ES2445193T3

ES2445193T3 - Mamíferos no humanos productores de anticuerpos

Info

Publication number: ES2445193T3
Application number: ES09075279.1T
Authority: ES
Inventors: Erwin Houtzager; Rui Daniel Pinto; Ton Logtenberg; Mark Throsby
Original assignee: Merus BV
Current assignee: Merus BV
Priority date: 2008-06-27
Filing date: 2009-06-29
Publication date: 2014-02-28
Anticipated expiration: 2029-06-29
Also published as: DK2147594T3; HRP20140139T1; JP7439201B2; HRP20220205T1; JP6824807B2; RU2020127564A3; SG10201408500RA; DK2556747T3; AU2009263082B9; LT3456190T; DK3456190T3; SI2147594T1; ES2906344T3; NZ590118A; CA2729095C; JP2022188085A; KR102306491B1; EP2556747A3; CA2729095A1; CN105191863A

Abstract

Un mamífero murino transgénico que comprende, integrado en su genoma, una molécula de ácido nucleico quecontiene una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada, en el que dicha cadenaligera es capaz de emparejarse con al menos dos cadenas pesadas diferentes codificadas por el mamífero murino,de tal manera que la variedad en la especificidad de anticuerpos está conservada a través de reordenamientos ehipermutaciones en las cadenas pesadas, y en el que dicha cadena ligera comprende adicionalmente una regiónconstante de cadena ligera murina.

Description

Mamiferos no humanos productores de anticuerpos

Campo tecnico

La invencion se refiere a la produccion y al uso de animales no humanos capaces de producir anticuerpos, o

5 derivados de los mismos, que se expresan a partir de acidos nucleicos al menos parcialmente exogenos (transgenes). Se describen transgenes para producir dichos animales transgenicos y procedimientos para producir dichos anticuerpos heterologos; procedimientos y vectores para producir dichos animales transgenicos.

Antecedentes de la invenci6n

Los linfocitos B median en la inmunidad humoral produciendo anticuerpos especificos. La subunidad estructural

10 basica de un anticuerpo (Ab) es una molecula de inmunoglobulina (Ig). Las moleculas de Ig constan de un complejo de dos cadenas polipeptidicas ligeras (L) identicas y dos pesadas (H) identicas. En el extremo amino de cada cadena H y cadena L hay una region que varia en la secuencia de aminoacidos denominada region variable (V). La parte restante de las cadenas H y L es relativamente constante en la secuencia de aminoacidos y se denomina region constante (C). En una molecula de Ig, las regiones V de cadena H y L (VH y VL) se yuxtaponen para formar el

15 posible sitio de union a antigeno. Los genes que codifican las regiones V de cadena H y L se ensamblan somaticamente a partir de segmentos de ADN de la linea germinal durante la diferenciacion de linfocitos B precursores (pre-B): segmentos genicos V, D y J para la cadena H y segmentos genicos V y J para la cadena L. Dentro de las regiones V de Ig existen tres regiones de mayor variabilidad de secuencia de aminoacidos que interaccionan para formar el sitio de reconocimiento del antigeno y por tanto se denominan regiones determinantes

20 de complementariedad (CDR).

El segmento genico V codifica la mayor parte del dominio de la region V, incluyendo la CDR1 y CDR2. La diversidad en la CDR1 y CDR2 deriva de la heterogeneidad de secuencias entre multiples segmentos V codificados por diferentes lineas germinales. La CDR3 se codifica por secuencias que estan formadas por la union de segmentos genicos V, D y J de la cadena H y segmentos V y J de la cadena L y por mecanismos que crean heterogeneidad de

25 secuencia de nucleotidos donde se combinan estos segmentos. Diversidad adicional puede derivar del emparejamiento de regiones V de cadena H y L diferentes. En su conjunto estos procesos producen un repertorio primario de anticuerpos codificados por segmentos genicos de la linea germinal y expresados por linfocitos B recien formados.

Una fuente adicional de diversidad de anticuerpos esta impuesta por encima de la diversidad generada por

30 recombinacion de segmentos genicos de Ig. Los linfocitos B pueden introducir mutaciones en las regiones V del anticuerpo que expresan, un proceso denominado hipermutacion somatica. Por tanto, cuando un animal se encuentra por primera vez con un antigeno, el antigeno se une a un linfocito B especifico que sucede que lleva anticuerpos que tienen un dominio V que se une al antigeno. Esta respuesta primaria puede activar a este linfocito B para que continue segregando el anticuerpo afin. Estos linfocitos B activados tambien pueden dirigir ahora un

35 proceso de mutacion somatica en sus segmentos genicos de anticuerpo reordenados y por tanto permitir la produccion de celulas hijas que producen variantes de los anticuerpos de la respuesta primaria. Un proceso de seleccion amplifica aquellos descendientes de linfocitos T variantes que constituyen un anticuerpo de afinidad mejorada por el antigeno. En linfocitos B, las hipermutaciones somaticas se dirigen a una region genomica limitada incluyendo los dos genes VH y VL reordenados. Por tanto la mutacion somatica permite la maduracion por afinidad,

40 la produccion y la seleccion de anticuerpos de alta afinidad. Por lo tanto, la mutacion somatica es importante para la generacion de anticuerpos de alta afinidad.

La especificidad exquisita y la alta afinidad de los anticuerpos y el descubrimiento de la tecnologia de hibridoma que permite la generacion de anticuerpos monoclonales (mAb) ha generado grandes expectativas para su utilizacion como agentes terapeuticos diana para enfermedades humanas. Los mAb son identicos porque estan producidos por 45 un solo linfocito B y su progenie. Los mAb se preparan fusionando los esplenocitos de un raton que se ha inmunizado con el antigeno deseado con celulas de mieloma para generar hibridomas inmortalizados. Uno de los mayores impedimentos enfrentados con el desarrollo de aplicaciones in vivo para los mAb en seres humanos es la inmunogenicidad intrinseca de las Ig no humanas. Los pacientes que responden a dosis terapeuticas de mAbs de raton fabricando anticuerpos contra las secuencias de Ig de raton (Anticuerpos Humanos Anti-raton; HAMA),

50 ocasionan toxicidad aguda, alteran su biodistribucion y aceleran la eliminacion, reduciendo de este modo la eficacia de administraciones posteriores (Mirick, y col., (2004) Q. Nucl. Med. Mol. Imaging 48, 251-257).

Para rodear la generacion de HAMA, se han desarrollado procedimientos de humanizacion de anticuerpos en un intento para producir mAbs con menor inmunogenicidad cuando se aplican a seres humanos. Estos intentos han producido diversas estrategias basadas en ADN recombinante orientadas a aumentar el contenido de secuencias de 55 aminoacidos humanas en los mAb conservando al mismo tiempo la especifidad y afinidad del anticuerpo no humano parental. La humanizacion comenzo con la construccion de mAb quimericos raton-ser humano (Morrison, S. L., y col., (1984). Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos., 81, 6851-5), en los que las regiones C de la Ig en los mAb murinos se reemplazaron por regiones C humanas. Los mAb quimericos contienen el 60-70 % de las secuencias de

2 5

aminoacidos de ser humano y son considerablemente menos inmunogenicos que sus homologos murinos cuando se inyectan en seres humanos, a pesar de observarse aun una respuesta de anticuerpo antiquimerico humano (Hwang,

W. Y., y col. (2005). Methods, 36, 3-10).

En intentos para humanizar adicionalmente mAb murinos, se desarrollo el injerto de CDR. En el injerto de CDR, los anticuerpos murinos se humanizan injertando sus CDR sobre los armazones VL y VH de moleculas de IgG humana, conservando al mismo tiempo los restos marco conservados murinos considerados como esenciales para la especifidad y afinidad (Jones, P.T., y col., (1986). Nature, 321, 522).

En conjunto, los anticuerpos con CDR injertadas constan de mas del 80 % de secuencias de aminoacidos humanas (Queen, C. y col. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 86, 10029; Carter, P. y col. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 89, 4285). A pesar de estos esfuerzos, se observo que los anticuerpos humanizados con CDR injertadas aun suscitaban una respuesta de anticuerpo contra la region V injertada (Hwang, W. Y., y col. (2005). Methods, 36, 3).

Posterior al injerto de CDR, se han desarrollado procedimientos de humanizacion basados en diferentes paradigmas, tales como reaparicion (Padlan, E. A., y col., (1991). Mol. Immunol., 28, 489), superhumanizacion (Tan, P., D. A., y col., (2002) J. Immunol., 169, 1119), optimizacion del contenido de cadenas humanas (Lazar, G. A., y col., (2007). Mol. Immunol., 44, 1986) y humanizacion mediante modificacion por ingenieria genetica (humaneering) en un intento para disminuir adicionalmente el contenido de secuencias no humanas en mAb terapeuticos (Almagro,

J. C., y col., (2008). Frontiers in Bioscience 13, 1619). Al igual que en las estrategias de injerto de CDR, estos procedimientos se basan en analisis de la estructura de anticuerpos y comparacion de secuencias de los mAb no humanos y humanos para evaluar el impacto del proceso de humanizacion en la inmunogenicidad del producto final. Cuando se compara la inmunogenicidad de anticuerpos quimericos y humanizados, la humanizacion de regiones variables parece disminuir adicionalmente la inmunogenicidad (Hwang, W. Y., y col. (2005). Methods, 36, 3-10).

Las desinmunizacion es otra estrategia desarrollada para reducir la inmunogenicidad de anticuerpos quimericos o de raton. Esto implica la identificacion de epitopes de linfocitos T lineales en el anticuerpo de interes, usando bioinformatica, y su reemplazo posterior por mutagenesis dirigida a sitio por secuencias no inmunogenicas o humanas (documento W009852976A1). Aunque los anticuerpos desinmunizados presentan inmunogenicidad reducida en primates, en comparacion con sus homologos quimericos, se observo alguna perdida de afinidad de union (Jain, M., y col., (2007). Trends in Biotechnol. 25, 307).

El desarrollo de la tecnologia de presentacion de fagos complemento y amplio las estrategias de humanizacion en intentos de obtener mAb menos inmunogenicos para terapia en seres humanos. En la presentacion de fagos, se expresan grandes colecciones (,bibliotecas') de regiones VH y VL de anticuerpos humanos sobre la superficie de particulas de bacteriofagos filamentosos. A partir de estas bibliotecas, se seleccionan fagos excepcionales mediante la interaccion de union con antigeno; los fragmentos de anticuerpos solubles se expresan de bacterias infectadas y la afinidad de union de los anticuerpos seleccionados se mejora por mutacion (Winter, G., y col. (1994). Annu. Rev. Immunol. 12, 433). Este proceso imita la seleccion inmunitaria y usando esta estrategia se han aislado anticuerpos con muchas especificidades de union diferentes (Hoogenboom, H. R., y col. (2005). Nat. Biotechnol., 23, 1105). Se han usado diversas fuentes de regiones V de cadena H y L para construir bibliotecas de presentacion de fagos incluyendo los aislados de donantes no inmunes o inmunes. Ademas, se han construido bibliotecas de presentacion de fagos de regiones V que contienen regiones CDR sinteticas artificialmente aleatorizadas para crear diversidad adicional. A menudo, los anticuerpos obtenidos a partir de bibliotecas de presentacion de fagos se someten a maduracion por afinidad in vitro para obtener anticuerpos de alta afinidad (Hoogenboom, H. R., y col. (2005). Nat. Biotechnol., 23, 1105).

La creacion de cepas de raton transgenico que producen anticuerpos humanos en ausencia de bibliotecas de raton ha proporcionado otra plataforma de tecnologia para la generacion de mAb humanos especificos y de alta afinidad para aplicacion en seres humanos. En estos animales transgenicos, la maquinaria de anticuerpo de raton endogena se inactiva y se reemplaza por locus de Ig humana para reproducir sustancialmente el sistema inmunitario humoral humano en ratones (Jakobovits, A., y col. (2007). Nat. Biotechnol. 25, 1134. Lonberg, N. (2005). Nat. Biotechnol. 23, 1117). El desarrollo de linfocitos B, asi como la diversificacion de Ig por recombinacion de segmentos genicos, se reproduce satisfactoriamente en estos ratones, lo que conduce a un repertorio diverso de linfocitos B murinos que expresan Ig humanas. Inmunizando a estos ratones con antigenos, se demostro adicionalmente que estos animales transgenicos acumulaban mutaciones somaticas en las regiones V de las cadenas tanto pesadas como ligeras para producir una amplia diversidad de mAb humanos de alta afinidad (Lonberg, N. (2005). Nat. Biotechnol. 23, 1117).

La cuestion de si los mAb quot;completamente humanosquot;, tales como los derivados de bibliotecas de presentacion de fagos o de ratones transgenicos, son menos inmunogenicos que los mAb humanizados continua sin poder responderse, porque los datos de inmunogenicidad completa solo estan disponibles para dos mAb humanos. Un mAb anti-factor de necrosis tumoral, desarrollado a partir de bibliotecas humanas de presentacion de fagos, indujo respuestas de anticuerpos en el 12 % de los pacientes- al extremo de la frecuencia mas alta de respuestas antianticuerpo de los anticuerpos humanizados (Hwang, W. Y., y col. (2005). Methods, 36, 3-10).

La evaluacion de la inmunogenicidad del primer mAb humano registrado generado mediante estrategia transgenica

3 5

demostro que el tratamiento con mAb daba como resultado la generacion de anticuerpos en aproximadamente el 5,5 % de pacientes con cancer tratados (Jakobovits, A., y col. (2007). Nat. Biotechnol. 25, 1134., Lofgren, J. A., y col. (2007). J. Immunol. 178, 7467).

Sirac y col. (2006, Blood 108(2): 536-543) desvelan un raton transgenico que comprende el dominio variable humano reordenado del sindrome de Fanconi (FC) insertado cadena arriba del dominio constante murino endogeno. El dominio V de FC tiene muchas caracteristicas atipicas, ya que forma cristales y es resistente a digestion proteolitica. El analisis de separacion de celulas activadas por fluorescencia muestra expresion superficial de dicha cadena ligera de inmunoglobulina quimerica en el raton transgenico, pero no se observa ninguna poblacion de linfocitos B que exprese tanto la cadena pesada de inmunoglobulina como la cadena ligera de FC.

El documento EP0814159 desvela un experimento teorico para la produccion de un raton transgenico para la produccion de anticuerpos, que comprende un dominio V humano reordenado unido a un dominio constante de cadena ligera humana. No se han producido ratones transgenicos.

Por lo tanto, continua existiendo la necesidad de un procedimiento y un medio para producir anticuerpos que sean especificos para sus dianas, pero que sean menos inmunogenicos. De acuerdo con la invencion, la reduccion de la inmunogenicidad se consigue, al menos parcialmente, proporcionando un mamifero murino transgenico que comprenda, integrado en su genoma, una molecula de acido nucleico que codifique una region variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada, donde dicha cadena ligera sea capaz de emparejarse con al menos dos cadenas pesadas diferentes codificadas por el mamifero murino, de tal manera que se conserve la variedad en la especifidad de anticuerpos a traves de reordenaciones e hipermutaciones en las cadenas pesadas y donde dicha cadena ligera comprenda adicionalmente una region constante de cadena ligera murina.

En el resto de la memoria descriptiva, los ratones se usan tipicamente como ejemplos de animales murinos. Los huespedes mamiferos murinos transgenicos son capaces de suscitar una respuesta inmunitaria contra un antigeno, donde la respuesta produce anticuerpos que tienen regiones variables de primates, particularmente de ser humano.

Se han usado ratones para la produccion de linfocitos B para inmortalizacion para la produccion de anticuerpos. Dado que los ratones son faciles de manipular, pueden reproducirse en grandes cantidades, y se sabe que tienen un amplio repertorio inmunitario, normalmente los ratones seran el animal de eleccion. Por lo tanto, la siguiente explicacion se referira a ratones, pero debe entenderse que otros mamiferos murinos puedan sustituirse facilmente por los ratones, siguiendo los mismos procedimientos.

La razon de impedir reordenaciones e hipermutacion es que de esta manera puede seleccionarse de antemano un polipeptido no inmunogenico sabiendo que esta cadena polipeptidica permanecera no inmunogenica. Al menos una de las cadenas de la inmunoglobulina resultante es por tanto menos inmunogenica. El anticuerpo resultante necesita tener (normalmente) una cadena tanto ligera como pesada. La cadena no inmunogenica debe por tanto ser capaz de emparejarse con la otra cadena. La otra cadena puede ser una cadena endogena, una cadena exogena o un hibrido de ambas. Para terapia en seres humanos, la cadena no inmunogenica debe ser tan cercana a la humana como sea posible.

Naturalmente, un medio para hacer que un gen que codifica una cadena (o cadenas) de inmunoglobulina sea resistente a reordenamiento y/o mutacion de ADN es la eliminacion de todos los elementos geneticos responsables de dicho reordenamiento y/o mutacion. Su inconveniente es que se elimina la variabilidad de las dos cadenas, mientras que la invencion conserva preferentemente la variabilidad en una cadena (preferentemente en la cadena pesada) e inhibe y/o impide el reordenamiento/mutacion de la otra cadena (preferentemente de la cadena ligera).

Los elementos para el reordenamiento y/o hipermutacion caracterizados hasta ahora se localizan en los locus de las inmunoglobulinas. Por lo tanto, los medios para hacer que la secuencia que codifica la inmunoglobulina sea resistente a reordenamiento y/o mutacion de ADN es insertar el gen en un locus fuera del locus de los locus de la inmunoglobulina.

Se describe un mamifero murino transgenico en el que la secuencia que codifica la cadena ligera esta integrada en el genoma del animal murino en un locus fuera de los locus de inmunoglobulina. Preferentemente la insercion es en un locus que es resistente al silenciamiento genico. De acuerdo con la invencion, la integracion es en el locus Rosa.

Se prefiere proporcionar un casete de expresion que pueda insertarse en un locus Rosa o en un locus comparable con un medio que permita la expresion de la cadena (o cadenas) de inmunoglobulina esencialmente limitada a celulas de linaje de linfocitos B, preferentemente con un medio que permita la expresion del acido nucleico que codifica la cadena ligera durante una determinada fase del desarrollo de linfocitos B. La expresion quot;expresion esencialmente limitadaquot; indica que la expresion se realiza predominantemente en celulas de linaje de linfocitos B, pero que son posibles niveles mas bajos de expresion en otras celulas, en comparacion con el nivel de expresion en linfocitos B.En una realizacion preferida, la expresion quot;expresion esencialmente limitadaquot; indica que la expresion esta exclusivamente presente en celulas de linaje de linfocitos B. Dichos medios incluyen tipica o preferentemente promotores especificos de linfocitos B (fase de desarrollo), tales como CD19, CD20, μHC (todos genes V), VpreB1, VpreB2, VpreB3, λ5, Igα, Igβ, κLC (todos genes), λLC (todos genes), BSAP (Pax5). Aunque es muy posible que dichos promotores dirijan la cadena resistente a reordenamiento y/o mutacion del ADN, estos son relativamente

4 5

debiles. Tipicamente se requerira un promotor fuerte para garantizar la expresion adecuada en la superficie del receptor de linfocitos B (constituido de la cadena H y L de la Ig unida a la membrana) y competir con la expresion y emparejamiento de cadenas endogenas (si estan presentes) a traves de exclusion alelica. Sin embargo, dicho promotor es normalmente no especifico de tejido. Para conferir especifidad tisular, se prefiere un sistema indirecto que emplee Cre/lox o similar. La cadena deseada se pone bajo el control de un promotor fuerte inhibido por un elemento que puede eliminarse por la accion de una proteina Cre, que conduce a la activacion del gen deseado que codifica la inmunoglobulina. Este sistema se describe con detalle en Wunderlich F. T. (2004), quot;Generation of inducible Cre systems for conditional gene inactivation in micequot;, Inauguraldissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultat der Universitat zu K6ln; http://deposit.ddb.de/cgibin/dokserv?idn= 97557230x&dok var=d 1&dok-ext=pdf&filename=97557230x.pdf.

La cadena de inmunoglobulina producida de una manera resistente a reordenamientos e hipermutacion es una cadena ligera capaz de emparejarse con diferentes cadenas pesadas codificadas por el mamifero murino. La cadena ligera sera por tanto la misma (y menos inmunogenica) en todos los anticuerpos, pero se conserva la variedad en cuanto a la especificidad a traves de reordenamientos e hipermutaciones en las cadenas pesadas. En este caso puede ser preferible silenciar al menos uno de los locus endogenos que codifica una cadena ligera, aunque la exclusion alelica puede hacer que esto sea innecesario.

De acuerdo con la presente realizacion, preferentemente el locus de cadena ligera kappa (κ) endogena esta silenciado funcionalmente.

Si el locus de cadena ligera κ endogena esta silenciado, aunque tambien por otras razones, se prefiere que la cadena ligera resistente sea una cadena ligera κ, preferentemente una cadena ligera que tenga una secuencia similar a la de la linea germinal. De acuerdo con la invencion dicha cadena ligera conduciria a un anticuerpo con inmunogenicidad reducida. La secuencia de la linea germinal preferida se basa en la IGKV1-39 (012) humana ya que esta cadena ligera se observa muy frecuentemente en el repertorio humano (de Wildt y col. 1999. J. Mol. Biol. 285(3): 895) y tiene mejor estabilidad termodinamica, rendimiento y solubilidad (Ewert y col. 2003. J. Mol. Biol. 325(3): 531).

A continuacion se proporcionan realizaciones mas especificas del casete de expresion con el que el mamifero murino puede proporcionarse de acuerdo con la invencion.

Por tanto, la invencion proporciona, en una realizacion especifica, un mamifero murino transgenico en el que el acido nucleico que codifica la cadena ligera comprende, en direccion 5'-3': un promotor especifico de linfocitos B, un lider, un gen V humano reordenado, opcionalmente un potenciador MoEκi, una region constante (κ) y opcionalmente un potenciador MoEκ3' (truncado). Neuberger identifico y examino un nuevo potenciador especifico de linfocitos B localizado cadena abajo de la region constante kappa (documento EP004690251). Se ha observado que este potenciador desempefa una funcion crucial en la expresion de genes kappa ya que la eliminacion del potenciador de 808 pb redujo fuertemente la expresion. La delecion del potenciador kappa 3' tambien redujo fuertemente el nivel de hipermutaciones somaticas (SHM). En estudios transgenicos y de expresion celular, se ha revelado que los potenciadores kappa 3' reducidos, mutados o delecionados potencian no solo la disminucion de los niveles de expresion sino que tambien reducen el nivel de hipermutaciones somaticas. Actualmente, no puede determinarse si el potenciador kappa 3' esta implicado en procesos de SHM, regulacion de expresion o ambos (revisado en 0degard, V. H., y col. (2006). Nat. Rev. Immunol. 6, 573; Inlay, M., y col. (2002). Nat. Immunol. 3, 463.).

Estudios de expresion detallados utilizando variantes modificadas por ingenieria genetica del potenciador kappa 3' indicaron que bastaba una region de 50 nucleotidos para dirigir la expresion. Sin embargo para una expresion adecuada se prefiere una secuencia reducida de 145 nucleotidos (documento EP04690251; Meyer, K. B., y col. (1990) Nucleic Acids Res. 18(19): 5609-15).

Por tanto, en un aspecto, la invencion utiliza un acido nucleico para la insercion en el genoma de un mamifero murino que es un casete de expresion para la expresion de una molecula proteica deseada en celulas que se desarrollan en linfocitos B maduros durante una determinada fase de desarrollo, comprendiendo dicho casete medios para prevenir el silenciamiento de la expresion de la molecula proteica deseada despues de la introduccion en una celula huesped y medios para sincronizar la expresion de la molecula proteica deseada con la fase de desarrollo deseada de la celula huesped.

Un casete de expresion se define como un acido nucleico que se ha proporcionado con medios para la introduccion en el genoma de una celula huesped, tales como secuencias que permiten la recombinacion homologa con un sitio determinado en el genoma. Normalmente el acido nucleico sera ADN, tipicamente bicatenario. Tipicamente el casete de expresion proporcionara a la celula en un vector a partir del cual este se transfiere al genoma de la celula. El casete de expresion comprende adicionalmente todos los elementos necesarios para la expresion del gen en una celula huesped, aunque en determinadas realizaciones algunos de dichos elementos pueden estar presentes en un segundo acido nucleico a introducir, mediante lo cual estos elementos actuan en trans. Los elementos necesarios para la expresion en una celula huesped incluyen promotores, potenciadores y otros elementos reguladores. Solo son necesarios los elementos no proporcionados por la celula huesped.

5 5

En el contexto de la invencion es importante que la expresion del gen de interes no este silenciada en el genoma de la celula huesped, especialmente no en la fase desarrollo en la que se requiere la expresion. Esto puede realizarse por diversos medios, tales como insercion en el locus endogeno o proporcionando al casete elementos de acido nucleico que impidan el silenciamiento (Kwaks y col. (2006) Trends Biotechnol. 24(3), pags.137-142). Se prefiere insertar el casete de expresion en un locus que este silenciado en las celulas huesped (documento EP 01439234).

Dichos medios para impedir el silenciamiento comprenden secuencias Estabilizantes Anti-Represoras (secuencias STAR®) y Regiones de Union a la Matriz (MAR). Una secuencia STAR es una secuencia de acido nucleico que comprende una capacidad para ejercer influencia en la transcripcion de genes en cis. Tipicamente, aunque no necesariamente, una secuencia STAR no codifica por si misma un elemento de proteina funcional. En una realizacion se utiliza un elemento STAR. Sin embargo, preferentemente, se utiliza mas de un elemento STAR. En una realizacion particularmente preferida se proporciona un casete de expresion de acuerdo con la invencion con dos secuencias STAR; una secuencia STAR en el lado 5' de la secuencia codificante del gen de inmunoglobulina y otra secuencia STAR en el lado 3' de la secuencia codificante del gen de inmunoglobulina. Las MAR son secuencias de ADN que estan implicadas en el anclaje del ADN/cromatina a la matriz nuclear y se han descrito en especies tanto de mamiferos como de plantas. Las MAR poseen diversas caracteristicas que facilitan la apertura y conservacion de la eucromatina. Las MAR pueden aumentar la expresion transgenica y limitar efectos posicionales.

En el contexto de la invencion es importante que la expresion del casete se produzca solo durante un determinado periodo en el desarrollo de una celula, en particular un linfocito B en desarrollo, mas en particular un linfocito B en un animal no humano transgenico, en particular un raton. En este caso particular el periodo de desarrollo se selecciona de tal manera que la expresion del gen a partir del casete (tipicamente un polipeptido de tipo cadena pesada o ligera) no interfiera significativamente con la diferenciacion y/o maduracion normal de la celula y cuando sea aplicable, permita el emparejamiento de la cadena polipeptidica producida con su homologo.

De acuerdo con la invencion, en una realizacion, esto puede conseguirse proporcionando un acido nucleico util para la invencion, en el que dicho medio para sincronizar la expresion es un promotor en el que la actividad se limita esencialmente a la fase de desarrollo concreta. En un linfocito B en desarrollo, que, despues de la inmunizacion, madura y/o se diferencia, la expresion del gen de interes, cuando este es una de las cadenas polipeptidicas de una inmunoglobulina, no debe interferir (significativamente) con dicha maduracion y/o diferenciacion y requiere sincronizarse de tal manera que el polipeptido resultante pueda emparejarse con sus homologos. Por lo tanto la invencion puede usar un acido nucleico en el que dicha fase comienza en una fase inmediatamente anterior o coincidiendo con la aparicion de la expresion de moleculas de cadena ligera por dichas celulas en determinada fase de desarrollo en un linfocito B maduro.

Lo anterior puede conseguirse seleccionando un promotor que sea activo solo durante dicho periodo adecuado. Dicho promotor puede ser un promotor CD 19, el promotor Ig-α, el promotor Ig-β, el promotor μhc (todos los genes), el promotor Vκ o analogos u homologos de los mismos.

En una realizacion especifica de la presente invencion, el promotor como se desvela anteriormente no dirige directamente la expresion del gen de interes. En cambio, dirige la expresion de un gen cuyo producto activa en trans la expresion del gen de interes. Dicho gen activador puede ser un gen que codifique una proteina denominada Cre recombinasa o similar a Cre. El casete de expresion para el gen de interes puede proporcionarse, por ejemplo, con una secuencia que inhiba la expresion del gen de interes. Dicha secuencia puede eliminarse por la accion de la Cre recombinasa, que esta bajo el control del promotor deseado (activo durante la fase de desarrollo correcta). En este aspecto se requiere un conjunto de casetes de expresion.

Por lo tanto, en el contexto de la invencion puede utilizarse un conjunto de acidos nucleicos que sean casetes de expresion, en el que un acido nucleico comprende un casete de expresion que codifica una proteina similar a Cre bajo el control de un promotor activo durante la fase de desarrollo deseada de la celula huesped y el segundo acido nucleico comprende una secuencia que codifica una molecula proteica deseada bajo el control de un promotor constitutivo que puede activarse mediante la accion de una proteina similar a Cre. Dicha activacion se realiza preferentemente eliminando una secuencia de terminacion flanqueada por sitios loxP. El sistema Cre/lox se describe con detalle en Rajewsky y col. (1996) J. Clin. Invest. 98, pags. 600-603. Dichos sistemas se revisan en Wunderlich

F. T. (2004), quot;Generation of inducible Cre systems for conditional gene inactivation in micequot;, Inauguraldissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultat der Universitat zu K6ln; http://deposit.ddb.de/cgi-bin/dokserv?idn=97557230x&dok var=d1&dok ext=pdf&filename=9755723 0x.pd.

Adicionalmente, se describe un animal no humano transgenico al cual se ha proporcionado un casete de expresion como se ha descrito anteriormente, en el que la molecula proteica deseada es una cadena polipeptidica de una inmunoglobulina. Una cadena polipeptidica preferida es una cadena ligera. Un polipeptido mas preferido es una cadena ligera de la linea germinal o similar a la linea germinal. Un polipeptido mas preferido es 012, preferentemente la cadena ligera kappa de la linea germinal reordenada IGKV1-39*01/IGKJ1*01 (nomenclatura de acuerdo con la base de datos de IMGT, http://www.imgt.org).

Adicionalmente, se prefiere que la cadena polipeptidica se vuelva esencialmente incapaz de reordenamiento y/o de excluir cualquier modificacion de secuencia de tal modo que opere normalmente en la Ig durante el proceso de

6 5

maduracion por afinidad de linfocitos B. Por lo tanto, se describe un animal no humano transgenico al cual se le ha proporcionado un casete de expresion, como se ha descrito anteriormente, en el que dicho reordenamiento y/o modificaciones de secuencia se impiden por la ausencia de elementos al menos parcialmente responsables de hipermutacion somatica, tal como, por ejemplo, el potenciador MoEki.

Un casete de expresion preferido comprende medios para impedir el silenciamiento. Dichos medios para impedir el silenciamiento son medios de insercion en un locus en el genoma de la celula huesped que es resistente al silenciamiento. Dichos medios de insercion son preferentemente medios de recombinacion homologa en dicho sitio resistente al silenciamiento. Un locus preferido cuando el mamifero murino es un raton es el locus rosa.

Un casete de expresion preferido adicional util para la invencion comprende, en direccion 5'-3': un promotor Vκ, un lider de raton, un gen V humano, opcionalmente un potenciador MoEκi, una region constante (Cκ) de rata y opcionalmente un potenciador MoEx3' (truncado).

Incluso otro casete de expresion adicional preferido util para la invencion comprende, en direccion 5'-3': un promotor Vκ, un lider de ser humano, un gen V humano, opcionalmente un potenciador MoEκi, una region constante (Cκ) de rata y opcionalmente un potenciador MoEx3' (truncado).

Por supuesto, el objetivo final del raton transgenico de la invencion, es que el mamifero produzca los anticuerpos a usar en agentes terapeuticos humanos. Por lo tanto la invencion proporciona un procedimiento para producir un anticuerpo deseado que comprende exponer a un antigeno un mamifero murino de acuerdo con la invencion de tal manera que se induzca una respuesta de anticuerpo y aislar los anticuerpos especificos para el antigeno.

En una realizacion alternativa, la invencion proporciona un procedimiento para producir un anticuerpo deseado que comprende exponer a un antigeno un mamifero murino de acuerdo con la invencion de tal manera que se induzca una respuesta de anticuerpo y aislar las celulas que producen dichos anticuerpos, cultivar y opcionalmente inmortalizar dichas celulas y recoger dichos anticuerpos.

En una realizacion adicional, la invencion proporciona un procedimiento para producir un anticuerpo deseado que comprende exponer a un antigeno un mamifero murino de acuerdo con la invencion de tal manera que se induzca una respuesta de anticuerpo y aislar un acido nucleico que codifique al menos parte de dicho anticuerpo, insertar dicho acido nucleico o una copia o un derivado del mismo en un casete de expresion y expresar dicho anticuerpo en una celula huesped.

Un experto en la tecnica conoce procedimientos para producir anticuerpos de ratones transgenicos. Particularmente preferidos son los procedimientos para la produccion de mezclas de anticuerpos procedentes de una celula, mediante los cuales, los acidos nucleicos que codifican estos anticuerpos han derivado de ratones de acuerdo con la invencion.

En los documentos W004106375 yW005068622 se desvelan estos denominados oligoclonicos.

La presente invencion proporciona animales murinos transgenicos, preferentemente ratones, capaces de generar anticuerpos hibridos raton-ser humano de alta afinidad y especificidad con regiones variables de cadena ligera (VL) de inmunoglobulina humana en o casi configuracion de la linea germinal y preferentemente regiones variables de cadena pesada (VH) de inmunoglobulina murina que pueden tener mutaciones somaticas acumuladas durante el proceso de maduracion de afinidad conducida por antigenos. Se contempla que las regiones VH murinas de los anticuerpos hibridos puedan someterse a procedimientos de humanizacion para producir mAb que tengan inmunogenicidad reducida cuando se aplica en seres humanos basados en regiones VL casi de la linea germinal o de la linea germinal y regiones VH murinas que se han humanizado.

En particular, en la presente invencion se ha observado que ratones transgenicos que llevan una construccion de expresion de ADN que codifica una region VL humana reordenada bajo el control de elementos geneticos que actuan en cis que proporcionan expresion sincronizada y regulada del transgen en una proporcion significativa de linfocitos B durante el desarrollo de linfocitos B, aun carente de elementos que dirigen la maquinaria de hipermutacion somatica en el transgen, son capaces de generar anticuerpos hibridos raton-ser humano de alta afinidad y especificos con cadenas L esencialmente no mutadas. Esto muestra que el transgen humano reordenado es capaz de emparejarse con una diversidad de cadenas H de inmunoglobulina murina endogena para formar inmunoglobulinas hibridas raton-ser humano expresadas sobre la superficie de linfocitos B y facilitar cumplidamente el desarrollo de linfocitos B murinos para obtener un compartimento de linfocitos B periferico diverso y cuantioso.

En una realizacion preferida, la construccion de la expresion transgenica lleva las secuencias codificantes de una region V de cadena L reordenada humana bajo el control de un promotor VL humano para dirigir la expresion especifica de linfocitos B. Ademas, la construccion lleva la secuencia potenciadora 3' Ck murina para especificidad de linfocitos B y nivel de expresion inducible y elevado del transgen. Ademas, la construccion se disefa de manera que carece de elementos reguladores que facilitan el reclutamiento de la maquinaria de hipermutacion somatica al transgen, tales como el potenciador intronico y el potenciador C-kappa 3'.

En una realizacion relacionada, el gen VL humano reordenado se inserta en el locus Rosa26 murino por integracion

7 5

especifica de sitio. El locus Rosa26 es util en el contexto de la estrategia de quot;transgenesis dianaquot; para la generacion eficaz de organismos transgenicos (tales como ratones) con un modelo de expresion transgenico predecible.

En una realizacion preferida, la region VL humana reordenada se selecciona por su capacidad para emparejarse con muchos genes VH murinos diferentes para garantizar la generacion de una poblacion de linfocitos B con un repertorio de genes VH diverso. Un procedimiento para obtener dichas regiones VL comprende amplificar un repertorio de genes VH reordenados a partir de los linfocitos B de ratones y un repertorio de regiones VL humanas de la linea germinal reordenada a partir de los linfocitos B de seres humanos y clonarlos en vectores de presentacion de fagemidos para preparar diversas bibliotecas de inmunoglobulinas hibridas en bacterias. Mediante analisis de secuencias de nucleotidos de colecciones de pares VH/VL seleccionados y no seleccionados por antigeno, se identifican genes VL de la linea germinal humana que se emparejan con muchos genes VH murinos diferentes. Se describe una coleccion de genes VL de la linea germinal humana con esta capacidad.

Se muestra que, despues de la inmunizacion con el antigeno, los linfocitos B son capaces de generar una respuesta inmunitaria, conduciendo a la generacion de linfocitos B que segregan anticuerpos hibridos con alta especifidad y afinidad. Las regiones V que codifican estos anticuerpos se caracterizan por la cadena ligera transgenica humana que no lleva, o lleva muy pocas, mutaciones y una cadena pesada murina que lleva un numero variable de mutaciones introducidas por la maquinaria de hipermutacion somatica.

Se contemplan estrategias para obtener anticuerpos monoclonales hibridos de alta afinidad a partir de los ratones transgenicos por tecnologias de hibridoma y de presentacion, asi como por procedimientos para humanizar las regiones VH murinas para obtener anticuerpos menos inmunogenicos para aplicacion en seres humanos.

La invencion incluye el uso de una construccion transgenica de cadena L de inmunoglobulina que comprende secuencias de ADN que codifican una region VL de inmunoglobulina humana en combinacion con una region constante de cadena ligera (CL) de una proteina de inmunoglobulina murina, cuyas secuencias estan unidas operativamente a secuencias reguladoras transcripcionales que, cuando se integran en un mamifero murino transgenico, producen un polipeptido VL-CL de Ig con una region VL humana que no esta sometida o lo esta marginalmente a hipermutacion somatica. La VL de Ig es capaz de emparejarse con polipeptidos VH-CH reordenados que se generan durante el desarrollo de linfocitos B en el mamifero murino transgenico, conservando dichos polipeptidos VH-CH la capacidad de experimentar hipermutacion somatica despues de estimulacion. La region CL puede ser de cualquier especie murina y es generalmente capaz de emparejarse con las regiones CH del mamifero transgenico murino.

La invencion tambien incluye el uso de una construccion transgenica, como se ha indicado anteriormente, en la produccion de un mamifero murino transgenico capaz de la produccion de anticuerpos hibridos que constan de polipeptidos VL-CL y polipeptidos VH-CH en los que la region VL es de origen humano y la region CL es de origen murino. La VH y la CH puede ser de cualquier especie murina, o puede ser de ser humano. Despues de la humanizacion, estos mamiferos murinos transgenicos son capaces de generar anticuerpos de alta afinidad codificados por genes VH somaticamente hipermutados y genes VL esencialmente no mutados codificados por el transgen.

En otro aspecto, se describe un proceso para la produccion de un mamifero murino transgenico de la invencion, que puede producir anticuerpos hibridos en respuesta a exposicion antigenica, que comprende alterar funcionalmente el locus endogeno de la cadena ligera de inmunoglobulina e insertar en dicho genoma mamifero una construccion transgenica como se describe.

Se describe el uso de mamiferos murinos que pueden obtenerse mediante este proceso en la produccion de linfocitos B que producen inmunoglobulina que tiene cadena ligera VL humana. En otro aspecto, se describe un proceso para la produccion de linfocitos B que producen inmunoglobulina que tiene VL humana y que se unen a un antigeno seleccionado, que comprende exponer un animal que puede obtenerse mediante un proceso como se ha indicado anteriormente con dicho antigeno y explorar los linfocitos B de dicho animal que se unen a dicho antigeno. La descripcion contempla adicionalmente linfocitos B que pueden obtenerse mediante este proceso e hibridomas que pueden obtenerse inmortalizando dichos linfocitos B, por ejemplo, hibridomas obtenidos fusionando linfocitos B, como se ha indicado anteriormente, con celulas de mieloma. La descripcion tambien contempla un proceso para producir anticuerpos monoclonales que comprende cultivar dicho hibridoma. En otro aspecto adicional, se describe el uso de los linfocitos B anteriores en la produccion de un hibridoma o anticuerpo monoclonal correspondiente.

0tro aspecto adicional es un proceso para la produccion de inmunoglobulina que tiene cadenas VL humanas y que se une a un antigeno seleccionado, que comprende exponer un animal, que puede obtenerse como se ha indicado anteriormente, a dicho antigeno y obtener inmunoglobulina del mismo.

8 5

En una estrategia, como una etapa individual, en la linea germinal de raton se introduce una region VL reordenada codificada por segmentos genicos V y J de la linea germinal humana y una region constante de cadena ligera murina. El ADN transgenico puede introducirse en el pronucleo de oocitos fertilizados o celulas madre embrionarias. La integracion puede ser al azar u homologa dependiendo de la estrategia particular a emplear. Por ejemplo, el transgen VL puede introducirse por insercion al azar, dando como resultado ratones que llevan una o multiples copias del transgen en el genoma. Como alternativa, el transgen VL humano puede dirigirse a un locus genomico especifico usando recombinacion especifica de sitio como se describe en la tecnica.

En una realizacion preferida, el transgen VL se dirige al locus murino R0SA26 que es un sitio de integracion adecuado que muestra una fuerte y predecible expresion de los transgenes insertados (documento EP 1439234). El vector diana permite la insercion de una sola copia de un casete de expresion genico, impidiendo asi la modulacion de la expresion del transgen por la disposicion de copias multiples. Seleccionando el locus Rosa26 autosomico como sitio de insercion, el patron de expresion del transgen insertado en el animal no humano es predecible. Ademas, se impide la inactivacion y/o modulacion del cromosoma X al azar por efectos de posicion cromosomica. Esto tambien elimina la necesidad de generar y analizar cepas transgenicas multiples para cualquier transgen determinado. Finalmente, el vector diana Rosa26 puede usarse para la integracion especifica de sitio para casetes de expresion genica multiples. Por tanto, puede contemplarse que 2 o mas regiones VL humanas diferentes de la linea germinal reordenadas se inserten en el locus Rosa26 para aumentar adicionalmente la diversidad del repertorio de anticuerpos hibridos humanos.

Una region VL humana reordenada puede dirigirse al locus murino de cadena ligera lambda o kappa de Ig para inactivar funcionalmente el locus endogeno o pueden cruzarse ratones que contengan la region VL humana reordenada con ratones que carezcan de locus Ig lambda o kappa funcionales o ambos. Por tanto, usando transformacion, usando etapas repetitivas o en combinacion con reproduccion, pueden obtenerse mamiferos murinos transgenicos que sean capaces de producir anticuerpos que lleven el transgen VL humano en ausencia sustancial de cadenas ligeras de inmunoglobulina de huesped endogeno.

En una realizacion, se selecciona un transgen VL humano por su capacidad para emparejarse con una parte sustancial de regiones VH murinas para formar un repertorio diverso de anticuerpos hibridos raton-ser humano funcionales expresados sobre la superficie de linfocitos B. Una parte sustancial de regiones VH murinas significa que la VL humana se empareja con al menos el 0,1 % de las regiones VH murinas generadas durante el desarrollo de linfocitos B, mas preferentemente con al menos el 1 % y mas preferentemente con al menos el 10 %. Como procedimientos para identificar genes VL humanos con esta caracteristica se incluyen, el emparejamiento al azar de un repertorio de regiones VL humanas con un repertorio de regiones VH murinas, la co-expresion de regiones VH y VL en vectores de expresion eucariotas o procariotas adecuados y la exploracion de regiones VL humanas que se emparejan con una parte sustancial de regiones VH murinas. Pueden usarse vectores fagemidos para dirigir la expresion de fragmentos de anticuerpo raton-ser humano en celulas bacterianas o en la superficie de fagos filamentosos y analisis de capacidad de union de fragmentos de anticuerpo mediante procedimientos conocidos en la tecnica.

En otra realizacion, se selecciona un transgen VL humano por su capacidad para emparejarse con una parte sustancial de regiones VH humanas para formar un repertorio diverso de anticuerpos humanos expresados sobre la superficie de linfocitos B. Una parte sustancial de regiones VH humanas se refiere a que la VL humana se empareja con al menos el 0,1 % de las regiones VH humanas generadas durante el desarrollo de linfocitos B, mas preferentemente con al menos el 1 % y mas preferentemente con al menos el 10 %.

En la ultima realizacion, los ratones transgenicos VL humanos se cruzan con ratones que llevan locus funcionales de inmunoglobulina de cadena H humana no reordenada o reordenada y locus endogenos de Ig de cadena H inactivados funcionalmente como se describe en la tecnica. La inactivacion funcional de las dos copias de cada uno de los tres locus de Ig huesped (cadena pesada, cadena ligera kappa y lambda), en la que el huesped contiene la IgH humana y el transgen VL humano reordenado permitiria la produccion de moleculas de anticuerpo puramente humanas sin la produccion de anticuerpos huesped o quimericos humanos huesped. Dicha cepa huesped, por inmunizacion con antigenos especificos, responderia a la produccion de linfocitos B de raton productores de anticuerpos humanos especificos, cuyos linfocitos B se fusionan posteriormente con celulas de mieloma de raton o se inmortalizan de cualquier otra manera para la produccion estable continua de anticuerpos monoclonales humanos. Como alternativa, dicha poblacion de linfocitos B se usa como una fuente de regiones VH que puede obtenerse mediante la construccion de bibliotecas de ADNc o por amplificacion mediante PCR usando cebadores para regiones VH humanas como se conoce en la tecnica.

Un gen VL reordenado humano se reconstruye en un microorganismo eucariota o procariota apropiado y los fragmentos de ADN resultantes pueden introducirse en pronucleos de oocitos de raton fertilizados o en celulas madre embrionarias. En la tecnica se han descrito diversas construcciones que dirigen la expresion directa, especifica de linfocitos B, de transgenes VL y tienen el siguiente formato general: una secuencia lider y secuencias relevantes cadena arriba para dirigir la expresion especifica de linfocitos B del transgen, una secuencia codificante de un transgen VL humano, una secuencia potenciadora que dirige la expresion a alto nivel y especifica de linfocitos B del transgen y un gen murino de region constante. En un formato preferido, el potenciador es el potenciador Ckappa 3' porque dirige la expresion a alto nivel en linfocitos de linaje B, pero no recluta hipermutacion somatica

9 5

cuando se usa en construcciones transgenicas.

Los mamiferos murinos, preferentemente ratones, que comprenden una o multiples copias del transgen en el genoma, se aislan y analizan con respecto a la expresion estable. Se seleccionan mamiferos murinos que muestran expresion estable del transgen durante periodos de tiempo mas largos, preferentemente en linfocitos B. Si se requiere, se cruzan diferentes lineas de mamiferos murinos que comprenden inserciones independientes de una o multiples copias del transgen, preferentemente en diferentes cromosomas, para obtener mamiferos murinos con diferentes inserciones de una o multiples copias del transgen para aumentar la expresion del transgen en mamiferos murinos, preferentemente en linfocitos B.

Adicionalmente se describe la progenie de un mamifero murino transgenico de acuerdo con la invencion, comprendiendo la progenie, al menos en su linaje de linfocitos B, una secuencia codificante de cadena pesada o ligera junto con un medio que hace que la secuencia sea resistente a reordenamientos de ADN y/o hipermutaciones somaticas.

Adicionalmente se describe la progenie de un mamifero murino transgenico de acuerdo con la invencion, comprendiendo la progenie un casete de expresion para la expresion de una molecula proteica deseada en celulas durante una determinada fase del desarrollo en celulas que se desarrollan en linfocitos B maduros.

Adicionalmente se describe una celula que se aisla de un mamifero murino transgenico de acuerdo con la invencion, comprendiendo la celula una secuencia codificante de cadena ligera o pesada junto con un medio que hace que la secuencia sea resistente a reordenamientos de ADN y/o hipermutaciones somaticas. Adicionalmente se describe una celula que esta aislada de un mamifero murino transgenico de acuerdo con la presente invencion, comprendiendo la celula un casete de expresion para la expresion de una molecula proteica deseada en celulas durante una determinada fase del desarrollo en celulas que se desarrollan en linfocitos B maduros. Puede usarse, una celula, como se describe, preferentemente un linfocito B productor de anticuerpos o una celula que sea capaz de diferenciarse o madurar en un linfocito B productor de anticuerpos, para la produccion in vitro de anticuerpos, como conoce un experto habitual en la tecnica, por ejemplo, a partir de documento de Gascan y col. 1991. J. Exp. Med. 173: 747-750. En la tecnica se conocen procedimientos para la inmortalizacion de una celula e incluyen la generacion de hibridomas, por ejemplo, por fusion con una celula de mieloma, transformacion con el virus de Epstein Barr; expresion del transductor de sefal de la activacion y transcripcion (STAT), activacion mediante CD40 y sefalizacion de receptores de IL4, y/o expresion de Bcl6 (Shvarts y col. 2002. Genes Dev 16: 681-686).

En una etapa separada, los locus endogenos de cadena ligera Kappa y Lambda se vuelven esencialmente no funcionales de tal manera que al menos la mayoria de los linfocitos B en los ratones transgenicos llevan receptores de Ig que contienen la region VL humana transgenica. La inactivacion de los locus de inmunoglobulina de raton endogena se realiza por alteracion diana de locus apropiados por recombinacion homologa en celulas madre embrionarias de raton. Dicha alteracion diana comprende la alteracion de la secuencia genomica de tal manera que se produce una cadena ligera Kappa y/o Lambda de inmunoglobulina de raton endogena sustancialmente no funcional. La expresion quot;inmunoglobulina de raton endogena sustancialmente no funcionalquot; indica que los locus endogenos de cadena ligera Kappa y/o Lambda se silencian funcionalmente de tal manera que el nivel de expresion de proteina funcional de los locus endogenos de cadena ligera Kappa y/o Lambda, preferentemente el locus endogeno de cadena ligera Kappa, se reduce a aproximadamente un 20 % del nivel de expresion en un raton de referencia, mas preferentemente se reduce a aproximadamente un 10 %, mas preferentemente a aproximadamente un 5 %, mas preferentemente a aproximadamente un 2 % y mas preferentemente a aproximadamente un 1 %. El nivel de expresion de proteina funcional de los locus endogenos de cadena ligera Kappa y/o Lambda puede reducirse al 0 %. El nivel de expresion de proteina funcional puede determinarse por medios conocidos por un experto en la tecnica, incluyendo transferencia de western y emparejamiento con una cadena pesada de raton. Dicho raton de referencia es un raton en el que los locus endogenos de cadena ligera Kappa y/o Lambda no estan alterados. Dicha alteracion comprende mutacion y/o delecion de secuencias genicas que son necesarias para la expresion funcional de genes de inmunoglobulina endogenos. Como alternativa, dicha alteracion comprende la insercion de un acido nucleico en los locus endogenos de cadena ligera Kappa y/o Lambda de inmunoglobulina de raton de tal manera que se reduce la expresion funcional de los genes de inmunoglobulina endogenos. Dicho acido nucleico puede comprender un elemento silenciador dando como resultado el silenciamiento transcripcional del gen de inmunoglobulina endogeno. Ademas, dicho acido nucleico puede comprender una secuencia que altere el corte y empalme y/o la traduccion del gen de inmunoglobulina endogeno, por ejemplo, introduciendo un exon que de lugar a un desplazamiento de fase de lectura en la secuencia codificante, o que comprenda un codon de terminacion prematuro. En cada caso se generan ratones quimericos que derivan en parte de las celulas madre embrionarias modificadas y que son capaces de transmitir las modificaciones geneticas a traves de la linea germinal. El apareamiento de cepas de raton con locus de inmunoglobulina humana con cepas con locus de raton inactivados conduce a animales que producen anticuerpos que comprenden cadenas ligeras esencialmente solo humanas.

Por medios conocidos en la tecnica se prepara una construccion para recombinacion homologa y se elimina cualquiera de las secuencias no deseables, por ejemplo, las secuencias procariotas. Puede emplearse cualquier tecnica conveniente para introducir una construccion para recombinacion homologa en una celula diana. Estas tecnicas incluyen fusion de esferoplastos, lipofeccion, electroporacion, transferencia de ADN mediada con fosfato calcico, o microinyeccion directa. Despues de la transformacion o transfeccion de las celulas diana, estas se

10 5

seleccionan mediante marcadores positivos y/o negativos, por ejemplo, por resistencia a neomicina y/o resistencia a aciclovir y/o a ganciclovir. Estas celulas, que muestran el fenotipo deseado, pueden despues analizarse posteriormente por analisis de restriccion, electroforesis, analisis de Southern, PCR o similar. Identificando fragmentos que muestren la presencia de lesion (o lesiones) en el locus diana, se identifican celulas en las que se ha producido recombinacion homologa para inactivar una copia del locus diana.

Adicionalmente, se muestra que, despues de la inmunizacion en los ratones transgenicos mencionados anteriormente, las regiones VH humanas y murinas, pero no las regiones VL, son capaces de experimentar mutaciones somaticas para generar anticuerpos de alta afinidad. Ventajosamente, se preve que estos anticuerpos codificados por regiones VL de la linea germinal contribuyan a disminuir la inmunogenicidad cuando se apliquen en seres humanos y produzcan anticuerpos mas estables que sean menos propensos a la agregacion y por tanto mas seguros para su uso terapeutico en seres humanos.

Todos los mAb derivados de las celulas o de los mamiferos murinos transgenicos mencionados anteriormente comparten las mismas regiones VL humanas identicas. Se ha descrito que los mAb que comparten la misma region VL identica pueden co-expresarse en una sola celula clonal para la produccion de mezclas de anticuerpos recombinantes con sitios de union funcionales (veanse los documentos W004106375 y W005068622). Por tanto la invencion proporciona una plataforma para la generacion de mAb especificos y de alta afinidad que constituye la base para mezclas de mAb producidos por celulas clonales.

Se prefiere que los mAb derivados de las celulas o de los mamiferos murinos transgenicos mencionados anteriormente se dirijan contra dianas celulares. Las dianas preferidas son proteinas o moleculas de carbohidrato humanas solubles o expresadas en la superficie. Las dianas adicionalmente preferidas son proteinas o moleculas de carbohidrato expresadas en la superficie que se expresan sobre la superficie de bacterias, virus u otros patogenos, especialmente de seres humanos.

Mas especificamente, las dianas preferidas incluyen citocinas y quimiocinas, incluyendo, pero sin limitacion, interleucina 1beta (IL1beta), IL2, IL4, IL5, IL7, IL8, IL12, IL13, IL15, IL18, IL21, IL23 y quimiocinas tales como, por ejemplo, quimiocinas CXC, quimiocinas CC, quimiocinas C (o quimiocinas γ) tales como quimiocinas XCL1 (linfotactina-α) y XCL2 (linfotactina-β) y quimiocinas CX3C. Adicionalmente, como dianas preferidas se incluyen moleculas receptoras de las citocinas y quimiocinas, incluyendo receptores de citocina de tipo I tales como, por ejemplo, el receptor de IL-2, receptores de citocina de tipo II, tales como, por ejemplo, receptores de interferon, receptores de la superfamilia de inmunoglobulina (Ig), la familia de receptores del factor de necrosis tumoral, incluyendo receptores para CD40, CD27 y CD30, receptores de serina/treonina-proteina quinasa tales como receptores del TGF beta, receptores acoplados a proteina G, tales como CXCR1-CXCR7, y receptores de tirosina quinasa, tales como los miembros de la familia de receptores del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR), miembros de la familia de receptores del EGF, incluyendo erbB1 (EGF-R; HER1), erbB2, (HER2), erbB3 (HER3) y erbB4 (HER4), miembros de la familia de receptores de insulina, incluyendo IGF-R1 e IGF-RII, miembros de la familia de receptores del PDGF, miembros de la familia de receptores del factor de crecimiento de hepatocitos, incluyendo c-Met (HGF-R), miembros de la familia de receptores de Trk, miembros de la familia de receptores de AXL, miembros de la familia de receptores de LTK, miembros de la familia de receptores de TIE, miembros de la familia de receptores R0R, miembros de la familia de receptores DDR, miembros de la familia de receptores de KLG, miembros de la familia de receptores RYK, miembros de la familia de receptores de MuSK, y miembros de la familia de receptores del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR).

Las dianas adicionalmente preferidas son dianas que se sobreexpresan o se expresan selectivamente en tumores, tales como, por ejemplo, VEGF, CD20, CD38, CD33, CEA, EpCAM, PSMA, CD54, Lewis Y, CD52, CD40, CD22, CD51/CD61, CD74, MUC-1, CD38, CD19, CD262 (TRAIL-R2), RANKL, CTLA4 y CD30; dianas que estan implicadas en inflamacion cronica, tales como, por ejemplo, CD25, CD11a, TNF, CD4, CD80, CD23, CD3, CD14, IFNgamma, CD40L, CD50, CD 122, TGFbeta y TGFalfa.

Las proteinas o moleculas de carbohidrato expresadas en superficie preferidas que se expresan sobre la superficie de bacterias, virus y otros patogenos parasitos, especialmente de seres humanos, incluyen marcadores de superficie de virus de gripe la A y B tales como hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA), fliovirus tales como el virus del Ebola, de la rabia, sarampion, rubeola, paperas, flavivirus tales como los tipos 1-4 del virus del dengue, virus de la encefalitis transmitido por garrapatas, virus del Nilo occidental, virus de la encefalitis japonesa, y virus de la fiebre amarilla, Paramixovirus incluyendo Paramixovirus tales como virus paragripal 1, 3, Rubulavirus tales como virus de las paperas y paragripal 2, 4, Morbilivirus y Pneumovirus, tas como el virus respiratorio sincitial, virus de la vacuna, de la viruela pequefa, coronavirus, incluyendo el virus del Sindrome Respiratorio Agudo Grave (SARS), virus de la hepatitis A, B y C, virus de la inmunodeficiencia humana, herpesvirus, incluyendo citomegalovirus, virus de Epstein Barr, virus del herpes simple y virus de la varicela zoster, parvovirus, tal como, por ejemplo, B19; Legionella pneumophila; Listeria monocytogenes; Campylobacter jejuni; Staphylococcus aureus; E. coli 0157:H7 Borrelia burgdorferi; Helicobacter pylori; Ehrlichia chaffeensis; Clostridium difficile; Vibrio cholera; Salmonella enterica Serotipo Typhimurium; Bartonella henselae; Streptococcus pyogenes (estreptococo de Grupo A); Streptococcus agalactiae (estreptococo de Grupo B); S. aureus resistente a multiples farmacos (por ejemplo, MRSA); Chlamydia pneumoniae; Clostridium botulinum; Vibrio vulnificus; Parachlamydia pneumonia; Corynebacterium amycolatum; Klebsiella pneumonia; enterococos resistentes a Linezolid (E. faecalis y E. faecium); y Acinetobacter baumannii

resistente a multiples farmacos

Las dianas mas preferidas son IL-6 y su receptor, IL-6Ralfa, gp130 denominada glucoproteina, RSV, especialmente las proteinas de superficie F, G y SH y proteinas no estructurales tales como N y M, y tirosina quinasas receptoras en particular erbB1 (EGF-R; HER1), erbB2, (HER2), erbB3 (HER3), erbB4 (HER4), IGF-R1 y IGF-RII, c-Met (HGF

5 R).

Por lo tanto, la invencion proporciona una plataforma para la generacion de mAb especificos y de alta afinidad contra las dianas mencionadas anteriormente que constituyen la base para las mezcla de los mAb producidos por celulas clonales. Dichos mAb especificos y de alta afinidad pueden comprender mAb que se dirigen contra diferentes epitopes sobre al menos una de las dianas. En una realizacion adicional preferida, dichos mAb especificos y de alta

10 afinidad comprenden mAb que se dirigen contra diferentes dianas tales como, por ejemplo, uno o mas miembros de la familia de receptores de EGF incluyendo, erbB1 (EGF-R; HER1), erbB2, (HER2), erbB3 (HER3) y erbB4 (HER4).

Salvo que se defina en contra, los terminos cientificos y tecnicos utilizados en conexion con la presente invencion tendran los significados normalmente entendidos por los expertos habituales en la tecnica. Ademas, salvo que el contexto lo requiera de otra manera, los terminos en singular incluiran pluralidades y los terminos en plural incluiran 15 el singular. Generalmente, las nomenclaturas utilizadas en conexion con, y tecnicas de, cultivo de celulas y tejidos, biologia molecular y quimica de proteinas y oligo o polinucleotidos e hibridacion descritas en el presente documento son las bien conocidas y normalmente utilizadas en la tecnica. Se utilizan tecnicas convencionales para ADN recombinante, sintesis de oligonucleotidos y cultivo y transformacion de tejidos (por ejemplo, electroporacion, lipofeccion). Las reacciones enzimaticas y tecnicas de purificacion se realizan de acuerdo con las especificaciones 20 del fabricante o como normalmente se llevan a cabo en la tecnica o se describe en el presente documento. Las tecnicas y procedimientos anteriores se realizan generalmente de acuerdo con procedimientos convencionales bien conocidos en la tecnica y se describen en diversas referencias generales y mas especificas citadas y comentadas a lo largo de la presente memoria descriptiva. Vease, por ejemplo, Sambrook y col. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3a edicion, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001)). Las nomenclaturas

25 utilizadas en conexion con, y los procedimientos y tecnicas de laboratorio de, quimica analitica, quimica organica sintetica y quimica medicinal y farmaceutica descritos en el presente documento son los bien conocidos y normalmente utilizados en la tecnica. Para la sintesis quimica, analisis quimicos, preparaciones, formulaciones y administraciones farmaceuticas y tratamiento de pacientes se utilizan tecnicas convencionales.

Leyenda de las figuras

30 Figura 1 Mapa topologico de las localizaciones de hibridacion de cebadores de VH especificos de raton y la posicion de los sitios de restriccion requeridos que se introducen mediante secuencias salientes en el extremo 3' de los cebadores.

Figura 2 35 Etapas de amplificacion por PCR (amplificacion, productos intermedios e introduccion en sitio). La localizacion y nombres de los cebadores de amplificacion de VH de raton (y mezclas de cebadores) se indican por etapa.

Figura 3 Topologia del vector MV1043. Este vector se usa para la clonacion de fragmentos VH humanos o murinos. 012 (IGKV1-39) se indica como el gen de VL. Los productos de este vector en combinacion con fagos auxiliares en

40 celulas E. coli permiten la generacion de fagos que presentan fragmentos Fab en la superficie de las particulas de fago como un producto de fusion con la proteina g3 y presencia del vector en el fago como el contenido genetico (F1 0RI).

Figura 4 Topologia del locus Ckappa de raton cadena abajo de los segmentos J. Se indican ambos potenciadores y la 45 region Ckappa. La flecha inferior indica la region que se elimina para silenciar el locus.

Figura 5 Topologia del locus C-lambda de raton. Se indican las tres regiones V activa (V1, V2 y V3 de IgI) como los segmentos J (Igl-J1, Igl-J2, Igl-J3, Igl-J4 y el pseudo fragmento Igl-J3p) y regiones constantes (Igl-C1, Igl-C2, Igl-C3 y Igl-C4). Las regiones que se delecionan para silenciar el locus se indican por marcadores de delecion.

50 Estas deleciones incluyen todos los agentes V (1, 2 y 3) activos y el segmento intergenico entre V2 y V3.

Figura 6 Topologia de la construccion de IGKV1-39/J-Ck con un intron localizado en la fase de lectura abierta (0RF) lider.

Figura 7 Topologia de la construccion de IGLV2-14/J-Ck con un intron localizado en la fase de lectura abierta (0RF) lider.

55 Figura 8 Topologia de la construccion de VkP-IGKV1-39/J-Ck (VkP-012). El promotor se origina desde el gen IGKV1-39 y

12 5

se coloca directamente delante de los elementos requeridos para la transcripcion y traduccion eficaces. Las secuencias intergenicas (incluyendo los potenciadores) derivan de ratones y se obtienen a partir de clones BAC. La secuencia C-kappa codifica la region constante kappa de rata.

Figura 9 Topologia de la construccion de VkP-IGLV2-14/J-Ck (VkP-2a2). El promotor se origina del gen IGKV1-39 y se coloca directamente delante de los elementos requeridos para la transcripcion y traduccion eficaces. Las secuencias intergenicas (incluyendo los potenciadores) derivan de ratones y se obtienen a partir de clones BAC. La secuencia C-kappa codifica la region constante kappa de rata.

Figura 10 Topologia de la construccion de VkP-IGKV1-39/J-Ck-Δ1 (VkP-012-del1) es identica a VkP-IGKV1-39/J-Ck de la figura 9 excepto que la region potenciadora intronica se elimina.

Figura 11 La Topologia de la construccion de VkP-IGKV1-39/J-Ck-Δ2 VkP-012-del2) es identica a la de VkP-IGKV1-39/JCk-Δ1 de la figura 10 excepto que se deleciona una gran parte de la region intergenica entre el gen Ck y el potenciador 3'. Ademas, el potenciador 3' se reduce de tamafo de 809 pb a 125 pb.

Figura 12 Vision general de las secuencias utilizadas o las que se hace referencia en la presente solicitud

Figura 13 Generacion del alelo Rosa26-IgVk1-39 KI. (A) Dibujo esquematico del vector diana pCAGGS-IgVK1-39. (B) Secuencia de nucleotidos del vector diana pCAGGS-IgVK1-39. (C) Estrategia diana.

Figura 14

(A): Analisis de transferencia de southern de ADN genomico de clones ES que comprende una insercion del vector diana pCAGGS-IgVK1-39. El ADN genomico de 4 clones independientes se sometio a digestion con AseI y se exploro con 5e1 indicando el limite en 5' del vector diana. Todos los clones comprenden una insercion correcta del vector diana en el extremo 5'.

(B): Analisis de transferencia de southern de ADN genomico de clones ES que comprende una insercion del vector diana pCAGGS-IgVK1-39. El ADN genomico de 4 clones independientes se sometio a digestion con MscI y se exploro con 3e1 indicando el limite en 3' del vector diana. Todos los clones comprenden una insercion correcta del vector diana en el extremo 3'.

(C): Analisis de transferencia de southern de ADN genomico de clones ES que comprende una insercion del vector diana pCAGGS-IgVK1-39. El ADN genomico de 4 clones independientes se sometio a digestion con BamHI y se exploro con una sonda Neo interna indicando el limite en 5' del vector diana. Todos los clones comprenden una sola insercion correcta del vector diana.

Figura 15 Generacion del alelo Rosa26-IgVl2-14 KI. (A) Dibujo esquematico del vector diana pCAGGS-IgVL2-14. (B) Secuencia de nucleotidos del vector diana pCAGGS-IgVL2-14 que contiene el inserto de expresion CAGGS basado en la region lambda IGLV2-14/J V de la linea germinal reordenada (IGLV2-14/J-Ck). (C) Estrategia diana.

Figura 16 Perfil Epibase® de los restos 1-107 de IGKV1-39. La subfigura A representa el tramo de union para alotipos DRB1, mientras que C presenta el tramo de union para los alotipos DRB3/4/5, DQ y DP. Los valores en la figura representan constantes de disociacion (Kd) y se representan graficamente en una escala logaritmica en el intervalo 0,01 μM - 0,1 μM (los aglutinantes muy fuertes pueden haberse salido fuera de la grafica). Para peptidos de union media, solo se proporcionan valores cualitativos y los aglutinantes debiles y no aglutinantes no se muestran. Los valores se representan graficamente en el primer resto del peptido en la secuencia diana (el propio peptido se extiende por otros 9 restos). Cabe destacar que, solo se muestra el receptor de union mas fuerte de cada peptido: en esta grafica no se observan alotipos de reaccion cruzada con afinidad mas baja. El receptor de union mas fuerte se indica por su nombre serotipico. Finalmente, en el mapa epitopico, cualquiera de los peptidos filtrados por linea germinal se representa graficamente con un color mas ligero (en este caso, no se encontraron no-auto-epitopes). La subfigura B muestra la promiscuidad de union a HLA para cada peptido decamerico (eje Y: numero de alotipos HLA que reconocen epitopes criticos en cada uno de los peptidos comenzando en el resto indicado mostrado en el eje X). La promiscuidad se mide como el numero de alotipos del total de 47 para el que el peptido es aglutinante critico. Las columnas en blanco se refieren a auto-peptidos, y las columnas en negro (ausentes aqui), a no- auto-peptidos.

Figura 17 Mapa epitopico de IGKV1-39 mostrando la presencia de aglutinantes peptidicos predichos en la secuencia de IGKV1-39 por serotipo en el formato 15-mer. Cada 15-mer se numera como se indica en la parte superior de la

13 5

figura. La secuencia completa de 15-mer correspondiente se indica en la Tabla 7. Las cajas en negrita indican la presencia de uno o mas auto-epitopes criticos en el 15-mer para el serotipo indicado a la izquierda. Se definen epitopes criticos desde el punto de vista operativo como aglutinantes DRB1 fuertes o medios y aglutinantes DRB3/4/5 o DP o DQ fuertes.

Figura 18 Desactivacion (knock-out, K0) constitutiva del locus kappa de Ig. (A) Estrategia diana. (B) Dibujo esquematico del vector diana pIgKappa

Figura 19 K0 constitutiva del locus lambda de Ig. (A) Primera etapa de la estrategia diana. (B) Segunda etapa de la estrategia diana.

Figura 20 Dibujo esquematico de vectores diana. (A) pVkP-012 (VkP-IGKV1-39/J-Ck); (B) pVkP-012-del1 (VkP-IGKV139/JCk-Δ1); (C) pVkP-012-del2 (VkP-IGKV1-39/J-Ck-Δ2).

Figura 21 Estrategias diana para la insercion de transgenes en el locus Rosa26 por transgenesis diana usando RMCE. (A) VkP-012 (VkP-IGKV1-39/J-Ck); (B) VkP-012-dell (VkP-IGKV1-39/J-Ck-Δ1); (C) VkP-012-del2 (VkP-IGKV139/JCk-Δ2).

Figura 22 Topologia del vector MV1057. Reemplazando el fragmento de relleno indicado con un fragmento VH se produce un vector de expresion que puede transfectarse a celulas eucariotas para la produccion de anticuerpos IgG1 con cadenas ligeras que contienen un gen VL 012 (IGKV1-39).

Figura 23 Ausencia de expresion de cadena ligera Vk1 humana transgenica en poblaciones de linfocitos no T de bazo.

Figura 24 La cadena ligera Vk1 humana transgenica se expresa en todas las poblaciones de linfocitos B de bazo.

Figura 25 La cadena ligera Vk1 humana transgenica se expresa en linfocitos B1 de la cavidad peritoneal.

Figura 26 La cadena ligera Vk1 humana transgenica no se expresa en linfocitos pro- y pre- B sino en los linfocitos B de poblaciones inmaduras y recirculantes en la medula osea. (A) Compuerta de celulas de medula osea. (B) Histogramas de expresion transgenica con solapamiento de un control de TS (Tipo Silvestre).

Figura 27 La cadena ligera Vk1 humana transgenica se correlaciona directamente con la cadena ligera endogena y la expresion de IgM en linfocitos B circulantes en la sangre.

Ejemplos.

Ejemplo 1

Clones del gen V de cadena ligera humana

Este ejemplo describe el razonamiento detras de la eleccion de dos genes V de cadena ligera humana, un gen de tipo kappa y un gen de tipo lambda, que se usan como prueba de hipotesis para ratones transgenicos que expresan cadenas ligeras. De Wildt y col. 1999 (de Wildt y col. (1999) J. Mol. Biol. 285(3): 895) analizaron la expresion de cadenas ligeras humanas en linfocitos B positivos a IgG perifericos. Basandose en estos datos, se seleccionaron IGKV1-39 (012) y IGLV2-14 (2a2) como cadenas ligeras ya que estaban bien representadas en el repertorio de linfocitos B. La secuencia de segmento J de las cadenas ligeras se ha seleccionado basandose en secuencias como se presentan en GenBank ABA26122 para IGKV1-39 (Rabquer, B.J., Smithson, S.L., Shriner, A.K. y Westerink, M.A.J.) y en GenBank AAF20450 para IGLV2-14 (Ignatovich, 0., Tomlinson, I.M., Popov, A.V., Bruggemann, M. y Winter, G. J. Mol. Biol. 294 (2), 457-465 (1999)).

Todos los segmentos armazon se convierten en secuencias de aminoacidos de la linea germinal para proporcionar la inmunogenicidad mas baja posible en posibles aplicaciones clinicas.

Ejemplo 2

0btencion de genes V de cadena pesada de raton que se emparejan con el segmento genicos IGKV1-39 humano para formar sitios de union a anticuerpo funcionales.

14 5

Este ejemplo describe la identificacion de genes V de cadena pesada de raton que son capaces de emparejarse con una sola region IGKV1-39/J de la linea germinal humana reordenada. Un repertorio VH de bazo de ratones que se inmunizaron con el toxoide tetanico se clono en un vector Fab de presentacion de fagos con una sola cadena ligera kappa IGKV1-39-C humana y se sometio a seleccion contra el toxoide tetanico. Los clones obtenidos despues de una sola ronda de seleccion se analizaron con respecto a su especifidad de union. Los genes VH murinos que codifican fragmentos Fab especificos del toxoide tetanico se sometieron a analisis de secuencia para identificar clones unicos y asignar la utilizacion de VH, DH y JH.

Muchos de los protocolos descritos en el presente documento son protocolos convencionales para la construccion de bibliotecas de presentacion de fagos y la seleccion de fagos para la union a un antigeno de interes y se describen en Antibody Phage Display: Methods and Protocols (editor(s): Philippa M. 0'Brien, Robert Aitken).

Inmunizaciones

Ratones BALB/c recibieron una inmunizacion con el toxoide tetanico y volvieron a vacunarse 6 semanas despues con el toxoide tetanico.

Aislamiento de esplenocitos

Preparacion de suspension de celulas de bazo. Despues de realizar la diseccion, el bazo se lavo con PBS y se transfirio a una placa de Petri de 60 mm con PBS 20 ml. Se utilizo una jeringa protegida con PBS 25 ml y una aguja G20 para lavar el bazo repetidamente. Despues de lavar las celulas abundantemente con PBS, las celulas se llevaron cuidadosamente en suspension usando PBS 20 ml y se dejaron en una bancada durante 5 minutos para separar los esplenocitos de los restos y agregados celulares. La suspension de esplenocitos se transfirio a la parte superior de un tubo cargado con Ficoll-Paque™ PLUS y se proceso de acuerdo con los procedimientos del fabricante para el aislamiento de linfocitos (Amersham Biosciences).

Aislamiento de ARN y sintesis de ADNc

Despues del aislamiento y sedimentacion de linfocitos, las celulas se suspendieron en Reactivo TRIzol LS (Invitrogen) para el aislamiento de ARN total de acuerdo con el protocolo adjunto del fabricante y se sometieron a reaccion de transcripcion inversa usando 1 microgramo de ARN, Superscript III RT en combinacion con dT20 de acuerdo con los procedimientos del fabricante (Invitrogen).

Amplificacion de ADNc por PCR

El ADNc se amplifico en una reaccion PCR usando combinaciones de cebadores que permiten la amplificacion de aproximadamente 110 genes V murinos diferentes que pertenecen a 15 familias VH (tabla 1; RefSec NG 005838; Thiebe y col., 1999. European Journal of Immunology 29: 2072 - 2081). En la primera ronda, se usaron las combinaciones de cebadores que se unian al extremo 5' de los genes V y al extremo 3' de las regiones J. En la segunda ronda, los productos de la PCR que se generaron con el cebador MJHRev2 se amplificaron para introducir modificaciones en la region 3' para permitir la clonacion eficaz de los productos. En la ultima ronda de amplificacion, se amplificaron todos los productos de la PCR usando cebadores que introducian un sitio de restriccion SfiI en el extremo 5' y un sitio de restriccion BstEII en el extremo 3' (veanse las figuras 1 y 2, y la tabla 1).

Condiciones de reaccion para la 1a ronda de PCR: 4 reacciones diferentes combinando los 25 cebadores directos (MVH1 a MVH25, tabla 1 y figura 2) y 1 cebador inverso por reaccion (MJH-Rev1, MJH-Rev2, MJH-Rev3 o MJH-Rev4; vease tabla 1 y figura 2). Volumenes PCR de 50 microlitros estaban compuestos por 2 microlitros de ADNc (de reacciones RT), 10 microlitros de tampon 5* Phusion polymerase HF, 40 nM de cada uno de los 25 cebadores directos (concentracion total de 1 micromolar), cebador inverso 1 micromolar, 1 microlitro de reserva dNTP 10 mM, polimerasa Phusion 1,25 unidades y agua MQ esteril. El programa del termociclador consistio en un programa de toma de contacto: 1 ciclo a 98 DC durante 30 segundos, 30 ciclos a 98 DC durante 10 segundos, 58 DC disminuyendo 0,2 DC por ciclo 10 segundos, 72 DC 20 segundos y 1 ciclo a 72 DC durante 3 minutos. El programa PCR de la segunda ronda se establecio solo para los productos de la 1a PCR que contenia el cebador MJH-Rev2: 2 reacciones diferentes combinando cualquiera de los cebadores ExtMVH-1 o ExtMVH-2 (tabla 1 y figura 2) en combinacion con el cebador inverso ExtMJH-Rev2int (tabla 1 y figura 2). 50 microlitros de volumenes PCR estaban compuestos por producto PCR 50 ng (de la primera ronda PCR), tampon 5* Phusion polymerase HF 10 microlitros, 500 nM de cada cebador directo, cebador directo 1 micromolar, 1 microlitro de reserva de dNTP 10 nM, polimerasa Phusion 1,25 unidades y agua MQ esteril. El programa del termociclador consistio en un programa de toma de contacto seguido de una etapa de amplificacion regular: 1 ciclo a 98 DC durante 30 segundos, 10 ciclos a 98 DC durante 10 segundos, 65 DC disminuyendo 1,5 DC por ciclo 10 segundos, 72 DC 20 segundos, 10 ciclos a 98 DC durante 10 segundos, 55 DC 10 segundos, 72 DC 20 segundos y 1 ciclo a 72 DC durante 3 minutos. El programa PCR de la tercera ronda se establecio como se describe en la figura 2. Volumenes PCR de 50 microlitros estaban compuestos por producto PCR 50 ng (de las rondas PCR anteriores, figura 2), tampon 5* Phusion polymerase HF 10 microlitros, cebador directo 1 micromolar (tabla 1 y figura 2), cebador inverso 1 micromolar, 1 ml de reserva dNTP 10 mM, polimerasa Phusion 1,25 unidades y agua MQ esteril. El programa consistio en un programa de toma de contacto seguido de una etapa de amplificacion regular: 1 ciclo a 98 DC durante 30 segundos, 10 ciclos a 98 DC durante 10 segundos, 65 DC disminuyendo 1,5 DC por ciclo de 10 segundos, 72 DC 20 segundos, 10 ciclos a 98 DC durante 10 segundos, 55 DC

15 5

10 segundos, 72 DC 20 segundos y 1 ciclo a 72 DC durante 3 minutos. Despues de las amplificaciones por PCR, todos los productos de la PCR se purificaron en gel usando Qiaex II de acuerdo con los protocolos del fabricante.

Digestiones con enzimas de restriccion

Los productos purificados se sometieron a digestion con BstEII y SfiI en dos etapas. En primer lugar se realizo la digestion de 1 microgramo de ADN en reacciones de 100 microlitros que consistian en 10 microlitros de tampon 10* NEB 3 (New England Biolabs), 1 microlitro de 100* BSA, 12,5 unidades de BstEII y agua esteril durante 6 horas a 60 DC en una estufa. Los productos se purificaron usando el kit de Purificacion PCR Qiaquick de Qiagen de acuerdo con el manual de instrucciones y se eluyeron en 40 microlitros de agua. A continuacion todos los productos se sometieron adicionalmente a digestion con SfiI en reacciones de 100 microlitros que consistian en 10 microlitros de tampon 10* NEB 2 (New England Biolabs), 1 microlitro de 100* BSA, 12,5 unidades de SfiI y agua esteril durante 12 horas a 50 DC en una estufa. Los fragmentos digeridos se purificaron usando el kit de Extraccion en Gel Qiaquick seguido de separacion en gel sobre un gel de bromuro de etidio mas TBE agarosa 1,5 % de 20 cm a 80 V. 100 microgramos del vector aceptor (MV1043, figuras 3 y 12) se sometieron a digestion con 50 unidades de Eco91I en 600 microlitros en condiciones convencionales (tampon Tango) y despues se purifico en un gel de agarosa al 0,9 %. Despues de una segunda etapa de digestion en condiciones recomendadas con 400 unidades de SfiI en 500 microlitros durante 12 horas, se afadieron 100 unidades de BsrGI durante 3 horas a 50 DC.

Ligamientos

Cada producto de la PCR se ligo por separado de acuerdo con el siguiente esquema: 70 ng de productos PCR digeridos, 300 ng de vector aceptor digerido, 100 unidades de T4 Ligasa (NEB), tampon ligasa 1* en 30 microlitros durante 16 horas a 12 DC. Las reacciones de ligamiento se purificaron con extracciones de fenol/cloroformo/alcohol isoamilico seguido de precipitaciones con glucogeno (Sigma-Aldrich ND G1767) de acuerdo con el protocolo del fabricante y finalmente se disolvieron en 25 microlitros de agua esteril.

Transformaciones y conservacion de bibliotecas

Los productos de ligamiento purificados se transformaron por electroporacion usando 1200 microlitros de bacterias electrocomponentes TG1 (Stratagene ND 200123) por lote de ligamiento y se sembraron en placas de caldo LB con carbenicilina que contenia glucosa al 4 %. Las bibliotecas se recogieron raspando las bacterias en 50 ml de caldo LB con carbenicilina. Despues de centrifugar a 2000 g durante 20 minutos a 4 DC, los sedimentos bacterianos se resuspendieron cuidadosamente en 2 ml de 2*TY/glicerol al 30 % enfriado con hielo en agua helada y se congelaron en hielo seco/etanol antes de conservar a -80 DC.

Amplificacion de bibliotecas

Las bibliotecas se cultivaron y se recogieron de acuerdo con los procedimientos descritos por Kramer y col. 2003 (Kramer y col. 2003. Nucleic Acids Res. 31(11): e59) usando VCSM13 (Stratagene) como cepa fago auxiliar.

Seleccion de fagos en inmunotubos revestidos

El toxoide tetanico se disolvio en PBS en una concentracion de 2 μg/ml y se revistio en tubos MaxiSorp Nunc-Immuno (Nunc 444474) durante una noche a 4 DC. Despues de desechar la solucion de revestimiento, los tubos se bloquearon con leche desnatada (ELK) al 2 % en PBS (tampon de bloqueo) durante 1 hora a TA. En paralelo, 0,5 ml de la fagoteca se mezclaron con 1 ml de tampon de bloqueo y se incubo durante 20 minutos a temperatura ambiente. Despues de bloquear los fagos, la solucion de fagos se afadio a los tubos revestidos con el toxoide tetanico y se incubo durante 2 horas a TA en una plataforma rotatoria lenta para permitir la union. A continuacion, los tubos se lavaron 10 veces con PBS/Tween-20 al 0,05 % seguido por elucion de fagos mediante una incubacion con 1 ml de glicina-HCl 50 mM a pH 2,2 durante 10 min a TA en una rueda rotatoria y directamente seguido de neutralizacion del eluyente recogido con 0,5 ml de Tris-HC1 1 M a pH 7,5.

Recogida de clones de fagos

A la solucion de fagos recogida se afadieron 5 ml de cultivo XL1-Blue MRF (Stratagene) a una D.0. de 0,4 y se incubo durante 30 minutos a 37 DC sin agitar para permitir la infeccion de los fagos. Las bacterias se sembraron en placas 2*TY de glucosa al 4 % Tetraciclina/Carbenicilina y se cultivo durante una noche a 37 DC.

Produccion de fagos

Los fagos se cultivaron y procesaron como describen Kramer y col. 2003 (Kramer y col. 2003. Nucleic Acids Res. 31(11): e59) usando VCSM13 como cepa fago auxiliar.

ELISA para fagos

Se revistieron placas ELISA con 100 microlitros de IL-6 recombinante por pocillo a una concentracion de 2,5 microgramos/ml en PBS durante a 4 DC. Se usaron placas revestidas con 100 microlitros de tiroglobulina a una concentracion de 2 microgramo/ml en PBS como control negativo. Los pocillos se vaciaron, se secaron golpeteando

16 5

suavemente sobre una toallita de papel, se cargaron completamente con PBS-leche desnatada (ELK) al 4 % y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente para bloquear los pocillos. Despues de desechar la solucion de bloqueo, las mini-preparaciones de fagos premezcladas con solucion de bloqueo 50 μl se afadieron y se incubaron durante 1 hora a TA. Despues, 5 etapas de lavado con PBS-Tween-20 al 0,05 % retiraron los fagos no unidos. Los fagos no unidos se detectaron incubando los pocillos con 100 microlitros de anticuerpo anti-M13 conjugado con HRP (diluido a 1/5000 en tampon de bloqueo) durante 1 hora a temperatura ambiente. Se retiraron los anticuerpos libres repitiendo las etapas de lavado como se ha descrito anteriormente, seguido de incubacion en sustrato TMB hasta ser visible el revelado del color. La reaccion se detuvo afadiendo 100 microlitros de H2S04 2 M por pocillo y se analizo en un lector ELISA a una longitud de onda de emision de 450 nm.

Secuenciacion

Los clones que dieron sefales al menos 3 veces por encima de la sefal de fondo (Tabla 2) se propagaron, se usaron para procedimientos miniprep ADN (vease el manual de procedimientos miniPrep de Qiagen) y se sometieron a analisis de secuencia de nucleotidos. La secuenciacion se realizo de acuerdo con el manual adjunto al kit Big Dye 1.1 (Applied Biosystems) usando un cebador inverso (CH1 Rev1, tabla 1) que reconoce una secuencia 5' de la region CH1 de la cadena pesada IgG1 humana (presente en el vector de presentacion Fab MV1043, figuras 3 y 12). Las secuencias VH de raton de 28 clones de union al toxoide tetanico se representan en la Tabla 3. Los resultados muestran que los genes VH murinos seleccionados pertenecen a diferentes familias de genes y diferentes miembros individuales de estas familias de genes son capaces de emparejarse con la region VH de IGKV1-39/J humana reordenada para formar sitios de union a anticuerpo especificos del toxoide tetanico funcionales. A partir de los analisis de secuencia, se llego a la conclusion de que las regiones VH murinas utilizan una diversidad de segmentos genicos DH y JH.

Ejemplo 3

Silenciamiento de locus de cadena ligera kappa de raton

Este ejemplo describe el silenciamiento de los locus endogenos de cadena ligera kappa de raton. El locus kappa endogeno se modifica por recombinacion homologa en celulas ES, seguido de la introduccion de celulas ES modificadas geneticamente en embriones de raton para obtener descendencia geneticamente adaptada.

Un vector que contiene una secuencia de nucleotidos ensamblada que consta de una parte que comprende la region J a 338 pb cadena abajo del segmento genico J5 fusionada con una secuencia 3' terminal del potenciador CK 3' se usa para recombinacion homologa en celulas ES. La secuencia ensamblada se usa para delecionar un fragmento de ADN genomico que abarca desde el extremo 3' de la region JK justo hasta el extremo 3' del potenciador CK 3'. Como una consecuencia de este procedimiento, se elimina el gen constante CK, el potenciador 3' y algunas regiones intergenicas (veanse las figuras 4 y 18).

Construccion del vector diana

Un vector que recibia brazos flanqueantes de 4,5-8 kb en los extremos 3' y 5' fusionado con el segmento de deleccion se uso para dirigir la recombinacion homologa en una linea de celulas ES. Ambos brazos se obtuvieron por medios PCR garantizando una homologia maxima. La estrategia diana permite la generacion del alelo K0 constitutivo. La secuencia genomica de raton que abarca el potenciador intronico Igk, la region constante Igk y el potenciador 3' Igk se reemplazo con un casete PuroR, que estaba flanqueado por sitios F3 e se inserto cadena abajo de los elementos Jk. La eliminacion mediada por Flp del marcador de seleccion dio como resultado un alelo K0 constitutivo. El reemplazo de la region genomica Igk MiEk-Igk C-Igk 3'E (aproximadamente 10 kb) con un casete F3-Puro (aproximadamente 3 kb) disminuyo probamente la eficacia de la recombinacion homologa. Por lo tanto, los brazos de homologia se extendieron por consiguiente y se analizaron mas colonias de celulas ES despues de la transfeccion para identificar clones recombinantes homologos.

Generacion de celulas ES que llevan el fragmento kappa delecionado

La generacion de celulas ES modificadas geneticamente se realizo esencialmente como describen (Seibler y col. Nucleic Acids Res. 2003 feb 15;31(4):e12). Vease tambien el ejemplo 14 para una descripcion detallada.

Generacion de ratones ES por complementacion de embriones tetraploides.

La produccion de ratones por complementacion de embriones tetraploides utilizando celulas ES modificadas geneticamente se realizo esencialmente como describen (Eggan y col., PNAS 98, 6209-6214; Seibler J, y col. Nucleic Acids Res. 2003 Feb 15;31 (4):e12; Hogan y col., (Summary of mouse development. Manipulating the Mouse Embryo, (1994) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY.), paginas 253-289.)).

Ejemplo 4

Silenciamiento del locus de cadena ligera lambda de raton

Este ejemplo describe el silenciamiento del locus endogeno de cadena ligera lambda de raton. El locus endogeno

17 5

lambda se modifica por recombinacion homologa en celulas ES seguido de la introduccion de celulas ES modificadas geneticamente en embriones de raton para obtener descendencia geneticamente adaptada

Dos regiones del locus lambda murino que en su conjunto contiene todas las regiones V lambda funcionales se sometieron a delecion.

La primera region dirigida para deleccion basada en recombinacion homologa es una region que se localiza 408 pb cadena abajo del sitio de inicio del segmento genico IGLV2 y acaba 215 pb cadena abajo de segmento genico IGLV3, incluyendo el tramo de secuencia intergenica entre estos elementos genicos IGLV. La segunda region que se sometio a una deleccion implica el segmento genico IGLV1 que consiste en un fragmento que abarca desde 392 pb cadena arriba a 171 pb cadena abajo del segmento genico IGLV1. Como una consecuencia de estas dos etapas de delecion, se delecionaron todos los segmentos genicos lambda V funcionales, que vuelven al locus funcionalmente inactivo (figuras 5 y 19).

Construccion de los vectores diana

Los vectores que recibieron brazos flanqueantes 3-9,6 kb en los extremos 3' y 5' fusionados con el segmento de delecion se usaron para recombinacion homologa diana en una linea de celulas ES. Ambos brazos se obtuvieron por medios PCR garantizando maxima homologia. En una primera etapa, la secuencia genomica de raton que abarcaba las regiones V2-V3 de Igl se reemplazo con un casete PuroR flanqueado por sitios F3, que produce un alelo K0 constitutivo despues de la retirada mediada por Flp del marcador de seleccion (vease la figura 19A). En una segunda etapa, la secuencia genomica de raton que abarcaba la region V1 de Igl se reemplazo con un casete Neo en clones de celulas ES que ya llevaban una delecion de las regiones V2-V3 de Igl (vease la figura 19B). El marcador de seleccion (NeoR) se flanqueo por sitios FRT. Se obtuvo un alelo K0 constitutivo despues de retirada mediada por Flp de marcadores de seleccion.

Generacion de celulas ES que llevan el fragmento lambda delecionado

La generacion de celulas ES modificadas geneticamente se realizo esencialmente como describen (Seibler J, Zevnik B, Kuter-Luks B, Andreas S, Kern H, Hennek T, Rode A, Heimann C, Faust N, Kauselmann G, Schoor M, Jaenisch R, Rajewsky K, Kuhn R, Schwenk F. Nucleic Acids Res. 15 feb 2003;31(4):e12). Vease tambien el ejemplo 14 para una descripcion detallada. Para demostrar que ambos eventos diana se producian en el mismo cromosoma se seleccionaron diversos clones doble diana para la delecion in vitro con pCMV C31deltaCpG. Los clones se expandieron bajo presion con antibioticos en una capa alimentadora mitoticamente inactivada que comprendia fibroblastos embrionarios de raton en medio DMEM con Alto contenido en Glucosa que contenia FCS (PAN) al 20 % y Factor Inhibidor de Leucemia 1200 u/ml (Millipore ESG 1107). 1x107 celulas de cada clon se sometieron a electroporacion con 20 μg de pCMV C31deltaCpG circular a 240 V y 500 μF y se sembraron en 4 discos de 10 cm cada uno. 2 -3 dias despues de la electroporacion las celulas se recogieron y se analizaron por PCR. Los cebadores utilizados fueron:

2005 5: CCCTTTCCAATCTTTATGGG

2005 7: AGGTGGATTGGTGTCTTTTTCTC

2005 9: GTCATGTCGGCGACCCTACGCC

Las reacciones PCR se realizaron en mezclas que comprendian Tampon PCR 5 μl 10x (Invitrogen), MgCl2 2 μl (50 mM), los dNTP 1 μl (10 mM), primer cebador 1 μl (5 μM), segundo cebador 1 μl (5 μM), Taq 0,4 μl (5 U/ul, Invitrogen), H20 37,6 μl y ADN 2 μl. El programa usado fue a 95 DC, 5'; seguido de 35 ciclos a 95 DC 30quot;; 60 DC 30quot;; 72 DC 1'; seguido de 72 DC 10'.

Generacion de ratones ES por complementacion con embriones tetraploides

La produccion de ratones por complementacion con embriones tetraploides usando celulas ES modificadas geneticamente se realizo esencialmente como describen (Eggan y col., PNAS 98, 6209-6214; Seibler J, Zevnik B, Kuter-Luks B, Andreas S, Kern H, Hennek T, Rode A, HeimannC, Faust N, Kauselmann G, Schoor M, Jaenisch R, Rajewsky K, Kuhn R, Schwenk F. Nucleic Acids Res. 15 feb 2003;31(4):e12; Hogan y col., (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY.), paginas 253-289).

Ejemplo 5

Construccion del inserto de expresion CAGGS basado en un gen IGKV1-39/J-Ck de la linea germinal humana reordenado (IGKV1-39/JCk)

Este ejemplo describe la construccion de un casete de expresion CAGGS que incorpora la region IGKV1-39/J de la linea germinal humana reordenada. Este casete de expresion inserto abarca sitios de clonacion, una secuencia Kozak, una secuencia lider que contiene un intron, una fase de lectura abierta de la region IGKV1-39 reordenada, una region constante CK de rata del alelo a y una secuencia de terminacion traduccional (IGKV1-39/J-Ck; figura 6). La construccion primaria consta de secuencias de origen natural y se ha analizado y optimizado eliminando elementos no deseados que actuan en cis como: cajas TATA internas, sefales de poliadenilacion, sitios chi, sitios de

18 5

entrada ribosomales, tramos de secuencia ricos en AT o ricos en GC, elementos de secuencia ARE-, INS- y CRS, secuencias de repeticion, estructuras secundarias de ARN, sitios donantes y aceptores de corte y empalme (cripticos) y puntos de ramificacion de corte y empalme (GeneArt GmbH). Ademas, para la expresion en ratones, se optimizo el uso de codones en las regiones de fase de lectura abierta. La secuencia intronica es invariable y por tanto representa la secuencia identica a la parte codificante del intron lider IGKV1-39 humano.

En el extremo 5' del casete de expresion, se introdujo un sitio NotI y en el extremo 3' un sitio NheI. Ambos sitios se usaron para la clonacion en el modulo de expresion CAGGS. Despues del ensamblaje genico de acuerdo con los procedimientos usados por GeneArt, el inserto se sometio a digestion con NotI-NheI y se clono en el modulo de expresion que contenia un promotor CAGGS, una secuencia bloqueadora flanqueada por sitios LoxP (,floxed'), una secuencia sefal de poliadenilacion y, en el extremo 5' y 3', secuencias para facilitar la recombinacion homologa en el locus Rosa26 de las lineas de celulas ES de raton. Los fragmentos promotores y/o de ADNc se amplificaron por PCR, se confirmaron por secuenciacion y/o se clonaron directamente a partir de plasmidos administrados en un vector de intercambio RMCE que llevaba las caracteristicas indicadas. En la figura 13A y 13B se muestra un dibujo esquematico y la secuencia confirmada del vector diana final pCAGGS-IgVK1-39. La estrategia diana se representa en la figura 13c.

Ejemplo 6

Inserto de expresion CAGGS en base a la region lambda IGLV2-14/J V de la linea germinal reordenada (IGLV2-14/J-Ck)

Este ejemplo describe la secuencia e insercion de un casete de expresion que incorpora la region lambda V de IGLV2-14/J de la linea germinal reordenada. Este inserto abarca sitios de clonacion, una secuencia Kozak, una secuencia lider que contiene un intron, una fase de lectura abierta de la region IGLV2-14/J reordenada y una region constante CK de rata del alelo a y una secuencia de terminacion traduccional (IGLV2-14/J-Ck; figura 7). La construccion primaria consta de secuencias de origen natural y se ha analizado y optimizado eliminando elementos no deseados que actuan cis como: cajas TATA internas, sefales de poliadenilacion, sitios chi, sitios de entrada ribosomales, tramos de secuencia ricos en AT o ricos en GC, elementos de secuencia ARE-, INS- y CRS, secuencias de repeticion, estructuras secundarias de ARN, sitios donantes y aceptores de corte y empalme (cripticos) y puntos de ramificacion de corte y empalme (GeneArt GmbH). Ademas, para la expresion en ratones, se optimizo el uso de codones en las regiones de fase de lectura abierta. La secuencia intronica es invariable y por tanto representa la secuencia identica a la del intron lider IGKV1-39 humano.

En el extremo 5' del casete de expresion, se introdujo un sitio NotI y en el extremo 3' un sitio NheI. Ambos sitios se usaron para la clonacion en el modulo de expresion CAGGS como describe TaconicArtemis. Despues del ensamblaje genico de acuerdo con los procedimientos usados por GeneArt, el inserto se sometio a digestion con NotI-NheI y se clono en el modulo de expresion que contenia un promotor CAGGS, una secuencia bloqueadora flanqueada por sitios LoxP (,floxed'), una secuencia sefal de poliadenilacion y, en el extremo 5' y 3', secuencias para facilitar la recombinacion homologa en el locus Rosa26 de las lineas de celulas ES de raton. Para construir el vector diana RMCE R0SA26 final, se amplificaron los fragmentos promotores y/o de ADNc por PCR. Los productos amplificados se confirmaron por secuenciacion y/o se clonaron directamente a partir de plasmidos administrados en un vector de intercambio RMCE que llevaba las caracteristicas indicadas. En las figuras 15A y 15B se muestra un dibujo esquematico y la secuencia confirmada del vector diana final pCAGGSIgVL2-14. En la figura 15C se representa la estrategia diana.

Ejemplo 7

Expresion de IGKV1-39/J-Ck en lineas de celulas HEK293 (pSELECT-IGKV1-39/J-Ck)

Este ejemplo describe un procedimiento para verificar que las construcciones IGKV1-39/J-Ck descritas en el ejemplo 5 permiten la expresion y deteccion de la cadena L de IGKV1-39/J-Ck en celulas HEK293. El inserto IGKV1-39/J (figura 6) se modifico en el extremo 5' cambiando el sitio NotI en un sitio SalI. Este cambio se requiere para la clonacion del producto en el plasmido de casete de expresion pSELECT-hygro (InvivoGen). El inserto de expresion CAGGS IGKV1-39/J-Ck y pSELECT-hygro se sometieron a digestion con SalI y NheI, se ligaron y se usaron para transformar celulas XL1-Blue competentes usando tecnicas convencionales. Las colonias se seleccionaron y el ADN se purifico usando columnas Midi-prep de Qiagen de acuerdo con los procedimientos del fabricante.

El vector que expresa la cadena ligera (LC) resultante denominado 0817676 pSELECT 0815426 se uso para transfectar celulas HEK293 con Fugene6 (Roche) de acuerdo con los protocolos del fabricante. Los sobrenadantes se exploraron para determinar la presencia de cadenas ligeras de IGKV1-39/J-Ck por ELISA y transferencia de western usando anticuerpos anti-Ck de rata (Beckton Dickinson ND 550336 y 553871) y los protocolos usados en la tecnica.

La VH de la IgG anti-toxoide tetanico (TT) MG 1494 se clono en el vector de expresion de IgG MV1056 usando los sitios de restriccion SfiI y BstEII. El clon resultante se verifico por secuenciacion. Las celulas HEK293T se transfectaron con cinco combinaciones de vectores diferentes, como se muestra en la Tabla (vease el ejemplo 8 para detalles del vector 0817678 pSELECT 0815427). Los sobrenadantes se recogieron y se determinaron las

19 5

concentraciones de IgG (vease la Tabla 4). No pudo detectarse IgG para los sobrenadantes A y B que solo contenian cadena ligera como se esperaba (parte Fc de IgG reconocida por anticuerpos de deteccion). La concentracion de IgG en los sobrenadantes C y D fue comparable a la del sobrenadante E de control positivo, indicando expresion correcta de las construcciones de cadena ligera.

La union a TT se analizo por ELISA para comprobar la funcionalidad de los anticuerpos producidos, usando hemoglobina como antigeno de control negativo. No pudo detectarse union especifica a TT para los sobrenadantes A y B que solo contenian cadena ligera como se esperaba. La union especifica a TT para los sobrenadantes C y D fue al menos tan buena como para el sobrenadante E de control positivo, confirmando expresion correcta de las construcciones de cadena ligera y ensamblaje funcional con cadena pesada. Se detectaron los anticuerpos no solo usando un anticuerpo secundario anti-IgG humana, sino tambien un anticuerpo secundario anti-cadena ligera Ckappa de rata. Los resultados confirman que el anticuerpo anti-Ckappa de rata (BD Pharmingen ND 553871, clon MRK-1) reconoce la cadena ligera expresada por los vectores pSELECT.

Los sobrenadantes se analizaron por SDS-PAGE no reductora y transferencia de Western (no mostrada). La deteccion usando un anticuerpo anti-cadena pesada de IgG humana no mostro bandas para los sobrenadantes A y B que solo contenian cadena ligera, como se esperaba. Los resultados para los sobrenadantes C y D fueron comparables a los del sobrenadante E de control positivo, con una banda cerca del marcador de 170 kD como se esperaba para la IgG intacta. Se observaron bandas adicionales de peso molecular mas bajo tambien en los sobrenadantes C, D y E, que podrian representar productos de degradacion, fragmentos IgG resultantes de reduccion (parcial) y/o bandas irrelevantes de proteina debido a union no especifica del anticuerpo de deteccion.

La deteccion usando un anticuerpo anti-cadena ligera Ckappa de rata mostro una banda cerca al marcador de 26 kD para los sobrenadantes A y B, como se esperaba solo para cadena ligera. Esta banda era mucho mas intensa para A en comparacion con B, lo que indicaba que la cadena ligera IGKV1-39 libre podia expresarse mejor y/o era mas estable que la cadena ligera IGLV2-14 libre. No se detectaron bandas para el sobrenadante E de control como se esperaba, dado que la IgG expresada contenia una cadena ligera Ckappa humana. Para los sobrenadantes C y D, se observaron bandas esperadas cerca de marcador de 170 kD; tambien se observaron bandas de peso molecular mas bajo, pero a un grado mas bajo que el anterior usando el anticuerpo anti-IgG humana.

En conclusion, la transfeccion de las construcciones de expresion de cadena ligera combinado con la cadena pesada de la IgG anti-toxoide tetanico (TT) MG 1494 dio como resultado la produccion de IgG comparable a la de la construccion de control positivo para ambas construcciones de cadena ligera lambda y kappa pSELECT. Ambas producciones de IgG produjeron sefales ELISA en un ELISA TT que eran mejores que o comparables con las del control de IgG. Los analisis de SDS-PAGE y transferencia de Western confirmaron la presencia de IgG intacta. El anticuerpo anti-Ckappa de rata ensayado trabajo eficazmente en el ELISA y en la transferencia de Western. El sobrenadante de cultivo de las celulas transfectadas solo con construcciones de cadena ligera no dio como resultado produccion detectable de IgG ni union especifica detectable a TT, mientras que la cadena ligera libre se detecto por transferencia de Western.

Ejemplo 8

Expresion de IGLV2-14/J-Ck en lineas de celulas HEK293 (pSELECT-IGLV2-14/J-Ck)

Este ejemplo describe un procedimiento para verificar que las construcciones de IGLV2-14/J descritas en el ejemplo 6 permiten la expresion y deteccion de la cadena L de IGLV2-14/J-Ck en celulas HEK293. El inserto IGLV2-14/J-Ck (figura 7) se modifico en el extremo 5' cambiando el sitio NotI en un sitio SalI. Este cambio se requiere para la clonacion del producto en el plasmido del casete de expresion pSELECT-hygro (InvivoGen). El inserto de expresion CAGGS IGLV2-14/J-Ck y pSELECT-hygro se sometieron a digestion con Sall y NheI, se ligaron y se usaron para transformar celulas XL1-Blue competentes usando tecnicas convencionales. Las colonias se seleccionaron y el ADN se purifico usando columnas Midi-prep de Qiagen de acuerdo con los procedimientos del fabricante. El vector que expresaba la cadena ligera (LC) resultante denominado 0817678 pSELECT 0815427 se uso para transfectar celulas HEK293 con Fugene6 (Roche) de acuerdo con los protocolos del fabricante. Los sobrenadantes se exploraron para determinar la presencia de cadenas ligeras IGLV2-14/J-Ck por ELISA y transferencia de western usando anticuerpos anti-Ck de rata (Becton Dickinson ND 550336 y 553871) y protocolos usados en la tecnica. Vease el ejemplo 7 para detalles y resultados.

Ejemplo 9

Construccion de una construccion de expresion dirigida por el promotor VK que contiene un inserto IGKV1-39/J y elementos potenciadores multiples derivados del locus CK murino (VkP-IGKV1-39/J-Ck; VkP-012)

Este ejemplo describe la construccion de un casete de expresion que contiene elementos relevantes que permite la expresion especifica de fase de linfocitos B y desarrollo/diferenciacion de la region IGKV1-39 VK humana reordenada, en base a la region promotora IGKV1-39 VK, lider que contiene un intron, gen V de linea la germinal, CDR3, segmento IGKJ, region intergenica de raton localizada entre la fase de lectura abierta Jk y Ck, y alelo a Ck de rata, y un fragmento intergenico de raton desde extremo 3' del gen CK de raton acabando justo en 3' del potenciador CK 3'.

20 5

Las fases de lectura abierta optimizadas del lider, del gen IGKV1-39 reordenado y del gen del alelo CK de rata, como se describe en el ejemplo 5 se usaron para la construccion del casete de expresion. La region promotora VK se obtuvo por procedimientos de sintesis genica (GeneArt, GmbH) y es casi identica a la secuencia de la region IGKV1-39 humana entre -500 pb y el ATG (sitio de inicio) del gen. La unica desviacion de la secuencia natural es la introduccion de una secuencia Kozak GCCACCATGG en el sitio ATG (inicio) para promover la traduccion. Como base para la introduccion de elementos individuales se usa un fragmento genomico de un clon BAC de raton (TaconicArtemis). Este fragmento es identico a la secuencia del locus VK de raton comenzando con el sitio donante intronico localizado directamente en 3' de la region JK5 y finalizando justo en 3' del potenciador CK 3' y cubre aproximadamente 12,5 kb.

La construccion final contiene desde el extremo 5' a 3' los siguientes elementos: promotor IGKV1-39 genomico humano (500 pb), una secuencia Kozak, una parte 1 del lider IGKV1-39 humano (optimizado), un intron lider IGKV139 humano, una parte 2 del lider IGKV1-39 humano (optimizado), un gen de la linea germinal IGKV1-39 humana (optimizado), una region J humana (optimizada), una region intergenica de raton incluyendo el elemento potenciador intronico, una region constante kappa de rata (Rattus norvegicus) (optimizada), y una region intergenica de raton incluyendo el potenciador kappa 3'. Los elementos de este casete de expresion se muestran en la figura 8 y se denominan VkP-IGKV1-39/J-Ck (VkP-012). En las figuras 20A y 21A se representa un esquema del vector pVkP012 y la estrategia diana. El vector se introdujo en celulas ES siguiendo procedimientos convencionales (vease el ejemplo 14).

Ejemplo 10

Construccion de una construccion de expresion dirigida por el promotor VK que contiene un clon IGLV2-14/J y elementos potenciadores derivados del locus CK multiple (VkP-IGLVL2-14/J-Ck; VkP-2a2).

Este ejemplo describe la misma construccion a la descrita en el ejemplo 9, excepto que el gen IGKV1-39 y la region J se reemplazaron por el gen de la linea germinal IGLV2-14 humana optimizado incluyendo una region V-J unica (VkP-IGLV2-14/JCk; VkP-2a2; figura 9).

Ejemplo 11

Construccion de una construccion de expresion dirigida por el promotor VK que contiene un clon IGKV1-39 que carece del elemento potenciador intronico de CK (VkP-IGKV1-39/J-Ck-Δ1; VkP-012-del1)

La construccion descrita en el ejemplo 9 se modifico eliminando el elemento potenciador intronico de CK, localizado en la region intergenica entre la region J humana y la region CK de rata por modificacion PCR convencional y metodologias de clonacion de ADN (GeneArt, GmBH). El casete de expresion resultante se muestra en la figura 10 y se denomino VkP-IGKV1-39/JCk-Δ1 (VkP-012-dell).

En las figuras 20B y 21B se representa un esquema del vector pVkP-012-del1 y la estrategia diana. El vector se introdujo en celulas ES siguiendo procedimientos convencionales (vease el ejemplo 14).

Ejemplo 12

Construccion de una construccion de expresion dirigida por el promotor VK que contiene un clon IGKV1-39 que carece del elemento potenciador intronico de CK y un elemento potenciador de CK 3' truncado (VkP-IGKV1-39/J-CkΔ2; VkP-012-del2)

La construccion descrita en el ejemplo 11 se modifico truncando el elemento potenciador CK 3' y delecionando parte de la region intergenica 3' del gen Ck de rata, para eliminar posibles elementos inhibidores. Esto se consiguio eliminando la secuencia intergenica entre un sitio EcoRV (localizado 3' del gen Ck de rata) y el sitio NcoI presente en el potenciador 3' (5993 pb) y eliminando adicionalmente la secuencia entre el sitio BstXI potenciador 3' y el sitio BstXI 3' del potenciador 3' (474 pb) usando procedimientos convencionales. El casete de expresion resultante se muestra en la figura 11 y se denomino VkPIGKV1-39/J-Ck-Δ2 (VkP-012-del2).

En las figuras 20C y 21C se representa un esquema del vector pVkP-012-del2 y la estrategia diana. El vector se introdujo en celulas ES siguiendo procedimientos convencionales (vease el ejemplo 14).

Ejemplo 13

Expresion de construcciones Vk en lineas celulares

Las construcciones descritas en los ejemplos 9-12 se sometieron a ensayo con respecto a su capacidad para producir proteinas de cadena ligera en las lineas de celulas de mieloma MPC11 (ATCC CCL167), linfoma de linfocitos B WEHI231 (ATCC CRL-1702), linfoma de linfocitos T EL4 (ATCC TIB-39) y en HEK293 (ATCC CRL1573). Los elementos potenciadores y promotores en la construccion permiten la expresion en lineas de linfocitos B pero no en lineas de celulas derivadas de otros tejidos. Despues de la transfeccion de las lineas celulares usando ADN linealizado purificado y Fugene6 (Roche), las celulas se cultivaron para expresion transitoria. Las celulas y el

21 5

sobrenadante se recogieron y se sometieron a analisis SDS-PAGE seguido de transferencia de western usando un anticuerpo anti-C-kappa de rata especifico. Los sobrenadantes se analizaron en ELISA para detectar cadenas L segregadas usando el anticuerpo anti-CK de rata (Beckton Dickinson ND 550336).

Ejemplo 14

Generacion de lineas ES transgenicas

Todas las construcciones descritas en los ejemplos 3, 4, 5, 6, 9, 10, 11 y 12 se usaron para generar lineas ES transgenicas estables individuales mediante recombinacion homologa. En la tecnica se conocen procedimientos para generar lineas ES transgenicas mediante recombinacion homologa (por ejemplo Eggan y col., PNAS 98, 62096214; Seibler J, Zevnik B, Kuter-Luks B, Andreas S, Kern H, Hennek T, Rode A, HeimannC, Faust N, Kauselmann G, Schoor M, Jaenisch R, Rajewsky K, Kuhn R, Schwenk F. Nucleic Acids Res. febrero 2003 15;31(4):e12; Hogan y col. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY.), paginas 253-289.).

Para todas las construcciones descritas en los ejemplos 5-6, y en los ejemplos 9-12, la linea celular ES RMCE (derivada de la cepa de raton 129S6B6F1-Gt(R0SA)26Sortm10Arte) se cultivo en una placa alimentadora mitoticamente inactivada que comprendia fibroblastos embrionarios de raton (FER) en medio DMEM con Alto contenido Glucosa que contenia FBS al 15 % (PAN 1302-P220821). Se afadio Factor Inhibidor de Leucemia (Chemicon ESG 1107) al medio a una concentracion de 900 U/ml. Para la manipulacion, 2x105 celulas ES se sembraron en discos de 3,5 cm con 2 ml de medio. Directamente antes de la transfeccion, se afadieron 2 ml de medio reciente a las celulas. Se mezclo Reactivo Fugene6 3 ul (Roche; Catalogo ND 1 814 443) con medio aserico 100 ul (0ptiMEM I con Glutamax I; Invitrogen; Catalogo ND 51985-035) y se incubo durante 5 min. 100 ul de la solucion Fugene/0ptiMEM se afadieron al vector circular 2 ug y CAGGS-Flp 2 ug y se incubo durante 20 min. Este complejo de transfeccion se afadio gota a gota a las celulas y se mezclo. Se afadio medio reciente a las celulas al dia siguiente. Desde el dia 2 hacia adelante el medio se reemplazo diariamente con medio que contenia G418 250 ug/ml (Geneticin; Invitrogen; Catalogo ND 10131-019). Siete dias despues de la transfeccion, se aislaron clones sencillos, se expandieron y las moleculas se analizaron por transferencia de Southern de acuerdo con procedimientos convencionales.

Para cada construccion, el analisis de clones multiples por digestion con enzimas de restriccion de ADN genomico de clones sencillos seguido de hibridacion con sondas 5', sondas 3' y sondas internas dio como resultado clones que comprendian una sola insercion correcta en la posicion correcta en el locus Rosa26. En la figura 14 se proporciona un ejemplo.

Ejemplo 15

Generacion de cepas transgenicas de raton

Todas las lineas de celulas ES que se generaron y se verificaron con respecto a sus modificaciones, como se describe en el ejemplo 14, se usaron para generar ratones transgenicos estables mediante recombinacion tetraploide. Los procedimientos son conocidos en la tecnica. En general, despues de la administracion de hormonas, hembras Balb/c superovuladas se aparearon con machos Balb/c. Los blastocitos se aislaron del utero en una capa hidrofuga (quot;dpc, damp-proof course') de 3,5. Para la microinyeccion, los blastocitos se colocaron en una gota de DMEM con FCS al 15 % con aceite mineral. Una pipeta de microinyeccion, accionada de forma piezoelectrica, de punta plana con un diametro interno de 12 -15 micrometros se uso para inyectar 10-15 celulas ES C57BL/6 N.tac diana en cada blastocito. Despues de su recuperacion, los blastocitos inyectados se transfirieron a cada cuerno uterino de hembras NMRI pseudoprefadas, 2,5 dias post-coito. El quimerismo se midio en quimeras (G0) por contribucion de recubrimiento de color de celulas ES en huesped Balb/c (negro/blanco). Los ratones muy quimericos se cruzaron con hembras de la cepa C57BL/6. Dependiendo de las necesidades del proyecto, los compaferos de apareamiento C57BL/6 son no mutantes (W) o mutantes para la presencia de un gen recombinasa (supresor-Flp o supresor Cre o supresor inducible CreER o combinacion de supresor-Flp/CreER). La transmision de la linea germinal se identifico por la presencia de descendencia de color negro, cepa C57BL/6, (G1).

Por ejemplo, el clon ESC IgVK1-39 2683 8 (vease los ejemplos 5 y 14) se inyecto en un total de 62 blastocitos en 3 experimentos independientes. Se obtuvieron 3 camadas con un total de 6 crias. Todas las crias eran quimericas. Se obtuvieron 3 crias de descendencia heterocigota que se usaron para cruzamiento posterior.

El clon ESC Kappa 2692 A-C10 (vease los ejemplos 3 y 14) se inyecto en un total de 54 blastocitos en 3 experimentos independientes. Se obtuvieron 3 camadas con un total de 11 crias, de las cuales 10 eran quimericas. Se obtuvieron 8 crias de descendencia heterocigota que se usaron para cruzamiento posterior.

El clon ESC Kappa 2692 B-C1 (vease los ejemplos 3 y 14) se inyecto en un total de 51 blastocitos en 3 experimentos independientes. Se obtuvieron 2 camadas con un total de 6 crias, de las cuales 4 eran quimericas. Se obtuvieron 3 crias de descendencia heterocigota que se usaron para cruzamiento posterior.

22 5

Ejemplo 16

Cruzamiento

Este ejemplo describe el cruzamiento para obtener ratones que contienen casetes de expresion transgenicos como se describe en el ejemplo 14 y ratones genosuprimidos (quot;knock out') en los que se habian silenciado los locus lambda y kappa endogenos. La localizacion de V-lambda en el cromosoma 16 y CD 19 en el cromosoma 7 permite realizar procedimientos de cruzamiento convencionales. El cruzamiento del locus Vk y el locus Rosa26 colocalizados en el cromosoma 6 con una distancia de aproximadamente 24 cM requiere especial atencion durante la exploracion ya que solo un porcentaje de la descendencia muestra entrecruzamiento de una manera que ambas modificaciones se integran en un cromosoma.

Los cuatro locus deben combinarse en una sola cepa de raton que es homo- o heterocigota para el transgen CD 19cre (no descrito) y Rosa26 modificado y homocigota para los otros locus. El cruzamiento se realiza mediante tecnicas de cruzamiento y de exploracion convencionales segun sea apropiado y propuesto por compafias de cria del mercado. (Por ejemplo, TaconicArtemis).

Ejemplo 17

Inmunizaciones de ratones

Usando protocolos convencionales se realizaron inmunizaciones primarias y de refuerzo

Para validar la expresion transgenica de cadenas ligeras de Cκ de rata Vκ 012 (IGKV1-39) (veanse los ejemplos 5, 14-16) en linfocitos B de ratones CD19-HuVκ1 y para evaluar su impacto sobre el tamafo del repertorio VH, diversidad de uso de familia y recombinacion V(D)J despues de inmunizacion, se inmunizaron ratones transgenicos CD19-HuVκ1 con la vacuna de la toxina tetanica (vacuna TT) y la diversidad de secuencia VH de clones seleccionados al azar de ratones CD19-HuVκ1 se comparo con ratones de ts inmunizados con TT y miembros de la misma camada negativos a CD19-Cre HuVk1. Se obtuvieron datos sobre la frecuencia SHM del transgen Vκ 012 humano en los ratones inmunizados. Se recupero una coleccion diversa de al menos 40 mAb no relacionados clonalmente, especificos de TT, que contenian Vκ 012 de ratones CD19-HuVκ1 por exhibicion de fagos.

Para realizar esto, tres ratones CD19-HuVκ1 adultos se vacunaron con vacuna TT usando procedimientos de inmunizacion convencionales. Despues de la inmunizacion, se midieron los titulos en suero usando ELISA especifico de TT (TT: Statens Serum Institute, Art. ND 2674) y las suspensiones de bazo se sometieron a separacion de celulas por procedimiento FACS despues de tincion con un anticuerpo monoclonal especifico de Cκ de rata para aislar linfocitos B transgenicos (clon RG7/9.1; BD Pharmingen ND 553901, Lot ND 06548). El ARN de linfocitos B positivos a Cκ se extrajo y el material de ADNc resultante se uso para construir bibliotecas y realizar analisis SHM.

El anticuerpo anti-Cκ de rata monoclonal convencional (clon RG7/9.1; BD Pharmingen ND 553901, Lot ND 06548) se uso en analisis FACS de linfocitos B que expresan el transgen (Meyer y col., 1996, Int. Immunol., 8: 1561). El anticuerpo RG7/9.1 del clon reacciona con un determinante de cadena kappa monotipico (comun). Este anticuerpo anti-Cκ de rata (clon RG7/9.1 (BD Pharmingen ND 553901, Lot ND 06548) se marco con R-ficoeritrina (PE), usando el kit de conjugacion rapida LYNX de acuerdo con las instrucciones del fabricante para analisis y separacion por FACS. El anticuerpo marcado se somete en primer lugar a ensayo por citometria de flujo con respecto a la union a proteinas de cadena ligera funcionales que contienen Cκ de rata producidas en celulas HEK-293T transfectadas transitoriamente; el anticuerpo no conjugado sirve como un control positivo. Dos anticuerpos distintos que mostraron unirse a Cκ de rata por ELISA y transferencia de Western (vease el ejemplo 7) se sometieron tambien a ensayo por citometria de flujo.

Se realizo la construccion de una biblioteca de presentacion de fagos Fab con un conjunto de cebadores de PCR degenerados optimizados, disefados para amplificar genes C57BL/6 VH; el tamafo minimo de la biblioteca es de 106 clonesy la frecuencia minima de inserto es del 80 %. El vector usado, MV1043 (figuras 3 y 12), que contiene el Vκ humano se fusiono con una region Cκ humana. La Cκ se intercambio por lo tanto por el homologo humano en el proceso de generacion de la biblioteca.

Antes de la seleccion, se realizo secuenciacion de VH de 96 clones seleccionados al azar para validar la diversidad del repertorio de VH que se comparo con la diversidad obtenida a partir de una biblioteca no seleccionada previamente generada usando los mismos procedimientos de los ratones BALB/c inmunizados con TT. Una biblioteca de ratones C57B1/6 de ts que se inmunizaron de la misma manera permite comparar la diversidad entre dos bibliotecas preseleccionadas que comparten la misma vacuna y el mismo fondo genetico.

Diversas selecciones independientes se realizaron sobre TT revestido en inmunotubos. Las variables que pueden incluirse son selecciones usando antigenos biotinilados en solucion o selecciones en TT de captura. Basandose en el numero y diversidad de clones positivos a ELISA obtenidos en las primeras selecciones, se realizaron decisiones sobre rondas de seleccion adicionales. Los clones se consideran positivos cuando #30; 3x positivos sobre un clon control negativo. Los clones positivos se analizan por ELISA frente a un panel de antigenos de control negativos

23 5

para verificar la especifidad antigenica. El objetivo es identificar al menos 40 regiones VH unicas, en base a secuencias CDR3 unicas y reordenamientos de VHDJH.

La amplificacion de material de ADNc de linfocitos B clasificados positivos-Cκ de rata se realizo con un cebador directo de PCR especifico para la secuencia lider humana y un cebador inverso de PCR especifico para la secuencia Cκ de rata, en una region no redundante con la secuencia Cκ de raton, como se describe en un estudio reciente (Brady y col., 2006, JIM, 315: 61). Las combinaciones de los cebadores y las temperaturas de hibridacion se sometieron en primer lugar a ensayo sobre ADNc de celulas HEK-293T transfectadas con el vector 0817676 pSELECT 0815426 = pSELECT con el casete de ADN IGKV1-39 (vease el ejemplo 7).

Los productos de amplificacion se clonaron en el vector pJET-1 y despues de transformacion con XL1-blue, se secuenciaron 96 colonias para evaluar la frecuencia SHM de VL por comparacion directa con la secuencia de la linea germinal Vκ 012 (IGKV1-39). El procedimiento de proporcion R/S, como se describe en este estudio en anticuerpos especificos de TT humanos (de Kruif y col., 2009, J. Mol. Biol., 387: 548) permite discriminar entre mutaciones al azar y mutaciones dirigidas por antigeno que se producen en secuencias VL.

Ejemplo 18

Analisis inmunofluorescente de poblaciones de linfocitos B en lineas de raton transgenico

Este ejemplo describe el uso de anticuerpos y citometria de flujo para analizar poblaciones de linfocitos T en organos linfoides primarios (medula osea) y secundarios (bazo, cavidad peritoneal) y sangre. Procedimientos y reactivos se describen en Middendorp y col. (2002) J. Immunol. 168: 2695 y Middendorp y col. (2004) J. Immunol.

172: 1371. Para el analisis del desarrollo temprano de linfocitos B en medula osea, se tifo la superficie de las celulas con combinaciones de anticuerpos (Becton Dickinson) especificas para B220, CD 19, CD25, IgM, IgD, Ckappa de raton, Clambda de raton y Ckappa de rata para detectar poblaciones de prolinfocitos B, prelinfocitos B, prelinfocitos B grandes, linfocitos B inmaduros tempranos y tardios y linfocitos B recirculantes que expresen el transgen en su superficie. Se incluyo tincion con DAPI (Invitrogen) para excluir del analisis celulas muertas y bloqueo con FC (Becton Dickinson) para inhibir la interaccion de anticuerpos con receptores de Fc en celulas mieloides. Para analisis de expresion transgenica de superficie sobre poblaciones de linfocitos B en organos linfoides perifericos y sangre, las celulas se tiferon con combinaciones de anticuerpos (Becton Dickinson) especificos para B220, CD5, CD19, CD21, CD23, IgM, IgD, Ckappa de raton, Clambda de raton y Ckappa de rata. Se incluyo tincion con DAPI para excluir del analisis las celulas muertas y bloqueo con FC para inhibir la interaccion de anticuerpos con receptores de FC en celulas mieloides. Ademas, se incluyeron combinaciones de anticuerpos (Becton Dickinson) especificos para CD3, CD4, CD11b, CD11c y NK1.1 para determinar si se producia la expresion transgenica en los tipos de celulas fuera de compartimento de linfocitos B.

Se analizaron tres ratones heterocigotos para el transgen Ckappa de rata IGKV1-39 humano y heterocigotos para el transgen CD19-Cre en un fondo C57BL6 (HuVk1/CD19-Cre). Como controles para el analisis FACS, se incluyeron tres ratones de la misma camada de tipo silvestre para el transgen IGKV1-39 humano/Ckappa de rata y heterocigotos para el transgen CD19-Cre en un fondo C57BL6 (CD19-Cre) y dos ratones C57BL6/NTac (Ts). Se permitio que todos los animales se aclimatasen en la instalacion de animales durante 1 semana antes del analisis y todos los ratones eran machos y tenian 6 semanas de vida. Se aislaron linfocitos de los femures, bazos, cavidad peritoneal y sangre de los ratones usando tecnicas convencionales como se ha descrito previamente (Middendorp y col. (2002) J. Immunol. 168: 2695 y Middendorp y col. -(2004) J. Immunol. 172: 1371). Los anticuerpos se precombinaron como se muestra en la Tabla 10 y la tincion se realizo en placas de 96 pocillos. La incubacion con el anti-C kappa de rata conjugado con PE (descrito anteriormente) se realizo antes de la tincion con los anticuerpos anti-murinos de rata para impedir la union no especifica. Despues de finalizar la tincion celular, las celulas marcadas se analizaron en un aparato FACS de Becton Dickinson LSR II y los datos adquiridos se analizaron con el programa informatico FlowJo (v6.4.7).

Los ratones transgenicos eran similares en cuanto a peso, aspecto y actividad a los ratones transgenicos. No se observaron importantes alteraciones anatomicas durante la extraccion de tejidos. No se observo ninguna diferencia en cuanto al numero de linfocitos B en medula osea (M0) y bazo (Tabla 11) ni en cuanto al numero de linfocitos B, linfocitos T y celulas mieloides en organos perifericos entre los ratones de tipo silvestre y transgenicos. Ademas, la frecuencia o proporcion de las celulas en las diferentes rutas de desarrollo de linfocitos no estaba alterada en los ratones transgenicos cuando se comparo con los ratones de tipo silvestre. Por tanto, en los ratones doble transgenicos (HuVk1/CD19-Cre) y transgenicos (CD19-Cre) el desarrollo de organos linfoides y lo que es mas importante de linfocitos B no podia distinguirse de los ratones de tipo silvestre.

En organos linfoides perifericos, la tincion con el anticuerpo especifico de transgen (anti-Ckappa de rata-PE) solo se observo en las poblaciones de linfocitos B. Todas las poblaciones de linfocitos T, de celulas mieloides y de linfocitos citoliticos (NK) fueron negativas para la expresion en superficie del transgen en el bazo (Figura 23). En cambio, en las celulas tefidas con los marcadores de linfocitos B pan B220 y CD 19 todas las celulas se desplazaron hacia la derecha en la grafica FACS indicando expresion en la superficie celular del transgen (Figura 24). Se midio una tincion especifica de transgen similar en linfocitos B1 CD5+ del peritoneo, una poblacion distinta desde el punto de vista evolutivo de los linfocitos B (Figura 25).

24 5

La diferenciacion de linfocitos B de precursores multilinaje de linfocitos B maduros se produce en la medula osea. En los linfocitos analizados de la medula osea, la expresion extracelular y transgenica no fue detectable en los progenitores mas precoces de linfocitos B, los pro-y pre- linfocitos, coherente con el patron de expresion de cadena ligera normal (Figura 26). La expresion transgenica se vuelve primero detectable en linfocitos B inmaduros, la fase de desarrollo en la que cadena ligera murina de la linea germinal experimenta reordenamiento y se expresa en la superficie celular en el contexto de la cadena pesada preseleccionada (Figura 26). Coherente con la tincion en la expresion de la cadena ligera transgenica en bazo esta tambien se detecta en linfocitos B recirculantes maduros (Figura 26). Por tanto, la expresion dirigida por CD19-Cre del transgen es coherente con el patron normal de expresion de cadena ligera. La tincion con el anticuerpo especifico de cadena ligera endogena es mas intensa que la del anticuerpo de cadena ligera especifico de transgen. Esto puede indicar un nivel de expresion mas alto de la cadena ligera endogena, una tincion mas sensible con el anticuerpo especifico de cadena ligera endogena o una combinacion de ambas cosas. Cabe destacar que, la intensidad de la expresion en superficie de la cadena ligera transgenica se correlaciona con la expresion tanto de la cadena ligera endogena como con la de la superficie de IgM como se observa en la tincion de linfocitos B circulantes en la sangre (Figura 27).

Por tanto, en conjunto este analisis demuestra que la expresion del transgen IGKV1-39/Ckappa humano esta restringida al compartimento de linfocitos B y la regulacion temporal de su expresion es similar a la de las cadenas ligeras kappa y lambda endogenas que resultan en el desarrollo normal de todas las poblaciones de linfocitos B. El nivel de expresion aparente mas bajo del transgen podria explicarse por la fuerza del promotor en comparacion con el promotor y potenciadores presentes en los genes de cadena ligera endogena o por un retraso en la expresion del transgen que otorga a las cadenas ligeras endogenas una ventaja competitiva en el emparejamiento con la cadena pesada reordenada. Esto es coherente con la observacion de que a medida que los linfocitos B maduran la intensidad relativa de la tincion del transgen aumenta en comparacion con las cadenas ligeras endogenas. Ademas, la observacion de que los numeros de linfocitos B son normales y que cada linfocito B Ig+ de superficie co-expresa una cadena ligera endogena y transgenica refuerza la conclusion de que la region variable IGKV1-39 es capaz de emparejarse con un repertorio normal de regiones variables de cadena pesada murina diferentes. A partir de este analisis se llega a la conclusion de que la insercion del transgen IGKV1-39/Ckappa de rata dirigida por el promotor CAGGS activado por CD19-Cre en el locus Rosa facilita la expresion especifica y oportuna de linfocitos B del transgen y que el transgen es capaz de emparejarse con un repertorio normal de cadenas pesadas murinas.

Ejemplo 19

Perfil epitopico de linfocitos T Epibase® para IGKV1-39.

La secuencia proteica de IGKV1-39 (figura 12, Proteina IGKV1-39/J de la linea germinal humana) se examino para determinar la presencia de supuestos epitopes restringidos a HLA de clase II, conocidos tambien como epitopes TH. Para esto, se aplico la plataforma Epibase® de Algonomics a IGKV1-39. En resumen, la plataforma analiza las especificidades de union a HLA de todos los posibles peptidos de 10 oligomeros derivados de una secuencia diana (Desmet y col. Nature 1992, 356: 539-542; Desmet y col. FASEB J. 1997, 11: 164-172; Desmet y col. Proteins 2002,

48: 31-43; Desmet y col. Proteins 2005, 58: 53-69). El perfilado se realiza a nivel alotipico para 20 DRB1, 7 DRB3/4/5, 13 DQ y 7 DP, es decir, 47 receptores de HLA de clase II en total (vease la Tabla 5). Epibase® calcula una estimacion cuantitativa de la energia de union libre ΔGunion de un peptido para cada uno de los 47 receptores de HLA de clase II. Estos datos se procesaron adicionalmente de la siguiente manera:

•: Las energias libres se convirtieron a valores Kd a traves de ΔGunion = TR ln(Kd).

•: Los peptidos se clasificaron como fuertes (F), medios (M) debiles y no aglutinantes (N). Se aplicaron los siguientes limites:

S: aglutinante fuerte: Kd 0,1 μM.

M: aglutinante medio: 0,1 μM ≤ Kd lt; 0,8 μM.

N: aglutinante debil y no aglutinante: 0,8 μM ≤ Kd.

• Los peptidos correspondientes a auto-peptidos se trataron independientemente. La lista de auto-peptidos se extrajo de secuencias de la linea germinal de 293 anticuerpos. Estos se denominan peptidos ,depurados por la linea germinal'.

Los peptidos S- y M- se mapearon sobre la secuencia diana en mapas denominados epitopicos; las afinidades de S se representaron graficamente de modo cuantitativo; los valores de M se presentan de modo cualitativo. Como una vision general de los resultados, la Tabla 6 indica el numero de aglutinantes fuertes y medios en las proteinas analizadas, para los grupos de receptores de HLA de clase II correspondientes a los genes DRB1, DQ, DP y DRB3/4/5. El recuento se realizo individualmente para los aglutinantes de afinidad fuerte y media. Los peptidos de union a alotipos multiples del mismo grupo se contaron como uno. Los valores entre corchetes se refieren a peptidos depurados por la linea germinal. En la Tabla 7, la secuencia se muestra en un formato adecuado para el trabajo experimental. La secuencia se desglosa en 15 oligomeros (15 meros) que se solapan por 12 restos. Se indica la promiscuidad (el numero de alotipos de un total de 47 para el cual los 15 meros contienen un aglutinante critico) de cada uno de los 15 meros, asi como los serotipos implicados. El perfil Epibase® y los mapas epitopicos se muestran en las figuras 16 y 17.

25 5

Se llego a la conclusion de que IGKV1-39 no contenia aglutinantes DRB1 no-propios fuertes. Tipicamente, de manera significativa, se encontraron mas aglutinantes para DBR1 que para otros genes HLA. Esto concuerda con la confirmacion experimental de que los alotipos que pertenecen al grupo DRB1 son aglutinantes peptidicos mas potentes. Se espera que los epitopes de fuerza media para los alotipos de DBR1 contribuyan a la respuesta de la poblacion y no pueden pasarse por alto. De nuevo, no se encontraron aglutinantes DBR1 no-propios en IGKV1-39. En la respuesta humoral suscitada contra un antigeno, la activacion/proliferacion de linfocitos TH observada se interpreta generalmente en terminos de especificidad de DRB1. Sin embargo, no puede ignorarse la posible contribucion de los genes DRB3/4/5, DQ y DP. Dados los niveles de expresion mas bajos de estos genes en comparacion con DRB1, el enfoque fue sobre la clase de epitopes fuertes para DRB3/4/5, DQ y DP. Los ,epitopes criticos' son aquellos epitopes que son fuertes aglutinantes para cualquier alotipo de DRB1, DRB3/4/5, DQ o DP o son aglutinantes medios para DRB1. IGKV1-39 no contiene aglutinantes no-propios fuertes o medios para DRB3/4/5, DQ, o DP.

Diversos peptidos tambien estan presentes en las secuencias de la linea germinal (valores entre corchetes en la Tabla 6). Dichos peptidos pueden unirse muy bien a HLA pero se supone que son propios y, por tanto, no inmunogenicos. En total, en IGKV1 se encontraron 6 aglutinantes DRB1 depurados por la linea germinal fuertes y 16 aglutinantes DRB1 depurados por la linea germinal medios. La region marco conservada 1 hasta la region marco conservada 3 es una concordancia exacta para el segmento V de la linea germinal VKI 2-1-(1) 012 (VBase), tambien conocido como IGKV1-39*01 (IMGT). La region marco conservada 4 es una concordancia exacta para el segmento-J JK1 de la linea germinal JK1 (V-base) tambien conocido como IGKJ1*01(IMGT). No resulta sorprendente que estos segmentos no contengan ningun epitope no-propio.

Ejemplo 20

Caracteristicas de produccion de IGKV1-39

Existe una gran demanda de plataformas de descubrimiento de anticuerpos que produzcan anticuerpos terapeuticos que sean termodinamicamente estables y proporcionen buenos rendimientos de expresion. Estas caracteristicas son importantes para garantizar la estabilidad de la sustancia farmacologica durante la produccion y despues de la inyeccion del producto farmacologico en el paciente. Ademas, una buena expresion produce un impacto directamente sobre el coste de la fabricacion del farmaco y por tanto en el precio, acceso al paciente y rentabilidad. Practicamente todos los anticuerpos terapeuticos en uso clinico actual estan compuestos de regiones constantes kappa e IgG1 humana pero usan regiones variables de cadena pesada y ligera diferentes que confieren especificidad. Los dominios de cadena ligera y cadena variable humana pueden dividirse en familias que tienen divergencia de secuencias mayor del 80 %. Cuando se combinan ejemplos reordenados de estas familias en la configuracion de la linea germinal y se compara la estabilidad y produccion es obvio que las familias de genes no son iguales en cuanto a propiedades biofisicas. En particular VH3, VH1 y VH5 tienen estabilidad favorable para las cadenas pesadas y Vk1 y Vk3 tienen la mejor estabilidad y produccion de cadenas ligeras. Ademas, cuando se introducen mutaciones como parte del proceso de hipermutacion somatica estas pueden interferir con el emparejamiento de VH/VL. Para evaluar el efecto que diferentes genes de cadena ligera con diferentes tasas de mutacion tiene sobre las caracteristicas de produccion de una cadena VH fija, se construyo una biblioteca de presentacion de fagos Fab de cadenas ligeras (kappa y lambda) de seis donantes sanos sin tratar combinada con un panel de 44 cadenas pesadas de union a TT de donantes inmunizados. Despues de una ronda de seleccion se aislaron clones Fab de union a TT. Muchos de estos compartian el mismo gen VH que el del clon TT PG1433 en combinacion con diferentes cadenas ligeras. Los fragmentos de cadena ligera Fab se reclonaron en un vector de expresion kappa y se transfectaron en combinacion con ADN que codificaba la cadena pesada de PG1433 en celulas 293 y la produccion especifica de IgG se midio por ELISA. Como se demuestra en la tabla 8 los clones seleccionados que contienen VH PG1433 combinado con diferentes cadenas ligeras tenian entre 5 y 10 veces una expresion de proteinas mas baja que VH PG1433 combinado con IGKV1-39. 0bservese que todas las cadenas ligeras contenian mutaciones de aminoacidos en sus regiones codificantes que podrian alterar el emparejamiento de VH y reducir la estabilidad en produccion. Por tanto, ademas de reducir los cambios inmunogenicidad no deseados, se espera que el uso de IGKV1-39 de cadena ligera sin mutaciones contribuya a una estabilidad de produccion y a rendimientos mejorados de diversos genes VH que contribuyen con diversa especificidad. Por supuesto, clones estables por transfeccion de genes VH diferentes todos emparejados con IGKV1-39 pueden realizar pases ampliamente y aun conservar caracteristicas de produccion fuertes como se muestra en la tabla 9.

Ejemplo 21

Generacion de ratones que expresan regiones VH y VL completamente humanas.

Se cruzaron ratones transgenicos con ratones que ya contenian un locus VH humano. En Taylor y col. (1992). Nucleic Acids Res 20: 6287-95; Lonberg y col. (1994). Nature 368: 856-9; Green y col. (1994). Nat Genet 7: 13-21; Dechiara y col. (2009). Methods Mol Biol 530: 311-24) se describen ejemplos de ratones apropiados que contienen un locus VH humano. Despues de cruzar y seleccionar ratones que son al menos heterocigotos para el transgen IGKV1-39 y el locus VH humano, los ratones seleccionados se inmunizaron con una diana. Los genes VH se recogieron como se ha descrito anteriormente en el presente documento. Este procedimiento tiene la ventaja de que los genes VH ya son completamente humanos y por tanto no requieren humanizacion.

26 5

Ejemplo 22

Aislamiento, caracterizacion, formateo con 0ligoclonics y produccion de anticuerpos que se dirigen a IL6 humana para el tratamiento de enfermedades inflamatorias cronicas tales como artritis reumatoide.

Un repertorio de VH de bazo de ratones transgenicos que se inmunizaron con IL6 recombinante humana se clono en un vector Fab de presentacion de fagos con una sola cadena ligera kappa IGKV1-39-C humana (identica a la del transgen de raton) y se sometio a seleccion contra la IL6 humana inmunogenica. Los clones que se obtuvieron despues de dos a cuatro rondas de seleccion se analizaron para determinar su especificidad de union. Los genes VH que codifican los fragmentos Fab especificos de IL6 se sometieron a analisis de secuencia para identificar clones unicos y asignar la utilizacion VH, DH y JH. Los fragmentos Fab se reformatearon como moleculas de IgG1 y se expresaron transitoriamente. Los clones unicos se agruparon despues basandose en ensayos de union no competitiva y se sometieron a analisis de afinidad y funcionales. Los mAb anti-IgG1 de IL6 mas fuertes se expresaron posteriormente como combinaciones de dos, tres, cuatro o cinco cadenas pesadas que comprendian diferentes regiones VH del formato 0ligoclonics, junto con una cadena ligera kappa basada en IGKV1-39-C y se sometio a ensayo in vitro para determinar la formacion de complejos con IL-6. Los 0ligoclonics tambien se sometieron a ensayo in vivo para la eliminacion de la IL-6 humana de los ratones. Se selecciono un 0ligoclonics con la actividad de eliminacion mas fuerte y los genes VH murinos se humanizaron de acuerdo con procedimientos convencionales. La IgG1 humanizada se transfecto en una linea de celulas de mamifero para generar un clon estable. Se selecciono un subclon optimo para la generacion de un banco de celulas maestro y la generacion de material de ensayo clinico. Muchos de los protocolos descritos en el presente documento son protocolos convencionales para la construccion de bibliotecas de presentacion de fagos y la seleccion de fagos para la union a un antigeno de interes y tambien se describen, por ejemplo, en Antibody Phage Display: Methods and Protocols. 2002. Editor(s): Philippa M. 0'Brien, Robert Aitken. Humana Press, Totowa, New Jersey, Estados Unidos.

Inmunizaciones

Ratones transgenicos recibieron tres inmunizaciones con IL6 humana cada dos semanas usando el adyuvante Sigma titerMax de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Aislamiento de ARN y sintesis de ADNc

Tres dias despues de la ultima inmunizacion, se extirparon los bazos y los ganglios linfaticos de los ratones y se hicieron pasar a traves de un filtro de 70 micrometros en un tubo que contenia PBS pH 7,4 para generar una suspension de celulas sencillas. Despues de lavar y sedimentar los linfocitos, las celulas se suspendieron en Reactivo TRIzol LS (Invitrogen) para el aislamiento de ARN total de acuerdo con el protocolo del fabricante y se sometio a reaccion de transcripcion inversa usando 1 microgramo de ARN, Superscript III RT en comparacion con dT20 de acuerdo con los procedimientos del fabricante (Invitrogen).

La generacion de bibliotecas de presentacion de fagos Fab se realizo como se describe en el Ejemplo 2.

Seleccion de fagos en inmunotubos revestidos

La IL6 recombinante humana se disolvio en PBS en una concentracion de 5 μg/ml y se aplico a Tubos MaxiSorp Nunc-Immuno (Nunc 444474) durante una noche a 4 DC. Despues de desechar la solucion de revestimiento, los tubos se bloquearon con leche desnatada (ELK) al 2% en PBS (tampon de bloqueo) durante 1 hora a Temperatura Ambiente (TA). En paralelo, 0,5 ml de la biblioteca de fagos se mezclo con 1 ml de tampon de bloqueo y se incubo durante 20 minutos a temperatura ambiente. Despues de bloquear los fagos, la solucion de fagos se afadio a los tubos revestidos con IL6 y se incubo durante 2 horas a TA en una plataforma rotatoria lenta para permitir la union. A continuacion, los tubos se lavaron 10 veces con PBS/Tween-20 al 0,05 % seguido de elucion de los fagos incubando con 1 ml de glicina-HCl 50 mM pH 2,2 durante 10 min a TA en una rueda giratoria y directamente seguido de neutralizacion del eluyente recogido con 0,5 ml de Tris-HCl 1 M pH 7,5.

Recogida de clones de fagos

A la solucion de fagos recogida se afadio un cultivo de 5 ml de XL1-Blue MRF (Stratagene) a una D.0. de 0,4 y se incubo durante 30 minutos a 37 DC sin agitacion para permitir la infeccion de los fagos. Las bacterias se sembraron en placas de 2*TY con Carbenicilina/Tetraciclina glucosa al 4 % y se cultivaron durante una noche a 37 DC.

Produccion de fagos.

Los fagos se cultivaron y procesaron como describen Kramer y col. 2003 (Kramer y col. 2003. Nucleic Acids Res. 31(11): e59) usando VCSM13 como cepa de fago auxiliar.

ELISA para fagos

Se revistieron placas de ELISA con 100 microlitros de IL6 recombinante humana por pocillo a una concentracion de 2,5 microgramos/ml en PBS durante una noche a 4 DC. Las placas se revistieron con 100 microlitros de tiroglobulina a una concentracion de 2 microgramos/ml en PBS y se usaron como un control negativo. Los pocillos se vaciaron,

27 5

se secaron golpeteando sobre una toallita de papel, se cargaron completamente con PBS-leche desnatada al 4 % (ELK) y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente para bloquear los pocillos. Despues de desechar la solucion de bloqueo, las minipreparaciones de fagos se premezclaron con solucion de bloqueo 50 μl afadida y se incubaron durante 1 hora a TA. Los fagos no unidos se retiraron posteriormente mediante 5 etapas de lavado con PBS-Tween-20 al 0,05 %. Los fagos unidos se detectaron incubando los pocillos con 100 microlitros de anticuerpo anti-M13 conjugado con HRP (diluido 1/5000 en tampon de bloqueo) durante 1 hora a temperatura ambiente. Los anticuerpos libres se retiraron repitiendo las etapas de lavado como se ha descrito anteriormente, seguido por incubacion con sustrato TMB hasta que fue visible el desarrollo del color. La reaccion se detuvo afadiendo 100 microlitros de H2S04 2 M por pocillo y se analizo en un lector ELISA a una longitud de onda de emision 450 nm.

Secuenciacion

Los clones que dieron sefales al menos 3 veces por encima de la sefal de fondo se propagaron, se usaron para procedimientos miniprep ADN (vease el manual de procedimientos miniPrep de Qiagen) y se sometieron a analisis de secuencia de nucleotidos. La secuenciacion se realizo de acuerdo con el manual adjunto al kit Big Dye 1.1 (Applied Biosystems) usando un cebador inverso (CH1 Rev1, tabla 1) que reconoce una secuencia 5' de la region CH1 de la cadena pesada IgG1 humana (presente en el vector de presentacion Fab MV1043, figuras 3 y 12). Las secuencias de las regiones VH murinas se analizaron con respecto a la diversidad de los segmentos de los genes DH y JH.

Construccion y expresion de IgG1 quimerica

Se genero el vector MV1057 (figuras 12 y 22) por clonacion del fragmento transgenico de cadena L (IGKV1-39) en un derivado del vector pcDNA3000Neo (Crucell, Leiden, Paises Bajos) que contenia las regiones constantes kappa e IgG1 humana. Las regiones VH se clonaron en MV1057 y las secuencias de nucleotidos de todas las construcciones se verificaron de acuerdo con tecnicas convencionales. Las construcciones resultantes se expresaron transitoriamente en celulas HEK293T y usando procedimientos convencionales como se ha descrito anteriormente (Throsby, M. 2006. J Virol 80: 6982-92) se obtuvieron y purificaron los sobrenadantes que contenian la IgG1 quimerica.

Union a IgG1 y analisis de competencia

Los anticuerpos IgG1 se titularon en ELISA usando placas revestidas con IL6, como se ha descrito anteriormente, y un anti-IgG humano conjugado con peroxidasa. Se realizaron ensayos ELISA de competencia para agrupar anticuerpos basandose en el reconocimiento epitopico, incubando fagos Fab junto con IgG1 o con anticuerpos comerciales contra IL6 (por ejemplo Abcam cat. ND ab9324) en placas revestidas con IL6, seguido por la deteccion de los fagos Fab unidos usando un anti-M13 conjugado con peroxidasa

Mediciones de afinidad de IgG1

Las afinidades de los anticuerpos contra IL6 se determinaron con el protocolo cinetico cuantitativo del 0ctet (ForteBio). Los anticuerpos se capturaron sobre un biodetector de Captura Fc Anti-IgG Humano y se expusieron a IL6 libre y se analizaron usando un programa informatico patentado para calcular el valor de la Kd de cada anticuerpo.

Actividad funcional de los anticuerpos IL6

Para ensayar la capacidad de los anticuerpos seleccionados para inhibir la union entre IL6 y el receptor de IL6 (IL6R), se uso un ensayo basado en ELISA. Diversas concentraciones de anticuerpos se mezclaron con una concentracion fija (10 ng/ml) de IL6 marcada con biotina descrito por Naoko y col. 2007, Can. Res. 67: 817-875. El complejo inmunitario anticuerpo-IL6 se afadio al IL6R inmovilizado. La union de IL6 marcada con biotina a IL6R se detecto con estreptavidina conjugada con peroxidasa de rabano picante. La reduccion de la sefal ELISA es una medicion de la inhibicion. Como control positivo para la inhibicion de la union entre IL6 e IL6R se uso cualquiera de anticuerpo anti-IL6R (Abcam cat. ND ab34351; clon B-R6) o anticuerpo anti-IL6 (Abcam cat. ND ab9324). La actividad bloqueante in vitro de los anticuerpos anti-IL6 seleccionados se midio en un ensayo de proliferacion usando la linea celular 7TD1 dependiente de IL6. En resumen, las celulas se incubaron con diferentes concentraciones de IL6 humana con o sin el anticuerpo anti-IL6. La cantidad disponible de IL6 determina el grado de proliferacion. Por tanto si un anticuerpo afadido bloquea la union de IL6 la lectura de proliferacion se reduce en comparacion con un control de anticuerpo no unido. La proliferacion se mide por la incorporacion de 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU) al ADN usando el kit de proliferacion BrdU (Roche cat. ND. 11444611001) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Generacion de 0ligoclonics anti-IL6

Se seleccionaron los anticuerpos anti-IL6 mas potentes de cada grupo epitopico. Las construcciones de expresion que expresaban estos anticuerpos se transfectaron en celulas HEK293T en grupos de tres no competidores en diferentes proporciones (1:1:1; 3:1:1; 1:3:1; 1:1:3; 3:3:1; 1:3:3; 3:1:3; 10:1:1; 1:10:1; 1:1:10; 10:10:1; 1:10:10; 10:1:10; 3:10:1; 10:3:1; 1:10:3; 3:1:10; 10:1:3; 1:3:10). Los sobrenadantes que contenian anticuerpos se recogieron, se purificaron y se caracterizaron como se ha indicado anteriormente.

Formacion de complejos y eliminacion in vivo de 0ligoclonics anti-IL6

Para medir la capacidad de 0ligoclonics anti-IL6 para formar complejos inmunitarios y analizar estos complejos se uso Cromatografia de Exclusion por Tamafo (SEC) de acuerdo con la estrategia desvelada por Min-Soo Kim y col. (2007) JMB 374: 1374-1388 para caracterizar los complejos inmunitarios formados con diferentes anticuerpos contra 5 TNFα. Se mezclaron diferentes proporciones molares de los 0ligoclonics anti-IL6 con IL6 humana y se incubaron durante 20 horas a 4 DC o 25 DC. La mezcla se analizo en un sistema HPLC ajustado con una columna de exclusion por tamafo; se correlacionaron tiempos de elucion diferentes con peso molecular usando patrones de peso molecular. La capacidad de los anticuerpos para formar complejos con IL6 se correlaciona con su capacidad para eliminar rapidamente la citocina de la circulacion in vivo. Esto se confirma midiendo la eliminacion de IL6 10 radiomarcada de ratones. En resumen, se obtuvieron hembras Balb/c de 6 a 8 semanas de vida y 18 horas antes del experimento, a los animales se les inyecto por via intravenosa (IV) en la vena lateral de la cola diferentes dosis de 0ligoclonics anti-IL6 purificado. El dia 0 los ratones recibieron una inyeccion IV de 50 microlitros de IL6 radiomarcada (1x10E7 cpm/ml) en las mismas condiciones. Se extrajeron muestras de sangre (aproximadamente 50 microlitros) a diversos intervalos de tiempo y se conservaron a 4 DC. Las muestras se centrifugaron durante 5

15 minutos a 4000 x g y se determino la radioactividad del suero. Todos los experimentos farmacocineticos se realizaron simultaneamente con tres animales por cada tratamiento.

Generacion de clones estables 0ligoclonics anti-IL6 y desarrollo preclinico

Se selecciono un 0ligoclonic anti-IL6 lider basandose en la potencia in vitro e in vivo como se ha determinado anteriormente. Los genes VH murinos se humanizaron de acuerdo con procedimientos convencionales y se 20 combinaron con la cadena ligera IGKV1-39 completamente humana en un vector de expresion como se ha descrito anteriormente. Los ejemplos de procedimientos de humanizacion incluyen aquellos basados en paradigmas tales como reaparicion (Padlan, E. A., y col., (1991). Mol. Immunol., 28, 489), superhumanizacion (Tan, P., D. A., y col., (2002) J. Immunol., 169, 1119) y optimizacion del contenido de cadenas humanas (Lazar, G. A., y col., (2007). Mol. Immunol., 44, 1986). Las tres construcciones se transfectaron en celulas PER.C6 a la proporcion optima

25 predeterminada (descrita anteriormente) a presion selectiva de G418 de acuerdo con procedimientos convencionales. Se selecciono un clon 0ligoclonic anti-IL6 de produccion altamente estable y se genero un banco de trabajo y cualificado de celulas maestro.

Tabla 1 Listado de cebadores

D0-: Cebador Secuencia

0012: CH1 Rev1 TGCCAGGGGGAAGACCGATG

0656: MVH-1 GCCGGCCATGGCCGAGGTRMAGCTTCAGGAGTCAGGAC

0657: MVH-2 GCCGGCCATGGCCGAGGTSCAGCTKCAGCAGTCAGGAC

0658: MVH3 GCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGAAGSASTCAGG

0659: MVH-4 GCCGGCCATGGCCGAGGTGCAGCTTCAGGAGTCSGGAC

0660: MVH-5 GCCGGCCATGGCCGARGTCCAGCTGCAACAGTCYGGAC

0661: MVH-6 GCCGGCCATGGCCCAGGTCCAGCTKCAGCAATCTGG

0662: MVH-7 GCCGGCCATGGCCCAGSTBCAGCTGCAGCAGTCTGG

0663: MVH-8 GCCGGCCATGGCCCAGGTYCAGCTGCAGCAGTCTGGRC

0664: MVH-9 GCCGGCCATGGCCCAGGTYCAGCTYCAGCAGTCTGG

0665: MVH-10 GCCGGCCATGGCCGAGGTCCARCTGCAACAATCTGGACC

0666: MVH-11 GCCGGCCATGGCCCAGGTCCACGTGAAGCAGTCTGGG

0667: MVH-12 GCCGGCCATGGCCGAGGTGAASSTGGTGGAATCTG

0668: MVH-13 GCCGGCCATGGCCGAVGTGAAGYTGGTGGAGTCTG

0669: MVH-14 GCCGGCCATGGCCGAGGTGCAGSKGGTGGAGTCTGGGG

0670: MVH-15 GCCGGCCATGGCCGAKGTGCAMCTGGTGGAGTCTGGG

0671: MVH-16 GCCGGCCATGGCCGAGGTGAAGCTGATGGARTCTGG

0672: MVH-17 GCCGGCCATGGCCGAGGTGCARCTTGTTGAGTCTGGTG

0673: MVH-18 GCCGGCCATGGCCGARGTRAAGCTTCTCGAGTCTGGA

29 (continuacion)

D0-: Cebador Secuencia

0674: MVH-19 GCCGGCCATGGCCGAAGTGAARSTTGAGGAGTCTGG

0675: MVH-20 GCCGGCCATGGCCGAAGTGATGCTGGTGGAGTCTGGG

0676: MVH-21 GCCGGCCATGGCCCAGGTTACTCTRAAAGWGTSTGGCC

0677: MVH-22 GCCGGCCATGGCCCAGGTCCAACTVCAGCARCCTGG

0678: MVH-23 GCCGGCCATGGCCCAGGTYCARCTGCAGCAGTCTG

0679: MVH-24 GCCGGCCATGGCCGATGTGAACTTGGAAGTGTCTGG

0680: MVH-25 GCCGGCCATGGCCGAGGTGAAGGTCATCGAGTCTGG

0681: ExtMVH-1 CAGTCACAGATCCTCGCGAATTGGCCCAGCCGGCCATGGCCSANG

0682: ExtMVH-2 CAGTCACAGATCCTCGCGAATTGGCCCAGCCGGCCATGGCCSANC

0683: MJH-Rev1 GGGGGTGTCGTTTTGGCTGAGGAGAC GGTGACC GTGG

0684: MJH-Rev2 GGGGGTGTCGTTTTGGCTGAGGAGAC TGTGAGA GTGG

0685: MJH-Rev3 GGGGGTGTCGTTTTGGCTGCAGAGAC AGTGACC AGAG

0686: MJH-Rev4 GGGGGTGTCGTTTTGGCTGAGGAGAC GGTGACT GAGG

0687: ExtMJH- GGGGGTGTCGTTTTGGCTGAGGAGAC GGTGACC GTGG

0688: ExtMJH- GGGGGTGTCGTTTTGGCTGAGGAGAC GGTGACA GTGG

0690: ExtMJH- GGGGGTGTCGTTTTGGCTGAGGAGAC GGTGACC AGAG

0691: ExtMJH- GGGGGTGTCGTTTTGGCTGAGGAGAC GGTGACC GAGG

Tabla 2

Niveles de sefal ELISA de fagos medido a 450 nm. Placas revestidas con TT representan placas que se revistieron

con toxoide tetanico. Las placas revestidas con tiroglobulina se usaron como controles negativos. 10/10 y 15/15 5 indica el numero de etapas de lavado con PBS-Tween durante procesos de seleccion. El toxoide tetanico 10/10 y las

placas de tiroglobulina 10/10 y el toxoide tetanico 15/15 y las placas de tiroglobulina 15/15 son duplicados entre si

excepto para el agente de revestimiento. Los valores de D0 mayores de 3 veces el fondo se supone que son

especificos.

Lavados de placa revestida con TT 10/10

1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112

A 0,139 0,093 0,089 0,121 0,117 0,598 0,146 0,115 0,18 0,155 0,543 0,601

B 0,136 0,404 0,159 0,187 0,489 0,134 0,216 0,092 0,222 0,108 0,181 0,484

C 0,197 0,526 0,09 0,213 0,395 0,155 0,108 0,12 0,183 0,136 0,092 0,866

D 0,143 0,258 0,101 0,422 0,088 0,243 0,485 0,251 0,304 0,198 0,478 0,091

E 0,445 0,169 0,526 0,481 0,206 0,285 0,111 0,119 0,128 0,2 0,118 0,098

F 0,237 0,291 0,594 0,139 0,206 0,565 0,543 0,091 0,136 0,227 0,228 0,099

G 0,459 0,102 0,152 0,659 0,203 0,452 0,152 0,133 0,094 0,102 0,375 0,098

H 0,341 0,623 0,745 0,415 0,682 0,527 0,655 0,114 0,258 0,284 0,685 0,113

Lavados de placa revestida con TT 15/15

1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112

A 0,247 0,582 0,421 0,428 0,133 0,082 0,262 0,079 0,343 0,414 0,095 0,292

B 0,065 0,364 0,073 0,042 0,049 0,071 0,046 0,103 0,078 0,057 0,048 0,155

C 0,081 0,044 0,066 0,082 0,225 0,444 0,203 0,362 0,122 0,047 0,052 0,309

D 0,092 0,11 0,59 0,22 0,33 0,544 0,058 0,159 0,047 0,174 0,086 0,05

E 0,469 0,577 0,206 0,304 0,13 0,749 0,431 0,062 0,167 0,049 0,056 0,049

F 0,846 0,07 0,561 0,656 0,882 0,094 0,383 0,13 0,152 0,098 0,134 0,048

G 0,537 0,052 0,49 0,105 0,337 0,193 0,514 0,294 0,068 0,35 0,525 0,05

H 0,061 0,306 0,157 0,853 0,054 0,534 0,102 0,235 0,441 0,412 0,565 0,061

30 (continuacion)

Lavados de placa revestida con tiroglobulina 10/10

1: 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A: 0,047 0,051 0,045 0,043 0,051 0,044 0,046 0,042 0,047 0,048 0,049 0,05

B: 0,042 0,042 0,042 0,042 0,043 0,041 0,041 0,042 0,043 0,045 0,042 0,046

C: 0,044 0,043 0,043 0,044 0,043 0,044 0,043 0,042 0,043 0,041 0,044 0,046

D: 0,045 0,044 0,044 0,044 0,045 0,046 0,045 0,056 0,045 0,049 0,048 0,73

E: 0,046 0,045 0,046 0,044 0,045 0,044 0,044 0,044 0,047 0,046 0,047 0,926

F: 0,048 0,045 0,044 0,046 0,044 0,043 0,044 0,046 0,046 0,046 0,046 0,792

G: 0,051 0,048 0,045 0,045 0,044 0,043 0,048 0,045 0,048 0,051 0,045 0,053

H: 0,064 0,05 0,049 0,047 0,05 0,051 0,047 0,046 0,047 0,047 0,047 0,056

Lavados de placa revestida con tiroglobulina 15/15

1: 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A: 0,036 0,049 0,045 0,044 0,046 0,047 0,046 0,042 0,042 0,043 0,042 0,041

B: 0,045 0,042 0,041 0,043 0,043 0,043 0,045 0,045 0,047 0,048 0,044 0,045

C: 0,049 0,047 0,047 0,046 0,046 0,046 0,045 0,047 0,046 0,045 0,045 0,052

D: 0,047 0,049 0,046 0,048 0,048 0,048 0,047 0,052 0,048 0,046 0,048 0,456

E: 0,049 0,047 0,047 0,047 0,047 0,049 0,047 0,048 0,047 0,046 0,048 0,412

F: 0,05 0,047 0,046 0,046 0,046 0,046 0,046 0,046 0,046 0,047 0,048 0,528

G: 0,05 0,048 0,045 0,045 0,046 0,049 0,048 0,046 0,053 0,049 0,05 0,057

H: 0,057 0,05 0,046 0,045 0,047 0,049 0,047 0,047 0,046 0,047 0,053 0,048

Tabla 3

Analisis de secuencia de proteinas de aglutinantes del toxoide tetanico positivos a ELISA. Se indican las secuencias de CDR3, la longitud de CDR3, los miembros y el nombre especifico de la familia VH, el origen de JH y el origen de DH de los clones .

CDR3: longitud de CDR3 VH DH JH familia del gen V

HGAYYTYDEKAWFAY: 15 musIGHV192 DSP2.11 JH3 de raton VH7183

HGAYYTYDEKAWFAY: 15 musIGHV192 DSP2.11 JH3 de raton VH7183

HGAYYTYDEKAWFAY: 15 musIGHV192 DSP2.11 JH3 de raton VH7183

HGAYYTYDEKAWFAY: 15 musIGHV192 DSP2.11 JH3 de raton VH7183

HGAYYTYDEKAWFAY: 15 musIGHV192 DSP2.11 JH3 de raton VH7183

HGAYYTYDEKAWFAY: 15 musIGHV192 DSP2.11 JH3 de raton VH7183

HGAYYTYDEKAWFAY: 15 musIGHV192 DP2.11 JH3 de raton VH7183

HGAYYTYDEKAWFAY: 15 musIGHV192 DSP2.11 JH3 de raton VH7183

HGAYYTYDEKAWFAY: 15 musIGHV192 DSP2.11 JH3 de raton VH7183

HGAFYTYDEKPWFAY: 15 musIGHV192 IGHD2-14*01 JH3 de raton VH7183

HISYYRYDEEVSFAY: 15 musIGHV192 IGHD2-14*01 JH3 de raton VH7183

HISYYRYDEEVSFAY: 15 musIGHV192 IGHD2-14*01 JH3 de raton VH7183

GWRAFAY: 7 musIGHV131 DSP2.9 JH3 de raton VH7183

GWRAFAY: 7 musIGHV131 DSP2.9 JH3 de raton VH7183

GWRAFAY: 7 musIGHV131 DSP2.9 JH3 de raton VH7183

DRGNYYGMDY: 10 musIGHV178 DSP2.1 JH4 de raton VH7183

LGDYYVDWFFAV: 12 musIGHV165 DFL16.1 JH1 de raton VH7183

NFPAWFAF: 8 musIGHV547 DST4.3inv JH3 de raton VJH558

NFPAWFAY: 8 musIGHV547 DSP2.1 JH3 de raton VJH558

NFPAWFVY: 8 musIGHV547 DSP2.1 JH3 de raton VJH558

SFTPVPFYYGYDWYFDV: 17 musIGHV532 DSP2.3 JH1 de raton VJH558

SFTPVPFYYGYDWYFDV: 17 musIGHV532 DSP2.3 JH1 de raton VJH558

SDYDWYFDV: 9 musIGHV286 DSP2.2 JH1 de raton VJH558

31 (continuacion)

CDR3: longitud de CDR3 VH DH JH familia del gen V

SDYDWYFDV: 9 musIGHV286 DSP2.2 JH1 de raton VJH558

DSKWAYYFDY: 10 musIGHV532 DST4.3 JH2 de raton VJH558

GDYTGYGMDY: 10 musIGHV125 DSP2.13 JH4 de raton VHSM7

GDYTGYGMDY: 10 musIGHV125 DSP2.13 JH4 de raton VHSM7

GGYDGYWFPY: 10 musIGHV125 DSP2.9 JH3 de raton VHSM7

Tabla 4

Combinaciones de vectores que se transfectaron a HEK293T.

C6digo: Vector HC vector LC vector combinado Nombre de la Prep. Concentraci6n ( g/ml)

A: x 0817676 pSELECT 0815426 (IGKV1-39) x PIGKV1-39/P1 -

B: x 0817678 pSELECT 0815427 (IGLV2-14) x PIGLV2-14/P1 -

C: MV1110 0817676 pSELECT 0815426 (IGKV1-39) x PMV1110/ IGKV1-39/P1 11,0

D: MV1110 0817678 pSELECT 0815427 (IGLV2-14) x PMV1110/ IGLV2-14/P1 15,4

E: x x MG1494 MG1494/P2 16,1

Tabla 5. Alotipos HLA considerados en el perfilado epitopico de TH. Se muestran los serotipos correspondientes, asi como las frecuencias alotipicas en la poblacion caucasica (Klitz y col. Tissue Antigens 2003, 62: 296-307; Gjertson y Terasake (eds) in: HLA 1997; Gjertson y Terasake (eds) en: HLA 1998; Castelli y col. J. Immunol. 2002, 169: 69286934). Las frecuencias pueden aumentar mas del 100 % dado que cada individuo tiene 2 alelos para cada gen. Si se conociesen todas las frecuencias alelicas de un solo gen, aumentaria a ligeramente menos del 200 % debido a individuos homocigotos.

Tipo HLA Serotipo Poblacion % Tipo HLA Serotipo Poblacion %

DRB1*0101 DR1 17,4 DRB4*0103 DR53 21 DRB1*0102 DR1 4,9 DRB5*0101 DR51 15,8 DRB1*0301 DR17(3) 21,2 DRB5*0202 DR51 5,7 DRB1*0401 DR4 11,5 DQA1*0101/DQB1*0501 DQ5(1) 20,5 DRB1*0402 DR4 3,1 DQA1*0102/DQB1*0502 DQ5(1) 2,6 DRB1*0404 DR4 5,5 DQA1*0102/DQB1*0602 DQ6(1) 26,5 DRB1*0405 DR4 2,2 DQA1*0102/DQB1*0604 DQ6(1) 6,7 DRB1*0407 DR4 lt;2 DQA1*0103/DQB1*0603 DQ6(1) 11 DRB1*0701 DR7 23,4 DQA1*0104/DQB1*0503 DQ5(1) 4 DRB1*0801 DR8 3,3 DQA1*0201/DQB1*0202 DQ2 20,9 DRB1*0802 DR8 lt;2 DQA1*0201/DQB1*0303 DQ9(3) 7,2 DRB1*0901 DR9 lt;2 DQA1*0301/DQB1*0301 DQ7(3) 12,5 DRB1*1101 DR11(5) 17 DQA1*0301/DQB1*0302 DQ8(3) 18,3 DRB1*1104 DR11(5) 5,7 DQA1*0401/DQB1*0402 DQ4 4,5 DRB1*1201 DR12(5) 3,1 DQA1*0501/DQB1*0201 DQ2 24,6 DRB1*1301 DR13(6) 15,4 DQA1*0501/DQB1*0301 DQ7(3) 20,9 DRB1*1302 DR13(6) 10,8 DPA1*0103/DPB1*0201 DPw2 199

(continuacion) Tipo HLA Serotipo Poblacion % Tipo HLA Serotipo Poblacion %

DRB1*1401 DR14(6) 4,2 DPA1*0103/DPB1*0401 DPw4 65,1 DRB1*1501 DR15(2) 13,2 DPA1*0103/DPB1*0402 DPw4 24,3 DRB1*1601 DR16(2) 5,5 DPA1*0201/DPB1*0101 DPw1 6,3 DRB3*0101 DR52 24,6 DPA1*0201/DPB1*0301 DPw3 lt;2 DRB3*0202 DR52 43 DPA1*0201/DPB1*0501 DPw5 lt;2 DRB3*0301 DR52 10 DPA1*0201/DPB1*0901 -2,4 DRB4*0101 DR53 25,5

Tabla 6. Recuentos epitopicos de TH para IGKV1-39. Los peptidos que se unen HLA multiples del mismo grupo (DRB1, DRB3/4/5, DP, DQ) se cuentan como uno. Los valores entre corchetes se refiere a peptidos depurados por la linea germinal.

DRB1 DRB3/4/5 DQ DP Fuerte Medio Fuerte Medio Fuerte Medio Fuerte Medio

0ligomeros de 0(+6) 0(+16) 0(+0) 0(+5) 0(+3) 0(+9) 0(+0) 0(+9) IGKVI-39

Tabla 7. Mapeo de predicciones Epibase® para oligomeros (Meros) de IGKV1-39 en el formato clasico de peptidos de 15 oligomeros (15-mer). Esta tabla muestra el recuento alotipico de epitopes criticos y serotipos implicados para cada uno de los 15 oligomeros que abarcan de la secuencia oligomerica de IGKV1-39.

15-mer Posicion de inicio Secuencia 15-mer Recuento

Serotipos implicados

alotipico

1 1 DIQMTQSPSSLSASV 6 DR1, DR4, DR7, DR9

2 4 MTQSPSSLSASVGDR 5 DR1, DR4, DR9

3 7 SPSSLSASVTGDRVTI 0

4 10 SLSASVGDRVTITCR 0

5 13 ASVGDRVTITCRASQ 0

6 16 GDRVTITCPASQSIS 2 DR11(5), DR7 DQ2 DR11(5),

7 19 VTITCRAS0SISSYL 4 DR4, DR7

8 22 TCRASQSISSYLNWY 2 DQ2, DR4 DR13(6),

DR15(2),

9 25 ASQSISSYLNWYQQR 5 DR4 DR12(5), DR13(6), DR15(2), DR16(2),

10 28 SISSYLNWYQQKPGK 8 DR4, DR8 DR1, DR12(5), DR16(2), DR4,

11 31 SYLNWYQQKPGKAPK 10 DR51, DR8, DR1, DR15(2),

12 34 NWYQQKPGKAPKLLI 9 DR4. DR51, DR8, DQ4, DR1, DR11 (5), DR15(2),

13 37 QQKPGKAPKLLIYAA 7 DR51, DR8, DQ4, DR1, DR11

14 40 PGKAPKLLIYAASSL 7 (5), DR4, DR8 DR1, DR11(5), DR12(5), DR13(6), DR14(6), DR15(2), DR4, DR51, DR8,

(continuacion) 15-mer Posicion de inicio Secuencia 15-mer Recuento Serotipos implicados alotipico

15 43 APKLLIYAASSLQSG 15 DR9 DR1, DR11(5), DR12(5), DR13(6), DR14(6), DR15(2), DR4, DR51, DR8,

16 46 LLIYAASSLQSGVPS 15 DR9 17 49 YAASSLQSGVPSRFS 1 DR15(2) 18 52 SSLQSGVPSRFSGSG 1 DR15(2) 19 55 QSGVPSRFSGSGSGT 0 20 58 VPSRFSGSGSGTDFT 0 21 61 RFSGSGSGTDFTLTI 0 22 64 GSGSGTDFTLTISSL 1 DR52,

DR4, DR52, DR7, 23 67 SGTDFTLTISSLQPE 4 DR9

DQ2, DR4, DR7, 24 70 DFTLTISSLQPEDFA 4 DR9 25 73 LTISSLQPEDFATYY 1 DQ2 26 76 SSLQPEDFATYYCQQ 0 27 79 QPEDFATYYCQQSYS 1 DR4 28 82 DFATYYCQQSYSTPP 5 DR4, DR51, DR7 29 85 TYYCQQSYSTPPTFG 4 DR4, DR51, DR7 30 88 CQQSYSTPPTFGQGT 0 31 91 SYSTPPTFGQGTKVE 0 32 94 TPPTFGQGTKVEIK 0

Tabla 8. El gen VH de PG1433 emparejado con diversos genes de cadena ligera con diferentes tasas de mutacion de aminoacidos se comparo con respecto a los niveles de produccion con el clon original que contenia el gen IGKV1

5 39.

Nombre de IgG: Gen de cadena ligera Numero de mutaciones de aminoacidos Concentraci6n ( g/ml)

PG1433: 1-39 0 63, 45,5, 38,6 (media = 49)

PG1631: 1-12 4 10,5

PG1632: 1-27 7 9,3

PG1634: 1D-12 10 10,8

PG1635: 1D-33 6 10,2

PG1642: 1-5 8 7,1

PG1644: 1-9 3 7,8

PG1650: 1D-39 3 9,1

PG1652: 2D-28 3 7,1

PG1653: 3-15 14 7

PG1654: 3-20 2 5,2

PG1674: 1-40 7 8,2

PG1678: 2-11 2 8,1

PG1680: 2-14 15 10,8

PG1682: 3-1 13 9,9

PG1683: 6-57 6 13,9

Tabla 9 Parametros de estabilidad para clones estables �ue contienen el gen IGKV1-39

Subclon: dias de cultivo al inicio deldesarrollodel lote Media pdt en 14diasprevios pDT %media Comienzo del lote en poblacionesdobles Densidadcelularviablemaxima1x109celulas/ml) %media IVE a lamaximaconcentracion de IgG (104celulas/h/l) %media gAb(pg/celulas/dia) %media concentracion IgG maxima (mg/l) %media correlacionTF CorrelacionFH CorrelacionTH

B38.1: 2140 79 35 5,1 99 41 1,2 115 36 0,2 101 19 31 62 3 91 3,7 112 3,2 97 530 92 368 99 627 109 9,5 97 10,5 107 9,4 96 122 79 188 122 154 100 0,99 0,95 0,92 1 0,99 0,99 0,97 0,99 0,96

media: 36 3,3 575 9,8 155

B38.4: 2140 79 35 1 101 35 0,3 101 34 0,2 99 15 29 59 2,2 114 1,9 98 1,7 88 424 134 247 78 278 88 14,2 116 12,5 102 9,9 81 141 127 96 86 97 87 1 0,96 0,97 1 1 1 0,99 1 0,99

media: 35 1,9 316 12,2 111

B38.15: 2140 79 35 1,6 106 32 0,3 97 31 0,2 94 16 3063 2,5 90 3,7 134 2,1 76 497 101 557 114 415 85 7,9 99 7,3 91 8,8 110 97 93 114 109 102 98 0,99 0,95 0,93 1 0,97 0,97 0,96 0,96 0,99

media: 33 2,8 490 8 104

B38.30: 2140 79 38 5,2 97 51 2,2 131 40 0,7 103 15 30 64 1,6 61 2,7 137 1,6 81 335 89 472 125 325 86 14,5 112 13,9 107 10,6 82 100 71 206 147 114 81 0,99 1 0,99 1 0,99 0,99 0,99 0,98 0,99

media: 39 2,0 377 13 140

B224.18: 23 42 81 34 2,6 100 37 0,7 109 34 0,2 100 17 33 63 3,1 103 3,6 120 2,3 77 507 103 575 117 393 80 15,8 98 18,1 112 14,6 90 208 81 318 124 244 95 1 0,99 0,99 1 0,94 0,95 1 1 0,96

media: 34 3,0 492 16,2 257

B224,47: 23 42 81 32 0,4 102 33 0,3 105 31 0,2 98 17 33 63 3,5 98 3,6 101 3,6 101 695 109 578 91 634 100 22,5 114 20 101 16,8 85 387 122 357 112 209 66 0,99 0,93 0,99 0,99 0,92 0,95 1 0,99 0,99

media: 32 3,6 636 19,8 318

B224,53: 23 42 81 33 0,5 100 32 0,4 97 33 0,1 100 17 3363 3,9 110 3,7 105 3 65 553 99 605 108 525 94 20,6 102 24,3 121 15,4 77 372 114 379 116 232 71 0,98 0,82 0,83 0,98 0,88 0,94 0,99 0,89 0,94

media: 33 3,5 561 20,1 327

B224,59: 23 42 81 36 0,6 104 34 0,2 99 33 0,3 96 17 3363 4,3 115 4,4 118 2,5 67 750 107 779 111 583 83 16,4 106 14,6 95 15,2 99 303 104 344 119 224 77 0,99 0,78 0,84 0,98 0,92 0,96 0,97 0,99 0,96

media: 35 3,7 704 15,4 290

B280.3: 2342 81 34 0,8 105 32 0,4 98 31 0,1 95 17 3367 4,3 105 4 98 4 98 840 108 841 108 660 85 13 109 12,3 103 10,5 88 293 117 292 116 109 67 0,99 0,98 0,93 0,99 0,98 0,98 0,99 0,98 1

media: 33 4,1 780 11,9 251

B280.12: 23 42 81 36 1,7 104 37 0,7 107 33 0,2 96 15 30 64 2 72 3,2 116 3,1 112 426 77 673 122 552 100 5,8 95 6,2 101 6,4 104 64 81 96 121 78 98 0,98 0,98 0,98 1 0,97 0,97 0,98 0,98 0,98

media: 35 2,8 550 6,1 79

B280.21: 23 42 81 32 0,6 102 31 0,4 98 31 0,4 98 18 3466 3,1 103 3,4 113 2,5 83 550 97 589 104 566 100 9,1 128 3,6 51 8,6 121 112 93 137 113 114 94 0,97 0,92 0,93 1 0,98 0,99 0,97 0,99 1

media: 32 3,0 568 7,1 121

(continuacion)

Subclon: dias de cultivo alinicio deldesarrollodel lote Media pdt en 14diasprevios pDT %media Comienzo del lote en poblacionesdobles Densidadcelularviablemaxima1x109celulas/ml) %media IVE a lamaximaconcentracion de IgG (104 celulas/h/l) %media gAb(pg/celulas/dia) %media concentracion IgG maxima (mg/l) %media correlacionTF CorrelacionFH CorrelacionTH

B280.36: 23 42 81 33 1 99 36 0,5 107 34 0,3 101 1730 62 3 81 4,6 124 3,5 95 596 75 1168 146 635 79 10 186 5,6 104 0,56 10 143 156 124 138 8 9 1 0,98 0,98 1 0,98 0,97 0,97 0,98 1

media: 34 3,7 800 5,4 92

Tabla 10 Me�clas de anticuerpos usadas para la tinci6n de poblaciones de linfocitos M0 � medula 6sea, CP � cavidad peritoneal, PP � parc�es de Peyer

37 (continuacion)

Medula 6sea

*10e6/ml: vol total Celulas totales

celulas: (ml) *106

Ts: 18,82 5,05 95,0

Ts: 19,24 4,96 95,4

CD19-Cre: 23,42 5,08 119,0

Medula 6sea

*10e6/ml: vol total Celulas totales

celulas: (ml) *106

CD19-Cre: 20,58 4,82 99,2

CD19-Cre: 25,77 5,15 132,7

CD19-Cre / HuVk1: 17,71 5,06 89,6

CD19-Cre / HuVk1: 12,60 5,33 67,2

CD19-Cre / HuVk1: 18,13 5,27 95,5

Ba�o

*10e6/ml: vol total Celulas totales

celulas: (ml) *106

38 (continuacion)

Medula 6sea

Ts: 41,70 5,36 223,5

Ts: 37,85 4,71 178,3

CD19-Cre: 60,19 3,77 226,9

CD19-Cre: 35,06 3,66 128,3

CD19-Cre: 80,69 4,60 371,2

CD19-Cre / HuVk1: 51,67 4,48 231,5

CD19-Cre / HuVk1: 58,80 6,24 366,9

CD19-Cre / HuVk1: 24,37 6,25 152,3

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Un mamifero murino transgenico que comprende, integrado en su genoma, una molecula de acido nucleico que contiene una region variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada, en el que dicha cadena ligera es capaz de emparejarse con al menos dos cadenas pesadas diferentes codificadas por el mamifero murino, de tal manera que la variedad en la especificidad de anticuerpos esta conservada a traves de reordenamientos e hipermutaciones en las cadenas pesadas, y en el que dicha cadena ligera comprende adicionalmente una region constante de cadena ligera murina.
2.

Un mamifero murino transgenico de acuerdo con la reivindicacion 1, que es un raton.
3.

Un raton transgenico de acuerdo con la reivindicacion 2, en el que la integracion es en un locus que es resistente a silenciamiento.
4.

Un raton transgenico de acuerdo con la reivindicacion 3, en el que la integracion es en el locus Rosa.
5.

Un mamifero murino transgenico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que la molecula de acido nucleico que codifica una cadena ligera esta provista de un medio que permite la expresion de dicha molecula de acido nucleico esencialmente limitada a celulas del linaje de linfocitos B.
6.

Un mamifero murino transgenico de acuerdo con la reivindicacion 5, en el que la molecula de acido nucleico que codifica una cadena ligera esta provista de un medio que permite la expresion de la molecula de acido nucleico que codifica una cadena ligera predominantemente durante una determinada fase del desarrollo de linfocitos B.
7.

Un mamifero murino transgenico de acuerdo con la reivindicacion 6, en el que dicho medio comprende un promotor seleccionado del grupo de CD19, CD20, μHC, VpreB1, VpreB2, VpreB3, λ5, Iga, Ig�, κLC, λLC y BSAP (Pax5).
8.

Un mamifero murino transgenico de acuerdo con la reivindicacion 6 o 7, en el que dicho medio comprende un sistema cre-lox.
9.

Un raton transgenico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que dicha cadena ligera es capaz de emparejarse con al menos dos cadenas pesadas murinas.
10.

Un mamifero murino transgenico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que dicha cadena ligera es capaz de emparejarse con al menos dos cadenas pesadas humanas.
11.

Un mamifero murino transgenico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que al menos uno de los locus endogenos que codifica una cadena ligera endogena esta silenciado funcionalmente.
12.

Un mamifero murino transgenico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en el que el locus de cadena ligera K endogena esta silenciado funcionalmente.
13.

Un mamifero murino transgenico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en el que la secuencia de la molecula de acido nucleico que codifica una cadena ligera es una secuencia VK humana.
14.

Un mamifero murino transgenico de acuerdo con la reivindicacion 13, en el que la molecula de acido nucleico que codifica una cadena ligera es una secuencia de la linea germinal.
15.

Un mamifero murino transgenico de acuerdo con la reivindicacion 14, en el que la secuencia de la linea germinal esta basada en 012.
16.

Un mamifero murino transgenico de acuerdo con la reivindicacion 15, en el que la secuencia de la linea germinal es IGKV1-39*01 / IGKJ1*01.
17.

Un mamifero murino transgenico de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que la molecula de acido nucleico que codifica una cadena ligera comprende en direccion 5'-3': un promotor vκ, un lider humano, un gen V humano y una region constante (K) de rata.
18.

Un mamifero murino transgenico al cual se ha provisto de un casete de expresion que comprende en direccion 5'-3': un promotor VK, un lider, un gen V humano reordenado capaz de emparejarse con al menos dos cadenas pesadas diferentes codificados por el mamifero murino, y una region constante (κ) de rata.
19.

Un procedimiento de produccion de un anticuerpo deseado que comprende la exposicion de un mamifero murino de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-18 a un antigeno de tal manera que se induce una respuesta de anticuerpo y el aislamiento de los anticuerpos especificos del antigeno.
20.

Un procedimiento de produccion de un anticuerpo deseado que comprende la exposicion de un mamifero murino de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-18 a un antigeno, de tal manera que se induce una

respuesta de anticuerpo y el aislamiento de celulas que producen dichos anticuerpos, el cultivo y la recuperacion de dichos anticuerpos.
21. Un procedimiento de produccion de un anticuerpo deseado que comprende la exposicion de un mamifero murino de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-18 a un antigeno de tal manera que se induce una respuesta de anticuerpo y el aislamiento de una molecula de acido nucleico que codifica al menos una parte de dicho anticuerpo, la insercion de dicha molecula de acido nucleico o una copia o un derivado de la misma, en un casete de expresion y la expresion de dicho anticuerpo en una celula huesped.

41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120