MXPA01010348A

MXPA01010348A - Anticuerpos anti-idiotipicos contra anticuerpos que inhiben el enlace de inmunoglobulina con su receptor de alta afinidad.

Info

Publication number: MXPA01010348A
Application number: MXPA01010348A
Authority: MX
Inventors: Franz Kricek
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 1999-04-14
Filing date: 2000-04-12
Publication date: 2002-10-23
Also published as: CA2363991A1; CN1268644C; CZ20013673A3; CA2363991C; EP1169353A1; GB9908533D0; WO2000063252A1; TR200102877T2; DE60038608D1; SK14592001A3; KR20020007366A; ES2302693T3; CO5241329A1; PT1169353E; IL145507A; AU3966000A; NO20014936L; BR0009781A; HK1044544A1; RU2253655C2

Abstract

Se describen anticuerpos y fragmentos de anticuerpos que son anti-idiotipicos para un anticuerpo que interfiere con el enlace de la region C?3 de IgE a su receptor de alta afinidad (mimocuerpos), particularmente que son anti-idiotipicos para BSW17 (mimocuerpos de BSW17), asi como su uso como productos farmaceuticos, especialmente vacunas, en el tratamiento de enfermedades mediadas por IgE.

Description

ANTICUERPOS ANTI-IDIOTIPICOS CONTRA ANTICUERPOS OUE INHIBEN EL ENLACE DE INMUNOGLOBULINA CON SU RECEPTOR DE ALTA AFINIDAD La presente invención se refiere a anticuerpos anti- idiotípicos. Se dirige hacia la inhibición de las interacciones que normalmente ocasionarían el disparo de las células mástil y de los basófilos, inducido por la inmunoglobulina E (IgE) enlazada con las células, ligada a un alérgeno, dando como resultado la liberación de histamina y otros mediadores, así como la síntesis de novo de citocinas involucradas en la regulación de reacciones alérgicas e inflamatorias. Se refiere a anticuerpos anti-idiotípicos o a fragmentos de anticuerpos que interfieren con el enlace de la región Ce3 de IgE con el receptor de alta afinidad para IgE. El conocimiento de sitios de enlace específicos sobre IgE que interactúen con su receptor de alta afinidad (FceRI) , proporciona una base para la generación de anticuerpos que impiden esta interacción, mediante el reconocimiento de los epítopos de enlace. La inducción de estos anticuerpos mediante vacuna da como resultado una terapia novedosa y generalmente aplicable para alergia. La presente invención describe la identificación y producción, en particular, de fragmentos de anticuerpos recombinantes que se pueden formular en una vacuna para la generación de anticuerpos anti-IgE que protegen de la inducción de reacciones alérgicas mediadas por IgE. Los síntomas alérgicos son inducidos por la liberación de aminas vasoactivas (mediadoras) , notoriamente histamina, desde las células hacia el tejido circundante y las estructuras vasculares. La histamina normalmente se almacena en células especiales conocidas como células mástil y granulocitos de basófilos. Las células mástil están dispersadas a través de todo el tejido animal, mientras que los basófilos circulan adentro del sistema vascular. Estas células sintetizan y almacenan la histamina adentro de la célula, a menos que ocurra una secuencia especializada de eventos para disparar su liberación. El papel de los anticuerpos IgE en la mediación de reacciones alérgicas es bien conocido. La IgE es un arreglo complejo de cadenas de polipéptido que, como en otras inmunoglobulinas, consiste en dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas enlazadas entre sí por enlaces de disulfuro en una configuración en forma de "Y" . Cada cadena ligera tiene dos dominios, un dominio variable (VL) enlazado con un dominio con una secuencia de aminoácidos relativamente invariante denominado un dominio constante (CL) . Las cadenas pesadas, en contraste, tienen un dominio variable (VH) , y en el caso de la IgE, cuatro dominios constantes (C1, CH2 , CH3 , CH , también conocidos como Cel, Ce2, Ce3, Ce4) . Los dos "brazos" del anticuerpo son responsables del enlace del antígeno, que tienen regiones en donde varía la estructura del polipéptido, y se denominan fragmentos Fab' o F(ab')2, que representa dos brazos Fab' enlazados entre sí por enlaces de disulfuro. La "cola" o eje central del anticuerpo contiene una secuencia fija o constante de péptidos, y se denomina el fragmento Fc . El fragmento Fc contiene sitios interactivos que hacen posible que el anticuerpo se comunique con otras moléculas o células del sistema inmune, enlazándose con sus receptores de Fc . Los receptores de Fc son moléculas que se enlazan específicamente con los sitios moleculares activos adentro de las regiones Fc de la inmunoglobulina. Los receptores de Fc pueden existir como proteínas de membrana integrales adentro de una membrana de plasma externa de la célula, o pueden existir como moléculas "solubles" libres, que circulan libremente en el plasma sanguíneo o en otros fluidos corporales. En el sistema humano, el enlace de alta afinidad de IgE con FceRI se realiza mediante una compleja interacción de proteína-proteína que involucra diferentes partes del tercer dominio de la región constante de cadena pesada (Ce3) de la IgE y el dominio de tipo de inmunoglobulina proximal de membrana (a2) de la subunidad FceRI . Aunque se han identificado residuos adentro del dominio Ce3 de Fce, y regiones que pertenecen al dominio a2 de FceRIa, que son importantes para el enlace, todavía se tiene que caracterizar el mecanismo detallado del proceso de enlace. La evidencia experimental ha demostrado que la IgE humana adopta una estructura doblada que se especula que contribuye a la alta afinidad de IgE para FceRI (Kd = 10"10M) . Más aún, también se postula que esta estructura doblada es responsable del complejo equimolar entre IgE y FceRI enlazado con células o soluble, aunque la molécula de IgE proporcionaría epítopos idénticos sobre los dos dominios Ce3 para el enlace del receptor. Esta monovalencia es una necesidad funcional si se quiere eliminar el disparo del receptor en ausencia del alérgeno. Los sitios interactivos, dependiendo de su función, pueden ya estar expuestos, y por consiguiente, pueden enlazarse a los receptores celulares. De una manera alternativa, pueden estar ocultos hasta que el anticuerpo se enlace con el antígeno, sobre lo cual, el anticuerpo puede cambiar su estructura, y subsecuentemente exponer otros sitios activos, que luego pueden desencadenar una actividad inmune específica. Se ha propuesto una reconfiguración de conformación que afecta a Ce3 después del enlace del receptor, como una explicación para la estequiometría de 1:1 del complejo Fce/FceRI sobre la superficie celular. La liberación alérgica (inmunológica) de mediadores adentro del organismo desde las células mástil y los basófilos, solamente puede presentarse bajo las siguientes circunstancias: una molécula de IgE debe asegurarse sobre, o unirse con, su porción Fc, al sitio del receptor de Fc celular, asegurando de esta manera la molécula de IgE a la célula mástil o al - - •~-~«-»^.»'^»»^-** - lii liiiiÉ ilÉJif j j basófilo; y las porciones Fab' de las moléculas de IgE enlazadas con células deben reticularse mediante un antígeno compatible particular (el alérgeno) . Si ocurriera esta interacción, la célula mástil o el basófilo se dispara automáticamente para liberar histamina hacia el medio ambiente local, manifestando síntomas alérgicos familiares (Figura 1). Siguen otros eventos bioquímicos en una reacción de fase tardía, que dan como resultado la síntesis de novo y la liberación de citocinas y otros mediadores. Los planteamientos convencionales para el tratamiento de alergia han involucrado terapia sistémica con antihistaminas, o intentos por desensibilizar a los pacientes, planteamientos que no se han dirigido hacia la interacción básica de IgE-célula mástil/basófilo. Otro planteamiento se ha preocupado de la producción de cadenas de polipéptido capaces de bloquear el enlace del anticuerpo IgE con los receptores de Fc sobre las superficies celulares, y de desplazar la IgE de los sitios de enlace sobre los que ya está enlazada la IgE, y ha investigado la naturaleza de un sitio "efector" putativo supuesto adentro de la región Fc de IgE, que se especuló que proporciona una señal inmunológica que dispara las células mástil/los basófilos para la liberación de histamina. También se ha intentado utilizar fragmentos recombinantes de IgG como inmunógenos para la generación de una vacuna protectora anti-IgE, y se ha demostrado que es efectiva.

La objeción principal contra esta vacuna resulta de la posibilidad de que la utilización de grandes fragmentos de IgE para la inmunización, podría iniciar no solamente la producción de anticuerpos inhibidores, sino que también podría generar reticulación, y de esta manera, anticuerpos anafilactogénicos en los pacientes. Una estrategia para superar este problema se dirigiría a la identificación del fragmento de IgE más pequeño posible, consistente idealmente en el sitio de enlace del receptor solamente, que está enterrado adentro del complejo de IgE/IgERI después del enlace, y por consiguiente, ya no es accesible para la reticulación mediante la respuesta inmune generada por la vacuna. Aunque todavía se hacen intentos, esta estrategia tiene pocas probabilidades de tener éxito en vista de las distancias espaciales de las diferentes regiones Ce3 involucradas en la interacción de IgE/IgERI. Los problemas intrínsecamente ligados al planteamiento de vacuna "clásica" se pueden superar mediante la utilización de péptidos mimótopos cortos para inmunización activa, ya sea como péptidos químicamente sintetizados acoplados con portadores apropiados, o bien como construcciones de fusión recombinantes con, por ejemplo, ovalbúmina o IgG. Estos péptidos son imitaciones estructurales del epítopo reconocido por el anticuerpo monoclonal BS 17, que reconoce un epítopo de conformación sobre Fce, residiendo una parte de él -Jt-t-j j.-b.fay^.y.M.,....^ adentro de Ce3, y residiendo una parte de él adentro de Ce . La línea celular de hibridoma que produce BS 17 se depositó el 19 de diciembre de 1996 en la ECACC de acuerdo con las disposiciones del Tratado de Budapest sobre el depósito de microorganismos, bajo el número de depósito 96121916. Este anticuerpo exhibe un perfil interesante de actividades biológicas, como se resumen en la Figura 2. Es por sí mismo no anafilactogénico, y protege a las células mástil y a los basófilos humanos de la liberación de histamina dependiente de IgE inducida por los agentes disparadores. El BS 17, o los anticuerpos de tipo BS 17 que circulan adentro del sistema vascular, protegen de reacciones alérgicas mediante: a) la inhibición del disparo de las células mástil y de los basófilos a través de la inhibición competitiva de la interacción de IgE/IgERI, y b) la reducción de los niveles en suero de IgE a través de la regulación descendente de la síntesis de IgE al nivel de las células B. Como imitaciones estructurales de un epítopo de anticuerpo anti-IgE, los péptidos del mimótopo de BS 17 químicamente sintetizados inducen una respuesta inmune que da como resultado la producción de anticuerpos de tipo BS 17 en el huésped. Debido a que se ha demostrado que el BSW17 es no-anafilactogénico, inhibidor para el enlace de IgE/IgERI y la síntesis de IgE en las células B, estos anticuerpos que se reprodujeron contra la vacuna basada en el péptido del mimótopo de BSW17, tienen propiedades protectoras similares. Un posible inconveniente de esta vacuna basada en el péptido mimótopo de BSW17 se puede presentar de la necesidad de acoplar los péptidos químicamente sintetizados con proteínas portadoras para incrementar la inmunogenicidad de los péptidos. Además, la 5 flexibilidad estructural de los péptidos cortos les permite adoptar muchas conformaciones esféricas diferentes. Por consiguiente, solamente una fracción de la respuesta inmune policlonal anti-mimótopo será terapéuticamente activa mediante su reacción cruzada con la IgE humana. 10 La presente invención elimina los posibles inconvenientes intrínsecos a un planteamiento de péptido mitnótopo. Se basa en anticuerpos o en fragmentos de anticuerpos que son anti-idiotípicos para los anticuerpos que interfieren con el enlace de IgE con su receptor de alta 15 afinidad, en particular sobre un anticuerpo anti-idiotípico recombinante para BSW17. De acuerdo con la teoría de red de Jerne (Jerne N. , Ann . Immunol . 125C

[1974] 373), las regiones hipervariables de un anticuerpo (Abl) pueden ellas mismas actuar como antígenos. Los anticuerpos producidos de esta 20 manera se conocen como anticuerpos (Ab2) anti-idiotipo (anti- id) , debido a que se enlazan con la región idiotípica del primer anticuerpo (Figura 3) . Estos anticuerpos anti-id se dirigen hacia el sitio de enlace (parátopo) del primer anticuerpo (Abl) , y por lo tanto, representan una "imagen 25 interna" del antígeno original. En consecuencia, los .-..xa -t, .«ü.^»---**--*.,!. »A*j anticuerpos anti-id (Ab2) , denominados anticuerpos de imagen interna o Ab2ß, también son capaces de provocar una formación de anticuerpo por medio de sus regiones hipervariables. Estos anticuerpos anti-anti-id (Ab3) imitan estructuralmente al parátopo de Abl, y por consiguiente, tienen propiedades biológicas similares a las del anticuerpo Abl. En el caso del sistema hIgE/BS 17, IgE representa el antígeno original, y BSW17 el anticuerpo Abl. El parátopo de un anticuerpo Ab2 anti-idiotipo BSW17, por consiguiente, representa una imitación estructural de la región hlgE (el epítopo) reconocida por BS 17. Estructuralmente, el parátopo Ab2 es equivalente a los péptidos mimótopos de BS 17 químicamente sintetizados mencionados anteriormente. Si se utiliza este anticuerpo anti-idiotipo BSW17 (recombinante) como una vacuna, se inducirá una respuesta inmune de tipo BS 17 (Ab3) en el paciente vacunado. Como BSW17, estas inmunoglobulinas Ab3 (policlonales) interferirán con el enlace entre IgE y su receptor de alta afinidad, actuando de esta manera como agentes antialérgícos . En contraste con los péptidos mimótopos sintéticos flexibles, el parátopo Ab2 se presentará al medio ambiente en una conformación estructuralmente definida. La reacción inmune dirigida contra el epítopo de hlgE definido, por consiguiente, será más específica. Más aún, no será necesaria ninguna proteína portadora inmunogénica heteróloga. Por consiguiente, se eliminarán los posibles efectos secundarios ocasionados por una proteína portadora, como toxoide de tétanos o toxoide de difteria. La presente invención comprende anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que son anti-idiotípicos para los anticuerpos tales como E25 (olizumab) o CGP56901, o de preferencia, BS 17, que interfieren con el enlace de la región Ce3 de IgE al receptor de alta afinidad para IgE posteriormente en la presente, se denominan brevemente como "los mimocuerpos de la invención" . Cuando son anti-idiotípicos para BSW17, se denominan posteriormente en la presente brevemente como "mimocuerpos de BSW17" . Los mimocuerpos de la invención, por lo tanto, son anticuerpos anti-idiotipo o fragmentos de anticuerpos que se enlazan específicamente con un epítopo que es el parátopo de un anticuerpo anti-IgE que reconoce el sitio sobre la región Ce3 de la molécula de IgE que se enlaza con el receptor de alta afinidad para IgE (FceRI) . Los mimocuerpos de la invención, en principio, son de origen humano, hasta donde se contemple el uso en seres humanos . De preferencia son reco binantes . De preferencia son monoclonales. De preferencia son fragmentos de anticuerpo, por ejemplo, que consisten en, o que comprenden: tanto cadenas pesadas como ligeras (por ejemplo fragmentos Fab) , o bien, solamente cadenas pesadas o ligera (por ejemplo, dímeros de cadena ligera) , de preferencia junto con sus estiramientos de componentes de la región constante, por ejemplo, co o se definen en la Figura 4 (SEO ID Nos: 35, 36 , 37 , y 38) , en donde se debe entender que la "región constante" también cubre las modificaciones estéricas menores, tales como se encuentran en las variantes alotípicas, por ejemplo, en 1 a 5, normalmente solo una posición de aminoácido en la parte constante; o partes de las mismas, en particular cuando menos las partes determinantes de especificidad de las mismas, por ejemplo como se definen en las Figuras 5a a 5d (SEO ID Nos: 2, 4, 6, 8) ; o subpartes de las mismas, en particular cuando menos las subpartes hipervariables de las mismas, tales como péptidos formados de estiramientos de aminoácidos que comprenden cuando menos una CDR, por ejemplo, que comprenden cuando menos una CDR, o de preferencia dos, o más preferiblemente las tres CDR de las Figuras 5a, 5b, 5c, ó 5d (SEO ID Nos: 2, 4. 6. 8) , opcionalmente junto con las secuencias de estructura adyacentes, por ejemplo de hasta aproximadamente 10 aminoácidos en uno o en ambos extremos de la CDR. Los mimocuerpos de la invención representan anticuerpos aislados y sustancialmente puros o fragmentos de anticuerpos derivados a partir de anticuerpos anti-id anti-IgE l^-J-J^.*...--^-», ~ ..a__HA.¿¡_H que se presentan naturalmente. En particular, están sustancialmente libres de otros anticuerpos. Como "sustancialmente puro" se debe entender una pureza de cuando menos aproximadamente el 60 por ciento en peso, de preferencia de aproximadamente el 90 por ciento en peso, más preferiblemente de aproximadamente el 99 por ciento en peso o más . La invención también se refiere a composiciones farmacéuticas, especialmente vacunas, que comprenden los mimocuerpos de la invención, ya sea como una sola entidad molecular, o como un conjugado de proteína químicamente acoplado con una molécula portadora inmunogénica, en donde sea apropiado junto con un adyuvante y excipientes convencionales adicionales. Además, se refiere a los mimocuerpos de la invención para utilizarse como un producto farmacéutico, en particular como una vacuna, en particular en el tratamiento de enfermedades mediadas por IgE. Además se refiere al uso de anticuerpos que interfieren con el enlace de la región Ce3 de IgE con el receptor de alta afinidad para IgE, tal como BSW17, para la identificación de los mimocuerpos de la invención, utilizando métodos convencionales, tales como tecnología de despliegue de fagos . Además se refiere a un método de tratamiento de Í-á-¿-lttiáA,-^^^-J.^f^«-'.- -'-• •-^f^--^. -a-^ a enfermedades mediadas por IgE, en particular mediante vacuna, que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de los mimocuerpos de la invención a un paciente que necesite dicho tratamiento o vacuna. Además se refiere al uso de los mimocuerpos de la invención en la preparación de un medicamento contra las enfermedades mediadas por IgE, en particular de una vacuna. Además se refiere al uso de los mimocuerpos de la invención para reproducir anticuerpos policlonales o monoclonales contra los mismos, para inmunización pasiva; a la preparación de anticuerpos policlonales o monoclonales contra los mimocuerpos de la invención para inmunización pasiva, ya sea mediante la administración de los mimocuerpos de la invención a un animal no humano adecuado, y el aislamiento y la purificación de los anticuerpos generados contra los mismos, o bien mediante tecnología de hibridoma convencional; y al uso de los anticuerpos policlonales o monoclonales, siempre que se obtengan a partir de los mimocuerpos de la invención, en el tratamiento de enfermedades mediadas por IgE, mediante inmunización pasiva. Además, se refiere a un proceso para la identificación de los mimocuerpos de la invención, el cual comprende : identificar los anticuerpos anti-IgE anti- idiotípicos que se presentan naturalmente; aislar los fragmentos de los mismos; y seleccionar los fragmentos recombinantes de los mismos mediante el enlace con un anticuerpo monoclonal anti-IgE adecuado, tal como BS 17, que interfiere con el enlace de la región Ce3 de IgE al receptor de alta afinidad para IgE. Una vez identificados y caracterizados, los mimocuerpos de la invención se pueden preparar de una manera convencional, por ejemplo, mediante tecnología de /ADN recombinante o síntesis química. Para la identificación de los anticuerpos anti-idiotípicos que exhiban la misma especificidad que los péptidos mimótopos mencionados anteriormente (es decir, el epítopo seleccionado sobre IgE) , se puede utilizar una biblioteca de despliegue de bacteriófagos que esté expresando la parte Fab de un repertorio de anticuerpos humanos. Esta biblioteca se construye, por ejemplo, a partir de un grupo de células B obtenidas de amígdalas de sujetos humanos, y se utiliza el anticuerpo BS 17 inmovilizado como blanco para el biopaneo. Las partículas de fagos que expresan Fab humano que reconocen BSW17 específicamente se aislan y enriquecen. Por consiguiente, estos fragmentos Fab recombinantes son mimocuerpos de la invención, y representan anti-idiotipos contra las regiones hipervariables de BS 17. Cuando se utilizan como una vacuna, inducen una respuesta inmune que da como resultado la producción de anticuerpos de tipo BS 17 en el irniTii ri iiimttrtií im .é paciente alérgico. Debido a que el BSW17 no es anafilactogénico y es inhibidor del enlace de IgE/IgERI y de la síntesis de IgE en las células B, los anticuerpos policlonales reproducidos en el paciente contra la vacuna Fab anti-idiotípica de BS 17 tienen propiedades similares. La respuesta inmune es muy específica y segura debido a que, en contraste con el "planteamiento de vacuna clásica" , no hay fragmentos de proteína derivados de IgE presentes que pudieran generar anticuerpos reticulantes en los pacientes inmunizados, y se pueden contemplar composiciones que no tengan portador. Estos mimocuerpos de BS 17 son anticuerpos recombinantes o fragmentos de anticuerpos que consisten en dominios variables (dominios V) y dominios constantes (dominios C) derivados a partir de la inmunoglobulina G humana. Se han identificado dos clones diferentes (clones 52 y 43) , que exhiben diferentes fragmentos del mimocuerpo sobre su superficie, mediante biopaneo de las bibliotecas de fagos de anticuerpos sobre el anticuerpo BS 17 inmovilizado. La estructura del mimocuerpo que imita el epítopo de BS 17 sobre la- IgE humana reside adentro de las regiones hipervariables (CDR) y de las regiones de estructura adyacentes (FR) de los dominios V. El ADNc y las secuencias de aminoácidos de los dominios V de cadena pesada y ligera del clon 52 y del clon 43, se muestran en las Figuras 5a a 5d (SEO ID Nos: 1 a 8) . La construcción de cadena ligera del clon 52 (L.C.)2 consiste en un fragmento de cadena ligera de "tipo Fab" dimérico. La estructura completa de estos mimocuerpos de BS 17 está representada esquemáticamente en las Figuras 4A a 4C, en donde se debe entender que las partes de la región constante también cubren las modificaciones esféricas menores, tales como se encuentran en las variantes alotípicas, como se mencionó anteriormente. La secuencia de aminoácidos para cada cadena pesada y ligera completa de estos clones se proporciona en las Figuras 12a a 12d (SEO ID Nos: 35 a 38) . Los mimocuerpos de la invención poseen actividad farmacológica. Por consiguiente, se indican para utilizarse como productos farmacéuticos, por ejemplo, como antígenos para vacunas . Aunque son sustancialmente incapaces de mediar la liberación de histamina no citolítica, son capaces de provocar anticuerpos con una fuerte reactividad cruzada serológica con las secuencias de aminoácidos blanco de la región Fc de IgE. La dosis inicial del mimocuerpo de la invención, por ejemplo, desde aproximadamente 0.05 miligramos a aproximadamente 5 miligramos, de preferencia de aproximadamente 1 miligramo; se administrará, por ejemplo, nasalmente, o subcutáneamente o intramuscularmente, seguida por dosis repetidas (de refuerzo) del mismo, por ejemplo 14 a 28 días después. Las dosificaciones a utilizar dependerán hasta algún grado de la edad, el peso, y la salud general del paciente, y se pueden ajustar según sea apropiado.

La vacunación directa, es decir, la inmunización activa con los mimocuerpos de la invención, de preferencia se realizará utilizando péptidos recombinantes (fragmento Fab, cadena ligera o cadena pesada) que se puedan producir en sistemas de expresión de diferentes huéspedes, por ejemplo bacterias, hongos, o células eucarióticas, de una manera convencional . Se prefiere la administración del mimocuerpo recombinante libre. Sin embargo, también es posible incrementar la inmunogenicidad del inmunógeno adicionalmente mediante acoplamiento químico con un portador inmunogénico. El término "material portador inmunogénico" incluye en la presente aquellos materiales que tengan la propiedad de provocar de una manera independiente una respuesta inmunogénica en un animal huésped, y que se puedan acoplar de una manera covalente con el polipéptido, ya sea directamente mediante la formación de enlaces peptídicos o de esféricos entre los grupos carboxilo, amino, o hidroxilo libres en el polipéptido, y los grupos correspondientes sobre el material portador inmunogénico, o de una manera alternativa, mediante el enlace a través de un grupo de enlace bifuncional convencional. Los ejemplos de estos portadores incluyen albúminas de suero animal, globulinas de suero animal, tiroglobulinas de animales, hemoglobinas de animales, hemocianinas de animales (particularmente Hemocianina de Limpete de Orificio [KLH]), proteínas extraídas de áscaris, ^ ^l^!^^ •"t- ^~'~^^*~>*^*»'* * * ¿¿¿ por ejemplo extractos de áscaris, tales como aquéllos descritos en J. Immun. 111

[1973] 260-268, J . Immun . 122

[1979] 302-308, J . Iptmun . 98

[1967] 893-900 y Am. J. Phvsiol . 199

[1960] 575- 578, o productos purificados de los mismos; polilisina, ácido poliglutámico, copolímeros de lisina-ácido glutámico, copolímeros que contengan lisina, u ornitina, etcétera.

Recientemente, se han producido vacunas utilizando toxoide de difteria, tal como CRM197, o toxoide de tétanos, como materiales portadores inmunogénicos (Lepow. M. L. y colaboradores, J. Infectious Diseases 150

[1984] 402-406; y Coen Beuvery, E. y colaboradores, Infection and Immunitv 40

[1983] 39-45) , y estos materiales toxoides también se pueden utilizar en la presente. En contraste con la toxina de difteria químicamente destoxificada, de preferencia se utiliza la toxina de difteria mutada recombinante CRM197. En CRM197, el residuo de glicina-52 es reemplazado por ácido glutámico, dando como resultado un producto no tóxico. CRM197 es una proteína portadora no tóxica bien caracterizada, y se utiliza en una vacuna humana registrada. El derivado de proteína purificado de tuberculina (PPD) también se puede utilizar en el esquema de inmunización "activa", debido a que: (1) no induce una respuesta de células T por sí misma (es decir, en efecto es un "hapteno de células T" ) , y no obstante, se comporta como un antígeno completamente procesado, y es reconocida por las células T como tal; (2) se sabe que es uno de los "portadores" de hapteno más poderosos en el modo de reconocimiento enlazado; y (3) se puede utilizar en seres humanos sin mayor prueba. Como los agentes de enlace de hapteno-portador, se puede emplear aquéllos convencionalmente empleados en la preparación de antígenos. El acoplamiento covalente de los mimocuerpos de la invención con el material portador inmunogénico se puede realizar de una manera convencional. Por ejemplo, para el acoplamiento covalente directo, es posible utilizar derivados de bis-N-succinimidilo, más preferiblemente suberato de bis (sulfosuccinimidilo) como agente de acoplamiento, o glutaraldehído o carbodi-imida, más preferiblemente (diciclohexil) carbodi-imida o l-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodi-imida. Las proporciones de hapteno, agente de enlace de hapteno-portador, y portador, se pueden determinar apropiadamente, pero se prefiere que el portador esté en una cantidad de aproximadamente 1 a aproximadamente 6 veces, de preferencia de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 veces el peso del hapteno, y que el agente de enlace de hapteno-portador esté en una cantidad de aproximadamente 5 a aproximadamente 10 veces el equivalente molar del hapteno. Mediante la reacción de acoplamiento anterior, el portador se enlaza con el hapteno por medio del agente de enlace de hapteno-portador para obtener un antígeno deseado compuesto de un complejo de péptido-portador del mimótopo de la invención, y el portador. ^ ^a_á____J__y_4ii____ÍÍ____l Después de que se termina la reacción, el inmunógeno resultante se puede aislar y purificar de una manera convencional, tal como mediante diálisis, filtración de gel, o precipitación por fraccionamiento. La presente invención se dirige esencialmente a la inmunización activa mediante vacunación directa; sin embargo, también contempla la inmunización pasiva. En esta situación, los mimocuerpos de la invención se administran a un animal no humano adecuado, y los anticuerpos generados contra los mismos se aislan y se purifican, y subsecuentemente se administran a un sujeto humano para inducir el alivio de los síntomas alérgicos. Los mimocuerpos de la invención se indican para utilizarse como productos farmacéuticos, especialmente vacunas, en particular en el tratamiento de enfermedades mediadas por IgE, tales como alergia, por ejemplo asma, dermatitis atópica, formas alérgicas de eosinofilia, rinitis, urticaria crónica, y alergias a alimentos. Se debe entender que "tratamiento" comprende el tratamiento profiláctico así como curativo. El huésped es de preferencia un ser humano, pero la invención es aplicable mutatis mutandis esencialmente para cualquier mamífero, por ejemplo un gato o un perro.

Las siguientes referencias de la técnica anterior se han considerado durante el examen en la Fase Internacional en relación con esta presentación: DI Progr. Allerqy Clin. Immunol . (Proc. Int. Congress Allergol. Clin. Immunol . , 16th) 4

[1997] 339-342; D2 Int. Arch. Allergy Immunol . 118 (1999) 119-121; D3 Tumor Biology 18 (1997) Suplemento 2, 59; D4 Tanox WO 89/06138; D5 Patent Abstracts of Japan 4 (1999) [C.A. 130 (1999) 138296k] [JP 11/000174] .

Explicación de las Figuras: Figura 1: Interacción entre IgE y su receptor de alta afinidad.

Figura 2: Propiedades del anticuerpo monoclonal BSW17 anti- hlgE.

Figura 3: La red anti-idiotípica : El epítopo hlgE reconocido por BSW17, y el parátopo anti-idiotípico se indican esquemáticamente como puntos negros.

Los círculos negros indican las regiones hipervariables homologas del anticuerpo BSW17 (Abl) y de los anticuerpos policlonales 3 (Ab3), inducidos mediante inmunización con el anticuerpo anti-idiotípico Ab2.

Figura 4 : Estructura de tres mimocuerpos de BSW17 recombinantes : A: Anti-id-BSW17, clon 52 (SDS426) ; cadena ligera: (L.C.)2. (SEQ ID NO: 36) . B: Anti-id-BSW17, clon 52 (SDS427) ; Fab: FAB. (SEQ ID Nos : 35 y 36) . C: Anti-id-BSW17, clon 43 (SDS463) ; Fab: F?. (SEQ ID Nos: 37 y 38) .

Figura 5: Clones Fab anti-BSW17: secuencia de ADN de inmunoglobulina humana exhibida por el bacteriófago, y secuencia de aminoácidos deducida: Las regiones hipervariables (Regiones Determinantes de Complementariedad; CDR) están en cursivas: Figura 5a: clon 52; cadena pesada variable (SEQ ID Nos: 1 y 2) (CDRl: SEQ ID Nos: 39 y 40; CDR2 : SEQ ID Nos: 41 y 42; CDR3 : SEQ ID Nos: 43 y 44) ; Figura 5b: clon 52; cadena ligera variable (SEQ ID Nos: 3 y 4) (CDRl: SEQ ID Nos: 45 y 46; CDR2 : SEQ ID Nos: 47 y 48; CDR3 : ¡^ Mj SEQ ID Nos: 49 y 50) ; Figura 5c : clon 43; cadena pesada variable (SEQ ID Nos: 5 y 6) (CDRl: SEQ ID Nos : 51 Y 52; CDR2 : SEQ ID Nos: 53 Y 54; CDR3 : SEQ ID Nos: 55 Y 56) ; Figura 5d: clon 43; cadena ligera variable (SEQ ID Nos: 7 Y 8) (CDRl: SEQ ID Nos : 57 Y 58; CDR2 : SEQ ID Nos: 59 Y 60; CDR3 : SEQ ID Nos: 61 Y 62) .

Figura 6 : Homología de secuencia de aminoácidos entre rFab anti-BSW17 y el dominio Ce3 de IgE humana: A: Fab anti-id, clon 52, cadena pesada (hlgE, Ce3: SEQ ID NO: 25; clon 52: SEQ ID NO: 26)); Fab anti-id, clon 52, cadena ligera, alineamiento 1 (hIGE,Ce3: SEQ ID NO: 27; clon 52: SEQ ID NO: 28); Fab anti-id, clon 52, cadena ligera, alineamiento 2 (hIGE,Ce3: SEQ ID NO: 29; clon 52: SEQ ID NO: 30), respectivamente; B: Fab anti-id, clon 43, cadena pesada (hlgE, Ce3: SEQ ID NO: 31; clon 43: SEQ ID NO: 32); Fab anti-id, clon 43, cadena ligera (hlgE, Ce3: SEQ ID NO: 33; clon 43: SEQ ID NO: 34), respectivamente.

Alineamiento de secuencia de aminoácidos: los residuos idénticos se muestran en cuadros negros, los aminoácidos similares están en cuadros grises (Lipman y Mfcy-fap..----.y.^y-iüja-h.-th Pearson) . Las posiciones de los residuos Fce se indican en la parte superior de cada alineamiento. La contribución de las regiones hipervariables (CDR) y de estructura (FR) de los fragmentos Fab recombinantes, se muestran debajo de cada par de secuencias .

Figura 7: Enlace competitivo de rFab de BSW17 anti-id sobre células CHOa cebadas con IgE, con BSW17 marcado con FITC Figura 8: Enlace de inmunoglobulinas anti -mimocuerpo de BSW17 de conejo purificadas por afinidad para IgE humana: Determinación de complejos de hlgE/anti-mimocuerpo mediante ELISA de emparedado: se mezclaron preparaciones de hlgE y mimocuerpo anti-BSW17 purificado por inmunoafinidad en una concentración equimolar, y se incubaron durante la noche a 4°C. Las mezclas de incubación subsecuentemente se agregaron a pozos de la placa de microtitulación recubiertos con anticuerpo monoclonal LE27 anti-hlgE (1 microgramo/mililitro) , como anticuerpo de captura. La IgG del mimocuerpo enlazado se detectó con IgG de cabra anti-conejo conjugada con HRP: O = complejos de hIgE/SDS410; o = complejos de hIgE/SDS411.

Figura 9: Respuesta inmune del mimocuerpo anti-BSW17 en ratones Balb/c: íi». ?mA.?, X.. tf ?*i.m •j*Mj*?m*M, Mtirit?fa* " ' I s&éM&uU* U = ratón 1; • = ratón 2; T = ratón 3; A = ratón 4; * ratón 5. A: anti-id-BSW17.52; cadena ligera (SDS426) ; B: anti-id-BSW17.52; Fab (SDS427) ; C: anti-id-BSW17.43; Fab (SDS463) ; Los valores O.D. representan las lecturas de densidad óptica, corregidas para el enlace de fondo con los pozos no recubiertos . Se muestran los valores promedio de las mediciones por duplicado. Las variaciones fueron en general <0.05 O.D.

Figura 10: Inhibición de enlace de hlgE/FceRI mediante anticuerpos anti-mimocuerpos purificados por inmunoafinidad: A: U = BSW17 • = anti-clon 52; cadena ligera (SDS410) ? = anti-clon 52; Fab (SDS411) T = anti-clon 52; cadena ligera (flujo atravesado de columna) . B: M = BSW17 • = anti-clon 43; Fab (SDS476) . . > ..^....-.¡1,..,—„ ._._.._Hit_afc__Ma__a?_j_u^ta-Bri^--? Figura 11: Perfiles de calificación PCA de grupos de monos Rhesus (n = 2), inmunizados con diferentes preparaciones de mimocuerpos : A: Inmunógeno: anti-id-BSW17.52 ; cadena ligera (SDS426) ; B: Inmunógeno: anti-id-BSW17.52 ; Fab (SDS427) ; C: Inmunógeno: anti-id-BSW17.43 ; Fab (SDS463).

Reacción de anafilaxis cutánea pasiva (PCA) en la piel de mono Rhesus en diferentes puntos del tiempo después de la inmunización. Los valores de calificación PCA representan las intensidades de PCA calculadas a partir del área debajo de las curvas (AUC) generadas graficando los diámetros de los puntos de piel azul contra las concentraciones de IgE inyectadas (JW8) . Las calificaciones son los números promedio para cada grupo de dos monos inmunizados con la misma preparación de mimocuerpo, calculadas a partir de los valores de monos únicos mostrados en la Tabla 4. Las variaciones se muestran como barras de error. Los valores estadísticos P se indican arriba de las barras de error. Los puntos del tiempo de las inyecciones de refuerzo se indican debajo del eje x.

Figura 12 : Secuencias de aminoácidos completas para la cadena pesada y ligera de los tres mimocuerpos de BSW17 recombinantes: Figura 12a: Anti-id-BSW17, clon 52: dominio variable y primer dominio constante de la cadena pesada (SEQ ID NO: 35) ; Figura 12b: Anti-id-BSW17 , clon 52: dominios variable y constante de la cadena ligera kappa (SEQ ID NO: 36) ; Figura 12c : Anti-id-BSW17, clon 43: dominio variable y primer dominio constante de la cadena pesada (SEQ ID NO: 37; Figura 12d: Anti-id-BSW17, clon 43: dominios variable y constante de la cadena ligera lambda (SEQ ID NO: 38) .

El clon 52 del mimocuerpo (L.C.)2 comprende las cadenas ligeras de las Figura 12b (SEQ ID NO: 36) , enlazadas por puentes de disulfuro, como se indica en la Figura 4A. El clon 52 de Fab del mimocuerpo comprende la cadena ligera de la Figura 12b (SEQ ID NO: 36) , y la cadena pesada de la Figura 12a (SEQ ID NO: 35), enlazadas por puentes de disulfuro, como se indica en la Figura 4B. El clon 43 de Fab del mimocuerpo comprende la cadena ligera de la Figura 12d (SEQ ID NO: 38) , y la cadena pesada de la Figura 12c (SEQ ID NO: 37) , enlazadas por puentes de disulfuro, como se indica en la Figura 4C. Los siguientes ejemplos ilustran la invención, y no son limitantes. Las temperaturas están en grados Celsius. Se utilizan las siguientes abreviaturas: anti-id = anti-idiotípico; ABTS = [sulfonato de 2 , 2 ' -azinodi (3-etil-benzotiazoli- na) ] ; BSA = albúmina de suero bovino; BSW17 anticuerpo monoclonal de ratón anti-IgE humana; específico de Ce3; CDR regiones determinantes de complementariedad; Ce3 tercer dominio de la región constante de cadena pesada de IgE; Ce4 cuarto dominio de la región constante de cadena pesada de IgE; CeE péptido mimótopo que imita la región del epítopo Ce3 de BSW17; CeM Péptido mimótopo que imita la región del epítopo Ce4 de BSW17; cfu unidades formadoras de colonias; ELISA ensayo inmunosorbente enlazado con enzima; Fab fragmento de anticuerpo que carece de las regiones constantes de cadena pesada 2 y 3 ; FceRI; IgERI receptor de alta afinidad para IgE; FceRIa receptor de alta afinidad para IgE, cadena OÍ; FCS suero fetal de becerro; FR regiones de estructura; FITC conjugado con isotiocianato de fluoresceína; HRP peroxidasa de rábano; HSA albúmina de suero humano; (h)IgE inmunoglobulina E (humana) ; mAb anticuerpo monoclonal; MNC células mononucleares; r-*"'-rflffpt 'H "T" •' NIP = ácido 3-nitro-4-hidroxi-yodofenil-acético; p.c. = policlonal; Phab = fragmentos Fab que exhiben el fabo (bacteriófago que expresa Fab) ; PBS = salmuera regulada con fosfato; PCA = anafilaxis cutánea pasiva; PWM = mitógeno de hierba carmín; r = recombinante; RT = temperatura ambiente; SPR = resonancia de plasmón superficial .

Ejemplo 1; Construcción de bibliotecas de exhibición de fagos a) Fuente de linfocitos Se utilizaron dos donadores adultos masculinos para preparar células mononucleares (MNC) a partir de sangre periférica. Un primer donador masculino adulto atópico, que tenía síntomas clínicos de alergia, se reforzó con una inyección intramuscular de 0.5 mililitros de toxoide de tétanos adsorbido en alum (Te Anatoxal Bern, Swiss Serum and Vaccine Institute, Berna, Suiza) . Las células mononucleares se aislaron 7 días después utilizando centrifugación en gradiente Ficoll (Lymphoprep, Pharmacia, Milwaukee, Wl , EUA), y luego se cultivaron durante 3 días en un medio RMPI-1640 (Seromed, at-l?-t-fc-hj-frt.l- ^«l-JÉfa-.-.^ -My-j Basilea, Suiza) conteniendo 103 unidades/mililitro de IL-2 (Sigma, St-Louis, MO, EUA) , 50 microgramos/mililitro de células Pansorbin (cepa 1 Cowan de Staphylococcus aureus, Calbiochem, La Jolla, CA, EUA), y toxoide de tétanos diluido a 1:1000 en un medio RMPI-1640. Luego se preparó ARN total a partir de estas células, utilizando un procedimiento de isotiocianato de guanidinio con fenol -cloroformo (Chomczynsi, P. y Sacci, N. , Anal. Biochem. 162

[1987] 156) . El segundo donador masculino adulto, un donador Rhesus D hiperinmune, recibió un refuerzo intravenoso de 2 mililitros de glóbulos rojos sanguíneos empacados a partir de un donador masculino conocido del grupo sanguíneo O RhD+ . Las células mononucleares se aislaron mediante centrifugación en gradiente Ficoll a los +18 días después del refuerzo. Las células se cultivaron primero durante 3 días en un medio RPMI-1640 conteniendo 103 unidades/mililitro de IL-2, y 10 microgramos/mililitro de mitógeno de hierba carmín (PWM; Sigma L9379, Buchs, Suiza) antes de extraer el ARN . Se obtuvieron muestras de amígdala humana de tres niños amigdalectomizados . Las amígdalas se maceraron en un medio RPMI-1640 en cajas de Petri estériles, y se cortaron en pequeños pedazos. El tejido, las células, y el medio se transfirieron entonces a tubos estériles, y se dejó asentar el desecho de tejido, y las células mononucleares se aislaron del sobrenadante utilizando centrifugación en gradiente Ficoll. Las células B se seleccionaron incubando las células mononucleares con perlas paramagnéticas recubiertas con CD19, y luego se preparó el ARN de acuerdo con el procedimiento de isotiocianato de guanidinio con fenol-cloroformo mencionado anteriormente. El vector pComb3 utilizado para la clonación de las cadenas para todos los mimocuerpos, se obtuvo en Scripps Research Institute La Jolla, CA, EUA (Barbas III, C.F. y Lerner, R.A. , Companion Methods Enzymol . 2

[1991] 119). La cepa XLl-Blue de Escherichia coli utilizada para la transformación del vector pComb3 y el fago auxiliar VCSM13 se adquirieron en Stratacyte (La Jolla, CA, EUA) . b) Construcción de bibliotecas de bacteriófagos Se construyeron tres bibliotecas separadas: la primera denominada BS a partir de las células mononucleares aisladas del primer donador masculino atópico, la segunda denominada LD2 a partir de las células mononucleares cosechadas a los +18 días después del refuerzo intravenoso del segundo donador masculino, y la tercera denominada CT a partir de la población enriquecida con células B de células mononucleares aisladas de amígdalas de niños. El ARN total se preparó a partir de estas células utilizando el método de isotiocianato de guanidinio con fenol-cloroformo. A partir de este ARN, se utilizaron 10 microgramos para hacer el AD?c utilizando un cebador oligo (dT) (400 nanogramos), y se transcribió inversamente con transcriptasa inversa M-MuLV de acuerdo con las condiciones especificadas por el proveedor (Boehringer Mannheim, Alemania) . Se realizó amplificación con reacción en cadena de la polimerasa como se describe en Vogel, M. y colaboradores, E. J. of Immunol . 24 (1994) 1200. Dicho de una manera breve, 100 microlitros del medio de reacción en cadena de la polimerasa contenían regulador Perkin-Elmer con MgCl2 10 M, 5 microlitros de ADNc, 150 nanogramos de cada cebador 5' y 3' apropiado, los cuatro dNTP a 200 µM cada uno, y 2 unidades/mililitro de polimerasa Taq (Perkin Elmer, NJ, EUA) . La amplificación con reacción en cadena de la polimerasa de las cadenas pesada y ligera de la molécula Fab se realizó por separado con un conjunto de cebadores de Stratacyte (los detalles se dan más adelante) . Para la cadena pesada, se utilizaron seis cebadores corriente arriba que se hibridan en cada una de las seis familias de los genes VH, mientras que se utilizó un cebador de cadena kappa y un cebador de cadena lambda para las cadenas ligeras. Los cebadores corriente abajo se diseñaron para acoplarse con la región de articulación de los dominios constantes Yl y Y3 para la cadena pesada. Para la cadena ligera, los cebadores corriente abajo se acoplaron con el extremo 3' de los dominios constantes kappa y lambda. Los productos de la reacción en cadena de la polimerasa, de cadena pesada y ligera, se agruparon por separado, se purificaron en gel, y se cortaron con enzimas de restricción Xhol/Spel y Sacl/Xbal (Boehringer Mannheim, Alemania), respectivamente. Después de la digestión, los productos de la reacción en cadena de la polimerasa se extrajeron una vez con fenol : cloroformo: alcohol isoamílico, y se purificaron mediante separación del gel. La inserción del fragmento Fd digerido con Xhol/Spel, y el ligamiento subsecuente de la cadena ligera digerida con Sacl/Xbal en el vector pComb3 , la transformación en células XLl-Blue, y la producción de fagos, se realizaron como se describe en Barbas III, C.F., y Lerner, R.A. , Companion Methods Enzymol . 2

[1991] 119. Después de la transformación de las células XLl-Blue de E. coli , se retiraron muestras y se titularon en placas para determinar el tamaño de la biblioteca. Estos resultados indicaron bibliotecas de expresión de 1 x 107, 7.7 x 106, y 3 x 106 cfu (unidades formadoras de colonias) para BS, LD2, y CT, respectivamente. c) Cebadores de reacción en cadena de la polimerasa VHI 5' -CAC TCC CAG GTG CAG CTG CTC GAG TCT GG-3' (SEQ ID NO: 9) ; VHII 5' -GTC CTG TCC CAG GTC AAC TTA CTC GAG TCT GG-3' (SEQ ID NO: 10) VHIII5'-GTC CAG GTG GAG GTG CAG CTG CTC GAG TCT GG-3' (SEQ ID NO: 11) VHIV 5' -GTC CTG TCC CAG GTG CAG CTG CTC GAG TCG GG-3' (SEQ ID NO: 12) VHV 5' -GTC TGT GCC GAG GTG CAG CTG CTC GAG TCT GG-3' (SEQ ID NO: 13) VHVI 5' -GTC CTG TCA CAG GTA CAG CTG CTC GAG TCA GG-3' tj^tt ^üÜÉ g (SEQ ID NO: 14);' * CHI ((I) 5' -AGC ATC ACT AGT ACA AGA TTT GGG CTC-3' (SEQ ID NO: 15) ; VL(6)5'- GT GCC AGA TGT GAG CTC GTG ATG ACC CAG TCT CCA-3' (SEQ ID NO: 16) ; CL(6)5'- T CCT TCT AGA TTA CTA ACA CTC TCC CCT GTT GAA GCT CTT TGT GAC GGG CGA ACT C-3' (SEQ ID NO: 17) ; VL(()5'- C TGC ACA GGG TCC TGG GCC GAG CTC GTG OTG ACT CA-3' (SEQ ID NO: 18) ; CL(()5'- G CAT TCT AGA CTA TTA TGA ACA TTC TGT AGG GGC-3' (SEQ ID NO: 19) . Ejemplo 2: Selección de fragmentos de anticuerpos específicos de BSW17 recombinantes (mimocuerpos de BSW17) a partir de bibliotecas de fagos La selección de los fagos específicos de BSW17 se realizó efectuando cuatro rondas de paneo. Cada ronda comprendió dos preabsorciones sobre el mAb Le27 anti-IgE antes de la absorción sobre el mAb BSW17 anti-IgE. La preabsorción se realizó como sigue: se recubrieron dos inmunotubos (Maxisorp, Nunc) con 4 mililitros de Le27 (20 microgramos/mililitro) durante la noche a 4°C, y luego se bloquearon durante 2 horas a 37°C con 4 mililitros de suero regulado con fosfato/leche descremada al 2 por ciento. Un primer tubo se incubó en una sub- y sobre-tornamesa a temperatura ambiente durante 30 minutos con 4 mililitros de solución bloqueadora conteniendo 2 x 1012 unidades formadoras de colonias de cada biblioteca de fagos (BS, LD2 , y CT) . Luego los fagos se transfirieron al segundo tubo, y el proceso se repitió una vez. Después de la segunda preabsorción, se agregaron los fagos no específicos de Le27 a un tubo recubierto con 4 mililitros de BSW17 (20 microgramos/mililitro) , y se bloquearon con suero regulado con fosfato/leche descremada al 2 por ciento como se describió anteriormente. Después de la incubación durante 2 horas a temperatura ambiente sobre una sub- y sobre-tornamesa, el tubo se lavó sucesivamente 10 veces con suero regulado con fosfato/Tween al 0.1 por ciento, y 10 veces con suero regulado con fosfato. Los fagos adherentes se eluyeron sucesivamente con, primero, 500 microlitros de trietilamina 0.1M, y luego después de tres veces de enjuague en suero regulado con fosfato, con 500 microlitros de HCl 0. ÍM ajustado a un pH de 2.2 con glicina, y conteniendo 1 miligramo/mililitro de albúmina de suero bovino. Cada paso de elución se realizó durante 10 minutos a temperatura ambiente, y los fagos eluidos se neutralizaron con 250 microlitros de Tris.Cl ÍM, pH de 7.4, y 30 microlitros de base de Tris 2 M, respectivamente. Los fagos seleccionados se amplificaron utilizando células XLl-Blue de E. coli como se describe en Barbas y Lerner, supra (1991) , antes de utilizarse subsecuentemente en tres rondas más de paneo. Después de cada ronda de paneo, se monitoreó la titulación de los fagos eluidos mediante determinación de unidades formadoras de colonias (Tabla 2) : Tabla 2 Enriquecimiento de Phabs específicos de BSW17 mediante rondas consecutivas de paneo Por cada ronda de paneo, se preabsorbieron 6 x 1012 partículas de fago dos veces en tubos recubiertos con 20 microgramos/ - mililitro de Le27, seguido por incubación en un tubo recubierto con 20 microgramos/mililitro de BSW17.

Ejemplo 3: Secuencia de nucleótidos de mimocuerpos de BSW17 recombinantes Se preparó ADN de plásmido a partir de los clones de fagos seleccionados utilizando un estuche Nucleotrap (Machery-Nagel, Duren, Alemania), y se realizó el secuenciamiento del ácido nucleico en un sistema de secuenciamiento ABI 373A, utilizando un PRISM Ready Reactin DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Alemania). Los cebadores utilizados para ei secuenciamiento de la secuencia de cadena pesada fueron: ^j "' ' ' e * "-HM Iiir f^-^*—— ^-. É^^-*^^-^..

CHY1 (5' -CGCTGTGCCCCCAGAGGT-3' ) (SEQ ID NO: 20), y pCH (5' -GGCCGCAAATTCTATTTCAAGG-3' ) (SEQ ID NO: 21).

Para obtener las secuencias de cadena ligera, se utilizaron los siguientes cebadores: C? (5 ' -GAGACACACCAGTGTGGC-3 ' ) (SEQ ID NO : 22), CK (5' -CACAACAGAGGCAGTTCC-3' ) (SEQ ID NO: 23), y pCL (5' -CTAAACTAGCTAGTCGCC-3' ) (SEQ ID NO: 24).

Los cebadores fueron sintetizados por Microsynth (Balgach, Suiza) . A partir de las secuencias de ADN de una selección de varios clones de fago, se dedujeron dos secuencias de aminoácidos diferentes para las cadenas pesada y ligera del anticuerpo recombinante específico de BSW17 (clon 52, clon 43). Las secuencias y su asignación a las regiones hipervariables (CDR) y las secuencias de estructura, se muestran en las Figuras 5a a 5d (SEQ ID Nos: 1 a 8) . El alineamiento de las secuencias de aminoácidos de los fragmentos de anticuerpos recombinantes específicos de BSW17 exhibido por los clones 52 y 43 con la IgE humana, revela homologías con estiramientos del dominio Ce3 humano que está involucrado en el enlace con el receptor de alta afinidad (Figura 6) (SEQ ID Nos: 25 a 34) . Por consiguiente, los parátopos exhibidos por los fragmentos de anticuerpos recombinantes imitan estructuras definidas presentes en la IgE humana ("mimocuerpos"). Por consiguiente, los anticuerpos generados en pacientes alérgicos mediante vacuna con estos mimocuerpos recombinantes reconocerán la IgE humana, e impedirán las reacciones alérgicas mediante la inhibición del <- enlace de IgE/IgERI.

Ejemplo 4: Preparación y purificación de mimocuerpos de BSW17 recombinantes Se generaron mimocuerpos solubles derivados a partir 0 de los clones de fago 43 y 52 (Figura 5) (SEQ ID Nos: 1 a 8) . Con el objeto de producir fragmentos Fab solubles, se removió la secuencia gilí que codifica la proteína de cola pIII de la partícula de fago, y fue reemplazada por una marca de hexahistidina para facilitar la purificación del fragmento Fab mediante cromatografía por afinidad con quelato de Ni+. El ADN del fagémido se preparó utilizando un estuche Nucleotrap (Macherey-Nagel, Duren, Alemania) , y se digirió con SPel y Nhel . El fragmento de ADN de 4.7 kb que carecía de la porción gilí, se trató con fosfatasa alcalina, y se purificó o mediante electroforesis en gel de agarosa. El ADN linearizado se ligó con un fragmento de ADN que codificaba seis histidinas en los extremos 5' y 3' de los sitios de restricción Spel y Nhel, respectivamente. Después del ligamiento, el ADN se transformó en células XLl-Blue de E. coli , y se seleccionaron 5 los clones individuales que producían mimocuerpos solubles. Uno de estos clones se seleccionó para la purificación a gran escala, y se cultivó en 1 litro de SB (Súper Caldo) conteniendo 50 microgramos/mililitro de carbenicilina a 37 °C, a una OD de 1.0 a 600 ñamómetros . Luego se indujo el cultivo con ß-D-tiogalactopiranosida de isopropilo lmM (IPTG) (Biofinex, Praroman, Suiza) , y se cultivó durante 4 horas a 37°C. Las bacterias se granularon a 6000 rpm durante 20 minutos a 4°C, se volvieron a suspender en 30 mililitros de regulador de sonicación (NaP0 0.1M, urea 8M, pH de 8.0), y subsecuentemente se sonicaron sobre hielo. Luego se removieron los componentes insolubles mediante centrifugación a 15,000 rpm durante 30 minutos a 4°C, y el sobrenadante que contenía Fab se purificó sobre una columna de 1 mililitro de nitriloacetato de níquel. La columna se lavó con el regulador de sonicación para remover los contaminantes, seguido por dos pasos de elución con el regulador de sonicación a un pH de 5.1 y de 4.9, respectivamente. Las fracciones se monitorearon a una OD de 280 nanómetros, y las alícuotas se analizaron mediante SDS-PAGE (no reductor al 12 por ciento) para confirmar la pureza e identidad del mimocuerpo. Luego se agruparon las fracciones que contenían los mimocuerpos, se concentraron, y se dializaron contra suero regulado con fosfato. La pureza de las preparaciones de mimocuerpo finales (como se especifican en las Figuras 4 y 12) (SEQ ID Nos: 35, 36, 37, 38) se evaluó ensayando una muestra mediante SDS-PAGE. de proteína se detectaron mediante teñido con azul La concentración se determinó comparando la banda de mimocuerpo teñida con azul Coomassie con cantidades conocidas de una proteína estándar (albúmina de suero bovino) , y también mediante espectrofotometría. Estas preparaciones de mimocuerpo se utilizaron subsecuentemente para el ensayo de enlace competitivo, y para la inmunización de conejos.

Ejemplo 5: Inhibición del desplazamiento mediado por BSW17 0 de la IgE enlazada con receptor, mediante mimocuerpos de BSW17 recombinantes BSW17 reconoce y desplaza la IgE enlazada con su receptor de alta afinidad. Con el objeto de determinar que los fragmentos rFab de BSW17 anti-id son capaces de inhibir esta 5 reacción de desplazamiento, se realizó un ensayo de enlace competitivo utilizando IgE unida a IgERI expuesta a la superficie celular. Se utilizó una línea celular de ovario de hámster chino recombinante (CHO) , establemente transfectada con ADN que codificaba la cadena alfa de IgERI humana para el ensayo [línea celular CHOa; Blank, U. y colaboradores, Eur. J. Biol. Chem. 266 (1991) 2639] . Una serie de muestras de prueba que contenían 5 x 104 células CHOa se incubaron en regulador FACS (suero regulado con fosfato, albúmina de suero bovino al 0.3 por ciento, NaN3 al 0.02 por ciento) con 48 nanogramos de hibridoma Bll de IgE (Zürcher, A.W. y colaboradores, Immunol .

Lett . 46 (1995) 49-57] durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después de lavar una vez con regulador FACS, cada muestra se incubó durante 15 minutos a temperatura ambiente con complejos preformados de BSW17 conjugado con isotiocianato de fluoresceína (BSW17-FITC) , y cantidades crecientes de rFabs de BSW17 anti-id. Los complejos se prepararon como sigue: se incubaron 50 microlitros de BSW17-FITC en una concentración de 1.13 nM, con diferentes cantidades de rFabs de BSW17 anti-id (40 nM; 200 nM; 1 µM; 4 µM; y 40 µM) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Una muestra de control que contenía solamente las células CHOa se incubó durante 15 minutos a temperatura ambiente con BSW17-FITC para la determinación del enlace no específico. Las células CHOa se lavaron una vez con regulador FACS, y después de la adición de 100 microlitros de regulador FACS, las células se analizaron en un citómetro de flujo FACSCalibur (Becton Dickinson) equipado con un dispositivo de láser de argón sintonizado a 488 nanómetros. Las compuertas en la mancha de puntos de dispersión delantera/dispersión lateral se establecieron alrededor de las células monoméricas, y la fluorescencia se cuantificó y se expresó como fluorescencia de canal promedio (mcf) . El porcentaje de células positivas se calculó como el porcentaje de BSW17 que se enlazó con células CHOa. Como se ve en la Figura 7, el enlace de BSW17 con células CHOa disminuyó al incrementar las concentraciones de fragmentos Fab de BSW17 -!£-£»£-.! anti-id, indicando que los dos clones Fab de BSW17 anti-id eran capaces de inhibir el enlace de BSW17 con IgE.

Ejemplo 6: Inmunización de conejos con mimocuerpos de BSW17 recombinantes Este ejemplo muestra que la inmunización con rFab anti-BSW17 (consistente en cadena pesada más ligera del clon 52, como se muestra en la Figura 4B, junto con las Figuras 12a y 12b) (SEQ ID Nos: 35 y 36), o bien con el mimocuerpo recombinante consistente en solamente la cadena ligera (Figura 4A junto con Figura 12B) (SEQ ID NO: 36) , induce en conejos una respuesta inmune humoral que reacciona cruzadamente con la IgE humana. A dos conejos hembras blancos Nueva Zelanda se les dio una inmunización primaria subcutáneamente con 300 microgramos/ mililitro de rFab anti-BSW17 o fragmento de cadena ligera del clon 52, emulsionado a 1:1 en adyuvante completo de Freund, y luego se reforzaron tres veces con la misma cantidad del mimocuerpo emulsionado a 1:1 en adyuvante incompleto de Freund cada dos semanas . Los sueros se recolectaron en el día 0 (presangrado) , y los animales se sangraron 7 días después de la última inyección. Los sueros inmunes de conejo se purificaron mediante cromatografía por inmunoafinidad utilizando IgE humana (SUS-11 IgE) , químicamente reticulada con columnas de Sepharose 4B . Mediante este procedimiento, se puede aislar la fracción anti- ___t__ __í_f d ?^^**f ft^m...r<*fftf.*.?«...,..,Ji.^^^.l-,^-tfAi1 Sí- hlgE de las inmunoglobulinas totales, permitiendo una caracterización precisa de la respuesta inmune terapéuticamente pertinente con respecto a las titulaciones de anticuerpos y a la afinidad. La purificación por inmunoafinidad de los anticuerpos anti-mimocuerpo que reaccionan cruzadamente con la IgE humana, consistió en dos pasos. En el primer paso, se aisló la fracción IgG del antisuero de conejo mediante precipitación con sulfato de amonio, y en el segundo paso, los anticuerpos anti-io mimocuerpo de BSW17 específicos de hlgE se enlazaron con IgE humana (SUS-11 IgE) , se acoplaron covalentemente con CH- Sepharose 4B, seguido por elución, diálisis, y concentración. La formación del complejo dependiente de la concentración de las inmunoglobulinas purificadas por 15 inmunoafinidad con IgE humana en solución, se confirmó mediante ELISA: la SUS-11 IgE se incubó con cantidades equimolares de inmunoglobulinas anti-mimocuerpo durante la noche a 4°C. Los complejos formados en solución se agregaron a pozos de la placa de microtitulación, que se habían recubierto con el anticuerpo 0 monoclonal LE27 anti-hlgE como anticuerpo de captura. La IgE anti -mimocuerpo enlazada se detectó con IgG-HRP policlonal anti-conejo. Los resultados se muestran en la Figura 8.

Ejemplo 7: Inmunización de ratones con mimocuerpos de BSW17 5 recombinantes Los mimocuerpos recombmantes derivados a part.¿ tanto del clon 43 como del clon 52, pueden inducir anticuerpos anti-mimocuerpo. Se realizaron inmunizaciones en ratones. Los grupos de cinco ratones Balb/c se inyectaron subcutáneamente con 5 microgramos por ratón de mimocuerpos de BSW17 recombinantes que se habían producido en bacterias E. coli , y se purificaron mediante cromatografía por afinidad con níquel. Se utilizó hidróxido de aluminio como adyuvante: El Grupo 1 se inmunizó con el lote SDS426 = anti-Id-BSW17.52; cadena ligera. El Grupo 2 se inmunizó con el lote SDS427 = anti-id-BSW17.52; Fab. El Grupo 3 se inmunizó con el lote SDS463 = anti-Id-BSW17.43; Fab. En los días 21 y 41 después de la inmunización primaria, se administraron dos inyecciones de refuerzo (5 microgramos por ratón) . Se tomaron muestras de sangre en los días 0, 20, 28, 35, 42, 49, y 56 después de la inmunización primaria. El suero se preparó y se sondeó para determinar la presencia de los anticuerpos anti-mimocuerpo mediante ELISA. Los pozos de la placa de microtitulación se recubrieron con 1 microgramo/mililitro de IgG humana policlonal, y se incubaron con suero de ratón diluido a 1:50, preparado a partir de muestras de sangre tomadas en los puntos del tiempo indicados, después de la inmunización primaria. Los anticuerpos anti -mimocuerpo enlazados (ahlgG, dirigida contra las regiones humanas de estructura y de dominio constante) se detectaron mediante una segunda incubación con IgG de cabra anti-ratón conjugada con peroxidasa de rábano (gamlgG-HRP) . La reacción de color se reveló utilizando un sustrato cromogénico ABTS. Todos los ratones produjeron anticuerpos anti- mimocuerpo después del segundo refuerzo con todas las preparaciones de mimocuerpos recombinantes (Figura 9) .

Ejemplo 8: Las inmunoglobulinas generadas en conejos contra mimocuerpos de BSW17 recombinantes, se enlazan con la IgE humana con una alta afinidad En la presente se muestra que la vacunación con los mimocuerpos de BSW17 recombinantes para inducir una respuesta inmune humoral con una alta afinidad para la IgE humana. Los parámetros cinéticos representativos del enlace de las inmunoglobulinas anti-mimocuerpo purificadas por inmunoafinidad para la IgE humana se analizaron mediante resonancia de plasmón superficial (SPR) . Las mediciones de resonancia de plasmón superficial se realizaron en un instrumento BIAcore (Biacore, Uppsala, Suecia) . Se prepararon superficies de enlace específico mediante el acoplamiento de IgE humana o de IgG3 de murino a un chip sensor CM5 utilizando acoplamiento de amina de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Utilizando este procedimiento, las biomoléculas se unen por medio de los grupos amino primarios con la superficie de dextrano ca boxi etilada del chip sensor. Se acoplaron 10 picomoles de IgE de mieloma humano ó IgE SUS-11, para separar las celdas de flujo del chip. El mAb de IgG3 de murino, ABL 364 (ATCC HB 9324) se inmovilizó en una pista separada del mismo chip sensor. El ABL 364 se utilizó como una referencia para determinar el enlace de los anticuerpos anti-mimocuerpo con las estructuras de inmunoglobulina que no eran de hlgE, y para corregir los posibles cambios del índice de refracción ocasionados por los cambios de regulador del pH. Las densidades de acoplamiento fueron de aproximadamente 13,000 RU. Todas las interacciones biomoleculares medidas en el instrumento BIAcore se realizaron a 25 °C, utilizando HBS (Hepes 10 mM, pH = 7.4, NaCl 150 mM, EDTA 3.4 mM, y 0.005 por ciento por volumen/volumen de tensoactivo P-20) como el regulador de flujo continuo. El rango de concentración de cada analito pasado sobre la superficie del chip sensor para el análisis cinético fue de 33 nM a 499 nM. La velocidad de flujo fue de 5 icrolitros/minuto. Los analitos se inyectaron durante 1200 segundos, seguidos por HBS durante aproximadamente 1800 segundos, para monitorear la disociación del analito enlazado.

El chip se regeneró con un impulso de 120 segundos de HCl 10 mM. El enlace no específico se monitoreó pasando los analitos sobre la pista de control de ABL 364, para sustraerse del enlace específico antes del análisis cinético. Las curvas de enlace generadas mediante las mediciones de resonancia de plasmón superficial se analizaron utilizando el paquete de análisis BIAevaluation 3.0. Para una comparación relativa de las interacciones de anti-mimocuerpo/IgE, se utilizó un modelo monofásico. Se calcularon las constantes de índice de asociación ka, las constantes de índice de disociación k<_., y las constantes de disociación en equilibrio KD = 1/KA (KA = constante de afinidad) por cada curva, y se resumen en la Tabla 3: Tabla 3 Constantes cinéticas (SPR/BIAcore) de la interacción entre las preparaciones de Ig anti-mimocuerpo de conejo policlonal (p.c.) y hlgE 0 a = anti- 1)es decir anti-SDS426. n.d. = no determinado. 2)es decir anti-SDS427. 3>es decir anti-SDS463.

Parece que los anticuerpos de alta afinidad contra la IgE humana podrían inducirse en conejos inmunizados con mímocuerpos de BSW17 recombinantes (valores KD en el rango nanomolar). El Fab derivado del clon 43 (SDS463; Figura 4C; anti-id-BSW17.43) tiene la capacidad para inducir una respuesta k^^^i^At^t?^^tíum ^^^^ ^^^^É^^^ inmune de muy alta afinidad para la IgE humana (KD <1 nM) . Por consiguiente, mediante la utilización de un anticuerpo anti-idiotípico monoclonal, fue posible inducir una fuerte respuesta policlonal contra la IgE, como era pretendido por la estrategia de vacunación humana.

Ejemplo 9: Las inmunoglobulinas generadas en conejos contra mimocuerpos de BSW17 recombinantes inhiben el enlace de la IgE humana con su receptor de alta afinidad Para ser activa como una vacuna antialérgica, se espera que la formación del complejo entre los anticuerpos anti-mimocuerpo y hlgE impida que se enlace la IgE con su receptor de alta afinidad. La región del epítopo Ce3 Val (370) -Gly(379) en el estiramiento Val (370) -Asn (383) (Figura 6) (SEQ ID NO: 25), que muestra la homología de la secuencia de aminoácidos con la CDR del mimocuerpo de BSW17, está involucrada en el enlace del receptor de alta afinidad. Por consiguiente, se espera que los anticuerpos específicos de IgE reproducidos contra los mimocuerpos de BSW17 recombinantes ejerzan su efecto terapéutico mediante la inhibición del enlace de la IgE con su receptor de alta afinidad, mediante el bloqueo del dominio de enlace. Para confirmar esto, se probaron los anticuerpos anti-mimocuerpo purificados obtenidos de conejos inmunizados, para determinar la inhibición del enlace de hlgE/FceRIa en un ELISA de competencia. Como una lectura >,•* ' . : üe& jÉ " pertinente a la enfermedad, se midió la IgE libre por su capacidad para enlazarse con FceRIa recombinante (proteína de fusión doble Rla-HSA-RIa; DFP) (Figura 10) . La hlgE (SUS-11; 1 microgramo/mililitro en la Figura 5 10A, y 0.1 microgramos/mililitro en la Figura 10B) se preincubó durante 16 horas a +4°C con cantidades crecientes de ínmunoglobulinas anti-mimocuerpo ó mAb BSW17 como una referencia. Las inmunoglobulinas en volumen presentes en el flujo atravesado de la columna de inmunoafinidad de la 10 preparación SDS410 se incluyeron como un control negativo. Los complejos formados se agregaron a los pozos de la placa de microtitulación recubiertos con 1 microgramo/mililitro del anticuerpo LE27 anti-IgE como un anticuerpo de atrape, y se incubaron con proteína de fusión doble FceRI-HSA-FceRIa (DFP) 15 marcada con peroxidasa de rábano durante 1 hora a 37 °C. La DFP enlazada se detectó con un sustrato cromogénico. Los valores O.D. se expresan como porcentaje de enlace. El enlace con la IgE SUS-11 sin competidor se estableció como el 100 por ciento. Se muestran los valores promedio de las mediciones hechas por 2o duplicado. Las variaciones fueron en general menores del 2 por ciento. Los resultados muestran que la inmunización con mimocuerpos de BSW17 da como resultado la generación de anticuerpos anti-hlgE de alta afinidad específicos en roedores. 25 Estos anticuerpos anti-mimocuerpo inhiben el enlace de IgE con su receptor de alta afinidad in vi tro, indicando el valor de la estrategia de vacunación con el mimocuerpo de BSW17 para el desarrollo de la vacuna antialérgica.

Ejemplo 10: Inhibición de anafilaxis cutánea pasiva mediante vacunación de monos Rhesus con mimocuerpos de BSW17 recombinantes Se puede utilizar la inhibición de anafilaxis cutánea pasiva (PCA) en monos para probar la actividad antialérgica de los compuestos in vivo . La vacunación con el mimocuerpo da como resultado la inhibición de reacciones anafilácticas de la piel en monos Rhesus. Se inyectaron grupos de dos monos subcutáneamente con 500 microgramos por animal de mimocuerpos anti-BSW17 recombinantes. Después de la inmunización primaria, se administraron dos inyecciones de refuerzo. Aproximadamente 10 días después de cada refuerzo, se realizaron pruebas de anafilaxis cutánea pasiva. Los monos VI 91, VI 92, VI 93, y VI 95 se probaron para determinar la reacción de anafilaxis cutánea pasiva una vez más tres meses después de la última inyección de refuerzo. El esquema de inmunización se resume en la siguiente Tabla 1 : Tabla 1 Los monos Rhesus previamente tratados con pequeñas dosis de clorhidrato de cetamina (10-15 miligramos/kilogramo, intramuscular) (Ketalar®, Parke Davis, Gran Bretaña) para mantenerlos inmovilizados, recibieron inyecciones i.c. de varias dosis de IgE (JW8) (Serotec, Oxford, Reino Unido) en la piel del abdomen. La IgE (JW8) es un anticuerpo quimérico que consiste en una parte de enlace de antígeno de ratón específica para el hapteno NIP, y una cadena pesada de Fce humana. Se inyectaron cantidades crecientes (0, 2, 10, 50, 250 nanogramos/mililitro de suero) de IgE (JW8) en una serie cefalocaudal, con una aguja calibre 30, en un volumen de 100 microlitros. Dos horas después, se administraron 25 miligramos de NIP conjugada con albúmina de suero bovino intravenosamente por animal . Los animales se sedaron nuevamente después del estímulo intravenoso con el conjugado de NIP-BSA. Para la visualización de la reacción de la piel, se inyectó intravenosamente tinte azul Evans (al 1 por ciento, 0.5 mililitros/kilogramo) inmediatamente después del estímulo con el antígeno. Las reacciones de la piel se leyeron 20 minutos después de la inyección del antígeno, midiendo dos diámetros de la mancha azul, y calculando su promedio en milímetros. La PCA se probó en los puntos del tiempo indicados después de la inmunización primaria y del refuerzo. La intensidad de la PCA se calculó a partir del área debajo de las curvas (AUC) generadas mediante la graficación de los diámetros de las áreas de piel azules contra las concentraciones de IgE inyectadas (JW8) . Las calificaciones de PCA mostradas en la Tabla 4 para cada mono representan los valores AUC calculados : Tabla 4 Efecto de la vacunación con el mimocuerpo de BSW17 sobre la jmmddC^. t ^íl anafilaxis cutánea pasiva en monos Rhesus B 1)Calificaciones de PCA calculadas a partir del área debajo de las curvas (AUC) generadas mediante graficación de los diámetros de las áreas de piel azules contra las concentraciones de IgE inyectadas (JW8) como se describió anteriormente (77) . 2> Intensidad de PCA en relación con los valores antes de la inmunización. PCA en el día 0 = 100 por ciento.

Tomando las calificaciones de PCA antes de la inmunización individuales (valores en el día 0) como una referencia, todos los monos respondieron a la vacunación con el mimocuerpo de BSW17 con una reducción de la intensidad de PCA. Se obtuvieron los mejores resultados con la construcción de la cadena ligera del clon 52 (SDS426) (Figura 4A) , con índices de inhibición del 60 al 83 por ciento (calificaciones de PCA 40 y 17) . Los monos inmunizados con Fab del clon 52 (lote SDS427) (Figura 4B) suprimieron la PCA por el 55 al 65 por ciento (calificaciones de PCA 45 y 35) . Se observó una inhibición de PCA un poco más baja desde el 18 hasta el 38 por ciento (calificaciones de PCA 82 y 62) con el Fab del clon 43 (lote SDS463) (Figura 4C) , a pesar de su superioridad sobre los mimocuerpos del clon 52 con respecto al enlace de BSW17 y la inducción anti-hlgE de alta afinidad en conejos. En seguida del protocolo de vacunación, la vacunación con los mimocuerpos del clon 52 llegó a ser efectiva después de la tercera inyección de refuerzo (excepto el mono VI92) , y todavía se observó una supresión de PCA parcial más de tres -M .Í *?^. i. ? ?.ik *k meses después. En contraste, el Fab del clon 43 fue efectivo después de la segunda inyección de refuerzo, mientras que un tercer estímulo de mimocuerpo no tuvo efecto alguno. El perfil de calificación de PCA promedio para cada grupo de dos monos inmunizados con la misma preparación de mimocuerpo, calculado a partir de los valores de un solo mono de la Tabla 4, se muestra en la Figura 11. Un resultado de PCA positivo en los monos vacunados (en relación con las calificaciones antes del tratamiento individuales o en relación con los animales de control no tratados) , es una indicación clara de la eficacia de la vacunación con mimocuerpo, y prueba la validez de su concepto mecánico. La vacunación de monos Rhesus con mimocuerpos BSW17 recombinantes da como resultado la generación de anticuerpos anti-IgE humana de alta afinidad, que inhiben la PCA in vivo .

LISTADO DE SECUENCIAS <110> Novartis AG <120> ANTICUERPOS ANTI-IDIOTÍPICOS RECOMBINANTES <130> Listado de secuencia para 4-30888 <140> <141> <150> GB 9908533.4 <151> 1999-04-14 <160> 62 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 345 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 1 caggtgaaac tgctcgagtc ggggggaggc ctggtcaagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag tctctggatt caccttcagt aactataata tgaactgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gactagagtg ggtctcatcc attagtagtc gaaattctta catatactac 180 gcagactcag tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccgagag taccttgtat 240 ctgcaaatgg acaacctggg agtcgaagac acggctgtct atttttgtac gagcggccgc 300 cttttcgact actggggcca gggaaccctg gtcaccgtct cctct 345 <210> 2 <211> 115 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Gln Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Asn Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser lie Ser Ser Arg Asn Ser Tyr lie Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Glu Ser Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asp Asn Leu Gly Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Thr Ser Gly Arg Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 3 <211> 315 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 3 gtgatgaccc agtctccatc ctcactgtct gcatctgtag gagacagagt caccatcact 60 tgtcgggcta gtcagggcat taacaattat ttagcctggt ttcagcagaa accagggaaa 120 gcccctaagt ccctgatcta tagtgcatcc attttgcaaa gtggggtccc atccaagttc 180 agcggcagtg gatctgggac agatttcact ctcaccatca gcaacctgca gcctgaagat 240 tttgcaactt attactgcca acaatataat tattatccgc tcactttcgg cggagggacc 300 aaggtggaga tcaaa 315 <210> 4 <211> 105 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg 1 5 10 15 Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly lie Asn Asn Tyr Leu Ala 20 25 30 Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu lie Tyr Ser 35 40 45 Ala Ser lie Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Lys Phe Ser Gly Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Asn Leu Gln Pro Glu Asp 65 70 75 80 Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Tyr Tyr Pro Leu Thr Phe 85 90 95 Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 5 caggtgaaac tgctcgagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agtggtggtt actactggac ctggatccgc 120 cagcgcccag ggaagggcct ggagtggatt ggatacatct attacagtgg gagcacctcc 180 tacaacccgt ccctcaagag tcgagtcacc atgtcagtgg acacgtctaa aaaccagttc 240 tccctgaggc tgacctctgt gactgccgcg gacacggccg tctattactg tgcgcgagag 300 cggggtgaga ccggtctata ttacccctat tactacatag acgtctgggg cacagggacc 360 accgtcaccg tctcctca 378 <210> 6 <211> 126 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Gln Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser lie Ser Ser Gly 20 25 30 Gly Tyr Tyr Trp Thr Trp lie Arg Gln Arg Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp lie Gly Tyr lie Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Val Thr Met Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Arg Leu Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Glu Arg Gly Glu Thr Gly Leu Tyr Tyr Pro Tyr Tyr Tyr 100 105 110 He Asp Val Trp Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 7 <211> 342 <212> ADN <213> Homo sapiens tgg tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccafec 60 tcctgcactg gaaccagaag tgacgttggt ggttataact atgtctcctg gtaccaacaa 120 cacccaggca aagcccccaa actcatgatt tatgatgtca gtaatcggcc ctcaggggtt 180 tctaatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ccctgaccat ctctgggctc 240 caggctgagg acgaggctga ttattactgc agctcatata caagcagcag cactctcggg 300 gtgttcggcg gagggaccaa gttgaccgtc ctaggtcagc cc 342 <210> 8 <211> 114 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Glu Leu Val Val Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser He Thr He Ser Cys Thr Gly Thr Arg Ser Asp Val Gly Gly Tyr 20 25 30 Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Met He Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr He Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser 85 90 95 Ser Thr Leu Gly Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 Gln Pro <210> 9 <211> 29 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 9 cactcccagg tgcagctgct cgagtctgg 29 <210> 10 <211> 32 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 10 gtcctgtccc aggtcaactt actcgáug ct gg 32 <210> 11 <211> 32 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 11 gtccaggtgg aggtgcagct gctcgagtct gg 32 <210> 12 <211> 32 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 12 gtcctgtccc aggtgcagct gctcgagtcg gg 32 <210> 13 <211> 32 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 13 gtctgtgccg aggtgcagct gctcgagtct gg 32 <210> 14 <211> 32 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 14 gtcctgtcac aggtacagct gctcgagtca gg 32 <210> 15 <211> 27 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 15 agcatcacta gtacaagatt tgggctc 27 <210> 16 ??kg HAbA&ttHttiÉ |iMfl N|Htt|ißB^ <211> 35 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 16 gtgccagatg tgagctcgtg atgacccagt ctcca 35 <210> 17 <211> 56 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 17 tccttctaga ttactaacac tctcccctgt tgaagctctt tgtgacgggc gaactc 56 <210> 18 <211> 36 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 18 ctgcacaggg tcctgggccg agctcgtggt gactca 36 <210> 19 <211> 34 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 19 gcattctaga ctattatgaa cattctgtag gggc 34 <210> 20 <211> 18 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 20 cgctgtgccc ccagaggt <210> 21 <211> 22 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 21 ggccgcaaat tctatttcaa gg 22 <210> 22 <211> 18 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 22 gagacacacc agtgtggc 18 <210> 23 <211> 18 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 23 cacaacagag gcagttcc <210> 24 <211> 18 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 24 ctaaactagc tagtcgcc 18 <210> 25 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Val Asn Leu Thr Trp Ser Arg Ala Ser Gly Lys Pro Val Asn 1 5 10 <210> 26 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Tyr Asn Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 1 5 10 15 <210> 27 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens ^m ? km Ké áá <400> 27 Pro Ser Pro Phe Asp Leu Phe He Arg Lys Ser Pro Thr He Thr Cye 1 5 10 15 <210> 28 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr He Thr Cys 1 5 10 15 <210 > 29 <211> 10 <212 > PRT <213 > Homo sapiens <400 > 29 Val Asn Leu Thr Trp Ser Arg Ala Ser Gly 1 5 10 <210> 30 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Val Thr He Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly 1 5 10 <210 > 31 <211> 29 <212 > PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Thr He Thr Cys Leu Val Val Asp Leu Ala Pro Ser Lys Gly Thr Val 1 5 10 15 Asn Leu Thr Trp Ser Arg Ala Ser Gly Lys Pro Val Asn 20 25 <210> 32 <211> 30 <212> PRT *a**ait*tiiJL< <213> Homo sapiens <400> 32 Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser He Ser Ser Gly Gly Tyr 1 5 10 15 Tyr Trp Thr Trp He Arg Gln Arg Pro Gly Lys Gly Leu Glu 20 25 30 <210> 33 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Gly Thr Arg Asp Trp He Glu Gly Glu Thr Tyr Gln Cys Arg Val Thr 1 5 10 15 His Pro His Leu Pro Arg Ala Leu Met 20 25 <210> 34 <211> 26 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 Gly Thr Arg Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln 1 5 10 15 Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met 20 25 <210> 35 <211> 218 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 Gln Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Asn Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser He Ser Ser Arg Asn Ser Tyr He Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ala Glu Ser Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asp Asn Leu Gly Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Thr Ser Gly Arg Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 115 120 125 Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 130 135 140 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 145 150 155 160 Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly 165 170 175 Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly 180 185 190 Thr Gln Thr Tyr He Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 195 200 205 Val Asp Lys Lys Ala Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 <210> 36 <211> 211 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg 1 5 10 15 Val Thr He Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly He Asn Asn Tyr Leu Ala 20 25 30 Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu He Tyr Ser 35 40 45 Ala Ser He Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Lys Phe Ser Gly Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Asn Leu Gln Pro Glu Asp 65 70 75 80 Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Tyr Tyr Pro Leu Thr Phe 85 90 95 Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu He Lys Thr Val Ala Ala Pro Ser Val 100 105 110 Phe He Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser 115 120 125 Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln 130 135 140 Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val 145 150 155 160 Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu 165 170 175 Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu 180 185 190 Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys He Phe Asn Arg 195 200 205 Gly Glu Cys 210 <210> 37 <211> 229 <212> PRT <213> Homo £sapiens <400> 37 Gln Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser He Ser Ser Gly 20 25 30 Gly Tyr Tyr Thr Trp Trp He Arg Gln Arg Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp He Gly Tyr He Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Val Thr Met Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Arg Leu Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr fff f . **"- • -*-•'* •** *fff? 85 90 95 Cys Ala Arg Glu Arg Gly Glu Thr Gly Leu Tyr Tyr Pro Tyr Tyr Tyr 100 105 110 He Asp Val Trp Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 115 120 125 Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 130 135 140 Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro 145 150 155 160 Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 165 170 175 His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 180 185 190 Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr He 195 200 205 Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Ala 210 215 220 Glu Pro Lys Ser Cys 225 <210> 38 <211> 219 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 Glu Leu Val Val Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser He Thr He Ser Cys Thr Gly Thr Arg Ser Asp Val Gly Gly Tyr 20 25 30 Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Met He Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr He Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser M_b_tteri?j_^>-»....trfli¡fa^^ 85 90 95 Ser Thr Leu Gly Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 Gln Pro Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser 115 120 125 Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu He Ser 130 135 140 Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser 145 150 155 160 Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn 165 170 175 Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp 180 185 190 Lys Ser His Lys Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr 195 200 205 Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 210 215 <210> 39 <211> 15 <212> ADN <213> Homo esapiens <400> 39 aactataata tgaac 15 <210> 40 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40 Asn Tyr Asn Met Asn 1 5 <210> 41 <211> 51 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 41 tccattagta gtcgaaattc ttacatatac tacgcagact cagtgaaggg c 51 <210> 42 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 42 Ser He Ser Ser Arg Asn Ser Tyr He Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 43 <211> 18 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 43 ggccgccttt tcgactac 18 <210> 44 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44 Gly Arg Leu Phe Asp Tyr 1 5 <210> 45 <211> 33 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 45 cgggctagtc agggcattaa caattattta gcc 33 <210> 46 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46 Arg Ala Ser Gln Gly He Asn Asn Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 47 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 47 agtgcatcca ttttgcaaag t 21 <210> 48 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 48 Ser Ala Ser He Leu Gln Ser 1 5 <210> 49 <211> 27 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 49 caacaatata attattatcc gctcact 27 <210> 50 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 50 Gln Gln Tyr Asn Tyr Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> 51 <211> 24 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 51 agcagtggtg gttactactg gacc 24 <210> 52 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 52 Ser Ser Gly Gly Tyr Tyr Trp Thr 1 5 <210> 53 <211> 51 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 53 ggatacatct attacagtgg gagcacctcc tacaacccgt ccctcaagag t 51 <210> 54 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 54 Gly Tyr He Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 1 5 10 15 Ser <210> 55 <211> 48 <212 > ADN <213 > Homo sapiens <400> 55 gagcggggtg agaccggtct atattacccc tattactaca tagacgtc 48 <210> 56 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 56 Glu Arg Gly Glu Thr Gly Leu Tyr Tyr Pro Tyr Tyr Tyr He Asp Val 1 5 10 15 <210> 57 <211> 42 <212 > ADN <213 > Homo sapiens *¿. *^¿li á?**? .a4É?LjJl¡ <400> 57 astggaacca gaagtgacgt tggtggttat aactatgtct cc 42 <210> 58 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 58 Thr Gly Thr Arg Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser 1 5 10 <210> 59 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 59 gatgtcagta atcggccctc a 21 <210> 60 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 60 Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser 1 5 <210> 61 <211> 33 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 61 agctcatata caagcagcag cactctcggg gtg 33 <210> 62 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 62 Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Ser Thr Leu Gly Val 1 5 10

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo monoclonal recombinante que es anti-idiotípico para el anticuerpo BSW17 que tinterfiere con el enlace de la región Ce3 de la IgE al receptor de alta afinidad para IgE (un mimocuerpo) , y el cual consiste en, o comprende, el dímero de cadena ligera, o uno de los dos fragmentos Fab de la Figura 4 (SEQ ID Nos: 35, 36, 37, y 38), en donde se debe entender que las regiones constantes de los mismos también cubren las modificaciones esféricas de hasta 5 aminoácidos, tales como las que se encuentran en las variantes alotípicas.

2. Un mimocuerpo como se define en la reivindicación 1, el cual consiste en, o comprende, una secuencia de aminoácidos de las Figuras 5a, 5b, 5c, ó 5d (SEQ ID NOS: 2, 4, 6, y 8) , en donde se entiende que sus regiones constantes también cubren modificaciones esféricas de hasta 5 aminoácidos, tales como se encuentran en las variantes alotípicas .

3. Un mimocuerpo como se define en la reivindicación 1, el cual consiste en, o comprende, una ó dos ó tres CDR de las Figuras 5a (SEQ ID NO: 2 y NOS: 40, 42, y 44), 5b (SEQ ID NO: 4 y NOS: 46, 48, y 50), 5c (SEQ ID NO: 6 y NOS: 52, 54, y 56), ó 5d (SEQ ID NO: 8 y NOS: 58, 60, y 62), opcionalmente junto con las secuencias de estructura adyacentes de hasta 10 aminoácidos en uno o en ambos extremos de la CDR.

4. Un mimocuerpo como se define en la reivindicación 1, el cual consiste en, o comprende, cuando menos una de las secuencias definidas en la Figura 6 para los clones 52 y 43, que son homologas al dominio Ce3 de la IgE humana (SEQ ID NOS: 26, 28, 30, 32, y 34) .

5. Una composición farmacéutica, tal como una vacuna, la cual consiste en, o comprende, un mimocuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 , ya sea como una sola entidad molecular, o bien como un conjugado de proteína químicamente acoplado con una molécula portadora inmunogénica, en donde sea apropiado junto con un adyuvante y otros excipientes convencionales.

6. Un mimocuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para utilizarse como un producto farmacéutico en el tratamiento de enfermedades mediadas por IgE.

7. Un método de tratamiento de enfermedades mediadas por IgE, el cual comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un mimocuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, a un paciente que necesite dicho tratamiento.

8. Un método de tratamiento mediante vacunación, de asma, dermatitis atópica, rinitis, urticaria crónica, o alergias a alimentos, el cual comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un mimocuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 a un paciente que necesite dicho tratamiento.

9. El uso de un mimocuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para reproducir anticuerpos policlonales o monoclonales contra el mismo mediante inmunización pasiva.

10. El uso del anticuerpo BSW17 que interfiere con el enlace de la región Ce3 de la IgE al receptor de alta afinidad para IgE, para la identificación de un mimocuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.