KR20080016871A - 포유류 숙주 세포에서의 재조합 항체의 고-수준 발현 - Google Patents
포유류 숙주 세포에서의 재조합 항체의 고-수준 발현 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 항체 경쇄 및 중쇄를 엔코딩하는 유전자 최적화된 서열을 갖는 2중-유전자 벡터를 포함하는 재조합 항체의 높은 수준 발현을 갖는 포유류 숙주 세포, 2중-유전자 그 자체 및 포유류 숙주 세포에서 재조합 항체의 제조를 향상하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 재조합 항체의 고(高)-수준 발현을 갖는 포유류 숙주 세포 (여기서 숙주 세포는 항체 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 유전자-최적화된 뉴클레오티드 서열을 갖는 2중-유전자 벡터를 포함함), 2중-유전자 벡터 그 자체 및 포유류 숙주 세포에서의 재조합 항체 제조를 향상하는 방법에 관한 것이다.
면역글로불린으로도 불리는 항체는 항원으로 불리는 외래 분자를 특이적으로 인식하는 글리코단백질이다. 외부 항체가 인간 또는 기타 동물에 침입할 경우, B-림프구에 의한 항체의 제조를 수반하는 면역학적 반응이 초래된다. 이러한 면역학적 반응에 의해, 미생물, 바이러스 및 박테리아성 독소가 무해하게 될 수 있다. 척추 동물에서 면역계에서 상이한 기능을 갖는 5 개의 면역글로불린 부류가 알려져 있다: IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE. 상기는 2 개의 동일한 중쇄 폴리펩티드 및 2 개의 동일한 경쇄 폴리펩티드의 기본 구조를 갖는다. 중쇄 및 경쇄는 디술피드 가교 및 비공유 상호작용에 의해 서로 연결된다. 사슬은 그 자체가 가변 및 불변 도메인을 포함한다. 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 불변 부위 도메인보다 아미노산 서열이 더욱 가변성이며, 항체 분자의 N-말단 부분에 위치 한다. 중쇄 및 경쇄 가변 도메인은 각각 3 개의 스트레치 (stretch) 의 과변이 (hypervariable) 또는 상보성 결정 부위 (CDR) 서열을 포함하며, 이는 함께 유일한 항원-인식 부위를 형성한다.
몇몇의 기능성 항원-결합 절편은 예를 들어 파파인 소화, 펩신 소화 또는 기타 효소적 방법에 의한 항체의 단백질가수분해에 의해 엔지니어링되어, 예를 들어, Fab, F(ab')2 또는 Fv 절편을 수득할 수 있다. 재조합 DNA 기법의 개발은 몇몇의 새로운 항체 및 항체 절편의 설계를 초래하였다. 예를 들어, 상기 단백질의 기능성이 변경되어 신규하고 개선된 기능을 초래한다. 따라서, 의학적 적용에서 원치 않는 면역학적 특성을 감소시키는 것이 가능하다. 또한, 조직 투과 및혈액으로부터의 신속한 제거를 필요로 하는 적용에서 전체 항체에 비해 장점을 갖는, 보다 작은 재조합 항체 절편이 발현될 수 있다.
엔지니어링된 항체 분자 및 그의 절편은 질병의 치료 및 진단을 위한 과학적 및 임상적 수단으로서 점차 이용되고 있다.
실질적으로 임의의 유형의 항체를 특이적으로 인식하고 높은 친화도로 결합하는 항체의 독특한 능력은, 이가 신규 생물약학 제품 및 과학 연구를 위한 출발점으로서 매력이 있게 한다. 연구 및 의학 외의 보다 많은 적용, 예컨대 소비자 적용이 고려될 수 있다. 예는 비듬 형성을 방지하기 위한 샴푸 또는 카리에스 (caries) 예방을 위한 치약 및 카리에스에 의해 초래되는 치아 부패 각각에서의 항체의 사용이다. 기타 생각할 수 있는 적용은 예를 들어 바이오센서, 폐수의 처 리, 공업적 물때 분리 공정에서, 또는 압자임 (abzyme; 즉, 인공적으로 생성된 항체의 효소로서의 용도) 으로서의 용도를 포함한다. 항체 절편의 결합 능력의 완전히 다른 용도는 융합 단백질의 설계에 있다. 예를 들어, 중쇄 불변 영역 유전자의 3' 말단이 효소 유전자의 5' 말단에 융합된다. 항체가 종양 항원에 대한 특이성을 갖는다면, 예를 들어, 융합이 사용되어 독소 또는 독소 효소를 효과적으로 치사시키기 위해 이를 종양 세포에 전달할 수 있다. 대안적으로, (방사성-동위원서 결합 가능한) 킬레이트가 재조합 항-종양 항체 또는 항체 절편에 화학적으로 커플링되어, 종양 세포를 또한 선택적으로 치사시킨다. 인간 약품에서 상기 방법은 가끔 "매직 불렛" 이라 불린다.
그러나, 상기 목적을 위해, 다량의 항체가 필요하다. 원핵 또는 진핵 기원으로 모두로부터의 몇몇의 발현 시스템이 이용가능하다. 시스템의 선택은 여러 요인에 의존하며, 이는 발현되는 분자 종 및 개별적인 항체의 정확한 서열을 포함한다. 항체를 포함하는 재조합 단백질을 위한 가장 널리 사용되는 발현 시스템 중 하나는 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 포유류 발현 시스템이다. 이는 동물 세포의 간단하고 효율적인 고밀도 부유 배지 배양을 허용하는 몇몇 세포 유형 중 하나이다. CHO 세포는 매우 높은 생성물 수율을 허용하며 대사 스트레스에 비교적 강하다. CHO 세포에서 재조합 단백질의 발현에 의해, 인간 세포로부터 수득되는 것과 유사하지만 동일하지는 않은 글리코실화 패턴을 달성하는 것이 가능하다.
최근에, CHO 세포에서 재조합 항체의 수율은 배양 배지 조성, 바이오리액터 설계 및 세포 배양의 매개변수의 최적화에 의해 크게 향상되었다. 따라서, 고밀도 성장률, 높은 특이적 생산율 및 배양 세포의 연장된 생존력을 달성하기 위해 막대한 진보가 있었다. 추가적으로, 전사 수준에서의 수율 향상은 대부분 바이러스성 기원의, 가능한 가장 강한 프로모터 (promoter) 및 엔한서 (enhancer) 요소를 사용하여 널리 최적화되었다. 추가적으로, 벡터 시스템 및 숙주 세포에 대한 비교 연구는 중쇄 및 경쇄 전사 단위 모두가 삽입된 일렬의 (tandem) 벡터의 사용이 각 중쇄 벡터 및 경쇄 벡터의 혼합물의 사용과 비교하여 훨씬 더 높은 항체 제조 수준을 초래하는 것을 나타내었다.
그러나, 정련된 유전자 발현 기법에도 불구하고, 항체 발현의 명백한 수준은 여전히 200-배까지 변화할 수 있다. [Bentley et al., Hybridoma, 17 (1998), 559-567] 에 따르면, 각 항체는 경쇄 합성의 수준 및 중쇄 및 경쇄의 "친화성" 을 포함하는 요인의 조합으로 측정되는 특징적인 효율로 발현된다. [Strutzenberger et al., J. Biotechnol., 69 (1999), 215-226] 에 따르면, 경쇄의 높은 발현 속도는 전체 항체의 분비 속도를 증가하는데 유익하다. CHO 세포-기재 발현 시스템에서, 이들은 경쇄 발현의 감소가 경쇄의 낮은 세포내 농도를 초래하고 샤페론 (chaperone) 에 의해 체류에 의해 세포질세망에서의 중쇄 축적을 초래하는 것을 나타냈다. [Borth et al., J. Biotechnol., 8 (1999), 57-66] 은 세포내 경쇄 및 중쇄 mRNA 및 그의 각각의 폴리펩티드의 함량, 및 저, 중 및 고 특이적 생산율을 갖는 3 개의 서브-클론 (sub-clone) 의 특이적 분비 속도를 분석하였다. 3 개의 서브-클론에 대해, 경쇄에 있어서의 세포내 함량 및 분비 속도 간 의 상호 관련을 발견하였으며, 중쇄에 있어서의 세포내 함량은 3 개의 서브-클론에 대해 동일하였다. 저자들은 세포질세망에서의 조합이 항체 제조에서의 주요 속도 제한 요소 중 하나인 것으로 결론지었다. [Smales et al., Biotechnol. Bioeng., 88(4) (2004), 474-488] 은 재조합 단일클론 항체를 생성하는 GS-NSO 세포주에서 세포내 경쇄 함량이 세포내 중쇄 함량을 현저히 초과한 것을 기술한다. 그들은 세포내 몰비가 대략 10:1 이었음으로 결론지었다.
따라서, 항체 제조 경로를 따라 상당한 부분의 경쇄 및 중쇄가 사합체성 면역글로불린으로 적당히 조합되지 않음이 전적으로 가능하다. 첫째로, 단량체 단백질 사슬의 조합 문제가 있으며; 70% 유리 IgG 경쇄의 존재 하에서도, 상당한 양의 단량체성 IgG 중쇄가 검출가능하다. 과잉의 경쇄 또한 기능성인, 완전히 조합된 단일클론 항체 (mAb) 와 함께 세포 배지에 흘려질 수 있다. 단순한 질량 작용의 화학적 법칙이 세포 내에서 적용되지 않는다. 중쇄의 발현 수준을 선택적으로 증가시키기 위한 노력은 성공적으로 시험되지 못했다. [Gass et al., Trends Immunol. 25(1) (2004), 17-24] 는 자연 항체 분비 B-세포인 혈장 세포 내에서, 가장 달성가능한 mAb 터이터 (titre) 가 과잉의 경쇄의 존재 하에서 도달됨을 제시한다.
가능한 설명은 또한 프로페오솜으로의 표적에 의한 중쇄의 조급한 선택적 분해 및/또는 비효과적인 조합; 품질 관리 및 분해 타이밍은 탄수화물 부분의 글루코스 태깅 (tagging) 을 수반하는 것으로 알려져 있다. 단백질 도메인 조합은 친화성 상호 작용, 도메인을 근접하게 모으는 디술피드 결합의 형성 및/또는 개별적 인 도메인의 표면상의 노출된 소수성 패치 (patch) 를 숨기기 위한 필요에 의해 추진될 수 있으며; 조합 및 폴딩 (folding) 의 초기 단계에서는, 상기와 같은 패치가 샤페론 단백질에 의해 보호될 수 있다고 생각된다. 분비성 글리코단백질은 단백질 합성 직후, 폴딩되고 세포의 내부 세포질세망 (ER) 구획 내의 보다 높은 품등의 복합체 내로 조합된다. ER 은 품질 관리 기전과 함께 특이적인 보조의 조합 인자를 포함하는 단독의 구획이다 (Ellgaard et al., Quality control in the secretory pathway, Science. 1999 Dec 3;286: 1882-8; Helenius et al., Intracellular functions of N-linked glycans, Science. 2001 Mar 23;291:2364-9). 성공적인 조합 국면이 지난 후, 세포의 분비성 경로를 통한 경과가 진행되는 동안 추가의 조합은 일어나지 않을 것이다. 실제로, CHO 세포와 같은 일부 세포 유형은 둘 모두의 유형의 비조합된 사슬을 분비하는 한편, NSO 세포와 같은 기타의 것들은 IgG 중쇄 유형의 비조합된 사슬만을 선택적으로 유지하고 아마도 이들을 분해 경로로 표적시킨다.
이전의 연구는 세포 환경 (Lambert and Merten, Biotechnol. Bioeng., 54(2) (1997), 165-180) 또는 배양 시간 (Downham et al., Biotechnol. Bioeng., 51(6) (1996), 691-696) 의 변화의 결과로서 발생하는 분비성 경로 단백질의 세포성 존재도와 특이적 재조합 단일클론 항체 제조의 변화를 서로 관련시켰다. 따라서, 진핵 세포에 의해 재조합 상체 분비의 속도를 엔지니어링하기 위해 ER 샤페론 및 폴다아제 (foldase) 의 과발현을 사용하였다. 예를 들어, WO 03/057897 은 샤페론 단백질 및 작은 열충격 단백질의 공동-발현을 포함하는 재조합 단백질 발현 방법을 교시한다. 상기 추가적인 단백질은 성공적인 폴딩 및 조합을 조장하며, 이에 따라 가장 활성인 생성물 단백질인 바르게 폴딩된 부위를 조장하는 것으로 여겨진다.
그러나, 개별적인 샤페론 및 폴다아제의 과발현은 포유류 동물에서의 단일클론 항체 제조를 증가시키지 않았다. 예를 들어, 포유류 동물 내의 BIP 과발현은 그가 회합하는 단백질의 분비를 감소시켰으며 (Domer and Kaufman, Biologicals, 22(2) (1994), 103-112) CHO 세포에서의 PDI 의 과발현은 디술피드-풍부 융합 단백질의 분비를 감소시킨 것으로 나타났다 (Davis et al., Biotechnol. Prog., 16(5) (2000), 736-743). 따라서, 몇몇의 보조 인자의 발현은 단백질 생성물의 총 발현 속도를 감소시킬 수 있으며 이러한 보조 인자의 개별적인 공동-발현 속도의 조심스러움 최적화를 필요로 한다. 상이한 생성물 단백질은 개별적인, 부분적으로만 중복되는 샤페론 기능에 다양한 정도로 의존할 수 있으며, 이들 중 다수는 현재 공지되어 있다 (예를 들어, GroEL, GroES, DnaK, DnaJ, GrpE, ClpB, IbpA, Ibp). 따라서, 생성물 단백질 생성율 단독의 희생으로 상기 모두를 한번에 공동-발현시키는 것은 바람직하거나 가능하지 않다.
본 발명의 근원적인 기술적 문제는 종래 기술의 단점을 피하고, Fc 수용체 활성을 가지며 2 개 이상의 상이한 폴리펩티드 사슬로 이루어진 표준, 사합체성 전체 IgG 항체의 고-수준 제조를 허용하는 포유류 숙주 세포에서의 항체 제조 향상을 위한 신규한 수단 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 적어도 제 1 폴리펩티드 사슬을 엔코딩하는 제 1 합성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제 1 전사 단위 및 제 2 폴리펩티드 사슬을 엔코딩하는 제 2 합성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제 2 전사 단위를 포함하는 포유류 발현 벡터를 제공하여 상기 기술적 문제를 해결하며, 여기서 제 1 및 제 2 합성 뉴클레오티드 서열은 자연 발생 뉴클레오티드 서열에 기재하며, 제 1 및 제 2 폴리펩티드 사슬은 제 1 및 제 2 폴리펩티드 사슬 각각의 하나 이상 또는 다중 복제본을 포함하는 분자를 형성할 수 있으며, 제 1 및 제 2 뉴클레오티드 서열 모두의 코돈 조성은 자연 발생 뉴클레오티드 서열이 원래 유도된 포유류 종으로부터 상이한, 주어진 포유류 숙주 종의 유전자의 코돈 바이어스 (bias) 에 적응된 것을 특징으로 한다.
따라서, 본 발명은 주어진 포유류 숙주 세포의 코돈 바이어스에 적응된 뉴클레오티드 서열, 즉, 유전자-최적화된 뉴클레오티드 서열을 갖는 포유류 발현 벡터를 제공한다. 본 발명의 발명자들은 포유류 CHO 세포 발현 시스템에서 경쇄 및 중쇄의 유전자-최적화된 유전자를 포함하는 본 발명의 2중-유전자 벡터를 시험하였으며, 여기서 경쇄 및 중쇄의 아미노산 서열은 유전자 최적화에 의해 변경되지 않았다. 놀랍게도, 그리고 예상외고, 중쇄 및 경쇄 유전자 모두가 유전자-최적화된 벡터의 사용은 항체 제조의 중앙값 수준을 37.8 ㎍/ml 에서 51.3 ㎍/ml 로 현저히 증가시킨 것을 발견하였다. 반대로, 유전자-최적화된 중쇄를 비-최적화된 경쇄와 함께 발현하는 것은 항체 발현 수준을 향상시키기에 충분하지 않았다. 따라서, 중쇄 및 경쇄 모두에 대해 유전자-최적화된 유전자를 포함하는 본 발명의 포유류 2중-유전자 발현 벡터의 사용에 의해, 하나의 유전자-최적화된 유전자 및 하나의 비-최적화된 유전자를 포함하는 대조군 벡터 또는 중쇄 및 경쇄 모두가 유전자-최적화되지 않은 대조군 벡터와 비교하여 현저히 증가된 분비된 항체의 총 수율을 달성하는 것이 가능하다. 유전자-최적화된 중쇄 및 경쇄 유전자를 갖는 벡터에 의해 수득된 항체 제조의 현저히 향상된 수준은 유전자-최적화된 중쇄 및 경쇄 유전자에 귀착되어야 한다.
본 발명의 발명자에 의해 수득되는 추가의 결과는 코딩 유전자 서열의 특정 부분만이 아니라 전체 코딩 유전자 서열을 최적화시키는 것이 유리함을 나타낸다. 예를 들어, 오로지 경쇄 및 중쇄 유전자의 N-말단이 유전자-최적화되면, 전체 항체 제조는 증가하지 않거나 약간만 증가하였다.
본 발명의 발명자들에 의해 수득된 결과는 종래기술에 기재된 관찰과 뚜렷이 대조된다. 종래기술로부터 경쇄의 세포내 함량 및 항체의 특이적 분비 속도 사이에 상호 관련이 있음이 공지되어 있으며, 이는 높은 수준의 항체 제조를 달성하기 위해 중쇄에 비해 경쇄가 과잉으로 발현되어야만 하며, 그렇지 않으면 샤페론에 의한 체류 때문에 세포질세망에 중쇄가 축적될 것을 제시한다. 반대로, 본 발명자들의 결과는 도리어 포유류 발현 시스템에서도 높은 수준의 분비 항체의 제조를 달성하기 위해 경쇄 발현 및 중쇄 발현이 균형을 이루어야 함을 나타낸다. 임의의 특정 이론에 결부되지 않기를 바라며, 높은 수준의 항체 제조를 달성하기 위해, 경쇄의 증가된 세포내 풀 (pool) 만을 갖는 것은 충분하지 않은 것으로 생각된다. 높은 세포내 중쇄 풀 또한 필요한 것으로 보인다.
추가적으로, 본 발명자들의 결과는 세포질세망 내의 조합이 항체 제조에서 뿐만 아니라, 전사의 조절 및 mRNA 안정성의 조절에서도 주요 속도 제한 요소 중 하나임을 나타낸다. 본 발명자들에 의해 사용된 유전자 최적화가 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열을 변경하지 않았기 때문에, 보다 높은 항체 제조는 사슬의 변경된 조합 또는 잘못 폴딩되거나 폴딩되지 않은 폴리펩티드 사슬의 변경된 ER-관련 분해에 귀착시킬 수 없다. 중쇄 및 경쇄 유전자 모두가 유전자-최적화된 본 발명의 2중-유전자 벡터에 의해 수득된 증가된 항체 제조는 오히려 전사 효율 및 mRNA 안정성은 내부 TAT-박스, 카이(chi)-부위, 반복 서열, 암호 스플라이스 부위 (cryptic splice site) 등과 같은 cis-작용 서열 모티프의 제거로 인해 최적화되어 각각의 유전자의 증가된 전사 효율을 초래함을 나타낸다.
따라서, 본 발명은 적어도 제 1 폴리펩티드 사슬을 엔코딩하는 제 1 합성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제 1 전사 단위 및 제 2 폴리펩티드 사슬을 엔코딩하는 제 2 합성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제 2 전사 단위를 포함하는 포유류 발현 벡터를 제공하여 근원적인 기술적 문제를 해결하며, 여기서 제 1 및 제 2 합성 뉴클레오티드 서열은 자연 발생 뉴클레오티드 서열에 기재하며, 제 1 및 제 2 폴리펩티드 사슬은 제 1 및 제 2 폴리펩티드 사슬 각각의 하나 이상 또는 다중 복제본을 포함하는 분자를 형성할 수 있으며, 제 1 및 제 2 뉴클레오티드 서열 모두의 코돈 조성은 그의 mRNA 가 더욱 높은 효율로 전사되도록 변경된 것을 특징으로 한다.
본 발명의 문맥에서 "제 1 및 제 2 폴리펩티드 사슬 각각의 하나 이상 또는 다중 복제본을 포함하는 분자" 는 다중하위단위 분자이며, 특히 분비성 다중하위단위 분자이다. 분자는 2 개의 상이한 폴리펩티드 사슬 각각의 하나 이상의 복제본으로 이루어질 수 있다. 분자는 2 개 이상의 상이한 폴리펩티드 사슬을 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서 분자는 분비성 항체이다. 그러나, 분비된 분자는 또한 서로 다른 폴리펩티드 사슬 또는 하위단위로 이루어진 또 다른 단백질일 수 있다. 상기 다중하위단위 단백질의 예는, 다중하위단위 효소, 수용체 분자 및 이온-통로를 포함하나 그에 제한되지는 않는다.
본 발명의 문맥에 있어서, "포유류 발현 벡터" (바람직하게는 단리 및 정제됨) 는 적절한 포유류 숙주 세포로 형질전환 시, 숙주 세포 내의 폴리펩티드 사슬 모두의 높은 수준 발현을 제공하는 DNA 분자이다.
본 발명에 따른 포유류 발현 벡터는 2 개 이상의 개별적인 전사 단위를 포함한다. 2 개의 분리된 전사 단위를 갖는 발현 벡터는 또한 2중-유전자 벡터로 불린다. 따라서, 일례로서 제 1 합성 뉴클레오티드 서열 또는 제 1 전사 단위의 제 1 유전자가 항체의 중쇄 또는 그의 절편을 엔코딩하고, 제 2 전사 단위의 제 2 합성 뉴클레오티드 서열이 항체의 경쇄를 엔코딩하는 2중 유전자 벡터가 있다. 또 다른 예는 2 개의 합성 뉴클레오티드 서열이 효소와 같은 단백질의 2 개의 상이한 하위단위를 엔코딩하는 2중 유전자 벡터이다.
그러나, 본 발명의 발현 벡터가 2 개 이상의 개별적인 전사 단위, 예를 들어, 3 개, 4 개 또는 그 이상의 개별적인 전사 단위를 포함하는 것이 가능하며, 이들 각각은 서로 다른 폴리펩티드 사슬을 엔코딩하는 서로 다른 합성 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 따라서, 일례로서 4 개의 개별적인 전사 단위의 각각이 4 개의 서로 다른 하위단위로 이루어진 효소의 하나의 하위단위를 엔코딩하는 서로 다른 합성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터가 있다.
본 발명의 문맥에서, "유전자 최적화" 라는 용어는 다수의 변형을 관심 유전자와 같은 자연 뉴클레오티드 서열로 도입하여 새로운 합성 뉴클레오티드 서열의 생성을 초래하는 기법을 의미한다. 따라서 본 발명의 문맥에서, "합성 뉴클레오티드 서열" 은 자연 뉴클레오티드 서열로부터 유전자 최적화에 의해 유도되는 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 자연 뉴클레오티드 서열은 유전체 서열 또는 유전체 서열로부터 수득되는 cDNA 이며 인트론 서열이 결핍될 수 있다.
유전자 최적화의 목표는 유전자의 전사 효율을 증가시키고 표적 생물체 또는 이러한 표적 생물체의 조직 또는 세포에서의 그의 최적 발현을 확보하기 위한 것이다 (표적 생물체는 뉴클레오티드 서열이 원래 유도된 생물체로부터 상이하다). 상이한 종에서의 상이한 변질 이동 RNA 의 상이한 다량에 기초하여, 각 생물체는 그의 바람직한 선택의 코돈 사용을 갖는다. 주어진 생물체 또는 종에서 가장 높은 수준의 발현을 나타내는 단백질은 높은 코돈 바이어스를 갖는다 (즉, 아미노산에 대한 동일한 코돈이 유전자에서 사용되는 경향의 정도).
따라서 유전자 최적화는 자연 뉴클레오티드 서열의 존재하는 코돈 하나 이상의, 표적 생물체에서 바람직하게 사용되는 유사물 (synonymous) 코돈으로의 대체를 포함한다. 유사물 코돈은 이소-tRNA 에 상응하며, 이는 대체된 코돈에 상응하는 이소-tRNA 와 비교하여 표적 세포 또는 생물체에서 더욱 높은 다량으로 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 제 1 및 제 2 뉴클레오티드 서열의 코돈 조성은 특정 표적 포유류 숙주 세포의 유전자의 코돈 바이어스에 적응되어 있다. 제 1 및 제 2 뉴클레오티드 서열의 가장 바람직한 코돈 조성은 CHO 또는 NSO 세포 유전자의 코돈 바이어스에 적응되어 있다. 또 다른 구현예에서, 제 1 및 제 2 뉴클레오티드 서열의 코돈 조성은 호모 사피엔스 유전자의 코돈 바이어스에 적응되어 있다.
진핵 유전자 발현은 전사, 후-전사, 번역 및 후-번역 수준 상에서 조절될 수 있다. 효모에 대한 실험은 80% 의 단백체가 기하급수적 성장 동안 발현되고 85% 의 리보솜이 전사에 관여하는 것을 나타내며, mRNA 는 리보솜을 위해 경쟁해야함을 제시한다. 키메라성 항체를 제조하는 NSO 세포주에 대한 본 발명의 연구는 재조합 mRNA 가 총 mRNA 의 대략 20% 를 차지함을 추가로 밝혔다. 이는 리보솜에 대한 요구가 세포 자원을 초과하며, 이에 따라 리보솜 부족은 세포 유지 및 성장을 방해할 수 있음을 나타낸다.
mRNA 안정성의 조절은 유전자 발현의 조절의 중요한 요소이다. 개별적인 mRNA 의 구조적 특징은 번역 과정에 영향을 미칠 수 있다. 보다 고등의 진핵동물에서, 예를 들어, 리더 (leader) 의 길이, 개시 코돈의 상류 또는 하류 중 어느 하나에서의 2차 구조의 존재 및 폴리 (A) 테일의 길이가 mRNA 번역 효율에 영향을 미칠 수 있음이 나타났다. 리더 내의 안정적 2차 구조는 그의 개시 코돈에 대한 검색에서 40S 리보솜 하위단위의 스캐닝을 방해하여 번역을 억제할 수 있다. mRNA 안정성을 측정하는데 연루되는 공통 시스-작용 서열 및 서열 모티프가 존재하는 것으로 알려져 있다. 핵산 내의 요소의 협동적 상호 작용은 또한 후-전사 수준 상에서 세포성 유전자의 발현을 제한하는데 연루된다. 상기와 같은 억제 서열 (INS) 은 mRNA 내에서 활성이다. 추가적으로, 몇몇의 바이러스성 및 세포성 mRNA 는 진화된 조절 요소 (즉, mRNA 에 내부적으로 결합하는 40S 리보솜 하위단위를 촉진하는 캡 (cap)-독립적 기전을 통해 작용하는 리더 내에서의 내부 리보솜 출입 부위 (IRES) 요소) 를 갖는다.
따라서, 본 발명에 따라 유전자 최적화는 또한 합성 뉴클레오티드 서열의 전사 효율을 개선하고, mRNA 에 향상된 안정성을 부여하고/하거나 mRNA 의 전사 효율을 증가시키는 변형을 포함한다.
따라서, 본 발명의 바람직한 구현예에서 유전자 최적화는 자연 뉴클레오티드 서열과 비교하여, 합성 뉴클레오티드 서열 중 하나 또는 모두에서 GC 함량 또는 GC 분포의 변형을 포함한다. 따라서, 본 발명은 2 개의 합성 뉴클레오티드 서열이 상응하는 자연 발생 뉴클레오티드 서열의 것으로부터 상이한 GC 함량 및/또는 GC 분포를 갖는 포유류 발현 벡터에 관한 것이다. "상이한" GC 함량은 합성 뉴클레오티드 서열이, 표적 포유류 숙주 세포에 따라, 자연 발생 뉴클레오티드 서열보다 높거나 낮은 GC 함량을 가질 수 있음을 의미한다. 특히, 합성 뉴클레오티드 서열 중 하나 또는 모두에서 5'UTR 의 GC 함량은 상응하는 자연 발생 뉴클레오티드 서열과 비교하여 감소되는 것이 바람직하다. 합성 뉴클레오티드 서열 중 하나 또는 모두에서 3'UTR 의 GC 함량은 상응하는 자연 발생 뉴클레오티드 서열과 비교하여 증가되는 것이 바람직하다.
본 발명의 또 다른 바람직한 구현예에서, 합성 뉴클레오티드 서열 중 하나 또는 모두는 상응하는 자연 발생 뉴클레오티드 서열의 것으로부터 상이한 AT 함량 및/또는 AT 분포를 갖는다. 특히 합성 뉴클레오티드 서열 중 하나 또는 모두에서 3'UTR 의 AT 함량은 상응하는 자연 발생 뉴클레오티드 서열과 비교하여 감소되는 것이 바람직하다.
본 발명의 또 다른 바람직한 구현예에서, 합성 뉴클레오티드 서열 중 하나 또는 모두에서 3'UTR 및/또는 5'UTR 의 길이는 상응하는 자연 발생 뉴클레오티드 서열과 비교하여 변경된다. 3'UTR 의 길이가 증가되는 것이 특히 바람직하다. 5'UTR 의 길이가 약 60 bp 로 조절되는 것이 추가로 바람직하다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 2 개의 합성 뉴클레오티드 서열 중 하나 또는 모두는 상응하는 자연 발생 뉴클레오티드 서열보다 적은 시스-작용 서열 모티프를 포함한다. "보다 적은 시스-작용 서열 모티프" 는 자연 발생 뉴클레오티드 서열이 합성 뉴클레오티드 서열과 비교하여 하나 이상의 시스-작용 서열 모티프를 갖는 것을 의미한다. 바람직하게는, 합성 뉴클레오티드 서열은 자연 발생 뉴클레오티드 서열에 존재하는 모든 시스-작용 서열 모티프의 95% 미만, 90% 미만, 80% 미만, 70% 미만, 60% 미만, 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만 또는 10% 미만을 갖는다. 가장 바람직하게는, 합성 뉴클레오티드 서열은 시스-작용 서열 모티프를 전혀 갖지 않는다. 유전자 최적화가 특히 5'UTR 및 3'UTR 에 존재하는 시스-작용 서열 모티프의 변형을 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따라, "시스-작용 서열 모티프" 또는 "시스-작용 서열 요소" 는 내부 TATA 박스, 카이-부위, 리보솜 출입 부위 예컨대 IRES 부위, AT-풍부 또는 GC 풍부 서열 스트레치, ARE, INS 또는 CRS 서열 요소, RNA 안정성에 영향을 미칠 수 있는 반복 서열, 암호 슬라이스 공여자 및 수용자 부위 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 따라서, 2 개의 합성 뉴클레오티드 서열은 바람직하게는 자연 발생 뉴클레오티드 서열보다 적은 내부 TATA-박스, 카이-부위 및/또는 리보솜 출입 부위를 포함한다. 2 개의 합성 뉴클레오티드 서열은 또한 자연 발생 뉴클레오티드 서열과 비교하여 보다 적은 ARE, INS 및/또는 CRS 서열 요소를 포함한다. 추가적으로, 2 개의 합성 뉴클레오티드 서열은 자연 발생 뉴클레오티드 서열과 비교하여 보다 적은 반복 서열을 포함할 수 있으므로, 그의 RNA 는 자연 발생 뉴클레오티드 서열보다 적은 2차 구조를 형성할 것이다. 또한, 2 개의 합성 뉴클레오티드 서열은 자연 발생 뉴클레오티드 서열과 비교하여 보다 적은 암호 스플라이스 공여자 및 수용자 부위를 포함할 수 있다.
본 발명의 구현예에서, 유전자 최적화는 자연 발생 뉴클레오티드 서열에 존재하는 ARE 요소의 변경 및/또는 제거와 같은 특정 유형의 시스-작용 서열 모티프의 변형만을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 유전자 최적화는 자연 발생 뉴클레오티드 서열에 존재하는 2 개 이상의 유형의 시스-작용 서열 모티프의 변형 및/또는 제거, 예를 들어, TATA-박스 및 ARE 서열 요소 및 암호 스플라이스 공여자 및 수용자 부위의 제거를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 유전자 최적화는 모든 상상가능한 유형의 시스-작용 서열 모티프의 변형 및/또는 제거를 포함한다. 제 1 및 제 2 합성 뉴클레오티드 서열의 유전자 최적화는 서로 다른 시스-작용 서열 모티프의 변형 및/또는 제거를 포함할 수 있다.
또 다른 바람직한 구현예에서 유전자 최적화는 uCDS 및 uAUG 와 같은 대안적 개시 부위를 제거하는 변형을 포함한다. 따라서, 본 발명은 2 개의 합성 뉴클레오티드 서열 중 하나 또는 모두가 상응하는 자연 발생 뉴클레오티드 서열보다 적은 대안적 개시 부위를 포함하는 포유류 발현 벡터에 관한 것이다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 폴리펩티드 사슬을 엔코딩하는 전체 뉴클레오티드 서열은 유전자-최적화되어 있다. 추가의 구현예에서, 뉴클레오티드 서열의 특정 부위만 유전자-최적화되어 있다. 이에 대한 예는 뉴클레오티드 서열의 N-말단의 유전자 최적화이다. 본 발명에 따라, 제 1 및 제 2 합성 뉴클레오티드 서열은 물론 서로 다른 유전자 최적화의 결과인 것이 가능하다. 예를 들어, 2 개의 합성 뉴클레오티드 서열 중 하나에서 전체 서열이 유전자-최적화되는 한편, 다른 합성 서열에서는 서열의 일부만 유전자-최적화되는 것이 가능하다. 그러나, 합성 뉴클레오티드 서열에서 상이한 특징이 변형되는 것 또한 가능하다. 예를 들어, 합성 뉴클레오티드 서열 중 하나에서 GC 함량만이 변형된 반면, 다른 합성 뉴클레오티드 서열에서는 특정 시스-작용 요소만이 제거되었다.
본 발명의 특히 바람직한 구현예에서, 유전자 최적화는 변형된 아미노산 서열을 초래하지 않는다 (즉, 합성 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된 제 1 및 제 2 폴리펩티드 사슬은 자연 발생 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩되는 상응하는 폴리펩티드 사슬과 비교하여 동일한 아미노산 서열을 갖는다).
그러나, 유전자 최적화가 합성 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩되는 폴리펩티드 사슬의 하나 또는 모두의 변경된 아미노산 서열을 초래하는 것이 물론 가능하다; 즉, 제 1 합성 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩되는 제 1 폴리펩티드 또는 제 2 합성 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩되는 제 2 폴리펩티드 중 어느 하나, 또는 이들 모두는 자연 발생 뉴클레오티스 서열에 의해 엔코딩되는 상응하는 폴리펩티드 사슬과 비교하여 상이한 아미노산 서열을 갖는다. 바람직한 예는 자연 발생 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩되는 상응하는 폴리펩티드 사슬과 비교하여 보다 적은 글리코실화 부위 또는 변경된 글리코실화 부위를 갖는 폴리펩티드 사슬에 관한 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예는 제 1 합성 뉴클레오티드 서열이 항체의 경쇄 또는 그의 절편을 엔코딩하고, 제 2 합성 뉴클레오티드 서열이 항체의 중쇄 또는 그의 절편을 엔코딩하는 포유류 발현 벡터에 관한 것이다. 바람직하게는, 발현 시 제 1 및 제 2 폴리펩티드 사슬은 항체 또는 면역글로불린 또는 그의 절편을 형성할 수 있다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 제 1 및/또는 제 2 합성 뉴클레오티드 서열은 효과기 단백질의 유전자에 융합된다. 이러한 경우, 발현 시 제 1 및 제 2 폴리펩티드 사슬은 융합 단백질을 형성할 수 있으며, 여기서 효과기 단백질은 항체 또는 면역글로불린 또는 그의 절편에 커플링된다.
본 발명에 따른 면역글로불린은 Fc-수용체 활성 또는 보체 활성화 작용 또는 둘 다를 가질 수 있다. 보체 활성화는 당업계에서 (가능하게 상이한 경로에 의해) 보체 케스케이드 (cascade) 의 유도와 관련되는 것으로 명백히 정의되어 있는 반면, 본 발명의 문맥에서 Fc-수용체 활성은 세포성 반응을 유발하는 세포성 Fc 수용체의 활성 (예를 들어, 자연 발생 IgG 또는 IgA 이 포식세포성 또는 세포독성 활성을 유발하는 경우, 또는 자연 IgE 부류 면역글로불린에 의해 세포성 수용체의 유발시 비만 세포 과립의 방출의 경우) 으로 이해되어야 한다. 유사하게 자연 항체 중, IgM 및 IgG 부류 항체 모두가 보체 활성을 유발할 수 있다. 임의의 상기와 같은 효과기 작용은 항체의 자연 발생 하위부류 및 그의 공지된 동종이형 중 변화할 수 있으며, 이에 따라 본 발명의 항체 중 변화할 수 있음은 당연하다. 그러나, 본 발명의 문맥에서, Fc-수용체 활성 또는 보체 활성 효과기 도메인이, 상기 수득되는 면역글로불린에서 도메인 교환에 의해 임의의 주어진 면역글로불린 구조로 엔지니어링되어 상기 수득되는 면역글로불린에 각각의 효과기 특성을 효과적으로 이동 또는 부가함이 가능하다.
면역글로불린은 주어진 항원에 대한 그의 특이적 결합과 별개로, 자연 발생 유형의 면역글로불린이거나, 또는 엔지니어링된 인공 유형의 면역글로불린일 수 있다. 이는 종(species)-키메라성 항체 또는 CDR 그라프트된 항체, 유전자 셔플링 (shuffling) 또는 지정-부위 엔지니어링에 의해 제작된 항체, PEG 로 화학적으로 변경된 항체 또는 상기 활성을 갖는 면역글로불린 부분을 또 다른 효소적으로 활성인 도메인과 같은 임의의 기타 단백질성 부분에 연결하는 융합 단백질 또는 동위원소-킬레이트 부분을 포함한다. 주어진 면역글로불린에 의해 수여되는 모든 활성 정도는 변화할 수 있다. 작용기 기능의 모든 유형은 면역글로불린 중쇄의 불변 부분 영역에 의해 초래되며; 예를 들어, 서로 다른 인간 IgG 하위부류는 보체 케스케이드의 단계를 활성화 및 증대하는 그의 상대 효능이 다양할 수 있다. 일반적으로, 인간 IgG1 및 IgG3 는 보체를 가장 효과적으로 고정시키고, IgG2 는 보다 덜 효과적이고, IgG4 는 보체를 활성화하지 않는다. 상기 활성 중 어느 하나를 시험하는 검정 형식은 면역학자 및 기타 사람들에게 잘 알려져 있다; 적합한 프로토콜은 예를 들어 [Harlow et al., Antibodies - a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1988] 와 같은 표준 면역화학 실험실 책자에서 찾을 수 있다. 예를 들어, 자연 발생 면역글로불린에서, 경쇄는 단일의 불변 도메인을 가지며 중쇄는 몇몇의 불변 영역 도메인을 갖는다. 모든 인간 하위부류 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 는 불변 사슬 부분을 통해 세포독성 효과기 작용을 매개하는데 (ADCC: 항체 지시 세포독성) (항체와 살해 세포/세포독성 T-림프구와의 상호작용에 의해 초래됨); 이는 IgG4 는 흔히 상기와 같은 효과를 매개하지 않는 것으로 생각되기 때문에 매우 주목할만하다. 그러나, 인간 IgG4 는 적어도 ADCC 를 내재적으로 매개할 수 있는 한편, 인간에서 뚜렷한 자연 다행태에 기인하여, 그의 정도는 51Cr-방출과 같은 검정에서 사용되는 효과기 세포의 원천에 의존/강하게 조절되는 것으로 일관되게 나타났다. 이는 [Greenwood J, Clark M, Waldmann H.: Structural motifs involved in human IgG antibody effector functions Eur J Immunol 1993; 5: 1098-1104] 에 의해 나타냈다.
자연 발생 항체 또는 면역글로불린 부류 IgG 및 IgA 는 본래 CH1, CH2 및 CH3 으로 칭하는 3 개의 불변 영역 도메인을 가지며, IgM 및 IgE 부류는 4 개의 불변 영역 도메인을 갖는다. 반면에, 예를 들어, WO02/056910 는 CH1 도메인이 없는 인간 치료를 위한 인공 항체를 고안하며; 이러한 항체는 또한 본 발명에 따른 면역글로불린의 개념에도 포함된다.
바람직하게는, 면역글로불린 또는 Ig 분자는 적어도 경첩 도메인, CH2 및 CH3 도메인 또는 그의 기능적 변형을 포함한다. 상기 도메인은 실질적인 Fc 부분, 예를 들어, 자연 IgG 를 형성한다. 이러한 면역글로불린의 구조적 요소의 상세한 설명 및 정의는 [Amzel et al., Three- dimensional structure of immunoglobulins, Ann. Rev. Biochem. 48, 961-997 (1979); Davies et al., Structural basis of antibody function, Ann. Rev. Immunol. 1, 87-117 (1983); Hunkapiller et al., Diversity of immunoglobulin gene superfamily, Adv. Immunol. 44, 1-63 (1989)] 에 기재되어 있다. 상기 도메인은 자연 발생 도메인, 이러한 도메인의 인공적으로 제조된 키메라성 변형 또는 예를 들어 지정-부위 돌연변이생성에 의해 엔지니어링된 도메인 또는 변형의 키메라성 조합일 수 있다. 과거에는, 키메라성, CDR 그라프트된 마우스 인간 키메라성 항체가 흔히 사용되었으며; 마찬가지로, 가변성 또는 CH1/CL 도메인 부분의 잠재적 글리코실화 부위는 흔히 지정-부위 돌연변이생성에 의해 제거되었다. 물론, 본 발명에 따른 면역글로불린의 임의의 부분의 엔지니어링 정도는 흔히 상보성 결정 부위 고유의 자연 변이성과 별개로, 엔지니어링된 항체에서의 연장된, 강한 면역성 모티프의 생성을 피하기 위한 필요에 의해 제한 될 수 있다. 이를 제외하고, 예를 들어 IgG 유형 항체의 Fv 부분 (VH 및 VL 도메인을 포함함) 으로 통상적으로 불리는 경첩 부분의 상류의 항체-결합 부분에 대해, 본 발명에 따른 유일한 요건은 이러한 부분이 2 개의 별개의 폴리펩티드 사슬 (분비시) 로 이루어지며 다소의 항원-결합 특성을 갖는 것이다. 본 발명에 따른 면역글로불린이 항원-결합 Fv 형식에서 '실에 꿰인 진주' 형식으로 배열된 다중 가변성 도메인에 의해 달성된 증가된 항원-결합 원자가를 갖는 것이 가능하다.
본 발명의 특히 바람직한 구현예에서, 항체의 경쇄를 엔코딩하는 제 1 의 합성 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID No.3 에서 묘사된 서열을 포함하고, 항체의 중쇄를 엔코딩하는 제 2 합성 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID No.1 에서 묘사된 서열을 포함한다. SEQ ID No.3 에 의해 엔코딩된 경쇄의 아미노산 서열은 SEQ ID No.4 에서 묘사된다. SEQ ID No.1 에 의해 엔코딩되는 중쇄의 아미노산 서열은 SEQ ID No.2 에서 묘사된다.
폴리펩티드 사슬을 코딩하는 합성 뉴클레오티드 서열 이외에, 포유류 발현 벡터는 코딩 서열로부터 효율적인 mRNA 의 전사 및 숙주 세포주에서 mRNA 의 효율적인 번역을 위해 필요한 조절 DNA 서열을 포함한다. 조절 서열이 합성 뉴클레오티드 서열에 작용가능하게 연결된 (operably linked) 경우, 이들은 상기 뉴클레오티드 서열의 전자 개시를 매개하고 포유류 세포의 환경 내에서 상응하는 mRNA 로부터의 효율적인 단백질 합성을 촉진시킬 것이다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 2 개의 전사 단위 각각에서 2 개의 상이한 폴리펩티드 사슬을 엔코딩하는 합성 뉴클레오티드 서열은 동일한 조절 단위의 제어 하에 있다.
바람직하게는, 본 발명의 포유류 발현 벡터는 추가로 동물 세포에서 선택가능한 하나 이상의 발현가능한 마커를 포함한다. 따라서, 바람직한 구현예에서, 본 포유류 발현 벡터는 선택가능 마커를 엔코딩하는 제 3 의 전사 단위를 포함한다. 티미딘 키나아제 (tk), 디히드로폴레이트 환원효소 (DHFR) 또는 글루타민 합성효소 (GS) 와 같이 흔히 사용되는 임의의 선택 마커가 사용될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 발현가능한 GS 선택 마커가 사용된다 (Bebbington et al., 1992, High-level expression of a recombinant antibody from myeloma cells using a glutamine synthetase gene as an amplifiable selectable marker, Bio/Technology 10:169-175; Cockett et al., 1990, High level expression of tissue inhibitor of metalloproteinases in Chinese Hamster Ovary (CHO) cells using Glutamine synthetase gene amplification, Bio/Technology 8: 662-667). GS 시스템은 치료 단백질의 제조를 위해 특히 중요한 오로지 2 개의 시스템 중 하나이다. 디히드로폴레이트 환원효소 (DHFR) 시스템과 비교하여, GS 시스템은 발달 동안 큰 시간 잇점을 제공하는데 이는 고도의 생산성의 세포주가 흔히 초기 형질전환체로부터 생성되어 유전자 증폭을 달성하기 위한 증가하는 선택제의 농도의 존재 하에서 수회의 선택에 대한 필요를 피할 수 있기 때문이다 (Brown et al., 1992, Process development for the production of recombinant antibodies using the glutamine synthetase (GS) system, Cytotechnology 9:231-236).
특히 일시적/에피솜 발현에 대해서만 사용될 경우, 본 발명의 발현 벡터는 진핵 숙주 세포에서의 자발적 복제/에피솜 유지를 위한 복제기점 예컨대 엡스타인 바 바이러스 (Epstein Barr Virus (EBV)) 또는 SV40 바이러스의 기점을 추가로 포함할 수 있으나, 선택 마커가 결여될 수 있다. 본 발명의 발현 벡터는 예를 들어, 선형 DNA 절편, 핵 표적 서열을 포함하는 DNA 절편을 포함하지만 이제 제한되지는 않거나, 또는 형질전환 시약, 동물 바이러스 또는 셔플되어 박테리아에서 제조될 수 있는 적합한 플라즈미드와의 상호 작용을 위해 특별히 최적화될 수 있다.
본 발명은 본 발명의 포유류 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공함에 의해서도 근원적인 기술적 문제를 해결한다. 따라서, 본 발명의 추가적 측면은 척추동물 숙주 세포, 바람직하게는 본 발명의 포유류 발현 벡터를 포함하는 척추동물 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 본 발명에 따른 숙주 세포는 초대 세포주에 반해 세포 배양액에서 안정적으로 증식될 수 있는 임의의 척추동물 숙주 세포주일 수 있다. 가능한 세포주는 예를 들어, COS 세포, NSO 세포, CHO 세포, HT1080 세포, PER-C6 세포, BHK 세포, Sf-9 세포, 293 또는 293-EBNA 세포이다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 척추동물 숙주 세포는 포유류 세포, 가장 바람직하게는 예를 들어, HT1080 세포, 293, 293-EBNA 또는 HBK-11 세포 (ATCC-CRL 12569; 또한 US6,136,599 참조) 와 같은 인간 세포이다. 가장 바람직하게는, 본 발명에 따른 인간 세포는 HT1080 세포 및 Per-C6 세포 (Crucell B. V., Netherlands; WO97/00326, 또한 EP-1161548 참조) 로 이루어진 군으로부터 선택된다. 가장 바람직하게는, 상기 세포는 HT1080 세포이다. 예를 들어, HT 1080 세포는 [Amercian Type Culture Collection, Manassas/VA, U.S.A.] 에서 ATCC No. CCL-121 로 주문할 수 있다. HT1080 세포는 글루타민 합성효소 선택 마커 시스템과 함께 사용될 경우 향상된 생성물 글리코실화를 허용하는 것으로 밝혀졌다 (WO 03/064630).
특히 바람직한 구현예에서, 포유류 숙주 세포는 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 세포주이며 (Puck et al., 1958, J. Exp. Med. 108: 945-955), 특히 CHO-Kl 세포 (ATCC CCL-61), CHO pro3-, CHO DG44, CHO P12, dhfr- CHO 세포주 DUK-BII (Chassin et al., PNAS 77, 1980, 4216-4220), DUXB11 (Simonsen et al., PNAS 80, 1983, 2495-2499) 또는 무혈청 부유 배양액 (i.e. 미립답체를 지닌 배양액 제외) 중 성장에 적응된 CHO 세포이다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 숙주 세포는 림프계 세포, 더욱 바람직하게는 예를 들어 하이브리도마, 골수종 및 트리오마 (trioma) 세포주를 포함하는 포유류 림프계 세포이다. 예는 비-분비성 하이브리도마 예컨대 SP2/0 및 비-분비성 골수종 세포 예컨대 마우스로부터 NSO 세포주 ECACC No. 85110503 (European Collection of Cell cultures, Centre for Applied microbiology, Salisbury/Wiltshire SP4 OJG, United Kingdom) 또는 래트로부터의 YB2/3.0 Ag20 (GB2070313 에 기술됨) 이다. 골수종 세포 예컨대 NS0 세포는 당업계에서 일상적으로 '골수종' 으로 칭하지만, 참된 B-림프구 세포 유형, 즉, 형질세포종 세포주이다 (Barnes et al., Cytotechnology 32:109-123, 2000).
포유류 숙주 세포의 기타 바람직한 예는 MRC5 인간 섬유모세포, 983M 인간 흑색종 세포, MDCK 갯과 신장 세포, Sprague-Dawley 래트로부터 단리된 RF 배양 래트 폐 섬유모세포 B16BL6 쥣과 흑색종 세포, P815 쥣과 비만세포종 세포 및 MT1A2 쥣과 유방선암종을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에 따라 포유류 숙주 세포로 발현 벡터를 도입하기 위해, 당업계에 널리 공지된 것과 같은 임의의 형질전환 기법, 예컨대 전기천공, 칼슘 포스페이트 공동-침전, DEAE-덱스트란 형질전환, 리포펙션이 주어진 숙주 세포 유형에 적절하다면 사용될 수 있다. 본 발명의 벡터로 형질전환된 포유류 숙주 세포가 일시적 또는 안정적으로 형질전환된 세포주로 생각될 수 있음을 주목해야 한다. 따라서, 본 발명에 따라 본 포유류 발현 벡터는 에피솜적으로 유지되거나 포유류 숙주 세포의 유전체에 안정적으로 혼입될 수 있다.
일시적 형질전환은 벡터가 지니는 선택 마커를 위한 선택 압력의 비(非)-설비를 특징으로 한다. 일시적 형질전환으로부터 유래되는 세포의 풀 또는 배치 (batch) 는 외래 DNA 를 취하지 않은 세포 및 취하고 발현하지 않는 세포를 포함하는 풀링된 (pooled) 세포 개체군이다. 형질전환 후 흔히 20-50 시간 동안 지속되는 일시적 발현 실험에서, 형질전환된 벡터는 에피솜 요소로 유지되며 아직 유전체에 혼입되지 않는다. 즉, 형질전환된 DNA 는 보통 숙주 세포 유전체로 혼입되지 않는다. 숙주 세포는 형질전환된 DNA 를 잃고, 일시적으로 형질전환된 세포 풀의 배양시 개체군 내의 형질전환된 세포를 과성장시키는 경향이 있다. 따라서, 발현은 형질전환 직후의 기간 동안 가장 강하며 시간에 따라 감소한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 일시적 형질전환은 형질전환 90 시간 후의 시점까지 선택 압력의 부재 하에서 세포 배양액에 유지되는 세포로 이해된다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 포유류 숙주 세포, 예를 들어 CHO 숙주 세포는 본 발명의 포유류 발현 벡터로 안정적으로 형질전환된다. 안정적 형질전환은 벡터 DNA 와 같이 새로 도입된 외래 DNA 가 일반적으로 무작위, 비-동종 재조합 사건에 의해 유전체 DNA 로 혼입되는 것을 의미한다. 벡터 DNA 의 복제수 및 동시에 유전자 생성물의 양은 벡터 서열이 숙주 세포의 DNA 로의 혼입후 증폭된 세포주를 선택하여 증가될 수 있다. 따라서, 상기와 같은 안정성 혼입이 유전자 증폭을 위한 추가의 선택 압력으로의 노출시 CHO 세포에서 이중 미세 염색체를 초래하는 것이 가능하다. 추가적으로, 벡터 서열의 경우, 안정적 형질전환은 예를 들어 유전체 혼입시 불필요하게 되는 박테리아 복제수 제어 영역과 같은 재조합 유전자 생성물의 발현에 직접 관련되지 않는 벡터 서열 부분의 손실을 초래할 수 있다. 따라서, 형질전환된 숙주 세포는 발현 벡터의 적어도 일부 또는 상이한 부분을 유전체 내로 혼입하였다.
본 발명은 하기 단계를 포함하는, 제 1 및 제 2 폴리펩티드 사슬 각각의 다중 복제본을 포함하는, 분비된 분자의 제조 수준을 개선하기 위한 방법을 제공함에 의해서도 근원적인 기술적 문제를 해결한다:
a) 적어도 제 1 및 제 2 폴리펩티드 사슬을 엔코딩하는 본 발명에 따른 발현 벡터로 포유류 숙주 세포를 형질전환시킴,
b) 숙주 세포를 적절한 조건 하에서 배양하여 세포의 증식 및 발현 제 1 및 제 2 폴리펩티드 사슬 각각의 다중 복제본을 포함하는 분자를 형성하는 세포 내 2 개의 폴리펩티드 사슬의 조합 및 형성된 분자의 분비를 가능하게 함,
c) 형성된 분자의 수확.
분비된 분자, 특히 분비된 항체의 제조 수준을 증가시키기 위한 방법은, 발현시 요망되는 분자를 형성하는 2 개의 상이한 폴리펩티드 사슬, 예를 들어 항체의 중쇄 및 경쇄를 엔코딩하는 2 개의 상이한 유전자-최적화된 유전자를 포함하는 본 발명의 포유류 2중-유전자 발현 벡터의 사용에 기초한다. 본 발명의 벡터의 사용에 의해, 유전자 모두가 유전자-최적화되지 않은 대조군 벡터 또는 오로지 하나의 유전자-최적화된 유전자를 포함하는 대조군 벡터와 비교하여 현저히 증가된 분비된 분자의 총 수율을 달성하는 것이 가능하다. 따라서, 본 발명의 방법은 유리하게, 분비된 분자의 상당히 향상된 제조 수준을 초래한다.
바람직하게는, 본 발명의 방법에서 서로 상이한 폴리펩티드 사슬 모두는 거의 1:1 비율로 발현된다. 이는 요망되는 분자가 중쇄 및 경쇄의 다중 복제본으로 이루어진 항체일 경우 특히 유리하다. 그러나, 2 개의 폴리펩티드 사슬의 발현을 다른 비율로 조절하는 것 또한 가능하다. 이는 상이한 유전자 최적화 방법을, 폴리펩티드 사슬을 엔코딩하는 2 개의 상이한 합성 뉴클레오티드 서열에 적용하거나, 2 개의 합성 뉴클레오티드 서열을 상이한 프로모터에 작용가능하게 연결하여 달성될 수 있다.
본 발명의 방법은 2 개 이상의 상이한 폴리펩티드 사슬로 이루어진 임의의 분비된 분자의 수율을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 바람직하게는, 분비된 분자는 분비성 항체이다. 그러나, 분비된 분자는 또한 상이한 폴리펩티드 사슬 또는 하위단위로 이루어진 또 다른 단백질일 수 있다. 상기 다중하위단위 단백질의 예는 몇몇의 상이한 하위단위를 포함하는 효소, 수용체 분자 및 이온-통로를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
포유류 세포주를 위한 적합한 배지 및 배양 방법은 예를 들어 US 5,633,162 에 기술된 바와 같이 당업계에 널리 공지되어 있다. 실험 플라스크를 위한 표준 세포 배양 배지 또는 저밀도 세포 배양 및 특정 세포 유형의 필요에 적응된 예는 Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 배지 (Morre, G., The Journal of the American Medical Association, 199, p.519 f. 1967), L-15 배지 (Leibovitz, A. et al., Amer. J. of Hygiene, 78, lp.173 ff, 1963), Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), Eagle's Minimal Essential Medium (MEM), Ham's F12 배지 (Ham, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sc.53, p288 ff. 1965) 또는 알부민, 트랜스페린 및 레시틴이 결핍된 Iscoves' Modified DMEM (Iscoves et al., J. Exp. med. 1, p. 923 ff, 1978) 을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, Ham's FlO 또는 F12 배지는 CHO 세포 배양을 위해 특별히 고안되었다. CHO 세포에 특별히 적응된 기타 배지는 EP-481 791 에 기술되어 있다. 상기와 같은 배양 배지는 우태아 혈청 (FBS, 송아지 태아 혈청 FCS 로도 칭함) 으로 보충될 수 있음이 공지되어 있으며, 후자는 호르몬 및 성장 인자의 천연 공급원을 제공할 수 있다. 포유류 세포의 세포 배양은 지금 과학 교과서 및 매뉴얼에 상세히 기술된 일반적인 작업이며, 예를 들어, [R. Ian Fresney, Culture of Animal cells, a manual, 4th edition, Wiley-Liss/N.Y., 2000] 에 상세하게 다루어져 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 사용된 세포 배양 배지는 송아지 태아 혈청 (FCS 또는 FBS) 이 결핍되며, 이는 '무혈청' 으로 칭한다. 무혈청 배지의 세포는 최적의 성장을 위해 무혈청 배지 중 인슐린 및 트랜스페린을 필요로 한다. 트랜스페린은 WO 94/02592 에 기술된 트로폴론과 같은 철포획제 (siderophore) 또는 비-펩티드성 킬레이트제 또는 바람직하게는 비타민 C 와 같은 항산화제와 함께 유기 철 원천의 증가된 수준에 의해 적어도 부분적으로 치환될 수 있다. 대부분의 세포주는 예를 들어, 표피 성장 인자 (EGF), 섬유모세포 성장 인자 (FGF), 인슐린형 성장 인자 I 및 II (IGFI, IGFII) 등을 포함하는 하나 이상의 합성 성장 인자 (재조합 폴리펩티드 포함) 을 필요로 한다. 필요할 수 있는 기타 부류의 인자는 하기를 포함한다: 프로스타글란딘, 운반 및 결합 단백질 (예를 들어, 세풀로플라스민, 고밀도 및 저밀도 지질단백질, 소혈청 알부민 (BSA)), 스테로이드 호르몬을 포함하는 호르몬, 및 지방산. 폴리펩티드 인자 심험은 성장 촉진성으로 밝혀진 것의 존재 하에서 새로운 폴리펩티드 인자를 시험하는 단계식 방식으로 가장 잘 수행된다. 이들 성장 인자는 합성 또는 재조합이다. 동물 세포 배양에서 잘 알려진 몇몇의 방법론적 방식이 있으며, 하나의 예는 하기에 기술된다. 초기 단계는 세포가 혈청-보충된 배양 배지로부터 이동 후 3-6 일 동안 생존 및/또는 서서히 성장하는 조건을 수득하기 위해서이다. 대부분의 세포 유형에서, 이는 적어도 부분적으로 접종량 밀도의 함수이다. 최적의 호르몬/성자 인자/폴리펩티드 보충이 밝혀진 후, 생존에 필요한 접종량 밀도는 감소할 것이다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 세포 배양 배지는 무(無)-단백질, 즉, 태아 혈청 및 개별적인 단백질 성장 인자 보충물 모두 또는 재조합 트랜스페린과 같은 기타 단백질이 없다.
또 다른 구현예에서 본 발명의 방법은 동물 숙주 세포의 고밀도 성장, 예를 들어 공업용 공급-배치 바이오리액터 (fed-batch bioreactor) 를 포함한다. 이후, 통상적인 하류 공정이 적용될 수 있다. 결과적으로, 고밀도 성장 배양 배지가 이용되어야 한다. 상기와 같은 고밀도 성장 배지는 일반적으로 모든 아미노산과 같은 영양분, 상술된 범위의 글루코스와 같은 에너지원, 무기염, 비타민, 미량 원소 (일반적으로 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로 정의됨), 완충액, 4 개의 뉴클레오시드 또는 그의 상응하는 뉴클레오티드, 글루타티온 (환원) 과 같은 항산화제, 비타민 C 및 기타 성분 예컨대 중요한 막 지질, 예를 들어, 콜레스테롤 또는 포스파티딜콜린 또는 지질 전구체, 예를 들어, 콜린 또는 이노시톨로 보충될 수 있다. 고밀도 배지는 이들 화합물 대부분 또는 모두에서 보강되며, 본질적으로 등장 배지의 삼투몰농도가 기초하여 조절되는 무기염을 제외하고, RPMI 1640 과 비교하여, GB2251 249 로부터 초래될 수 있는 상기 언급된 표준 배지보다 더 높은 양 (강화) 으로 포함할 것이다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 고밀도 배양 배지는 트립토판을 제외한 모든 아미노산이 75 mg/l 배양 배지 초과인 점에서 강화된다. 바람직하게는, 일반적인 아미노산 요건과 함께, 글루타민 및/또는 아스파라긴은 1 g/l 초과이며, 더욱 바람직하게는 2 g/l 초과의 고밀도 배양 배지이다. 본 발명의 문맥에서, 고밀도 세포 배양액은 105 세포/ml 이상 또는 초과, 바람직하게는 106 세포/ml 이상 또는 초과의 생존가능 세포의 밀도를 임시로 갖는 동물 세포의 개체군으로서, 세포 배양 배지 중 단일 세포 또는 더욱 낮은 생존가능 세포 밀도의 접종량으로부터 일정하거나 증가하는 배양액 부피로 지속적으로 성장시킨 개체군으로 정의된다.
추가의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 방법은 공급-배치 배양액을 포함한다. 공급-배치 배양액은 개별적인 공급물에 의한 글루코스 농도 제어와 별개로, 임의로 하나 또는 몇몇의 기타 아미노산, 바람직하게는 글리신과 함께 적어도 글루타민이 배지 내 그의 농도를 유지하기 위해 GB2251249 에 기술된 바와 같이 세포 배양액에 공급되는 배양 시스템이다. 더욱 바람직하게는, 글루타민 및 임의로 하나 또는 기타 아미노산의 공급물은 EP-229 809-A 에서 기술된 바와 같이 세포 배양액에 글루코스와 같은 하나 이상의 에너지원의 공급과 혼합된다. 공급물은 보통 배양 개시 후 25-60 시간에 시작되며; 예를 들어, 세포가 약 106 세포/ml 의 밀도에 도달하였을 때 공급을 시작하는 것이 유용하다. 배양된 동물 세포에서 '글루타미노가수분해' (McKeehan et al., 1984, Glutaminolysis in animal cells,in: Carbohydrate Metabolism in Cultured Cells, ed. MJ. Morgan, Plenum Press, New York, pp. 11-150) 가 성장 시기 동안 중요한 에너지원이 될 수 있음이 당업계에 널리 공지되어 있다. 총 글루타민 및/또는 아스파라긴 공급물 (아스파라긴에 의한 글루타민의 치환을 위한, Kurano, N. et al., 1990, J. Biotechnology 15, 113-128 참조) 은 일반적으로 리터 배양액 부피 당 0.5 내지 10 g, 바람직하게는 리터 당 1 내지 2 g 범위이며; 공급물 내에 존재할 수 있는 기타 아미노산은 배양물의 리터 당 10 내지 300 mg 총 공급물이며, 특히 글리신, 라이신, 아르기닌, 발린, 이소루신 및 루신은 일반적으로 기타 아미노산과 비교하여 150 내지 200 mg 이상의 높은 양으로 공급된다. 공급물은 샷(shot)-첨가로서, 또는 지속적인 펌프식 공급으로서 첨가될 수 있으며, 바람직하게 공급물은 거의 지속적으로 바이오리액터에 펌핑된다. pH 는 염기 또는 완충액의 첨가에 의해 주어진 세포주에 최적인 대략의 생리학적 pH 로 바이오리액터에서의 공급-배치 배양 동안 조심스럽게 제어된다. 글루코스가 에너지원으로 사용될 경우, 총 글루코스 공급은 배양액의 리터 당 일반적으로 1 내지 10, 바람직하게는 3 내지 6 그램이다. 아미노산의 포함과 별개로, 공급물은 바람직하게 배양의 리터 당 5 내지 20 mg 범위의 소량의 콜린을 포함한다. 가장 바람직하게는, 상기 콜린의 공급물은 특히 글루타민 공급과 함께, 본질적으로 US 6,048,728 에서 기술된 바와 같이 에탄올아민의 보충물과 조합된다. GS-마커 시스템의 사용시, 비-GS 발현 시스템과 비교하여 소량의 글루코스가 필요한데, 이는 내재적으로 생성되는 것 이외의 과량의 글루타민의 축적이 암모니아 제조 및 수반되는 독성을 초래하기 때문이다. GS 에 대해서는, 공급물 또는 배지 중 글루타민은 대체로 그의 동등물 및/또는 전구체, 즉 아스파라긴 및/또는 글루타메이트에 의해 치환된다.
수확, 즉 세포로부터 주어진 단백질을 단리 및/또는 정제하는 방법, 세포 배양액 또는 세포가 배양되는 배지는 당업계에 널리 공지되어 있다. 단백질은 예를 들어 염 또는 유기 용매로의 분별 침전, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 크로마토그래피, HPLC, 친화도 크로마토그래피 등에 의해 생물학적 물질로부터 단리 및/또는 정제될 수 있다.
바람직한 구현예에서 포유류 숙주 세포는 CHO 세포이다.
도면은 하기를 나타낸다:
도 1 중쇄의 유전체 서열을 포함하는 벡터 pcB72.3 의 맵 (map)
도 2 중쇄의 cDNA 를 포함하는 벡터 pcB72.3 HC cDNA 의 맵
도 3 hCMV-MIE 프로모터의 제어 하에서 중쇄를 엔코딩하는 유전자-최적화된 유전자를 포함하는 벡터 pcB72.3 Geneart HC 및 중쇄를 엔코딩하는 유전자-최적화된 유전자 및 경쇄를 엔코딩하는 유전자-최적화된 유전자를 포함하는 벡터 pcB72.3 Geneart HC/LC (여기서, 각각의 유전자가 hCMV-MIE 프로모터의 제어 하에 있다) 의 맵.
도 4 형질전환된 CHO-KlSV 세포에서의 상대 항체 발현 수준. 중쇄를 엔코딩하는 유전체 DNA 를 포함하는 벡터 pcB72.3 및 중쇄를 엔코딩하는 cDNA 를 포함하는 벡터 pcB72.3 HC cDNA 간의 비교.
도 5 형질전환된 CHO-KlSV 세포에서의 상대 항체 발현 수준. 중쇄를 엔코딩하는 cDNA 를 포함하는 벡터 pcB72.3 HC cDNA, 중쇄를 엔코딩하는 유전자-최적화된 유전자를 포함하는 벡터 pcB72.3 HC 및 중쇄를 엔코딩하는 유전자-최적화된 유전자 및 경쇄를 엔코딩하는 유전자-최적화된 유전자를 포함하는 벡터 pcB72.3 HC/LC 간의 비교.
도 6 은 형질전환된 CHO-K1SV 세포에서의 항체 제조에 대한 유전자 최적화된 불변 영역의 영향을 나타낸다. 벡터 pConG1GA 는 최적화된 불변 영역 및 비-최적화된 가변 영역을 갖는 IgG1 유전자 서열을 포함한다. 벡터 pConG2GA 는 최 적화된 불변 영역 및 비-최적화된 가변 영역을 갖는 IgG2 유전자 서열을 포함한다. 벡터 pConG4GA 는 최적화된 불변 영역 및 비-최적화된 가변 영역을 갖는 IgG4 유전자 서열을 포함한다. 벡터 GlcDNA 는 비-최적화된 IgG1 유전자 서열을 포함하며, 벡터 G2cDNA 는 비-최적화된 IgG2 유전자 서열을 포함하며, 벡터 pcB72.3 HCcDNA 는 비-최적화된 IgG4 서열을 포함한다. 유전자-최적화된 불변 영역 및 유전자 최적화된 가변 영역을 갖는 벡터인, 벡터 pcB72.3 GAHC/LC 가 대조군으로 사용되었다. pcB72.3 (7) 및 pConG4GA (8) 에 대한 자료는 개별적인 실험으로부터 수득되었으며, pcB72.3 (l) 및 pcB72.3 (7) 사이에 관찰된 대조군 값의 차이를 설명한다.
서열 목록은 하기를 나타낸다:
SEQ ID No. 1 은 최적화된 cB72.3 중쇄를 엔코딩하는 핵산 서열을 나타낸다.
SEQ ID No. 2 는 SEQ ID No. 1 의 핵산 서열에 의해 엔코딩되는 최적화된 cB72.3 중쇄의 아미노산 서열을 나타낸다.
SEQ ID No. 3 은 최적화된 cB72.3 경쇄를 엔코딩하는 핵산 서열을 나타낸다.
SEQ ID No. 4 는 SEQ ID No. 3 의 핵산 서열에 의해 엔코딩되는 최적화된 cB72.3 경쇄의 아미노산 서열을 나타낸다.
본 발명의 본 명세서에서 주어진 바람직한 구현예에서의 설명 및 참조는 마찬가지로 본 발명의 모든 추가의 바람직한 구현예에 관련되는 것으로 이해된다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 더욱 상세하게 설명된다.
재료 및 방법
사용된 세포:
CHO 세포주 CHOK1SV: 은 CHO-Kl 세포주의 변형이며, 부유 및 단백질-결핍 배지 중의 성장에 적응시켰다.
CHOK1SV 세포의 증식:
CHOK1SV 세포는 6 mM L-글루타민이 보충된 CD-CHO 배지 (Invitrogen) 중 부유 진탕기에서 증식시켰다. 시드 (seed) 농도는 2 x 105 세포/ml 였으며, 세포는 매 4 일마다 계대하였다. 플라스크는 5% CO2 가스 공급하였고 140 rpm 으로 선회 진탕하며 36.5℃ (35.5℃ 내지 37.0℃)에서 배양하였다.
일시적 형질전환:
일시적 형질전환은 부유-성장 세포를 사용하여 수행하였다. 세포를 계수하고, 10% 혈청 및 6 mM L-글루타민으로 보충된 DMEM-기재 배지 중 웰 당 2.5 x 105 가변성 세포로 24-웰 플레이트의 벽에 분배하고, +36.5℃ 에서 밤새 배양하였다. 다음 날, 컨디셔닝된 (conditioned) 배지를 1 mL 의 (상기와 같은) 신선한 배지로 대체하고, +37℃ 에서 3 시간 동안 세포를 배양하였다.
각 형질전환을 위해, 5 ㎍ 의 각 SGV (HC 및 LC-SGV 가 함께 혼합됨) 또는 5 ㎍ 의 DGV 를 100 μL 형질전화 배지 (OptiMEM, Invitrogen) 에 재현탁시켰다. 양성 대조군을 위해, 세포를 모델 항체로 작용하는 IgG4/카파 항체에 대한 중쇄 및 경쇄 유전자를 엔코딩하는 벡터 pcB72.3 로 형질전환시켰다. 음성 대조군 (오로지 물) 또한 포함하였다.
각 형질전환을 위해, 5 μL 의 리포펙타민-2000 시약 (Invitrogen) 을 100 μL 형질전환 배지에 희석하고, 혼합하고 실온에서 5 분간 방치하였다.
DNA 및 희석된 리포펙타민 시약을 합하고, 혼합하고 추가로 대기 온도에서 20 분 동안 방치하였다. 이후, 상기 200 μL 혼합물은 세포를 포함하는 24-웰 플레이트의 웰에 첨가하였고, 세포를 +37℃ 에서 4 또는 10 시간 동안 교반하였다. 배양 상청액을 수집하고 조합 ELISA 에 의한 항체의 존재에 대한 검정 전에 원심분리에 의해 정화시켰다.
안정적 형질전환:
형질전환에 사용된 세포는 상기 설명된 바와 같이 세포 부유 배양액 중 성장시켰다. 성장 배양액으로부터의 세포를 원심분리하고 무혈청 배지에 1 회 세척한 후, 1.43 x 107 세포/mL 의 농도에 재현탁시켰다. 0.7 mL 부피의 세포 현탁액 및 40 ㎍ 의 플라즈미드 DNA 를 전기천공 큐벳에 첨가하였다. 이후, 큐벳을 전기청공 장치에 위치시키고 250 V 및 400 μF 의 단일 펄스를 가하였다. 형질전환 후, 10% dFCS 가 보충된 비-선택적 DMEM-기재 배지를 사용하여 세포를 96-웰 플레이트에 약 2,500 숙주 세포/웰 (5 x 104/mL) 로 분배하였다. 플레이트는 공기 중 10% CO2 의 대기 하에서 36.5℃ (35.5℃ 내지 37.0℃) 에서 인큐베이션하였다.
형질전환 다음 날, 10% dFCS/66 μM L-메티오닌 술폭시민이 보충된 DMEM-기재 배지를 각 웰 (150 μL/웰) 에 첨가하여 50 μM 의 최종 L-메티오닌 술폭시민 농도를 부여하였다. 비-형질전환된 세포가 언제 치사하는지, 및 형질전환 세포의 병터 (foci) 가 언제 나타나는지를 결정하기 위해 플레이트를 모니터하였다. 형질전환 세포의 병터는 형질전환 약 3 내지 4 주 후 명백해졌다. 조사되고 진행된 모든 세포주는 단일 콜로니만을 포함하는 웰로부터 기인하였다.
정적 배양 중 세포주의 생산성 평가
96-웰 형질전환 플레이트는 콜로니 형성을 허용하도록 약 3 주 동안 인큐베이션하였다. 수득된 콜로니는 콜로니가 검정을 위해 적합한 크기 (웰의 바닥의 60% 초과를 덮음) 이며, 오로지 하나의 콜로니가 각 웰에 존재함을 증명하기 위해 현미적으로 조사하였다.
적합한 콜로니를 1 mL 의 선택 성장 배지 (DMEM-기재 배지/10% dFCS/25μM L-메티오닌) 를 포함하는 24-웰 플레이트의 웰로 옮겼다. 상기 배양물을 공기 중 10% CO2 대기 하에서 36.5℃ (35.5℃ 내지 37.0℃) 에서 14 일 동안 인큐베이션 하였다. 각 웰의 상청액을 수확하고 단백질-A HPLC 방법에 의해 존재하는 항체의 농도에 대해 분석하였다.
조합 ELISA:
샘플의 항체 농도는 조합된 인간 IgG 를 측정하는 샌드위치 ELISA 를 사용하여 측정하였다. 이는 항-인간 Fc 항체로 코팅된 96 웰 플레이트 상으로의 시료 및 표준의 포획을 포함한다. 결합된 항체는 호스라디쉬 퍼옥시다제 (horseradish peroxidase) 및 색원체의 기질 TMB 에 연결된 항-인간 경쇄로 밝혀졌다. 색상 현색은 표준과 비교할 때 시료 내에 존재하는 항체의 농도와 비례하였다.
단백질 A HPLC:
IgG 의 측정을 위한 단백질 A 친화도 크로마토그래피 방법은 Agilent 1100 HPLC 상에서 수행하였다. IgG 생성물은 Poros 단백질 A 면역검출 컬럼에 선택적으로 결합한다. 비결합된 물질은 컬럼으로부터 세척하고 컬럼 및 나머지 결합 항체는 용매의 pH 를 감소시켜 유리시켰다. 용출은 280 nm 에서의 흡광도에 의해 모니터하였고 생성물은 일반적인 항체 표준에 대해 (Chemstation 소프트웨어를 사용하여) 정량하고, 흡광 계수에서의 차이에 대한 보정을 하였다.
벡터 구축
a)
중쇄
cDNA
pcB72.3 의 HC cDNA 는 제조사의 설명에 따라 리포펙타민-2000 (Invitrogen) 을 사용하여 pcB72.3 발현 벡터 (도 1 에 묘사됨) 을 CHOK1SV 세포로 일시적으로 형질전환시켜 생성하였다. 다음 날, 총 RNA 를 형질전환 세포로부터 추출하여 cDNA 합성에서 템플레이트로 사용하였다. cB72.3 HC 서열은 특정 프라이머를 사용하여 cDNA 로부터 증폭시켰다. 이러한 서열이 mRNA 로부터 유도되기 때문에 이는 인트론 서열이 결여된다. 이후, 상기 서열은 벡터 pEE6.4 로 클로닝하고, 벡터 pConK+VL 과 혼합하여 pcB72.3 HC cDNA 벡터 (도 2 에 묘사됨) 를 생성한 다.
b) 유전자-최적화된 유전자
유전자 최적화는 cB72.3 의 HC 및 LC 를 엔코딩하는 cDNA 서열 상에서 수행하였다. 모든 잠재적 음성 작용 서열을 제거하고, 코돈 사용을 최적화시키기 위해 서열 상에서 최적화를 수행하였다. 이후, 최적의 서열을 유전자 조합 방식을 사용하여 합성하였다. 조합 후, SEQ ID Nos. 1 및 3 에 각각 묘사된 HC 및 LC 엔코딩 서열을 Hind III 및 EcoR I 부위를 통해 (HC 를 위한) 벡터 pEE6.4 및 (LC 를 위한) 벡터 pEE12.4 로 클로닝하였다. 이후, DGV 는 Not I 및 Pvu I 제한 효소 부위를 통한 클로닝에 의해 HC 및 LC 발현 카세트를 혼합하여 생성하였다. 이러한 생성된 벡터 pcB72.3 Geneart HC 및 pcB72.3 Geneart HC/LC 는 도 3 에 묘사되어 있다.
c) 형질전환을 위한
DNA 의
제조
cDNA 및 Geneart 벡터를 위해, Qiagen Maxiprep 키트를 사용하여 DNA 의 벌크 제조를 수행하였다. 모든 형질전환에 대해 벡터 DNA 는 Pvu I 로의 소화에 의해 선형화시켰다. 완전한 선형화를 확인하기 위해 아가로스 젤 상에서 시료를 걸어 소화된 플라즈미드를 조사하였다. DNA 는 페놀:클로로포름 추출에 의해 정제하고 40 ㎍ 의 분할량으로 분할하였다. 각 분할량 내의 DNA 는 0.1 부피의 3 M 소듐 아세테이트, pH 5.2 및 2 부피의 빙냉 100% 에탄올의 첨가로 침전시켰고, 필요할 때까지 -20 ± 5℃ 에 저장하였다.
형질전환, 선택 및 과성장 배양
CHOK1SV 세포는 표준 전기천공 방법을 사용하여 벡터 구축물로 형질전환시켰다. 세포는 96-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 다음 날, 선택 배지를 50 μM 로 첨가하였다.
형질전환 4 주 후, 발생하는 콜로니에 대해 플레이트를 스크리닝하였다. 각 형질전환 풀에 대해, 적절한 크기의 약 100 개 콜로니를 25 μM MSX 를 포함하는 배지의 24-웰 플레이트로 옮겼다. 세포는 2 주 동안 과성장시키고, 이후 각 웰로부터의 세포 배양 배지를 수집하고, 존재하는 cB72.3 항체의 수준에 대해 단백질 A HPLC 로 평가하였다.
결과 및 토론
유전체 대
cDNA
중쇄
서열
pcB72.3 의 HC 엔코딩 서열로부터 인트론을 제거하는 효과는 안정적 형질전환에서 평가하였다. 형질전환체 각 세트의 104 개 콜로니를 24-웰 플레이트에서 과성장시키고, 각 세포주로부터 수득되는 항체 농도를 측정하였다. 결과는 도 4 및 표 1 에 요약하였다. 자료로부터, pcB72.3 HC 엔코딩 서열에서 인트론의 존재는 생성된 항체의 수준에 영향을 미치지 않는 것이 명백했다. 프로모터 서열 내의 인트론이 최대 유전자 발현에 필요하며, 이러한 인트론 단독이 효과적인 유전자 발현에 기여하는 것이 가능함이 나타났다.
상기가 달성되는 2 개의 가능한 기전이 있다. 프로모터 자체가 인트론이 존재하는 경우 더욱 효과적이거나, 또는 프로모터 유래된 인트론의 스플라이싱 후 생성되는 mRNA 가 더욱 안정적이다. HC 엔코딩 서열 내에 존재하는 것과 같은 인트론의 추가적인 스플라이싱은 증가된 유전자 발현을 초래하지 않음이 상기 자료로부터 명백하다.
표 1: 유전체 대
cDNA
비교로부터의 자료의 통계적 분석
| 구축물 | n | 평균 (㎍/ ml ) | 최대 (㎍/ ml ) | % 대 대조군 | p 대 대조군 1 |
| pcB72.3 (대조군) | 104 | 37.2 | 144 | - | - |
| pcB72.3 HC cDNA | 104 | 41.1 | 145.7 | 110 | 0.686 |
| (1) ANOVA 분석 - p ≤0.05 의 값은 유의한 것으로 간주된다. | |||||
유전자-최적화된 유전자 서열의 분석
DNA 서열 최적화의 효과를 안정적 형질전환에서 평가하였다. 형질전환체의 각 세트의 104 개의 콜로니를 24-웰 플레이트에서 과성장시키고, 각 세포주로부터 수득된 항체 농도를 측정하였다. 상기 경우, 유전자-최적화 서열이 표준 유전체 형식보다는 cDNA 형식으로 있었으므로 자료를 cDNA 변형과 비교하였다. 결과는 도 5 및 표 2 에 요약되어 있다.
유전자 최적화는 둘 모두의 사슬의 최적화가 35% (p = 0.006) 의 중앙값 항체 농도의 증가를 제공함을 나타내었다. 그러나, HC 단독의 최적화는 항체 발현에서의 유의한 증가를 초래하지 않았다. 자료는 항체 발현 증가를 위해 LC 의 최적화 또한 필요함을 나타낸다. 이에 대한 이유는 LC 서열이 차선이었고, 최적화가 발현된 LC 수준을 HC 수준과 일치시켰기 때문일 수 있다. 예를 들어, RNA 불안정성 모티프를 LC 서열로부터 제거하였고, 이는 HC 서열에 존재하지 않았다.
표 2: 유전자 최적화로부터의 자료의 통계적 분석
| 구축물 | n | 평균 (㎍/ ml ) | 최대 (㎍/ ml ) | % 대 대조군 | p 대 대조군 1 |
| pcB72.3 HC cDNA (대조군) | 104 | 41 | 145.7 | - | - |
| pcB72.3 HC Geneart | 104 | 40.8 | 94.1 | 99.5 | 0.539 |
| pcB72.3 Geneart HC/LC | 104 | 55.4 | 134 | 135 | 0.006 |
| (1) ANOVA 분석 - p ≤0.05 의 값은 유의한 것으로 간주된다. | |||||
유전자 최적화 불변 영역의 항체 제조에 대한 영향
IgGl, IgG2 및 IgG4 각각에 대한 중쇄 및 경쇄 유전자를 포함하는 벡터를 제조하였다 (여기서 중쇄 및 경쇄 유전자의 불변 영역은 최적화된 반면, 두 유전자의 가변 영역은 최적화되지 않았다). 따라서, 최적화된 불변 영역 및 비-최적화된 가변 영역을 갖는 IgG1 유전자 서열을 포함하는 벡터 pConG1GA, 최적화된 불변 영역 및 비-최적화된 가변 영역을 갖는 IgG2 유전자 서열을 포함하는 pConG2GA 벡터 및 최적화된 불변 영역 및 비-최적화된 가변 영역을 갖는 IgG4 유전자 서열을 포함하는 벡터 pConG4GA 를 생성하였다.
수득된 벡터는 항체 제조를 위한 표준 방식으로 시험하고 비-최적화된 cDNA 벡터, 특히 비-최적화된 IgG1 중 및 경 유전자를 포함하는 벡터 G1cDNA, 비-최적화 IgG2 중 및 경 유전자를 포함하는 벡터 G2cDNA 및 비-최적화 IgG4 서열을 포함하는 벡터 pcB72.3 HCcDNA 와 비교하였다. 또한 완전히 최적화된 벡터 pcB72.3 GAHC/LC, 유전자-최적화된 불변 영역 및 유전자 최적화된 가변 영역을 갖는 벡터를 첫번째 실험에서 대조군으로 포함하였다. 결과는 도 6 에 요약되어 있다. 벡터 pConG1GA 및 G1cDNA 의 비교는 IgG1 최적화된 불변 영역이 증가된 발현을 제 공함을 나타낸다. 또한, pConG2GA 및 G2cDNA 의 직접적인 비교는 IgG2 최적화된 불변 영역이 증가된 발현을 제공함을 나타낸다. 반면에, IgG4 최적화는 벡터 pConG4GA 및 pcB72.3 HCcDNA 의 비교에 의해 나타난 바와 같은 증가된 발현을 제공하지 않는다. 따라서, 유전자-최적화된 불변 영역의 사용은 증가된 평균 항체 발현을 초래함을 나타낸다.
IgG4 자료는 개별적인 실험으로부터 수득되었음을 유의해야 하며, 이는 2 개 세트의 형질전환 간에 관찰된 대조군 값의 차를 설명한다.
<110> Lonza Biologics plc.
<120> High-level expression of recombinant antibody in a mammalian host
cell
<130> LBP1009PCT00
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1500
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
taaaacgacg gccagtgagc gcgcgtaata cgactcacta tagggcgaat tgggtaccaa 60
gcttgccgcc accatggagt ggagctgggt gttcctgttc ttcctgagcg tgaccaccgg 120
cgtgcacagc caggtgcagc tgcagcagag cgacgccgag ctggtgaagc ctggcgccag 180
cgtgaagatc agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc gatcacgcca tccactgggc 240
caagcagaag cccgagcagg gcctggagtg gatcggctac atcagccccg gcaacgacga 300
catcaagtac aacgagaagt tcaagggcaa ggccaccctg accgccgaca agagcagcag 360
caccgcctac atgcagctga acagcctgac cagcgaggac agcgccgtgt acttctgcaa 420
gcggagctac tacggccact ggggccaggg caccaccctg acagtgagca gcgccagcac 480
caagggccca agcgtgttcc ccctggcccc ctgcagcaga agcaccagcg agagcacagc 540
cgccctgggc tgcctggtga aggactactt ccccgagccc gtgaccgtgt cctggaacag 600
cggagccctg acaagcggag tgcacacctt ccccgccgtg ctgcagagca gcggcctgta 660
ctccctgagc agcgtggtga ccgtgcccag cagcagcctg ggcaccaaga cctacacctg 720
caacgtggac cacaagccca gcaacaccaa agtggacaag cgcgtggaga gcaagtacgg 780
ccctccctgc cccagctgcc ctgcccccga gttcctgggc ggacccagcg tgtttctgtt 840
cccccccaag cccaaggata ccctgatgat cagccggacc cctgaagtga cctgcgtggt 900
ggtggatgtg agccaggagg accccgaagt gcagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga 960
agtgcacaac gccaagacca agcccagaga ggagcagttc aacagcacct accgcgtggt 1020
gtctgtgctg accgtgctgc accaggattg gctgaacggc aaggagtaca agtgcaaagt 1080
gagcaacaag ggcctgccta gcagcatcga gaaaaccatc agcaaggcca agggccagcc 1140
aagagagccc caggtgtaca ccctgccccc ctcccaggag gagatgacca agaaccaggt 1200
gtccctgacc tgtctggtga agggcttcta ccccagcgac atcgccgtgg agtgggagag 1260
caacggccag cccgagaaca actacaagac caccccccct gtgctggaca gcgatggcag 1320
cttcttcctg tacagccggc tgaccgtgga taagagcaga tggcaggagg gcaacgtgtt 1380
cagctgcagc gtgatgcacg aggccctgca caatcactac acccagaaga gcctgagcct 1440
gtccctgggc aagtgagaat tccgagctcc agcttttgtt ccctttagtg agggttaatt 1500
1500
<210> 2
<211> 460
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Asp Ala Glu Leu Val Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Thr Asp His Ala Ile His Trp Ala Lys Gln Lys Pro Glu Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Ser Pro Gly Asn Asp Asp Ile Lys Tyr Asn
65 70 75 80
Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
100 105 110
Tyr Phe Cys Lys Arg Ser Tyr Tyr Gly His Trp Gly Gln Gly Thr Thr
115 120 125
Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
130 135 140
Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys
145 150 155 160
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
165 170 175
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
180 185 190
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
195 200 205
Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn
210 215 220
Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro
225 230 235 240
Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
245 250 255
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
260 265 270
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe
275 280 285
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
290 295 300
Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
305 310 315 320
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
325 330 335
Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
340 345 350
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln
355 360 365
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
370 375 380
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
385 390 395 400
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
405 410 415
Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu
420 425 430
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
435 440 445
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
450 455 460
<210> 3
<211> 800
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
taaaacgacg gccagtgagc gcgcgtaata cgactcacta tagggcgaat tgggtaccaa 60
gcttgccgcc accatgagcg tgcccaccca ggtgctgggc ctgctgctgc tgtggctgac 120
cgatgccaga tgcgacatcc agatgaccca gagccccgcc agcctgagcg tgtctgtggg 180
cgagaccgtg accatcacct gcagagccag cgagaacatc tacagcaacc tggcctggta 240
tcagcagaag cagggcaaga gcccccagct gctggtgtac gccgccacca acctggccga 300
cggcgtgccc agcagattca gcggcagcgg ctccggcacc cagtacagcc tgaagatcaa 360
cagcctgcag agcgaggatt tcggcagcta ctactgccag cacttctggg gcacccccta 420
cacctttggc ggcggaacca ggctggagat caagcggacc gtggccgccc ccagcgtgtt 480
catcttcccc cccagcgatg agcagctgaa gagcggcacc gccagcgtgg tgtgtctgct 540
gaacaacttc taccctcgag aggccaaagt gcagtggaaa gtggacaacg ccctgcagtc 600
cggcaacagc caggagagcg tgaccgagca ggacagcaag gactccacct acagcctgag 660
cagcaccctg accctgagca aggccgacta cgagaagcac aaagtgtacg cctgcgaagt 720
gacccaccag ggcctgtcca gccccgtgac caagagcttc aaccggggcg agtgctgaga 780
attccgagct ccagcttttg 800
<210> 4
<211> 234
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Met Ser Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr
1 5 10 15
Asp Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser
20 25 30
Val Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn
35 40 45
Ile Tyr Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro
50 55 60
Gln Leu Leu Val Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn
85 90 95
Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp
100 105 110
Gly Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg
115 120 125
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
130 135 140
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
145 150 155 160
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
165 170 175
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
180 185 190
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
195 200 205
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
210 215 220
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
Claims (20)
- 적어도 제 1 폴리펩티드 사슬을 엔코딩하는 제 1 합성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제 1 전사 단위 및 제 2 폴리펩티드 사슬을 엔코딩하는 제 2 합성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제 2 전사 단위를 포함하는 포유류 발현 벡터로서, 여기서 제 1 및 제 2 합성 뉴클레오티드 서열은 자연 발생 뉴클레오티드 서열에 기초하며, 여기서 제 1 및 제 2 폴리펩티드 사슬은 제 1 및 제 2 폴리펩티드 사슬 각각의 하나 이상 또는 다중 복제본을 포함하는 분자를 형성할 수 있으며, 제 1 및 제 2 뉴클레오티드 서열 모두의 코돈 조성은 자연 발생 뉴클레오티드 서열이 원래 유래된 포유류 종으로부터 상이한 주어진 포유류 숙주 종의 유전자의 코돈 바이어스 (bias) 에 적응된 것을 특징으로 하는 포유류 발현 벡터.
- 제 1 항에 있어서, 제 1 및 제 2 뉴클레오티드 서열의 코돈 조성이 CHO 세포의 유전자의 코돈 바이어스에 적응된 포유류 발현 벡터.
- 적어도 제 1 폴리펩티드 사슬을 엔코딩하는 제 1 합성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제 1 전사 단위 및 제 2 폴리펩티드 사슬을 엔코딩하는 제 2 합성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제 2 전사 단위를 포함하는 포유류 발현 벡터로서, 여기서 제 1 및 제 2 합성 뉴클레오티드 서열은 자연 발생 뉴클레오티드 서열에 기초하며, 여기서 제 1 및 제 2 폴리펩티드 사슬은 제 1 및 제 2 폴리펩티드 사슬 각각의 하 나 이상 또는 다중 복제본을 포함하는 분자를 형성할 수 있으며, 제 1 및 제 2 뉴클레오티드 서열 모두의 코돈 조성은 그의 mRNA 가 더욱 높은 효율로 전사되도록 변경된 것을 특징으로 하는 포유류 발현 벡터.
- 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 2 개의 합성 뉴클레오티드 서열은 상응하는 자연 발생 뉴클레오티드 서열과 상이한 GC 함량 및/또는 GC 분포를 갖는 포유류 발현 벡터.
- 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 2 개의 합성 뉴클레오티드 서열은 상응하는 자연 발생 뉴클레오티드 서열과 상이한 AT 함량 및/또는 AT 분포를 갖는 포유류 발현 벡터.
- 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 2 개의 합성 뉴클레오티드 서열은 상응하는 자연 발생 뉴클레오티드 서열보다 적은 시스-작용 서열 모티프를 포함하는 포유류 발현 벡터.
- 제 6 항에 있어서, 2 개의 합성 뉴클레오티드 서열은 보다 적은 내부 TATA-박스, 카이(chi)-부위 및/또는 리보솜 출입 부위 (ribosomal entry site) 를 포함하는 포유류 발현 벡터.
- 제 6 항 또는 제 7 항에 있어서, 2 개의 합성 뉴클레오티드 서열은 보다 적은 ARE, INS 및/또는 CRS 서열 요소를 포함하는 포유류 발현 벡터.
- 제 6 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 2 개의 합성 뉴클레오티드 서열은 보다 적은 반복 서열을 포함하여, 그의 RNA 가 자연 발생 뉴클레오티드 서열보다 적은 2 차 구조를 형성하는 포유류 발현 벡터.
- 제 6 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 2 개의 합성 뉴클레오티드 서열은 보다 적은 암호 스플라이스 (cryptic splice) 공여자 및 수용자 부위를 포함하는 포유류 발현 벡터.
- 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 2 개의 합성 뉴클레오티드 서열은 상응하는 자연 발생 뉴클레오티드 서열보다 적은 대안적 개시 부위를 포함하는 포유류 발현 벡터.
- 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 합성 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩되는 제 1 및 제 2 폴리펩티드 사슬은 자연 발생 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩되는 상응하는 폴리펩티드 사슬과 비교하여 동일한 아미노산 서열을 갖는 포유류 발현 벡터.
- 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 합성 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩되는 제 1 및 제 2 폴리펩티드 사슬은 자연 발생 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩되는 상응하는 폴리펩티드 사슬과 비교하여 상이한 아미노산 서열을 갖는 포유류 발현 벡터.
- 제 13 항에 있어서, 합성 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩되는 제 1 및 제 2 폴리펩티드 사슬은 자연 발생 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩되는 상응하는 폴리펩티드 사슬과 비교하여 보다 적은 글리코실화 부위 또는 변경된 글리코실화 부위를 갖는 포유류 발현 벡터.
- 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 합성 뉴클레오티드 서열이 항체의 경쇄 또는 그의 절편을 엔코딩하는 포유류 발현 벡터.
- 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 2 합성 뉴클레오티드 서열이 항체의 중쇄 또는 그의 절편을 엔코딩하는 포유류 발현 벡터.
- 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 및 제 2 폴리펩티드 사슬이 항체 또는 그의 절편을 형성할 수 있는 포유류 발현 벡터.
- 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 및/또는 제 2 합성 뉴 클레오티드 서열이 효과기 단백질의 유전자에 융합된 포유류 발현 벡터.
- 제 18 항에 있어서, 제 1 및 제 2 폴리펩티드 사슬이 융합 단백질을 형성하며, 여기서 효과기 단백질이 항체 또는 그의 절편에 커플링되는 포유류 발현 벡터.
- 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터가 선택가능 마커, 바람직하게는 글루타민 합성효소 (GS) 마커를 엔코딩하는 제 3 전사 단위를 포함하는 포유류 발현 벡터.
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|---|---|---|---|
| GB0510277.7 | 2005-05-20 | ||
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