KR20200074273A - 생성 셀라인 인핸서 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 유용한 다중-하위유닛 단백질의 수율을 향상시키기 위한 생성 세포에서의 EDEM2의 이소성 발현의 발견에 관한 것이다. 그러므로, 본 발명은 생성 셀라인, 예컨대 EDEM2를 코드화하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 함유하고 있는, 기본적인 포유류 생물약제학적 생성 세포-CHO 세포를 제공한다. 또한 본 발명에는 EDEM2-코드화 폴리뉴클레오티드뿐 아니라 XBP1-코드화 폴리뉴클레오티드를 모두 함유하는 생성 세포도 개시된다. 이들 셀라인에 의해 생성된 항체의 향상된 역가가 개시되며, 이들 세포에 의해 배양 중에 획득된 향상된 세포 밀도 또한 개시된다.

Description

생성 셀라인 인핸서{PRODUCTION CELL LINE ENHANCERS}
관련 출원과의 교차-참조
본 출원은 2012년 5월 29일에 출원된 미국 임시 특허 출원 번호 61/652,549의 35 U.S.C. §119(e)의 규정 하의 유익을 주장하며, 상기 출원은 본원에 그것의 전체 내용이 참조로 구체적으로 포함된다.
기술분야
본 발명은 다중-하위유닛 단백질의 향상된 생성을 위한 재조합 스트레스-반응 렉틴을 발현하는 세포 또는 세포들에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 EDEM2를 코드화하는 유전자를 함유하고 고역가로 항체를 생산하는 포유류 세포 및 그것으로부터 유도된 셀라인을 제공한다.
치료적으로 활성인 단백질의 제조는 분비 전에 적절한 접힘 및 프로세싱을 필요로 한다. 적절한 접힘은 특히 분비 전에 적절하게 조립되어야 하는 다수의 하위유닛으로 구성되는 단백질, 예컨대 항체와 관련된다. 진핵 세포는 단백질의 적절한 접힘과 분비 경로로부터 잘못 접혀진 단백질의 제거를 보장하는 시스템에 적응되어 왔다. 이 시스템은 풀린 단백질 반응(UPR) 경로로 불리며, 소포체(endoplasmic reticulum, ER)에서 잘못 접혀진 단백질의 축적에 의해 촉발된다.
UPR의 초기 사건은 전사 인자 Xbp1의 활성화인데, 그것은 계속해서 소포체 관련된 분해(ERAD) 경로의 한 구성원인 소포체 분해-증강 알파-만노시다제-유사 단백질 2(EDEM2)의 전사를 활성화시킨다. EDEM2는 잘못 접혀진 단백질의 제거를 촉진한다. ERAD 경로는 다음의 5 단계를 포함한다: (1) 기형 단백질의 샤프롱-중재된 인지; (2) EDEM2를 포함하는 역전위 기계 또는 E3-리가제로의 기형 단백질의 표적화; (3) 역전위의 개시; (4) 유비퀴틴화 및 추가의 역전위; 및 (5) 프로테오솜 표적화 및 분해.
항체는 두 개의 중쇄와 두 개의 경쇄를 포함하는 다중-하위유닛 단백질로, 그것은 적절하게 접혀지고 결합되어 기능적 이종사량체를 형성해야 한다. 기능성 항체 이종사량체의 수율 또는 역가를 향상시키기 위하여 중쇄 및 경쇄의 효과적이고 정확한 프로세싱이 어떻게든 향상되는 것이 요구된다.
본 출원인은 놀랍게도 단백질-제조 셀라인에서 EDEM2의 이소성(ectopic) 발현이 세포당 단백질의 평균 산출량을 증가시키고, 배지로 분비된 단백질의 역가를 증가시키며, 제조 셀라인의 통합된 세포 밀도를 증가시킨다는 것을 발견하였다.
그러므로 한 측면으로, 본 발명은 (a) 스트레스-유도된 만노스-결합 렉틴을 코드화하는 재조합 폴리뉴클레오티드 및 (b) 다중-하위유닛 단백질을 코드화하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 세포를 제공한다. 어떤 구체예에서, 스트레스-유도된 만노스-결합 렉틴은 EDEM2 단백질이고, 그것의 비-제한적인 실례는 아래의 표 1에 제시되며, 다중-하위유닛 단배질은 항체이다. 다른 구체예에서, 세포는 또한 XBP1의 활성 스플라이싱 형태를 코드화하는 폴리뉴클레오티드를 함유하고, 그것의 비-제한적인 실례는 아래의 표 2에 제시된다. 한 구체예에서, 세포는 포유류 세포, 예를 들면 생명제약의 제조에 사용된 CHO 세포이다.
다른 측면으로, 본 발명은 전술한 측면에서 기술된 세포로부터 유도된 셀라인을 제공한다. "...로부터 유도된"은 개별적인 세포로부터 클론적으로 유래되고 어떤 선택 품질, 예컨대 주어진 역가에서 활성 단백질을 생성하는 능력 또는 특정 밀도로 증식시키는 능력을 가지는 집단을 의미한다. 어떤 구체예에서, 스트레스-유도된 만노스-결합 렉틴을 코드화하는 재조합 폴리뉴클레오티드 및 다중-하위유닛 단백질을 코드화하는 폴리뉴클레오티드를 은닉하는 세포로부터 유도된 셀라인은 배지의 리터당 적어도 3그람(g/L), 적어도 5g/L 또는 적어도 8g/L의 역가로 다중-하위유닛 단백질을 생성할 수 있다. 어떤 구체예에서, 셀라인은 본질적으로는 동일한 세포지만 스트레스-유도된 만노스-결합 렉틴을 코드화하는 재조합 폴리뉴클레오티드가 없는 세포로부터 유도된 셀라인에 의해 얻어질 수 있는 통합된 세포 밀도보다 적어도 30% 더 큰, 적어도 50% 더 큰, 적어도 60% 더 큰 또는 적어도 90% 더 큰 통합된 세포 밀도(ICD)를 얻을 수 있다.
또 다른 측면으로, 본 발명은 구성성이고 어디에서나 발현되는 포유류 프로모터, 예컨대 유비퀴틴 C 프로모터에 작동가능하게 연결된(시스) EDEM2 단백질을 코드화하는 핵산 서열을 포함하는 분리된 또는 재조합 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 어떤 구체예에서, EDEM2 단백질은 SEQ ID NO:8의 아미노산 또는 SEQ ID NO:1 내지 7 중 어느 하나에 적어도 92% 동일한 아미노산 서열을 가진다. 어떤 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:16의 핵산 서열을 포함한다. 한 특정 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:14의 핵산 서열로 구성되며; 다른 특정 구체예에서는 SEQ ID NP:15의 핵산 서열로 구성된다.
또 다른 측면으로, 본 발명은 구성성이고 어디에서나 발현되는 포유류 프로모터, 예컨대 유비퀴틴 C 프로모터에 작동가능하게 연결된(시스로) XBP1 단백질을 코드화하는 핵산 서열을 포함하는 분리된 또는 재조합 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 어떤 구체예에서, XBP1 단백질은 SEQ ID NO:13의 아미노산 또는 SEQ ID NO:9 내지 12 중 어느 하나에 적어도 86% 동일한 아미노산 서열을 가진다. 어떤 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:18의 핵산 서열을 포함한다. 한 특정 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:17의 핵산 서열로 구성된다.
또 다른 측면으로, 본 발명은 앞의 측면에서 기술된 것과 같은 EDEM2-코드화 폴리뉴클레오티드와, 다중-하위유닛 단백질, 예컨대 항체를 코드화하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 세포를 제공한다. 어떤 구체예에서, 세포는 또한 전술한 측면에서 기술된 것과 같은, XBP1-코드화 폴리뉴클레오티드를 함유한다. 한 구체예에서, 다중-하위유닛 단백질은 항체이고, 그 항체의 중쇄는 SEQ ID NO:43 및 SEQ ID NO:44의 아미노산 서열을 포함하며, 항체의 경쇄는 SEQ ID NO:45 및 SEQ ID NO:46의 아미노산 서열을 포함한다. 이 구체예 및 여러 구체예에서, 다중-하위유닛 단백질의 각각의 폴리펩티드 하위유닛은 별도의 폴리뉴클레오티드에 의해 코드화된다. 그러므로, 예를 들어 항체를 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 중쇄를 코드화하는 폴리뉴클레오티드와 경쇄를 코드화하는 폴리뉴클레오티드, 따라서 두 개의 하위유닛을 포함할 수 있다. 어떤 구체예에서, 세포는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포이다.
한 구체예에서, 코드화된 다중-하위유닛 단백질은 SEQ ID NO:20의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 SEQ ID NO:22의 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 가지는 항-GDF8 항체이다. 한 구체예에서, 항-GDF8 항체는 SEQ ID NO:19의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 및 SEQ ID NO:21의 아미노산 서열을 가지는 경쇄를 포함한다. 한 구체예에서, 항-GDF8 항체의 중쇄를 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:23의 핵산 서열을 포함하고; 항-GDF8 항체의 경쇄를 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:25의 핵산 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 항-GDF8 항체의 중쇄를 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:24의 핵산 서열로 구성되고; 항-GDF8 항체의 경쇄를 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:26의 핵산 서열로 구성된다.
다른 구체예에서, 코드화된 다중-하위유닛 단백질은 SEQ ID NO:28의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 SEQ ID NO:30의 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 가지는 항-ANG2 항체이다. 한 구체예에서, 항-ANG2 항체는 SEQ ID NO:27의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 및 SEQ ID NO:29의 아미노산 서열을 가지는 경쇄를 포함한다. 한 구체예에서, 항-ANG2 항체의 중쇄를 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:31의 핵산 서열을 포함하고; 항-ANG2 항체의 경쇄를 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:33의 핵산 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 항-ANG2 항체의 중쇄를 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:32의 핵산 서열로 구성되고; 항-ANG2 항체의 경쇄를 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:34의 핵산 서열로 구성된다.
또 다른 구체예에서, 코드화된 다중-하위유닛 단백질은 SEQ ID NO:36의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 SEQ ID NO:38의 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 가지는 항-ANGPTL4 항체이다. 한 구체예에서, 항-ANGPTL4 항체는 SEQ ID NO:35의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 및 SEQ ID NO:37의 아미노산 서열을 가지는 경쇄를 포함한다. 한 구체예에서, 항-ANGPTL4 항체의 중쇄를 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:39의 핵산 서열을 포함하고; 항-ANGPTL4 항체의 경쇄를 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:41의 핵산 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 항-ANGPTL4 항체의 중쇄를 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:40의 핵산 서열로 구성되고; 항-ANGPTL4 항체의 경쇄를 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:42의 핵산 서열로 구성된다.
또 다른 측면으로, 본 발명은 배지에서 앞의 측면의 세포를 배양함으로써 다중-하위유닛 단백질을 제조하는 방법을 제공하는데, 이때 다중-하위유닛 단백질은 세포에서 합성되고 계속해서 배지로 분비된다. 어떤 구체예에서, 다중-하위유닛 단백질은 항체, 예컨대 항-GDF8, 항-ANG2, 항-ANGPTL4 또는 SEQ ID NO:43 및 44의 중쇄 서열과 SEQ ID NO:45 및 46의 경쇄 서열을 가지는 항체이다. 어떤 구체예에서, 다중-하위유닛 단백질은 적어도 3g/L, 적어도 5g/L, 적어도 6g/L 또는 적어도 8g/L의 역가를 얻는다. 어떤 구체예에서, 세포는 배지에서 증식하고, 약 ≥5×107 세포-일/mL, 약 ≥1×108 세포-일/mL 또는 약 ≥1.5×108 세포-일/mL의 통합된 세포 밀도를 수립한다.
또 다른 측면으로, 본 발명은 전술한 측면에서 기술된 방법에 따라 제조된 다중-하위유닛 단백질을 제공한다. 한 구체예에서, 제조된 단백질은 항체이다. 어떤 구체예에서, 항체는 SEQ ID NO:43 및 SEQ ID NO:44의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO:45 및 SEQ ID NO:46의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄로 구성된다. 한 특정 구체예에서, 제조된 다중-하위유닛 단백질은 SEQ ID NO:20의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열과 SEQ ID NO:22의 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 가지는 항-GDF8 항체이다. 다른 특정 구체예에서, 제조된 다중-하위유닛 단백질은 SEQ ID NO:28의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열과 SEQ ID NO:30의 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 가지는 항-ANG2 항체이다. 또 다른 특정 구체예에서, 제조된 다중-하위유닛 단백질은 SEQ ID NO:36의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열과 SEQ ID NO:38의 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 가지는 항-ANGPTL4 항체이다.
본 발명을 설명하기 전에, 본 발명은 기술되는 특정 방법 및 실험 조건에 제한되지 않으며, 그런 방법과 조건들은 달라질 수 있음이 인정되어야 한다. 또한 본원에서 사용된 용어는 단지 특별한 구체예를 설명할 목적에 대한 것이고, 본 발명의 범주는 첨부되는 청구범위에 의해서만 제한될 것이기 때문에 제한적인 것으로 의도되지 않아야 한다는 것이 인정되어야 한다.
다르게 규정되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적이고 과학적인 용어들은 본 발명이 속하는 해당 기술분야의 숙련자가 통상적으로 이해하는 것과 같은 의미를 가진다. 본원에서 사용되는 것과 같은 용어 "약"은 특별히 인용된 수치 또는 값의 범위와 관련하여 사용될 때, 그 값이 인용된 값으로부터 단지 1% 정도 달라질 수 있음을 의미한다. 예를 들어 본원에서 사용되는 것과 같은 표현 "약 100"은 99와 101 및 그 사이의 모든 값(예컨대 99.1, 99.2, 99.3, 99.4 등)을 포함한다.
비록 본원에 기술된 것과 유사하거나 동등한 어떠한 방법 및 재료든지 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 재료를 이제 기술하기로 한다. 본원에서 언급되는 모든 공개물은 그것의 전체 내용이 참조로 본원에 포함된다.
본원에서 사용되는 것과 같은 용어 "재조합 폴리뉴클레오티드"는 "분리된 폴리뉴클레오티드"와 상호교환적으로 사용되고, 유전자 공학 조작에 의해 유래된, 단일 가닥이거나 이중 가닥의 리보핵산 또는 데옥시리보핵산과 같은 핵산 중합체를 의미한다. 재조합 폴리뉴클레오티드는 원형 플라스미드이거나 시험관 내에서 또는 세포 내에서 에피솜으로서 존재하는 선형 구성물일 수 있다. 재조합 폴리뉴클레오티드는 더 큰 폴리뉴클레오티드 분자 또는 슈퍼분자 구조, 예컨대 선형 또는 원형 염색체 안에 통합된 구성물일 수 있다. 더 큰 폴리뉴클레오티드 분자 또는 슈퍼분자 구조는 세포 내에 있거나 세포의 핵 내에 있을 수 있다. 그러므로 재조합 폴리뉴클레오티드는 세포의 염색체 내에 통합될 수 있다.
본원에서 사용되는 것과 같은 용어 "스트레스-유도된 만노스-결합 렉틴"은 만노스, 만노스의 유도체, 예컨대 만노스-6-포스페이트 또는 만노스 또는 만노스 유도체를 그것의 당질층에 발현하는 당단백질에 결합하거나 결합할 수 있고, 그것의 활성이 스트레스 동안 상향조절되는 단백질을 의미한다. 세포의 스트레스는 그 중에서도 굶주림, DNA 손상, 저산소증, 중독, 전단 스트레스 및 다른 기계적 스트레스, 종양 스트레스 및 소포체에서 잘못 접혀진 단백질의 축적을 포함한다. 스트레스-유도된 만노스-결합 렉틴의 예를 들면 EDEM 단백질 EDEM1, EDEM2 및 EDEM3, Yos 9, OS9 및 XTP3-B를 들 수 있다(Vembar and Brodsky, Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 9(12): 944-957, 2008, 및 거기에 인용된 참고문헌들 참조).
본원에서 사용되는 것과 같은 용어 "EDEM2"는 소포체 분해-증강 알파-만노시다제-유사 단백질의 어떠한 이종상동체, 상동체 또는 보존적으로 치환된 변이체를 의미한다. EDEM2 단백질은 일반적으로 해당 기술분야에서 소포체-관련 분해(ERAD)에 관련되고, Xbp-1에 의해 상향-조절되며 제거를 위해 칼넥신 주기로부터 잘못 접혀진 당단백질의 추출을 촉진하는 것으로 알려져 있다(Mast et al., Glycobiology 15(4):421-436, 2004; Olivari and Molinari, FEBS Lett. 581:3658-3664, 2007; Olivari et al., J. Biol. Chem. 280(4):2424-2428, 2005; 및 Vembar and Brodsky 2008 참조). 예시적인 EDEM2 서열을 아래의 표 1에 서열 목록과 교차 참조하여 나타낸다.
동물 SEQ ID NO: %동일성 사람 %동일성 마우스 %동일성 햄스터
마우스 1 93 100 96
쥐 2 94 98 96
햄스터 3 93 96 100
사람 4 100 93 93
침팬지 5 99 94 93
오랑우탄 6 97 92 92
제브라피시 7 69 70 69
공통 8 100 100 100
본원에서 사용되는 것과 같이, XBP1 또는 X-박스 결합 단백질 1로도 알려져 있는 용어 "Xbp1"은 Xbp1의 어떠한 이종상동체, 상동체 또는 보존적으로 치환된 변이체를 의미한다. Xbp1은 UPR의 전사 인자 및 기능적 요소이다. ER 스트레스는 (1) 계속해서 Xbp1 mRNA의 전사를 상향조절하는 전사 인자 ATF6과 (2) 전구체 Xbp1 mRNA의 스플라이싱을 중재하여 활성 Xbp1을 생성하는 ER 막 단백질 IRE1을 둘 다 활성화시킨다. 상기에서 언급된 것과 같이, 활성화된 Xbp1은 계속해서 EDEM2의 활성을 상향조절한다(Yoshida et al., Cell Structure and Function 31(2): 117-125, 2006; 및 Olivari, 2005 참조). 예시적인 Xbp1 아미노산 서열은 서열 목록과 교차-참조하여 표 2에 나타낸다.
동물 SEQ ID NO %동일성 사람 %동일성 마우스 %동일성 햄스터
마우스 9 86 100 92
햄스터 10 86 92 100
사람 11 100 86 86
제브라피시 12 47 47 48
공통 13 100 100 100
본원에서 사용되는 것과 같이, 용어 "항체"는 일반적으로, 4개의 폴리펩티드 사슬, 즉 이황화 결합에 의해 상호연결된 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)를 포함하는 면역글로불린 분자뿐 아니라 그것의 다량체(예컨대 IgM)를 언급하는 것으로 의도되지만; 단지 중쇄만으로 구성된 면역글로불린 분자(즉 경쇄가 없음)도 또한 용어 "항체"의 정의 내에 포함된다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본원에서는 HCVR 또는 VH로 약칭됨)과 중쇄 불변 영역을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 세 개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3를 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본원에서는 LCVR 및 VL로 약칭됨)과 경쇄 불변 영역을 포함한다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인(CL1)을 포함한다. VH와 VL 영역은 나아가 프레임워크 영역(FR)으로 명명된 보다 보존된 영역이 사이에 끼어 있는 초가변성 영역, 이름하여 상보성 결정 영역(CDR)으로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 세 개의 CDR과 네 개의 FR로 구성되며, 아미노-말단으로부터 카복시-말단쪽으로 다음 순서로 배열된다:FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. "분리된 항체" 또는 "정제된 항체"는 실질적으로 다른 세포 물질 또는 화학물질이 없을 것이다.
용어 "특이적으로 결합하는" 등은 항체 또는 그것의 항원-결합 단편이 생리적 조건 하에서 상대적으로 안정한 항원과 복합체를 형성하는 것을 의미한다. 특이적 결합은 적어도 약 1×10-6M 또는 그 이상의 해리 상수를 특징으로 한다. 두 개의 분자가 특이적으로 결합하는 지를 측정하기 위한 방법은 해당 기술분야에 잘 알려져 있고, 예를 들면 평형 투석, 표면 플라스몬 공명 등을 포함한다. 그러나 (예를 들어) 사람 GDF8에 특이적으로 결합하는 분리된 항체는 다른 항원, 예컨대 다른 종으로부터의 F8 분자(이종상동체)에 대해 교차-반응성을 가질 수 있다.
다양한 항체가 스트레스-유도된 만노스-결합 렉틴을 코드화하는 폴리뉴클레오티드를 은닉하는 세포에 의해 분비된 다중-하위유닛 단백질의 실례로서 사용된다. 그런 실례로는 항-GDF8, 항-ANG2 및 항-ANGPTL4 항체를 포함한다. 이들 및 유사한 항체는 각각 미국 특허 출원 번호 20110293630, 20110027286 및 20110159015에 기술되어 있다.
본원에서 사용되는 것과 같은 용어 "세포"는 DNA를 복제하고, RNA를 전사하며, 폴리펩티드를 번역하고 단백질을 분비할 수 있는 원핵 또는 진핵 세포를 말한다. 세포는 생물학적 제품의 상업적 제조에 사용된 동물 세포, 예컨대 곤충 세포(예컨대 Schneider 세포, Sf9 세포, Sf21 세포, Tn-368 세포, BTI-TN-5B1-4 세포; Jarvis, Methods Enzymol. 463:191-222, 2009; 및 Potter et al., Int. Rev. Immunol. 10(2-3):103-112, 1993) 및 포유류 세포(예컨대 CHO 또는 CHO-K1 세포, COS 또는 COS-7세포, HEK293 세포, PC12 세포, HeLa 세포, 하이브리도마 세포; Trill et al., Curr. Opin. Biotechnol. 6(5):553-560, 1995; Kipriyanov and Little, Mo. Biotechnol. 12(2):173-201, 1999)를 포함한다. 한 구체예에서, 세포는 기술된 UPR 경로 폴리뉴클레오티드를 함유하는 CHO-K1 세포이다. CHO-K1 세포의 설명에 대해서는 Kao et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 60:1275-1281, 1968을 참조한다.
본원에서 사용된 것과 같이, 용어 "프로모터"는 일반적으로 시스로(in cis) 단백질 코딩 서열의 위쪽에 위치하고, 단백질 코딩 서열의 전사를 촉진하는 유전자 서열을 의미한다. 프로모터는 조절되거나(발생 단계에서, 조직 특이적으로 또는 유도성(화학적, 온도)임) 또는 구성적으로 활성일 수 있다. 특정 구체예에서, 단백질을 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 구성성 프로모터에 작동가능하게 연결된다. "작동가능하게 연결된"이란 단백질-코드화 폴리뉴클레오티드가 프로모터의 3-프라임(하향) 및 cis로 위치하고, 프로모터의 제어 하에 있는 것을 의미한다. 특정 구체예에서, 프로모터는 구성성 포유류 프로모터, 예컨대 유비퀴틴 C 프로모터(Schorpp et al., Nucl. Acids Res. 24(9):1787-1788, 1996); Byun et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 332(2):518-523, 2005 참조), CMV-IE 프로모터(Addison et al., J. Gen. Virol. 78(7):1653-1661, 1997; Hunninghake et al., J. Virol. 63(7):3026-3033, 1989 참조) 또는 hCMV-IE 프로모터(사람 사이토메갈로바이러스 즉시 초기 유전자 프로모터)(Stinski & Roehr, J. Virol. 55(2):431-441, 1985; Hunninghake et al., J. Virol. 63(7):3026-3033, 1989 참조)이다.
본원에서 사용되는 것과 같이, 구절 "통합된 세포 밀도" 또는 "ICD"는 일정 시간에 걸쳐서 적분(integral)으로서 얻어지고 mL당 세포-일로 표시되는 배양 배지 중의 세포의 밀도를 의미한다. 어떤 구체예에서, ICD는 세포가 배양된지 12일째 정도에 측정된다.
본원에서 사용되는 것과 같이, 용어 "배양"은 세포가 활발하게 분할되거나 그렇지 못하거나에 관계없이, (1) 세포, 배지 및 분비된 다중-하위유닛 단백질을 포함하는 조성물 및 (2) 세포를 배지에서 배양하는 작업 둘 다를 의미한다. 세포는 25mL 또는 그것보다 작은 플라스크 정도의 작은 용기에서, 및 10,000리터 또는 그 이상의 상업적 생물반응기처럼 크게 배양될 수 있다. "배지"는 배양 배지를 말하는 것으로, 그 중에서도 세포의 성장, 증식 또는 유지, 및 세포에 의한 다중-하위유닛 단백질의 생성을 가능하게 하는 영양분, 지질, 아미노산, 핵산, 완충제 및 미량 요소를 포함한다. 세포 배양 배지는 혈청(예컨대 소 태아 혈청(FBS)) 또는 단백질 가수분해물이 첨가된 배지뿐 아니라 혈청-유리 및 가수분해물-유리 규정 배지를 포함한다. 상업적으로 얻을 수 있는 배지의 비-제한적인 실례로는 RPMI 배지 1640, 둘베코 변형 이글 배지(DMEM), DMEM/F12 혼합물, F10 영양 혼합물, Ham F12 영양 혼합물 및 최소 필수 배지(MEM)가 있다.
본원에서 사용된 것과 같이, 폴리펩티드에 적용되는 것으로서 구절 "보존적으로 치환된 변이체"는 보다 더 보존성인 아미노산 치환 중 하나를 포함한 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 의미한다. "보존성 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 화학적 특성(예컨대 전하 또는 소수성)을 가지는 측쇄(R 기)를 가지는 다른 아미노산 잔기에 의해 치환되는 것이다. 일반적으로, 보존성 아미노산 치환은 실질적으로 단백질의 기능적 특성을 바꾸지 않을 것이다. 둘 또는 그 이상의 아미노산 서열이 상호간에 보존성 치환에 의해 상이한 경우에, 유사성의 % 또는 정도는 치환의 보존적 성질에 대해 수정하기 위해 상향 조정될 수 있다. 이런 조정을 만들기 위한 수단은 해당 기술분야의 숙련자들에게 잘 알려져 있다(예컨대 Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24:307-331 참조). 유사한 화학적 특성을 가지는 측쇄를 가지는 아미노산의 그룹의 실례는 다음을 포함한다: 1) 지방족 측쇄: 글리신, 알라닌, 발린, 로이신 및 아이소로이신; 2) 지방족-하이드록실 측쇄: 세린 및 쓰레오닌; 3) 아마이드-함유 측쇄: 아스파라긴 및 글루타민; 4) 방향족 측쇄: 페닐알라닌, 타이로신 및 트립토판; 5) 염기성 측쇄: 라이신, 아르기닌 및 히스티딘; 6) 산성 측쇄: 아스파테이트 및 글루타메이트, 및 7) 황-함유 측쇄: 시스테인 및 메티오닌. 바람직한 보존성 아미노산 치환 기는 다음과 같다: 발린-로이신-아이소로이신, 페닐알라닌-타이로신, 라이신-아르기닌, 알라닌-발린, 글루타메이트-아스파테이트 및 아스파라긴-글루타민. 또는 다르게는, 보존성 대체는 문헌에서 개시된 PAM250 로그-가능성 매트릭스에서 양의 값을 가지는 어떠한 변화이다(Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443-45). "적당한 보존성" 대체는 PAM250 로그-가능성 매트릭스에서 음이 아닌 값을 가지는 어떠한 변화이다.
구체예 - 세포
한 측면으로, 본 발명은 치료적 또는 연구 활용성을 가지는 단백질의 제조에 유용한 세포를 제공한다. 어떤 구체예에서, 단백질은 다중 하위유닛으로 구성되고, 그것은 적절하게 접혀지고 조립되어 충분한 양의 활성 단백질이 생성되어야 한다. 항체는 치료적 또는 연구 유용성을 가지는 다중-하위유닛 단백질의 실례이다. 어떤 구체예에서, 세포는 다중-하위유닛 단백질의 하나 또는 그 이상의 개별적인 하위유닛을 코드화하는 재조합 유전자 구성물(즉 폴리뉴클레오티드)을 은닉한다. 다른 구체예에서, 개별적인 폴리펩티드 하위유닛을 코드화하는 유전자 구성물은 자연 발생적인 것으로, 예를 들면 B 세포에서 항체의 하위유닛을 코드화하는 핵산 서열이다.
다중-하위유닛 단백질의 적절한 조립 및 분비를 촉진하기 위하여, 세포는 어떤 구체예에서, 스트레스-유도된 만노스-결합 렉틴은 ERAD의 성분인 스트레스-유도된 만노스-결합 렉틴을 코드화하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 함유한다. 어떤 구체예에서, 스트레스-유도된 만노스-결합 렉틴은 소포체 분해-증강 알파-만노시다제-유사 단백질 2(EDEM2)이다. 어떠한 코드화된 EDEM2 또는 보존적으로 치환된 변이체든지 본 발명에 성공적으로 사용될 수 있는 것으로 예상된다. 표 1은 척추동물 EDEM2 단백질의 일부 실례를 열거한다. Thompson 등의 Clustal W 프로그램(Thompson et al., Nucl. Acids Rev. 22(22):4673-80, 1994, 또한 Yuan et al., Bioinformatics 15(10):862-3, 1999 참조)을 사용하여 수행된 그 단백질 서열들의 다수의 쌍 비교 결과, 개시된 EDEM2 폴리뉴클레오티드 서열은 각각 상호간에 다른 EDEM2 서열에 대해 적어도 69% 동일한 것으로 나타났다. 개시된 포유류 EDEM2 서열의 Clustal W 비교는 각 서열이 다른 것에 대해 적어도 92% 동일한 것을 나타냈다. 그러므로 어떤 구체예에서, 세포는 포유류 EDEM2의 어느 하나에 적어도 92% 동일한 서열을 가지는 EDEM2 폴리펩티드를 코드화하는 폴리뉴클레오티드를 함유한다. 공통 EDEM2 아미노산 서열은 마우스, 쥐, 햄스터, 침팬지 및 사람 EDEM2 폴리펩티드 아미노산 서열을 일렬 배열함으로써 구성되었다. 그 공통 서열은 SEQ ID NO:8로서 표시된다. 그러므로 어떤 구체예에서, 세포는 SEQ ID NO:8의 아미노산 서열을 가지는 EDEM2 폴리펩티드를 코드화하는 폴리뉴클레오티드를 함유한다.
다양한 구체예에서, 세포는 마우스 EDEM2(mEDEM2) 아미노산 서열에 적어도 92% 동일한 아미노산 서열을 가지는 EDEM2 폴리펩티드를 코드화하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 함유하고; 특별한 구체예에서, 폴리펩티드는 mEDEM2 또는 그것의 보존적으로 치환된 변이체이다.
어떤 구체예에서, 다중-하위유닛 단백질은 항체이고, 세포는 SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45 및 SEQ ID NO:46의 아미노산 서열을 포함하는 어떠한 하나 또는 그 이상의 폴리펩티드를 코드화하는 폴리뉴클레오티드를 함유한다. SEQ ID NO:43 및 44는 각각 특정 항체 중쇄의 대략 N-말단 및 C-말단 부분의 공통 서열을 나타낸다. 그러므로, 한 구체예에서 단백질 하위유닛을 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:43과 SEQ ID NO:44 둘 다를 포함하는 폴리펩티드를 코드화한다. SEQ ID NO:45 및 46은 각각 특정 항체 경쇄의 대략 N-말단 및 C-말단 부분의 공통 서열을 나타낸다. 그러므로, 한 구체예에서 단백질 하위유닛을 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:45와 SEQ ID NO:46 둘 다를 포함하는 폴리펩티드를 코드화한다. 어떤 구체예에서, EDEM2 단백질을 코드화하는 재조합 폴리뉴클레오티드 외에 세포는 적어도 두 개의 폴리뉴클레오티드를 함유하는데, 그것들은 각각 다중-하위유닛 단백질의 특정 하위유닛을 코드화한다. 예를 들어, 그리고 하기에서 예시되는 것과 같이, 세포는 SEQ ID NO:43 및 SEQ ID NO:44의 아미노산 서열을 포함하는 항체 중쇄를 코드화하는 폴리뉴클레오티드와, SEQ ID NO:45 및 SEQ ID NO:46의 아미노산 서열을 포함하는 항체 경쇄를 코드화하는 다른 폴리뉴클레오티드를 함유한다.
어떤 구체예에서, 세포는 상기에서 기술된 것과 같이 스트레스-반응 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 하위유닛을 코드화하는 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 것 외에, 또한 EDEM2의 상류에서 작동하는 접혀지지 않은 단백질 반응 전사 인자를 코드화하는 폴리뉴클레오티드를 함유한다. 상류 전사 인자는 어떤 경우에는 XBP1의 스플라이싱 형태이다. 어떠한 코드화된 XBP1이든지 본 발명에서 성공적으로 사용될 수 있다고 예상된다. 표 2는 척추동물 XBP1 스플라이싱 형태 폴리펩티드의 서열의 일부 실례를 열거한다. Clustal W(Thompson 1994; Yuan 1999)를 사용하여 수행된 그런 폴리펩티드 서열들의 다수의 쌍 비교 결과, 개시된 스플라이싱된 XBP1 폴리뉴클레오티드 서열들은 각각 상호간에 다른 XBP1 서열에 대해 적어도 48% 동일한 것으로 나타났다. 개시된 포유류 XBP1 서열의 Clustal W 비교는 각 서열이 다른 것에 대해 적어도 86% 동일한 것을 나타냈다. 그러므로 어떤 구체예에서, 세포는 포유류의 스플라이싱된 XBP1의 어느 하나에 적어도 86% 동일한 서열을 가지는 XBP1 폴리펩티드의 스플라이싱된 형태를 코드화하는 폴리뉴클레오티드를 함유한다. 공통 XBP1 아미노산 서열은 마우스, 햄스터 및 사람 XBP1 아미노산 서열을 일렬 배열함으로써 구성되었다. 그 공통 서열은 SEQ ID NO:13으로서 표시된다. 그러므로 어떤 구체예에서, 세포는 SEQ ID NO:13의 아미노산 서열을 가지는 XBP1 폴리펩티드를 코드화하는 폴리뉴클레오티드를 함유한다.
다양한 구체예에서, 세포는 마우스 XBP1(mXBP1) 아미노산 서열(SEQ ID NO:9)에 적어도 86% 동일한 아미노산 서열을 가지는 XBP1 폴리펩티드를 코드화하는 폴리뉴클레오티드를 함유하고; 특별한 구체예에서, 폴리펩티드는 mXBP1 또는 그것의 보존적으로 치환된 변이체이다.
본 발명은 어떠한 세포든지 적절하게 접혀지고 활성인 다중-하위유닛 단백질의 제조를 위한 렉틴-코드화 폴리펩티드를 은닉하기 위해 사용될 수 있다고 예상한다. 그러한 세포로는 잘 알려져 있는 단백질 생성 세포, 예컨대 박테리아 대장균 및 유사한 원핵 세포, 효모 피치아 파스토리스 및 다른 피치아 및 비-피치아 효모, 식물 세포 절편, 예컨대 니코티아나의 절편, 곤충 세포, 예컨대 쉬나이더 2 세포, Sf9 및 Sf21, 및 트라이코플러시아 니-유도된 하이파이브 세포 및 생물생성에 전형적으로 사용된 포유류 세포, 예를 들면 CHO, CHO-K1 COS, HeLa, HEK93, Jurkat 및 PC12 세포를 포함한다. 어떤 구체예에서, 세포는 CHO-K1 또는 변형된 CHO-K1 세포, 예컨대 미국 특허 번호 7,435,553, 7,514,545 및 7,771,997 및 미국 공개 특허 출원 번호 US 2010-0304436 A1에서 교시된 것과 같은 세포이다.
어떤 특정 구체예에서, 본 발명은 (1) SEQ ID NO:16의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 mEDEM2-코드화 폴리뉴클레오티드, (2) SEQ ID NO:18의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 XBP1-코드화 폴리뉴클레오티드, (3) SEQ ID NO:43 및 44의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 항체 중쇄-코드화 폴리뉴클레오티드 및 (4) SEQ ID NO:45 및 46의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 항체 경쇄-코드화 폴리뉴클레오티드를 함유하는 생체 외 CHO-K1 세포를 제공한다.
한 특정 구체예에서, 본 발명은 (1) SEQ ID NO:16의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 mEDEM2-코드화 폴리뉴클레오티드, (2) SEQ ID NO:18의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 XBP1-코드화 폴리뉴클레오티드, (3) SEQ ID NO:23의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 항체 중쇄-코드화 폴리뉴클레오티드 및 (4) SEQ ID NO:25의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 항체 경쇄-코드화 폴리뉴클레오티드를 함유하는 생체 외 CHO-K1 세포를 제공한다.
다른 특정 구체예에서, 본 발명은 (1) SEQ ID NO:16의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 mEDEM2-코드화 폴리뉴클레오티드, (2) SEQ ID NO:18의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 XBP1-코드화 폴리뉴클레오티드, (3) SEQ ID NO:31의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 항체 중쇄-코드화 폴리뉴클레오티드 및 (4) SEQ ID NO:33의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 항체 경쇄-코드화 폴리뉴클레오티드를 함유하는 생체 외 CHO-K1 세포를 제공한다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명은 (1) SEQ ID NO:16의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 mEDEM2-코드화 폴리뉴클레오티드, (2) SEQ ID NO:18의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 XBP1-코드화 폴리뉴클레오티드, (3) SEQ ID NO:39의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 항체 중쇄-코드화 폴리뉴클레오티드 및 (4) SEQ ID NO:41의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 항체 경쇄-코드화 폴리뉴클레오티드를 함유하는 생체 외 CHO-K1 세포를 제공한다.
셀라인
다른 측면으로, 본 발명은 상기에서 설명된 세포로부터 클론 팽창에 의해 유래된 다수의 세포를 포함하는 셀라인을 제공한다. 셀라인을 구성하는 세포의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 약 100%는 어떤 구체예에서는 ERAD의 성분인 스트레스-유도된 만노스-결합 렉틴을 코드화하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 함유한다. 어떤 구체예에서, 스트레스-유도된 만노스-결합 렉틴은 소포체 분해-증강 알파-만노시다제-유사 단백질 2(EDEM2)이다. 어떠한 코드화된 EDEM2 또는 그것의 보존적으로 치환된 변이체든지 본 발명에서 성공적으로 사용될 수 있는 것으로 예상된다. 이전 단원에서 논의된 것과 같이 표 1은 척추동물 EDEM2 단백질의 일부 실례를 열거한다. 어떤 구체예에서, 구성 세포는 어떠한 포유류 EDEM2에 적어도 92% 동일한 서열을 가지는 EDEM2 폴리펩티드를 코드화하는 폴리뉴클레오티드를 함유한다. 어떤 구체예에서, 구성 세포는 SEQ ID NO:8의 포유류 공통 아미노산 서열을 가지는 EDEM2 폴리펩티드를 코드화하는 폴리뉴클레오티드를 함유한다. 어떤 구체예에서, 구성 세포는 SEQ ID NO:1의 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 보존적으로 치환된 변이체를 함유한다.
어떤 구체예에서, 셀라인에 의해 생성된 다중-하위유닛 단백질은 항체이고, 셀라인의 구성 세포는 SEQ ID NO:43 및 SEQ ID NO:44(각각 특정 항체 중쇄의 N-말단 및 C-말단 부분의 공통 서열을 나타낸다), 및 SEQ ID NO:45 및 SEQ ID NO:46(각각 특정 항체 경쇄의 N-말단 및 C-말단 부분의 공통 서열을 나타낸다)의 아미노산 서열을 포함하는 어떠한 하나 또는 그 이상의 폴리펩티드를 코드화하는 폴리뉴클레오티드를 함유한다. 어떤 구체예에서, EDEM2 단백질을 코드화하는 재조합 폴리뉴클레오티드 외에, 셀라인의 구성 세포는 적어도 두 개의 폴리뉴클레오티드를 함유하고, 그것들은 각각 다중-하위유닛 단백질의 특정 하위유닛을 코드화한다. 예를 들어 구성 세포는 SEQ ID NO:43 및 SEQ ID NO:44의 아미노산 서열을 포함하는 항체 중쇄를 코드화하는 폴리뉴클레오티드와, SEQ ID NO:45 및 SEQ ID NO:46의 아미노산 서열을 포함하는 항체 경쇄를 코드화하는 다른 폴리뉴클레오티드를 함유한다.
어떤 구체예에서, 구성 세포는 상기에서 기술된 것과 같이 스트레스-반응 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 하위유닛을 코드화하는 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드 외에, 또한 EDEM2의 상류에서 작동하는 접혀지지 않은 단백질 반응 전사 인자, 예컨대 XBP1의 스플라이싱 형태를 코드화하는 폴리뉴클레오티드를 함유한다. 어떠한 코드화된 XBP1이든지 본 발명에서 성공적으로 사용될 수 있는 것으로 예상된다. 전술한 단원에서 논의된 것과 같이, 표 2는 척추동물 XBP1 스플라이싱 형태 폴리펩티드의 서열의 일부 실례를 열거한다. 그 서열들의 Clustal W 분석은 개시된 스플라이싱된 XBP1 폴리뉴클레오티드 서열이 각각 상호간에 XBP1 서열에 대해 적어도 48% 동일하고; 포유류 XBP1 서열들의 비교 결과 각 서열은 상호간에 적어도 86% 동일한 것으로 나타났다. 그러므로 어떤 구체예에서, 셀라인의 구성 세포는 포유류의 어떠한 하나의 스플라이싱된 XBP1에 대해 적어도 86% 동일한 서열을 가지는 XBP1 폴리펩티드의 스플라이싱 형태를 코드화하는 폴리뉴클레오티드를 함유한다. 어떤 구체예에서, 구성 세포는 SEQ ID NO:13의 공통 아미노산 서열을 가지는 XBP1 폴리펩티드를 코드화하는 폴리뉴클레오티드를 함유한다.
다양한 구체예에서, 세포는 마우스 XBP1(mXBP1) 아미노산 서열(SEQ ID NO:9)에 대해 적어도 86% 동일한 아미노산 서열을 가지는 XBP1 폴리펩티드를 코드화하는 폴리뉴클레오티드를 함유하고; 특정 구체예에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:9의 mXBP1 또는 그것의 보존적으로 치환된 변이체이다.
본 발명은 셀라인이 그것의 원래 세포가 잘 알려져 있는 단백질 생성 세포, 예를 들면 박테리아 대장균 및 유사한 원핵 세포, 효모 피치아 파스토리스 및 다른 피치아 및 비-피치아 효모, 식물 세포 절편, 예컨대 니코티아나의 절편, 곤충 세포, 예컨대 쉬나이더 2 세포, Sf9 및 Sf21, 및 트라이코플러시아 니-유도된 하이파이브 세포 및 생물생성에 전형적으로 사용된 포유류 세포, 예를 들면 CHO, CHO-K1 COS, HeLa, HEK93, Jurkat 및 PC12 세포의 목록으로부터 선택된 구성 세포를 포함한다. 어떤 구체예에서, 세포는 CHO-K1 또는 변형된 CHO-K1 세포, 예컨대 미국 특허 번호 7,435,553, 7,514,545 및 7,771,997 및 미국 공개 특허 출원 번호 US 2010-0304436 A1에서 교시된 것과 같은 세포이다.
어떤 구체예에서, 배지에서 배양된 셀라인은 다중-하위유닛 단백질을 생성하고, 적절하게 조립된 다중-하위유닛 단백질을 배지로 적어도 3g/L, 적어도 5g/L 또는 적어도 8g/L의 역가로 분비할 수 있다.
나아가, 셀라인의 구성 세포는 배양 중에 스트레스-유도된 만노스-결합 렉틴을 코드화하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 함유하지 않는 셀라인의 통합된 세포 밀도보다 약 30% 더 큰 통합된 세포 밀도를 획득할 수 있을 정도로 증식할 수 있다. 어떤 경우에, 셀라인은 스트레스-유도된 만노스-결합 렉틴을 코드화하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 함유하지 않는 셀라인의 통합된 세포 밀도보다 적어도 약 50% 더 큰, 적어도 60% 더 큰, 또는 적어도 90% 더 큰 통합된 세포 밀도를 획득할 수 있다. 어떤 구체예에서, 셀라인의 통합된 세포 밀도는 배양후 약 12일 후에 평가된다.
어떤 특정 구체예에서, 본 발명은 클론-유도된 구성 세포를 포함하는 셀라인을 제공하는데, 이때 구성 세포는 (1) SEQ ID NO:16의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 mEDEM2-코드화 폴리뉴클레오티드, (2) SEQ ID NO:18의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 XBP1-코드화 폴리뉴클레오티드, (3) SEQ ID NO:43 및 44의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 항체 중쇄-코드화 폴리뉴클레오티드 및 (4) SEQ ID NO:45 및 46의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 항체 경쇄-코드화 폴리뉴클레오티드를 함유하는 CHO-K1 세포이다.
한 특정 구체예에서, 본 발명은 클론-유도된 구성 세포를 포함하는 셀라인을 제공하는데, 이때 구성 세포는 (1) SEQ ID NO:16의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 mEDEM2-코드화 폴리뉴클레오티드, (2) SEQ ID NO:18의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 XBP1-코드화 폴리뉴클레오티드, (3) SEQ ID NO:23의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 항체 중쇄-코드화 폴리뉴클레오티드 및 (4) SEQ ID NO:25의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 항체 경쇄-코드화 폴리뉴클레오티드를 함유하는 CHO-K1 세포이다.
다른 특정 구체예에서, 본 발명은 클론-유도된 구성 세포를 포함하는 셀라인을 제공하는데, 이때 구성 세포는 (1) SEQ ID NO:16의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 mEDEM2-코드화 폴리뉴클레오티드, (2) SEQ ID NO:18의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 XBP1-코드화 폴리뉴클레오티드, (3) SEQ ID NO:31의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 항체 중쇄-코드화 폴리뉴클레오티드 및 (4) SEQ ID NO:33의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 항체 경쇄-코드화 폴리뉴클레오티드를 함유하는 CHO-K1 세포이다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명은 클론-유도된 구성 세포를 포함하는 셀라인을 제공하는데, 이때 구성 세포는 (1) SEQ ID NO:16의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 mEDEM2-코드화 폴리뉴클레오티드, (2) SEQ ID NO:18의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 XBP1-코드화 폴리뉴클레오티드, (3) SEQ ID NO:39의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 항체 중쇄-코드화 폴리뉴클레오티드 및 (4) SEQ ID NO:41의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 항체 경쇄-코드화 폴리뉴클레오티드를 함유하는 CHO-K1 세포이다.
EDEM2 폴리뉴클레오티드
또 다른 측면으로, 본 발명은 EDEM2 단백질을 코드화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. EDEM2-코드화 폴리뉴클레오티드는 재조합체이고, 시험관에서, 또는 시험관 내 번역 시스템에서와 같이, 시험관 내 제조, 보관, 사용 또는 발현될 수 있고, 또는 생체 내에서, 예컨대 세포 배양에서와 같이 생체 외에 있을 수 있는 세포에서, 또는 유기체에서와 같은 생체 내에서 제조, 보관, 사용 또는 발현될 수 있다. 어떤 구체예에서, EDEM2-코드화 폴리뉴클레오티드는 유전자 내에 있는데, 이것은 그것이 프로모터의 제어하에 있으면서 그 아래 쪽에 있고, 폴리아데닐화 부위의 위쪽에 있음을 의미한다. EDEM2-코드화 폴리뉴클레오티드 또는 유전자는 플라스미드 또는 다른 원형 또는 선형 벡터 내에 있을 수 있다. EDEM2-코드화 폴리뉴클레오티드 또는 유전자는 세포 내에 에피솜으로서 존재하거나 세포 게놈 안으로 통합되는 원형 또는 선형 DNA 구성물 내에 있을 수 있다.
상기에서 기술된 것과 같이, EDEM2-코드화 폴리뉴클레오티드는 표 1의 어떠한 이종상동체, 상동체 또는 보존적으로 치환된 EDEM2 폴리펩티드, 또는 SEQ ID NO:8의 포유류 공통 서열을 포함하여 SEQ ID NO:1 내지 5 및 8 중 어느 하나에 적어도 92% 동일한 아미노산 서열을 가지는 EDEM2 폴리펩티드를 코드화한다.
어떤 경우에, 재조합 또는 분리된 EDEM2-코드화 폴리뉴클레오티드는 포유류 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 프로모터는 어떠한 프로모터든지 가능하지만, 어떤 경우에는 예를 들면 유비퀴틴 C 프로모터와 같은 포유류 프로모터이다.
특정 구체예에서, EDEM2-코드화 폴리뉴클레오티드는 본질적으로 5'으로부터 3'쪽으로 프로모터, 예컨대 유비퀴틴 C 프로모터, 이어서 임의의 인트론, 예컨대 베타 글로빈 인트론, 이어서 EDEM2 코딩 서열, 이어서 폴리아데닐화 서열, 예컨대 SV40pA 서열로 구성된다. 그런 EDEM2-코드화 폴리뉴클레오티드의 특정 구체예이기도 한 구체적인 실례는 SEQ ID NO:16에 의해 표시된다. 그 서열의 보존된 변이체는 또한 본 발명의 구체예일 것으로 예상된다.
어떤 경우에, 재조합 EDEM2-코드화 폴리뉴클레오티드는 선형, 원형, 에피솜성, 통합된, 고정된 DNA 구성물, 또는 EDEM2 유전자를 전달하거나 EDEM2 단백질을 발현하기 위한 벡터일 수 있는 플라스미드의 부분이다. 한 특정 구체예에서, 플라스미드는 (1) 유비퀴틴 C 프로모터의 제어하에 있고 SV40 폴리아데닐화 신호로 종결되는 EDEM2 유전자 및 (2) 선택가능한 마커, 예컨대 폴리아데닐화 서열, 예컨대 PGK pA 서열로 종결되고, SV40 프로모터와 같은 프로모터의 제어 하에 제오신에 대한 내성을 부여하는 폴리펩티드를 코드화하는 폴리뉴클레오티드 또는 네오마이신에 대한 내성을 부여하는 폴리펩티드를 코드화하는 폴리뉴클레오티드를 함유한다. 한 특정 구체예에서, 플라스미드는 5'에서 3' 방향으로 계속되는 원형 형식으로, 유비퀴틴 C 프로모터, 베타 글로빈 인트론, EDEM2 코딩 서열, SV40 pA 서열, SV40 프로모터, 네오마이신-내성 코딩 서열 및 PGK pA 서열을 포함한다. 이 구체예의 특정 실례는 SEQ ID NO:14의 서열을 가지는 플라스미드에 의해 예시된다. 또 다른 특정 구체예에서, 플라스미드는 5'에서 3' 방향으로 계속되는 원형 형식으로, 유비퀴틴 C 프로모터, 베타 글로빈 인트론, EDEM2 코딩 서열, SV40 pA 서열, SV40 프로모터, 제오신-내성 코딩 서열 및 PGK pA 서열을 포함한다. 이 구체예의 특정 실례는 SEQ ID NO:15의 서열을 가지는 플라스미드에 의해 예시된다.
XBP1 폴리뉴클레오티드
또 다른 측면으로, 본 발명은 XBP1 단백질을 코드화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. XBP1-코드화 폴리뉴클레오티드는 재조합체이고, 시험관에서, 또는 시험관 내 번역 시스템에서와 같이, 시험관 내 제조, 보관, 사용 또는 발현될 수 있고, 또는 생체 내에서, 예컨대 세포 배양에서와 같이 생체 외에 있을 수 있는 세포에서, 또는 유기체에서와 같은 생체 내에서 제조, 보관, 사용 또는 발현될 수 있다. 어떤 구체예에서, XBP1-코드화 폴리뉴클레오티드는 유전자 내에 있는데, 이것은 그것이 프로모터의 제어하에 있으면서 그 아래 쪽에 있고, 폴리아데닐화 부위의 위쪽에 있음을 의미한다. XBP1-코드화 폴리뉴클레오티드는 플라스미드 또는 다른 원형 또는 선형 벡터 내에 있을 수 있다. XBP1-코드화 폴리뉴클레오티드 또는 유전자는 세포 내에 에피솜으로서 존재하거나 세포 게놈 안으로 통합되는 원형 또는 선형 DNA 구성물 내에 있을 수 있다.
상기에서 기술된 것과 같이, XBP1-코드화 폴리뉴클레오티드는 표 2의 어떠한 이종상동체, 상동체 또는 보존적으로 치환된 XBP1 폴리펩티드, 또는 SEQ ID NO:13의 포유류 공통 서열을 포함하여 SEQ ID NO:9, 10 및 11 중 어느 하나에 적어도 86% 동일한 아미노산 서열을 가지는 XBP1 폴리펩티드를 코드화한다.
어떤 경우에, 재조합 또는 분리된 XBP1-코드화 폴리뉴클레오티드는 포유류 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 프로모터는 어떠한 프로모터든지 가능하지만, 어떤 경우에는 예를 들면 유비퀴틴 C 프로모터와 같은 포유류 프로모터이다.
특정 구체예에서, XBP1-코드화 폴리뉴클레오티드는 본질적으로 5'으로부터 3'쪽으로 프로모터, 예컨대 유비퀴틴 C 프로모터, 이어서 임의의 인트론, 예컨대 베타 글로빈 인트론, 이어서 XBP1 코딩 서열, 이어서 폴리아데닐화 서열, 예컨대 SV40pA 서열로 구성된다. SEQ ID NO:18은 XBP1-코드화 폴리뉴클레오티드의 실례를 나타낸다. 그 서열의 보존된 변이체는 또한 본 발명의 구체예일 것으로 예상된다.
어떤 경우에, 재조합 XBP1-코드화 폴리뉴클레오티드는 선형, 원형, 에피솜성, 통합된, 고정된 DNA 구성물, 또는 XBP1 유전자를 전달하거나 스플라이싱되고 활성인 XBP1 단백질을 발현하기 위한 벡터일 수 있는 플라스미드의 부분이다. 한 특정 구체예에서, 플라스미드는 (1) 유비퀴틴 C 프로모터의 제어하에 있고 SV40 폴리아데닐화 신호로 종결되는 XBP1 유전자 및 (2) 선택가능한 마커, 예컨대 폴리아데닐화 서열, 예컨대 PGK pA 서열로 종결되고, SV40 프로모터와 같은 프로모터의 제어 하에 제오신에 대한 내성을 부여하는 폴리펩티드를 코드화하는 폴리뉴클레오티드 또는 네오마이신에 대한 내성을 부여하는 폴리펩티드를 코드화하는 폴리뉴클레오티드를 함유한다. 한 특정 구체예에서, 플라스미드는 5'에서 3' 방향으로 계속되는 원형 형식으로, 유비퀴틴 C 프로모터, 베타 글로빈 인트론, XBP1 코딩 서열, SV40 pA 서열, SV40 프로모터, 제오신-내성 코딩 서열 및 PGK pA 서열을 포함한다. 이 구체예의 특정 실례는 SEQ ID NO:17의 서열을 가지는 원형 플라스미드로 예시된다.
항체 중쇄 및 경쇄-코드화 폴리뉴클레오티드
또 다른 측면으로, 본 발명은 항체 중쇄 폴리펩티드(HC)를 코드화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. HC-코드화 폴리뉴클레오티드는 재조합체이고, 시험관에서, 또는 시험관 내 번역 시스템에서와 같이, 시험관 내 제조, 보관, 사용 또는 발현될 수 있고, 또는 생체 내에서, 예컨대 세포 배양에서와 같이 생체 외에 있을 수 있는 세포에서, 또는 유기체에서와 같은 생체 내에서 제조, 보관, 사용 또는 발현될 수 있다. 어떤 구체예에서, HC-코드화 폴리뉴클레오티드는 유전자 내에 있는데, 이것은 그것이 프로모터의 제어하에 있으면서 그 아래 쪽에 있고, 폴리아데닐화 부위의 위쪽에 있음을 의미한다. HC-코드화 폴리뉴클레오티드는 플라스미드 또는 다른 원형 또는 선형 벡터 내에 있을 수 있다. HC-코드화 폴리뉴클레오티드 또는 유전자는 세포 내에 에피솜으로서 존재하거나 세포 게놈 안으로 통합되는 원형 또는 선형 DNA 구성물 내에 있을 수 있다.
어떤 경우에, 재조합 또는 분리된 HC-코드화 폴리뉴클레오티드는 포유류 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 프로모터는 어떠한 프로모터든지 가능하지만, 어떤 경우에는 예를 들면 유비퀴틴 C 프로모터 또는 hCMV-IE 프로모터와 같은 포유류 프로모터이다.
특정 구체예에서, HC-코드화 폴리뉴클레오티드는 본질적으로 5'으로부터 3'쪽으로 프로모터, 예컨대 hCMV-IE 프로모터, 이어서 임의의 인트론, 예컨대 베타 글로빈 인트론, 이어서 중쇄 코딩 서열, 예컨대 SEQ ID NO:43 및 44, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:27 또는 SEQ ID NO:35의 아미노산 서열을 코드화하는 서열, 이어서 폴리아데닐화 서열, 예컨대 SV40pA 서열을 포함하는 HC 유전자이다. HC 유전자의 특정 실례는 SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:31 또는 SEQ ID NO:39로 표시된다. 이들 서열 중 어느 하나의 보존된 변이체는 또한 본 발명의 구체예일 것으로 예상된다.
어떤 경우에, 재조합 HC-코드화 폴리뉴클레오티드는 선형, 원형, 에피솜성, 통합된, 고정된 DNA 구성물, 또는 중쇄 유전자를 전달하거나 중쇄 하위유닛을 발현하기 위한 벡터일 수 있는 플라스미드의 부분이다. 한 특정 구체예에서, 플라스미드는 (1) hCMV-IE 프로모터의 제어하에 있고 SV40 폴리아데닐화 신호로 종결되는 HC 유전자 및 (2) 선택가능한 마커, 예컨대 SV40 프로모터와 같은 프로모터의 제어 하에 하이그로마이신에 대한 내성을 부여하고, 폴리아데닐화 서열, 예컨대 PGK pA 서열로 종결되는 폴리펩티드를 코드화하는 폴리뉴클레오티드를 함유한다. 한 특정 구체예에서, 플라스미드는 5'에서 3' 방향으로 계속되는 원형 형식으로, hCMV-IE 프로모터, 베타 글로빈 인트론, 항체 중쇄 코딩 서열(SEQ ID NO:43 및 44, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:27 또는 SEQ ID NO:35의 아미노산을 가지는 HC를 코드화한다), SV40 pA 서열, SV40 프로모터, 하이그로마이신-내성 코딩 서열 및 PGK pA 서열을 포함한다. HC 유전자를 함유하는 그런 플라스미드의 특정 실례 및 특별한 구체예는 SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:32 또는 SEQ ID NO:40에 의해 예시된다. 이들 서열 중 어느 하나의 보존된 변이체는 본 발명의 구체예일 것으로 예상된다.
또 다른 측면으로, 본 발명은 항체 경쇄 폴리펩티드(LC)를 코드화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. LC-코드화 폴리뉴클레오티드는 재조합체이고, 시험관에서, 또는 시험관 내 번역 시스템에서와 같이, 시험관 내 제조, 보관, 사용 또는 발현될 수 있고, 또는 생체 내에서, 예컨대 세포 배양에서와 같이 생체 외에 있을 수 있는 세포에서, 또는 유기체에서와 같은 생체 내에서 제조, 보관, 사용 또는 발현될 수 있다. 어떤 구체예에서, LC-코드화 폴리뉴클레오티드는 유전자 내에 있는데, 이것은 그것이 프로모터의 제어하에 있으면서 그 아래 쪽에 있고, 폴리아데닐화 부위의 위쪽에 있음을 의미한다. LC-코드화 폴리뉴클레오티드 또는 유전자는 플라스미드 또는 다른 원형 또는 선형 벡터 내에 있을 수 있다. LC-코드화 폴리뉴클레오티드 또는 유전자는 세포 내에 에피솜으로서 존재하거나 세포 게놈 안으로 통합되는 원형 또는 선형 DNA 구성물 내에 있을 수 있다.
어떤 경우에, 재조합 또는 분리된 LC-코드화 폴리뉴클레오티드는 포유류 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 프로모터는 어떠한 프로모터든지 가능하지만, 어떤 경우에는 예를 들면 유비퀴틴 C 프로모터 또는 hCMV-IE 프로모터와 같은 포유류 프로모터이다.
특정 구체예에서, LC-코드화 폴리뉴클레오티드는 본질적으로 5'으로부터 3'쪽으로 프로모터, 예컨대 hCMV-IE 프로모터, 이어서 임의의 인트론, 예컨대 베타 글로빈 인트론, 이어서 경쇄 코딩 서열, 예컨대 SEQ ID NO:45 및 46, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:29 또는 SEQ ID NO:37의 아미노산 서열을 코드화하는 서열, 이어서 폴리아데닐화 서열, 예컨대 SV40pA 서열을 포함하는 LC 유전자이다. 그런 LC 유전자의 구체적인 실례 및 특정 구체예는 SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:33 또는 SEQ ID NO:41로 표시된다. 이들 서열 중 어느 하나의 보존된 변이체는 또한 본 발명의 구체예일 것으로 예상된다.
어떤 경우에, 재조합 LC-코드화 폴리뉴클레오티드는 선형, 원형, 에피솜성, 통합된, 고정된 DNA 구성물, 또는 경쇄 유전자를 전달하거나 경쇄 하위유닛을 발현하기 위한 벡터일 수 있는 플라스미드의 부분이다. 한 특정 구체예에서, 플라스미드는 (1) hCMV-IE 프로모터의 제어하에 있고 SV40 폴리아데닐화 신호로 종결되는 LC 유전자 및 (2) 선택가능한 마커, 예컨대 SV40 프로모터와 같은 프로모터의 제어 하에 하이그로마이신에 대한 내성을 부여하고, 폴리아데닐화 서열, 예컨대 PGK pA 서열로 종결되는 폴리펩티드를 코드화하는 폴리뉴클레오티드를 함유한다. 한 특정 구체예에서, 플라스미드는 5'에서 3' 방향으로 계속되는 원형 형식으로, hCMV-IE 프로모터, 베타 글로빈 인트론, 항체 경쇄 코딩 서열(SEQ ID NO:45 및 46, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:29 또는 SEQ ID NO:37의 아미노산을 가지는 LC를 코드화한다), SV40 pA 서열, SV40 프로모터, 하이그로마이신-내성 코딩 서열 및 PGK pA 서열을 포함한다. LC 유전자를 함유하는 그런 플라스미드의 구체적인 실례 및 특별한 구체예는 SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:34 또는 SEQ ID NO:42에 의해 예시된다. 이들 서열 중 어느 하나의 보존된 변이체는 본 발명의 구체예일 것으로 예상된다.
다중-하위유닛 단백질의 제조 방법
또 다른 측면으로, 본 발명은 상대적으로 다량의 적절하게 조립된 다중-하위유닛 단백질을 생성하고 분비할 수 있는 세포, 또는 셀라인의 구성 세포를 배지에서 배양함으로써 다중-하위유닛 단백질을 제조하는 방법을 제공하는데, 이때 다중-하위유닛 성분은 상대적으로 높은 역가로 배지로 분비된다. 이 제조 과정에서 활용된 세포는 전술한 측면에서 기술된 세포이고, 그것은 본원에 기술된 ERAD 렉틴-코드화 폴리뉴클레오티드를 함유한다.
유용한 재조합 단백질을 제조할 목적을 위해, 세포 및 특히 포유류 세포를 배양하는 방법은 해당 기술분야에 잘 알려져 있다(예컨대 De Jesus & Wurm, Eur. J. Pharm. Biopharm. 78:184-188, 2011 참조). 간단히 설명하면, 기술된 폴리뉴클레오티드를 함유하는 세포는 혈청 또는 가수분해물을 함유할 수 있거나, 또는 화학적으로 규정되고 단백질 생성을 위해 최적화될 수 있는 배지에서 배양된다. 배양은 물질 환경 조절 장치에서처럼 공급-배치식 배양이거나 연속식 배양일 수 있다. 세포는 실험실 벤치 크기 플라스크(~ 25mL), 제조 스케일-업 생물반응기(1 내지 5L) 또는 산업 규모 생물반응기(5,000 내지 25,000L)에서 배양될 수 있다. 제조 작동은 여러 주에서 1개월까지 지속될 수 있고, 그 시간 동안 다중-하위유닛 단백질이 배지 안으로 분비된다.
대상 세포는 적절하게 조립된 다중-하위유닛 단백질을 생성하고 분비하는 증강된 능력을 가진다. 어떤 구체예에서, 다중-하위유닛 단백질, 예컨대 항체는 적어도 94pg/세포/일, 적어도 37pg/세포/일 또는 적어도 39pg/세포/일의 속도로 배지 안으로 분비된다. 어떤 구체예에서, 다중-하위유닛 단백질은 배양 후 약 12일 후에 적어도 3g/L, 적어도 5g/L, 적어도 6g/L 또는 적어도 8g/L의 역가를 획득한다.
나아가, 대상 세포는 증식하고 상대적으로 높은 세포 밀도, 나아가 최적의 생산성을 획득할 수 있는 증강된 능력을 가진다. 어떤 구체예에서, 세포 또는 셀라인 시드 트레인은 배양중에 적어도 5×107 세포-일/mL, 적어도 1×108 세포-일/mL 또는 적어도 1.5×108 세포-일/mL의 통합된 세포 밀도를 획득한다.
임의로, 분비된 다중-하위유닛 단백질은 계속해서 그것이 분비된 배지로부터 정제된다. 단백질 정제 방법은 해당 기술분야에 잘 알려져 있다(예컨대 Kelley, mAbs 1(5):443-452 참조). 어떤 구체예에서, 단백질은 액체 배지 상층액으로부터 세포를 제거하기 위한 원심분리와, 이어서 다양한 크로마토그래피 단계 및 그 중에서도 바이러스 및 다른 오염물 또는 불순물을 제거하기 위한 여과 단계에 의해 수득된다. 어떤 구체예에서, 크로마토그래피 단계는 이온 교환 단계, 예컨대 양이온-교환 또는 음이온-교환을 포함한다. 다양한 친화성 크로마토그래피 배지, 예컨대 항체의 정제를 위한 단백질 A 크로마토그래피가 또한 사용될 수 있다.
임의로, 제조 방법은 세포를 생성하는 선행 단계들을 포함한다. 그러므로 어떤 구체예에서, 다중-하위유닛 단백질의 제조 방법은 세포를 상술된 것과 같은 스트레스-유도된 만노스-결합 렉틴을 코드화하는 벡터로 형질전환하는 단계와, 이어서 그것의 안정한 통합체를 선택하는 단계를 포함한다. 벡터의 비-제한적인 실례는 SEQ ID NO:1 내지 8 중 어느 하나의 아미노산 서열, SEQ ID NO:1 내지 8 중 어느 하나에 적어도 92% 동일한 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO:1 내지 8의 어느 하나의 보존적으로 치환된 변이체를 가지는 EDEM2를 코드화하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 그런 유전자 구성물들을 포함한다. 유용한 벡터로는, 예를 들면 SEQ ID NO:16의 유전자를 은닉하는 플라스미드, SEQ ID NO:15의 플라스미드 및 SEQ ID NO:14의 플라스미드를 포함한다. 당업자는 플라스미드 서열(예컨대 SEQ ID NO:14, 15, 17, 24, 26, 32, 34, 40 및 42)이 서열 목록에서 선형 방식으로 기술된 원형 서열임을 유념해야 한다. 그러므로 그런 경우에, 기록된 서열의 3-프라임의 대부분의 뉴클레오티드는 기록된 것과 같은 서열의 5-프라임의 대부분의 뉴클레오티드의 5-프라임쪽 바로 옆에 있을 것으로 간주될 것이다. SEQ ID NO:14의 플라스미드의 실례에서, 형질전환체는 네오마이신에 대한 내성을 통해 선택되고; SEQ ID NO:15의 경우, 선택은 ZEOCIN 내성을 통해서 이루어진다.
폴리뉴클레오티드 및 그것을 포함하는 벡터를 구성하기 위한 상세한 방법은 미국 특허 번호 7,435,553 및 7,771,997, 및 예컨대 Zwarthoff et al., J. Gen. Virol. 66(4):685-91, 1985; Mory et al., DNA. 5(3):181-93, 1986; 및 Pichler et al., Biotechnol. Bioeng. 108(2):386-94, 2011에 설명되어 있다.
그 안에 스트레스-유도된 만노스-결합 렉틴을 코드화하는 벡터가 놓이게 되는 출발 세포는 이미 다중-하위유닛 단백질, 또는 XBP1을 활용하는 그런 구체예의 경우에는 XBP1을 코드화하거나 또는 발현을 조절하는 구성물 또는 유전자 요소를 함유할 수 있다. 또는 다르게는, 스트레스-유도된 만노스-결합 렉틴을 코드화하는 벡터는 먼저 세포 내부에, 그 다음에 다른 구성물 내부에 놓일 수 있다.
방법에 의해 제조된 다중-하위유닛 단백질
또 다른 측면으로, 본 발명은 본원에 개시된 방법에 따라 만들어진 다중-하위유닛 단백질을 제공한다. 다중-하위유닛 단백질, 예컨대 항체의 적절한 접힘, 조립 및 번역-후 변형을 촉진하는 하나 또는 그 이상의 요소가 포함된다면, 해당 기술분야의 숙련자라면 그런 단백질이 뚜렷한 구조적 및 기능적 품질을 가지는 것으로 타당하게 예상할 수 있을 것이다. 예를 들어 개시된 방법에 의해 제조된 항체는 특별한 글리코실화 패턴 및 비-응집된 이종사량체의 정량적으로 더 큰 부분을 가지는 것으로 타당하게 여겨진다.
실시예
다음의 실시예는 해당 기술분야의 숙련된 사람들에게 본 발명의 방법 및 조성물을 제조하고 사용하는 방법을 완전하게 개시하고 설명하기 위해 제공되는 것으로, 본 발명자들이 자신들의 발명으로 간주하는 범주를 제한하려는 의도는 아니다. 사용된 숫자(예컨대 양, 온도 등)와 관련하여 정확성을 보장하기 위한 노력이 기울여졌지만, 약간의 실험적 오류나 편차는 설명되어야 한다. 다르게 표시되지 않는 한, 부는 몰에 의한 부이고, 분자량은 평균 분자량이며, 퍼센트 농도(%)는 밀리리터의 용액의 부피로 나눈 그램의 용매의 질량 곱하기 100%를 의미하고(예컨대 10% 물질 X는 용액 밀리리터당 물질 X의 0.1그램을 의미한다), 온도는 섭씨 온도이며, 압력은 대기압이거나 대기압 근처이다.
실시예 1: 셀라인
CHO-K1 유도된 숙주 셀라인을 사람 항체의 중쇄 및 경쇄를 코드화하는 두 개의 플라스미드로 형질전환하였다. 두 개의 플라스미드는 모두 하이그로마이신 B에 대한 내성을 부여하는 hph 유전자를 함유한다(Asselbergs and Pronk, 1992, Mol. Biol. Rep., 17(1):61-70). 세포를 LIPOPECTAMIN 시약(Invitrogen cat.#18324020)을 사용하여 형질전환하였다. 간단하게 설명하면, 형질전환 하루 전에 3.5×106 세포를 10cm 플레이트 상에서 10%의 소태아 혈청(FBS)(Invitrogen cat.#10100)을 함유하고 있는 완전 F12(Invitrogen cat.#11765)에 플레이팅하였다. 형질전환 후 1일에 세포를 1회 세척하고, 배지를 OPTIMEM으로 교체하였다(Invitrogen cat.#31985로부터). DNA/리포펙타민 복합체를 OPTIMEM 배지에서 제조한 후 세포에 첨가하였다. 배지를 다시 한 번 6시간 후에 10%의 FBS를 포함하고 있는 완전 F12로 교환하였다. 플라스미드의 안정한 통합을 하이그로마이신 B 선택을 사용하여 400㎍/ml에서 선택하였다. 클론성 항체를 발현하는 셀라인을 FASTR 기술(미국 특허 번호 6,919,183에 설명되어 있음)을 사용하여 분리하였다.
그런 다음 항체를 발현하는 라인을 EDEM2 코드화 플라스미드로 재-형질전환시켰다. EDEM2 플라스미드는 네오마이신 포스포트란스페라제("p3"로 표시된 플라스미드 구성물) 또는 sh ble(플라스미드 "p7") 유전자 중 하나를 함유하여 G418 또는 제오신에 대한 내성을 부여하였다. 동일한 형질전환 방법을 사용하였다. 선택가능한 마커에 따라 세포를 각각 G418 또는 제오신을 사용하여 400㎍/ml 또는 250㎍/ml에서 선택하였다. 그런 다음 클론성 셀라인을 FASTR 기술을 사용하여 분리하였다.
명칭 인핸서 구성물 단백질
C1 EDEM2 + XBP1 HC/LC = p1/p2
EDEM2 = p3
XBP1 = p4		 aAng2
C2 XBP1
C3 EDEM2 + XBP1 HC/LC = p5/p6
EDEM2 = p7
XBP1 = p4		 aGDF8
C4 XBP1
C5 EDEM2
C6 EDEM2 + XBP1 HC/LC = p8/p9
EDEM2 = p3
XBP1 = p4		 aAngPtl4
C7 XBP1
실시예 2:
항체 생성을 진동 플라스크를 사용하여 스케일-다운된 12일 공급 배치 공정으로 평가하였다. 이 방법으로 세포를 진동 플라스크에 생성 배지(고아미노산을 포함한 규정 배지)의 mL당 0.8×106 세포의 밀도로 시딩하였다. 배양을 약 12일 동안 유지하고, 글루코스뿐 아니라 3회의 공급물을 보충하였다. 생존 세포 밀도 및 항체 역가를 배치를 통털어 모니터하였다.
증강된 단백질 생성에 미치는 mEDEM2의 효과를 측정하기 위하여, mEDEM2 및 mXBP1을 함유하고 있는 CHO 셀라인에 의한 단백질의 생성을 mEDEM2가 아닌 mXBP1을 함유한 대조 세포에 의한 생성과 비교하였다. 단백질 역가는 mEDEM2를 발현하지 않은 셀라인에 비해 mEDEM2를 발현하는 그런 셀라인에서 더 높았다.
역가
셀라인 인핸서 생성률(pg/세포/일) 역가 g/L (% 증가)
C1 EDEM2 + XBP1 39 8.1 (93)
C2 XBP1 39 4.2
C3 EDEM2 + XBP1 37 5.9 (55)
C8 XBP1 32 3.8
C6 EDEM2 + XBP1 94 5.3 (152)
C7 XBP1 52 2.1
C5 EDEM2 29 3.1 (343)
C9 --- 9 0.7
실시예 3: 통합된 세포 일
통합된 세포 일("ICD")은 공급 배치 과정을 통털어 배양의 성장을 설명하기 위해 사용된 구절이다. 12-일 생성 분석의 과정에서, 본 발명자들은 0, 3, 5, 7, 10 및 12일에 생존 세포 밀도를 모니터하였다. 그런 다음 이 데이터를 시간에 대해 도표화하였다. ICD는 세포 밀도 곡선 아래의 면적으로서 계산된 생존 세포 밀도의 적분이다. EDEM2 형질전환된 라인은 12-일 공급 배치 과정에서 더 높은 ICD를 나타낸다(표 5 참조).
통합된 세포 밀도
셀라인 인핸서 ICD 106 세포-일/mL (% 증가)
C1 EDEM2 + XBP1 205 (93)
C2 XBP1 106
C3 EDEM2 + XBP1 157 (34)
C4 XBP1 117
C6 EDEM2 + XBP1 56 (51)
C7 XBP1 37
C5 EDEM2 116 (59)
C9 --- 73
실시예 4: 항-GDF8 항체 생성
EDEM2, XBP1 또는 두 가지 모두의 이소성 발현이 SEQ ID NO:19의 중쇄 서열 및 SEQ ID NO:21의 경쇄 서열을 가지는 항-GDF8 항체의 생성에 미치는 효과를 조사하였다. 개별적인 셀라인을 역가 및 통합된 세포 밀도에 대하여 조사하고, "bins" 또는 값의 범위에 놓았다. EDEM2의 이소성 발현은 5 내지 6g/L의 역가 범위로 항체를 발현하는 셀라인의 수를 상당히 증가시켰다. XBP1과 EDEM2의 조합은 고역가 셀라인의 증가를 향한 첨가 효과 이상을 나타냈다. 항체를 분비하는 세포에서 EDEM2의 발현은 또한 높은 ICD를 획득하는 셀라인의 수를 상당히 증가시켰다(표 6 참조).
역가 Bins (g/L) ICD Bins (106 세포-일/mL)
구성물 <1 1-3 3-5 5-6 30-50 50-100 100-200
E+X 0% 33.3% 44.4% 22.2% 11.1% 50% 38.9%
X 0% 37.5% 54% 8.3% 14.3% 85.7% 0%
E 0% 33% 60% 7% 0% 27% 73%
- 82% 18% 0% 0% 13% 67% 21%
SEQUENCE LISTING <110> Regeneron Pharmaceuticals, Inc. <120> Production Cell Line Enhancers <130> 8150A <150> US 61/652,549 <151> 2012-05-29 <160> 46 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 577 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Met Pro Phe Arg Leu Leu Ile Pro Leu Gly Leu Val Cys Val Leu Leu 1 5 10 15 Pro Leu His His Gly Ala Pro Gly Pro Asp Gly Thr Ala Pro Asp Pro 20 25 30 Ala His Tyr Arg Glu Arg Val Lys Ala Met Phe Tyr His Ala Tyr Asp 35 40 45 Ser Tyr Leu Glu Asn Ala Phe Pro Tyr Asp Glu Leu Arg Pro Leu Thr 50 55 60 Cys Asp Gly His Asp Thr Trp Gly Ser Phe Ser Leu Thr Leu Ile Asp 65 70 75 80 Ala Leu Asp Thr Leu Leu Ile Leu Gly Asn Thr Ser Glu Phe Gln Arg 85 90 95 Val Val Glu Val Leu Gln Asp Asn Val Asp Phe Asp Ile Asp Val Asn 100 105 110 Ala Ser Val Phe Glu Thr Asn Ile Arg Val Val Gly Gly Leu Leu Ser 115 120 125 Ala His Leu Leu Ser Lys Lys Ala Gly Val Glu Val Glu Ala Gly Trp 130 135 140 Pro Cys Ser Gly Pro Leu Leu Arg Met Ala Glu Glu Ala Ala Arg Lys 145 150 155 160 Leu Leu Pro Ala Phe Gln Thr Pro Thr Gly Met Pro Tyr Gly Thr Val 165 170 175 Asn Leu Leu His Gly Val Asn Pro Gly Glu Thr Pro Val Thr Cys Thr 180 185 190 Ala Gly Ile Gly Thr Phe Ile Val Glu Phe Ala Thr Leu Ser Ser Leu 195 200 205 Thr Gly Asp Pro Val Phe Glu Asp Val Ala Arg Val Ala Leu Met Arg 210 215 220 Leu Trp Glu Ser Arg Ser Asp Ile Gly Leu Val Gly Asn His Ile Asp 225 230 235 240 Val Leu Thr Gly Lys Trp Val Ala Gln Asp Ala Gly Ile Gly Ala Gly 245 250 255 Val Asp Ser Tyr Phe Glu Tyr Leu Val Lys Gly Ala Ile Leu Leu Gln 260 265 270 Asp Lys Lys Leu Met Ala Met Phe Leu Glu Tyr Asn Lys Ala Ile Arg 275 280 285 Asn Tyr Thr His Phe Asp Asp Trp Tyr Leu Trp Val Gln Met Tyr Lys 290 295 300 Gly Thr Val Ser Met Pro Val Phe Gln Ser Leu Glu Ala Tyr Trp Pro 305 310 315 320 Gly Leu Gln Ser Leu Ile Gly Asp Ile Asp Asn Ala Met Arg Thr Phe 325 330 335 Leu Asn Tyr Tyr Thr Val Trp Lys Gln Phe Gly Gly Leu Pro Glu Phe 340 345 350 Tyr Asn Ile Pro Gln Gly Tyr Thr Val Glu Lys Arg Glu Gly Tyr Pro 355 360 365 Leu Arg Pro Glu Leu Ile Glu Ser Ala Met Tyr Leu Tyr Arg Ala Thr 370 375 380 Gly Asp Pro Thr Leu Leu Glu Leu Gly Arg Asp Ala Val Glu Ser Ile 385 390 395 400 Glu Lys Ile Ser Lys Val Glu Cys Gly Phe Ala Thr Ile Lys Asp Leu 405 410 415 Arg Asp His Lys Leu Asp Asn Arg Met Glu Ser Phe Phe Leu Ala Glu 420 425 430 Thr Val Lys Tyr Leu Tyr Leu Leu Phe His Pro Asn Asn Phe Ile His 435 440 445 Asn Asn Gly Ser Thr Phe Asp Ser Val Met Thr Pro His Gly Glu Cys 450 455 460 Ile Leu Gly Ala Gly Gly Tyr Ile Phe Asn Thr Glu Ala His Pro Ile 465 470 475 480 Asp Pro Ala Ala Leu His Cys Cys Arg Arg Leu Lys Glu Glu Gln Trp 485 490 495 Glu Val Glu Asp Leu Ile Lys Glu Phe Tyr Ser Leu Lys Gln Ser Arg 500 505 510 Pro Lys Arg Ala Gln Arg Lys Thr Val Arg Ser Gly Pro Trp Glu Pro 515 520 525 Gln Ser Gly Pro Ala Thr Leu Ser Ser Pro Ala Asn Gln Pro Arg Glu 530 535 540 Lys Gln Pro Ala Gln Gln Arg Thr Pro Leu Leu Ser Cys Pro Ser Gln 545 550 555 560 Pro Phe Thr Ser Lys Leu Ala Leu Leu Gly Gln Val Phe Leu Asp Ser 565 570 575 Ser <210> 2 <211> 576 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 2 Met Pro Phe Arg Leu Leu Ile Pro Leu Gly Leu Val Cys Val Leu Leu 1 5 10 15 Pro Leu His His Gly Ala Pro Gly Pro Glu Gly Thr Ala Pro Asp Pro 20 25 30 Ala His Tyr Arg Glu Arg Val Lys Ala Met Phe Tyr His Ala Tyr Asp 35 40 45 Ser Tyr Leu Glu Asn Ala Phe Pro Tyr Asp Glu Leu Arg Pro Leu Thr 50 55 60 Cys Asp Gly His Asp Thr Trp Gly Ser Phe Ser Leu Thr Leu Ile Asp 65 70 75 80 Ala Leu Asp Thr Leu Leu Ile Leu Gly Asn Thr Ser Glu Phe Gln Arg 85 90 95 Val Val Glu Val Leu Gln Asp Asn Val Asp Phe Asp Ile Asp Val Asn 100 105 110 Ala Ser Val Phe Glu Thr Asn Ile Arg Val Val Gly Gly Leu Leu Ser 115 120 125 Ala His Leu Leu Ser Lys Lys Ala Gly Val Glu Val Glu Ala Gly Trp 130 135 140 Pro Cys Ser Gly Pro Leu Leu Arg Met Ala Glu Glu Ala Ala Arg Lys 145 150 155 160 Leu Leu Pro Ala Phe Gln Thr Pro Thr Gly Met Pro Tyr Gly Thr Val 165 170 175 Asn Leu Leu His Gly Val Asn Pro Gly Glu Thr Pro Val Thr Cys Thr 180 185 190 Ala Gly Ile Gly Thr Phe Ile Val Glu Phe Ala Thr Leu Ser Ser Leu 195 200 205 Thr Gly Asp Pro Val Phe Glu Asp Val Ala Arg Val Ala Leu Met Arg 210 215 220 Leu Trp Glu Ser Arg Ser Asp Ile Gly Leu Val Gly Asn His Ile Asp 225 230 235 240 Val Leu Thr Gly Lys Trp Val Ala Gln Asp Ala Gly Ile Gly Ala Gly 245 250 255 Val Asp Ser Tyr Phe Glu Tyr Leu Val Lys Gly Ala Ile Leu Leu Gln 260 265 270 Asp Lys Lys Leu Met Ala Met Phe Leu Glu Tyr Asn Lys Ala Ile Arg 275 280 285 Asn Tyr Thr His Phe Asp Asp Trp Tyr Leu Trp Val Gln Met Tyr Lys 290 295 300 Gly Thr Val Ser Met Pro Val Phe Gln Ser Leu Glu Ala Tyr Trp Pro 305 310 315 320 Gly Leu Gln Ser Leu Ile Gly Asp Ile Asp Asn Ala Met Arg Thr Phe 325 330 335 Leu Asn Tyr Tyr Thr Val Trp Lys Gln Phe Gly Gly Leu Pro Glu Phe 340 345 350 Tyr Asn Ile Pro Gln Gly Tyr Thr Val Glu Lys Arg Glu Gly Tyr Pro 355 360 365 Leu Arg Pro Glu Leu Ile Glu Ser Ala Met Tyr Leu Tyr Arg Ala Thr 370 375 380 Gly Asp Pro Thr Leu Leu Glu Leu Gly Arg Asp Ala Val Glu Ser Ile 385 390 395 400 Glu Lys Ile Ser Lys Val Glu Cys Gly Phe Ala Thr Ile 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Val Ala Ala Gln Thr Ala 65 70 75 80 Arg Asp Arg Lys Lys Ala Arg Met Ser Glu Leu Glu Gln Gln Val Val 85 90 95 Asp Leu Glu Glu Glu Asn Xaa Lys Leu Xaa Leu Glu Asn Gln Leu Leu 100 105 110 Arg Glu Lys Thr His Gly Leu Val Xaa Glu Asn Gln Glu Leu Arg Xaa 115 120 125 Arg Leu Gly Met Asp Xaa Leu Asp Xaa Xaa Glu Xaa Xaa Glu Xaa Glu 130 135 140 Xaa Lys Gly Xaa Xaa Val Arg Xaa Val Ala Gly Ser Ala Glu Ser Ala 145 150 155 160 Ala Gly Ala Gly Pro Val Val Thr Xaa Pro Glu His Leu Pro Met Asp 165 170 175 Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Ser Asp Ser Glu Ser Asp Ile Leu Leu Gly 180 185 190 Ile Leu Asp Xaa Leu Asp Pro Val Met Phe Phe Lys Cys Pro Ser Pro 195 200 205 Glu Xaa Ala Xaa Leu Glu Glu Leu Pro Glu Val Tyr Pro Xaa Gly Pro 210 215 220 Ser Ser Leu Pro Ala Ser Leu Ser Leu Ser Val Gly Thr Ser Ser Ala 225 230 235 240 Lys Leu Glu Ala Ile Asn Glu Leu Ile Arg Phe Asp His Xaa Tyr Thr 245 250 255 Lys Pro Leu Val Leu Glu Ile Pro Ser Glu Thr Glu Ser Gln Xaa Asn 260 265 270 Val Val Val Lys Ile Glu Glu Ala Pro Leu Ser Xaa Ser Glu Xaa Asp 275 280 285 His Pro Glu Phe Ile Val Ser Val Lys Xaa Glu Pro Xaa Glu Xaa Asp 290 295 300 Xaa Xaa Pro Glu Xaa Gly Ile Ser Asn Leu Leu Ser Ser Ser His Cys 305 310 315 320 Xaa Xaa Pro Xaa Ser Cys Leu Leu Asp Ala Xaa Ser Asp Cys Gly Tyr 325 330 335 Xaa Gly Ser Xaa Ser Pro Phe Ser Asp Met Ser Ser Xaa Leu Gly Xaa 340 345 350 Xaa His Ser Trp Glu Asp Thr Phe Ala Asn Glu Leu Phe Pro Gln Leu 355 360 365 Ile Ser Val 370 <210> 14 <211> 7686 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic plasmid <400> 14 aagcttatac tcgagctcta gattgggaac ccgggtctct cgaattcgat gccttttaga 60 ctcctgatac cattgggtct tgtttgcgtt ctcctccctc tccatcacgg cgccccaggt 120 ccagacggta ccgcacctga tcctgcccat taccgcgaac gcgttaaagc catgttctac 180 cacgcctatg actcctatct ggaaaatgca ttcccctatg atgagctccg accccttacc 240 tgcgatggtc atgatacttg gggctctttt tcccttaccc ttattgacgc tctggacaca 300 ctccttatcc tcggaaacac cagcgaattt caaagagtag ttgaagtact tcaggacaat 360 gtcgactttg acatcgatgt gaacgcatca gttttcgaaa caaatataag agtcgttgga 420 ggtctgctct ccgcccacct tctctctaaa aaagccggag tagaagttga agctggctgg 480 ccctgctccg gacccctcct tcgtatggct gaagaagctg cccgcaaact ccttcccgct 540 tttcagaccc caaccggtat gccctatggt actgttaacc tcctgcacgg agtaaatccc 600 ggcgaaaccc ccgtcacatg tacagccgga attggaacct ttattgtgga atttgcaacc 660 cttagcagcc tgaccggaga tcctgtattc gaagacgtgg ctcgggttgc cctgatgcga 720 ctgtgggaat ccaggtctga tatcggtctg gtcggtaacc atatagacgt actcactggt 780 aaatgggttg cacaagacgc tggaattggg gcaggcgtgg attcttattt tgaatatctc 840 gtaaaagggg ccatactctt gcaggacaaa aaacttatgg ctatgttcct ggaatataac 900 aaagctatta ggaactacac acacttcgat gattggtatt tgtgggtcca aatgtataaa 960 ggaaccgttt ctatgcctgt ctttcagtca ctggaggctt attggcctgg tctgcaatcc 1020 ctgatcggag acattgacaa tgcaatgagg acattcctta attattacac tgtttggaag 1080 cagttcggcg gattgcccga attttacaac attcctcaag gctatacagt tgaaaaaaga 1140 gaaggatatc ccctgcgccc cgagcttatt gaaagcgcta tgtatctgta tcgtgcaaca 1200 ggtgatccaa ccctgcttga actgggacga gacgccgtcg aatcaatcga gaaaatttca 1260 aaagtggaat 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tcagggttat tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa 3840 ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc cccgaaaagt gccacctgac gtcaggtacc 3900 aagcctaggc ctccaaaaaa gcctcctcac tacttctgga atagctcaga ggcagaggcg 3960 gcctcggcct ctgcataaat aaaaaaaatt agtcagccat ggggcggaga atgggcggaa 4020 ctgggcggag ttaggggcgg gatgggcgga gttaggggcg ggactatggt tgctgactaa 4080 ttgagatgca tgctttgcat acttctgcct gctggggagc ctggggactt tccacacctg 4140 gttgctgact aattgagatg catgctttgc atacttctgc ctgctgggga gcctggggac 4200 tttccacacc ggatccacca tgggatcggc cattgaacaa gatggattgc acgcaggttc 4260 tccggccgct tgggtggaga ggctattcgg ctatgactgg gcacaacaga caatcggctg 4320 ctctgatgcc gccgtgttcc ggctgtcagc gcaggggcgc ccggttcttt ttgtcaagac 4380 cgacctgtcc ggtgccctga atgaactgca ggacgaggca gcgcggctat cgtggctggc 4440 cacgacgggc gttccttgcg cagctgtgct cgacgttgtc actgaagcgg gaagggactg 4500 gctgctattg ggcgaagtgc cggggcagga tctcctgtca tctcaccttg ctcctgccga 4560 gaaagtatcc atcatggctg atgcaatgcg gcggctgcat acgcttgatc cggctacctg 4620 cccattcgac 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gattgcccga attttacaac attcctcaag gctatacagt tgaaaaaaga 1140 gaaggatatc ccctgcgccc cgagcttatt gaaagcgcta tgtatctgta tcgtgcaaca 1200 ggtgatccaa ccctgcttga actgggacga gacgccgtcg aatcaatcga gaaaatttca 1260 aaagtggaat gcggctttgc aacaattaaa gatcttagag accacaaact ggataatcgc 1320 atggagtcat tctttttggc tgagaccgtc aagtatctgt atctgctttt tcatcccaac 1380 aacttcatcc ataataacgg gtccaccttc gattcagtca tgacccctca cggtgaatgc 1440 atactcggag ctggaggcta tatttttaac actgaagctc acccaattga cccagctgcc 1500 cttcattgtt gtcgacgtct gaaagaagaa caatgggagg ttgaagattt gatcaaagaa 1560 ttttactcac ttaaacaaag tcgacctaaa cgcgcacaga gaaaaactgt aagatctggt 1620 ccttgggaac ctcagtccgg cccagcaact ctttcatccc ccgccaacca accacgagaa 1680 aaacaaccag cccaacagag aacccccctg ctcagctgcc cctctcagcc cttcacttca 1740 aaactcgccc tgcttggaca ggtgtttctg gactcctctt gatttaaaca cgcggccgct 1800 aatcagccat accacatttg tagaggtttt acttgcttta aaaaacctcc cacacctccc 1860 cctgaacctg aaacataaaa tgaatgcaat tgttgttgtt aacttgttta ttgcagctta 1920 taatggttac 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gggtggagta tttacggtaa actgcccact tggcagtaca 240 tcaagtgtat catatgccaa gtacgccccc tattgacgtc aatgacggta aatggcccgc 300 ctggcattat gcccagtaca tgaccttatg ggactttcct acttggcagt acatctacgt 360 attagtcatc gctattacca tggtgatgcg gttttggcag tacatcaatg ggcgtggata 420 gcggtttgac tcacggggat ttccaagtct ccaccccatt gacgtcaatg ggagtttgtt 480 ttggcaccaa aatcaacggg actttccaaa atgtcgtaac aactccgccc cattgacgca 540 aatgggcggt aggcgtgtac ggtgggaggt ctatataagc agagctcatg atagaagcac 600 tctactattc gtcgaccgat cctgagaact tcagggtgag tttggggacc cttgattgtt 660 ctttcttttt cgctattgta aaattcatgt tatatggagg gggcaaagtt ttcagggtgt 720 tgtttagaat gggaagatgt cccttgtatc accatggacc ctcatgataa ttttgtttct 780 ttcactttct actctgttga caaccattgt ctcctcttat tttcttttca ttttctgtaa 840 ctttttcgtt aaactttagc ttgcatttgt aacgaatttt taaattcact tttgtttatt 900 tgtcagattg taagtacttt ctctaatcac ttttttttca aggcaatcag ggtatattat 960 attgtacttc agcacagttt tagagaacaa ttgttataat taaatgataa ggtagaatat 1020 ttctgcatat aaattctggc tggcgtggaa 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gtatcagcag aaaccaggga aagttcctaa cctcctgatc tatgctgcgt ccgctttaca 300 atcaggggtc ccatctcgtt tcagtggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat 360 cagcagcctg cagcctgagg atgttgcaac ttattactgt caaaattata acactgcccc 420 gctcactttc ggcgggggga ccaaggtgga aatcaaacga actgtggctg caccatctgt 480 cttcatcttc ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga actgcctctg ttgtgtgcct 540 gctgaataac ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg aaggtggata acgccctcca 600 atcgggtaac tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc aaggacagca cctacagcct 660 cagcagcacc ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa cacaaagtct acgcctgcga 720 agtcacccat cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc ttcaacaggg gagagtgtta 780 ggcggccgct aatcagccat accacatttg tagaggtttt acttgcttta aaaaacctcc 840 cacacctccc cctgaacctg aaacataaaa tgaatgcaat tgttgttgtt aacttgttta 900 ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca aataaagcat 960 ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct tatcatgtct 1020 accggtaggg cccctctctt catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa 1080 aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat 1140 cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc 1200 cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc 1260 gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcaatgct cacgctgtag gtatctcagt 1320 tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac 1380 cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg 1440 ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca 1500 gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc 1560 gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa 1620 accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa 1680 ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac 1740 tcacgttaag ggattttggt catgggcgcg ggcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc 1800 tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact 1860 tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt 1920 cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta 1980 ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta 2040 tcagcaataa accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc 2100 gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat 2160 agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt 2220 atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg 2280 tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca 2340 gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta 2400 agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg 2460 cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca tagcagaact 2520 ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg 2580 ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt 2640 actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga 2700 ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc 2760 atttatcagg gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa 2820 caaatagggg ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac ctgacgtcag gtacacttag 2880 gcgcgccatt agagttcctg caggctacat ggtaccaagc ctaggcctcc aaaaaagcct 2940 cctcactact tctggaatag ctcagaggca gaggcggcct cggcctctgc ataaataaaa 3000 aaaattagtc agccatgggg cggagaatgg gcggaactgg gcggagttag gggcgggatg 3060 ggcggagtta ggggcgggac tatggttgct gactaattga gatgcatgct ttgcatactt 3120 ctgcctgctg gggagcctgg ggactttcca cacctggttg ctgactaatt gagatgcatg 3180 ctttgcatac ttctgcctgc tggggagcct ggggactttc cacaccggat ccaccatgga 3240 tagatccgga aagcctgaac tcaccgcgac gtctgtcgag aagtttctga tcgaaaagtt 3300 cgacagcgtc tccgacctga tgcagctctc ggagggcgaa gaatctcgtg ctttcagctt 3360 cgatgtagga gggcgtggat atgtcctgcg ggtaaatagc tgcgccgatg gtttctacaa 3420 agatcgttat gtttatcggc actttgcatc ggccgcgctc ccgattccgg aagtgcttga 3480 cattggggag ttcagcgaga gcctgaccta ttgcatctcc cgccgtgcac agggtgtcac 3540 gttgcaagac ctgcctgaaa ccgaactgcc cgctgttctg cagccggtcg cggaggccat 3600 ggatgcgatc gctgcggccg atcttagcca gacgagcggg ttcggcccat tcggaccgca 3660 aggaatcggt caatacacta catggcgtga tttcatatgc gcgattgctg atccccatgt 3720 gtatcactgg caaactgtga tggacgacac cgtcagtgcg tccgtcgcgc aggctctcga 3780 tgagctgatg ctttgggccg aggactgccc cgaagtccgg cacctcgtgc acgcggattt 3840 cggctccaac aatgtcctga cggacaatgg ccgcataaca gcggtcattg actggagcga 3900 ggcgatgttc ggggattccc aatacgaggt cgccaacatc ttcttctgga ggccgtggtt 3960 ggcttgtatg gagcagcaga cgcgctactt cgagcggagg catccggagc ttgcaggatc 4020 gccgcggctc cgggcgtata tgctccgcat tggtcttgac caactctatc agagcttggt 4080 tgacggcaat ttcgatgatg cagcttgggc gcagggtcga tgcgacgcaa tcgtccgatc 4140 cggagccggg actgtcgggc gtacacaaat cgcccgcaga agcgcggccg tctggaccga 4200 tggctgtgta gaagtactcg ccgatagtgg aaaccgacgc cccagcactc gtccgagggc 4260 aaaggaatag acgcgtgctg taagtctgca gaaattgatg atctattaaa caataaagat 4320 gtccactaaa atggaagttt ttcctgtcat actttgttaa gaagggtgag aacagagtac 4380 ctacattttg aatggaagga ttggagctac gggggtgggg gtggggtggg attagataaa 4440 tgcctgctct ttactgaagg ctctttacta ttgctttatg ataatgtttc atagttggat 4500 atcataattt aaacaagcaa aaccaaatta agggccagct cattcctccc actcatgatc 4560 tatggatcta tagatctctc gtgcagctgg ggctctaggg ggtatcccca cgcgccctgt 4620 agcggcgcat taagcgcggc gggtgtggtg gttacgcgca gcgtgaccgc tacacttgcc 4680 agcgccctag cgcccgctcc tttcgctttc ttcccttcct ttctcgccac gttcgccggc 4740 tttccccgtc aagctctaaa tcgggggctc cctttagggt tccgatttag tgctttacgg 4800 cacctcgacc ccaaaaaact tgattagggt gatggttcac gtagtgggcc atcgccctga 4860 tagacggttt ttcgcccttt gacgttggag tccacgttct ttaatagtgg actcttgttc 4920 caaactggaa caacactcaa ccctatctcg gtctattctt ttgatttata agggattttg 4980 ccgatttcgg cctattggtt aaaaaatgag ctgatttaac aaaaatttaa cgcgaattaa 5040 ttctgtggaa tgtgtgtcag ttagtcgcga tgtgtgacta gttagttatt aatagtaatc 5100 aattacgggg tcattagttc atagcccata tatggagttc cgcgttacat aacttacggt 5160 aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta 5220 tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg 5280 gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga 5340 cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tatgggactt 5400 tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt accatggtga tgcggttttg 5460 gcagtacatc aatgggcgtg gatagcggtt tgactcacgg ggatttccaa gtctccaccc 5520 cattgacgtc aatgggagtt tgttttggca ccaaaatcaa cgggactttc caaaatgtcg 5580 taacaactcc gccccattga cgcaaatggg cggtaggcgt gtacggtggg aggtctatat 5640 aagcagagct catgatagaa gcactctact attcgtcgac cgatcctgag aacttcaggg 5700 tgagtttggg gacccttgat tgttctttct ttttcgctat tgtaaaattc atgttatatg 5760 gagggggcaa agttttcagg gtgttgttta gaatgggaag atgtcccttg tatcaccatg 5820 gaccctcatg ataattttgt ttctttcact ttctactctg ttgacaacca ttgtctcctc 5880 ttattttctt ttcattttct gtaacttttt cgttaaactt tagcttgcat ttgtaacgaa 5940 tttttaaatt cacttttgtt tatttgtcag attgtaagta ctttctctaa tcactttttt 6000 ttcaaggcaa tcagggtata ttatattgta cttcagcaca gttttagaga acaattgtta 6060 taattaaatg ataaggtaga atatttctgc atataaattc tggctggcgt ggaaatattc 6120 ttattggtag aaacaactac accctggtca tcatcctgcc tttctcttta tggttacaat 6180 gatatacact gtttgagatg aggataaaat actctgagtc caaaccgggc ccctctgcta 6240 accatgttca tgccttcttc tctttcctac agctcctggg caacgtgctg gttgttgtgc 6300 tgtctcatca ttttggcaaa gaattaagct tatac 6335 <210> 43 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> consensus sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (34)..(35) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (93)..(93) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (93)..(93) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (96)..(96) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (100)..(100) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (111)..(111) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (114)..(114) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 43 Xaa Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Xaa Val Ser Ser Ala Ser 1 5 10 15 Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Xaa Ser Xaa Ser Thr 20 25 30 Ser Xaa Xaa Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro 35 40 45 Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 50 55 60 His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 65 70 75 80 Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Xaa Thr Tyr Xaa 85 90 95 Cys Asn Val Xaa His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Xaa Val 100 105 110 Glu Xaa Lys 115 <210> 44 <211> 225 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> consensus sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (47)..(47) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (53)..(53) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (75)..(75) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (106)..(106) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (109)..(110) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (134)..(135) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (137)..(137) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (188)..(188) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (198)..(198) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (224)..(224) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 44 Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Xaa Leu Gly Gly 1 5 10 15 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 20 25 30 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Xaa Glu 35 40 45 Asp Pro Glu Val Xaa Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 50 55 60 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Xaa Asn Ser Thr Tyr Arg 65 70 75 80 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 85 90 95 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Xaa Leu Pro Xaa Xaa Ile Glu 100 105 110 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 115 120 125 Thr Leu Pro Pro Ser Xaa Xaa Glu Xaa Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 130 135 140 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 145 150 155 160 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 165 170 175 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Xaa Leu Thr Val Asp 180 185 190 Lys Ser Arg Trp Gln Xaa Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 195 200 205 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Xaa 210 215 220 Gly 225 <210> 45 <211> 60 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> consensus sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(14) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(22) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(27) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(31) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (34)..(34) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (48)..(48) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (50)..(50) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (54)..(54) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (56)..(56) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 45 Ser Asp Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Xaa Xaa Pro Xaa 1 5 10 15 Leu Leu Ile Tyr Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Val Pro Xaa Arg 20 25 30 Phe Xaa Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Xaa 35 40 45 Leu Xaa Pro Glu Asp Xaa Ala Xaa Tyr Tyr Cys Gln 50 55 60 <210> 46 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> consensus sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 46 Thr Phe Gly Xaa Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 1 5 10 15 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 20 25 30 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 35 40 45 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 50 55 60 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 65 70 75 80 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 85 90 95 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 100 105 110 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 115

Claims (42)

  1. 세포로서,
    a. SEQ ID NO: 9에 적어도 86% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제1 생성 인핸서 단백질을 코드화하는 핵산 서열을 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드; 및
    b. SEQ ID NO: 46의 아미노산 서열을 포함하는 다중-하위유닛 단백질을 코드화하는 핵산을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드
    를 포함하는 세포.
  2. 제1항에 있어서, 제1 폴리뉴클레오티드는 제1 생성 인핸서 단백질을 코드화하는 핵산에 작동가능하게 연결된 구성성 프로모터를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 세포.
  3. 제2항에 있어서, 제1 폴리뉴클레오티드의 구성성 프로모터는 유비퀴틴 C 프로모터, CMV-IE 프로모터, 및 SV40 프로모터로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 세포.
  4. 제1항에 있어서, 제1 폴리뉴클레오티드는 세포의 전사적으로 활성인 유전자좌에서 통합되는 것을 특징으로 하는 세포.
  5. 제1항에 있어서, 제1 생성 인핸서 단백질은 SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, 및 SEQ ID NO: 11로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포.
  6. 제1항에 있어서, 세포는 32 pg/세포/일보다 큰 속도로 세포 배지 안으로 다중-하위유닛 단백질을 분비하는 것을 특징으로 하는 세포.
  7. 제1항에 있어서, 세포는 SEQ ID NO: 1에 적어도 92% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제2 생성 인핸서 단백질을 코드화하는 핵산 서열을 포함하는 제3 폴리뉴클레오티드를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 세포.
  8. 제7항에 있어서, 제3 폴리뉴클레오티드는 제2 생성 인핸서 단백질을 코드화하는 핵산에 작동가능하게 연결된 제2 구성성 프로모터를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 세포.
  9. 제8항에 있어서, 제2 구성성 프로모터는 SV40 프로모터인 것을 특징으로 하는 세포.
  10. 제7항에 있어서, 제2 생성 인핸서 단백질은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, 및 SEQ ID NO: 8로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포.
  11. 제7항에 있어서, 세포는 적어도 37 pg/세포/일의 속도로 세포 배지 안으로 다중-하위유닛 단백질을 분비하는 것을 특징으로 하는 세포.
  12. 제1항에 있어서, 다중-하위유닛 단백질을 코드화하는 핵산은 SEQ ID NO: 45의 아미노산 서열을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 세포.
  13. 제1항에 있어서, 다중-하위유닛 단백질을 코드화하는 핵산은 SEQ ID NO: 44의 아미노산 서열을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 세포.
  14. 제1항에 있어서, 다중-하위유닛 단백질은 항체인 것을 특징으로 하는 세포.
  15. 제14항에 있어서, 항체는 SEQ ID NO: 44의 아미노산 서열을 가진 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포.
  16. 제15항에 있어서, 항체는 항-GDF8 항체, 항-Ang2 항체, 또는 항-AngPtl4 항체인 것을 특징으로 하는 세포.
  17. 제1항에 있어서, 세포는 진핵 세포인 것을 특징으로 하는 세포.
  18. 제17항에 있어서, 세포는 변형된 CHO-K1 세포인 것을 특징으로 하는 세포.
  19. 제7항에 있어서, 다중-하위유닛 단백질에 결합하는 세포 표면 포획 분자를 코드화하는 제4 폴리뉴클레오티드를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 세포.
  20. 제1항의 세포로부터 클론 팽창에 의해 유래된 다수의 세포를 포함하는 셀라인.
  21. 다중-하위유닛 단백질의 제조 방법으로서,
    a. i. SEQ ID NO: 9에 적어도 86% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제1 생성 인핸서 단백질을 코드화하는 핵산을 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드, 및
    ii. SEQ ID NO:46의 아미노산 서열을 포함하는 다중-하위유닛 단백질을 코드화하는 핵산을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드
    를 포함하는 세포로부터 클론 팽창에 의해 유래된 다수의 세포를 배지에서 배양하는 단계;
    b. 세포가 9 pg/세포/일보다 큰 속도로 배지 안으로 다중-하위유닛 단백질을 분비하도록 허용하는 단계; 및
    c. 배지로부터 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 또는 친화성 크로마토그래피와 이온 교환 크로마토그래피의 조합에 의해 다중-하위유닛 단백질을 정제하는 단계
    를 포함하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 제1 생성 인핸서 단백질은 SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, 및 SEQ ID NO: 13으로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제21항에 있어서, 제1 생성 인핸서 단백질을 코드화하는 핵산은 구성성 편재성 프로모터에 작동가능하게 연결되는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 구성성 프로모터는 유비퀴틴 C 프로모터, CMV-IE 프로모터, 및 SV40 프로모터로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제22항에 있어서, 제1 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 18의 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 제1 폴리뉴클레오티드는 핵산 서열 of SEQ ID NO: 17의 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제21항에 있어서, 세포는 32 pg/세포/일보다 큰 속도로 배지 안으로 다중-하위유닛 단백질을 분비하는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제21항에 있어서, 단계 (a) 전에:
    aa. 임의의 순서로,
    i. 세포를 제1 폴리뉴클레오티드로 형질전환하는 단계, 및
    ii. 세포를 제2 폴리뉴클레오티드로 형질전환하는 단계; 및
    bb. 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포를 클론적으로 팽창시키는 단계
    를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제21항에 있어서, 세포는 SEQ ID NO: 1에 적어도 92% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제2 생성 인핸서 단백질을 코드화하는 핵산을 포함하고, 세포가 단계 (b)에서 37 pg/세포/일 이상의 속도로 배지 안으로 다중-하위유닛 단백질을 분비하는 것을 허용하는 제3 폴리뉴클레오티드를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 제2 생성 인핸서 단백질은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 및 SEQ ID NO: 8로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제29항에 있어서, 제2 생성 인핸서 단백질을 코드화하는 핵산은 제2 구성성 프로모터에 작동가능하게 연결되는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 제2 구성성 프로모터는 유비퀴틴 C 프로모터, CMV-IE 프로모터, 및 SV40 프로모터로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제31항에 있어서, 제3 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 16의 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제31항에 있어서, 제3 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 14 또는 15의 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제29항에 있어서, 단계 (a) 전에:
    aa. 임의의 순서로,
    i. 세포를 제1 폴리뉴클레오티드로 형질전환하는 단계,
    ii. 세포를 제2 폴리뉴클레오티드로 형질전환하는 단계, 및
    iii. 세포를 제3 폴리뉴클레오티드로 형질전환하는 단계; 및
    bb. 제1 폴리뉴클레오티드, 제2 폴리뉴클레오티드 및 제3 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포를 클론적으로 팽창시키는 단계
    를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제21항에 있어서, 다중-하위유닛 단백질은 배지에 ≥2.1 g/L, ≥3.8 g/L, 또는 ≥4.2 g/L의 역가로 축적되는 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제29항에 있어서, 다중-하위유닛 단백질은 배지에 ≥5.3 g/L, ≥5.9 g/L, 또는 ≥8.1 g/L의 역가로 축적되는 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제21항에 있어서, 다중-하위유닛 단백질을 코드화하는 핵산은 SEQ ID NO: 45의 아미노산 서열을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제21항에 있어서, 다중-하위유닛 단백질을 코드화하는 핵산은 SEQ ID NO: 44의 아미노산 서열을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 제21항에 있어서, 다중-하위유닛 단백질은 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 제40항에 있어서, 항체는 SEQ ID NO: 44의 아미노산 서열을 가진 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 제41항에 있어서, 항체는 항-GDF8 항체, 항-Ang2 항체, 또는 항-AngPtl4 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
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