CN117362453A - 一种Derf1重组抗原、其制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种Derf1重组抗原、其制备方法及应用，Derf1重组抗原为包含Derf1蛋白片段I、Derf1蛋白片段II以及Derf1蛋白片段III的重组抗原，所述Derf1蛋白片段I为Derf1蛋白中第99位至第298位的200个氨基酸，所述Derf1蛋白片段II为Derf1蛋白中第99位至第112位的14个氨基酸，所述Derf1蛋白片段III为Derf1蛋白中第244位至第267位的24个氨基酸。该Derf1重组抗原用于粉尘螨过敏IgE抗体检测试剂盒中，大大提高了检测灵敏度，降低了假阳率。

Description

一种Derf1重组抗原、其制备方法及应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种Derf1重组抗原、其制备方法及应用。
背景技术
粉尘螨是广泛存在于人类生活和工作环境中的一种重要过敏原，可引起过敏性哮喘、过敏性鼻炎、皮炎等多种过敏性疾病。目前在粉尘螨中发现具有致敏性的蛋白近40种，其中Derf1、Derf2、Derf23等蛋白被列为粉尘螨主要致敏蛋白，其中Derf1蛋白能与90%以上粉尘螨过敏患者体内特异性IgE抗体结合，故Derf1蛋白在粉尘螨过敏诊断方面有着广泛应用。
目前，过敏诊断方法主要有皮肤检测及血清IgE检测等。其中，皮肤检测对某些患者并不友好，低致敏量抗原即能引发患者严重的过敏反应；血清IgE检测具有简便快速等优点，且对患者无副作用。两种方法均需要活性好、纯度高且批间稳定的抗原制剂。现有技术所制备的抗原制剂主要包含粉尘螨天然抗原和重组抗原2种：粉尘螨天然抗原活性好，纯度及批间差难以保证；重组抗原存在抗原活性差，应用于检测试剂盒上灵敏度低、特异性差、检出率较低等问题。因此，制备活性好且具有诊断意义的Derf1重组抗原显得尤为重要。
发明内容
本发明要解决的第一个技术问题是：针对现有技术的不足，提供一种高纯度、高活性的Derf1重组抗原。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种Derf1重组抗原，其核酸序列如SEQ ID NO.1所示，所编码的氨基酸序列如SEQID NO.2所示。
作为一种改进的技术方案，所述Derf1重组抗原为包含Derf1蛋白片段I、Derf1蛋白片段II以及Derf1蛋白片段III的重组抗原，所述Derf1蛋白片段I为Derf1蛋白中第99位至第298位的200个氨基酸，所述Derf1蛋白片段II为Derf1蛋白中第99位至第112位的14个氨基酸，所述Derf1蛋白片段III为Derf1蛋白中第244位至第267位的24个氨基酸。
作为一种改进的技术方案，所述Derf1蛋白片段I的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述Derf1蛋白片段II的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述Derf1蛋白片段III的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
本发明要解决的第二个技术问题是：针对现有技术的不足，提供一种Derf1重组抗原的制备方法，利用该制备方法可得到纯度高，活性较强的Derf1重组抗原。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种Derf1重组抗原的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
（1）利用在线分析工具分析，筛选出Derf1蛋白的第99位至第298位的200个氨基酸、第99位至第112位的14个氨基酸以及第244位至第267位的24个氨基酸，三个片段进行串联，并在N端加上EcoRⅠ酶切位点，在C端加上NotⅠ酶切位点后，进行基因合成；
（2）分别用EcoRⅠ和NotⅠ酶双酶切基因合成重组Derf1蛋白基因片段和pPICZαA质粒，回收酶切后的质粒片段和基因片段按照1:5的摩尔比，采用T4连接酶16℃连接2h，得连接产物；
（3）将步骤（2）中的连接产物转入DH5α感受态细胞,涂布于YPDZ平板上，37℃恒温培养；次日随机挑取单克隆菌落，提取质粒，用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳验证，鉴定为阳性，即重组质粒构建成功；
（4）将步骤（3）中构建成功的重组质粒经Sac Ⅰ酶线性化，按照化学转化法转入GS115感受态细胞中，涂布于YPDZ平板，30℃培养，挑取单克隆菌落，经PCR鉴定为阳性的，即为阳性表达菌；
（5）取步骤（4）中阳性表达菌，接种于BMGY培养基中，28℃、220rpm摇菌24h作为种子，次日接种于 BMMY培养基中，经甲醇诱导得到的发酵液，经离心收集的上清液经硫酸铵沉淀，离心收集的沉淀物经溶解、透析，收集的截留液经过滤后的滤液进入Ni离子亲和层析柱中，通过梯度洗脱处理后收集的洗脱液经浓缩，即可得到Derf1重组抗原。
作为一种改进的技术方案，步骤（4）中转化时先将240μl的PGE3350加入GS115感受态细胞中，吹打混匀后于30℃水浴锅中孵育5min，之后依次加入1M 的Licl36μl、2mg/mL的鲑鱼精25μl、线性化载体（10μg）50μl，吹打混匀30℃孵育30min后，42℃热激20min，室温6000rpm离心1min，收集的沉淀用500μl YPD重悬后于摇床中29℃、200rpm培养4h，培养完成后涂布于YPDZ平板，30℃培养3天。
作为一种改进的技术方案，步骤（5）中所述 BMGY及BMMY培养基中不含有YNB及生物素。
作为一种改进的技术方案，步骤（5）中梯度洗脱处理是指先采用20mM咪唑的Elution Buffer洗脱，然后再采用250mM咪唑的Elution Buffer洗脱，收集250mM咪唑的Elution Buffer洗脱时的流出液，经过浓缩，即可得到Derf1重组抗原。
针对现有技术的不足，提供一种Der f1重组抗原在粉尘螨过敏IgE抗体检测试剂盒中的应用。
采用了上述技术方案后，本发明的有益效果是：
本发明筛选出Derf1蛋白的第99位至第298位的200个氨基酸、第99位至第112位的14个氨基酸以及第244位至第267位的24个氨基酸，化学合成Derf1蛋白片段I、Derf1蛋白片段II以及Derf1蛋白片段III串联的基因序列，然后通过双酶切、T4连接酶的连接将得到的重组质粒经过转化、表达、纯化、浓缩，经检测得到的高纯度、活性较强的Derf1重组蛋白可用于包被抗原。将该Derf1重组抗原用于粉尘螨过敏IgE抗体检测试剂盒中，大大提高了检测灵敏度，降低了假阳率。
附图说明
图1为实施例1中SignalP-5.0分析蛋白信号肽结果图；
图2为实施例1中Derf1蛋白三维结构图（PDB）；
图3为实施例1中 Ellipro分析Derf1蛋白结果图；
图4为实施例1中目的基因双酶切电泳结果图；
图5为实施例1中重组载体双酶切验证结果图；
图6为实施例1中PCR鉴定阳性克隆结果图；
图7为实施例1中酵母表达蛋白SDS-PAGE验证图；
图8为实施例2中WB法鉴定目的蛋白表达结果图；
图9为实施例1中Derf1重组抗原纯化结果图；
图10为实施例3中Derf1重组抗原结合活性检测结果分析图；
图11为实施例1和对比例1的菌落图；
图12为对比例2中酵母表达SDS-PAGE电泳图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
一种Derf1重组抗原，为包含Derf1蛋白片段I、Derf1蛋白片段II以及Derf1蛋白片段III的重组抗原（核酸序列如SEQ ID NO.1所示，所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示），其中Derf1蛋白片段I为Derf1蛋白中第99位至第298位的200个氨基酸（氨基酸序列见SEQ ID NO.3），Derf1蛋白片段II为Derf1蛋白中第99位至第112位的14个氨基酸（氨基酸序列见SEQ ID NO.4），Derf1蛋白片段III为Derf1蛋白中第244位至第267位的24个氨基酸（氨基酸序列见SEQ ID NO.5）。
制备方法包括以下步骤：
（1）根据NCBI网站上已公布的Derf1蛋白的氨基酸序列(NCBI序列号AB034946)，利用ExPASy分析Derf1蛋白的部分序列（Derf1蛋白中第99位至第321位的223个氨基酸）分子量（27KD）、等电点（5.75）、稳定指数（39.58）、亲水性（-0.417）；通过SignalP-5.0对蛋白信号肽进行分析，详见图1；并根据PDB网站上公布的Derf1蛋白三维结构，详见图2；结合Ellipro分析结果，详见图3；利用在线分析工具分析，筛选出Derf1蛋白的第99位至第298位的200个氨基酸、第99位至第112位的14个氨基酸以及第244位至第267位的24个氨基酸，化学合成Derf1蛋白片段I、Derf1蛋白片段II以及Derf1蛋白片段III的串联序列，用ExpOptimizer在线密码子优化工具对其核酸序列进行优化，并在N端加上EcoRⅠ酶切位点，在C端加上NotⅠ酶切位点，进行基因合成；
（2）利用EcoRⅠ和NotⅠ对合成的基因序列及pPICZαA质粒进行双酶切；酶切反应体系为：EcoRⅠ(0.5μl)、NotⅠ(0.5μl)、10×QuickCut buffe(1μl)、DNA/质粒(8μl)、37℃酶切2h，经琼脂糖凝胶电泳后（详见图4）用大量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒对酶切产物回收，将酶切质粒和酶切基因按照1:5的摩尔比进行10μl体系连接，16℃连接2h，得到连接产物。取10μl连接产物转入100μl的DH5α中，涂布于YPDZ平板上，在37℃下培养过夜。挑取单克隆菌落接种于LB培养基中（含Zeocin抗生素），培养6-8h，提取重组质粒，并进行双酶切验证（详见图5），验证正确即为重组载体构建成功；
（3）将步骤（2）中的重组质粒经SacⅠ酶处理并用大量DNA产物纯化试剂盒提取线性化DNA，按照化学转入法转入GS115感受态细胞,（预先将240μl PGE3350加入感受态细胞中，吹打混匀于30℃水浴锅中孵育5min，之后依次加入1M 的Licl36μl、2mg/mL的鲑鱼精25μl、线性化载体（10μg）50μl，吹打混匀并30℃孵育30min后，42℃热激20min，室温6000rpm离心1min，沉淀用500μl YPD重悬后于摇床中29℃、200rpm培养4h）,培养完成后涂布于YPDZ平板上，30℃恒温培养3天，随机挑取单克隆菌落经PCR鉴定（鉴定结果如图6），引物：R:ACTTCTGCGTGTCGTATTAAC，F:GTTGTCGTGCTGGATTAT，扩增引物理论大小应为492bp，共鉴定出7株阳性。
（4）取步骤（3）中阳性表达菌，接种于30mLBMGY（不含YNB、生物素）培养基中，28℃、220rpm摇菌24h作为种子，次日测量OD值并接种于300mL BMMY培养基（不含YNB、生物素）中至接种后培养基终OD600nm为0.8，加入甲醇（AR）至终浓度为1%，每隔24h补加甲醇（AR）至培养液终浓度的1%，并取出1ml检测OD600nm及蛋白量，共检测144h。SDS-PAGE验证见图7，OD600nm检测结果见表1。将接种经甲醇诱导后得到的发酵液，在10000rpm的转速下离心10min，收集的上清液进行硫酸铵沉淀，离心收集的沉淀采用20mM、pH8.0的Tris溶解，并于20mM、pH8.0的Tris缓冲液中透析2天，将截留液采用0.45μm针孔过滤器过滤，收集的滤液以0.5mL/min的流速进入Ni离子亲和层析柱中（滤液进柱前柱子先采用20mM、pH8.0的Tris缓冲液平衡），采用20mM咪唑的Elution Buffer洗杂，然后再采用250mM咪唑的Elution Buffer洗脱，收集250mM咪唑的Elution Buffer洗脱时的流出液，经SDS-PAGE电泳鉴定，收集的目的蛋白经过浓缩，即为Derf1重组抗原，并用超微量紫外分光光度计测定蛋白浓度，SDS-PAGE电泳如图9所示。
实施例2
WB法鉴定目的蛋白表达
将实施例1中步骤（4）中经甲醇诱导后的发酵液经10000rpm的转速下离心10min，收集上清液，加入硫酸铵至终浓度为60%，12000rpm 10min离心，尽量吸除上清，沉淀用适量1×PBS溶解，取15μl蛋白进行SDS-PAGE电泳，电泳至溴酚蓝即将跑出凝胶时终止电泳，将胶拆下按照顺序放入转膜设备中，转膜设备放入冰浴中并以300mA恒流50min进行转膜。转印完成后将膜在TBST的中涮洗两次，在脱色摇床上用5wt%BSA封闭过夜，将膜取出放于鼠抗His-Tag抗体中室温摇床孵育60min。用TBST洗膜后将膜放入二抗孵育槽中，室温摇床孵育60min，TBST洗膜三次，吸去膜上多余液体，加入混合好的发光液进行显影，检测结果见图8。
实施例3
ELISA法鉴定蛋白结合活性
取实施例1中所得的Derf 1重组抗原，用包被缓冲液（pH9.6、0.05M碳酸盐缓冲液）稀释至10μg/mL，按照0μl、10μl、20μl、40μl、60μl、100μl依次加入孔中，补包被缓冲液至100μl，4℃包被过夜后倾去液体。每孔加入200μl封闭液（含5wt%BSA的10mMPBST），37℃孵育1h后，倾去液体采用PBST缓冲液洗涤3次，用纱布包裹并拍干。将血清样本按照1:100的比例稀释后，加入酶标孔中各100μl，置于37℃，孵育40min，用PBST缓冲液洗涤3次。将HRP-鼠抗人IgE按1:10000的比例稀释后，按100μl/孔加入酶标反应孔中，37℃孵育40min后，倾去液体采用PBST缓冲液清洗3次，用纱布包裹拍干。加入TMB显色液显色，100μl/孔，37℃避光反应5min；加2M硫酸终止液50μl终止反应，于酶标仪中双波长检测，即测试波长450nm，参考波长630nm。检测结果见表2。
根据检测结果，以蛋白含量为横坐标，OD值为纵坐标作图（详见图10），据图可知，随Derf1重组抗原含量增加结合IgE抗体含量增加，证明所制备的Derf1重组抗原结合活性良好。
实施例4
一种粉尘螨过敏原特异性IgE检测试剂盒（ELISA法），包括酶标板（包被有实施例1所制备的Derf 1重组抗原）、样本稀释液（pH7.4的PBS）、洗涤液（pH7.4的PBST）、酶标二抗（HRP-鼠抗人IgE，1:5000的比例稀释）、血清标准品（阴性血清，作为阴性对照）、显色液A（H2O2）、显色液B（TMB）、终止液（2mol/L H2SO4溶液）。
具体包被方法：将Derf 1重组抗原稀释至5μg/ml，100μl/孔包被在酶标板上，4℃包被过夜，倾去液体并用5wt% BSA 37℃封闭30min，PBST清洗三次，并拍干孔中液体。
检测方法为：加入待检标本37℃、60min，待检标本中特异性IgE与Derf1重组抗原结合，用洗涤液洗涤三次后拍干，再加入酶标抗人IgE抗体37℃、 30min，洗涤3次并拍干后，加入混合好的显色液，终止显色并与酶标仪上读数，测试波长450nm，参考波长630nm。
检测90例随机血清，（1,1）为空白对照，表示第1行第1列；（1,2）（2,1）（2,2）为阴性对照，分别表示第1行第2列，第2行第1列，第2行第2列；（1,3）（2,3）为阳性对照，分别表示第1行第3列，第2行第3列，结果见表3。
根据表3进行数据分析，以阴性血清平均值（N）的2.1倍作为cut off值，大于cutoff值记为阳性，即S（样本测值）/N（阴性对平均测值）≥2.1记为阳性，由上检测结果可得，90例随机血清中，9例判定为阳性，其中1例为强阳，5例为弱阳。
实施例5
一种粉尘螨过敏原特异性IgE检测试剂盒（免疫渗滤法），包括芯片反应板（包被有实施例2中所制备的Derf1重组抗原）、酶标试剂（AP-抗人IgE）、洗涤液（含1wt% BSA的TBST）、显色液(BCIP)、终止液（20mM TBS）。
包被方法：抗原稀释至1μg/μl，取0.5μl点加在小孔膜T侧，等阴干后滴加一滴封闭液，封闭液渗滤过膜等阴干后可存放用于后续检测。
检测方法：将待检样品通过小孔滴加在硝酸纤维素膜上，待完全渗滤过膜，滴加两滴洗涤液洗涤后，滴加一滴金标抗体于膜上，待金标液完全渗滤过膜，滴加两滴洗涤液进行脱色，阳性则在膜上留下两个红色斑点，阴性为一个。
对100例随机血清进行检测，结果显示，12例弱阳，2例强阳，86例阴性。对45例临床阳性患者进行检测，结果检出44例阳性，其余1例经再次检验为弱阳，检出率97%以上，灵敏度100%。对50例健康血清进行检测，结果显示，50例均为阴性，特异性100%。
此外需要说明的是，本发明所制备的Derf1重组抗原可应用于粉尘螨过敏特异性IgE检测试剂盒（ELISA法）、粉尘螨过敏原特异性IgE检测试剂盒（免疫渗滤法），此外还可用于其他粉尘螨过敏特异性IgE检测试剂盒中。
为了更好的证明本发明的Derf1重组抗原在粉尘螨过敏特异性IgE检测试剂盒的应用中，可以显著提高试剂盒的灵敏度和准确性，给出了以下对比例。
对比例1
将实施例1中的重组质粒经SacⅠ酶处理并用大量DNA产物纯化试剂盒提取线性化DNA，按照化学转入法转入GS115感受态细胞，然后将240μl的PGE3350、1M、36μl的 Licl、2mg/mL的鲑鱼精25μl、线性化载体（10μg）50μl预混后再加入感受态细胞，吹打混匀于30℃水浴锅中孵育30℃孵育30min，42℃热激20min，室温6000rpm离心1min，沉淀用500μl YPD重悬后于摇床中29℃、200rpm培养4h）,培养完成后涂布于YPDZ平板上，37℃恒温培养3天，观察单克隆菌生长个数。
试验结果：实施例1平板中单克隆菌落个数明显多于对比例1平板中单克隆菌落个数。因此实施例1中的转化效率要明显高于对比例1，选用实施例1进行转化更优。
对比例2
将实施例1中阳性表达菌，接种于 30mLBMGY培养基（含YNB、生物素）中，28℃、220rpm摇菌24h作为种子，次日测量OD值并接种于300mL BMMY（含YNB、生物素）培养基中至接种后培养基终OD600nm为0.8，加入甲醇（AR）至终浓度为1%，每隔24h补加甲醇（AR）至培养液终浓度为1%，并取出1ml检测OD600nm及蛋白量，共检测144h。SDS-PAGE验证图见图12，OD600nm检测结果见表4。采用实施例1中相同的分离纯化方法进行验证。
试验结果：对比例2与实施例1对比，培养基配方中增加的YNB、生物素对蛋白的表达没有明显的提升，反而会增加成本。因此在表达该蛋白时，应选用成本更低的实施例1。
对比例3
与实施例1不同的是，Derf1重组抗原制备时采用Ni离子亲和层析柱进行纯化时，直接采用250mM咪唑的Elution Buffer洗脱，收集250mM咪唑的Elution Buffer洗脱时的流出液，经SDS-PAGE电泳鉴定，收集的目的蛋白经过浓缩，即为Derf1重组抗原。再将该重组抗原用于实施例5的试剂盒中，并按照相同的方法检测，具体检测结果如下：
对100例随机血清进行检测，结果显示，40例弱阳，15例强阳，45例阴性。对45例临床阳性患者进行检测，结果检出45例阳性，检出率100%。对50例健康血清进行检测，结果显示，23例为阴性，27例为阳性，特异性46%。出现假阳现象。
试验结果：纯化时没有采用低浓度的咪唑的Elution Buffer洗脱，这样会导致纯度降低，进而出现假阳，检测的灵敏度降低，特异性降低。
其中需要说明的是，图4中第一泳道为Marker，分子量从上到下为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、50bp，第2-3泳道为目的基因经EcoRⅠ和Not Ⅰ双酶切后电泳结果；
图5中第一泳道为Marker，分子量从上到下为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、50bp，第2-3泳道为重组载体经EcoRⅠ和NotⅠ双酶切验证结果；
图6中第一泳道为Marker，分子量从上到下为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、50bp，第2-20泳道为重组载体转化宿主菌后单克隆PCR鉴定结果；
图7中第7、14泳道为Marker，分子量从上到下为116KD、66.2 KD、45 KD、35 KD、25KD、18.4KD、14.4 KD，1-6,8-13为PCR鉴定出的阳性克隆进行发酵（24h、48h、72h、96h、120h、144h）蛋白表达结果；
图8中第3泳道为Marker，分子量从上到下为180KD、130KD、95 KD、72KD 、55KD、43KD、34KD、26KD、17KD、10KD，第1、2泳道为发酵144h时发酵上清检测his标签结果图，其中第1泳道72-95 KD 、34-43KD之间有明显结合条带，因毕赤酵母发酵伴随蛋白糖基化等修饰，可能造成理论大小与实际大小不符的情况。
图9中第1泳道为Marker，分子量从上到下为116KD、66.2KD、45KD、35 KD 、25KD、18.4 KD、14.4 KD，2-10泳道为上样前、上样后、洗杂①、洗杂②、洗脱①、洗脱②、洗脱③、洗脱④、洗脱⑤、洗脱⑥，其中Elution Buffer的咪唑浓度分别为20mM、20mM、500mM、500mM、500mM、500mM、500mM、500mM。
图11中左图为实施例1图，右图为对比例1图。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种Derf1重组抗原，其特征在于，所述Derf1重组抗原的核酸序列如SEQ ID NO.1所示，所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的一种Derf1重组抗原，其特征在于，所述Derf1重组抗原为包含Derf1蛋白片段I、Derf1蛋白片段II以及Derf1蛋白片段III的重组抗原，所述Derf1蛋白片段I为Derf1蛋白中第99位至第298位的200个氨基酸，所述Derf1蛋白片段II为Derf1蛋白中第99位至第112位的14个氨基酸，所述Derf1蛋白片段III为Derf1蛋白中第244位至第267位的24个氨基酸。
3.根据权利要求2所述的一种Derf1重组抗原，其特征在于，所述Derf1蛋白片段I的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述Derf1蛋白片段II的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述Derf1蛋白片段III的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
4.一种如权利要求1所述的Derf1重组抗原的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
（1）利用在线分析工具分析，筛选出Derf1蛋白的第99位至第298位的200个氨基酸、第99位至第112位的14个氨基酸以及第244位至第267位的24个氨基酸，三个片段进行串联，并在N端加上EcoRⅠ酶切位点，在C端加上NotⅠ酶切位点后，进行基因合成；
（2）分别用EcoRⅠ和NotⅠ酶双酶切基因合成重组Derf1蛋白基因片段和pPICZαA质粒，回收酶切后的质粒片段和基因片段按照1:5的摩尔比，采用T4连接酶16℃连接2h，得连接产物；
（3）将步骤（2）中的连接产物转入DH5α感受态细胞,涂布于YPDZ平板上，37℃恒温培养；次日随机挑取单克隆菌落，提取质粒，用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳验证，鉴定为阳性，即重组质粒构建成功；
（4）将步骤（3）中构建成功的重组质粒经Sac Ⅰ酶线性化，按照化学转化法转入GS115感受态细胞中，涂布于YPDZ平板，30℃培养，挑取单克隆菌落，经PCR鉴定为阳性的，即为阳性表达菌；
（5）取步骤（4）中阳性表达菌，接种于BMGY培养基中，28℃、220rpm摇菌24h作为种子，次日接种于 BMMY培养基中，经甲醇诱导得到的发酵液，经离心收集的上清液经硫酸铵沉淀，离心收集的沉淀物经溶解、透析，收集的截留液经过滤后的滤液进入Ni离子亲和层析柱中，通过梯度洗脱处理后收集的洗脱液经浓缩，即可得到Derf1重组抗原。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）中转化时先将240μl的PGE3350加入GS115感受态细胞中，吹打混匀后于30℃水浴锅中孵育5min，之后依次加入1M的 Licl36μl、2mg/mL的鲑鱼精25μl、线性化载体50μl，吹打混匀30℃孵育30min后，42℃热激20min，室温6000rpm离心1min，收集的沉淀用500μl YPD重悬后于摇床中29℃、200rpm培养4h，培养完成后涂布于YPDZ平板，30℃培养3天。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤（5）中所述 BMGY及BMMY培养基中不含有YNB及生物素。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤（5）中梯度洗脱处理是指先采用20mM咪唑的Elution Buffer洗脱，然后再采用250mM咪唑的Elution Buffer洗脱，收集250mM咪唑的Elution Buffer洗脱时的流出液，经过浓缩，即可得到Derf1重组抗原。
8.一种如权利要求1所述的Derf1重组抗原在粉尘螨过敏IgE抗体检测试剂盒中的应用。
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