのYPD培地（1% Yeast Extract、2% Bact-Pepton、2%
Glucose）で酵母Pichia pastoris GS115（Invitrogen
社製）を30℃でOD₆₀₀=1.3〜1.5まで培養後、集菌（1500
xg、5分、4℃）し、氷冷した250ml滅菌水で2回洗浄（15
00xg、5分、4℃）した。続いて、氷冷した10mLの1Mソル
ビトール溶液で洗浄（1500xg、5分、4℃）後、1mlの1M
ソルビトール溶液でGS115を懸濁し、GS115形質転換用細
胞とした。この50μl細胞と適当な制限酵素（pHIL-S1は
BglII、pHIL-D2はNot I）で切断した2μg線状化Der f 1
発現ベクターを混合し、エレクトロポレーション（Bio-
Rad社製；200Ω、25μFD、2.0kV/0.2cm）に供した後、1
mlの1Mソルビトール溶液と混合し、適当量をMD培地（1.
34% Yeast Nitrogen base w/o a.a.、2% Glucose、4x10
^-6% Biotin、2% Agar）に塗布した。30℃で48時間培養
後、出現したコロニーをMD培地とMM培地（1.34% Yeast
Nitrogen base w/o a.a.、1% Methanol、4x10^-6% Bioti
n、2% Agar）に塗布し、さらに30℃で48時間培養し、MD
培地で正常な生育し、MM培地で生育しない株（約15%）
を取得することで、組換えDer f 1高産生株を得た。

【００２０】実施例４組換えDer f 1タンパクの発現糖鎖欠損型及び高分子量糖鎖が結合した組換えDer f 1
タンパクの発現は以下に示す同様の手法で行った。組換
えDer f 1産生株を10ml YPD培地で30℃、24時間前培養
後、500mlのYPD培地に接種し、30℃で36時間本培養後、
集菌（4000xg室温）した。これらを50〜100mlのBMM培地
（100mM potassium phosphate,pH6.0、1.34% Yeast Nit
rogen base w/o a.a.、1% Methanol、4x10^-6% Biotin）
に懸濁し、30℃で48時間強振とうして組換えDer f 1タ
ンパクを発現誘導し、この培養上清をマウス抗Der f 1
モノクローナル抗体（12F1）を用いたウェスタンブロッ
ティング法により、Der f 1タンパクが存在するか否か
を分析した。

【００２１】すなわち、上記培養上清及び発現誘導酵母
粗抽出液をSDS-PAGE（16％）に供した後、25mMトリス-1
92mMグリシン緩衝液を用いてニトロセルロース膜（Bio-
Rad社製）に電気的に転写した。得られた膜を1%牛血清
アルブミンを含むリン酸緩衝塩溶液（Phosphate buffer
ed Saline；以下「PBS」と略す。）でブロッキングした
後、0.2%牛血清アルブミンを含むPBSで3,000倍希釈した
マウス抗Der f 1モノクローナル抗体（12F1）と反応さ
せた。続いて上記膜を0.05% Tween20を含むPBSで洗浄し
た後、0.2% 牛血清アルブミンを含むPBSで2,000倍に希
釈したパーオキシダーゼ標識抗マウスIgGヤギ抗体（Bio
-Rad社製）と反応させた。更に上記膜を0.05% Tween20
を含むPBSで洗浄し、次いでPBSで１回洗浄し、４ークロ
ロー１ーナフトール（Bio-Rad社製）を用いて発色させ
た。これら操作の結果、目的とする組換えタンパク質が
培養上清のみに存在することが確認された。また、培養
上清に存在するタンパク質の90%以上はDer f 1タンパク
であり、糖鎖欠損型と高分子量糖鎖結合型ではそれぞれ
約100mg/L、約200mg/Lの発現量であった。

【００２２】実施例５組換えDer f 1タンパクの精製糖鎖欠損型Der f 1タンパク糖鎖欠損型Der f 1発現誘導粗抽出液を遠心（1500xg、5
min、4℃）し、培養上清を回収した。この上清に存在す
るDer f 1タンパクはウェスタンブロッティング法とN末
端アミノ酸配列分析の結果、配列表の配列番号：４で示
されるプロ体であることが確認されたため、小路らの方
法（Shouji, H., et al.: Biosci. Biotech. Biochem.,
60, 621-625, 1996）によりDer f 1タンパクの成熟化
を試みた。すなわち、pH4.0の100mM酢酸緩衝液に対して
Der f 1を含む培養上清を48時間4℃下に放置した。上記
分析の結果、ほぼ全てのDer f 1タンパクのプロ配列は
除去されており、成熟化していた（図３）。次にこれら
成熟型Der f 1タンパクを20mMトリス緩衝液（pH8.0）に
対して透析し、同緩衝液で平衡化したDEAE-Sepharoseク
ロマトグラフィーに供した後、0.1〜0.15MのNaClを含む
上記緩衝液で溶出してくる画分を回収した。この画分を
PBSに対して透析を行ったものを糖鎖欠損型Der f 1精製
標品とした。最終的に得られた組換え糖鎖欠損型Der f
1は配列表の配列番号：１で表されるタンパク質であ
る。

【００２３】高分子量糖鎖が結合したDer f 1タンパ
クの精製高分子量糖鎖が結合したDer f 1タンパクの精製は糖鎖
欠損型Der f 1タンパクの精製方法にDEAE-Sepharoseク
ロマトグラフィーの操作を省いて行った。すなわち、配
列表の配列番号：５で示される高分子量糖鎖の結合した
プロ体Der f 1タンパクを成熟化した後、PBSに対して透
析を行ったものを高分子量糖鎖が結合したDer f 1精製
標品とした（図３）。最終的に得られた高分子糖鎖結合
型組換えDer f 1は虫体由来Der f 1の４または６アミノ
酸残基上流から始まるタンパク質の混合物であった。す
なわち、配列表の配列番号：２および３で表されるタン
パク質の１：１の混合物であった。組換えDer f 1タン
パクのN末端アミノ酸配列の決定は、目的タンパクをSDS
-PAGEにより分離し、PVDF（ポリフッ化ビニリデン膜、
ミリポア社製）に電気的に転写した後、分析対象のバン
ドを切り取り、N末端アミノ酸分析機（Applied Biosyst
ems社製）を用いて決定した。

【００２４】実施例６ RAST-EIA法によるアレルゲン
（IgE結合）活性の測定組換えDer f 1タンパクのRAST活性はRAST-EIA Kit（Pha
rmacia社製）を用いて測定した。Incubation buffer、W
ashing buffer、酵素結合抗IgE抗体、基質溶液及び反応
停止液はRAST- EIA Kitに含まれるものを使用した。す
なわち、測定しようとする組換えDer f 1タンパク溶液
を、臭化シアンで活性化した濾紙に遮光下に室温で一晩
結合させた後、1M βーエタノールアミン（pH9.0）を加
え、室温で3時間放置した。次いで、0.1M NaHCO₃で1
回、0.1M 酢酸緩衝液（pH4.0）で3回、Incubation buff
erで2回洗浄し、更にヒト抗ダニIgE血清を加え、37℃で
3時間放置した。次いで、Washing bufferで3回洗浄し、
基質溶液を加え37℃で2時間放置した。しかる後、反応
停止液を加え、OD₄₂₀を測定した。得られた結果を図４
および５に示す。なお、虫体由来の天然Der f 1および
大腸菌由来の組換えDer f1のRAST結果にについても付記
する。

【００２５】図４および５から明らかなように、糖鎖欠
損型、高分子量糖鎖の結合した組換えDer f 1タンパク
いづれの場合においても、成熟後の組換えDer f 1タン
パクのIgE結合活性は虫体由来のものと同等であること
がわかる。このことから、Der f1タンパクのアレルゲン
性を決定するのはタンパク質部分のみであり、糖鎖部分
は関与しないと考えられる。

【００２６】

【配列表】

【００２７】配列番号：１配列の長さ：976 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA 起源生物名：デルマトファゴイデスファリナエ（Dermatop
hagoides farinae）配列 T CGA GCA GCT TCA ATC AAA ACT 22 Arg Ala Ala Ser Ile Lys Thr 7 TTT GAA GAA TTC AAA AAA GCC TTC AAC AAA AAC TAT GCC ACC GTT GAA 70 Phe Glu Glu Phe Lys Lys Ala Phe Asn Lys Asn Tyr Ala Thr Val Glu 23 GAG GAA GAA GTT GCC CGT AAA AAC TTT TTG GAA TCA TTG AAA TAT GTT 118 Glu Glu Glu Val Ala Arg Lys Asn Phe Leu Glu Ser Leu Lys Tyr Val 39 GAA GCT AAC AAA GGT GCC ATC AAC CAT TTG TCC GAT TTG TCA TTG GAT 166 Glu Ala Asn Lys Gly Ala Ile Asn His Leu Ser Asp Leu Ser Leu Asp 55 GAA TTC AAA AAC CGT TAT TTG ATG AGT GCT GAA GCT TTT GAA CAA CTC 214 Glu Phe Lys Asn Arg Tyr Leu Met Ser Ala Glu Ala Phe Glu Gln Leu 71 AAA ACT CAA TTC GAT TTG AAT GCC GAA ACA AGC GCT TGC CGT ATC AAT 262 Lys Thr Gln Phe Asp Leu Asn Ala Glu Thr Ser Ala Cys Arg Ile Asn 87 TCG GTT AAC GTT CCA TCG GAA TTG GAT TTA CGA TCA CTG CGA ACT GTC 310 Ser Val Asn Val Pro Ser Glu Leu Asp Leu Arg Ser Leu Arg Thr Val 103 ACT CCA ATC CGT ATG CAA GGA GGC TGT GGT TCA TGT TGG GCT TTC TCT 358 Thr Pro Ile Arg Met Gln Gly Gly Cys Gly Ser Cys Trp Ala Phe Ser 119 GGT GTC GCC GCA ACT GAA TCA GCT TAT TTG GCC TAC CGT AAC ACG TCT 406 Gly Val Ala Ala Thr Glu Ser Ala Tyr Leu Ala Tyr Arg Gln Thr Ser 135 TTG GAT CTT TCT GAA CAG GAA CTC GTC GAT TGC GCA TCT CAA CAC GGA 454 Leu Asp Leu Ser Glu Gln Glu Leu Val Asp Cys Ala Ser Gln His Gly 151 TGT CAC GGC GAT ACA ATA CCA AGA GGC ATC GAA TAC ATC CAA CAA AAT 502 Cys His Gly Asp Thr Ile Pro Arg Gly Ile Glu Tyr Ile Gln Gln Asn 167 GGT GTC GTT GAA GAA AGA AGC TAT CCA TAC GTT GCA CGA GAA CAA CAA 550 Gly Val Val Glu Glu Arg Ser Tyr Pro Tyr Val Ala Arg Glu Gln Gln 183 TGC CGA CGA CCA AAT TCG CAA CAT TAC GGT ATC TCA AAC TAC TGC CAA 598 Cys Arg Arg Pro Asn Ser Gln His Tyr Gly Ile Ser Asn Tyr Cys Gln 199 ATT TAT CCA CCA GAT GTG AAA CAA ATC CGT GAA GCT TTG ACT CAA ACA 646 Ile Tyr Pro Pro Asp Val Lys Gln Ile Arg Glu Ala Leu Thr Gln Thr 215 CAC ACA GCT ATT GCC GTC ATT ATT GGC ATT AAA GAT TTG AGA GCT TTT 694 His Thr Ala Ile Ala Val Ile Ile Gly Ile Lys Asp Leu Arg Ala Phe 231 CAA CAT TAT GAT GGA CGA ACA ATC ATT CAA CAT GAC AAT GGT TAT CAA 742 Gln His Tyr Asp Gly Arg Thr Ile Ile Gln His Asp Asn Gly Tyr Gln 247 CCA AAC TAT CAT GCC GTC AAC ATT GTC GGT TAC GGA AGT ACA CAA GGC 790 Pro Asn Tyr His Ala Val Asn Ile Val Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Gly 263 GTC GAT TAT TGG ATC GTA CGA AAC AGT TGG GAT ACT ACC TGG GGT GAT 838 Val Asp Tyr Trp Ile Val Arg Asn Ser Trp Asp Thr Thr Trp Gly Asp 279 AGC GGA TAC GGA TAT TTC CAA GCC GGA AAC AAC CTC ATG ATG ATC GAA 886 Ser Gly Tyr Gly Tyr Phe Gln Ala Gly Asn Asn Leu Met Met Ile Glu 295 CAA TAT CCA TAT GTT GTA ATC ATG TGA ACATTTGAAATTGAATATATTTATTTG 934 Gln Tyr Pro Tyr Val Val Ile Met *** 303 TTTTCAAAATAAAAACAACTACTCTTGCGAGTATTTTTTACG 976

【００２８】配列番号：2 配列の長さ：1058 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA 起源生物名：デルマトファゴイデスファリナエ（Dermatop
hagoides farinae）配列 -23 GATCCATTAAAAATTCATCAAAA ATG AAA TTC GTT TTG 15 Met Lys Phe Val Leu 5 GCC ATT GCC TCT TTG TTG GTA TTG AGC ACT GTT TAT GCT CGA GCA GCT 63 Ala Ile Ala Ser Leu Leu Val Leu Ser Thr Val Tyr Ala Arg Ala Ala 21 TCA ATC AAA ACT TTT GAA GAA TTC AAA AAA GCC TTC AAC AAA AAC TAT 111 Ser Ile Lys Thr Phe Glu Glu Phe Lys Lys Ala Phe Asn Lys Asn Tyr 37 GCC ACC GTT GAA GAG GAA GAA GTT GCC CGT AAA AAC TTT TTG GAA TCA 159 Ala Thr Val Glu Glu Glu Glu Val Ala Arg Lys Asn Phe Leu Glu Ser 53 TTG AAA TAT GTT GAA GCT AAC AAA GGT GCC ATC AAC CAT TTG TCC GAT 207 Leu Lys Tyr Val Glu Ala Asn Lys Gly Ala Ile Asn His Leu Ser Asp 69 TTG TCA TTG GAT GAA TTC AAA AAC CGT TAT TTG ATG AGT GCT GAA GCT 255 Leu Ser Leu Asp Glu Phe Lys Asn Arg Tyr Leu Met Ser Ala Glu Ala 85 TTT GAA CAA CTC AAA ACT CAA TTC GAT TTG AAT GCC GAA ACA AGC GCT 303 Phe Glu Gln Leu Lys Thr Gln Phe Asp Leu Asn Ala Glu Thr Ser Ala 101 TGC CGT ATC AAT TCG GTT AAC GTT CCA TCG GAA TTG GAT TTA CGA TCA 351 Cys Arg Ile Asn Ser Val Asn Val Pro Ser Glu Leu Asp Leu Arg Ser 117 CTG CGA ACT GTC ACT CCA ATC CGT ATG CAA GGA GGC TGT GGT TCA TGT 399 Leu Arg Thr Val Thr Pro Ile Arg Met Gln Gly Gly Cys Gly Ser Cys 133 TGG GCT TTC TCT GGT GTC GCC GCA ACT GAA TCA GCT TAT TTG GCC TAC 447 Trp Ala Phe Ser Gly Val Ala Ala Thr Glu Ser Ala Tyr Leu Ala Tyr 149 CGT CAA ACG TCT TTG GAT CTT TCT GAA CAG GAA CTC GTC GAT TGC GCA 495 Arg Asn Thr Ser Leu Asp Leu Ser Glu Gln Glu Leu Val Asp Cys Ala 165 TCT CAA CAC GGA TGT CAC GGC GAT ACA ATA CCA AGA GGC ATC GAA TAC 543 Ser Gln His Gly Cys His Gly Asp Thr Ile Pro Arg Gly Ile Glu Tyr 181 ATC CAA CAA AAT GGT GTC GTT GAA GAA AGA AGC TAT CCA TAC GTT GCA 591 Ile Gln Gln Asn Gly Val Val Glu Glu Arg Ser Tyr Pro Tyr Val Ala 197 CGA GAA CAA CAA TGC CGA CGA CCA AAT TCG CAA CAT TAC GGT ATC TCA 639 Arg Glu Gln Gln Cys Arg Arg Pro Asn Ser Gln His Tyr Gly Ile Ser 213 AAC TAC TGC CAA ATT TAT CCA CCA GAT GTG AAA CAA ATC CGT GAA GCT 687 Asn Tyr Cys Gln Ile Tyr Pro Pro Asp Val Lys Gln Ile Arg Glu Ala 229 TTG ACT CAA ACA CAC ACA GCT ATT GCC GTC ATT ATT GGC ATT AAA GAT 735 Leu Thr Gln Thr His Thr Ala Ile Ala Val Ile Ile Gly Ile Lys Asp 245 TTG AGA GCT TTT CAA CAT TAT GAT GGA CGA ACA ATC ATT CAA CAT GAC 783 Leu Arg Ala Phe Gln His Tyr Asp Gly Arg Thr Ile Ile Gln His Asp 261 AAT GGT TAT CAA CCA AAC TAT CAT GCC GTC AAC ATT GTC GGT TAC GGA 831 Asn Gly Tyr Gln Pro Asn Tyr His Ala Val Asn Ile Val Gly Tyr Gly 277 AGT ACA CAA GGC GTC GAT TAT TGG ATC GTA CGA AAC AGT TGG GAT ACT 879 Ser Thr Gln Gly Val Asp Tyr Trp Ile Val Arg Asn Ser Trp Asp Thr 293 ACC TGG GGT GAT AGC GGA TAC GGA TAT TTC CAA GCC GGA AAC AAC CTC 927 Thr Trp Gly Asp Ser Gly Tyr Gly Tyr Phe Gln Ala Gly Asn Asn Leu 309 ATG ATG ATC GAA CAA TAT CCA TAT GTT GTA ATC ATG TGA ACATTTGAAAT 977 Met Met Ile Glu Gln Tyr Pro Tyr Val Val Ile Met *** 321 TGAATATATTTATTTGTTTTCAAAATAAAAACAACTACTCTTGCGAGTATTTTTTACG 1035

【００２９】配列番号：3 配列の長さ：223 配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド起源生物名：デルマトファゴイデスファリナエ（Dermatop
hagoides farinae）配列 Thr Ser Ala Cys Arg Ile Asn Ser Val Asn Val Pro Ser Glu Leu 5 10 15 Asp Leu Arg Ser Leu Arg Thr Val Thr Pro Ile Arg Met Gln Gly 20 25 30 Gly Cys Gly Ser Cys Trp Ala Phe Ser Gly Val Ala Ala Thr Glu 35 40 45 Ser Ala Tyr Leu Ala Tyr Arg Gln Thr Ser Leu Asp Leu Ser Glu 50 55 60 Gln Glu Leu Val Asp Cys Ala Ser Gln His Gly Cys His Gly Asp 65 70 75 Thr Ile Pro Arg Gly Ile Glu Tyr Ile Gln Gln Asn Gly Val Val 80 85 90 Glu Glu Arg Ser Tyr Pro Tyr Val Ala Arg Glu Gln Glu Cys Arg 95 100 105 Arg Pro Asn Ser Gln His Tyr Gly Ile Ser Asn Tyr Cys Gln Ile 110 115 120 Tyr Pro Pro Asp Val Lys Gln Ile Arg Glu Ala Leu Thr Gln Thr 125 130 135 His Thr Ala Ile Ala Val Ile Ile Gly Ile Lys Asp Leu Arg Ala 140 145 150 Phe Gln His Tyr Asp Gly Arg Thr Ile Ile Gln His Asp Asn Gly 155 160 165 Tyr Gln Pro Asn Tyr His Ala Val Asn Ile Val Gly Tyr Gly Ser 170 175 180 Thr Gln Gly Val Asp Tyr Trp Ile Val Arg Asn Ser Trp Asp Thr 185 190 195 Thr Trp Gly Asp Ser Gly Tyr Gly Tyr Phe Gln Ala Gly Asn Asn 200 205 210 Leu Met Met Ile Glu Gln Tyr Pro Tyr Val Val Ile Met 215 220 223

【００３０】配列番号：4 配列の長さ：227 配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド起源生物名：デルマトファゴイデスファリナエ（Dermatop
hagoides farinae）配列 Leu Asn Ala Glu Thr Ser Ala Cys Arg Ile Asn Ser Val Asn Val 5 10 15 Pro Ser Glu Leu Asp Leu Arg Ser Leu Arg Thr Val Thr Pro Ile 20 25 30 Arg Met Gln Gly Gly Cys Gly Ser Cys Trp Ala Phe Ser Gly Val 35 40 45 Ala Ala Thr Glu Ser Ala Tyr Leu Ala Tyr Arg Asn Thr Ser Leu 50 55 60 Asp Leu Ser Glu Gln Glu Leu Val Asp Cys Ala Ser Gln His Gly 65 70 75 Cys His Gly Asp Thr Ile Pro Arg Gly Ile Glu Tyr Ile Gln Gln 80 85 90 Asn Gly Val Val Glu Glu Arg Ser Tyr Pro Tyr Val Ala Arg Glu 95 100 105 Gln Glu Cys Arg Arg Pro Asn Ser Gln His Tyr Gly Ile Ser Asn 110 115 120 Tyr Cys Gln Ile Tyr Pro Pro Asp Val Lys Gln Ile Arg Glu Ala 125 130 135 Leu Thr Gln Thr His Thr Ala Ile Ala Val Ile Ile Gly Ile Lys 140 145 150 Asp Leu Arg Ala Phe Gln His Tyr Asp Gly Arg Thr Ile Ile Gln 155 160 165 His Asp Asn Gly Tyr Gln Pro Asn Tyr His Ala Val Asn Ile Val 170 175 180 Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Gly Val Asp Tyr Trp Ile Val Arg Asn 185 190 195 Ser Trp Asp Thr Thr Trp Gly Asp Ser Gly Tyr Gly Tyr Phe Gln 200 205 210 Ala Gly Asn Asn Leu Met Met Ile Glu Gln Tyr Pro Tyr Val Val 215 220 225 Ile Met 227

【００３１】配列番号：5 配列の長さ：229 配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド起源生物名：デルマトファゴイデスファリナエ（Dermatop
hagoides farinae）配列 Phe Asp Leu Asn Ala Glu Thr Ser Ala Cys Arg Ile Asn Ser Val 5 10 15 Asn Val Pro Ser Glu Leu Asp Leu Arg Ser Leu Arg Thr Val Thr 20 25 30 Pro Ile Arg Met Gln Gly Gly Cys Gly Ser Cys Trp Ala Phe Ser 35 40 45 Gly Val Ala Ala Thr Glu Ser Ala Tyr Leu Ala Tyr Arg Asn Thr 50 55 60 Ser Leu Asp Leu Ser Glu Gln Glu Leu Val Asp Cys Ala Ser Gln 65 70 75 His Gly Cys His Gly Asp Thr Ile Pro Arg Gly Ile Glu Tyr Ile 80 85 90 Gln Gln Asn Gly Val Val Glu Glu Arg Ser Tyr Pro Tyr Val Ala 95 100 105 Arg Glu Gln Glu Cys Arg Arg Pro Asn Ser Gln His Tyr Gly Ile 110 115 120 Ser Asn Tyr Cys Gln Ile Tyr Pro Pro Asp Val Lys Gln Ile Arg 125 130 135 Glu Ala Leu Thr Gln Thr His Thr Ala Ile Ala Val Ile Ile Gly 140 145 150 Ile Lys Asp Leu Arg Ala Phe Gln His Tyr Asp Gly Arg Thr Ile 155 160 165 Ile Gln His Asp Asn Gly Tyr Gln Pro Asn Tyr His Ala Val Asn 170 175 180 Ile Val Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Gly Val Asp Tyr Trp Ile Val 185 190 195 Arg Asn Ser Trp Asp Thr Thr Trp Gly Asp Ser Gly Tyr Gly Tyr 200 205 210 Phe Gln Ala Gly Asn Asn Leu Met Met Ile Glu Gln Tyr Pro Tyr 215 220 225 Val Val Ile Met 229

【００３２】配列番号：6 配列の長さ：303 配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド起源生物名：デルマトファゴイデスファリナエ（Dermatop
hagoides farinae）配列 Arg Pro Ala Ser Ile Lys Thr Phe Glu Glu Phe Lys Lys Ala Phe 5 10 15 Asn Lys Asn Tyr Ala Thr Val Glu Glu Glu Glu Val Ala Arg Lys 20 25 30 Asn Phe Leu Glu Ser Leu Lys Tyr Val Glu Ala Asn Lys Gly Ala 35 40 45 Ile Asn His Leu Ser Asp Leu Ser Leu Asp Glu Phe Lys Asn Arg 50 55 60 Tyr Leu Met Ser Ala Glu Ala Phe Glu Gln Leu Lys The Gln Phe 65 70 75 Asp Leu Asn Ala Glu Thr Ser Ala Cys Arg Ile Asn Ser Val Asn 80 85 90 Val Pro Ser Glu Leu Asp Leu Arg Ser Leu Arg Thr Val Thr Pro 95 100 105 Ile Arg Met Gln Gly Gly Cys Gly Ser Cys Trp Ala Phe Ser Gly 110 115 120 Val Ala Ala Thr Glu Ser Ala Tyr Leu Ala Tyr Arg Gln Thr Ser 125 130 135 Leu Asp Leu Ser Glu Gln Glu Leu Val Asp Cys Ala Ser Gln His 140 145 150 Gly Cys His Gly Asp Thr Ile Pro Arg Gly Ile Glu Tyr Ile Gln 155 160 165 Gln Asn Gly Val Val Glu Glu Arg Ser Tyr Pro Tyr Val Ala Arg 170 175 180 Glu Gln Glu Cys Arg Arg Pro Asn Ser Gln His Tyr Gly Ile Ser 185 190 195 Asn Tyr Cys Gln Ile Tyr Pro Pro Asp Val Lys Gln Ile Arg Glu 200 205 210 Ala Leu Thr Gln Thr His Thr Ala Ile Ala Val Ile Ile Gly Ile 215 220 225 Lys Asp Leu Arg Ala Phe Gln His Tyr Asp Gly Arg Thr Ile Ile 230 235 240 Gln His Asp Asn Gly Tyr Gln Pro Asn Tyr His Ala Val Asn Ile 245 250 255 Val Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Gly Val Asp Tyr Trp Ile Val Arg 260 265 270 Asn Ser Trp Asp Thr Thr Trp Gly Asp Ser Gly Tyr Gly Tyr Phe 275 280 285 Gln Ala Gly Asn Asn Leu Met Met Ile Glu Gln Tyr Pro Tyr Val 290 295 300 Val Ile Met 303

【００３３】配列番号：7 配列の長さ：303 配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド起源生物名：デルマトファゴイデスファリナエ（Dermatop
hagoides farinae）配列 Arg Pro Ala Ser Ile Lys Thr Phe Glu Glu Phe Lys Lys Ala Phe 5 10 15 Asn Lys Asn Tyr Ala Thr Val Glu Glu Glu Glu Val Ala Arg Lys 20 25 30 Asn Phe Leu Glu Ser Leu Lys Tyr Val Glu Ala Asn Lys Gly Ala 35 40 45 Ile Asn His Leu Ser Asp Leu Ser Leu Asp Glu Phe Lys Asn Arg 50 55 60 Tyr Leu Met Ser Ala Glu Ala Phe Glu Gln Leu Lys The Gln Phe 65 70 75 Asp Leu Asn Ala Glu Thr Ser Ala Cys Arg Ile Asn Ser Val Asn 80 85 90 Val Pro Ser Glu Leu Asp Leu Arg Ser Leu Arg Thr Val Thr Pro 95 100 105 Ile Arg Met Gln Gly Gly Cys Gly Ser Cys Trp Ala Phe Ser Gly 110 115 120 Val Ala Ala Thr Glu Ser Ala Tyr Leu Ala Tyr Arg Asn Thr Ser 125 130 135 Leu Asp Leu Ser Glu Gln Glu Leu Val Asp Cys Ala Ser Gln His 140 145 150 Gly Cys His Gly Asp Thr Ile Pro Arg Gly Ile Glu Tyr Ile Gln 155 160 165 Gln Asn Gly Val Val Glu Glu Arg Ser Tyr Pro Tyr Val Ala Arg 170 175 180 Glu Gln Glu Cys Arg Arg Pro Asn Ser Gln His Tyr Gly Ile Ser 185 190 195 Asn Tyr Cys Gln Ile Tyr Pro Pro Asp Val Lys Gln Ile Arg Glu 200 205 210 Ala Leu Thr Gln Thr His Thr Ala Ile Ala Val Ile Ile Gly Ile 215 220 225 Lys Asp Leu Arg Ala Phe Gln His Tyr Asp Gly Arg Thr Ile Ile 230 235 240 Gln His Asp Asn Gly Tyr Gln Pro Asn Tyr His Ala Val Asn Ile 245 250 255 Val Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Gly Val Asp Tyr Trp Ile Val Arg 260 265 270 Asn Ser Trp Asp Thr Thr Trp Gly Asp Ser Gly Tyr Gly Tyr Phe 275 280 285 Gln Ala Gly Asn Asn Leu Met Met Ile Glu Gln Tyr Pro Tyr Val 290 295 300 Val Ile Met 303

【図面の簡単な説明】

【図１】糖鎖欠損型 Der f 1タンパク発現用プラスミド
の構築の概略図。

【図２】高分子量糖鎖の結合した Der f 1タンパク発現
用プラスミドの構築の概略図。

【図３】糖鎖欠損型と糖鎖結合型の２種の組換え Der f
1タンパク発現を比較するグラフ。

【図４】糖鎖欠損型組換え Der f 1タンパクのIgE結合
活性（RAST-EIA法）を示すグラフ。

【図５】高分子量糖鎖の結合した Der f 1タンパクのIg
E結合活性（RAST-EIA法）を示すグラフ。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者結城敏文東京都大田区大森北２−13−１アサヒビール株式会社基盤研究所内 (72)発明者奥村康東京都大田区大森北２−13−１アサヒビール株式会社基盤研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ダニ主要アレルゲンDer f 1をコードす
る遺伝子中の糖鎖結合部位であるアスパラギン残基（配
列表の配列番号：４の５７番目）をコードするコドンを
他のアミノ酸をコードするコドンに変更した遺伝子を用
いて得られた組換え糖鎖欠損型ダニアレルゲンDer f
1。
【請求項２】他のアミノ酸がグルタミンである請求項
１記載の組換え糖鎖欠損型ダニアレルゲンDer f 1。
【請求項３】請求項１または２記載のダニアレルゲン
Der f 1を製造するにあたり、改変した遺伝子を組換え
技術により酵母ピヒア・パストリス(Pichiapastoris)
で発現させることを特徴とする組換え糖鎖欠損型ダニア
レルゲンDerf 1の製造方法。
【請求項４】酵母ピヒア・パストリスが工業技術院生
命工学工業技術研究所に寄託した受託番号ＦＥＲＭＰ−
１５７１０の株である請求項３記載の製造方法。
【請求項５】ダニ主要アレルゲンDer f 1をコードす
る遺伝子を用いて製造することを特徴とする分子量１万
以上の糖鎖が結合した組換え高分子量糖鎖結合型ダニア
レルゲンDer f 1。
【請求項６】請求項５記載のダニアレルゲンDer f 1
を製造するにあたり、改変した遺伝子を組換え技術によ
り酵母ピヒア・パストリス(Pichia pastoris)で発現さ
せることを特徴とする分子量１万以上の糖鎖が結合した
組換え高分子量糖鎖結合型ダニアレルゲンDer f 1の製
造方法。
【請求項７】酵母ピヒア・パストリスが工業技術院生
命工学工業技術研究所に寄託した受託番号ＦＥＲＭＰ−
１５７０９の株である請求項６記載の製造方法。