ES2940900T3

ES2940900T3 - Potenciadores de líneas celulares de producción

Info

Publication number: ES2940900T3
Application number: ES13729169T
Authority: ES
Inventors: Gang Chen; Darya Burakov; Dipali Deshpande
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2012-05-29
Filing date: 2013-05-29
Publication date: 2023-05-12
Anticipated expiration: 2033-05-29
Also published as: US20190270800A1; TW201823460A; ZA201408289B; DK2875047T3; USRE48651E1; WO2013181253A1; BR112014029095A2; US9228012B2; US20150353634A1; US9688751B2; EA201792213A1; US10227401B2; EA201492242A1; SG11201407652RA; CA2873131A1; AU2021240303A1; EA028790B1; JP2022044609A; JP7382383B2; KR102126210B1

Abstract

La presente invención se refiere al descubrimiento de la expresión ectópica de EDEM2 en una célula de producción para mejorar el rendimiento de una proteína multisubunitaria útil. Por tanto, la presente invención proporciona líneas celulares de producción, tales como la célula de producción biofarmacéutica canónica de mamífero - la célula CHO, que contiene polinucleótidos recombinantes que codifican EDEM2. También se describe una célula de producción que contiene tanto un polinucleótido que codifica EDEM2 como un polinucleótido que codifica XBP1. Se describen títulos mejorados de anticuerpos producidos por estas líneas celulares, así como las densidades celulares mejoradas alcanzadas por estas células en cultivo. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Potenciadores de líneas celulares de producción

Campo

La invención se refiere a una célula o células que expresan una lectina de respuesta al estrés recombinante para la producción mejorada de una proteína de múltiples subunidades. Específicamente, la invención se refiere a una célula de mamífero que contiene un gen que codifica la proteína EDEM2, y que produce un anticuerpo con un título alto.

Antecedentes

La fabricación de proteínas terapéuticamente activas requiere un plegado y procesamiento apropiados previo a la secreción. El plegado adecuado es particularmente relevante para las proteínas, tales como los anticuerpos, las cuales consisten de múltiples subunidades que deben ensamblarse apropiadamente antes de la secreción. Las células eucariotas han adaptado un sistema que garantiza el plegado apropiado de las proteínas y la eliminación de las proteínas mal plegadas de la vía secretora. Este sistema se denomina vía de respuesta a proteínas desplegadas (UPR), y se activa por la acumulación de proteínas mal plegadas en el retículo endoplasmático (ER).

Un evento temprano de la UPR es la activación del factor de transcripción Xbp1, que a su vez activa la transcripción de la proteína similar a la alfa-manosidasa 2 que potencia la degradación del retículo endoplasmático (EDEM2), un miembro de la vía de degradación asociada al retículo endoplasmático (ERAD). EDEM2 facilita la eliminación de proteínas mal plegadas. La vía ERAD comprende cinco etapas: (1) reconocimiento mediado por chaperonas de proteínas malformadas, (2) direccionamiento de proteínas malformadas a la maquinaria de retrotranslocación o E3-ligasas, que involucra a EDEM2, (3) iniciación de la retrotranslocación; (4) ubiquitinación y posterior retrotranslocación; y (5) direccionamiento y degradación de proteosomas.

Los anticuerpos son proteínas de múltiples subunidades que comprenden dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras, que deben plegarse y asociarse apropiadamente para formar un heterotetrámero funcional. Se desea cualquier mejora en el procesamiento eficiente y preciso de las cadenas pesadas y ligeras para mejorar el rendimiento o el título de los heterotetrámeros de anticuerpos funcionales.

Olivari y otros, 2005 describen la identificación y caracterización de EDEM2.

Resumen

Los solicitantes realizaron el sorprendente descubrimiento de que la expresión ectópica de EDEM2 en una línea celular de fabricación de proteínas aumenta la producción promedio de proteínas por célula, aumenta el título de proteínas secretadas en el medio, y aumenta la densidad celular integrada de las líneas celulares de producción. Por tanto, en un aspecto, la descripción proporciona una célula eucariota aislada que comprende y expresa:

(a) un polinucleótido recombinante que codifica una proteína similar a la alfa-manosidasa 2 que potencia la degradación del retículo endoplasmático (EDEM2), en donde el polinucleótido recombinante que codifica dicha EDEM2 es parte de un plásmido; y

(b) un polinucleótido o polinucleótidos que codifican una proteína de múltiples subunidades, en donde la proteína de múltiples subunidades es un anticuerpo, y en donde la expresión de EDEM2 en la célula aumenta el título de la proteína de múltiples subunidades secretada en el medio cuando se cultiva la célula.

La lectina de unión a la manosa inducida por estrés es la proteína EDEM2, cuyos ejemplos no limitantes se proporcionan en la Tabla 1, y la proteína de múltiples subunidades es un anticuerpo. En otras modalidades, la célula también contiene un polinucleótido que codifica la forma sometida a corte y empalme activa de XBP1, cuyos ejemplos no limitantes se proporcionan en la Tabla 2. En una modalidad, la célula es una célula de mamífero, tal como una célula CHO usada en la fabricación de productos biofarmacéuticos.

También se proporciona un método para fabricar una proteína de múltiples subunidades que es un anticuerpo, el método comprende las etapas de:

(a) transfectar células eucariotas con un vector que codifica una proteína similar a la alfa-manosidasa 2 que potencia la degradación del retículo endoplasmático (EDEM2);

(b) seleccionar las células que son células integrantes estables para el vector; y

(c) cultivar las células integrantes estables en el medio, en donde la proteína de múltiples subunidades es secretada por la célula en el medio,

en donde o bien las células eucariotas al comienzo de la etapa (a) ya contienen los constructos o elementos genéticos que codifican el anticuerpo, o los constructos o elementos genéticos que codifican el anticuerpo se introducen en las células integrantes estables seleccionadas en (b) antes de que se realice la etapa (c).

Además, se proporciona una célula de mamífero aislada que comprende:

(i) (a) un polinucleótido, que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 16, y (b) un polinucleótido, que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 18;

(ii) (a) un polinucleótido, que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 16, (b) un polinucleótido, que codifica un polipéptido que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 y

SEQ ID NO: 44, y (c) un polinucleótido, que codifica un polipéptido que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 y SEQ ID NO: 46;

(iii) (a) un polinucleótido, que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 16, (b) un polinucleótido, que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 23, y (c) un polinucleótido, que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 25;

(iv) (a) un polinucleótido, que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 16, (b) un polinucleótido, que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 31, y (c) un polinucleótido, que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 33;

(v) (a) un polinucleótido, que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 16, (b) un polinucleótido, que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 39, y (c) un polinucleótido, que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 41;

(vi) (a) un polinucleótido, que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 16, (b) un polinucleótido, que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 18, (c) un polinucleótido, que codifica un polipéptido que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 y s Eq ID NO: 44, y (d) un polinucleótido, que codifica un polipéptido que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 y SEQ ID NO: 46;

(vii) (a) un polinucleótido, que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 16, (b) un polinucleótido, que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 18, (c) un polinucleótido, que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 23, y (d) un polinucleótido, que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 25; (viii) (a) un polinucleótido, que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 16, (b) un polinucleótido, que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:

18, (c) un polinucleótido, que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 31, y (d) un polinucleótido, que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 33;

(ix) (a) un polinucleótido, que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 16, (b) un polinucleótido, que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 18, (c) un polinucleótido, que comprende la secuencia de ácido nucleico de

EQ ID NO: 39, y (d) un polinucleótido, que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 41;

(x) (a) un polinucleótido, que consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 14 o 15, y (b) un polinucleótido, que consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 17;

(xi) (a) un polinucleótido, que consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 14 o 15, (b) un polinucleótido, que codifica un polipéptido que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 y la

SEQ ID NO: 44, y

(c) un polinucleótido, que codifica un polipéptido que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID

NO: 45 y SEQ ID NO: 46;

(xii) (a) un polinucleótido, que consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 14 o 15, (b) un polinucleótido, que consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 24, y (c) un polinucleótido, que consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 26;

(xiii) (a) un polinucleótido, que consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 14 o 15, (b) un polinucleótido, que consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 32, y (c) un polinucleótido, que consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 4;

(xiv) (a) un polinucleótido, que consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 14 o 15, (b) un polinucleótido, que consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 40, y (c) un polinucleótido, que consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 42;

(xv) (a) un polinucleótido, que consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 14 o 15, (b) un polinucleótido, que consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 17, (c) un polinucleótido, que codifica un polipéptido que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 y s Eq ID NO: 44, y (d) un polinucleótido, que codifica un polipéptido que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 y SEQ ID NO: 46;

(xvi) (a) un polinucleótido, que consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 14 o 15, (b) un polinucleótido, que consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 17, (c) un polinucleótido, que consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 24, y (d) un polinucleótido, que consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 26;

(xvii) (a) un polinucleótido, que consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 14 o 15, (b) un polinucleótido, que consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 17, (c) un polinucleótido, que consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 32, y (d) un polinucleótido, que consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 34; o

(xviii) (a) un polinucleótido, que consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 14 o 15, (b) un polinucleótido, que consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 17, (c) un polinucleótido, que

consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 40, y (d) un polinucleótido, que consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 42.

También se describe una línea celular derivada de la célula descrita en el aspecto anterior. Por "derivada de", se entiende una población de células que descienden clonalmente de una célula individual y que tienen algunas cualidades seleccionadas, tales como la capacidad de producir proteína activa en un título determinado, o la capacidad de proliferar a una densidad particular. En algunos casos, la línea celular, que se deriva de una célula que alberga el polinucleótido recombinante que codifica una lectina de unión a la manosa inducida por estrés y un polinucleótido que codifica una proteína de múltiples subunidades, es capaz de producir la proteína de múltiples subunidades a un título de al menos 3 gramos por litro de medio (g/L), al menos 5 g/L, o al menos 8 g/L. En algunos casos, la línea celular puede alcanzar una densidad celular integrada (ICD) que es al menos 30 % mayor, al menos 50 % mayor, al menos 60 % mayor, o al menos 90 % mayor que la densidad celular integrada alcanzable por una línea celular derivada de lo que es esencialmente la misma célula pero sin el polinucleótido recombinante que codifica la lectina de unión a la manosa inducida por estrés.

También se describe un polinucleótido aislado o recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína EDEM2, que está unido operativamente (en cis) a un promotor de mamíferos constitutivo y expresado de manera ubicua, tal como el promotor de ubiquitina C. En algunos casos, la proteína EDEM2 tiene el aminoácido de SEQ ID NO: 8, o una secuencia de aminoácidos que es al menos 92 % idéntica a una cualquiera de SEQ ID NO: 1-7. En algunos casos, el polinucleótido comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 16. En un caso particular, el polinucleótido consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 14; y en otro caso particular, SEQ ID NO: 15.

También se describe un polinucleótido aislado o recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína XBP1, que está unido operativamente (en cis) a un promotor de mamíferos constitutivo y expresado de manera ubicua, tal como el promotor de ubiquitina C. En algunos casos, la proteína XBP1 tiene el aminoácido de SEQ ID NO: 13, o una secuencia de aminoácidos que es al menos 86 % idéntica a una cualquiera de SEQ ID NO: 9-12. En algunos casos, el polinucleótido comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 18. En un caso particular, el polinucleótido consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 17.

En algunas modalidades, la célula proporcionada también contiene un polinucleótido que codifica XBP1, como se describió en el aspecto anterior. En una modalidad, la cadena pesada del anticuerpo comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 y SEQ ID NO: 44, y la cadena ligera del anticuerpo comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 y SEQ ID NO: 46. En esta y varias modalidades, cada subunidad polipeptídica de la proteína de múltiples subunidades es codificada por un polinucleótido separado. Por tanto, por ejemplo, un polinucleótido que codifica un anticuerpo puede incluir un polinucleótido que codifica una cadena pesada y un polinucleótido que codifica una cadena ligera, por lo tanto dos subunidades. En algunas modalidades, la célula es una célula de ovario de hámster chino (CHO).

En una modalidad, la proteína de múltiples subunidades codificada es un anticuerpo anti-GDF8 que tiene una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 20 y una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 22. En una modalidad, el anticuerpo anti-GDF8 comprende una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 y una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21. En una modalidad, el polinucleótido que codifica la cadena pesada del anticuerpo anti-GDF8 comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 23; y el polinucleótido que codifica la cadena ligera del anticuerpo anti-GDF8 comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 25. En una modalidad, el polinucleótido que codifica la cadena pesada del anticuerpo anti-GDF8 consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 24; y el polinucleótido que codifica la cadena ligera del anticuerpo anti-GDF8 consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 25.

En otra modalidad, la proteína de múltiples subunidades codificada es un anticuerpo anti-ANG2 que tiene una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 28 y una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 30. En una modalidad, el anticuerpo anti-ANG2 comprende una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 y una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29. En una modalidad, el polinucleótido que codifica la cadena pesada del anticuerpo anti-ANG2 comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 31; y el polinucleótido que codifica la cadena ligera del anticuerpo anti-ANG2 comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 33. En una modalidad, el polinucleótido que codifica la cadena pesada del anticuerpo anti-ANG2 consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 32; y el polinucleótido que codifica la cadena ligera del anticuerpo anti-ANG2 consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 34.

En otra modalidad, la proteína de múltiples subunidades codificada es un anticuerpo anti-ANGPTL4 que tiene una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 36 y una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 38. En una modalidad, el anticuerpo anti-ANGPTL4 comprende una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 y una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 37. En una modalidad, el polinucleótido que codifica la cadena pesada del anticuerpo anti-ANGPTL4 comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 39; y el polinucleótido que codifica la cadena ligera del anticuerpo anti-ANGPTL4 comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 41. En una modalidad, el polinucleótido que codifica la cadena pesada del anticuerpo anti-ANGPTL4 consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 40; y el polinucleótido que codifica la cadena ligera del anticuerpo anti-ANGPTL4 consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 42.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para fabricar una proteína de múltiples subunidades, mediante el cultivo de una célula del aspecto anterior en un medio, en donde la proteína de múltiples subunidades se sintetiza en la célula y se secreta subsecuentemente en el medio. En algunas modalidades, la proteína de múltiples subunidades es un anticuerpo, tal como, por ejemplo, anti-GDF8, anti-ANG2, anti-ANGPTL4 o un anticuerpo que tiene secuencias de cadena pesada de SEQ ID NO: 43 y 44, y secuencias de cadena ligera de SEQ ID NO: 45 y 46. En algunas modalidades, la proteína de múltiples subunidades alcanza un título de al menos 3 g/L, al menos 5 g/L, al menos 6 g/L, o al menos 8 g/L. En algunas modalidades, la célula prolifera en el medio y establece una densidad celular integrada de aproximadamente > 5 3 107 célula-día/mL, aproximadamente > 1 x 108 célula-día/mL, o aproximadamente > 1,5 x 108 célula-día/mL.

También se describe una proteína de múltiples subunidades, que se fabrica de acuerdo con el método descrito en el aspecto anterior. En un caso, la proteína fabricada es un anticuerpo. En algunos casos, el anticuerpo consiste en una cadena pesada, que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 y SEQ ID NO: 44, y una cadena ligera, que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 y SEQ ID NO: 46. En un caso específico, la proteína de múltiples subunidades fabricada es un anticuerpo anti-GDF8 que tiene la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 20 y una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 22. En otro caso específico, la proteína de múltiples subunidades fabricada es un anticuerpo anti-ANG2 que tiene la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 28 y una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 30. Aún en otro caso específico, la proteína de múltiples subunidades fabricada es un anticuerpo anti-ANGPTL4 que tiene la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 36 y una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 38.

A menos que se defina de cualquier otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente descripción tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Como se usa en la presente, el término "aproximadamente", cuando se usa en referencia a un valor o intervalo de valores numéricos mencionados particulares, significa que el valor puede variar del valor mencionado en no más de 1 %. Por ejemplo, como se usa en la presente, la expresión "aproximadamente 100" incluye 99 y 101 y todos los valores intermedios (por ejemplo, 99,1, 99,2, 99,3, 99,4, etc.).

Como se usa en la presente, el término "polinucleótido recombinante", que se usa indistintamente con "polinucleótido aislado", significa un polímero de ácido nucleico tal como un ácido ribonucleico o un ácido desoxirribonucleico, ya sea monocatenario o bicatenario, que se origina mediante manipulaciones de ingeniería genética. Un polinucleótido recombinante puede ser un plásmido circular o un constructo lineal existente in vitro o dentro de una célula como un episoma. Un polinucleótido recombinante puede ser un constructo que se integra dentro de una molécula de polinucleótido más grande o una estructura supermolecular, tal como un cromosoma lineal o circular. La molécula de polinucleótido más grande o la estructura supermolecular pueden estar dentro de una célula o dentro del núcleo de una célula. Por tanto, un polinucleótido recombinante puede integrarse dentro de un cromosoma de una célula.

Como se usa en la presente, el término "lectina de unión a la manosa inducida por estrés" se refiere a una proteína de unión a la manosa, que significa una proteína que se une o es capaz de unirse a la manosa, derivados de la manosa, tales como manosa-6-fosfato, o una glicoproteína que expresa manosa o un derivado de manosa en su glicocáliz; y cuya actividad se regula positivamente durante el estrés. El estrés celular incluye, entre otras cosas, inanición, daño al ADN, hipoxia, intoxicación, estrés por cizallamiento y otras tensiones mecánicas, estrés tumoral y la acumulación de proteínas mal plegadas en el retículo endoplasmático. La lectina de unión a la manosa inducida por estrés empleada es una proteína EDEM2 (ver Vembar y Brodsky, Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 9(12): 944-957, 2008, y las referencias citadas en el mismo).

Como se usa en la presente, el término "EDEM2" significa cualquier variante ortóloga, homóloga o sustituida conservadoramente de la proteína similar a alfa-manosidasa que potencia la degradación del retículo endoplasmático. Las proteínas EDEM2 se conocen generalmente en la técnica por estar involucradas en la degradación asociada al retículo endoplasmático (ERAD), por estar reguladas positivamente por Xbp-1 y por facilitar la extracción de glicoproteínas mal plegadas del ciclo de calnexina para su eliminación. (Ver Mast y otros, Glycobiology 15(4): 421-436, 2004; Olivari y Molinari, FEBS Lett. 581: 3658-3664, 2007; Olivari y otros, J. Biol. Chem. 280(4): 2424-2428, 2005; y Vembar y Brodsky 2008). Secuencias EDEM2 ilustrativas se representan en la Tabla 1, que hace referencia cruzada al Listado de Secuencias.

Tabla 1

Como se usa en la presente, el término "Xbp1", también conocido como XBP1 o proteína 1 de unión a la caja X, significa cualquier variante ortóloga, homóloga o sustituida conservadoramente de Xbp1. Xbp1 es un factor de transcripción y elemento funcional de la UPR. El estrés del ER activa tanto (1) el factor de transcripción ATF6, que a su vez regula positivamente la transcripción del ARNm de Xbp1, como (2) la proteína de membrana del ER IRE1, que media el corte y empalme del ARNm precursor de Xbp1 para producir Xbp1 activa. Como se mencionó anteriormente, Xbp1 activada a su vez regula positivamente la actividad de EDEM2. (Ver Yoshida y otros, Cell Structure and Function 31(2): 117-125, 2006; y Olivari, 2005). Secuencias de aminoácidos ilustrativas de Xbp1 se representan en la Tabla 2, que hace referencia cruzada al Listado de Secuencias.

Tabla 2

Como se usa en la presente, el término "anticuerpo" generalmente pretende referirse a moléculas de inmunoglobulina que comprenden cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro, así como también multímeros de estas (por ejemplo, IgM); sin embargo, las moléculas de inmunoglobulina que consisten solo en cadenas pesadas (es decir, que carecen de cadenas ligeras) también se abarcan dentro de la definición del término "anticuerpo". Cada cadena pesada comprende una región variable de la cadena pesada (abreviada en la presente descripción como HCVR o VH) y una región constante de la cadena pesada. La región constante de la cadena pesada comprende tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera comprende una región variable de la cadena ligera (abreviada en la presente descripción como LCVR o VL) y una región constante de la cadena ligera. La región constante de la cadena ligera comprende un dominio (CL1). Las regiones VH y VL pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (FR). Cada VH y VL se compone de tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino terminal al extremo carboxi terminal en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Un "anticuerpo aislado" o "anticuerpo purificado" puede estar sustancialmente libre de otro material celular o sustancias químicas.

El término "se une específicamente", o similares, significa que un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de este forma un complejo con un antígeno que es relativamente estable en condiciones fisiológicas. La unión específica puede caracterizarse por una constante de disociación de al menos aproximadamente 1 x 10-6 M o mayor. Los métodos para determinar si dos moléculas se unen específicamente se conocen bien en la técnica e incluyen, por ejemplo, diálisis de equilibrio, resonancia de plasmón superficial, y similares. Un anticuerpo aislado que se une específicamente a GDF8 humana (por ejemplo) puede, sin embargo, tener reactividad cruzada con otros antígenos, tales como moléculas de GDF8 de otras especies (ortólogos).

Diversos anticuerpos se usan como ejemplos de proteínas de múltiples subunidades secretadas por células que albergan el polinucleótido que codifica una lectina de unión a la manosa inducida por estrés. Estos ejemplos incluyen anticuerpos anti-GDF8, anti-ANG2 y anti-ANGPTL4. Estos anticuerpos y similares se describen en las solicitudes de Patente de Estados Unidos núms. 20110293630, 20110027286 y 20110159015, respectivamente.

Como se usa en la presente, el término "célula" se refiere a una célula procariota o eucariota capaz de replicar ADN, transcribir ARN, traducir polipéptidos y secretar proteínas. Las células incluyen células animales usadas en la producción comercial de productos biológicos, tales como células de insectos (por ejemplo, células de Schneider, células Sf9, células Sf21, células Tn-368, células BTI-TN-5B1-4; ver Jarvis, Methods Enzymol. 463: 191-222, 2009; y Potter y otros, Int. Rev. Immunol. 10(2-3): 103-112, 1993) y células de mamíferos (por ejemplo, células CHO o CHO-K1, células COS o COS-7, células HEK293, células PC12, células HeLa, células de hibridoma; Trill y otros, Curr. Opin. Biotechnol. 6(5): 553-560, 1995; Kipriyanov y Little, Mo. Biotechnol. 12(2): 173-201, 1999). En una modalidad, la célula es una célula CHO-K1 que contiene los polinucleótidos de la vía UPR descritos. Para una descripción de las células CHO-K1, ver también Kao y otros, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 60: 1275-1281, 1968.

Como se usa en la presente, el término "promotor" significa una secuencia genética generalmente en cis y ubicada aguas arriba de una secuencia codificante de proteínas, y que facilita la transcripción de la secuencia codificante de proteínas. Los promotores pueden estar regulados (por el desarrollo, específicos de tejido o inducibles (químicos, temperatura)) o ser constitutivamente activos. En ciertas modalidades, los polinucleótidos que codifican proteínas están unidos operativamente a un promotor constitutivo. Por "unido operativamente", se entiende que el polinucleótido codificante de proteínas se ubica en dirección tres-prima (aguas abajo) y en cis del promotor, y está bajo el control del promotor. En ciertas modalidades, el promotor es un promotor de mamíferos constitutivo, tal como el promotor de ubiquitina C (ver Schorpp y otros, Nucl. Acids Res. 24(9): 1787-1788, 1996); Byun y otros, Biochem. Biophys. Res. Comm. 332(2): 518-523, 2005) o el promotor de CMV-IE (ver Addison y otros, J. Gen. Virol. 78(7): 1653-1661, 1997; Hunninghake y otros, J. Virol. 63(7): 3026-3033, 1989), o el promotor de hCMV-IE (promotor inmediato temprano de genes de citomegalovirus humano) (ver Stinski y Roehr, J. Virol. 55(2): 431-441, 1985; Hunninghake y otros, J. Virol. 63(7): 3026-3033, 1989).

Como se usa en la presente, la frase "densidad celular integrada", o "ICD" significa la densidad de células en un medio de cultivo tomado como un integral durante un período de tiempo, expresada como células-día por mL. En algunas modalidades, la ICD se mide alrededor del duodécimo día de células en cultivo.

Como se usa en la presente, el término "cultivo" significa tanto (1) la composición que comprende células, medio y proteína de múltiples subunidades secretada, como (2 ) el acto de incubar las células en el medio, independientemente de si las células se dividen activamente o no. Las células se pueden cultivar en un recipiente tan pequeño como un matraz de 25 mL o más pequeño, y tan grande como un biorreactor comercial de 10000 litros o más grande. "Medio" se refiere al medio de cultivo, que comprende entre otras cosas nutrientes, lípidos, aminoácidos, ácidos nucleicos, tampones y oligoelementos para permitir el crecimiento, proliferación o mantenimiento de las células, y la producción de la proteína de múltiples subunidades por las células. Los medios de cultivo celular incluyen medios definidos libres de suero y libres de hidrolizado, así como también medios suplementados con sueros (por ejemplo, suero fetal bovino (FBS)) o hidrolizados de proteínas. Los ejemplos no limitantes de medios, que pueden adquirirse comercialmente, incluyen el medio RPMI 1640, el medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), la mezcla DMEM/F12, la mezcla de nutrientes F10, la mezcla de nutrientes F12 de Ham y el medio esencial mínimo (MEM).

Como se usa en la presente, la frase "variante sustituida conservadoramente", como se aplica a los polipéptidos, significa un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos con una de más sustituciones de aminoácidos conservadoras. Una "sustitución de aminoácido conservadora" es una en la que un residuo de aminoácido se sustituye por otro residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral (grupo R) con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad). En general, una sustitución de aminoácido conservadora no cambiará sustancialmente las propiedades funcionales de una proteína. En los casos en los que dos o más secuencias de aminoácidos difieren entre sí por sustituciones conservadoras, el por ciento o grado de similitud puede ajustarse hacia arriba para corregir la naturaleza conservadora de la sustitución. Los medios para realizar este ajuste se conocen bien por los expertos en la técnica. Ver, por ejemplo, Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331, que se incorpora como referencia en la presente descripción. Los ejemplos de grupos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con propiedades químicas similares incluyen 1 ) cadenas laterales alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; 2) cadenas laterales hidroxialifáticas: serina y treonina; 3) cadenas laterales que contienen amida: asparagina y glutamina; 4) cadenas laterales aromáticas: fenilalanina, tirosina y triptófano; 5) cadenas laterales básicas: lisina, arginina e histidina; 6) cadenas laterales ácidas: aspartato y glutamato, y 7) cadenas laterales que contienen azufre: cisteína y metionina. Los grupos de sustituciones de aminoácidos conservadoras preferidas son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato y asparagina-glutamina. Alternativamente, un reemplazo conservador es cualquier cambio que tenga un valor positivo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250 descrita en Gonnet y otros (1992) Science 256: 1443-45. Un reemplazo "moderadamente conservador" es cualquier cambio que tenga un valor no negativo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250.

Modalidades - La célula

La presente invención proporciona una célula eucariota aislada que comprende y expresa:

En algunas modalidades, la proteína consiste en múltiples subunidades, que deben plegarse y ensamblarse apropiadamente para producir cantidades suficientes de proteína activa. La proteína de múltiples subunidades codificada es un anticuerpo y los anticuerpos tienen utilidad terapéutica o para la investigación. En algunas modalidades, la célula alberga un constructo genético recombinante (es decir, un polinucleótido) que codifica una o más de las subunidades individuales de la proteína de múltiples subunidades. En otras modalidades, el constructo genético que codifica las subunidades polipeptídicas individuales es de origen natural, tal como, por ejemplo, las secuencias de ácido nucleico que codifican las subunidades de un anticuerpo en un linfocito B.

Para facilitar el ensamblaje y la secreción apropiados de la proteína de múltiples subunidades, la célula contiene un polinucleótido recombinante que codifica una lectina de unión a la manosa inducida por estrés, que en algunas modalidades es un componente de la ERAD. La lectina de unión a la manosa inducida por estrés es una proteína similar a la alfa-manosidasa 2 que potencia la degradación del retículo endoplasmático (EDEM2). Se prevé que cualquier EDEM2 codificada o variante sustituida conservadoramente puede emplearse con éxito en la presente invención. La Tabla 1 enumera algunos ejemplos de proteínas EDEM2 de vertebrados. Una comparación por pares múltiples de esas secuencias de proteínas, que se realizó mediante el uso del programa Clustal W de Thompson y otros, Nucl. Acids Rev. 22(22): 4673-80, 1994 (ver también Yuan y otros, Bioinformatics 15(10): 862-3, 1999), reveló que cada una de las secuencias de polinucleótidos de EDEM2 descritas es al menos 69 % idéntica a la otra secuencia de EDEM2. Una comparación por Clustal W de las secuencias de EDEM2 de mamíferos descritas reveló que cada secuencia es al menos 92 % idéntica a la otra. Por tanto, en algunas modalidades, la célula contiene un polinucleótido que codifica un polipéptido de EDEM2 que tiene una secuencia que es al menos 92 % a una cualquiera de una EDEM2 de mamífero. Se construyó una secuencia de aminoácidos de EDEM2 de consenso mediante el alineamiento de secuencias de aminoácidos de polipéptidos de EDEM2 de ratón, rata, hámster, chimpancé y ser humano. Esa secuencia consenso se representa como SEQ ID NO: 8.

En diversas modalidades, la célula contiene un polinucleótido recombinante que codifica un polipéptido de EDEM2 que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 92 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de EDEM2 de ratón (mEDEM2); y en una modalidad particular, el polipéptido es mEDEM2 o una variante sustituida conservadoramente de este.

En algunas modalidades, la proteína de múltiples subunidades es un anticuerpo, y la célula contiene un polinucleótido que codifica uno cualquiera o más de un polipéptido que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45 y SEQ ID NO: 46. Las SEQ ID NO: 43 y 44 representan cada una secuencias consenso de las porciones aproximadamente N-terminal y C-terminal, respectivamente, de cadenas pesadas de anticuerpos particulares. Por tanto, el polinucleótido que codifica una subunidad de proteína en una modalidad codifica un polipéptido que comprende tanto la SEQ ID NO: 43 como la SEQ ID NO: 44. Las SEQ ID NO: 45 y 46 representan cada una secuencias consenso de las porciones aproximadamente N-terminal y C-terminal, respectivamente, de cadenas ligeras de anticuerpos particulares. Por tanto, el polinucleótido que codifica una subunidad de proteína en una modalidad codifica un polipéptido que comprende tanto la SEQ ID NO: 45 como la SEQ ID NO: 46. En algunas modalidades, además del polinucleótido recombinante que codifica la proteína EDEM2, la célula contiene al menos dos polinucleótidos, cada uno de los cuales codifica una subunidad particular de la proteína de múltiples subunidades. Por ejemplo, y como se ejemplifica más abajo, la célula contiene un polinucleótido que codifica una cadena pesada de anticuerpo que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 y SEQ ID NO: 44, y otro polinucleótido que codifica una cadena ligera de anticuerpo que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 y SeQ ID NO: 46.

En algunas modalidades, la célula, además de contener el polinucleótido de respuesta al estrés y uno o más polinucleótidos que codifican una subunidad de polipéptido, como se describió anteriormente, también contiene un polinucleótido que codifica un factor de transcripción de respuesta de proteína desplegada que funciona aguas arriba de EDEM2. El factor de transcripción aguas arriba es en algunos casos la forma sometida a corte y empalme de un XBP1. Se prevé que cualquier XBP1 codificado puede emplearse con éxito en la presente invención. La Tabla 2 enumera algunos ejemplos de secuencias de polipéptidos de forma sometida a corte y empalme de XBP1 de vertebrados. Una comparación por pares múltiples de esas secuencias de polipéptidos, que se realizó mediante el uso de Clustal W (Thompson 1994; Yuan 1999), reveló que cada una de las secuencias de polinucleótidos XBP1 sometidos a corte y empalme descritas es al menos 48 % idéntica a la otra secuencia de XBP1. Una comparación por Clustal W de las secuencias XBP1 de mamíferos descritas reveló que cada secuencia es al menos 86 % idéntica a la otra. Por tanto, en algunas modalidades, la célula contiene un polinucleótido que codifica una forma sometida a corte y empalme de un polipéptido XBP1 que tiene una secuencia que es al menos 86 % a una cualquiera de un XBP1 sometido a corte y empalme de mamífero. Se construyó una secuencia de aminoácidos XBP1 de consenso mediante el alineamiento de secuencias de aminoácidos XBP1 de ratón, hámster y ser humano. Esa secuencia consenso se representa como SEQ ID NO: 13. Por tanto, en algunas modalidades, la célula contiene un polinucleótido que codifica un polipéptido XBP1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13.

En diversas modalidades, la célula contiene un polinucleótido que codifica un polipéptido XBP1 que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 86 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de XBP1 de ratón (mXBPI) (SEQ ID NO: 9); y en una modalidad particular, el polipéptido es mXBPI, o una variante de este sustituida conservadoramente.

La invención prevé que cualquier célula eucariota puede usarse para albergar el polipéptido que codifica la lectina para la producción de una proteína de múltiples subunidades plegada apropiadamente y activa. Dichas células incluyen las células de producción de proteínas bien conocidas tales como, las levaduras Pichia pastoris y otras levaduras Pichia y que no son pichia, explantes de células vegetales, tales como los de Nicotiana, células de insectos, tales como las células de Schneider 2, Sf9 y Sf21, y las células High Five derivadas de Trichoplusia ni, y las células de mamíferos usadas típicamente en la bioproducción, tales como células CHO, CHO-K1, COS, HeLa, HEK293, Jurkat, y PC12. En algunas modalidades, la célula es una célula CHO-K1 o una CHO-K1 modificada tal como la que se enseña en las Patentes de Estados Unidos núms. 7,435,553, 7,514,545 y 7,771,997, así como también la solicitud de Patente Publicada de Estados Unidos núm. US 2010-0304436 A1.

En algunas modalidades particulares, la invención proporciona ex vivo una célula CHO-K1 que contiene (1) un polinucleótido que codifica mEDEM2 que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 16, (2) un polinucleótido que codifica XBP1 que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 18, (3) un polinucleótido que codifica la cadena pesada de anticuerpo que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 y 44, y (4) un polinucleótido que codifica la cadena ligera de anticuerpo que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 y 46.

En una modalidad particular, la invención proporciona ex vivo una célula CHO-K1 que contiene (1) un polinucleótido que codifica mEDEM2 que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 16, (2) un polinucleótido que codifica XBP1 que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 18, (3) un polinucleótido que codifica la cadena pesada de anticuerpo que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 23, y (4) un polinucleótido que codifica la cadena ligera de anticuerpo que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 25.

En otra modalidad particular, la invención proporciona ex vivo una célula CHO-K1 que contiene (1) un polinucleótido que codifica mEDEM2 que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 16, (2) un polinucleótido que codifica XBP1 que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 18, (3) un polinucleótido que codifica la cadena pesada de anticuerpo que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 31, y (4) un polinucleótido que codifica la cadena ligera de anticuerpo que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 33.

Aún en otra modalidad particular, la invención proporciona ex vivo una célula CHO-K1 que contiene (1) un polinucleótido que codifica mEDEM2 que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 16, (2) un polinucleótido que codifica XBP1 que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 18, (3) un polinucleótido que codifica la cadena pesada de anticuerpo que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 39, y (4) un polinucleótido que codifica la cadena ligera de anticuerpo que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 41.

La línea celular

En otro aspecto, la invención proporciona una línea celular, que comprende una pluralidad de células que descienden por expansión clonal a partir de una célula descrita anteriormente. Al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o aproximadamente 100 % de las células constituyentes de la línea celular contienen un polinucleótido recombinante que codifica una lectina de unión a la manosa inducida por estrés, que en algunas modalidades es un componente de la ERAD. La lectina de unión a la manosa inducida por estrés es una proteína similar a la alfa-manosidasa 2 que potencia la degradación del retículo endoplasmático (EDEM2). Se prevé que cualquier EDEM2 codificada o variante de esta sustituida conservadoramente puede emplearse con éxito en la presente invención. La Tabla 1, como se analizó en la sección anterior, enumera algunos ejemplos de proteínas EDEM2 de vertebrados. En algunas modalidades, la célula constituyente contiene un polinucleótido que codifica un polipéptido de EDEM2 que tiene una secuencia que es al menos 92 % idéntica a cualquier EDEM2 de mamífero. En algunas modalidades, la célula constituyente contiene un polinucleótido recombinante de SEQ ID NO: 1 o una variante de este sustituida conservadoramente. La proteína de múltiples subunidades que se produce mediante la línea celular es un anticuerpo, y en algunas modalidades la célula constituyente de la línea celular contiene un polinucleótido que codifica uno cualquiera o más de un polipéptido que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 y SEQ ID NO: 44 (que representan secuencias consenso de las porciones N-terminal y C-terminal, respectivamente, de cadenas pesadas de anticuerpos particulares), y SEQ ID NO: 45 y SEQ ID NO: 46 (que representan secuencias consenso de las porciones N-terminal y C-terminal, respectivamente, de cadenas ligeras de anticuerpos particulares). En algunas modalidades, además del polinucleótido recombinante que codifica la proteína EDEM2, la célula constituyente de la línea celular contiene al menos dos polinucleótidos, cada uno de los cuales codifica una subunidad particular de la proteína de múltiples subunidades. Por ejemplo, la célula constituyente contiene un polinucleótido que codifica una cadena pesada de anticuerpo que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 y SEQ ID NO: 44, y otro polinucleótido que codifica una cadena ligera de anticuerpo que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 y SEQ ID NO: 46.

En algunas modalidades, la célula constituyente, además de contener el polinucleótido de respuesta al estrés y uno o más polinucleótidos que codifican una subunidad de polipéptidos, como se describió anteriormente, también contiene un polinucleótido que codifica un factor de transcripción de respuesta de proteína desplegada, que funciona aguas arriba de EDEM2, tal como una forma sometida a corte y empalme de un XBP1. Se prevé que cualquier XBP1 codificado puede emplearse con éxito en la presente invención. La Tabla 2, como se analizó en la sección anterior, enumera algunos ejemplos de secuencias de polipéptidos de forma sometida a corte y empalme de XBP1 de vertebrados. El análisis por Clustal W de esas secuencias reveló que cada una de las secuencias de polinucleótidos XBP1 sometidos a corte y empalme descritas es al menos 48 % idéntica entre sí a la secuencia XBP1; y una comparación de las secuencias XBP1 de mamíferos reveló que cada secuencia es al menos 86 % idéntica a la otra. Por tanto, en algunas modalidades, la célula constituyente de la línea celular contiene un polinucleótido que codifica una forma sometida a corte y empalme de un polipéptido XBP1 que tiene una secuencia que es al menos 86 % a una cualquiera de un XBP1 sometido a corte y empalme de mamíferos.

En diversas modalidades, la célula contiene un polinucleótido que codifica un polipéptido XBP1 que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 86 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de XBP1 de ratón (mXBP1) (SEQ ID NO: 9); y en una modalidad particular, el polipéptido es mXBP1 de SEQ ID NO: 9, o una variante de este sustituida conservadoramente.

La invención prevé que la línea celular comprende células constituyentes cuyos progenitores se seleccionan de una lista de células de producción de proteínas bien conocidas tales como, por ejemplo, las levaduras Pichia pastoris y otras levaduras Pichia y que no son pichia, explantes de células vegetales, tales como los de Nicotiana, células de insectos, tales como las células de Schneider 2, Sf9 y Sf21, y las células High Five derivadas de Trichoplusia ni, y las células de mamíferos típicamente usadas en la bioproducción, tales como células CHO, CHO-K1, COS, HeLa, HEK293, Jurkat, y PC12. En algunas modalidades, la célula es una célula CHO-K1 o una CHO-K1 modificada, tal como la que se enseña en las Patentes de Estados Unidos núms. 7,435,553, 7,514,545 y 7,771,997, así como también en la Solicitud de Patente Publicada de Estados Unidos núm. US 2010-0304436 A1.

En algunas modalidades, la línea celular, que se cultiva en medio, es capaz de producir la proteína de múltiples subunidades y secretar la proteína de múltiples subunidades ensamblada apropiadamente en el medio a un título que es al menos 3 g/L, al menos 5 g/L o al menos 8 g/L.

Además, las células constituyentes de la línea celular son capaces de proliferar en cultivo hasta el punto de alcanzar una densidad celular integrada que es aproximadamente 30 % mayor que la densidad celular integrada de una línea celular que no contiene el polinucleótido recombinante que codifica la lectina de unión a la manosa inducida por estrés. En algunos casos, la línea celular es capaz de alcanzar una densidad celular integrada que es al menos aproximadamente 50 % mayor, al menos 60 % mayor, o al menos 90 % mayor que la densidad celular integrada de una línea celular que no contiene el polinucleótido recombinante que codifica una lectina de unión a la manosa inducida por estrés. En algunas modalidades, la densidad celular integrada de la línea celular se evalúa después de aproximadamente 12 días en cultivo.

En algunas modalidades particulares, la invención proporciona una línea celular que comprende células constituyentes derivadas clonalmente, en donde la célula constituyente es una célula CHO-K1 que contiene (1) un polinucleótido que codifica mEDEM2 que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 16, (2) un polinucleótido que codifica XBP1 que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 18, (3) un polinucleótido que codifica la cadena pesada de anticuerpo que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 y 44, y (4) un polinucleótido que codifica la cadena ligera de anticuerpo que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 y 46.

En una modalidad particular, la invención proporciona una línea celular que comprende células constituyentes derivadas clonalmente, en donde la célula constituyente es una célula CHO-K1 que contiene (1) un polinucleótido que codifica mEDEM2 que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 16, (2) un polinucleótido que codifica XBP1 que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 18, (3) un polinucleótido que codifica la cadena pesada de anticuerpo que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 23, y (4) un polinucleótido que codifica la cadena ligera de anticuerpo que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 25.

En otra modalidad particular, la invención proporciona una línea celular que comprende células constituyentes derivadas clonalmente, en donde la célula constituyente es una célula CHO-K1 que contiene (1) un polinucleótido que codifica mEDEM2 que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 16, (2) un polinucleótido que codifica XBP1 que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 18, (3) un polinucleótido que codifica la cadena pesada de anticuerpo que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 31, y (4) un polinucleótido que codifica la cadena ligera de anticuerpo que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 33.

Aún en otra modalidad particular, la invención proporciona una línea celular que comprende células constituyentes derivadas clonalmente, en donde la célula constituyente es una célula CHO-K1 que contiene (1) un polinucleótido que codifica mEDEM2 que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 16, (2) un polinucleótido que codifica XBP1 que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 18, (3) un polinucleótido que codifica la cadena pesada de anticuerpo que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 39, y (4) un polinucleótido que codifica la cadena ligera de anticuerpo que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 41.

El polinucleótido EDEM2

También se describe un polinucleótido que codifica una proteína EDEM2. El polinucleótido que codifica EDEM2 es recombinante y puede fabricarse, almacenarse, usarse o expresarse in vitro, como en un tubo de ensayo, o un sistema de traducción in vitro, o in vivo, tal como en una célula, que puede estar ex vivo, como en un cultivo celular, o in vivo, como en un organismo. En algunos casos, el polinucleótido que codifica EDEM2 está dentro de un gen, lo que significa que está bajo el control y aguas abajo de un promotor, y aguas arriba de un sitio de poliadenilación. El polinucleótido o gen que codifica EDEM2 puede estar dentro de un plásmido u otro vector circular o lineal. El polinucleótido o gen que codifica EDEM2 puede estar dentro de un constructo de ADN circular o lineal, que puede estar dentro de una célula como un episoma o integrado en el genoma celular.

Como se describió anteriormente, el polinucleótido que codifica EDEM2 codifica cualquier polipéptido EDEM2 ortólogo, homólogo o sustituido conservadoramente de la Tabla 1, o un polipéptido EDEM2 que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 92 % idéntica a una cualquiera de las SEQ iD NO: 1-5 y 8.

En algunos casos, el polinucleótido que codifica EDEM2 recombinante o aislado está unido operativamente a un promotor de mamífero. El promotor puede ser cualquier promotor, pero en algunos casos es un promotor de mamíferos, tal como, por ejemplo, un promotor de ubiquitina C.

En un caso particular, el polinucleótido que codifica EDEM2 consiste esencialmente en, de 5' a 3', un promotor, tal como un promotor de ubiquitina C, seguido de un intrón opcional, tal como un intrón de globina beta, seguido de una secuencia codificante de EDEM2, seguido de una secuencia de poliadenilación, tal como una secuencia SV40pA. Un ejemplo específico, que también es una modalidad particular, de dicho polinucleótido que codifica EDEM2 se describe mediante la s Eq ID NO: 16. Las variantes conservadas de esa secuencia también se prevé como modalidades de la invención.

En algunos casos, el polinucleótido que codifica EDEM2 recombinante es parte de un plásmido, que puede ser lineal, circular, episomal, integrado, un constructo de ADN estático, o un vector para suministrar el gen EDEM2 o expresar la proteína EDEM2. En una modalidad particular, el plásmido contiene (1) un gen EDEM2, que está bajo el control de un promotor de ubiquitina C y termina con una señal de poliadenilación de SV40, y (2) un marcador seleccionable, tal como un polinucleótido que codifica un polipéptido que confiere resistencia a la zeocina o un polinucleótido que codifica un polipéptido que confiere resistencia a la neomicina, bajo el control de un promotor, tal como el promotor de SV40, y termina con una secuencia de poliadenilación, tal como una secuencia de pA de PGK. En una modalidad particular, el plásmido comprende, en un formato circular que se ejecuta en una dirección de 5' a 3', un promotor de ubiquitina C, un intrón de globina beta, una secuencia codificante de EDEM2, una secuencia de pA de SV40, un promotor de SV40, una secuencia codificante de resistencia a la neomicina y una secuencia de pA de PGK. Un ejemplo específico de esta modalidad se ejemplifica mediante un plásmido que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 14. En otra modalidad particular, el plásmido comprende, en un formato circular que se ejecuta en una dirección de 5' a 3', un promotor de ubiquitina C, un intrón de globina beta, una secuencia codificante de EDEM2, una secuencia de pA de SV40, un promotor de SV40, una secuencia codificante de resistencia a la zeocina y una secuencia pA de PGK. Un ejemplo específico de esta modalidad se ejemplifica mediante un plásmido que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 15.

El polinucleótido XBP1

También se describe un polinucleótido que codifica una proteína XBP1. El polinucleótido que codifica XBP1 es recombinante y puede fabricarse, almacenarse, usarse o expresarse in vitro, como en un tubo de ensayo, o un sistema de traducción in vitro, o in vivo, tal como en una célula, que puede estar ex vivo, como en un cultivo celular, o in vivo, como en un organismo. En algunos casos, el polinucleótido que codifica XBP1 está dentro de un gen, lo que significa que está bajo el control aguas abajo de un promotor, y aguas arriba de un sitio de poliadenilación. El polinucleótido que codifica XBP1 puede estar dentro de un plásmido u otro vector circular o lineal. El polinucleótido o gen que codifica XBP1 puede estar dentro de un constructo de ADN circular o lineal, que puede estar dentro de una célula como un episoma, o integrado en el genoma celular.

Como se describió anteriormente, el polinucleótido que codifica XBP1 codifica cualquier polipéptido XBP1 ortólogo, homólogo o sustituido conservadoramente de la Tabla 2, o un polipéptido XBP1 que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 86 % idéntica a una cualquiera de las SEQ ID NO: 9, 10, y 11, lo que incluye la secuencia consenso de mamífero de SEQ ID NO: 13.

En algunos casos, el polinucleótido que codifica XBP1 recombinante o aislado se une operativamente a un promotor de mamíferos. El promotor puede ser cualquier promotor, pero en algunos casos es un promotor de mamíferos, tal como, por ejemplo, un promotor de ubiquitina C.

En un caso particular, el polinucleótido que codifica XBP1 consiste esencialmente en, de 5' a 3', un promotor, tal como un promotor de ubiquitina C, seguido de un intrón opcional, tal como un intrón de globina beta, seguido de una secuencia codificante de XBP1, seguido de una secuencia de poliadenilación, tal como una secuencia de pA de SV40. La SEQ ID NO: 18 describe un ejemplo de un polinucleótido que codifica XBP1. También se prevén las variantes conservadas de esa secuencia ilustrativa.

En algunos casos, el polinucleótido que codifica XBP1 recombinante es parte de un plásmido, que puede ser lineal, circular, episomal, integrado, un constructo de ADN estático, o un vector para suministrar el gen XBP1 o expresar la proteína XBP1 sometida a corte y empalme y activa. En un caso particular, el plásmido contiene (1) un gen XBP1, que está bajo el control de un promotor de ubiquitina C y termina con una señal de poliadenilación de SV40, y (2) un marcador seleccionable, tal como un polinucleótido que codifica un polipéptido que confiere resistencia a la zeocina o un polinucleótido que codifica un polipéptido que confiere resistencia a la neomicina, bajo el control de un promotor, tal como un promotor de SV40, y termina con una secuencia de poliadenilación, tal como una secuencia de pA de PGK. En un caso particular, el plásmido comprende, en un formato circular que se ejecuta en una dirección de 5' a 3', un promotor de ubiquitina C, un intrón de globina beta, una secuencia codificante de XBP1, una secuencia de pA de SV40, un promotor de SV40, una secuencia codificante de resistencia a la zeocina, y una secuencia de pA de PGK. Un ejemplo específico de esta modalidad se ejemplifica mediante un plásmido circular que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 17.

Los polinucleótidos que codifican las cadenas pesada y ligera de anticuerpo

También se describe un polinucleótido que codifica un polipéptido de cadena pesada (HC) de anticuerpo. El polinucleótido que codifica la HC es recombinante y puede fabricarse, almacenarse, usarse o expresarse in vitro, como en un tubo de ensayo, o un sistema de traducción in vitro, o in vivo, tal como en una célula, que puede estar ex vivo, como en un cultivo celular, o in vivo, como en un organismo. En algunos casos, el polinucleótido que codifica la HC está dentro de un gen, lo que significa que está bajo el control aguas abajo de un promotor y aguas arriba de un sitio de poliadenilación. El polinucleótido que codifica la HC puede estar dentro de un plásmido u otro vector circular o lineal. El polinucleótido o gen que codifica la HC puede estar dentro de un constructo de ADN circular o lineal, que puede estar dentro de una célula como un episoma o integrado en el genoma celular.

En algunos casos, el polinucleótido que codifica la HC recombinante o aislado está unido operativamente a un promotor de mamíferos. El promotor puede ser cualquier promotor, pero en algunos casos es un promotor de mamíferos, tal como, por ejemplo, un promotor de ubiquitina C o un promotor de hCMV-IE.

En un caso particular, el polinucleótido que codifica la HC es un gen de HC, que comprende esencialmente, de 5' a 3', un promotor, por ejemplo, un promotor de hCMV-IE, seguido de un intrón opcional, tal como un intrón de globina beta, seguido de una secuencia codificante de la cadena pesada, tal como por ejemplo una secuencia codificante de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 y 44, SeQ ID NO: 19, SEQ iD NO: 27 o SEQ ID NO: 35, seguido de una secuencia de poliadenilación, por ejemplo, una secuencia de pA de SV40. Un ejemplo específico de un gen de HC se describe por las SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 31 o SEQ ID NO: 39. También se prevén las variantes conservadas de una cualquiera de estas secuencias.

En algunos casos, el polinucleótido que codifica la HC recombinante es parte de un plásmido, que puede ser lineal, circular, episomal, integrado, un constructo de ADN estático, o un vector para suministrar el gen de cadena pesada o expresar la subunidad de la cadena pesada. En un caso particular, el plásmido contiene (1) un gen de HC, que está bajo el control de un promotor de hCMV-IE y termina con una señal de poliadenilación de SV40, y (2) un marcador seleccionable, tal como un polinucleótido que codifica un polipéptido que confiere resistencia a la higromicina, bajo el control de un promotor, tal como un promotor de SV40, y termina con una secuencia de poliadenilación, tal como una secuencia de pA de PGK. En un caso particular, el plásmido comprende, en un formato circular que se ejecuta en una dirección de 5' a 3', un promotor de hCMV-IE, un intrón de globina beta, una secuencia codificante de la cadena pesada de anticuerpo (que codifica una HC que tiene las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 y 44, SEQ ID NO: 19, SEQ iD NO: 27 o SEQ ID NO: 35), una secuencia de pA de SV40, un promotor de SV40, una secuencia codificante de resistencia a la higromicina, y una secuencia de pA de PGK. Un ejemplo específico y un caso particular de dicho plásmido que contiene un gen de HC se describe por las SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 32 o SEQ Id NO: 40. También se prevén las variantes conservadas de una cualquiera de estas secuencias.

También se describe un polinucleótido que codifica un polipéptido de la cadena ligera (LC) de anticuerpo. El polinucleótido que codifica la LC es recombinante y puede fabricarse, almacenarse, usarse o expresarse in vitro, como en un tubo de ensayo, o un sistema de traducción in vitro, o in vivo, tal como en una célula, que puede estar ex vivo, como en un cultivo celular, o in vivo, como en un organismo. En algunos casos, el polinucleótido que codifica la LC está dentro de un gen, lo que significa que está bajo el control aguas abajo de un promotor, y aguas arriba de un sitio de poliadenilación. El polinucleótido o gen que codifica la LC puede estar dentro de un plásmido u otro vector circular o lineal. El polinucleótido o gen que codifica la LC puede estar dentro de un constructo de ADN circular o lineal, que puede estar dentro de una célula como un episoma o integrado en el genoma celular.

En algunos casos, el polinucleótido que codifica la LC recombinante o aislado está unido operativamente a un promotor de mamíferos. El promotor puede ser cualquier promotor, pero en algunos casos es un promotor de mamíferos, tal como, por ejemplo, un promotor de ubiquitina C o un promotor de hCMV-IE.

En un caso particular, el polinucleótido que codifica la LC es un gen de LC, que comprende esencialmente, de 5' a 3', un promotor, por ejemplo un promotor de hCMV-IE, seguido de un intrón opcional, tal como un intrón de globina beta, seguido de una secuencia codificante de la cadena ligera, tal como por ejemplo una secuencia codificante de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 y 46, SEQ ID NO: 21, S^eQ ID N^o: 29 o SEQ ID NO: 37, seguido de una secuencia de poliadenilación, tal como una secuencia de pA de SV40. Un ejemplo específico y un caso particular de dicho gen de LC se describe por las SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 33 o SEQ ID NO: 41. También se prevén las variantes conservadas de una cualquiera de estas secuencias.

En algunos casos, el polinucleótido que codifica la LC recombinante es parte de un plásmido, que puede ser lineal, circular, episomal, integrado, un constructo de ADN estático, o un vector para suministrar el gen de cadena ligera o expresar la subunidad de cadena ligera. En un caso particular, el plásmido contiene (1) un gen de LC, que está bajo el control de un promotor de hCMV-IE y termina con una señal de poliadenilación de SV40, y (2) un marcador seleccionable, tal como un polinucleótido que codifica un polipéptido que confiere resistencia a la higromicina, bajo el control de un promotor, tal como un promotor de SV40, y termina con una secuencia de poliadenilación, tal como una secuencia de pA de PGK. En un caso particular, el plásmido comprende, en un formato circular que se ejecuta en una dirección de 5' a 3', un promotor de hCMV-IE, un intrón de globina beta, una secuencia codificante de la cadena ligera de anticuerpo (que codifica una LC que tiene las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 y 46, SEQ ID NO: 21, SEQ ID nO: 29 o SEQ ID NO: 37), una secuencia de pA de SV40, un promotor de SV40, una secuencia codificante de resistencia a la higromicina, y una secuencia de pA de PGK. Un ejemplo específico y un caso particular de dicho plásmido que contiene un gen de LC se describe por las SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 34 o SEQ Id NO: 42. También se prevén las variantes conservadas de una cualquiera de estas secuencias.

Métodos de fabricación de proteínas de múltiples subunidades

En otro aspecto, la invención proporciona un método para fabricar una proteína de múltiples subunidades mediante el cultivo de una célula, o una célula constituyente de una línea celular, que es capaz de producir y secretar cantidades relativamente grandes de una proteína de múltiples subunidades ensamblada apropiadamente, en un medio, en donde el componente de múltiples subunidades se secreta en el medio a un título relativamente alto. La célula utilizada en este proceso de fabricación es una célula descrita en los aspectos anteriores, que contiene un polinucleótido que codifica la lectina de ERAD descrita en la presente descripción.

Los métodos para cultivar células, y en particular células de mamíferos, con el propósito de producir proteínas recombinantes útiles se conocen bien en la técnica (por ejemplo, ver De Jesus y Wurm, Eur. J. Pharm. Biopharm.

78:184-188, 2011, y las referencias citadas en la misma). Brevemente, las células que contienen los polinucleótidos descritos se cultivan en medios, que pueden contener sueros o hidrolizados, o pueden definirse químicamente y optimizarse para la producción de proteínas. Los cultivos pueden ser cultivos por lote alimentado o cultivos continuos, como en un quimiostato. Las células pueden cultivarse en matraces de tamaño de mesa de laboratorio (~25 mL), en biorreactores de escalado de producción (1-5 l), o en biorreactores de escala industrial (5000 -25000 L). Las ejecuciones de producción pueden durar de varias semanas a un mes, tiempo durante el cual la proteína de múltiples subunidades se secreta en el medio.

La célula objeto tiene una capacidad potenciada para producir y secretar proteínas de múltiples subunidades ensambladas apropiadamente. En algunas modalidades, el anticuerpo se secreta en el medio a una velocidad de al menos 94 pg/célula/día, al menos 37 pg/célula/día, o al menos 39 pg/célula/día. En algunas modalidades, la proteína de múltiples subunidades alcanza un título de al menos 3 g/L, al menos 5 g/L, al menos 6 g/L, o al menos 8 g/L después de aproximadamente doce días de cultivo.

Además, la célula objeto tiene una capacidad potenciada para proliferar y alcanzar una densidad celular relativamente alta, además de optimizar la productividad. En algunas modalidades, la expansión de semillas de la línea celular o de células alcanza una densidad celular integrada en cultivo de al menos 5 x 107 células-día/mL, al menos 1 x 108 células-día/mL o al menos 1,5 x 108 células-día/mL.

Opcionalmente, la proteína de múltiples subunidades secretada se purifica subsecuentemente a partir del medio en el que se secretó. Los métodos de purificación de proteínas se conocen bien en la técnica (ver, por ejemplo, Kelley, mAbs 1(5):443-452). En algunas modalidades, la proteína se cosecha mediante centrifugación para eliminar las células del sobrenadante del medio líquido, seguido de diversas etapas de cromatografía y una etapa de filtración para eliminar entre otras cosas, virus y otros contaminantes o adulterantes. En algunas modalidades, las etapas de cromatografía incluyen una etapa de intercambio iónico, tal como intercambio catiónico o intercambio aniónico. También pueden emplearse diversos medios cromatográficos de afinidad, tales como la cromatografía de proteína A para la purificación de anticuerpos.

Opcionalmente, el método de fabricación puede incluir las etapas previas de obtención de la célula. Por tanto, en algunas modalidades, el método para fabricar la proteína de múltiples subunidades comprende la etapa de transfectar la célula con el vector que codifica la lectina de unión a la manosa inducida por estrés, como se describió anteriormente, seguido de la selección de los integrantes estables de esta. Los ejemplos no limitantes de vectores incluyen aquellos constructos genéticos que contienen un polinucleótido que codifica una EDEM2 que tiene la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 1-8, una secuencia de aminoácidos que es al menos 92 % idéntica a una cualquiera de las SEQ ID NO: 1-8, o una cualquiera de una variante sustituida conservadoramente de las SEQ ID NO: 1-8. Los vectores útiles incluyen además, por ejemplo, un plásmido que alberga el gen de SEQ ID NO: 16, el plásmido de SEQ ID NO: 15, y el plásmido de S^eQ ID NO: 14. Se debe tener en cuenta que las secuencias de plásmidos (por ejemplo, las SEQ ID NO: 14, 15, 17, 24, 26, 32, 34, 40 y 42) son secuencias circulares descritas de manera lineal en el listado de secuencias. Por tanto, en esos casos, el nucleótido más cercano al extremo 3 prima de la secuencia escrita puede considerarse estar inmediatamente en dirección 5 prima del nucleótido más cercano al extremo 5 prima de la secuencia escrita. En el ejemplo del plásmido de SEQ ID NO: 14, los transformantes se seleccionan a través de la resistencia a la neomicina; para la SEQ ID NO: 15, mediante selección a través de la resistencia a la ZEOCINA.

Los métodos detallados para la construcción de polinucleótidos y vectores que comprenden los mismos, se describen en las Patentes de Estados Unidos núms. 7,435,553 y 7,771,997, que se incorporan como referencia en la presente descripción, y en, por ejemplo, Zwarthoff y otros, J. Gen. Virol. 66(4):685-91, 1985; Mory y otros, ADN.

5(3):181-93, 1986; y Pichler y otros, Biotechnol. Bioeng. 108(2):386-94, 2011.

La célula de partida, en la que se coloca el vector que codifica la lectina de unión a la manosa inducida por estrés, puede contener ya los constructos o elementos genéticos que codifican o regulan la expresión de las subunidades de la proteína de múltiples subunidades, o XBP1 para aquellas modalidades que utilizan XBP1. Alternativamente, el vector que codifica la lectina de unión a la manosa inducida por estrés puede ponerse primero dentro de la célula, y seguido de los otros constructos.

Ejemplos

Se han realizado esfuerzos para garantizar la exactitud con respecto a los números usados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.) pero deben tenerse en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique de cualquier otra manera, las partes son partes por mol, el peso molecular es el peso molecular promedio, la concentración en por ciento (%) significa la masa del soluto en gramos dividida por el volumen de la solución en mililitros por 100 % (por ejemplo, la sustancia X al 10 % significa 0,1 gramos de la sustancia X por mililitro de solución), la temperatura está en grados centígrados, y la presión es o está cerca de la presión atmosférica.

Ejemplo 1: Líneas celulares

La línea celular huésped derivada de CHO-K1 se transfectó con dos plásmidos que codifican las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo humano. Ambos plásmidos contienen el gen hph que confiere resistencia a la higromicina B (Asselbergs y Pronk, 1992, Mol. Biol. Rep., 17(1):61-70). Las células se transfectaron mediante el uso del reactivo LIPOFECTAMINA (Invitrogen, núm. cat. 18324020). Brevemente, un día antes de la transfección se sembraron 3,5 millones de células en una placa de 10 cm en F12 completo (Invitrogen, núm. cat. 11765) que contenía suero fetal bovino (FBS) al 10 % (Invitrogen, núm. cat. 10100). El día de la transfección, las células se lavaron una vez y el medio se reemplazó con OPTIMEM de (Invitrogen, núm. cat. 31985). Los complejos de ADN/lipofectamina se prepararon en medio OPTIMEM y después se añadieron a las células. El medio se cambió de nuevo a F12 completo con FBS al 10 % 6 horas más tarde. La integración estable de los plásmidos se seleccionó mediante el uso de un agente de selección por higromicina B a 400 mg/mL. Las líneas celulares que expresan anticuerpos clonales se aislaron mediante el uso de la tecnología FASTR (descrita en la Patente de Estados Unidos núm. 6,919,183, que se incorpora como referencia en la presente descripción).

Las líneas que expresan el anticuerpo se retransfectaron a continuación con el plásmido que codifica EDEM2. Los plásmidos EDEM2 contenían genes de neomicina fosfotransferasa (constructo de plásmido denominado "p3") o sh ble (plásmido "p7") para conferir resistencia a G418 o a la zeocina, respectivamente. Se usó el mismo método de transfección. En dependencia del marcador seleccionable, las células se seleccionaron con G418 o zeocina a 400 mg/mL o 250 mg/mL, respectivamente. A continuación, las líneas celulares clonales se aislaron mediante el uso de la tecnología FASTR.

Tabla 3: Líneas celulares

Ejemplo 2:

La producción de anticuerpos se evaluó en un proceso por lote alimentado a escala reducida de 12 días mediante el uso de matraces en agitación. En este método, las células se sembraron en un matraz de agitación a la densidad de 0,8 millones de células por mL en el medio de producción (medio definido con alto contenido de aminoácidos). El cultivo se mantuvo durante aproximadamente 12 días, y se suplementó con tres nutrientes, así como también glucosa. La densidad celular viable, y el título de anticuerpos se monitorearon a lo largo del lote.

Para determinar el efecto de mEDEM2 en la producción potenciada de proteínas, la producción de proteínas por líneas celulares CHO que contenían mEDEM2 y mXBP1 se comparó con la producción por células de control que contenían mXBP1, pero no mEDEM2. Los títulos de proteínas fueron más altos en aquellas líneas celulares que expresan mEDEM2 que en aquellas líneas celulares que no expresaban mEDEM2.

Tabla 4: Títulos

Ejemplo 3: Densidades celulares integradas

Densidades celulares integradas ("ICD") es una frase que se usa para describir el crecimiento del cultivo a lo largo del proceso por lote alimentado. En el curso del ensayo de producción de 12 días, monitoreamos la densidad celular viable en los días 0, 3, 5, 7, 10, y 12. Después, estos datos se representaron gráficamente en función del tiempo. La ICD es la integral de la densidad celular viable, calculada como el área bajo la curva de densidad celular. Las líneas transfectadas con EDEM2 tienen una ICD más alta en un proceso por lote alimentado durante 12 días (ver Tabla 5).

Tabla 5: Densidades celulares inte radas

Ejemplo 4: Producción de anticuerpo anti-gdf8

Se examinó el efecto de la expresión ectópica de EDEM2, XBP1, o ambas sobre la producción de un anticuerpo anti-GDF8 que tiene una secuencia de la cadena pesada de SEQ ID NO: 19 y una secuencia de la cadena ligera de SEQ ID NO: 21. Las líneas celulares individuales se examinaron para determinar el título y la densidad celular integrada y se colocaron en "agolpamientos", o intervalos de valores. La expresión ectópica de EDEM2 aumentó significativamente el número de líneas celulares que expresan el anticuerpo en el intervalo de título de 5-6 g/L. La combinación de XBP1 y EDEM2 mostró más que un efecto aditivo hacia el aumento en las líneas celulares de título alto. La expresión de EDEM2 en las células secretoras de anticuerpos también aumentó significativamente el número de líneas celulares que alcanzan una ICD alta (ver Tabla 6).

Tabla 6:

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una célula eucariota aislada que comprende y expresa:

(b) un polinucleótido o polinucleótidos que codifican una proteína de múltiples subunidades, en donde la proteína de múltiples subunidades es un anticuerpo, y en donde la expresión de EDEM2 en la célula aumenta el título de la proteína de múltiples subunidades secretada en el medio donde se cultiva la célula.

2. La célula eucariota aislada de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la proteína EDEM2 comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 92 % idéntica a la SEQ ID NO: 1.

3. La célula eucariota aislada de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45 y SEQ ID NO: 46.

4. La célula eucariota aislada de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones de 1 a la 3, en donde

(a) la célula comprende además un polinucleótido que codifica un factor de transcripción de respuesta de proteína desplegada que opera aguas arriba de EDEM2 , preferiblemente en el que el factor de transcripción es una forma empalmada de la proteína de unión a X-box 1 (XBP-1), más preferiblemente en donde el XBP -1 comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 86 % idéntica a la SEQ ID NO: 9;

(b) la célula es una célula de mamífero; y/o

(c) la célula es una célula CHO.

5. La célula eucariota aislada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el plásmido es lineal, circular, episomal o integrado.

6. La célula eucariota aislada de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el polinucleótido recombinante comprende una secuencia de nucleótidos, que codifica una EDEM2, unida operativamente a un promotor, preferentemente, en donde:

(a) la EDEM2 comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 92 % idéntica a la SEQ ID NO: 1 o consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos 92 % idéntica a la SEQ ID NO: 1; (b) la EDEM2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1;

(c) el polinucleótido o polinucleótidos que codifican la proteína de múltiples subunidades comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 16;

(d) el polinucleótido o polinucleótidos que codifican la proteína de múltiples subunidades comprende un promotor de la ubiquitina C de mamíferos; y/o

(e) el polinucleótido o polinucleótidos que codifican la proteína de múltiples subunidades comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 15 o consiste esencialmente en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 15.

7. La célula eucariota aislada de acuerdo con la reivindicación 6, en donde la célula comprende un polinucleótido que codifica una proteína Xbp-1 en donde:

(a) la proteína Xbp-1 comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 86 % idéntica a la SEQ ID NO: 9 o consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos 86 % idéntica a la SEQ ID NO: 9;

(b) la proteína Xbp-1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9;

(c) el polinucleótido que codifica la proteína Xbp-1 comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 18; y/o

(d) el polinucleótido que codifica la proteína Xbp-1 comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 17 o consiste esencialmente en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 17.

8. La célula eucariota aislada de acuerdo con la reivindicación 6 o 7, en donde el polinucleótido o los polinucleótidos recombinantes que codifican dicho anticuerpo comprenden una secuencia de nucleótidos que: (a) codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43;

(b) codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 44;

(c) codifica un polipéptido que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 y SEQ ID NO: 44;

(d) codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45;

(e) codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46; y/o

(f) codifica un polipéptido que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 y SEQ ID NO: 46.

9. La célula eucariota aislada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en donde el polinucleótido o los polinucleótidos que codifican dicha proteína de múltiples subunidades codifican un anticuerpo anti-GDF8, en donde:

(a) el anticuerpo anti-GDF8 tiene una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 20 y una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 22; o

(b) el anticuerpo anti-GDF8 comprende una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 y una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21.

10. La célula eucariota aislada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en donde el polinucleótido o los polinucleótidos que codifican dicha proteína de múltiples subunidades codifican un anticuerpo anti-GDF8, en donde:

(a) el polinucleótido que codifica la cadena pesada del anticuerpo anti-GDF8 comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 23 y el polinucleótido que codifica la cadena ligera del anticuerpo anti-GDF8 comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 25; o

(b) el polinucleótido que codifica la cadena pesada del anticuerpo anti-GDF8 consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 24 y el polinucleótido que codifica la cadena ligera del anticuerpo anti-GDF8 consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 26.

11. La célula eucariota aislada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en donde el polinucleótido o los polinucleótidos que codifican dicha proteína de múltiples subunidades codifican un anticuerpo anti-ANG2, en donde:

(a) el anticuerpo anti-ANG2 tiene una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 28 y una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 30; o

(b) el anticuerpo anti-ANG2 comprende una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 y una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29.

12. La célula eucariota aislada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en donde el polinucleótido o los polinucleótidos recombinantes que codifican dicha proteína de múltiples subunidades codifican una cadena de anticuerpo anti-ANG2, en donde:

(a) el polinucleótido que codifica la cadena pesada del anticuerpo anti-ANG2 comprende la secuencia de ácido nucleico de ^sE^qID NO: 31 y el polinucleótido que codifica la cadena ligera del anticuerpo anti-ANG2 comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 33; o

(b) el polinucleótido que codifica la cadena pesada del anticuerpo anti-ANG2 consiste en la secuencia de ácido nucleico de s Eq ID NO: 32 y el polinucleótido que codifica la cadena ligera del anticuerpo anti-ANG2 consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 34.

13. La célula eucariota aislada de acuerdo con una cualquiera de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en donde el polinucleótido o los polinucleótidos que codifican dicha proteína de múltiples subunidades codifican un anticuerpo anti-AngPtl4, en donde:

(a) el anticuerpo anti-ANGPTL4 tiene una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 36 y una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 38;

(b) el anticuerpo anti-ANGPTL4 comprende una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 y una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 37.

14. La célula eucariota aislada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8 o 13, en donde el polinucleótido o los polinucleótidos que codifican dicha proteína de múltiples subunidades codifican un anticuerpo anti-AngPtl4:

(a) el polinucleótido que codifica la cadena pesada del anticuerpo anti-ANGPTL4 comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 39 y el polinucleótido que codifica la cadena ligera del anticuerpo anti-ANGPTL4 comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 41; o

(b) el polinucleótido que codifica la cadena pesada del anticuerpo anti-ANGPTL4 consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 40 y el polinucleótido que codifica la cadena ligera del anticuerpo anti-ANGPTL4 consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 42.

15. La célula eucariota aislada de acuerdo con la reivindicación 14, en donde la proteína de múltiples subunidades es un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45 y SEQ ID NO: 46.

16. La célula eucariota aislada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la célula es una célula de ovario de hámster chino (CHO).

17. Un método para fabricar una proteína de múltiples subunidades que es un anticuerpo, el método comprende las etapas de:

18. El método de la reivindicación 17, en donde las células son células CHO.

19. Una célula de mamífero aislada que comprende:

(ii) (a) un polinucleótido, que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 16, (b) un polinucleótido, que codifica un polipéptido que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 y SEQ ID NO: 44, y (c) un polinucleótido, que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 y SEQ ID NO: 46;

(vi) (a) un polinucleótido, que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 16, (b) un polinucleótido, que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 18, (c) un polinucleótido, que codifica un polipéptido que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 y SEQ ID NO: 44, y (d) un polinucleótido, que codifica un polipéptido que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 y SEQ ID NO: 46;

(vii) (a) un polinucleótido, que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 16, (b) un polinucleótido, que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 18, (c) un polinucleótido, que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 23, y (d) un polinucleótido, que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 25;

(viii) (a) un polinucleótido, que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 16, (b) un polinucleótido, que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 18, (c) un polinucleótido, que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 31, y (d) un polinucleótido, que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 33;

(ix) (a) un polinucleótido, que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 16, (b) un polinucleótido, que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 18, (c) un polinucleótido, que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 39, y (d) un polinucleótido, que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 41;

(x) (a) un polinucleótido, que consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 14 o 15, (b) un polinucleótido, que codifica un polipéptido que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 y SEQ ID NO: 44, y (c) un polinucleótido, que codifica un polipéptido que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 y SEQ ID NO: 46;

(xi) (a) un polinucleótido, que consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 14 o 15, (b) un polinucleótido, que consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 24, y (c) un polinucleótido, que consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 26;

(xii) (a) un polinucleótido, que consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 14 o 15, (b) un polinucleótido, que consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 32, y (c) un polinucleótido, que consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 4;

(xiii) (a) un polinucleótido, que consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 14 o 15, (b) un polinucleótido, que consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 40, y (c) un polinucleótido, que consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 42;

(xiv) (a) un polinucleótido, que consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 14 o 15, (b) un polinucleótido, que consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 17, (c) un polinucleótido, que codifica un polipéptido que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 y SEQ ID NO: 44, y (d) un polinucleótido, que codifica un polipéptido que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 y SeQ ID NO: 46;

(xv) (a) un polinucleótido, que consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 14 o 15, (b) un polinucleótido, que consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 17, (c) un polinucleótido, que consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 24, y (d) un polinucleótido, que consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 26;

(xvi) (a) un polinucleótido, que consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 14 o 15, (b) un polinucleótido, que consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 17, (c) un polinucleótido, que consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 32, y (d) un polinucleótido, que consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 34; o

(xvii) (a) un polinucleótido, que consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 14 o 15, (b) un polinucleótido, que consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 17, (c) un polinucleótido, que consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 40, y (d) un polinucleótido, que consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 42.