JP2022534674A - タンパク質を多量体化する変異体ドメイン及びその分離 - Google Patents

タンパク質を多量体化する変異体ドメイン及びその分離 Download PDF

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Abstract

本発明は、第１及び第２免疫グロブリンポリペプチドを含む免疫グロブリンタンパク質を製造及び単離するための手段及び方法に関し、具体的には、当該第１及び第２免疫グロブリンポリペプチドを含む、タンパク質を製造及び分離するための手段及び方法に関する。アミノ酸に変異、及び所望の免疫グロブリンタンパク質を産生する細胞からの変異体分離用ドメインを含めることによって、生成された所望の免疫グロブリンタンパク質を免疫グロブリンタンパク質の混合物から分離することができる。

Description

導入
最近の数十年における治療用分子の重要なクラスは、モノクローナル抗体のクラスであった。モノクローナル抗体は、癌を含む様々な疾患の治療に効果を示してきた。最近の１０年で、２つ以上のエピトープ、例えば腫瘍細胞上の２つ以上のエピトープの標的化も有効であることが発見された。患者には、別々に開発されたモノクローナル抗体の組合せを投与してもよく、また、１つの細胞に由来するモノクローナル抗体の組合せも投与することもできる。このような細胞は、１つ以上の細胞型上の２つ以上の標的を標的化する目的で開発された抗体の混合物の一部を形成する、２つ以上の異なる特異性を有する抗体を産生することができる。２つの抗体が１つの細胞で発現される場合、二重特異性及び単特異性抗体を含む抗体の様々な組合せを産生することができる。
様々な免疫グロブリン鎖の会合を調整する技術を利用することができる。このような産生細胞において重鎖の特定の会合が優先されるように、様々な二量体化ドメインが開発されてきた。共通軽鎖を使用して、同族の重鎖及び軽鎖の誤対合を回避することができる。特定の用途では、二重特異性抗体によって２つの抗体の組合せの使用を置き換えることができる。二重特異性はまた、対象における２つの細胞、例えば腫瘍細胞及びＴ細胞などの免疫細胞を一緒にするために使用することもできる。その一例は、ＣＤ３及び癌細胞上に存在するエピトープの組み合わせ標的化である。同様に、３つ以上の同じ又は異なる抗原又はエピトープに結合することができる多価多量体又は多重特異性抗体も出現してきている。２つの抗体の組合せは、同じ又は異なる標的上の異なるエピトープに結合する２つの異なる免疫グロブリンの混合物を表すが、二重特異性抗体では、これは単一の免疫グロブリンによって実現される。多重特異性多量体又は多重特異性抗体では、同じ又は異なる抗原上の３つ以上の異なるエピトープが標的化され得る。
同じ又は異なる標的上の２つのエピトープに結合することにより、二重特異性抗体は、同じエピトープに結合する２つの抗体の組合せと比較して、同様の又は優れた効果を有することができる。このことはまた、３つ以上の標的に結合することができる多重特異性多量体にも当てはまる。二重特異性又は多重特異性免疫グロブリンタンパク質は、細胞上の２つ以上の表面タンパク質を集めるか、又は免疫エフェクター細胞を異常な細胞に近づけ、いずれの場合にも、細胞のアポトーシスを引き起こす。更に、単一の分子中の２つの異なる結合領域が組み合わされた単離された二重特異性抗体もまた、それの２つの異なる標的を標的化する２つの抗体の混合物よりも有益な効果を示す。技術的及び規制的な観点からは、単一の二重特異性抗体若しくは多重特異性多量体又は抗体の開発は、製造、前臨床試験、及び臨床試験で単一の分子が関与するため、複雑さが低くなり得る。したがって、二重特異性抗体又は多重特異性多量体／抗体に基づく療法は、より複雑さが少なく費用対効果の高い薬物開発プロセスによって促進することができると共に、同時により有効な療法を提供できる可能性も有する。
ＩｇＧのフォーマットに基づいたものなどの二重特異性抗体は、様々な方法によって産生されてきた。例えば、二重特異性抗体は、組み換えＤＮＡ技術を用いて、単一の細胞中で２つの抗体の構成成分を発現させることによって産生することができる。本明細書で前に述べたように、いくつかの実施形態では、これらのアプローチによって、例えば、２つの異なる重鎖及び７２つの異なる軽鎖が細胞によって産生される場合、複数の抗体種を生成することができる。特に調整されない限り、重鎖は、典型的には、細胞によって産生される任意の軽鎖と対を形成することができ、典型的には、それらが正しい同族対ではない場合、非機能性の結合部位を生じる。上の例において、そのような重鎖の１つは、軽鎖のいずれかと対を形成する。
特に調整されない限り、重鎖は、典型的には、細胞によって産生される任意の他の重鎖と対を形成することができる。調整されていない設定では、最大１０個の異なる免疫グロブリン分子が、細胞によって産生することができる。抗体混合物の複雑性並びに非機能性の重鎖及び軽鎖の組合せの存在には、共通軽鎖を共有する重軽鎖の組合せを選択することによって対処することができる。これはまた、多重特異性多量体又は抗体の産生、及び組み換えＤＮＡ技術を用いて３つ以上の可変ドメインを単一の抗体に組み込む状況にも当てはまる。
単一の産生細胞による異なる重鎖の特定のヘテロ二量体化を駆動する改変を含む、２つ以上の重鎖の発現と組み合わせて共通軽鎖を使用した場合、それにもかかわらず、同じ結合ドメインを有する重鎖が対を形成したいくつかのホモ二量体が生成され、単特異性抗体及び二重特異性抗体の混合物が得られる。これはまた、２つ以上の重鎖の発現と組み合わせて共通軽鎖を使用し、そのような重鎖の１つ以上が２つ以上の重鎖可変領域を含有する場合にもあてはまり、単一の産生細胞が、多重特異性多量体又は抗体及び更なるホモ二量体を産生する。特異性のホモ二量体を所望の場合、いくつかのヘテロ二量体が生成され得る。したがって、タンパク質の混合物が生成されるそれぞれの状況において、目的の二量体を得られた混合物から単離する必要があり得る。したがって、単特異性若しくは二重特異性抗体、又は多価抗体若しくは多量体を生成及び分離するための改良された技術及び／又は代替技術が当該技術分野において必要とされている。
抗体若しくはその断片の電荷及び／又は等電点（ｐＩ）を利用する、又は等電点電気泳動を使用する、若しくはイオン交換クロマトグラフィーで生じる目的のタンパク質種に固有のピークを使用する、様々な分離方法を利用することができる。本明細書では、混合物からの分離を容易にする新しい産物、及びそのような産物を分離するための新しい方法を開示する。
本明細書で荷電アミノ酸に言及する場合、それらは、例えばインビボの条件下などの生理学的に関連するｐＨにおける電荷を指す。
一実施形態では、本発明は、免疫グロブリン領域、好ましくはＣＨ１領域であって、元の免疫グロブリン領域、好ましくは元のＣＨ１領域、より好ましくはヒト野生型ＣＨ１領域と比較してアミノ酸の変異を含む、免疫グロブリン領域、好ましくはＣＨ１領域を提供し、元のアミノ酸は元の免疫グロブリン領域において表面に露出しておらず、変異は、
中性アミノ酸から負に荷電したアミノ酸、
正に荷電したアミノ酸から中性アミノ酸、
正に荷電したアミノ酸から負に荷電したアミノ酸、
中性アミノ酸から正に荷電したアミノ酸、
負に荷電したアミノ酸から中性アミノ酸、及び
負に荷電したアミノ酸から正に荷電したアミノ酸への変異から選択される。
一実施形態では、本発明は、免疫グロブリン領域、好ましくは免疫グロブリンのＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３領域であって、元の当該免疫グロブリン領域、好ましくは元のＣＨ１、ＣＨ２又はＣＨ３領域、より好ましくは、ヒト野生型ＣＨ１、ＣＨ２又はＣＨ３領域と比較して、免疫グロブリン又は当該領域の組合せにおいて表面に露出していないアミノ酸の変異を含む、免疫グロブリン領域、好ましくは免疫グロブリンのＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３領域を提供し、変異は、
中性アミノ酸から負に荷電したアミノ酸、
正に荷電したアミノ酸から中性アミノ酸、
正に荷電したアミノ酸から負に荷電したアミノ酸、
中性アミノ酸から正に荷電したアミノ酸、
負に荷電したアミノ酸から中性アミノ酸、及び
負に荷電したアミノ酸から正に荷電したアミノ酸への変異から選択される。
本発明による免疫グロブリンのＣＨ１領域は、好ましくは、ヒト野生型ＣＨ１領域と比較して１つ以上の表面に露出していない、又は好ましくは埋もれた１つ以上のアミノ酸の変異を含み、変異は、
中性アミノ酸の負に荷電したアミノ酸への変異、
正に荷電したアミノ酸の中性アミノ酸への変異、
中性アミノ酸の正に荷電したアミノ酸への変異、及び
負に荷電したアミノ酸の中性アミノ酸への変異からなる群から選択される。
本発明はまた、ヒト野生型ＣＨ１領域と比較して、Ｎ１５９、Ｎ２０１、Ｔ１２０、Ｋ１４７、Ｄ１４８、Ｙ１４９、Ｖ１５４、Ａ１７２、Ｑ１７５、Ｓ１９０及びＫ２１３から選択される位置（ＥＵナンバリング）にあるアミノ酸の変異を含む、免疫グロブリンのＣＨ１領域も開示する。アミノ酸変異は、好ましくはＤ１４８、Ｙ１４９、Ｖ１５４、Ｎ１５９、Ａ１７２、Ｓ１９０及びＮ２０１の位置である。好ましい実施形態では、変異は、Ｎ１５９及び／又はＮ２０１から選択されるアミノ酸の位置である。ＣＨ１領域は、当該アミノ酸の２つ以上の変異を含んでもよい。当該２つ以上の変異は、好ましくは、
中性アミノ酸から負に荷電したアミノ酸、
正に荷電したアミノ酸から中性アミノ酸、
正に荷電したアミノ酸から負に荷電したアミノ酸への変異の２つ以上、
又は
中性アミノ酸から正に荷電したアミノ酸、
負に荷電したアミノ酸から中性アミノ酸、
負に荷電したアミノ酸から正に荷電したアミノ酸への変異の２つ以上を含む。
ＣＨ１領域における２つ以上の変異の好適な組合せは、群Ａ１７２／Ｓ１９０／Ｎ２０１、Ｔ１９７／Ｋ２１３、Ｄ１４８／Ｑ１７５、Ｎ１５９／Ｑ２１３、Ｋ１４７／Ｑ１７５、Ｙ１４９／Ｖ１５４／Ａ１７２／Ｓ１９０、Ｎ２０１／Ｋ２１３、Ｔ１２０／Ｎ２０１、Ｎ２０１／Ｎ１５９、Ｔ１２０／Ｎ１５９、Ｔ１２０／Ｎ２０１／Ｎ１５９、及びＮ２０１／Ｋ２１３／Ｎ１５９から選択されるアミノ酸の変異を含む。
本発明はまた、ヒト野生型ＣＨ２領域と比較してＶ３０３の位置（ＥＵナンバリング）のアミノ酸の変異を含む、免疫グロブリンのＣＨ２領域を開示する。一実施形態では、免疫グロブリンのＣＨ２領域はＦｃサイレントＣＨ２領域であり、好ましくはＬ２３５Ｇ及びＧ２３６Ｒのアミノ酸変異を含む。
本発明はまた、ヒト野生型ＣＨ３領域と比較してＫ３７０、Ｅ３８２及び／又はＥ３８８の位置（ＥＵナンバリング）の１つ以上のアミノ酸の変異を含む、免疫グロブリンのＣＨ３領域を開示する。一実施形態では、免疫グロブリンのＣＨ３領域は、ＣＨ３／ＣＨ３界面におけるヘテロ二量体化を促進するための残基の変異を含み、好ましくはＬ３５１Ｄ及びＬ３６８Ｅの変異を含むか、又はその代わりにＴ３６６Ｋ及びＬ３５１Ｋの変異を含む。
一実施形態では、免疫グロブリンのＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３領域、又はそれらの組合せは、アミノ酸の２つ以上の変異を含み、少なくとも１つが免疫グロブリンの表面に露出していないアミノ酸の変異である。一実施形態では、免疫グロブリンのＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３領域、又はそれらの組合せは、免疫グロブリンの表面に露出していないアミノ酸の２つ以上の変異を含む。変異は、好ましくは、
中性アミノ酸から負に荷電したアミノ酸、
正に荷電したアミノ酸から中性アミノ酸、
正に荷電したアミノ酸から負に荷電したアミノ酸、
中性アミノ酸から正に荷電したアミノ酸、
負に荷電したアミノ酸から中性アミノ酸、及び
負に荷電したアミノ酸から正に荷電したアミノ酸への変異から選択される。１つ以上の変異は、好ましくは、１つ以上の表面に露出していないか又は好ましくは埋もれたアミノ酸の
中性アミノ酸の負に荷電したアミノ酸への変異、
正に荷電したアミノ酸の中性アミノ酸への変異、
中性アミノ酸の正に荷電したアミノ酸への変異、及び
負に荷電したアミノ酸の中性アミノ酸への変異からなる群から選択される１つ以上の変異を含む。少なくとも１つのアミノ酸の変異は、好ましくは、埋もれたアミノ酸である。
中性アミノ酸から負に荷電したアミノ酸、正に荷電したアミノ酸から中性アミノ酸、及び／又は正に荷電したアミノ酸から負に荷電したアミノ酸への変異を含むＣＨ領域は、元のＣＨ領域に対して、好ましくはヒト野生型ＣＨ領域と比較して、負の電荷差を有するＣＨ領域であると言われる。変異自体は、負の電荷差をＣＨ領域に提供すると言われる。中性アミノ酸から正に荷電したアミノ酸、負に荷電したアミノ酸から中性アミノ酸、及び／又は負に荷電したアミノ酸から正に荷電したアミノ酸への変異を含むＣＨ領域は、元のＣＨ領域に対して、好ましくはヒト野生型ＣＨ領域と比較して、正の電荷差を有するＣＨ領域であると言われる。本明細書に記載するように、ＣＨ領域がアミノ酸残基の２つの変異を有する場合、両方の変異がＣＨ領域に同じ方向の電荷差を提供することが好ましい。本明細書に記載するように、ＣＨ領域がアミノ酸残基の３つ以上の変異を有する場合、変異の正味の結果がＣＨ領域に電荷差を提供することが好ましい。免疫グロブリン領域は、好ましくはヒト免疫グロブリン領域である。いくつかの実施形態では、免疫グロブリン領域は、ＩｇＧ領域、好ましくはＩｇＧ１領域である。上に開示した免疫グロブリン領域は、例えば、抗体混合物からの分離が必要な抗体の一部として効果的に使用することができる。
本発明は更に、本明細書に記載の免疫グロブリンのＣＨ領域を含む重鎖及び軽鎖を含む、抗体を開示する。例えば、このような抗体が混合物の一部として産生される場合、ＣＨ領域に提供された電荷の変化によって、当該混合物からの当該抗体の分離が容易になり得る。好ましい実施形態では、抗体は異なる重鎖を含む。好ましい実施形態では、抗体は、二重特異性抗体又は三重特異性抗体などの多重特異性抗体である。この場合、ＣＨ領域に提供された電荷の変化によって、当該混合物からの当該二重特異性又は三重特異性抗体の分離が容易になり得る。異なる重鎖は、好ましくは、互換性を有するヘテロ二量体化領域、好ましくは互換性を有するヘテロ二量体化ＣＨ３領域を含む。一実施形態では、重鎖の一方はＣＨ３の変異Ｌ３５１Ｄ及びＬ３６８Ｅを含み、当該重鎖の他方は変異Ｔ３６６Ｋ及びＬ３５１Ｋを含む。本発明の抗体は、好ましくはＩｇＧ抗体、好ましくはＩｇＧ１抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は本明細書に記載する免疫グロブリンのＣＨ領域の１つ以上をそれぞれが含む第１及び第２重鎖を含む。ＣＨ３の変異Ｌ３５１Ｄ及びＬ３６８Ｅを含む重鎖は本明細書に記載の１つのＣＨ領域を含み、ＣＨ３の変異Ｔ３６６Ｋ及びＬ３５１Ｋを含む重鎖は本明細書に記載の別のＣＨ領域を含むことが好ましい。このような場合、一方及び他方のＣＨ領域は異なる電荷を有するＣＨ領域を含むことが好ましい。このような場合、混合物中に得られた抗体の等電点の差は更に離れ、それによって、当該混合物中の他の免疫グロブリン分子又はその一部からの当該抗体の分離が容易になる。換言すれば、一方のＣＨ領域が元のＣＨ領域と比較して負の電荷差を有するＣＨ領域である場合、他方は、好ましくは元のＣＨ領域と比較して正の電荷差を有するＣＨ領域である。同様に、一方のＣＨ領域が元のＣＨ領域と比較して正の電荷差を有するＣＨ領域である場合、他方は、好ましくは元のＣＨ領域と比較して負の電荷差を有するＣＨ領域である。
本明細書に記載のＣＨ領域を有する本明細書に記載の互換性を有するＣＨ３ヘテロ二量体化領域などの互換性のヘテロ二量体化領域を含む抗体は、典型的には、抗体又はその断片の電荷及び／又は等電点（ｐＩ）を利用する分離工程において、同じ重鎖を有するそれぞれの抗体、及び／又は存在する場合は半抗体からより良好に分離する。抗体は、好ましくは１つ以上の軽鎖を含む。それは、好ましくは同じ軽鎖を含む。軽鎖は、好ましくは本明細書に記載の共通抗体軽鎖である。共通軽鎖は、好ましくは、図１３の、例えば図１３Ｂ又は図１３Ｄの軽鎖可変領域を含む。一実施形態では、軽鎖は、図１３Ｃに示すような軽鎖定常領域を有する。好ましい実施形態では、軽鎖は、図１３Ａ又は図１３Ｅに示す軽鎖のアミノ酸配列を含む。好ましい実施形態では、軽鎖は、図１３Ａに示すような軽鎖のアミノ酸配列を含む。共通軽鎖は、好ましくは図１３Ｆに示すようなＣＤＲを有する軽鎖である。
本明細書に記載の抗体、ＣＨ領域又はＣＨドメインは、好ましくはヒト抗体又はヒト免疫グロブリンのＣＨ領域又はドメインである。これは、表面に露出していないか、好ましくは野生型ヒトＣＨ領域内に埋もれたアミノ酸の位置に変異を有する、ＣＨ領域を含むヒト抗体、ＣＨドメイン、又はＣＨ領域であることが好ましい。
免疫グロブリン領域、好ましくは、本明細書に記載のように表面に露出していないアミノ酸の変異を含むＣＨ領域又は抗体は、ＣＨ１／ＣＬ界面に存在しない、ＣＨ２／ＣＨ２界面に存在しない、及び／又はＣＨ３／ＣＨ３界面に存在しないアミノ酸から選択される変異を有する。ＣＨ３／ＣＨ３界面のアミノ酸を、Ｔｒａｘｌｍａｙｅｒら（２０１２；Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２６；４２３（３）：３９７～４１２．ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ及び図３）に従って図２２に列記する。
免疫グロブリン領域、好ましくは、本明細書に記載の表面に露出していないアミノ酸の変異を含む、ＣＨ１、ＣＨ２、若しくはＣＨ３領域又は抗体は、任意の重鎖及び軽鎖の界面を含む、生じるＣＨ１／ＣＬドメイン、ＣＨ２ドメイン、若しくはＣＨ３ドメイン又は抗体の安定性に実質的に悪影響を及ぼさない。免疫グロブリン領域、好ましくは、本明細書に記載の表面に露出していないアミノ酸の変異を含む、ＣＨ１、ＣＨ２、若しくはＣＨ３領域又は抗体は、電荷差を生成する変異の安定性を強化する更なる変異を含んでもよい。免疫グロブリン領域、好ましくは、本明細書に記載の表面に露出していないアミノ酸の変異を含む、ＣＨ１、ＣＨ２、若しくはＣＨ３領域又は抗体は、電荷差を生成する更なる変異を含んでもよい。
本発明はまた、本明細書に記載の免疫グロブリン領域を含む、免疫グロブリンのＣＨ１／ＣＬドメイン、ＣＨ２ドメイン又はＣＨ３ドメインを開示する。ＣＨ２ドメインは更に、好ましくは２３５及び／又は２３６におけるＣＨ３の変異を有する、Ｆｃサイレント変異を含んでもよい。ＣＨ３ドメインは更に、好ましくは、ＣＨ３の変異Ｌ３５１Ｄ及びＬ３６８Ｅを一方のＣＨ３領域に有し、ＣＨ３の変異Ｔ３６６Ｋ及びＬ３５１Ｋを他方に有する、ＣＨ３ヘテロ二量体化ドメインを含んでもよい。
本発明は更に、本明細書に記載の１つ以上のＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３領域、又はそれらの組合せを含む、タンパク質を開示する。また、本明細書に記載の１つ以上のＣＨ１／ＣＬ、ＣＨ２、ＣＨ３ドメイン、又はそれらの組合せを含むタンパク質も開示する。
本発明は更に、本明細書に記載の１つ以上のＣＨ１／ＣＬ、ＣＨ２、ＣＨ３ドメイン、又はそれらの組合せを含む、二重特異性抗体などの多重特異性抗体を開示する。
免疫グロブリンの１つの鎖、ポリペプチド又はタンパク質中の、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３領域、又はそれらの組合せにおける２つ以上の変異は、好ましくは全てが同一の方向、すなわちＣＨ領域若しくはそれらの組合せの全てをより正電荷に向かって、又はＣＨ領域又はそれらの組合せの全てをより負電荷に向かって、電荷を向ける変異を含む。
本発明は更に、本明細書に記載の免疫グロブリン領域又は抗体、及び医薬キャリア又は医薬賦形剤を含む、組成物を開示する。本明細書に記載の免疫グロブリン領域又は抗体を含む、医薬組成物を更に開示する。医薬組成物は、好ましくは医薬キャリア又は医薬賦形剤を含む。
本明細書に記載の免疫グロブリン領域又は抗体をコードする、核酸を更に開示する。本明細書に記載の免疫グロブリン領域が組み込まれた抗体又は多量体タンパク質を一緒にコードする、核酸の組合せを更に開示する。核酸は、物理的に連結されていてもよく、そうでなくてもよい。
核酸又は核酸の組合せを含む、組換え宿主細胞もまた開示する。
本発明は更に、請求項に記載の抗体の製造方法を提供し、方法は、
本明細書に記載のＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３領域、又はそれらの組合せを有する、第１重鎖をコードする核酸を提供する工程、
第２重鎖をコードする核酸を提供する工程であって、当該第１及び第２重鎖が同じであっても異なっていてもよい、工程、
軽鎖をコードする核酸を提供する工程、
当該核酸を宿主細胞に導入し、当該宿主細胞を培養して核酸を発現させる工程、及び
抗体を宿主細胞の培養物から収集する工程を含み、方法は、抗体及び／又は抗体断片の電荷に基づいて、分離工程において抗体を他の抗体又は抗体断片から分離する工程を更に含む。一実施形態では、当該第１及び第２重鎖は、互換性を有するヘテロ二量体化領域、好ましくは互換性を有するＣＨ３ヘテロ二量体化領域を含む。
本発明は更に、請求項に記載の抗体の製造方法を提供し、方法は、
本明細書に記載のＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３領域、又はそれらの組合せを有する、第１重鎖をコードする核酸を提供する工程、
第２重鎖をコードする核酸を提供する工程であって、当該第１及び第２重鎖は同じであっても異なっていてもよい、工程、
軽鎖をコードする核酸を提供する工程、
当該核酸を宿主細胞に導入し、当該宿主細胞を培養して核酸を発現させる工程、及び
宿主細胞の培養物から抗体を収集する工程を含み、方法は、収集物を清澄化する工程、
タンパク質を捕集する工程、
陰イオン交換クロマトグラフィーを行う工程、
陽イオン交換クロマトグラフィーを行い、他の抗体又は抗体断片から抗体を分離する工程を更に含む。一実施形態では、当該第１及び第２重鎖は、互換性を有するヘテロ二量体化領域、好ましくは互換性のＣＨ３ヘテロ二量体化領域を含む。
本発明は更に、請求項に記載の抗体の製造方法を提供し、方法は、
本明細書に記載のＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３領域、又はそれらの組合せを有する、第１重鎖をコードする核酸を提供する工程、
第２重鎖をコードする核酸を提供する工程であって、当該第１及び第２重鎖は同じであっても異なっていてもよい、工程、
軽鎖をコードする核酸を提供する工程、
当該核酸を宿主細胞に導入し、当該宿主細胞を培養して核酸を発現させる工程、及び
宿主細胞の培養物から抗体を収集する工程を含み、方法は、ゲル上の等電電気泳動を含む分離工程において、抗体を他の抗体又は抗体断片から分離する工程を更に含む。
等電点が異なる第１重鎖及び第２重鎖を含む、多重特異性抗体の製造方法を更に提供し、方法は、
（ａ）コードされた第１重鎖の等電点及びコードされた第２重鎖の等電点が異なるように、第１重鎖をコードする核酸及び第２重鎖をコードする核酸を発現させる工程であって、当該核酸が、第１及び／又は第２重鎖、好ましくはＣＨ１領域、より好ましくはＴ１２０、Ｋ１４７、Ｄ１４８、Ｙ１４９、Ｖ１５４、Ｎ１５９、Ａ１７２、Ｑ１７５、Ｓ１９０、Ｎ２０１及びＫ２１３、及び／又は好ましくはＣＨ２領域、好ましくはＶ３０３、及び／又は好ましくはＣＨ３領域、好ましくはＫ３７０、Ｅ３８２、Ｅ３８８（ＥＵナンバリング）を含むコードされた免疫グロブリン領域の表面に露出していない位置から選択されるアミノ酸位置における１つ以上の変異をコードする、工程、
（ｂ）宿主細胞を培養して、核酸を発現させる工程、及び
（ｃ）等電点の差を使用して、宿主細胞の培養物から多重特異性抗体を収集する工程を含む。
また、等電点が異なる第１重鎖及び第２重鎖を含む、多重特異性抗体を分離する方法も提供し、方法は、
（ａ）コードされた第１重鎖の等電点及びコードされた第２重鎖の等電点が異なるように、第１重鎖のアミノ酸残基をコードする核酸及び第２重鎖のアミノ酸残基をコードする核酸の両方又はいずれか一方を発現させる工程であって、当該核酸の位置が、表面に露出していない残基、好ましくはＴ１２０、Ｋ１４７、Ｄ１４８、Ｙ１４９、Ｖ１５４、Ｎ１５９、Ａ１７２、Ｑ１７５、Ｓ１９０、Ｎ２０１及びＫ２１３、及び／又は好ましくはＣＨ２領域、好ましくはＶ３０３、及び／又は好ましくはＣＨ３領域、好ましくはＫ３７０、Ｅ３８２、Ｅ３８８（ＥＵナンバリング）から選択される１つ以上のアミノ酸変異における、コードされたＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３領域、又はそれらの組合せとは異なる位置である、工程、
（ｂ）宿主細胞を培養して核酸を発現させる工程、及び
（ｃ）クロマトグラフィーによって宿主細胞の培養物から多重特異性抗体を分離する工程を含む。
好ましい実施形態では、核酸は、第１重鎖、第１重鎖のホモ多量体、第２重鎖、第２重鎖のホモ多量体、並びに第１及び第２重鎖のヘテロ多量体の保持時間が発現されたときに異なり、イオン交換クロマトグラフィー工程で分離されるように、第１重鎖及び第２重鎖をコードする。
当該核酸によってコードされる位置における変異体アミノ酸は、好ましくは、ヒト野生型ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３領域又はそれらの組合せにおける表面に露出していないアミノ酸から選択され、また
中性アミノ酸から負に荷電したアミノ酸、
正に荷電したアミノ酸から中性アミノ酸、
正に荷電したアミノ酸から負に荷電したアミノ酸、
中性アミノ酸から正に荷電したアミノ酸、
負に荷電したアミノ酸から中性アミノ酸、及び
負に荷電したアミノ酸から正に荷電したアミノ酸から選択される。
また、等電点が異なる第１重鎖及び第２重鎖を含む、多重特異性抗体の製造方法も提供し、方法は、
第１のコードされた重鎖の等電点及び第２のコードされた重鎖の等電点が異なるように、第１重鎖のＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３領域、又はそれらの組合せをコードする核酸、及び第２重鎖のＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３領域、又はそれらの組合せをコードする核酸を提供する工程であって、当該ＣＨ領域の少なくとも１つが、Ｔ１２０、Ｋ１４７、Ｄ１４８、Ｙ１４９、Ｖ１５４、Ｎ１５９、Ａ１７２、Ｑ１７５、Ｓ１９０、Ｎ２０１、Ｋ２１３、Ｖ３０３、Ｋ３７０、Ｅ３８２及びＥ３８８（ＥＵナンバリング）から選択される位置のアミノ酸変異を含む、工程、及び
宿主細胞を培養して核酸を発現させる工程、及び
宿主細胞の培養物から多重特異性抗体を、等電点の差を使用して収集する工程を含み、
宿主細胞の培養物から抗体を収集する工程、
収集物を清澄化する工程、
タンパク質を捕集する工程、
陰イオン交換クロマトグラフィーを行う工程、及び
陽イオン交換クロマトグラフィーを行い、別の抗体又は抗体断片から抗体を分離する工程を更に含む。
更に、等電点が異なる第１重鎖及び第２重鎖を含む、多重特異性抗体を精製する方法を提供し、方法は、
第１のコードされた重鎖及び第２のコードされた重鎖の等電点が異なるように、第１重鎖のＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３領域、又はそれらの組合せをコードする核酸、及び第２重鎖のＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３領域、又はそれらの組合せをコードする核酸の両方又はいずれか一方を提供する工程であって、当該ＣＨ領域の少なくとも１つが、Ｔ１２０、Ｋ１４７、Ｄ１４８、Ｙ１４９、Ｖ１５４、Ｎ１５９、Ａ１７２、Ｑ１７５、Ｓ１９０、Ｎ２０１、Ｋ２１３、Ｖ３０３、Ｋ３７０、Ｅ３８２及びＥ３８８（ＥＵナンバリング）から選択される位置のアミノ酸変異を含む、工程、
宿主細胞を培養して核酸を発現させる工程、及び
多重特異性抗体を、等電点電気泳動により宿主細胞の培養物から精製して、多重特異性抗体を別の抗体又は抗体断片から分離する工程を含む。
第１重鎖のホモ多量体、第２重鎖のホモ多量体、並びに第１及び第２重鎖のヘテロ多量体をコードする１つ以上の核酸は、異なる等電点を有するタンパク質として発現され、イオン交換クロマトグラフィーにおいて異なる保持時間を与える。
ＣＨ領域の位置の１つ以上のアミノ酸変異は、好ましくは、多重特異性抗体中で表面に露出しておらず、好ましくは、
中性アミノ酸から負に荷電したアミノ酸、
正に荷電したアミノ酸から中性アミノ酸、
正に荷電したアミノ酸から負に荷電したアミノ酸、
中性アミノ酸から正に荷電したアミノ酸、
負に荷電したアミノ酸から中性アミノ酸、及び
負に荷電したアミノ酸から正に荷電したアミノ酸への変異から選択される。
変異位置におけるアミノ酸は、好ましくは、１つ以上の表面に露出していないか、又は、好ましくは埋もれたアミノ酸の、
中性アミノ酸から負に荷電したアミノ酸、
正に荷電したアミノ酸から中性アミノ酸、
正に荷電したアミノ酸から中性アミノ酸、及び
負に荷電したアミノから中性アミノ酸への変異からなる群から選択される１つ以上の変異を含む。第１重鎖及び第２重鎖は、好ましくはＣＨ３領域を含み、当該ＣＨ３領域は、好ましくは、互換性を有するＣＨ３ヘテロ二量体化領域を含む。当該互換性を有するＣＨ３ヘテロ二量体化領域の一方は、好ましくはＬ３５１Ｄ及びＬ３６８Ｅを含み、他方は、好ましくはＴ３６６Ｋ及びＬ３５１Ｋを含む。
当該核酸によりコードされる位置における変異体アミノ酸は、好ましくはＴ１２０、Ｋ１４７、Ｄ１４８、Ｙ１４９、Ｖ１５４、Ｎ１５９、Ａ１７２、Ｑ１７５、Ｓ１９０、Ｎ２０１、Ｋ２１３、Ｖ３０３、Ｋ３７０、Ｅ３８２及びＥ３８８から選択される。
ヒト野生型ＣＨ１中の表面に露出していない位置、好ましくは１２０位、１４７位、１４８位、１４９位、１５４位、１５９位、１７２位、１７５位、１９０位、２０１位、又は２１３位に第１の荷電アミノ酸残基を含む、ＣＨ１領域又はＣＨ１含有免疫グロブリンポリペプチドを更に開示する。ＣＨ１領域又はＣＨ１含有免疫グロブリンポリペプチドは、好ましくは、荷電残基に加えて、ヒト、野生型ＣＨ１中の表面に露出していない位置、好ましくは、１２０位、１４７位、１４８位、１４９位、１５４位、１５９位、１７２位、１７５位、１９０位、２０１位、又は２１３位から選択される異なる位置に第２の荷電アミノ酸残基を含み、当該第２の荷電アミノ酸は第１の荷電アミノ酸と同じ電荷を有する。ＣＨ１領域又はＣＨ１含有免疫グロブリンポリペプチドは、好ましくは、１４７位及び／又は２１３位に中性又は負に荷電したアミノ酸残基を含む。ＣＨ１領域又はＣＨ１含有免疫グロブリンポリペプチドは、好ましくは、１４８位及び／又は２１６位のヒンジに中性又は正に荷電したアミノ酸残基を含む。ヒト、野生型ＣＨ２の表面に露出していない位置、好ましくは、３０３位に荷電アミノ酸残基を含むＣＨ２領域又はＣＨ２含有免疫グロブリンポリペプチドを更に開示する。ヒト、野生型ＣＨ３の表面に露出していない位置、好ましくは、３７０位、３８２位又は３８８位に第１の中性アミノ酸残基を含む、ＣＨ３領域又はＣＨ３含有免疫グロブリンポリペプチドを更に開示する。ＣＨ３領域又はＣＨ３含有免疫グロブリンポリペプチドは、好ましくは、その中性残基に加えて、第１の中性アミノ酸の位置とは異なる、ヒト、野生型ＣＨ３の表面に露出していない位置、好ましくは、３７０位、３８２位又は３８８位から選択される異なる位置に第２の中性アミノ酸残基を含む。あるいは、ヒト、野生型ＣＨ３の表面に露出していない位置、好ましくは、３７０位に第１の負に荷電したアミノ酸残基、及び３８２位又は３８８位に正に荷電したアミノ酸を含む、ＣＨ３領域又はＣＨ３含有免疫グロブリンポリペプチドを開示する。
ＣＨ１領域のＴ１２０位における変異は、好ましくは、中性アミノ酸から荷電アミノ酸への変異である。例としては、Ｔ１２０Ｒ、Ｔ１２０Ｋ、Ｔ１２０Ｄ及びＴ１２０Ｅの変異である。変異は、好ましくは、Ｔ１２０Ｄ又はＴ１２０Ｋの変異を含む。
ＣＨ１領域のＫ１４７位における変異は、好ましくは、正に電荷したアミノ酸から中性又は負に荷電したアミノ酸への変異である。例としては、Ｋ１４７Ｑ、Ｋ１４７Ｔ、Ｋ１４７Ｓ、Ｋ１４７Ｄ及びＫ１４７Ｅの変異である。変異は、好ましくは、Ｋ１４７Ｅの変異である。
ＣＨ１領域のＤ１４８位における変異は、好ましくは、中性アミノ酸から荷電したアミノ酸への変異である。例としては、Ｄ１４８Ｒ、Ｄ１４８Ｋ、Ｄ１４８Ｄ及びＤ１４８Ｅの変異である。変異は、好ましくは、Ｄ１４８Ｋの変異を含む。
ＣＨ１領域のＮ１５９位における変異は、好ましくは、中性アミノ酸から荷電したアミノ酸への変異である。例としては、Ｎ１５９Ｒ、Ｎ１５９Ｋ、Ｎ１５９Ｄ及びＮ１５９Ｅの変異である。変異は、好ましくは、Ｎ１５９Ｋ又はＮ１５９Ｄの変異を含む。
ＣＨ１領域のＱ１７５位における変異は、好ましくは、中性アミノ酸から荷電したアミノ酸への変異である。例としては、Ｑ１７５Ｒ、Ｑ１７５Ｋ、Ｑ１７５Ｄ及びＱ１７５Ｅの変異である。変異は、好ましくは、Ｑ１７５Ｋ又はＱ１７５Ｅの変異を含む。
ＣＨ１領域のＮ２０１位における変異は、好ましくは、中性アミノ酸から荷電したアミノ酸への変異である。例としては、Ｎ２０１Ｒ、Ｎ２０１Ｋ、Ｎ２０１Ｄ及びＮ２０１Ｅの変異である。変異は、好ましくは、Ｎ２０１Ｋ又はＮ２０１Ｄの変異を含む。
ＣＨ１領域のＫ２１３位における変異は、好ましくは、正に荷電したアミノ酸から中性又は負に荷電したアミノ酸への変異である。例としては、Ｋ２１３Ｑ、Ｋ２１３Ｔ、Ｋ２１３Ｓ、Ｋ２１３Ｄ及びＫ２１３Ｅの変異である。変異は、好ましくは、Ｋ２１３Ｑの変異を含む。
ＣＨ２領域のＶ３０３位における変異は、好ましくは、中性アミノ酸から荷電アミノ酸への変異である。例としては、Ｖ３０３Ｋ、Ｖ３０３Ｒ、Ｖ３０３Ｄ及びＶ３０３Ｅの変異である。変異は、好ましくは、Ｖ３０３Ｄ又はＶ３０３Ｅの変異を含む。
３０３位に荷電アミノ酸残基を含む、ＣＨ２含有免疫グロブリンポリペプチドを更に開示する。
３７０位、３８２位又は３８８位から選択される位置に非荷電アミノ酸残基を含む、ＣＨ３含有免疫グロブリンポリペプチドも開示する。
本明細書に記載のＣＨ２及び／又はＣＨ３含有免疫グロブリンポリペプチドは、３０３位の荷電アミノ酸残基、又は３７０位、３８２位又は３８８位における非荷電アミノ酸残基から選択されるアミノ酸変異の２つ以上を含んでもよい。
本明細書に示されるＣＨ２領域の変異は、好ましくは、Ｖ３０３位におけるＣＨ２の変異である。変異は、好ましくは、中性アミノ酸から荷電アミノ酸への変異である。例としては、Ｖ３０３Ｒ、Ｖ３０３Ｋ、Ｖ３０３Ｄ又はＶ３０３Ｅの変異である。好ましい変異は、例に記載したようなＶ３０３Ｋ変異又はＶ３０３Ｅ変異である。
本明細書に示されるＣＨ３領域の変異は、好ましくは、Ｋ３７０位、Ｅ３８２位、Ｅ３８８位、又はそれらの組合せにおけるＣＨ３の変異である。Ｋ３７０位における変異は、好ましくは、荷電アミノ酸から中性アミノ酸への変異である。例としては、Ｋ３７０Ｑ、Ｋ３７０Ｎ、Ｋ３７０Ｈ、Ｋ３７０Ｓ、Ｋ３７０Ｔ、又はＫ３７０Ｙ変異である。好ましい変異は、例に記載したようなＫ３７０Ｓ又はＫ３７０Ｔ変異である。Ｅ３８２位における変異は、好ましくは、荷電アミノ酸から中性アミノ酸への変異である。例としては、Ｅ３８２Ｑ、Ｅ３８２Ｎ、Ｅ３８２Ｈ、Ｅ３８２Ｓ、Ｅ３８２Ｔ、又はＥ３８２Ｙ変異である。好ましい変異は、例に記載したようなＥ３８２Ｑ又はＥ３８２Ｔ変異である。Ｅ３８８位における変異は、好ましくは、荷電アミノ酸から中性アミノ酸への変異である。例としては、Ｅ３８８Ｑ、Ｅ３８８Ｎ、Ｅ３８８Ｌ、Ｅ３８８Ｓ、Ｅ３８８Ｔ、又はＥ３８８Ｍ変異である。好ましい変異は、例に記載したようなＥ３８８Ｌ、Ｅ３８８Ｍ、又はＥ３８８Ｔ変異である。
本明細書に記載したような免疫グロブリンポリペプチドは、好ましくは抗体、好ましくは多重特異性抗体である。
抗体は、ヒンジ位置の２１６に正に荷電したアミノ酸残基を更に含んでもよい。
抗体は、Ｔ１９７から選択されるアミノ酸及びヒンジ位置のＥ２１６における変異を更に含んでもよい。
また、ＣＨ１ドメインにおける次の変異Ｇ１２２Ｐ、Ｉ１９９Ｖ、Ｎ２０３Ｉ、Ｓ２０７Ｔ、及びＶ２１１Ｉの１つ以上を更に含む、本明細書に記載の免疫グロブリンドメイン、免疫グロブリン領域ポリペプチド、タンパク質又は抗体を含む、組成物も開示する。
本発明は、本明細書に記載の抗体又は免疫グロブリンタンパク質の間、本明細書に記載の二重特異性抗体と単特異性抗体との間、本明細書に記載の多重特異性抗体と他の多重特異性及び単特異性抗体並びに半抗体との間の分離を提供するために使用することができる。
本発明はまた、細胞によって産生される２つ以上の所望の抗体の同時精製を最適化するために使用することもできる。重鎖の一方が互換性を有するヘテロ二量体化ドメインのメンバーを有し、また、他方の重鎖が互換性を有するヘテロ二量体化ドメインの他のメンバーを有する、例えば、一方においてＣＨ３ ＤＥ領域、他方においてＣＨ３ ＫＫ領域を有する、共通軽鎖と対を形成することができる３つ以上の重鎖を提供することによって、２つ以上の二重特異性抗体が産生され得る。本発明によって１つ以上の重鎖の電荷を調整することにより、電荷及び／又はｐＩを利用する分離方法において共泳動するヘテロ二量体重鎖を含有する抗体を提供することができる。電荷を調整して、共泳動するヘテロ二量体重鎖を含有する抗体が、それぞれの単量体重鎖を含有する抗体及び／又は半抗体とは異なる位置に泳動するようにすることができる。
更に、第１ＣＨ１領域又はＣＨ１含有免疫グロブリンポリペプチド及び第２ＣＨ１領域又はＣＨ１含有免疫グロブリンポリペプチドを含む、免疫グロブリンタンパク質を提供し、第１及び／又は第２ＣＨ１領域又はＣＨ１含有免疫グロブリンポリペプチドは、表面に露出していないＣＨ１領域内のアミノ酸から選択される１つ以上のアミノ酸の１つ以上の変異を含み、それにより、第１ＣＨ１領域又はＣＨ１含有免疫グロブリンポリペプチド及び第２ＣＨ１領域又はＣＨ１含有免疫グロブリンポリペプチドを含む免疫グロブリンタンパク質の等電点は、第１ＣＨ１領域又はＣＨ１免疫グロブリンポリペプチドのみを含有する免疫グロブリンタンパク質の等電点、又は第２ＣＨ１領域又はＣＨ１免疫グロブリンポリペプチドのみを含有する免疫グロブリンタンパク質の等電点とは異なる。
一実施形態では、本発明は、例えば二重特異性抗体又は多価多量体などの重鎖ドメインを含む、少なくとも２つの異なる重鎖可変領域及び共通軽鎖を含む、少なくとも２つの異なるポリペプチドを含む、タンパク質に関する。本発明は更に、このようなタンパク質を製造及び分離する手段及び方法に関する。２つの異なる免疫グロブリン可変領域ポリペプチドを含むタンパク質は、本明細書では、全般的に、二重特異性タンパク質、二重特異性免疫グロブリン又は二重特異性抗体と呼ばれる。２つの異なる免疫グロブリン可変領域ポリペプチドを含むタンパク質のフォーマットに基づいて、三重特異性及び／又は多重特異性フォーマットを含む３つ以上の標的／エピトープに特異的なドメインを含む、多重特異性多量体もまた生成することができ、例えば、国際出願ＰＣＴ／ＮＬ２０１９／０５０１９９号を参照されたい。当該技術分野には、所望の二重特異性又は多重特異性タンパク質又は抗体の収率を増加させるための戦略が存在するが、単特異性タンパク質又は半抗体を含む望ましくない種の生成を容易に完全に回避することはできない。したがって、二重特異性若しくは多重特異性タンパク質又は抗体を、単特異性、半抗体、又は望ましくない副産物タンパク質から分離することが、所望の二重特異性又は多重特異性タンパク質又は抗体を単離するために好ましい。更には、これらの二重特異性若しくは多重特異性タンパク質又は抗体のこのような分離が、そのようなタンパク質の臨床展開又は市販のために必要である。
本発明者らはここで驚くべきことに、免疫グロブリンポリペプチド中に埋もれた残基を含む定常領域内の表面に露出していないアミノ酸位置に荷電した残基を有する、免疫グロブリン領域、好ましくは、ＣＨ１、ＣＨ２又はＣＨ３を生成することにより、多重特異性又は二重特異性タンパク質及び単特異性タンパク質が、生成されたときに、等電点電気泳動及び従来のクロマトグラフィー法、例えば、イオン交換クロマトグラフィーなどの非親和性系クロマトグラフィーを使用することによって容易に分離して得られることを見出した。
このような免疫グロブリン領域は、定常領域を含有する免疫グロブリンポリペプチド鎖、好ましくはＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３又はそれらの組合せの１つ又は両方への電荷の追加、除去、又は逆転を含む。本発明の前には、任意のタンパク質、特に免疫グロブリンの表面に露出していないか、又は埋もれたアミノ酸の改変は、概して、このような残基の電荷の変化が、免疫グロブリンを不安定化させる影響の原因となる可能性を含めて、構造及び機能に潜在的に有害な効果を有すると理解されていたため、回避されてきた。更に、このような改変は、これらの残基がクロマトグラフィー樹脂との相互作用するようには容易に露出しないため、クロマトグラフィー特性を変化させるとは予想されなかった。
驚くべきことに、免疫グロブリンポリペプチド鎖のフレームワーク又は定常領域中、好ましくはＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３領域、又はそれらの組合せ中の表面に露出していない埋もれたアミノ酸の位置に荷電したアミノ酸を有する、免疫グロブリン領域を生成することにより、区別可能な電荷、及び異なる等電点（例えば、図１参照）を有する単特異性、二重特異性及び多重特異性タンパク質を生成することができ、それにより、二重特異性又は多重特異性タンパク質からの当該単特異性タンパク質の分離及び単離（逆も可能）、又は、望ましくないタンパク質副産物から所望のタンパク質の分離を行うことができることを発見した。更に、免疫グロブリン領域が、表面に露出していないか、又は埋もれた位置において荷電残基および他の変異を含んで生成されて、それが、野生型領域若しくはドメイン、又は電荷の変化のみを有する野生型領域若しくはドメインよりも、そのような免疫グロブリン領域の安定性を高め得る。
定常ドメインを含む変異体ドメイン、及びそのようなドメインを使用する方法は、多量体化タンパク質の生成、及びそのようなタンパク質の分離に適用できることが理解される。異なるタンパク質種が混合物中に生成されることにより、異なる種が同様の等電点（ｐＩ）を有し、分離が困難になる場合、本明細書に記載の変異体ドメインの使用、及び本明細書に記載の方法を用いて、所望の種の分離を改善することができる。
本発明は、分離用ドメインの構造及び機能に有害な影響を与えず、そのようなドメインが組み込まれた異なる多量体化タンパク質種の間に区別可能な等電点を生成する変異を選択する方法を開示する。本明細書に記載の発明は、様々な免疫グロブリン領域、例えば、ＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２及び／又はＣＨ３領域、並びにＶＨ／ＶＬ領域（特にフレームワーク領域）に適用可能な分離用ドメインを含む産物に適用される。本発明は、概して、任意の多量体タンパク質に適用することができる。例えば、生成される多量体が、少なくとも２つの異なるタンパク質（例えば、ＡおよびＢで示される）を含み、異なる多量体化タンパク質を形成することができ、それにより、生成される多量体種がＡＡ、ＡＢ、ＢＡまたはＢＢを含むことができる限り、本発明はそれに適用することができる。このような状況では、これらの多量体化タンパク質は、本発明の変異体ドメインを鎖Ａ及び／又は鎖Ｂに使用することができ、それにより、多量体種のそれぞれは、表面に露出していないか、又は埋もれた位置に電荷を有する１つ以上の変異体ドメインを含み、区別可能な等電点を有する多量体種を生成して、等電点電気泳動によって、及び／又はイオン交換クロマトグラフィー中の区別される保持時間に基づいてなどの当業者に既知の方法によって分離が可能になる。
上の原理はまた、二重特異性抗体の作製にも適用することができる（２つの異なる重鎖及び２つの異なる軽鎖が発現される場合、最大１０種が得られ、又は２つの異なる重鎖及び共通軽鎖が発現される場合、又は２つの異なる軽鎖及び共通重鎖が発現される場合、３種が得られる）。上記の原理はまた、より高次の多量体にも適用することができる。
多量体が二重特異性抗体である場合、電荷の追加、低減、又は反転を含む、表面ではないか又は埋もれた位置における電荷の変化を有する変異体免疫グロブリン領域を用いることができる。例えば、荷電したＣＨ１領域を用いてもよく（図１Ａ～Ｃに例示するように）、又は荷電したＣＨ２領域を用いてもよく（図１Ｄに例示するように）、軽鎖の荷電したＣＬ領域を用いてもよく（図１Ｅ）、又は荷電したＣＨ３領域を用いてもよい。
このような多量体はまた、例えば（図２Ａ及び図２Ｂに例示するように）ＣＨ１領域又はＣＬ領域の変異を含むＶＨ及びＶＬからなる例えば３つの可変ドメインを含んでもよいように、三価又は四価であってもよい。
本明細書においてなされる、ＣＨ１領域、又は任意の他の好適な領域若しくはドメインなどの免疫グロブリン領域の「変異」への言及は、例えば、抗体などの多量体タンパク質産物が変異していることを意味するものではなく、多量体タンパク質が、例えば野生型ドメインとは異なる本明細書に記載の分離用変異体を有するドメインを含むことを意味すると理解される。すなわち、このようなドメインは、野生型ドメイン中の表面に露出していない残基における差異を含有し、それによって電荷差が生成され、それを使用して、多量体化タンパク質の混合物からの分離を容易にすることができる。したがって、変異という用語は、二重特異性抗体に含まれるものなどの免疫グロブリンポリペプチドのアミノ酸配列が、例えば、ヒトＩｇＧ１配列などの参照配列とは異なるアミノ酸配列を有するという事実を指す。
所望の位置に所望の残基を有するアミノ酸配列は、例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３領域、又はそれらの組合せの参照配列と比較して、アミノ酸配列中に変異を含むライブラリから選択され得ることが理解される。したがって、変異という用語は、アミノ酸配列を得る方法とは無関係に、所望の位置に所望のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を指す。アミノ酸の変異を、本明細書に記載のように、例えば、非表面アミノ酸、好ましくは埋もれたアミノ酸におけるアミノ酸の変異と称する代わりに、これらの変異が所望の多量体種の分離を可能にすることから、「分離用アミノ酸残基」と称することもできる。
タンパク質産物はタンパク質をコードするＤＮＡ構築物から産生することができ、したがって、タンパク質産物の変異は、当該タンパク質をコードするＤＮＡ構築物にその起源を有する。本明細書には、例えば元の核酸に必要な変異、置き替え、置換、挿入、又は欠失のいずれの手段を用いることなく、例えばＤＮＡ合成を介して、例えば最初からそのような変異をコードする核酸を含んで生成することができる構築物を含む、当該技術分野において既知のこのような変異を生成する任意の好適な手段が包含される。変異ドメインを生成するそのような方法は、容易に使用することができる状態にあり、例えば、任意の可変領域（または、改変可変領域を使用する場合は、そこに含まれるＣＤＲ配列の任意の組合せ）をコードする任意の好適な核酸と組み合わせることができる。等電点での区別を提供する本明細書に記載の好適なアミノ酸変異を有するコードされた定常領域と組み合わせて、選択した可変領域をコードする構築物をデノボで簡単に合成することができる。例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３をコードする配列を提供して、選択されたＶＨをコードする配列と組み合わせることができ、この組合せは、インシリコ（及びデノボ合成され）及び／又はインビトロ（例えば、ライゲーション／クローニングなどの分子生物学の技術を使用して）、及び生成された発現カセットで行うことができる。可変領域（核酸配列によりコードされる）の好適な組合せの配列を提供することによって、これらは、例えば非表面アミノ酸、好ましくは埋もれたアミノ酸、好ましくはＣＨ１領域内の変異を有する本発明による変異をコードする、本発明による好適な定常領域、例えば、ＣＬ又はＣＨ１、及びＣＨ２及び／又はＣＨ３と容易に組み合わせることができる。
例えば、共通軽鎖及び２つの別個の重鎖などの多量体タンパク質を含む構成要素、例えばポリペプチドをコードする、好適な発現カセットを含む細胞を提供することもできる。当該細胞は、最初から、分離のための好適な変異体ドメインをコードする安定的に組み込まれた核酸を有してもよい。このような細胞には、その後、選択されたＶＬ若しくはＶＨ領域、又は両方をコードする核酸を組み込む（又はＶＬ領域及び／若しくはＶＨ領域を置き換える）ことのみが必要であり、次いで、それは変異体ドメインに基づいて容易に分離することができる多量体タンパク質の混合物を産生することができる。したがって、本明細書に記載する本発明の一態様は、共通軽鎖、及び本明細書に記載の分離用アミノ酸残基を含む１つ以上のドメインを含む定常領域をコードする核酸がそのゲノムに安定的に組み込まれた、宿主細胞を含む。好ましくは、本発明は、重鎖可変領域と組み合わせるための負に荷電した分離用アミノ酸残基を含むドメイン、及び第２の重鎖可変領域と組み合わせるための正に荷電した分離用アミノ酸残基を含むドメインをコードする、核酸を含む。好ましくは、当該２つのコードされた重鎖可変領域は異なるｐＩを有し、より正に荷電した可変領域は正に荷電した分離用アミノ酸残基を含むドメインに連結され、より負に荷電した可変領域は負に荷電した分離アミノ酸残基を含むドメインに連結される。
本発明はまた、多くの当該変異又は分離用アミノ酸残基を開示する。これらの変異はタンパク質の非表面残基を含むことから、これらの変異は、例えば、多重特異性タンパク質、特に多重特異性抗体中のＣＨ１領域などの分離に使用されるドメインの表面において潜在的な抗原性モチーフの露出を生じない場合があり、これらの変異が望ましくない免疫学的影響を低減し得るため有益である。更に、当該変異はタンパク質の表面ではないため、本明細書に開示する選択された変異は概して、本明細書に開示するような変異を含む定常領域又はフレームワーク領域、及び互換性を有するヘテロ二量体化領域（例えば、ＣＬ、ＣＨ２又はＣＨ３ドメイン）、好ましくは少なくとも２つの定常領域ドメイン、より好ましくは免疫グロブリンポリペプチドを含むＣＨ１を含む任意の二重特異性又は多重特異性タンパク質に有益に適用することができる。好ましくは、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを有する本発明による多重特異性タンパク質は、フレームワーク又は定常領域、好ましくは、ＣＨ１のＣＨ／ＣＬ界面に有害な影響を与えない表面に露出していないか、又は埋もれたＣＨ１領域、又は残基がＦｃ界面で改変されたＣＨ２ＣＨ３／ＣＨ２ＣＨ３ドメイン内で選択される１つ以上のアミノ酸の変化を有する。
あるいは、本発明の多重特異性タンパク質は、ＣＬと対を形成する必要がないＣＨ１領域などの分離用ドメインを含んでもよい。例えば、ＣＨ１は、カメリドのＣＨ１であってもよく、又は、カメリドのＣＨ１又はサメなどの軽鎖を欠いている他の生物に基づいてもよく、又は疎水性残基を欠き、軽鎖と対を形成しない改変ＣＨ１領域であってもよく、そのドメインは、表面に露出していない残基における変異を含んで等電点に差異を生じて、他のタンパク質及び断片からの多重特異性タンパク質の分離を容易にする。
ＣＨ１領域にそのような変異を含むことにより、当該変異体は、典型的にはＣＨ２ＣＨ３／ＣＨ２ＣＨ３界面におけるペプチドのＦｃ／Ｆｃリセプターの相互作用又は多量体化（例えば、ヘテロ又はホモ二量体化）に影響を与えない。好ましくは、本発明のドメインは、野生型ドメインと比較して、又は１つ以上の分離用残基のみを含むドメインと比較して安定性を有益に改善することができる別の変異に加えて、フレームワーク又は定常領域内、好ましくはＣＨ１領域内に、表面に露出していないか、又は埋もれた、選択された１つ以上の分離用残基を含む。
したがって、一実施形態では、第１ＣＨ１含有免疫グロブリンポリペプチド及び第２ＣＨ１含有免疫グロブリンポリペプチドを含む、二重特異性タンパク質、特に抗体を提供し、第１及び／又は第２ＣＨ１含有免疫グロブリンポリペプチドは、表面に露出していないか、又は埋もれた１つ以上の変異体分離用アミノ酸残基の変異を含み、それにより、第１ＣＨ１含有免疫グロブリンポリペプチド及び第２ＣＨ１含有免疫グロブリンポリペプチドを含む免疫グロブリンタンパク質の等電点は、第１ＣＨ１含有免疫グロブリンポリペプチドのみを有するタンパク質の等電点、及び／又は第２ＣＨ１含有免疫グロブリンポリペプチドのみを有するタンパク質（例えば、親タンパク質）の等電点とは異なる。
一実施形態では、ＣＨ１を含有する免疫グロブリンの変異により、イオン交換クロマトグラフィー上で免疫グロブリンの保持時間が延長又は短縮する。
これは、例えば、第３ＣＨ１含有免疫グロブリンポリペプチドを含む免疫グロブリンポリペプチド並びに二量体化する第１及び第２ＣＨ１領域を有する免疫グロブリンポリペプチドを含む、多重特異性抗体にも当てはまり、第１及び第２ＣＨ１含有免疫グロブリンポリペプチドは、表面に露出していないか、又は埋もれたＣＨ１領域内のアミノ酸から選択される１つ以上のアミノ酸の１つ以上の変異体分離用残基を含み、それにより、第１及び第２ＣＨ１含有免疫グロブリンポリペプチド並びに第３ＣＨ１含有免疫グロブリンポリペプチドを含む免疫グロブリンタンパク質の等電点は、第１ＣＨ１及び第２ＣＨ１含有免疫グロブリンポリペプチドのみを有するタンパク質の等電点、及び／又は第３ＣＨ１含有免疫グロブリンポリペプチドのみを有するタンパク質（例えば、親タンパク質）の等電点とは異なる。図２Ｂを参照されたい。
第１及び第２ＣＨ１含有免疫グロブリンポリペプチドを含む二重特異性タンパク質は、それぞれのタンパク質の等電点が類似しており、イオン交換などの従来のクロマトグラフィー法を使用して親タンパク質（例えば、単特異性二価抗体）から分離することが困難であることが理解される。実施例のセクションに示すように、等電点の類似性は、選択されたクロマトグラフィーカラムにおける同様の保持時間で示される。類似性はまた、実施例に示すように、例えば、等電点電気泳動を使用して決定することができる。免疫グロブリンドメインを含有する抗体又はタンパク質の混合物の製造中、保持時間が同様である場合があり、それにより、それぞれのタンパク質のピークが重なり、分離が困難になる。第１及び第２ＣＨ１含有免疫グロブリンポリペプチドに関して言及される用語「第１」及び「第２」は、いずれの順序又は選好も示唆せず、単にこれらの鎖が異なることを示すために使用されることもまた理解される。
本発明によるＣＨ１領域の変異は、二重特異性抗体の等電点に影響を及ぼし、電荷の追加、除去、又は反転が含まれることが理解される。ＣＨ１含有ポリペプチドなどへの電荷の追加は、生成された各免疫グロブリンポリペプチドのＣＨ１領域の１つ又はそれぞれに存在してもよい。電荷の追加は様々な手段によって行うことができる。中性アミノ酸は、（典型的には、発現構築物中のコードするＤＮＡレベルで）変化させることができ、負電荷又は正電荷を有するアミノ酸のいずれかに変化させて、負電荷及び正電荷をそれぞれ追加することができる。正に荷電したアミノ酸を、中性電荷又は負電荷を有するアミノ酸に変化させて、負電荷を追加することができ、正電荷から負電荷にアミノ酸を変化させて、比較的大きな変化を得ることができる。逆に、負に荷電したアミノ酸を、中性電荷又は正電荷を有するアミノ酸に変化させて、正電荷を追加することができ、負電荷から正電荷にアミノ酸を変化させて、比較的大きな変化を得ることができる。
したがって、更なる実施形態では、本発明による免疫グロブリンタンパク質は、１つ以上の、表面に露出していないか、又は好ましくは埋もれたアミノ酸の、
中性アミノ酸から負に荷電したアミノ酸、
正に荷電したアミノ酸から中性アミノ酸、
正に荷電したアミノ酸から負に荷電したアミノ酸、
中性アミノ酸から正に荷電したアミノ酸、
負に荷電したアミノ酸から中性アミノ酸、
負に荷電したアミノ酸から正に荷電したアミノ酸への変異からなる群から選択される１つ以上の変異を含む。
正電荷を有するアミノ酸は、リジン（Ｌｙｓ、Ｋ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、及びヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）である。好ましくは、正電荷を有するアミノ酸を鎖に含ませるか、又は親ドメインから変化させる場合、リシンを選択する。負電荷を有するアミノ酸は、グルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）及びアスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）である。等電点の観点から見た残りのアミノ酸は、中性アミノ酸を表す。好ましくは、更なる実施形態では、本発明による免疫グロブリンタンパク質は、１つ以上の表面に露出していないか、又は好ましくは埋もれたアミノ酸の、
中性アミノ酸から負に荷電したアミノ酸、
正に荷電したアミノ酸から中性アミノ酸、
正に荷電したアミノ酸から中性アミノ酸、及び
負に荷電したアミノから中性アミノ酸への変異からなる群から選択される１つ以上の変異を含む。
これらの変異は、保存的な設計変更として好ましい場合がある。
本発明による単特異性、二重特異性、及び例示的な多重特異性抗体を概略的に示した図１及び２に例示するように、ＣＨ１含有免疫グロブリンのいずれか一方又は両方を変化させることができる。ＣＨ１含有免疫グロブリンの一方などに選択される変異は、好ましくは同じタイプのものであり、すなわち、正電荷を１つの鎖に追加した場合、その鎖には（追加効果を有するように）正電荷を加える１つ以上の変異が選択されることが理解される。また、鎖の１つが正電荷を有し、他方の鎖が同様に１つ以上の変異を含む場合、他の鎖に選択される変異又は複数の変異は、好ましくは、負電荷の追加を含むように選択され、その理由は、そうでなければ、第１及び第２ＣＨ１含有免疫グロブリンを含有する異なる対を形成した免疫グロブリンタンパク質の等電点への影響が典型的には、打ち消されるか、又は更には無効にされるためであることが理解される。
したがって、一実施形態では、第１ＣＨ１含有免疫グロブリンポリペプチド及び第２ＣＨ１含有免疫グロブリンポリペプチドを含む、免疫グロブリンタンパク質を提供し、第１及び／又は第２ＣＨ１含有免疫グロブリンポリペプチドは、表面に露出していないＣＨ１領域内のアミノ酸から選択される１つ以上のアミノ酸の１つ以上の変異を含み、第１ＣＨ１含有免疫グロブリンポリペプチドは、
中性アミノ酸から負に荷電したアミノ酸、
正に荷電したアミノ酸から中性アミノ酸、及び
正に荷電したアミノ酸から負に荷電したアミノ酸への変異から選択される変異を含み、
第２ＣＨ１含有免疫グロブリンポリペプチドは、
中性アミノ酸から正に荷電したアミノ酸、
負に荷電したアミノ酸から中性アミノ酸、
負に荷電したアミノ酸から正に荷電したアミノ酸への変異から選択される変異を含む。
別の実施形態では、第１ＣＨ１含有免疫グロブリンポリペプチド及び第２ＣＨ１含有免疫グロブリンポリペプチドを含む、免疫グロブリンタンパク質を提供し、第１及び／又は第２ＣＨ１含有免疫グロブリンポリペプチドは、表面に露出していないＣＨ１領域内のアミノ酸から選択される１つ以上のアミノ酸の１つ以上の変異を含み、
第１ＣＨ１含有免疫グロブリンポリペプチドは、
中性アミノ酸から負に荷電したアミノ酸、及び
正に荷電したアミノ酸から中性アミノ酸への変異から選択される変異を含み、
第２ＣＨ１含有免疫グロブリンポリペプチドは、
正に荷電したアミノ酸から中性アミノ酸、及び
負に荷電したアミノから中性アミノ酸への変異から選択される変異を含む。
一実施形態では、第１ＣＨ１含有免疫グロブリンポリペプチド及び第２ＣＨ１含有免疫グロブリンポリペプチドは、ＣＨ１領域のアミノ酸配列に対してアラインメントしたとき、好ましくは実質的に同一であり、好ましくは本明細書に定義されるアミノ酸位置に関してのみ区別される。好ましくは、第１及び第２ＣＨ１含有ポリペプチドのＣＨ１領域の間で異なるアミノ酸の位置は、表面に露出していないアミノ酸の位置に関して異なる。当該ＣＨ１含有ポリペプチドは、好ましくは、ヒトＩｇＧ１免疫グロブリンのＣＨ１領域である。本明細書に記載の変異体残基を含む分離用ドメインの生成又は比較に好適なＣＨ１領域のアミノ酸配列の一例を図１４Ａに示す。
更なる実施形態では、本発明による免疫グロブリンタンパク質は、ＣＨ１領域内のアミノ酸から更に選択される第１ＣＨ１含有免疫グロブリンポリペプチド及び／又は第２ＣＨ１含有免疫グロブリンポリペプチドを安定化する変異を更に含む。本明細書に記載の分離用残基を含有するドメインを含むポリペプチド及び／又は二重特異性若しくは多重特異性タンパク質の安定性を向上させるための更なる変異を導入してもよい。
好ましくは、免疫グロブリンポリペプチド中の表面に露出していないか、又は埋もれた分離用残基は、野生型ドメインなどの参照ドメインと比較して、相対的に安定性が向上する場合がある。
本明細書で使用する場合、用語「表面に露出していない」とは、デフォルトパラメータを使用したＧＥＴＡＲＥＡ１．０βプログラムにおいて「比（％）」が５０％以下のスコアリングであることを意味し、このプログラムにおいて５０％超の比（％）は「Ｏｕｔ」又は「表面に露出」としてスコアリングされる。本明細書で使用する場合、用語「埋もれた」とは、デフォルトパラメータを使用したＧＥＴＡＲＥＡ１．０βプログラムにおいて２０％以下の「比（％）」のスコアリングを意味し、このプログラムにおいて「Ｉｎ」とスコアリングされる。Ｎｅｇｉら、「Ｓｏｌｖｅｎｔ Ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ Ｓｕｒｆａｃｅ Ａｒｅａｓ，Ａｔｏｍｉｃ Ｓｏｌｖａｔｉｏｎ Ｅｎｅｒｇｉｅｓ，ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｇｒａｄｉｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」，Ｌａｓｔ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｗｅｄ １７Ｔｈ Ａｐｒｉｌ，３：００ＰＭ，２０１５。その領域を含有するタンパク質ドメインの一次アミノ酸及び構造モデルを、ＧＥＴＡＲＥＡプログラムへの入力として使用し、本明細書の実施例に示すようなＧＥＴＡＲＥＡ出力ファイルにおける「比（％）」を得る。ここで、本明細書において埋もれたアミノ酸と称する場合、表１及び表２０～表２２に示すように、２０％以下、好ましくは１５％以下の比（％）のスコアリングを有するアミノ酸又はその変異を指す。いくつかの実施形態では、埋もれたアミノ酸という呼称は、表１及び表２０～表２２に示すように、１０％以下の比（％）のスコアリングを有するアミノ酸又はその変異を指す。
ＣＨ領域の構造情報は、ＣＨ領域のそれぞれについていくつかの高解像度構造を有するＰｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋから得ることができるか、又は（例えば、変異を含むＣＨ領域の構造をモデリングするためのホモロジーモデリングツール；（ｈｔｔｐ：／／ｓｗｉｓｓｍｏｄｅｌ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇを使用した）ホモロジーモデリングによって得ることができる。ｐｄｂフォーマットで提供される選択されたＣＨ１領域などの構造情報を、ＧＥＴＡＲＥＡプログラムにインポートし（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋフォーマット、Ｘ線回折及びＮＭＲ試験から導かれた巨大分子構造データの標準的な表現を提供）、それは解析のための入力で比（％）のスコアリングを記録する。
本明細書で使用する場合、「ｐＩ」は、デフォルトパラメータを使用した、ＥｘＰＡＳｙ、ＰｒｏｔＰａｒａｍツールによる一次アミノ酸に基づいて計算される。ＰｒｏｔＰａｒａｍは、Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ又はＴｒＥＭＢＬ又はユーザが入力したタンパク質配列に保存された所与のタンパク質に対する様々な物理的及び化学的パラメータの計算を可能にするツールである。計算されたパラメータは、理論上のｐＩを含む。Ｇａｓｔｅｉｇｅｒ Ｅ．、Ｈｏｏｇｌａｎｄ Ｃ．、Ｇａｔｔｉｋｅｒ Ａ．、Ｄｕｖａｕｄ Ｓ．、Ｗｉｌｋｉｎｓ Ｍ．Ｒ．、Ａｐｐｅｌ Ｒ．Ｄ．、Ｂａｉｒｏｃｈ Ａ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｏｏｌｓ ｏｎ ｔｈｅ ＥｘＰＡＳｙ Ｓｅｒｖｅｒ、（Ｉｎ）Ｊｏｈｎ Ｍ．Ｗａｌｋｅｒ（ｅｄ）：Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（２００５）ｐｐ．５７１－６０７．完全長のポリペプチドを、本明細書の実施例で示すような理論的ｐＩを測定するために使用する。
実施例のセクションに示すように、例えば、Ｒｏｓｅｔｔａソフトウェア（バージョン３．１＜＜ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｒｅｓｅｔｔａｃｏｍｍｏｎｓ．ｏｒｇ／ｓｏｆｔｗａｒｅ＞＞）によるインシリコの安定性解析を実行することによって、対象となるドメインに沿って、表面に露出した残基を変更することなく、表面に露出していない残基及び埋もれた残基の各アミノ酸の位置の更なる選択を行うことができる。インシリコでの選択の代わりに、これはまたインビトロでも実施することができる。更に、実施例のセクションに示すものなど、選択は、最初の場合にインシリコであってもよく、続いてインビトロでその確認を行ってもよい。
「抗体」は、抗原上のエピトープに結合する１つ以上のドメインを含有するタンパク質の免疫グロブリンクラスに属するタンパク質性分子であり、このようなドメインは、抗体の可変領域に由来するか又はそれとの配列相同性を共有する。抗体結合は、特異性及び親和性を含む異なる性質を有する。特異性は、どの抗原又はそのエピトープが結合ドメインによって特異的に結合されるかを決める。親和性は、特定の抗原又はエピトープへの結合の強度についての尺度である。本明細書では、抗体の「特異性」は、特定の抗原に対するその選択性を指し、「親和性」は、抗体の抗原結合部位とそれが結合するエピトープとの間の相互作用の強度を指すことに注意しておくとよい。治療用の抗体は、好ましくは、可能な限り治療される対象の天然抗体（例えば、ヒト対象の場合のヒト抗体）に近いものである。本発明による抗体は、いかなる特定のフォーマット又はそれを調製する方法にも限定されない。
「二重特異性抗体」は、抗体の１つのドメインが第１抗原又はエピトープに結合する一方で、抗体の第２ドメインが第２抗原又はエピトープに結合し、当該第１及び第２抗原が同一ではないか、第１及び第２エピトープが同一ではない、本明細書に記載の抗体である。用語「二重特異性抗体」はまた、１つの重鎖可変領域／軽鎖可変領域（ＶＨ／ＶＬ）の組み合わせが抗原上の第１のエピトープに結合し、第２のＶＨ／ＶＬの組み合わせが第２のエピトープに結合する抗体を包含する。この用語は、ＶＨが第１の抗原を特異的に認識することができ、ＶＬが免疫グロブリン可変領域中のＶＨと対になって、第２の抗原を特異的に認識することができる抗体を更に含む。得られたＶＨ／ＶＬ対は、抗原１又は抗原２のいずれかに結合する。このようないわゆる「ツーインワン抗体」は、例えば、国際公開第２００８／０２７２３６号、同第２０１０／１０８１２７号、及びＳｃｈａｅｆｅｒ（Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ２０，４７２～４８６，Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０１１）に記載されている。本発明による二重特異性抗体は、いかなる特定の二重特異性フォーマット又はそれを生成する方法にも限定されない。二重特異性抗体は、多重特異性抗体である。本明細書で言及される多重特異性多量体又は抗体は、抗原上のエピトープに結合する２つ以上のドメインを含有するタンパク質の免疫グロブリンのクラスに属するタンパク質性分子を包含し、このようなドメインは、抗体の可変領域に由来するか又はそれとの配列相同性を共有し、先に出願された米国特許６２／６５０，４６７号に記載されているものなどの当該技術分野において既知の３つ以上の抗原に結合するタンパク質性分子を含む。
本明細書に記載の本発明のドメインは、それが負に荷電したアミノ酸を含むように野生型又は参照配列とは異なるフレームワーク又は定常ドメインを含み、野生型又は参照配列の対応する位置は、表面に露出していないか又は埋もれており、中性アミノ酸を含有する。あるいは、本明細書に記載の本発明のドメインは、それが正に荷電したアミノ酸を含むように野生型又は参照配列とは異なるフレームワーク又は定常ドメインを含み、野生型又は参照配列の対応する位置は、表面に露出していないか又は埋もれており、中性アミノ酸を含有する。あるいは、本明細書に記載の本発明のドメインは、それが中性アミノ酸を含むように野生型又は参照配列とは異なるフレームワーク又は定常ドメインを含み、ここで、野生型又は参照配列の対応する位置は、表面に露出していないか又は埋もれており、正又は負に荷電したアミノ酸を含有する。あるいは、本明細書に記載の本発明のドメインは、ドメインの正味のｐＩが野生型又は参照配列から１つ以上の電荷で異なるように、上記の実施形態の組合せを含む。
本明細書で使用する場合、用語「荷電アミノ酸残基」又は「荷電残基」とは、生理学的に関連するｐＨにおいて荷電した側鎖を有するアミノ酸残基を意味する。これらは、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）及びリジン（Ｌｙｓ、Ｋ）中に存在するものなどの正に荷電した側鎖のいずれであってもよく、又はアスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）及びグルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）中に存在するものなどの負に荷電した側鎖であってもよい。本明細書で使用する場合、用語「中性アミノ酸残基」又は中性残基は、生理学的に関連するｐＨで荷電した側鎖を担持しない全ての他のアミノ酸を指す。これらの中性残基としては、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、スレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）、グルタミン（Ｇｌｕ、Ｑ）、システイン（Ｃｙｓ、Ｃ）、グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、プロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）、アラニン（Ａｌａ、Ａ）、バリン（Ｖａｌ、Ｖ）、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）、チロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）、及びトリプトファン（Ｔｒｐ、Ｔ）が挙げられる。
本明細書に記載の本発明の好ましい実施形態は、上記の分離用ドメイン、及び／又はそのような分離用ドメインを含むタンパク質を含む。本明細書に記載の本発明の分離用ドメインは、免疫グロブリンドメインを有する抗体又はタンパク質に組み込むことができる。それは、単特異性又は多重特異性の任意のサブクラスのＩｇＧ又はＴ細胞受容体ドメイン若しくは免疫グロブリンに組み込むことができる。
本明細書に記載の本発明の更に好ましい実施形態は、１つ以上の結合ドメインを含むタンパク質であり、Ｎ１５９Ｋ、Ｈ又はＲ若しくはＮ１５９Ｄ又はＥの分離用残基、より好ましくはＮ１５９Ｋ又はＮ１５９Ｄの分離用残基を含むＣＨ１分離用ドメインを含む。本明細書に記載の本発明の更に好ましい実施形態は、１つ以上の結合ドメインを含むタンパク質であり、Ｎ２０１Ｋ、Ｈ又はＲ若しくはＮ２０１Ｄ又はＥの分離用残基、より好ましくはＮ２０１Ｋ又はＮ２０１Ｄの分離用残基を含むＣＨ１分離用ドメインを含む。
本明細書に記載される本発明の分離用ドメインを組み込んで提供される、本発明による単特異性、二重特異性、又は多重特異性タンパク質は、ヒトＩｇＧからのＣＨ１領域になるよう選択されるＣＨ１領域を含み、一実施形態では、それは、ＣＨ１領域内にＴ１２０、Ｋ１４７、Ｄ１４８、Ｙ１４９、Ｖ１５４、Ｎ１５９、Ａ１７２、Ｑ１７５、Ｓ１９０、Ｎ２０１及びＫ２１３を含む群から選択されるアミノ酸を含む。これらのアミノ酸位置のナンバリングは、ＥＵナンバリングに従う。
本明細書に開示する本発明のＣＨ１分離用ドメインは、Ｔ１９７Ｄに対応する安定化させる変異を更に含んでもよい。
本明細書に開示する本発明のＣＨ１分離用ドメインは、Ｅ２１６Ｋのヒンジに対応する安定化させる変異を更に含んでもよい。
本明細書に開示する本発明のＣＨ１分離用ドメインは、Ｇ１２２Ｐ、Ｓ１５７Ｔ、Ｉ１９９Ｖ、Ｎ２０３Ｉ、Ｓ２０７Ｔ、及びＶ２１１Ｉに対応する安定化させる変異を更に含んでもよい。
例えば、ヒトＩｇＧ１免疫グロブリンポリペプチド鎖のＣＨ１領域内のＴ１２０、Ｋ１４７、Ｄ１４８、Ｙ１４９、Ｖ１５４、Ｎ１５９、Ａ１７２、Ｑ１７５、Ｓ１９０、Ｎ２０１、及びＫ２１３を含む群から選択される変異アミノ酸残基による本明細書に開示するような変異を含む分離用ドメインを生成して使用することにより、製剤化及び分離中に使用されるｐＨにおいて区別可能な電荷、すなわち異なる等電点（例えば、図１を参照）を有する単特異性タンパク質、二重特異性タンパク質又は多重特異性タンパク質を生成することができ、それにより、二重特異性又は多重特異性タンパク質からの単特異性タンパク質（又は、三重特異性からの二重特異性タンパク質など）の分離及び単離が可能になる。
一実施形態では、本発明によって、免疫グロブリンポリペプチドのＣＨ１領域が、Ｄ１４８、Ｙ１４９、Ｖ１５４、Ｎ１５９、Ａ１７２、Ｓ１９０及びＮ２０からなる群から選択される、表面に露出していないか、又は埋もれたアミノ酸である、ＣＨ１領域の分離用残基を含む単特異性、二重特異性又は多重特異性タンパク質を生成する。当該タンパク質は、好ましくはヒトタンパク質、好ましくはＩｇＧタンパク質、好ましくはＩｇＧ１タンパク質である。
一実施形態では、免疫グロブリンポリペプチドのＣＨ１領域がヒトＩｇＧ１由来のＣＨ１領域であるように選択される本発明による二重特異性タンパク質において、これらのアミノ酸位置が異なる電荷を有する変異（中性、正に荷電した、及び負に荷電したアミノ酸の間での変化）を可能にすることから、ＣＨ１領域内のアミノ酸はＴ１２０、Ｋ１４７、Ｄ１４８、Ｎ１５９、Ｑ１７５、Ｎ２０１、Ｋ２１３からなる群から選択される。更なる実施形態では、表面に露出していないアミノ酸であるＣＨ１領域内のアミノ酸は、Ｎ１５９及びＮ２０１からなる群から選択され、埋もれたアミノ酸である。より好ましくは、当該免疫グロブリンタンパク質は、二重特異性抗体又は多重特異性タンパク質である。最も好ましくは、当該第１及び第２ＣＨ１含有免疫グロブリンポリペプチドはそれぞれ重鎖可変領域を含み、当該可変領域のそれぞれは異なる抗原又はエピトープに結合する。
別の実施形態では、本発明によって、第１ＣＨ１含有免疫グロブリンポリペプチド及び第２ＣＨ１含有免疫グロブリンポリペプチドを含む、二重特異性タンパク質を提供し、当該ＣＨ１領域はヒトＩｇＧ１のＣＨ１領域であり、第１又は第２ＣＨ１含有免疫グロブリンポリペプチドは、ＣＨ１領域内のアミノ酸から選択されるアミノ酸の１つ以上の変異を含み、当該変異は、Ｋ１４７Ｅ、Ｎ１５９Ｄ、Ｑ１７５Ｅ、Ｎ２０１Ｄ、及びＫ２１３Ｑからなる群から選択される１つ以上の変異、又はＴ１２０Ｋ、Ｄ１４８Ｋ、Ｎ１５９Ｋ、Ｑ１７５Ｋ、Ｎ２０１Ｋからなる群から選択される１つ以上の変異を含む。最も好ましくは、当該二重特異性タンパク質は二重特異性抗体である。
好ましい実施形態では、本発明は、第１ＣＨ１含有免疫グロブリンポリペプチド及び第２ＣＨ１含有免疫グロブリンポリペプチドを含む、免疫グロブリンタンパク質を提供し、当該ＣＨ１領域はヒトＩｇＧ１のＣＨ１領域であり、第１又は第２ＣＨ１含有免疫グロブリンポリペプチドの一方は、Ｎ１５９Ｋ及びヒンジ位置のＥ２１６Ｋの変異を含む。更なる実施形態では、第１又は第２ＣＨ１含有免疫グロブリンポリペプチドの他方は、変異を含まないか、例えば、Ｔ１９７Ｄ及びＫ２１３Ｑから選択されるものなどの１つ以上の変異を含む。好ましくは、本発明の多量体化タンパク質は２つのポリペプチドで構成され、第１ポリペプチドは第１の抗原又はエピトープに結合する第１可変ドメインを含み、第２ポリペプチドは、第１可変ドメインとは異なる抗原又はエピトープに結合する第２可変ドメインを含み、第１可変ドメインはペプチド結合を介して、ＣＨ３などの二量体化ドメインに連結された分離用ドメインに結合し、当該二量体化ドメインは、当該第２可変ドメイン、及び、好ましくは第１の分離用ドメインとは異なる電荷を有する第２の分離用ドメインにペプチド結合を介して連結された第２ＣＨ３ドメインなどの第２の二量化ドメインとの界面を形成し、好ましくは、当該タンパク質は二重特異性若しくは多重特異性タンパク質又は抗体を含む。
一実施形態では、本発明によって、単特異性、二重特異性、又は多重特異性タンパク質を生成し、免疫グロブリンポリペプチドのＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３領域又はそれらの組合せは、Ｔ１２０、Ｋ１４７、Ｄ１４８、Ｙ１４９、Ｖ１５４、Ｎ１５９、Ａ１７２、Ｑ１７５、Ｓ１９０、Ｎ２０１、及びＫ２１３、Ｖ３０３、Ｋ３７０、ＥＥ３８２及びＥ３８８からなる群から選択される、表面に露出していないか、又は埋もれたアミノ酸である、ＣＨ領域の分離用残基を含む。当該タンパク質は、好ましくはヒトタンパク質、好ましくはＩｇＧタンパク質、好ましくはＩｇＧ１タンパク質である。
一実施形態では、免疫グロブリンポリペプチドのＣＨ領域がヒトＩｇＧ１由来のＣＨ領域であるように選択される、本発明による二重特異性タンパク質において、これらのアミノ酸位置が異なる電荷を有する変異（中性、正に荷電した、及び負に荷電したアミノ酸の間での変化）を可能にすることから、ＣＨ領域内のアミノ酸はＴ１２０、Ｋ１４７、Ｄ１４８、Ｎ１５９、Ｑ１７５、Ｎ２０１、Ｋ２１３、Ｖ３０３、Ｋ３７０、Ｅ３８２及びＥ３８８からなる群から選択される。更なる実施形態では、表面に露出していないアミノ酸であるＣＨ領域内のアミノ酸は、ＣＨ１についてはＮ１５９及びＮ２０１、ＣＨ２についてはＶ３０３及びＣＨ３についてはＥ３８２及びＥ３８８からなる群から選択され、それらは埋もれたアミノ酸である。より好ましくは、当該免疫グロブリンタンパク質は、二重特異性抗体又は多重特異性タンパク質である。最も好ましくは、当該第１及び第２ＣＨ含有免疫グロブリンポリペプチドはそれぞれ重鎖可変領域を含み、当該可変領域のそれぞれは異なる抗原又はエピトープに結合する。
別の実施形態では、本発明によって、第１ＣＨ含有免疫グロブリンポリペプチド及び第２ＣＨ含有免疫グロブリンポリペプチドを含む、二重特異性タンパク質を提供し、当該ＣＨ領域はヒトＩｇＧ１のＣＨ領域であり、第１又は第２ＣＨ含有免疫グロブリンポリペプチドは、ＣＨ１領域内のアミノ酸から選択されるアミノ酸の１つ以上の変異を含み、当該変異は、Ｋ１４７Ｅ、Ｎ１５９Ｄ、Ｑ１７５Ｅ、Ｎ２０１Ｄ、Ｋ２１３Ｑ及びＶ３０３Ｅからなる群から選択される１つ以上の変異、又はＴ１２０Ｋ、Ｄ１４８Ｋ、Ｎ１５９Ｋ、Ｑ１７５Ｋ、Ｎ２０１Ｋ、Ｖ３０３Ｋ、Ｅ３８２Ｑ、Ｅ３８２Ｔ、Ｅ３８８Ｌ、Ｅ３８８Ｍ、Ｅ３８８Ｔからなる群から選択される１つ以上の変異を含む。最も好ましくは、当該二重特異性タンパク質は二重特異性抗体である。
（ＥＵナンバリングで）変異Ｌ３５１Ｄ及びＬ３６８Ｅを含むＣＨ３領域を有する第１ポリペプチド（「ＤＥアーム」）、並びに変異Ｔ３６６Ｋ及びＬ３５１Ｋを含む第２のＣＨ３領域を有する第２ポリペプチド（「ＫＫアーム」）（以降、合わせて「ＤＥＫＫ」と称される）を含む、二重特異性又は多重特異性抗体を有することにより、二重特異性又は多重特異性抗体が、単特異性抗体（又は望ましくないタンパク質副産物）よりも優先的に生成され得ることが当該技術分野において既知であり、それにより、ＤＥ／ＤＥホモ二量体又はＫＫ／ＫＫホモ二量体のいずれかを含む２つのポリペプチドよりもＤＥＫＫを形成する２つのポリペプチドが優先的に対を形成する。当該技術分野において、他の形態の電荷操作がヘテロ二量体化を促進することは既知である。
本明細書に記載の実施形態では、ＣＨ１領域などの負に荷電した分離用ドメインを使用する場合、ＤＥのＣＨ３ドメインと優先的に組み合わせ、ＣＨ１領域などの正に荷電した分離用ドメインを使用する場合、ＫＫアーム又は前述の任意の組合せと優先的に組み合わせる（例えば、１方のポリペプチド上の負に荷電した分離用ドメイン及びＤＥのＣＨ３ドメイン、並びに他方のポリペプチド上の正に荷電した分離用ドメイン及びＫＫのＣＨ３ドメインは、ヘテロ二量体を優先的に形成し、それは、二重に正に荷電した分離用ドメイン及びＫＫ／ＫＫのホモ二量体又は二重に負に荷電した分離用ドメイン及びＤＥ／ＤＥのホモ二量体のいずれからもより容易に分離される）。当業者に既知であるように、他のヘテロ二量体化技術が使用される範囲で、負に荷電した分離用ドメインを負に荷電したヘテロ二量体化ドメインと、及び／又は正に荷電した分離用ドメインを正に荷電したヘテロ二量体化ドメインと組み合わせることにより、本発明を同じ方法で適用して、ヘテロ二量体の形成及び当該ヘテロ二量体の分離を容易にする。
更なる実施形態では、本発明によって、第１ＣＨ１含有免疫グロブリンポリペプチド及び第２ＣＨ１含有免疫グロブリンポリペプチドを含む、多量体化タンパク質、好ましくは二重特異性又は多重特異性タンパク質を提供し、当該ＣＨ１領域はヒトＩｇＧ１のＣＨ１領域であり、第１ＣＨ１含有免疫グロブリンポリペプチドは、ＣＨ１領域内のアミノ酸から選択されるアミノ酸の１つ以上の変異を含み、当該変異は、Ｋ１４７Ｅ、Ｎ１５９Ｄ、Ｑ１７５Ｅ、Ｎ２０１Ｄ、及びＫ２１３Ｑからなる群から選択される１つ以上の変異を含み、また、第２ＣＨ１含有免疫グロブリンポリペプチドは、ＣＨ１領域内のアミノ酸から選択されるアミノ酸の１つ以上の変異を含み、当該変異は、Ｔ１２０Ｋ、Ｄ１４８Ｋ、Ｎ１５９Ｋ、Ｑ１７５Ｋ、及びＮ２０１Ｋからなる群から選択される１つ以上の変異を含む。最も好ましくは、当該二重特異性タンパク質は二重特異性抗体である。
別の実施形態では、本発明によって、第１ＣＨ１含有免疫グロブリンポリペプチド及び第２ＣＨ１含有免疫グロブリンポリペプチドを含む多量体化タンパク質、好ましくは二重特異性又は多重特異性タンパク質を提供し、当該ＣＨ１領域はヒトＩｇＧ１のＣＨ１領域であり、第１又は第２ＣＨ１含有免疫グロブリンポリペプチドは、ＣＨ１領域内のアミノ酸から選択されるアミノ酸の１つ以上変異及びヒンジ残基Ｅ２１６Ｋのアミノ酸の変異を含み、前者の変異は、Ｋ１４７Ｅ及びＱ１７５Ｅ、Ｎ２０１Ｄ及びＫ２１３Ｑ、Ｔ１９７Ｄ及びＫ２１３Ｑ、Ｎ１５９Ｄ及びＫ２１３Ｑ、並びにＫ２１３Ｑからなる群から選択されるか、又は前者の変異は、Ｔ１２０Ｋ、Ｎ２０１Ｋ、Ｄ１４８Ｋ及びＱ１７５Ｋ、並びにＮ１５９Ｋからなる群から選択される。最も好ましくは、当該タンパク質は二重特異性抗体である。
より更なる実施形態では、本発明によって、第１ＣＨ１含有免疫グロブリンポリペプチド及び第２ＣＨ１含有免疫グロブリンポリペプチドを含む、多量体化タンパク質、好ましくは二重特異性又は多重特異性タンパク質を提供し、当該ＣＨ１領域はヒトＩｇＧ１のＣＨ１領域であり、第１ＣＨ１含有免疫グロブリンポリペプチドは、ＣＨ１領域内のアミノ酸から選択されるアミノ酸の１つ以上の変異を含み、当該変異は、Ｋ１４７Ｅ及びＱ１７５Ｅ、Ｎ２０１Ｄ及びＫ２１３Ｑ、Ｔ１９７Ｄ及びＫ２１３Ｑ、Ｎ１５９Ｄ及びＫ２１３Ｑ、並びにＫ２１３Ｑからなる群から選択され、第２ＣＨ１含有免疫グロブリンポリペプチドは、ＣＨ１領域内のアミノ酸から選択されるアミノ酸の１つ以上の変異及びヒンジ残基Ｅ２１６Ｋのアミノ酸の変異を含み、前者の変異は、Ｔ１２０Ｋ、Ｎ２０１Ｋ、Ｄ１４８Ｋ及びＱ１７５Ｋ、並びにＮ１５９Ｋからなる群から選択される。最も好ましくは、当該免疫グロブリンタンパク質は二重特異性抗体である。
一実施形態では、本発明によって、表１４パートＢに示されるＣＨ１、ＣＨ２、又はＣＨ３領域の配列を有するＣＨ領域を含む、多量体化タンパク質、好ましくは二重特異性又は多重特異性タンパク質を提供する。多量体化タンパク質、好ましくは二重特異性又は多重特異性タンパク質は、表１４パートＢのＣＨ領域の配列の２つ又は３つの組合せであるＣＨ１、ＣＨ２又はＣＨ３領域を有してもよい。それが、表１４パートＢに示すように、２つのＣＨ１、２つのＣＨ２又は２つのＣＨ３配列を有する場合、野生型ＣＨ領域と比較してその２つが反対の電荷差を有することが好ましい。したがって、一方が野生型ＣＨと比較してより正電荷を有する場合、他方は野生型ＣＨと比較してより負電荷を有することが好ましい。重鎖は、例えば、表１４パートＢのＣＨ１配列、ＣＨ２配列、及びＣＨ３配列の２つ又は３つを有することによって、表１４の配列の２つ又は３つを有することができる。このような場合、その２つ又は３つはＣＨの野生型と比較して同じ電荷差を有し得る。２つ若しくは３つの全ては野生型と比較してより正電荷であるか、又は、２つ若しくは３つの全てはより負電荷である。ここでも、多量体化タンパク質、好ましくは二重特異性又は多重特異性タンパク質は、そのような重鎖の２つを有してもよく、そのような場合、２つは、野生型重鎖と比較して反対の電荷差を有することが好ましい。
多量体化タンパク質、好ましくは二重特異性又は多重特異性タンパク質は、好ましくは多重特異性抗体、好ましくは二重特異性抗体である。
二重特異性抗体などの対象とする多重特異性タンパク質の形成を促進し、それによって単特異性二価（親）の含有量をが低減するための、様々なアプローチが当該技術分野において報告されている。抗体において、ＣＨ３ＣＨ３相互作用が、Ｆｃの二量体化を駆動する。２つのＣＨ３領域の間の界面におけるＣＨ３領域のアミノ酸の変異を導入して、二重特異性の形成を促進し、及び／又は単特異性の親形成を阻害することができる（例えば、適合性／反発性の電荷又は立体的（非）適合性の導入によって）。このようなアプローチは有益なことに、本明細書に記載のＣＨ１領域の変異と組み合わせることができる。
したがって、更なる実施形態では、本発明による免疫グロブリンタンパク質を提供し、第１及び第２ＣＨ１含有免疫グロブリンポリペプチドがＣＨ３領域を含み、第１及び第２ＣＨ１含有免疫グロブリンポリペプチドの一方は、（ＥＵナンバリングで）ＣＨ３の変異Ｌ３５１Ｄ及びＬ３６８Ｅを含み、他方は、ＣＨ３の変異Ｔ３６６Ｋ及びＬ３５１Ｋを含む（「ＤＥＫＫ」とも呼ばれる）。
これらのいわゆるＤＥＫＫ変異は、第１及び／又は第２ＣＨ１含有免疫グロブリンポリペプチドへの電荷の追加と整合していることが理解される。このことは、ＣＨ１含有免疫グロブリンポリペプチドが、負電荷が追加された変異を含む場合、その鎖は、好ましくは、Ｌ３５１Ｄ及びＬ３６８ＥのＣＨ３の残基を有し、他方の鎖は、変異体ＣＨ１領域である必要がなく（ただし、であってもよい）、ＣＨ３のＴ３６６Ｋ及びＬ３５１Ｋ残基を有することを意味する。逆に、このことは、ＣＨ１含有免疫グロブリンポリペプチドが、正電荷が追加された変異を含む場合、その鎖は、好ましくは、Ｔ３６６Ｋ及びＬ３５１ＫのＣＨ３の変異を有し、他方の鎖は、変異体ＣＨ１領域である必要はなく、Ｌ３５１Ｄ及びＬ３６８ＥのＣＨ３残基を有することを意味する。好ましくは、本発明による当該免疫グロブリンタンパク質は、ヒト免疫グロブリンのＦｃ領域を含み、最も好ましくは、当該ヒト免疫グロブリンのＦｃ領域は、ＩｇＧ１のＦｃ領域である。上記のように、ＣＨ３の電荷を変化させる他の技術がヘテロ二量体の形成に用いられてもよい場合、本発明の多量体化タンパク質の好ましい実施形態は、当該多量体化タンパク質のヘテロ二量体化および分離を容易にするために、負電荷を有するＣＨ３などの多量体化ドメインをさらに含む負電荷を有する分離用ドメイン含有免疫グロブリンポリペプチド、及び正電荷を有するＣＨ３などの多量体化ドメインを更に含む正電荷を有する分離用ドメイン含有免疫グロブリンポリペプチドを含む。
用語「ＣＨ１領域」、「ＣＨ２領域」及び「ＣＨ３領域」は、当該技術分野において公知である。ＩｇＧ構造は、４つの鎖、２つの軽鎖及び２つの重鎖を有し、各軽鎖は典型的には２つのドメイン、可変軽鎖及び定常軽鎖（ＶＬ及びＣＬ）を有し、各重鎖は、典型的には４つのドメイン、可変重鎖（ＶＨ）及び３つの定常重鎖ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）を有する。重鎖のＣＨ２及びＣＨ３領域は、Ｆｃ（結晶化可能断片）部分、Ｆｃ断片、Ｆｃ主鎖、又は単にＦｃと呼ばれる。ＩｇＧ分子は、ヒンジ領域及びＣＨ１とＣＬとの間でジスルフィド結合（－Ｓ－Ｓ－）によって一つに保持される２つの重鎖を有するヘテロ四量体である。重鎖の二量体化は、ＣＨ３ＣＨ３ドメインの界面に含まれる相互作用、及びヒンジ領域での相互作用を介した相互作用を含む。好適なＣＨ２、ＣＨ３、及びヒンジ領域のアミノ酸配列の例を図１４に示す。
一実施形態では、本明細書に記載の本発明による免疫グロブリンタンパク質は、抗体重鎖である第１ＣＨ１含有ポリペプチドを含む。一実施形態では、本明細書に記載の本発明による免疫グロブリンタンパク質は、抗体重鎖である第２ＣＨ１含有ポリペプチドを含む。更なる好ましい実施形態では、第１及び第２ＣＨ１含有ポリペプチドの両方は、ヒトＩｇＧ１重鎖などの抗体重鎖である。本発明による当該免疫グロブリンタンパク質は、１つ以上の抗体軽鎖を更に含むことができる。最も好ましくは、当該抗体軽鎖は、共通軽鎖である。
したがって、本明細書において使用する場合、用語「共通軽鎖」は、重鎖との対合後に得られる抗体の結合特異性を保持しながら、同一であり得る又はいくつかのアミノ酸配列の差異を有し得る軽鎖を指す。例えば、保存的なアミノ酸の変化、及び／又は重鎖と対を形成するときに結合特異性に寄与しないか、又は部分的にのみ寄与する領域におけるアミノ酸の変化などを導入し試験することなどによって、アミノ酸配列は同一ではないが、依然として機能的に同等である、軽鎖を調製又は見出すことができる。特定の共通軽鎖及びこのような機能的に同等である変異体の組み合わせは、用語「共通軽鎖」に包含される。共通軽鎖の使用についての詳細な説明は、国際公開第２００４／００９６１８号及び同第２００９／１５７７７１号を参照する。好ましくは、本発明では、生殖細胞系列様軽鎖、より好ましくは生殖細胞系列軽鎖、好ましくは再配列された生殖細胞系列ヒトκ軽鎖、最も好ましくは再配列された生殖細胞系列ヒトκ軽鎖ＩｇＶκ１－３９／Ｊκ又はＩｇＶκ３－２０／Ｊκのいずれかである共通軽鎖が使用される。本明細書に開示する本発明に包含される他の軽鎖としては、ＩｇＫＶ３－１５／ＪＫ１及びサロゲート軽鎖が挙げられ、これらもまた、共通軽鎖を構成することが当該技術分野において既知である。
共通軽鎖の使用の代替として、アンマッチな重鎖及び軽鎖の誤対合を回避するために、例えば国際公開第２００９／０８０２５１号、国際公開第２００９／０８０２５２号、及び／又は国際公開第２００９／０８０２５３号に記載されているものなどの重鎖及び軽鎖の強制対合のための手段を考えることができる。共通軽鎖可変領域、共通軽鎖のアミノ酸配列及び／又は共通軽鎖のＣＤＲ配列の例を図１３に示す。好ましい共通軽鎖は図１３ａに示す配列を有する。
ＣＨ１領域の変異体残基が、上述のように表面に露出していないアミノ酸、又は好ましくは埋もれたアミノ酸であるＣＨ１領域内のアミノ酸の中から選択されるため、これらの変異がヒト抗体の三次構造に最も近い二重特異性タンパク質を可能にすることから、このような変異は特にヒト二重特異性タンパク質に好適である。タンパク質の記述に関するヒトという用語において、第１及び第２ＣＨ１含有ポリペプチドのアミノ酸配列全体がヒト起源であることを必要とすることも、またアミノ酸配列がヒトから直接得られることを必要とすることも、意味するものではないことが理解される。ヒトドメイン、タンパク質又は抗体への言及は、アミノ酸配列のいくらかの改変、例えば、ＣＨ２操作（Ｆｃのサイレンシングを含む）、ＣＨ３操作（ヘテロ二量体化を含む）、及び／又はＦｃ操作（Ｆｃ受容体活性に影響を及ぼすことを含む）、及び分離用残基の含有を含んでもよいタンパク質を指すことが理解される。二重特異性又は多重特異性タンパク質を生成するために使用されるヒトドメインは、当該技術分野において知られているように、ヒト可変領域遺伝子セグメントをコードする重鎖、軽鎖、又はハイブリッド遺伝子座、及び／又は定常領域などのヒト免疫系の特徴を保有しているマウスから得られる、核酸配列によってコードされてもよい。国際公開第２００９／１５７７７１号。このようなタンパク質はまた、ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、及び当業者に公知の他の技術から同定されたヒト免疫グロブリンドメインをコードする核酸の同定によって得ることもできる。
本発明による多量体化タンパク質は、二重特異性又は多重特異性タンパク質、好ましくは、抗体であってもよく、それらはまた、天然には存在しないが、例えば、ヒト二重特異性抗体に結合する２つの重鎖及び２つの（共通）軽鎖の配列のようなヒト配列であってもよく、それらは、例えば、ＣＨ１領域及び／又は好ましくはＣＨ３操作などの変異を含む本明細書に記載されるようにアミノ酸配列の観点からのわずかな変異を有してもよい。
一実施形態では、軽鎖を更に含む、本発明による免疫グロブリンタンパク質は、好ましくは、表面に露出しておらず、ＣＨ１／ＣＬ界面から離れて位置するＣＨ１領域内の１つ以上のアミノ酸の１つ以上の変異を有する。このように、重鎖及び軽鎖の対合を含む抗原結合ドメインの機能に対する、全ての潜在的な影響を回避することができる。好ましくは、本発明による二重特異性タンパク質は二重特異性抗体である。より好ましくは、当該二重特異性抗体はヒト二重特異性抗体である。最も好ましくは、ヒト二重特異性抗体の当該二重特異性抗体はＩｇＧ１抗体である。
一実施形態では、表面に露出していないＣＨ１領域内のアミノ酸から選択される１つ以上の変異を含む免疫グロブリンＣＨ１含有ポリペプチドなどの本発明の分離用ドメインをコードする、核酸を提供する。更に、本明細書に記載する本発明の別の実施形態は、本発明の分離用ドメインをコードする核酸を含む、細胞又は組換え宿主細胞である。更に、別の実施形態では、本発明による第１及び第２ＣＨ１含有免疫グロブリンポリペプチドをコードする１つ以上の核酸を含む、細胞又は組換え宿主細胞を提供する。このような単離された核酸、細胞、及び組換え宿主細胞は、本明細書に開示する発明による免疫グロブリンタンパク質の産生に特に好適であり、そのような免疫グロブリンタンパク質の分離方法に好適である。
本明細書に開示する変異体分離用ドメインをコードする核酸を含む、本発明による宿主動物又はトランスジェニック動物もまた提供する。一実施形態では、当該宿主動物又はトランスジェニック動物は、本発明による野生型免疫グロブリンドメインの表面に露出していないアミノ酸残基に対応する１つ以上の分離用残基を含む免疫グロブリン領域をコードする。好ましくは、このようなトランスジェニック動物は、げっ歯類又は鳥類であり、より好ましくはマウス、ラット、又はニワトリであり、当該マウス、ラット、又はニワトリの抗体レパートリーの少なくとも一部は、ヒト抗体又はヒト化抗体である。
したがって、一実施形態では、本明細書に記載の本発明による免疫グロブリンタンパク質を含む、組成物を提供する。このような組成物は、例えば、粗細胞溶解物及び／又は濾過された粗溶解物又は半精製産物などの中間産物であってもよいことが理解される。このような組成物を更に処理する場合、例えば、本発明によるＣＨ１領域の変異による二重特異性タンパク質の取得を可能にする分離工程を含む。すなわち、本発明による二重特異性タンパク質、及び薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物を得ることができる。このような製品は、液体の形態であっても、凍結乾燥製品の形態であってもよい。任意の薬学的に許容される組成物を使用することができる。そのような薬学的に許容される組成物は、必ずしも患者に直接投与されなくてもよく、例えば、医薬製品を患者に注入するために、適切な溶液に溶解又は混合する更なる調製工程を行ってもよいことが理解される。上記のことは更に、全体にわたって更に記載されるＣＨ１領域以外の分離用ドメインを含む三重特異性タンパク質及び他の多重特異性タンパク質を含む組成物にも当てはまる。
以下に記載する更なる実施形態は、本発明による免疫グロブリンタンパク質の製造方法に関する。
一実施形態では、本発明による変異二重特異性タンパク質の製造方法を提供し、方法は、
ａ）第１ＣＨ含有免疫グロブリンポリペプチドをコードする核酸及び第２ＣＨ含有免疫グロブリンポリペプチドをコードする核酸を提供する工程であって、当該第１及び第２ＣＨ含有免疫グロブリンポリペプチドが二重特異性タンパク質をコードする、工程、
ｂ）第１ＣＨ含有免疫グロブリンポリペプチドをコードする当該核酸が、表面に露出していないＣＨ領域内の１つ以上のアミノ酸をコードするトリプレットの１つ以上の変異を含んで、それにより、第１ＣＨ含有免疫グロブリンポリペプチド及び第２ＣＨ含有免疫グロブリンポリペプチドを含む変異体二重特異性タンパク質の等電点が、第１ＣＨ含有免疫グロブリンポリペプチドのみのみを含有する単特異性タンパク質の等電点、又は第２ＣＨ含有免疫グロブリンポリペプチドのみを含有する単特異性タンパク質の等電点とは異なる、工程、
ｃ）第１ＣＨ含有免疫グロブリンポリペプチドをコードする核酸及び第２のＣＨ含有免疫グロブリンポリペプチドをコードする核酸を含む細胞を提供し、変異体二重特異性タンパク質を産生させる工程を含む。
既に述べたように、上及び下に記載したａ）及びｂ）の工程において、任意の変異をインシリコで実施できることが理解される。したがって、第１及び第２ＣＨ含有免疫グロブリンポリペプチドを、参照配列と比較しながら、完全にインシリコで変化させることができる。当該変異は、当該（変異体）核酸配列を単に提供して、これらを例えば好適な可変ドメインにライゲーションすることも含み得ることが理解される。標準的な分子技術、ＤＮＡ合成、及び／又はインシリコ設計を含む任意の構築方法を本発明によって使用することができ、上及び下に記載したａ）及びｄ）の工程で使用することができる。また、細胞への核酸の提供は、一過性及び安定的トランスフェクションなどの任意の好適な方法を含み得ることも理解される。工程ｃ）の核酸を細胞に提供する工程はまた、最終結果が、第１ＣＨ含有免疫グロブリンポリペプチドをコードする核酸及び第２ＣＨ含有免疫グロブリンポリペプチドをコードする核酸が細胞に提供され、当該細胞が変異二重特異性タンパク質を産生することができるかぎり、その一部のみを提供することを含んでもよいことが理解される。別の実施形態では、本発明による変異二重特異性タンパク質の製造方法を提供し、方法は、
ａ）第１ＣＨ含有免疫グロブリンポリペプチドをコードする核酸及び第２ＣＨ含有免疫グロブリンポリペプチドをコードする核酸を提供する工程であって、当該第１及び第２ＣＨ含有免疫グロブリンポリペプチドが二重特異性タンパク質をコードする、工程、
ｂ）第１ＣＨ含有免疫グロブリンポリペプチドをコードする核酸及び第２ＣＨ含有免疫グロブリンポリペプチドをコードする核酸が、表面に露出していないＣＨ領域内の１つ以上のアミノ酸をコードするトリプレットの１つ以上の変異を含んで、それにより、第１ＣＨ含有免疫グロブリンポリペプチド及び第２ＣＨ含有免疫グロブリンポリペプチドを含む変異二重特異性タンパク質の等電点が、第１ＣＨ含有免疫グロブリンポリペプチドのみを含有する親タンパク質の等電点、又は第２ＣＨ含有免疫グロブリンポリペプチドのみを含有する親タンパク質の等電点とは異なる、工程、
ｃ）第１及び第２ＣＨ含有免疫グロブリンポリペプチドをコードする核酸を有する細胞を提供し、変異免疫グロブリン二重特異性タンパク質を産生させる工程を含む。
好ましくは、当該変異の１つ以上を含む、本発明による当該方法は、
中性アミノ酸から負に荷電したアミノ酸に、
正に荷電したアミノ酸を中性アミノ酸に、
正に荷電したアミノ酸を負に荷電したアミノ酸に、
中性アミノ酸から正に荷電したアミノ酸に、
負に荷電したアミノ酸を中性アミノ酸に、及び
負に荷電したアミノ酸を正に荷電したアミノ酸に変化させることから選択される。
好ましくは、ＣＨ含有免疫グロブリンポリペプチドの１つが、追加された正電荷を有するか、又は追加された負電荷を有することが理解される。ＣＨ含有免疫グロブリンポリペプチドの両方が追加された電荷を有してもよく、好ましくは一方のＣＨ含有免疫グロブリンポリペプチドが追加された負電荷を有し、他方のＣＨ含有免疫グロブリンポリペプチドが追加された正電荷を有する。
したがって、更なる実施形態では、第１ＣＨ含有免疫グロブリンポリペプチド及び第２ＣＨ含有免疫グロブリンポリペプチドを含む、本発明による二重特異性タンパク質の製造方法を提供し、方法は、
ａ）第１ＣＨ含有免疫グロブリンポリペプチドをコードする核酸及び第２ＣＨ含有免疫グロブリンポリペプチドをコードする核酸を提供する工程であって、
第１及び／又は第２ＣＨ含有免疫グロブリンポリペプチドは、表面に露出していないＣＨ領域内のアミノ酸から選択される１つ以上のアミノ酸の１つ以上の変異を含み、第１ＣＨ含有免疫グロブリンポリペプチドが、
中性アミノ酸から負に荷電したアミノ酸、
正に荷電したアミノ酸から中性アミノ酸、及び
正に荷電したアミノ酸を負に荷電したアミノ酸への変異から選択される変異を含み、
第２ＣＨ含有免疫グロブリンポリペプチドが、
中性アミノ酸から正に荷電したアミノ酸、
負に荷電したアミノ酸から中性アミノ酸、及び
負に荷電したアミノ酸から正に荷電したアミノ酸への変異から選択される変異を含む、工程、
ｂ）第１及び第２ＣＨ含有免疫グロブリンポリペプチドをコードする核酸を有する細胞を提供し、二重特異性タンパク質を産生させる工程を含む。
工程ａ）において、任意の変異工程をインシリコで実施してもよいことが理解される。したがって、第１及び第２ＣＨ含有免疫グロブリンポリペプチドを、参照配列と比較しながら、完全にインシリコで変化させることができる。当該変異はまた、当該核酸配列を単に提供して、これらを例えば好適な可変ドメインをライゲーションすることも含み得ることが理解される。標準的な分子技術、ＤＮＡ合成、及び／又はインシリコ設計を含む任意の構築方法を、本発明によって使用することができ、工程ａ）に使用することができる。また、細胞への提供は、一過性及び安定的トランスフェクションなどの任意の好適な方法を含み得ることも理解される。工程ｂ）の核酸を細胞に提供する工程はまた、最終結果が、第１ＣＨ含有免疫グロブリンポリペプチドをコードする核酸及び第２ＣＨ含有免疫グロブリンポリペプチドをコードする核酸が細胞に提供され、当該細胞が変異体二重特異性タンパク質を産生することができるかぎり、その一部のみを提供することを含んでもよいことが理解される。
更なる実施形態では、ＣＨ含有免疫グロブリンポリペプチドのアミノ酸配列を変化させる工程は更に、ＣＨ領域内の１つ以上のアミノ酸に対応する更なるアミノ酸位置における安定化の改変の導入を含む。
上のことは、更に、三重特異性タンパク質及び他の多重特異性タンパク質、そのようなタンパク質をコードし、表面に露出していない残基における変異を有するＣＨ領域以外の分離用ドメインを含んでコードする、核酸の作製方法にも当てはまる。
本発明によって、本発明によるポリペプチド鎖を含む少なくとも第１及び第２ＣＨドメインをコードする核酸を含む、細胞が提供される。本発明による当該細胞は、軽鎖、好ましくは共通軽鎖をコードする核酸を更に含むことができる。本発明による免疫グロブリンタンパク質の製造には任意の細胞を用いることができ、細胞としては、例えば大腸菌、エンテロバクター、サルモネラ、バチルス、シュードモナス、ストレプトマイセスなどの細菌、例えば、出芽酵母、Ｋ．ラクティス、Ｐ．パストリス、カンジダ、又はヤロウィアなどの酵母、ニューロスポラ、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ニデュランス及びアスペルギルス・ニガーなどの糸状菌、ツマジロクサヨトウＳＦ－９又はＳＦ－２１細胞など昆虫細胞、好ましくは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳類細胞、ＢＨＫ細胞、ＳＰ２／０細胞及びＮＳ－０骨髄腫細胞を含むマウス細胞、ＣＯＳ及びＶｅｒｏ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＢＲＬ ３Ａ細胞、ハイブリドーマ、腫瘍細胞、不死化初代細胞などの霊長類細胞、Ｗ１３８、ＨｅｐＧ２、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３、ＨＴ１０８０などのヒト細胞、又はＰＥＲ．Ｃ６などのような胚性網膜細胞を含む組み換えＤＮＡ分子を発現することができる任意の細胞が挙げられる。
多くの場合、選択される発現系は、タンパク質が適切にグリコシル化されるように、哺乳類細胞発現ベクター及び宿主を伴う。ヒト細胞株を使用して、完全にヒトグリコシル化パターンを有する二重特異性抗体を得ることができる。概して、哺乳類細胞の培養物の生産性を最大化するための原理、プロトコル、及び実用的技術は、Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｍ．Ｂｕｔｌｅｒ編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９９１）に見ることができる。細胞及び組換え宿主細胞における抗体の発現は、当該技術分野において広く説明されている。したがって、本発明のタンパク質をコードする核酸は、例えばプロモーター配列、５’／３’ＵＴＲ、イントロン配列などの二重特異性タンパク質（例えば、２つの重鎖及び軽鎖）の構成成分の発現を可能にする全ての要素を含む。本発明によるタンパク質をコードする核酸は、染色体外に（安定的に）トランスフェクトされたコピーとして存在してもよく、及び／又は宿主細胞の染色体に安定的に組み込まれてもよい。後者が好ましい。
本発明の免疫グロブリンポリペプチドは宿主細胞中で発現され、当業者に概ね知られている方法によって、細胞から、又は好ましくは細胞培養培地から採取される。回収後、第１及び第２ＣＨ含有免疫グロブリンペプチド（又は同様のもの）を含む免疫グロブリンタンパク質は、当該技術分野において既知の従来の方法を使用して精製することができる。このような方法としては、沈降、遠心分離、濾過、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーを挙げることができる。ＩｇＧポリペプチドを含む抗体の混合物については、プロテインＡ、又はプロテインＧアフィニティークロマトグラフィーを好適に使用することができる（例えば、米国特許第４，８０１，６８７号及び第５，１５１，５０４号を参照）。アフィニティークロマトグラフィーを使用して捕集した後、適切なプロセスパラメータを有する直交する仕上げ工程を用いて、ＨＣＰ及びＤＮＡなどの残留するプロセス関連不純物を除去することができる。概して、精製された二重特異性抗体又は多価多量体を得るために、宿主細胞の培養、回収物の清澄化、続いて宿主細胞のＤＮＡを除去するためのタンパク質の捕集、陰イオン交換クロマトグラフィー、宿主細胞のタンパク質（ＨＣＰ）、浸出したプロテインＡ及び潜在的な凝集体を除去するためのＣＩＥＸを含む、いくつかの工程が行われ、続いて、ウイルス濾過などの更なる工程が行われる。当業者には、このような工程の順序は修正してもよく、又は個々の工程を置き換えてもよいことが理解される。例えば、仕上げ工程の代替としては、疎水性相互作用クロマトグラフィー及び混合モードクロマトグラフィーが挙げられる。
上記の処理に加えて、二重特異性タンパク質などを処理する当該方法は、産生された二重特異性タンパク質と産生された単特異性タンパク質との間の等電点の差に基づいて、産生された二重特異性タンパク質を産生された単特異性タンパク質から（又は多重特異性タンパク質を他の産生されたタンパク質から）分離する分離工程を更に含んでもよい。任意の好適な分離工程を用いることができる。選択される好適な分離工程は、等電点電気泳動であってもよい。あるいは、又は加えて、産生された二重特異性タンパク質を産生された親タンパク質から分離する分離工程を含む当該方法は、イオン交換又は疎水性相互作用を含む。実施例のセクションに示すように、ＣＨ領域内の表面に露出していないアミノ酸、好ましくは埋もれたアミノ酸の変異は、電荷に関して区別を可能にし、二重特異性タンパク質と親タンパク質との間の等電点及び／又はクロマトグラフィー特性における区別を提供することができる。このような区別によって、イオン交換及び疎水性相互作用を含む従来のクロマトグラフィーを使用してこれらのタンパク質を分離することができる。好ましい方法は、抗体などの生物学的医薬製品の処理のための工業的に適用可能な分離方法である。代替の分離方法は、分離用ドメイン及び変異の使用によって生成される電荷及び／又は等電点（ｐＩ）の差を利用する本発明の範囲内に含まれ、それには例えば、当業者に既知の技術であるキャピラリーゾーン、キャピラリー等速電気泳動、及びキャピラリー等電点電気泳動が挙げられる。
繰り返しになるが、ＣＨ領域などの分離用ドメインの変異は、本明細書に記載されるようにそれ自体で、本明細書に記載の方法において二重特異性タンパク質からの親タンパク質の十分な分離を可能にし得、例えば、ＣＨ含有免疫グロブリンポリペプチドに含まれるＣＨ３領域を変異させることによって細胞における産生の間の二重特異性タンパク質の形成を促進することができる。したがって、第１ＣＨ含有免疫グロブリンポリペプチド及び及び２ＣＨ含有免疫グロブリンポリペプチドがＣＨ３領域を含み、当該ＣＨ３領域が第１及び第２ＣＨ含有免疫グロブリンポリペプチドの間の対合を強化するＣＨ３の変異を含む、本発明による更なる方法を開示する。好ましくは、第１及び第２ＣＨ含有免疫グロブリンポリペプチドの一方が、ＣＨ３の変異Ｌ３５１Ｄ及びＬ３６８Ｅを含み、他方がＣＨ３の変異Ｔ３６６Ｋ及びＬ３５１Ｋを含む。ＤＥＫＫ残基は互いに相互作用する２つのドメインの間の界面に存在して、ＤＥ及びＫＫ鎖のヘテロ二量化を促進し、一方、２つのＫＫで改変されたＣＨ３ドメインは反発する。上記のように、ＤＥＫＫの変異は、好ましくは、アラインするように選択される（すなわち、同じポリペプチドに含まれるＣＨ３及びＣＨ領域の両方に正電荷又は負電荷を加える）ことが理解される。他の形態のヘテロ二量体化技術は当該技術分野において既知であり、例えば、ノブイントウホール技術又はエレクトロスタティックエンジニアリング手法を使用して、本明細書に記載の変異で用いることができる。
二重特異性タンパク質を生成するための上記の本発明による方法において、ＣＨ領域の変異は、好ましくは、本明細書全体を通して二重特異性タンパク質に好適であるとして定義されるような変異であり、また、好ましくは、当該二重特異性タンパク質は好ましくは本明細書全体を通して同様に記載される更なる特徴を含むように選択することができる。
好ましくは、本発明の方法において生成されるタンパク質は二重特異性抗体であり、より好ましくはヒト二重特異性抗体であり、最も好ましくはヒトＩｇＧ１である。本発明による方法において生成される当該二重特異性タンパク質において、免疫グロブリンポリペプチドのＣＨ領域がヒトＩｇＧ１由来のＣＨ領域であるように選択され、実施例のセクションに例示されるようにこれらのアミノ酸位置が、異なる電荷を有するこれらの位置において代替の残基（中性、正に荷電したアミノ酸及び負に荷電したアミノ酸の間の変化）を許容することから、ＣＨ領域内のアミノ酸はＴ１２０、Ｋ１４７、Ｄ１４８、Ｎ１５９、Ｑ１７５、Ｎ２０１、Ｋ２１３、Ｖ３０３、Ｋ３７０、Ｅ３８２、Ｅ３８８からなる群から選択される位置においてヒト野生型ＣＨ領域からの電荷差を有する。最も好ましくはアミノ酸Ｎ１５９及びＮ２０１であり、それらは埋もれたアミノ酸を表す。最も好ましくはアミノ酸Ｖ３０３、Ｅ３８２、Ｅ３８８であり、それらは埋もれたアミノ酸を表す。最も好ましくは、当該第１及び第２ＣＨ含有免疫グロブリンポリペプチドは、異なる抗原結合ドメインを提供する、すなわち、主に重鎖可変領域について異なる重鎖を表す。
別の実施形態では、本発明によって生成される二重特異性又は多重特異性タンパク質は、第１ＣＨ含有免疫グロブリンポリペプチド及び第２ＣＨ含有免疫グロブリンポリペプチドを含み、当該ＣＨ領域はヒトＩｇＧ１のＣＨ領域であり、第１又は第２ＣＨ含有免疫グロブリンポリペプチドは、ＣＨ領域内のアミノ酸から選択されるアミノ酸の１つ以上の変異を含み、当該変異は、Ｋ１４７Ｅ、Ｎ１５９Ｄ、Ｑ１７５Ｅ、Ｎ２０１Ｄ、Ｋ２１３Ｑ、Ｖ３０３Ｅ、Ｋ３７０Ｓ、Ｋ３７０Ｔからなる群から選択される１つ以上の変異、又はＴ１２０Ｋ、Ｄ１４８Ｋ、Ｎ１５９Ｋ、Ｑ１７５Ｋ、Ｎ２０１Ｋ、Ｖ３０３Ｋ、Ｅ３８２Ｑ、Ｅ３８２Ｔ、Ｅ３８８Ｌ、Ｅ３８８Ｍ、Ｅ３８８Ｔからなる群から選択される１つ以上の変異を含む。好ましくは、当該単離される免疫グロブリンタンパク質は、二重特異性抗体又は多重特異性抗体である。
更なる実施形態では、第１ＣＨ含有免疫グロブリンポリペプチド及び第２ＣＨ含有免疫グロブリンポリペプチドを含む、二重特異性又は多重特異性タンパク質が、本発明による方法で生成され、当該ＣＨ領域はヒトＩｇＧ１のＣＨ領域であり、第１ＣＨ含有免疫グロブリンポリペプチドはＣＨ領域内のアミノ酸から選択されるアミノ酸の１つ以上の変異を含み、当該変異は、Ｋ１４７Ｅ、Ｎ１５９Ｄ、Ｑ１７５Ｅ、Ｎ２０１Ｄ、Ｋ２１３Ｑ、Ｖ３０３Ｅ、Ｋ３７０Ｓ、Ｋ３７０Ｔ,からなる群から選択される１つ以上の変異を含み、第２ＣＨ含有免疫グロブリンポリペプチドはＣＨ領域内のアミノ酸から選択されるアミノ酸の１つ以上の変異を含み、当該変異は、Ｔ１２０Ｋ、Ｄ１４８Ｋ、Ｎ１５９Ｋ、Ｑ１７５Ｋ、Ｎ２０１Ｋ、Ｖ３０３Ｋ、Ｅ３８２Ｑ、Ｅ３８２Ｔ、Ｅ３８８Ｌ、Ｅ３８８Ｍ、Ｅ３８８Ｔからなる群から選択される１つ以上の変異を含む。最も好ましくは、当該生成される免疫グロブリンタンパク質は、二重特異性又は多重特異性抗体である。
別の実施形態では、第１ＣＨ１含有免疫グロブリンポリペプチド及び第２ＣＨ１含有免疫グロブリンポリペプチドを含む、二重特異性又は多重特異性タンパク質が、本発明による方法で生成され、当該ＣＨ１領域はヒトＩｇＧ１のＣＨ１領域であり、第１又は第２ＣＨ１含有免疫グロブリンポリペプチドは、ＣＨ１領域内のアミノ酸から選択されるアミノ酸の１つ以上の変異及びヒンジ残基Ｅ２１６Ｋのアミノ酸変異を含み、前者の変異は、Ｋ１４７Ｅ及びＱ１７５Ｅ、Ｎ２０１Ｄ及びＫ２１３Ｑ、Ｔ１９７Ｄ及びＫ２１３Ｑ、Ｎ１５９Ｄ及びＫ２１３Ｑ、並びにＫ２１３Ｑからなる群から選択されるか、又は前者の変異は、Ｔ１２０Ｋ、Ｎ２０１Ｋ、Ｄ１４８Ｋ及びＱ１７５Ｋ、並びにＮ１５９Ｋからなる群から選択される。最も好ましくは、当該生成される二重特異性又は多重特異性タンパク質は、二重特異性又は多重特異性ヒト抗体である。
なお更なる実施形態では、第１ＣＨ１含有免疫グロブリンポリペプチド及び第２ＣＨ１含有免疫グロブリンポリペプチドを含む、二重特異性又は多重特異性タンパク質が、本発明による方法で生成され、当該ＣＨ１領域はヒトＩｇＧ１のＣＨ１領域であり、第１ＣＨ１含有免疫グロブリンポリペプチドは、ＣＨ１領域内のアミノ酸から選択されるアミノ酸の１つ以上の変異を含み、当該変異はＫ１４７Ｅ及びＱ１７５Ｅ、Ｎ２０１Ｄ及びＫ２１３Ｑ、Ｔ１９７Ｄ及びＫ２１３Ｑ、Ｎ１５９Ｄ及びＫ２１３Ｑ、並びにＫ２１３Ｑからなる群から選択され、第２ＣＨ１含有免疫グロブリンポリペプチドは、ＣＨ１領域内のアミノ酸から選択されるアミノ酸の１つ以上の変異及びヒンジ残基Ｅ２１６Ｋにおけるアミノ酸の変異を含み、前者の変異は、Ｔ１２０Ｋ、Ｎ２０１Ｋ、Ｄ１４８Ｋ及びＱ１７５Ｋ、並びにＮ１５９Ｋからなる群から選択される。最も好ましくは、当該生成されるタンパク質は、二重特異性又は多重特異性ヒト抗体である。
中性アミノ酸から負に荷電したアミノ酸、正に荷電したアミノ酸から中性アミノ酸、及び／又は正に荷電したアミノ酸から負に荷電したアミノ酸への変異を含むＣＨ領域は、元のＣＨ領域に対して、好ましくはヒト野生型ＣＨ領域と比較して、負の電荷差を有するＣＨ領域であると言われる。この変異は、関連するｐＨにおいて、負の電荷差をＣＨ領域に提供する。中性アミノ酸から正に荷電したアミノ酸、負に荷電したアミノ酸から中性アミノ酸、及び／又は負に荷電したアミノ酸から正に荷電したアミノ酸への変異を含むＣＨ領域は、元のＣＨ領域に対して、好ましくはヒト野生型ＣＨ領域と比較して、正の電荷差を有するＣＨ領域であると言われる。本明細書に記載するように、ＣＨ領域がアミノ酸残基の２つの変異を有する場合、両方の変異がＣＨ領域に同じ方向の電荷差を提供することが好ましい。本明細書に記載するように、ＣＨ領域がアミノ酸残基の３つ以上の変異を有する場合、変異の正味の結果がＣＨ領域に電荷差を提供することが好ましい。免疫グロブリン領域は、好ましくはヒト免疫グロブリン領域である。いくつかの実施形態では、免疫グロブリン領域は、ＩｇＧ領域、好ましくはＩｇＧ１領域である。上に開示した免疫グロブリン領域は、有益なことに、抗体混合物から分離する必要がある抗体の一部として使用することができる。
本発明は更に、本明細書に記載の免疫グロブリンのＣＨ領域を含む重鎖及び軽鎖を含む、抗体を開示する。例えば、このような抗体が混合物の一部として産生される場合、ＣＨ領域に提供された電荷の変化によって、当該混合物からの当該抗体の分離が容易になり得る。好ましい実施形態では、抗体は異なる重鎖を含む。好ましい実施形態では、抗体は、二重特異性抗体又は三重特異性抗体などの多重特異性抗体である。この場合、ＣＨ領域に提供された電荷の変化によって、当該混合物からの当該二重特異性又は三重特異性抗体の分離が容易になり得る。異なる重鎖は、好ましくは、互換性を有するヘテロ二量体化領域、好ましくは互換性を有するヘテロ二量体化ＣＨ３領域を含む。一実施形態では、重鎖の一方はＣＨ３の変異Ｌ３５１Ｄ及びＬ３６８Ｅを含み、当該重鎖の他方はＣＨ３の変異Ｔ３６６Ｋ及びＬ３５１Ｋを含む。抗体は、好ましくはＩｇＧ抗体、好ましくはＩｇＧ１抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、本明細書に記載の２つ以上の免疫グロブリンのＣＨ領域を含む。ＣＨ３の変異Ｌ３５１Ｄ及びＬ３６８Ｅを含む重鎖が本明細書に記載の１つのＣＨ領域を含み、ＣＨ３の変異Ｔ３６６Ｋ及びＬ３５１Ｋを含む重鎖が本明細書に記載の別のＣＨ領域を含むことが好ましい。このような場合、一方及び他方のＣＨ領域は異なる電荷を有するＣＨ領域を含むことが好ましい。このような場合、混合物中に得られる抗体の等電点の差が更に離れ、それによって当該混合物からの当該抗体の分離が容易になる。換言すれば、一方のＣＨ領域が元のＣＨ領域と比較して負の電荷差を有するＣＨ領域である場合、他方は、好ましくは元のＣＨ領域と比較して正の電荷差を有するＣＨ領域である。同様に、一方のＣＨ領域が元のＣＨ領域と比較して正の電荷差を有するＣＨ領域である場合、他方は、好ましくは元のＣＨ領域と比較して負の電荷差を有するＣＨ領域である。ＣＨ３の変異Ｌ３５１Ｄ及びＬ３６８Ｅ並びにＣＨ３の変異Ｔ３６６Ｋ及びＬ３５１Ｋは、好ましくは、ＣＨの変異の電荷差と一致する。変異Ｌ３５１Ｄ及びＬ３６８Ｅは、好ましくは、元のＣＨ領域若しくは元の又は天然のＣＨ領域の比較残基に対して負の電荷差を有するＣＨ領域を含む重鎖に存在することが好ましい。変異Ｔ３６６Ｋ及びＬ３５１Ｋは、好ましくは、元のＣＨ領域若しくは元の又は天然のＣＨ領域の比較残基に対して正の電荷差を有するＣＨ領域を含む重鎖に存在することが好ましい。例えば、ＣＨ３の変異Ｌ３５１Ｄ及びＬ３６８Ｅを含むポリペプチドは、本明細書に記載のポリペプチドの負電荷を増加させる次のＫ１４７Ｅ、Ｎ１５９Ｄ、Ｑ１７５Ｅ、Ｎ２０１Ｄ、Ｋ２１３Ｑ、Ｖ３０３Ｅ、Ｋ３７０Ｓ、Ｋ３７０Ｔ又は他の変異の１つ以上と組み合わせることができる。同様に、ＣＨ３の変異Ｔ３６６Ｋ及びＬ３５１Ｋを含むポリペプチドは、本明細書に記載のポリペプチドの正電荷を増加させる次の変異、Ｔ１２０Ｋ、Ｄ１４８Ｋ、Ｎ１５９Ｋ、Ｑ１７５Ｋ、Ｎ２０１Ｋ、Ｖ３０３Ｋ、Ｅ３８２Ｑ、Ｅ３８２Ｔ、Ｅ３８８Ｌ、Ｅ３８８Ｍ、Ｅ３８８Ｔ又は他の変異の１つ以上と組み合わせることができる。
そのようなＣＨ１領域と互換性を有する、本明細書に記載されるようなＣＨ３ヘテロ二量化領域などの互換性を有するヘテロ二量体化領域を含む抗体は、典型的には、抗体又はその断片の電荷及び／又は等電点（ｐＩ）を利用する分離工程において、同一の重鎖を有するそれぞれの抗体、及び／又は存在する場合には半抗体からより良好に分離する。抗体は、好ましくは１つ以上の軽鎖を含む。それは、好ましくは同じ軽鎖を含む。軽鎖は、好ましくは本明細書に記載の共通抗体軽鎖である。共通軽鎖は、好ましくは、図１３Ｂ又は図１３Ｄに示すような軽鎖可変領域を含む。一実施形態では、軽鎖は、図１３Ｃに示すような軽鎖定常領域を有する。好ましい実施形態では、軽鎖は、図１３Ａ又は１３Ｅに示す軽鎖アミノ酸配列を含む。共通軽鎖は、好ましくは、図１３Ｆに示すようなＣＤＲを有する軽鎖である。抗体又はＣＨ領域は、好ましくはヒト抗体又はヒト免疫グロブリンのＣＨ領域であり、ヒトＣＨ領域は、野生型ヒトＣＨ領域内の表面に露出していない、好ましくは埋もれたアミノ酸の位置における変異を含む。
免疫グロブリン領域、好ましくは、本明細書に記載の表面に露出していない、好ましくは埋もれたアミノ酸の変異を含むＣＨ１領域又は抗体は、ＣＨ１／ＣＬの界面に存在しないアミノ酸から選択される変異を有する。Ｑ１７５の位置はＣＨ１／ＣＬ界面にあるにもかかわらず、例外的に有効かつ安定である。
免疫グロブリン領域、好ましくは、本明細書に記載の表面に露出していない、好ましくは埋もれたアミノ酸の変異を含むＣＨ３領域又は抗体は、ＣＨ３の界面に存在しないアミノ酸から選択される変異を有する。Ｋ３７０位は例外である。それは、ＣＨ３／ＣＨ３に存在する（図２２を参照）。それにもかかわらず、それは、例えばＤＥＫＫに存在するものなど、反対のＣＨ３鎖の変異を補償しない場合であっても、本明細書に示すような変異を導入するための良好な位置である。
免疫グロブリン領域、好ましくは、本明細書に記載の表面に露出していないアミノ酸の変異を含む、ＣＨ１、ＣＨ２、若しくはＣＨ３領域又は抗体は、好ましくは、任意の重鎖及び軽鎖の界面を含めて、得られるＣＨ１領域又は抗体の安定性に実質的に悪影響を及ぼさない。免疫グロブリン領域、好ましくは、本明細書に記載の表面に露出していないアミノ酸の変異を含む、ＣＨ１、ＣＨ２、若しくはＣＨ３領域又は抗体は、電荷差を生成する変異の安定性を強化する更なる変異を含んでもよい。免疫グロブリン領域、好ましくは、本明細書に記載の表面に露出していないアミノ酸の変異を含むＣＨ１領域又は抗体は、電荷差を生成する追加の変異を含んでもよい。
本発明は、上のいずれか１つの抗体の製造方法を更に提供し、方法は、
本明細書に記載のＣＨ領域を含む第１重鎖をコードする核酸を提供する工程、
第２重鎖をコードする核酸を提供する工程であって、当該第１及び第２重鎖は同じであっても異なっていてもよい、工程、
軽鎖をコードする核酸を提供する工程、
当該核酸を宿主細胞に導入し、当該宿主細胞を培養して核酸を発現させる工程、及び
抗体を宿主細胞の培養物から収集する工程を含み、方法は、抗体及び／又は抗体断片の電荷に基づいて、分離工程において抗体を他の抗体又は抗体断片から分離する工程を更に含む。一実施形態では、当該第１及び第２重鎖は、互換性を有するヘテロ二量体化領域、好ましくは互換性を有するＣＨ３ヘテロ二量体化領域を含む。
本発明は、上のいずれか１つの抗体の製造方法を更に提供し、方法は、
本明細書に記載のＣＨ領域を含む第１重鎖をコードする核酸を提供する工程、
第２重鎖をコードする核酸を提供する工程であって、当該第１及び第２重鎖は同じであっても異なっていてもよい、工程、
軽鎖をコードする核酸を提供する工程、
当該核酸を宿主細胞に導入し、当該宿主細胞を培養して核酸を発現させる工程、及び
宿主細胞の培養物から抗体を収集する工程を含み、方法は。収集物を清澄化する工程、
タンパク質を捕集する工程、
陰イオン交換クロマトグラフィーを行う工程、及び
陽イオン交換クロマトグラフィーを行い、抗体を他の抗体又は抗体断片から分離する工程を更に含む。一実施形態では、当該第１及び第２重鎖は、互換性を有するヘテロ二量体化領域、好ましくは互換性を有するＣＨ３ヘテロ二量体化領域を含む。
本発明は、上のいずれか１つの抗体の製造方法を更に提供し、方法は、
本明細書に記載のＣＨ領域を含む第１重鎖をコードする核酸を提供する工程、
第２重鎖をコードする核酸を提供する工程であって、当該第１及び第２重鎖は同じであっても異なっていてもよい、工程、
軽鎖をコードする核酸を提供する工程、
当該核酸を宿主細胞に導入し、当該宿主細胞を培養して核酸を発現させる工程、及び
宿主細胞の培養物から抗体を収集する工程を含み、方法は、ゲル上の等電電気泳動を含む分離工程において、抗体を他の抗体又は抗体断片から分離する工程を更に含む。
等電点が異なる第１重鎖及び第２重鎖を含む、多重特異性抗体の製造方法を更に提供し、方法は、
（ａ）コードされた第１重鎖の等電点及びコードされた第２重鎖の等電点が異なるように、第１重鎖をコードする核酸及び第２重鎖をコードする核酸を発現させる工程であって、当該核酸が、第１及び／又は第２重鎖、好ましくはＣＨ１領域、ＣＨ２、ＣＨ３、より好ましくはＴ１２０、Ｋ１４７、Ｄ１４８、Ｙ１４９、Ｖ１５４、Ｎ１５９、Ａ１７２、Ｑ１７５、Ｓ１９０、Ｎ２０１、Ｋ２１３、Ｖ３０３、Ｋ３７０、Ｅ３８２及びＥ３８８（ＣＨ領域におけるＥＵナンバリング）を含むコードされた免疫グロブリン領域の表面に露出していない位置から選択されるアミノ酸位置における１つ以上の変異をコードする、工程、
（ｂ）宿主細胞を培養して核酸を発現させる工程、及び
（ｃ）等電点の差を使用して、宿主細胞の培養物から多重特異性抗体を収集する工程を含む。
また、等電点が異なる第１重鎖及び第２重鎖を含む、多重特異性抗体を分離する方法も提供し、方法は、
（ａ）コードされた第１重鎖の等電点とコードされた第２重鎖の等電点が異なるように、第１重鎖のアミノ酸残基をコードする核酸及び第２重鎖のアミノ酸残基をコードする核酸の両方又はいずれか一方を発現させる工程であって、当該核酸の位置が、表面に露出していない残基においてコードされたＣＨ領域とは異なる位置であり、好ましくは、Ｔ１２０、Ｋ１４７、Ｄ１４８、Ｙ１４９、Ｖ１５４、Ｎ１５９、Ａ１７２、Ｑ１７５、Ｓ１９０、Ｎ２０１、Ｋ２１３、Ｖ３０３、Ｋ３７０、Ｅ３８２及びＥ３８８（ＣＨ領域内のＥＵナンバリング）から選択される１つ以上のアミノ酸の変異である、工程、
（ｂ）宿主細胞を培養して核酸を発現させる工程、及び
（ｃ）クロマトグラフィーによって宿主細胞の培養物から多重特異性抗体を分離する工程を含む。
好ましい実施形態では、核酸は、第１重鎖、第１重鎖のホモ多量体、第２重鎖、第２重鎖のホモ多量体、並びに第１及び第２重鎖のヘテロ多量体の保持時間が発現されたときに異なり、イオン交換クロマトグラフィー工程で分離されるように、第１重鎖及び第２重鎖をコードする。
当該核酸によりコードされる位置における変異体アミノ酸は、好ましくは、ヒト野生型ＣＨ領域の表面に露出していないアミノ酸から選択され、また、
中性アミノ酸から負に荷電したアミノ酸、
正に荷電したアミノ酸から中性アミノ酸、
正に荷電したアミノ酸から負に荷電したアミノ酸、
中性アミノ酸から正に荷電したアミノ酸、
負に荷電したアミノ酸から中性アミノ酸、及び
負に荷電したアミノ酸から正に荷電したアミノ酸から選択される。
また、等電点が異なる第１重鎖及び第２重鎖を含む、多重特異性抗体の製造方法も提供し、方法は、
第１のコードされた重鎖の等電点と第２のコードされた重鎖の等電点が異なるように、第１重鎖のＣＨ領域をコードする核酸及び第２重鎖のＣＨ領域をコードする核酸を提供する工程であって、当該ＣＨ領域の少なくとも１つが、Ｔ１２０、Ｋ１４７、Ｄ１４８、Ｙ１４９、Ｖ１５４、Ｎ１５９、Ａ１７２、Ｑ１７５、Ｓ１９０、Ｎ２０１、Ｋ２１３、Ｖ３０３、Ｋ３７０、Ｅ３８２及びＥ３８８（ＥＵナンバリング）から選択される位置のＣＨ領域におけるアミノ酸の変異を含む、工程、
宿主細胞を培養して核酸を発現させる工程、及び
宿主細胞の培養物から多重特異性抗体を、等電点の差を使用して収集する工程を含み、
宿主細胞の培養物から抗体を収集する工程、
収集物を清澄化する工程、
タンパク質を捕集する工程、
陰イオン交換クロマトグラフィーを行う工程、及び
陽イオン交換クロマトグラフィーを行い、別の抗体又は抗体断片から抗体を分離する工程を更に含む。
更に、等電点が異なる第１重鎖及び第２重鎖を含む、多重特異性抗体を精製する方法を提供し、方法は、
第１のコードされた重鎖及び第２のコードされた重鎖の等電点が異なるように、第１重鎖のＣＨ領域をコードする核酸及び第２重鎖のＣＨ領域をコードする核酸の両方又はいずれか一方を提供する工程であって、当該ＣＨ領域の少なくとも１つが、Ｔ１２０、Ｋ１４７、Ｄ１４８、Ｙ１４９、Ｖ１５４、Ｎ１５９、Ａ１７２、Ｑ１７５、Ｓ１９０、Ｎ２０１、Ｋ２１３、Ｖ３０３、Ｋ３７０、Ｅ３８２及びＥ３８８ ３（ＣＨ領域のＥＵナンバリング）から選択される位置におけるアミノ酸の変異を含む、工程、
宿主細胞を培養して核酸を発現させる工程、及び
多重特異性抗体を、等電点電気泳動により宿主細胞の培養物から精製して、多重特異性抗体を別の抗体又は抗体断片から分離する工程を含む。
第１重鎖のホモ多量体、第２重鎖のホモ多量体、並びに第１及び第２重鎖のヘテロ多量体をコードする１つ以上の核酸は、異なる等電点を有するタンパク質として発現され、イオン交換クロマトグラフィーにおいて異なる保持時間を与える。
本発明は更に、本明細書に記載の多重特異性抗体などの抗体を製造又は精製する方法を提供し、方法は、互いに対する重鎖の電荷又はｐＩの差を決定する工程、及びより多くの負の電荷／ｐＩを有する重鎖を当該第１重鎖として選択し、より多くの正の電荷／ｐＩを有する重鎖を当該第２重鎖として選択する工程を更に含む。この実施形態は、ＣＩＥＸなどの電荷による分離法において、ホモ二量体及び半抗体からの多重特異性抗体の分離を更に容易にする。本明細書で上に示すように、当該第１重鎖は、重鎖に追加の負電荷を提供する本明細書に記載の１つ以上のＣＨ１、ＣＨ２又はＣＨ３領域を含む。本明細書で上に示したことと同様に、当該第２重鎖は、重鎖に追加の正電荷を提供する本明細書に記載の１つ以上のＣＨ１、ＣＨ２、又はＣＨ３領域を含む。加えて、また本明細書で上に言及したように、第１重鎖は好ましくは、ＣＨ３ヘテロ二量体化ドメインのＤＥ変異を含み、一方、当該第２重鎖は、好ましくは、ＣＨ３ヘテロ二量体化ドメインのＫＫ変異を含む。
これらの実施形態では、重鎖の間の天然の電荷差、本明細書に記載のＣＨ１、ＣＨ２及び／又はＣＨ３領域のアミノ酸の変異、及び任意で、本明細書に記載のＤＥＫＫ ＣＨ３ヘテロ二量体化ドメインによって導入される電荷差は全て、本明細書に記載の二重特異性抗体及び多重特異性抗体などの抗体の電荷による分離を改善するために一緒に機能する。
２つの重鎖の相対的な電荷の差をもたらし得る因子は、可変ドメインのアミノ酸配列の差である。例えば、両方の重鎖可変領域に同一の軽鎖を使用する場合、重鎖可変領域のアミノ酸配列の差である。そのような場合、それらが互いに相対的である場合があり得ることから、多くの場合、可変ドメイン又は重鎖可変領域の電荷又はｐＩ差の決定で十分である。
可変ドメインの電荷又はｐＩ差を使用して、上に示したように製造及び／又は精製を改善することができる。いくつかの実施形態では、可変ドメインは激しく異なる重鎖及び同一の軽鎖。このように使用することができる軽鎖の例は、本明細書の他の箇所に記載されており、いくつかは例えば、図１３に列記されている。このような方法で使用することができる重鎖可変領域は、典型的には、選択された軽鎖と良好に対を形成するように選択される。図１３ａの軽鎖と良好に対を形成するように選択される重鎖可変領域を実施例に記載する。このような重鎖可変領域の他の例は、国際公開第２０１５／１３０１７２号、国際出願ＰＣＴ／ＮＬ２０２０／０５００８１号、国際公開第２０１９／０３１９６５号、国際公開第２０１９／００９７２６号、国際公開第２０１９／００９７２８号、及び同第２０１９／００９７２７号に記載されており、この目的のために参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に記載され、上の参考文献に記載されている重鎖可変領域は、重鎖の好適な例として見なされるべきであり、限定的なリストとは見なされない。本発明は、多種多様な可変ドメイン及び／又は重軽鎖の組合せに適用することができる。このような可変ドメイン及び／又は重鎖の組合せのいくつかの例を図１及び図２並びにその説明に示す。重鎖及び軽鎖の組合せの他の例は、例えば、その目的のために参照により組み込まれる国際公開第２０１９１９０３２７号に記載されている。
本発明の分離用ドメインによる二重特異性抗体及び単特異性抗体の概略図を示す。本発明の他の特徴及び態様は、例として本発明の実施形態による特徴を示した添付の図面と合わせて詳細な説明から明らかになることに留意されたい。各図面は例示的なものであり、本明細書に記載の発明を説明して可能にする特許請求の範囲及びの詳細な開示の全範囲によって定義される、提供された本発明の範囲を限定することを意図するものではなく、また、限定するものでもない。図１Ａ）～図Ｃ）において第１ＣＨ１含有免疫グロブリンは黒色で示されて第１重鎖を表し、第２ＣＨ１含有免疫グロブリンは灰色で示されて第２重鎖を表し、共通軽鎖のシナリオで、白色で軽鎖が示されている。これらの図において、第１重鎖は分離用ＣＨ１領域（図１Ａ）を含み、第２重鎖は分離用ＣＨ１領域（図１Ｂ）を含み、第１及び第２重鎖の両方は別々の電荷を有する分離用ＣＨ１領域を含む（図１Ｃ）。ここでも、本発明は、本発明の実施形態の一例として示した共通軽鎖の使用を必要としないことが理解される。図１Ｄでは、第１ＣＨ２含有免疫グロブリンは黒色で示されて第１重鎖を表し、第２ＣＨ２含有免疫グロブリンは灰色で示され、第２重鎖を表し、軽鎖は白色で示され、第２重鎖は分離用ＣＨ２ドメインを含む。図１Ｅでは、単一の重鎖が使用されて、黒色で示され、２つの異なる軽鎖が灰色及び白色で示されている。変異は＋又は－のいずれかで示され、未改変又は参照ドメインと比較した電荷の相対的変化を示し、及び未改変又は参照抗体に対するそれぞれの＋及び－標識の組込みを示す。図１Ａ）～Ｃ）において、ＣＨ１領域は本明細書に記載の本発明の分離用残基を含み、１ＤではＣＨ２領域、また、１Ｅでは軽鎖のＣＬ領域が、記載された本発明による変異体軽鎖である。 Ａ）このシナリオでは、第１重鎖には正電荷が提供され（ＣＨ１領域の＋で示される）、これにより、＋＋又は中性電荷のいずれかを有する２つの単特異性抗体が生じるが、二重特異性抗体は＋電荷を有する。示した電荷は、分離用ドメインを欠く抗体と比較した電荷の変化を表す。Ｂ）このシナリオでは、第２重鎖には２つの負電荷（ＣＨ１領域の－－で示される）が提供され、これにより、－－－－又は中性電荷のいずれかを有する２つの単特異性抗体が生じ、二重特異性抗体は－－電荷を有する。Ｃ）このシナリオでは、第１重鎖には正電荷が提供され（ＣＨ１領域の＋で示される）、第２重鎖に負電荷が提供され（ＣＨ１領域の－で示される）、これにより、－－又は＋＋電荷のいずれかを有する２つの単特異性抗体が生じ、二重特異性抗体は中性電荷を有する。Ｄ）このシナリオでは、第１重鎖は分離用ドメインを欠き、第２重鎖は－２の電荷の変化を有する負に荷電した分離用ＣＨ２ドメインを含む。これにより、中性又は－－－－電荷を有する２つの単特異性抗体が生じ、二重特異性抗体は、－－電荷を有する。Ｅ）このシナリオでは、２つのＣＬドメインが用いられ、１つは正に荷電したＣＬ分離用ドメインを含み、分離用ドメインではない１つは変異を有していない。ここに示したフォーマットは、共通重鎖フォーマットを利用している。これにより、＋＋又は中性電荷を有する単特異性抗体が生じ、二重特異性抗体は＋電荷を有する。 本発明による単特異性、三重特異性又は三価、及び四重特異性又は四価抗体の概略図を示す。図Ａ）及びＢ）では、第１ＣＨ１含有免疫グロブリンは黒色で示されて第１重鎖を表し、リンカーを介して第２ＣＨ１ＶＨドメイン（黒色及び縞状）を有する。第２重鎖は灰色で示される。共通軽鎖は白色で示される。ここでも、本発明は、本発明の実施形態の一例として示した共通軽鎖の使用を必要としないことが理解される。変異は、＋又は－のいずれかで示され、未改変鎖又は未改変抗体と比較した電荷の相対的変化を示す。図２Ａ）では、軽鎖のＣＬ領域が分離用ドメインであり、２Ｂ）では、第１重鎖のＣＨ１領域が分離用ドメインである。図２Ａ）において、このシナリオでは、－－－－電荷を有する四重特異性抗体又は四価抗体、及び－－電荷を有する単特異性抗体が形成され、－－－電荷を有する三重特異性抗体が形成される。図２Ｂ）では、－－－－－－－－電荷を有する四重特異性抗体又は四価抗体が形成され、単特異性抗体は中性電荷を有し、一方、三重特異性又は三価抗体は、－－－－電荷を有して形成される。 単特異性抗体の融解曲線を示し、野生型ＣＨ１を有するそのような抗体、及び変異ＣＨ１領域を含むものに関連する２つのピークを示す。 ＣＨ１変異を有して生成した２価の単特異性抗体の等電点電気泳動を示し、電荷に基づいたバンドの分離を実証する。これらのデータは、電荷を増加又は減少させる分離用ドメインと、等電点電気泳動中にこれらのドメインを含む抗体をバンドで分離する対応する能力との間の相関関係を示している。 ＤＥ、ＫＫ、並びにＤＥ及びＫアームのＣＩＥＸクロマトグラフィーである。上部のグラフには、野生型ＣＨ１配列及び重鎖可変領域（ＭＦ１５１６）を有するＤＥアームを使用して生成された単特異性二価抗体のクロマトグラムを示す。下部のグラフには、野生型ＣＨ１配列、及び異なる重鎖可変領域（ＭＦ３４６２）を有するＫＫアームを使用して生成された単特異性二価抗体のクロマトグラムを示す。中央のグラフには、野生型ＣＨ１配列を有する上述のＫＫアーム、及び野生型ＣＨ１配列を有する上述のＤＥアームを使用して生成された二重特異性抗体のクロマトグラムを示す。上部のグラフにおいて、矢印は、生成された二価の単特異性抗体（ＤＥ／ＤＥ）を示し、下部のグラフにおいて、矢印は、生成された一価の単特異的「半抗体」（ＫＫ）を示す。各抗体の軽鎖は同じである。 分離用ＣＨ１領域を有するＤＥ、ＫＫ、並びにＤＥ及びＫＫアームのＣＩＥＸクロマトグラフィーである。上部のグラフには、Ｔ１９７Ｄ及びＫ２１３Ｑの変異を有するＣＨ１配列を有するＤＥアーム、並びに重鎖可変領域（ＭＦ１５１６）を使用して生成された単特異性二価抗体のクロマトグラムを示す。下部のグラフには、Ｎ１５９Ｋを含むＣＨ１配列及びヒンジ残基のＥ２１６Ｋの変異を有するＫＫアーム、並びに重鎖可変領域（ＭＦ３４６２）を使用して生成された単特異性二価抗体のクロマトグラムを示す。中央のグラフには、ＫＫアームとＤＥアームを組み合わせて使用して作製した二重特異性抗体（ＭＦ１５１６／ＭＦ３４６２）のクロマトグラムを示し、二価のＤＥ、Ｔ１９７Ｄ、Ｋ２１３Ｑ／ＫＫ、Ｎ１５９Ｋ、Ｅ２１６Ｋのピークの、形成された他のタンパク質からの分離を示す。各抗体の軽鎖は同じである。 二重特異性抗体の分離 ＣＩＥＸ保持時間 分離用ＣＨ１領域を含む野生型ＣＨ１を有するＤＥアーム及びＫＫアームのＣＩＥＸクロマトグラフィーである。上部のグラフには、野生型ＣＨ１配列を有するＤＥ及びＫＫアームを用いて生成された抗体のクロマトグラムを示す。第２のグラフには、Ｔ１２０Ｋを含むＫＫアーム、並びにＤＥアームを有する野生型ＣＨ１領域を用いて生成された抗体のクロマトグラムを示す。第３のグラフには、Ｎ２０１Ｋを含むＫＫアーム、並びにＤＥアームを有する野生型ＣＨ１領域を用いて生成された抗体のクロマトグラムを示す。底部のグラフには、Ｎ１５９Ｋを含むＣＨ１配列及びヒンジ残基のＥ２１６Ｋを有するＫＫアーム、並びにＤＥアームを有する野生型ＣＨ１領域を用いて生成された抗体のクロマトグラムを示す。白い矢印は、生成された二価の単特異性抗体（ＤＥ／ＤＥ）を示す。黒色の矢印は、生成された二価の二重特異性抗体（ＤＥ／ＫＫ）を示す。灰色の矢印は、生成された二価の単特異性抗体（ＫＫ／ＫＫ）を示す。各抗体の軽鎖は同じである。 二重特異性抗体の分離 ＣＩＥＸ保持時間 分離用ＣＨ１領域を含むＤＥアーム及び野生型ＣＨ１を有するＫＫアームのＣＩＥＸクロマトグラフィーである。上部のグラフには、野生型ＣＨ１配列を有するＤＥ及びＫＫアームを用いて生成された抗体のクロマトグラムを示す。中央のグラフには、Ｔ１９７Ｄ及びＫ２１３Ｑを含むＣＨ１配列を有するＤＥアーム、並びにＫＫアームを有する野生型ＣＨ１領域を用いて生成された抗体のクロマトグラムを示す。底部のグラフにはＫ２１３Ｑを含むＣＨ１配列を有するＤＥアーム及びＫＫアームを有する野生型ＣＨ１領域を用いて生成された抗体のクロマトグラムを示す。白い矢印は、生成された二価の単特異性抗体（ＤＥ／ＤＥ）を示す。黒色の矢印は、生成された二価の二重特異性抗体（ＤＥ／ＫＫ）を示す。灰色の矢印は、生成された二価の単特異性抗体（ＫＫ／ＫＫ）を示す。各抗体の軽鎖は同じである。 二重特異性抗体の分離 ＣＩＥＸ保持時間 野生型又は分離用ＣＨ１領域を有するＤＥアーム及びＫＫアームのＣＩＥＸクロマトグラフィーである。上部のグラフには、野生型ＣＨ１配列を有するＤＥ及びＫＫアームを用いて生成された抗体のクロマトグラムを示す。第２のグラフには、Ｔ１２０Ｋを含むＣＨ１配列を有するＫＫアーム、並びにＴ１９７Ｄ及びＫ２１３Ｑを含むＣＨ１配列を有するＤＥアームを用いて生成された抗体のクロマトグラムを示す。第３のグラフには、Ｎ２０１Ｋを含むＣＨ１配列を有するＫＫアーム、並びにＴ１９７Ｄ及びＫ２１３Ｑを含むＣＨ１配列を有するＤＥアームを用いて生成された抗体のクロマトグラムを示す。底部のグラフには、Ｎ１５９Ｋを含むＣＨ１配列及びヒンジ残基のＥ２１６Ｋを有するＫＫアーム、並びにＴ１９７Ｄ及びＫ２１３Ｑを含むＣＨ１配列を有する及びＤＥアームを用いて生成された抗体のクロマトグラムを示す。白い矢印は、生成された二価の単特異性抗体（ＤＥ／ＤＥ）を示す。黒色の矢印は、生成された二価の二重特異性抗体（ＤＥ／ＫＫ）を示す。灰色の矢印は、生成された二価の単特異性抗体（ＫＫ／ＫＫ）を示す。各抗体の軽鎖は同じである。 二重特異性抗体の分離 ＣＩＥＸ保持時間 野生型又は分離用ＣＨ１領域を有するＤＥアーム及びＫＫアームのＣＩＥＸクロマトグラフィーである。上部のグラフには、野生型ＣＨ１配列を有するＤＥ及びＫＫアームを用いて生成された抗体のクロマトグラムを示す。第２のグラフには、Ｔ１２０Ｋを含むＣＨ１配列を有するＫＫアーム及びＫ２１３Ｑを含むＣＨ１配列を有するＤＥアームを用いて生成された抗体のクロマトグラムを示す。第３のグラフには、Ｎ２０１Ｋを含むＣＨ１配列を有するＫＫアーム及びＫ２１３Ｑを含むＣＨ１配列を有するＤＥアームを用いて生成された抗体のクロマトグラムを示す。底部のグラフには、Ｎ１５９Ｋを含むＣＨ１配列及びヒンジ残基のＥ２１６Ｋを有するＫＫアーム、並びにＫ２１３Ｑを含むＣＨ１配列を有する及びＤＥアームを用いて生成された抗体のクロマトグラムを示す。白い矢印は、生成された二価の単特異性抗体（ＤＥ／ＤＥ）を示す。黒色の矢印は、生成された二価の二重特異性抗体（ＤＥ／ＫＫ）を示す。灰色の矢印は、生成された二価の単特異性抗体（ＫＫ／ＫＫ）を示す。各抗体の軽鎖は同じである。 単特異性二価抗体（ＭＦ１１２２／ＭＦ１１２２）のＣＩＥＸ保持時間 ＣＨ１領域に変異を有する単特異性抗体のＣＩＥＸクロマトグラフィーである。各変異体を別々に試験し、グラフに、２つのヒト野生型ＣＨ１領域を含む単特異性二価抗体と比較して異なる保持時間を示す各変異体のＣＩＥＸ保持時間を示す。 クローニングに使用される構築物の構造 クローニングに使用して、分離用ＣＨ１領域を有する抗体の発現のための構築物を調製するための構築物である。ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、ＭＶ１７０８構築物から得る。この構築物は、ＣＨ２のＮ末端に固有のＢｓｐＥＩ部位を含有する。重鎖可変ドメイン（ＶＨ）は、ＭＦ１１２２構築物から得た。ＣＨ１領域を、ＢｓｔＥＩＩ及びＢｓｔＥＩの制限部位が隣接した最終構築物にクローニングした。 Ａ）共通軽鎖のアミノ酸配列 Ｂ）共通軽鎖可変ドメイン（ＩＧＫＶ１－３９／ｊｋ１）のＤＮＡ及びアミノ酸配列 Ｃ）共通軽鎖定常領域のＤＮＡ及びアミノ酸配列 Ｄ）ＩＧＫＶ１－３９／ｊｋ１共通軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列 Ｅ）Ｖ領域のＩＧＫＶ１－３９Ａのアミノ酸配列 Ｆ）共通軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ Ｇ）ヒト共通軽鎖ＩＧＫＶ３－１５／ｊｋ１のアミノ酸配列 Ｈ）ヒト共通軽鎖ＩＧＫＶ３－２０／ｊｋ１のアミノ酸配列 Ｉ）ヒト共通軽鎖ＩＧＫＶ３－２１／ｊＩ１のアミノ酸配列 Ｊ）ＩｇＫＶ３－１５のＶ領域のアミノ酸配列 Ｋ）Ｖ領域のＩｇＫＶ３－２０のアミノ酸配列 Ｌ）ヒト共通軽鎖ＩＧＫＶ１－３９／ｊｋ５及びκ定常領域のアミノ酸配列 Ｍ）ヒト共通軽鎖ＩＧＫＶ３－１５／ｊｋ１及びκ定常領域のアミノ酸配列 Ｎ）ヒト共通軽鎖ＩＧＫＶ３－２０／ｊｋ１及びκ定常領域のアミノ酸配列 Ｏ）ヒト共通軽鎖ＩｇＶλ３－２１／ＩＧＪλ３及びλ定常領域のアミノ酸配列 Ｐ）ＩＧＬＶ３－２１のＶ領域のアミノ酸配列 二重特異性分子の生成のためのＩｇＧ重鎖である。Ａ）ＣＨ１領域Ｂ）ヒンジ領域Ｃ）ＣＨ２領域Ｄ）変異Ｌ３５１Ｋ及びＴ３６６Ｋ（ＫＫ）を含有するＣＨ３ドメインＥ）変異Ｌ３５１Ｄ及びＬ３６８Ｅ（ＤＥ）を含有するＣＨ３ドメイン 矢印の暗灰色及び鋭い線でＥＵナンバリングにより８４位の２０１を示したヒト野生型ＣＨ１領域の３次元モデルであり、タンパク質のコアの中におけるその埋もれた位置及び溶媒のアクセス性の欠如を示す。 ＥＬＩＳＡの結果である。示されたＣＨ１の変異体を含むフィブリノーゲン又はＰＤ－Ｌ１特異的ＩｇＧ１抗体の、フィブリノーゲン及びＰＤ－Ｌ１への結合である。ＰＧ１１２２は、２つの同一の重鎖及び軽鎖を有する、単特異性二価フィブリノーゲン結合抗体である。２つの可変ドメインは、ＭＦ１１２２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び図１３ａの軽鎖を有する。ｐ１１３、ｐ１１８などの番号は、抗体のＣＨ１領域がどのアミノ酸の変異を有するかを示す。この情報を表１６に示す。ＰＧ ＰＤ－Ｌ１は、２つの同一のＰＤ－Ｌ１結合可変ドメインを有する単特異性二価抗体である。ｐ０６～ｐ１３の番号は、抗体のＣＨ１領域がどのアミノ酸の変異を有するかを示す。この情報を表１６に示す。 ＩｇＧ１のＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３領域のそれぞれのアミノ酸のＥＵナンバリングを含むＩＭＧＴ表である。アミノ酸残基の位置のナンバリングについて含める。 二重特異性抗体及び図１９の示された単特異性抗体のＥＬＩＳＡの結果のまとめである。試験した全ての二重特異性抗体は、ｃ－ＭＥＴ及び破傷風トキソイドに用量依存的な様式で結合する。 試験した抗体の特性のまとめである。各列に１つの抗体を列記する。ＰＢは２つの異なる可変ドメインを含む抗体を示し、ＰＧは２つの同一の可変ドメインを含む抗体を示す。ＰＢの後の数字は２つの可変ドメインの組合せを特定し、そのうち重鎖可変領域はＭＧの指定、続いて数字で特定される。次の列中のＭＧ１５１６．．．及びＭＧ３４６２．．．は、１つの可変ドメインが、ＭＦ１５１６のＶＨ及びＭＦ３４６２のＶＨを有することを示す。軽鎖領域は、図１３Ａの軽鎖であった。ＮＡは該当なしである。ＮＡと言及していない列ＭＧ１は、この抗体がＤＥ ＣＨ３ドメインを含む重鎖を有することを示す。ＮＡと言及していない列ＭＧ２は、この抗体がＫＫ ＣＨ３ドメインを含む重鎖を有することを示す。野生型ＩｇＧ１は、これらの抗体が、全ての野生型ＩｇＧ１定常領域、図１３ａの軽鎖、及びＭＦ１５１６又はＭＦ３４６２の重鎖可変領域を有することを示す。ＤＥＤＥは、これらの抗体が、ＤＥ ＣＨ３ドメインを含む重鎖のみを有することを示す。ＫＫは、これらの抗体が、ＫＫ ＣＨ３ドメインを含む重鎖のみを有することを示す。 二重特異性抗体及び単特異性抗体のＣＩＥＸプロファイルである。それぞれの抗体のコードを対応するパネルの上又は下に示す。左側の矢印でＤＥＤＥホモ二量体を示した。右側の矢印はＫＫ半抗体である。抗体のコードは図１９及び表２４で解読される。 二重特異性抗体及び単特異性抗体のＣＩＥＸプロファイルである。それぞれの抗体のコードを対応するパネルの上又は下に示す。左側の矢印でＤＥＤＥホモ二量体を示した。右側の矢印はＫＫ半抗体である。抗体のコードは図１９及び表２４で解読される。 Ｔｒａｘｌｍａｙｅｒら（２０１２）、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．Ｏｃｔ ２６；４２３（３）：３９７～４１２（ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ及び図３を参照）に従ってＣＨ３／ＣＨ３ホモ二量体の界面であると特定されたＣＨ３の残基である。
実施例１：分離の設計のための表面に露出していない残基の識別
ＶＬドメインを含むＩｇＧ１ ＣＨ１配列の構造情報から、表面、表面に露出しておらずＣＨ１領域の中に埋もれたアミノ酸残基の位置を、デフォルトパラメータを使用したＧＥＴＡＲＥＡ１．０プログラムを用いて同定した。Ｎｅｇｉら、「Ｓｏｌｖｅｎｔ Ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ Ｓｕｒｆａｃｅ Ａｒｅａｓ，Ａｔｏｍｉｃ Ｓｏｌｖａｔｉｏｎ Ｅｎｅｒｇｉｅｓ，ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｇｒａｄｉｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」，Ｌａｓｔ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｗｅｄ １７Ｔｈ Ａｐｒｉｌ，３：００ＰＭ，２０１５。表１及び図１３Ｃの配列を有するＣＨ１ＣＬドメインのモデルを、ＳＷＩＳＳ－ｍｏｄｅｌのウェブサイト（Ａｒｎｏｌｄ Ｋ，Ｂｏｒｄｏｌｉ Ｌ，Ｋｏｐｐ Ｊ，Ｓｃｈｗｅｄｅ Ｔ．Ｔｈｅ ＳＷＩＳＳ－ＭＯＤＥＬ ｗｏｒｋｓｐａｃｅ：タンパク質構造の相同性モデリングのためのウェブベースの環境．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２００６ Ｊａｎ １５；２２（２）：１９５～２０１）に入力した。ＰＤＢ構造６Ｃ６Ｘ．ｐｄｂ（ワクチン接種したアカゲザルから単離された中東呼吸器症候群コロナウイルスの中和抗体ＪＣ５７－１４の１．９９Å結晶構造）とアラインメント（ＣＨ１領域の全長にわたって９５％を超える同一性を有する）することによって、高品質の相同性モデルを得た。ＰＤＢ中の多くの他のＣＨ１領域は、高品質の出発構造（本明細書で使用するＣＨ１領域との＞９５％の配列同一性及び高品質の構造を有する）を提供することができた。ｐｄｂファイルをアップロードし、この構造をＧＥＴＡＲＥＡ１．０βで処理して、溶媒にアクセス可能と予測される各残基の表面積のパーセントを決定した。
ＧＥＴＡＲＥＡ１．０βのデフォルトパラメータに基づいて、表面への露出が５０％を超えるアミノ酸は「Ｏｕｔ」又は表面と称され、ＯＵＴではないか、又は表面に露出していない残基は５０％～２０％超であり、アクセス可能が２０％未満は、ＧＥＴＡＲＥＡ１．０βによって「Ｉｎ」又は本明細書では埋もれたアミノ酸と称される（表１を参照）。
Figure 2022534674000001
Figure 2022534674000002
ＣＨ１配列及びモデリング情報。位置は任意的な数で示されている。例えば、残基番号１はＥＵナンバー１１８に対応し、残基番号２はＥＵナンバー１１９に対応する。列Ｉｎ／Ｏｕｔは、アミノ酸が埋もれた（ｉ）、又は表面に露出している（ｏ）とみなされるかどうかを示す。空白は、表面に露出しておらず、埋もれてもいないアミノ酸の値を示す。
下にＥＵナンバリングに従ってモデル化したヒトＣＨ１領域のアミノ酸配列を列記し、表面に露出していないアミノ酸の位置は下線及びイタリックで示し、埋もれたアミノ酸は太字で示す。
Figure 2022534674000003
Ｒｏｓｅｔｔａソフトウェア（バージョン３．１ ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｒｏｓｅｔｔａｃｏｍｍｏｎｓ．ｏｒｇ／ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して（ｄｅｓｉｇｎモード）、インシリコ安定性分析と併せて非表面残基の変異をモデル化して、これらの位置における変異の影響及びタンパク質の安定性への影響を評価した。Ｒｏｓｅｔｔａ ｄｅｓｉｇｎの実行から、出発モデルにおいて＜２０％のＳＡＳＡを有する残基における次のＡ１７２Ｐ、Ｓ１９０Ａ、Ｙ１４９Ａ、Ｖ１５４Ｉの変異が安定性を改善と予測された。Ｒｏｓｅｔｔａからはまた、次のＧ１２２Ｐ、Ｓ１５７Ｔ、Ｉ１９９Ｖ、Ｎ２０３Ｉ、Ｓ２０７Ｔ、及びＶ２１１Ｉの変異が安定性を改善すると予測された。１回目の特定された非表面残基からの変異の設計を行った後、２つの追加のＲｏｓｅｔｔａ ｄｅｓｉｇｎ、すなわち、１）予測される正電荷を増加させた場合（残基を正電荷に変化させるか、又はＤ若しくはＥを除去する）に、非表面残基を変異させることのみができる位置、また、２）予測される負電荷を増加させた場合（中性からＤ又はＥに、又はＫ及びＲから非荷電に）に、残基を変化させることのみができる位置について実施した。
埋もれた残基Ｎ１５９（Ｎ４２）及びＮ２０１（Ｎ８４）が、良好な安定性を維持しながら、正電荷（Ｋ）及び負電荷（Ｄ）残基の変異に耐えることを見出した。ＣＨ１の安定性の有意な予測される低下を伴わずに電荷の変化を支持する可能性がある、他の表面に露出していない残基が特定され、それには、バイオインフォマティックス解析によって安定性を改善することが予測される特定の変異が含まれた（より高い負の数値スコアは、より安定なことを意味する）。
Figure 2022534674000004
実施例１ｂ：構築物の設計
ＣＨ１内の表面に露出していない及び埋もれた位置を、これらの免疫グロブリン領域が組み込まれた多量体化タンパク質の電荷を変化させるように変異させる。合計１３の例示的な変異ＣＨ１領域を生成して、野生型ＣＨ１領域を含む単特異性及び多重特異性抗体と比較するために単特異性及び多重特異性抗体に組み込む。これらの分離用ＣＨ１領域を含むこれらの分子を発現する構築物を以下のように調製する。
ＣＨ２及びＣＨ３ドメインをコードする断片をＭＶ１７０８構築物から得た。ＣＨ２のＮ末端に固有のＢｓｐＥＩ部位を含有することから、ＭＶＩ７０８を選択した。そのＣ末端にＢｓｔＥＩＩを有する可変重鎖ＭＦ１１２２をコードする断片を使用した。生成、精製、又はＣＩＥＸによるいかなる問題も存在せず、８．６４．のｐＩ（ＶＨ）において約１３．４分のＣＩＥＸでの平均保持時間を有することから、ＭＦ１１２２を選択した。クローニング及びクローニング戦略に使用される構築物を図１２に示す。
ベクターＭＶ１７０８（ＣＨ３のＤＥ変異を含有する）を、野生型ＣＨ３領域を含有するように改変した。Ｓｆｉｌ及びＢｓｔＥＩＩ－ＨＦ制限酵素を使用して、ＭＦ１１２２からのＶＨ遺伝子をベクターに挿入した。正しいコロニーをコロニーＰＣＲ及びシークエンシングにより選択する。
構築物において、ＣＨ１領域をコードする配列は、制限部位ＢｓｔＥＩＩ及びＢｓｐＥＩに隣接する。これにより、ＣＨ１をコードする配列の交換が可能になる。野生型又は変異体ＣＨ１領域を含有するプラスミドを作製した。各変異体ＣＨ１領域に特異的な配列を下に列記する。
ＣＨＩをコードする配列（３６３ｂｐ）を、ＢｓｔＥＩＩ及びＢｓｐＥＩを用いてプラスミドから切除した（それぞれ２μｇのＣＨ１をコードする構築物）。同時に、ＢｓｔＥＩＩ及びＢｓｐＥＩ制限酵素を使用して、調製したベクターをプラスミドから切除した（２０ｕｇのベクター）。プラスミドを、緩衝剤ＮＥＢｕｆｆｅｒ３．１中のＢｓｐＥＩ（０．２５ｕＬ酵素／ｕｇＤＮＡ）と共に３７度で少なくとも１時間インキュベートし、次いで混合物を６０度まで加熱してＢｓｔＥＩＩを添加した。ゲル電気泳動及びゲル抽出によって、消化したＤＮＡを精製した。消化によって、主鎖（約１０ｋｂ）由来の７４８ｂｐの断片並びにＣＨＩドメイン及びヒンジ含有構築物由来の３６３ｂｐ断片を除去する。
ベクターを、ＣＨ１をコードする配列とライゲーションした後、ＤＨ５ａ細胞を形質転換して、アンピシリンを含有するＬＢ寒天プレート上に播種した。正しい構築物を、コロニーＰＣＲ並びに正しいＣＨ１及び正しいＣＨ２ＣＨ３の同定を可能にするシークエンシングによって特定した。最終構築物の同一性をシークエンシングにより確認した。
実施例１ｃ：ＣＨ１の変異体を含む抗体の発現及び精製
全ての使用した緩衝液は、Ｖｅｒｓｙｌｅｎｅ（エンドトキシンフリー及び滅菌）水を使用して作製した。０．１ＭのＮａＯＨで少なくとも１６時間インキュベートして、ガラス器具、Ｑｕｉｘｓｔａｎｄ、Ａｋｔａ ｅｘｐｌｏｒｅｒからエンドトキシンを除去した。Ｈｅｋ２９３細胞を、エンドトキシンフリーのプラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。トランスフェクションの６日後に、組換え抗体を含有する調整済培地を、低速遠心分離（１０分、１０００ｇ）、続いて高速遠心分離（１０分、４０００ｇ）により採取した。１００μＬの試料を４℃で保存した。
ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅＬＸ（ＧＥヘルスケアライフサイエンス）で精製を行った。抗体を、バッチ毎に２ｍＬのＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅＬＸに４時間結合させた。結合した抗体を含有するＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅＬＸのセファロースを遠心分離により回収して、重力流カラムに移した。非特異的に結合したタンパク質をＰＢＳでカラムを洗浄することによって除去し、ここで、ＰＢＳは１ＭのＮａＣｌとＰＢＳを含有した。ｐＨ３．５の１００ｎＭのクエン酸塩を使用して結合した抗体を溶出させ、５ｍＬの画分毎に、ｐＨ７に中和するために４ｍＬのｐＨ ８．０の１ＭのＴｒｉｓを含有する１２ｍＬのチューブ中に回収した。タンパク質含有画分をプールした。ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅＬＸプールを、ｖｉｖａｓｐｉｎ２０の１０ＫＤａ Ｓｐｉｎフィルターを用いて２．０～３．０ｍＬに濃縮した。濃縮したプール中の凝集体を遠心分離により除去した。濃縮した試料を、ゲル濾過前に４℃で保存した。
ゲル濾過：組換え抗体を、ＰＢＳ中で平衡化したｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ １６／６００カラムを使用して、ゲル濾過によって更に精製した。タンパク質含有画分をＬａｂＣｈｉｐ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）により分析し、正しい抗体含有画分をプールした。プールを、０．２２ｕｍのシリンジフィルターを用いて濾過して滅菌した。産物を、１．８ｍＬを含有するアリコートにして、４℃で保存した。産物を、ＬａｂＣｈｉｐキャピラリー電気泳動（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）及びＬＡＬアッセイ（エンドトキシンアッセイ）によって分析した。
ＬａｂＣｈｉｐ分析は、還元及び非還元条件下で行った。試料のＨＰ－ＳＥＣ分析は、抗体の主要なピーク１つのみを示し、試料が凝集体又は半抗体を含有していないことを示した。
実施例１ｄ：ＣＨ１改変二重特異性抗体を産生する構築物の生成
重鎖のＤＥアームのＫＫアームとの交換
重鎖をコードする第２のベクターを作製した。このベクターによってコードされる重鎖は、ＤＥアームを含む重鎖からその重鎖を区別するためにＫＫアームを含む。２つの異なる重鎖の産生によって、二重特異性抗体を優先的に形成することができる。ＫＫ重鎖をコードするベクターは以下のように作製した。
抗体のＤＥアームをコードする断片を、ＫＫアームをコードする断片と交換した。アームは、構築物中の隣接する制限部位ＢｓｐＥＩ及びＡｆＩＩＩを使用して、上記のクローニング技術を用いて交換される。
続いて、ＤＥ重鎖を重鎖可変ドメインＶＨ領域のＭＦ１５１６と組み合わせ、ＫＫ重鎖を重鎖可変ドメインＶＨ領域のＭＦ３４６２と組み合わせた。このクローニング工程は、制限酵素ＳｆｉＩ及びＢｓｔＥＩＩ並びに上記のクローニング技術を用いて行った。最終構築物の同一性をシークエンシングにより確認した。
このクローニング手順によって、異なる結合特異性を有する２つの重鎖をコードするベクターを得る。重鎖を一緒に発現させると、重鎖は二重特異性抗体を優先的に形成する。上記のクローニング工程を適用することによって、ＣＨ１の変異体を２つの重鎖のそれぞれに挿入することができる。
実施例２：ＣＨ１分離用ドメイン中のｐＩ分離用残基に基づいた同一の単特異性抗体を分離する能力の実証。
抗体を発現させるために、核酸構築物の組合せを使用する。構築物は、共通軽鎖（図１３ａ）及びフィブリノーゲンを標的とする重鎖可変領域（ＭＦ１１２２）（下に記載）を含む重鎖をコードする。重鎖は、野生型ヒトＣＨ１と比較して負の電荷差又は正の電荷差を有するＣＨ１分離用ドメインを更に含む。構築物の発現により、単特異性ＩｇＧ１ヒト抗体を優先的に形成する。再配列された生殖細胞系列ヒトκ軽鎖ＩｇＶκ１－３９＊０１／ＩｇＪκ１＊０１を共通軽鎖として使用する。
Figure 2022534674000005
これらの実験で使用したフィブリノーゲンに結合可能な重鎖可変領域（ＭＦ１１２２）のアミノ酸配列を下に列記する。ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３領域は、ヒトＩｇＧ１である（図１４）。
重鎖可変ドメインの標的はフィブロネクチンであり、重鎖可変ドメインの等電点は８．６４（ｐＩ）であり、完全長重鎖の等電点は８．５４（ｐＩ）である。
Figure 2022534674000006
試験した以下のＣＨ１の変異体を、ＥＵナンバリングに従って特定される残基の変異と共に下に示す。
Figure 2022534674000007
約１．７ｍｇ／ｍＬの濃度を有する１０～２５ｍＬの範囲の体積収率で、十分かつ同様の量の各抗体が産生された。
各抗体について、ＣＩＥＸの保持時間を決定した。
ＣＩＥＸ－ＨＰＬＣクロマトグラフィは、ＴＳＫｇｅｌ ＳＰ－ＳＴＡＴ（粒径７μｍ、４．６ｍＭ Ｉ．Ｄ．×１０ｃｍ Ｌ、東ソー２１９６４）シリーズのイオン交換カラムを使用して行った。ＣＩＥＸアッセイは、非多孔性樹脂粒子が充填された親水性ポリマー系カラム材料を使用し、その表面は、多層のカチオン交換基（スルホン酸基）のオープンアクセスネットワークからなり、それにより、強い陽イオン交換体を形成し、したがって、ＮａＣｌ塩の勾配を使用したモノクローナル抗体の荷電異性体の分離に適している。正に荷電した抗体は、負に荷電したカラムに結合する。
ＴＳＫｇｅｌ ＳＰ－ＳＴＡＴ（粒径７μｍ、内径４．６ｍ×長さ１０ｃｍ、東ソー２１９６４）を、緩衝液Ａ（リン酸ナトリウム緩衝液、２５ｍＭ、ｐＨ６．０）を使用して、約５０バールの圧力で少なくとも３０分間平衡化する。これに続いて、対照及び試料ＩｇＧを注入する。全ての試験試料及び対照（ＰＢＳ中）の注入試料の質量は１０μｇであり、注入体積は１０～１００μｌであった。塩濃度を増加させ、緩衝液Ｂ（２５ｍＭリン酸ナトリウム、１ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０）の勾配をかけることによって、抗体をカラムから溶出させる。流速は０．５ｍＬ／分に設定した。クロマトグラムを、２２０ｎｍの結果に基づいて、観察された主要なピークのピークパターン、保持時間及びピーク面積について分析した。
この検討において、保持時間は野生型と比較した総電荷差と相関し、すなわち、正電荷がより加えられると保持時間が長くなり、負電荷がより加えられると、保持時間が短くなった。
Figure 2022534674000008
全てのＣＨ１の変異体のＣＩＥＸの保持時間を表６及び図１１に示す。これらのデータは、さもなければ同じｐＩを有する抗体、例えば、各重鎖のためのＣＨ１分離用ドメインを含み、野生型ヒトＣＨ２及びＣＨ３ドメイン並びに共通軽鎖を含む、上記の２価の単特異性ヒトＩｇＧ抗体が、上に提供される分離用残基の使用のみに基づいて適切に分離され得、それにより、ＣＨ１分離用ドメイン当たり１つ以上の正の電荷又は負の電荷の差を有する残基を組み込むことによって、野生型ＣＨ１領域と比較して０．１～７．６の保持時間の差を生成することを示している。
実施例３：展開に適した安定性を示す分離用残基が組み込まれた抗体の安定性分析
ＰＢＳ中の二価単特異性抗体の安定性を、抗体を凍結及び解凍することによって判定し、それにより、全ての二価単特異性抗体が野生型モノクローナル抗体と同等の安定性を有したことが示された。
試料の組成を、１回の凍結／解凍のサイクルの後にＨＰ－ＳＥＣで分析した。試料を－８０℃で一晩保存し、翌日に室温で解凍した。各抗体について、ＰＢＳ中に溶解した２１μｇをＨＰ－ＳＥＣで分析した。全ての抗体は１つの主要なピークとして溶出され、生成された抗体が凍結解凍サイクル後に安定であることを示している。したがって、試料は－８０℃で保存された場合、それらの組成を維持する。
更に、分離用ドメインが組み込まれた抗体を、ＤＳＣ（示差走査熱量測定）を使用して温度融解曲線を決定することによって評価した。ＤＳＣを実施するために、ＰＢＳで中０．５ｍｇ／ｍＬまで抗体を希釈し、透析緩衝液中で透析した。続いて、抗体を、０．４５μｍフィルターを通して濾過した。透析後、試料を０．２５ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈し、ＤＣＳ分析を行い、各抗体の温度融解曲線を得た。
温度融解（ＴＭ）曲線を図３に示す。温度融解曲線から決定したＴＭ１及びＴＭ２を下の表７に示す（ＤＳＣ）。
第２の安定性アッセイにおいて、ＴＭ２を、表８に記載するように、ＵＮｃｌｅ（Ｕｎｃｈａｉｎｅｄ Ｌａｂｓ）を用いて決定した。結果を下の表に列記する。また、ＴＭ２についてのＩｇＧＳの安定性をランク付けしてランクを示した。試料をＰＢＳ緩衝液中で摂氏２５度から９５℃まで０．５℃／分で加熱し、０．２～１ｍｇ／ｍＬの範囲のタンパク質試料を用いてｐＨ７．４で試験した。次いで、Ｔｍ／Ｔａｇｇ温度を蛍光シグナルから計算し、トリプリケートで実施した。
ＵＮＣＬＥ（Ｕｎｃｈａｉｎｅｄ Ｌａｂｓ）を用いて、示差走査蛍光測定（ＤＳＦ）及び静的光散乱（ＳＬＳ）による熱安定性試験を行った。ＤＳＦは、２５０～７２０ｎｍの固有のアミノ酸の蛍光の検出に基づくものであり、変性時のタンパク質のアンフォールディングを推測するために使用される。ＳＬＳは、２６６ｎｍのレーザーの光散乱の変化によって凝集体含有量の変化を検出する。簡潔に述べると、タンパク質を５０ｕｇ／ｍＬで分析し、温度を２５から９５度まで上昇させる（０．３又は０．５度／分）。熱変性は、検出及び分析されるタンパク質の蛍光の変化（２５０～７２０ｎｍでモニターされる）及び光散乱（２６６ｎｍのレーザー光）の変化を誘発する。蛍光の変化は、温度に対するＢＭＣ（ｂａｒｙｃｅｎｔｒｉｃ ｍｅａｎ：検出された蛍光スペクトルが２つの等しい領域に分割される）として表示される。ＵＮＣＬＥ解析ソフトウェアを使用して、温度グラフ上の蛍光の変化の差を計算し、融点（ＴＭ 蛍光の変化が生じる温度）及び温度誘導凝集（ＴＡＧＧ ２６６ｎｍにおける静的光散乱のシグナルがベースラインより約１０％上昇する温度）の存在を特定する。
Figure 2022534674000009
Figure 2022534674000010
実施例４：等電点電気泳動
産生の際、ＩｇＧを還元及び非還元条件下で、ＳＤＳ－ｐａｇｅゲルに流した。全てのタンパク質のサイズは予想通りであり、各変異体の全てのバンドは同じ高さであった。また、産生されたＩｇＧを、等電点電気泳動を用いてゲルに流した。その結果を図４に示す。ゲル上のバンドの相対的な泳動は、以下に列記する計算されたｐＩと相関した（図４）。
Figure 2022534674000011
実施例５：ＣＨ１分離用ドメイン（分離用残基を含む）の使用による二重特異性及び単特異性抗体の分離
二重特異性抗体は、２つの異なる重鎖を一緒に発現させることによって産生される。抗体を形成させるために、これらの重鎖を上記のように共通軽鎖と組み合わせた。
実験は、ＤＥアームを有する重鎖及びＫＫアームを有する重鎖を用いて実施する。これらの構築物のクローニングは、実施例１Ｄに記載されている。ＤＥ又はＫＫの改変は重鎖のＣＨ３ドメインに位置する。
各重鎖は、ＣＨ３、ＣＨ２、ＣＨ１、及びＶＨドメインからなる。ＣＨ３ドメインは、重鎖抗体のヘテロ二量体化を可能にし、２つの異なる重鎖のためのＤＥ又はＫＫ残基のいずれかを含有する。ＣＨ２ドメインはヒトＣＨ２ドメインである。ＶＨは抗体の特異性を決定し、これにより、ＤＥ重鎖は破傷風毒素（ＴＴ）を標的とし（ＭＦ１５１６）、また、ＫＫ重鎖はｃＭＥＴを標的とする（ＭＦ３４６２）。以下の表１０及び１１に配列を示す。
重鎖のＣＨ１領域は、野生型、又は野生型ドメインとの電荷差を生成する本明細書に記載の分離用ドメインのいずれかである。ＤＥアームを有する重鎖は、ヘテロ二量体化を促進するためのヒト野生型ＣＨ３ドメインの変異体である。ＫＫアームを有する重鎖は、ヘテロ二量体化を促進するためのヒト野生型ＣＨ３の変異体である。ＤＥアームは野生型ドメインと比較して負の電荷差を有する分離用ドメインに連結され、ＫＫアームは野生型ドメインと比較して正の電荷差を有する分離用アームに連結される。
Figure 2022534674000012
Figure 2022534674000013
破傷風トキソイドを標的とする番号で特定される抗体のアミノ酸配列は、ＭＦ１３３７のアミノ酸配列を有する。
ＭＦ１３３７
ＥＶＱＬＶＥＴＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＤＹＩＦＴＫＹＤＩＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＭＳＡＮＴＧＮＴＧＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＮＴＡＹＭＥＬＳＳＬＴＳＧＤＴＡＶＹＦＣＡＲＳＳＬＦＫＴＥＴＡＰＹＹＨＦＡＬＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
二重特異性抗体を、以下のように軽鎖構築物を含むＩｇＧ１重鎖構築物をＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションして産生させた。懸濁液にした２９３細胞を、３．０×１０６細胞／ｍＬの密度になるまでＴ１２５フラスコ中でｓｈａｋｅｒ ｐｌａｔｅａｕで培養した。細胞は、２４穴ディープウェルプレートの各ウェル中に０．３～０．５ｘ１０６生細胞／ｍＬの密度で播種した。細胞を、標準化された手順に従って個々の滅菌ＤＮＡ：ＰＥＩ混合物で一過性にトランスフェクトして、更に培養した。トランスフェクションの７日後に、上清を採取して、０．２２μＭフィルターを通して濾過した。抗体をプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーで精製するまで、滅菌上清を４℃で保存した。続いて、抗体を一過性トランスフェクションによってＨＥＫ２９３細胞で発現させ、標準的な手順に従ってプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを用いて培養上清から精製した。
機能性スクリーニングのためのＩｇＧの精製
プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを用いて、ＩｇＧの精製を、小規模（＜５００μｇ）、中規模（＜１０ｍｇ）及び大規模（＞１０ｍｇ）で行った。濾過を使用して、２４ウェルフィルタプレート中で、滅菌条件下で小規模の精製を行った。まず、培地のｐＨをｐＨ８．０に調整し、続いて、ＩｇＧ含有上清を、タンパク質ＡセファロースＣＬ－４Ｂビーズ（５０％ｖ／ｖ）（Ｐｉｅｒｃｅ）と共に、振盪プラットフォーム上、６００ｒｐｍで２５℃にて２時間インキュベートした。次に、濾過によりビーズを採取した。ビーズをＰＢＳ ｐＨ７．４で２回洗浄した。次いで、結合したＩｇＧを、０．１Ｍクエン酸緩衝液で、ｐＨ３．０にて溶出させ、溶出液を、トリスｐＨ８．０を用いて直ちに中和した。マルチスクリーンＵｌｔｒａｃｅｌ １０マルチプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、遠心分離により緩衝液交換を行った。試料を最後に、ＰＢＳ ｐＨ７．４中で採取した。ＩｇＧ濃度を、Ｏｃｔｅｔ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を用いて測定した。タンパク質試料を４℃で保存した。
以下の構築物を作製して、実験に使用した。実験を実施する前に、構築物を配列について検証した。コードされた重鎖を産生させて、還元条件下及び非還元条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥを用いて分析した。全ての重鎖は、二重特異性一価抗体及び予想されるサイズの半抗体を生成した。
Figure 2022534674000014
二重特異性抗体を生成するために、様々なＤＥ重鎖を様々なＫＫ重鎖と組み合わせた。産物を、実施例２に記載したようにＣＩＥＸで分析する。ＤＥ／ＫＫ抗体の両方の組合せ、及びＤＥ又はＫＫのいずれかを有する１つのアームの生成を分析する。ＤＥを有する１つのアームの生成は、ＤＥ／ＤＥホモ二量体を与え、ＫＫを有する１つのアームの生成は、ＫＫの半抗体を与えた。ＫＫ／ＫＫホモ二量体の生成は観察されなかった。
下の表に、様々な抗体種及び１つのアームの生成についての保持時間を記載する。二重特異性抗体（ＤＥ／ＫＫ）とホモ二量体（ＤＥ／ＤＥ）又はＫＫ半抗体との間の保持時間の相対的な差は、ＣＩＥＸスペクトルにおけるピーク間の距離を示す。より大きな差により、二重特異性抗体で、ホモ二量体及び半抗体を形成する画分の分離がより容易になる。
Figure 2022534674000015
表１３に記載した様々な抗体種の保持時間を図５～図１０に示す。図５に示すように、野生型ＤＥ／ＤＥホモ二量体とＫＫ半抗体のＣＩＥＸ保持時間は比較的近い。対照的に、これらの重鎖のＤＥ及びＫＫのＣＨ３ヘテロ二量体化ドメインと共に変異体ＣＨ１の分離用ドメインを使用することにより、重鎖のＣＩＥＸ保持時間が変化し、ホモ二量体、二重特異性ヘテロ二量体及び半抗体の保持時間の差が増大する。図６では、Ｔ１９７Ｄ及びＫ２１３Ｑの変異を有するＤＥ重鎖のＣＨ１領域を示す。Ｎ１５９Ｋ及びヒンジ残基Ｅ２１６Ｋの変異を有するＫＫ重鎖のＣＨ１領域を示す。したがって、ホモ二量体（ＤＥＤＥ）及び半抗体（ＫＫ）のＣＩＥＸ保持時間は、図６に示すように、保持時間の大きな差を有する。二重特異性抗体（ＤＥ／ＫＫ）の保持時間は他の種から更に離れ、これにより、異なる種のより良好な分離が可能になる。
二重特異性抗体のＣＩＥＸ保持時間に対する、ＣＨ１分離用ドメインにおける変異の効果を図７～図１０に示す。
Figure 2022534674000016
Figure 2022534674000017
Figure 2022534674000018
Figure 2022534674000019
Figure 2022534674000020
実施例６ 実施例１～５のＣＨ１の変異体及び新しいＣＨ１の変異体の更なる解析
本実施例における抗体が２つの同一の重鎖及び２つの同一の軽鎖を有する単特異性二価抗体であることを条件として、抗体を、実施例１に示したように生成する。抗体は二重特異性抗体ではないため、野生型ＣＨ３ドメインを有する。
様々なＣＨ１の変異体のフィブリノーゲンコーティンングプレートへの結合を評価するためのＥＬＩＳＡ。抗体は、示したＣＨ１の変異体を含むＩｇＧ１抗体である。全ての抗体は、ＭＦ１１２２のＶＨを含む可変ドメインと図１３Ａの共通軽鎖（ＰＧ１１２２として示される）を有する二価単特異性抗体である。陰性対照として、同じ抗体であるが、ここではＰＤ－ＰＬ１抗体のＶＨ（ＰＧ ＰＤ－ＰＬ１として示される）を含む抗体を、同じフィブリノーゲンコーティングプレート上で試験した（図１６を参照：それぞれフィブリノーゲンプレート陽性試料セット１、フィブリノーゲンプレート陽性試料セット２、及びフィブリノーゲンプレート陰性試料セット）。同じ抗体を、ＰＤ－ＰＬ１コーティングプレートへの結合について評価した（図１６を参照：ＰＤ－ＰＬ１プレート陽性試料セット及びＰＤ－ＰＬ１プレート陰性試料セット）。
フィブリノーゲンＥＬＩＳＡプレートを、１０μｇ／ｍＬのヒトフィブリノーゲン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ；カタログ番号Ｆ４７５３）でコーティングした。抗体を、５μｇ／ｍＬから始めて０．００５μｇ／ｍＬの最終濃度の１０倍濃度希釈の範囲でインキュベートした。
ＰＤ－Ｌ１ ＥＬＩＳＡプレートを、２．５μｇ／ｍＬのヒトＰＤ－ＰＬ１ Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ番号１５６－Ｂ７）でコーティングした。抗体を、５μｇ／ｍＬから始めて０．００５μｇ／ｍＬの最終濃度の１０倍濃度希釈の範囲でインキュベートした。結合した抗体を、κ軽鎖に結合する１：１０００希釈のＨＲＰコンジュゲートＰｒｏｔｅｉｎ Ｌをベースとした二次抗体（Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号３２４２０）で検出した。
ＰＤ－Ｌ１結合抗体を、フィブリノーゲンＥＬＩＳＡにおける陰性対照として共に試験し、フィブリノーゲン結合抗体をＰＤ－Ｌ１ ＥＬＩＳＡの陰性対照として共に試験した。反対の結合特異性を有する陰性対照は、しかし、試験抗体と同じＣＨ２、ＣＨ３配列及びＣＨ１の変異体配列を有した。ＭＦ１１２２のＶＨ可変領域のアミノ酸配列を表４に示す。それぞれのＣＨ１の変異体の配列を表１４に示す。したがって、これらのデータは、分離用残基が、指定された重鎖可変領域の標的抗原への結合に影響しないことを示している。
ＥＬＩＳＡアッセイの結論は、試験した全ての抗体が、可変ドメイン配列によって特定された標的に結合し、重要なこととして、非特異的標的には結合しないことである（図１６）。換言すれば、フィブリノーゲン特異的抗体は、フィブリノーゲンＥＬＩＳＡにおいてフィブリノーゲンに結合し、ＰＤ－Ｌ１ ＥＬＩＳＡにおいてＰＤ－Ｌ１には結合せず、ＰＤ－ＰＬ１特異的抗体は、ＰＤ－Ｌ１ ＥＬＩＳＡにおいてＰＤ－Ｌ１に結合し、フィブリノーゲンＥＬＩＳＡにおいてフィブリノーゲンには結合しない。
Figure 2022534674000021
示した変異体を野生型ＩｇＧ１のバックグラウンドで分析した。また、ＣＨ１の変異体が、ＤＥ又はＫＫアームのいずれかを有する重鎖と会合しているかどうかも示す。重鎖の重鎖可変領域（ＶＨ）は、ＭＦ１１２２の配列（表４を参照）を有する。電荷を増加させるＣＨ１変異体（図中の最初の７個のエントリ）を、ＰＤ－Ｌ１重鎖可変領域と検討した（ＲＴ約１１分及びＦＡＢ Ｔｍ約７６℃）。
様々なＣＨ１の変異体を、他の野生型ＩｇＧ１に組み合わせて、示した可変ドメイン及びＣＨ１の変異体を有するＩｇＧ１抗体を生成した。抗体は、同一の重鎖及び軽鎖を有する、単特異性二価抗体である。各抗体は、２つの同一のＣＨ１ドメイン及び２つの同一の可変ドメインを有する。産物を、実施例２に記載のＣＩＥＸで分析する。それぞれのＣＩＥＸの保持時間（ＲＴ）及び同じ可変ドメイン及び野生型ＣＨ１（ＷＴ）を有するＩｇＧ１抗体の保持時間との相対的な差について表１６に示す。より大きな差により、二重特異性抗体で、ホモ二量体及び半抗体を形成する画分の分離がより容易になる。
Figure 2022534674000022
結論として、アミノ酸の変異は、予想されるようにΔＲＴ（ＩｇＧ変異体のＲＴと野生型ＩｇＧとの間の差として定義される）を増大させる。一部の変異体は他のものよりも大きいΔＲＴを示す。試験したＶＨ配列（ＶＨ１１２２及びＰＤ）の両方は、変異によって同程度に影響を受ける。
分離用残基が組み込まれた抗体の安定性の分析
実施例３では、Ｕｎｃｌｅによる安定性についてのアッセイを説明する。下に示すデータを、実施例３に記載の方法を用いて、Ｕｎｃｌｅ装置で取得する。
表１６に示した単特異性二価抗体を、様々な安定性パラメータについて試験した。これらの結果を表１７に示す。
Figure 2022534674000023
Figure 2022534674000024
全ての場合において、いくつかの変異の組合せはＴＡＧＧを低下させるが、低下は許容レベル内で良好である。全体的な熱安定性は、両方のＶＨにおいて同程度に影響を受け、会合した可変ドメイン中の特定のＶＨ配列には無関係であることを証明している。抗ＰＤ－Ｌ１含有可変ドメインを含むＮ１５９のＫへの改変は、この分析において、約６６度の早い融解事象に関連している。これは、ＭＦ１１２２含有可変ドメインを含むこの変異体の値が、野生型と同じこの差を示さないことから、測定の問題である可能性が高い。この傾向はまた、典型的には、同じ野生型との差を示さないＮ１５９Ｋとの様々な組合せでも見られる。
Figure 2022534674000025
表１８に列記された他のＣＨ１の変異体と比較して、単一のアミノ酸の変異体Ｎ２０１Ｋは、高い熱安定性を維持しながら（ＴＡＧＧは０～２℃低下する）、ＣＩＥＸで最も大きなシフト（２．５～３．４分）を生じさせるとみられる。これは、それらの抗原結合特異性及びそれらが由来する生殖細胞系列Ｖ領域に関係なく、試験したＶＨ配列の両方について当てはまる。他の列記された単一のアミノ酸の変異体もまた、良好な安定性を示し、ＣＩＥＸ保持時間の有用なシフトを示す。
Figure 2022534674000026
試験した変異体は、全て同様のＴｍ１値を有し、Ｔｍ２は好適な範囲内である。単一の変異Ｋ２１３Ｑは、良好な熱安定性を維持しながら（ＴＡＧＧは０．７℃低下する）、ＣＩＥＸの大きなシフト（－０．８分）を生じさせる。二重変異体Ｎ２０１Ｋ＋Ｎ１５９Ｋは、熱安定性には限定された効果を示す一方で、ＣＩＥＸの保持時間に顕著な効果を与える。この場合、試験した三重変異体は、最大のＣＩＥＸの保持時間のシフトを示した。
実施例７ａ：分離の設計のための非表面残基の特定
別のＣＨ２領域表面を有するＩｇＧ１ ＣＨ２領域の構造情報から、デフォルトパラメータを使用して、プログラムＧＥＴＡＲＥＡ１．０を用いて、ＣＨ２領域内の表面に露出していない及び埋もれたアミノ酸残基の位置を特定した。Ｎｅｇｉら、「Ｓｏｌｖｅｎｔ Ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ Ｓｕｒｆａｃｅ Ａｒｅａｓ，Ａｔｏｍｉｃ Ｓｏｌｖａｔｉｏｎ Ｅｎｅｒｇｉｅｓ，ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｇｒａｄｉｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」，Ｌａｓｔ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｗｅｄ １７Ｔｈ Ａｐｒｉｌ，３：００ＰＭ，２０１５。表２０の配列を有するＣＨ２領域のモデルを、Ｓｗｉｓｓ－ｍｏｄｅｌウェブサイト（Ａｒｎｏｌｄ Ｋ，Ｂｏｒｄｏｌｉ Ｌ，Ｋｏｐｐ Ｊ，Ｓｃｈｗｅｄｅ Ｔ．Ｔｈｅ ＳＷＩＳＳ－ＭＯＤＥＬ ｗｏｒｋｓｐａｃｅ：タンパク質構造相同性モデリングのためのウェブベースの環境．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２００６ Ｊａｎ １５；２２（２）：１９５～２０１）に入力した。ＩｇＧ１ ＣＨ３領域についても同じことを行った。
基本的に上述したように、Ｓｗｉｓｓ－Ｍｏｄｅｌバージョン１．３．０をＳｗｉｓｓ－Ｍｏｄｅｌウェブサーバから使用して、高品質のＣＨ２及びＣＨ３のホモロジーモデルを得た。いくつかの適切な結晶構造が存在する（それらは高品質の構造であり、本明細書の多くの実施形態では「元の」又はテンプレートの配列として使用されるＣＨ２ドメインと＞９５％の配列同一性を示すアライメントを有する）。ＰＤＢ中の多くの他のＣＨ２領域は、高品質の出発構造（ここで使用されるＣＨ２領域と＞９５％の配列同一性及び高品質構造を有する）を提供することができた。多くは、実施例１と同様に、一般的に使用されるホモロジーモデリングツールを使用して容易に同定される。ＣＨ２ドメインの構造モデルを、ＣＨ２クエリー配列のＰＤＢテンプレート５ｖｕ０から出発して完全長で９８．２％の配列同一性で得た（ミスマッチは、遺伝子操作した領域及び末端／リンカー領域で生じ、モデルは、０．９９のバージョン１．３．０のＳｗｉｓｓ－Ｍｏｄｅｌ ＧＭＱＥスコアを得ることに留意されたい）。
Ｓｗｉｓｓ－Ｍｏｄｅｌにより生成されたｐｄｂファイルをアップロードして、この構造をＧＥＴＡＲＥＡ１．０βで処理した。ＧＥＴＡＲＥＡ１．０βのデフォルトパラメータに基づいて、５０％を超えて表面に露出するアミノ酸は、「Ｏｕｔ」又は表面と呼ばれ、ｎｏｎ－ＯＵＴ又は表面に露出していない残基は、５０％～２０％超であり、アクセス可能が２０％未満は、ＧＥＴＡＲＥＡ１．０βによって「ｉｎ」と称されるか、又は本明細書では埋もれたアミノ酸と称される。
ＣＨ３
同様に、本明細書で具体化される「元の」又は任意の遺伝子操作されたＣＨ３ドメインを、ホモロジーモデリングを使用して、ホモ二量体（相互作用する２つのＣＨ３鎖）として、又は単量体としてモデル化することができる。いくつかの適切な結晶構造が存在する（それらは高品質の構造であり、本明細書の実施形態の多くにおいて「元の」配列として使用されるＤＥ又はＫＫ－ＣＨ３ドメインと＞９２％の配列同一性を示すアライメントを有する）。ＰＤＢ中の多くの他のＣＨ３領域は、高品質の出発構造（ここで使用されるＣＨ３領域と＞９２％の配列同一性及び高品質構造を有する）を提供することができた。多くは、実施例１と同様に、一般的に使用されるホモロジーモデリングツールを使用して容易に同定される。例えば、ＤＥ－ＣＨ３クエリー配列のＰＤＢテンプレート５ｗ３８から出発して完全長で９３．４６の配列同一性を有するＣＨ３ドメイン（ＤＥ－ＣＨ３）の構造モデルを得る（ミスマッチは、遺伝子操作した領域及びリンカー／ドメイン末端領域で生じ、モデルは、０．９９の、バージョン１．３．０のＳｗｉｓｓ－Ｍｏｄｅｌ ＧＭＱＥスコアを得ることに留意されたい）。Ｓｗｉｓｓ－Ｍｏｄｅｌにより生成されたＰＤＢファイルをアップロードして、この構造をＧＥＴＡＲＥＡ１．０βで処理した。ＧＥＴＡＲＥＡ１．０βのデフォルトパラメータに基づいて、表面への露出が５０％を超えるアミノ酸は、「Ｏｕｔ」又は表面と呼ばれ、ｎｏｎ－ＯＵＴ又は表面に露出していない残基は、５０％～２０％超であり、アクセス可能が２０％未満は、ＧＥＴＡＲＥＡ１．０βによって「Ｉｎ」と称されるか、又は本明細書では埋もれたアミノ酸と称される（表２０～２２を参照）。
モデル化されたＣＨ２領域は、ＥＵナンバリングに従った２３５位及び２３６位でサイレンシングするために改変されたヒトＣＨ２である。モデル化されたＣＨ３領域は、ＥＵナンバリングに従って表２１のＬ３５１Ｄ及びＬ３６８Ｅの変異、及び表２２のＴ３６６Ｋ及びＬ３５１Ｋの変異を含むように改変されたヒトＣＨ３であり、それにより、ＣＨ３ ＤＥＫＫヘテロ二量体化ドメインのＣＨ３鎖をモデリングする。
Figure 2022534674000027
Figure 2022534674000028
Figure 2022534674000029
ＣＨ２の配列及びモデリング情報。位置は任意的な数で示している。ＥＵナンバーリングに従った位置番号３４０を有する番号１１１の残基ＬＹＳまで、番号２の残基ＡＬＡはＥＵナンバー２３１に対応し、番号３の残基ＰＲＯはＥＵナンバー２３２に対応するなどする（図１７に示すＩＭＧＴ表を参照）。
ＣＨ２領域の配列は、２３５位及び２３６位にＦｃサイレント変異（Ｌ２３５Ｇ及びＧ２３６Ｒの変異）を含む。列Ｉｎ／Ｏｕｔは、アミノ酸が埋もれた（ｉ）又は表面に露出している（ｏ）とみなされるかどうかを示す。空白は、表面に露出しておらず、埋もれてもいないアミノ酸の値を示す。
Figure 2022534674000030
Figure 2022534674000031
Figure 2022534674000032
ＣＨ３の配列及びモデリング情報。位置は任意的な数で示している。ＥＵナンバーリングに従った位置番号４４３を有する番号１０３の残基ＬＥＵまで、番号１の残基ＧＬＹはＥＵナンバー３４１に対応し、番号２の残基ＧＬＮはＥＵナンバー３４２に対応するなどする（図１７に示すＩＭＧＴ表を参照）。
ＣＨ３領域の使用される配列は、３５１位及び３６８位におけるＤＥヘテロ二量体化の変異を含む（Ｌ３５１Ｄ及びＬ３６８Ｅの変異はそれぞれ上のナンバリングの位置１１及び２８）。列Ｉｎ／Ｏｕｔは、アミノ酸が埋もれた（ｉ）又は表面に露出している（ｏ）とみなされるかどうかを示す。空白は、表面に露出しておらず、埋もれてもいないアミノ酸の値を示す。
Figure 2022534674000033
Figure 2022534674000034
Figure 2022534674000035
ＣＨ３の配列及びモデリング情報。位置は任意的な数で示している。ＥＵナンバーリングに従った位置番号４４３を有する番号１０３の残基ＬＥＵまで、番号１の残基ＧＬＹはＥＵナンバー３４１に対応し、番号２の残基ＧＬＮはＥＵナンバー３４２に対応するなどする（図１７に示すＩＭＧＴ表を参照）。
ＣＨ３領域の使用される配列は、３５１位及び３６６位におけるＫＫヘテロ二量体化の変異を含む（Ｌ３５１Ｋ及びＴ３６６Ｋの変異はそれぞれ上のナンバリングの位置１１及び２６）。列Ｉｎ／Ｏｕｔは、アミノ酸が埋もれた（ｉ）又は表面に露出している（ｏ）とみなされるかどうかを示す。空白は、表面に露出していないアミノ酸の値を示す。
実施例７ｂ：構築物の設計
ＣＨ２及びＣＨ３における非表面及び埋もれた位置を、これらの免疫グロブリン領域が組み込まれた多量体化タンパク質の電荷を変化させるように変更する。合計９つの例示的なＣＨ２及びＣＨ３領域の変異を生成して、野生型のＣＨ２及びＣＨ３領域を有する単特異性、及び多重特異性抗体と比較するための単特異性、及び多重特異性抗体に組み込む。これらの分離用ＣＨ２／ＣＨ３領域を含む重鎖分子を発現する構築物を、実施例１に詳述した方法と同様に調製する。
試験した変異体のアミノ酸の変異を表２３に示す。
Figure 2022534674000036
変異体は全て、表２０に示すＣＨ２領域におけるＦｃサイレントの変異を含む。変異体は、ＤＥ変異体について表２１、及びＫＫ変異体について表２２に示した、ＣＨ３ヘテロ二量体化ドメインを更に含有する。負の電荷の増加を提供した変異体を、ＤＥのＣＨ３主鎖に組み込んだ。正の電荷が増加したものについては、それらをＫＫのＣＨ３主鎖に組み込んだ。
それぞれの重鎖を、図１３ａの共通軽鎖と共に破傷風トキソイド（ＴＴ）に結合するか、又はｃ－ＭＥＴの細胞外部分に結合する可変ドメインを形成する重鎖可変領域で作製した。ＴＴ可変ドメインは、ＭＦ１５１６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を有する。ｃ－ＭＥＴ可変ドメインは、ＭＦ３４６２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を有する。ＶＨ ＭＦ１５１６及びＭＦ３４６２のアミノ酸配列を上に示した。互換性を有するヘテロ二量化領域を含む重鎖の産生によって、二重特異性抗体の優先的な形成が可能になる。ＶＨ ＭＦ１５１６を含む重鎖はＤＥ変異体ＣＨ３ドメインを含有し、一方、ＶＨ３４６２を含む重鎖はＫＫ変異体ＣＨ３ドメインを有する。
最終構築物の同一性をシークエンシングにより確認した。二重特異性抗体の産生のために、一方の重鎖は、ＭＦ１５１６の可変領域、野生型ＣＨ１領域及びヒンジ領域、ＦｃサイレントＣＨ２領域、及びＤＥ ＣＨ３領域を含有する。他方の重鎖は、ＭＦ３４６２の可変領域、野生型ＣＨ１領域及びヒンジ領域、ＦｃサイレントＣＨ２領域、及びＫＫ ＣＨ３領域を含有する。上述したように、負の電荷の増加をもたらす表２３に示した変異体を、ＤＥ ＣＨ３領域と共に重鎖に組み込んだ。正の電荷の増加をもたらす変異体を、ＫＫ ＣＨ３領域を含む重鎖に組み込んだ。以下の本明細書において、野生型に言及する場合、二重特異性抗体は、上記の重鎖及び軽鎖を有するが、表２３に記載の変異体の１つを有していないものを指す。
二重特異性抗体を、２つの重鎖を組み合わせることによって産生させた。抗体を発現させて、実施例１ｃに基本的に記載した方法を用いて精製した。簡潔に述べると、図１３ａの配列を有する２つの重鎖及び共通軽鎖を発現する構築物を、ＨＥＫ２９３細胞に導入した。トランスフェクション後の６日目に、細胞の培地を採取した。続いて、抗体を、実施例１に記載の方法でこの培地から精製した。この方法で生成された抗体を図１９に列記する。
互換性を有するヘテロ二量体化ＣＨ３ドメインを含有しないＣＨ３ドメインを含む重鎖を用いて、表２３の変異体を有する単特異性二価抗体を産生させた。重鎖は、ＭＦ１５１６又はＭＦ３４６２のアミノ酸配列を含むＶＨのいずれか、野生型ＣＨ１領域及びヒンジ領域、ＦｃサイレントＣＨ２領域、及び野生型ＣＨ３領域を有する。表２３に示したアミノ酸の変異を、ＦｃサイレントＣＨ２領域又は野生型ＣＨ３領域のいずれかに導入した。負の電荷の増加をもたらす表２３に示した変異体を、ＭＦ１５１６のＶＨ領域を含む重鎖に組み込んだ。正の電荷の増加をもたらす変異体を、ＭＦ３４６２領域を含む重鎖に組み込んだ。以下の本明細書において野生型に言及する場合、抗体は、上記の重鎖及び軽鎖を有するが、表２３に記載の変異体の一方を有していないものを指す。簡潔に述べると、図１３ａの配列を含む示された重鎖及び共通軽鎖を発現する構築物を、ＨＥＫ２９３細胞に導入した。トランスフェクション後の６日目に、細胞の培地を採取した。続いて、抗体を、実施例１に記載の方法でこの培地から精製した。この方法で生成された抗体を図１９に列記する。
ＥＬＩＳＡ
様々な抗体の結合を評価するために、ＥＬＩＳＡプレートをｃ－ＭＥＴ、破傷風トキソイド又はチログロブリンでコーティングした。（ｃ－ＭＥＴ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ カタログ番号３５８－ＭＴ／ＣＦ）２．５μｇ／ｍＬ、破傷風トキソイド（Ｓｔａｔｅｎｓ ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ カタログ番号Ｔ１６２－２）２μｇ／ｍＬ及びチログロブリン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ カタログ番号Ｔ１１２６－５００ＭＧ）１０μｇ／ｍＬ）。抗体を１０、１、０．１、０．０１μｇ／ｍＬでインキュベートした。結合した抗体を、１：２０００希釈のκ軽鎖に結合するＨＲＰコンジュゲートプロテインＬベースの二次抗体（Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号．３２４２０）で検出した。
ＥＬＩＳＡの結果を図１８にまとめる。
抗体ＰＧ１３３７は、単特異性二価ＴＴ ＩｇＧ１抗体である。抗体ＰＧ１０２５は、単特異性二価チロシングロブリンＩｇＧ１抗体である。抗体ＰＧ２９９４は、単特異性二価ｃＭＥＴ ＩｇＧ１抗体である。全ての二重特異性抗体は、用量依存的な様式でｃ－ＭＥＴ及び破傷風トキソイドに結合すると結論付けられる。二重特異性抗体は陰性対照抗原（チログロブリン）には結合しない。結合は、野生型ＣＨ２／ＣＨ３領域又はその変異体を有する抗体の間で異なるとはみえない。
実施例８：それぞれの二重特異性抗体のＣＩＥＸプロファイル。
ＣＩＥＸ実験を実施例２に記載のように行った。それぞれの抗体の結果を図２０及び２１に示し、表２４にまとめる。
Figure 2022534674000037
実施例９：それぞれのＣＨ２ ＣＨ３分離用ドメインを含有する抗体の融解温度
熱安定性を実施例６で説明したようにＵＮＣＬＥで測定した。
Figure 2022534674000038
分離用変異体を含むほとんどの二重特異性抗体は、融解温度が少ししか低下しないこと（約２～３℃）を示す。
ＴＭ１：半ＩｇＧ
半ＩｇＧ及び１つのＰＢに早いＴＭが見られ、それはそのＰＢの調製における半ＩｇＧに起因する可能性がある。ＴＭ１は、全ての半ＩｇＧで同様であった（ＤＥ半抗体のトランスフェクションと比較してＫＫの方が低く、Ｖ３０３Ｋが最も低い）。
ＴＭ２：Ｆｃの融解
ＫＫ側の変異を有するＰＢは、ＴＭ２の低下（２～３度）を示す。
Ｖ３０３の変異（ＤＥ及びＫＫ側の両方で）は、ＰＢのＴＭ２を低下させる。
ＴＭ３：Ｆａｂの融解
野生型ＩｇＧ１対照から予想されるように、全てのＰＢで約７８～７９度と検出された（図２０及び２１を参照）。このことは、ＰＢの安定性が、Ｆｃの変異によって著しくは影響を受けないことを示している。
ＴＡＧＧ：全てのＰＢにおいて同じであり、ＫＫ半ＩｇＧでは高くなった。
Ｅ３８８Ｔの半ＩｇＧは、高いＴＡＧＧを有する。
まとめ
Figure 2022534674000039
試験したＣＨ２及びＣＨ３変異体は全て、ＤＥＤＥ及びＫＫ分子からの二重特異性抗体の分離に有利に影響を及ぼす。一部の変異体は、より高い効果を有する。熱安定性は、分離用変異に少ししか影響されない。これらの比較的粗製の調製物中の半抗体の割合もまた、それぞれの分離用変異にわたって比較的一定であり、効果的に半抗体が０％であるＥ３８８Ｔを除いて野生型と同様である。
本発明は、本発明の一部として以下の態様を提供する。
態様
態様１ 免疫グロブリンのＣＨ１領域であって、免疫グロブリン中の表面に露出していないアミノ酸の変異を含み、変異が
中性アミノ酸から負に荷電したアミノ酸、
正に荷電したアミノ酸から中性アミノ酸、
正に荷電したアミノ酸から負に荷電したアミノ酸、
中性アミノ酸から正に荷電したアミノ酸、
負に荷電したアミノ酸から中性アミノ酸、及び
負に荷電したアミノ酸から正に荷電したアミノ酸への変異から選択される、免疫グロブリンのＣＨ１領域。
態様２ 免疫グロブリン中の表面に露出していないアミノ酸の２つ以上の変異を含む、態様１に記載の免疫グロブリン領域。
態様３ ヒト免疫グロブリン領域である、態様１又は２に記載の免疫グロブリン領域。
態様４ 表面に露出していないアミノ酸が埋もれた、態様１～３のいずれか１つに記載の免疫グロブリン領域。
態様５ ＩｇＧ領域、好ましくはＩｇＧ１領域である、態様１～４のいずれか１つに記載の免疫グロブリン領域。
態様６ Ｔ１２０、Ｋ１４７、Ｄ１４８、Ｙ１４９、Ｖ１５４、Ｎ１５９、Ａ１７２、Ｑ１７５、Ｓ１９０、Ｎ２０１及びＫ２１３（ＥＵナンバリング）から選択されるアミノ酸の変異を含む、免疫グロブリンのＣＨ１領域。
態様７ Ｄ１４８、Ｙ１４９、Ｖ１５４、Ｎ１５９、Ａ１７２、Ｓ１９０及びＮ２０１から選択されるアミノ酸の変異を含む、態様６に記載の免疫グロブリンのＣＨ１領域。
態様８ Ｎ１５９及び／又はＮ２０１から選択されるアミノ酸の変異を含む、態様６又は７に記載の免疫グロブリンのＣＨ１領域。
態様９ 態様１～８のいずれか１つに記載のＣＨ１領域を含む、抗体。
態様１０ 態様１～８のいずれか１つに記載の２つ以上のＣＨ１領域を含む、態様９に記載の抗体。
態様１１ 異なる重鎖を含む、態様９又は１０に記載の抗体。
態様１２ 多重特異性抗体である、態様１１に記載の抗体。
態様１３ 重鎖が、互換性を有するヘテロ二量体化領域を含む、態様１１又は１２に記載の多重特異性抗体。
態様１４ 互換性を有するヘテロ二量体化ＣＨ３領域を含む、態様１３に記載の多重特異性抗体。
態様１５ 重鎖の一方がＣＨ３の変異Ｌ３５１Ｄ及びＬ３６８Ｅを含み、当該重鎖の他方がＣＨ３の変異Ｔ３６６Ｋ及びＬ３５１Ｋを含む、態様１２～１４のいずれか１つに記載の多重特異性抗体。
態様１６ ＩｇＧ１抗体である、態様９～１５のいずれか１つに記載の抗体。
態様１７ １つ以上の抗体軽鎖を含む、態様９～１６のいずれか１つに記載の抗体。
態様１８ 共通軽鎖を含む、請求項９～１７のいずれか１つに記載の抗体。
態様１９ 態様１～８のいずれか１つに記載の免疫グロブリン領域又は態様９～１８のいずれか１つに記載の抗体を含む、組成物。
態様２０ 態様１～８のいずれか１つに記載の免疫グロブリン領域又は態様９～１８のいずれか１つに記載の抗体を含む、医薬組成物。
態様２１ 態様１～８のいずれか１つに記載のＣＨ１領域又は態様９～１８のいずれか１つに記載の抗体をコードする、核酸。
態様２２ 態様９～１８のいずれか１つに記載の抗体をコードする、核酸。
態様２３ 態様２１又は２２に記載の核酸を含む、組換え宿主細胞。
態様２４ 態様９～１８のいずれか１つに記載の抗体の製造方法であって、方法が、
態様１～８のいずれか１つに記載のＣＨ１領域を含む、第１重鎖をコードする核酸を提供する工程、
第２重鎖をコードする核酸を提供する工程であって、当該第１及び第２重鎖は同じであっても異なっていてもよい、工程、
軽鎖をコードする核酸を提供する工程、
当該核酸を宿主細胞に導入し、当該宿主細胞を培養して核酸を発現させる工程、並びに及び以下の工程、
宿主細胞の培養物から抗体を収集する工程、
収集物を清澄化する工程、
タンパク質を捕集する工程、
陰イオン交換クロマトグラフィーを行う工程、及び
陽イオン交換クロマトグラフィーを行い、別の抗体又は抗体断片から抗体を分離する工程、
の少なくとも１つを実施することによって抗体を製造する工程を含む、方法。
態様２５ 態様９～１８のいずれか１つに記載の抗体の製造方法であって、方法が、
態様１～８のいずれか１つに記載のＣＨ１領域を含む、第１重鎖をコードする核酸を提供する工程、
第２重鎖をコードする核酸を提供する工程であって、当該第１及び第２重鎖は同じであっても異なっていてもよい、工程、
軽鎖をコードする核酸を提供する工程、
当該核酸を宿主細胞に導入し、当該宿主細胞を培養して核酸を発現させる工程、及び
宿主細胞の培養物から抗体を収集する工程、及び
分離工程において、ゲル上の等電点電気泳動によって他の抗体又は抗体断片から抗体を分離する工程を含む、方法。
態様２６ 当該第１及び第２重鎖が、互換性を有するヘテロ二量体化領域、好ましくは互換性を有するＣＨ３ヘテロ二量体化領域を含む、態様２４又は２５に記載の方法。
態様２７ 等電点が異なる第１重鎖及び第２重鎖を含む、多重特異性抗体の製造方法であって、方法が、
第１のコードされた重鎖の等電点及び第２のコードされた重鎖の等電点が異なるように、第１重鎖のＣＨ１領域をコードする核酸及び第２重鎖のＣＨ１領域をコードする核酸を提供する工程であって、当該ＣＨ１領域の少なくとも１つが、Ｔ１２０、Ｋ１４７、Ｄ１４８、Ｙ１４９、Ｖ１５４、Ｎ１５９、Ａ１７２、Ｑ１７５、Ｓ１９０、Ｎ２０１及びＫ２１３（ＥＵナンバリング）から選択される位置のアミノ酸の変異を含む、工程、
宿主細胞を培養して核酸を発現させる工程、及び
宿主細胞の培養物から多重特異性抗体を、等電点の差を使用して収集する工程を含み、
宿主細胞の培養物から抗体を収集する工程、
収集物を清澄化する工程、
タンパク質を捕集する工程、
陰イオン交換クロマトグラフィーを行う工程、及び
陽イオン交換クロマトグラフィーを行い、別の抗体又は抗体断片から抗体を分離する工程を更に含む、方法。
態様２８ 等電点が異なる第１重鎖及び第２重鎖を含む、多重特異性抗体の精製方法であって、方法が、
第１のコードされた重鎖及び第２のコードされた重鎖の等電点が異なるように、第１重鎖のＣＨ１領域をコードする核酸、及び第２重鎖のＣＨ１領域をコードする核酸の両方又はいずれか一方を提供する工程であって、当該ＣＨ１領域の少なくとも１つが、Ｔ１２０、Ｋ１４７、Ｄ１４８、Ｙ１４９、Ｖ１５４、Ｎ１５９、Ａ１７２、Ｑ１７５、Ｓ１９０、Ｎ２０１及びＫ２１３（ＥＵナンバリング）から選択される位置のアミノ酸の変異を含む、工程、及び
宿主細胞を培養して核酸を発現させる工程、及び
多重特異性抗体を、等電点電気泳動により宿主細胞の培養物から精製して、多重特異性抗体を別の抗体又は抗体断片から分離する工程を含む、方法。
態様２９ 第１重鎖のホモ多量体、第２重鎖のホモ多量体、及び第１及び第２重鎖のヘテロ多量体をコードする核酸が、異なる等電点を有するタンパク質として発現され、イオン交換クロマトグラフィーにおいて異なる保持時間を生じさせる、態様２７又は２８に記載の方法。
態様３０ 当該位置の当該１つ以上のアミノ酸の変異が、
中性アミノ酸から負に荷電したアミノ酸、
正に荷電したアミノ酸から中性アミノ酸、
正に荷電したアミノ酸から負に荷電したアミノ酸、
中性アミノ酸から正に荷電したアミノ酸、
負に荷電したアミノ酸から中性アミノ酸、及び
負に荷電したアミノ酸から正に荷電したアミノ酸への変異から選択される、態様２７～２９のいずれか１つに記載の方法。
態様３１ 第１重鎖及び第２重鎖が、互換性を有するＣＨ３ヘテロ二量体化領域を含む、態様２７～３０のいずれか１つに記載の方法。
態様３２ 当該互換性を有するＣＨ３ヘテロ二量体化領域の一方がＬ３５１Ｄ及びＬ３６８Ｅの変異を含み、他方がＴ３６６Ｋ及びＬ３５１Ｋの変異を含む、態様３１に記載の方法。
態様３３ １２０位、１４７位、１４８位、１４９位１５４位、１５９位、１７２位、１７５位、１９０位、２０１位又は２１３位に第１の荷電アミノ酸残基を含む、ＣＨ１含有免疫グロブリンポリペプチド。
態様３４ 態様３３に記載の荷電残基に加えて、１２０位、１４７位、１４８位、１４９位、１５４位、１５９位、１７２位、１７５位、１９０位、２０１位又は２１３位から選択される異なる位置に第２の荷電アミノ酸残基を含む、態様３３に記載のＣＨ１含有免疫グロブリンポリペプチド。
態様３５ １９７位及び／又は２１３位に中性又は負に荷電したアミノ酸残基を含む、ＣＨ１含有免疫グロブリンポリペプチド。
態様３６ １５９位に中性又は正に荷電したアミノ酸残基、及びヒンジ位置２１６に正に荷電したアミノ酸残基を含む、ＣＨ１含有免疫グロブリンポリペプチド。
態様３７ 第１ＣＨ１含有免疫グロブリンポリペプチド及び第２ＣＨ１含有免疫グロブリンポリペプチドを含む、免疫グロブリンタンパク質であって、第１及び／又は第２ＣＨ１含有免疫グロブリンポリペプチドが、表面に露出していないＣＨ１領域内のアミノ酸から選択される１つ以上のアミノ酸の１つ以上の変異を含み、それにより、第１ＣＨ１含有免疫グロブリンポリペプチド及び第２ＣＨ１含有免疫グロブリンポリペプチドを含む免疫グロブリンタンパク質の等電点が、第１ＣＨ１免疫グロブリンポリペプチドのみを含有する免疫グロブリンタンパク質の等電点、又は第２ＣＨ１免疫グロブリンポリペプチドのみを含有するタンパク質の等電点とは異なる、免疫グロブリンタンパク質。
態様３８ ＣＨ１領域内のアミノ酸から選択される１つ以上のアミノ酸の当該１つ以上の変異が埋もれた、態様３７に記載の免疫グロブリンタンパク質。
態様３９ Ｔ１９７から選択されるアミノ酸及びヒンジ位置Ｅ２１６における変異を更に含む、態様１～１８のいずれか１つに記載の免疫グロブリン領域又は抗体を含む組成物。
態様４０ 第１ＣＨ１領域含有免疫グロブリンポリペプチド及び第２ＣＨ１領域含有免疫グロブリンポリペプチドを含む、免疫グロブリンタンパク質であって、一方のＣＨ１領域が、表面に露出していないアミノ酸の１つ以上の変異を含み、アミノ酸の１つ以上の変異が、
中性アミノ酸から負に荷電したアミノ酸、
正に荷電したアミノ酸から中性アミノ酸、及び
正に荷電したアミノ酸から負に荷電したアミノ酸、又は、
中性アミノ酸から正に荷電したアミノ酸、
負に荷電したアミノ酸から中性アミノ酸、及び
負に荷電したアミノ酸から正に荷電したアミノ酸への変異から選択される、免疫グロブリンタンパク質。
態様４１ 第１ＣＨ１領域含有免疫グロブリンポリペプチド及び第２ＣＨ１領域含有免疫グロブリンポリペプチドを含む、免疫グロブリンタンパク質であって、一方のＣＨ１領域が、表面に露出していないアミノ酸の１つ以上の変異を含み、アミノ酸の１つ以上の変異が、
中性アミノ酸から負に荷電したアミノ酸、
正に荷電したアミノ酸から中性アミノ酸、及び
正に荷電したアミノ酸から負に荷電したアミノ酸への変異であり、
他方のＣＨ１領域が、表面に露出していないアミノ酸の１つ以上の変異を含み、アミノ酸の１つ以上の変異が
中性アミノ酸から正に荷電したアミノ酸、
負に荷電したアミノ酸から中性アミノ酸、及び
負に荷電したアミノ酸から正に荷電したアミノ酸への変異である、免疫グロブリンタンパク質。
態様４２ 第１ＣＨ１領域含有免疫グロブリンポリペプチド及び第２ＣＨ１領域含有免疫グロブリンポリペプチドを含む、免疫グロブリンタンパク質であって、第１及び／又は第２ＣＨ１領域含有免疫グロブリンポリペプチドが、表面に露出していないＣＨ１領域内のアミノ酸から選択される１つ以上のアミノ酸の１つ以上の変異を含み、それにより、第１ＣＨ１領域含有免疫グロブリンポリペプチド及び第２ＣＨ１領域含有免疫グロブリンポリペプチドを含む免疫グロブリンタンパク質の等電点が、第１ＣＨ１領域免疫グロブリンポリペプチドのみを含有する免疫グロブリンタンパク質の等電点、及び第２ＣＨ１領域免疫グロブリンポリペプチドのみを含有する免疫グロブリンタンパク質の等電点とは異なる、免疫グロブリンタンパク質。
態様４３ ヒトＣＨ１領域を含む、態様４０～４２のいずれか１つに記載の免疫グロブリンタンパク質。
態様４４ ＩｇＧである、態様４０～４３のいずれか１つに記載の免疫グロブリンタンパク質。
態様４５ 表面に露出していないアミノ酸が埋もれた、態様４０～４４のいずれか１つに記載の免疫グロブリンタンパク質。
態様４６ Ｔ１２０、Ｋ１４７、Ｄ１４８、Ｙ１４９、Ｖ１５４、Ｎ１５９、Ａ１７２、Ｑ１７５、Ｓ１９０、Ｎ２０１及びＫ２１３から選択されるアミノ酸のＣＨ１領域におけるアミノ酸の変異を含む、態様４０～４４のいずれか１つに記載の免疫グロブリンタンパク質。
態様４７ Ｄ１４８、Ｙ１４９、Ｖ１５４、Ｎ１５９、Ａ１７２、Ｓ１９０及びＮ２０１から選択されるアミノ酸の変異を含む、態様４６に記載の免疫グロブリンタンパク質。
態様４８ Ｎ１５９及び／又はＮ２０１のアミノ酸の変異を含む、態様４７に記載の免疫グロブリンタンパク質。
態様４９ 第１ＣＨ１領域含有免疫グロブリンポリペプチド及び第２ＣＨ１領域含有免疫グロブリンポリペプチドが重鎖である、態様４０～４８のいずれか１つに記載の免疫グロブリンタンパク質。
態様５０ 抗体である、態様４０～４９のいずれか１つに記載の免疫グロブリンタンパク質。
態様５１ 二重特異性抗体である、態様５０に記載の抗体。
態様５２ 多重特異性抗体である、態様５０に記載の抗体。
態様５３ Ｔ１９７から選択されるアミノ酸及びヒンジ位置Ｅ２１６における変異を更に含む、態様４０～５２のいずれか１つに記載の免疫グロブリンタンパク質。
態様５４ 次の変異Ｇ１２２Ｐ、Ｉ１９９Ｖ、Ｎ２０３Ｉ、Ｓ２０７Ｔ及びＶ２１１Ｉの１つ以上を更に含む、態様１～８のいずれか１つに記載の免疫グロブリン領域又は態様９～１８のいずれか１つに記載の抗体を含む、組成物。

Claims (76)

  1. 免疫グロブリンのＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３領域であって、免疫グロブリン又は前記領域の組合せ内の表面に露出していないアミノ酸の変異を含み、前記変異が、
    中性アミノ酸から負に荷電したアミノ酸、
    正に荷電したアミノ酸から中性アミノ酸、
    正に荷電したアミノ酸から負に荷電したアミノ酸、
    中性アミノ酸から正に荷電したアミノ酸、
    負に荷電したアミノ酸から中性アミノ酸、及び
    負に荷電したアミノ酸から正に荷電したアミノ酸への変異から選択される、免疫グロブリンのＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３領域。
  2. 免疫グロブリン内の表面に露出していないアミノ酸の２つ以上の変異を含む、請求項１に記載の免疫グロブリン領域。
  3. アミノ酸の前記変異が、ＣＨ１／ＣＬ、ＣＨ２／ＣＨ２ドメイン、又はＣＨ３／ＣＨ３ドメインの界面に存在しない、請求項１又は２に記載の免疫グロブリン領域。
  4. ＩｇＧ領域、好ましくはＩｇＧ１領域である、請求項１～３のいずれか一項に記載の免疫グロブリン領域。
  5. 表面に露出していない前記アミノ酸が埋もれた、請求項１～４のいずれか一項に記載の免疫グロブリン領域。
  6. Ｎ１５９、Ｎ２０１、Ｔ１２０、Ｋ１４７、Ｄ１４８、Ｙ１４９、Ｖ１５４、Ａ１７２、Ｑ１７５、Ｓ１９０及びＫ２１３（ＥＵナンバリング）から選択されるアミノ酸の変異を含む、免疫グロブリンのＣＨ１領域。
  7. Ｄ１４８、Ｙ１４９、Ｖ１５４、Ｎ１５９、Ａ１７２、Ｓ１９０及びＮ２０１から選択されるアミノ酸の変異を含む、請求項５に記載の免疫グロブリンのＣＨ１領域。
  8. Ｎ１５９及び／又はＮ２０１から選択されるアミノ酸の変異を含む、請求項６又は７に記載の免疫グロブリンのＣＨ１領域。
  9. 前記アミノ酸の２つ以上の変異を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の免疫グロブリンのＣＨ１領域。
  10. 前記２つ以上の変異が、
    中性アミノ酸から負に荷電したアミノ酸、
    正に荷電したアミノ酸から中性アミノ酸、
    正に荷電したアミノ酸から負に荷電したアミノ酸への変異の２つ以上、
    又は
    中性アミノ酸から正に荷電したアミノ酸、
    負に荷電したアミノ酸から中性アミノ酸、
    負に荷電したアミノ酸から正に荷電したアミノ酸への変異の２つ以上を含む、請求項９に記載の免疫グロブリンのＣＨ１領域。
  11. 群Ａ１７２／Ｓ１９０／Ｎ２０１、Ｔ１９７／Ｋ２１３、Ｄ１４８／Ｑ１７５、Ｎ１５９／Ｑ２１３、Ｋ１４７／Ｑ１７５、Ｙ１４９／Ｖ１５４／Ａ１７２／Ｓ１９０、Ｎ２０１／Ｋ２１３、Ｔ１２０／Ｎ２０１、Ｎ２０１／Ｎ１５９、Ｔ１２０／Ｎ１５９、Ｔ１２０／Ｎ２０１／Ｎ１５９、及びＮ２０１／Ｋ２１３／Ｎ１５９から選択されるアミノ酸の変異を含む、請求項９又は１０に記載の免疫グロブリンのＣＨ１領域。
  12. アミノ酸Ｖ３０３の変異を含む、免疫グロブリンのＣＨ２領域。
  13. Ｋ３７０、Ｅ３８２及びＥ３８８、好ましくはＥ３８８から選択されるアミノ酸の変異を含む、免疫グロブリンのＣＨ３領域。
  14. 前記変異が、
    中性アミノ酸から負に荷電したアミノ酸、
    正に荷電したアミノ酸から中性アミノ酸、
    正に荷電したアミノ酸から負に荷電したアミノ酸、
    中性アミノ酸から正に荷電したアミノ酸、
    負に荷電したアミノ酸から中性アミノ酸、
    負に荷電したアミノ酸から正に荷電したアミノ酸への変異から選択される、請求項６～１３のいずれか一項に記載の免疫グロブリン領域。
  15. 請求項６～１４のいずれか一項に記載の免疫グロブリン領域を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の免疫グロブリン領域。
  16. 請求項１～１５のいずれか一項に記載の免疫グロブリン領域を含む、免疫グロブリンのＣＨ１／ＣＬドメイン、ＣＨ２ドメイン又はＣＨ３ドメイン。
  17. Ｆｃサイレント変異を更に含む、請求項１６に記載の免疫グロブリンのＣＨ２ドメイン。
  18. ＣＨ３のヘテロ二量体化ドメインを更に含み、好ましくは、ＣＨ３の変異Ｌ３５１Ｄ及びＬ３６８Ｅを一方のＣＨ３領域に含み、ＣＨ３の変異Ｔ３６６Ｋ及びＬ３５１Ｋを他方に含む、請求項１６に記載の免疫グロブリンのＣＨ３ドメイン。
  19. 請求項１６～１８のいずれか一項に記載の免疫グロブリンドメインを含む、タンパク質。
  20. 請求項１６～１９のいずれか一項に記載の免疫グロブリンドメインを含む、抗体、好ましくは多重特異性抗体。
  21. 異なる重鎖を含む、請求項２０に記載の多重特異性抗体。
  22. 請求項２０又は２１に記載の抗体であって、
    中性アミノ酸から負に荷電したアミノ酸、
    正に荷電したアミノ酸から中性アミノ酸、
    正に荷電したアミノ酸から負に荷電したアミノ酸への変異から選択される１つ以上の変異を含む第１重鎖、及び
    前記第１重鎖とは異なり、
    中性アミノ酸から正に荷電したアミノ酸、
    負に荷電したアミノ酸から中性アミノ酸、及び
    負に荷電したアミノ酸から正に荷電したアミノ酸への変異から選択される１つ以上の変異を含む第２重鎖を含む、抗体。
  23. 前記重鎖が互換性を有するヘテロ二量体化領域を含む、請求項２０～２２のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  24. 互換性を有するＣＨ３ヘテロ二量体化領域を含む、請求項２３に記載の多重特異性抗体。
  25. 前記重鎖の一方がＣＨ３の変異Ｌ３５１Ｄ及びＬ３６８Ｅを含み、前記重鎖の他方がＣＨ３の変異Ｔ３６６Ｋ及びＬ３５１Ｋを含む、請求項２１～２４のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  26. 第１重鎖及び異なる第２重鎖を含む、請求項２０～２５のいずれか一項に記載の抗体であって、前記第１重鎖が、
    中性アミノ酸から負に荷電したアミノ酸、
    正に荷電したアミノ酸から中性アミノ酸、及び
    正に荷電したアミノ酸から負に荷電したアミノ酸への変異から選択される１つ以上の変異を含み、
    前記第１重鎖が、ＣＨ３の変異Ｌ３５１Ｄ及びＬ３６８Ｅを更に含み、前記第２重鎖が、ＣＨ３の変異Ｔ３６６Ｋ及びＬ３５１Ｋを含む、抗体。
  27. 第１重鎖及び異なる第２重鎖を含み、前記第２重鎖が、
    中性アミノ酸から正に荷電したアミノ酸、
    負に荷電したアミノ酸から中性アミノ酸、
    負に荷電したアミノ酸から正に荷電したアミノ酸への変異から選択される１つ以上の変異を含み、
    前記第１重鎖が、ＣＨ３の変異Ｌ３５１Ｄ及びＬ３６８Ｅを更に含み、前記第２重鎖が、ＣＨ３の変異Ｔ３６６Ｋ及びＬ３５１Ｋを含む、請求項２０～２６のいずれか一項に記載の抗体。
  28. 表１４パートＢのＣＨ１、ＣＨ２、及び／又はＣＨ３領域の配列を含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載の免疫グロブリン領域又はドメイン、請求項２０に記載のタンパク質、又は請求項２１～２７のいずれか一項に記載の抗体。
  29. ヒト免疫グロブリン領域、好ましくはＩｇＧ領域、好ましくはＩｇＧ１領域を含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載の免疫グロブリン領域若しくはドメイン、請求項１９に記載のタンパク質、又は請求項２０～２７若しくは請求項２８のいずれか一項に記載の抗体。
  30. ＩｇＧ１抗体である、請求項２０～２９のいずれか一項に記載の抗体。
  31. １つ以上の抗体軽鎖を含む、請求項２０～３０のいずれか一項に記載の抗体。
  32. 請求項１～３１のいずれか一項に記載の免疫グロブリン領域、ドメイン、タンパク質、又は抗体を含む、組成物。
  33. 請求項１～３２のいずれか一項に記載の免疫グロブリン領域、ドメイン、タンパク質又は抗体、及び好ましくは薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
  34. 請求項１～３３のいずれか一項に記載の免疫グロブリン領域、ドメイン、タンパク質、又は抗体をコードする、核酸。
  35. 請求項２０～３１のいずれか一項に記載の抗体をコードする、核酸。
  36. 請求項３４又は３５に記載の核酸を含む、組換え宿主細胞。
  37. 請求項２０～３１のいずれか一項に記載の抗体の製造方法であって、前記方法が、
    請求項１～１５のいずれか一項に記載のＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３領域若しくはそれらの組合せ、又は請求項１６～１８のいずれか一項に記載のドメインを含む、第１重鎖をコードする核酸を提供する工程、
    第２重鎖をコードする核酸を提供する工程であって、前記第１及び第２重鎖は同じであっても異なっていてもよい、工程、
    軽鎖をコードする核酸を提供する工程、
    前記核酸を宿主細胞に導入し、前記宿主細胞を培養して前記核酸を発現させる工程、並びに以下の工程、
    前記宿主細胞の培養物から前記抗体を収集する工程、
    収集物を清澄化する工程、
    タンパク質を捕集する工程、
    陰イオン交換クロマトグラフィーを行う工程、及び
    陽イオン交換クロマトグラフィーを行い、別の抗体又は抗体断片から前記抗体を分離する工程、
    の少なくとも１つを実施することによって前記抗体を製造する工程を含む、方法。
  38. 請求項２０～３１のいずれか一項に記載の抗体の製造方法であって、前記方法が、
    請求項１～１５のいずれか一項に記載のＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３領域若しくはそれらの組合せ、又は請求項１６～２０のいずれか一項に記載のドメインを含む、第１重鎖をコードする核酸を提供する工程、
    第２重鎖をコードする核酸を提供する工程であって、前記第１及び第２重鎖は同じであっても異なっていてもよい、工程、
    軽鎖をコードする核酸を提供する工程、
    前記核酸を宿主細胞に導入し、前記宿主細胞を培養して前記核酸を発現させる工程、及び
    前記宿主細胞の培養物から前記抗体を収集する工程、及び
    分離工程において、ゲル上の等電点電気泳動によって他の抗体又は抗体断片から前記抗体を分離する工程を含む、方法。
  39. 前記第１及び第２重鎖が、互換性を有するヘテロ二量体化領域、好ましくは互換性を有するＣＨ３ヘテロ二量体化領域を含む、請求項３７又は３８に記載の方法。
  40. 等電点が異なる第１重鎖及び第２重鎖を含む、多重特異性抗体の製造方法であって、前記方法が、
    第１のコードされた重鎖の等電点及び第２のコードされた重鎖の等電点が異なるように、前記第１重鎖のＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３領域、又はそれらの組合せをコードする核酸、及び前記第２重鎖のＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３領域、又はそれらの組合せをコードする核酸を提供する工程であって、前記ＣＨ１領域の少なくとも１つが、Ｎ１５９、Ｎ２０１、Ｔ１２０、Ｋ１４７、Ｄ１４８、Ｙ１４９、Ｖ１５４、Ａ１７２、Ｑ１７５、Ｓ１９０及びＫ２１３（ＥＵナンバリング）から選択される位置のアミノ酸変異、又はＶ３０３（ＥＵナンバリング）の位置のＣＨ２領域のアミノ酸変異、又はＫ３７０、Ｅ３８２及びＥ３８８から（ＥＵナンバリング）から選択される位置のＣＨ３領域のアミノ酸変異、又は前記ＣＨ領域のアミノ酸変異の組合せを含む、工程、及び
    宿主細胞を培養して前記核酸を発現させる工程、及び
    前記宿主細胞の培養物から前記多重特異性抗体を、等電点の差を使用して収集する工程を含み、
    前記宿主細胞の培養物から前記抗体を収集する工程、
    収集物を清澄化する工程、
    タンパク質を捕集する工程、
    陰イオン交換クロマトグラフィーを行う工程、及び
    陽イオン交換クロマトグラフィーを行い、別の抗体又は抗体断片から前記抗体を分離する工程を更に含む、方法。
  41. 等電点が異なる第１重鎖及び第２重鎖を含む、多重特異性抗体の精製方法であって、前記方法が、
    第１のコードされた重鎖及び第２のコードされた重鎖の等電点が異なるように、前記第１重鎖のＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３領域又はそれらの組合せをコードする核酸、及び前記第２重鎖のＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３領域又はそれらの組合せをコードする核酸の両方又はいずれか一方を提供する工程であって、前記領域の少なくとも１つが、Ｎ１５９、Ｎ２０１、Ｔ１２０、Ｋ１４７、Ｄ１４８、Ｙ１４９、Ｖ１５４、Ａ１７２、Ｑ１７５、Ｓ１９０及びＫ２１３（ＥＵナンバリング）から選択される位置におけるＣＨ１領域のアミノ酸変異、又は、位置Ｖ３０３（ＥＵナンバリング）におけるＣＨ２領域のアミノ酸変異、又はＫ３７０、Ｅ３８２及びＥ３８８（ＥＵナンバリング）から選択される位置におけるＣＨ３領域のアミノ酸変異、又は前記ＣＨ領域のアミノ酸変異の組合せを含む、工程、及び
    宿主細胞を培養して前記核酸を発現させる工程、及び
    前記多重特異性抗体を、等電点電気泳動により前記宿主細胞の培養物から精製して、前記多重特異性抗体を別の抗体又は抗体断片から分離する工程を含む、方法。
  42. 前記第１重鎖のホモ多量体、前記第２重鎖のホモ多量体、及び前記第１及び第２重鎖のヘテロ多量体が、異なる等電点を有するタンパク質として発現され、イオン交換クロマトグラフィーにおいて異なる保持時間を生じさせる、請求項４０又は４１に記載の方法。
  43. 前記位置の前記１つ以上のアミノ酸変異が、
    中性アミノ酸から負に荷電したアミノ酸、
    正に荷電したアミノ酸から中性アミノ酸、
    正に荷電したアミノ酸から負に荷電したアミノ酸、
    中性アミノ酸から正に荷電したアミノ酸、
    負に荷電したアミノ酸から中性アミノ酸、及び
    負に荷電したアミノ酸から正に荷電したアミノ酸への変異から選択される、請求項４０～４２のいずれか一項に記載の方法。
  44. 前記第１重鎖及び前記第２重鎖が、互換性を有するＣＨ３ヘテロ二量体化領域を含む、請求項４０～４３のいずれか一項に記載の方法。
  45. 前記第１重鎖が、
    中性アミノ酸から負に荷電したアミノ酸、
    正に荷電したアミノ酸から中性アミノ酸、
    正に荷電したアミノ酸から負に荷電したアミノ酸への変異から選択される１つ以上の変異を含み、
    前記第１重鎖とは異なる前記第２重鎖が、
    中性アミノ酸から正に荷電したアミノ酸、
    負に荷電したアミノ酸から中性アミノ酸、及び
    負に荷電したアミノ酸を正に荷電させたアミノ酸への変異から選択される１つ以上の変異を含む、請求項４０～４４のいずれか一項に記載の方法。
  46. 前記互換性を有するＣＨ３ヘテロ二量体化領域の一方がＬ３５１Ｄ及びＬ３６８Ｅの変異を含み、他方がＴ３６６Ｋ及びＬ３５１Ｋの変異を含む、請求項４４又は４５に記載の方法。
  47. 前記第１重鎖がＣＨ３の変異Ｌ３５１Ｄ及びＬ３６８Ｅを含み、前記第２重鎖が、ＣＨ３の変異Ｔ３６６Ｋ及びＬ３５１Ｋを含む、請求項４４～４６のいずれか一項に記載の方法。
  48. １５９位、２０１位、１２０位、１４７位、１４８位、１４９位、１５４位、１７２位、１７５位、１９０位又は２１３位に第１の荷電アミノ酸残基を含む、ＣＨ１含有免疫グロブリンポリペプチド。
  49. 前記荷電残基に加えて、１５９位、２０１位、１２０位、１４７位、１４８位、１４９位、１５４位、１７２位、１７５位、１９０位又は２１３位から選択される異なる位置に第２の荷電アミノ酸残基を含む、請求項４８に記載のＣＨ１含有免疫グロブリンポリペプチド。
  50. １９７位及び／又は２１３位に中性又は負に荷電したアミノ酸残基を含む、ＣＨ１含有免疫グロブリンポリペプチド。
  51. １５９位に中性又は正に荷電したアミノ酸残基、及びヒンジ位置２１６に正に荷電したアミノ酸残基を含む、ＣＨ１含有免疫グロブリンポリペプチド。
  52. 第１ＣＨ１含有免疫グロブリンポリペプチド及び第２ＣＨ１含有免疫グロブリンポリペプチドを含む、免疫グロブリンタンパク質であって、前記第１及び／又は第２ＣＨ１含有免疫グロブリンポリペプチドが、表面に露出していない前記ＣＨ１領域内のアミノ酸から選択される１つ以上のアミノ酸の１つ以上の変異を含み、それにより、前記第１ＣＨ１含有免疫グロブリンポリペプチド及び前記第２ＣＨ１含有免疫グロブリンポリペプチドを含む前記免疫グロブリンタンパク質の等電点が、前記第１ＣＨ１免疫グロブリンポリペプチドのみを含有する免疫グロブリンタンパク質の等電点、又は前記第２ＣＨ１免疫グロブリンポリペプチドのみを含有するタンパク質の等電点とは異なる、免疫グロブリンタンパク質。
  53. 前記ＣＨ１領域内のアミノ酸から選択される１つ以上のアミノ酸の前記１つ以上の変異が埋もれた、請求項５２に記載の免疫グロブリンタンパク質。
  54. Ｔ１９７から選択されるアミノ酸及びヒンジ位置Ｅ２１６における変異を更に含む、請求項１～３１のいずれか一項に記載の免疫グロブリン領域、免疫グロブリンドメイン又は抗体を含む、組成物。
  55. 第１ＣＨ１領域含有免疫グロブリンポリペプチド及び第２ＣＨ１領域含有免疫グロブリンポリペプチドを含む、免疫グロブリンタンパク質であって、一方のＣＨ１領域が、表面に露出していないアミノ酸の１つ以上の変異を含み、アミノ酸の前記１つ以上の変異が、
    中性アミノ酸から負に荷電したアミノ酸、
    正に荷電したアミノ酸から中性アミノ酸、及び
    正に荷電したアミノ酸から負に荷電したアミノ酸、又は、
    中性アミノ酸から正に荷電したアミノ酸、
    負に荷電したアミノ酸から中性アミノ酸、及び
    負に荷電したアミノ酸から正に荷電したアミノ酸への変異である、免疫グロブリンタンパク質。
  56. 第１ＣＨ１領域含有免疫グロブリンポリペプチド及び第２ＣＨ１領域含有免疫グロブリンポリペプチドを含む、免疫グロブリンタンパク質であって、一方のＣＨ１領域が、表面に露出していないアミノ酸の１つ以上の変異を含み、アミノ酸の前記１つ以上の変異が、
    中性アミノ酸から負に荷電したアミノ酸、
    正に荷電したアミノ酸から中性アミノ酸、及び
    正に荷電したアミノ酸から負に荷電したアミノ酸への変異であり、
    他方のＣＨ１領域が表面に露出していないアミノ酸の１つ以上の変異を含み、アミノ酸の１つ以上の変異が
    中性アミノ酸から正に荷電したアミノ酸、
    負に荷電したアミノ酸から中性アミノ酸、及び
    負に荷電したアミノ酸から正に荷電したアミノ酸への変異である、免疫グロブリンタンパク質。
  57. 第１ＣＨ１領域含有免疫グロブリンポリペプチド及び第２ＣＨ１領域含有免疫グロブリンポリペプチドを含む、免疫グロブリンタンパク質であって、前記第１及び／又は第２ＣＨ１領域含有免疫グロブリンポリペプチドが、表面に露出していない前記ＣＨ１領域内のアミノ酸から選択される１つ以上のアミノ酸の１つ以上の変異を含み、それにより、前記第１ＣＨ１領域含有免疫グロブリンポリペプチド及び前記第２ＣＨ１領域含有免疫グロブリンポリペプチドを含む前記免疫グロブリンタンパク質の等電点が、前記第１ＣＨ１領域免疫グロブリンポリペプチドのみを含有する免疫グロブリンタンパク質の等電点、及び前記第２ＣＨ１領域免疫グロブリンポリペプチドのみを含有する免疫グロブリンタンパク質の等電点とは異なる、免疫グロブリンタンパク質。
  58. ヒトＣＨ１領域を含む、請求項５５～５７のいずれか一項に記載の免疫グロブリンタンパク質。
  59. ＩｇＧである、請求項５５～５８のいずれか一項に記載の免疫グロブリンタンパク質。
  60. 表面に露出していない前記アミノ酸が埋もれた、請求項５５～５９のいずれか一項に記載の免疫グロブリンタンパク質。
  61. Ｔ１２０、Ｋ１４７、Ｄ１４８、Ｙ１４９、Ｖ１５４、Ｎ１５９、Ａ１７２、Ｑ１７５、Ｓ１９０、Ｎ２０１及びＫ２１３から選択されるアミノ酸のＣＨ１領域におけるアミノ酸の変異を含む、請求項５５～６０のいずれか一項に記載の免疫グロブリンタンパク質。
  62. Ｄ１４８、Ｙ１４９、Ｖ１５４、Ｎ１５９、Ａ１７２、Ｓ１９０及びＮ２０１から選択されるアミノ酸の変異を含む、請求項６１に記載の免疫グロブリンタンパク質。
  63. Ｎ１５９及び／又はＮ２０１のアミノ酸の変異を含む、請求項６２に記載の免疫グロブリンタンパク質。
  64. 前記第１ＣＨ１領域含有免疫グロブリンポリペプチド及び前記第２ＣＨ１領域含有免疫グロブリンポリペプチドが重鎖である、請求項５５～６３のいずれか一項に記載の免疫グロブリンタンパク質。
  65. 抗体である、請求項５５～６４のいずれか一項に記載の免疫グロブリンタンパク質。
  66. 多重特異性抗体である、請求項６５に記載の抗体。
  67. 二重特異性抗体である、請求項６５又は６６に記載の抗体。
  68. Ｔ１９７から選択されるアミノ酸及びヒンジ位置Ｅ２１６における変異を更に含む、請求項５５～６７のいずれか一項に記載の免疫グロブリンタンパク質。
  69. 次の変異Ｇ１２２Ｐ、Ｉ１９９Ｖ、Ｎ２０３Ｉ、Ｓ２０７Ｔ及びＶ２１１Ｉの１つ以上を更に含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の免疫グロブリン領域又は請求項９～３１のいずれか一項に記載の抗体を含む、組成物。
  70. ３０３位に荷電アミノ酸残基を含む、ＣＨ２含有免疫グロブリンポリペプチド。
  71. ３７０位、３８２位又は３８８位から選択される位置に非荷電アミノ酸残基を含む、ＣＨ３含有免疫グロブリンポリペプチド。
  72. ３０３位の荷電アミノ酸残基、又は、３７０位、３８２位又は３８８位の非荷電アミノ酸残基から選択されるアミノ酸の変異の２つ以上を含む、請求項７０又は７１に記載のＣＨ２及び／又はＣＨ３含有免疫グロブリンポリペプチド。
  73. 抗体、好ましくは多重特異性抗体である、請求項７０～７２のいずれか一項に記載のＣＨ２及び／又はＣＨ３含有免疫グロブリンポリペプチド。
  74. ヒンジ位置２１６に正に荷電したアミノ酸残基を含む、請求項７３に記載の抗体。
  75. Ｔ１９７から選択されるアミノ酸及びヒンジ位置Ｅ２１６における変異を更に含む、請求項２０～３１のいずれか一項に記載の抗体。
  76. 次の変異Ｇ１２２Ｐ、Ｉ１９９Ｖ、Ｎ２０３Ｉ、Ｓ２０７Ｔ及びＶ２１１Ｉの１つ以上を更に含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の免疫グロブリン領域、請求項１６～１８のいずれか一項に記載の免疫グロブリンドメイン又は請求項２０～３１、７３～７５のいずれか一項に記載の抗体を含む、組成物。
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